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CN104136915B - 目标粒子的检测方法 - Google Patents

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CN104136915B
CN104136915B CN201380010136.4A CN201380010136A CN104136915B CN 104136915 B CN104136915 B CN 104136915B CN 201380010136 A CN201380010136 A CN 201380010136A CN 104136915 B CN104136915 B CN 104136915B
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Abstract

目标粒子的检测方法为使用共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测试样溶液中分散并随机运动的不发光粒子的方法，其具有：(a)调制包含目标粒子和平均外径小于前述光学系统的光检测区域的直径的15％的标记用粒子的试样溶液，在前述试样溶液中使每1分子前述目标粒子结合2分子以上的前述标记用粒子，形成外径为前述光检测区域的直径的15％以上的不发光复合体的工序；和(b)通过反转型扫描分子计数法算出前述工序(a)中调制的试样溶液中的前述复合体的分子数的工序。

Description

目标粒子的检测方法
技术领域
本发明涉及使用共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等能够检测到来自溶液中的微小区域的光的光学系统而检测目标粒子的方法。
本申请基于2012年4月18日在日本提交的日本特愿2012-095101号主张优先权，本文援引其内容。
背景技术
随着近年来光学测量技术的发展，使用共聚焦显微镜的光学系统和能够进行光子计数(单光子检测)的超高灵敏度的光检测技术，能够检测以及测定单光子或单分子荧光水平的微弱光。因此，提出了使用这样的微弱光的检测技术，进行生物分子等的分子间相互作用或者结合-解离反应的检测的各种装置或方法。特别是，荧光相关光谱分析(FluorescenceCorrelationSpectroscopy：FCS)、荧光强度分布分析(Fluorescence－IntensityDistributionAnalysis：FIDA)等使用了应用了共聚焦显微镜的光学系统和光子计数技术的微小区域的荧光测定技术的方法，测定所需要的试样与以往相比较浓度极低且微量即可，每次测定所使用的量最多数十μL左右。另外，测定时间也大幅地缩短，每次测定中可重复进行数次的秒数量级时间的测定。需要说明的是，前述微小区域是指显微镜的激光聚光而成的焦点区域，被称为共焦体积。进而，作为FCS的方式之一有如下方法：分散于溶解有大量发光物质的溶液中的不发光粒子进入共焦体积内时检测到的光强度降低的体系中，计算出荧光强度的自相关函数的值并计算出不发光粒子在共焦体积内的平移扩散时间和滞留粒子数的平均值的方法(inverse－FCS(iFCS))(例如，参照专利文献1。)
最近，提出了使用共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等能够检测到来自溶液中的微小区域的光的光学系统，一边在试样溶液内移动作为光的检测区域的微小区域的位置，一边逐个地检测在前述微小区域内出入的发光粒子(通过荧光、磷光、化学发光、生物发光、光散射等发出光的粒子)的新颖方式的光分析技术(扫描分子计数法)(例如，参照专利文献2～4)。扫描分子计数法为如下技术：具体而言，使用共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统，一边在试样溶液内移动前述光学系统的光检测区域的位置，一边检测由前述光检测区域中的发光粒子发出的光，由此一个一个地逐个检测试样溶液中的发光粒子，能够取得关于发光粒子的计数、试样溶液中的发光粒子的浓度或数密度的信息。
扫描分子计数法的光检测机理自身与FIDA等光分析技术的情况相同，采取对来自共聚焦显微镜或多光子显微镜的光检测区域的光进行检测的构成，所以与FIDA同样地，试样溶液的量同样地可以是微量的(例如数十μL左右)，另外，测定时间也短。另一方面，扫描分子计数法与需要计算出荧光强度的波动这样的统计学处理的FIDA等不同，不需要实行这样的统计学处理。因此，扫描分子计数法的光分析技术能够适用于粒子的数密度或浓度大幅地低于FIDA等光分析技术所需要的水平的试样溶液。即，利用扫描分子计数法检测被发光探针标记的试样溶液中的目标粒子(观测对象粒子)，即便在试样溶液中的目标粒子的浓度或数密度非常低的情况下，也能够检测并解析目标粒子的状态或特性(参照例如专利文献5。)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2010/119098号
专利文献2：国际公开第2011/108369号
专利文献3：国际公开第2011/108370号
专利文献4：国际公开第2011/108371号
专利文献5：国际公开第2012/014778号
发明内容
发明要解决的问题
逐个地检测发光的单一粒子的光的扫描分子计数法中，来自单一粒子的光是微弱的，所以容易受到漫射光、水的拉曼散射的影响。即，将表示由发光粒子发出的光的光强度值的增大识别为发光粒子的信号的分析手法的情况下，有时误将漫射光、水的拉曼散射产生的光识别为发光粒子的信号。另外，检测单一粒子的光的扫描分子计数法的情况下，作为观测对象的粒子(观测对象粒子)仅仅限于发光粒子。因此，想观测不发光粒子的情况下，需要对于作为观测对象的粒子附加发光标记(荧光标记、磷光标记等)，但不一定总是能够对观测对象粒子赋予适当的发光标记。观测对象粒子有时由于赋予发光标记而变性。
本发明的方式目的在于提供抑制由漫射光、水的拉曼散射带来的影响并且不进行发光标记地利用扫描分子计数法检测试样溶液中的不发光目标粒子(检测对象的粒子)的方法。
用于解决问题的方案
为了解决上述问题而深入研究，结果发现，使用了共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的扫描分子计数法中，如果从所述光学系统的光检测区域检测包含实质上一定的背景光的光，则当充分小于光检测区域的粒子通过时，检测到的光强度几乎没有变化；而比较大的粒子通过时，光被前述粒子遮蔽，检测到的光强度降低。进而，使用每一分子的大小充分地小于光检测区域的不发光粒子作为标记用粒子、使用多个标记用粒子来标记每一分子目标粒子，检测背景光的降低(由光检测区域检测到的光强度的降低)作为表示目标粒子存在的信号，由此能够区别地检测与目标粒子结合的标记用粒子与游离的标记用粒子。
即，本发明的一方式的目标粒子的检测方法为以下的(1)～(12)。
(1)本发明的一方式的目标粒子的检测方法为使用共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测试样溶液中分散并随机运动的不发光粒子的方法，
(a)调制包含目标粒子和平均外径小于前述光学系统的光检测区域的直径的15％的标记用粒子的试样溶液，在前述试样溶液中使每1分子前述目标粒子结合2分子以上的前述标记用粒子，形成外径为前述光检测区域的直径的15％以上的不发光复合体的工序；和
(b)通过如下工序算出所述工序(a)中调制的试样溶液中的前述复合体的分子数的工序：
在前述试样溶液内移动前述光学系统的光检测区域的位置的工序；
一边在前述试样溶液内移动前述光学系统的光检测区域的位置，一边由前述光检测区域检测包含实质上一定的背景光的光而生成按照时间顺序的光强度数据的工序；
在前述按照时间顺序的光强度数据中，将前述复合体进入前述光检测区域内时产生的光强度的降低作为表示各前述复合体存在的信号并逐个检测的工序；和
对前述逐个检测到的表示复合体存在的信号的个数进行计数，从而计数前述光检测区域的位置的移动中检测到的前述复合体的个数的工序。
(2)前述(1)的目标粒子的检测方法中，前述复合体的外径为前述光检测区域的直径的35％以上。
(3)前述(1)或(2)的目标粒子的检测方法中，前述目标粒子与前述标记用粒子特异地结合。
(4)前述(1)～(3)的任一项的目标粒子的检测方法中，前述目标粒子为核酸。
(5)前述(1)～(4)的任一项的目标粒子的检测方法中，前述背景光为由分散于前述试样溶液内的物质产生的荧光、磷光、化学发光、生物发光或散射光。
(6)前述(1)～(4)的任一项的目标粒子的检测方法中，前述背景光为照明光。
(7)前述(1)～(6)的任一项所述的目标粒子的检测方法中的前述移动光检测区域的位置的工序中，前述光检测区域的位置以比前述复合体的扩散移动速度更快的速度移动。
(8)前述(1)～(7)的任一项的目标粒子的检测方法中的前述移动光检测区域的位置的工序中，通过改变前述光学系统的光路而移动前述光检测区域在前述试样溶液内的位置。
(9)前述(1)～(8)的任一项的目标粒子的检测方法中的逐个地检测表示前述复合体存在的信号的工序中，由前述背景光的强度进行测量，检测到具有低于规定阈值的光强度的信号时可以判定1个复合体进入到前述光检测区域。
