CN104099366B - 一种谷氨酸脱羧酶重组质粒及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明的谷氨酸脱羧酶重组质粒是通过将谷氨酸脱羧酶基因gadB与麦芽糖启动子pamyE拼接后，插入到穿梭表达载体pEKEx2中形成的重组质粒pEKEx2‑pamyE‑gadB。本发明还提供了该重组质粒的构建方法以及其应用。本发明的重组质粒，大大提高了重组谷氨酸脱羧酶的表达量，促进谷氨酸的脱羧，由此进一步实现了提高γ‑氨基丁酸的产量，也缩短了生产周期，更适于大规模工业化生产，并且安全性较高，避免了因安全性问题对产品应用领域的限制，在食品及医药领域均可应用。

Description

一种谷氨酸脱羧酶重组质粒及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种谷氨酸脱羧酶重组质粒及其构建方法和应用。

背景技术

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一种以自由态形式存在的非蛋白质氨基酸，是哺乳动物中枢神经系统的抑制性传递物质。GABA具有多种生理功能，如降血压、预防癫痫、改善睡眠、抗抑郁、镇静安神、促进激素分泌和保肝利肾等功效，因此，受到了人们的广泛关注。目前，国内外对GABA进行制备，主要采用化学合成法或微生物发酵法。由于采用化学合成法制备GABA时，需从产品中脱除的有毒成分复杂且产品的安全性差，因此，相较于化学合成法，微生物发酵法具有更为良好的发展前景。

微生物发酵法制备GABA，主要是利用谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase，GAD；EC 4.1.1.15)催化L-谷氨酸脱羧，从而生成GABA的。目前，已经发现的能够积累GABA的微生物主要有大肠杆菌和乳酸菌，其中，乳酸菌为益生菌，所以在生产GABA时乳酸菌更为常用。但是，GAD是生物催化谷氨酸脱羧生成GABA的限速酶，微生物积累GABA速度较慢，因此，导致GABA的产量较低，难以大规模工业化生产。

为提高GABA的产量，出现了利用微生物的基因工程酶法合成技术，通过过量表达菌株中的高活性谷氨酸脱羧酶基因，来进一步提高GABA的产量。在此研究中，采用的方法主要是将来源于可积累GABA的菌株中的谷氨酸脱羧酶基因导入到具有活性较低的内源谷氨酸脱羧酶编码基因的大肠杆菌或枯草芽孢杆菌的某个野生型菌株中，并使谷氨酸脱羧酶在宿主菌中得到高效表达，从而增强宿主菌生产GABA的能力。上述方法虽在一定程度上提高了GABA的产量，但是，在利用上述宿主菌进行GABA的生产过程中，均需在发酵时添加L-谷氨酸或L-谷氨酸盐作为前体物质，使之脱羧为GABA，加之有些宿主菌的安全性仍受到人们的质疑，在一定程度上制约了GABA产品的应用。因此，近些年来又出现了把乳酸菌或大肠杆菌来源的GAD基因导入到谷氨酸棒杆菌ATCC13032中，利用重组谷氨酸棒杆菌生产GABA的研究。重组谷氨酸棒状菌可在发酵过程中积累产生谷氨酸，与此同时表达GAD基因合成GAD，对积累的谷氨酸进行脱羧，可实现无需添加底物L-谷氨酸及L-谷氨酸盐即可一步合成GABA，同时，谷氨酸棒杆菌为食品微生物，安全性较高，可应用于食品及医药领域。然而，目前的重组谷氨酸棒状菌表达GAD催化转化的产量仍维持在较低水平，究其原因，主要是将原菌体中的GAD基因导入宿主菌时，采用的穿梭表达载体的启动子强度差，导致重组谷氨酸脱羧酶表达量少、活性低，进而导致GABA收率不高，并且，即使分批添加足够的底物(谷氨酸)，在重组谷氨酸脱羧酶表达量少、活性低的情况下，也无法获得较多的产物。因此，目前亟待寻求一种新的方法从根本上解决采用重组谷氨酸棒状菌生产GABA产量较低的问题。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是现有技术中的重组谷氨酸脱羧酶在宿主菌谷氨酸棒状菌中表达量少、活性低的问题，进而提供一种可实现GAD的高效表达的谷氨酸脱羧酶重组质粒以及该重组质粒的构建方法。

