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CN104159600A - 用抗体靶向干扰素-λ来有效增强抗肿瘤和抗病毒活性 - Google Patents

用抗体靶向干扰素-λ来有效增强抗肿瘤和抗病毒活性 Download PDF

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CN104159600A CN201380004311.9A CN201380004311A CN104159600A CN 104159600 A CN104159600 A CN 104159600A CN 201380004311 A CN201380004311 A CN 201380004311A CN 104159600 A CN104159600 A CN 104159600A
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Abstract

本发明涉及用于形成干扰素-λ与抗体或抗原结合抗体片段的复合物的方法和组合物。在优选的实施方案中，所述干扰素-λ和所述抗体或片段是融合蛋白，各自包含来自人类蛋白激酶A的二聚化和停靠结构域(DDD)部分或来自A激酶锚定蛋白(AKAP)的锚定结构域(AD)部分。在更优选的实施方案中，所述干扰素-抗体复合物可比单独的干扰素-λ、单独的抗体或未轭合的干扰素-λ与抗体的组合更有效地用于治疗癌症、哮喘、阿尔茨海默氏病(Alzheimer′s disease)、多发性硬化症或病毒感染。

Description

用抗体靶向干扰素-λ来有效增强抗肿瘤和抗病毒活性
相关申请
本申请依据35U.S.C.119(e)要求了2012年1月26日提交的临时美国专利申请61/591,087和2012年3月6日提交的美国专利申请No.13/412,816的权益。上文引用的各优先申请的正文以全文引用的方式并入本文中。
序列表
本申请包含通过EFS-Web提交并特此以全文引用的方式并入的序列表。所述ASCII副本创建于2013年1月22日，被命名为IBC136WO.txt并且大小为50,753字节。
背景
发明领域
本发明涉及包含连接至抗体或抗原结合抗体片段的干扰素-λ(IFN-λ)、更优选IFN-λ1的DOCK-AND-LOCKTM(DNLTM)复合物的组合物和治疗使用方法。在优选的实施方案中，抗体可为抗TROP-2、抗CEACAM5、抗CEACAM6、抗HLA-DR、抗粘蛋白、抗CD19、抗CD20、抗CD74、抗AFP或抗CD22抗体。然而，本领域技术人员将认识到本发明不受如此限制并且更宽泛地涵盖抗体-干扰素复合物。优选地，所述DNLTM复合物是使用如美国专利No.7,521,056、7,527,787、7,534,866、7,550,143和7,666,400中所示例的组合物和技术制得的，所述专利各自的实施例部分以引用的方式并入本文中。抗体轭合的干扰素保留体外活性并显示大体上增强的体内功效和增加的血清半衰期。DNLTM产品的其他优点还可包括较低的免疫原性、给药频率降低、溶解性增加、稳定性增强以及肾清除率降低。
相关背景
据报道干扰素-α(IFNα)在动物癌症模型(Ferrantini等，1994，JImmunol153：4604-15)和人类癌症患者(Gutterman等，1980，Ann InternMed93：399-406)中都具有抗肿瘤活性。IFNα可发挥多种直接的抗肿瘤作用，包括下调致癌基因、上调肿瘤抑制因子、通过增加肿瘤表面MHC I类蛋白的表达而增强免疫识别、加强细胞凋亡，以及对化学治疗剂的增敏(Gutterman等，1994，PNAS USA91：1198-205；Matarrese等，2002，Am J Pathol160：1507-20；Meechia等，2000，Gene Ther7：167-79；Sabaawy等，1999，Int J Oncol14：1143-51；Takaoka等，2003，Nature424：516-23)。对于一些肿瘤，IFNα可通过活化STAT1而具有直接和有效的抗增殖作用(Grimley等，1998Blood91：3017-27)。
间接地，IFNα可以抑制血管生成(Sidky和Borden，1987，CancerRes47：5155-61)以及刺激宿主免疫细胞，其可能对整体抗肿瘤反应至关重要但却已在很大程度上被低估(Belardelli等，1996，ImmunolToday17：369-72)。IFNα通过对骨髓细胞(Raefsky等，1985，J Immunol135：2507-12；Luft等，1998，J Immunol161：1947-53)、T细胞(Carrero等，2006，J Exp Med203：933-40；Pilling等，1999，Eur J Immunol29：1041-50)以及B细胞(Le等，2001，Immunity14：461-70)的作用而对免疫反应具有多效性影响。作为先天性免疫系统的重要调节剂，IFNα诱导树突细胞的快速分化和活化(Belardelli等，2004，Cancer Res64：6827-30；Paquette等，1998，J Leukoc Biol64：358-67；Santini等，2000，J Exp med191：1777-88)并增强细胞毒性、迁移、细胞因子生成以及NK细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)(Biron等，1999，Annu RevImmunol17：189-220；Brunda等，1984，Cancer Res44：597-601)。
迄今为止，通过批准IFN-α2用于治疗毛细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、恶性黑色素瘤、滤泡性淋巴瘤、尖锐湿疣、AID相关性卡波西肉瘤(AIDs-related Kaposi sarcoma)、慢性乙型肝炎和丙型肝炎；IFN-β用于治疗多发性硬化症；以及IFN-γ用于治疗慢性肉芽肿病和恶性骨石化病，已经证实了IFN的治疗有效性。尽管关于这组自分泌和旁分泌细胞因子的文献众多，但其在健康和疾病中的功能仍然被阐明，包括临床上引入的更有效和新颖的形式(Pestka，2007，J.Biol.Chem282：20047-51；Vilcek，2006，Immunity25：343-48)。
干扰素在抗肿瘤和抗微生物宿主防御中起到关键作用，并且已经被广泛探索作为癌症和感染性疾病的治疗剂(Billiau等，2006，Cytokine Growth Factor Rev17：381-409；Pestka等，2004，Immunol Rev202：8-32)。尽管I型和II型干扰素(IFN-α/β和γ)已作出相当大的努力，但由于其在患者中的短的循环半衰期、全身毒性以及欠佳反应而在临床配置中的使用是有限的(Pestka等，2004，Immunol Rev202：8-32；Miller等，2009，Ann N Y Acad Sci1182：69-79)。2003年初IFN-λ家族的发现为开发针对这些未满足的临床适应症的可选IFN剂带来了-个令人振奋的新机会(Kotenko等，2003，Nat Immunol4：69-77；Sheppard等，2003，Nat Immunol4：63-8)。
IFN-λ(称为III型干扰素)是一组最新描述的由IFN-λ1、2、3(也分别称为干扰素-29、28A和28B)组成的细胞因子，它们由位于染色体19上三个不同基因进行遗传编码(Kotenko等，2003，Nat Immunol4：69-77；Sheppard等，2003，Nat Immunol4：63-8)。在蛋白质水平上，IFN-λ2和IFN-λ3高度同源，具有96％氨基酸同一性，而IFN-λ1与IFN-λ2和IFN-λ3共有约81％同源性(Sheppard等，2003，Nat Immunol4：63-8)。IFN-λ通过与由I型IFN所诱导类似的JAK/STAT途径激活信号转导，包括JAK1和TYK2激酶的活化、STAT蛋白的磷酸化以及IFN刺激的基因因子3(ISGF3)的转录复合物的活化(Witte等，2010，Cytokine Growth Factor Rev21：237-51；Zhou等，2007，J Virol81：7749-58)。
III型IFN系统与I型IFN系统之间的主要差异在于其各自的受体复合物的分布。IFN-α/β通过两种广泛表达的I型干扰素受体进行信号传导，并且与IFN-α/β施用有关的所得全身毒性已经限制了它们作为治疗剂的使用(Pestka等，2007，J Biol Chem282：20047-51)。相比之下，IFN-λ通过由独特的IFN-λ受体1(IFN-λR1)和IL-10受体2(IL-10R2)组成的异源二聚受体复合物进行信号传导。如先前所报道(Witte等，2009，Genes Immun10：702-14)，IFN-λR1具有一个非常受限的表达模式，其中在上皮细胞、黑素细胞和肝细胞中水平最高，而在原发性中枢神经系统(CNS)细胞中水平最低。血液免疫系统细胞表达高水平的短IFN-λ受体剪接变体(sIFN-λR1)，其抑制IFN-λ作用。神经元细胞和免疫细胞的有限响应性意味着，利用IFN-λ可使与IFN-α疗法频繁相关的严重毒性不存在或显著减少(Witte等，2009，GenesImmun10：702-14；Witte等，2010，Cytokine Growth Factor Rev21：237-51)。最新出版物报道，虽然IFN-α和IFN-λ诱导一组常见ISG(干扰素刺激基因)在肝细胞中的表达，但与IFN-α不同，IFN-λ的施用不会在纯化的淋巴细胞或单核细胞中诱导STAT活化或ISG表达(Dickensheets等，2013，J Leukoc Biol.93，网上公布于12/20/12)。这表明对于慢性HCV感染的治疗，IFN-λ可能优于IFN-α，因为IFN-λ不太可能诱导经常与IFN-α疗法相关的白细胞减少(Dickensheets等，2013)。
IFN-λ显示与IL-10有关的细胞因子类似的结构特征，但在功能上具有I型IFN类抗病毒和抗增殖活性(Witte等，2009，Genes Immun10：702-14；Ank等，2006，J Virol80：4501-9；Robek等，2005，J Virol79：3851-4)。IFN-λ1和IFN-λ2已经证明可减少病毒复制或各种病毒的细胞病变作用，所述病毒包括DNA病毒(乙型肝炎病毒(Robek等，2005，J Virol79：3851-4；Doyle等，2006，44：896-906)和2型单纯疱疹病毒(Ank等，2008，J Immunol180：2474-85))、ss(+)RNA病毒(EMCV；Sheppard等，2003，Nat Immunol4：63-8)和丙型肝炎病毒(Robek等，2005，J Virol79：3851-4；Doyle等，2006，44：896-906；Marcello等，2006，Gastroenterol131：1887-98；Pagliaccetti等，2008，J Biol Chem283：30079-89)、ss(-)RNA病毒(水泡性口炎病毒；Pagliaccetti等，2008，J Biol Chem283：30079-89)和甲型流感病毒(Jewell等，2010，J Virol84：11515-22)以及双链RNA病毒如轮状病毒(Pott等，2011，PNAS USA108：7944049)。IFN-λ3已经根据遗传研究被鉴定为HCV感染中的关键细胞因子(Ge等，2009，Nature461：399-401)，并且还已显示针对EMCV的潜在活性(Dellgren等，2009，Genes Immun10：125-31)。鼻病毒诱导的IFN-λ产生的缺乏据报道与鼻病毒诱发的哮喘加剧的严重程度高度相关(Contoli等，2006，Nature Med12：1023-26)并且IFN-λ疗法已被建议作为治疗过敏性哮喘的新方法(Edwards和Johnston，2011，EMBO Mol Med3：306-8；Koltsida等，2011，EMBO Mol Med3：348-61)。
已经在若干种人类癌症细胞系中确定了IFN-λ的抗增殖活性，包括神经内分泌癌BON1(Zitzmann等，2006，344：1334-41)、胶质母细胞瘤LN319(Meager等，2005，Cytokine31：109-18)、永生化角质形成细胞HaCaT(Maher等，2008，Cancer Biol Ther7：1109-15)、黑色素瘤F01(Guenterberg等，2010，Mol Cancer Ther9：510-20)和食道癌TE-11(Li等，2010，Eur J Cancer46：180-90)。在动物模型中，IFN-λ通过先天性和适应性免疫反应诱导肿瘤细胞凋亡和破坏，这表明IFN-λ的局部递送可能是人类恶性肿瘤治疗中的有用辅助策略(Numasaki等，2007，JImmunol178：5086-98)。
在临床配置中，聚乙二醇化IFN-λ1(PEG-IFN-λ1)已经被临时用于具有慢性丙型肝炎病毒感染的患者。在Ib阶段研究(n＝56)中，在所有的剂量水平(0.5-3.0μg/kg)下都观察到抗病毒活性，并且当将PEG-IFN-λ1施用至在IFN-α疗法后复发的基因1型HCV患者时，病毒载量从2.3降至4.0log(Muir等，2010，Hepatology52：822-32)。IIb阶段研究(n＝526)显示具有基因1型和4型HCV的患者对于用PEG-IFN-λ1治疗相比于PEG-IFN-α治疗具有显著更高的反应率。与此同时，利用PEG-IFN-λ1的情况相比于利用PEG-IFN-α的情况下与I型干扰素治疗通常相关的不良事件发生率较低。很少观察到中性粒细胞减少和血小板减少，并且流感样症状、贫血和肌肉骨骼症状的发生率降至用PEG-IFN-α治疗所见的约1/3。然而，PEG-IFN-λ1与PEG-IFN-α之间的严重不良事件、抑郁症和其他常见的不良事件(≥10％)发生率类似。与PEG-IFN-α相比，在最高剂量PEG-IFN-λ1中可见更高比率的肝毒性(“Investigational Compound PEG-InterferonLambda Achieved Higher Response Rates with Fewer Flu-like andMusculoskeletal Symptoms and Cytopenias Than PEG-Interferon Alfa inPhase IIb Study of526Treatment-Naive Hepatitis C Patients，”2011年4月2日，Press Release from Bristol-Myers Squibb)。
需要包含干扰素-λ-抗体复合物的组合物和方法，所述复合物保持未修饰干扰素的生物活性，但展现出改进的体内功效、降低的毒性和/或优异的药物动力学性质。
发明内容
本发明公开了用于产生DNLTM复合物的方法和组合物，所述复合物包含连接至抗体或抗原结合抗体片段的干扰素、优选干扰素-λ、更优选IFN-λ1。所述干扰素部分可轭合至人类蛋白激酶A(PKA)调节亚基RIα、RIβ、RIIα或RIIβ的二聚化和停靠结构域(DDD)部分或可选地轭合至A激酶锚定蛋白(AKAP)的锚定结构域(AD)部分。抗体或抗体片段部分轭合至互补性AD或DDD部分。因为DDD部分自发地形成二聚体，所述二聚体以高亲和性结合于AD部分，所以可由诸如干扰素、抗体或抗体片段等效应子组装DNLTM复合物，所述效应子各自连接至DDD部分或AD部分。通过将连接至DDD部分的效应子与连接至AD部分的效应子混合，可将实质上任何效应子并入DNLTM复合物中。
DNLTM复合物优选含有一个、两个或四个拷贝的连接至抗体或片段的干扰素部分。然而，本领域技术人员将认识到，可在所要求保护的方法和组合物的范围内构建并使用具有不同的结构和不同的干扰素/抗体比的其他类型的DNLTM复合物，例如美国专利No.7,521,056、7,527,787、7,534,866、7,550,143和7,666,400中所公开。在更优选的实施方案中，可通过在DDD和AD序列中的适当位置引入半胱氨酸残基来形成可稳定化复合物的二硫键，从而将DNLTM复合物共价稳定化。
在其他优选的实施方案中，包含干扰素轭合抗体的DNLTM复合物显示比未轭合干扰素慢至少一个数量级的血清清除速率。
本领域技术人员将认识到，该技术不限于干扰素-λ，而是可应用于多种治疗剂的靶向递送，所述治疗剂包括(但不限于)酶、细胞因子、趋化因子、生长因子、肽、适体、血红蛋白、抗体和其片段。示例性剂包括MIF、HMGB-1(高迁移率族蛋白1)、TNF-α、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-21、IL-23、IL-24、CCL19、CCL21、IL-8、MCP-1、RANTES、MIP-1A、MIP-1B、ENA-78、MCP-1、IP-10、Gro-β、嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、干扰素-λ、G-CSF、GM-CSF、SCF、PDGF、MSF、Flt-3配体、促红细胞生成素(erythropoietin)、血小板生成素(thrombopoietin)、hGH、CNTF、瘦素(leptin)、制瘤素M、VEGF、EGF、FGF、PIGF、胰岛素、hGH、降钙素、因子VIII、IGF、生长抑素、组织纤溶酶原激活物以及LIF。
可用于所要求保护的方法和组合物的范围内的癌症靶向治疗的抗体包括(但不限于)LL1(抗CD74)、LL2和RFB4(抗CD22)、RS7(抗上皮糖蛋白-1(EGP-1))、PAM4和KC4(都是抗粘蛋白)、MN-14(抗癌胚抗原(CEA，也称为CD66e)、MN-15(抗CEACAM6)、Mu-9(抗结肠特异性抗原-p)、Immu-31(抗α-甲胎蛋白)、抗TAG-72(例如CC49)、抗Tn、J591或HuJ591(抗PSMA(前列腺特异性膜抗原))、AB-PG1-XG1-026(抗PSMA二聚体)、D2/B(抗PSMA)、G250(抗碳酸酐酶IX)、hL243(抗HLA-DR)、阿仑单抗(alemtuzumab)(抗CD52)、贝伐单抗(bevacizumab)(抗VEGF)、西妥昔单抗(cetuximab)(抗EGFR)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)(抗CD33)、替伊莫单抗(ibritumomabtiuxetan)(抗CD20)；帕尼单抗(panitumumab)(抗EGFR)；利妥昔单抗(rituximab)(抗CD20)；托西莫单抗(tositumomab)(抗CD20)；GA101(抗CD20)；以及曲妥珠单抗(trastuzumab)(抗ErbB2)。这些抗体是本领域中已知的(例如，美国专利No.5,686,072、5,874,540、6,107,090、6,183,744、6,306,393、6,653,104、6,730.300、6,899,864、6,926,893、6,962,702、7,074,403、7,230,084、7,238,785、7,238,786、7,256,004、7,282,567、7,300,655、7,312,318、7,585,491、7,612,180、7,642,239；和美国专利申请公开No.20040202666(现已弃权)、20050271671和20060193865；各文献的实施例部分以引用的方式并入本文中)。所用的具体已知抗体包括hPAM4(美国专利No.7,282,567)、hA20(美国专利No.7,251,164)、hA19(美国专利No.7,109,304)、hIMMU31(美国专利No.7,300,655)、hLL1(美国专利No.7,312,318)、hLL2(美国专利No.7,074,403)、hMu-9(美国专利No.7,387,773)、hL243(美国专利No.7,612,180)、hMN-14(美国专利No.6,676,924)、hMN-15(美国专利No.7,541,440)、hR1(美国专利申请12/772,645)、hRS7(美国专利No.7,238,785)、hMN-3(美国专利No.7,541,440)、AB-PG1-XG1-026(美国专利申请11/983,372，以ATCC PTA-4405和PTA-4406存放)和D2/B(WO2009/130575)，每个所述专利或申请的正文以关于附图和实施例部分进行引用的方式并入本文中。
抗TNF-α抗体是本领域中已知的并且可用于治疗免疫疾病，例如哮喘(参见例如Erin等，2006，Am J Respir Crit Care Med174：753-62)。已知的针对TNF-α的抗体包括人类抗体CDP571(Ofei等，2011，Diabetes45：881-85)；鼠类抗体MTNFAI、M2TNFAI、M3TNFAI、M3TNFABI、M302B和M303(Thermo Scientific，Rockford，IL)；英利昔单抗(infliximab)(Centocor，Malvern，PA)；聚乙二醇化赛妥珠单抗(certolizumab pegol)(UCB，Brussels，Belgium)；以及阿达木单抗(adalimumab)(Abbott，Abbott Park，IL)。这些和许多其他的已知抗TNF-α抗体可用于所要求保护的方法和组合物中。使用的其他抗体包括(但不限于)抗B细胞抗体，例如维妥珠单抗(veltuzumab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、米拉珠单抗(milatuzumab)或hL243；托珠单抗(tocilizumab)(抗IL-6受体)；巴利昔单抗(basiliximab)(抗CD25)；达利珠单抗(daclizumab)(抗CD25)；依法珠单抗(efalizumab)(抗CD11a)；莫罗单抗(muromonab)-CD3(抗CD3受体)；抗CD40L(UCB，Brussels，Belgium)；那他珠单抗(natalizumab)(抗α4整合素)和奥马珠单抗(omalizumab)(抗IgE)。
巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)是先天性和适应性免疫性和细胞凋亡的重要调节因子。已经报道了CD74是MIF的内源受体(Leng等，2003，J Exp Med197：1467-76)。拮抗性抗CD74抗体对于MIF介导的细胞内途径的治疗作用可用于治疗广泛多种疾病状态，例如膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌和慢性淋巴细胞性白血病(例如，Meyer-Siegler等，2004，BMC Cancer12：34；Shachar和Haran，2011，Leuk Lymphoma52：1446-54)；肾病，例如肾脏同种异体移植排斥反应(Lan，2008，Nephron Exp Nephrol.109：e79-83)；以及众多的发炎性疾病(Meyer-Siegler等，2009，Mediators Inflamm，电子出版于2009年3月22日；Takahashi等，2009，Respir Res10：33)。米拉珠单抗(hLL1)是具有用于治疗MIF介导性疾病的治疗用途的示例性抗CD74抗体。
本发明的药物组合物可用于治疗具有神经退化性疾病如阿尔茨海默氏病的受试者。巴匹珠单抗(bapineuzumab)正处于阿尔茨海默氏病治疗的临床试验中。建议用于阿尔茨海默氏病治疗的其他抗体包括Alz50(Ksiezak-Reding等，1987，J Biol Chem263：7943-47)、更汀芦单抗(gantenerumab)和苏兰珠单抗(solanezumab)。英利昔单抗(一种抗TNF-α抗体)已经被报道可减少淀粉样蛋白斑块和提高认知。阿尔茨海默氏病患者大脑的神经原纤维缠结中CD74的存在(Bryan等，MolNeurodegeneration2008；3：13doi：10.1186/1750-1326-3-13)表明CD74可为肽或抗体疗法的靶标，或用于使治疗剂靶向阿尔茨海默氏病患者大脑的这些区域。
可使用的其他抗体包括针对感染性疾病病原体如细菌、病毒、支原体或其他病原体的抗体。许多针对这些感染性病原体的抗体是本领域中已知的并且任何这种已知的抗体都可用于所要求保护的方法和组合物中。例如，针对人类免疫缺陷病毒I(HIV-1)的gp120糖蛋白抗原的抗体是已知的，并且某些这种抗体可以在人类中具有免疫保护作用。参见例如Rossi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.86：8055-8058，1990。已知的抗HIV抗体包括由Johansson等(AIDS.2006年10月3日；20(15)：1911-5)描述的抗包膜抗体，以及由Polymun(Vienna，Austria)描述和销售的抗HIV抗体，其还描述于美国专利5,831,034、美国专利5,911,989，以及Vcelar等，AIDS2007；21(16)：2161-2170和Joos等，Antimicrob.Agents Chemother.2006；50(5)：1773-9中，全部都以引用的方式并入本文中。
针对疟疾寄生虫的抗体可以针对子孢子、裂殖子、裂殖体和配子体阶段。已生成针对子孢子(环子孢子抗原)的单克隆抗体，并且已显示其在体外和啮齿动物中可中和子孢子(N.Yoshida等，Science207：71-73，1980)。若干团队已经开发了弓形虫抗体，弓形虫是弓形虫病中所涉及的原生动物寄生虫(Kasper等，J.Immunol.129：1694-1699，1982；同上，30：2407-2412，1983)。已开发了针对童虫(schistosomulae)表面抗原的抗体并且已发现其在体内或体外作用于童虫(Simpson等，Parasitology，83：163-177，1981；Smith等，Parasitology，84：83-91，1982；Gryzch等，J.Immunol.，129：2739-2743，1982；Zodda等，J.Immunol.129：2326-2328，1982；Dissous等，J.Immunol.，129：2232-2234，1982)。
克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)是美洲锥虫病(Chagas′disease)的病原体，并且通过吸血的猎蝽昆虫传播。已生成了在体外特异性抑制寄生虫的一种形式至另一种形式(上鞭毛体至锥鞭毛体阶段)的分化并且与细胞表面糖蛋白反应的抗体；然而，寄生虫的哺乳动物(血流)形式不存在这种抗原(Sher等，Nature，300：639-640，1982)。
抗真菌抗体是本领域中已知的，例如抗菌核病抗体(美国专利7,910,702)；抗葡萄糖醛酸木糖甘露聚糖(antiglucuronoxylomannan)抗体(Zhong和Priofski，1998，Clin Diag Lab Immunol5：58-64)；抗念珠菌属抗体(Matthews和Burnie，2001，2：472-76)；以及抗鞘糖脂抗体(Toledo等，2010，BMC Microbiol10：47)。
已经开发了针对大多数在人类中造成大部分感染的微生物(细菌、病毒、原生动物、真菌、其他寄生虫)的合适抗体，并且许多已先前用于体外诊断目的。可商购获得的针对广泛多种病原体的抗体是已知的并且可被利用。来自Millipore(Billerica，MA)的示例性抗病原体抗体包括抗大肠杆菌(E.coli)抗体(MAB8272)、抗沙门氏菌属(Salmonella)抗体(MAB748-MG-K)、抗单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)抗体(MAB8001)、抗幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)抗体(IHC2140-6)、抗金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抗体(MAB930)、抗沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)抗体(AB1120F)、抗牛支原体(Mycoplasma bovis)抗体(MAB970)、抗鼠贾第鞭毛虫(Giardia muris)抗体(MAB10242)、抗登革热病毒(Dengue virus)抗体(MAB10226)、抗黄病毒属(Flavivirus)抗体(MAB10216)、抗嗜肺军团菌(L.pneumophila)抗体(MAB10223)、抗乙型肝炎抗体(MAB10201)、抗登革热病毒抗体(MAB10217)、抗单纯疱疹抗体(MAB8685)、抗爱泼斯坦巴尔病毒(Epstein Barr virus)抗体(MAB10219)、抗柯萨奇病毒(Coxsackie virus)抗体(MAB10220)、抗呼吸道合胞体病毒(Respiratory Syncytial virus)抗体(MAB8262-KC)、抗腺病毒抗体(MAB8043-KC)、抗流感病毒抗体(MAB8661-KC)、抗RSV抗体(MAB8594)、抗乳头状瘤病毒(Papillomavirus)抗体(MAB837)、抗丙型肝炎病毒抗体(AB307)、抗肠病毒71抗体(MAB979-K)、抗麻疹抗体(MAB8905-K)、抗巨细胞病毒(Cytomegalovirus)抗体(MAB8140-KC)、抗黄热病病毒(Yellow Fever virus)抗体(MAB984-K)、抗狂犬病抗体(MAB8724)、抗疱疹病毒6抗体(MAB8535)、抗脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)抗体(MAB8566)、抗SARS抗体(MAB8785)、抗新城疫病毒(Newcastle Disease virus)抗体(MAB80144)和抗西尼罗河病毒(West Nile virus)抗体(MAB8150)。来自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)的示例性抗病原体抗体包括抗登革热病毒抗体(sc-325018)、抗牛痘病毒抗体(sc-69949)、抗多瘤病毒抗体(sc065925)、抗风疹病毒抗体(sc101364)、抗埃博拉病毒(Ebola virus)抗体(sc-51872)、抗EBV抗体(sc-17500)、抗麻疹抗体(sc-58167)、抗腮腺炎抗体(sc-57918)、抗汉坦病毒(Hantavirus)抗体(sc-57755)以及抗人型支原体(Mycoplasma hominis)病毒(sc-58171)。来自ProSci Inc.(Poway，CA)的示例性抗病原体抗体包括抗曲霉菌属(Aspergillus)抗体(35-595)、抗白色念珠菌(Candida albicans)抗体(35-121)和抗酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)抗体(35-361)。来自KPL(Gaithersburg，MD)的示例性抗病原体抗体包括抗金黄色葡萄球菌抗体(01-90-05)、抗莱姆病螺旋体(Borrelia burgdorferi)抗体(01-97-91)、抗幽门螺旋杆菌抗体(01-93-94)、抗军团菌属(Legionellaspp.)抗体(01-90-03)和抗耶尔森菌属(Yersinia spp.)抗体(01-90-04)。存在许多本领域中众所周知的其他来源的商业抗病原体抗体。本领域技术人员将认识到针对实质上任何所感兴趣的病原体的抗体可商购获得和/或公开获得，并且任何此类已知的抗体可并入使用下文所述的方法和组合物的DNLTM复合物中。