(10)前述(1)～(9)的任一项的目标粒子的检测方法中的逐个地检测表示前述复合体存在的信号的工序中，前述按照时间顺序的光强度数据被平滑化，在前述被平滑化的按照时间顺序的光强度数据中，由前述背景光的强度进行测量，检测具有低于规定阈值的强度的、向下凸的钟形的脉冲状信号作为表示前述复合体存在的信号。
(11)前述(1)～(10)的任一项的目标粒子的检测方法进而具有：根据前述工序(b)中检测到的被计数的前述复合体的个数确定前述试样溶液中的前述目标粒子的数密度或浓度的工序。
(12)前述(1)～(10)的任一项的目标粒子的检测方法的前述工序(b)中，重复进行前述光检测区域的位置的移动、来自前述光检测区域的光的检测、表示前述复合体存在的信号的检测，直至表示前述复合体存在的信号的个数达到预定的个数为止，
根据表示前述复合体的信号存在的个数达到预定的个数所需要的时间，确定前述试样溶液中的前述目标粒子的浓度。
发明的效果
本发明的方式中的目标粒子的检测方法利用扫描分子计数法的原理，所以即便在试样溶液中的目标粒子的数密度或浓度非常低的情况下，也能够检测目标粒子。另外，本发明的方式中的目标粒子的检测方法不需要对目标粒子进行发光标记，因此，即便是赋予光标记时变性的粒子，也能够作为目标粒子检测出。进而，通过在某种程度的背景光存在下检测背景光的降低作为表示目标粒子存在的信号的方式，能够防止将漫射光、拉曼散射光误检测为目标粒子的信号。
附图说明
图1A是用于反转型扫描分子计数法的光分析装置的内部结构的示意图。
图1B是共焦体积(共聚焦显微镜的光检测区域)的示意图。
图1C是改变镜子7的方向，在试样溶液内部移动光检测区域的位置的机构的示意图。
图1D是移动微孔板的水平方向位置而移动光检测区域在试样溶液内的位置的机构的示意图。
图2A是说明反转型扫描分子计数法的检测不发光的单一粒子的存在的原理的示意图以及检测到的光强度的时间变化的示意图。
图2B是说明反转型扫描分子计数法的检测不发光的单一粒子的存在的原理的示意图以及检测到的光强度的时间变化的示意图。
图2C是说明不发光的单一粒子进入光检测区域时的检测光量降低的原理的图。
图2D是表示光检测区域与单一粒子的直径的比、与检测光量的降低的比例的关系的图。
图3为以流程图的形式表示反转型扫描分子计数法的处理次序的一方式的图。
图4A是表示单一粒子边进行布朗运动边横穿光检测区域时的粒子的运动方式、以及以快于单一粒子的扩散移动速度的速度移动光检测区域在试样溶液内的位置、从而粒子横穿光检测区域时的粒子的运动方式的模型图。
图4B是表示单一粒子边进行布朗运动边横穿光检测区域时的粒子的运动方式、以及以快于单一粒子的扩散移动速度的速度移动光检测区域在试样溶液内的位置、从而粒子横穿光检测区域时的粒子的运动方式的模型图。
图4C是说明从根据通过反转型扫描分子计数法测量的按照时间顺序的光强度数据(光子计数的时间变化)检测单一粒子存在的处理次序中的、检测信号的信号处理过程的例子的图。
图5为以流程图的形式表示反转型扫描分子计数法的处理次序的另一方式的图。
图6A为以流程图的形式表示反转型扫描分子计数法的处理次序的另一方式的图。
图6B为以流程图的形式表示反转型扫描分子计数法的处理次序的另一方式的图。
图7为表示参考例1中计算各试样溶液的峰检测率(％)的结果的图。
图8为表示实施例1中由各试样溶液得到的峰数与葡聚糖生物素的浓度的图。
具体实施方式
本实施方式的目标粒子的检测方法(以下，有时简单地称为“本实施方式的检测方法”。)为使用共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测试样溶液中分散并随机运动的不发光粒子的方法，利用反转型扫描分子计数法。反转型扫描分子计数法是指由前述光学系统的光检测区域检测包含实质上一定的背景光的光，将由前述光检测区域检测到的光强度的降低作为指标，检测通过前述光检测区域的粒子的存在的扫描分子计数法。
专利文献2～5中记载的通常的扫描分子计数法中，作为观测对象的粒子为发光粒子，不能检测出不发光粒子。因此，本来将不发光粒子作为观测对象时，需要对所述粒子赋予荧光标记等发光标记。然而，某些粒子难以赋予发光标记，可能由于赋予发光标记而引起粒子的变性。另外，将粒子发出的光识别为表示该粒子存在的信号时，由漫射光、散射光或者光检测器的电噪音导致产生光强度数据上的值增大时，存在误将该值的增大识别为发光粒子的信号的情况。
另一方面，通常通过显微镜的光学系统进行光检测的情况下，背景光高时，不易受到漫射光、水的拉曼散射的影响。另外，为共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的情况下，沿光轴方向的分辨率比通常的光学显微镜高，所以当不发光粒子通过共焦体积的内部时，观测到来自共焦体积的光强度的降低。即，在充分的背景光存在下通过反转型扫描分子计数法进行检测，从而能够在漫射光、水的拉曼散射的影响降低的环境下检测目标粒子。另外，不需要将目标粒子用发光探针等标记。
本实施方式中，共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的“光检测区域”是指在这些显微镜中检测到光的微小区域，当由物镜照射照明光时，相当于该照明光聚光的区域。需要说明的是，在共聚焦显微镜中，所述区域尤其根据物镜与小孔之间的位置关系确定。
本实施方式中，“在试样溶液中分散并随机运动的粒子”是指在试样溶液中分散或溶解的原子、分子或者它们的聚集体等粒子(可以为发光的粒子或不发光粒子的任一者。)，是指非固定于基板等而在溶液中自由地进行布朗运动的粒子。
反转型扫描分子计数法与扫描分子计数法同样地，边在试样溶液内移动光检测区域的位置、即通过光检测区域扫描试样溶液内边逐次地进行光的检测。所述构成中，来自光检测区域的光包含实质上一定的背景光的情况下，“相对于光检测区域具有某种程度的大小的不发光粒子”进入光检测区域时，或者在试样溶液内移动的光检测区域包含前述不发光粒子时，由于前述粒子的存在，来自光检测区域的、到达光检测部的背景光的光强度或光量降低。这样，反转型扫描分子计数法中，逐个地检测到的光中，在逐次地检测所述背景光的光强度或光量的降低作为前述不发光粒子的信号。由此，能够一个一个逐个逐次地检测粒子的存在，并且能够取得关于粒子在溶液内的状态的各种信息。需要说明的是，本实施方式中，言及“粒子的信号”时，只要没有特别的限定，是指表示前述粒子存在的信号。
以下，首先对反转型扫描分子计数法进行说明。
＜用于反转型扫描分子计数法的光分析装置的构成＞
可以通过在基本的构成中如图1A中示意性的示例那样组合能够实施FCS、FIDA等的共聚焦显微镜的光学系统和光检测器而构成的光分析装置实施反转型扫描分子计数法。参照图1A，光分析装置1是由光学系统2～17、和用于控制光学系统的各部分的行为并获得、分析数据的计算机18构成的。光分析装置1的光学系统可以是与通常的共聚焦显微镜的光学系统同样的。光分析装置1的光学系统中，自光源2放射的在单模光纤3内传播的激光(Ex)在光纤的射出端以固有的NA(NumericalAperture)规定的角度放射为发散的光，通过准直仪4成为平行光，在分色镜5、反射镜6、7处发生反射，入射至物镜8。在物镜8的上方，典型地配置有分注了1μL～数十μL的试样溶液的试样容器或排列有孔10的微孔板9。自物镜8射出的激光在试样容器或孔10内的试样溶液中聚集为焦点，形成光强度强的区域(激发区域)。试样溶液中,除了作为观测对象的不发光粒子(本实施方式的方法中为目标粒子)等不发光粒子之外，可以分散或溶解产生背景光的任意的发光物质。该情况下，当不发光粒子未进入激发区域时，发光物质被激发而发出实质上一定的光而成为背景光；当不发光粒子进入激发区域时，背景光降低。
这样，由激发区域发出的光(Em)通过物镜8、分色镜5，在镜11处反射，在聚光镜12处聚光，通过小孔13，透过二次滤片14(此处，只选择特定的波长范围的光成分。)被导入至多模光纤15而到达光检测器16，转换成按照时间顺序的电信号之后，输入至计算机18，按照后面说明的方式实施用于检测单一粒子(显示作为一粒子的行为的粒子。本实施方式的检测方法中，除了游离状态的目标粒子、游离状态的标记用粒子之外，还包含目标粒子与标记用粒子的复合体。)的处理。需要说明的是，如本领域技术人员所知，在上述的构成中，小孔13配置于与物镜8的焦点位置共轭的位置上。由此，仅自如图1B中示意地所示的激光的焦点区域即激发区域内发出的光通过小孔13，而来自激发区域以外的光被挡住。图1B所例示的激光的焦点区域通常是具有1fL～10fL左右的实际体积的、位于本光分析装置中的光检测区域(典型地，光强度呈现以区域的中心为顶点的高斯样分布。实际体积是以光强度为1/e2的面为界面的几乎椭球体的体积。)，被称为共焦体积。另外，本实施方式中，由于检测的是由来自数分子左右的荧光色素分子的微弱光形成的背景光中的、由单一粒子的存在导致的光量的降低，所以作为光检测器16优选使用能够用于光子计数的超高灵敏度的光检测器。光的检测通过光子计数进行时，光强度的测定按照如下方式实施：经过规定时间逐次地检测规定的每单位时间(BINTIME)内到达光检测器的光子的个数。因此，该情况下，按照时间顺序的光强度的数据也可以为按照时间顺序的光子计数数据。此外，为了改变欲进行观察的孔10，在显微镜的平台(没有图示)上可以设有用于移动微孔板9的水平方向位置的平台位置变化装置17a。可以通过计算机18控制平台位置变化装置17a的动作。通过所述的构成，即使被检体为多个，也能够实现快速的测量。