本发明要解决的第二个技术问题是现有技术中的重组谷氨酸棒状菌生产GABA产量较低的问题，提供一种采用重组谷氨酸棒状菌高效生产GABA的方法。

本发明的谷氨酸脱羧酶重组质粒，所述重组质粒是通过将谷氨酸脱羧酶基因gadB与麦芽糖启动子pamyE拼接后，插入到穿梭表达载体pEKEx2中形成的重组质粒pEKEx2-pamyE-gadB；所述麦芽糖启动子pamyE具有SEQ ID No.1所示的序列结构。

所述麦芽糖启动子的基因序列为，SEQ ID No.1：CCTCTCGCGTGCCCCAACGGCTCCTACGATCAAAAATCCTCCCTGCTTCCCTCAACTGTTTTTATATGTATTTGTATGTTTTAGGCCCGATTACTTGTGAATATGTGGAATACCTCACTAAGGTGGAAGGAAGGCTAACCAGTTCATAGTCGGACTGCAATCCGCTATGAAGTACTTGGTGGCGCTGGGAAGAAGCCTTCGTTATGGGAGGTCTCCCAGACACAATCGAATACGGGCCGGATATCCATCTCGGCTCATCACCCCGCTTTTTATCAAGAAAGATGAGGACCTC。

所述穿梭表达载体pEKEx2为大肠杆菌-谷氨酸棒状杆菌穿梭表达载体。

所述谷氨酸脱羧酶基因gadB的序列结构见NCBI中GeneID为12931794的序列。

构建上述谷氨酸脱羧酶重组质粒的方法，包括以下步骤：

(1)取穿梭表达载体pEKEx2，根据其多克隆位点及Ptac启动子的序列，将pEKEx2载体用PvuII限制性内切酶单切，改造获得不含Ptac启动子的pEKEx2载体；

(2)取谷氨酸脱羧酶的全长基因序列gadB与谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组麦芽糖启动子pamyE序列，利用Overlap-PCR技术进行拼接得到pamyE-gadB基因；

(3)将拼接后的pamyE-gadB基因插入到步骤1)中得到的不含Ptac启动子的穿梭表达载体pEKEx2中，构建得到谷氨酸脱羧酶重组质粒pEKEx2-pamyE-gadB。

进一步的，所述步骤(2)具体为：

根据大肠杆菌来源谷氨酸脱羧酶gadB氨基酸序列和谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组麦芽糖启动子pamyE序列，以及pEKEx2的多克隆位点，设计合成如下四条引物：

YW3:5’-GAACCCGGGATCCGAGCTC CCTCTCGCGTGCCCCAACGGCTC-3’

Sma I

YW4:5’-CGTTACTTGCTTCTTATCCATGAGGTCCTCATCTTTCTTGATAAAAAG-3’

YW5:5’-ATGGATAAGA AGCAAGTAAC G-3’

YW6:5’-GGACCCGGGTACCGTCGAC TCAGGTATGTTTAAAGCTGTTC-3’

Sma I

分别以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组和E.coli K-12基因组DNA做为模板，YW3、YW4的pamyE PCR产物和YW5、YW6的gadB PCR产物回收后进行overlap-PCR扩增。

进一步的，所述步骤(3)具体为：

取步骤(2)的PCR产物pamyE-gadB进行Sma I单酶切，并与步骤(1)中改造后的pEKEx2载体进行PvuII单酶切，回收酶切产物进行连接，得到重组表达质粒pEKEx2-pamyE-gadB。