所述DNLTM复合物适用于广泛多种治疗和诊断应用中。DNLTM复合物的使用方法可包括检测、诊断和/或治疗疾病或其他医学病状。这些病状可包括(但不限于)癌症、增生、哮喘、多发性硬化症、感染性疾病、慢性病毒性肝炎、疱疹病毒感染、慢性乙型或丙型肝炎病毒感染、慢性肉芽肿病、恶性骨石化病、卡波西氏肉瘤(Karposi′ssarcoma)、人类乳头状瘤病毒感染、流感、慢性髓细胞性白血病、毛细胞白血病、皮肤T细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、转移性肾细胞癌、血管瘤、血液科恶性肿瘤、尖锐湿疣以及恶性黑色素瘤。
可治疗的示例性肿瘤类型包括急性成淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、胆癌、乳腺癌、子宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、头颈癌、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin′s lymphoma)、肺癌、甲状腺髓样癌、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾癌、卵巢癌、胰腺癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、肝癌、前列腺癌以及膀胱癌。
可治疗各种病毒感染，包括(但不限于)人类免疫缺陷病毒(HIV)、疱疹病毒、单纯疱疹病毒、牛痘病毒、巨细胞病毒、狂犬病毒、流感病毒、鼻病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、仙台病毒(Sendai virus)、猫白血病病毒、呼肠孤病毒(Reo virus)、脊髓灰质炎病毒、人类血清细小样病毒、猿猴病毒40、呼吸道合胞病毒、小鼠乳腺肿瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒、登革病毒、风疹病毒、麻疹病毒、腺病毒、人类T细胞白血病病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、鼠类白血病病毒、腮腺炎病毒、水泡性口炎病毒、辛德毕斯病毒(Sindbis virus)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、疣病毒以及蓝舌病毒；或细菌选自由以下组成的群组：无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、肺炎球菌(Pneumococcus)、乙型流感嗜血杆菌(Hemophilus influenzae B)、梅毒螺旋菌(Treponema pallidum)、莱姆病螺旋体(Lyme disease spirochetes)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)或破伤风梭菌(Clostridium tetani)。
附图简要说明
图1是描述细胞因子-DDD2(C)和IgG-AD2(D)DNL模块的表达的基因结构(A和B)的卡通图。所述模块被组合以形成由融合至IgG(E)的四个细胞因子组成的DNL结构。
图2示出了细胞因子-MAb DNL构建体与聚乙二醇化或原生IFNα相比的体外IFNα活性。如实施例中所述测量特异性活性(IU/pmol)。从rhIFNα2b标准曲线外推已知浓度的每个测试物品的活性。在递增浓度的20-2b(●)、734-2b(■)、v-mab(○)、v-mab+734-2b(□)、PEGASYS、PEG-内含子(▲)或1R-2b存在下使培养物生长并且用MTS测量相对活细胞密度。绘制从未处理的细胞获得的信号的％相对于摩尔浓度的log值的曲线。使用Prism软件生成剂量-反应曲线和EC50值。误差条，SD。
图2(A)基于细胞的报道基因测定法。
图2(B)利用EMC病毒和A549细胞的病毒保护测定法。
图2(C)使用Daudi细胞的体外淋巴瘤增殖测定法。
图2(D)使用Jeko-1细胞的体外淋巴瘤增殖测定法。
图3示出了Swiss-Webster小鼠中的药物动力学分析结果。向小鼠施用20-2b、α2b-413、PEG内含子或PEGASYS并且经96小时通过ELISA分析血清样品中的IFNα2b浓度。示出了血清消除曲线。血清半衰期(T1/2)消除速率和平均滞留时间(MRT)概述于插入的表格中。
图4(A)示出了20-2b的ADCC效应功能。在新鲜分离的PBMC存在下将Daudi或Raji细胞与5μg/ml的20-2b、22-2b、v-mab、依帕珠单抗(e-mab)或h734一起温育4小时，随后定量细胞溶解。
图4(B)示出了20-2B的CDC效应功能。在人类补体存在下将Daudi细胞与20-2b(●)、734-2b(■)或v-mab(○)的连续稀释液一起温育。绘制补体对照％(测试样品中的活细胞数目，相比于仅被补体处理的细胞)相对于nM浓度的log值的曲线。误差条，SD。
图5示出了20-2b对来自全血的NHL细胞的消耗增强。将新鲜的肝素化人类血液与Daudi或Ramos混合并与0.01、0.1或1nM的20-2b(●)、v-mab(○)、734-2b(■)或v-mab+734-2b(□)一起温育两天。使用流式细胞测量术评价所示治疗对淋巴瘤和外周血淋巴细胞的影响。误差条，SD。
图6(A)示出了显示20-2b于播散性伯基特淋巴瘤(Daudi)异种移植物模型中的治疗功效的存活曲线。在第0天向雌性C.B.17SCID小鼠静脉内施用Daudi细胞。治疗由以单一皮下剂量给出的20-2b(●)、734-2b(■)、v-mab(○)、PEGASYS或盐水(X)组成。治疗天数以箭头指示。使用Prism软件分析存活曲线。在早期Daudi模型中，在第1天向10只小鼠的群组提供0.7pmol(实线)或0.07pmol(虚线)的单一剂量。
图6(B)示出了与图6(A)类似的研究，但是在晚期Daudi模型中。在第7天向10只小鼠的群组提供0.7pmol(实线)、7pmol(虚线)或70pmol(灰线)的单一剂量。
图7(A)呈现了显示20-2b于播散性伯基特淋巴瘤(Raji和NAMALWA)异种移植物模型中的治疗功效的存活曲线。在第0天向雌性C.B.17SCID小鼠静脉内施用NHL细胞。治疗由以皮下剂量给出的20-2b(●)、734-2b(■)、v-mab(○)或盐水(X)组成。治疗天数以箭头指示。使用Prism软件分析存活曲线。在晚期Raji模型中，在第5、7、9、12、14和16天使10只小鼠的群组接受250pmol剂量。
图7(B)示出了与图7(A)类似的研究，但是在早期NAMALWA模型中。6只小鼠的群组在第1、3、5、8、10和12天接受250pmol剂量的20-2b或734-2b或在第1、5、9、13、17、21和25天接受3.5nmol剂量的v-mab。
图8(A)AD2-IFN-λ1表达模块的示意图。图按外观顺序分别公开了SEQ ID NO99-100。(B)示出了干扰素-抗体DNLTM模块的构造的示意图。
图9抗原在各种细胞系中的细胞表面表达。
图10(A)(E1)-λ1与ME-180细胞、(B)(15)-λ1与HepG2细胞以及(C)(C2)-1与A375细胞的结合活性相比于AD2-λ1模块有所增强。
图11(E1)-λ1对于ME-180细胞的细胞毒性作用。
图12(15)-λ1对于ME-180细胞的细胞毒性作用。
图13.抗病毒作用。(A)(c225)-λ1在Huh-7细胞中的抗HCV效力增强。用所示浓度的(c225)-λ1、(C2)-λ1或rhIFN-λ1剂处理具有表达萤火虫荧光素酶的HCV基因1b型Con1复制子的Huh-7稳定细胞系。3天后，测量荧光素酶活性并且通过相对于未处理的细胞的活性降低百分比测定抗病毒作用。利用Graph Pad Prism使用S形拟合(可变斜率)来分析数据。样品一式两份地独立操作两次。(B)(15)-λ1于A549细胞中的抗EMCV效力增强。在用EMCV激发之前，使A549细胞与(15)-λ1、(C2)-λ1、rhIFN-λ1或hMN15-Fab-DDD2的连续稀释液一起温育。进行目测细胞病变作用(CPE)测定，并且利用GraphPadPrism使用S形拟合(可变斜率)来分析数据。样品一式两份地独立操作两次。
详述
定义
除非另外说明，否则“一”意指“一个或多个”。
如本文所用，术语“和”与“或”可用于指合取或析取。即，除非另外指明，否则这两个术语应理解为等同于“和/或”。
“治疗剂”是可用于治疗疾病的原子、分子或化合物。治疗剂的实例包括抗体、抗体片段、肽、药物、毒素、酶、核酸酶、激素、免疫调节剂、反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)、螯合剂、硼化合物、光敏剂、染料和放射性同位素。
“诊断剂”是可用于诊断疾病的原子、分子或化合物。有用的诊断剂包括(但不限于)放射性同位素、染料(例如与生物素-链霉亲和素复合物一起)、造影剂、荧光化合物或分子，以及用于磁共振成像(MRI)的增强剂(例如，顺磁离子)。
如本文所用的“抗体”是指全长(即天然存在的或通过正常的免疫球蛋白基因片段重组方法形成的)免疫球蛋白分子(例如IgG抗体)，或者具有免疫活性(即特异性结合)的免疫球蛋白分子的一部分，如抗体片段一样。“抗体”包括单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、鼠类抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人类抗体。
“裸抗体”是未连接至治疗剂或诊断剂的抗体或其抗原结合片段。完整裸抗体的Fc部分可以提供效应功能，例如补体固定和ADCC(参见例如Markrides，Pharmacol Rev50：59-87，1998)。裸抗体诱导细胞死亡的其他机制可包括细胞凋亡。(Vaswani和Hamilton，Ann AllergyAsthma Immunol81：105-119，1998。)
“抗体片段”是完整抗体的一部分，例如F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab、Fv、sFv、scFv、dAb等。无论结构如何，抗体片段与全长抗体所识别的相同抗原结合。例如，抗体片段包括由可变区组成的分离片段，例如由重链和轻链的可变区组成的“Fv”片段或通过肽接头连接轻链和重链可变区的重组单链多肽分子(“scFv蛋白”)。“单链抗体”(经常缩写为“scFv”)由包含VH和VL结构域的多肽链组成，所述结构域相互作用以形成抗原结合位点。VH和VL结构域通常由具有1至25个氨基酸残基的肽连接。抗体片段还包括双链抗体、三链抗体和单域抗体(dAb)。
如果抗体或免疫轭合物制剂或本文所述的组合物的施用量是生理学上显著的，则将其称为以“治疗有效量”施用。如果药剂的存在引起接受体受试者的生理学发生可检测的变化，则所述药剂为生理学上显著的。在特定的实施方案中，如果抗体制剂的存在引起了抗肿瘤反应或减轻了疾病状态的征象和症状，则所述抗体制剂为生理学上显著的。生理学上显著的作用还可以是引起了接受体受试者的体液和/或细胞免疫反应，导致靶细胞生长受到抑制或死亡。
DOCK-AND-LOCK TM (DNL TM )
在优选的实施方案中，干扰素-抗体复合物以DOCK-AND-LOCKTM(DNLTM)复合物形式形成(参见例如美国专利No.7,521,056、7,527,787、7,534,866、7,550,143和7,666,400，其各自的实施例部分以引用的方式并入本文中)。一般来说，所述技术利用发生在cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)的调节(R)亚基的二聚化和停靠结构域(DDD)序列与源自多种AKAP蛋白中的任一者的锚定结构域(AD)序列之间的特异性和高亲和性结合相互作用(Baillie等，FEBSLetters.2005；579：3264；Wong和Scott，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004；5：959)。DDD和AD肽可连接至任何蛋白质、肽或其他分子。因为DDD序列自发地二聚化并结合于AD序列，所以所述技术允许在可连接至DDD或AD序列的任何所选分子之间形成复合物。
尽管标准的DNLTM复合物包含具有两个DDD连接分子连接至一个AD连接分子的三聚体，但复合物结构的变化允许形成二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体和其他多聚体。在一些实施方案中，DNLTM复合物可包含两个或更多个抗体、抗体片段或融合蛋白，其结合于相同的抗原决定簇或结合于两个或更多个不同的抗原。DNLTM复合物还可包含一个或多个其他效应子，例如蛋白质、肽、免疫调节剂、细胞因子、白细胞介素、干扰素、结合蛋白、肽配体、载体蛋白、毒素、核糖核酸酶如豹蛙酶(onconase)、抑制性寡核苷酸如siRNA、抗原或异种抗原、聚合物如PEG、酶、治疗剂、激素、细胞毒性剂、抗血管生成剂、促凋亡剂或任何其他分子或聚集体。
PKA在通过第二信使cAMP与R亚基的结合而触发的一个最佳研究的信号转导途径中起到关键作用，它于1968年首先从兔骨骼肌中分离出来(Walsh等，J.Biol.Chem.1968；243：3763)。全酶的结构由通过R亚基保持为非活性形式的两个催化亚基组成(Taylor，J.Biol.Chem.1989；264：8443)。发现PKA的同功酶具有两种类型的R亚基(RI和RII)，并且每一种类型具有α和β同工型(Scott，Pharmacol.Ther.1991；50：123)。因此，PKA调节亚基的四种同工型为RIα、RIβ、RIIα和RIIβ。所述R亚基已经仅以稳定的二聚体形式分离并且二聚化域已显示由RIIα的前44个氨基末端残基组成(Newlon等，Nat.Struct.Biol.1999；6：222)。如下文所讨论，其他调节亚基的氨基酸序列的类似部分涉及于二聚化和停靠中，各自位于调节亚基的N末端附近。cAMP与R亚基的结合导致活性催化亚基的广谱丝氨酸/苏氨酸激酶活性的释放，所述亚基通过其与AKAP一起停靠对PKA进行划分而定位于所选底物(Scott等，J.Biol.Chem.1990；265；21561)。
自从第一个AKAP即微管相关蛋白-2于1984年被表征以来(Lohmann等，Proc.Natl.Acad.Sci US A.1984；81：6723)，已在范围从酵母菌到人类的物种中鉴定结构多样的50种以上AKAP，其定位于各种亚细胞位点，包括质膜、肌动蛋白细胞骨架、细胞核、线粒体和内质网(Wong和Scott，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004；5：959)。用于PKA的AKAP的AD为具有14-18个残基的两亲性螺旋(Carr等，J.Biol.Chem.1991；266：14188)。单独的AKAP之间的AD的氨基酸序列极为不同，其中报道对于RII二聚体的结合亲和性范围为2至90nM(Alto等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2003；100：4445)。AKAP将仅结合于二聚R亚基。对于人类RIIα，AD结合于由23个氨基末端残基形成的疏水性表面(Colledge和Scott，Trends Cell Biol.1999；6：216)。因此，人类RIIα的二聚化结构域和AKAP结合域都定位于相同的N端44个氨基酸的序列内(Newlon等，Nat.Struct.Biol.1999；6：222；Newlon等，EMBO J.2001；20：1651)，其在本文称为DDD。
我们已经开发了如下平台技术，其中利用人类PKA调节亚基的DDD和AKAP的AD作为一对优秀的接头模块，用来停靠任何两个实体(下文称为A和B)成为非共价复合物，其可通过在DDD和AD的战略性位置引入半胱氨酸残基以促进二硫键形成而进一步锁定成为DNLTM复合物。所述方法的一般方法论如下。实体A由将DDD序列连接至A的前体而构建，由此获得第一个组成部分，下文称之为a。由于所述DDD序列将实现二聚体的自发形成，因此A将由a2组成。实体B是通过将AD序列连接至B的前体而构建，由此获得第二个组成部分，称之为b。a2中所含的DDD的二聚基序将产生用来与b中包含的AD序列结合的停靠位点，从而促进a2与b的预备缔合以形成由a2b组成的二元的三聚复合物。该结合事件由于随后通过二硫键桥共价地固定两个实体的反应而变得不可逆，由于初始结合相互作用应使位于DDD和AD上的反应性硫醇基位点特异性地靠近(Chmura等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2001；98：8480)以连接，根据有效性局部浓度的原理，该反应将高效发生。使用接头、适体模块和前体的各种组合，可产生并使用广泛多种具有不同化学计量的DNLTM构建体(参见例如美国专利No.7,550,143、7,521,056、7,534,866、7,527,787和7,666,400)。
通过将DDD和AD远离两种前体的功能性基团连接，这些位点特异性连接也预期保留这两种前体的原始活性。这种方法本质上为模块化的并且潜在可用于位点特异性和共价地连接广泛范围的物质，包括肽、蛋白质、抗体、抗体片段和具有广泛范围的活性的其他效应子部分。利用下文实施例中所述的构建AD和DDD轭合效应子的融合蛋白方法，可将实质上任何蛋白质或肽并入DNLTM构建体中。然而，该技术不受限制并且可利用其他轭合方法。
已知用于制造融合蛋白的多种方法，包括核酸合成、杂交和/或扩增以产生编码所感兴趣的融合蛋白的合成双链核酸。此类双链核酸可插入表达载体中，以供通过标准分子生物学技术产生融合蛋白(参见例如Sambrook等，Molecular Cloning，A laboratory manual，第2版，1989)。在这些优选的实施方案中，可将AD和/或DDD部分连接至效应蛋白或肽的N末端或C末端。然而，本领域技术人员将认识到，依据效应子部分的化学性质和效应子部分中涉及其生理活性的部分，在效应子部分上连接AD或DDD部分的位点可能不同。可使用本领域已知的技术来位点特异性连接多种效应子部分，例如使用双价交联试剂和/或其他化学轭合技术。
AD和DDD部分中的结构功能关系
对于不同类型的DNLTM构建体，可利用不同的AD或DDD序列。下文提供示例性DDD和AD序列。
DDD1
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：1)
DDD2
CGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：2)
AD1
QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：3)
AD2
CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(SEQ ID NO：4)
本领域技术人员将认识到，DDD1和DDD2是基于蛋白激酶A的人类RIIα同工型的DDD序列。然而，在可选的实施方案中，DDD和AD部分可能基于人类RIα形式的蛋白激酶A的DDD序列和相应的AKAP序列，如下文DDD3、DDD3C和AD3所例示。
DDD3
SLRECELYVQKHNIQALLKDSIVQLCTARPERPMAFLREYFERLEKEEAK(SEQID NO：5)
DDD3C
MSCGGSLRECELYVQKHNIQALLKDSIVQLCTARPERPMAFLREYFERLEKEEAK(SEQ ID NO：6)
AD3
CGFEELAWKIAKMIWSDVFQQGC(SEQ ID NO：7)
在其他可选的实施方案中，AD和/或DDD部分的其他序列变体可用于DNLTM复合物的构建。例如，存在人类PKA DDD序列的仅四种变体，对应于PKA RIα、RIIα、RIβ和RIIβ的DDD部分。RIIαDDD序列是上文公开的DDD1和DDD2的基础。下文示出四种人类PKADDD序列。DDD序列表示RIIα的残基1-44、RIIβ的残基1-44、RIα的残基12-61以及RIβ的残基13-66。(注意到DDD1的序列是从人类PKA RIIαDDD部分轻微修饰得到的。)
PKA RIα
SLRECELYVQKHNIQALLKDVSIVQLCTARPERPMAFLREYFEKLEKEEAK(SEQID NO：8)
PKA RIβ
SLKGCELYVQLHGIQQVLKDCIVHLCISKPERPMKFLREHFEKLEKEENRQILA(SEQ ID NO：9)
PKA RIIα
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVGQQPPDLVDFAVEYFTRLREARRQ(SEQ ID NO：10)
PKA RIIβ
SIEIPAGLTELLQGFTVEVLRHQPADLLEFALQHFTRLQQENER(SEQ ID NO：11)
AD与DDD结构域的结构功能关系是研究的主题。(参见例如Bums-Hamuro等，2005，Protein Sci14：2982-92；Carr等，2001，J BiolChem276：17332-38；Alto等，2003，Proc Natl Acad Sci USA100：4445-50；Hundsrucker等，2006，Biochem J396：297-306；Stokka等，2006，Biochem J400：493-99；Gold等，2006，Mol Cell24：383-95；Kinderman等，2006，Mol Cell24：397-408，其各自的全部内容以引用的方式并入本文中。)
例如，Kinderman等(2006，Mol Cell24：397-408)研究了AD-DDD结合相互作用的晶体结构并推断出人类DDD序列含有多个在二聚体形成或AKAP结合中重要的保守氨基酸残基，下文SEQ ID NO：1中以下划线标出。(参见Kinderman等，2006的图1，以引用的方式并入本文中。)本领域技术人员将认识到，在设计DDD序列的序列变体时，人们会期望避免改变任何带下划线的残基，而可对对于二聚化和AKAP结合不太重要的残基作出保守氨基酸取代。
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：1)
如下文更详细讨论，已对二十种常见L-氨基酸各自表征了保守氨基酸取代。因此，根据Kinderman(2006)的数据和保守氨基酸取代，基于SEQ ID NO：1的潜在的可选DDD序列示于表1中。在设计的表1中，仅考虑了高度保守的氨基酸取代。例如，仅用带电残基取代具有相同电荷的残基，用具有类似尺寸的残基取代具有小的侧链的残基，仅用其他羟基取代羟基侧链等。由于脯氨酸对于氨基酸二级结构的独特作用，脯氨酸未被其他残基取代。有限数目的这些潜在的可选DDD部分序列示于下文SEQ ID NO：12至SEQ ID NO：31中。本领域技术人员将认识到，可以利用标准技术，例如使用市售的肽合成器或众所周知的定点诱变技术来构建DDD部分类别内几乎不受限制的数目的可选物质。还可通过标准结合测定法容易地确定氨基酸取代对于AD部分结合的作用，例如如Alto等(2003，Proc Natl Acad Sci USA100：4445-50)中所公开。
表1.DDD1(SEQ ID NO：1)中的保守氨基酸取代。共同序列公开为SEQ ID NO：87。
THIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：12)
SKIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFFRLREARA(SEQ ID NO：13)
SRIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：14)
SHINIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：15)
SHIQIPPALTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：16)
SHIQIPPGLSELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：17)
SHIQIPPGLTDLLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：18)
SHIQIPPGLTELLNGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：19)
SHIQIPPGLTELLQAYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：20)
SHIQIPPGLTELLQGYSVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：21)
SHIQIPPGLTELLQGYTVDVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：22)
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLKQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：23)
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRNQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：24)
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQNPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：25)
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPELVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：26)
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVDFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：27)
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFLVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：28)
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFIVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：29)
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFVVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：30)
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVDYFTRLREARA(SEQ ID NO：31)
Alto等(2003，Proc Natl Acad Sci USA100：4445-50)对各种AKAP蛋白的AD序列进行生物信息学分析以设计被称为AKAP-IS的RII选择性AD序列(SEQ ID NO：3)，其中DDD的结合常数为0.4nM。AKAP-IS序列被设计为结合于PKA的AKAP的肽拮抗剂。下文在SEQ ID NO：3中用下划线标出了AKAP-IS序列中倾向于减少与DDD结合的取代的残基。本领域技术人员将认识到，在设计AD序列的序列变体时，人们会期望避免改变任何带下划线的残基，而可对对于DDD结合不太重要的残基作出保守氨基酸取代。表2示出了AKAP-IS序列(AD1，SEQ ID NO：3)中的潜在保守氨基酸取代，与上文表1中关于DDD1(SEQ ID NO：1)所示类似。
