CN104099370A - 肿瘤靶向治疗的非整合慢病毒载体系统及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肿瘤靶向治疗的非整合慢病毒载体系统及制备方法和应用，属于肿瘤基因治疗领域。本发明构建的慢病毒载体系统能协同表达GFP/RFP和白喉毒素A片段（DTA）双顺反子，驱动DTA在肿瘤细胞中高效表达，荧光蛋白的表达可用于验证所表达的DTA的有效性，同时，荧光蛋白的表达还可用于准确反映慢病毒包装细胞系的构建和慢病毒包装效果。本发明构建的慢病毒载体系统能特异抑制肿瘤细胞生长和细胞中蛋白质的合成，对肿瘤细胞有特异杀伤效果，可用于肿瘤靶向基因治疗。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤基因治疗领域，具体涉及肿瘤靶向治疗的非整合慢病毒载体系统及制备方法和应用。
背景技术
白喉毒素(diphtheriatoxin，DT)只在白喉杆菌的溶源性菌体内产生,因为只有溶源菌才含有编码该蛋白的结构基因（Tox基因）。白喉毒素致毒机理主要是能抑制真核生物细胞的胞内蛋白质合成而表现毒性，它能催化真核胞质内NAD+上的ADP核糖基向翻译延伸因子-2(EF-2)转移，从而消耗了生物正常代谢过程所需NAD+并阻断真核细胞蛋白质合成而对细胞致死。同时，白喉毒素的毒性具有很强特异性，具体表现在两个方面:首先，它只催化NAD+上ADP核糖基向EF-2转移，对NAD+类似物如α-NAD+，NADP+和NADH则不发生该转移反应；其次，仅真核生物的EF-2作为该反应的受体。
白喉毒素的毒性全部集中在白喉毒素A片段（DTA）上，而片段A进入细胞后能独立地表达ADP核糖基转移活性,且编码片段A的基因长度大约只有800个碱基，有利于基因治疗方面的操作。
Survivin蛋白（由BIRC5基因编码）在肿瘤细胞中高丰度表达，而在正常组织细胞中表达丰度很低(很多正常器官和组织中没有发现其表达)。 同时，该蛋白能增强肿瘤细胞的抗凋亡能力，是一种抗凋亡蛋白，这些都表明该基因的异常表达与肿瘤关系紧密。
为实现安全的基因治疗，慢病毒整合能力应尽可能被消除。非整合的慢病毒载体由于病毒组装、反转录、前病毒的入核和病毒的整合过程是分开的，因此，它不仅能避免由整合入基因组DNA引起插入突变的风险，而且仍具有高效感染广宿主范围的宿主细胞和静止细胞的优势。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肿瘤靶向治疗的非整合慢病毒载体系统及制备方法和应用。
本发明首先公开了一种非整合慢病毒载体系统，是将HIV整合酶D64突变为A的PMDL-D64A以及另外两个包装质粒REV、VSVG连同慢病毒表达载体共转入过量表达突变EF-2的293T细胞，即在宿主细胞中包装获得非整合慢病毒载体系统；所述的慢病毒表达载体包括pPRIME-Surp-P269-GFP-2A-DTA-FF3、pPRIME- Surp-P269-RFP-2A-DTA-FF3；所述的非整合慢病毒载体系统是利用Survivin启动子驱动白喉毒素A片段和荧光蛋白协同表达，其出发载体为pPRIME-CMV-GFP-FF3或pPRIME-CMV-dsRed-FF3。
所述的Survivin启动子为269bp长度的Surp-P269启动子。
其次，本发明提供了一种所述非整合病毒载体系统的制备方法，包括以下步骤：
步骤1）荧光蛋白基因的克隆：以pPRIME-CMV-GFP-FF3或pPRIME-CMV-dsRed-FF3质粒为模板，分别高保真PCR扩增GFP和RFP基因，并分别克隆入T/A克隆载体；
步骤2）DTA克隆：以pBSDTA-II的质粒为模板，高保真PCR克隆DTA片段，PCR产物以ApaI和NotI酶按双酶切连接方法克隆入步骤1）的T/A克隆载体中，获得GFP/RFP-DTA的T/A克隆载体；
步骤3）口蹄疫病毒2A序列的设计和合成：根据口蹄疫病毒的2A短肽氨基酸序列，设计并合成寡核苷酸片段，通过退火，连接插入步骤2）中获得的T/A克隆载体的GFP/RFP和DTA之间，获得GFP/RFP-2A-DTA T/A克隆载体；
步骤4）启动子克隆：以提取的293T细胞基因组DNA为模板，高保真PCR克隆基因启动子Surp-P269，PCR产物以ApaI和NheI酶按双酶切连接方法克隆入用同种内切酶酶切形成的线性pPRIME-CMV-GFP-FF3慢病毒载体，连接形成pPRIME-Surp-P269-GFP-FF3表达载体；