包含有上述谷氨酸脱羧酶重组质粒的重组菌，所述重组菌为生产谷氨酸脱羧酶的谷氨酸棒杆菌。

构建所述的重组菌的方法，包括将所述的重组质粒pEKEx2-pamyE-gadB，导入所述谷氨酸棒状菌ATCC13032的感受态细胞中的步骤，以使所述重组质粒高效表达，构建得到所述重组菌。

所述重组菌在发酵制备γ-氨基丁酸领域中的应用。

所述重组菌发酵生产γ-氨基丁酸的方法，包括将权利要求7所述的重组菌进行扩大培养以诱导其大量表达谷氨酸脱羧酶的步骤，以及以谷氨酸为底物，在适宜条件下进行发酵产γ-氨基丁酸的步骤。

所述重组菌的扩大培养步骤中，还包括向发酵液中加入麦芽糖和/或IPTG作为诱导剂的步骤。

所述重组菌的扩大培养步骤中，发酵培养基的组分如下：40g/l葡萄糖，50g/l硫酸铵，1g/l磷酸氢二钾，3g/l尿素，0.4g/l硫酸镁，50g/l大豆蛋白栋，0.01g/l硫酸铁，0.01g/l硫酸锰，200μg/l硫胺素，0.5mg/l生物素，0.265g/l磷酸吡哆醛，5g/l吐温-40，pH值为7.5。

优选的，在所述发酵谷氨酸底物产γ-氨基丁酸的步骤中，采用分批添加底物的方式进行。

本发明的上述技术方案，相比现有技术具有以下优点：

(1)本发明将麦芽糖启动子pamyE作为谷氨酸脱羧酶gadB的启动子，使得表达载体pEKEx2-pamyE-gadB具有强启动子，大大提高了重组谷氨酸脱羧酶的表达量，促进谷氨酸的脱羧，由此进一步实现了提高γ-氨基丁酸的产量，也缩短了生产周期，更适于大规模工业化生产。同时，麦芽糖启动子pamyE为碳源诱导型启动子，可采用无毒的麦芽糖作为诱导剂诱导GAD表达，使最终的产品更为安全；

另外，表达载体pEKEx2为大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体，自身带有一段卡那霉素抗性基因，卡那霉素抗性基因作为标记基因，可方便重组菌的筛选。

(2)本发明的重组菌，采用谷氨酸棒状菌作为宿主菌，可在发酵过程中积累产生谷氨酸，从而在一定程度上减少底物谷氨酸的添加，甚至于无需再添加外源的底物谷氨酸。重组菌表达的GAD，可对积累的谷氨酸直接进行脱羧，一步合成GABA，降低了生产成本。同时，谷氨酸棒状菌本身是食品微生物，安全性较高，结合发酵过程中使用安全的麦芽糖作为诱导剂，可保证合成的GABA的安全性，避免了因安全性问题对产品应用领域的限制，在食品及医药领域均可应用。

(3)采用本发明的重组菌发酵生产γ-氨基丁酸，包括将所述重组菌进行扩大培养以诱导其大量表达谷氨酸脱羧酶的步骤，以及以谷氨酸为底物，在适宜条件下进行发酵产γ-氨基丁酸的步骤。上述方法生产易操作，易放大，稳定性好，适于大规模工业生产。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1为gadB基因PCR扩增产物1％琼脂糖凝胶电泳分析图；其中，M为DL2000DNAMarker；1为gadB PCR产物；

图2为pamyE-gadB基因PCR扩增产物1％琼脂糖凝胶电泳分析图；其中，M为DL2000DNA Marker；1为pamyE-gadB基因overlap-PCR产物；

图3为不同重组表达菌酶法合成γ-氨基丁酸的纸层析图,其中，

1、2为标准品，

3为pEKEx2/ATCC13032菌种发酵111h的产物，

4为pEKEx2-gadB/ATCC13032菌种发酵111h的产物，

5为pEKEx2-pamyE-gadB/ATCC13032菌种发酵111h的产物。

具体实施方式

实施例1 重组pEKEx2-gadB表达载体的构建

本实施例构建的重组pEKEx2-gadB表达载体具有Ptac启动子，为IPTG诱导型表达载体。其构建方法为：根据大肠杆菌来源谷氨酸脱羧酶gadB氨基酸序列以及穿梭表达载体pEKEx2的多克隆位点，设计合成如下二条引物进行PCR扩增，其中以E.coli K-12基因组DNA做为模板。