下文SEQ ID NO：32至SEQ ID NO：49示出了有限数目的这些潜在的可选AD部分序列。此外，本领域技术人员可基于Alto等(2003)的数据制造、测试和使用可能的AD部分序列类别内相当大数目的物质。注意到，Alto(2003)的图2示出了可基于实际结合实验制造并且同时保持与DDD部分的结合活性的甚至很大数目的潜在的氨基酸取代。
AKAP-IS
QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：3)
表2.AD1(SEQ ID NO：3)中的保守氨基酸取代。共同序列公开为SEQ ID NO：88。
NIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：32)
QLEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：33)
QVEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：34)
QIDYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：35)
QIEFLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：36)
QIETLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：37)
QIESLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：38)
QIEYIAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：39)
QIEYVAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：40)
QIEYLARQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：41)
QIEYLAKNIVDNAIQQA(SEQ ID NO：42)
QIEYLAKQIVENAIQQA(SEQ ID NO：43)
QIEYLAKQIVDQAIQQA(SEQ ID NO：44)
QIEYLAKQIVDNAINQA(SEQ ID NO：45)
QIEYLAKQIVDNAIQNA(SEQ ID NO：46)
QIEYLAKQIVDNAIQQL(SEQ ID NO：47)
QIEYLAKQIVDNAIQQI(SEQ ID NO：48)
QIEYLAKQIVDNAIQQV(SEQ ID NO：49)
Gold等(2006，Mol Cell24：383-95)利用结晶学和肽筛选来开发SuperAKAP-IS序列(SEQ ID NO：50)，展现PKA的RII同工型相比于RI同工型的选择性高五个数量级。未加下划线的残基指示氨基酸取代相对于AKAP-IS序列的位置，其增加了与RIIα的DDD部分的结合。在这个序列中，N端Q残基被编号为残基编号4，而C端A残基为残基编号20。可进行取代以影响对于RIIα的亲和性的残基为残基8、11、15、16、18、19和20(Gold等，2006)。预期在某些可选的实施方案中，可用SuperAKAP-IS序列取代AKAP-IS AD部分序列来制备DNLTM构建体。可取代AKAP-IS AD序列的其他可选的序列示于SEQ ID NO：51-53中。相对于AKAP-IS序列的取代经下划线标出。可以预料到，与SEQ ID NO：4中所示的AD2序列一样，AD部分还可包括其他的N端残基半胱氨酸和甘氨酸以及C端残基甘氨酸和半胱氨酸。
SuperAKAP-IS
QIEYVAKQIVDYAIHQA(SEQ ID NO：50)
可选的AKAP序列
QIEYKAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO：51)
QIEYHAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO：52)
QIEYVAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO：53)
Gold等的图2公开了来自多种AKAP蛋白的其他DDD结合序列，示于下文。
RII特异性AKAP
AKAP-KL
PLEYQAGLLVQNAIQQAI(SEQ ID NO：54)
AKAP79
LLIETASSLVKNAIQLSI(SEQ ID NO：55)
AKAP-Lbc
LIEEAASRIVDAVIEQVK(SEQ ID NO：56)
RI-特异性AKAP
AKAPce
ALYQFADRFSELVISEAL(SEQ ID NO：57)
RIAD
LEQVANQLADQIIKEAT(SEQ ID NO：58)
PV38
FEELAWKIAKMIWSDVF(SEQ ID NO：59)
双重特异性AKAP
AKAP7
ELVRLSKRLVENAVLKAV(SEQ ID NO：60)
MAP2D
TAEEVSARIVQVVTAEAV(SEQ ID NO：61)
DAKAP1
QIKQAAFQLISQVILEAT(SEQ ID NO：62)
DAKAP2
LAWKIAKMIVSDVMQQ(SEQ ID NO：63)
Stokka等(2006，Biochem J400：493-99)也开发了结合于PKA的AKAP的肽竞争物，示于SEQ ID NO：64-66中。将肽拮抗剂指定为Ht31(SEQ ID NO：64)、RIAD(SEQ ID NO：65)和PV-38(SEQ IDNO：66)。Ht-31肽展现对于PKA的RII同工型的亲和性更大，而RIAD和PV-38显示对RI的亲和性更高。
Ht31
DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGAY(SEQ ID NO：64)
RIAD
LEQYANQLADQIIKEATE(SEQ ID NO：65)
PV-38
FEELAWKLAKMIWSDVFQQC(SEQ ID NO：66)
Hundsrucker等(2006，Biochem J396：297-306)开发了结合于PKA的AKAP的其他肽竞争物，对于PKA的RII形式的DDD的结合常数低至0.4nM。各种AKAP拮抗性肽的序列提供于Hundsrucker等的表1中，下文再现于表3中。AKAPIS表示合成RII亚基结合肽。所有其他肽都源自所示AKAP的RII结合域。
表3.AKAP肽序列
下文通过对于AKAP IS序列(SEQ ID NO：3)加下划线来指示在不同的AKAP蛋白的AD结构域中高度保守的残基。所述残基与Alto等(2003)所观察的一样，其中添加了C端丙氨酸残基。(参见Hundsrucker等(2006)的图4，以引用的方式并入本文中。)对于RIIDDD序列具有特别高亲和性的肽拮抗剂的序列为AKAP-IS、AKAP7δ-wt-pep、AKAP7δ-L304T-pep和AKAP7δ-L308D-pep的序列。
AKAP-IS
QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：3)
Carr等(2001，J Biol Chem276：17332-38)研究了来自人类和非人类蛋白质的不同的AKAP结合DDD序列之间的序列同源性程度，并且鉴定出在不同的DDD部分中似乎最高度保守的DDD序列中的残基。这些在下文通过关于SEQ ID NO：1的人类PKA RIIαDDD序列加下划线来指示。特别保守的残基进一步通过斜体指示。所述残基与Kinderman等(2006)提出对于结合至AKAP蛋白来说重要的那些残基重叠、但不相同。本领域技术人员将认识到，在设计DDD的序列变体时，最优选的是避免改变最保守的残基(斜体化)，并且还优选避免改变保守残基(加下划线)，而可考虑对于既未加下划线又非斜体的残基进行保守氨基酸取代。
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：1)
基于Carr等(2001)的数据的DDD1(SEQ ID NO：1)序列的一组经过修饰的保守氨基酸取代示于表4中。即使通过这组减少的被取代序列，仍存在65,000种以上可由本领域技术人员在无过多实验下而产生、测试和使用的可能的可选DDD部分序列。本领域技术人员可容易地得到如上文表1和表2所公开的这些可选的DDD氨基酸序列。
表4.DDD1(SEQ ID NO：1)中的保守氨基酸取代。共同序列公开为SEQ ID NO：89。
本领域技术人员将认识到，使用本领域中的标准技术和仅通过常规实验，在DDD或AD氨基酸序列中的这些和其他氨基酸取代可用于产生在AD或DDD部分类别内的可选物质。
干扰素和其他免疫调节剂
在某些优选的实施方案中，效应子部分为免疫调节剂。免疫调节剂为一种当存在时可改变、抑制或刺激身体的免疫系统的剂。使用的免疫调节剂可包括细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、血细胞生成因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、促红细胞生成素、血小板生成素和其组合。特别有用的是淋巴毒素如肿瘤坏死因子(TNF)、血细胞生成因子如白细胞介素(IL)、集落刺激因子如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素如干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ或干扰素-λ，以及干细胞生长因子如称为“S1因子”者。
在更优选的实施方案中，效应子部分为细胞因子，例如淋巴因子、单核因子、生长因子和传统多肽激素。细胞因子包括生长激素如人类生长激素、N-甲硫氨酰人类生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素如卵泡刺激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体生成素(LH)；胎盘生长因子(PIGF)、肝生长因子；前列腺素、成纤维细胞生长因子；泌乳素；胎盘催乳激素、OB蛋白；肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β；苗勒抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神经生长因子如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和胰岛素样生长因子-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素如干扰素-α、干扰素-β、干扰素-λ和干扰素-λ；集落刺激因子(CSF)如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；白细胞介素(IL)如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、LIF、kit配体或FLT-3、血管抑制素、血小板反应蛋白、内皮抑制素、肿瘤坏死因子(TNF，例如TNF-α)和LT。在一个特别优选的实施方案中，细胞因子为IFN-α2b。
蛋白质或肽免疫调节剂如细胞因子的氨基酸序列是本领域众所周知的，并且可在本发明的实践中使用任何这样的已知序列。本领域技术人员了解细胞因子序列的公共信息的多种来源。例如，NCBI数据库包含大量细胞因子和免疫调节剂的蛋白质和编码核酸序列，例如促红细胞生成素(GenBank NM000799)、IL-1β(GenPept AAH08678)、GM-CSF(GenPept AAA52578)、TNF-α(GenPept CAA26669)、干扰素-α(GenPept AAA52716.1)、干扰素-α2b(GenPept AAP20099.1)、干扰素-λ(GenPept30G6_B；3HHC_A；3HHC_B；3HHC_C；3HHC_D；EAW56870.1；EAW56869.1；AAI40873.1)以及实质上任何上文所列的肽或蛋白质免疫调节剂。鉴定基本上任何所感兴趣蛋白质或肽效应子部分的适当的氨基酸和/或核酸序列是本领域技术人员的例行事务。细胞因子的商业来源也可获得并且可使用，例如全长人类IFN-α2bcDNA克隆(Invitrogen Ultimate ORF人类克隆目录#HORF01克隆IDIOH35221)。
抗体
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段可并入DNLTM构建体中，例如通过将抗体或片段连接至干扰素或其他细胞因子以供细胞因子靶向递送。任何已知的抗体或其抗原结合片段可并入DNLTM构建体中。在优选的实施方案中，将复合物用于癌症疗法并且抗体结合于肿瘤相关抗原(TAA)。多种肿瘤相关抗原是本领域中已知的，包括(但不限于)碳酸酐酶IX、CCCL19、CCCL21、CSAp、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、AFP、PSMA、CEACAM5、CEACAM6、B7、纤维连接蛋白的ED-B、因子H、FHL-1、Flt-3、叶酸受体、GROB、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF)、HM1.24、胰岛素样生长因子-1(ILGF-1)、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、IP-10、MAGE、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-13、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5a、PAM4抗原、NCA-95、NCA-90、Ia、HM1.24、EGP-1、EGP-2、HLA-DR、腱生蛋白(tenascin)、Le(y)、RANTES、T101、TAC、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、TNF-α、TRAIL受体(R1和R2)、VEGFR、EGFR、PlGF、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5以及致癌基因产物。其他类型的靶抗原可用于不同疾病状态的基于抗体的疗法并且可利用合并有靶向任何这类可选抗原的抗体的DNLTM构建体。
可用于DNLTM构建体中的示例性抗癌抗体包括(但不限于)hR1(抗IGF-1R，美国临时专利申请序列No.61/145,896，提交于1/20/09)、hPAM4(抗MUC1，美国专利No.7,282,567)、hA20(抗CD20，美国专利No.7,251,164)、hA19(抗CD19，美国专利No.7,109,304)、hIMMU-31(抗AFP，美国专利No.7,300,655)、hLL1(抗CD74，美国专利No.7,312,318)、hLL2(抗CD22，美国专利No.7,074,403)、hMu-9(抗CSAp，美国专利No.7,387,773)、hL243(抗HLA-DR，美国专利No.7,612,180)、hMN-14(抗CEACAM5，美国专利No.6,676,924)、hMN-15(抗CEACAM6，美国专利申请No.10/672,278)、hRS7(抗EGP-1，美国专利No.7,238,785)和hMN-3(抗CEA，美国专利No.7,541,440)，每个所引用专利或申请的实施例部分以引用的方式并入本文中。本领域技术人员将认识到，这个列表不具限制性并且可将任何其他已知的抗TAA抗体并入DNLTM构建体中。
抗原结合抗体片段是本领域中众所周知的，例如F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab、Fv、scFv等，并且可使用任何此类已知的片段。如本文所用，抗原结合抗体片段是指结合可被完整或亲本抗体识别的相同抗原的抗体的任何片段。已知用于制备实质上任何所感兴趣的抗体或片段的AD和/或DDD轭合物的技术(例如，美国专利No.7,527,787)。
可使用的未轭合于治疗剂的抗体或其片段被称为“裸”抗体或其片段。在可选的实施方案中，可将抗体或片段轭合于一种或多种治疗剂和/或诊断剂。在本领域中已知广泛多种此类治疗剂和诊断剂，如下文更详细讨论，并且可使用任何此类已知的治疗剂或诊断剂。
用于制备抗实质上任何靶抗原的单克隆抗体的技术是本领域中众所周知的。参见例如Kohler和Milstein，Nature256：495(1975)；以及Coligan等(编)，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，第1卷，第2.5.1-2.6.7页(John Wiley&Sons 1991)。简要来说，可通过以下获得单克隆抗体：向小鼠中注射包含抗原的组合物，移出脾脏以获得B淋巴细胞，将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤，克隆所述杂交瘤，选择产生针对抗原的抗体的阳性克隆，培养所述产生针对抗原的抗体的克隆，以及将所述抗体从杂交瘤培养物中分离出来。
可通过多种完善的技术将MAb从杂交瘤培养物中分离和纯化。此类分离技术包括使用蛋白A琼脂糖的亲和色谱法、尺寸排阻色谱法和离子交换色谱法。参见例如Coligan的第2.7.1-2.7.12页和第2.9.1-2.9.3页。此外，参见Baines等，″Purification ofImmunoglobulin G(IgG)，″METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，第10卷，第79-104页(The Humana Press，Inc.1992)。
在初始产生针对免疫原的抗体以后，可将抗体测序然后通过重组技术制备。本领域技术人员众所周知鼠类抗体和抗体片段的人源化和嵌合化。使用源自人源化、嵌合或人类抗体的抗体组成部分排除了与鼠类恒定区的免疫原性相关的潜在问题。
嵌合抗体
嵌合抗体是一种重组蛋白，其中人类抗体的可变区已经被例如小鼠抗体的可变区(包括小鼠抗体的互补决定区(CDR))置换。当施用于受试者时，嵌合抗体展现出免疫原性降低和稳定性增加。克隆鼠类免疫球蛋白可变结构域的一般技术公开于例如Orlandi等，Proc.Nat′lAcad.Sci.USA86：3833(1989)中。本领域技术人员众所周知构建嵌合抗体的技术。例如，Leung等，Hybridoma13：469(1994)中，通过将编码鼠类LL2(一种抗CD22单克隆抗体)的Vκ和VH结构域的DNA序列与相应的人类κ和IgG1恒定区结构域组合而产生LL2嵌合体。
人源化抗体
用于产生人源化MAb的技术是本领域中众所周知的(参见例如Jones等，Nature321：522(1986)；Riechmann等，Nature332：323(1988)；Verhoeyen等，Science239：1534(1988)；Carter等，Proc.Nat′lAcad.Sci.USA89：4285(1992)；Sandhu，Crit.Rev.Biotech.12：437(1992)；以及Singer等，J.Immun.150：2844(1993))。可通过将小鼠免疫球蛋白的重可变链和轻可变链的小鼠CDR转移到人类抗体的相应可变结构域来将嵌合或鼠类单克隆抗体人源化。嵌合单克隆抗体中的小鼠框架区(FR)也被人类FR序列置换。由于简单地将小鼠CDR转移到人类FR中经常导致抗体亲和性的降低甚至丧失，因此可能需要额外的修饰以恢复鼠类抗体的原始亲和性。这可通过将FR区中的一个或多个人类残基置换为其鼠类对应物而获得对其表位具有良好结合亲和性的抗体而实现。参见例如Tempest等，Biotechnology9：266(1991)和Verhoeyen等，Science239：1534(1988)。通常，与鼠类对应物不同并且位于接近或接触一个或多个CDR氨基酸残基的人类FR氨基酸残基将成为取代的候选者。
人类抗体
使用组合方法或以人类免疫球蛋白基因座转化的转基因动物产生完全人类抗体的方法是本领域中已知的(例如，Mancini等，2004，New Microbiol.27：315-28；Conrad和Scheller，2005，Comb.Chem.HighThroughput Screen.8：117-26；Brekke和Loset，2003，Curr.Opin.Phamacol.3：544-50)。完全人类抗体也可以由基因或染色体转染方法以及嗜菌体展示技术构建，所述技术都是本领域中已知的。参见例如McCafferty等，Nature348：552-553(1990)。此类完全人类抗体预期展现比嵌合或人源化抗体更少的副作用，并在体内发挥基本上内源人类抗体的功能。在某些实施方案中，所要求保护的方法和程序可利用通过此类技术产生的人类抗体。
在另一种情况下，可使用噬菌体展示技术生成人类抗体(例如，Dantas-Barbosa等，2005，Genet.Mol.Res.4：126-40)。可从正常人类或展现出特定疾病状态如癌症的人类生成人类抗体(Dantas-Barbosa等，2005)。从患病的个体构建人类抗体的优点在于循环抗体库可能偏爱抗疾病相关抗原的抗体。
在这种方法的一个非限制性实例中，Dantas-Barbosa等(2005)构建了来自骨肉瘤患者的人类Fab抗体片段的噬菌体展示文库。通常，总RNA由循环血液淋巴细胞获得(同上)。从μ、γ和κ链的抗体库克隆重组Fab并插入噬菌体展示文库中(同上)。将RNA转化为eDNA并用于使用针对重链和轻链免疫球蛋白序列的特异性引物产生FabcDNA文库(Marks等，1991，J.Mol.Biol.222：581-97)。根据Andris-Widhopf等(2000，在Phage Display Laboratory Manual中，Barbas等(编)，第1版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，第9.1至9.22页)进行文库的构建。使用限制性核酸内切酶消化最终Fab片段并插入噬菌体基因组来生成噬菌体展示文库。可通过如本领域中已知的标准噬菌体展示方法来筛选所述文库(参见例如Pasqualini和Ruoslahti，1996，Nature380：364-366；Pasqualini，1999，The Quart.J.Nuel.Med.43：159-162)。
噬菌体展示可以多种格式进行，其综述参见例如Johnson和Chiswell，Current Opinion in Structural Biology3：5564-571(1993)。也可通过体外活化的B细胞生成人类抗体。参见美国专利No.5,567,610和5,229,275，通过全文引用的方式并入本文中。本领域技术人员将认识到，这些技术是示例性的，并且可利用任何已知的用于制备和筛选人类抗体或抗体片段的方法。
在另一种可选情况下，可利用标准免疫方案，使用已被遗传工程化以产生人类抗体的转基因动物生成抗基本上任何免疫原性靶标的抗体。从转基因小鼠中获得人类抗体的方法公开于Green等，NatureGenet.7：13(1994)；Lonberg等，Nature368：856(1994)；以及Taylor等，Int.Immun.6：579(1994)中。此种系统的一个非限制性实例为来自Abgenix(Fremont，CA)的(例如，Green等，1999，J.Immunol.Methods231：11-23)。在和类似的动物中，小鼠抗体基因已被灭活并以功能性人类抗体基因替代，而小鼠免疫系统的其余部分保持完整。
使用含有人类IgH和Igκ基因座的部分(包括大多数可变区序列以及辅助基因和调控序列)的生殖系构造的YAC(酵母菌人造染色体)转化。人类可变区库可用于生成产生抗体的B细胞，其可通过已知技术处理成为杂交瘤。利用靶抗原免疫的通过正常免疫反应将产生人类抗体，其可通过上文讨论的标准技术采集和/或制备。多种品系是可用的，每一种都能够产生不同种类的抗体。转基因产生的人类抗体已显示具有治疗潜力，同时保持正常人类抗体的药物动力学性质(Green等，1999)。本领域技术人员将认识到，所要求保护的组合物和方法不限于使用系统，而可利用已被遗传工程化以产生人类抗体的任何转基因动物。
抗体片段
可通过已知技术生成识别特异性表位的抗体片段。抗体片段为抗体的抗原结合部分，例如F(ab′)2、Fab′、F(ab)2、Fab、Fv、sFv等。F(ab′)2片段可由胃蛋白酶消化抗体分子而产生，而Fab′片段可通过还原F(ab′)2片段的二硫键而生成。可选地，可构建Fab′表达文库(Huse等，1989，Science，246：1274-1281)以允许对具有所需特异性的单克隆Fab′片段进行迅速和简易的鉴定。F(ab)2片段可由木瓜蛋白酶消化抗体而生成，而Fab片段可由还原二硫键获得。
单链Fv分子(scFv)包含VL结构域和VH结构域。VL和VH结构域缔合形成靶标结合位点。这两个结构域进一步通过肽接头(L)共价连接。制备scFv分子和设计合适的肽接头的方法在以下描述：美国专利No.4,704,692；美国专利No.4,946,778；R.Raag和M.Whitlow，″Single Chain Fvs.″FASEB第9卷：73-80(1995)；以及R.E.Bird和B.W.Walker，″Single Chain Antibody Variable Regions，″TIBTECH，第9卷：132-137(1991)。
用于产生单结构域抗体(DAB)的技术也在本领域中已知，例如在以引用的方式并入本文中的Cossins等(2006，Prot Express Purif51：253-259)中所公开。
可通过将全长抗体蛋白水解或在大肠杆菌(E.coli)或另一种宿主中表达编码抗体片段的DNA来制备抗体片段。可通过常规方法使用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化全长抗体而获得抗体片段。这些方法已被描述在例如Goldenberg的美国专利No.4,036,945和4,331,647以及其中所含的参考文献中。此外，参见Nisonoff等，Arch Biochem.Biophys.89：230(1960)；Porter，Biochem.J.73：119(1959)；Edelman等，METHODS IN ENZYMOLOGY，第1卷，第422页(Academic Press1967)；以及Coligan的第2.8.1-2.8.10页和第2.10.-2.10.4页。
已知抗体
可从广泛多种已知来源商购获得所用抗体。例如，由美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)可获得多种抗体分泌性杂交瘤细胞系。大量的针对各种疾病靶标(包括但不限于肿瘤相关抗原)的抗体已在ATCC中保藏和/或已公开了可变区序列并可用于所要求保护的方法和组合物中。参见例如美国专利No.7,312,318；7,282,567；7,151,164；7,074,403；7,060,802；7,056,509；7,049,060；7,045,132；7,041,803；7,041,802；7,041,293；7,038,018；7,037,498；7,012,133；7,001,598；6,998,468；6,994,976；6,994,852；6,989,241；6,974,863；6,965,018；6,964,854；6,962,981；6,962,813；6,956,107；6,951,924；6,949,244；6,946,129；6,943,020；6,939,547；6,921,645；6,921,645；6,921,533；6,919,433；6,919,078；6,916,475；6,905,681；6,899,879；6,893,625；6,887,468；6,887,466；6,884,594；6,881,405；6,878,812；6,875,580；6,872,568；6,867,006；6,864,062；6,861,511；6,861,227；6,861,226；6,838,282；6,835,549；6,835,370；6,824,780；6,824,778；6,812,206；6,793,924；6,783,758；6,770,450；6,767,711；6,764,688；6,764,681；6,764,679；6,743,898；6,733,981；6,730,307；6,720,155；6,716,966；6,709,653；6,693,176；6,692,908；6,689,607；6,689,362；6,689,355；6,682,737；6,682,736；6,682,734；6,673,344；6,653,104；6,652,852；6,635,482；6,630,144；6,610,833；6,610,294；6,605,441；6,605,279；6,596,852；6,592,868；6,576,745；6,572,856；6,566,076；6,562,618；6,545,130；6,544,749；6,534,058；6,528,625；6,528,269；6,521,227；6,518,404；6,511,665；6,491,915；6,488,930；6,482,598；6,482,408；6,479,247；6,468,531；6,468,529；6,465,173；6,461,823；6,458,356；6,455,044；6,455,040；6,451,310；6,444,206；6,441,143；6,432,404；6,432,402；6,419,928；6,413,726；6,406,694；6,403,770；6,403,091；6,395,276；6,395,274；6,387,350；6,383,759；6,383,484；6,376,654；6,372,215；6,359,126；6,355,481；6,355,444；6,355,245；6,355,244；6,346,246；6,344,198；6,340,571；6,340,459；6,331,175；6,306,393；6,254,868；6,187,287；6,183,744；6,129,914；6,120,767；6,096,289；6,077,499；5,922,302；5,874,540；5,814,440；5,798,229；5,789,554；5,776,456；5,736,119；5,716,595；5,677,136；5,587,459；5,443,953；5,525,338。这些仅为示例性的并且在本领域中已知广泛多种其他抗体和其杂交瘤。本领域技术人员将认识到，可通过ATCC、NCBI和/或USPTO数据库中简单搜索针对所感兴趣的所选疾病相关靶标的抗体而获得针对几乎任何疾病相关抗原的抗体序列或抗体分泌性杂交瘤。使用本领域中众所周知的标准技术，可将克隆抗体的抗原结合结构域扩增，剪切，连接进入表达载体，转染进入适应宿主细胞并用于产生蛋白质。
