Die Erfindung betrifft wässrige Organextrakte mit verbessertem biochemischem Wirkungsgrad, die aus Zelllinien der entsprechenden Organe von Tieren bzw. Teilen von Pflanzen (nachstehend allgemein als "Organe" bezeichnet) gewonnen worden sind, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung einzeln oder in Form von Extraktkombinationen in pharmazeutischen, kosmetischen und sonstigen Zusammensetzungen.
Organextrakte besitzen als Grundstoffe für Pharmaka und Kosmetika eine grosse Bedeutung. Fraktionierte Milz-, Blut-, Plazenta- und Thymusextrakte zum Beispiel werden als Wirkstoffe in Pharmaka und Kosmetika eingesetzt ("Seifen - \le - Fette - Wachse" 112, 215-218 (1986)), wobei sie in vielen Fällen durch niedermolekulare Zusätze ergänzt werden.
Organextrakte zeichnen sich durch eine Vielzahl von lnhalts- bzw. Wirkstoffen aus, die entweder als vollständiger Extrakt oder in Form daraus solierter Einzelsubstanzen Verwendung finden. Für Plazenta-Extrakte wurden beispielsweise über 100 Komponenten nachgewiesen (vgl. "Kosmetik International" 6, 1-8 (1978)). Für einen Teil bestimmter Einzelsubstanzen der Organextrakte ist die Synthese bisher nicht gelungen, zumal der dazu nötige Aufwand oft zu gross ist.
Zahlreiche Organextrakte stehen heute in mehr oder minder naturbelassener Form zur Verfügung, beispielsweise Plazenta-Extrakte, Blut-Extrakte, Thymus-Extrakte, Kollagen-Extrakte, Bindegewebs-Extrakte, Amnion-Extrakte und dgl., die aus frischem Organmaterial hergestellt werden. Dabei wird das frische Organmaterial, beispielsweise frische Plazenten, Leber, Nieren, Milz, Thymus, Blut und dgl., gewaschen, zerkleinert (zuletzt in Kolloidmühlen), und extrahiert durch Behandlung des dabei erhaltenen Organbreis bei -10 bis -20 DEG C in organischen Lösungsmitteln für 6 bis 12 Tage. Im Falle von Blut wird beispielsweise bei -15 DEG C mit der 3fachen Menge Wasser (Nipagin-haltig) längere Zeit hämolysiert. Im Falle der Gewinnung eines Rogen-Extrakts (Kaviar- Extrakts) müssen zunächst bei geeignetem pH-Wert die Geruchsstoffe durch Wasserdampfdestillation entfernt werden.
Für Bindegewebsextrakte sowie für pflanzliche Extrakte sind wieder andere vorbereitende Massnahmen erforderlich (vgl. auch die weiter unten folgenden Beispiele 8, 9 und 10).
Nach der Gewinnung des wässrigen Rohextrakts durch Zentrifugieren bzw. Filtration oder andere geeignete Massnahmen wird dieser weiterverarbeitet zu reinen proteinhaltigen oder proteinfreien Organextrakten, die vor dem Einfrieren bis zur weiteren Verwendung sterilfiltriert werden, beispielsweise unter Verwendung eines 0,2 mu m Millipore< TM >-Filters. Solche Präparate enthalten meist noch Proteine oder hochmolekulare Protein-Abbauprodukte, die pathogene und immunogene Eigenschaften aufweisen können und bei regelmässiger oder wiederholter Verabreichung - meistens verbunden mit langen Inkubationszeiten - zu schwerwiegenden Erkrankungen führen können. Bekannt sind insbesondere die durch unkonventionelle Viren, d.h. Prionen, verursachten Krankheitsbilder, wie TSE (transmissible spongioforme Encephalopathien), insbesondere BSE (Rinderwahnsinn), und das Jacob-Creutzfeld-Syndrom.
Es sind aber auch proteinhaltige Plazenta-Extrakte bekannt, die bei ihrer Anwendung auf den Menschen krebserregend sein können [Lit. 1].
Vor allem durch die mit Prionen, insbesondere mit BSE-Prionen, zusammenhängenden Probleme sind tierische Organextrakte weltweit in Verruf geraten. Der Nachweis, dass Organmaterial von Herden stammt, die BSE-frei waren, ist im Falle der Verwendung grosser Organmengen bestimmten Alters kaum durchzuführen. Um BSE-Freiheit eines Endprodukts experimentell im Goldhamster-Modell-Versuch zu beweisen, bedarf es mindestens 9 Monate Zeit - in vielen Fällen undurchführbar. Ein BSE-Schnelltest fehlt bisher.
Aus DE-OS 2 405 983 und DE-OS 2 021 969 sind Kombinationen niedermolekularer Komponenten mit aus natürlichem, frischem Organmaterial gewonnenen Organextrakten bekannt, die jedoch ebenfalls die vorstehend geschilderten Nachteile haben.
Um solche Komplikationen zu vermeiden, wurde in EP-A-0 552 516 ein Weg zur Herstellung wasserlöslicher synthetischer Organextrakte aufgezeigt, bei dem auf synthetischem Wege gewonnene niedermolekulare Komponenten, wie sie auch in natürlichen Organextrakten vorkommen, miteinander kombiniert werden.
Während die natürlichen Organextrakte die oben geschilderten Nachteile aufweisen, haben die synthetischen Organextrakte den Nachteil, dass sie grossenteils den vollen biochemischen Wirkungsgrad der natürlichen Organextrakte nicht entwickeln, weil ihnen bestimmte Komponenten fehlen.
Aufgabe der in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Erfindung ist es, Organextrakte zu schaffen, die das biochemische Wirkungsprofil von natürlichen und synthetischen Organextrakten mindestens erreichen, vorzugsweise jedoch wesentlich verbessern, insbesondere frei von unerwünschten Substanzen, speziell immunogenen und pathogenen Proteinen und Proteinabbauprodukten, wie sie in natürlichen Organextrakten zu finden sind, und deren unerwünschten Wirkungen sind.
Zwar lassen sich durch Anwendung von ausschliesslich synthetischen Organextrakten, wie sie in EP-A-0 552 516 beschrieben sind, die weiter oben geschilderten Nachteile vermeiden, deren biochemisches Wirkungsprofil ist jedoch nicht immer zufriedenstellend. Eine Steigerung des biochemischen Wirkungsprofils ist nun erfindungsgemäss möglich durch Herstellung von wasserlöslichen Organextrakten aus Zelllinien der entsprechenden Organe, die gegebenenfalls mit synthetisch hergestellten oder natürlichen Organextrakten kombiniert werden und die frei von allergologischen Effekten sind, wie sie beispielsweise mithilfe des Patch-Tests nachgewiesen werden können.
Gemäss einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung wässrige Organextrakte mit verbessertem biochemischem Wirkungsgrad, die aus Zelllinien der entspre chenden Organe von Tieren bzw. Teilen von Pflanzen hergestellt worden sind, sowie beliebige Kombinationen derselben und deren Verwendung als Wirkstoffe in pharmazeutischen, kosmetischen und sonstigen Zusammensetzungen.
Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von wässrigen Organextrakten mit verbessertem biochemischem Wirkungsgrad aus Zelllinien der entsprechenden Organe von Tieren bzw. Teilen von Pflanzen, das durch die folgenden Stufen gekennzeichnet ist:
a) Aktivierung der gewählten tierischen bzw.
pflanzlichen Zellen in einem Wasserbad von vorzugsweise 25 bis 30 DEG C,
b) Zugabe eines vorgewärmten, für die jeweils gewählten Zellen vorgeschriebenen Kulturmediums unter Vermischung und anschliessendes Inkubieren in an sich bekannter Weise, vorzugsweise bei etwa 37 DEG C und vorzugsweise in einer etwa 5% CO2 enthaltenden Atmosphäre,
c) Gewinnung der dabei gebildeten Zellen als Ausgangsmaterial für Grosskulturen auf Oberflächen oder in Suspension durch Dekantieren des Nährmediums, Waschen des entstandenen Zellrasens mit einem geeigneten Puffer und Aufnahme der Zellen in einem kompletten Medium unter Einstellung einer für die Massenproduktion geeigneten Verdünnung,
d) Kultivierung der Zellen auf Oberflächen, vorzugsweise in Perfusionssystemen, auf festen Medien und/oder unter Anwendung der Plastikfilm-Kultur-Methode (für tierische Zellen) bzw.
in Suspensionskultur (für pflanzliche Zellen) im Grossmassstab auf an sich bekannte Weise durch Beimpfen der Kultivierungsapparatur mit einer Zellsuspension in einem sterilen CO2/Luft-Gemisch,
e) Herstellung eines Extrakts durch Behandlung des suspendierten geernteten Zellmaterials in einem organischen Lösungsmittel und/oder Wasser, Gewinnung der wässrigen Phase vorzugsweise durch Zentrifugieren, Entfernung von restlichen Lipidanteilen aus der wässrigen Phase durch mehrmaliges Behandeln mit dem organischen Lösungsmittel un ter Bildung eines wässrigen Rohextrakts, gegebenenfalls in Form einer Suspension,
f) Reinigung bzw.
Behandlung des Rohextrakts je nach Ausgangsmaterial und anschliessendes Dialysieren, vorzugsweise unter Verwendung einer Membran Visking C 150, gegen eine Nipagin oder ein anderes Konservierungsmittel enthaltende wässrige Lösung zur Gewinnung eines von hochmolekularen Verbindungen freien Extrakts als Dialysat und
g) Sterilfiltration des Extrakts, vorzugsweise unter Verwendung eines 0,2 bzw. 0,1 mu m (Millipore< TM >)-Filters oder einer PALL-Kerze nach Einstellung des Extrakts auf den gewünschten pH-Wert, vorzugsweise 5,0 bis 7,2.
Die erfindungsgemässen wasserlöslichen Organextrakte lassen sich sowohl mit synthetischen Organextrakten, wie sie in EP-A-0 552 516 beschrieben sind, als auch mit natürlichen Organextrakten oder beiden kombinieren. Auch im Falle dieser Kombinationen werden verbesserte biochemische Wirkungsprofile erzielt, die besser sind als diejenigen der synthetischen Organextrakte allein und frei sind von den unerwünschten Nebenwirkungen der natürlichen Organextrakte. Erfindungsgemäss ist es insbesondere möglich, auf technisch einfache und besonders elegante Weise garantiert virusfreie und prionenfreie Kombinationen von synthetischen Organextrakten und Zelllinienextrakten herzustellen, was besonders bedeutsam ist im Zusammenhang mit den heute sehr akuten TSE-Problemen, speziell BSE.
Bevorzugte Ausführungsformen des vorstehend beschriebenen erfindungsgemässen Verfahrens sind dadurch charakterisiert, dass
eine in der Stufe (d) gewonnene tierische Zellmasse in Ethylether oder Chloroform suspendiert und etwa 8 bis etwa 15 Tage lang bei etwa -10 bis etwa -20 DEG C im Kälteraum stehen gelassen und dann zur Gewinnung der wässrigen Phase zentrifugiert wird;
die letzten Spuren von Ether oder Chloroform aus dem Dialysat (Aussenlösung) in der Stufe (f) durch Stickstoff-Durchblasen bei pH 7,2 bis 7,5 entfernt werden; und/oder
in der Stufe (a) Zellkulturen aus handelsüblichen Zelllinien einschliesslich der in der Beschreibung genannten nichthandelsüblichen speziellen Zelllinien einzeln oder im Gemisch eingesetzt werden.
Zur Herstellung der erfindungsgemässen Organextrakte und zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens werden vorzugsweise
als tierische Zelllinien mindestens eine der Zelllinien MDBK (Rindernierenzellen DSM ACC 174 aus der Niere eines normal ausgewachsenen Rindes), P1-1A3 (Thymus-Epithel-Zellen DSM ACC 280 aus dem Thymusepithel eines 6 Monate alten Kindes), EBL (Rinderlungenzellen DSM ACC 192 aus der Lunge eines 7 Monate alten Rinderfötus, gefrorene 110.
Passage), AM-C6SC8 (Schweinenieren-Zellen DSM ACC 152 aus einem Subklon von der Zelllinie Am II, die von einer normalen Schweineniere gewonnen wurde), BeWo (weibliche Human-Plazenta-Zellen ATCC CCL 98), AV 3 (Human-Amnion-Zellen ATCC CCL 21), WISH (Human-Amnion-Zellen ATCC CCL 25), B 95.8 (Blut-Zellen, Monkey, ATCC CRL 1612 ECACC 8501 1419, PK (15) (Schweinenieren-Zellen) ATCC CCL 33) und FL (Human-Amnion-Zellen ATCC CCL 62 IZSBS BSCL 46); 3A-subE (Human-Plazenten-Zellen) ATCC CRL-1584; BVDV + EJG (Rinder-Kapillarzellen) ATCC CRL-8659; P-17 (Kalbsthymus-Epithelzellen) Brastone von Dr. F. R. Pesserl, Curitiba, Paranà, Brasilien; FB 5.Bm (Rinder-Knochenmark) ATCC CRL-6043; R.Sp. (Rind) ATCC CRL-6019; RPL 10 (Rinder-Plazenten-Zellen von Prof. Dr.
Mariano da Rocha Filho, UFSM, Faculdade de Medicina, Santa Maria, Rio Grande do Sul, Brasilien, SPI.K (Delphin) ATCC CRL-6556; CF 37 Mg (Beagle-Hund, Mammary gland) ATCC CRL 6230, SRC (Rogenzellen vom Stör, Acipenser huso von Dr. F. R. Pesserl, 80 000 Curitiba, Paranà, Brasilien), Kalbsthymus-Zelllinie WANK und N. M. FARIA, 10 000 S. Paolo, SP, Brasil, von Prof. Dr. Dr. R. Riemschneider, Instituto Central de Quimica da UFSM, S. Maria RS, Brasilien); XTH-2 (Zellen vom südafrikanischen Krallenfrosch Xenopus leavis DAUDIN, South African clawed toad) DSM ACC 190
und/oder
als pflanzliche Zelllinien mindestens einer der Zelllinien Acer pseudoplatanus L.
(Sycamore), Phaseolus vulgaris (aus Hypocotyl of Pole Bean), Nicotiana tabacum, Solanum tuberosum (tetraploider Stamm), Ginkgo biloba, Pisum sativum (root), Centaurus cyanus, Daucus carota, Apium graveolens, Daucus catora, Apium graveolens, Arthrospira und/oder Saccharomaces cerevisiae oder andere Actinomyceten verwendet.
Die aus tierischen Zelllinien gewonnenen, sterilfiltrierten erfindungsgemässen Organextrakte werden einzeln oder im Gemisch vorzugsweise mit mindestens einem synthetisch hergestellten Extrakt oder mit mindestens einem aus frischen Organen hergestellten Extrakt oder mit beiden kombiniert, wobei das Gewichts-Mengenverhältnis zwischen dem aus tierischen Zelllinien gewonnenen, steril filtrierten Organextrakt und dem synthetisch hergestellten Organextrakt und/oder dem aus frischen Organen hergestellten Extrakt vorzugsweise (1 bis 99):(99 bis 1), insbesondere (1 bis 50):(50 bis 1), speziell (1 bis 20):(99 bis 80), beträgt. Die gleichen Gewichts-Mengenverhältnisse werden vorzugsweise auch angewendet bei Kombination eines oder mehrerer der vorstehend beschriebenen tierischen Zellextrakte mit einem oder mehreren der aus einer pflanzlichen Zelllinie gewonnenen Extrakte.
Bei Verwendung von pflanzlichen Zelllinien wird in der Stufe (e) das in Wasser oder in einem organischen Lösungsmittel suspendierte Zellmaterial, wenn es auf das Zellwandmaterial ankommt, vorzugsweise in einem Ultraschallgenerator zerbrochen und das aufgeschlossene Material wird nach dem Zentrifugieren und Waschen mit Wasser durch chemische und/oder enzymatische Partialhydrolysen aufgeschlossen und dialysiert.
Weitere bevorzugte Ausgestaltungen des erfindungsgemässen Verfahrens ergeben sich aus den Ansprüchen 10 bis 20.
Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung der vorstehend beschriebenen wässrigen Organextrakte einzeln oder in Form von Gemischen oder Kombinationen derselben als Ersatz oder Ergänzung für Plazenta-, Thymus-, Blut-, Serum-, Milz-, Leber-, Kollagen-, Bindegewebs-, Amnionflüssigkeits-, Quallen-, Rogen- und Euterextrakte bzw. Kombinationen davon sowie zur Herstellung von kosmetischen Formulierungen und zur Herstellung medizinischer Präparate für die Stärkung des Immunsystems, für die Aktivierung des Zellstoffwechsels oder für die Behandlung gastroenterologischer Erkrankungen, insbesondere Ulcera, und für die topische, subkutane, intravenöse oder intramuskuläre Applikation zum Zwecke der äusseren oder inneren Wundheilung, zur Behandlung von Arteriosklerose oder von Strahlungsschäden.
Die vorstehend beschriebenen erfindungsgemässen wässrigen Organextrakte und Extrakt-Kombinationen eignen sich auch zur Herstellung von Präparaten mit aphrodisiakatischer Wirkung. Dies gilt insbesondere für die aus pflanzlichen Zelllinien von vorzugsweise Ginkgo biloba, Sycamore, Saccharomyces, Torula oder Cyanophyten gewonnenen Extrakte und ihre Kombinationen mit auf tierischen Zelllinien basierenden Extrakten, die als Wirkstoffe in Präparaten mit aphrodisiakatischer Wirkung verwendet werden können.
Ausserdem betrifft die Erfindung die Verwendung der erfindungsgemässen Extrakte und Extraktgemische einschliesslich der Rohextrakte, Rohextraktgemische und ihrer Vorstufen zur Stabilisierung und Haltbarmachung von gefärbten Geweben, Farbanstrichen und Lackierungen, insbesondere solchen mit Lacken auf Wasserbasis, sowie zur Herstellung von Kulturlösungen, Nährlösungen und diätetischen Lösungen.
Die Erfindung, insbesondere die einzelnen Stufen des erfindungsgemässen Verfahrens, werden nachstehend unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen näher erläutert.
Ad 1) Auftauen von tiefgefrorenen Zellkulturen aus kompetenten Quellen, aus eigener Zucht oder Zelllinien, wie sie im Handel sind (vgl. z.B. [Lit. 13, 14, 15]), z.B. von tierischen Zelllinien, wie
MDBK (Rindernierenzellen DSM ACC 174 aus einer Niere eines normal ausgewachsenen Rindes in einem Medium aus 95% Dulbecco's MEM + 5% FCS (fötales Kälberserum) wie von Martin und Darby in "Proc. Soc. Expr. Biol. Med." 98, 574 (1958) beschrieben, hinterlegt bei Dr. R. Riebe, BFA, Insel, Riems (Deutschland),
P1-1A3 (Thymus-Epithel-Zellen DSM ACC 280 aus dem Thymusepithel eines 6 Monate alten Kindes in einem Medium aus 80% RMPI 1640 + 20% FCS, wie von Fernandez in "Blood", 83, 3245-3254 (1994), beschrieben, hinterlegt bei E. Fernandez, Dr. Toribio, Universität Madrid (Spanien),
EBL, Rinderlungenzellen DSM ACC 192 aus der Lunge eines 7 Monate alten Rinderfötus, gefrorene 110.