进一步，上述的光分析装置的光学系统中，设置有通过光检测区域扫描试样溶液内部、即用于在试样溶液内移动焦点区域即光检测区域的位置的机构。所述用于移动光检测区域的位置的机构，例如如图1C示意性示例的，也可以采用改变反射镜7的方向的镜转向器17(移动光检测区域的绝对位置的方式)。所述的镜转向器17也可以为与装备在普通的激光扫描型显微镜中的检流计镜装置相同。或者，作为其他的方式，如图1D所例示，也可以操作平台位置变化装置17a从而移动注入有试样溶液的容器10(微孔板9)的水平方向的位置，从而移动光检测区域在试样溶液内的相对位置(移动试样溶液的绝对位置的方式)。利用任意方式的情况下，镜转向器17或平台位置变化装置17a在计算机18的控制下与光检测器16的光检测协调而被驱动，以实现预期的光检测区域的位置移动模式。光检测区域的位置的移动轨迹可任意地选自圆形、椭圆形、矩形、直线、曲线或它们的组合(可以从计算机18的程序中的各种移动模式中选择。)。另外，也可以将移动光检测区域的绝对位置的方式与移动试样溶液的绝对位置的方式组合，移动试样溶液的位置并且实施光检测区域的绝对位置的移动。该情况下，能够避免由于光检测区域短时间内通过同一区域而重复检测同一单一粒子。或者，也可以通过移动光检测区域绝对位置的方式，有意地使光检测区域重复地通过同一区域而周期性检测同一单一粒子多次，从而谋求信号精度的提高。该情况下，也可以在规定时间内实行光检测区域的绝对位置的移动之后，间歇地移动试样溶液的位置，在试样溶液内的其他位置，实行同一单一粒子的重复检测而谋求所检测的单一粒子的个数的增大。需要说明的是，虽然没有图示，但也可以通过上下地移动物镜8或平台，而使光检测区域的位置沿上下方向移动，使光检测区域位置的轨迹在试样溶液内被三维地展开。
当产生背景光的发光物质通过吸收多光子而发光时，上述光学系统作为多光子显微镜使用。在此情况下，仅在激发光的焦点区域(光检测区域)中发出光，所以可以去除小孔13。此外，当产生背景光的发光物质通过化学发光或生物发光现象而不依赖激发光发光时，可以省略用于产生激发光的光学系统2～5。当产生背景光的发光物质通过磷光或散射发光时，直接使用上述共聚焦显微镜的光学系统。另外，在装置1中，如图1A所示，可以为如下构成：可以设置有多个激发光源2，根据发光物质的激发波长，选择适当的激发光的波长。同样地，也可以设置多个光检测器16，也可以根据背景光的波长而分别检测。进而，背景光也可以通过照明光而给与。该情况下，通过由物镜的上方进行透射照明(也可以为Koehler照明。)而使试样溶液被照明。
＜反转型扫描分子计数法的光分析技术的原理＞
反转型扫描分子计数法直接了当地说，按照检测单一粒子的影子的形式的扫描分子计数法，逐个地检测单一粒子的存在，能够取得关于其计数或试样溶液中的浓度的信息，所述反转型扫描分子计数法在背景光存在下在试样溶液内移动光检测区域的位置，检测不发光的单一粒子包含于光检测区域时的背景光的降低作为单一粒子的信号。
具体而言，与通常的扫描分子计数法同样地，驱动用于移动光检测区域的位置的机构(镜偏向器17)而改变光路，或者移动注有试样溶液的容器10(微孔板9)的水平方向的位置，如图2A中示意地描述，一边在试样溶液内移动光检测区域CV的位置即利用光检测区域CV扫描试样溶液内，一边实施光检测。如已经提到的，试样溶液中分散有发光物质，光检测区域CV内存在有多个发光物质，所以在光检测区域CV的移动中(图2A中，时间t0～t2)，基本上检测出大致一样的来自这些发光物质的光。然而，在光检测区域CV移动期间通过存在有1个不发光粒子的区域时(t1)，发光物质存在区域的体积降低，所以发光物质发出的光的总量降低，如图2B所描述那样，按照时间顺序的光强度数据上，出现钟形的脉冲状的显著的光强度(Em)的降低。这样，实行上述的光检测区域CV位置的移动和光检测，一个一个地检测其间出现的如图2B所例示的脉冲状的显著的光强度的降低即表示单一粒子存在的信号。由此，通过逐个地检测单一粒子并将其个数进行计数，能够得到与存在于所测量的区域内的单一粒子的个数、或者浓度或数密度相关的信息。
上述的光强度降低的程度，可以由不发光的单一粒子的直径与光检测区域直径的关系而大概算出。参照图2C，典型地，光检测区域内的光强度分布如图2C中实线所示，在中心具有最大强度Imax，并且具有向着半径r方向降低的钟形的轮廓f(r)。因此，光检测区域内不存在不发光粒子时，由光检测区域内发出的光的总量α可使用f(r)大致为0的光检测区域的半径a由式(1)给出。
α＝4π∫r2f(r)dr[积分区间为0～a]…(1)
另一方面，半径为b的不发光的单一粒子进入光检测区域内并如图2C的下部分那样位于光检测区域的中心时，该区域的发光物质被排除。由此，降低了相当于图2C的上部分的斜线区域的光量。相当于该被排除的发光物质的光量即降低量β由式(2)给出。
β＝4π∫r2f(r)dr[积分区间为0～b]…(2)
这样，光强度降低的比例能够通过β/α而估算出。
此处，f(r)为高斯函数，α＝1、a＝1时，f(r)用式(3)表示。
f(r)＝0.684exp(－2r2)…(3)
图2D为使用式(3)，将相对于半径比b/a的光强度降低的比例β/α作图而成的图。参照图2D，典型地，当背景光的变动率为1％左右、由单一粒子导致的光强度降低的比例为1％以下时不能检测信号，所以单一粒子半径相对于光检测区域的半径的比b/a应该为0.15以上。另外，将由单一粒子导致的光强度降低的比例设为10％以上时，能够检测的单一粒子半径相对于光检测区域的半径的比b/a为0.35。
需要说明的是，欲观测的单一粒子为猝灭剂、荧光共振能量转移的受体的情况下，单一粒子吸收周围(例如，10nm)的光，所以能够检测的单一粒子半径可以比上述所例示的半径更小。
＜反转型扫描分子计数法的处理工序＞
反转型扫描分子计数法中，测定包含成为观测对象的粒子的试样溶液的光强度之后进行分析。图3中以流程图的形式表示反转型扫描分子计数法中的处理次序的一方式。
(试样溶液的光强度的测定：图3的步骤S100)
就利用反转型扫描分子计数法的光分析中的光强度的测定而言，除了在检测中驱动镜转向器17或平台位置变化装置17a，在试样溶液内移动光检测区域的位置(试样溶液内部的扫描)以外，可以以与FCS或FIDA中的光强度检测工序相同的方式实施。在操作处理中，典型地，在微孔板9的孔10中注入试样溶液而载置于显微镜的平台上后，使用者对计算机18输入测定开始的指示，计算机18根据存储装置(没有图示)存储的程序(在试样溶液内移动光检测区域的位置的次序、和在光检测区域的位置的移动中检测来自光检测区域的光并生成按照时间顺序的光强度数据的次序)，开始试样溶液内的光检测区域中的激发光的照射以及光强度的测量。所述测量中，在根据计算机18程序的处理操作的控制下，镜转向器17或平台位置变化装置17a驱动镜7(检流计镜)或显微镜的平台上的微孔板9，在孔10内实施光检测区域的位置的移动。同时光检测器16将逐次检测到的光转换为电信号，传送给计算机18，计算机18以任意方式由送达的信号生成按照时间顺序的光强度数据并保存。需要说明的是，典型地光检测器16为能够检测到单光子到达的超高灵敏度光检测器，所以光的检测利用光子计数的情况下，按照时间顺序的光强度数据也可以为按照时间顺序的光子计数数据。
光强度测量中的光检测区域的位置移动速度可以是任意的，可以设定为适合例如实验或分析目的的规定速度。当根据所检测到的单一粒子的个数获得与其数密度或浓度相关的信息时，光检测区域所通过的区域的大小或体积是必需的，所以以移动距离受掌握的方式进行光检测区域的位置移动。需要说明的是，测量中的经过时间与光检测区域的位置的移动距离成比例关系的方式，能够容易地解释测定结果，所以移动速度优选基本上为恒定速度，但并非仅限于此。
此外，对于光检测区域的位置的移动速度，为了由测量的按照时间顺序的光强度数据逐个地检测单一粒子或者以良好的精度定量地实行单一粒子的个数的计数，优选将所述的移动速度设定为比单一粒子的随机运动即布朗运动导致的移动速度更快的值。反转型扫描分子计数法的观测对象粒子是分散或溶解在溶液中的自由地随机运动的粒子，由于布朗运动，位置伴随着时间而移动。因此，光检测区域的位置的移动速度比粒子的布朗运动导致的移动慢时，如图4A示意地描述，粒子在区域内随机地移动。由此，光强度随机地变化(如已知，光检测区域的激发光强度以区域的中心为顶点向外侧降低。)，难以确定对应于各个单一粒子的显著的光强度的变化。于是，如图4B所描述那样，优选粒子几乎直线地横穿光检测区域，由此，按照时间顺序的光强度数据中，如图4C的最上部分例示，对应于各个单一粒子的光强度变化的轮廓大概一致(单一粒子几乎直线地通过光检测区域的情况下，光强度变化的轮廓与反转激发光强度轮廓几乎相同。)，将光检测区域的位置的移动速度设定为快于粒子的布朗运动导致的平均的移动速度(扩散移动速度)，以容易确定每个粒子与光强度的对应关系。
另外，反转型扫描分子计数法中，检测光检测区域通过单一粒子的存在位置时由该单一粒子的存在导致的背景光的降低，从而逐个地检测单一粒子。然而，单一粒子在溶液中由于布朗运动而随机移动，在光检测区域中出入多次时，多次检测到来自一个单一粒子的、表示其存在的信号，难以将检测到的信号与一个单一粒子的存在对应起来。因此，如上所述，通过将光检测区域的移动速度设为高于单一粒子的扩散移动速度，能够使1个单一粒子与一个(表示单一粒子存在的)信号相对应。