可用于所要求保护的方法和组合物的范围内的癌症疗法的特定抗体包括(但不限于)LL1(抗CD74)、依帕珠单抗(LL2)和RFB4(抗CD22)、RS7(抗上皮糖蛋白-1(EGP-1)或抗TROP-2)、PAM4和KC4(都是抗粘蛋白)、MN-14(抗癌胚抗原(CEACAM5，也称为CD66e)、Mu-9(抗结肠特异性抗原-p)、Immu-31(抗α-甲胎蛋白)、抗TAG-72(例如CC49)、抗Tn、J591或HuJ591(抗PSMA(前列腺特异性膜抗原))、AB-PG1-XG1-026(抗PSMA二聚体)、D2/B(抗PSMA)、G250(抗碳酸酐酶IX)、hL243(抗HLA-DR)、阿仑单抗(抗CD52)、贝伐单抗(抗VEGF)、西妥昔单抗(抗EGFR)、吉妥珠单抗(抗CD33)、替伊莫单抗(抗CD20)；帕尼单抗(抗EGFR)；利妥昔单抗(抗CD20)；托西莫单抗(抗CD20)；GA101(抗CD20)；维妥珠单抗(抗CD20)，以及曲妥珠单抗(抗ErbB2)。这些抗体是本领域中已知的(例如，美国专利No.5,686,072、5,874,540、6,107,090、6,183,744、6,306,393、6,653,104、6,730.300、6,899,864、6,926,893、6,962,702、7,074,403、7,230,084、7,238,785、7,238,786、7,256,004、7,282,567、7,300,655、7,312,318、7,585,491、7,612,180、7,642,239；和美国专利申请公开No.20040202666(现已弃权)、20050271671和20060193865；各文献的实施例部分以引用的方式并入本文中)。使用的具体已知抗体包括hPAM4(美国专利No.7,282,567)、hA20(美国专利No.7,251,164)、hA19(美国专利No.7,109,304)、hIMMU31(美国专利No.7,300,655)、hLL1(美国专利No.7,312,318)、hLL2(美国专利No.7,074,403)、hMu-9(美国专利No.7,387,773)、hL243(美国专利No.7,612,180)、hMN-14(美国专利No.6,676,924)、hMN-15(美国专利No.7,541,440)、hR1(美国专利申请12/772,645)、hRS7(美国专利No.7,238,785)、hMN-3(美国专利No.7,541,440)、AB-PG1-XG1-026(美国专利申请11/983,372，以ATCC PTA-4405和PTA-4406存放)和D2/B(WO2009/130575)，每个所述专利或申请的全文以关于附图和实施例部分进行引用的方式并入本文中。
抗TNF-α抗体是本领域中已知的并且可用于治疗免疫疾病，例如哮喘。已知的针对TNF-α的抗体包括人类抗体CDP571(Ofei等，2011，Diabetes45：881-85)；鼠类抗体MTNFAI、M2TNFAI、M3TNFAI、M3TNFABI、M302B和M303(Thermo Scientific，Rockford，IL)；英利昔单抗(Centocor，Malvern，PA)；聚乙二醇化赛妥珠单抗(UCB，Brussels，Belgium)；以及阿达木单抗(Abbott，Abbott Park，IL)。这些和许多其他的已知抗TNF-α抗体可用于所要求保护的方法和组合物中。使用的其他抗体包括(但不限于)抗B细胞抗体，例如维妥珠单抗、依帕珠单抗、米拉珠单抗或hL243；托珠单抗(抗IL-6受体)；巴利昔单抗(抗CD25)；达利珠单抗(抗CD25)；依法珠单抗(抗CD11a)；莫罗单抗-CD3(抗CD3受体)；抗CD40L(UCB，Brussels，Belgium)；那他珠单抗(抗α4整合素)和奥马珠单抗(抗IgE)。
巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)是先天性和适应性免疫性和细胞凋亡的重要调节因子。已经报道了CD74是MIF的内源受体(Leng等，2003，J Exp Med197：1467-76)。拮抗性抗CD74抗体对于MIF介导的细胞内途径的治疗作用可用于治疗广泛多种疾病状态，例如膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌和慢性淋巴细胞性白血病(例如，Meyer-Siegler等，2004，BMC Cancer12：34；Shachar和Haran，2011，Leuk Lymphoma52：1446-54)；肾病，例如肾脏同种异体移植排斥反应(Lan，2008，Nephron Exp Nephrol.109：e79-83)；以及众多的发炎性疾病(Meyer-Siegler等，2009，Mediators Inflamm，电子出版于2009年3月22日；Takahashi等，2009，Respir Res10：33)。米拉珠单抗(hLL1)是具有用于治疗MIF介导性疾病的治疗用途的示例性抗CD74抗体。
本发明的药物组合物可用于治疗具有神经退化性疾病如阿尔茨海默氏病的受试者。巴匹珠单抗正处于阿尔茨海默氏病治疗的临床试验中。建议用于阿尔茨海默氏病治疗的其他抗体包括Alz50(Ksiezak-Reding等，1987，J Biol Chem263：7943-47)、更汀芦单抗和苏兰珠单抗。英利昔单抗(一种抗TNF-α抗体)已经被报道可减少淀粉样蛋白斑块和提高认知。由于CD74在阿尔茨海默氏病患者大脑的神经原纤维缠结中表达(Bryan等，Mol Neurodegeneration2008；3：13)，因此CD74是通过单独使用的抗CD74拮抗肽或抗体或通过如本文所述的DNL构建体以轭合物形式使用来治疗这种疾病的另一种靶标。
可使用的其他抗体包括针对感染性疾病病原体如细菌、病毒、支原体或其他病原体的抗体。许多针对这些感染性病原体的抗体是本领域中已知的并且任何这种已知的抗体都可用于所要求保护的方法和组合物中。例如，针对人类免疫缺陷病毒I(HIV-1)的gp120糖蛋白抗原的抗体是已知的，并且某些这种抗体可以在人类中具有免疫保护作用。参见例如Rossi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.86：8055-8058，1990。已知的抗HIV抗体包括由Johansson等(AIDS.2006年10月3日；20(15)：1911-5)描述的抗包膜抗体，以及由Polymun(Vienna，Austria)描述和销售的抗HIV抗体，其还描述于美国专利5,831,034、美国专利5,911,989，以及Vcelar等，AIDS2007；21(16)：2161-2170和Joos等，Antimicrob.Agents Chemother.2006；50(5)：1773-9中，全部都以引用的方式并入本文中。
针对疟疾寄生虫的抗体可以针对子孢子、裂殖子、裂殖体和配子体阶段。已生成针对子孢子(环子孢子抗原)的单克隆抗体，并且已显示其在体外和啮齿动物中可中和子孢子(N.Yoshida等，Science207：71-73，1980)。若干团队已经开发了弓形虫抗体，弓形虫是弓形虫病中所涉及的原生动物寄生虫(Kasper等，J.Immunol.129：1694-1699，1982；同上，30：2407-2412，1983)。已开发了针对童虫表面抗原的抗体并且已发现其在体内或体外作用于童虫(Simpson等，Parasitology，83：163-177，1981；Smith等，Parasitology，84：83-91，1982；Gryzch等，J.Immunol.，129：2739-2743，1982：Zodda等，J.Immunol.129：2326-2328，1982；Dissous等，J.immunol.，129：2232-2234，1982)。
克氏锥虫是美洲锥虫病的病原体，并且通过吸血的猎蝽昆虫传播。已生成了在体外特异性抑制寄生虫的一种形式至另一种形式(上鞭毛体至锥鞭毛体阶段)的分化并且与细胞表面糖蛋白反应的抗体；然而，寄生虫的哺乳动物(血流)形式不存在这种抗原(Sher等，Nature，300：639-640，1982)。
抗真菌抗体是本领域中已知的，例如抗菌核病抗体(美国专利7,910,702)；抗葡萄糖醛酸木糖甘露聚糖抗体(Zhong和Priofski，1998，Clin Diag Lab Immunol5：58-64)；抗念珠菌属抗体(Matthews和Burnie，2001，2：472-76)；以及抗鞘糖脂抗体(Toledo等，2010，BMC Microbiol10：47)。
已经开发了针对大多数在人类中造成大部分感染的微生物(细菌、病毒、原生动物、真菌、其他寄生虫)的合适抗体，并且许多已先前用于体外诊断目的。可通过常规方法生成的这些抗体和更新型抗体适用于本发明中。
抗体异型
治疗性抗体的免疫原性与输液反应风险增加和治疗反应持续时间减少相关(Baert等，2003，N Engl J Med348：602-08)。可通过抗体的异型部分地测定治疗性抗体在宿主中诱发免疫反应的程度(Stickler等，2011，Genes and Immunity12：213-21)。抗体异型与抗体的恒定区序列中特定位置的氨基酸序列变化有关。包含重链γ型恒定区的IgG抗体的异型称为Gm异型(1976，J Immunol117：1056-59)。
对于常见的IgG1人类抗体，最普遍的异型为G1m1(Stickler等，2011，Genes and Immunity12：213-21)。然而，在白种人中也频繁出现G1m3异型(同上)。已经报道了G1m1抗体含有异型序列，当施用于非G1m1(nG1m1)接受体如G1m3患者时，所述异型序列倾向于诱发免疫反应(同上)。当施用于G1m1患者时，非G1m1异型抗体并非呈免疫原性(同上)。
人类G1m1异型在重链IgG1的CH3序列中包含在Kabat位置356的氨基酸天冬氨酸和在Kabat位置358的亮氨酸。nG1m1异型包含在Kabat位置356的氨基酸谷氨酸和在Kabat位置358的甲硫氨酸。G1m1和nG1m1异型包含在Kabat位置357的谷氨酸残基并且所述异型有时被称为DEL和EEM异型。显示了示例性抗体利妥昔单抗(SEQ IDNO：85)和维妥珠单抗(SEQ ID NO：86)的G1m1和nG1m1异型抗体的重链恒定区序列的非限制性实例。
利妥昔单抗重链可变区序列(SEQ ID NO：85)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS
GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY
NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR
DELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
维妥珠单抗重链可变区(SEQ ID NO：86
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS
GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY
NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR
EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Jefferis和Lefranc(2009，mAb1：1-7)评述了IgG异型的特征性序列变化和其对于免疫原性的影响。他们报道了G1m3异型的特征在于Kabat位置214的精氨酸残基，与G1m17异型中Kabat214的赖氨酸残基形成对比。nG1m1，2异型的特征在于Kabat位置356的谷氨酸、Kabat位置358的甲硫氨酸和Kabat位置431的丙氨酸。G1m1，2异型的特征在于Kabat位置356的天冬氨酸、Kabat位置358的亮氨酸和Kabat位置431的甘氨酸。除重链恒定区序列变体之外，Jefferis和Lefranc(2009)还报道了κ轻链恒定区异型变体，其中Km1异型的特征在于Kabat位置153的缬氨酸和Kabat位置191的亮氨酸，Km1，2异型的特征在于Kabat位置153的丙氨酸和Kabat位置191的亮氨酸，并且Km3异型的特征在于Kabat位置153的丙氨酸和Kabat位置191的缬氨酸。
关于治疗性抗体，维妥珠单抗和利妥昔单抗分别被人源化并且针对CD20的嵌合IgG1抗体被用于广泛多种血液科恶性肿瘤的治疗。表5比较了利妥昔单抗与维妥珠单抗的异型序列。如表5中所示，利妥昔单抗(G1m17，1)为DEL异型IgG1，其中在Kabat位置214(重链CH1)的另外的序列变化在利妥昔单抗中为赖氨酸，相对于在维妥珠单抗中为精氨酸。已报道了维妥珠单抗在受试者中的免疫原性低于利妥昔单抗(参见例如Morchhauser等，2009，J Clin Oncol27：3346-53；Goldenberg等，2009，Blood113：1062-70；Robak和Robak，2011，BioDrugs25：13-25)，这种作用被归因于人源化抗体与嵌合抗体之间的差异。然而，EEM和DEL异型之间的异型差异还可能造成维妥珠单抗的免疫原性较低。
表5.利妥昔单抗对维妥珠单抗的异型
为了降低治疗性抗体在nG1m1基因型个体中的免疫原性，希望选择对应于以下的抗体异型：G1m3异型，特征在于Kabat214的精氨酸；和nG1m1，2空异型，特征在于Kabat位置356的谷氨酸、Kabat位置358的甲硫氨酸和Kabat位置431的丙氨酸。令人惊讶的是，发现G1m3抗体在很长一段时间内的重复皮下施用未产生显著的免疫反应。在可选的实施方案中，与G1m3异型一样的人类IgG4重链具有Kabat214的精氨酸、Kabat356的谷氨酸、Kabat359的甲硫氨酸和Kabat431的丙氨酸。由于免疫原性似乎至少在某种程度上与那些位置的残基有关，所以将人类IgG4重链恒定区序列用于治疗性抗体也是一个优选的实施方案。G1m3IgG1抗体与IgG4抗体的组合也可用于治疗性施用。
氨基酸取代
在某些实施方案中，所公开的方法和组合物可能涉及具有一个或多个取代的氨基酸残基的蛋白质或肽的产生和使用。在一个非限制性实例中，用于制造DNLTM构建体的DDD和/或AD序列可被进一步优化，例如以增加DDD-AD结合亲和性。
本领域技术人员将会认识到，一般情况下，氨基酸取代典型地涉及将一种氨基酸用另一种具有相对类似特性的氨基酸置换(即，保守氨基酸取代)。各种氨基酸的特性和氨基酸取代对蛋白质结构和功能的影响已被深入研究并在本领域中已知。
例如，可考虑氨基酸的亲水指数(Kyte和Doolittle，1982，J.Mol.Biol.，157：105-132)。氨基酸的相对亲水特征促成所得蛋白质的二级结构，其反过来又界定所述蛋白质与其他分子的相互作用。基于氨基酸的疏水性和电荷特征对每种氨基酸赋予一个亲水指数(Kyte和Doolittle，1982)，具体为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。在进行保守性取代时，优选使用亲水指数在±2内的氨基酸，更优选是在±1内，以及甚至更优选是在±0.5内。
氨基酸取代也可考虑到氨基酸残基的亲水性(例如，美国专利No.4,554,101)。氨基酸残基被赋予亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0)；谷氨酸(+3.0)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5.+-.1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。优选用具有类似亲水性的其他氨基酸进行氨基酸置换。
其他的考虑包括氨基酸侧链的大小。例如，通常不优选将带有紧密侧链的氨基酸如甘氨酸或丝氨酸置换成带有庞大侧链的氨基酸如色氨酸或酪氨酸。各种氨基酸残基对蛋白质二级结构的影响也是一种考虑。通过实证研究，不同的氨基酸残基对于蛋白质结构域采取α-螺旋、β-折叠或反转二级结构倾向性的影响已被确定并在本领域已知(参见例如Chou和Fasman，1974，Biochemistry，13：222-245；1978，Ann.Rev.Biochem.，47：251-276；1979，Biophys.J.，26：367-384)。
基于所述考虑和深入的实证研究，已构建保守氨基酸取代表并在本领域已知。例如：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。可选地：Ala(A)leu、ile、Val；Arg(R)gln、asn、lys；Asn(N)his、asp、lys、arg、gln；Asp(D)asn、glu；Cys(C)ala、ser；Gln(Q)glu、asn；Glu(E)gln、asp；Gly(G)ala；His(H)asn、gln、lys、arg；Ile(I)Val、met、ala、phe、leu；Leu(L)Val、met、ala、phe、ile；Lys(K)gln、asn、arg；Met(M)phe、ile、leu；Phe(F)leu、Val、ile、ala、tyr；Pro(P)ala；Ser(S)、thr；Thr(T)ser；Trp(W)phe、tyr；Tyr(Y)trp、phe、thr、ser；Val(V)ile、leu、met、phe、ala。
其他关于氨基酸取代的考虑包括该残基是否位于蛋白质内部或暴露于溶剂。对于内部残基，保守取代包括：Asp和Asn；Ser和Thr；Ser和Ala；Thr和Ala；Ala和Gly；Ile和Val；Val和Leu；Leu和Ile；Leu和Met；Phe和Tyr；Tyr和Trp。(参见例如rockefeller.edu的PROWL网站)。对于暴露于溶剂的残基，保守取代包括：Asp和Asn；Asp和Glu；Glu和Gln；Glu和Ala；Gly和Asn；Ala和Pro；Ala和Gly；Ala和Ser；Ala和Lys；Ser和Thr；Lys和Arg；Val和Leu；Leu和Ile；Ile和Val；Phe和Tyr。(同上)已构建各种基质来辅助选择氨基酸取代，例如PAM250评分基质、Dayhoff基质、Grantham基质、McLachlan基质、Doolittle基质、Henikoff基质、Miyata基质、Fitch基质、Jones基质、Rao基质、Levin基质和Risler基质(同上)。
在决定氨基酸取代时，人们也可考虑分子间或分子内键的存在，例如带正电荷残基(例如His、Arg、Lys)和带负电荷残基(例如Asp、Glu)之间离子键(盐桥)的形成，或相近的半胱氨酸残基之间的二硫键。
众所周知在编码蛋白质序列中用任何氨基酸取代任何其他氨基酸的方法，并且是本领域技术人员的常规实验事务，例如通过定点诱变技术或通过合成和组装编码氨基酸取代的寡核苷酸并剪接进入表达载体构建体。
适体
在某些实施方案中，使用的靶向部分可为适体。本领域中众所周知构建和测定适体的结合特性的方法。例如，此类技术描述于美国专利No.5,582,981、5,595,877和5,637,459中，其各自的实施例部分以引用的方式并入本文中。制备和筛选结合于所感兴趣的特定靶标的适体的方法是众所周知的，例如美国专利No.5,475,096和美国专利No.5,270,163，其各自的实施例部分以引用的方式并入本文中。
适体可通过任何已知方法(包括合成、重组和纯化方法)制备，并且可单独使用或与其他对相同靶标具特异性的配体组合使用。一般来说，需要最少约3个核苷酸、优选至少5个核苷酸来实现特异性结合。短于10个碱基的序列的适体可为可行的，但具有10、20、30或40个核苷酸的适体可为优选的。
适体可经分离、测序和/或扩增或以常规DNA或RNA分子形式合成。可选地，所感兴趣的适体可包含修饰的寡聚物。适体中通常存在的任何羟基可被膦酸酯基、磷酸酯基置换，被标准的保护基保护，或被活化以制备另外的与其他核苷酸的连接，或可轭合至固体支撑物。一个或多个磷酸二酯键可被可选的连接基团置换，例如P(O)O被P(O)S、P(O)NR2、P(O)R、P(O)OR′、CO或CNR2置换，其中R为H或烷基(1-20C)并且R′为烷基(1-20C)；另外，这个基团可通过O或S连接至相邻的核苷酸。寡聚物中的所有连接无需相同。
亲和体和Fynomer
某些可选的实施方案可利用亲和体来代替抗体。亲和体可商购自Affibody AB(Solna，Sweden)。亲和体是充当抗体模拟物并用于结合靶标分子中的小蛋白质。通过在α螺旋蛋白质骨架上进行组合工程化而产生亲和体(Nord等，1995，Protein Eng8：601-8；Nord等，1997，NatBiotechnol15：772-77)。亲和体设计是基于包含蛋白质A的IgG结合域的三螺旋束结构(Nord等，1995；1997)。可通过在细菌蛋白A的Fc结合活性中所涉及的13种氨基酸的随机化来产生具有多种结合亲和性的亲和体(Nord等，1995；1997)。在随机化之后，将PCR扩增文库克隆到噬菌体素载体中以供通过突变蛋白的噬菌体展示进行筛选。可使用标准的噬菌体展示筛选技术(例如，Pasqualini和Ruoslahti，1996，Nature380：364-366；Pasqualini，1999，Quart.J.Nucl.Med.43：159-162)针对任何已知的抗原来筛选噬菌体展示文库，以鉴定一种或多种针对靶抗原的亲和体。
对HER2/neu具特异性的177Lu标记的亲和体已证实体内靶向表达HER2的异种移植物(Tolmachev等，2007，Cancer Res67：2773-82)。尽管由于低分子量放射性标记化合物的积聚造成的肾毒性最初是一个问题，但与白蛋白的可逆结合减少了肾积聚，得以实现用被标记的亲和体进行的基于放射性核素的疗法(同上)。
近来已证明了使用放射性标记的亲和体用于体内肿瘤成像的可行性(Tolmachev等，2011，Bioconjugate Chem22：894-902)。马来酰亚胺衍生的NOTA轭合于抗HER2亲和体并用111In放射性标记(同上)。施用至带有表达HER2的DU-145异种移植物的小鼠，接着进行γ相机成像，允许异种移植物的可视化(同上)。
Fynomer也可以结合于对抗体具有类似亲和性和特异性的靶抗原。Fynomer是基于作为结合分子组装的骨架的人类Fyn SH3结构域。所述Fyn SH3结构域是可在细菌中以高产率产生的具有63个氨基酸的完全人类蛋白质。Fynomer可连接在一起以得到对两种或更多种不同的抗原靶标具有亲和性的多特异性结合蛋白。Fynomer可商购获自COVAGEN AG(Zurich，Switzerland)。
本领域技术人员将认识到，在所要求保护的方法和组合物的实践中可将亲和体或fynomer用作靶向分子。
双特异性和多特异性抗体
双特异性抗体可用于多种生物医学应用中。例如，具有对肿瘤细胞表面抗原和T细胞表面受体的结合位点的双特异性抗体可以引导特异性肿瘤细胞被T细胞溶解。识别神经胶质瘤和T细胞上的CD3表位的双特异性抗体已经被成功地用于治疗人类患者中的脑肿瘤(Nitta等，Lancet.1990；355：368-371)。在某些实施方案中，用于本文公开的治疗剂轭合的技术和组合物可与双特异性或多特异性抗体一起用作靶向部分。
用于产生双特异性或多特异性抗体的众多方法是已知的，如例如美国专利No.7,405,320中所公开，所述专利的实施例部分以引用的方式并入本文中。可通过四体杂交瘤方法产生双特异性抗体，所述方法涉及两种不同的杂交瘤的融合，所述杂交瘤各自产生识别不同的抗原位点的单克隆抗体(Milstein和Cuello，Nature，1983；305：537-540)。
用于产生双特异性抗体的另一种方法使用异双功能交联剂来化学栓系两种不同的单克隆抗体(Staerz等，Nature.1985；314：628-631；Perez等，Nature.1985；316：354-356)。还可以通过将两个亲本单克隆抗体各自还原成相应的半分子，然后混合并使其再氧化以获得杂合结构来产生双特异性抗体(Staerz和Bevan.Proc Natl Acad Sci U S A.1986；83：1453-1457)。另一种可选方案涉及使用适当的接头将两个或三个独立纯化的Fab′片段化学交联。(参见例如欧洲专利申请0453082)。
其他方法包括通过经由逆转录病毒衍生的穿梭载体将不同的选择性标记基因转移至相应的亲本杂交瘤，随后将其融合(DeMonte等，Proc Natl Acad Sci U S A.1990，87：2941-2945)；或用包含不同抗体的重链和轻链基因的表达质粒转染杂交瘤细胞系，来提高产生杂合杂交瘤的效率。
可用具有适当组成和长度的肽接头(通常由12个以上氨基酸残基组成)将同源VH和VL结构域接合在一起以形成具有结合活性的单链Fv(scFv)。制造scFv的方法公开于美国专利No.4,946,778和美国专利No.5,132,405中，其各自的实施例部分以引用的方式并入本文中。将肽接头长度缩短至少于12个氨基酸残基可防止同一链上的VH和VL结构域配对并迫使其他链上具有互补结构域的VH和VL结构域配对，从而导致形成功能性多聚体。用具有3至12个氨基酸残基的接头接合的VH和VL结构域的多肽链主要形成二聚体(称为双链抗体)。利用具有0至2个氨基酸残基的接头，有利于形成三聚体(称为三链抗体)和四聚体(称为四链抗体)，但除了接头长度之外，确切的寡聚模式似乎取决于V结构域的组成以及定向(VH-接头-VL或VL-接头-VH)。
用于产生多特异性或双特异性抗体的这些技术在低产率、纯化必要性、低稳定性或技术的劳动密集性方面展现各种困难。最近，已利用被称为“停靠和锁定(DNL)”的技术来产生实质上任何所需抗体、抗体片段和其他效应分子的组合(参见例如美国专利No.7,550,143；7,521,056；7,534,866；7,527,787和USSN11/925,408，其各自的实施例部分以引用的方式并入本文中)。所述技术利用被称为锚定结构域(AD)和二聚化和停靠结构域(DDD)的互补性蛋白质结合域，它们彼此结合并实现复合物结构的组装，形成范围包括二聚体、三聚体、四聚体、五聚体和六聚体。这些以高产率形成稳定的复合物而无需广泛纯化。DNL技术允许单特异性、双特异性或多特异性抗体的组装。本领域中已知用于制造双特异性或多特异性抗体的任何技术可用于本发明所要求保护的方法的实践中。
预靶向
双特异性或多特异性抗体可用于预靶向技术中。预靶向是最初开发用来解决直接靶向抗体的缓慢血液清除的多步骤方法，其对正常组织如骨髓造成不期望的毒性。通过预靶向，将放射性核素或其他治疗剂连接至在数分钟内从血液清除的小的递送分子(可靶向构建体)。首先施用对可靶向构建体以及靶抗原具有结合位点的预靶向双特异性或多特异性抗体，使得自由抗体从循环中清除，然后施用可靶向构建体。
预靶向方法公开于例如Goodwin等人，美国专利No.4,863,713；Goodwin等人，J.Nucl.Med.29：226，1988；Hnatowich等人，J.NuchMed.28：1294，1987；Oehr等人，J.Nucl.Med.29：728，1988；Klibanov等人，J.Nucl.Med.29：1951，1988；Sinitsyn等人，J.Nucl.Med.30：66，1989；Kalofonos等人，J.Nucl.Med.31：1791，1990；Schechter等人，Int.J.Cancer48：167，1991；Paganelli等人，Cancer Res.51：5960，1991；Paganelli等人，Nucl.Med.Commun.12：211，1991；美国专利No.5,256,395；Stickney等人，Cancer Res.51：6650，1991；Yuan等人，CancerRes.51：3119，1991；美国专利No.6,077,499；7,011,812；7,300,644；7,074,405；6,962,702；7,387,772；7,052,872；7，138,103；6,090,381；6,472,511；6,962,702；和6,962,702，各自以引用的方式并入本文中。
可通过以下提供治疗或诊断受试者中的疾病或病症的预靶向方法：(1)向受试者施用双特异性抗体或抗体片段；(2)任选地向所述受试者施用清除组合物，并且使所述组合物从循环中清除抗体；以及(3)向所述受试者施用包含一种或多种螯合或化学结合的治疗剂或诊断剂如干扰素λ的可靶向构建体。
可靶向构建体
在某些实施方案中，可选择被一种或多种治疗剂或诊断剂标记以用于预靶向的可靶向构建体肽以结合于对可靶向构建体肽具有一个或多个结合位点和对与疾病或病状相关的靶抗原具有一个或多个结合位点的双特异性抗体。双特异性抗体可用于预靶向技术中，其中可首先向受试者施用抗体。可允许足够时间以使双特异性抗体结合于靶抗原以及使未结合的抗体从循环中清除。然后可向受试者施用可靶向构建体如被标记的肽并且使其结合于双特异性抗体并定位在患病细胞或组织。