步骤5）慢病毒表达载体的建立：利用双酶切连接方法将GFP/RFP-2A-DTA T/A克隆载体中的GFP/RFP-2A-DTA片段分别转移入pPRIME-Surp-P269-GFP-FF3慢病毒表达载体，获得慢病毒表达载体pPRIME-Surp-P269-GFP- 2A-DTA-FF3，pPRIME-Surp-P269-RFP-2A-DTA-FF3；
步骤6）慢病毒的包装：在转染前对宿主细胞进行无血清饥饿2小时，将位于整合酶D64突变为A的PMDL-D64A、REV、VSVG和步骤5）中的慢病毒表达载体混匀后，再与PEI转染试剂混匀，共同加入宿主细胞中，6小时后将培养基替换为含体积分数为2%血清的培养基，连续收集3天上清，利用超速离心机浓缩病毒，获得非整合慢病毒载体系统。
更具体地，所述非整合病毒载体系统的制备方法，包括以下步骤：
步骤1）荧光蛋白基因的克隆：以pPRIME-CMV-GFP-FF3或pPRIME-CMV-dsRed-FF3质粒为模板，GFP正向引物：5’-GCACCGGTGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3’（SEQ ID NO:1），末端为AgeI酶切位点（下划线表示的碱基），GFP反向引物：5’-ATAGTTTAGCGGCCGCG GGCCCTCTAGACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3’（SEQ ID NO:2），末端为NotI酶切位点（下划线表示的碱基）；RFP正向引物：5’-GCACCGGTGCCACCATGGCCTCCTCCGAGGAC-3’（SEQ ID NO:3），末端为AgeI酶切位点（下划线表示的碱基），RFP反向引物：5’-ATAGTTTAGCGGC CGCGGGCCCTCTAGACAGGA ACAGGTGGTGGCG-3’（SEQ ID NO:4），末端为NotI酶切位点（下划线表示的碱基），高保真PCR扩增GFP和RFP基因，PCR反应条件为：95°C 变性2min，95°C 变性20sec-60°C退火20sec-72°C 30sec延伸重复35个循环，72°C延伸 5min，并克隆入T/A克隆载体；
步骤2）DTA克隆：以pBSDTA-II的质粒为模板，正向引物：5’-GCGGGCCCATGGACCCTGAT GATGTTG-3’（SEQ ID NO:5），末端为ApaI酶切位点（下划线表示的碱基），反向引物：5’-ATAGT TTAGCGGCCGCTTAGAGCTTTAAATCTCTGTA-3’（SEQ ID NO:6），末端为NotI酶切位点（下划线表示的碱基），高保真克隆DTA片段，PCR反应条件为：95°C 变性2min，95°C 变性20sec-60°C退火20sec-72°C 1min延伸重复35个循环，72°C 延伸5min，PCR产物以ApaI和NotI酶按双酶切连接方法克隆入步骤1）的T/A克隆载体中，获得GFP/RFP-DTA的T/A克隆载体；
步骤3）口蹄疫病毒2A序列的设计和合成：合成的核苷酸翻译后对应的氨基酸序列为：SRAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（SEQ ID NO:7），根据此2A短肽氨基酸序列，设计寡核苷酸片段，通过退火，连接插入步骤2）中获得的T/A克隆载体的GFP/RFP和DTA之间，获得GFP/RFP-2A-DTA的T/A克隆载体；
步骤4）启动子克隆：以提取的293T细胞基因组DNA为模板，正向引物：5’-GCGGGCCC CGCGTTCTTTGAAAGCAGTC-3’（SEQ ID NO:8），末端为ApaI酶切位点（下划线表示的碱基），反向引物：5’-CTAGCTAGCTGCCGCCGCCGCCACCTCTG-3’（SEQ ID NO:9），末端为NheI酶切位点（下划线表示的碱基），高保真克隆基因启动子，PCR反应条件为：95°C 变性2min，95°C 变性20sec-60°C退火20sec-72°C 30sec延伸重复35个循环，72°C 延伸5min，PCR产物以ApaI和NheI酶按双酶切连接方法克隆入用同种内切酶酶切形成的线性pPRIME-CMV-GFP-FF3慢病毒载体，连接形成pPRIME- Surp-P269-GFP-FF3表达载体；
