CH701730B1 - VCAM-1 spezifischer monoklonaler Antikörper. - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft einen monoklonalen Antikörper, der spezifisch sowohl an Menschen- als auch an Mäuse-Gefässzellen-Adhäsionsmolekül-1 (VCAM-1) bindet, ein Verfahren zur Herstellung desselben, eine Zusammensetzung zum Diagnostizieren oder zur Behandlung, die diesen umfasst, und ein Verfahren zum Diagnostizieren oder zur Behandlung, die diesen benutzt. Der erfindungsgemässe monoklonale Antikörper ist der erste rekombinante monoklonale Antikörper, der spezifisch ist für Menschen- und Mäuse-VCAM-1. Ausserdem zeigt der monoklonale Antikörper ein starke Affinität für VCAM-1, das in Ratten-Skelettmuskulatur- und in Schweine-Endothel-Zellen, ebenso wie in Menschen- und Mäuse-Endothelzellen exprimiert ist, und man hat gefunden, dass er die Interaktion zwischen Leukozyten und aktivierten Endothelzellen stark inhibiert. Folglich kann der erfindungsgemässe monoklonale Antikörper eine VCAM-1-vermittelte Adhäsion von Leukozyten an Endothelzellen inhibieren und eine VCAM-1-vermittelte Krankheit wirksam behandeln, insbesondere eine Entzündungskrankheit oder Krebs.
Description
Technisches Gebiet
[0001] Die vorliegende Erfindung betrifft einen monoklonalen Antikörper, der spezifisch an Vaskularzellen-Adhäsionsmolekül-1 (vascular cell adhesion molecule-1, nachfolgend einfach als «VCAM-1» bezeichnet) bindet. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung einen monoklonalen Antikörper, der spezifisch sowohl an Menschen- als auch an Mäuse-Gefässzellen-Adhäsionsmolekül-1 (VCAM-1) bindet, ein Verfahren zur Herstellung desselben, eine Arzneimittel-Zusammensetzung zum Diagnostizieren oder zur Behandlung, die diesen umfasst, und ein Verfahren zum Diagnostizieren oder zur Behandlung, die diesen benutzt. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Inhibition einer VCAM-1-vermittelten Adhäsion eines Leukozyten an einer Endothelzelle.
Technologischer Hintergrund
[0002] Zell-Adhäsionsmoleküle (cell adhesion molecules, CAM’s) sind wichtig für die Rekrutierung von Leukozyten aus zirkulierendem Blut für das Endothel in der Entzündungsreaktion.
[0003] Endothelzellen als ein aktiver Responder exprimieren als Reaktion auf die extrazellulären Reize verschiedene CAM’s, wie zum Beispiel E- und P-Selektine und Mitglieder der Immunoglobulin-Superfamilie, einschliesslich interzellulärer Zell-Adhäsionsmolekül (ICAM)-1, -2 und -3, Vaskularzellen-Adhäsionsmolekül (VCAM)-1, welche mit den Kohlenhydrat-Liganden und Integrinen interagieren, die in Leukozyten exprimiert sind. Folglich glaubt man, wegen der zentralen Rolle von CAM’s, die die Akkumulation von Leukozyten bei Entzündungen vermitteln, dass das Blockieren von CAM’s eine vielversprechende Strategie für ein therapeutisches Eingreifen bei Entzündungskrankheiten sei.
[0004] Innerhalb der CAM’s ist VCAM-1, CD106, dominant exprimiert in und induzierbar exprimiert auf Endothelzellen nach Aktivierung durch Lipopolysaccharid (LPS), Interleukin-1 (IL-1), Interferon-ν (INFν) oder Tumornecrosis-Faktor alpha (TNFα). VSAM-1 bindet an sehr spätes Antigen-4 (VLA-4), α4β1-Integrin, das auf aktivierten Leukozyten bei Entzündung oder Immunabstossung exprimiert ist, und spielt eine kritische Rolle beim Fördern der Interaktion zwischen Endothelzellen und Leukozyten, einschliesslich Monozyten-und T-Zellen. Gegenwärtig wird den VCAM-1-VLA-4-Interaktionen zunehmend mehr Beachtung geschenkt als Ziele für therapeutische Eingriffe bei Entzündungskrankheiten. Beispielsweise sind kleine Peptid-Antagonisten von Integrin α4β1, TR14035, oder ein α4-Integrin-Antikörper, Tysabri oder Natalizumab, wirksam, um die Pathologie bei entzündlicher Magenerkrankung (inflammatory bowl disease), Multipler Sklerose und Asthma zu verbessern. TR14035, und Natalizumab sind derzeit in Phase II, respektive III. Ausserdem ist VCAM-1 auch, gemäss in letzter Zeit zunehmenden Anzeichen, eng verbunden mit dem Fortschreiten von Krebs. Im Detail wird VCAM-1 zunächst als ein Marker für die Diagnose von verschiedenen Krebsarten angesehen. Zweitens spielt VCAM-1, das im Tumor-Umfeld exprimiert ist, eine Schlüsselrolle dabei, die Zielsuche von Knochenmark-abgeleiteten Stammzellen für die Neubildung von Tumor-Gefässzellen zu erleichtern. Drittens ist VCAM-1 wichtig für die Extravasation von zirkulierenden Krebszellen, einen Schlüsselschritt bei der Metastase. Viertens wurde festgestellt, dass die Hinunter-Regulierung (down-regulation) von VCAM-1 bei hoch immunresistenten Krebszelllinien zu reduzierter Tumor-Immun-Evasion führt. In diesen Zusammenhängen gibt es zunehmenden Bedarf für Diagnose und Therapie von Anti-Adhäsions-Medikamenten bei der Behandlung von Krebs.
Offenbarung der Erfindung
Technische Aufgabe
[0005] Trotz kürzlicher Aufmerksamkeit gegenüber VCAM-1-VLA-4-Interaktion, wurde die Entwicklung eines neutralisierenden Antikörpers für VCAM-1 nicht aktiv untersucht. Obwohl M/K-2.7, ein monoklonaler Antikörper für Mäuse-VCAM-1, vor kurzem entwickelt worden ist und einen reduzierten Effekt auf Gelenkentzündung im Collagen-induzierten Arthritis-Maus-Modell, sollte der Nutzen des Antikörpers weiter getestet werden für eine klinische Anwendung. Bis jetzt haben die meisten klinischen Studien über Anti-Adhäsions-Therapien humanisierte monoklonale Antikörper verwendet. In diesem Zusammenhang ist die Entwicklung eines monoklonalen Antikörpers, der spezifisch für Mäuse- und Menschen-VCAM-1 ist für vorklinische und klinische Studien und der geeignet ist für die Konversion von humanisiertem Antikörper, dringend notwendig.
Technische Lösung
[0006] In der vorliegenden Studie haben wir zum ersten Mal einen Hasen/Menschen-chimären monoklonalen Antikörper spezifisch für Menschen- und Mäuse-VCAM-1 generiert, der schwere Ketten (VH) und leichte Ketten (VL), variable Domäne von Hasen und menschliche der schwere Ketten (CH1) und leichte Ketten (CL) konstante Domäne aus einer synthetischen Antikörper-Sammlung enthält. Dieser Antikörper erkennt spezifisch Menschen-, Mäuse-, Ratten- und Schweine-VCAM-1, das in verschiedenen Zelltypen, wie Endothelzellen und Skelett-Muskulaturzellen, exprimiert ist. Ausserdem weist es eine starke Wirksamkeit, die Interaktion zwischen U937 menschlichen promonozytischen Leukozyten und aktivierten Endothelzellen zu blockieren. Schliesslich haben wir die epitopen Regionen gegen VCAM-1-spezifischen Antikörper identifiziert, deren Sequenzen von Mäuse-VCAM-1 abgeleitet sind. Zusammenfassend beschreibt die vorliegende Anmeldung einen potentiell therapeutischen monoklonalen Antikörper, der zweifach spezifisch ist für Menschen- und Mäuse-VSAM-1.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
[0007] Die vorliegende Erfindung wird besser verstanden werden anhand der detaillierten Beschreibung, die im Folgenden gegeben ist, und die begleitenden Zeichnungen, die nur zur Illustration gezeigt sind und dementsprechend nicht einschränkend sind für die vorliegende Erfindung, und wobei:
[0008] Fig. 1a–1c die Reinigung und Charakterisierung eines anti-FCAM-1 Fab-Klons spezifisch für Menschen- und Mäuse-VCAM-1. Fig. 1a: 0.2 µg anti-VCAM-1 Fab wurde durch SDS-PAGE aufgelöst und sichtbar gemacht mittels Coomassie Blue Anfärben. Das anti-VCAM-1 Fab mit einer Molekularmasse von 25 kDa ist durch einen Pfeil angezeigt. Fig. 1b: Rekombinante Menschen- und Mäuse-VCAM-1/Fc-Chimären, die auf 96 Titerplatten aufgebracht waren, wurden mit praeimmunem, immunem Serum detektiert, respektive gereinigtes anti-VCAM-1 Fab, wie in den Beispielen beschrieben. Fig. 1c: Unterschiedliche Mengen an rekombinanten Menschen- und Mäuse-VCAM-1/Fc-Chimären wurden auf ein Gel geladen und Immunoblotting mit anti-VCAM-1 Fab unterzogen, wie in den Beispielen beschrieben.