具体而言，由于布朗运动，具有扩散系数D的粒子通过半径Wo的光检测区域(共焦体积)所需要的时间Δt是由均方位移的关系式(4)推断出，用式(5)表示。
(2Wo)2＝6D·Δt…(4)
Δt＝(2Wo)2/6D…(5)
因此，粒子通过布朗运动移动的速度(扩散移动速度)Vdif大约是由式(6)表示。
Vdif＝2Wo/Δt＝3D/Wo…(6)
此处，光检测区域的位置的移动速度可以参考所述Vdif而设定为比之充分快的值。例如，假定观测对象粒子的扩散系数为D＝2.0×10-10m2/s左右的情况下，Wo为0.62μm左右，则Vdif为1.0×10-3m/s。因此，光检测区域的位置的移动速度设定为其略10倍以上的15mm/s等即可。此外，当观测对象粒子的扩散系数未知时，为了找到使在光检测区域的位置移动速度的各种设定下的光强度变化的轮廓成为预期轮廓(典型的是与激发光强度分布几乎相同)的条件，可以重复进行预备实验，确定适当的光检测区域的位置的移动速度。
(光强度的分析)
通过上述的处理得到按照时间顺序的光强度数据时，计算机18中，按照存储装置中存储的程序进行处理，从而实施单一粒子的信号的检测、单一粒子的计数、浓度算出等各种分析。
1个粒子是否进入光检测区域的判定，可以通过上述的处理，根据按照时间顺序检测到的光信号的形状而进行。典型地，首先测量背景光的强度，检测到具有低于规定阈值的光强度的信号时，可以判定1个单一粒子进入到光检测区域。更具体而言为如下构成，通常表示单一粒子存在的信号在光检测部的按照时间顺序的检测值即光强度数据中以低于某种程度的强度的向下凸的钟形的脉冲状信号的形式表现；噪音并非钟形的脉冲状，以强度高的信号的形式表现。因此，按照时间顺序的光强度数据上，首先，测量背景光的强度，检测低于规定阈值的、向下凸的钟形的脉冲状的信号作为表示单一粒子的存在的信号。“规定阈值”能够通过实验设定为适当的值。
进而，由反转型扫描分子计数法中应用的光分析装置而得到的光强度是比较微弱的，产生细微的增减，所述光强度的细微的增减使表示单一粒子存在的信号的检测精度变差。因此，也可以将按照时间顺序的光强度数据平滑化并将数据加工成能够无视光强度细微的增减之后，在平滑化的按照时间顺序的光强度数据中，由背景光的强度进行测量，检测具有低于规定阈值的强度的、向下凸的钟形的脉冲状信号作为表示单一粒子存在的信号。
反转型扫描分子计数法中，也可以计数信号的个数并计数光检测区域所包含的单一粒子的个数(粒子的计数)。该情况下，通过组合检测到的单一粒子的个数与光检测区域的位置的移动量，能够获得与试样溶液中被识别的单一粒子的数密度或浓度相关的信息。具体而言，例如，计算出多个试样溶液的数密度或浓度的比或者相对于成为浓度或数密度的基准的标准试样溶液的相对的数密度或浓度的比，或者，使用相对于成为浓度或数密度的基准的标准试样溶液的相对的数密度或浓度的比，从而确定绝对的数密度值或浓度值。或者，通过任意手法例如以规定速度移动光检测区域的位置等来确定光检测区域的位置移动轨迹的总体积，就能够具体计算单一粒子的数密度或浓度。
以下，更详细地进行说明。
(i)单一粒子信号的逐个检测
在按照时间顺序的光强度数据中，当一个粒子通过光检测区域时的轨迹是如图4B所示的几乎直线状时，与该粒子相对应的信号的光强度变化具有反映(由光学系统确定的)光检测区域内的光强度分布的、向下凸的大致钟形的轮廓(参照图4C最上部分)。因此，扫描分子计数法中，基本上，当由背景光测量的、低于适宜设定的阈值的光强度降低的持续时间宽度在规定的范围时，判定为具有该光强度降低轮廓的信号与一个粒子通过光检测区域相对应，从而检测到一个粒子。并且，低于阈值的光强度的降低所持续的时间宽度不在规定的范围内的信号，可以判定为噪音或异物的信号。另外，光检测区域的光强度分布可以假设为由背景光Ibg向下凸的高斯分布的式(7)。
I＝Ibg－A·exp(－2t2/a2)…(7)
当对光强度显著降低的轮廓(可以明确判断为非背景光的波动的轮廓)拟合式(7)算出的强度A和宽度a落入规定范围内时，该光强度轮廓可判断为对应一个粒子通过了光检测区域，可以视为检测到一个粒子。
强度A和宽度a落在规定范围之外的信号，可以在之后的分析等中作为噪音或异物的信号而无视。
作为由按照时间顺序的光强度数据对于单一粒子进行一次性地检测的处理方法的一例，首先，对于按照时间顺序的光强度数据(图4C的最上部分“检测结果(未处理)”所表示的数据)进行平滑(平滑化)处理(图3－步骤S110、图4C的中上部分用“SMOOTHING”表示。)。发光物质发出的光是概率地发出的，另外，该光强度是比较微弱的，所以产生细微的增减的结果，所述光强度的细微的增减(波动)使表示单一粒子存在的信号的检测精度变差。平滑处理可以无视所述数据上的细微的增减。平滑化处理可以例如通过移动平均法等而进行。需要说明的是，可以根据获得光强度数据时的光检测区域的位置移动速度(扫描速度)、BINTIME，适当设定实施平滑化处理时的参数，例如，在移动平均法中一次取平均的数据点数、移动平均的次数等。
接着，为了检测平滑处理后的按照时间顺序的光强度数据中存在显著的脉冲状的信号(以下，称为“脉冲信号”。)的时间区域(脉冲存在区域)，对于平滑处理后的按照时间顺序的光强度数据对时间进行一阶微分值运算(步骤S120)。按照时间顺序的光强度数据的时间微分值，如图4C中下部分的“时间微分”所示信号值变化时间点处的值的变化变大，所以通过参考所述时间微分值可以有利地确定显著的信号的起点和终点。
之后，在按照时间顺序的光强度数据上，逐次检测显著的脉冲信号，判断检测到的信号是否是与单一粒子相对应的信号。具体而言，首先，在按照时间顺序的光强度数据的按照时间顺序的时间微分值数据基础上，逐次地参照时间微分值，搜索一个脉冲信号的始点和终点进行确定，从而确定脉冲存在区域(步骤S130)。一旦确定了一个脉冲存在区域，就对该脉冲存在区域中的平滑化的按照时间顺序的光强度数据，进行向下凸的钟形函数拟合(图4C下部分的“钟形函数拟合”)，算出钟形函数的脉冲的峰强度(由背景光的最大降低量)Ipeak、脉冲宽度(半高全宽(fullwidthhalfmaximum))Wpeak、拟合中的(最小二乘法的)相关系数等参数(步骤S140)。需要说明的是，拟合的钟形函数典型的是高斯函数，也可以是洛伦兹型函数。并且，判断算出的钟形函数的参数是否落在一个发光粒子通过光检测区域时检测到的脉冲信号所描述的钟形轮廓的参数所规定的范围内，即，脉冲的峰强度、脉冲宽度、相关系数是否分别落在规定范围内等(步骤S150)。例如，判定是否满足下述的条件等。
20μ秒＜脉冲宽度＜400μ秒
峰强度＞4.0[pc/10μs]…(A)
相关系数＞0.95，这样，计算的钟形函数的参数被判断为落在与一个粒子对应的信号规定的范围内时，则该信号判定为与一个粒子对应的信号。另一方面，将算出的钟形函数的参数没有落在规定范围内的脉冲信号作为噪音而无视。
上述的步骤S130～S150的处理中的脉冲信号的搜索和判定可以在按照时间顺序的光信号数据的整个领域内重复地进行(步骤S160)。需要说明的是，从按照时间顺序的光强度数据中逐个地检测发光粒子的信号的处理，不限定于上述的次序，可以通过任意的手法实行。
(ii)粒子浓度的确定
进而，也可以计数检测到的单一粒子的信号的个数，确定粒子的个数(粒子的计数)。另外，通过任意的手法计算光检测区域所通过的区域的总体积，由该体积值和粒子的个数确定试样溶液中的粒子的数密度或浓度(步骤S170)。
光检测区域所通过的区域的总体积理论上可以根据激发光或检测光的波长、镜头开口数、光学系统的调整状态而计算。另外，实验上例如可以在与所要检查的试样溶液的测定相同的条件下，对已知粒子浓度的溶液(对照溶液)进行上文说明的光强度测定、粒子的检测和计数，根据检测到的粒子的个数和对照溶液的粒子的浓度而确定。具体而言，例如，对于粒子浓度为C的对照溶液，对照溶液的单一粒子的检测数为N时，光检测区域所通过的区域总体积Vt则由式(8)给出。
Vt＝N/C…(8)
另外，准备单一粒子的多个浓度不同的溶液作为对照溶液，分别对其实施测定，将算出的Vt的平均值作为光检测区域所通过区域的总体积Vt而采用即可。并且，一旦获得Vt值，单一粒子的计数结果为n的试样溶液的粒子浓度c可由式(9)给出。
c＝n/Vt…(9)
需要说明的是，可以不通过上述方法而利用任意方法例如FCS、FIDA等得到光检测区域的体积、光检测区域所通过区域的总体积。此外，本实施方式的装置也可以如下构成，对于规定的光检测区域的移动模式，将各种标准粒子的浓度C和粒子的个数N之间的关系(式(6))的信息预先存储在计算机18的存储装置中，装置的使用者在实施单一粒子的检测时可以适当利用存储的关系信息。
这样，用光检测区域在试样溶液中扫描并逐个地检测粒子的反转型扫描分子计数法中，通过上述的处理次序能够进行试样溶液中的粒子的计数、浓度的确定等。
检测一定信号数的单一粒子检测处理