步骤5）利用酶切连接方法将GFP/RFP-2A-DTA T/A克隆载体中的GFP/RFP-2A-DTA片段分别转移入pPRIME-Surp-P269-GFP-FF3慢病毒表达载体，获得pPRIME-Surp-P269-GFP-2A-DTA-FF3，pPRIME-Surp-P269-RFP-2A-DTA-FF3；
步骤6）慢病毒的包装：在转染前对宿主细胞进行无血清饥饿2小时，将位于整合酶D64突变为A的PMDL（D64A）、以及其他两个包装质粒REV、VSVG和步骤5）中的慢病毒表达载体混匀后，再与PEI转染试剂混匀后，加入至宿主细胞培养基中，6小时后将细胞培养基替换为含2%的血清的培养基，连续收集3天上清，利用超速离心机浓缩病毒，获得整合缺陷型的pPRIME-Surp-P269-GFP-2A-DTA-FF3和pPRIME-Surp-P269-RFP-2A-DTA-FF3慢病毒。
本发明还要求保护一种所述非整合慢病毒载体系统的应用，将所述的非整合慢病毒载体系统应用于制备肿瘤靶向基因治疗药物。
表达白喉毒素DTA慢病毒的宿主细胞为改建的HEK293T细胞系，该细胞系过量表达突变的蛋白延伸因子2（EF-2）,突变的氨基酸位点为717(甘氨酸GGA定点突变为精氨酸CGA)，该细胞系来自于专利（专利申请号：201310500310.5），该细胞系命名为HEK293T[mEF-2(G717R)]。
本发明的有益效果在于：
（1）通过载体构建的方式，构建了由Surp-P269启动子驱动的荧光蛋白GFR/RFP和DTA协同表达的慢病毒载体，GFR/RFP和DTA之间用口蹄疫病毒的2A片段进行藕联；
（2）利用位于整合酶D64突变为A的PMDL(D64A)、和其他两个包装质粒REV、VSVG连同慢病毒表达载体，对DTA和GFP/RFP双顺反子协同表达的慢病毒进行了包装，获得非整合的慢病毒载体系统；
（3）通过对蛋白质合成能力（荧光蛋白和荧光素酶的表达能力）以及肿瘤细胞的存活能力进行比较，发现构建的协同表达荧光蛋白和白喉毒素的慢病毒载体不仅能有效监测病毒的包装过程，同时，Surp-P269驱动的慢病毒对肿瘤细胞具有靶向性；
（4）本发明构建的慢病毒表达载体系统对肿瘤细胞具有特异杀伤能力，该系统病毒的产生可用荧光蛋白进行实时监测，经体外实验证实，所构建的慢病毒载体系统能抑制蛋白质的合成和细胞的生长。
（5）与专利申请号：201310500310.5的启动子相比，Survivin的启动子更短，更利于基因工程的操作，短的启动子使得慢病毒的负载更小，更有利于慢病毒的包装，从而提高病毒的滴度。另外CMV启动子不是肿瘤特异的启动子，它是广谱的启动子，在正常组织和细胞里面都能获得高效表达，因而造成肿瘤基因治疗的副作用高。而Survivin的启动子与专利201310500310.5中使用的启动子活性在正常组织和细胞中表达范围和水平不同，因此可以弥补肿瘤基因治疗的不足，它们存在互补的效果。
附图说明
图1：Surp-P269启动子驱动荧光蛋白和白喉毒素A片段协同表达的慢病毒载体构建图。
图2：慢病毒的包装和肿瘤清除模型的流程图。
图3：荧光蛋白监测慢病毒的包装和病毒包装细胞系的建立。
图4：过量表达DTA的慢病毒载体感染肿瘤细胞系后的生存分析。
具体实施方式
表达白喉毒素A片段的慢病毒载体系统是将整合酶D64突变为A的PMDL-D64A、其他两个包装质粒REV、VSVG和表达载体共转入HEK293T[mEF-2(G717R)]细胞，即在宿主细胞中包装获得非整合慢病毒载体系统；其表达载体包括pPRIME-Surp-P269-GFP-2A-DTA-FF3和pPRIME-Surp-P269-RFP-2A-DTA - FF3。
实施例1
表达绿色荧光蛋白和白喉毒素A片段的非整合慢病毒载体系统的制备方法包括以下步骤：
步骤1）绿色荧光蛋白基因的克隆：以pPRIME-CMV-GFP-FF3质粒为模板，正向引物：5’-GC ACCGGTGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3’（SEQ ID NO:1），末端为AgeI酶切位点（下划线表示的碱基），反向引物：5’-ATAGTTTAGCGGCCGCGGGCCCTCTAGACTTGTACAGCT CGTCCATGC-3’（SEQ ID NO:2），末端为NotI酶切位点（下划线表示的碱基），高保真PCR扩增GFP基因，并克隆入T/A克隆载体；