[0009] Fig. 2 zeigt Sequenzen von schweren Ketten und leichten Ketten variablen Domänen von anti-VCAM-1 Fab-Klonen. Die ausgewählten Fab-Klonen wurden einer DNA-Sequenzierung unterzogen und die identifizierten Sequenzen von schweren Ketten (VH) und leichten Ketten (VL) variablen Domänen von anti-VSAM-1 Fab wurden dann dargestellt wie angezeigt. FR bedeutet Rahmenregion (framework region). CDR bezeichnet eine Komplementaritäts-bestimmende Region (complementarity-determining region). Sequenzen von humanisiertem Antikörper abgeleitet von anti-VCAM-1 Fab-Klonen sind ebenfalls dargestellt.
[0010] Fig. 3 zeigt die Detektion von nativem VCAM-1, das in verschiedenen Zelltypen exprimiert ist, durch anti-VCAM-1 Fab. HUVEC’s, MEC’s, PAEC s und L6 Skelett-Muskulaturzellen, die in der Abwesenheit (gestrichelte Linie) oder Gegenwart (ausgezogene Linie) von hTNF oder H2O2 kultiviert wurden, wie in den Beispielen beschrieben, wurden einer Durchflusscytometrie mit anti-VCAM-1 Fab unterzogen. Gereinigtes VCAM-1-spezifisches Polyserum wurde als positive Kontrolle verwendet. Die gezeigten Resultate sind repräsentativ für mindestens drei separate Experimente.
[0011] Fig. 4a und 4b zeigen den neutralisierenden Effekt von anti-VCAM-1 Fab auf die Interaktion zwischen Leukozyten und Endothelzellen. Fig. 4a: Mit 400 µM H2O2 behandelte PAECs wurden in Abwesenheit (dünne Linie) oder Gegenwart (dicke Linie) von anti-VCAM-1 Fab oder anti-VCAM-1 IgG inkubiert und dann einer Adhäsions-Untersuchung unterzogen mit CSFE-markierten U937 Zellen, wie in den Beispielen beschrieben. Das Ausmass des Bindens von U937 an Endothelzellen wurde mittels Durchflusscytometrie detektiert. Eine PAEC-Kultur in Abwesenheit von H2O2 (gestrichelte Linie) wurde verwendet, um grundlegendes Binden von U397 an übrige Endothelzellen zu messen. Fig. 4b: Die Prozent-Werte von CFSE-markiertem U937, die an Endothelzellen gebunden sind, sind als vertikale Balken abgebildet. Die gezeigten Resultate entsprechen den Durchschnitten ± S.D., die aus der repräsentativen Messung von zwei separaten Experimenten erhalten wurden, die zweifach ausgeführt wurden.
Beste Ausführungsform der Erfindung
[0012] In der vorliegenden Erfindung beziehen sich «ein» und «eine» auf Objekte sowohl in der Einzahl als auch in der Mehrzahl.
[0013] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zum Lösen der oben beschriebenen Aufgabe wird ein monoklonaler Antikörper zur Verfügung gestellt, der spezifisch sowohl an Menschen- als auch an Mäuse-Gefässzellen-Adhäsionsmolekül-1 (vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1) bindet.
[0014] Wie hier verwendet, beinhaltet «Antikörper» die Referenz auf ein Immunoglobulin-Molekül, das immunologisch reaktiv ist gegenüber einem bestimmten Antigen, und sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper beinhaltet. Der Begriff beinhaltet auch gentechnisch manipulierte Formen, wie chimäre Antikörper (z.B. humanisierte Mäuse-Antikörper) und heterokonjugate Antikörper (z.B. dispezifische Antikörper). Der Begriff «Antikörper» beinhaltet auch Antigen-bindende Formen von Antikörpern, inklusive Fragmente mit der Fähigkeit, Antigen zu binden, (z.B. Fab ́, F8ab ́) 2, Fab, Fv und rlgG). Der Ausdruck bezieht sich auch auf rekombinante, Einzelketten-Fv-Fragmente (Single chain Fv fragments, scFv). Der Begriff Antikörper beinhaltet auch bivalente oder bispezifische Moleküle, Diabody’s, Triabody’s und Tetrabody’s. Bivalente und bispezifische Moleküle sind beispielsweise in Kostelny et al. (1992, J. Immunol. 148:15467). Pack und Pluckthen (1992, Biochemistry 31:1579) Hollinger et al. (1993, supra), Gruber et al. (1994, J. Immunol. 5368), Zhu et al. (1997, Protein Sci. 6:781), Hu et al. (1996, Cancer Res. 56:3005), Adams et al. (1993, Cancer Res. 53:4026) und McCartney et al. (1995, Protein Eng. 8:301) beschrieben.
[0015] Ausserdem bezieht sich der Begriff «monoklonaler Antikörper», wie er hier verwendet wird, auf ein Antikörper-Molekül, das von einem im Wesentlichen identischen Antikörper-Klon erhalten wurde, welcher Einzelbindungs-Spezifität zeigt und Affinität für ein spezifisches Antigen.
[0016] Typischerweise hat ein Immunoglobulin eine schwere und eine leichte Kette. Jede schwere und leichte Kette enthält eine konstante Region und eine variable Region (die Regionen sind auch als «Domänen» bekannt). Leichte Ketten und variable Regionen schwerer Ketten enthalten drei hypervariable Regionen, die «Komplementaritäts-definierende Regionen» (complementarity-defining regions) oder CDR’s genannt werden, und vier «Rahmenregionen». Die CDR sind in erster Linie für das Binden an ein Epitop eines Antigens verantwortlich. Die CDR’s jeder Kette werden üblicherweise als CDR1, CDR2 und CDR3 bezeichnet, sequentiell vom N-Terminus aus nummeriert, und werden typischerweise auch identifiziert durch die Kette, in welcher die bestimmt CDR angeordnet ist.
[0017] In einer bevorzugten Ausführungsform bezieht sich die vorliegende Erfindung auf einen monoklonalen Antikörper, umfassend eine variable Region leichter Ketten, die eine leichte Kette CDRl, wie sie durch SEQ ID Nr. 5 definiert ist; eine leichte Kette CDR2, wie sie durch SEQ ID Nr. 6 definiert ist; und eine leichte Kette CDR3, wie sie durch SEQ ID Nr. 7 definiert ist, umfasst. Besonders bevorzugt ist es, dass der erfindungsgemässe monoklonale Antikörper eine leichte Kette umfasst, deren Aminosäure-Sequenz durch SEQ ID Nr. 1 definiert ist.
[0018] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen monoklonalen Antikörper, umfassend eine variable Region schwerer Ketten, die eine schwere Kette CDR1, wie sie durch SEQ ID Nr. 8 definiert ist; eine schwere Kette CDR2, wie sie durch SEQ ID Nr. 9 oder SEQ ID Nr. 11 definiert ist; und eine schwere Kette CDR3, wie sie durch SEQ ID Nr. 10 oder SEQ ID Nr. 12 definiert ist, umfasst. Besonders bevorzugt ist es, dass der erfindungsgemässe monoklonale Antikörper eine schwere Kette umfasst, deren Aminosäure-Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe von Aminosäure-Sequenzen, die durch SEQ ID Nr. 2, 3 und 4 definiert sind.
[0019] Der erfindungsgemässe monoklonale Antikörper kann auch sowohl die obige variable Region leichter Ketten als auch die variable Region schwerer Ketten umfassen.
[0020] In der Zwischenzeit kann der erfindungsgemässe monoklonale Antikörper hergestellt werden durch Einpflanzen der obigen Komplementaritäts-definierenden Regionen (CDR’s) von anti-VCAM-1 Fab in den Rahmen (FR) in variablen Regionen von therapeutischen Antikörpern. Vorzugsweise kann der FR eine Aminosäure-Sequenz umfassen, wie sie in Fig. 2beschrieben ist.
[0021] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann der erfindungsgemässe monoklonale Antikörper humanisiert werden, um eine menschliche Krankheit richtig zu behandeln. Besonders bevorzugt ist es, dass der humanisierte monoklonale Antikörper eine leichte Kette umfassen kann, deren Aminosäure-Sequenz durch SEQ ID Nr. 13 definiert ist, und/oder eine schwere Kette, deren Aminosäure-Sequenz durch SEQ ID Nr. 14 oder 15 definiert ist.
[0022] Ein «humanisierter Antikörper» ist ein Immunoglobulin-Molekül, das eine Minimalsequenz enthält, die von nichtmenschlichem Immunoglobulin abgeleitet ist. Humanisierte Antikörper umfassen menschliche Immunoglobuline (Empfänger-Antikörper), in welchen Reste einer Komplementaritäts-definierenden Regionen (CDR) des Empfängers ersetzt sind durch Reste einer CDR einer nichtmenschlichen Spezies (Spender-Antikörper), wie von einer Maus, einer Ratte oder einem Hasen, die die gewünschte Spezifität, Affinität und Kapazität haben.