YW1：5’-GGA GTCGAC AAGGAGATATAGAT ATGGATAAGA AGCAAGTAAC G

Sal I

YW2:

5’-5’-GGAGAGCTC TCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCGGTATGTTTAAAGCTGTTC-3’

SacI

在50μl的PCR反应管中建立如下反应体系：

PCR反应条件如下：

反应结束后，取10μl进行1.0％Agarose电泳鉴定。检测结果如图1，获得的产物大小为1400bp左右，符合gadB基因的预期大小。

随后PCR产物和pEKEx2载体分别进行Sac I和Sal I双酶切，回收酶切产物进行连接，常规CaCl₂法转化大肠杆菌DH5α，并涂布于含有50mg/lKan的固体LB平板，37℃培养到转化子长出。然后挑取转化子进行重组克隆的鉴定，根据鉴定结果，最终成功获得重组表达质粒pEKEx2-gadB。

实施例2 重组pEKEx2-pamyE-gadB表达载体的构建：

本实施例构建的重组pEKEx2-pamyE-gadB表达载体具有麦芽糖启动子，为麦芽糖诱导型表达载体。其构建方法为：根据穿梭表达载体pEKEx2的多克隆位点及Ptac启动子序列，将pEKEx2载体用PvuII限制性内切酶单切，回收并自主连接，获得改造后不含Ptac启动子的pEKEx2载体。随后，根据大肠杆菌来源谷氨酸脱羧酶gadB氨基酸序列和谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组麦芽糖启动子pamyE序列，以及pEKEx2的多克隆位点，设计合成如下四条引物，分别以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组和E.coli K-12基因组DNA做为模板，YW3、YW4的pamyE PCR产物和YW5、YW6的gadB PCR产物回收后进行overlap PCR扩增。

YW3:5’-GAA CCCGGGATCCGAGCTC CCTCTCGCGTGCCCCAACGGCTC-3’

Sma I

YW4:5’-CGTTACTTGCTTCTTATCCATGAGGTCCTCATCTTTCTTGATAAAAAG-3’

YW5:5’-ATGGATAAGA AGCAAGTAAC G-3’

YW6:5’-GGA CCCGGGTACCGTCGAC TCAGGTATGTTTAAAGCTGTTC-3’

Sma I

在50μl PCR反应管中建立如下overlap PCR反应体系：

反应条件如下：

反应结束后，取10μl进行1.0％Agarose电泳鉴定。检测结果如图2，获得的产物大小为1700bp左右，符合pamyE-gadB基因的预期大小。

随后PCR产物pamyE-gadB进行Sma I单酶切和改造后的pEKEx2载体进行PvuII单酶切，回收酶切产物进行连接，常规CaCl₂法转化大肠杆菌DH5α，并涂布于含有50mg/l Kan的固体LB平板，37℃培养到转化子长出。然后挑取转化子进行重组克隆的鉴定，根据鉴定结果，最终成功获得重组表达质粒pEKEx2-pamyE-gadB。