步骤2）DTA克隆：以pBSDTA-II的质粒为模板，正向引物：5’-GCGGGCCCATGGACCCTGATG ATGTTG-3’（SEQ ID NO:5），末端为ApaI酶切位点（下划线表示的碱基），反向引物：5’-ATAGTT TAGCGGCCGCTTAGAGCTTTAAATCTCTGTA-3’（SEQ ID NO:6），末端为NotI酶切位点（下划线表示的碱基），高保真克隆DTA片段，PCR产物以ApaI和NotI酶按双酶切连接方法克隆入步骤1）的T/A克隆载体中，获得GFP-DTA的T/A克隆载体；
步骤3）口蹄疫病毒2A序列的设计和合成：合成的核苷酸翻译后对应的氨基酸序列为：SRAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（SEQ ID NO:7），根据此2A短肽氨基酸序列，设计寡核苷酸片段，通过退火，连接插入步骤2）中获得的T/A克隆载体的GFP和DTA之间，获得GFP-2A-DTA的T/A克隆载体；
步骤4）Surp-P269启动子克隆：以提取的293T细胞基因组DNA为模板，正向引物：5’-GCGGGCCC CGCGTTCTTTGAAAGCAGTC-3’（SEQ ID NO:8），末端为ApaI酶切位点（下划线表示的碱基），反向引物：5’-CTAGCTAGCTGCCGCCGCCGCCACCTCTG-3’（SEQ ID NO:9），末端为NheI酶切位点（下划线表示的碱基），高保真克隆Surp-P269启动子，PCR反应条件为：95°C 变性2min，95°C 变性20sec-60°C退火20sec-72°C 30sec延伸重复35个循环，72°C 延伸5min，PCR产物以ApaI和NheI酶按双酶切连接方法克隆入用同种内切酶酶切形成的线性pPRIME-CMV-GFP-FF3慢病毒载体，连接形成pPRIME- Surp-P269-GFP-FF3表达载体；
步骤5）利用酶切连接方法将GFP-2A-DTA T/A克隆载体中的GFP-2A-DTA片段转移入步骤4）中的pPRIME-Surp-P269-GFP-FF3慢病毒载体，形成pPRIME-Surp-P269-GFP-2A-DTA-FF3慢病毒载体；
步骤6）慢病毒的包装：在转染前对HEK293T[mEF-2(G717R)]包装细胞系细胞进行无血清饥饿2小时，将位于整合酶D64突变为A的PMDL-D64A、其他两个包装质粒REV、VSVG和pPRIME-Surp-P269-GFP -2A- DTA-FF3表达载体混匀后，再与PEI转染试剂混匀，共同加入HEK293T[mEF-2(G717R)]包装细胞细胞培养基中，6小时后将培养基替换为含2%的血清的培养基，连续收集3天上清，利用超速离心机浓缩病毒，获得非整合型的pPRIME-Surp-P269-GFP-2A-DTA-FF3慢病毒；
实施例2
表达红色荧光蛋白和白喉毒素A片段的慢病毒载体系统的制备方法包括以下步骤：
步骤1）红色荧光蛋白基因的克隆：以pPRIME-CMV-dsRed-FF3质粒为模板，正向引物：5’-GCACCGGTGCCACCATGGCCTCCTCCGAGGAC-3’（SEQ ID NO:3），末端为AgeI酶切位点（下划线表示的碱基），反向引物：5’- ATAGTTTAGCGGCCGCGGGCCCTCTAGACAGGAAC AGGTGGTGGCG-3’（SEQ ID NO:4），末端为NotI酶切位点（下划线表示的碱基），高保真PCR扩增RFP基因，并克隆入T/A克隆载体；
步骤2）DTA克隆：以pBSDTA-II的质粒为模板，正向引物：5’-GCGGGCCCATGGACCCTGAT GATGTTG-3’（SEQ ID NO:5），末端为ApaI酶切位点（下划线表示的碱基），反向引物：5’-ATAGTTTAGCGGCCGCTTAGAGCTTTAAATCTCTGTA-3’（SEQ ID NO:6），末端为NotI酶切位点（下划线表示的碱基），高保真克隆DTA片段，PCR产物以ApaI和NotI酶按双酶切连接方法克隆入步骤1）的T/A克隆载体中，获得RFP-DTA的T/A克隆载体；