[0023] Die Humanisierung kann im Wesentlichen gemäss dem Verfahren von Winter und Mitarbeitern (Jones et al., Nature 321 : 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature 332 : 323–327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239 : 1534–1536 (1988)) durchgeführt werden, durch Einsetzen von CDR’s einer nicht-menschlichen Spezies anstelle der entsprechenden Sequenzen eines menschlichen Antikörpers.
[0024] Humanisierte Antikörper haben im Allgemeinen mindestens drei potentielle Vorteile für den Gebrauch in der Behandlung von Menschen. Erstens können sie besser mit dem menschlichen Immunsystem interagieren, z.B. um Zielzellen effizienter zu zerstören durch Komplement-abhängige Zytotoxizität (complement-dependent cytotoxicity, CDC) oder Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC). Zweitens sollte das menschliche Immunsystem den Antikörper nicht als fremd erkennen. Drittens wird die Halbwertszeit im menschlichen Kreislauf ähnlich sein wie bei natürlichen menschlichen Antikörpern, was die Abgabe von kleineren und weniger häufigen Dosen erlaubt.
[0025] WO 93/14220 offenbart monoklonale Antikörper, die an die vierte Immunoglobulin-ähnliche Domäne von VCAM-1 binden und die nur an menschliches VCAM-1 binden. Wie oben beschrieben, bindet der erfindungsgemässe monoklonale Antikörper spezifisch an VCAM-1, das in verschiedenen Zellen exprimiert ist, wie Menschen-, Mäuse- und Schweine-Endothelzellen und auch Skelett-Muskulaturzellen bei Ratten. Ausserdem ist das Epitop des erfindungsgemässen monoklonalen Antikörpers anders als dasjenige des monoklonalen Antikörpers, der in WO 93/14220 offenbart ist.
[0026] Da der erfindungsgemässe monoklonale Antikörper eine starke Affinität für natives VCAM-1 hat, das in verschiedenen Zelltypen, wie Menschen-, Mäuse- oder Schweine-Endothelzellen und Skelett-Muskulaturzellen bei Ratten, exprimiert ist, kann er für irgendeine Anwendung verwendet werden, die eine Antigen-Erkennung mit VCAM-1 benutzt. Ausserdem inhibiert der monoklonale Antikörper wirksam das Binden von Leukozyten an aktivierte Endothelzellen. Deshalb stellt die Erfindung ein Verfahren zur Diagnose und Behandlung von VCAM-1-bedingten Krankheiten bereit.
[0027] Dementsprechend kann der erfindungsgemässe monoklonale Antikörper, der spezifisch sowohl an Menschen- als auch an Mäuse-VCAM-1 bindet, allein oder in Form einer Arzneimittel-Zusammensetzung verabreicht werden für die Diagnose und Behandlung einer VCAM-1-bedingten Krankheit in Kombination mit einem konventionellen Träger.
[0028] Ausserdem kann der erfindungsgemässe monoklonale Antikörper auch in Kombination mit anderen Antikörpern, bioaktiven Reagenzien oder Materialien für verschiedene Zwecke verwendet werden. Zum Beispiel kann der vorliegende monoklonale Antikörper in Kombination mit 4B9 oder anderen anti-VCAM-1 Antikörpern verwendet werden für die Behandlung von Krankheiten, die durch die Expression von VCAM-1 im Endothel charakterisiert sind. Alternativ kann der vorliegende monoklonale Antikörper in Kombination mit anderen Antikörpern verwendet werden, die andere Endothelzellen-Rezeptoren erkennen, die im Falle von Entzündungen identifiziert wurden (z.B. ELAM1, CAM1, etc.), und mit bekannten Medikamenten, die Entzündungskrankheiten oder Krebsarten behandeln.
[0029] In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine variable Region leichter Ketten, umfassend eine leichte Kette CDR1, wie sie durch SEQ ID Nr. 5 definiert ist; eine leichte Kette CDR2, wie sie durch SEQ ID Nr. 6 definiert ist; und eine leichte Kette CDR3, wie sie durch SEQ ID Nr. 7 definiert ist. Vorzugsweise kann die erfindungsgemässe variable Region leichter Ketten eine leichte Kette umfassen, deren Aminosäure-Sequenz durch SEQ ID Nr. 1 oder 13 definiert ist.
[0030] In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine variable Region schwerer Ketten, umfassend eine schwere Kette CDR1, wie sie durch SEQ ID Nr. 8 definiert ist; eine schwere Kette CDR2, wie sie durch SEQ ID Nr. 9 oder SEQ ID Nr. 11 definiert ist; und eine schwere Kette CDR3, wie sie durch SEQ ID Nr. 10 oder SEQ ID Nr. 12 definiert ist. Vorzugsweise kann die erfindungsgemässe variable Region schwerer Ketten eine schwere Kette umfassen, deren Aminosäure-Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe von Aminosäure-Sequenzen, die durch SEQ ID Nr. 2, 3, 4, 14 und 15 definiert sind.
[0031] In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des Antikörpers, der spezifisch sowohl an Menschen- als auch an Mäuse-Gefässzellen-Adhäsionsmolekül-1 (VCAM-1) bindet.
[0032] Der erfindungsgemässe monoklonale Antikörper kann leicht durch wohlbekannt Verfahren zur Herstellung eine monoklonalen Antikörpers hergestellt werden. Zum Beispiel kann das Verfahren das Herstellen eines Hybridoms unter Verwendung von B-Leukozyten, die von immunisierten Tieren erhalten wurden (Koeher und Milsteinm, 1976, Nature, 256:495), oder die Verwendung eines Phagen-Display-Verfahrens beinhalten, und ist nicht darauf limitiert.
[0033] Eine Antikörper-Sammlung, welche die Darstellung von Phagen verwendet ist ein Verfahren zur Expression eines Antikörpers auf der Oberfläche eines Phagen mit Genen des Antikörpers, die direkt von B-Lymphozyten erhalten wurden. Viele der Schwierigkeiten, die mit der Generierung von monoklonalen Antikörpern durch Immortalisierung von B-Zellen verbunden sind, können durch Manipulieren und Expression des Antikörpers in E. coli überwunden werden, unter Verwendung eines Phagen-Display-Verfahrens.
[0034] Ein konventionelles Phagen-Display umfasst:
[0035] 1) Einfügen eines Oligonucleotids mit einer zufälligen Sequenz in die Region, die dem N-Terminus eines Phagenmantel-Proteins pIII (oder pIV) entspricht; 2) Expression eines Fusions-Proteins von einem natürlichen Mantel-Protein und einem Polyprotein, das durch dieses genannte Oligonucleotid mit einer zufälligen Sequenz kodiert ist; 3) Behandeln eines Rezeptor-Materials, das an das Polypeptid binden kann, das durch dieses genannte Oligonucleotid kodiert ist; 4) Eluieren von Peptid-Phagen-Partikeln, die und die Rezeptoren gebunden sind, unter Verwendung eines niedrigen pH’s oder eines Moleküls, das Bindungs-Konkurrenzfähigkeit hat; 5) Amplifizieren des eluierten Phagen durch ein Panning-Verfahren in einer Wirtszelle; 6) Wiederholen der genannten Schritte, um die gewünschte Menge an Phagen zu erhalten; und 7) Bestimmen einer Sequenz eines aktiven Peptids mit den DNA-Sequenzen von Phagen-Klonen, die durch das Panning-Verfahren ausgewählt wurden.
[0036] In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemässen monoklonalen Antikörpers. Dieses Verfahren kann unter Verwendung von Phagen-Display-Techniken durchgeführt werden, umfassend:
<tb>(a)<sep>Immunisieren von rekombinanter menschlicher VCAM-1/Fc-Chimäre in Säugetieren;
<tb>(b)<sep>Bestimmen des Antikörper-Titers der immunisierten Säugetiere;
<tb>(c)<sep>Reinigen von polyklonalen Seren von den immunisierten Säugetieren;
<tb>(d) <sep>Konstruieren einer nicht-menschlichen Säugetier-/menschliche Chimären-Antikörper-Sammlung; und
<tb>(e)<sep>Selektieren von anti-VCAM-1-spezifischem Antikörper aus den Antikörper-Sammlungen.
[0037] Ein Fachmann auf dem Gebiet, zu dem die vorliegende Erfindung gehört, kann die obigen Schritte leicht durchführen mit Bezug auf wohlbekannte Phagen-Display-Techniken, die beispielsweise in Barbas et al. (METHODS: A Companion to Methods in Enzymology 2 : 119, 1991 und J. Virol. 2001, Jul; 75 (14) : 6692-9) und Winter et al. (Ann. Rev. Immunol. 12 : 433, 1994) offenbart sind.