此类可靶向构建体可具有多种结构并且不仅针对以高亲和性结合于可靶向构建体的抗体或片段的可用性，而且针对当在预靶向方法和双特异性抗体(bsAb)或多特异性抗体内使用时快速的体内清除率进行选择。疏水剂最擅长引起强烈的免疫反应，而亲水剂优选用于快速体内清除。因此，疏水性特性与亲水性特性之间建立平衡。这可部分地通过使用亲水性螯合剂来抵消许多有机部分的固有疏水性来实现。此外，可选择具有相反的溶解性质的可靶向构建体的亚基，例如肽，其含有氨基酸，其中一些具疏水性并且其中一些具亲水性。
可使用具有少至两个氨基酸残基、优选2至10个残基的肽，并且其还可偶合至其他部分如螯合剂。接头应为低分子量轭合物，优选具有小于50,000道尔顿、且有利地小于约20,000道尔顿、10,000道尔顿或5,000道尔顿的分子量。可靶向构建体肽更通常将具有四个或更多个残基，例如肽DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQ IDNO：98)，其中DOTA为1，4，7，10-四氮杂环十二烷1，4，7，10-四乙酸并且HSG为组胺丁二酰基甘氨酰基。可选地，DOTA可被NOTA(1，4，7-三氮杂-环壬烷-1，4，7-三乙酸)、TETA(对溴乙酰胺基-苄基-四乙胺四乙酸)、NETA([2-(4，7-双羧基甲基[1，4，7]三氮杂环壬烷-1-基-乙基]-2-羰基甲基-氨基]乙酸)或其他已知的螯合部分代替。可使用螯合部分例如以结合于治疗性和或诊断性放射性核素、顺磁离子或造影剂。
可靶向构建体还可在主链结构中包含非天然氨基酸如D-氨基酸以增加肽在体内的稳定性。在可选的实施方案中，可使用其他主链结构，例如由非天然氨基酸或类肽构建的那些主链结构。
宜使用固相支撑物和重复正交脱保护和偶联的标准技术在自动化肽合成器上合成被用作可靶向构建体的肽。将肽中稍后被用于轭合螯合部分或其他剂的游离氨基有利地用标准保护基如Boc基团阻断，同时可将N端残基乙酰化以增加血清稳定性。此类保护基是本领域技术人员众所周知的。参见Greene和Wuts Protective Groups inOrganic Synthesis，1999(John Wiley and Sons，N.Y)。当肽准备稍后用于双特异性抗体系统内时，它们有利地从树脂裂解以生成相应的C端酰胺，以抑制体内羧肽酶活性。肽合成的示例性方法公开于下文实施例中。
当使用双特异性抗体进行预靶向时，抗体将包含由靶组织产生或与靶组织缔合的抗原的第一结合位点和针对可靶向构建体上的半抗原的第二结合位点。示例性半抗原包括(但不限于)HSG和In-DTPA。募集至HSG半抗原的抗体是已知的(例如679抗体)并且可容易地并入适当的双特异性抗体中(参见例如美国专利No.6,962,702、7,138,103和7,300,644，关于实施例部分以引用的方式并入本文中)。然而，其他半抗原和结合于其的抗体是本领域中已知的并且可使用，例如In-DTPA和734抗体(例如，美国专利No.7,534,431，其实施例部分以引用的方式并入本文中)。
治疗剂
在多个实施方案中，治疗剂如细胞毒性剂、抗血管生成剂、促凋亡剂、抗生素、激素、激素拮抗剂、趋化因子、药物、前药、毒素、酶或其他剂可被用作本文所述的干扰素-抗体DNLTM构建体的辅助疗法。所用药物可具有选自由抗有丝分裂剂、抗激酶剂、烷化剂、抗代谢物、抗生素、生物碱、抗血管生成剂、促凋亡剂以及其组合组成的群组的药物性质。
所用的示例性药物可包括5-氟尿嘧啶、阿普立定(aplidin)、阿扎立平(azaribine)、阿那曲唑(anastrozole)、蒽环类、苯达莫司汀(bendamustine)、博莱霉素(bleomycin)、硼替佐米(bortezomib)、苔藓抑素-1(bryostain-1)、白消安(busulfan)、刺孢霉素(calicheamycin)、喜树碱(camptothecin)、卡铂(carboplatin)、10-羟基喜树碱、卡莫司汀(carmustine)、西乐葆(celebrex)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺铂(cisplatin)(CDDP)、Cox-2抑制剂、伊立替康(irinotecan)(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉曲滨(cladribine)、氯法拉滨(clofarabine)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside)、喜树碱类、环磷酰胺、阿糖胞苷(cytarabine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、多西紫杉醇(docetaxel)、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、2-吡咯啉基阿霉素(2P-DOX)、氰基-吗啉基阿霉素、阿霉素葡糖苷酸、表柔比星葡糖苷酸、雌莫司汀(estramustine)、表鬼白毒素(epipodophyllotoxin)、雌激素受体结合剂、依托泊苷(etoposide)(VP16)、依托泊苷葡糖苷酸、磷酸依托泊苷、氟尿苷(FUdR)、3′，5′-O-二油酰基-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨(fludarabine)、氟他胺(flutamide)、法尼基-蛋白转移酶抑制剂、酪氨酸激酶和Bruton激酶抑制剂、吉西他滨(gemcitabine)、羟基脲、伊达比星(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、左旋天冬酰胺酶、来那度胺(lenolidamide)、甲酰四氢叶酸(leucovorin)、洛莫司汀(lomustine)、氮芥(mechlorethamine)、美法仑(melphalan)、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤(methotrexate)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、丝裂霉素(mitomycin)、米托坦(mitotane)、诺维本(navelbine)、亚硝基脲、普卡霉素(plicomycin)、丙卡巴肼(procarbazine)、紫杉醇(paclitaxel)、喷司他丁(pentostatin)、PSI-341、雷洛昔芬(raloxifene)、司莫司汀(semustine)、链脲菌素(streptozocin)、他莫昔芬(tamoxifen)、紫杉酚(taxol)、替莫唑胺(temazolomide)(DTIC的水性形式)、反铂(transplatinum)、沙利度胺(thalidomide)、硫鸟嘌呤、噻替哌(thiotepa)、替尼泊苷(teniposide)、拓扑替康(topotecan)、尿嘧啶氮芥、长春瑞滨(vinorelbine)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)以及长春花生物碱。
所用的酪氨酸激酶抑制剂可包括LFM-A13、达沙替尼(dasatinib)、伊马替尼(imatinib)或尼洛替尼(nilotinib)。
所用的毒素可包括蓖麻毒素、相思子毒素、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)如豹蛙酶、DNA酶I、葡萄球菌属肠毒素-A、商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌属外毒素和假单胞菌属内毒素。
所用的趋化因子可包括RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-β和IP-10。
在某些实施方案中，可使用抗血管生成剂，例如血管抑制素、杆抑素(baculostatin)、血管能抑素(canstatin)、乳腺丝抑蛋白(maspin)、抗VEGF抗体、抗PlGF肽和抗体、抗血管生长因子抗体、抗Flk-1抗体、抗Flt-1抗体和肽、抗Kras抗体、抗cMET抗体、抗MIF(巨噬细胞迁移抑制因子)抗体、层粘连蛋白肽、纤维连接蛋白肽、纤溶酶原激活物抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白细胞介素-12、IP-10、Gro-β、血小板反应蛋白、2-甲氧基雌二醇、增殖蛋白相关蛋白、羧基酰氨三唑(carboxiamidotriazole)、CM101、马立马司他(Marimastat)、戊聚糖多硫酸酯、血管生成素-2、干扰素、除莠霉素A、PNU145156E、16K泌乳素片段、利诺胺(罗喹美克)、沙利度胺、己酮可可碱、染料木素、TNP-470、内皮抑制素、紫杉醇、accutin、血管抑制素、西多福韦(cidofovir)、长春新碱、博莱霉素、AGM-1470、血小板因子4或米诺环素(minocycline)。
其他有用的治疗剂可包含寡核苷酸，特别是优选地针对致癌基因和致癌基因产物如bcl-2或p53的反义寡核苷酸。一种优选的治疗性寡核苷酸形式为siRNA。
诊断剂
诊断剂优选地选自由放射性核素、放射性造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记、超声造影剂和光敏剂组成的群组。所述诊断剂是众所周知的，并且可使用任何这样的已知诊断剂。诊断剂的非限制性实例可包括放射性核素，例如110In、111In、177Lu、18F、19F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr或其他γ发射体、β发射体或正电子发射体。所用的顺磁离子可包括铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)或铒(III)。金属造影剂可包括镧(III)、金(III)、铅(II)或铋(III)。超声造影剂可包含脂质体如充气脂质体。不透射线诊断剂可选自化合物、钡化合物、镓化合物和铊化合物。本领域中已知广泛多种荧光标记，包括(但不限于)异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白(phycoerytherin)、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺。可用的化学发光标记可包括鲁米诺、异鲁米诺、芳族吖啶酯、咪唑、吖啶盐或草酸酯。
轭合技术
在某些实施方案中，可将DNLTM构建体轭合于一种或多种治疗剂或诊断剂。例如，可将131I并入蛋白质或肽的酪氨酸，或连接至赖氨酸残基的ε氨基的药物。还可将治疗剂和诊断剂连接至例如还原的SH基团。本领域中已知多种制备治疗剂或诊断剂与蛋白质或肽的共价或非共价轭合物的方法，并且可利用任何此类已知方法。
可使用异双功能交联剂如3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-丁二酰基酯(SPDP)连接治疗剂或诊断剂。Yu等，Int.J.Cancer56：244(1994)。本领域中众所周知用于此种轭合的一般技术。参见例如Wong，CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING(CRC Press1991)；Upeslacis等，″Modification of Antibodies byChemical Methods，″MONOCLONAL ANTIBODIES：PRINCIPLESAND APPLICATIONS，Birch等(编)，第187-230页(Wiley-Liss，Inc.1995)；Price，″Production and Characterization of SyntheticPeptide-Derived Antibodies，″MONOCLONAL ANTIBODIES：PRODUCTION，ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION，Ritter等(编)，第60-84页(Cambridge University Press1995)。
在一些实施方案中，可将螯合剂连接至蛋白质或肽并用于螯合治疗剂或诊断剂，例如放射性核素。示例性螯合剂包括(但不限于)DTPA(例如Mx-DTPA)、DOTA、TETA、NETA或NOTA。本领域中众所周知轭合和使用螯合剂来连接金属或其他配体与蛋白质或肽的方法(参见例如美国专利No.7,563,433，其实施例部分以引用的方式并入本文中)。特别有用的金属-螯合物组合包括2-苄基-DTPA和其单甲基和环己基类似物，可与一般能量范围为60至4,000keV的诊断同位素一起用于放射性成像，所述同位素例如125I、131I、123I、124I、62Cu、64Cu、18F、111In、67Ga、68Ga、99mTc、94mTc、11C、13N、15O或76Br。当与非放射性金属如镁、铁和钆复合时，相同的螯合物可用于MRI。大环螯合物如NOTA、DOTA和TETA可与多种金属和放射性金属一起使用，更特别地分别与镓、铱和铜的放射性核素一起使用。可通过为所感兴趣的金属定制环的大小使所述金属-螯合物复合物非常稳定。涵盖其他的环型螯合物如大环聚醚，其可用于稳定结合核素，例如RAIT中的223Ra。
最近，已公开在PET扫描技术中使用18F标记的方法，例如通过将F-18与金属或其他原子如铝进行反应。18F-Al轭合物可与直接连接至抗体或用于在预靶向方法中标记可靶向构建体的螯合基团如DOTA、NOTA或NETA复合。所述F-18标记技术公开于美国专利No.7,563,433中。
治疗方法
各种实施方案涉及在受试者如哺乳动物(包括人类、家养或陪伴宠物，例如狗和猫)中治疗癌症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的干扰素-抗体DNLTM构建体。可由同时或依序施用治疗有效量的结合于靶标细胞表面上的抗原或与之反应的抗体而对干扰素-抗体DNLTM构建体的施用进行补充。优选的其他MAb包含至少一种选自由与以下反应的MAb组成的群组的人源化、嵌合或人类MAb：CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD95、CD126、CD133、CD138、CD154、CEACAM5、CEACAM6、B7、AFP、PSMA、EGP-1、EGP-2、碳酸酐酶IX、PAM4抗原、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、Ia、MIF、HM1.24、HLA-DR、腱生蛋白、Flt-3、VEGFR、PlGF、ILGF、IL-6、IL-25、腱生蛋白、TRAIL-R1、TRAIL-R2、补体因子C5、致癌基因产物或其组合。
可通过同时或依序施用至少一种治疗剂进一步补充干扰素-抗体DNLTM构建体疗法。例如“CVB”(1.5g/m2环磷酰胺、200-400mg/m2依托泊苷和150-200mg/m2卡莫司汀)为用于治疗非霍奇金淋巴瘤的方案。Patti等人，Eur.J.Haematol.51：18(1993)。本领域技术人员众所周知其他合适的联合化学治疗方案。参见例如Freedman等，″Non-Hodgkin′s Lymphomas，″CANCER MEDICINE，第2卷，第3版，Holland等(编)，第2028-2068页(Lea&Febiger1993)。作为说明，用于治疗中间级非霍奇金淋巴瘤(NHL)的第一代化学治疗方案包括C-MOPP(环磷酰胺、长春新碱、丙卡巴肼和强的松)和CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和强的松)。有用的第二代化学治疗方案为m-BACOD(甲氨蝶呤、博莱霉素、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、地塞米松和甲酰四氢叶酸)，而合适的第三代方案为MACOP-B(甲氨蝶呤、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、强的松、博莱霉素和甲酰四氢叶酸)。其他有用的药物包括丁酸苯酯、苯达莫司汀(bendamustine)和苔藓抑素-1。
可根据已知方法来配制干扰素-抗体DNLTM构建体以制备药学上有用的组合物，据此将干扰素-抗体DNLTM构建体与药学上合适的赋形剂组合于混合物中。无菌磷酸盐缓冲盐水为药学上合适的赋形剂的一个实例。本领域技术人员众所周知其他合适的赋形剂。参见例如Ansel等，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUGDELIVERY SYSTEMS，第5版(Lea&Febiger1990)，和Gennaro(编)，REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版(MackPublishing Company1990)，以及其修订版。
可将干扰素-抗体DNLTM构建体配制用于静脉内施用，通过例如推注注射或连续输液。优选地，将干扰素-抗体DNLTM构建体经少于约4个小时的时期并且更优选地经少于约3个小时的时期输液。例如，最初的25-50mg可在30分钟、优选甚至15分钟内输液，而余下的部分经随后2-3小时输液。注射制剂可以单位剂型呈现，例如，在安瓿或多剂量容器中，其中添加有防腐剂。组合物可采用于油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液形式，并且可以包含配制剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可选地，活性成分可为粉末形式，在使用前与合适载体例如无菌的无热原水重构。
可使用其他制药方法控制干扰素-抗体DNLTM构建体作用的持续时间。可通过使用聚合物复合或吸附干扰素-抗体DNLTM构建体来制备控制释放制剂。例如，生物相容性聚合物包括聚(乙烯-共-醋酸乙烯酯)基质和硬脂酸二聚体与癸二酸的聚酸酐共聚物基质。Sherwood等，Bio/Technology10：1446(1992)。所述基质的释放速率取决于干扰素-抗体DNLTM构建体的分子量、基质内干扰素-抗体DNLTM构建体的量以及分散粒子的大小。Saltzman等，Biophys.J.55：163(1989)；Sherwood等，同上。其他固体剂型描述于Ansel等，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERYSYSTEMS，第5版(Lea&Febiger1990)，和Gennaro(编)，REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版(MackPublishing Company1990)及其修订版中描述。
干扰素-抗体DNLTM构建体也可对哺乳动物进行皮下施用或者甚至其他非肠道途径施用。所述构建体优选经少于约4个小时的时期并且更优选经少于约3个小时的时期输液。
更普遍的情况下，施用于人类的干扰素-抗体DNLTM构建体的剂量将根据诸如患者年龄、体重、身高、性别、一般医学病状和先前病史等因素而变化。在非限制性实例中，剂量可为10μg、20μg、50μg、75μg、100μg、150μg、200μg、250μg、300μg、400μg、500μg、750μg、1mg、1.5mg、2mg、2.5mg、5mg、10mg、20mg、50mg、75mg或100mg。本领域技术人员将认识到，如果观察到毒性征象，则可降低剂量或终止治疗。如果需要，可重复给药，例如，每周两次持续4-10周、每周一次持续4-10周、每周一次持续8周或每周一次持续4周。也可以根据维持疗法的需要以更小的频率给药，例如每两周一次持续几个月，或每个月或每个季度一次持续多个月。可选地，可以每2周或3周一次剂量施用干扰素-抗体DNLTM构建体，重复总共至少3次剂量。或者，可每周两次施用构建体持续4-6周。根据对剂量和方案的适当调节，给药方案可任选地以其他间隔重复，并可通过各种非肠道途径给药。
在优选的实施方案中，干扰素-抗体DNLTM构建体可用于癌症治疗。癌症的实例包括(但不限于)癌瘤、淋巴瘤、胶质母细胞瘤、黑色素瘤、肉瘤、和白血病、骨髓瘤或淋巴系统恶性肿瘤。所述癌症的更具体实例注明于下并包括：鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)、尤因肉瘤、肾母细胞瘤、星形细胞瘤、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric cancer)或胃癌(stomach cancer)(包括胃肠癌)、胰腺癌、多形性胶质母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、肝细胞癌、神经内分泌肿瘤、甲状腺髓样癌、分化型甲状腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney cancer)或肾癌(renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、肛门癌、阴茎癌以及头颈癌。术语“癌症”包括原发性恶性细胞或肿瘤(例如，细胞还没有迁移到受试者身体内除了最初的恶性肿瘤或肿瘤位置以外其他位置的恶性肿瘤或肿瘤)和继发性恶性细胞或肿瘤(例如，来源于转移瘤、恶性细胞或肿瘤细胞迁移到与最初的肿瘤位置不同的继发性位置的恶性细胞或肿瘤)。
癌症或恶性肿瘤的其他实例包括(但不限于)：儿童急性成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、肾上腺皮质癌、成人(原发性)肝细胞癌、成人(原发性)肝癌、成人急性淋巴细胞性白血病、成人急性髓细胞性白血病、成人霍奇金淋巴瘤、成人淋巴细胞性白血病、成人非霍奇金淋巴瘤、成人原发性肝癌、成人软组织肉瘤、AIDS相关淋巴瘤、AIDS相关恶性肿瘤、肛门癌、星形细胞瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑干神经胶质瘤、脑肿瘤、乳腺癌、肾盂和输尿管癌、中枢神经系统(原发性)淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤、子宫颈癌、儿童(原发性)肝细胞癌、儿童(原发性)肝癌、儿童急性成淋巴细胞性白血病、儿童急性髓细胞性白血病、儿童脑干神经胶质瘤、儿童小脑星形细胞瘤、儿童脑星形细胞瘤、儿童颅外生殖细胞瘤、儿童霍奇金病、儿童霍奇金淋巴瘤、儿童下丘脑和视觉通路神经胶质瘤、儿童成淋巴细胞性白血病、儿童髓母细胞瘤、儿童非霍奇金淋巴瘤、儿童松果体和幕上原始神经外胚层肿瘤、儿童原发性肝癌、儿童横纹肌肉瘤、儿童软组织肉瘤、儿童视觉通路和下丘脑神经胶质瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、上皮癌、食道癌、尤因氏肉瘤和相关肿瘤、外分泌胰腺癌、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、眼癌、女性乳腺癌、高雪氏病(Gaucher′sDisease)、胆囊癌、胃癌、胃肠类癌肿瘤、胃肠肿瘤、生殖细胞肿瘤、妊娠性滋养层细胞瘤、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤、高丙球蛋白血症、下咽癌、肠癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞胰腺癌、卡波西氏肉瘤、肾癌、喉癌、唇和口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴增生性病症、巨球蛋白血症、男性乳腺癌、恶性间皮瘤、恶性胸腺瘤、髓母细胞瘤、黑色素瘤、间皮瘤、转移隐匿性原发性鳞状细胞颈癌、转移性原发性鳞状细胞颈癌、转移性鳞状细胞颈癌、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞赘瘤、骨髓增生异常综合征、髓细胞性白血病、骨髓性白血病、骨髓增生性病症、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非黑色素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、隐匿性原发性转移性鳞状细胞颈癌、口咽癌、骨/恶性纤维肉瘤、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、低恶性度卵巢肿瘤、胰腺癌、异常蛋白血症、真性红细胞增多症、甲状旁腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、结节病肉瘤、塞扎里综合征、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞颈癌、胃癌、幕上原始神经外胚层和松果体瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、肾盂和输尿管移行癌、滋养细胞肿瘤、输尿管和肾盂细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、视觉通路和下丘脑神经胶质瘤、外阴癌、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom′sMacroglobulinemia)、肾母细胞瘤，以及位于上文列出的器官系统内除赘瘤外的任何其他过度增生疾病。
本文中描述和要求保护的方法和组合物可用于治疗恶性或恶化前的病状并阻止进展成为赘瘤或恶性瘤状态，包括(但不限于)上文所述的那些病症。所述用途在已知或疑似继续进展为赘瘤或癌症的病状中有所指示，特别是在非赘瘤细胞生长包括发生增生、化生或最特别是发育不良的时候(所述异常生长状况的综述参见Robbins和Angell，Basic Pathology，第2版，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，第68-79页(1976))。
发育不良常为癌症的前兆，并且主要在上皮中发现。其为非肿瘤细胞生长中最无序的一种形式，包括失去单独的细胞的一致性和失去细胞的结构定向。发育不良典型地发生在存在慢性刺激或炎症的部位。可治疗的发育不良病症包括(但不限于)无汗性外胚层发育不良、前面部发育不良(anterofacial dysplasia)、窒息性胸廓发育不良、心房-指发育不良、支气管肺发育不良、脑发育不良、宫颈发育不良、软骨外胚层发育不良、锁骨颅骨发育不良、先天性外胚层发育不良、颅骨骨干发育不良(craniodiaphysial dysplasia)、颅腕跖骨发育不良、颅骨干骺端发育不全(craniometaphysial dysplasia)、牙质发育不良、骨干发育不良、外胚层发育不良、牙釉质发育不良、脑性眼球发育不全、偏侧骨骺发育不良、多发性骨骺发育不良、点状骨骺发育不良、上皮发育不良、面-指(趾)-生殖器发育不良、家族性颌骨纤维性发育不良、家族性白色皱襞性发育不良、纤维肌肉发育不良、骨纤维性发育不良、旺盛骨性发育不良、遗传性肾性视网膜发育不良、有汗性外胚层发育不良、少汗性外胚层发育不良、淋巴细胞减少性胸腺发育不良、乳腺发育不良、下颌面骨发育不良、干骨后端发育不良、蒙迪尼发育不良、单骨纤维性骨发育不良、粘膜上皮发育不良、多发性骨骺发育不良、眼耳脊椎发育不良、眼齿指发育不良、眼椎骨发育不良、齿源性发育不良、眼下颚发育不良、根尖周牙骨质发育不良、多骨性纤维发育不良、假性软骨发育不全性脊椎骨骺发育不良、视网膜发育不良、视隔发育不良、脊椎骨骺发育不良和脑室径向发育不良。
其他可治疗的肿瘤前期病症包括(但不限于)良性增生失调病症(例如，良性肿瘤、纤维囊肿病状、组织肥大、肠息肉或腺瘤、和食管发育不良)、粘膜白斑病、角化症、博温氏病(Bowen′s disease)、农民皮肤病(Farmer′s Skin)、日光性唇炎和日光性角化病。
在优选的实施方案中，本发明方法用于抑制癌症的生长、进展和/或转移，特别是上文所列的癌症。
其他过度增生疾病、病症和/或病状包括(但不限于)恶性肿瘤和相关病症的进展和/或转移，例如白血病(包括急性白血病(例如，急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病(包括成髓细胞性、早幼粒细胞性、髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病))和(慢性白血病(例如，慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病)))、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如，霍奇金病和非霍奇金病)、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、重链病、和实体肿瘤，包括(但不限于)肉瘤和癌瘤如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、子宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤(emangioblastoma)、听神经瘤、寡突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