实施例3 重组菌的构建：

本实施例的重组菌的构建方法，包括以下步骤：

(1)挑取谷氨酸棒杆菌单菌落于LBG液体培养基中，30℃，200rpm过夜培养16h；

(2)测其OD₆₀₀值，将菌液转接入含有30ml感受态培养基的250ml的三角瓶中，菌液的最终OD₆₀₀值为0.2；

(3)继续于30℃，200rpm培养3-5h，使其OD₆₀₀在0.9左右；

(4)将培养液在冰上放置15min；

(5)将菌液加入到预冷的50ml离心管中，于4℃，4000rpm下离心10min；

(6)弃上清，向离心管中加入10％预冷的甘油，将菌体充分悬浮，于4℃，4000rpm下离心10min；

(7)弃上清，用10％预冷甘油再重复洗涤两次；

(8)用400μl预冷的10％甘油重悬细胞，然后分装到1.5ml的离心管中，每管100μl，于-70℃的超低温冰箱中保存；

(9)将谷氨酸棒杆菌感受态细胞于冰上融化；

(10)分别加入5μl预冷质粒(pEKEx2-gadB，pEKEx2-pamyE-gadB，pEKEx2)，混匀，于冰上放置5-10min；

(11)然后将混合液加入到预冷的0.1cm电击杯中，利用电穿孔仪于1.8KV，电击一次；

(12)加入恢复用培养基1ml，混匀，于46℃下水浴6min；

(13)将混合液于30℃，180rpm下培养1h；

(14)12000rpm离心2min，吸取部分上清液，余下大约100μl菌液涂布于含25mg/lKan的固体平板；

(15)将筛选平板放置于30℃恒温培养箱中培养36h,即得重组菌。

实施例4 谷氨酸棒杆菌重组菌株的发酵：

将保存于冻存管中的谷氨酸棒杆菌重组菌株pEKEx2-gadB-ATCC13032、pEKEx2-pamyE-gadB-ATCC13032、pEKEx2-ATCC13032接种于含有25mg/l卡那霉素的LBG固体培养基中，在30℃的恒温培养箱中放置24h活化菌株；然后从LBG固体培养基中挑取谷氨酸棒杆菌重组菌株加入培养谷氨酸棒杆菌的种子培养基中，于30℃、200rpm的条件下培养12h左右，然后以10％的转接量加入到发酵培养基中，在发酵2-4h后，加入1mol/l的IPTG或20g/l的麦芽糖对目的基因进行诱导表达。为了保证最适酶活和最大的γ-氨基丁酸产量，同时发酵27h后每隔12h，在菌株自产少量谷氨酸基础上分批添加底物谷氨酸(共添加110g左右)。对发酵15h后的发酵液(每隔12h)定时取样，然后将发酵液高速离心，取上清液，用5％的三氯乙酸稀释相应倍数后静置1h以上，高速离心后取上清液，将上清液用0.22μm水相针孔滤膜即为待上样样品，利用纸层析(见图3)和高效液相色谱(表1)对其进行精确定量，每个水平重复三次，结果见表1。

表1 重组菌株在不同发酵时间点的γ-氨基丁酸累积量

由上述三种菌种积累γ-氨基丁酸的量的结果可知，本发明的具有麦芽糖启动子pamyE的菌种，积累γ-氨基丁酸的量显著高于不含麦芽糖启动子pamyE的菌种，说明将麦芽糖启动子pamyE作为谷氨酸脱羧酶gadB的启动子，可提高重组谷氨酸脱羧酶的表达量，进而促进谷氨酸的脱羧，可提高γ-氨基丁酸的产量，并且在较短的发酵时间内即产生γ-氨基丁酸，可缩短生产周期，更适于大规模工业化生产。同时，本发明的pEKEx2-pamyE-gadB/ATCC13032菌种，可采用无毒的麦芽糖作为诱导剂诱导GAD表达，安全性较高，在食品及医药领域均可应用。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

SEQUENCE LISTING

<110> 苏州凯祥生物科技有限公司

<120> 一种谷氨酸脱羧酶重组质粒及其构建方法和应用

<130> SHA201400108

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 292

<212> DNA

<213> maltose promoter

<400> 1

cctctcgcgt gccccaacgg ctcctacgat caaaaatcct ccctgcttcc ctcaactgtt 60

tttatatgta tttgtatgtt ttaggcccga ttacttgtga atatgtggaa tacctcacta 120

aggtggaagg aaggctaacc agttcatagt cggactgcaa tccgctatga agtacttggt 180

ggcgctggga agaagccttc gttatgggag gtctcccaga cacaatcgaa tacgggccgg 240

atatccatct cggctcatca ccccgctttt tatcaagaaa gatgaggacc tc 292

Claims (11)