在上述的单一粒子检测处理中，经过某设定的时间实施光测定之后，根据得到的光强度数据检测单一粒子的信号。即，计数任意设定的测定时间中得到的单一粒子的信号的个数。该情况下，试样溶液中的粒子浓度未知时，经过某固定的测定时间进行光强度的测定时，预期粒子的浓度低时，测定时间可以设定为充分地长。另一方面，试样溶液中的粒子浓度高的情况下，可以使光强度的测定持续所需要的时间以上，使得以可以接受的精度或者满足的精度确定浓度等特性。另外，试样溶液中的粒子浓度低于实验者预期的浓度、且设定的测定时间不足的情况下，结果的误差变大。这样，根据设定的测定时间的长度变更检测到的单一粒子的信号数，特别是，单一粒子浓度低时，由检测信号数计算的单一粒子浓度值的偏差变大，精度降低。
因此，作为粒子的计数的另一方式，也可以实施测定直至单一粒子的信号数到达任意设定的个数为止，根据测定时间计算单一粒子浓度值。即，作为单一粒子检测处理的另外的方式，重复进行边移动光检测区域的光强度的测定和单一粒子的信号的检测直至信号的个数到达预定的个数，测量信号的个数到达预定的个数所需要的时间，根据所述单一粒子的信号的个数到达预定的个数所需要的时间确定粒子浓度。根据所述构成，当试样溶液中的粒子浓度高时，光强度的测定所需要的时间被缩短；当试样溶液中的粒子浓度低时，可以持续进行光强度的测定直至得到达到结果(即，粒子浓度)所要求的精度的粒子数为止。即，根据单一粒子的浓度而使测定时间最优化。
并且，通过将单一粒子的信号的个数所应该达到的预定的个数，设定为达到结果所要求的精度的粒子数，单一粒子的信号的个数达到预定的个数所需要的时间反映达到结果所需要的精度的粒子数，所以可以期待根据该时间确定的粒子的浓度值具有能够接受的精度或者满足的精度。即，将预定的个数设定为达到结果所要求的精度的个数，该预定的个数的单一粒子的检测所需要的时间或者由其导出的任意的结果中的偏差被抑制得很小，能够满足结果的精度。
(i)基本原理
粒子的浓度值与信号数达到预定的个数所需要的时间为如以下的关系。即，某粒子浓度C的试样溶液中，经过时间τ以扫描速度u移动光检测区域时，如果将光检测区域的截面积设为S，则检测到的粒子信号的个数X用式(10)表示。
X＝CSuτNA…(10)
此处，NA为阿伏伽德罗数。因此，当信号数到达预定的数XE需要的时间为T时，粒子浓度C根据式(11)以时间T的函数形式给出。
C＝XE/(STuNA)…(11)
需要说明的是，式(11)中，每单位时间的粒子的检测速度V根据信号数达到预定的数XE所需要的时间T和粒子检测数XE，由式(12)给出。
V＝XE/T…(12)
由此，粒子浓度C用式(13)表示。
C＝V/(SuNA)…(13)
该式(13)中，粒子浓度C与检测速度V成一次比例，粒子浓度C与检测速度V的对应关系容易理解，所以在实际的实验中，粒子浓度C也可以使用检测速度V确定。
(ii)处理操作次序
检测一定的信号数的单一粒子检测处理也可以例如按照图5的流程图所示的处理次序实行。图5的例中，简单地说，每隔解析时间间隔t(规定的时间间隔)反复实施光检测区域位置的移动、来自光检测区域的光的检测、单一粒子的信号的检测以及检测到的粒子信号的计数的一连串处理，直至检测到的粒子数X到达结束粒子数XE(发光粒子数所应到达的预定的数)为止。需要说明的是，应该理解为，以下所述的一连串处理和构成，通过计算机18的处理操作而实现。
(a)初始设置
参照图5，对于操作处理具体地进行说明。首先，向微孔板9的孔10中注入试样溶液，载置于显微镜的平台上。之后，使用者对计算机18输入光强度的测定、粒子的检测以及计数处理的开始指示，计算机18进行结束粒子数XE的设定(步骤10)以及解析时间间隔t的设定(步骤20)作为初始设置。结束粒子数XE和解析时间间隔t也可以由使用者任意地设定。为了达到粒子浓度的结果值所要求的精度，可以使用粒子浓度已知的溶液进行预实验，参考预实验的结果而适宜确定结束粒子数XE。作为解析时间间隔t，充分短于由处理开始后至粒子数(X)到达结束粒子数(XE)为止的时间的任意的时间间隔，也可以考虑装置1中的处理速度等而适宜设定。另外，关于结束粒子数XE和解析时间间隔t，分别参考使用了粒子浓度已知的溶液的预实验的结果而预先确定的值被存储于装置1中，所述存储的值可以通过自动选择或者通过使用者的选择而使用。
(b)粒子数的检测
如上所述进行结束粒子数XE和解析时间间隔t的设定时，可以如下所述反复实施以下的步骤：每隔解析时间间隔t，利用经过解析时间间隔t的扫描分子计数法进行光强度的测定处理和由测定的光强度数据进行粒子信号的检测以及粒子数x的检测(步骤S30)；累积步骤S30中检测到的粒子数x计算粒子的总数X(tn)的处理(步骤S40)，直至粒子的总数X(tn)达到结束粒子数XE为止(步骤S50)。需要说明的是，也可以先于反复实施步骤S30～S50的处理存储一系列处理的开始时间Ts(步骤S25)。
步骤S30中的光检测以及粒子数检测的处理也可以与图3所示的处理同样。简单地说，边进行光检测区域位置在试样溶液内的移动(试样溶液内的扫描)边经过解析时间间隔t进行光强度的测定。之后，在得到的解析时间间隔t中的按照时间顺序的光强度数据中，在计算机18中，根据存储于存储装置的程序进行处理，实施表示单一粒子存在的信号的检测以及检测数的计数。
这样，如果检测到经过解析时间间隔t的按照时间顺序的光强度数据中的粒子数x，则发光粒子的检测总数X(tn)通过式(14)算出(图5－步骤S40)。
X(tn)＝X(tn－1)+x…(14)
需要说明的是，X(tn－1)为至前次的解析时间间隔t为止检测到的粒子的检测总数，其初始值为0。接着，每隔解析时间间隔t重复步骤S30～S40直至发光粒子的检测总数X(tn)达到结束粒子数XE为止即式(15)成立为止(步骤50)。
X(tn)≥XE…(15)
并且，反复进行步骤S30～S50期间，当式(15)成立时，试样溶液的光强度的测定与粒子的检测/计数的处理结束。也可以当步骤S30～S50的反复处理结束时，存储结束时间TE(步骤S60)。
(c)粒子数与测定结束时间的显示
然而，每隔解析时间间隔t反复实施步骤S30～S50期间(直至式(15)成立为止)，计算机18的监视器上等显示器显示粒子的检测总数X(tn)和/或测定结束时间TE或者测定剩余时间Tr。根据所述构成，有如下优点：使用者能够通过看见这些显示预测实施中的测定何时结束。
如上所述实施显示的情况下，图5的步骤S50的判定中，当式(15)不成立时，实施图中虚线所示的各处理。具体而言，首先，在显示器上显示步骤S40中计算的最新的粒子的检测总数X(tn)(步骤S52)。需要说明的是，已经反复实施了步骤S30～S50的情况下，到目前为止的粒子的检测总数X(tn)的值被更新。接着，为了计算出测定结束时间TE或者测定剩余时间Tr，计算出步骤S30～S50的处理开始后的粒子的检测速度v(步骤S54)。到目前为止的粒子的检测速度v可以由式(16)给出。
v＝X(tn)/(Tp－Ts)…(16)
此处，Tp为现在的时刻。这样，可以使用粒子的检测速度v通过式(17)推定测定剩余时间Tr(直至步骤S30～S50的处理结束为止的时间)。
Tr＝(XE－X(tn))/v…(17)
另外，测定结束时间TE(步骤S30～S50的处理结束的时间)通过式(18)推测(步骤S56)。
TE＝Tp+Tr…(18)
接着，在显示器上显示推定的测定结束时间TE或者测定剩余时间Tr(步骤S58)。需要说明的是，当已经反复实施步骤S30～S50的情况下，已经显示的值被更新。另外，当X(tn)＝0时，式(17)或(18)没有被运算而Tr和TE也可以显示为不明。
如上所述，每隔解析时间间隔t重复上述图5的步骤S30～S50的处理。关于这一点，图3的步骤S100的光强度的测定也可以从测定的开始至结束为止在步骤S100以外的信号处理步骤的实施中也连续地实施。即，在光检测以及粒子数检测的处理中，当一次循环的经过解析时间间隔t的光强度的测定结束时，直接连续地实施下一循环的经过解析时间间隔t的光强度的测定，与此同时，在计算机18中，由结束的循环的经过解析时间间隔t而取得的光强度数据实施粒子的信号检测以及计数的处理。由此，实时地实现粒子的检测以及计数。
(d)浓度计算等分析
这样，当粒子数到达结束粒子数时，也可以使用粒子数到达结束粒子数为止的时间T(＝TE－Ts)或者由检测到的粒子信号得到的其他的信息，实施浓度计算等的分析(步骤S70)。如上所述，使用式(12)，由到达结束粒子数为止的时间T和结束粒子数XE，计算粒子的检测速度V；由粒子的检测速度V使用式(13)的关系确定粒子浓度。
需要说明的是，式(10)～(13)中的光检测区域所通过区域的截面积S理论上可以根据激发光或检测光的波长、镜头开口数、光学系统的调整状态而算出；也可以通过实验例如：对于粒子浓度已知的溶液(对照溶液)，按照与欲检查的试样溶液的测定同样的条件，进行如上述说明的光强度的测定、粒子的检测以及计数，根据由此检测到的粒子的个数、对照溶液的发光粒子的浓度而确定。具体而言，例如，对于粒子浓度为C的对照溶液，假设以移动速度uo经过某时间τo实施的光强度的测定中的粒子的检测数为N，则光检测区域所通过区域的截面积S由式(19)给出。
S＝N/(C·NA·uo·τo)…(19)
另外，准备粒子的多个浓度不同的溶液作为对照溶液，分别对其实施测定，将计算的S的平均值作为光检测区域的截面积S而采用即可。
(e)试样溶液的光强度的测定和粒子的检测以及计数处理的修正例