在其他实施方案中，聚乙二醇化DNLTM复合物可用于治疗感染病原有机体如细菌、病毒或真菌的受试者。可治疗的示例性真菌包括小孢子菌属(Microspomm)、毛癣菌属(Trichophyton)、表皮癣菌属(Epidermophyton)、申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、英膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)或白色念珠菌。示例性病毒包括人类免疫缺陷病毒(HIV)、疱疹病毒、巨细胞病毒、狂犬病毒、流感病毒、人类乳头状瘤病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、仙台病毒、猫白血病病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、人类血清细小样病毒、猿猴病毒40、呼吸道合胞病毒、小鼠乳腺肿瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒、登革病毒、风疹病毒、麻疹病毒、腺病毒、人类T细胞白血病病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、鼠类白血病病毒、腮腺炎病毒、水泡性口炎病毒、辛德毕斯病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒或蓝舌病毒。示例性细菌包括炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、无乳链球菌、嗜肺军团菌、化脓性链球菌、大肠杆菌、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎球菌属、乙型流感嗜血杆菌、梅毒螺旋菌、莱姆病螺旋体、铜绿假单胞菌、麻风分枝杆菌、流产布鲁氏菌、结核分枝杆菌或支原体。
试剂盒
各种实施方案可涉及包含适合于治疗患者患病组织的组成部分的试剂盒。示例性试剂盒可含有至少一种或多种如本文所述的干扰素-抗体构建体。如果含有施用组成部分的组合物未被配制为通过消化道递送，例如经口递送，则试剂盒中可包括能够通过一些其他途径递送试剂盒组成部分的装置。一种类型的供施用如非肠道递送装置为用于将组合物注射进入受试者体内的注射器。也可使用吸入装置。在某些实施方案中，可以含有无菌液体制剂或冻干制剂的预充式注射器或自动注射笔的形式提供治疗剂。
试剂盒的各组成部分可包装在一起或分装在两个或更多个容器中。在一些实施方案中，容器可为含有适于重构的组合物的无菌冻干制剂的管形瓶。试剂盒还可包含一种或多种适于重构和/或稀释其他试剂的缓冲液。其他可用的容器包括(但不限于)囊、盘、盒子、管等。试剂盒组成部分可在容器内包装并保持无菌。另外一个可包括的组成部分为人们使用试剂盒的说明书。
实施例
提供以下实施例用于阐明但不限制本发明的权利要求。
实施例1.CH3-AD2-IgG表达载体
pdHL2哺乳动物表达载体已被用于表达重组IgG(Qu等，Methods2005，36：84-95)。产生一种质粒穿梭载体来辅助将任何IgG-pdHL2载体转变为CH3-AD2-IgG-pdHL2载体。使用pdHL2载体作为模板并使用以下寡核苷酸引物通过PCR扩增Fc(CH2和CH3结构域)的基因：
Fc BglII左
AGATCTGGCGCACCTGAACTCCTG(SEQ ID NO：90)
Fc Bam-EcoRI右
GAATTCGGATCCTTTACCCGGAGACAGGGAGAG(SEQ ID NO：91)。
将扩增引物克隆于pGemT PCR克隆载体(Promega)中。使用XbaI和Bam HI将Fc插入片段由pGemT中剪切并且与通过使用Xba I和Bam HI消化h679-Fab-AD2-pdHL2(Rossi等，Proc Natl Acad SciUSA2006，103：6841-6)制备的AD2-pdHL2载体连接以生成穿梭载体Fc-AD2-pdHL2。为了将IgG-pdHL2表达载体转化为CH3-AD2-IgG-pdHL2表达载体，将861bp的BsrG I/Nde I限制片段从前者剪切下来并使用剪切自Fc-AD2-pdHL2载体的952bp的BsrGI/Nde I限制片段置换。以下为已生成并用于产生重组人源化IgG-AD2模块的CH3-AD2-IgG-pdHL2表达载体的部分列表：
CH3-AD2-IgG-hA20(抗CD20)
CH3-AD2-IgG-hLL2(抗CD22)
CH3-AD2-IgG-hL243(抗HLA-DR)
CH3-AD2-IgG-hLL1(抗CD74)
CH3-AD2-IgG-hR1(抗IGF-1R)
CH3-AD2-IgG-h734(抗铟-DTPA)。
实施例2.CH3-AD2-IgG的产生
稳定的C H 3-AD2-IgG分泌细包系的转染和选择
所有的细胞系均在杂交瘤SFM(Invitrogen，Carlsbad CA)中生长。通过使用Sal I限制性内切酶消化并通过电穿孔(450伏，25μF)转染进入Sp2/0-Ag14(2.8×106个细胞)将CH3-AD2-IgG-pdHL2载体(30μg)线性化。所述pdHL2载体包含二氢叶酸还原酶的基因，允许使用甲氨蝶呤(MTX)进行克隆选择以及基因扩增。
转染之后，将细胞在96孔板上铺板并在含有0.2μM MTX的培养基中选择转基因克隆。通过使用特异性抗独特型MAb涂布的96孔微量滴定板的夹心ELISA筛选各克隆的CH3-AD2-IgG生产率。将推定克隆的条件性培养基转移到微量板孔中，并使用辣根过氧化物酶轭合的山羊抗人类IgG F(ab′)2(Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA)检测融合蛋白。将给出最高信号的孔扩增并最终用于生产。
C H 3-AD2-IgG模块的产生和纯化
为了产生融合蛋白，以2×105个细胞/ml的密度在滚瓶培养中播种细胞并在37℃和5％CO2下在滚瓶温育器中温育直至细胞存活率降到低于25％(约10天)。通过离心将培养肉汤澄清，过滤并通过超滤浓缩至50倍。为了纯化CH3-AD2-IgG模块，将浓缩的上清液上样到蛋白A(MAB Select)亲和柱上。使用PBS将该柱洗至基线并且使用0.1M甘氨酸(pH2.5)将该融合蛋白洗脱。
实施例3.来自多种抗体的AD和DDD连接的Fab和IgG融合蛋白的产生
使用前述实施例中所述的技术，构建表6中所示的IgG和Fab融合蛋白并且并入DNL构建体中。所述融合蛋白保留了亲本抗体的抗原结合特性并且DNL构建体展现所并入的抗体或抗体片段的抗原结合活性。
表6.包含IgG或Fab的融合蛋白
实施例4.基于干扰素(IFN)-α2b的DDD模块的生成
用于在哺乳动物细胞中表达的IFN-α2b-DDD2-pdHL2的构建
通过PCR扩增IFN-α2b的cDNA序列，得到包含以下特征的序列，其中XbaI和BamHI为限制性位点，信号肽为IFN-α2b天然信号肽，并且6His为六组氨酸标签：XbaI---信号肽---IFNα2b---6His---BamHI(6His以SEQ ID NO：92公开)。所得分泌蛋白由在其C端融合下列序列的多肽的IFN-α2b组成：
KSHHHHHHGSGGGGSGGGCGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：93)。
使用全长人类IFNα2b cDNA克隆(InVitrogen Ultimate ORF人类克隆目录#HORF01克隆ID IOH35221)为模板以及下列寡核苷酸为引物实现PCR扩增：
IFNA2Xba I左
TCTAGACACAGGACCTCATCATGGCCTTGACCTTTGCTITACTGG(SEQ ID NO：94)
IFNA2BamHI右
GGATCCATGATGGTGATGATGGTGTGACTTTTCCTTACTTCTTAAACTTTCTTGC(SEQ IDNO：95)
将PCR扩增引物克隆于pGemT载体中。如下制备用于连接IFN-α2b的DDD2-pdHL2哺乳动物表达载体。使用Xba I和Bam HI将CH1-DDD2-Fab-hMN-14-pdHL2(Rossi等，Proc Natl Acad Sci USA2006，103：6841-6)载体消化，除去所有Fab基因序列但是保留DDD2编码序列。使用Xba I和Bam HI将IFN-α2b扩增引物从pGemT上剪切并连接到DDD2-pdHL2载体上以生成表达载体IFN-α2b-DDD2-pdHL2。
IFN-α2b-DDD2的哺乳动物细胞表达
使用Sal I将IFN-α2b-DDD2-pdHL2消化而线性化，并通过电穿孔稳定转染到Sp/ESF骨髓瘤细胞中(参见美国专利申请11/877,728，其实施例部分以引用的方式并入本文中)。利用ELISA发现两个克隆具有可检测水平的IFN-α2b。这两个克隆之一，命名为95，可在不显著降低生产率的情况下适应在无血清培养基中生长。随后经五周将该克隆用0.1至0.8μM递增浓度的MTX扩增。在此阶段，通过限制稀释将其亚克隆并将最高产的亚克隆(95-5)扩增。使用商业rIFN-α2b(Chemicon IF007，批号06008039084)为标准物，生长在摇瓶中的95-5的估计产量为2.5mg/L。
从滚瓶中生长的分批培养物中纯化IFN-α2b-DDD2
将克隆95-5扩增到34个含有总共20L无血清杂交瘤SFM与0.8μM MTX的滚瓶中并使之到达末期培养。将培养肉汤处理并如下通过固定化金属亲和色谱法(IMAC)将IFN-α2b-DDD2纯化。通过离心使上清液澄清，0.2μM过滤，渗滤到1X结合缓冲液(10mM咪唑、0.5MNaCl、50mM NaH2PO4，pH7.5)中，浓缩至310mL，加入Tween20达到最终浓度0.1％，并上样到30mL Ni-NTA柱上。在样品上样后，依次用500mL的于1X结合缓冲液中的0.02％Tween20和290mL的30mM咪唑、0.02％Tween20、0.5M NaCl、50mM NaH2PO4(pH7.5)洗涤柱。使用110mL的250mM咪唑、0.02％Tween20、150mMNaCl、50mM NaH2PO4(pH7.5)将产物洗脱。纯化得到大约6mgIFNα2b-DDD2。
IFN-α2b-DDD2在大肠杆菌中的产生
也可将IFN-α2b-DDD2以可溶蛋白形式通过微生物发酵在大肠杆菌中表达。使用IFN-α2b-DDD2-pdHL2 DNA为模板将编码序列通过PCR扩增。使用Nde I和Xho I限制性位点将该扩增引物克隆到pET26b大肠杆菌表达载体中。通过在18℃使用100μm IPTG对LB摇瓶进行12个小时诱导将蛋白质在BL21pLysS宿主细胞中细胞内地表达。如上所述通过IMAC将可溶性IFN-α2b-DDD2从细胞溶解产物中纯化。
实施例5.包含连接至CH3-AD2-IgG的四个IFN-α2b-DDD2部分的DNL轭合物的生成
如下制备包含连接至CH3-AD2-IgG的四个IFN-α2b-DDD2部分的DNL复合物(图1)。简要来说，将所选CH3-AD2-IgG与大约两摩尔当量的IFN-α2b-DDD2组合，并在加入1mM EDTA和2mM还原型谷胱甘肽(GSH)后，将该混合物在温和的条件下在室温过夜还原。加入氧化型谷胱甘肽至2mM并将该混合物再置于室温12-24小时。通过蛋白A亲和柱纯化该DNL轭合物。制备四种被设计为20-2b、22-2b、hR1-2b和243-2b的此类DNL轭合物，各包含四个拷贝的分别锚定于CH3-AD2-IgG-hA20(具有CD20特异性)、CH3-AD2-IgG-hLL2(具有CD22特异性)、CH3-AD2-IgG-hR1(具有IGF-1R特异性)和CH3-AD2-IgG-hL243(具有HLA-DR特异性)上的IFN-α2b。使用SE-HPLC对哺乳动物(m)或大肠杆菌(e)产生的IFN-α2b-DDD2所生成的20-2b分析表明，每种显示出滞留时间与由IgG和4个IFN-α2b基团组成的共价复合物一致的一个主峰(未示出)。在其他三种IFN-IgG轭合物中观察到类似的SE-HPLC概况。
实施例6.IFN-IgG轭合物的体外活性。
使用基于细胞的报道基因、病毒保护和淋巴瘤增殖测定法将20-2b的体外IFNα生物活性与商业聚乙二醇化IFNα2剂PEGASYS和PEG-内含子进行比较。使用基于细胞的试剂盒确定特异性活性，其利用带有融合于干扰素刺激反应元件的报道基因的转基因人类前单核细胞系(图2A-2D)。20-2b(5300IU/pmol)的特异性活性大于PEGASYS(170IU/pmol)和PEG-内含子(3400IU/pmol)(图2A)。以类似于20-2b的方法产生的734-2b、1R-2b和五种其他MAb-IFNα构建体(数据未示出)，均展现出相似的特异性活性(4000-8000IU/pmol)，表明生成此类结构的DNL方法的一致性(图2A)。具有四个IFNα2b基团有助于增强MAb-IFNα的效力。当对IFNα等效物归一化后，特异性活性/IFNα比PEGASYS高大约10倍，并仅比PEG-内含子低大约2倍。
在体外病毒保护测定法中对MAb-IFNα、PEGASYS和PEG-内含子进行比较，表明MAb-IFNα保留类似于PEG-内含子并为PEGASYS10倍的特异性活性的IFNα2b抗病毒活性(图2B)。
IFNα2b可对一些肿瘤细胞系具有直接的抗增殖或细胞毒性作用。在体外增殖测定法中以对IFNα高度敏感的伯基特淋巴瘤细胞系(Daudi)进行20-2b活性的测量(图2C)。每个IFNα2剂在体外以高效力(EC50＝4-10pM)有效地抑制(＞90％)Daudi。然而，20-2b(EC50＝0.25pM)比非靶向MAb-IFNα构建体更加强效大约30倍。在相当高的浓度下(EC50＞10nM)，20-2b的亲本抗CD20MAb在多种淋巴瘤细胞系(包括Daudi)中具有体外抗增殖活性(Rossi等，2008，Cancer Res68：8384-92)。也使用Jeko-1评估20-2b的体外活性，Jeko-1为对IFNα和抗CD20具有较低敏感性的套细胞淋巴瘤细胞系(图2D)。Jeko-1对于亲本抗CD20MAb仅为中度敏感，在EC50接近1nM时具有10％的最大抑制(Imax)。如以734-2b所示，Jeko-1(Imax＝43％；EC50＝23pM)相比于Daudi(Imax＝90％；EC50＝7.5pM)对IFNα2b响应较小。相比于734-2b，20-2b在更大的程度上抑制Jeko-1(Imax＝65％)并展现出双相剂量-响应曲线(图2D)。在＜10pM下，观察到归因于IFNα2b活性的低浓度响应，其于Imax＝43％稳定，与734-2b相似。在100pM以上可明显观察到高浓度响应，其中Imax达到65％。20-2b的低浓度IFNα2b响应(EC50＝0.97pM)比734-2b有效25倍，与使用Daudi的结果类似。
对亲本抗CD20抗体和734-2b(维妥珠单抗+734-2b)的组合进行测定以阐明20-2b效力的增加是否归因于CD20和IFNα信号传导的加和/协同效应。v-mab+734-2b的剂量响应曲线大部分与单独的734-2b相似，除了在＞1nM时，前者而非后者的抑制加强。这些结果表明MAb靶向造成20-2b的EC50较低，而其较大的Imax显然归因于IFNα2b和CD-20信号传导的加和活性。CD20信号传导的效果只在20-2b的高浓度响应(EC50＝0.85nM)中明显，其与对v-mab(EC50＝1.5nM)的响应平行。v-mab+734-2b的双相剂量-响应曲线不明显，因为这两个响应重叠。然而，在＞1nM的浓度下有明显的加和效应。20-2b的Imax(65％)比IFNα2b(Imax＝43％)和维妥珠单抗(Imax＝10％)加和的响应高，表明IFNα2b和v-mab(维妥珠单抗)的作用之间可能存在协同效应。
ADCC活性
IFNα可通过活化NK细胞和巨噬细胞来增强ADCC活性，其为抗CD20免疫疗法的基本作用机制(MOA)。我们使用外周血单核细胞(PBMC)作为效应细胞在两种NHL细胞系下比较了20-2b和v-mab的ADCC。使用来自多个捐赠者的PBMC的重复测定法一致地表明20-2b相比于v-mab具有增强的ADCC，如关于Daudi和Raji细胞所示(图4A)。该作用也表现在22-2b(一种包含抗CD22MAb依帕珠单抗的MAb-IFNα)，其显示中等的ADCC(Carnahan等，2007，MolImmunol44：1331-41)。
CDC活性
CDC被认为是I型抗CD20MAb(包括v-mab和利妥昔单抗)的重要MOA。然而，在以托西莫单抗为代表的II型MAb中缺乏这种功能(Cardarelli等，2002，Cancer Immunol Immunother51：15-24)，尽管其仍然具有抗淋巴瘤活性。与v-mab不同的是，20-2b在体外未显示出CDC活性(图4B)。这些结果与其他基于CH3-AD2-IgG-v-mab模块的DNL结构一致，其可能通过位阻干扰，使其中补体固定受到明显损害(Rossi等，2008，Cancer Res68：8384-92)。
实施例7.20-2b的药物动力学(PK)分析。
在雄性Swiss-Webster小鼠中评价20-2b的药物动力学(PK)性质并与PEGASYS、PEG-内含子和α2b-413(使用DNL制备的聚乙二醇化IFN，参见美国专利申请序列No.11/925,408)进行比较。利用ELISA根据生产商的说明在多个时间下测定IFN-α在血清样品中的浓度。简要地说，根据试剂盒中提供的人类IFN-α标准物将血清样品适当稀释。结合于微量滴定板孔的抗体捕捉干扰素。然后使用第二抗体显示结合的干扰素，在加入四甲基联苯胺(TMB)后，通过轭合至辣根过氧化物酶(HRP)的抗二级抗体定量干扰素。在450nm下读板。图3呈现PK分析的结果，其显示20-2b相比于其他剂显著较慢的消除和较长的血清滞留期。在注射剂量为210pmol的情况下，计算所得的药物动力学血清半衰期(以小时计)为8.0小时(20-2b)、5.7小时(α2b-413)、4.7小时(PEGASYS)和2.6小时(PEG-内含子)。消除速率(1/h)为0.087(20-2b)、0.121(α2b-413)、0.149(PEGASYS)和0.265(PEG-内含子)。计算所得的MRT0.08→∞(小时)为22.2(20-2b)、12.5(α2b-413)、10.7(PEGASYS)和6.0(PEG-内含子)。由于药物动力学参数更多地决定于该复合物的性质而非单独的抗体或细胞因子，所以预期细胞因子-DNL复合物的PK特性可通用于其他细胞因子部分和抗体部分而不限于以上所讨论的特定20-2b构建体。
实施例8.20-2b的体内活性
血清稳定性
20-2b在37℃在人类血清(≥10天)或全血(≥6天)中稳定(未示出)。使用双特异性ELISA测定法确定20-2b复合物的浓度。在测定法的时段中，在全血或血清中血清20-2b水平基本上没有可检测的变化。
20-2b抗来自人类全血的淋巴瘤细胞的离体功效
我们比较了20-2b、v-mab、734-2b或v-mab+734-2b在离体配置下从全血中消除淋巴瘤或正常B细胞的能力(图5)。裸的抗CD20MAb的治疗功效被认为通过三种作用机制(MOA)实现-信号传导诱导的凋亡或生长停滞、ADCC和CDC(Glennie等，2007，Mol Immunol44：3823-37)。在该测定法中，v-mab可采用所有三种MOA，然而，基于体外研究结果，20-2b可潜在地利用信号传导并加强ADCC而非CDC。在该短期模型中，20-2b和734-2b的IFNα2b基团可直接作用于肿瘤细胞，增强v-mab的ADCC活性，并可能具有一些免疫刺激作用。然而，在持续两天的离体测定法中，没有实现可能在体内发生的IFNα介导的全谱先天性和适应性免疫系统的活化。
在0.01nM下，20-2b(60.5％)比v-mab(22.8％)、734-2b(38.6％)或v-mab+734-2b(41.7％)消耗显著更多的Daudi细胞(图5)。在0.1nM下，20-2b和v-mab+734-2b消耗相似程度的Daudi(88.9％)，其比v-mab(82.4％)或734-2b(40.7％)多(图5)。在1nM下，除了734-2b(55.7％)，各剂消耗＞95％的Daudi(图5)。每个所指示的差异都具统计显著性(P＜0.01)。
对于IFNα2b和v-mab，Ramos不如Daudi敏感。734-2b的作用仅为中等，在每个浓度下造成Ramos的消耗＜20％(图5)。在0.01和0.1nM下，20-2b比v-mab+734-2b消耗更多Ramos，其转而比v-mab消除更多的细胞(图5)。在1nM下，除了734-2b以外所有的处理都得到相似的Ramos消耗(75％)(图5)。每个所指示的差异都具统计显著性(P＜0.02)。
如关于734-2b所示，在该测定法中单独IFNα2b不能消耗正常B细胞。在这些低浓度下，20-2b、v-mab和v-mab+734-2b各自都显示相似的B细胞的剂量响应消耗，其显著少于Daudi或Ramos的消耗。所有处理都不会导致显著的T细胞消耗(数据未示出)。
20-2b在SCID小鼠中的体内功效
小鼠模型的一个限制为鼠类细胞对人类IFNα2b的极低敏感性。20-2b可在人类中实现的整体治疗益处可包括增强先天性和适应性免疫。在了解这些限制之后，我们研究了20-2b在SCID小鼠中抗播散性伯基特淋巴瘤模型的体内抗淋巴瘤功效。我们起初测试了高敏感性早期Daudi模型(图6A)。在接种后一天，向各组施用单一低剂量的20-2b、v-mab或734-2b。将单一剂量的0.7pmol(170ng)的v-mab(维妥珠单抗)或734-2b与盐水相比较，v-mab导致存活率显著提高(P＜0.0001)，但不相关MAb-IFNα对照734-2b无这种表现(图6A)。这种提高是中等的，中值存活时间(MST)从盐水的27天增加到v-mab的34天。然而，单一剂量的0.7pmol(170ng)的20-2b相比于盐水对照和v-mab组使MST提高了100天以上(P＜0.0001)(图6A)。该项研究在19周后终止，此时对0.7pmol20-2b处理组中的7个长期存活者(LTS)进行尸体剖检，并未发现可见的疾病迹象(已治愈)(图6A)。值得注意的是，即使最低剂量的0.07pmol(17ng)的20-2b都不仅仅使MST加倍(图6A)。
接下来，我们评估20-2b在更具挑战性的晚期Daudi模型中的功效，其中使小鼠在处理前形成大体上更大的肿瘤负担(图6B)。肿瘤接种后七天，向各组施用单一低剂量(0.7、7.0或70pmol)的20-2b、v-mab、734-2b或PEGASYS。盐水对照小鼠的MST为21天(图6B)。最高剂量(70pmol)的PEGASYS或734-2b各自都具有增强的Pk(相比于重组IFNα2b)，但是不靶向于肿瘤，它们使MST加倍(42天；P＜0.0001)(图6B)。使用20-2b在100倍低剂量(0.7pmol)下处理产生与最高剂量(70pmol)的PEGASYS或734-2b相似的结果(38.5天)(图6B)。使用20-2b在10倍低剂量(7pmol)下处理导致相比于使用70pmol的PEGASYS或734-2b处理的存活率显著提高(80.5天，20％LTS)(P＜0.0012)(图6B)。在所测试的最高剂量(70pmol)下，20-2b将MST增加至＞105天并且存在100％LTS(图6B)。在早期肿瘤模型中我们先前已经证明v-mab在相对低的剂量(3.5pmol)下可增加带有Daudi的小鼠的存活，而较高剂量则产生LTS。然而，在该晚期肿瘤模型中，单一剂量为70pmol的v-mab对于存活仅具有显著但是中等的作用(MST＝24天，P＝0.0001)(图6B)。
我们随后在更具挑战性的模型中测定20-2b，该模型对于IFNα直接抑制比Daudi更不敏感，并对于v-mab免疫疗法更不响应。Raji相比于Daudi对于IFNα2b直接作用的敏感度小约1000倍。然而，Raji具有和Daudi相似的CD20抗原密度(Stein等，2006，Blood108：2736-44)并对v-mab响应，但比Daudi的响应显著小很多(Goldenberg等，2009，Blood113，1062-70)。在肿瘤接种五天后开始治疗，在晚期Raji模型中研究20-2b的功效(图7A)。经两周向各组施用共6次注射(每次250pmol)。相对于盐水，734-2b没有增加存活(MST＝16天)，这与Raji对IFNα的不敏感性相一致(图7A)。相对于盐水，V-mab显著增加存活(MST＝26天，P＜0.000l)(图7A)。20-2b比其它所有处理更有效(MST＝33天，P＜0.0001)(图7A)。
最后，我们在NAMALWA情况下研究了20-2b的功效(图7B)，NAMALWA为一种对IFNα的直接作用具有低敏感性，相比于Daudi或Raji的CD20抗原密度低约25倍，并且被认为对抗CD20免疫疗法有抗性的人类淋巴瘤(Stein等，2006)。向各组施用共6个剂量(每个剂量250pmol)的20-2b或734-2b。向另一组施用共7个剂量(每个剂量3.5nmol)的v-mab。用盐水处理的组具有17天的MST(图7B)。用734-2b处理的组具有显著但是非常中度的存活提高(MST＝20天，P＝0.0012)(图7B)。20-2b(MST＝34天)比734-2b(P＝0.0004)以及v-mab(MST＝24天，P＝0.0026)更有效，并且v-mab所给剂量比20-2b高14倍(图7B)。
结论
所得结果明确表明用抗CD20MAb靶向IFNα使得免疫细胞因子比任一种剂单独使用或联合使用更强效和有效。IFNα的MAb靶向肿瘤使得可以更低频率的方案给与单独剂，减低或消除IFN疗法相关的副作用，并得到大幅增强的功效。另外，所靶向的IFNα可诱发急性肿瘤定向免疫反应，并可能通过对先天性和适应性免疫的多效性刺激而唤起免疫记忆(Belardelli等，2002，Cytokine Growth Factor Rev12：119-34)。通过化学轭合生成MAb-IFNα的其他组揭示了此类构建体的一些潜在临床益处(Pelham等，1983，Cancer Immunol Immunother15：210-16；Ozzello等，1998，Breast Cancer Res Treat48：135-47)。包含鼠类IFNα和抗HER2/neu MAb的重组MAb-IFNα在具有免疫活性的小鼠中表现出对转基因(HER2/neu)鼠类B细胞淋巴瘤的强效抑制，并且还能够根据免疫记忆诱发保护性适应性免疫反应(Huang等，2007，JImmunol179：6881-88)。
我们预期20-2b疗法将刺激包括NK、T4、T8和树突细胞的多种免疫细胞的局部募集和活化，导致加强的细胞毒性和ADCC，并可潜在地诱发肿瘤定向免疫记忆。然而，对于人类IFNα2b，鼠类细胞的敏感度相对人类细胞极大地降低(约4log)(Kramer等，1983，JInterferon Res3：425-35；Weck等，1981，J Gen Virol57：233-37)。因此，在上述小鼠模型体内研究中，即使有，也是非常少的20-2b的抗淋巴瘤活性可归因于IFNα2b对小鼠免疫反应的活化。反而，死亡主要是由于IFNα2b对淋巴瘤细胞的直接作用。
我们已经显示20-2b可增强ADCC，这可能是抗CD20免疫疗法的最重要的MOA。然而，由于人类IFNα2b仅为鼠类宿主免疫效应细胞的非常弱刺激剂，所以可能不会像在人类中那样实现IFNα增强的ADCC。即使具有这些局限性，体内结果仍表明20-2b可为高效的抗淋巴瘤剂，在IFNα敏感性Daudi模型中表现出比v-mab或非靶向性MAb-IFNα多100倍的效力。即使在对IFNα直接作用相对不敏感(Raji/NAMALWA)或对抗CD20免疫疗法具有抗性(NAMALWA)的淋巴瘤模型中，20-2b仍显示出比v-mab或非靶向的MAb-IFNα更高的功效。
IFNα2b至v-mab的融合通过延长循环时间和允许肿瘤靶向而增强其体内效力。在Daudi模型中展示出Pk的治疗显著性，其中较慢清除的PEGASYS优于比较快清除的PEG-内含子，尽管后者具有更高的特异性活性(数据未示出)。20-2b比PEGASYS或734-2b都有显著更大的效力，表明通过抗CD20MAb靶向淋巴瘤对于其更优效力和功效起到决定性作用。出乎意料的是，靶向的影响甚至在体外测定法中也很显著。在体外增殖实验中，仅允许通过信号传导对淋巴瘤进行抑制，相对于非靶向的MAb-IFNα，不论在单独或联合v-mab的情况下，20-2b均在相对低25倍的浓度下表现出活性。离体配置允许涉及到所有的三种抗CD20MOA。即使没有CDC活性，不论在单独或联合的情况下，20-2b都比IFNα或v-mab更有效地从血液中消耗淋巴瘤，表明了靶向的重要性。而在体外/离体研究中MAb靶向的影响多少有些出乎意料，因为MAb、效应子和靶标细胞在整个实验中全部受限。我们预期在人类患者的体内实验中，20-2b将具有大体上更大的影响。
20-2b的IFNα2b和v-mab组成部分很显然可以加和或协同作用，以促成其增强的效力。体外增殖测定法表明有至少一种加和作用，其通过在离体研究中得到联合v-mab和734-2b优于单独使用任何一种剂的结果证实。这可通过增加作为20-2b的一部分的v-mab的ADCC活性或者与734-2b联合时离体实现，然而在体外增殖测定法中ADCC仍然不具功能性，表明存在其他机制。结合v-mab的CD20引起的信号转导可增强IFNα信号，导致增强的效力。可选地，与v-mab(其为一种缓慢内化的MAb)结合可防止I型IFN受体的内化/下调，产生更长时间和有效的IFNα诱导信号。
实施例9.(Fab)2-干扰素-λ1的DNL构建体对所靶向的细胞显示有效的生物活性
概述和引言
干扰素λ1(IFN-λ1)是近来被描述为II类细胞因子家族成员的III型干扰素，关于抗病毒和抗肿瘤活性以及免疫系统调节具有治疗潜力。IFN-λ，如I型IFN一样(包含IFN-α和IFN-β)，通过JAK/STAT途径触发信号转导，包括JAK1和TYK2激酶的活化、STAT蛋白的磷酸化以及IFN刺激的基因因子3的转录复合物的活化(Witte等，2010，Cytokine Growth Factor Rev21：237-51；Zhou等，2007，J Virol81：7749-58)。
III型IFN与I型IFN之间的主要差异在于其相应的受体复合物的分布。IFN-α/β通过两种广泛表达的I型干扰素受体进行信号传导，这至少部分造成了与IFN-α/β疗法相关的全身毒性(Pestka，2007，JBiol Chem282：20047-51)。相比之下，IFN-λ通过包含IFN-λ受体1(IFN-λR1)和IL-10受体2(IL-10R2)的异源二聚受体复合物进行信号传导。而IL-10R2在造血细胞和非造血细胞中普遍表达，IFN-λR1具有高度受限的表达模式，其中在上皮细胞、黑素细胞和肝细胞中水平最高，而在原发性中枢神经系统细胞中水平最低(Wolk等，2005，GenesImmun6：8-18)。尽管血液免疫细胞表达IFN-λR1，但其由于分泌可抑制IFN-λ1的作用的IFN-λR1短剪接变体而展现对IFN-λ的响应受损(Witte等，2009，Genes Immun10：702-14)。神经元细胞和免疫细胞的有限响应性还促使IFN-λ的毒性相比于I型IFN有所降低(Witte等，2009，Genes Immun10：702-14)。