[0038] Im Detail kann ein Verfahren zum (a) Immunisieren von rekombinanter menschlicher VCAM-1/Fc-Chimäre in Säugetieren gemäss irgendeiner auf dem Fachgebiet bekannten Methode durchgeführt werden. Siehe zum Beispiel [Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Mannual, New York: Cold Spring Harber Press (1990)]. Verfahren zum Immunisieren von nicht-menschlichen Tieren wie Mäusen, Ratten, Schafen, Ziegen, Schweinen, Rindern und Pferden sind wohl bekannt auf dem Fachgebiet. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das VCAM/Fc-Antigen mit einem Zusatz verabreicht, der die Immunreaktion stimuliert. Solche Zusätze umfassen vollständigen oder unvollständigen Freund’s Zusatz, RIBI (Muramyl-Dipeptide) oder ISCOM (Immunostimulierende Komplexe).
[0039] (b) Bestimmen des Antikörper-Titers der immunisierten Säugetiere kann gemäss irgendeiner auf dem Fachgebiet bekannten Methode durchgeführt werden, beispielsweise mittels Enzym-gekoppeltem Immunoassay (ELISA) oder Radioimmunoassay (RIA), vorzugsweise ELISA.
[0040] (c) Reinigen von polyklonalen Seren von den immunisierten Säugetieren mittels einer Vielzahl von gängigen Isolations- und Reinigungs-Techniken durchgeführt werden. Solche Isolations- und Reinigungs-Techniken für polyklonale Seren umfassen Affinitäts-Chromatographie mit Protein-A Sepharose, Grössen-Ausschluss-Chromatographie und Ionenaustausch-Chromatographie. Siehe zum Beispiel Coligan auf den Seiten 2.7.1-2.7.12 und 2.9.1-2.9.3. Siehe auch Baines et al., «Purification of Immunoglobulin G (IgG)», in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 10, pages 79–104 (The Humana Press, Inc. 1992).
[0041] (d) Konstruieren einer nicht-menschlichen Säugetier-/menschliche Chimären-Antikörper-Sammlung; und (e) Selektieren von anti-VCAM-1 spezifischem Antikörper aus den Antikörper-Sammlungen kann leicht durchgeführt werden gemäss der oben beschriebenen konventionellen Phagen-Display-Technik. Ein Phage, der für das Konstruieren einer Antikörper-Sammlung verwendet werden kann, kann ein faserartiger Phage sein, zum Beispiel fd, M13, f1, If1, Ike, Zj/Z, Ff, Xf, Pf1 und Pf3. Ausserdem kann ein Vektor, der für die Expression eines heterogenen Gens auf der Oberfläche des faserartigen Phagen verwendet werden kann, ein Phagen-Vektor sein, beispielsweise fUSE5, fAFF, fd-CAT1 und fdtetDOG; oder ein Phagemid-Vektor, zum Beispiel pHENl, pComb3, pComb8 und pSEX. Vorzugsweise kann eine pComb3X Phagemid-Vektor verwendet werden.
[0042] Ausserdem kann ein Hilfs-Phage, der zum Bereitstellen eines natürlichen Mantelproteins, das für eine erfolgreiche Reinfektion eines rekombinanten Phagen nötig sein kann, zum Beispiel M13K07 oder VSCM13 sein, vorzugsweise VSCM13.
[0043] In einem bevorzugten Beispiel haben wir zunächst rekombinante menschliche VCAM-1/Fc-Chimäre in Hasen immunisiert, um rekombinante Antikörper zu generieren, die doppel-spezifisch für Menschen- und Mäuse-VCAM-1 sind. Ein Enzym-Immunoassay von Hasen-Seren, die während der Immunisierungs-Abläufe gesammelt wurden, zeigte, dass alle Hasen erhöhte Antikörper-Titer gegenüber dem Antigen hatten (Daten nicht gezeigt). Nach der fünften Antreiber-Injektion wurde die gesamte DNA isoliert aus Milz und Knochenmark der immunisierten Hasen und eine cDNA-Synthese unterzogen. Unter Verwendung von drei PCR-Schritten wurde eine Hasen/Menschen-Chimären Antikörper-Sammlung generiert und in einen Phagemid-Vektor pComb3X geklont, was einen Umfang von 5.7 × 109 unabhängigen Transformanten lieferte.
[0044] Nach sechs Runden von Bio-Panning auf immobilisiertem Mäuse-VCAM-1 wurden 20 Klone zufällig ausgewählt, gerettet durch Infizieren eines Hilfs-Phagen und auf ihre Reaktivität gegenüber Menschen- und Mäuse-VCAM-1 getestet in einem Phagen-Enzym-Immunoassay. Drei der zwanzig gewählten Klone zeigten eine starke Aktivität gegenüber sowohl Menschen- als auch Mäuse-VCAM-1. Diese drei einzelnen Klone wurden im Anschluss durch DNA-Sequenzierung analysiert. Drei Klone haben ziemlich ähnliche Nucleotid-Sequenzen und die Sequenz ist in Fig. 2 gezeigt.
[0045] Um die Immunogenität von anti-VCAM-1 chimärem Fab im Menschen zu verhindern, haben wir auch versucht, humanisierten Antikörper herzustellen durch Einpflanzen von sechs Komplementaritäts-bestimmenden Regionen (CDR’s) von anti-VCAM-1 Fab in den Rahmen von verschiedenen Regionen von bekannten therapeutischen humanisierten Antikörpern. Die ausgeführten Sequenzen sind in Fig. 2 beschrieben.
[0046] Schliesslich wurden 0.3 mg anti-VCAM-1 spezifischem Fab erhalten aus 1 l einer geschüttelten Kultur, die überexprimiert wurde mit E. coli und gereinigt mit einer anti-HA Affinitäts-Säulenchromatographie, gefolgt von Charakterisierung der biochemischen und funktionellen Eigenschaften des ausgewählten anti-VCAM-1 spezifischem Fab. Seine Reinheit wurde durch SDS-PAGE und Anfärben mit Coomassie Blue bestätigt (Fig. 1A). Enzym-Immunoassay-Experimente haben gezeigt, dass der gereinigte Antikörper spezifisch an Menschen- und Mäuse-VCAM-1 band. Praeimmunes Serum und immunes Serum wurden als negative und positive Kontrolle verwendet im Experimentenset (Fig. 1B). Ausserdem wurden, um die Spezifität des Antikörpers für sowohl Menschen- als auch Mäuse-VCAM-1 zu bestätigen, gereinigte rekombinante Menschen- und Mäuse VCAM-1/Fc Chimären einer Western-Blot-Analyse unterzogen mit dem gereinigten anti-VCAM-1 Fab. Das Resultat zeigte, dass das gereinigte anti-VCAM-1 Fab erfolgreich mit sowohl Menschen- als auch Mäuse-VCAM-1/Fc Chimären reagierte (Fig. 1C). Diese Ergebnisse lieferten klare Beweise, dass das VCAM-1 Fab Spezifität für sowohl Menschen- als auch Mäuse-VCAM-1 hat.
[0047] Um seine Reaktivität gegenüber nativem VCAM-1 zu untersuchen, wurde VCAM-1 spezifisches Fab anschliessend mittels Durchflusscytometrie analysiert. Es wurde gefunden, dass das ausgewählte Fab an VCAM-1 bindet, das in hTNFα-stimulierten HUVEC’s, in H2O2-aktivierten Schweine- und Mäuse-Endothelzellen exprimiert ist. Es wurde auch gezeigt, dass dieses Fab mit VCAM-1 reagiert, das basal in Ratten-Skelett-Muskulaturzellen exprimiert ist (Fig. 3). Weil die Interaktion zwischen Leukozyten und aktivierten Endothelzellen durch VCAM-1 vermittelt wird, haben wir als Nächstes untersucht, ob das ausgewählte Fab diese Interaktion inhibieren kann. Zu diesem Zweck haben wir einen Adhäsions-Assay mit CFSE-markierten U937 menschlichen promonozytischen Leukozyten und Menschen-, Mäuse und Schweine-Endothelzellen untersucht, die mit hTNFα oder H2O2stimuliert wurden nach Inkubation mit dem ausgewählten Fab. Das erhaltene Resultat zeigte eine wirksame Inhibition der Interaktion zwischen menschlichem Monozyten und drei Typen von aktivierten Endothelzellen (Fig. 4).
[0048] In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung zur Diagnose einer Krankheit, die mit der Expression von VCAM-1 verbunden ist, oder einer VCAM-1-vermittelten Krankheit, wobei die Zusammensetzung den monoklonalen Antikörper umfasst, der spezifisch an sowohl Menschen- als auch Mäuse Gefässzellen-Adhäsionsmolekül-1 bindet, und ein Verfahren zur Diagnose dieser Krankheit, das dieselbe verwendet.
[0049] Beispielsweise kann VCAM-1 detektiert werden, indem ein erfindungsgemässer Antikörper mit einer biologischen Probe zur Reaktion gebracht wird und die Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes gemessen wird.