Passage, in einem Medium aus 85% RPMI 1640 oder MEM + 15% FCS, wie von Bechman und Schöss in "Deutsche Tieräztl. Wochenschrift." 95, 283 (1988) und ibid., 98, 310 (1992), sowie von Rutter und Luther in "Vet. Rec." 114, 393 (1984) beschrieben, hinterlegt bei Dr. V. \ppling, Paul Ehrlich-Institut Langen (Deutschland),
AM-C6SC8, Schweinenieren-Zellen DSM ACC 152 aus einem Subklon von der Zelllinie Am II, die von einer normalen Schweineniere gewonnen wurde, in einem Medium aus 80% Medium 199 (Hanks-Salze) + 20% FCS), wie von Limezewski in "Mycotoxin Res." 3, 69-76 (1967), beschrieben, hinterlegt bei Dr.
Limezewski, Bundesanstalt für Milchforschung (Kiel),
BeWo, weibliche Human-Plazenta-Zellen ATCC CCL 98 in einem Medium aus Waymouth's + Gey's BBS + 10% Newborn Calf-Serum [Lit. 13],
AV 3, Human-Amnion-Zellen ATCC CCL 21 in einem Medium aus M199 mit Earle's BBS + 20% FCS [Lit. 13],
WISH, Human-Amnion-Zellen ATCC CCL 25 in einem Medium aus Eagle's MEM mit Eagle's-BSB + 10% FCS*, und PK (15), Schweinenieren-Zellen ATCC CCL 33 in einem Medium aus Eagle's MEM mit Eagle's BSS + 10% FCS + Na-Pyruvat [Lit. 13],
B95.8 (Blood-Zellen, Strain Marmaset, Suspensions-Kultur ATCC CRL 1612 ECAGC 85011419. Medium: RPMI 1640 + 10% FCS + L-Glutamin + Na-Pyruvat + nichtessentielle Aminosäuren + 2-Mercaptoethanol, hinterlegt bei G. B.
Ferrara, Servizia di lmmunogenetica, Istituto Nazionale per la Ricerca, 16132 Genua (Italien),
FL (Human-Amnion-Zellen ATCC CCL62 IZSBS BSCL46 in einem Medium Eagle's MEM mit Earle's BSS + 10% FCS, beschrieben in "Proc. Soc. Exp. Biol. Medicine", 94, 532 (1957), hinterlegt bei: M. Ferrari, Istituto Zooprofilattico Sperimentale, 25100 Brescia, Italien);
RPL 10 (Rinderplazenten-Zellen, bos taurus, in einem Medium aus Waymouth's + Gey's BBS + 8% Newborn Calf-Serum, Herkunft: Professor Dr. Mariano da Rocha Filho, Reitor da UFSM, Faculdade de Medicina, Santa Maria Rio Grande do Sul, Brasilien, und Dr. G. da Roche Filho da UFSM, Bioquìmica, lstituto Central de Química, Santa Maria, RS, Brasilien;
SRC, Rogenzellen vom Stör, Acipenser huso, Wolga, in einem Medium aus 85% Dulbecco's MEM + 10% Gay's BBS + 5% FCS, hinterlegt bei Brastone, Dr. F. R.
Pesserl, 82500 Curitiba, Paranà, Brasilien;
P-17, Thymus-Epithelzellen aus Thymusepithel eines 4 Monate alten Kalbs in einem Medium aus 80% RMPI 1640 + 20% FCS, hinterlegt bei Dr. F. R. Pesserl, Brastone, 82500 Curitiba, Paranà, Brasilien;
CHSE-214 Fish: Chinook Salmon Embryo NBL-4 (EB Tr) Bovine embryonic trachea [Lit. 15];
3A-sub E (Human Plazenta-Zellen) ATCC-CRL-1584 in einem Medium aus Waymouth's + Gay's BBS + 15% Newborn Calf-Serum, Katalog: "ATCC Cell lines and Hybridomas", Rockville, MD 20852, USA, 1996;
BVDV + EJG (Rind, bos taurus, Kapillarepithel ATCC CRL-8659 im Medium Eagle's MEM + 20% FCS;
Katalog: "ATCC Cell lines and Hybridomas", USA 1996 (siehe oben));
FB 3 Sp/Thy (Rind, bos taurus, normal) ATCC-CRL 6039, Katalog wie oben;
B Sp.
(Rind, bos taurus, normal) ATCC-CRL 6019, Katalog wie oben;
CF 37 Mg (Hund, Canis familiaris, Beagle ATCC CRL 6230, Mammary gland, normal), Katalog wie oben;
PTI.Sp. (Schimpanse, Pan troglodytes Milz) ATCC CRL 6315, Katalog wie oben;
FB5.BM (Rind, bos taurus, Knochenmark, normal) ATCC CRL 6043, Katalog wie oben;
DBI. Tes (Delphin, Pacific common, Delphinus bairdi, Testes, normal) ATCC CRL 6258, Katalog wie oben;
Spl.K (Delphin, stenella plagiodon, Niere, normal) ATCC CRL 6262, Katalog wieoben; und
L01.HT (Seeschildkröte, Lepidochelys olivacea, Herz) ATCC CRL 6556, Katalog wie oben, oder
von geeigneten pflanzlichen Zelllinien, die z.B. in Suspensionskulturen gezüchtet werden können, wie
Acer pseudoplatanus L. (Sycamore) nach D. T. A. Lamport & D. H. Northcote, "Nature (London)" 188, 665-666 (1960) und L. G. Nickell, "Proc. U.S. Nat. Acad.
Sci." 42, 848 (1956), (vgl. auch das weiter unten folgende Beispiel 8),
Phaseolus vulgaris (aus Hypocotyl of Pole Bean) im modifizierten White's Medium, gezüchtet nach L. G. Nickell, "Proc. U.S. Nat. Acad. Sci." 42, 848-850 (1956),
Nicotiana tabacum nach D. K. Dougall & K. Shimbayshi, "Plant Physiology" 33, 396-404 (1960),
Solanum tuberosum (tetraploider Stamm) nach D. T. A. Lamport, "Adv. Bot.
Research" 2, 168 (1965): Michigan State University Atomic Energy Commission Plant Research Laboratory,
Ginkgo biloba, Pisum sativum (root), Centaurus cyanus, Daucus carota, Apium graveolens (wie oben),
Saccharomyces cerevisiae Hansen von der Hefefabrik Asmussen, Elmshorn bei Hamburg (Backhefen, Brennereihefen, obergärige Bierhefen), handelsübliche Brauerei- und Bäckerhefen oder Hefen wie Torula utilis, Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus (Weinhefen), Saccharomyces carlsbergensis (untergärige Bierhefen), Saccharomyces fragilis und Saccharomyces lactis (Milchzucker vergärende Hefen), Candida utilis (früher Torulopsis utilis) und Candida tropicalis (technische Futter- und Nährhefen) und andere,
Nostoc commune VAUCHER und andere Cyanophyten wie Arthrospira, Nostoc mucosum etc. Rabenhorst, Algae. Eur. Nr. 28 etc. Wittr. Nordst., Alg. exsicc. Nr. 497 etc.
Vorkommen: kosmopolitisch, am Rande von Salzsümpfen [Lit. 11];
Zellen von Baumpollen: Acer negundo (Box Elder);
Betual alba (White Birch; Olea europeae (Evergreen olive);
Ulmus pumila (Chinese Elm); Quercus rubra (Nothern Red Oak).
Pollen (Gras-Pollen): Cynodon dectylon (Bermuda);
Poa pratensis (Kentucky Blue); Secale cerate (Cultivated Rye).
Werd Pollen: Artemisia absinthum (Wormwood); Iva xantifolia (Giant Poverty);
Ambrosia elatior (Short Rogweed).
Rivularia bullata (poir), Berkeley, Glean, Brit. Alg. S. 1833.
Vorkommen: kosmopolitisch, in der Ebbe-Flut-Zone; [Lit. 11],
Calothrix pulvinata Kg., Syth. Alg., S. 71, 1824. Vorkommen auf Felsen, Holz, Algen (Europa, Nordamerika, Australien); [Lit. 11], und
Romeria elegans Wollszynska, gefunden in Koczw, in einem Teich bei Lwòw.
Ad 2) lnkubieren der jeweiligen Zellkulturen nach den Vorschriften des Lieferanten.
Ad 3) Gewinnung von Zellen als Ausgangsmaterial für Grosskulturen auf Oberflächen bzw. in Suspension auf an sich bekannte Weise, und zwar tierische Zellen auf Oberflächen, pflanzliche Zellen in Suspension.
Kultivierung der Zellen auf Oberflächen z.B. in Perfusionssystemen (nach Weiss und Schleicher [Lit. 2]), auf festen Medien und/oder nach der Plastik-Film-Kultur-Methode (nach House, Scherer und Maroudas [Lit. 3]) im Grossmassstab.
Extraktion durch Behandlung des suspendierten geernteten Zellmaterials bei vorzugsweise -10 bis -20 DEG C in organischen Lösungsmitteln für vorzugsweise 6 bis 12 Tage.
Ad 4) Herstellung eines Extrakts durch Gewinnung des wässrigen Rohextrakts vorzugsweise durch Zentrifugieren mit beispielsweise 3000 UpM und
weitere Verarbeitung zu reinen, proteinhaltigen oder proteinfreien Organextrakten, die vor ihrer Lagerung sterilfiltriert werden.
Für den Fall, dass die gewählte Zelllinie in Suspensionskultur wächst, wird mit der "Rotary Shaker Technique", z.B. in der Roller-Flaschen-Apparatur (gemäss beiliegender Fig. 1), begonnen und dann wird in Suspensionskulturflaschen, z.B. gemäss beiliegenden Fig. 2 und 3, weiter gearbeitet.
Die Suspensionskulturen in sehr grossem Massstab werden dann in 50 L- bis zu 1500 L-Fermentern, z.B. nach Moore et al. [Lit. 5], durchgeführt.
Bewährt haben sich auch Rohrschlangen-Kultivatoren IGV von 50 L bis zu 2000 L zur Biomasse-Produktion pflanzlicher Zellen gemäss beiliegender Fig. 6.
Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 eine Burler- oder Roller-Flaschen-Apparatur, in der die Zellen auf der inneren Oberfläche der Winchester- oder Baxter-Flaschen wachsen, die durch Rollen oder Räder, auf denen sie liegen, langsam gedreht werden [Lit. 4];
Fig. 2 eine Suspensionskulturflasche, die aus einer Saugflasche hergestellt ist. Um zwischendurch Kulturmedium zugeben und Proben entnehmen zu können, sind der Schlauch zur Erneuerung des Kulturmediums und der Probenschlauch mit einer Klemme abgequetscht. Zum "Füttern" wird die Klemme vom Schlauch zur Erneuerung des Kulturmediums entfernt und Kulturmedium wird durch die Gummiverschlusskappe injiziert. Zur Proben-Entnahme wird die Klemme vom Probenschlauch entfernt. Da nach wird der Universalbehälter durch einen sterilen ersetzt.
Das Gefäss sollte nicht mehr als zu einem Viertel gefüllt sein. Es sei darauf hingewiesen, dass der "Kragen" um den Magnetstab dazu dient, den Kontakt zwischen dem Magneten und dem Boden der Flasche möglichst klein zu halten;
Fig. 3 ein Gefäss, das zur Zucht von Zellen in Suspension dient. Der mit Kunststoff überzogene Magnet wird durch einen ausserhalb des Gefässes befindlichen Magnetrührer gedreht;
Fig. 4 eine Gewebekultur-Apparatur mit vielfach vergrösserter Oberfläche nach Weiss und Schleicher [Lit. 2] (erhältlich in den Abbot-Laboratorien), in der ebenfalls das Prinzip eines Perfusionssystems mit fester Matrix nach McCoy et al. [Lit. 6] angewendet wird.
Die übereinander gesetzten Titanplatten werden von einem Stützgestell innerhalb eines Glaskulturgefässes zusammengehalten.
Schichten aus Titanplatten werden mit Metallenstangen in einem zylindrischen Kulturgefäss zusammengehalten. Die Zellimpfmenge wird in das Gefäss durch das Zugangsrohr gepumpt. Das Medium wird innerhalb des Gefässes durch eine Luftpumpe umgepumpt (wenn das Gas durch das Gasrohr gelangt ist, steigen die Bläschen im Pumpenrohr empor, wobei sie Medium mit sich reissen). Nach der Beimpfung zirkulieren die Zellen einige Zeit auf diese Weise, dann stoppt man die Pumpen einige Stunden lang, damit die Zellen sich absetzen können. Das Gasumpumpen kann dann erneuert werden. Medium kann durch das Einfüllrohr zugegeben oder entnommen werden. Am Ende des Umlaufs wird alles Medium entnommen und durch Trypsin ersetzt.
Die Zellsuspension wird dann durch das Einfüllrohr entnommen.
Die Apparatur wird beimpft, indem man eine Zellsuspension einpumpt. Der Apparat wird mit einem sterilen Kohlendioxid-Luft-Gemisch mithilfe der Luftpumpe beschickt, um die Zellen gleichmässig zu verteilen. Die kohlensaure Luftzufuhr wird 2 h lang gestoppt, damit sich die Zellen absetzen, dann wird sie fortgesetzt. Sobald eine ausreichende Zelldichte erreicht ist, wird das Kulturmedium herausgepumpt und durch eine Trypsin-Lösung ersetzt. Nach einer lnkubation kann die Zellsuspension aus der Maschine herausgepumpt werden.
Dieser Apparate-Typ hat den Vorteil, dass er sich selbst zu einem sehr einfachen, geschlossenen Kreislaufsystem eignet.
Fig. 5 eine Apparatur nach House, Scherer und Maracoudas [Lit. 3] in der mit einer Spirale aus flexiblem Kunststoff in Form eines Polystyrolfilms gearbeitet wird, um eine grosse Oberfläche zu schaffen. Kulturmedium und Gas werden durch die \ffnungen eingeführt. Die Zellen wachsen auf der Plastikspirale.
Eine Spirale aus flexiblem Kunststoff mit einer Steigung von etwa 4 cm wird mit einem passenden Former hergestellt und vertikal in einen zylindrischen Behälter eingesetzt mit einer Luftpumpe, die durch die Mitte der Spirale läuft. Um den Apparatur zu beimpfen, wird Kulturmedium mit der Zell-Suspension zugegeben.
Dann lässt man die Zellen absitzen und verteilt sie gleichmässig über beide Oberflächen des Films, indem man sie mit einer Geschwindigkeit von 2 Uph horizontal auf einem Roller-Gestell rotieren lässt. Sobald die Zellen vollkommen haften (nach 3 bis 18 h, abhängig von Zelltyp), werden die Flaschen vom Roller genommen und zur Begasung aufrecht hingestellt. Um eine genaue Begasung mit kohlendioxidhaltiger Luft zu gewährleisten, ist es erforderlich, ein Antischaummittel (z.B. Midland-Silicone, Antifoam Emulsion RD) zuzusetzen.
Wenn das Wachstum abgeschlossen ist, können die Zellen mithilfe von Trypsin geerntet werden, wie bei einer normalen Roller-Flasche oder durch Abkratzen;
Fig. 6 einen Rohrschlangen-Kultivator IGV zur Produktion von pflanzlichen Zellen in Suspensions-Kulturen;
Fig. 7a eine Vorrichtung zur Messung der Hautfeuchtigkeit (Corneometer CM 820 PC);
Fig. 7b den Messfühler des Corneometers CM 820 PC mit einem flachen Kondensator als Stirnfläche, der auf die Haut gedrückt wird zur Messung der Hautfeuchtigkeit;
Fig. 8 eine grafische Darstellung des Feuchtigkeitshaltevermögens der Haut (in h) nach einmaliger Applikation einer Hautcreme ohne Zusätze (Kontrolle) bzw. einer Hautcreme mit zugesetztem Amnion-Extrakt IIb oder IIa gemäss dem weiter unten folgenden Beispiel 4;
Fig. 9 eine grafische Darstellung der Veränderung der Oberflächenstruktur menschlicher Haut bei mikroskopischer Betrachtung anhand der prozentualen Änderung der Profillinienareale (FA) und der Profillinienlänge (LL) in Abhängigkeit von der Verwendung von Plazenta-Extrakt enthaltenden Emulsionspräparaten gemäss dem weiter unten folgenden Beispiel 5;
Fig. 10 das DC-Fertigplatten-Laufbild des in dem weiter unten folgenden Beispiel 7 beschriebenen Blutextrakts nach zweidimensionaler Entwicklung, aus dem die in dem Blutextrakt enthaltenden unterschiedlichen Aminosäuren ersichtlich sind;
Fig. 11 eine grafische Darstellung der Gärungssteigerung von Hefe durch das Hefeextrakt-Dialysat (gemäss Beispiel 9) und
Fig. 12 eine grafische Darstellung der Hydroxyl-Radikal-Hemmungen durch Organextrakte als Radikalfänger (Scavengers on the viscosity of hyaluronic acid) (gemäss Beispiel 10).
In allen Fällen ist es wichtig, dass sterile Bedingungen streng eingehalten werden, und zwar sowohl hinsichtlich der Apparaturen als auch hinsichtlich der in beträchtlichen Mengen erforderlichen, vorher zu testenden und sterilisierenden Kulturmedien.
Hinsichtlich der Zellvermehrung kann auf Grund arithmetischer Überlegungen erwartet werden, dass die beschriebenen Grosskultur-Verfahren innerhalb verhältnismässig kurzer Zeiten ausreichende Zellmaterial-Mengen, ausgehend von einer gefrorenen Zellkultur, liefern werden. Langsam wachsende Zellen vermehren sich in einer Woche auf das 10fache, in 6 Wochen auf das 10<6>fache. Aus einer Zelle können innerhalb von 12 Wochen 10<1><2> Zellen (4 kg), innerhalb von 15 Wochen 10<1><5> Zellen (4000 kg) entstehen.
Bei der Entwicklung und beim Einsatz von geeigneten Nährlösungen ist darauf zu achten, dass nur Komponenten zum Einsatz kommen, die in dem angestrebten Organextrakt später keine pharmakologisch-toxikologischen und dermatologisch unerwünschten Effekte verursachen. Dies gilt vor allem im Falle einer medizinischen Anwendung der erfindungsgemäss hergestellten Organextrakte.