上述的试样溶液的光强度的测定、发光粒子的检测以及计数的处理中，作为另外的方式，解析时间间隔t并非为固定值，也可以根据发光粒子的检测状况进行修正。图6A以流程图的形式表示包含将解析时间间隔t根据粒子的检测状况进行修正的处理(步骤S20’)而构成的、试样溶液的光强度的测定和粒子的检测以及计数的处理。图6B以流程图的形式表示步骤S20’中的解析时间间隔t的运算处理。需要说明的是，图6A中，与图5相同的处理中，带有同一步骤序号。
图6A的处理中，每次经过解析时间间隔t的光强度的测定结束后，解析时间间隔t都会被修正(步骤S20’)。另外，图示的例子的处理特别构成为：从开始起至粒子数到达结束粒子数XE为止的一次测定中，只实施预定的次数N(以下，称为“更新预定次数”。)的、光强度的测定和粒子的检测、计数的处理循环。具体而言，首先，作为初始设置进行结束粒子数XE的设定(步骤S10)以及开始时间Ts的存储(步骤S25)之后，最初实施光强度的测定和粒子的检测、计数的处理时即光强度的测定和粒子的检测以及计数的处理循环的实施次数k为0时，对于解析时间间隔t，赋值为可以任意设定的初始值to(参照图6B的步骤S200、S210)。接着，处理循环的实施次数k增大1(步骤S270)，与图5所述的处理同样地实施经过解析时间间隔t的光强度的测定和粒子的检测以及计数的处理(步骤S30～S50)。这样，当得到最初循环的粒子数x(＝X(t1))时，依次计算出粒子检测速度v(步骤S54)、测定剩余时间Tr(步骤S56)。需要说明的是，也可以与图5的情况同样地，计算机18的监视器上等显示器显示粒子的检测总数X(tn)和/或测定结束时间TE或者测定剩余时间Tr(步骤S52、S58)。另外，在最初的处理循环中粒子数即到达结束粒子数XE时，直接结束光强度的测定、粒子的检测以及计数的处理(步骤S50)。
最初的处理循环之后，反复进行解析时间间隔t的修正、与图5的情况同样的光强度的测定和粒子的检测以及计数的处理循环(步骤S20’、S30～S58)直至粒子数到达结束粒子数XE为止。此时，在进行解析时间间隔t的修正的步骤S20’中，首先，判断到此时为止检测到的粒子数X(tn)是否为0(步骤S220)。X(tn)＝0时，即将开始的循环的解析时间间隔t也可以设为m倍(m为1以上的正数)。当X(tn)＞0时，使用测定剩余时间Tr、更新预定次数N和处理循环的实施次数k，通过式(20)算出解析时间间隔t(步骤S240)。
t＝Tr/(N－k)…(20)
需要说明的是，计算的解析时间间隔t也可以设定下限，解析时间间隔t低于下限值tmin时，解析时间间隔t也可以设定为下限值tmin(步骤S250、S260)。如上所述，根据解析时间间隔t被修正的方式，测定剩余时间Tr反映作为观测对象的试样溶液中的粒子的检测状况，所以解析时间间隔t可以根据所述粒子的检测状况而最优化。
＜目标粒子的检测方法＞
本实施方式的检测方法利用反转型扫描分子计数法检测试样溶液中分散并随机运动的不发光粒子。如前所述，反转型扫描分子计数法在分子离散的状况下对于pM级以下的比较低的浓度的粒子也能进行测定。因此，通过本实施方式的检测方法，即使当试样溶液中的解析对象的目标粒子的浓度非常低时，也能够高灵敏度地计数结合有标记用粒子的目标粒子。
进而，本实施方式的检测方法中，通过使每一分子的大小相对于光学系统的光检测区域的体积充分小(即，前述粒子通过前述光检测区域时，由前述光检测区域检测到的光强度几乎不降低)的标记用粒子结合2个以上目标粒子，形成相对于前述光检测区域的体积为某程度的大小的复合体。接着，前述复合体通过光检测区域时，根据由前述光检测区域检测到的光强度降低而检测前述复合体。即，本实施方式的检测方法中使用的反转型扫描分子计数法中，由于能够将与目标粒子结合而形成复合体的标记用粒子从没有结合目标粒子的游离的标记用粒子中区别地检测，所以不需要在利用反转型扫描分子计数法的测量之前从试样溶液中去除游离的标记用粒子。
具体而言，本实施方式的方法具有下述工序(a)和(b)。
(a)调制包含目标粒子和外径小于前述光学系统的光检测区域的直径的15％的标记用粒子的试样溶液，在前述试样溶液中使每1分子前述目标粒子结合2分子以上的前述标记用粒子，形成外径为前述光检测区域的直径的15％以上的不发光复合体的工序；和
(b)通过如下工序算出前述工序(a)中调制的试样溶液中的前述复合体的分子数的工序：
在前述试样溶液内移动前述光学系统的光检测区域的位置的工序；
一边在前述试样溶液内移动前述光学系统的光检测区域的位置，一边由前述光检测区域检测包含实质上一定的背景光的光而生成按照时间顺序的光强度数据的工序；
在前述按照时间顺序的光强度数据中，将前述复合体进入前述光检测区域内时产生的光强度的降低作为表示各前述复合体存在的信号并逐个检测的工序；和
对前述逐个检测到的表示复合体存在的信号的个数进行计数，从而计数前述光检测区域的位置的移动中检测到的前述复合体的个数的工序。
本实施方式的检测方法的作为检测对象的目标粒子只要是试样溶液中分散并随机运动粒子，就可以是任意的，没有特别的限定。可列举出例如：蛋白质、肽、核酸、核酸类似物质、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚集体等生物分子、病毒、细胞等粒子状的生物学的对象物或非生物学的粒子(例如：原子、分子、胶束、金属胶体等)等。核酸可以为DNA，也可以为RNA，也可以为cDNA这样的人工扩增的核酸。核酸类似物质可列举DNA或RNA这类天然类型核苷酸(天然存在的核苷酸)的侧链等被氨基等官能团修饰的物质、用蛋白质或低分子化合物等标记的物质等。更具体而言，可列举出例如：桥式核酸(BNA,Bridgednucleicacid)、天然型核苷酸的4’位氧原子被硫原子取代的核苷酸、天然型核糖核苷酸的2’位羟基被甲氧基取代的核苷酸、己糖醇核酸(HNA,HexitolNucleicAcid)、肽核酸(PNA)等。
作为本实施方式的检测方法中的目标粒子，优选为核酸分子或核酸类似物质。核酸分子或核酸类似物质既可以是双链核酸分子，也可以是单链核酸分子。具体而言，可列举出例如：具有存在于动物或植物的染色体、细菌或病毒基因中的碱基序列的核酸分子、具有人工设计的碱基序列的核酸分子。其中，作为目标粒子，优选例如：microRNA、siRNA、mRNA、hnRNA、基因组DNA、利用PCR扩增等得到的合成DNA、使用逆转录酶由RNA合成的cDNA等。
本实施方式的检测方法中所应用的标记用粒子，每一分子的大小充分小至前述粒子通过光检测区域时由前述光检测区域检测到的光强度几乎不降低的程度，并且每1分子目标粒子结合2分子以上标记用粒子而通过前述光检测区域时，相比于一分子的状态，形成的不发光复合体的大小为由前述光检测区域检测到的背景光的光强度降低程度显著地变大的程度。因此，通过反转型扫描分子计数法，能够将没有结合目标粒子的游离的标记用粒子与结合了目标粒子而形成复合体的标记用粒子区别地计数。
标记用粒子的大小只要是该粒子通过光检测区域时由前述光检测区域检测到的光强度几乎不降低的程度即可，可以考虑反转型扫描分子计数法的测定中使用的光分析装置的光检测区域、检测到的背景光的波长、光强度等而适宜确定。本实施方式中，出于一分子的状态下几乎观察不到背景光的光强度的降低的考虑，标记用粒子的平均外径优选小于前述光学系统的光检测区域的直径的15％，更优选小于10％。
目标粒子与2分子以上的标记用粒子结合而成的复合体的大小，只要前述粒子通过光检测区域时由前述光检测区域检测到的光强度的降低度相比于标记用粒子一分子的情况显著地大即可，可以考虑反转型扫描分子计数法的测定所使用的光分析装置的光检测区域、检测到的背景光的波长、光强度等而适宜确定。本实施方式中，复合体的外径优选为前述光学系统的光检测区域的直径的15％以上，更优选为35％以上。
每一分子的目标粒子所结合的标记用粒子的个数只要是2分子以上即可，可以考虑目标粒子、标记用粒子的每一分子的大小、复合体的大小等而适宜确定。本实施方式中，标记用粒子一分子的大小与结合了目标粒子的复合体的大小的差可以充分地大，所以优选与每一分子的目标粒子结合的标记用粒子的个数多。
本实施方式的检测方法中，复合体为不发光粒子即可。例如，可以是目标粒子与标记用粒子两者均为不发光粒子，也可以是目标粒子为荧光粒子，标记用粒子为吸收由前述荧光物质发出的荧光的猝灭物质。
标记用粒子为具有与目标粒子特异或非特异地结合或吸附的部位的物质。例如，目标粒子为核酸分子或核酸类似物质的情况下，作为标记用粒子，可列举出：与目标粒子杂交的寡核苷酸、核酸结合性蛋白质(例如，核酸结合性抗体等)、与核酸结合的不发光的色素分子等。作为该寡核苷酸,可以为DNA，也可以为RNA，也可以为cDNA这样的人工扩增物质，可以是部分或全部包含核酸类似物质的物质；所述核酸类似物质能够与天然的核酸碱基同样地形成核苷酸链或碱基对。
另外，目标粒子为蛋白质的情况下，作为标记用粒子，可以使用目标粒子的抗原或抗体、目标粒子的配体或受体。
本实施方式中使用的标记用粒子也可以为与目标粒子非特异地结合等的物质，从目标粒子的检测以及定量的精度的观点出发，优选特异地结合等的物质。需要说明的是，作为与目标粒子特异地结合的标记用粒子，只要是与物理或化学的性质与目标粒子类似的其他物质相比更优先与目标粒子结合的物质即可，不需要为与除了目标粒子以外的物质完全地不结合的物质。因此，例如，目标粒子为核酸分子的情况下，作为标记用粒子使用的寡核苷酸既可以具有与前述目标粒子的部分碱基序列完全地互补的碱基序列，也可以具有与前述目标粒子的部分碱基序列错配1～数碱基的碱基序列。