[0050] Die «biologische Probe», wie hier verwendet, kann ein Gewebe, eine Zelle, Vollblut, Serum, Plasmaflüssigkeit, autoptische Gewebeproben (Hirn, Haut, Lymphknoten, Rückenmark), Überstand eines Zellkultur-, eines gespaltenen eukaryotischen Zell- und eines Bakterien-Expressionssystems sein, was nicht hierauf beschränkt ist. Das Vorhandensein von VCAM-1, einer Entzündungskrankheit oder von Krebs kann detektiert werden, indem eine manipulierte oder nicht manipulierte biologische Probe mit dem erfindungsgemässen monoklonalen Antikörper zur Reaktion gebracht wird.
[0051] Der «Antigen-Antikörper-Komplex», wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Kombinationsmaterial von VCAM-1 Antigen in der Probe und dem erfindungsgemässen monoklonalen Antikörper. Bildung eines solchen Antigen-Antikörper-Komplexes kann durch ein Verfahren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem kolorimetrischen Verfahren, einem elektrochemischen Verfahren, einem fluorimetrischen Verfahren, Luminometrie, einem Teilchenzähl-Verfahren, einer visuellen Abschätzung und einem Szintillationszähl-Verfahren, detektiert werden. Jedoch ist das Verfahren nicht auf die obigen Beispiele limitiert und hat eine Vielzahl von Anwendungen.
[0052] Verschiedene Markierungen (labels) können für die Detektion eines Antigen-Antikörper-Komplexes in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
[0053] Nicht beschränkende Beispiele für die Markierung, die eine quantitative oder qualitative Bestimmung der Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes erlauben, umfassen Enzyme, fluoreszente Substanzen, Liganden, lumineszente Substanzen, Mikropartikel, Redox-Moleküle und radioaktive Isotope.
[0054] Geeignete Beispiele von Materialien, die als Markierung verwendet werden können, umfassen Acetylcholin-Esterase, alkalische Phosphatase, β-D-Galactosidase, Meerrettich-Peroxidase und β-Lactamase als ein Enzym; Fluorescein, Eu<3+>, Eu<3+>-Chelat und -Kryptat als Fluoreszens; Biotin-Derivate als Ligand; Acridinester, Isoluminol-Derivate als Lumineszens; kollodes Gold, gefärbtes Latex als Mikropartikel; und <57>Co, <3>H, <125>I, I-Bonton Hunter Reagens als radioaktive Isotope.
[0055] Vorzugsweise kann der Antigen-Antikörper-Komplex mittels ELISA detektiert werden. ELISA-Techniken umfassen einen direkten ELISA unter Verwendung eines markierten Antikörpers, der ein Antigen erkennt, das mit einem Stützkörper verbunden ist; einen indirekten ELISA unter Verwendung eines markierten Sekundär-Antikörpers, der den gefangenen Antikörper eines Antigen-Antikörper-Komplexes erkennt, wobei das Antigen mit einem Stützkörper verbunden ist; einen direkten Sandwich-ELISA unter Verwendung eines weiteren markierten Antikörpers, der ein Antigen eines Antigen-Antikörper-Komplexes erkennt; und einen indirekten Sandwich-ELISA unter Verwendung eines weiteren markierten Sekundär-Antikörpers, der ein gefangenes Antigen eines Antigen-Antikörper-Komplexes erkennt. Der monoklonale Antikörper kann ein detektierbares Label haben, andernfalls kann der Antigen-Antikörper-Komplex detektiert werden, indem ein weiterer Antikörper, der den erfindungsgemässen monoklonalen Antikörper fangen kann und ein detektierbares Label hat, behandelt wird.
[0056] In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung zur Behandlung einer Krankheit, die mit der Expression von VCAM-1 verbunden ist, oder einer VCAM-1-vermittelten Krankheit, wobei eine Zusammensetzung den monoklonalen Antikörper umfasst, der spezifisch sowohl an Menschen- als auch an Mäuse-Gefässzellen-Adhäsionsmolekül-1 bindet, und einen pharmazeutisch akzeptierten Träger oder Hilfsstoff, und ein Verfahren zur Behandlung dieser Krankheit, das dieselbe verwendet. Vorzugsweise ist die Krankheit eine Entzündungskrankheit oder eine Krebsart.
[0057] Die vorliegende Zusammensetzung kann in einer Einzeldosis oder in mehreren Dosen verabreicht werden in einer Menge, die ausreicht, um die Krankheit zu behandeln. Die erfindungsgemässe Zusammensetzung kann in nicht limitierender Form von Lösungen, Puder, Aerosolen, Kapseln, magensaftresistenten Tabletten oder Kapseln oder Zäpfchen verabreicht werden. Eine Vielzahl von Verabreichungsarten kommen in Betracht, einschliesslich intraperitoneal, intravenös, intramuskulär, subkutan, intradermal, oral, topisch, intranasal, intrapulmonal und intrarectal, aber die vorliegende Erfindung ist nicht limitiert auf diese beispielhaft gezeigten Verabreichungsarten. Jedoch sollten, da Peptide bei oraler Verabreichung verdaut werden, aktive Ingredienzien einer Zusammensetzung für orale Verabreichung beschichtet oder formuliert sein für den Schutz gegen Degradation im Magen. Ausserdem kann die erfindungsgemässe Arzneimittel-Zusammensetzung mittels einer bestimmten Vorrichtung verabreicht werden, die in der Lage ist, die aktiven Ingredienzien in eine Zielzelle zu transportieren.
[0058] Die vorliegende Zusammensetzung kann in «einer pharmazeutisch wirksamen Menge verabreicht werden, die für die Behandlung der Krankheit genügt. Die «pharmazeutisch wirksame Menge» bezieht sich auf eine Menge, die ausreicht, um einer Krankheit vorzubeugen und/oder sie zu behandeln mit einem angemessenen Verhältnis Vorteil/Risiko, die anwendbar ist bei medizinischer Behandlung oder Vorbeugung.
[0059] Das effektive Dosierungsniveau kann variieren aufgrund einer Vielzahl von Faktoren, einschliesslich Eigenschaften und Ernsthaftigkeit der Krankheit, Wirksamkeit des Arzneimittels, Alter des Patienten, Gewicht, Gesundheitszustand, Geschlecht und Empfindlichkeit für das Arzneimittel, Zeitpunkt der Verabreichung der erfindungsgemässen Zusammensetzung, Verabreichungsarten und -routen, Ausscheidungsrate der Zusammensetzung, Dauer der Behandlung, Medikament in Kombination mit der erfindungsgemässen Zusammensetzung oder gleichzeitig verabreicht und die anderen Faktoren, und kann durch einen Spezialisten auf diesem Fachgebiet leicht bestimmt werden. Die vorliegende Zusammensetzung kann entweder gleichzeitig oder aufeinanderfolgend mit pharmazeutischen oder physiologischen Bestandteilen verabreicht werden, und kann auch in Kombination mit konventionellen Wirkstoffen auf sequenzielle oder simultane Art verabreicht werden.
[0060] Im Fall, dass die erfindungsgemässe Zusammensetzung in einer pharmazeutisch wirksamen Menge verabreicht wird, bindet der erfindungsgemässe Antikörper, der eine starke Affinität für VCAM-1 hat, spezifisch an VCAM-1, das auf einer Endothelzelle exprimiert ist, und führt zu einer Neutralisierung von VCAM-1. Letztendlich inhibiert der erfindungsgemässe monoklonale Antikörper die Adhäsion eines Leukozyten an die Endothelzelle und behandelt eine VCAM-1-vermittelte Krankheit. Vorzugsweise ist die VCAM-1-vermittelte Krankheit eine Entzündungskrankheit oder eine Krebsart, und besonders bevorzugt ist die Entzündungskrankheit ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus Arthritis, Multipler Sklerose, entzündliche Magenerkrankung (bowl disease), Asthma, Arteriosklerose, Herzinfarkt, Abstossung eines Transplantats und Schlaganfall.
[0061] Alle der hier zitierten Referenzen werden durch Referenz in ihrer Gesamtheit eingeschlossen. Ausserdem werden Fachmänner auf dem Gebiet viele Äquivalente zu den spezifischen Ausführungsformen der Erfindung, die hier spezifisch beschrieben sind, erkennen oder mittels reiner Routine-Experimentation bestimmen können. Es ist beabsichtigt, dass solche Äquivalente im Geltungsbereich der Ansprüche eingeschlossen sind.
[0062] Ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung kann durch die nachfolgenden Beispiele erhalten werden, welche dargelegt sind, um zu illustrieren, aber die nicht derart ausgelegt werden sollen, um die vorliegende Erfindung zu limitieren.