Die erfindungsgemäss hergestellten wasserlöslichen Organextrakte lassen sich sowohl mit synthetischen Organextrakten wie sie in EP-A-0 552 516 beschrieben sind, als auch mit natürlichen Organextrakten oder beiden kombinieren. Auch im Falle dieser Kombinationen werden verbesserte biochemische Wirkungsprofile erzielt, die besser sind als diejenigen der synthetischen Organextrakte und frei sind von den unerwünschten Nebenwirkungen der natürlichen Organextrakte. Die Erfindung erlaubt insbesondere eine technisch einfache und besonders elegante Herstellung von garantiert virusfreien und prionenfreien Organextrakten, die eine Kombination von synthetischen und Zelllini enextrakten darstellen, was besonders bedeutsam ist im Zusammenhang mit den TSE-Problemen, speziell BSE.
Die Gewichts-Mengenverhältnisse, die bei der Kombination von Zellextrakten aus tierischen und/oder pflanzlichen Zelllinien mit entsprechenden synthetischen Zellextrakten anzuwenden sind, können in weiten Bereichen variiert werden, z.B. zwischen (1 bis 50):(98 bis 50), vorzugsweise (1 bis 20):(99 bis 80), insbesondere (1 bis 10):(99 bis 90), liegen. Entsprechendes gilt auch für die Extrakt-Kombination, die aus frischen Organen und zugehörigen Zelllinien hergestellt werden. Auch Kombinationen aller drei Extrakt-Arten sind von Interesse, und zwar in vielen Bereichen von beispielsweise (1 bis 20):(1 bis 10):(Rest synthetischer Extrakt), vorzugsweise (1 bis 10):(1 bis 5):(Rest synthetischer Extrakt), insbesondere (1 bis 5):(1 bis 5):(Rest synthetischer Extrakt), für Zelllinien-Extrakt zu entsprechendem natürlichem Organextrakt zu entsprechendem synthetischem Organextrakt.
Die angegebenen Mengenverhältnisse sollen die Erfindung besser verständlich machen, die Erfindung ist darauf aber nicht beschränkt.
Wie in der mehrfach zitierten EP-A-0 552 516 ausgeführt, lassen sich durch Erhöhung der Anteile an bestimmten Komponenten, z.B. Glycin bis auf 4,5%, durch Erhöhung der Anteile an Sorbit, Mannit bis auf 6% und durch Erhöhung der Anteile an Panthenol bis auf 35%, besondere kosmetische Effekte erzielen, die Naturextrakten fehlen (vgl. Beispiel 2, Tabelle 11, von EP-A-0 552 516). Im weiter unten folgenden Beispiel 8 ist für den Sycamore-Extrakt VI eine entsprechende Massnahme beschrieben.
In der nachstehenden Tabelle I sind einige der zur Extraktherstellung in den weiter unten beschriebenen Beispielen herangezogenen, erfindungsgemäss verwendbaren tierischen Zelllinien zusammengestellt.
Die Herstellung eines Rindernieren-Extrakts aus der Zelllinie MDBK ist in dem nachfolgenden Beispiel 1 beschrieben.
Die Herstellung einer Kombination des im Beispiel 1 erhaltenen Extrakts mit einem wässrigen synthetischen Rindernieren-Extrakt ist im Beispiel 2 beschrieben.
Die Kombination des in Beispiel 1 gewonnen Extrakts mit einem aus frischen Rindernieren hergestellten Extrakt ist in Beispiel 3 beschrieben.
Weitere Extraktherstellungen, in denen z.B. auch pflanzliche Zelllinien eingesetzt werden, sind in den Beispielen 4 bis 11 beschrieben.
<tb><TABLE> Columns=5 Tabelle I
<tb>Head Col 1: Nr.
<tb>Head Col 2: Zelllinie
<tb>Head Col 3: Zelllinien-Typ
<tb>Head Col 4: Beschreibung
<tb>Head Col 5: Kulturmedium
<tb><SEP>1<SEP>MDBK<SEP>Rindernierenzellen
DSM ACC 174<SEP>von einer Niere eines normal ausgewachsenen Rindes<SEP>95% Dulbecco's MEM +
5% FCS<1)>
<tb><SEP>2<SEP>P1-1A3<SEP>Thymus-Epithelzellen
DSM ACC 280<SEP>vom Thymusepithel eines
6 Monate alten Kindes<SEP>80% RPMI 1640 +
20% FCS<2)>
<tb><SEP>3<SEP>EBL<SEP>Rinderlungenzellen
DSM ACC 192<SEP>von der Lunge eines 7 Monate alten Rinderfötus; gefroren, 110.
Passage<SEP>85% RPMI 1640 oder MEM + 15% FCS<3)>
<tb><SEP>4<SEP>AM-C6SC8<CEL AL=L>Schweinenieren-Zellen
DSM-ACC 152<SEP>von einem Subklon von der Zelllinie AM II, die von einer normalen Schweineniere gewonnen wurde<SEP>80% Medium 199 (Hanks-
Salze) + 20% FCS<4)>
<tb><SEP>5<SEP>BeWo<SEP>Human-Plazentazellen,
weiblich ATCC CCL 98<SEP>Waymouth's + Gay's BBS + 10% Newborn Calf Serum<5)>
<tb><SEP>6<SEP>AV 3<CEL AL=L>Human-Amnion-Zellen
ATCC CCL 21<SEP>Medium:
M199 mit Eagle's-BBS + 20% FCS<5)>
<tb><SEP>7<SEP>WISH<CEL AL=L>Human-Amnion-Zellen
ATCC CCL 25<SEP>Eagle's MEM mit Eagle's BSB + 10% FCS<5)>
<tb><SEP>8<SEP>PK (15)<CEL AL=L>Schweinenieren-Zellen ATCC CCL 33<SEP>Eagle's MEM mit Eagle's BSS + 10% FCS + Na-Pyruvat<5)>
<tb><CEL AL=L>9<SEP>B95.8<SEP>Blutzellen
Strain Marmoset
ATCC CRL 1612
ECACC 85011419<SEP>RPMI 1640 + 10% FCS +
L-Glutamin + Na-Pyruvat + nichtessentielle Aminosäuren + 2-Mercaptoethanol<6)>
<tb><SEP>10<SEP>FL<SEP>Human-Amnionzellen
ATCC CCL 62
IZSBS BSCL46<SEP>Eagle's MEM mit Earle's BSS + 10% FCS<7)>
<tb>
<1)> Madin & Darby, "Proc. Soc. Exp. Biol. Med.", 98, 574 (1958). Hinterlegung: Dr. R. Riebe, BFA, Insel, Riems, Deutschland
<2)> Fernandez, "Blood", 83, 3245-3254 (1994). Hinterlegung: E. Fernandez, Dr.
Toribio, Universität
Madrid, Spanien
<3)> Beckmann und Schöss, "Deutsche Tierärztliche Wochenschrift", 95, 283 (1988); ibid, 98, 310, Rutter und Luther, "Vet. Rec.", 114, 393 (1984). Hinterlegung: Dr. V. \ppling, Paul Ehrlich-Institut, Langen, Deutschland
<4)> Limezewski, "Mycotoxin Res.", 3, 69-76 (1987). Hinterlegung: Dr. Limezewski, Bundesanstalt für Milchforschung, Kiel
<5)> CRC-IST Ansaldo, Data Bank for Biochemical Research, Animal Cell Lines Katalog 1990 von Manniello, Parodi, Aresu, Romano, Mailand 1990
<6)> Hinterlegung: G.B. Ferrara, Servizion di Immunogenetica, Istituto Nazionale per la Ricerca,
16132 Genova, Italien
<7)> "Proc. Soc. Exp. Biol. Medicine", 94, 532 (1957): Hinterlegung: M. Ferrari, Istituto Zooprofilattico Sperimentale, 25100 Brescia, Italien.
<tb>
<tb></TABLE>
Die Extrakte werden üblicherweise durch die folgenden Kennzahlen charakterisiert:
pH-Wert, Trockenrückstand (5 h bei 105 DEG C), N-Gehalt (nach Kjeldahl), Aminosäurebestimmung: qualitativ mittels Ninhydrin und mittels Dünnschichtchromatografie (TLC), Peptidnachweis: mittels Biuret-Reagens, Protein-Freiheit (mittels Sulfosalicylsäure), Nucleinsäurekomponenten: TLC, Kohlenhydrat-Komponenten: TLC, UV-Spektrum (1:50 oder 1:100), HPLC, Sterilitätsprüfungen nach DAB 10.
Im Falle medizinischer Anwendung von Extrakten ist Prüfung auf Pyrogene im Kaninchen- bzw. LAL-Test erforderlich. Besondere Kennzahlen, die zur Charakterisierung von Extrakten herangezogen werden, sind die Hydroxyprolin-Bestimmung z.B. für Bindegewebsextrakte und pflanzliche Extrakte, wie sie aus Cyanophyten gewonnen werden können, oder wie sie im Beispiel 8 dieser Erfindung für Colla 120 beschrieben worden ist. Rogenextrakte können durch entsprechende Fettsäurebestimmungen charakterisiert werden. Der im Beispiel 9 behandelte proteinfreie Hefeextrakt lässt sich durch seine hohe Gärungssteigerungs-Aktivität im WARBURG-Versuch charakterisieren (vgl. Fig. 11). Entsprechendes gilt auch für dessen Atmungssteigerung.
Die dermatologische Verträglichkeit und die Toxikologie wurden in üblicher Weise nach folgenden Methoden geprüft:
Tabelle II
Akute Toxizitätsprüfung nach intravenöser Applikation an der Maus.
Kumulative Toxizitätsprüfung nach 7-tägiger peroraler Applikation an der Maus.
Klinisch-toxikologische Beobachtungen nach intravenöser Verabreichung bei der Maus (Screening nach R. T. Turner): 2 g/kg, 10 g/kg, 20 g/kg Maus.
Offener epikutaner Sensibilisierungstest am Meerschweinchen über 3 Wochen (nach Bühler).
Augenreiztest am Kaninchen in Anlehnung an "Appraisal of the Safety of Chemicals in Foods, Drugs and Cosmetics" von The Staff of Division of Pharmacology, FDA, Bewertung von Augen-Läsionen nach Draize, 1959.
Prüfung auf primäre Hautreizung beim Kaninchen in Anlehnung an "Appraisal of the Safety of Chemicals in Foods, Drugs and Cosmetics" von The Staff of Division of Pharmacology, FAD, Hautgiftigkeit nach Draize, 1959.
Klinisch-allergologische Prüfung im Patch-Test beim Menschen.
Ames-Test: Zur Prüfung auf mutagene Wirkung wird der Ames-Test ohne und mit metabolischer Aktivierung herangezogen: Mutagenitätsprüfung (Screening).
Abwesenheit von Viren und Prionen: Sie kann durch den Einsatz von Zellkulturen aus kompetenten Quellen garantiert werden. Die in der Beschreibungseinleitung weiter oben (S. 2) erwähnten Probleme mit frischem Organmaterial entfallen erfindungsgemäss vollkommen.
Die lege artis d.h. nach GMP (good manufacturing practice) hergestellten erfindungsgemässen Organextrakte passierten sämtliche genannten Tests problemlos - wie es auch für die bereits bekannten synthetischen Organextrakte sowie auch für die aus frischem Organmaterial gewonnen Organextrakte beobachtet worden ist, sachgemässe Produktion vorausgesetzt. Weitere Angaben sind in den weiter unten folgenden Beispielen enthalten.
Die Wirkungsweise aller oben genannten Extrakte wurde mithilfe folgender Untersuchungen verglichen und gestützt (biochemische und biologische Tests):
<tb><TABLE> Columns=3 Tabelle III
Methoden zur Prüfung der Wirkung von Organextrakten
<tb>Head Col 1: Nr.
<tb>Head Col 2: Methode
<tb>Head Col 3: Beschreibung [Lit.]
<tb><SEP>1<SEP>Messung der Steigerung der Gewebsatmung z.B. von Leberhomogenat einer Ratte oder eines Meerschweinchens im Warburg-Test zur Bestimmung des
Atmungssteigerungsfaktors (die Atmung des Leberhomogentas wird auf 1,0 festgesetzt):
Faktorangabe<SEP>ab S. 41 [Lit. 8]
<tb><SEP>2<SEP>Wachstumstest zur Beurteilung der Steigerung der Stoffwechselaktivität beispielsweise durch Messung des Wachstums von
<tb><SEP>a) Guppy-Fischen durch Längenmessung in mm nach 20 Tagen [Tp 80-100], (Kontrollwerte in runden Klammern)<SEP>S. 74/75
<tb><SEP>b) Kaulquappen von Xenopus laevis DAUDIN durch Längenmessung,
Gewichtszunahme und Vorverlegung der Metamorphose (Beginn und Ende bei der Umwandlung zum Frosch) in Tagen<SEP>S. 73-74
<tb><SEP>3<SEP>Messung der Hautglättung nach der modifizierten PADBERG-Methode unter Verwendung von 3%igen W/\-Emulsionen nach 14-tägiger Anwendung;
Messung der Fotometerwerte in % von "behandelt" im Vergleich zum Ausgangszustand (Kontrollwerte in Klammern)<SEP>ab S. 62 [Lit. 10]
<tb><SEP>4<SEP>Profillinien-Messung nach der Bildanalyse;
beurteilt werden die Profillinienflächen FA und die Linienlänge LL<SEP>ab S. 55
(vgl. auch Fig. 9)
<tb><SEP>5<SEP>Vergleich des Fibroblasten-Wachstums mittels Thymidin-Einbaurate mit und ohne Formalinschädigung; Prüfung einer Kompensation der formalingeschädigten Fibroblasten nach 6 Tagen<SEP>ab S. 71/72
<tb><SEP>6<SEP>Messung des Wasserrückhaltevermögens mittels eines Corneometers<SEP>ab S. 49
<tb><SEP>7<CEL AL=L>Patch-Test am Menschen, d.h. allergologische Prüfung<SEP>ab S. 84
<tb><SEP>8<SEP>Messung der Steigerung der Hautspannung im Wundheilungstest
nach 21 Tagen ( DELTA -Werte)<SEP>S. 39/40
<tb></TABLE>
Einige der dabei erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle IV und V zusammengestellt, die sich auf die Beispiele 1 bis 4 der vorliegenden Anmeldung beziehen.
Tabelle IV
Vergleich der Wirksamkeit der nach den Beispielen 1, 2 und 3 hergestellten Rindernieren-Extrakte la, lb und Ic
Die laufenden Nummern in der linken Spalte beziehen sich auf die in Tabelle III unter Nr. 1-8 aufgeführten Testmethoden:
<tb><TABLE> Columns=2
<tb><SEP>la:<SEP>Rindernieren-Extrakt aus der Zelllinie MDBK
<tb><SEP>lb:<SEP>Zelllinien-Extrakt la kombiniert mit einem synthetischen Rindernieren-Extrakt
<tb><SEP>lc:<SEP>Zelllinien-Extrakt la kombiniert mit einem natürlichen Rindernieren-Extrakt aus frischen Rindernieren
<tb></TABLE>
<tb><TABLE> Columns=5
<tb>Head Col 1: Nr.
<tb>Head Col 2: (gemäss Tabelle III)
<tb>Head Col 3: la
<tb>Head Col 4: lb
<tb>Head Col 5:
Ic
<tb><SEP>1<SEP>Faktor<SEP>1,9<SEP>2,4<SEP>1,7
<tb><SEP>2a<SEP>Länge in mm <CEL AL=L>22,0 (18,0)<SEP>23,2 (18,0)<SEP>21,0 (18,0)
<tb><SEP>2b<SEP>Metamorphose abgekürzt auf<SEP>6 Tage<CEL AL=L>10 Tage<SEP>4 Tage
<tb><SEP>3<SEP>70 (85)<SEP>60 (85)<SEP>70 (85)
<tb><SEP>4 <CEL CB=3 AL=L>FA + 6
LL -2,8<SEP>+10
-2<SEP>+4
-4
<tb><SEP>5<SEP>Thymidin-Einbaurate nach 6 Tagen
<tb><SEP>ohne HCHO<SEP>350 x 10<3><SEP>350 x 10<3><CEL AL=L>350 x 10<3>
<tb><SEP>mit HCHO<SEP>10 x 10<3><SEP>10 x 10<3><SEP>10 x 10<3>
<tb><SEP>mit HCHO+Zusatz von<SEP>la<SEP>lb<SEP>lc
<tb><SEP>kompensiert:<SEP>280 x 10<3><SEP>330 x 10<3><SEP>250 x 10<3>
<tb><SEP>6 <SEP>++<SEP>+++ (SEP)<+>(TB><SEP>7<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><CEL AL=L>8<SEP> DELTA -Wert<SEP>290<SEP>320<SEP>230*
<tb>
* vgl. auch Tabelle VIII auf Seite 19
<tb></TABLE>
Aus der vorstehenden Tabelle ergibt sich, dass das Optimum an Wirksamkeit erreicht wird durch die Kombination von synthetischem Extrakt mit dem aus einer Zelllinie gewonnen Extrakt: Daten unter lb.
Tabelle V
Vergleich der Wirksamkeit der nach Beispiel 4 hergestellten Amnion-Extrakte lIa und llb
Die laufenden Nummern in der linken Spalte beziehen sich auf die in Tabelle III aufgeführten Testmethoden
<tb><TABLE> Columns=2
<tb><SEP>Ila:<SEP>Amnion- Extrakt aus der Zelllinie WISH (human)
<tb><SEP>Ilb:<SEP>Zelllinien-Extrakt lIa kombiniert mit einem synthetischen Human-AmnionExtrakt
<tb></TABLE>
<tb><TABLE> Columns=4
<tb>Head Col 1: Nr.
<tb>Head Col 2: (gemäss Tabelle III)
<tb>Head Col 3: Ila
<tb>Head Col 4:
Ilb
<tb><SEP>1<SEP>2,0<SEP>2,3
<tb><SEP>2a<SEP>21,0 (17,0)<SEP>22,5 (17,0)
<tb><SEP>2b<SEP>Metamorphose abgekürzt auf<SEP>2 Tage<SEP>6 Tage
<tb><SEP>3<SEP>60 (80)<SEP>55 (80)
<tb><SEP>4<SEP>keine Messungen
<tb><SEP>5<SEP>ohne HCHO<SEP>360 x 10<3><CEL AL=L>360 x 10<3>
<tb><SEP>mit HCHO<SEP>20 x 10<3><SEP>20 x 10<3>
<tb><SEP>mit HCHO, kompensiert<CEL AL=L>280 x 10<3><SEP>340 x 10<3>
<tb><SEP>6 <SEP>++ <SEP>++
<tb><SEP>7<SEP>0<SEP>0
<tb><CEL AL=L>8<SEP> DELTA -Wert<SEP>260<SEP>300
<tb></TABLE>
Aus der vorstehenden Tabelle ergibt sich, dass eine optimale Wirksamkeit bei der Kombination (lIb) eines synthetischen Extrakts mit dem aus einer Zelllinie gewonnenen Extrakt (Ila) erreicht wird: Daten unter Ilb.