1.一种谷氨酸脱羧酶重组质粒，其特征在于，所述重组质粒是通过将谷氨酸脱羧酶基因gadB与麦芽糖启动子pamyE拼接后，插入到穿梭表达载体pEKEx2中形成的重组质粒pEKEx2-pamyE-gadB；所述麦芽糖启动子pamyE的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种构建权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶重组质粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取穿梭表达载体pEKEx2，根据其多克隆位点及Ptac启动子的序列，将pEKEx2载体用PvuII限制性内切酶单切，改造获得不含Ptac启动子的pEKEx2载体；

(2)取谷氨酸脱羧酶的全长基因序列gadB与谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组麦芽糖启动子pamyE序列，利用Overlap-PCR技术进行拼接得到pamyE-gadB基因；

(3)将拼接后的pamyE-gadB基因插入到步骤1)中得到的不含Ptac启动子的穿梭表达载体pEKEx2中，构建得到谷氨酸脱羧酶重组质粒pEKEx2-pamyE-gadB。

3.根据权利要求2所述的构建权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶重组质粒的方法，其特征在于，所述步骤(2)具体为：

根据大肠杆菌来源谷氨酸脱羧酶gadB氨基酸序列和谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组麦芽糖启动子pamyE序列，以及pEKEx2的多克隆位点，设计合成如下四条引物：

YW3:5'-GAACCCGGGATCCGAGCTC CCTCTCGCGTGCCCCAACGGCTC-3'

Sma I

YW4:5'-CGTTACTTGCTTCTTATCCATGAGGTCCTCATCTTTCTTGATAAAAAG-3'

YW5:5'-ATGGATAAGA AGCAAGTAAC G-3'

YW6:5'-GGACCCGGGTACCGTCGAC TCAGGTATGTTTAAAGCTGTTC-3'

Sma I

分别以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组和E.coli K-12基因组DNA做为模板，YW3、YW4的pamyE PCR产物和YW5、YW6的gadB PCR产物回收后进行overlap-PCR扩增。

4.根据权利要求2或3所述的构建权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶重组质粒的方法，其特征在于，所述步骤(3)具体为：

取步骤(2)的PCR产物pamyE-gadB进行Sma I单酶切，并与步骤(1)中改造后的pEKEx2载体进行连接，得到重组表达质粒pEKEx2-pamyE-gadB。

5.一种包含有权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶重组质粒的重组菌，其特征在于，所述重组菌为生产谷氨酸脱羧酶的谷氨酸棒杆菌。

6.一种构建权利要求5所述的重组菌的方法，其特征在于，包括将权利要求1所述的重组质粒pEKEx2-pamyE-gadB，导入谷氨酸棒状菌ATCC13032的感受态细胞中的步骤，以使所述重组质粒高效表达，构建得到所述重组菌。

7.权利要求5所述的重组菌在发酵制备γ-氨基丁酸领域中的应用。

8.一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，包括将权利要求5所述的重组菌进行扩大培养以诱导其大量表达谷氨酸脱羧酶的步骤，以及以谷氨酸为底物，在适宜条件下进行发酵产γ-氨基丁酸的步骤。

9.根据权利要求8所述的发酵生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述重组菌的扩大培养步骤中，还包括向发酵液中加入麦芽糖和/或IPTG作为诱导剂的步骤。

10.根据权利要求9所述的发酵生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述重组菌的扩大培养步骤中，发酵培养基的组分如下：40g/l葡萄糖，50g/l硫酸铵，1g/l磷酸氢二钾，3g/l尿素，0.4g/l硫酸镁，50g/l大豆蛋白栋，0.01g/l硫酸铁，0.01g/l硫酸锰，200μg/l硫胺素，0.5mg/l生物素，0.265g/l磷酸吡哆醛，5g/l吐温-40，pH值为7.5。

11.根据权利要求8-10任一所述的发酵生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，在所述发酵谷氨酸底物产γ-氨基丁酸的步骤中，采用分批添加底物的方式进行。