作为标记用粒子，可以使用例如：表面具备与目标粒子特异或非特异地结合或吸附的物质(以下，有时称为“与目标粒子结合的物质”。)的粒子。作为前述粒子，可列举出例如：磁性粒子、二氧化硅粒子、琼脂糖凝胶粒子、聚丙烯酰胺树脂粒子、胶乳粒子、聚苯乙烯粒子等塑料粒子，陶瓷粒子、氧化锆粒子等。
作为标记用粒子，使用表面上具备与目标粒子结合的物质的粒子的情况下，通常在粒子表面结合多个用于与目标粒子结合的物质。因此，通过使用这样的粒子，目标粒子与标记用粒子聚集，能够形成更大的复合体。需要说明的是，1个粒子的表面可以结合有一种用于与目标粒子结合等的物质，也可以结合两种以上用于与目标粒子结合等的物质。
对于特异地或者非特异地结合或吸附目标粒子的物质与这些粒子表面结合的方法，没有特别地限定，可以物理地吸附，也可以与粒子表面的官能团化学地结合。化学地结合的情况下，可以根据适合于各官能团的方法使其结合。可列举出例如：EDAC反应、预先将EDC和NHS混合而使羧酸与氨基结合的反应，使用具有双极性的连接体使氨基之间交联的反应，使活性化的醛基、甲苯磺酰基、与特异地或者非特异地结合或吸附目标粒子的物质中的官能团结合的反应等。在粒子表面上不具有官能团的磁性粒子的情况下，也可以用官能团覆盖粒子表面。
本实施方式中，1分子目标粒子同时与多个标记用粒子结合即可，可以使用一种标记用粒子，也可以使用两种以上的标记用粒子。例如，目标粒子中存在多处相同结构的部位时，也可以使用与前述部位特异或非特异地结合或吸附的一种物质作为标记用粒子。另外，对于目标粒子，也可以一起使用能够分别独立地与不同的部位结合的多个物质作为标记用粒子。例如，目标粒子为核酸分子或核酸类似物质的情况下，能够使用与前述目标粒子的各个不同部分区域杂交的多个寡核苷酸作为标记用粒子。
具体而言，工序(a)首先向适当的溶剂中添加目标粒子和标记用粒子而调制包含两者的溶液。前述溶剂只要是不有损目标粒子和标记用粒子的溶剂，就没有特别的限定。典型地为水溶液，也可以为甲酰胺等有机溶剂及其他的任意的液体。具体而言，前述溶剂可以从该技术领域中通常使用的缓冲液中适宜选择而使用。作为前述缓冲液，有例如：PBS(磷酸缓冲生理盐水、pH7.4)等磷酸缓冲液、Tris缓冲液等。
对于溶液中添加的标记用粒子的浓度，没有特别的限定，为了提高目标粒子的检测灵敏度，优选按照标记用粒子的浓度高于所期待的目标粒子的浓度与每一分子目标粒子可结合的标记用粒子的个数相乘而得的浓度的方式调制包含两者的溶液。
接着，在该试样溶液中使每1分子前述目标粒子结合2分子以上的前述标记用粒子而形成复合体。只是使目标粒子与标记用粒子共存于同一溶液中就能够使两者结合的情况下，调制包含两者的溶液之后，只需根据需要以规定时间孵育前述溶液，就能在前述溶液中形成包含目标粒子与标记用粒子的复合体。
另一方面，目标粒子、标记用粒子为双链结构的核酸分子或者核酸类似物质的情况下，优选使溶液中的核酸分子等变性之后使两者缔合。需要说明的是，“使核酸分子或核酸类似物质变性”是指使碱基对解离。例如，意味着使双链核酸分子成为单链核酸分子。需要说明的是，当标记用粒子是包含PNA等核酸类似物质的寡核苷酸时，即使目标粒子是双链核酸分子，有时不进行特别的变性处理也可以形成包含前述标记用粒子和目标粒子的复合体。
作为变性处理，可列举出：利用高温处理的变性(热变性)或利用低盐浓度处理的变性等。其中，由于操作简便而优选进行热变性。具体而言，热变性可以通过将前述溶液进行高温处理而使前述溶液中的核酸分子等变性。通常地，DNA在90℃下、RNA在70℃下保温数秒至2分钟左右，能够使之变性；但根据目标粒子的碱基的长度等进行变性的温度千差万别，只要能够变性，就对其温度没有限定。另一方面，通过低盐浓度处理进行变性可以是例如利用纯水等稀释，将前述溶液的盐浓度调整至足够低，从而进行。
根据需要使之变性之后，使前述溶液中的目标粒子与标记用粒子缔合，从而形成包含两者的复合体。当进行热变性时，在高温处理后，使前述溶液的温度降至目标粒子能够与标记用粒子特异地杂交的温度(特异的缔合条件)，由此能够使前述溶液中的两者适当缔合。优选使包含两者的溶液的温度降低至标记用粒子中具有与目标粒子互补的碱基序列的区域的Tm值±3℃的温度左右。另外，当通过低盐浓度处理进行变性时，通过添加盐溶液等，使前述溶液的盐浓度升高至目标粒子能够与标记用粒子特异地杂交的浓度，能够使前述溶液中的两者适当缔合。
需要说明的是，可以根据两者的缔合体的熔解曲线，求出两条单链核酸分子能够特异地杂交的温度。例如可以使仅含有两者的溶液的温度从高温向低温变化，测定前述溶液的吸光度或荧光强度来求出熔解曲线。根据所获得的熔解曲线，从变性了的两条单链核酸分子开始形成缔合体的温度，至几乎全部成为缔合体的温度这一范围内的温度，都可以作为两者能够特异地杂交的温度。也可以用使溶液中的盐浓度自低浓度向高浓度变化来代替温度，同样地确定熔解曲线，能够求出两条单链核酸分子能够特异地杂交的浓度。
这样，特异的缔合条件根据目标粒子、标记用粒子的种类而不同，由实验而确定；通常，可以用Tm值(熔解温度)代替。例如，利用普遍使用的引物/探针设计软件等，根据标记用粒子的碱基序列信息，能够算出与目标粒子杂交的区域的Tm值(双链DNA的50％解离为单链DNA的温度)。可以将温度为Tm值附近的值的条件例如Tm值±3℃左右的条件作为特异的缔合条件。在算出的Tm值附近通过实验求出熔解曲线，由此也能够更详细地确定特异的缔合条件。
此外，为了抑制非特异杂交，在形成缔合体时，优选使前述溶液的温度较缓慢地下降。例如，使前述溶液温度为70℃以上而使核酸分子变性后，可以按0.05℃/秒以上的降温速度，降低该溶液的液温。
此外，为了抑制非特异地杂交，还优选预先在前述溶液中添加表面活性剂、甲酰胺、二甲亚砜或尿素等。这些化合物可以只添加一种，也可以组合添加2种以上。通过添加这些化合物，在较低温度环境下也能够使非特异的杂交难以发生。
之后，作为工序(b)，通过反转型扫描分子计数法计算工序(a)中调制的试样溶液中的前述复合体的分子数。具体而言，首先，将试样溶液设置于用于前述反转型扫描分子计数法的光分析装置中。边通过前述的手法在前述试样溶液内移动前述光学系统的光检测区域的位置边由前述光检测区域检测包含实质上一定的背景光的光，从而生成按照时间顺序的光强度数据。在得到的按照时间顺序的光强度数据中，逐个地检测前述复合体进入前述光检测区域内时产生的光强度的降低作为表示各前述复合体存在的信号。对于逐个检测到的表示复合体存在的信号的个数进行计数，从而计数前述光检测区域的位置的移动中检测到的前述复合体的个数。
利用反转型扫描分子计数法的测量中，作为来自光检测区域的光所应包含的实质上一定的背景光，可以是利用透射照明等的照明光，也可以是由试样溶液内分散的物质产生的荧光、磷光、化学发光、生物发光或散射光。该情况下，用作试样溶液的溶液中没有分散发出或散射光的物质的情况下，所述溶液中也可以溶解或分散有积极地发出或散射光的物质。另外，用作试样溶液的溶液发出自身荧光的情况下，其自身荧光也可以作为上述背景光而利用。
为了作为背景光而在试样溶液内溶解或分散发出或散射光的物质的情况下，前述物质可以在利用反转型扫描分子计数法的测量之前添加至试样溶液内，也可以在工序(a)中形成复合体之前与标记用粒子等一起添加，还可以在工序(a)之后添加。作为前述物质，典型地为荧光性物质，但也可以为通过磷光、化学发光、生物发光、光散射等发出光的物质。作为荧光物质，只要是由特定波长的光照射就发出荧光的物质即可，没有特别的限定，可以从用于FCS或FIDA等的荧光色素中适当的选择使用。
进而，可以根据工序(b)中检测到的被计数的前述复合体的个数，确定前述试样溶液中的前述目标粒子的数密度或浓度。通过组合检测到的复合体的个数与光检测区域的位置的移动量，能够获得与试样溶液中的被识别的复合体的数密度或浓度相关的信息。具体而言，例如，计算出多个试样溶液的数密度或浓度的比或者相对于成为浓度或数密度的基准的标准试样溶液的相对的数密度或浓度的比，或者，使用相对于成为浓度或数密度的基准的标准试样溶液的相对的数密度或浓度的比，从而确定绝对的数密度值或浓度值。或者，通过任意手法例如以规定速度移动光检测区域的位置等来确定光检测区域的位置移动轨迹的总体积，就能够具体计算复合体的数密度或浓度。
实施例
接着，以下示出实施例等，进一步详细说明本发明的方式，但本发明的方式不限于下列实施例。
[参考例1]
使用光检测区域的直径为约2.8μm的共聚焦显微镜的光学系统，通过反转型扫描分子计数法测量直径不同的不发光粒子。
首先，将平均粒径(平均外径)为0.32μm、0.41μm或0.92μm的聚苯乙烯粒子(SpheroTech公司制)使用20体积％的PEG溶液调制成各20fM，从而调制聚苯乙烯粒子溶液。另外，将荧光物质ATTO(注册商标)488(ATTO公司制)使用10mMTris缓冲液(pH8)调制成6nM，从而调制荧光物质溶液。之后，将前述聚苯乙烯粒子溶液和前述荧光物质溶液等量混合，调制测定用的试样溶液。通过反转型扫描分子计数法测定这些试样溶液。