Während vorstehend vorwiegend über wasserlösliche Organextrakte aus Zelllinien entsprechender tierischer Organe, aus frischen tierischen Organen bzw. auf dem Syntheseweg gewonnenen Extrakten und Kombination davon gesprochen worden ist - vor allem in Hinsicht auf ihre kosmetische Verwendung als kosmetische Additive und in Hinblick auf ihren medizinischen Einsatz - soll im Folgenden auf pflanzliche Extrakte eingegangen werden, die ebenfalls aus entsprechenden pflanzlichen Zelllinien gewonnen werden können (vgl. auch S. 7). Hierbei wird, wie bereits erwähnt, im Allgemeinen in Suspensionskulturen gearbeitet, was am nachstehenden Beispiel von Sycamore-Zellkulturen (Acer pseudoplatanus L.) und von Hefen gezeigt werden soll (siehe auch die weiter unten folgenden Beispiele 8, 9, 10).
Die Weiterverarbeitung der in grossem Massstab gewonnenen pflanzlichen Zellmasse hängt dann sehr von dem angestrebten pflanzlichen Extrakt selbst ab. Im Falle der aus Sycamore gewonnenen Extrakte interessiert vor allem das Zellwandmaterial, das Glycoproteine in einem Protein-Kohlenhydrat-Verhältnis von ca. 50:50 enthält und dessen Proteinanteile sich durch einen hohen Gehalt an Hydroxyprolin, Serin, Glycin usw. auszeichnen und dadurch dem tierischen Kollagen nahekommen (Hydroxyprolin ist ja bekanntlich die für Kollagene typische Aminosäure, die viele Besonderheiten aufweist; Hydroxyprolin ist nicht Baustein der Proteinbiosynthese, nur Prolin).
Das Produktionsschema für einen "kollagenähnlichen Pflanzen-Extrakt" aus Sycamore-Kulturen ist in Tabelle VI dargestellt. Eine Beschreibung der Arbeitsweise findet sich in Beispiel 8.
<tb><TABLE> Columns=3 Tabelle VI
Schema der Gewinnung eines Pflanzenextrakts (Colla 120) aus Sycamore-Zellkulturen (Acer pseudoplatanus L.) und Verwendung als pflanzliches kosmetisches Additiv im Sinne von Kollagen-Ersatz
<tb><SEP>1) <SEP>Gewinnung von Sycamore-Pflanzenmaterial aus Suspensionkulturen:
<tb><SEP>Sycamore in Zellkultursuspension (50 ml)
<tb><CEL CB=3 AL=L> &darr&
<tb><SEP>Vermehrung nach der Rotary-Shaker-Technik (500 ml)
<tb><SEP> &darr&
<tb><CEL CB=2 CE=3 AL=L>in Suspensionskulturflaschen (Bekkico Glass Inc.) (5-20 L)
<tb><SEP> &darr&
<tb><SEP>in 50 L bis 4000 L-Fermentern oder in 2000 L Rohrschlangen-Kultivatoren
<tb><SEP> &darr&
<tb><SEP>Ernte von Sycamore-Zellmaterial als Pulver bzw.
Suspension
<tb><CEL AL=L>2)<CEL CB=2 CE=3 AL=L>Zellwand-Brechen:
<tb><SEP> &darr&
<tb><SEP>suspendiertes Sycamore-Zellmaterial im Kilowatt-Ultrasonic-Generator zerbrochen
<tb><SEP> &darr&
<tb><SEP>Zentrifugieren des aufgeschlossenen Materials und Waschen mit Wasser
<tb><SEP> &darr&
<tb><SEP>3)<SEP>Splitting und Deproteinisierung:
<tb><CEL CB=3 AL=L> &darr&
<tb><SEP>durch chemische und enzymatische Partialhydrolysen
<tb><SEP> &darr&
<tb><CEL CB=2 CE=3 AL=L>Konzentration im Vakuum auf 10- bis 15%igen Extrakt
<tb><SEP> &darr&
<tb><SEP>Einsatz als kosmetisches Additiv analog Kollagen in Cremes, Lotionen, Masken und dgl.
<tb></TABLE>
In ähnlicher Weise kann auch vorgegangen werden, wenn von Solanum tuberosum, und zwar einem tetraploiden Stamm in Suspensions-Kulturen ausgegangen wird.
Das Molekulargewicht der erhaltenen kosmetischen Additive liegt unter 3000. Feuchtigkeitshaltevermögen und andere kosmetische Effekte dieser Hydrolysate dürften mit den darin enthaltenen niedermolekularen Peptiden zusammenhängen, beispielsweise mit Oligopeptiden, entsprechend DE-OS 4 127 790 oder konstitutionell ähnlichen Derivaten.
Die erfindungsgemässen Organextrakte und/oder ihre Kombinationen lassen sich nicht nur kosmetisch und medizinisch nutzen. Es gibt weitere Anwendungsmöglichkeiten, wenn man bedenkt, dass die als Atmungssteigerung (oder durch andere Systeme) nachweisbare Zellstoffwechselaktivierung gleichzeitig eine Aktivierung des Sauerstoffs bedeutet sowie, damit zusammenhängend, auch eine Beeinflussung radikalbildender Systeme (Radikalfängerwirkung). Infolgedessen war der Einfluss von Organextrakten der verschiedenen Art auch in Bereichen zu erwarten, wo eine Stabilisierung und Haltbarmachung erwünscht ist. Entsprechende Versuche mit Farbanstrichen und gefärbten Geweben haben positive Effekte gezeigt:
Farbanstriche von Farblösungen, denen tierische oder pflanzliche Extrakte oder Extraktgemische gemäss der Erfindung zugefügt worden sind, gegebenenfalls aufkonzentriert auf 10-15% Feststoff und gegebenenfalls unter Zusatz von Lösungsvermittlern oder Lösungsmitteln, erwiesen sich in mehrjährigen Dauerversuchen sowie auch in Modellversuchen unter UV-Bestrahlung als farbbeständiger als die Kontrollversuche ohne Zusätze. Entsprechende Ergebnisse sind auch mit eingefärbten Geweben und Autolacken auf Wasserbasis verschiedener Art erzielt worden: längere Beständigkeit der Farben und weniger empfindlich gegen Auswaschen. Besonders gute Effekte sind mit den im weiter unten folgenden Beispiel 11 genannten Extrakten erzielt worden.
Die für biologische Systeme ermittelte Radikalfängerwirkung der erfindungsgemässen pflanzlichen und tierischen Organextrakte dürfte auch bei den oben beschriebenen Effekten eine Rolle spielen. Es sei hier nachdrücklich auf die im weiter unten folgenden Beispiel 10 beschriebenen Modellversuche über die Radikalfängerwirkung von Hydroxyl-Radikalen auf Hyaluronsäure und ihre Hemmung durch die Organextrakte verwiesen (vgl. Fig. 12).
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.
Beispiel 1
Herstellung eines Rindernieren-Extrakts aus der Zelllinie MDBK
1.1 Bereitstellung der Zellmaterials
1.2 Extraktion und Aufarbeitung zum eiweissfreien bzw. eiweisshaltigen Rindernieren-Extrakt
Ad 1.1
Als Ausgangsmaterial zur Herstellung eines Rindernieren-Extrakts dient die Zelllinie MDBK (DSM ACC 174).
Die Zellen stammen von einer Niere eines normal ausgewachsenen Stiers aus dem Jahre 1957. Die Zellen sind BVD-frei. Es handelt sich dabei um adhärente epithelähnliche Zellen.
Als Kulturmedium ist vorgeschrieben: 95% Dulbecco's + 5% FCS.
Für die Subkultur-Routine gilt: optimale Teilungsrate 1:4 bis 1:6 mit Trypsin/EDTA. Die Zellen wachsen innerhalb von 2 bis 3 Tagen zusammen. Aussaat: (2-4) x 10<5> Zellen/80 cm<2>; Ernte (4-6) x 10<6> Zellen/80 cm<2>; 5% CO2, 37 DEG C.
Ausgehend von der gefrorenen Zellkultur der Linie MDBK wird diese zunächst im Wasserbad bei 30 DEG C aufgetaut und in ein 15-ml-Röhrchen überführt. Es werden 10 ml vorgewärmtes Kulturmedium hinzugegeben, damit vermischt, bebrütet (37 DEG C, 5% CO<2>). Nach der Ausbildung des Zellrasens wird in folgender Weise weitergearbeitet unter Vermeidung von Zentrifugationen, um Zellschädigungen zu vermeiden:
Dekantieren des Mediums, einmaliges Waschen des Zellrasens mit einem Phosphatpuffer, Benetzung des Zellrasens mit Trypsin/EDTA (1 ml pro 25-cm<2>-Flasche) durch 3- bis 4-maliges Schwenken der Zellkulturflasche, Absaugen von Trypsin, 2 bis 3 min lnkubieren bei 37 DEG C;
nach Ablösung des Zellrasens (leichtes Schütteln oder Klopfen an das Kulturgefäss) werden die Zellen in komplettem Medium aufgenommen;
die erwünschte Zellkonzentration von 4 x 10<5> Zellen pro 80 cm<2> wird durch mikroskopische Auszählung und entsprechende Verdünnung hergestellt.
In dieser Weise wird in einer grösseren Anzahl von Flaschen das Ausgangsmaterial für eine Grosskultur von Zellen auf Oberflächen bereitgestellt.
Es wird mit einem Perfusionssystem mit fester Matrix nach McCoy, Wittle, Conway und Weiss [Lit. 6], Schleicher, Weiss [Lit. 2] aus den Abott-Laboratorien weiter gearbeitet.
Die Kulturoberflächen bestanden aus Schichten übereinander gesetzter Titanplatten, die von einem Stützgestell innerhalb des Kulturgefässes zusammengehalten werden (vgl. Fig. 4). Es kann eine einfache Luftpumpe verwendet werden.
Die Apparatur wird beimpft mit einer Zellsuspension, die aus den Kulturflaschen eingepumpt wird. Die Apparatur wird dann - immer alles unter streng sterilen Bedingungen - mit einem sterilen CO2-Luft-Gemisch mithilfe der Luftpumpe beschickt, um die Zellen gleichmässig zu verteilen. Die CO2-haltige Luftzufuhr wird 2 h lang gestoppt, damit sich die Zellen absetzen können, dann wird das Beschicken fortgesetzt. Sobald eine ausreichende Zelldichte erreicht ist (siehe Ernte), wird das Kulturmedium abgepumpt und durch eine Trypsin-Lösung ersetzt. Nach einer Inkubation kann die Zellsuspension aus der Apparatur herausgepumpt werden. Bei jedem Zyklus werden bis zu 20 g Zellmaterial gewonnen.
Parallel dazu wurde auch nach der Plastik-Film-Kultur-Methode im grosstechnischen Massstab gearbeitet.
Auf diese Weise war es kein Problem, innerhalb einer verhältnismässig kurzen Zeit 10 kg Rindernierenzellen zu züchten, die dann zur Extraktgewinnung weiterbehandelt wurden, wobei man wie mit frischem Rindernieren-Organmaterial nach dem Waschen und Zerkleinern in Kolloidmühlen verfährt.
Ad 1.2
10 kg aufgetautes Zellmaterial gemäss Abschnitt 1.1 werden in Ethylether suspendiert und etwa 10 Tage lang bei -20 DEG C im Kälteraum stehen gelassen. Nach dem Zentrifugieren in einer geeigneten Apparatur, beispielsweise einer explosionssicheren Trommelzentrifuge, werden 4 l Rohextrakt erhalten, die zur weiteren Reinigung zunächst filtriert, mindestens zweimal intensiv ausgeethert und dann gegen eine 0,3% Nipagin enthaltende Lösung dialysiert werden.
Etherreste lassen sich aus dem Dialysat (Aussenlösung) durch Stickstoff-Durchblasen bei pH 7,2 entfernen. Das Dialysat ist ein eiweissfreier Rindernieren-Extrakt. In den Dialyseschläuchen befindet sich ein eiweisshaltiger Rindernieren-Extrakt.
Die Ausbeute an eiweissfreiem Rindernieren-Extrakt la betrug 25 L. Eine Ultrafiltration des Extrakts la ist nicht erforderlich, da das Ausgangsmaterial BSE-frei war und keine Prionen enthielt.
Der mit einem 0,2 mu m-(Millipore< TM >)-Filter sterilfiltrierte Rindernieren-Extrakt la hat nach der pH-Wert-Einstellung die folgenden Kennzahlen:
<tb><TABLE> Columns=3
<tb><SEP>pH-Wert<SEP>6,8
<tb><SEP>Trockenrückstand<SEP>7 mg/ml
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>N-Gehalt (Kjeldahl) (SEP)<>0,03%
<tb><SEP>Aminosäuren (Ninhydrin)<SEP>positiv
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>Peptide (Biuret)<SEP>positiv
<tb><SEP>Proteine<SEP>negativ
<tb><SEP>Stoffwechselaktivität:
<tb><SEP>Atmungssteigerungsfaktor nach Warburg (Homogenat, Ratte)
<SEP>1,9
<tb><SEP>Schwermetalle<SEP><10 ppm
<tb><SEP>Arsen<SEP><2 ppm
<tb><SEP>Sterilität<SEP>keimfrei sowie frei von Hormonen, Prionen und Viren
<tb></TABLE>
Beispiel 2
Kombination eines wässrigen synthetischen Rindernieren-Extrakts mit einem aus der Zelllinie MDBK nach Beispiel 1 hergestellten Rindernieren-Extrakt
5 L des nach Beispiel 1 hergestellten sterilen eiweissfreien Rindernieren-Extrakts la werden mit 19,8 L wässrigem synthetischem Rindernieren-Extrakt, hergestellt nach EPA 92 250 349.5, kombiniert, nach pH-Wert-Einstellung auf 6,8 auf 25 L aufgefüllt und mit einem 0,2 mu m-(Millipore< TM >)-Filter sterilfiltriert (kombinierter Rindernieren-Extrakt lb).
Die Herstellung von 20 l wässrigem synthetischem Rindernieren-Extrakt wurde wie folgt durchgeführt:
Die in der folgenden Tabelle angegebenen Bestandteile wurden unter sterilen Bedingungen und unter Rühren in 8 L bidestilliertem Wasser gelöst, wobei der pH-Wert der Lösung während der Herstellung zwischen 6,0 und 7,5 gehalten wurde (Teillösung I, deren pH-Wert zum Schluss auf 6,7 eingestellt wurde).
Tabelle VII
Zur Herstellung der Teillösung I werden in 8 L bidestilliertem Wasser gelöst (die angegebenen Mengen sind für eine Endlösung von 20 L berechnet):
<tb><TABLE> Columns=2
<tb><SEP>L-Glutaminsäure<SEP>6,0 g
<tb><SEP>D-Ornithin<SEP>1,6
<tb><SEP>L-Asparaginsäure<CEL AL=L>3,0
<tb><SEP>L-Tyrosin<SEP>0,6
<tb><SEP>L-Hydroxyprolin<SEP>4,0
<tb><SEP>Kreatinin<CEL AL=L>0,2
<tb><SEP>L-Isoleucin<SEP>0,02
<tb><SEP>L-Leucin<SEP>1,0
<tb><SEP>Cystein<CEL AL=L>0,04
<tb><CEL AL=L>Glycin<SEP>12,0
<tb><SEP>L-Serin<SEP>6,0
<tb><SEP>L-Lysin<SEP>7,0
<tb><SEP>Harnstoff<CEL AL=L>1,6
<tb><SEP>L-Histidin<SEP>1,2 g
<tb><SEP>L-Asparagin<SEP>1,0
<tb><SEP>L-Valin<CEL AL=L>1,0
<tb><SEP>DL-Threonin<SEP>0,8
<tb><SEP>L-Phenylalanin<SEP>0,8
<tb><SEP>L-Methionin<CEL AL=L>0,4
<tb><SEP>L-Tryptophan<SEP>0,4
<tb><SEP> beta -Alanin<SEP>0,7
<tb><SEP>L-Alanin<CEL AL=L>4,8
<tb><CEL AL=L>L-Prolin<SEP>4,8
<tb><SEP>L-Arginin<SEP>7,0
<tb><SEP>Hippursäure<SEP>0,02
<tb><SEP>Adenin<SEP>0,4 g
<tb><SEP>Guanin<SEP>0,2
<tb><SEP>Hypoxanthin<SEP>0,4
<tb><CEL AL=L>Uracil<SEP>0,
4
<tb><SEP>Harnsäure<SEP>0,02
<tb><SEP>AMP<SEP>0,2
<tb><SEP>Glucose<CEL AL=L>3,0
<tb><SEP>Adenosin<SEP>0,4 g
<tb><SEP>Cytosin<SEP>0,6
<tb><SEP>Inosin<CEL AL=L>2,0
<tb><CEL AL=L>Uridin<SEP>0,6
<tb><SEP>Orotsäure<SEP>0,02
<tb><SEP>Sorbit<SEP>40,0
<tb><SEP>Cytidin<CEL AL=L>0,8 g
<tb><SEP>Guanosin<SEP>0,4
<tb><SEP>Thymin<SEP>0,8
<tb><SEP>Xanthin<SEP>0,2
<tb><CEL AL=L>Cycl.
AMP<SEP>0,8
<tb><SEP>Mannit<SEP>3,0
<tb><SEP>Bernsteinsäure<SEP>30,0 g
<tb><CEL AL=L>Ethanol<CEL AL=L>40 ml
<tb><SEP>Apfelsäure<SEP>0,2 g
<tb><SEP>Citronensäure<SEP>2,0 g
<tb><CEL AL=L>Benzylalkohol<SEP>3 ml
<tb><SEP>Thiamindichlorid<SEP>0,04 g
<tb><SEP>Ca-pantothenat<CEL AL=L>0,04
<tb><SEP>Pyridoxol HCI<SEP>0,08
<tb><SEP>Tocopherolsuccinat<SEP>0,08
<tb><SEP>Panthenol<SEP>20,0
<tb><SEP>Mg-aspartat<CEL AL=L>0,4
<tb><SEP>Mn-gluconat<SEP>0,2
<tb><SEP>N-Methylglucamin<SEP>8,0
<tb><CEL AL=L>p-Hydroxybenzoesäuremethylester Na-Salz<SEP>14
<tb><SEP>Nikotinsäureamid<SEP>0,2
<tb><CEL AL=L>myo-Inosit<SEP>1,0
<tb><SEP>Biotin<SEP>0,2
<tb><SEP>MgSO47H2O<SEP>2,0
<tb><SEP>Co-gluconat<CEL AL=L>0,01
<tb><SEP>NaH2PO4H2O<SEP>1,0
<tb><SEP>Na-Iaktat 50%ig<SEP>20,0
<tb></TABLE>
Parallel dazu wurde eine Teillösung II hergestellt, indem eine aus Soja, Mais und partiell dehydratisierter Hefe im Gewichtsverhältnis 1:1:10 gewonnene Peptonmenge von insgesamt 80 g zur Desodorierung und Entfärbung in 9 L bidestilliertem Wasser unter starkem Rühren gelöst und über Nacht mit 15 g frischer Aktivkohle behandelt wurde.