IFN-λ显示与IL-10有关的细胞因子类似的结构特征，但展现I型IFN类抗病毒和抗增殖活性(Witte等，2010，Cytokine Growth FactorRev21：237-51；Ank等，2006，J Virol80：4501-9；Robek等，2005，J Virol79：3851-54)。例如，研究已表明IFN-λ1和IFN-λ2可减少病毒复制或各种病毒的细胞病变作用，所述病毒包括DNA病毒，例如乙型肝炎病毒(Robek等，2005，J Virol79：3851-54；Doyle等，2006，Hepatology44：896-906)和2型单纯疱疹病毒(Ank等，2006，J Virol80：4501-9)；正义单链RNA病毒，例如脑心肌炎病毒(EMCV)(Sheppard等，2003，NatImmunol4：63-68)和丙型肝炎病毒(HCV)(Robek等，2005，J Virol79：3851-54；Doyle等，2006，Hepatology44：896-906)；负义单链RNA病毒，例如水泡性口炎病毒(Kotenko等，2003，Nat Immunol6：69-77；Pagliaccetti等，2008，J Biol Chem283：30079-89)和甲型流感病毒(Jewell等，2010，J Virol84：11515-22)；以及双链RNA病毒，例如轮状病毒(Pott等，2011，PNAS USA108：7944-49)。IFN-λ3已经根据遗传研究被鉴定为HCV感染中的关键细胞因子(Ge等，2009，Nature461：399-401)，并且具有针对EMCV的最有效活性(Dellgren等，2009，Genes Immun10：125-31)。
还已经在若干种人类癌症细胞系中确定了IFN-λ的抗增殖活性，包括神经内分泌癌BON1(Zitzmann等，2006，BBRC344：1334-41)、胶质母细胞瘤LN319(Meager等，2005，Cytokine31：109-18)、永生化角质形成细胞HaCaT(Maher等，2008，Cancer Biol Ther7：1109-15)、黑色素瘤F01(Guenterberg等，2010，Mol Cancer Ther9：510-20)和食道癌TE-11(Li等，2010，Eur J Cancer46：180-90)。在动物模型中，IFN-λ通过先天性和适应性免疫反应诱导肿瘤细胞凋亡和消除，这表明IFN-λ的局部递送可能是人类恶性肿瘤治疗中的有用策略(Numasaki等，2007，J Immunol178：5086-98；Sato等，2006，J Immunol176：7686-94)。
轭合于20-kDa聚乙二醇的人类IFN-λ1(PEG-IFN-λ1)目前正处于慢性HCV感染治疗的临床开发中。在Ib阶段研究中，在每个剂量(0.5-3.0μg/kg)下都观察到抗病毒活性，并且当将PEG-IFN-λ1施用至在IFN-α疗法后复发的基因1型HCV患者时，病毒载量从2.3降至4.0log(Muir等，2010，Hepatology52：822-32；Ramos，2010，J InterferonCytokine Res30：591-95)。IIb阶段研究(Zeuzem等，2011，J Hepatology54：5538-39)报道了HCV患者(基因1型和4型)对于用PEG-IFN-λ1治疗相比于PEG-干扰素α-2a治疗具有显著更高的反应率，并且利用PEG-IFN-λ1相比于利用PEG-干扰素α-2a的其他优点包括不良事件频率较低、流感样症状、贫血和肌肉骨骼症状的频率降低，以及很少观察到中性粒细胞减少和血小板减少。然而，与PEG-干扰素α-2a相比，在最高剂量PEG-IFN-λ1中可见更高比率的肝毒性(Zeuzem等，2011，J Hepatology54：5538-39)。为了改善IFN-λ1的效力和安全性概况，我们构建了模块DOCK-AND-LOCKTM(DNLTM)复合物来栓系这种细胞因子与呈Fab蛋白的稳定化二聚体形式的靶向抗体。
将源自人源化抗体hRS7(抗Trop2)、hMN15(抗CEACAM6)、hL243(抗HLA-DR)或c225(嵌合抗EGFT)的Fab-DDD2模块二聚化并与AD2-IFN-λ1连接以分别产生免疫细胞因子(E1)-λ1、(15)-λ1、(C2)-λ1和(c225)-λ1。本领域普通技术人员将认识到，本发明并不限于示例性抗体，而是可利用任何已知抗体来实施。评价干扰素-抗体构建体的生物活性并与所靶向细胞系和非靶向细胞系中的重组人类IFN-λ1(rhIFN-λ1)进行比较。我们观察到(E1)-λ1中的hRS7Fab二聚体使IFN-λ1针对若干种Trop2-阳性细胞系的体外效力显著增大(约1000倍)，所述细胞系包括人类子宫颈癌ME-180(EC50＜0.1pM)、肺鳞癌SK-MES-1(最大60％抑制)和食道癌TE-11(最大45％抑制)。类似地，在CEACAM6-阳性ME-180细胞(EC50＜1pM)和TE-11细胞中，hMN15Fab二聚体使IFN-λ1介导的生长抑制显著增强(约100倍)，但在CEACAM6阴性SK-MES-1细胞中并非如此。
为了研究(Fab)2-IFN-λ1的抗病毒活性，我们比较了rhIFN-λ1、(15)-λ1和(C2)-λ1对于脑心肌炎病毒(EMCV)感染和在表达CEACAM6而非HLA-DR的A549细胞中复制的影响。结果显示，rhIFN-λ1和(Fab)2-IFN-λ1都可有效地预防EMCV诱导的细胞病变作用，但(15)-λ1显示比rhIFN-λ1高6倍并且比(C2)-λ1高10倍的抗病毒功效。其他研究显示，在所靶向的细胞中，(Fab)2-IFN-λ1可增强信号转导子和转录激活子(STAT)1、2和3的磷酸化(Jak-STAT信号转导的激活中的关键事件)，以及I类主要组织相容性复合物(MHC I)的细胞表面表达，其促进抗原呈现。这些数据共同表明，通过靶向结合Fab抗体片段所介导的IFN-λ1的细胞表面固定化可以显著增强其在所靶向的细胞中的效力并改善体内安全性概况。本领域技术人员将认识到，这些作用不限于Fab抗体片段，而是还会出现在完整抗体或其他抗体片段中。这些结果显示，包含连接至IFN-λ1的靶向抗体或抗体片段的DNLTM复合物可被用作治疗剂来治疗癌症、感染性疾病、哮喘或多发性硬化症。
材料和方法
抗体和试剂-人源化抗体hA20-IgG(抗CD20)、hRS7-IgG(抗Trop-2)、hMN15-IgG(抗CEACAM6)和hL243(抗HLA-DR)是来自Immunomedics，Inc。重组人类IFN-λ1、针对人类IFN-λ1的小鼠mAb和针对人类HLA-ABC的小鼠FITC-IgG1k是购自R&D Systems Inc。包含连接至突变体(C171S)或野生型IFNλ1的AD2部分和聚His序列的融合蛋白的氨基酸序列于下面显示。针对STAT1、STAT3、pY-STAT1和pY-STAT3的兔抗体是购自Cell Signaling Technology Inc。STAT2抗体是来自Santa Cruz Biotechnology。pY-STAT2抗体是来自MilliporeCorporation。
野生型：AD2-IFN-λ1
MCGQIEYLAKQIVDNAIQQAGCEFPKPSTPPGSSGGAPAMDGPVPTSKPTTTGKGCHIGR FKSLSPQELASFKKARDALEESLKLKNWSCSSPVFPGNWDLRLLQVRERPVALEAELAL TLKVLEAAAGPALEDVLDQPLHTLHHILSQLQACIQPQPTAGPRPRGRLHHWLHRLQEA PKKESAGCLEASVTFNLFRLLTRDLKYVADGNLCLRTSTHPESTVEHHHHHH(SEQ IDNQ：96)
突变体：AD2-IFN-λ1-C171S
MCGQIEYLAKQIVDNAIQQAGCEFPKPSTPPGSSGGAPAMDGPVPTSKPTTTGKGCHIGR FKSLSPQELASFKKARDALEESLKLKNWSCSSPVFPGNWDLRLLQVRERPVALEAELAL TLKVLEAAAGPALEDVLDQPLHTLHHILSQLQACIQPQPTAGPRPRGRLHHWLHRLQEA PKKESAGCLEASVTFNLFRLLTRDLKYVADGNLSLRTSTHPESTVEHHHHHH(SEQ IDNO：97)
AD2-IFN-λ1的表达和纯化-为了产生用于DNLTM复合物形成的IFN-λ1模块，合成包含AD2、铰链接头和为在大肠杆菌中表达而优化的人类INF-λ1(C171S)的合成DNA序列(图8A)并克隆至pET-26b载体的Msc I和Xho I位点中。用质粒转化的Rosetta-pLysS细胞(Novagen)在37℃下补充有100μg/ml硫酸卡那霉素和34μg/ml氯霉素的Difco 2xYT肉汤(Becton Dickinson)中生长。当细胞密度达到OD600为1.0时，加入IPTG至0.5mM并在30℃下诱导蛋白质表达持续4小时。通过离心收集细胞并在-80℃下冷冻过夜。将团块解冻并在溶解缓冲液(2％Triton-X100、5mM MgSO4、10单位/毫升核酸酶(benzonase)(Novagen)、100μM AEBSF、20mM Tris-HCl，pH8.0)中均质化。匀浆液在18,000RPM下离心30分钟并且将团块在PBS/1％Triton X-100中再次均质化，然后再次形成团块。将团块溶解在20ml的6M盐酸胍、100mM磷酸钠(pH8.0)中并上样到His-Select亲和柱(GE-Healthcare)上，然后用6M胍、50mM磷酸钠(pH8.0)洗涤。在4M盐酸胍、100mM NaH2PO4(pH4.5)中洗脱蛋白质，并且通过加入200μL的3M Tris-HCl(pH8.6)中和，加入DTE至60mM并且使溶液在室温下保持过夜。将还原的变性蛋白质溶液快速稀释于0.5M精氨酸、20mM氧化型谷胱甘肽、2mM EDTA、100mM Tris(pH8.0)中，然后针对5L复性缓冲液(0.5M精氨酸、2mM氧化型谷胱甘肽、0.6mM DTE、2mM EDTA、20mM Tris(pH8.0))进行透析并在4℃下保持72小时。然后针对PBS-AG-2缓冲液(35.2mM Na2PO4.7H2O；0.4M NaCl；6.5mM NaH2PO4.H2O；150mM精氨酸；150mM谷氨酸，pH8.0)透析溶液。将最终产物浓缩至约0.5mg/ml并利用SDS-PAGE进行分析。
DNL TM 构建体-通过hRS7-、hMN15-或hL243-Fab-DDD2模块与AD2-IFN-λ1模块融合形成DNLTM复合物来生成(Fab)2-IFN-λ1轭合物，包括(E1)-λ1、(15)-λ1和(C2)-λ1(图8B)，如先前所述(参见例如美国专利No.7,521,056、7,527,787、7,550,143、7,534,866、7,666,400、7,858,070、7,871,622、7,901,680、7,906,118、7,906,121、7,981,398和8,003,111，其各自的实施例部分以引用的方式并入本文中)。根据来自DrugBank的序列(登录号：DB00002)来构建c225-Fab-DDD2模块。依序在Kappa-select和His-select柱上纯化产物并利用SDS-PAGE在还原和非还原条件下使用4-20％Tris-甘氨酸凝胶(未示出)进行分析。
细胞培养和表面结合-TE-11由Hiroshi Nakagawa博士(宾夕法尼亚大学)友情提供。Huh-7和T.Tn是购自日本研究生物资源保藏中心(Japanese Collection of Research Bioresources)。所有其他细胞系是购自美国典型培养物保藏中心。ME-180、TE-11和A375细胞在含10％FBS(Hyclone)的RPMI1640培养基(Invitrogen)中生长。HepG2、Huh-7和SK-MES-1细胞在含10％FBS的EMEM培养基(ATCC)中生长。A549在含10％FBS的F12培养基(InVitrogen)中生长，并且T.Tn在含10％FBS的DMEM/F12培养基(InVitrogen)中生长。所有细胞系都在37℃下在5％CO2的潮湿气氛中培养。
对于结合测定法，对细胞进行短暂的胰蛋白酶消化，悬浮在新鲜培养基中并形成团块，然后用10μg/ml人源化mAb或在1％BSA-PBS中连续稀释的基于IFN-λ1的剂再次悬浮。在4℃下温育45分钟后，将细胞形成团块并用1％BSA-PBS洗涤两次，在4℃下与FITC标记的山羊抗人类IgG-Fc或小鼠抗人类IFN-λ1一起温育45分钟，然后用FITC标记的山羊抗小鼠IgG-Fc探测。在三次洗涤之后，利用流式细胞测量术测量结合。为了研究MHC I表达的变化，使细胞暴露于IFN-λ1剂持续3天，并且通过与针对人类HLA-ABC的FITC标记的小鼠IgG1k结合来检测其表面MHC1。使用FITC标记的非特异性小鼠IgG1k作为阴性对照。
体外增殖-将ME-180、SK-MES-1、TE-11和T.Tn细胞以1000个细胞/孔的密度播种于96孔板中并在37℃下温育过夜，然后暴露于递增浓度的IFN-λ1剂，持续4天。使用CellTiter96细胞增殖测定法(Promega)测定活细胞密度。
抗病毒测定法-使用稳定的含有HCV基因1b型Con1复制子的Huh-7细胞系(称为Huh-7-Con1)，利用HD Biosciences(China)Co.，Ltd(Shanghai，China)测量IFN-λ1和2(Fab)-λ1的抗HCV活性。将萤火虫荧光素酶基因整合到这个复制子中作为病毒水平的报告基因。该测定法中包括三种IFN-λ1剂，(c225)-λ1、(C2)-λ1和rhIFN-λ1。其中，(c225)-λ1包含特异性靶向Huh-7细胞表面上的EGFR的嵌合mAb的两个Fab，而(C2)-λ1和rhIFN-λ1是两个非靶向对照物。Huh-7-Con1细胞用这三种剂处理3天，并且通过测量荧光素酶活性来测定病毒复制水平。同时，还使用CellTiter Glo试剂盒(Promega)评价了这些剂对于亲本Huh-7细胞的细胞毒性。
在另一项测定法中，使用利用PBL Interferon Source(Piscataway，NJ)进行的细胞病变作用抑制测定法在具有EMCV的A549细胞上测量(15)-λ1的抗病毒活性。该测定法中包括hMN-15-Fab-DDD2作为阴性对照，rhIFN-λ1标准物(PBL Interferon Source)作为阳性对照，以及(C2)-λ1作为结构对应物的非靶向对照。
免疫印迹法(Western blot)-将ME-180、HepG2和A375细胞以5×105个细胞/孔的密度涂铺于6孔板中并在37℃下温育过夜。为了评价STAT活化，用递减浓度的所示IFN-λ1剂处理细胞1小时，然后用PhosphoSafeTM提取试剂(EMD)溶解。在SDS-PAGE上离析细胞溶解产物，转移至硝基纤维素膜(Bio-Rad)上，然后用针对总STAT1、STAT2或STAT3的兔抗体和磷酸酪氨酸特异性抗体pY-STAT1、pY-STAT2或pY-STAT3产生印迹，用HRP-山羊抗兔抗体检测。将β-肌动蛋白抗体用作上样对照。
向四组8周龄的雌性无胸腺裸小鼠(Taconic，Germantown，NY)皮下注射2.4nmol的(E1)-λ1并在6小时、16小时、24小时和48小时采血。使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测量完整(E1)-λ1的血清浓度。使用WinNonLin非房室分析程序(5.3版，Pharsight Corporation，St.Louis，MO)计算药物动力学参数。为了证实ELISA的结果，还通过ME-180细胞的离体增殖测定法，使用(E1)-λ1作为标准物，评价了IFN-λ1在选择性血清样品中的生物活性。
RT-PCR分析。用IFN-λ1剂处理HepG2细胞24小时并使用试剂(Life Technologies)分离总RNA。使用III单步RT-PCR系统(Life Technologies)利用正向和反向引物在以下条件下分析粘病毒抗性A(MxA)基因的mRNA表达：cDNA合成-55℃/30分钟持续一个循环以及PCR-94℃/15秒、62℃/30秒、68℃/30秒持续25个循环。在与内部对照类似的条件下扩增甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)cDNA的452-bp片段。
小鼠中的药物动力学.向四组8周龄的雌性无胸腺裸小鼠(Taconic，Germantown，NY)皮下注射2.4nmol的(E1)-λ1并在6小时、16小时、24小时和48小时采血。使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测量完整(E1)-λ1的血清浓度。使用WinNonLin非房室分析程序(5.3版，Pharsight Corporation，St.Louis，MO)计算药物动力学参数。为了证实ELISA的结果，还通过ME-180细胞的离体增殖测定法，使用(E1)-λ1作为标准物，评价了IFN-λ1在选择性血清样品中的生物活性。
统计分析。使用Prism GraphPad软件包(Advanced GraphicsSoftware，Rancho Santa Fe，CA)用F检验测定所有结果的统计显著性(P＜0.05)。
结果
(Fab) 2 -IFN-λ1的生成和表征-将点突变(C171S)引入野生型IFN-λ1序列中以消除具有DNL模块的再折叠和组装的未配对半胱氨酸残基的潜在干扰。在大肠杆菌中产生AD2-IFN-λ1模块的重组形式并通过固定化金属离子亲和色谱法(IMAC)在变性条件下从包涵体中纯化。用二硫苏糖醇(DTE)还原蛋白质，然后在含有氧化型谷胱甘肽的再折叠缓冲液中再折叠以允许形成二硫键。如利用SDS-PAGE(未示出)所测定，AD2-IFN-λ1蛋白质被高度纯化并主要以单体状态存在。最终产物的产量为约6mg/ml大肠杆菌细胞培养物。
如图8B中所示，通过将AD2-IFN-λ1模块与Fab-DDD2模块组合来生成(Fab)2-IFN-λ1轭合物。在目前的研究中，将hRS7、hMN15或hL243的Fab-DDD2模块与摩尔过量的AD2-IFN-λ1混合，并且与1mmol/L的还原型谷胱甘肽温育过夜，随后添加氧化型谷胱甘肽(2mmol/L)。利用Kappa-select柱纯化反应混合物，并且成功地生成四种轭合物(E1)-λ1、(15)-λ1、(C2)-λ1和(c225)-λ1。利用SDS-PAGE显示这些轭合物的纯度，其在还原性凝胶中离析三个谱带(Fab DDD2-重链、Fab轻链和AD2-IFN-λ1)以及在非还原性凝胶中离析主要高分子量带(未示出)。
抗原的细胞表面表达-通过流式细胞测量术测定Trop-2、CEACAM6、HLA-DR和EGFR在七种人类癌症细胞系(子宫颈癌，ME-180；食道癌，TE-11；肺癌，A549、SK-MES-1；肝癌，HepG2、Huh-7；和黑色素瘤-皮肤癌，A375)的细胞表面上的表达水平。如图9中所示，Trop-2在ME-180和TE-11细胞上高度表达，并且在SK-MES-1细胞上中度表达。除了A375和SK-MES-1之外，CEACAM6在所有其他细胞系上表达，其中在A549和HelpG2细胞上的水平最高。A375细胞系显示HLA-DR的高表达。观察到EGFR对于Huh-7、ME-180、TE-11、SK-MES-1和A549的高表达。这些数据提供了(Fab)2-IFN-λ1的细胞特异性靶向的进一步研究的基础。
(Fab) 2 -IFN-λ1在细胞表面上的增强的固定化-与AD2-IFN-λ1模块相比，(Fab)2-IFN-λ1显示与所靶向细胞的结合亲和性显著增强。在8nM的浓度下，如由小鼠抗人类IFN-λ1mAb所检测，相比于AD2-IFN-λ1模块，(E1)-λ1对于ME-180的结合信号高107倍(图10A)，(15)-λ1对于HepG2的结合信号高15倍(图10B)，并且(C2)-λ1对于A375细胞的结合信号高508倍(图10C)。这些数据显示与(Fab)2轭合的IFN-λ1展现在所靶向的细胞表面上显著增强的固定化。
体外生长抑制和细胞毒性-鉴定子宫颈癌ME-180为对IFN-λ1高度敏感的细胞系。rhIFN-λ1在高于10nM的浓度下几乎完全抑制细胞生长，并且AD2-IFN-λ1模块显示与rhIFN-λ1相等的活性(EC50＝0.1nM，数据未示出)。在靶向轭合物(E1)-λ1中IFN-λ1对于ME-180的特异性活性显著增强(EC50＜0.1pM)，其比AD2-IFN-λ1或者AD2-IFN-λ1与AD2-hRS7-Fab的组合高1000倍以上(图11)。与ME-180相比，肺鳞癌SK-MES-1和食道癌TE-11细胞对IFN-λ1的敏感性较小并且在最高浓度的IFN-λ1下仅显示分别为最大60％和45％的生长抑制(未示出)。然而，在这两种细胞系中仍观察到(E1)-λ1的增强的活性，比AD2-IFN-λ1或者AD2-IFN-λ1与AD2-hRS7-Fab的组合高约1000倍(未示出)。此外，我们评价了(15)-λ1对于CEACAM6-阳性ME-180和TE-11细胞系的活性。如图12中所示，(15)-λ1展现比AD2-IFN-λ1或者AD2-IFN-λ1与hM[N15-IgG-AD2的组合高100倍的活性。(15)-λ1对于ME-180的EC50为约1pM，其比(E1)-λ1高10倍。
抗病毒活性-分别在Huh-7和A549细胞中测量了选择性2(Fab)-λ1构建体针对HCV和EMCV的抗病毒活性。在表达EGFR的Huh-7细胞中，在抑制HCV复制时，(c225)-λ1(EC50＝0.56pM)比非靶向性(C2)-λ1(EC50＝91.2pM)和商业rhIFN-λ1(EC50＝69.2pM)分别更有效163倍和123倍(图13A)。在表达CEACAM6的A549细胞中，(15)-λ1相比于非靶向性(C2)-λ1和rhIFN-λ1分别显示高10倍和6倍的抗EMCV活性(图13B)。值得注意的是，(C2)-λ1保留了rhIFN-λ1的65％至75％抗病毒活性。这些结果指示IFN-λ1的细胞表面靶向可以有效增强其抗病毒活性。
细胞信号传导-为了理解(Fab)2增强IFN-λ1活性的机制，我们比较了(Fab)2-IFN-λ1和AD2-IFN-λ1在三种细胞系中的信号传导活性。磷酸化测定法显示15-Fab-DDD2未在HepG2细胞中诱导任何STAT磷酸化，而AD2-IFN-λ1在0.1nM浓度下诱导可检测的磷酸化(未示出)。相比之下，(15)-λ1诱导三种STAT、特别是STAT1的显著更大磷酸化，显示出0.01nM(15)-λ1的信号传导活性几乎等于0.1nMAD2-IFN-λ1(未示出)。在(E1)-λ1靶向的ME-180和(C2)-λ1靶向的A375细胞中还显示了(Fab)2-IFN-λ1相对于AD2-IFN-λ1的STAT磷酸化增强(数据未示出)。
还通过流式细胞测量术研究了(15)-λ1在HepG2细胞中上调MHCI类抗原(MHC-I)的细胞表面表达的能力(未示出)。而用至多1nM的hMN-15-Fab-DDD2处理HepG2细胞持续三天使MHC-1的表面水平无变化(MFI约50)，在低至1pM的(15)-λ1处理的细胞中观察到MFI增加3倍以上(约170)。在100pM的(15)-λ1下，MHC-1的表达达到最大水平(MFI约270)。尽管AD2-IFN-λ1能够上调MHC-1，但其需要较高浓度(100pM)才有效(未示出)。
我们还研究了(15)-λ1诱导粘病毒抗性A(MxA)基因(IFN生物活性的可靠标记物)的表达的能力，并且利用RT-PCR测定结果。在未处理或被hMN-15-Fab-DDD2处理的HepG2细胞中，利用RT-PCR未能检测出MxA的mRNA(未示出)。在被0.1pM(15)-λ1或10pMAD2-IFN-λ1处理的细胞中MxA基因的诱导作用是明显的(未示出)，因此进一步证明了(15)-λ1优于AD2-IFN-λ1、特别是一般2(Fab)-λ1优于IFN-λ1的优势。
小鼠中的药物动力学。在单一剂量(2.4nmol)的皮下施用后，完整(E1)-λ1的平均血清浓度在6小时时达到高水平并且在48小时时降至ELISA检测限度以下(未示出)。源自非房室分析的药物动力学(PK)参数显示平均滞留时间为12小时，T1/2为8.6小时，并且清除速率为2.2ml/h。当使用MTS测定法还通过(E1)-λ1对于ME-180细胞的抑制活性来测量其在血清样品中的浓度时，结果在很大程度上一致(未示出)。
重组IFN-α在小鼠中具有非常快速的清除速率，显示平均滞留时间仅为0.7小时。因此，2(Fab)-λ1显示与PEG-IFN-α[37]和PEG-IFN-λ相当的显著改善的PK(未示出)。
讨论
包含IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3的III型干扰素(IFN)在引起抗病毒、抗肿瘤和免疫调节活性方面与IFN-α行为类似。由于其更受限的细胞靶标，IFN-λ对于作为基于IFN-α的现有治疗方案的潜在替代物具有吸引力。通过将源自hRS7(人源化抗Trop-2)、hMN-15(人源化抗CEACAM6)、hL243(人源化抗HLA-DR)和c225(嵌合抗EGFR)的稳定化Fab二聚体与IFN-λ1位点特异性地栓系在一起，形成分别被称为(E1)-λ1、(15)-λ1、(C2)-λ1和(c225)-λ1的新型免疫细胞因子，我们制备了包含抗体轭合IFN-λ1的DOCK-AND-LOCKTM复合物以提高IFN-λ1在所靶向的癌症细胞系中的抗增殖效力(至多1,000倍)。与非靶向性(C2)-λ1相比，通过(15)-λ1或(c225)-λ1将IFN-λ1靶向递送至各自的抗原表达细胞还显著增加了抗病毒活性，如针对脑心肌炎病毒的(15)-λ1在人类肺腺癌上皮细胞系A549中(EC50＝22.2pM对223pM)以及针对丙型肝炎病毒的(c225)-λ1在人类肝癌细胞系Huh-7中(EC50＝0.56pM对91.2pM)所示。这些令人惊讶和出乎意料的结果是归因于IFN-λ1向抗体所靶向的细胞的更好定位和更强结合，以及(E1)-λ1在小鼠中的有利的药物动力学概况(T1/2＝8.6小时)。
Trop-2和CEACAM6以相比于IFN-λ1的受体更高的水平表达于靶标细胞上(未示出)。因此，10倍多的IFN-λ1分子可以DNL轭合物形式结合于靶标细胞。Trop-2或CEACAM6与IFN-λ1的异源二聚受体的共连接还可使IFN-λ1的结合强度增加几乎100倍，如(E1)-λ1在ME-180中所示。免疫轭合的IFN-λ1的靶向递送相比于分别地单独或组合施用的抗体和干扰素提供了显著更大的对于肿瘤和感染性疾病治疗的生物活性。
正在利用PEG-IFN-λ1探索IFN-λ作为IFN-α的治疗替代物的潜力，其在临床研究中显示了相比于PEG-IFN-α-2a有所提高的安全性概况(Miller等，2009，Ann N Y Acad Sci1182：80-87；Ramos，2010，JInterferon Cytokine Res30：591-95)。然而，对于用PEG-IFN-λ1和PEG-IFN-α-2a处理的患者，一些严重不良事件(包括剂量限制性肝毒性)的发生率是类似的，而在用最高剂量的PEG-IFN-λ1处理的患者中甚至更频繁(Zeuzem等，2011，J Hepatology54：5538-38)。另一方面，针对某些癌症(Meager等，2005，Cytokine31：109-18)或病毒(Ank等，2006，J Interferon Cytokine Res26：373-79)，IFN-λ不如I型IFN有效。我们假定将IFN-λ连接至对于大量表达的表面抗原具特异性的抗体可增强其在靶标细胞的定位，从而产生更大的效力以及有希望使得对于非靶标细胞的毒性较小。因此，我们开发了四种基于IFN-λ的免疫细胞因子的原型，各自包含位点特异性轭合于Fab的稳定化二聚体的IFN-λ1，并显示了其相比于单独或组合的未轭合亲本模块的优越性。在抗肿瘤和抗病毒测定法中显示了改善的作用，并且这与可由组成性抗体实现的增强的细胞表面结合和信号转导相一致。
在抗肿瘤研究中，我们确定了ME-180作为对IFN-λ1最敏感的细胞系，其具有80％以上的最大抑制作用并且EC50相比于文献中所报道的其他细胞系低20倍(Zitzman等，2006，BBRC344：1334-41；Meager等，2005，Cytokine31：109-18；Maher等，2-8，Cancer Biol Ther7：1109-15；Guenterberg等，2010，Mol Cancer Ther9：510-20)。此外，Trop-2在ME-180上的大量表达使得这些肿瘤细胞对(E1)-λ1高度敏感，在1fM下可检测到生长抑制作用并且EC50(＜0.1pM)相比于AD2-IFN-λ1(EC50约100pM)低1000倍。在TE-11、SK-MES-1和其他癌症细胞系中还观察到抑制效力的类似增强。因为IFN-λ还诱导先天性和适应性免疫反应，这在此处未进行评价，并且考虑到显示IFN-λ在包括B16黑色素瘤、BNL肝细胞瘤和MCA205纤维肉瘤的若干种鼠类癌症细胞系中的组成性表达的近来研究，尽管缺乏体内抗增殖活性，但通过募集免疫细胞和相关细胞因子而显著抑制了同基因小鼠模型中的肿瘤生长和转移(Numasaki等，2007，J Immunol178：5086-98；Abushahba等，2010，Cancer Immunol Immunother59：1059-71：Lasfar等，2006，Cancer Res66：4468-77)，我们假定IFN-λ的靶向递送将类似于IFN-λ在癌细胞中的组成性表达，从而在癌症免疫疗法中产生局部免疫反应和增强的细胞毒性(Pardoll和Drake，2012，J Exp Med209：201-9)。