具体而言，检测中，使用具备共聚焦荧光显微镜的光学系统和光子计数系统的单分子荧光测定装置MF-20(OlympusCorporation)作为光分析装置，对于上述的各试样溶液，获得按照时间顺序的光子计数数据。激发光使用50μW的488nm的激光，使用带通滤波器，测定510nm～560nm的波长频带的光，生成按照时间顺序的光强度数据。使试样溶液中的光检测区域按照6000rpm的移动速度旋转，将BINTIME设为10μ秒，将测定时间设为30秒钟。对于各试样溶液，各进行3次测定。用Savinzky-Golay算法将由测定获得的按照时间顺序的数据进行平滑化以后，通过微分进行峰检测。从被视为峰的区域中，提取可以拟合为高斯函数的区域作为信号。
将由测定的结果得到的实际的峰数除以由扫描体积计算的峰数，从而算出峰检测率(％)。将计算结果示于图7中。平均粒径为0.32μm和0.41μm的聚苯乙烯粒子没有检测到峰，峰检测率分别为5.6％和4.7％，均小于10％；与此相对，平均粒径为0.92μm的聚苯乙烯粒子的峰检测率高达85.7％。由这些结果可以确认，外径小于光检测区域的直径的粒子在反转型扫描分子计数法中没有被检测到。
[实施例1]
使用光检测区域的直径为约2.8μm的共聚焦显微镜的光学系统，使用每1分子具有多个生物素化部位的葡聚糖(葡聚糖生物素)作为目标粒子，使用链亲合素粒子作为标记用粒子，通过反转型扫描分子计数法检测试样溶液中的目标粒子。
首先，将粒子表面涂敷有链亲合素的链亲合素粒子(平均粒径：0.32μm、Spherotech公司制)使用20体积％的PEG溶液调制成各4pM(链亲合素粒子溶液)。另外，将葡聚糖生物素(Invitrogen公司制)使用10mMTris缓冲液(pH8)调制成0pM、20pM、200pM、2nM(葡聚糖生物素溶液)。进而，另外将荧光物质ATTO(注册商标)488(ATTO公司制)使用10mMTris缓冲液(pH8)调制成6nM(荧光物质溶液)。
将链亲合素粒子溶液和葡聚糖生物素溶液等量地混合，将得到的混合液在室温下静置30分钟。之后，向前述混合液中加入等量的荧光物质溶液，调制测定用的试样溶液。
对于这些试样溶液，将测定时间设为60秒钟，除此以外，与参考例1同样地，通过反转型扫描分子计数法进行测定。图8为表示得到的峰数与葡聚糖生物素的浓度的图。结果，检测到的峰数依赖葡聚糖生物素浓度而增大。即，通过葡聚糖生物素与链亲合素粒子的聚集体检测到峰。
[实施例2]
使用光检测区域的直径为约2.8μm的共聚焦显微镜的光学系统，使用每1分子具有0、1或2处生物素化部位的核酸作为目标粒子，使用链亲合素粒子作为标记用粒子，通过反转型扫描分子计数法检测试样溶液中的目标粒子。
首先，调制分别含有以下所示的核酸的水溶液(核酸试样1～4)。需要说明的是，将各个碱基序列示于表1中。
核酸试样1为10ng/μL的由HSRRB(HealthScienceResearchResourcesBank)提供的基因组试样：No.194(以下，为“基因组No.194”)。
核酸试样2为10ng/μL的基因组No.194、与一条核酸链为由序列号1所表示的碱基序列组成的PCR产物(以下，为“PCR产物”)。
核酸试样3为10ng/μL的基因组No.194、与由序列号2所表示的碱基序列组成的5’末端被生物素标记的单链核酸(以下，为“生物素-ssDNA”)。
核酸试样4：10ng/μL的基因组No.194、以及由序列号3所表示的碱基序列组成的5’末端被生物素标记的单链核酸与由序列号4所表示的碱基序列形成的5’末端被生物素标记的单链核酸缔合而成的双链核酸(以下，为“生物素－dsDNA”)。
[表1]
进而，将粒子表面涂敷有链亲合素的链亲合素粒子(平均粒径：0.32μm、Spherotech公司制)使用20体积％的PEG溶液调制成各100pM(链亲合素粒子溶液)。另外，将荧光物质ATTO(注册商标)488(ATTO公司制)使用10mMTris缓冲液(pH8)调制成6nM(荧光物质溶液)。
将核酸试样1与链亲合素粒子溶液等量混合，将得到的混合液在室温下静置30分钟。之后，向前述混合液中加入等量的荧光物质溶液，调制测定用的试样溶液1。代替核酸试样1，分别使用核酸试样2～4，同样地调制测定用的试样溶液2～4。对于这些试样溶液，将转动速度设为6000rpm、测定时间设为30秒钟，除此以外，与参考例1同样地，通过反转型扫描分子计数法进行测定。
将各试样溶液中得到的峰数(平均值)和标准偏差(SD)示于表2中。结果，每1分子核酸只包含1个生物素，每1分子只结合1分子链亲合素粒子的试样溶液3，只能得到与不包含被生物素标记的核酸的试样1和2相同程度的峰数(小于40)。与此相对，每1分子核酸只包含2个生物素，每1分子结合2分子链亲合素粒子的试样溶液4中，检测到达148的峰数。这是因为，通过多个生物素-dsDNA与链亲合素粒子聚集形成大的复合体，所以被反转型扫描分子计数法高灵敏度地检测出来。另外，可以确认，这些试样溶液中包含基因组No.194，所以即便在试样溶液中大量存在除了目标粒子以外的类似的物质的情况下，通过使用与目标粒子特异地结合的标记用粒子，也能够通过反转型扫描分子计数法检测到目标粒子。
[表2]
试样溶液中的核酸 峰数 SD
试样溶液1 基因组No.194 36 2
试样溶液2 基因组No.194 PCR产物 34 5
试样溶液3 基因组No.194 生物素-ssDNA 38 4
试样溶液4 基因组No.194 生物素-dsDNA 148 7
产业上的可利用性
根据本发明的方式的目标粒子的检测方法，能够通过反转型扫描分子计数法测定在试样溶液中仅以非常低浓度存在的目标粒子的浓度，所以本发明的方式的检测方法能够利用于临床被检体等解析对象物质的浓度为微量的试样的解析/检查等领域中。
附图标记说明
1…光分析装置(共聚焦显微镜)
2…光源
3…单模光纤
4…准直仪透镜
5…分色镜
6、7、11…反射镜
8…物镜
9…微孔板
10…孔(试样溶液容器)
12…聚光镜
13…小孔
14…二次滤片
14a…分色镜或偏振光分束器
15…多模光纤
16…光检测器
17…镜转向器
17a…平台位置变化装置
18…计算机

Claims (12)

1.一种目标粒子的检测方法，其为使用共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测试样溶液中分散并随机运动的不发光粒子的方法，其具有：
(a)调制包含目标粒子和平均外径小于所述光学系统的光检测区域的直径的15％的标记用粒子的试样溶液，在所述试样溶液中使每1分子所述目标粒子结合2分子以上的所述标记用粒子，形成外径为所述光检测区域的直径的15％以上的不发光复合体的工序；和
(b)通过如下工序算出所述工序(a)中调制的试样溶液中的所述复合体的分子数的工序：
在所述试样溶液内移动所述光学系统的光检测区域的位置的工序；
一边在所述试样溶液内移动所述光学系统的光检测区域的位置，一边由所述光检测区域检测包含实质上一定的背景光的光而生成按照时间顺序的光强度数据的工序；
在所述按照时间顺序的光强度数据中，将所述复合体进入所述光检测区域内时产生的光强度的降低作为表示各所述复合体存在的信号并逐个检测的工序；和
对所述逐个检测到的表示复合体存在的信号的个数进行计数，从而计数所述光检测区域的位置的移动中检测到的所述复合体的个数的工序。
2.根据权利要求1所述的目标粒子的检测方法，其中，所述复合体的外径为所述光检测区域的直径的35％以上。
3.根据权利要求1或2所述的目标粒子的检测方法，其中，所述目标粒子与所述标记用粒子特异地结合。
4.根据权利要求1或2所述的目标粒子的检测方法，其中，所述目标粒子为核酸。
5.根据权利要求1或2所述的目标粒子的检测方法，其中，所述背景光为所述试样溶液内分散的物质产生的荧光、磷光、化学发光、生物发光或散射光。
6.根据权利要求1或2所述的目标粒子的检测方法，其中，所述背景光为照明光。
7.根据权利要求1或2所述的目标粒子的检测方法，其中，在所述移动光检测区域的位置的工序中，所述光检测区域的位置以比所述复合体的扩散移动速度更快的速度移动。
8.根据权利要求1或2所述的目标粒子的检测方法，其中，在所述移动光检测区域的位置的工序中，通过变更所述光学系统的光路而移动所述光检测区域在所述试样溶液内的位置。
9.根据权利要求1或2所述的目标粒子的检测方法，其中，在逐个检测表示所述复合体存在的信号的工序中，由所述背景光的强度进行测量，检测到具有低于规定阈值的光强度的信号时判定1个复合体进入到所述光检测区域内。
10.根据权利要求1或2所述的目标粒子的检测方法，其中，在逐个地检测表示所述复合体存在的信号的工序中，所述按照时间顺序的光强度数据被平滑化，在所述被平滑化的按照时间顺序的光强度数据中，由所述背景光的强度进行测量，检测具有低于规定阈值的强度的、向下凸的钟形的脉冲状信号作为表示所述复合体存在的信号。
11.根据权利要求1或2所述的目标粒子的检测方法，其进而具有：根据所述工序(b)中检测到的被计数的所述复合体的个数确定所述试样溶液中的所述目标粒子的数密度或浓度的工序。
12.根据权利要求1或2所述的目标粒子的检测方法，其中，
所述工序(b)中，重复进行所述光检测区域的位置的移动、所述来自光检测区域的光的检测、表示所述复合体存在的信号的检测，直至表示所述复合体存在的信号的个数达到预定的个数为止，
根据表示所述复合体的信号存在的个数达到预定的个数所需要的时间，确定所述试样溶液中的所述目标粒子的浓度。
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