Die so erhaltene Lösung wurde nach dem Abnutschen und Sterilfiltrieren durch ein 0,2 mu m-(Millipore< TM >)-Filter mit der Teillösung I vereinigt. Anschliessend wurden dem Ansatz die synthetischen Peptidfragmente Glutathion (180 mg) und Gly-His-Lys (2,3 mg) sowie 0,2 mg H-Asp-Arg-Val-Tyr-lle-His-Pro-Phe-His-Leu-Leu-Val-Tyr-Ser-OH + 0,08 mg H-Arg-Lys-Glu-Val-Tyr-OH + 5 ml Renin-Hydrolysat hinzugefügt und nach der pH-Wert-Einstellung auf 20 L aufgefüllt, mit einem 0,2 mu m-Filter sterilfiltriert und analysiert:
<tb><TABLE> Columns=2
<tb><SEP>pH-Wert<SEP>6,7
<tb><SEP>Trockenrückstand<SEP>1,6%
<tb><SEP>N-Gehalt (Kjeldahl) (SEP)<> 0,05%
<tb><SEP>Warburg-Faktor (Atmungssteigerung)<SEP>2,0
<tb><SEP>Aminosäuren (Ninhydrin)<SEP>positiv
<tb><CEL AL=L>Peptid (Biuret)<SEP>positiv
<tb><SEP>Schwermetalle<SEP>< 10 ppm
<tb><SEP>Arsen<SEP>< 2 ppm
<tb><SEP>Sterilität<SEP>keimfrei
<tb></TABLE>
Bei der Herstellung der Teillösung I ist zu beachten, dass von den in der Tabelle I genannten Bestandteilen die Aminosäuren L-Glu, L-Asp, L-Val, L-Tyr, L-Phe, L-Isoleu in 2 n NAOH vorgelöst werden müssen. Anschliessend erfolgt dann die Zugabe der Carbonsäuren, Citronensäure, Bernsteinsäure und Apfelsäure. Nach der pH-Wert-Einstellung auf 6,4 werden die anderen Komponenten zugegeben. Die Bestandteile Xanthin und Guanin müssen in 3 n NAOH bzw. 3 n HCI vorgelöst und vor der Zugabe neutralisiert werden.
Über eine technische Anwendung eines synthetischen Rindernieren-Extrakts, der nur aus Teillösung I und II besteht, konserviert, aber nicht sterilfiltriert ist, vgl. das weiter unten folgende Beispiel 11.
Entsprechendes gilt für den im folgenden Beispiel 3 beschriebenen, aus frischen Rindernieren hergestellten konservierten, aber nicht dialysierten Roh-Extrakt.
Beispiel 3
Kombination eines aus frischen Rindernieren hergestellten Extrakts mit einem aus der Zelllinie MDBK nach Beispiel 1 hergestellten Rindernieren-Extrakt
5 L des nach Beispiel 1 hergestellten sterilfiltrierten Rindernieren-Extrakts la werden mit 19,8 L wässrigem Rindernieren-Extrakt kombiniert, der wie nachstehend beschrieben aus frischen Rindernieren hergestellt worden ist. Nach der pH-Wert-Einstellung auf 6,8 wird auf 25 L aufgefüllt und mit einem 0,2- mu m-Filter sterilfiltriert, wobei man den kombinierten Rindernieren-Extrakt Ic erhält.
Der Rindernieren-Extrakt aus frischen, gewaschenen, zerkleinerten Rindernieren von BSE-freien Herden wurde wie folgt hergestellt:
Die vorbereiteten und zerkleinerten (zuletzt in einer Kolloidmühle) Rindernieren werden in Ethylether suspendiert und etwa 10 Tage lang bei -20 DEG C im Kälteraum belassen. Nach dem Zentrifugieren in einer geeigneten Apparatur, beispielsweise einer (explosionssicheren) Trommelzentrifuge, werden aus 100 kg Rindernieren etwa 25 L wässriger Rohextrakt erhalten. Dieser wird zur weiteren Reinigung zunächst filtriert, mindestens zweimal intensiv ausgeethert und dann gegen eine 0,3% Nipagin enthaltende Lösung dialysiert.
Nach 4-tägigem Stehenlassen bei 5 DEG C wird das aussen stehende eiweissfreie Dialysat durch Hindurchleiten von Stickstoff bei pH 7,2 von letzten Etherspuren befreit und nach erneuter Einstellung des pH-Wertes auf 6,8 ultrafiltriert (Filtron, Centrasette, Typ OMEGA, NMWL 8K).
Dieses eiweissfreie sterile Dialysat ist der Rindernieren-Extrakt, der mit dem Zelllinien-Extrakt la kombiniert wird unter Bildung des kombinierten Rindernieren-Extrakts Ic.
Der in den Dialyseschläuchen befindliche eiweisshaltige Rindernieren-Extrakt kann anderweitig Verwendung finden, beispielsweise um nach partieller Hydrolyse zu Rindernieren-Peptiden zu gelangen, die für die Herstellung von synthetischen Extrakten von Bedeutung sind. Der im Dialyseschlauch verbleibende Rindernieren-Extrakt, sein Dialysat und eine Kombination Ic sind auf Radikalfängerwirkung geprüft worden, wobei in allen Fällen positive Ergebnisse erzielt worden sind (vgl. das weiter unten folgende Beispiel 10 und Fig. 12).
Für den kombinierten Rindernieren-Extrakt Ic sind folgende Kennzahlen ermittelt worden: <SEP>
<tb><TABLE> Columns=3
<tb><SEP>pH-Wert<SEP>6,8
<tb><SEP>Trockenrückstand<SEP>8 mg/ml
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>N-Gehalt (Kjeldahl) (SEP)<>0,03%
<tb><SEP>Aminosäuren (Ninhydrin)<SEP>positiv
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>Peptide (Biuret)<SEP>positiv
<tb><SEP>Proteine<SEP>proteinfrei
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>Stoffwechselaktivität:
<tb><SEP>Atmungssteigerungsfaktor
(Leber-Homogenat, Ratte)<SEP>1,7
<tb><SEP>Sterilität<SEP>keimfrei
<tb></TABLE>
Das zur Kombination zur Herstellung des kombinierten Extrakts lc verwendete eiweissfreie Dialysat hatte einen Warburg-Faktor von 1,55.
Mit den nach Beispiel 1, 2 und 3 hergestellten Rindernieren-Extrakten verschiedener Art sind umfangreiche Wirksamkeitsprüfungen durchgeführt worden, über deren Ergebnisse in Tabelle IV (nach dem Schlüssel der Tabelle III) zusammenfassend berichtet worden ist.
Unter anderem waren zur Demonstration der Wirksamkeit des erfindungsgemässen Extraktes Wundheilungsversuche bei Ratten gemäss DE-PS 3 711 054 sowie anschliessend Hautspannungsmessungen durchgeführt worden (vgl. auch EP-A-0 552 516, Tabelle 11). Diese Ergebnisse sind in Tabelle VIII aufgeführt:
<tb><TABLE> Columns=4 Tabelle VIlI
<tb>Head Col 1: Zeit nach dem Setzen
der Wunde
<tb>Head Col 2: Versuchsgruppe
<tb>Head Col 3: Kontrollgruppe
<tb>Head Col 4:
Differenz DELTA
<tb><SEP>a) Rindernieren-Extrakt nach Beispiel 1 (la), hergestellt aus Zelllinie MDBK
<tb><SEP>5 Tage<SEP>240<SEP>142<SEP>98
<tb><SEP>12 Tage<SEP>490<SEP>412<CEL AL=L>78
<tb><SEP>21 Tage<SEP>1630<SEP>1340<SEP>290*
<tb><SEP>b) Rindernieren-Extrakt nach Beispiel 2 (1b), hergestellt durch Kombination von Zelllinien-Extrakt mit synthetischem Rindernieren-Extrakt
<tb><SEP>5 Tage<SEP>250<SEP>140<SEP>110
<tb><SEP>12 Tage<SEP>530<CEL AL=L>429<CEL AL=L>101
<tb><SEP>21 Tage<SEP>1800<SEP>1480<SEP>320*
<tb><SEP>c) Rindernieren-Extrakt nach Beispiel 3, hergestellt aus Zelllinien-Extrakt und natürlichem Rindernieren-Extrakt aus frischen Rindernieren
<tb><SEP>5 Tage<SEP>190<SEP>110<SEP>80
<tb><SEP>12 Tage<SEP>460<CEL AL=L>390<CEL AL=L>70
<tb><SEP>21 Tage<SEP>1530<SEP>1300<SEP>230*
<tb>
* Werte in Tabelle IV unter Nr. 8
<tb></TABLE>
Die in der Tabelle VIII aufgeführten Ergebnisse der Hautspannungsmessungen dokumentieren die überlegene Wirksamkeit der erfindungsgemässen Präparate unter a) und b) und in allen Fällen gegenüber den Kontrollgruppen.
Die in Tabelle IV unter Nr. 1 und alle weiteren in der Anmeldung angegebenen Atmungssteigerungs-Faktoren sind nach folgender Arbeitsvorschrift über "Wirksamkeitsprüfung von Testlösungen auf Atmungssteigerung im Rattenleberhomogenat (Warburg-Methode)" gewonnen worden [Lit. 8].
Methode und Arbeitsplan
A. Lösungen
1. Sörensen-Puffer, pH 7,4 aus 80,4 ml einer Lösung von 11,87 g Na2HPO4.2H2O/l und 19,6 ml einer Lösung von 9,08 g KH2PO4/l.
Nach Zusammengeben der genannten Lösungsmengen wird der pH-Wert überprüft und, falls erforderlich, durch Zusatz der einen oder anderen Lösung korrigiert.
2. Rattenleberhomogenat: Einer 24-h-Hungerratte wird nach Dekapitation und Ausbluten die Leber entnommen und sofort auf Eis gekühlt. Nach dem Waschen und Abtrocknen mit Zellstoff werden 6 g zerkleinerte Leber im Homogenisator nach Potter-Elvehjem mit leicht gängigem Teflonpistill auf 30 ml mit gekühltem Sörensenpuffer aufgefüllt und unter Eiswasserkühlung für 2 bis 3 min homogenisiert. Das fertige Homogenat lässt man für ca. 3 min unter Eiskühlung stehen, um die beim Homogenisieren eingequirlte Luft entweichen zu lassen.
3. KOH 6n
4. Testlösungen, z.B. die Rindernieren-Extrakte la, lb und Ic siehe Tabelle IV u.a.
5. Aqua dest.
B. Versuchsdurchführung
Kegelförmige Warburg-Gefässe mit einem Zylindereinsatz (ZE) und einem Seitenarm (SA) und einem Volumen von ca. 13 ml werden wie folgt gefüllt:
<tb><TABLE> Columns=6 Füllplan, die Angaben erfolgen in ml
<tb>Head Col 1: Gläser-Nr.
<tb>Head Col 3 AL=L: 1/2
<tb>Head Col 2: 3/4
<tb>Head Col 3: 5/6
<tb>Head Col 4: 7/8
<tb><SEP>Lösung<SEP>Füllort
<tb><SEP>1<SEP>HR*)<SEP>3,0<SEP>1,5<CEL AL=L>3,0<CEL AL=L>1,5
<tb><SEP>5<SEP>SA<SEP>0,25<SEP>0,25<SEP>- (SEP)<->(TB><SEP>4<SEP>SA<SEP>-<CEL AL=L>-<SEP>0,25<SEP>0,25
<tb><SEP>3<SEP>ZE<SEP>0,2<SEP>0,2<SEP>0,2<SEP>0,2
<tb><CEL AL=L>2<SEP>HR<SEP>-<SEP>1,5<SEP>-<SEP>1,5
<tb><SEP>*) HR = Hauptraum
<tb></TABLE>
Die Lösungen werden in der angegebenen Reihenfolge einpipettiert. Zur Erhöhung der KOH-Oberfläche werden in die Zylindereinsätze gefaltete Filterstreifen eingesetzt. Sofort nach Beendigung der Füllung werden die Gefässe mit den passenden Schlauchventilstopfen am Seitenarmansatz dicht verschlossen, die Gefässe an den Manometern befestigt und mit Klammern oder Paketgummis gesichert. Die Manometer werden bei geöffneten Hähnen in die auf 37 DEG C temperierte Apparatur eingehängt und 60 Minuten geschüttelt, um die Reaktionslösung zu temperieren und die anfänglich sehr schnelle Atmung abklingen zu lassen.
Danach werden die rechten Manometerschenkel mithilfe des Quetschhahns auf die Marke "5" eingestellt, die Differenz der linken Schenkel zu "15" notiert, die Manometerhähne geschlossen und die Lösungen aus den Seitenarmen durch Kippen in die Haupträume überführt (0-Zeit). Nach je 20 Minuten wird die Schüttelvorrichtung abgestellt, die rechten Manometerschenkel auf "15" eingestellt (V = konst.) und die Differenz der linken Schenkel zu "15" notiert.
Der Versuch läuft bis zu einer Messdauer von 100 Minuten. Sollte in einigen Gläsern der Sauerstoffverbrauch so gross sein, dass die Manometerlänge nicht ausreicht, wird rechtzeitig ein Druckausgleich geschaffen, indem man sofort nach der Ablesung den Manometerhahn öffnet, den rechten Schenkel wieder auf "15" einstellt, die Differenz des linken Schenkels zu "15" notiert und den Manometerhahn sofort wieder schliesst. Nach der letzten Ablesung werden die Manometerhähne geöffnet und die Volumen der Gefässe und der dazugehörigen Manometer notiert.
C. Auswertung
Zunächst werden die Gefässe 3/4 und 7/8 mit den entsprechenden Thermobarometern (TB: Gefäss 1/2 bzw. 5/6) abgeglichen, um Luftdruck- und Temperaturschwankungen während des Versuches auszugleichen. Danach werden die Gefässkonstanten für O2 der Gläser 3/4 und 7/8 nach folgender Gleichung berechnet:
EMI43.1
Vg = Volumen der Gasphase (Volumen des Gefässes und des Manometers bis zur Marke "15" abzüglich Vf). Vf = Volumen der im Gefäss enthaltenen Gesamtflüssigkeit. T = Versuchstemperatur in DEG K. alpha = Bunsenscher Absorptionskoeffizient (O2 37 DEG C = 0,0239).
P0 = 1 atm, gemessen in mm Brodie'sche Lösung (Manometerfüllung) bei 0,1 MPa (760 mm Hg) = 10 000 Brodie'sche Lösung.
Der verbrauchte Sauerstoff kann nun direkt nach der Gleichung
X ( mu l O2) = h . k
berechnet werden, da die durch die Atmung entstandene Kohlensäure durch die KOH vollständig absorbiert wurde (h = manometrische Differenz). Dividiert man die verbrauchten mu l O2 der Gläser 7/8 durch die der Gläser 3/4, so erhält man einen Faktor, der das Mass der Atmungssteigerung darstellt. [Lit. 8].
Beispiel 4
Herstellung eines wässrigen Amnion-Extrakts durch Kombinieren eines Extrakts aus der Zelllinie WISH mit einem synthetischen Amnion-Extrakt analog zu EPA 0 522 516
4.1 Bereitstellung des Zellmaterials, ausgehend von der Amnion-Zelllinie WISH (human)
4.2 Extraktion des Amnion-Zellmaterials und Aufarbeitung zu einem eiweissfreien Amnion-Extrakt Ila
4.3 Herstellung eines synthetischen Amnion-Extrakts gemäss EP-A-0 522 516
4.4 Kombination der beiden Amnion-Extrakte zu dem Extrakt lIb
4.5 Testversuche mit Ila und lIb.
Ad 4.1
Als Ausgangsmaterial zur Herstellung des Amnion-Extrakts diente die Zelllinie WISH, ATCC CCL 25, IZSBS BS C192.
Als Kulturmedium ist vorgeschrieben: Eagle's MEM mit Earle's BSS + 10% FCS (Einzelheiten sind zu finden in "Exp. Cell. Res.", 23, 14 (1961)).
Es wurde verfahren wie in Beispiel 1.1 beschrieben. Hinsichtlich der Herstellung einer Grosskultur wurde nach der Plastik-Film-Kultur-Methode im Grossmassstab gearbeitet. Das gewonnene Zellmaterial wurde bis zur Weiterverarbeitung tiefgefroren.
Ad 4.2
1 kg aufgetautes Zellmaterial gemäss 4.1 wird in Ethylether suspendiert und 12 Tage lang bei -20 DEG C im Kälteraum stehen gelassen. Der durch Zentrifugieren erhaltene Rohextrakt wird vor der Weiterverarbeitung filtriert, mehrmals intensiv mit Diethylether (hier stets "Ether" genannt) und/oder Chloroform behandelt und dann gegen eine 0,3% Nipagin enthaltende Lösung dialysiert. Das eiweissfreie Dialysat wird ultrafiltriert (FILTRON< TM >): Ausbeute 2,4 L.
Die analytischen Daten des erhaltenen Amnion-Extrakts Ila sind folgende:
<tb><TABLE> Columns=2
<tb><SEP>pH-Wert<SEP>6,7
<tb><SEP>Trockenrückstand<SEP>1,0%
<tb><SEP>N-Gehalt (Kjeldahl)<CEL AL=L>0,02%
<tb><SEP>Aminosäure<SEP>positiv
<tb><SEP>Proteine<SEP>negativ
<tb><SEP>Peptide<CEL AL=L>positiv
<tb><SEP>Atmungssteigerungsfaktor<SEP>2,0
<tb><SEP>Sterilität<SEP>keimfrei
<tb></TABLE>
Ad 4.3
Die Herstellung des synthetischen Amnion-Extrakts erfolgt auf folgende Weise:
Die in der folgenden Tabelle aufgezählten Bestandteile werden unter sterilen Bedingungen und unter Rühren in 300 ml bidestilliertem Wasser gelöst zur Herstellung der Teillösung I mit einem pH-Wert von 6,7.
Tabelle IX
Zur Herstellung der Teillösung I werden in 300 ml bidestilliertem Wasser die folgenden Komponenten gelöst (die angegebenen Mengen sind für eine Endlösung von 1000 ml berechnet).