步骤3）Surp-P269启动子克隆：以提取的293T细胞基因组DNA为模板，正向引物：5’-GCGGGCCC CGCGTTCTTTGAAAGCAGTC-3’（SEQ ID NO:7），末端为ApaI酶切位点（下划线表示的碱基），反向引物：5’-CTAGCTAGCTGCCGCCGCCGCCACCTCTG-3’（SEQ ID NO:8），末端为NheI酶切位点（下划线表示的碱基），高保真克隆Surp-P269启动子，PCR反应条件为：95°C 变性2min，95°C 变性20sec-60°C退火20sec-72°C 30sec延伸重复35个循环，72°C 延伸5min，PCR产物以ApaI和NheI酶按双酶切连接方法克隆入用同种内切酶酶切形成的线性pPRIME-CMV-GFP-FF3慢病毒载体，连接形成pPRIME- Surp-P269-GFP-FF3表达载体；
步骤4）口蹄疫病毒2A序列的设计和合成：合成的核苷酸翻译后对应的氨基酸序列为：SRAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（SEQ ID NO:7），根据此2A短肽氨基酸序列，设计寡核苷酸片段，通过退火，连接插入步骤2）中获得的T/A克隆载体的RFP和DTA之间，获得RFP-2A-DTA的T/A克隆载体；
步骤5）利用酶切连接方法将RFP-2A-DTA T/A克隆载体中的RFP-2A-DTA片段转移入步骤3）中的pPRIME-Surp-P269-GFP-FF3慢病毒表达载体，获得pPRIME-Surp-P269-RFP-2A- DTA-FF3；
步骤6）慢病毒的包装：在转染前对HEK293T[mEF-2(G717R)]包装细胞系进行无血清饥饿2小时，将位于整合酶D64突变为A的PMDL-D64A、其他两个包装质粒REV、VSVG和pPRIME-Surp-P269-RFP-2A- DTA-FF3表达载体混匀后，再与PEI转染试剂混匀，共同加入无血清饥饿的HEK293T[mEF-2(G717R)]包装细胞培养基中，6小时后将培养基替换为含2%的血清的培养基，连续收集3天上清，利用超速离心机浓缩病毒，获得非整合型的pPRIME-Surp-P269-RFP-2A-DTA-FF3慢病毒。
乳腺癌细胞系ZR7530及其改建的细胞系来源于专利申请号：201310500310.5，细胞系分别为ZR7530, ZR7530（mEF-2），ZR7530（Luc+mEF-2）。
慢病毒表达载体对肿瘤细胞存活能力影响的测定：（1）由图3可知，在表达野生型翻译延伸因子EF-2的293T细胞中，未见到荧光蛋白的表达；而在HEK293T[mEF-2(G717R)]稳定细胞系中，可以见到荧光的显著表达，表明该慢病毒载体对蛋白质的合成具有显著的抑制作用。（2）将pPRIME-Surp-P269-RFP-2A-DTA-FF3非整合型浓缩慢病毒分别感染ZR7530, ZR7530（mEF-2）和ZR7530（Luc+mEF-2）细胞系。两天后，进行细胞计数。由图4可知，感染病毒两天后，ZR7530细胞总数约减少75%，ZR7530（mEF-2）和ZR7530（Luc+mEF-2）细胞总数无显著变化。由此表明，Surp-P269启动子驱动的DTA的非整合慢病毒对乳腺癌细胞具有很强的杀灭能力，能显著影响肿瘤细胞的存活；然而，该病毒对于过量表达突变的EF-2的乳腺癌细胞影响很小。因此，本发明的非整合慢病毒载体系统对于肿瘤的基因治疗具有潜在的优势和价值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
<110> 中国人民解放军南京军区福州总医院
<120> 肿瘤靶向治疗的非整合慢病毒载体系统及制备方法和应用
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcaccggtgc caccatggtg agcaagggcg agg 33
<210> 2
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atagtttagc ggccgcgggc cctctagact tgtacagctc gtccatgc 48
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcaccggtgc caccatggcc tcctccgagg ac 32