在抗病毒研究中，(c225)-λ1与以HCV基因1b型Con1复制子为主的EGFR-阳性Huh-7细胞的特异性靶向显示了抗病毒效力相比于非靶向性rhIFN-λ1和(C2)-λ1分别增强123倍和163倍。在另一项测定法中，将(15)-λ1靶向用EMCV激发的CEACAM6-阳性A549细胞显示了抗病毒保护相比于非靶向性rhIFN-λ1和(C2)-λ1分别提高6倍和10倍。(c225)-λ1与(15)-λ1之间的效力差异可能是由于其所靶向的细胞/病毒系统对IFN-λ1的敏感性不同。在先前的研究中(Marcello等，2006，Gastroenterol131：1887-98)，在Huh-7/HCV系统中rhIFN-λ1比rhIFN-α效力低10倍，但在A549EMCV中效力低210倍(Meager等，2005，Cytokine31：109-18)。尽管在靶标细胞中(15)-λ1诱导的抗病毒活性增强不如(c225)-λ1高，但考虑到聚乙二醇化IFN仅保留未聚乙二醇化IFN的约30％以下的活性，这仍然是一个显著的发现(Grace等，2005，J Biol Chem280：6327-36)，并且AD2-IFN-λ1的特异性活性与rhIFN-λ1类似。因此，2(Fab)-λ1可允许相比于目前临床研究中所用的PEG-IFN-λ1的剂量较低且频率相同或较小的给药方案。
作为治疗剂，重组IFN受其非常快速的清除速率的限制。基于先前的研究，重组IFN-α-2b、PEG-IFN-α-2a和PEG-IFN-α-2b分别显示0.7小时、14.9小时和9.3小时的半衰期(Rossi等，2009，Blood114：3864-71)。因此，(E1)-λ1在小鼠中与PEG-IFN-α相当的半衰期(8.6小时)对于体内治疗使用是有希望的。
实施例10.用于治疗阿尔茨海默氏病的(Fab)2-干扰素-λ1的DNL构建体
阿尔茨海默氏病(AD)是一种临床特征在于进行性记忆减退、精神混乱、身体逐渐恶化并最终死亡的退化性脑部病症。全世界范围内有约1500万人受到阿尔茨海默氏病侵扰。在组织学上，该疾病的特征为神经炎斑块，主要存在于联想皮质、边缘系统和基底神经节中。这些斑块的主要成分是淀粉样蛋白β肽(Aβ)，其为β淀粉样前体蛋白(βAPP或APP)的裂解产物。
Aβ似乎在阿尔茨海默氏病的神经病理学中具有关键作用。该疾病的家族形式与APP的突变和早衰基因有关联(Tanzi等，1996，Neurobiol.Dis.3：159-168；Hardy，1996，Ann.Med.28：255-258)。这些基因中的疾病相关突变导致42个氨基酸形式的Aβ的产生增加，所述形式是淀粉样蛋白斑块中存在的主要形式。用人类Aβ使过度表达疾病相关突变体形式的APP的转基因小鼠免疫可减少斑块负担和相关病变(Schenk等，1999，Nature400：173-177；WO99/27944)。针对Aβ的抗体的外周施用也降低脑部中的斑块负担(Bard等，2000，NatureMedicine6(8)：916-919；WO2004/032868；WO00/72880)。
抗体疗法为阿尔茨海默氏病的治疗和预防提供了一种有希望的方法。然而，用包括Aβ1-42的疫苗进行的人类临床试验由于患者子集中的脑膜脑炎而暂停。Orgogozo等，Neruology61：7-8(2003)；Ferrer等，Brain Pathol.14：11-20(2004)。用N端特异性抗Aβ抗体进行被动免疫导致弥漫性淀粉样蛋白显著减少，但转基因小鼠的脑部微出血频率增加。Pfeifer等，Science298：1379(2002)。仍然需要具有降低的毒性的用于治疗阿尔茨海默氏病的改善的抗体和/或免疫轭合物。
根据实施例9制备了包含连接至干扰素-λ1的阿仑单抗的DNLTM复合物。以2mg的剂量向诊断患有阿尔茨海默氏病的人类患者静脉内施用干扰素-抗体复合物，每周两次，持续4、8或12周。通过神经心理学测试测量功效，所述测试包括ADAS-cog和CERAD成套神经心理学测试。
在除最低剂量处理组之外的所有患者中，在12周的处理后观察到ADAS-cog的轻微(15％)改善。对于简易精神状态检查(MMSE)观察到类似的研究结果。在十分之四的患者中，视觉构建能力得到改善。未观察到干扰素-抗体施用的严重不良作用。
根据实施例9制备了包含连接至干扰素-λ1的米拉珠单抗(抗CD74人源化IgG)或其Fab片段的DNLTM复合物。以每周两次2mg的剂量向患有早期阿尔茨海默氏病的75岁妇女静脉内施用这种复合物，持续8周。在每次输液后注意到一些轻微的恶心和低血压迹象，这在随后3天内消退。通过认知能力测试(ADAS-cog)和CERAD成套神经心理学测试，在基线时和治疗后2周和8周时测量功效。结果指示，认知能力和一般心理学和交流状态提高20％。4个月后重复该治疗，其具良好耐受性，并且患者显示认知能力改善的维持，包括视觉构建能力。
根据实施例9制备了包含连接至干扰素-λ1的hL243(抗HLA-DR人源化IgG)或其Fab片段的DNLTM复合物。以每周两次1mg的剂量向患有阿尔茨海默氏病的82岁妇女静脉内施用这种复合物，持续8周。在每次输液后注意到一些轻微的恶心和低血压迹象，这在随后3天内消退。通过认知能力测试(ADAS-cog)和CERAD成套神经心理学测试，在基线时和治疗后2周和8周时测量功效。结果指示，认知能力和一般心理学和交流状态提高17％。4个月后重复该治疗，其具良好耐受性，并且患者显示认知能力改善的维持，包括视觉构建能力。
实施例11.用于治疗哮喘的(Fab)2-干扰素-λ1的DNL构建体
哮喘是一种异质性家族性疾病，其特征在于气管支气管对于刺激的高反应性。临床上，哮喘表现为气管支气管的广泛狭窄、分泌物浓稠粘滞、呼吸困难、咳嗽和喘息，从而导致气道阻力增加、肺部和胸部过度膨胀、通气和肺血流的异常分布。该疾病表现为无症状期之间穿插着急性症状发作期。急性发作导致缺氧，并且可能致命。总世界人口的约3％患有该疾病。哮喘症状可能由触发抗原的存在和水平、环境因素、职业因素、体力消耗以及情绪应激而加剧。尽管哮喘可用甲基黄嘌呤(例如茶碱)、β-肾上腺素能激动剂(例如儿茶酚胺、间苯二酚、水杨苷元和麻黄碱)、糖皮质激素(例如氢化可的松)、肥大细胞脱粒抑制剂(即色酮类如色甘酸钠)和抗胆碱能剂(例如阿托品)治疗，但仍需要用于治疗哮喘的改进的方法和组合物。
一名80岁男性支气管哮喘患者出现感冒和其哮喘的急性发作，频繁的咳嗽产生大量的浓稠黄色粘液。经6天时间每天两次通过气雾剂吸入向他施用(15)-λ1。如实施例9中所述制备抗体-干扰素复合物。在第一次吸入的几个小时内，他的呼吸明显改善，咳嗽不频繁。在这个治疗过程结束时，他的体力消耗状况似乎得到提高，情绪状态也如此，这是因为他的呼吸已经有改善并且粘液性咳嗽显著减少。
实施例12.用于治疗多发性硬化症的(Fab)2-干扰素-λ1的DNL构建体
多发性硬化症(MS)是一种自身免疫疾病，其中自身反应性T细胞穿越血脑屏障并攻击髓鞘，产生炎症并导致脱髓鞘和轴突变性。在青壮年中神经功能障碍的不可预测的发作之后是身体和认知障碍在离散攻击(复发型)中或随时间逐渐积累。尽管还没有已知的治愈方法，但干扰素-β疗法是目前用于复发性缓解型多发性硬化症的一线治疗，其在复发率降低方面显示功效。然而，IFN疗法与显著发病率相关联，具有诸如流感样症状、骨髓抑制、自身免疫疾病的发展或恶化、中性粒细胞减少、血小板减少和神经精神影响等副作用。
如实施例9中所述制备了包含连接至干扰素-λ1的阿仑单抗的DNLTM复合物。每四周向患有复发性多发性硬化症(RMS)的64岁女性施用2mg复合物。在12个月的治疗后，在复合物情况下观察到年度复发率下降和失能持续进展的风险降低。与基线测量结果相比，注意到每个T1加权MRI扫描的钆增强病灶显著减少。副作用包括1/2级输液反应、1级低血压和有些过敏，这些都可用皮质类固醇良好控制。

Claims (37)

1.一种治疗癌症、病毒感染、哮喘或多发性硬化症的方法，其包括：
a)获得干扰素-抗体复合物，其包含：
i)第一融合蛋白，其包含连接至AKAP蛋白质的锚定结构域(AD)部分的干扰素-λ；
ii)第二融合蛋白，其包含连接至人类蛋白激酶A(PKA)RIα、RIβ、RIIα或RIIβ的二聚化和停靠结构域(DDD)部分的抗体或抗原结合抗体片段；以及
b)向具有癌症、病毒感染、哮喘或多发性硬化症的受试者施用所述干扰素-抗体复合物；
其中两个拷贝的所述DDD部分形成二聚体，所述二聚体结合于所述AD部分以形成所述复合物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述干扰素-λ选自由人类干扰素-λ1、干扰素-λ2和干扰素-λ3组成的群组。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体或抗体片段结合于选自由以下组成的群组的抗原：碳酸酐酶IX、CCCL19、CCCL21、CSAp、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、AFP、PSMA、CEACAM5、CEACAM-6、B7、纤维连接蛋白的ED-B、因子H、FHL-1、Flt-3、叶酸受体、gp41、gp120、GRO-β、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF)、HM1.24、胰岛素样生长因子-1(ILGF-1)、IFN-λ、IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、IP-10、MAGE、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、PAM4抗原、NCA-95、NCA-90、Ia、HM1.24、EGP-1、EGP-2、HLA-DR、腱生蛋白、Le(y)、RANTES、T101、TAC、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、TNF-α、TRAIL受体(R1和R2)、VEGFR、EGFR、PlGF、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5以及致癌基因产物。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体或其抗体片段结合于选自由以下组成的群组的抗原：TROP-2、CEACAM5、CEACAM6、HLA-DR、CD19、CD20、CD22、CD52、CD74和EGFR。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体或抗体片段选自由hLL1、hLL2、RFB4、hRS7、hPAM4、hMN-3、hMN-14、hMN-15、hMu-9、Immu31、hL243、hA19、hA20、阿仑单抗和hR1组成的群组。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体片段选自由Fab、Fv、scFv和dAb组成的群组。
7.如权利要求1所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用其他治疗剂。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述治疗剂选自由第二抗体、第二抗体片段、第二干扰素、药物、毒素、酶、激素、免疫调节剂、细胞因子、趋化因子、反义寡核苷酸、siRNA、RNAi、放射性核素、硼化合物、光敏剂、抗血管生成剂和促凋亡剂组成的群组。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述药物选自由以下组成的群组：5-氟尿嘧啶、阿普立定、阿扎立平、阿那曲唑、蒽环类、苯达莫司汀、博莱霉素、硼替佐米、Bruton激酶抑制剂、苔藓抑素-1、白消安、刺孢霉素、喜树碱、卡铂、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、西乐葆、苯丁酸氮芥、顺铂(CDDP)、Cox-2抑制剂、伊立替康(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉曲滨、喜树碱类、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、多西紫杉醇、更生霉素、柔红霉素、阿霉素、2-吡咯啉基阿霉素(2P-DOX)、氰基-吗啉基阿霉素、阿霉素葡糖苷酸、表柔比星葡糖苷酸、雌莫司汀、表鬼白毒素、雌激素受体结合剂、依托泊苷(VP16)、依托泊苷葡糖苷酸、磷酸依托泊苷、氟尿苷(FUdR)、3′，5′-O-二油酰基-FudR、氟达拉滨、氟他胺、法尼基-蛋白转移酶抑制剂、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、左旋天冬酰胺酶、来那度胺、甲酰四氢叶酸、洛莫司汀、氮芥、美法仑、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、光神霉素、丝裂霉素、米托坦、诺维本、亚硝基脲、普卡霉素、丙卡巴肼、紫杉醇、喷司他丁、PSI-341、雷洛昔芬、司莫司汀、链脲菌素、他莫昔芬、紫杉酚、替莫唑胺、反铂、沙利度胺、硫鸟嘌呤、噻替哌、替尼泊苷、拓扑替康、酪氨酸激酶抑制剂、尿嘧啶氮芥、长春瑞滨、长春碱、长春新碱、长春花生物碱、LFM-A13、达沙替尼、伊马替尼以及尼洛替尼。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述毒素选自由蓖麻毒素、相思子毒素、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)、豹蛙酶、DNA酶I、葡萄球菌属肠毒素-A、商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌属外毒素和假单胞菌属内毒素组成的群组。
11.如权利要求8所述的方法，其中所述抗血管生成剂选自由以下组成的群组：血管抑制素、杆抑素、血管能抑素、乳腺丝抑蛋白、抗VEGF抗体、抗PlGF抗体、层粘连蛋白肽、纤维连接蛋白、纤溶酶原激活物抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白细胞介素-12、IP-10、Gro-β、血小板反应蛋白、2-甲氧基雌二醇、增殖蛋白相关蛋白、羧基酰氨三唑、CM101、马立马司他、戊聚糖多硫酸酯、血管生成素-2、干扰素-α、除莠霉素A、PNU145156E、16K泌乳素片段、利诺胺(罗喹美克)、沙利度胺、己酮可可碱、染料木素、TNP-470、内皮抑制素、紫杉醇、accutin、血管抑制素、西多福韦、长春新碱、博莱霉素、AGM-1470、血小板因子4以及米诺环素。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述AD部分的氨基酸序列选自由以下组成的群组：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：32、SEQ IDNO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ IDNO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ IDNO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ IDNO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ IDNO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ IDNO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ IDNO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ IDNO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ IDNO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ IDNO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ IDNO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ IDNO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ IDN0：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83和SEQ ID NO：84。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述DDD部分的氨基酸序列选自由以下组成的群组：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30和SEQ IDNO：31。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述干扰素-抗体复合物比单独的所述干扰素、单独的所述抗体或未轭合的干扰素与抗体的组合更有效。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的群组：急性成淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、胆癌、乳腺癌、子宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、头颈癌、霍奇金淋巴瘤、肺癌、甲状腺髓样癌、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾癌、卵巢癌、胰腺癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、肝癌、前列腺癌以及膀胱癌。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述病毒感染选自由以下组成的群组：人类免疫缺陷病毒(HIV)、疱疹病毒、单纯疱疹病毒、牛痘病毒、巨细胞病毒、狂犬病毒、流感病毒、鼻病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、仙台病毒、猫白血病病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、人类血清细小样病毒、猿猴病毒40、呼吸道合胞病毒、小鼠乳腺肿瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒、登革病毒、风疹病毒、麻疹病毒、腺病毒、人类T细胞白血病病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、鼠类白血病病毒、腮腺炎病毒、水泡性口炎病毒、辛德毕斯病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、疣病毒以及蓝舌病毒。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述病毒感染为慢性丙型肝炎感染。
18.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体为抗HIV抗体、抗gp120抗体、抗gp41抗体、抗HCV抗体、抗疟疾抗体、抗原生动物抗体、抗血吸虫抗体、抗锥虫抗体、抗细菌抗体、抗病毒抗体和抗真菌抗体。
19.如权利要求1所述的方法，其中所述疾病为哮喘或多发性硬化症。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述疾病为哮喘并且所述复合物是通过鼻施用来施用的。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述抗体或抗体片段为抗TNF、抗CD74或抗MIF抗体或抗体片段。
22.一种治疗癌症、病毒感染、哮喘或多发性硬化症的方法，其包括：
a)获得干扰素-抗体复合物，其包含：
i)第一融合蛋白，其包含连接至人类蛋白激酶A(PKA)RI、RIβ、RII或RIIβ的二聚化和停靠结构域(DDD)部分的干扰素-λ；
ii)第二融合蛋白，其包含连接至AKAP蛋白质的锚定结构域(AD)的抗体或抗原结合抗体片段；以及
b)向具有癌症、病毒感染、哮喘或多发性硬化症的受试者施用所述干扰素-抗体复合物；
其中两个拷贝的所述DDD部分形成二聚体，所述二聚体结合于所述AD部分以形成所述复合物。
23.一种治疗癌症、病毒感染、哮喘或多发性硬化症的方法，其包括：
a)向具有癌症、病毒感染、哮喘或多发性硬化症的受试者施用双特异性抗体复合物，所述复合物包含：(i)第一融合蛋白，其包含连接至人类蛋白激酶A(PKA)RI、RIβ、RII或RIIβ的二聚化和停靠结构域(DDD)部分的第一抗体或其抗原结合片段；(ii)第二融合蛋白，其包含连接至AKAP蛋白质的锚定结构域(AD)的第二抗体或其抗原结合抗体片段，其中所述第一和第二抗体或其片段结合于疾病相关抗原和结合于半抗原；以及
b)向所述受试者施用包含干扰素-λ和至少一个拷贝的所述半抗原的可靶向构建体，其中所述可靶向构建体结合于所述双特异性抗体以向患病细胞递送所述干扰素-λ。
24.一种组合物，其包含：
a)第一融合蛋白，其包含连接至AKAP蛋白质的锚定结构域(AD)部分的干扰素-λ；和
b)第二融合蛋白，其包含连接至人类蛋白激酶A(PKA)RI、RIβ、RII或RIIβ的二聚化和停靠结构域(DDD)部分的抗体或抗原结合抗体片段；并且
其中两个拷贝的所述DDD部分形成二聚体，所述二聚体结合于所述AD部分以形成所述复合物。
25.如权利要求24所述的组合物，其中所述干扰素-λ选自由人类干扰素-λ1、干扰素-λ2和干扰素-λ3组成的群组。
26.如权利要求24所述的组合物，其中所述抗体或抗体片段结合于选自由以下组成的群组的抗原：碳酸酐酶IX、CCCL19、CCCL21、CSAp、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、AFP、PSMA、CEACAM5、CEACAM-6、B7、纤维连接蛋白的ED-B、因子H、FHL-1、Flt-3、叶酸受体、GROB、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF)、HM1.24、胰岛素样生长因子-1(ILGF-1)、IFN-、IFN-、IFN-β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、IP-10、MAGE、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、PAM4抗原、NCA-95、NCA-90、Ia、HM1.24、EGP-1、EGP-2、HLA-DR、腱生蛋白、Le(y)、RANTES、T101、TAC、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、TNF-、TRAIL受体(R1和R2)、VEGFR、EGFR、PlGF、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5以及致癌基因产物。
27.如权利要求24所述的组合物，其中所述抗体或其抗体片段结合于选自由以下组成的群组的抗原：TROP-2、CEACAM5、CEACAM6、HLA-DR、CD19、CD20、CD22、CD74、CD52和EGFR。
28.如权利要求24所述的组合物，其中所述抗体或其抗体片段选自由hLL1、hLL2、RFB4、hRS7、hPAM4、hMN-3、hMN-14、hMN-15、hMu-9、Immu-31、hL243、hA19、hA20和hR1组成的群组。
29.如权利要求24所述的组合物，其中所述抗体片段选自由Fab、Fv、scFv和dAb组成的群组。
30.如权利要求24所述的组合物，其进一步包含选自由以下组成的群组的其他治疗剂：第二抗体、第二抗体片段、药物、毒素、酶、激素、免疫调节剂、细胞因子、趋化因子、反义寡核苷酸、siRNA、RNAi、放射性核素、硼化合物、光敏剂、抗血管生成剂和促凋亡剂。
31.如权利要求30所述的组合物，其中所述药物选自由以下组成的群组：5-氟尿嘧啶、阿普立定、阿扎立平、阿那曲唑、蒽环类、苯达莫司汀、博莱霉素、硼替佐米、Bruton激酶抑制剂、苔藓抑素-1、白消安、刺孢霉素、喜树碱、卡铂、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、西乐葆、苯丁酸氮芥、顺铂(CDDP)、Cox-2抑制剂、伊立替康(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉曲滨、喜树碱类、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、多西紫杉醇、更生霉素、柔红霉素、阿霉素、2-吡咯啉基阿霉素(2P-DOX)、氰基-吗啉基阿霉素、阿霉素葡糖苷酸、表柔比星葡糖苷酸、雌莫司汀、表鬼白毒素、雌激素受体结合剂、依托泊苷(VP16)、依托泊苷葡糖苷酸、磷酸依托泊苷、氟尿苷(FUdR)、3′，5′-O-二油酰基-FudR、氟达拉滨、氟他胺、法尼基-蛋白转移酶抑制剂、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、左旋天冬酰胺酶、来那度胺、甲酰四氢叶酸、洛莫司汀、氮芥、美法仑、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、光神霉素、丝裂霉素、米托坦、诺维本、亚硝基脲、普卡霉素、丙卡巴肼、紫杉醇、喷司他丁、PSI-341、雷洛昔芬、司莫司汀、链脲菌素、他莫昔芬、紫杉酚、替莫唑胺、反铂、沙利度胺、硫鸟嘌呤、噻替哌、替尼泊苷、拓扑替康、酪氨酸激酶抑制剂、尿嘧啶氮芥、长春瑞滨、长春碱、长春新碱、长春花生物碱、LFM-A13、达沙替尼、伊马替尼或尼洛替尼。
32.如权利要求30所述的组合物，其中所述毒素选自由蓖麻毒素、相思子毒素、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)、豹蛙酶、DNA酶I、葡萄球菌属肠毒素-A、商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌属外毒素和假单胞菌属内毒素组成的群组。
33.如权利要求30所述的组合物，其中所述抗血管生成剂选自由以下组成的群组：血管抑制素、杆抑素、血管能抑素、乳腺丝抑蛋白、抗VEGF抗体、抗PlGF抗体、层粘连蛋白肽、纤维连接蛋白、纤溶酶原激活物抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白细胞介素-12、IP-10、Gro-β、血小板反应蛋白、2-甲氧基雌二醇、增殖蛋白相关蛋白、羧基酰氨三唑、CM101、马立马司他、戊聚糖多硫酸酯、血管生成素-2、干扰素-α、除莠霉素A、PNU145156E、16K泌乳素片段、利诺胺(罗喹美克)、沙利度胺、己酮可可碱、染料木素、TNP-470、内皮抑制素、紫杉醇、accutin、血管抑制素、西多福韦、长春新碱、博莱霉素、AGM-1470、血小板因子4以及米诺环素。
34.如权利要求24所述的组合物，其中所述AD部分的氨基酸序列选自由以下组成的群组：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ IDNO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ IDNO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ IDNO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ IDNO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ IDNO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ IDNO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ IDNO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ IDNO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ IDNO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ IDNO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ IDN0：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83和SEQ ID NO：84。
35.如权利要求24所述的组合物，其中所述DDD部分的氨基酸序列选自由以下组成的群组：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30和SEQ IDNO：31。
36.如权利要求24所述的组合物，其中所述干扰素-抗体复合物比单独的所述干扰素、单独的所述抗体或未轭合的干扰素与抗体的组合更有效。
37.一种组合物，其包含：
a)第一融合蛋白，其包含连接至人类蛋白激酶A(PKA)RI、RIβ、RII或RIIβ的二聚化和停靠结构域(DDD)部分的干扰素-λ；和
b)第二融合蛋白，其包含连接至AKAP蛋白质的锚定结构域(AD)部分的抗体或抗原结合抗体片段；
其中两个拷贝的所述DDD部分形成二聚体，所述二聚体结合于所述AD部分以形成所述复合物。
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