<tb><TABLE> Columns=2
<tb><SEP>L-Glutaminsäure<SEP>0,3 g
<tb><SEP>L-Histidin<SEP>0,06 g
<tb><SEP>L-Ornithin<SEP>0,08 g
<tb><SEP>L-Asparagin<SEP>0,05 g
<tb><SEP>L-Asparaginsäure<SEP>0,15 g
<tb><SEP>L-Valin<SEP>0,05 g
<tb><SEP>L-Tyrosin<SEP>0,03 g
<tb><SEP>DL-Threonin<SEP>0,04 g
<tb><SEP>L-Hydroxyprolin<SEP>0,2 g
<tb><SEP>L-Phenylalanin<SEP>0,04 g
<tb><SEP>Kreatinin<SEP>0,01 g
<tb><SEP>L-Methionin<SEP>0,02 g
<tb><SEP>L-Isoleucin<SEP>0,001 g
<tb><SEP>L-Tryptophan<SEP>0,02 g
<tb><SEP>L-Leucin<SEP>0,05 g
<tb><SEP> beta -Alanin<SEP>0,035 g
<tb><SEP>Cystein<SEP>0,2 g
<tb><SEP>L-Alanin<SEP>0,24 g
<tb><CEL AL=L>Glycin<SEP>4,0 g
<tb><SEP>L-Prolin<SEP>0,24 g
<tb><SEP>L-Serin<SEP>0,
26 g
<tb><CEL AL=L>L-Arginin<CEL AL=L>0,3 g
<tb><SEP>L-Lysin<SEP>0,3 g
<tb><SEP>Harnstoff<SEP>0,8 g
<tb><SEP>Adenin<SEP>0,02 g
<tb><SEP>Adenosin<SEP>0,02 g
<tb><SEP>Cytidin<SEP>0,04 g
<tb><CEL AL=L>Guanin<SEP>0,01 g
<tb><SEP>Cytosin<SEP>0,03 g
<tb><SEP>Guanosin<SEP>0,02 g
<tb><CEL AL=L>Hypoxanthin<SEP>0,02 g
<tb><SEP>lnosin<SEP>0,1 g
<tb><SEP>Thymin<SEP>0,04 g
<tb><CEL AL=L>Uracil<CEL AL=L>0,02 g
<tb><SEP>Uridin<SEP>0,03 g
<tb><SEP>Xanthin<SEP>0,01 g
<tb><SEP>Orotsäure<SEP>0,001 g
<tb><SEP>cyclisches AMP<SEP>0,04 g
<tb><SEP>Adenosinmonophosphat<SEP>0,01 g
<tb><SEP>Glucose<CEL AL=L>0,45 g
<tb><SEP>Sorbit<SEP>4,0 g
<tb><SEP>Mannit<SEP>0,5 g
<tb><SEP>Bernsteinsäure<CEL AL=L>1,5 g
<tb><SEP>Apfelsäure<SEP>0,01 g
<tb><SEP>Citronensäure<SEP>0,1 g
<tb><SEP>Ethanol<SEP>2,0 ml
<tb><SEP>Glycerin<SEP>0,4 ml
<tb><SEP>Thiamindichlorid<SEP>0,002 g
<tb><SEP>Nikotinsäureamid<CEL AL=L>0,
01 g
<tb><SEP>Calciumpantothenat<SEP>0,002 g
<tb><SEP>myo-Inosit<SEP>0,05 g
<tb><SEP>Pyridoxol. HCI<SEP>0,6 mg
<tb><SEP>Biotin<SEP>0,1 mg
<tb><SEP>Tocophenolsuccinat<SEP>0,002 g
<tb><SEP>Magnesiumsulfat<CEL AL=L>0,05 g
<tb><SEP>Magnesiumaspartat<SEP>0,05 g
<tb><SEP>Mangangluconat<SEP>0,01 mg
<tb><CEL AL=L>NaH2PO4H2O<SEP>0,05 g
<tb><SEP>N-Methylglucamin<SEP>0,2 g
<tb><SEP>Natriumlactat, 50%ige Lösung<CEL AL=L>2,0 g
<tb></TABLE>
Konservierungsstoffe
<tb><TABLE> Columns=2
<tb><SEP>p-Hydroxybenzoesäuremethylester-Natriumsalz (Nipagin)
<SEP>0,2 g
<tb><SEP>Dehydracetsäure<SEP>3,5 g
<tb></TABLE>
Zur Herstellung der Teillösung II werden 2 g Collagel Sol (Firma Stoess) und 2 g partiell dehydratisierte Hefe in 300 ml bidestilliertem Wasser unter starkem Rühren gelöst und über Nacht mit 2 g Aktivkohle behandelt. Nach dem Abnutschen und Sterilfiltrieren wird dieser Ansatz (Teillösung II) mit der Teillösung I vereinigt und vor dem Auffüllen auf 750 ml mit 0,02 mg Tripeptiden Gly-His-Lys, Gly-Pro-His und Gly-Ala-Lys im Verhältnis 1:1:1 und 0,4 g Glutathion versetzt.
Ad 4.4
250 ml des nach Abschnitt 4.2 hergestellten sterilen eiweissfreien Amnion-Extrakts lIa werden mit 725 ml wässrigem synthetischem Amnion-Extrakt gemäss Abschnitt 4.3 nach Einstellung des pH-Wertes auf 6,7 kombiniert und auf 1000 ml aufgefüllt unter Bildung des kombinierten Extrakts lIb.
Die analytischen Daten des Extrakts Ilb sind folgende:
<tb><TABLE> Columns=2
<tb><SEP>pH-Wert<SEP>6,7
<tb><SEP>Trockenrückstand<SEP>1,72%
<tb><SEP>N-Gehalt (Kjeldahl) (SEP)<> 0,03
<tb><SEP>Atmungssteigerungsfaktor<SEP>2,3
<tb><CEL AL=L>Aminosäuren<SEP>positiv
<tb><SEP>Peptide<SEP>positiv
<tb><SEP>Proteine<SEP>negativ
<tb><CEL AL=L>Sterilität<SEP>keimfrei
<tb></TABLE>
Ad 4.5
Ein Wirksamkeitsvergleich der Amnion-Extrakte Ilb und Ila ist Tabelle V zu entnehmen. Zur Demonstration der kosmetischen Effekte in Cremes, in die Ila und Ilb eingearbeitet worden sind, werden die folgenden Versuchsergebnisse angeführt:
Der hergestellte Amnion-Extrakt lIb wurde zu 4% in eine Tagescreme der folgenden Zusammensetzung eingearbeitet: Es handelt sich um eine Feuchtigkeitscreme vom \l-in-Wasser-Typ:
<tb><TABLE> Columns=3
<tb><SEP>Cetylalkohol<SEP>3%
<tb><SEP>Myrj 51<SEP>3%
<tb><SEP>Arlatone 983<CEL CB=3 AL=L>2%
<tb><SEP>Arlamol HD<SEP>2%
<tb><SEP>Miglyol 812<SEP>6%
<tb><CEL AL=L>1,2-Propylenglycol<SEP>3%
<tb><SEP>Glycerin<SEP>0,5%
<tb><SEP>Nipasteril 30K<CEL CB=3 AL=L>0,2%
<tb><SEP>Amnion-Extrakt Ilb<SEP>4%
<tb><SEP>Parfüm-\l<SEP>0,2%
<tb><SEP>Wasser<CEL AL=L>ad<SEP>100%
<tb></TABLE>
Die ölige Phase einschliesslich Miglyol wird auf 75 DEG C erhitzt und homogenisiert. Zur gleichen Zeit werden Propylenglycol, Glycerin und Nipasteril 30 K in Wasser gelöst und auf 75 DEG C erhitzt.
Die Emulgierung wird ausgeführt durch Zugabe der Wasserphase zur \lphase unter starkem Rühren. Dann wird bei schwächerem Rühren 5 min auf Temperatur gehalten und dann auf 35 DEG C abgekühlt. Unter Rühren werden Amnion-Extrakt und Parfümöle hinzugefügt. Alle Operationen müssen unter streng sterilen Bedingungen durchgeführt werden.
In entsprechender Weise werden dann Cremes unter Verwendung von Amnion-Extrakt lIa und eine Kontrollcreme ohne Amnion-Extrakt hergestellt und hinsichtlich Feuchthaltevermögen mit der lIb-Creme verglichen:
Zur Messung der Hautfeuchtigkeit wurde das Corneometer CM 820 PC (Courage & Khazaka GmbH, Köln) gemäss Fig. 7a verwendet. Das Gerät nutzt die relativ hohe Dielektrizitätskonstante von Wasser. Der Messfühler gemäss Fig. 7b besitzt als Stirnfläche einen flachen Kondensator.
Wird der Messkopf auf die Haut gedrückt, gelangt die Hornschicht in den Streubereich des Kondensatorfeldes. Proportional zum Wassergehalt stellt sich eine bestimmte Kapazität des Kondensators ein. Das Gerät wurde gewählt, weil es in Sekunden einen zuverlässigen Messwert liefert. Der Messkopf ist durch die Glasbedampfung so robust, dass er mit Alkohol gereinigt werden kann. Einflüsse durch Verschmutzung sind dadurch nahezu ausgeschlossen.
Durchführung der Messungen
A. 10 weibliche Probanden im Alter von 40 bis 76 Jahren (X = 58,2; s = 13,0) wurden 30 Minuten bei 20 DEG C und 65% relative Luftfeuchte akklimatisiert.
B. Zur Bestimmung der Ausgangswerte wurden 3 Messergebnisse von unterschiedlichen Stellen je Testfeld gemittelt. Als Testfelder dienten die volaren Seiten der Unterarme.
C. Nach einmaliger Applikation einer verbrauchergerechten Produktmenge wurde im 15-Minuten-Takt die Feuchtigkeit gemessen. Es wurde die Zeit notiert, nach der die Feuchtigkeit wieder auf den Ausgangswert abgesunken war. Während der gesamten Messperiode sassen die Probanden auf speziellen Ruhestühlen im Klimalabor.
D. Ein 14-tägiger Anwendungstest folgte. Die Produkte wurden mit der Anweisung ausgegeben, diese verbrauchergerecht über eine Dauer von 14 Tagen morgens und abends auf den zugewiesenen Arealen anzuwenden.
E. Nach Ablauf der Anwendungsphase, 12 Stunden nach der letzten Applikation, wurde wiederum 30 Minuten akklimatisiert und die Feuchtigkeit gemessen.
Ergebnisse:
a) Hautfeuchtigkeitsmessungen nach einmaliger Applikation: dargestellt ist die Zeit in Stunden nach dem Auftragen, nachdem die Ausgangsfeuchtigkeit wieder erreicht ist: vgl. Fig. 8 und Tabelle X.
Der Unterschied zwischen der Kontrollcreme ohne Zusätze und Cremes mit 4% lla und 4% lIb ist im paarweisen t-Test [Lit. 9] hochsignifikant und mit der lrrtumswahrscheinlichkeit p < 0,01.
b) Anwendungstest über 14 Tage: Tabelle XI:
Die zweite Messung erfolgte 12 h nach der letzten Applikation.
<tb><TABLE> Columns=2 Tabelle X
Hautfeuchtigkeitsmessungen nach einmaliger Applikation der Amnion-Extrakt llb und lIa enthaltenden Cremes
<tb>Head Col 1: getestet
<tb>Head Col 2: Hautfeuchtigkeitshaltevermögen in Stunden*
<tb><SEP>Basis (Kontrollcreme)<SEP>4,1
<tb><SEP>Basis + 4% Ilb<SEP>6,0
<tb><SEP>Basis + 4% Ila<SEP>5,8
<tb><SEP>* Zeitangabe in Stunden nach Anwendung der Testcremes, wenn der Anfangsfeuchtigkeitswert wieder erreicht ist.
<tb></TABLE>
<tb><TABLE> Columns=2 Tabelle XI
Hautfeuchtigkeitsmessungen nach 14-tägiger Applikation der Amnion-Extrakt Ilb und lIa enthaltenden Cremes
<tb>Head Col 1: getestet
<tb>Head Col 2: Verbesserung der Hautfeuchtigkeit in %
<tb><SEP>Basis (Kontrollcreme)<SEP>9,2
<tb><SEP>Basis + 4% Ilb<CEL AL=L>25,0
<tb><SEP>Basis + 4% Ila<SEP>24,0
<tb></TABLE>
Für den Amnion-Extrakt lIb konnte im Melanin-Inhibitor-Test unter Verwendung von Sarcoma B 16-Zellen eine starke positive Wirkung nachgewiesen werden. Bei Anwendung von 5% Ilb wurde ein "whitening effect " von +++ (whitening degree: white-greyish white) gefunden entsprechend einem authentischen Handelspräparat. [Lit. 19].
Beispiel 5
Herstellung eines wässrigen Plazenta-Extrakts Illb durch Kombination eines Extrakts aus der Plazenta-Zelllinie JAR mit einem synthetischen Plazentaextrakt nach EP-A-0 552 516.
5.1. Bereitstellung des Zellmaterials ausgehend von Plazenta-Zelllinie JAR-Plazenta-Zelllinie ATCC HTB 144
5.2 Extraktion des Plazentazellmaterials und Aufarbeitung zu eiweissfreiem Plazenta-Extrakt lIla
5.3. Herstellung des synthetischen Plazenta-Extrakts analog zu EP-A-0 552 516
5.4. Kombination der beiden Plazenta-Extrakte aus 5.2 und 5.3 zu Illb
5.5 Testergebnisse mit lIla, Illb und llIc (Plazenta-Extrakt aus frischen Plazenten)
Ad 5.1
Als Ausgangsmaterial zur Herstellung von lllb diente die Zelllinie JAR. Epithelähnliche Morphologie.
Medium: RPMI 1640 + 10% FCS. Split: 1: 4-6.
Bibliographie: "In Vitro", 6, 398 (1971).
Hinterlegung: Paolo Paolucci, Lb. lmmunologia-Citogenetica e Biologia Cellulare, III Clinica Pediatrica Osp. S. Orsola-Malpighi, 40138 Bologna, Italien.
Es wurde verfahren wie im Beispiel 1.1 beschrieben. Hinsichtlich Grosskultur wurde nach der Plastik-Film-Kultur-Methode gearbeitet. Die gewonnene Zellmasse wurde bis zur Weiterverarbeitung tiefgefroren.
Ad 5.2
10 kg aufgetautes Zellmaterial aus 5.1. werden in Ethylether suspendiert und 2 Wochen bei -15 DEG C im Kälteraum stehengelassen. Der durch Zentrifugation erhaltene Rohextrakt wird vor der Weiterverarbeitung filtriert, mindestens dreimal intensiv ausgeethert und dann gegen eine 0,3%ige Nipagin enthal tende Lösung dialysiert. Das eiweissfreie Dialysat wird ultrafiltriert (FILTRON< TM >). Ausbeute 35 L: Illa. Die analytischen Daten des erhaltenen Plazenta-Extrakts sind: pH 6,5; Trockenrückstand: 0,9%; N: 0,08%; Aminosäuren: positiv (TLC: 18 Aminosäuren); Proteine: negativ; Peptide: positiv; Atmungssteigerungsfaktor: 1,8; Sterilität: keimfrei.
Ad 5.3
Die Herstellung des synthetischen Plazenta-Extrakts erfolgte nach EP-A-0 552 516.
Für den Fall, dass der nach Beispiel 1 von EP-A-0 552 516 hergestellte synthetische Plazenta-Extrakt alkalische Phosphatase enthalten soll, kann pro Liter Endvolumen die Menge von 0,03 g alkalische Plazenta-Phosphatase hinzugefügt werden. Um auch für diesen Fall die BSE-Freiheit zu garantieren, muss die Phosphatase aus Plazenten isoliert werden, die von Herden stammen, in denen kein BSE aufgetreten ist (am besten aus Ländern wie Neuseeland oder Brasilien).
Die angegebene Phosphatase-Menge bringt den synthetischen Plazenta-Extrakt auf einen King-Armstrong-Wert von mehr als 180 U.
Eine geeignete Vorschrift für die Gewinnung von alkalischer Phosphatase aus Rinderplazenten und die Stabilisierung der Phosphatase durch Magnesiumsalze wie Magnesiumgluconat, Magnesiumacetat und dgl. haben R. Riemschneider und V. Schulz in [Lit. 16] entwickelt.
Die Bedeutung der alkalischen Phosphatase für die Kosmetik ist umstritten. Nach einschlägiger Literatur wurde der Gehalt an alkalischer Phosphatase als Kriterium für die lege artis erfolgte Herstellung von Plazenta-Extrakten gewertet, nicht aber als Charakteristikum für die kosmetischen Eigenschaften von Plazenta-Extrakten, die als kosmetische Additive eingesetzt werden [Lit. 17].
Ad 5.4
30 L des nach 5.2 hergestellten eiweissfreien Plazenta-Extrakts lIla werden mit 90 L wässrigem synthetischem Plazenta-Extrakt aus 5.3. kombiniert, nach pH-Einstellung auf 6,7 bei 0,2 mu m als Extrakt Illb filtriert.
Analytische Daten von lllb: pH 6,7; Trockenrückstand: 1%.
N: 0,1%; alle weiteren Daten wie lIla.
Ad 5.5
Testergebnisse der Bildanalyse mit Emulsions-Präparaten, welche die Plazenta-Extrakte lIla, Illb und lllc (Plazenta-Extrakt aus frischen Plazenten, hergestellt analog Beispiel 3, Seite 38, Zeilen 5 bis 20) in Mengen von 1%, 1,5% und 2% enthielten.
Die Bildanalyse gestattet eine Beurteilung der Beeinflussung der Oberflächenstruktur menschlicher Haut durch die Plazenta-Extrakt enthaltenden Emulsionspräparate.
Zur Prüfung wurden 35 Probandinnen im Alter von 39 bis 61 Jahren herabgezogen. Sie wurden angewiesen, 4 Tage vor Beginn des Tests und während der Dauer des Tests keine anderen Kosmetika auf den Testarealen (Unterarme) zu verwenden. Bei jeder Probandin wurden 12 Testfelder auf beiden Unterarmen (6 je Arm) markiert. Die Areale waren so zugewiesen, dass die Präparate gleich häufig bei 35 Probandinnen auf die Testfelder verteilt wurden (gleichförmige Permutation). Neben den Testemulsionen wurde ein Leerfeld mitgeprüft. Nachdem die Leerwerte aller Areale bestimmt worden waren, wendeten die Probandenen die Präparate selbst an in einem Zeitraum von 2 Wochen, morgens und abends. 4 Stunden nach der letzten Anwendung wurde mit der Bildanalyse geprüft.
Methode: Nach 45 min Akklimatisierung der Probandinnen bei 22 DEG C und 65% relativer Luftfeuchtigkeit wurden mit einer Siliconmasse bestrichene Objektträger (Schichtdicke 500 mu m) auf die Testareale gedrückt. Die Abdruckmasse härtete innerhalb von 2 min aus. Die gleiche Prozedur wurde nach 2 Wochen Anwendung wiederholt, Die so gewonnenen Abdrücke wurden unter dem Transmissions-Lichtmikroskop bildanalytisch ausgewertet. Das über eine TV-Kamera in den Bildrechner eingezogene Bild wird elektronisch so umgeformt, dass sich die Fläche der im Mikroskop dunkel erscheinenden Profillinien eines Bildes (entsprechend Parameter FA = Flächenareal, Profillinienareal, Profillinienfläche) und deren Länge (als Gesamtlänge) in diesem Bild (Parameter LL = Linienlänge) bestimmen lassen.