Art und Weise der Erfindung
Beispiele
1. Materialien
[0063] Rekombinante Menschen- und Mäuse-VCAM-1/Fc Chimären wurden bei R&D Systems (Minneapolis, MN) gekauft. Das Expand High Fidelity PCR System und HRP-konjugierte anti-Influenza A Viren Hemagglutinin (HA) Antikörper (3 F10) kamen von Roche (Mannheim, Deutschland). TMB-Lösung kam von Pierce (Rockford, IL). 5,6-Carboxy-Fluorescein-Succinimid-Ester (CSFE) und Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-markierte Ziegen- und Hasen-Sekundär-Antikörper wurden von Molecular Probes erhalten. Verbesserte Chemilumineszenz und HRP-konjugierter anti-Hasen IgG-Antikörper wurden bei Amersham Biosciences (Uppsala, Schweden) gekauft. Aprotinin, Leupeptin, Paraformaldehyd, menschliches TNFα (hTNFα) und Wasserstoffperoxid kamen von Sigma. Menschliche Nabel-Adern Endothelzellen (HUVEC’s) und EGM-2-«Bullet-Kit» waren von Cambrex. Ziegen anti-Menschen-Fab polyklonale Antikörper waren von Bethyl Laboratories (Montgomery, TX). Penicillin/Streptomycin, fötales Rinderserum, RPMA, Superscript Preamplification System und Dulbecco’s modifiziertes Eagle’s minimales Essentialmedium wurden bei Life Technologies (Gaithersburg, MD) gekauft. Schweine-Aorten-Endothelzelllinien (PAEC’s) wurden netterweise von Dr. Curie Ahn (Seoul National University, Seoul, Südkorea) zur Verfügung gestellt. SV40 transformierte Mäuse-Endothel Lagerhans’sche Inseln-Zelllinien MS-1 (MILE SEVEN 1) kam von Dr. Pann-Ghill Suh (POSTECH, Pohang, Südkorea). L6 Ratten-Skelettmuskulatur-Zellen waren von Dr. Sang Chul Park (Seoul National University, Seoul, Südkorea).
2. Zellkulturen
[0064] Die PAEC’s, MEC’s und L6 Muskelzellen wurden in Dulbecco’s modifiziertem Eagle’s Medium unterhalten, das mit 10% (v/v) fötalem Rinderserum respektive 1% (v/v) Penicillin/Streptomycin ergänzt war. HUVEC’s wurden in EGM-2 unterhalten gemäss den Anweisungen des Herstellers. U937 menschliche promonozytische Leukozyten-Zelllinien wurden in RPMI kultiviert, das mit 10% (v/v) fötalem Rinderserum und 1% (v/v) Penicillin/Streptomycin ergänzt war. Alle Zellen wurden bei 37 °C in einem befeuchteten, CO2-kontrollierten (5%) Inkubator kultiviert.
3. Immunisierung von menschlichen VCAM-1/Fc Chimären
[0065] 2.5 µg rekombinante Menschen- und Mäuse-VCAM-l/Fc Chimären wurden vermischt in 2 ml PBS, emulgiert mit einem MPL+TDM+CWS-Hilfsstoff, der bei 37 °C während 30 Minuten prae-inkubiert wurde, und dann in Neuseeland weissen Hasen injiziert. Der Antikörper-Titer der immunisierten Hasen wurde mittels Enzym-verbundem Immunosorbent-Assay (ELISA) bestimmt unter Verwendung von HRP-konjugierten anti-Hasen IgG-Antikörpern als Sekundär-Antikörper. Nach fünf Antreiber-Injektionen mit einem 3-Wochen-Intervall zwischen den Injektionen wurde polyklonales Serum von immunisierten Hasen mit Protein A Sepharose-Kügelchen gereinigt.
4. Konstruktion einer Hasen/Menschen-Chimären Antikörper Bibliothek
[0066] Das Protokoll wurde mit einer kleinen Modifikation durch Barbas et al., 2001, durchgeführt. In Kürze wurde ein erster cDNA-Strang synthetisiert von der gesamten DNA aus Milz und Knochenmark von mit rekombinanten Menschen- und Mäuse-VCAM-l/Fc Chimären immunisierten Hasen unter Verwendung des SUPERSCRIPT Preamplification Systems mit oligo(dT) Grundierung. Um eine VCAM-1 Fab Bibliothek zu konstruieren, wurde PCR mit drei PCR-Schritten durchgeführt. Mit der ersten PCR-Runde wurden Hasen-VL und -VH amplifiziert aus Hasen-cDNA und Menschen-CL und –CH1 aus einem pComb3X-Expressionsvektoren, der menschliches Fab enthielt. Dann, mit der zweiten PCR-Runde, wurde eine Hasen/Menschen-Chimären leichte Kette und eine schwere Kette generiert durch Kombinieren von Hasen-VL mit Menschen-CL, respektive Hasen-VH mit Menschen-CH1unter Verwendung von Überlappungs-Extensions-PCR. In der dritten PCR-Runde wurden die Chimären leichte Ketten Produkte und schwere Ketten Produkte verbunden mittels Überlappungs-Extensions-PCR. Die resultierende, Fab-kodierende Bibliothek wurde mit Sfi I (Roche, Indianapolis, IN) verdaut, an einen Phagemid-Vektoren pComb3X angebunden und in E. coli-Stamm ER2738 Zellen (New England Biolabs) transformiert, die in SB-Medium kultiviert wurden, das 10 µg/ml Tetrazyklin enthielt. Die Kulturen wurden dann während 1 h in einem 37 °C-Schüttler inkubiert nach der Zugabe von 30 µg/ml Carbenicillin. VCSM13 Hilfs-Phage (> 1 × 10<12> pfu/ml) und 70 µg/ml Kanamycin wurden zu den Kulturen zugegeben und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Nach Zentrifugieren bei 5000 rpm während 15 min wurde der gesammelte Überstand mit 8 g Polyethylenglycol-8000 (PEG-8000) und 6 g NaCl auf Eis während 30 min inkubiert und dann bei 9000 rpm während 20 min zentrifugiert. Der Phagen-Pressling wurde in Tris-gepufferter Salzlösung (TBS) wieder suspendiert, die 3% (w/v) BSA und 0,02% NaN3enthielt.
5. Auswahl von anti-VCAM-1 spezifischen Antikörpern aus den Antikörper-Bibliotheken
[0067] Insgesamt wurden sechs Panning-Runden durchgeführt. Nachdem 2.5 µg rekombinante Mäuse-VCAM-1/Fc-Chimären über Nacht bei 4 °C auf einer Mikrotiterplatte aufgetragen wurden, wurde TBS, das 5% (w/v) BSA enthielt, während 2 h bei 37 °C inkubiert, um nicht-spezifisches Binden zu verhindern, und dann wurden 50 µl rekombinanter Phagen in TBS, das 3% (v/v) BSA enthielt, während 2 h bei 37 °C inkubiert. Nicht-spezifische Phagen wurden durch Waschen mit TBS entfernt, das 0.1% (v/v) Tween 20 enthielt. Bindende Phagen wurden mit 0.1 M Glycin/HCl mit pH 2.2 eluiert und neutralisiert mit 1 M Tris-HCl mit pH 9.1. Das Eluat wurde dazu verwendet, logarithmisch wachsendes ER2738 zu transfizieren, und das ER2738, das die Phagemid-Bibliothek beherbergte, wurde gezüchtet durch die Rettung des Phagemids mit Hilfs-Phagen VCSM13 für Amplifizierung über Nacht. Phagen-Präparationen wurden gereinigt und konzentriert durch Zugabe von PEG und NaCl, wie oben beschrieben. Dieses gesamte Auswahlverfahren wurde 6 Mal wiederholt und die Reinigungsschritte wurde von 1 Mal in der ersten Runde auf 3 Mal in der zweiten, dritten und vierten Runde, 6 Mal in der fünften Runde und 10 Mal in der sechsten Runde erhöht.
6. Überexpression und Reinigung von anti-VCAM-1 Fab
[0068] 0.5 µg Phagemid-DNA wurde in HB2151 E. coli transformiert und die Zellen wurden in LB-Medium, das 50 mg/ml Carbenicillin enthielt, bei konstantem Schütteln bei 37 °C gezüchtet. Wenn die optische Dichte bei 600 nm 0.6 erreichte, wurden die Zellen über Nacht bei 30 °C gezüchtet. Nach einem Zentrifugieren bei 15 000 × g während 30 min, wurden die gesammelten Überstände mit Labscale TFF System (Milipore, Bedford, MA) konzentriert und dann mit anti-Hemagglutin (HA) Antikörper-konjugierter Protein A Sepharose inkubiert. Nach dem Waschen mit einem 50 mM Natrium enthaltenden Puffer mit pH 8.2, wurde das Fab mit 0.1 M Glycin mit pH 2.2 eluiert und die Fraktion wurde sofort mit 1 M Tris mit pH 9.2 neutralisiert, um physiologischen pH zu erhalten. Nach einer Dialyse in PBS über Nacht bei 4 °C wurde die Konzentration der Proben berechnet durch Messen der optischen Dichte bei 280 nm. Die Reinheit des Fab’s wurde mittels Coomassie Brilliant Anfärben bestimmt.