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atagtttagc ggccgcgggc cctctagaca ggaacaggtg gtggcg 46
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gcgggcccat ggaccctgat gatgttg 27
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atagtttagc ggccgcttag agctttaaat ctctgta 37
<210> 7
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Ser Arg Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu
1 5 10 15
Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gcgggccccg cgttctttga aagcagtc 28
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ctagctagct gccgccgccg ccacctctg 29
Claims (4)
1.一种非整合慢病毒载体系统，其特征在于：将HIV整合酶D64突变为A的PMDL-D64A以及另外两个包装质粒REV、VSVG连同慢病毒表达载体共转入过量表达突变EF-2的293T细胞，即在宿主细胞中包装获得非整合慢病毒载体系统；所述的慢病毒表达载体包括pPRIME-Surp-P269-GFP-2A-DTA-FF3、pPRIME- Surp-P269-RFP-2A-DTA-FF3；所述的非整合慢病毒载体系统是利用Survivin启动子驱动白喉毒素A片段和荧光蛋白协同表达，其出发载体为pPRIME-CMV-GFP-FF3或pPRIME-CMV-dsRed-FF3。
2.根据权利要求1所述的非整合慢病毒载体系统，其特征在于：所述的Survivin启动子为269bp长度的Surp-P269启动子。
3.如权利要求1所述的非整合病毒载体系统的制备方法，其特征在于：其制备方法包括以下步骤：
步骤1）荧光蛋白基因的克隆：以pPRIME-CMV-GFP-FF3或pPRIME-CMV-dsRed-FF3质粒为模板，分别高保真PCR扩增GFP和RFP基因，并分别克隆入T/A克隆载体；
步骤2）DTA克隆：以pBSDTA-II的质粒为模板，高保真PCR克隆DTA片段，PCR产物以ApaI和NotI酶按双酶切连接方法克隆入步骤1）的T/A克隆载体中，获得GFP/RFP-DTA的T/A克隆载体；
步骤3）口蹄疫病毒2A序列的设计和合成：根据口蹄疫病毒的2A短肽氨基酸序列，设计并合成寡核苷酸片段，通过退火，连接插入步骤2）中获得的T/A克隆载体的GFP/RFP和DTA之间，获得GFP/RFP-2A-DTA T/A克隆载体；
步骤4）启动子克隆：以提取的293T细胞基因组DNA为模板，高保真PCR克隆基因启动子Surp-P269，PCR产物以ApaI和NheI酶按双酶切连接方法克隆入用同种内切酶酶切形成的线性pPRIME-CMV-GFP-FF3慢病毒载体，连接形成pPRIME-Surp-P269-GFP-FF3表达载体；
步骤5）慢病毒表达载体的建立：利用双酶切连接方法将GFP/RFP-2A-DTA T/A克隆载体中的GFP/RFP-2A-DTA片段分别转移入pPRIME-Surp-P269-GFP-FF3慢病毒表达载体，获得慢病毒表达载体pPRIME-Surp-P269-GFP- 2A-DTA-FF3，pPRIME-Surp-P269-RFP-2A-DTA-FF3；
步骤6）慢病毒的包装：在转染前对宿主细胞进行无血清饥饿2小时，将位于整合酶D64突变为A的PMDL-D64A、REV、VSVG和步骤5）中的慢病毒表达载体混匀后，再与PEI转染试剂混匀，共同加入宿主细胞中，6小时后将培养基替换为含体积分数为2%血清的培养基，连续收集3天上清，利用超速离心机浓缩病毒，获得非整合慢病毒载体系统。
4.如权利要求1所述的非整合慢病毒载体系统的应用，其特征在于：所述的非整合慢病毒载体系统应用于制备肿瘤靶向基因治疗药物。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20141015 |