Diese bildanalytische Methode erfasst relativ makroskopische Oberflächeneigenschaften der Haut, nämlich die Veränderungen der Profillinien, wie sie bei Austrocknungs- und Befeuchtungsvorgängen auftreten. Verarmung des Profils, d.h. Abnahme von FA und LL, deuten auf Hautaustrocknung hin, während bei verbesserter Durchfeuchtung der gegenteilige Effekt auftritt. Das Profil wird reicher an Profillinien. 4 h nach der letzten Anwendung kann für die Produkte ein sich überlagernder "Zuschmiereffekt" ausgeschlossen werden, sodass das tatsächliche Hautprofil zum jeweiligen Zeitpunkt erfasst und gemessen wurde. Die prozentuale Änderung von FA und LL ist in Fig. 9 in Abhängigkeit von der Konzentration der Präparate wiedergegeben.
Um genügend Daten zu ermitteln, die statistisch auswertbar sind, wurden von jedem Hautabdruck 5 Bilder (an unterschiedlichen Stellen) genommen, sodass genügend FA- und LL-Daten je Restsubstanzkonzentration zum Zeitpunkt "unbehandelt" und auch zum Zeitpunkt "behandelt" ermittelt und gespeichert wurden (für 3 Präparate insgesamt mehr als 6000 Daten). Da die Daten häufig nicht die Bedingungen der Normalverteilung erfüllen, wurden die unbehandelten Daten je Produkt paarweise in einem Wilcoxon-Test auf signifikante Unterschiede hin geprüft. Für die Parameter FA und LL wurden je Produkt für alle 35 Probandinnen Mittelwerte und Standardabweichungen ermittelt. Dann wurde die prozentuale Veränderung von "unbehandelt" gegenüber "behandelt" berechnet und die mit dem Leerwert korrigierten Werte bestimmt.
Die Formulierungen mit 1,5% und 2% Plazenta-Extrakt Illb zeigen eine deutliche Verbesserung der Hautstruktur. Die FA-Daten sind besser differenziert: (Fig. 9)
In analoger Weise ist auch ein Plazenta-Extrakt, ausgehend von einer Rinderplazenten-Zelllinie RPL 10, hergestellt worden, die gezüchtet und hinterlegt ist bei Prof. Dr. Mariano da Rocha Filho, Reitor da UFSM (Universidade de Santa Maria), Faculdade de Medicina, Santa Maria, Rio Grande do Sul, Brasilien, und Dr. G. da Rocha Filho, UFSM, Bioquìmica, lstituto Central de Quimica, Santa Maria RS, Brasilien.
Beispiel 6
Herstellung eines wässrigen Thymus-Extrakts durch Kombinieren eines Extrakts aus Zelllinie P1-1A3 (Thymus-Epithelzellen DSM ACC 280) oder einer Zelllinie aus Kalbsthymus (A. Wank) mit einem synthetischen Thymus-Extrakt analog zu EP-A-0 552 516
6.1. Bereitstellung des Zellmaterials, ausgehend von der Thymus-Zelllinie P1-1A3 bzw. aus der Thymus-Zelllinie Kalb WANK
6.2. Extraktion des Thymus-Zellmaterials und Aufarbeitung zu einem eiweissfreien Thymus-Extrakt IVa
6.3. Herstellung eines synthetischen Thymus-Extrakts IVb gemäss EP-A-0 552516
6.4. Kombination der beiden Thymus-Extrakte aus 6.2 und 6.3 zu dem Extrakt lVc
6.5. Testversuche mit dem unter 6.4 erhaltenen Thymus-Extrakt IVc und Vergleich mit synthetischem Thymus-Extrakt lVb und mit Thymus-Extrakt IVd aus frischen Thymus-Drüsen vom Kalb.
Ad 6.1
Als Ausgangsmaterial zur Herstellung des Thymus-Extrakts lVa diente die Zelllinie P1-1A3, Thymus-Epithelzellen DSM ACC 280.
Als Kulturmedium ist vorgeschrieben 80% RPMI + 20% FCS [Einzelheiten sind zu finden in "Blood" 83, 3245-3254 (1994)"].
Zur Zucht der erwähnten Kalbsthymus-Epithelzellen WANK ist in Brasilien im Oktober 1973 von einem 2-2,5 Monate alten Kälbchen ausgegangen worden. Kulturmedium analog P1-1A3.
Es wurde verfahren wie in Beispiel 1 beschrieben. Hinsichtlich der Grosskultur wurde nach der Plastik-Film-Kultur-Methode im Grossmassstab gearbeitet. Das gewonnene Zellmaterial wurde bis zur Weiterverarbeitung tiefgefroren. Ausbeute in 5 Wochen: 25 kg Masse.
Im Falle des Arbeitens mit der Kalbsthymus-Zelllinie (bos taurus) WANK konnte völlig analog verfahren werden, Ausbeute 30 kg. Herkunft der genannten Zelllinie: Hwa Sook Chang und A. Wank, Bethesda, Md. 20014, Clarandon, USA, und N. M. Faria, Pc. Carlos Gomez, 10000 S. Paolo, SP, Brasilien. Prof. Dr. Dr. R. Riemschneider, Istituto Central de Quimica da UFSM, Santa Maria, RS, Brasilien.
Ad 6.2
25 kg aufgetautes Zellmaterial aus P1-1A3, nach 6.1 hergestellt, wurden in Ethylether suspendiert und 10 Tage lang bei -15 DEG C in einer Kältezelle stehen gelassen. Der durch Zentrifugieren erhaltene Rohextrakt wird vor der Weiterverarbeitung filtriert, intensiv ausgeethert und dann gegen 0,3% Nipagin (p-Hydroxybenzoesäuremethylester-Natriumsalz) in Wasser dialysiert. Das eiweissfreie Dialysat wird ultrafiltriert (FILTRON< TM >): Ausbeute 30 L.
Die analytischen Daten des erhaltenen Thymus-Extrakts IVa sind folgende:
<tb><TABLE> Columns=3
<tb><SEP>pH<SEP>6,8
<tb><SEP>Trockenrückstand<SEP>2,8%
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>N (Kjeldahl)<SEP>0,6%
<tb><SEP>Aminosäuren (Ninhydrin)<SEP>positiv und TLC
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>Peptide (Biuret)<SEP>positiv und TLC
<tb><SEP>Nucleinsäurekomponenten<SEP>positiv TLC (9 Komponenten nachgewiesen)
<tb><SEP>Stoffwechselaktivität
<tb><SEP>(Warburg-Faktor)<CEL CB=3 AL=L>>2,3
<tb><SEP>Schwermetalle<SEP><10 ppm
<tb><SEP>As<SEP><2 ppm
<tb><SEP>Sterilität<SEP>keimfrei
<tb><SEP>Haltbarkeit (SEP)<>2 Jahre
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>akute Toxizität an Mäusen (60 Tiere)
<tb><SEP>DL50<SEP>i.v. > 20 ml/kg
<tb><CEL CB=2 AL=L>DL50<CEL AL=L>i.p. > 30 ml/kg
<tb><SEP>DL50<SEP>p.o. > 25 ml/kg
<tb><SEP>Studie der chronischen Toxizität an Albinoratten (40 Tage):
<SEP>keine Toxizität
<tb><SEP>Toxizität bei Hunden (10 Beagle-Hunde, 26 Wochen):<SEP>keine Toxizität
<tb></TABLE>
Ad 6.3
Die Herstellung des synthetischen Thymus-Extrakts IVb erfolgt wie nachstehend beschrieben:
150 g p-Hydroxybenzoesäuremethylester in 0,7 L Ethanol (94%ig) und
20 g Benzylalkohol werden in bidestilliertem Wasser auf 20 L gelöst bzw. verdünnt. In der angegebenen Reihenfolge werden unter Rühren und sterilen Bedingungen hinzugegeben:
<tb><TABLE> Columns=4
<tb><TABLE> Columns=2
<tb><SEP>Kontrollgruppe I:<SEP>ungeschädigte Fibroblasten und Epithelzellen
<tb><SEP>Gruppe II:<SEP>mit CHOH geschädigte Fibroblasten und Epithelzellen (reversibel geschädigt),
<tb><SEP>Gruppe III:<SEP>mit CHOH geschädigte und durch Zusatz von synthetischem Serumextrakt behandelte Fibroblasten und Epithelzellen,
<tb><SEP>Gruppe IV:<SEP>mit CHOH geschädigte und durch Zusatz von V.
<tb></TABLE>
Ergebnisse
<tb><TABLE> Columns=5 Tabelle XV
<tb>Head Col 1: Gruppe
<tb>Head Col 2 to 5 AL=L:
Thymidineinbauraten 1 x 10<3>/min
<tb>Head Col 2 AL=L: Tag 0
<tb>Head Col 2: Tag 2
<tb>Head Col 3: Tag 4
<tb>Head Col 4: Tag 6
<tb><SEP>I Kontrolle<SEP>0<SEP>35<SEP>200<SEP>450
<tb><SEP>II<SEP>0<CEL AL=L>3<SEP>30<SEP>30
<tb><SEP>III<SEP>0<SEP>25<SEP>90<SEP>350
<tb><SEP>IV<SEP>0<CEL AL=L>30<SEP>120<SEP>410
<tb></TABLE>
Die angegebenen Werte repräsentieren Mittelwerte aus jeweils 10 Versuchen. Sie machen deutlich, dass die durch CHOH geschädigte Fibroblastenkultur sowohl mit den Zusätzen in Gruppe III als auch IV hinsichtlich ihrer DNA-Syntheserate der als Kontrolle dienenden Kulturgruppe I angepasst werden konnte.
7.5.2. Einfluss von V
auf das Wachstum und die Metamorphose von Kaulquappen (Xenopus laevis DAUDIN)
Das Wachstum von Kaulquappen wurde vom Tag 1 (vom Froschpaar abgelegter Laich) bis zum Tag 67 beobachtet und ab Tag 3 gemessen, nachdem die frei schwimmenden Kaulquappen erhalten worden waren. Wassertemperatur 24 DEG C. Am Tag 7 wurden die Kaulquappen in 5 Gruppen aufgeteilt, um einen Test mit Blutextrakt V und 3 Kontrollen durchzuführen. Jede Versuchsgruppe umfasste ca. 100 Kaulquappen.
Die Wassermenge wurde gesteigert auf 2,5 L bis zum Tag 21, auf 5 L bis zum Tag 35 und auf 7,5 L pro Gruppe ab Tag 36 bis 67. Belüftung mittels handelsüblicher poröser Aquariensteine. Wasserwechsel der Becken alle 7 Tage.
Futter ab Tag 7 Brennnesselpulver, vorher Liquifry.
Zugabe von V pro Woche in 3 Portionen, Menge 0,2%.
Längenmessungen hier nicht notiert.
*Beginn der Metamorphose bei V am Tag 51, bei den Kontrollen erst ab Tag 56: Tabelle XVII.
Die Frösche von Xenopus laevis sind Carnivoren und erhalten frische Leber als Futter.
<tb><TABLE> Columns=5 Tabelle XVI
Metamorphosen und Frösche, d 51-67
<tb>Head Col 1: Versuchsgruppe
<tb>Head Col 2: 1
<tb>Head Col 3: 2
<tb>Head Col 4: 3
<tb>Head Col 5: 4
<tb><SEP>d51<SEP>1 + 0<SEP>1 + 0
<tb><SEP>d53<SEP>1 + 1<SEP>1 + 0
<tb><CEL AL=L>d56<SEP>0 + 2<SEP>1 + 1<SEP>1 + 2
<tb><SEP>d58<SEP>0 + 3<SEP>0 + 1<SEP>1 + 1<CEL AL=L>1 + 2
<tb><SEP>d60<SEP>0 + 3<SEP>0 + 1<SEP>1 + 2<SEP>1 + 2
<tb><SEP>d63<SEP>0 + 4<SEP>1 + 1<SEP>2 + 2<SEP>2 + 4
<tb><SEP>d65<SEP>1 + 3<SEP>1 + 1<SEP>2 + 3<SEP>2 + 4
<tb><CEL AL=L>d67<CEL AL=L>2 + 2<SEP>1 + 0<SEP>2 + 5<SEP>3 + 4
<tb>
Erste Zahl: Anzahl der Frösche.
Zweite Zahl: Anzahl der Metamorphosen (die Metamorphose ist beendet, wenn der Schwanz vollständig oder fast vollständig resorbiert worden ist).
1, 2: Kontrollen. 3, 4:
Blutextrakt V
<tb></TABLE>
7.5.3 Bericht über den Einfluss von Blut-Extrakt V
auf das Wachstum von Guppy-Fischen von Tag 75 bis 100
Sämtliche eingesetzten Guppy-Fische waren gleich alt.
115 Guppys wurden in 5 Gruppen zu je ca. 22 bis 24 in 5-L-Aquarien getestet, Wasser-Temperatur 24,0-24,6 DEG C.
Die Zugabe der zu testenden Proben erfolgte jeden zweiten Tag.
Menge pro Woche ist in der Tabelle angegeben.
Die Ergebnisse des Längenwachstums x in mm nach 100 Tagen (Versuchsbeginn am Tag 75) sind in der Tabelle XVII zusammengestellt.
<tb><TABLE> Columns=4 Tabelle XVII
Mittelwerte d<1><0><0>
<tb>Head Col 1: Gruppe
<tb>Head Col 2: 1
<tb>Head Col 3: 2
<tb>Head Col 4: 3
<tb><SEP>Zugabe Probe/Woche (absolut)<SEP>0 per 1000 Kontrolle<SEP>1 per 1000 V<SEP>1 per 1000 V
<tb><CEL AL=L>Zugabe Probe/Woche (Trockenrückstand)<SEP>0 per 1000 Kontrolle<SEP>0,95 per 1000 V<SEP>0,94 per 1000 V
<tb><SEP>x (mm)<CEL AL=L>19,91<CEL AL=L>23,24<SEP>22,95
<tb></TABLE>
7.5.4. Über die Radikalfängerwirkung von Blut-Extrakt V vgl.
Fig. 12 und bezüglich der Methodikbeschreibung siehe in dem weiter unten folgenden Beispiel 10.
Beispiel 8
Herstellung eines pflanzlichen Extrakts VI aus der Sycamore-Zelllinie (Acer pseudoplatanus L.) (Colla 120) und Verwendung als kosmetisches Additiv im Sinne eines Kollagenersatzes (siehe auch obige Tabelle VI)
Das Ausgangsmaterial ist eine Sycamore-Zellkultur (Herkunft: Botanisches Institut der UFSM, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, Rio Grande do Sul, Brasilien. Die Sycamore-Zellkultur wurde abgeleitet vom Kallusgewebe, das ursprünglich von Explantaten sekundärer Kambialgewebe des Sycamore-Baumes stammt).
Die Kulturen von Sycamore (Acer pseudoplatanus L.) wurden in Suspension gezüchtet, wie es Stoddart, Barrett und Northcode in "Biochemical Journal", 102, 194 (1967), beschrieben haben. Das Gewebe in Suspension wurde geerntet durch Zentrifugation und mit Wasser gewaschen.
Das Kulturmedium war ein modifiziertes White's Medium, das in g/L folgende Bestandteile enthielt:
<tb><TABLE> Columns=2
<tb><SEP>Ca(NO3)2<SEP>0,2 g
<tb><SEP>MgSO4.7H2O<SEP>0,36 g
<tb><SEP>KCI<SEP>0,055 g
<tb><CEL AL=L>KNO3<SEP>0,08 g
<tb><SEP>Na2SO4<SEP>0,2 g
<tb><SEP>MnSO4.4H2O<SEP>0,009
<tb><CEL AL=L>ZnSO4.7H2O<CEL AL=L>0,003
<tb><SEP>H3BO3<SEP>0,003
<tb><SEP>KJ<SEP>0,0015
<tb><SEP>NaH2PO4.H2O<CEL AL=L>0,0165
<tb><CEL AL=L>Fe2(SO4)3.6H2O<SEP>0,0025
<tb><SEP>Thiamin.HCI:<SEP>0,0001,
<tb><SEP>Ca-Pantothenat<CEL AL=L>0,0001
<tb><SEP>Glycin<SEP>0,003
<tb><SEP>Cystein-HCI<SEP>0,001 g
<tb><SEP>Saccharose<SEP>20,0 g
<tb><SEP>dazu: Kokosnussmilch 20%
(deproteinisiert [15 min 15 at] und sterilisiert).
<tb></TABLE>
Zur weiteren Extraktherstellung sei zweckmässig auf das Schema in obiger Tabelle VI verwiesen.
Die Zellvermehrung erfolgt zunächst mittels Rotary-Shaker-Technik, dann in einer Anzahl von Bekkino-Glas-Suspensionskultur-Flaschen von 10 L, im Grossmassstab dann in Fermentern (1000-4000 L) bzw. Rohrschlangen-Kultivatoren (1000-2000 L).
Das geerntete Zellmaterial wird getrocknet und in Chargen von 10 kg Wasser suspendiert und in einem Kilowatt-Ultraschall-Generator, der eine starke Oszillation liefert, bearbeitet.
Der gewonnene Zentrifugenrückstand enthält das gewünschte Zellwandmaterial, das als Basis für die folgenden enzymatischen und chemischen Hydrolyse-Prozesse dient.
Nach 4-tägiger Behandlung mit 10% Cellulase bei 35 DEG C wird zentrifugiert: Rückstand I wird bei 4 DEG C für die weitere Behandlung gelagert. Die überstehende Lösung I wird mit Schwefelsäure auf eine Konzentration von 2 N gebracht und zur partiellen Hydrolyse 4 Tage bei 15 at autoklaviert. Die Trennung führt zu Rückstand II (gelagert wie 1 bei 4 DEG C) und Lösung II, die auf pH 5,3 gebracht wird. Arbeitstemperaturen bei 4 bis 10 DEG C.
Die Rückstände I und II werden partiell im Autoklaven in 3 N HCI partiell hydrolysiert und dann mit dem Hydrolysat II (aus I) vereinigt und dialysiert.
Konzentrierung des Dialysats im Vakuum bei 20 DEG C auf ca. 10% Trockenrückstand, Einstellen auf pH 5,3. Sterilfiltration durch ein 0,2- mu m-Millipore< TM >-Filter.
Das resultierende proteinfreie kosmetische Additiv VI (Colla 120) weist die folgenden analytischen Kennzahlen auf:
pH: 5,3, Trockenrückstand: 10,5%; N: 0,95%; Aminosäuren: 4,5% (nach Hydrolyse); Hydroxyprolin: 0,3%; Kohlenhydrate: 5,2% (nach Hydrolyse); Stoffwechselaktivität: 1,8 (Warburg-Faktor): Sterilität: keimfrei; Konservierungsmittel: 0,3% Phenonip-Proteine: proteinfrei.