7. Immunoblot-Analyse
[0069] Nach einem Untersuch mittels Bradford-Lösung wurden Proteine denaturiert durch Kochen während 5 min bei 95 °C in einem Laemmli Proben-Puffer, getrennt durch SDSPAGE und auf Nitrozellulose-Membranen transferiert mittels Elektroblotting unter Verwendung des Nasstransfer-Systems (Amersham Biosciences). Nach dem Blockieren in TTBS-Puffer (10 mM Tris/HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl und 0.05% Tween 20), der 5% (w/v) Magermilchpulver enthielt, wurden die Membranen mit individuellen monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern inkubiert, was anschliessend gefolgt war durch eine weitere Inkubation mit anti-Mäuse- oder anti-Hasen-Immunoglobulin G, wie nötig, verbunden mit Meerrettich-Peroxidase. Die Detektion wurde mittels eines erhöhter Chemiluminszenz-Kits durchgeführt gemäss den Anleitungen des Herstellers. Zur weiteren Prüfung mit einem ersten Antikörper wurden die Membranen in einem Stripping-Puffer (62.5 mM Tris-HCl, pH 6.0, 100 mM 2-Mercaptoethanol [2-ME] und 2% SDS) während 30 Minuten bei 50 °C inkubiert, gewaschen, und dann für die weitere Untersuchung verwendet.
8. Enzym-verbundener Immunosorbent-Assay (ELISA)
[0070] Rekombinante Menschen- und Mäuse-VCAM-l/Fc-Chimären, die in PBS in einer Konzentration von 2 µg/ml gelöst waren, wurden in den Vertiefungen (wells) der Mikrotiter-Platten über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach kurzem Waschen mit PBS wurde die Platte mit 3% (W/v) BSA in PBS blockiertem inkubiert mit dem Polyserum (1:2000) während 1 h bei 37 °C und mehr als drei Mal mit PBS gewaschen, das 0.05% Tween enthielt. Die Menge an Fab, das an die Platte gebunden war, wurde durch die Anwendung von Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem anti-HA mAb 3F10 (Roche) detektiert. Die optische Dichte wurde, nach einer Inkubation mit ABTS-Substrat-Lösung (2,2 ́-Azino-bis-13-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure, MP Biomedicals, Inc) während 30 min bei 37 °C, bei 405 nm mit einem Mikrotiterplatten-Leser (Labsystems, Barcelona, Spanien) gemessen. Für Konkurrenz-ELISA wurden VCAM-1-Peptide auf einer Mikrotiter-Platte während 1 h bei 37 °C inkubiert nach Beschichtung mit Antigen. Die nächsten Verfahren waren ähnlich wie oben beschrieben.
9. Behandlung von H2O2 und hTNFα in Menschen-, Mäuse- und Schweine-Endothelzellen
[0071] Für PAEC’s und MEC’s wurden 400 µM H2O2während 24 h behandelt, um maximale VCAM-1-Expression in den Zellen zu bestimmen. Für HUVEC’s wurden 20 ng/ml hTNFα während 24 h behandelt.
10. Durchfluss-Zytometrie
[0072] Alle Zellen wurden in einer Dichte von 3 × 10<5> Zellen/Vertiefung in 60 mm Schalen aufgetragen und mit H2O2respektive hTNFα behandelt, und dann wurden die Zellen trypsiniert. Nach kurzem Zentrifugieren bei 1500 rpm für 5 min wurden die Pellets mit 1 × PBS und mit blockierendem Puffer, der 1% (w/v) BSA in 1 × PBS enthielt, gewaschen, und 50 µl anti-VCAM-1 spezifisches Fab in einem blockierenden Puffer, der auf 50 µg/ml Endkonzentration abgestimmt war, wurde mit den Zellen bei 37 °C für 50 min inkubiert. Nach Zentrifugieren bei 2000 rpm während 5 min wurden die Zellen mit 140 µl blockierendem Puffer gewaschen und/oder FITC-markierter anti-Menschen-Fab Antikörper (1:100) wurde bei 37 °C während 30 min inkubiert. Nach kurzem Zentrifugieren wurden die Pellets mit 140 µl blockierendem Puffer gewaschen und dann wurden die endgültigen Pellets wieder in 300 µl 2% Paraformaldehyd in PBS suspendiert. Die VCAM-1-Expression wurde mittels Durchfluss-Zytometrie analysiert (Beckmann Coulter, CA, USA).
11. CFSE-Markierung
[0073] Nach der Ernte der U937 Zellen wurden die Zellen zweimal mit HBSS gewaschen. Die gewaschenen Zellen (1 × 10<7> Zellen) wurden mit CFSE-Lösung in DMSO inkubiert, um die Endkonzentration auf 2.5 µM CFSE auf Eis zu bringen im Dunkeln während 5 min. Um den Markierungs-Prozess zu stoppen, wurde 1/10 Volumen an fötalem Rinderserum zugegeben und vorsichtig gemischt während 1 min. Nach dem kurzen Zentrifugieren wurden die Zellen wieder suspendiert und vor dem Gebrauch gezählt.
12. Zelladhäsions- und Neutralisierungs-Assay
[0074] Leukozytenadhäsions-Assays wurden mit einer kleinen Änderung durchgeführt. Kurz gesagt, wurden 3 × 10<5> Zellen von Endothelzellen, die auf 60 mm Schalen aufgetragen waren, wie angegeben mit H2O2 oder hTNFα stimuliert, und dann wurden die Zellen einmal mit 1 × PBS gewaschen. Nach der CFSE-Markierung mit U937 promonozytischen Leukozyten wurden die markierten Zellen wie beschrieben mit H2O2- oder hTNFα-stimulierten Endothelzellen während 1 h bei 37 °C inkubiert und dann wurden die ungebundenen Zellen 5 Mal mit 1 × PBS gewaschen, das 0.2 mM CaCl2und 0.1 mM MgCl2 enthielt. Die Endzellen wurden trypsiniert und dann einer FACS-Analyse unterzogen. Für den Neutralisierungs-Assay wurden Endothelzellen, die während 1 Tag mit H2O2 oder hTNFα stimuliert worden waren, mit anti-VCAM-1 polyklonalen Antikörpern oder anti-VCAM-1 Fab wie angegeben inkubiert während 1 h bei 37 °C, bevor CFSE-markierte U937 zugegeben wurden. Die nachfolgenden Verfahren sind gleich wie die obigen Verfahren.
Industrielle Anwendbarkeit
[0075] Gemäss unserem Wissen ist der erfindungsgemässe monoklonale Antikörper der erste rekombinante monoklonale Antikörper, der spezifisch ist für Menschen- und Mäuse-VCAM-1. Ausserdem zeigt der erfindungsgemässe monoklonale Antikörper ein starke Affinität für VCAM-1, das in Ratten-Skelettmuskulatur- und in Schweine-Endothel-Zellen, ebenso wie in Menschen- und Mäuse-Endothelzellen exprimiert ist, und man hat gefunden, dass er die Interaktion zwischen Leukozyten und aktivierten Endothelzellen stark inhibiert. Folglich kann der monoklonale Antikörper die VCAM-1-vermittelte Leukozyten-Adhäsion an Endothelzellen wirksam inhibieren. Dementsprechend kann der erfindungsgemässe monoklonale Antikörper eine VCAM-1-vermittelte Adhäsion von Leukozyten an Endothelzellen inhibieren und eine VCAM-1-vermittelte Krankheit wirksam behandeln, insbesondere eine Entzündungskrankheit oder eine Krebsart.
Sequenzliste
[0076]
<tb><110><sep>HANWHA CHEMICAL COROPORATION
<tb><120><sep>VCMA-1 spezifischer monoklonaler Antikörper
<tb><150><sep>US 60/803,521
<tb><151><sep>2006-05-31
<tb><160><sep>15
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Claims (17)
1. Ein monoklonaler Antikörper, der spezifisch sowohl an Menschen- als auch an Mäuse-Gefässzellen-Adhäsionsmolekül-1 (vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1) bindet.
2. Der monoklonale Antikörper gemäss Anspruch 1, der weiter spezifisch an Menschen-, Mäuse-, Ratten- und Schweine-VCAM-1 bindet, das in verschiedenen Zelltypen, einschliesslich Endothelzellen oder Skelett-Muskulaturzellen exprimiert wird.
3. Der monoklonale Antikörper gemäss Anspruch 1, der die Interaktion zwischen Leukozyten und aktivierten Endothelzellen inhibiert.
4. Der monoklonale Antikörper gemäss Anspruch 1, wobei der monoklonale Antikörper ein rekombinanter monoklonaler Antikörper ist.
5. Der monoklonale Antikörper gemäss Anspruch 4, umfassend eine variable Region leichter Ketten, die eine leichte Kette CDR1, wie sie durch SEQ ID Nr. 5 definiert ist; eine leichte Kette CDR2, wie sie durch SEQ ID Nr. 6 definiert ist; und eine leichte Kette CDR3, wie sie durch SEQ ID Nr. 7 definiert ist, umfasst.
6. Der monoklonale Antikörper gemäss Anspruch 5, umfassend eine leichte Kette, deren Aminosäure-Sequenz durch SEQ ID Nr. 1 definiert ist.
7. Der monoklonale Antikörper gemäss einem der Ansprüche 4 bis 6, umfassend eine variable Region schwerer Ketten, die eine schwere Kette CDR1, wie sie durch SEQ ID Nr. 8 definiert ist; eine schwere Kette CDR2, wie sie durch SEQ ID Nr. 9 oder SEQ ID Nr. 11 definiert ist; und eine schwere Kette CDR3, wie sie durch SEQ ID Nr. 10 oder SEQ ID Nr. 12 definiert ist, umfasst.
8. Der monoklonale Antikörper gemäss Anspruch 7, umfassend eine schwere Kette, deren Aminosäure-Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe von Aminosäure-Sequenzen, die durch SEQ ID Nr. 2, 3 und 4 definiert sind.
9. Der monoklonale Antikörper gemäss Anspruch 4, wobei der monoklonale Antikörper humanisiert ist.
10. Der monoklonale Antikörper gemäss Anspruch 9, umfassend eine leichte Kette, deren Aminosäure-Sequenz durch SEQ ID Nr. 13 definiert ist und/oder eine schwere Ketten-Aminosäure-Sequenz definiert durch SEQ ID Nr. 14 oder 15.
11. Ein Verfahren zur Herstellung des Antikörpers gemäss Anspruch 1, umfassend:
(a) Immunisieren von rekombinanter menschlicher VCAM-1/Fc-Chimäre in Säugetieren;
(b) Bestimmen des Antikörper-Titers der immunisierten Säugetiere;
(c) Reinigen von polyklonalen Seren von den immunisierten Säugetieren;
(d) Konstruieren einer nicht-menschlichen Säugetier-/menschliche Chimären-Antikörper-Sammlung; und
(e) Selektieren von anti-VCAM-1 spezifischem Antikörper aus den Antikörper-Sammlungen.
12. Verwendung einer Arzneimittel-Zusammensetzung zur Herstellung eines Diagnostikums zum Diagnostizieren einer VCAM-1-vermittelten Krankheit, umfassend den monoklonalen Antikörper gemäss irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
13. Verwendung einer Arzneimittel-Zusammensetzung zur Herstellung eines Diagnostikums zum Diagnostizieren einer VCAM-1-vermittelten Krankheit, wobei die VCAM-1-vermittelte Krankheit eine Entzündungskrankheit oder eine Krebsart ist, umfassend den monoklonalen Antikörper gemäss irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
14. Verwendung einer Arzneimittel-Zusammensetzung zur Herstellung eines Diagnostikums zum Diagnostizieren einer VCAM-1-vermittelten Krankheit, wobei die VCAM-1-vermittelte Krankheit eine Entzündungskrankheit ist, ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus Arthritis, Multipler Sklerose, entzündlicher Magenerkrankung (bowl disease), Asthma, Arteriosklerose, Herzinfarkt, Abstossung eines Transplantats und Schlaganfall, umfassend den monoklonalen Antikörper gemäss irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
15. Verwendung einer Arzneimittel-Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer VCAM-1-vermittelten Krankheit, umfassend den monoklonalen Antikörper gemäss irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
16. Verwendung einer Arzneimittel-Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer VDAM-1-vermittelten Krankheit, wobei die VCAM-1-vermittelte Krankheit eine Entzündungskrankheit oder eine Krebsart ist, umfassend den monoklonalen Antikörper gemäss irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10 und einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
17. Verwendung einer Arzneimittel-Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer VCAM-1-vermittelten Krankheit, wobei die VCAM-1-vermittelte Krankheit eine Entzündungskrankheit ist, ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus Arthritis, Multipler Sklerose, entzündlicher Magenerkrankung (bowl disease), Asthma, Arteriosklerose, Herzinfarkt, Abstossung eines Transplantats und Schlaganfall, umfassen den monoklonalen Antikörper gemäss irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
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| EP2085407A1 (de) * | 2008-02-04 | 2009-08-05 | Sahltech I Göteborg AB | Behandlung von idiopathischer thrombozytopenischer Purpura |
| WO2010053316A2 (en) * | 2008-11-06 | 2010-05-14 | Snu R&Db Foundation | New use of sixth immunoglobulin-like domain of vcam-1 |
| KR20110112307A (ko) * | 2008-11-25 | 2011-10-12 | 앨더 바이오파마슈티컬즈, 인코포레이티드 | 알부민을 상승시키고 및／또는 ｃｒｐ를 낮추는 ｉｌ６의 길항제 |
| US8337847B2 (en) | 2008-11-25 | 2012-12-25 | Alderbio Holdings Llc | Methods of treating anemia using anti-IL-6 antibodies |
| US8992920B2 (en) | 2008-11-25 | 2015-03-31 | Alderbio Holdings Llc | Anti-IL-6 antibodies for the treatment of arthritis |
| US9452227B2 (en) | 2008-11-25 | 2016-09-27 | Alderbio Holdings Llc | Methods of treating or diagnosing conditions associated with elevated IL-6 using anti-IL-6 antibodies or fragments |
| US9212223B2 (en) | 2008-11-25 | 2015-12-15 | Alderbio Holdings Llc | Antagonists of IL-6 to prevent or treat thrombosis |
| US8420089B2 (en) | 2008-11-25 | 2013-04-16 | Alderbio Holdings Llc | Antagonists of IL-6 to raise albumin and/or lower CRP |
| US8323649B2 (en) | 2008-11-25 | 2012-12-04 | Alderbio Holdings Llc | Antibodies to IL-6 and use thereof |
| KR101238061B1 (ko) | 2009-03-31 | 2013-02-27 | 한화케미칼 주식회사 | Ｖｃａｍ－１에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론항체 및 그를 포함하는 염증성 질환 또는 암의 치료용 조성물 |
| CN102574916A (zh) * | 2009-10-23 | 2012-07-11 | 韩华石油化学株式会社 | 特异性结合vcam-1并抑制白细胞与内皮细胞之间粘附和变移的人重组单克隆抗体 |
| US9775921B2 (en) | 2009-11-24 | 2017-10-03 | Alderbio Holdings Llc | Subcutaneously administrable composition containing anti-IL-6 antibody |
| US20120294852A1 (en) | 2009-11-24 | 2012-11-22 | Smith Jeffrey T L | Antagonists of il-6 to raise albumin and/or lower crp |
| CA2818813C (en) | 2010-11-23 | 2020-10-06 | Alder Biopharmaceuticals, Inc. | Anti-il-6 antibodies for the treatment of oral mucositis |
| CN102539736B (zh) * | 2011-12-16 | 2015-04-29 | 北京汉氏联合生物技术有限公司 | 一种cd106阳性细胞、其鉴定、制备方法及应用 |
| JP6339063B2 (ja) | 2012-03-15 | 2018-06-06 | エスエヌユー アールアンドディービー ファウンデーション | グレムリン−１に対する抗体 |
| TR201909801T4 (tr) | 2012-03-20 | 2019-07-22 | Biogen Ma Inc | JCV nötrleştirici antikorlar. |
| WO2013142300A2 (en) | 2012-03-20 | 2013-09-26 | Biogen Idec Ma Inc. | Jcv neutralizing antibodies |
| GB201207155D0 (en) * | 2012-04-24 | 2012-06-06 | Isis Innovation | Antibodies |
| US10947311B2 (en) | 2015-11-20 | 2021-03-16 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | VCAM-1 mediated methods and compositions for treating aging-associated impairments |
| US11560433B2 (en) | 2016-05-27 | 2023-01-24 | Albert Einstein College Of Medicine | Methods of treatment by targeting VCAM1 and MAEA |
| EP4233902A3 (de) | 2016-12-14 | 2024-02-28 | Biora Therapeutics, Inc. | Behandlung einer krankheit des gastrointestinalen traktus mit einem integrin-hemmer |
| WO2019246455A1 (en) | 2018-06-20 | 2019-12-26 | Progenity, Inc. | Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an integrin inhibitor |
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| EP0623173A1 (de) * | 1992-01-13 | 1994-11-09 | Biogen, Inc. | Antikörper die die vierte immunglobulinähnliche Domäne von VCAM1 erkennen. |
| US5932214A (en) * | 1994-08-11 | 1999-08-03 | Biogen, Inc. | Treatment for inflammatory bowel disease with VLA-4 blockers |
| US5484590A (en) * | 1993-09-09 | 1996-01-16 | La Jolla Cancer Research Foundation | Expression of the developmental I antigen by a cloned human cDNA encoding a member of a β-1,6-N-acetylglucosaminyltransferase gene family |
| EP1576013A4 (de) * | 2002-03-22 | 2008-08-13 | Amrad Operations Pty Ltd | Monoklonaler antikörper gegen den interleukin-13-rezeptor alpha 1 (il-13ra1) |
| TWI323265B (en) * | 2002-08-06 | 2010-04-11 | Glaxo Group Ltd | Antibodies |
| US20050106667A1 (en) * | 2003-08-01 | 2005-05-19 | Genentech, Inc | Binding polypeptides with restricted diversity sequences |
| WO2005056575A2 (en) * | 2003-12-03 | 2005-06-23 | The Scripps Research Institute | INTEGRIN αIIbβ3 SPECIFIC ANTIBODIES AND PEPTIDES |
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