Gegebenenfalls kann durch Zusatz von 5% Mannit und 10% Panthenol der Trockenrückstand auf 25% erhöht werden, wodurch sich die kosmetischen Effekte des Feuchthaltevermögens der Haut und die Radikalfängerwirkung von Extrakt VI verbessern lassen (vgl. auch Fig. 12).
Der Sycamore-Extrakt VI mit 10,5% Trockenrückstand, im Folgenden "Colla 120" genannt, wurde in einer Reihe von kosmetischen Formulierungen eingesetzt und mit einem Kollagen-Präparat verglichen.
1) Hautfeuchtigkeitsmessungen nach einmaliger und nach 14-tägiger Applikation von VI enthaltender Creme (Corneometer)
2) Hautrauigkeitsmessungen nach der modifizierten PADBERG-Methode
3) Einfluss einer VI enthaltenden \l-Wasser-Emulsion auf die Hauttemperatur von Probanden mit trockener Haut
4) Hautkonditionierung durch VI enthaltende Formulierungen
5) Patch-Test zur Prüfung auf allergologische Wirkung.
Ad 1)
Colla 120 (VI) wurde zu 5% in die folgende Rezeptur eingearbeitet:
Phase I Schmelzen auf 70 DEG C: C: 10% Cetiol V, 10% Lanette N; 5% Miglyol 812,2% Adeps lanae; 0,3% Phenonip,
Phase II auf ca. 70 DEG C erwärmen, enthaltend: 0,3% Phenonip; 5% Karion fl., Karion F; 62,3% Wasser,
Phase II in Phase I einrühren, weiterrühren, bis die Mischung auf 32 DEG C abgekühlt ist, dann Colla 120 5% (VI) und Parfümöle einrühren und homogenisieren.
Analog eine Creme mit 5% Kollagen (1%ig) herstellen, ebenso eine Kontrollcreme ohne Zusatz eines Additivs.
Die Messungen, durchgeführt analog Beispiel 4.5, ergaben für das Feuchtigkeitshaltevermögen:
<tb><TABLE> Columns=2
<tb>Head Col 1: nach einmaliger Applikation getestet
<tb>Head Col 2: Hautfeuchtigkeitshaltevermögen in Stunden
<tb><SEP>Basis (Kontrollcreme)<SEP>4,5
<tb><SEP>Basis + 5% VI Colla 120<SEP>6,5
<tb><SEP>Basis + 5% Kollagen<SEP>6,3
<tb></TABLE>
<tb><TABLE> Columns=2
<tb>Head Col 1: nach 14-tägiger Applikation getestet
<tb>Head Col 2: Verbesserung der Hautfeuchtigkeit in %
<tb><SEP>Basis (Kontrollcreme)<SEP>8,4
<tb><SEP>Basis + Colla 120 VI 5%<SEP>22
<tb><SEP>Basis + Kollagen 5%<SEP>19
<tb></TABLE>
Ad 2)
Beschreibung der Padberg-Methode
Padbergmethode:
Im Padberg-Test wird die Rauigkeit einer Haut anhand derjenigen Menge Methylenblau bewertet, die in Abhängigkeit von den Hautkonditionen von der Haut absorbiert wird. Studien mit "subjektiv rauer Haut" bzw. mit "durch Tenside geschädigter Haut" ergaben, dass die absorbierte Methylenblau-Menge der Hautrauigkeit proportional ist. Gute Haut bzw. gut gepflegte Haut absorbiert demgegenüber nur eine geringe Menge Methylenblau.
Für den Test wurden 10 Probandinnen im Alter von 40 bis 66 Jahren herangezogen. Die Versuchspersonen stellten sich freiwillig für diesen Test zur Verfügung. Sie wurden angewiesen, drei Tage vor Beginn des Tests und während der gesamten Testdauer keine anderen Kosmetika auf den Testarealen (der Unterarme) zu verwenden. Bei jeder Probandin wurden sechs Testfelder auf beiden Unterarm-Innenseiten (also drei je Arm) markiert. Die Areale waren so zugewiesen, dass die Produkte gleich häufig bei den zehn Probandinnen auf die sechs Testfelder verteilt waren (gleichförmige Permutation). Neben den fünf Emulsionen wurde ein Leerfeld mitgeprüft. Nachdem die Leerwerte aller Areale nach beiden Methoden bestimmt waren, wendeten die Probandinnen die Produkte selbst zu Hause in einem Zeitraum von 14 Tagen morgens und abends an.
Danach wurde 4 Stunden nach der letzten Anwendung erneut nach Padberg geprüft.
Zur Durchführung des Padberg-Tests werden folgende Schritte angewendet:
(1) Markierung der Testfelder
(2) Vorbehandlung der Testfelder mit einer 1%igen Lösung eines nichtionischen Tensids in Wasser
(3) Nachwaschen mit Leitungswasser von 35 DEG C
(4) Abtupfen der Testfelder
(5) nach 30-minütigem Akklimatisieren der Probanden bei 22 DEG C und 60% relativer Luftfeuchte
(6) Auftragen von 20 mu l Farblösung (die Farblösung besteht aus 0,5%igem Methylenblau (20%) und 80% einer 1%igen Lösung eines nichtionischen Tensids) und 30 s verteilen lassen
(7) Antrocknenlassen der Farbe für 30 s
(8) Entfernen des Farbüberschusses mit 2 ml einer 0,25%igen nichtionischen Tensidlösung
(9) Extraktion mit 2 x 2 ml einer Mischung aus:
2,0% Natriumlaurylsulfat
48,0% Wasser
50,0% lsopropylalkohol
jeweils nach 60 s
(10) Messen des Eluats im Spektralphotometer bei 660 nm gegen Luft
(11) Ergebnis = Extinktion Haut (Ausgangswert)
(12) es erfolgte nun die Ausgabe der Produkte mit der Anweisung, diese 14 Tage lang morgens und abends auf den vorgesehenen markierten Stellen aufzutragen.
Zuvor wurde sichergestellt, dass 3 Tage vor Beginn der Prüfung und während der gesamten Prüfdauer keine anderen kosmetischen Produkte auf den Testrealen angewendet wurden.
(13) Wiederholung der Schritte (1) bis (9) am 15. Tag. Die letzte Anwendung vor dem Test erfolgte 4 Stunden zuvor.
Ergebnis = Extinktion nach der Anwendung
(14)
EMI81.1
Diskussion der Padberg-Methode:
Die Padberg-Methode liefert Daten über die Adsorption von Methylenblau auf der Haut. Je nach Hautzustand stehen dem Farbstoff mehr oder weniger Bindungsstellen auf der Haut zur Verfügung. Jahrelange Erfahrungen haben immer wieder bestätigt, dass subjektiv "raue" Haut oder beispielsweise durch Detergentien geschädigte Haut mehr Bindungsstellen für Methylenblau aufweist, und zwar in Abhängigkeit vom Schädigungsgrad. Umgekehrt zeigt eine mit Cremes verbesserte Haut eine Abnahme der Bindungsstellen, und proportional zur Anwendungsdauer. Die Differenzierung bei verschiedenen Produkten ist sehr gut und verlässlich; auch hier wird stets eine Korrelierung mit der subjektiven Begutachtung erzielt. Bezüglich weiterer Einzelheiten siehe [Lit. 10].
Ergebnisse des Padberg-Tests:
Die Fotometer-Werte, ausgedrückt in Prozent des Wertes bei behandelter Haut und bezogen auf den Ausgangszustand, sind in der folgenden Tabelle XVIII zusammengefasst. In der Tabelle sind auch die errechneten Mittelwerte angegeben.
Die Ergebnisse zeigen, dass mit den Testemulsionen eine Glättung der Haut erzielbar ist.
<tb><TABLE> Columns=4 Tabelle XVIII
Rauigkeitstest nach der Padberg-Methode mit Wasser/\I-Emulsionen mit und ohne Zusatz von Tripeptiden (Anwendungsdauer 14 Tage)
<tb>Head Col 1: Alter der Probanden
<tb>Head Col 2: Plazebo
<tb>Head Col 3 to 4 AL=L:
Wasser-\l-Emulsionen der Erfindung Colla 120 (VI)
<tb><SEP>46<SEP>81,0<CEL AL=L>50,1<SEP>60,0
<tb><SEP>41<SEP>91,0<SEP>64,4<SEP>64,9
<tb><SEP>47<SEP>80,0<CEL AL=L>76,5<CEL AL=L>40,0
<tb><SEP>50<SEP>76,6<SEP>33,0<SEP>41,2
<tb><SEP>51<SEP>75,3<SEP>56,8<CEL AL=L>70,0
<tb><SEP>40<SEP>95,0<SEP>37,5<SEP>40,5
<tb><SEP>65<SEP>89,0<SEP>72,5<CEL AL=L>68,0
<tb><SEP>66<SEP>97,8<SEP>57,8<SEP>55,0
<tb><SEP>62<SEP>92,6<SEP>70,0<CEL AL=L>60,0
<tb><SEP>45<SEP>76,9<SEP>60,7<SEP>62,7
<tb><SEP>Mittelwerte:<SEP>85,6<SEP>58,2<CEL AL=L>56,4
<tb></TABLE>
Ad 3)
Einfluss einer Colla-120-Sycamore-Extrakt (VI) (hergestellt nach Beispiel 8) \l/Wasser-Emulsion auf die Hauttemperatur von Probanden
Der Einfluss der Emulsion auf die Hauttemperatur wurde an 30 Probandinnen im Alter von 40 bis 60 Jahren mit trockener Haut getestet. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle XIX angegeben.
<tb><TABLE> Columns=4 Tabelle XIX
<tb>Head Col 1: Temperatur ( DEG C)
vor Applikation
<tb>Head Col 2: \l-Wasser-Emulsion
<tb>Head Col 3: Temperatur ( DEG C)
nach Applikation
<tb>Head Col 4: DELTA T
<tb><SEP>30,6-33,0<SEP>Colla 120 (VI)<SEP>32,7-32,9<SEP>0,2
<tb><CEL AL=L>30,5-34,0<CEL AL=L>Kontrollemulsion<SEP>30,5-33,6<SEP>3,1
<tb></TABLE>
Ohne Colla 120 (VI) konnte keine merkliche Stabilisierung (kleiner DELTA T-Wert) der Hauttemperatur festgestellt werden, daher hoher DELTA T-Wert bei Verwendung der Kontrollemulsion.
Ad 4)
Nach folgender Vorschrift wurde eine Lanolin enthaltende Handcreme formuliert, in der Colla 120 (VI) inkorporiert wurde. Die End-Zusammensetzung der Cremeformulierung war folgende:
<tb><TABLE> Columns=3
<tb><SEP>lösliches Lanolinderivat<SEP>1,0 Gew.-%
<tb><SEP>acetylierte Lanolinalkohole<SEP>5,0 Gew.-%
<tb><SEP>flüssiger Multisterol-Extrakt<SEP>5,0 Gew.-%
<tb><SEP>Vaseline<SEP>5,0 Gew.-%
<tb><CEL AL=L>Polyvinylalkohol-Gel<SEP>0,75 Gew.-%
<tb><SEP>10%iges NaOH<SEP>2,25 Gew.-%
<tb><SEP>Colla 120 (VI)<SEP>6,0 Gew.-%
<tb><SEP>ethoxylierte Fettamine<SEP>3,75 Gew.-%
<tb><SEP>Parfümöl<CEL CB=3 AL=L>0,3 Gew.-%
<tb><SEP>Wasser, bidest.<SEP>ad<SEP>100,00 Gew. -%
<tb></TABLE>
Zur Herstellung dieser Handcreme wurden die Fettphasen-Bestandteile und Vaseline auf ca. 75 DEG C erwärmt. Gleichzeitig wurde das PVA-Gel in heissem Wasser von ca. 80 DEG C dispergiert und allmählich gelöst. Zur letzteren Dispersion wurden das ethoxylierte Fettamin (mit ca. 25 EO-Einheiten) und gegebenenfalls noch ein Emulgator gegeben, wonach die vorher angesetzte erwärmte Fettphase darin emulgiert wurde. Nach 5 Minuten Rühren bei der Mischungstemperatur wurde auf 60 DEG C abgekühlt, dann mit 10%iger Natronlauge versetzt und weiter bis auf unter 40 DEG C gekühlt. Unter langsamem Rühren wurden dann 6% Colla 120 (VI) sowie das Parfüm zugesetzt. Der Ansatz wurde gut homogenisiert. Die Handcreme war stabil konfektioniert und zeigte eine verbessernde Hautkonditionierung, verglichen mit einem Ansatz ohne Colla 120 (VI).
Aus der folgenden Zusammensetzung wurde ein Baby-Shampoo hergestellt:
<tb><TABLE> Columns=2
<tb><SEP>Sulfobernsteinsäure-halbester-Natriumsalz, verdünnt (Steinapol SBFA 30 und Steinapol SBZ)
<SEP>700 g
<tb><SEP>Alkylethersulfat<SEP>10 g
<tb><SEP>Colla 120 (VI)<SEP>50 g
<tb><SEP>Gummi arabicum<SEP>5 g
<tb><SEP>Oberflächenfett<SEP>10 g
<tb><SEP>Wasser<SEP>275 g
<tb><CEL AL=L>Kaliumsorbat<CEL AL=L>1,5 g
<tb><SEP>Manganacetat<SEP>1,0 g
<tb></TABLE>
Der pH-Wert der Mischung wurde auf einen Endwert von 6,5 eingestellt.
Eine Creme-Grundlage wurde wie folgt compoundiert:
<tb><TABLE> Columns=3
<tb><SEP>Vaseline<SEP>40 Gew.-%
<tb><SEP>Cetanol<SEP>18 Gew.-%
<tb><CEL AL=L>Sorbitansesquioleat<CEL CB=3 AL=L>5 Gew.-%
<tb><SEP>Polyoxyethylenlaurylether<SEP>0,5 Gew.-%
<tb><SEP>p-Hydroxyalkylbenzoat<CEL CB=3 AL=L>0,2 Gew.-%
<tb><SEP>Colla 120 (VI)<SEP>5,0 Gew.-%
<tb><SEP>Wasser<SEP>ad<SEP>100,00 Gew. -%
<tb></TABLE>
Ad 5)
Klinisch-allergologische Prüfung von Colla 120 (Sycamore-Extrakt VI) im Patch-Test am Menschen
Zusammenfassung: Colla 120 ist im Patch-Test auf allergisierendes Potenzial geprüft worden. In einer präklinischen Prüfung wurde die lokale Verträglichkeit abgeklärt. Diese Prüfung zeigte keine Bedenken für den Einsatz des Produkts in einer klinischen Prüfung am Menschen (vgl. auch die obige Tabelle II).
Die klinische Prüfung im Patch-Test ergab für die Frage des Einsatzes von Colla 120 im Gesicht des Menschen vom allergologischen Standpunkt keine Bedenken, da bei den 60 geprüften Probanden dahingehend keinerlei Reaktion auftrat.
Testmethode: Diese wurde durchgeführt unter den Bedingungen eines epikutanen Läppchentests. Eine kleine Menge Testsubstanz wird auf hygroskopische Testplättchen aufgebracht und mittels Heftpflaster auf der Rückenhaut der Patienten, die wegen des Verdachts auf das Vorliegen einer Kontaktallergie im allergologischen Labor der Klinik getestet wurden, befestigt. Nach 24 Stunden wurden die mit der Testsubstanz beschickten Plättchen entfernt und die örtliche Hautreaktion an der Anliegestelle der Testplättchen eine halbe Stunde nach Abnahme der Testpflaster abgelesen. Weitere Ablesungen erfolgten nach 48 h und 72 h: Tabelle XIX
Bewertung: 0 = negativ, (-) = fraglich positiv, + = schwach positiv, ++ = positiv, +++ = stark positiv
Die Prüfung erfolgt unter einer extremen Belastung, die unter normalen Bedingungen nicht gegeben ist.
<tb><TABLE> Columns=5 Tabelle XX
<tb>Head Col 1: Patient Nr.
<tb>Head Col 2: Testreaktion auf andere Stoffe
<tb>Head Col 3 to 5 AL=L: Reaktionen von Colla 120
<tb>Head Col 3 AL=L: nach 24
<tb>Head Col 3: 48
<tb>Head Col 4:
72 h
<tb><SEP>1<SEP>p-Phenylendiamin<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>2<CEL AL=L>Kaliumbichromat<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>3<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>4<CEL CB=3 AL=L>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>5<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>6<SEP>0<SEP>0<CEL AL=L>0
<tb><SEP>7<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>8<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><CEL AL=L>9<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>10<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>11<CEL AL=L>Zimtaldehyd<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>12<SEP>Kolophonium<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><CEL AL=L>13<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>14<SEP>Nickelsulfat<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><CEL AL=L>15<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>16<SEP>Epoxydharz<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><CEL AL=L>17<SEP>Eucerin<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>18<SEP>Perubalsam<SEP>0<SEP>0<CEL AL=L>0
<tb><SEP>19<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>20<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><CEL AL=L>21<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>22<SEP>Formaldehyd<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><CEL
AL=L>23<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>24<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>25<CEL AL=L>Kobaltchlorid<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>26<SEP>Chloramphenocol<SEP>0<SEP>0<CEL AL=L>0
<tb><SEP>27<SEP>Quecksilber<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>28<SEP>0<SEP>0<CEL AL=L>0
<tb><SEP>29<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>30<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><CEL AL=L>31<SEP>Lanette N<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>32<SEP>Bufexamac<SEP>0<SEP>0<CEL AL=L>0
<tb><SEP>33<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>34<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><CEL AL=L>35<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>36<SEP>Formaldehyd<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><CEL AL=L>37<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>38<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>39<CEL CB=3 AL=L>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>40<SEP>Hydroxycitronellal<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>41<CEL AL=L>Abitol<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>42<SEP>Kolophonium<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><CEL AL=L>43<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>44<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>45<CEL CB=3
AL=L>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>46<SEP>Formaldehyd<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>47<CEL CB=3 AL=L>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>48<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>49<SEP>Clotriazol<CEL AL=L>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>50-50<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb></TABLE>
Ergebnisse: Colla 120 wurde von allen 60 Patienten im Epikutantest reaktionslos vertragen bei unverdünnter Anwendung.
Wie aus dem Testprotokoll hervorgeht, erwiesen sich 20 der 60 getesteten Personen als kontaktallergisch gegenüber verschiedenen Allergenen des Alltags und des Berufslebens.
Beispiel 9
Herstellung eines proteinfreien Hefeextraktes VII aus partiell dehydratisierten Zellen von Saccharomyces cerevisiae Hansen
10 kg einer ca. 20%igen Suspension von frisch gezüchteter Hefe Saccharomyces cerevisiae in Wasser (sog. Hefemilch) werden mit 200 g stoffwechselaktivem Extrakt VIl (als Anlasser) und mit 150 g einer Mischung aus 114 g NaCl, 20 g MgSO4.7H2O, 1 g Aktivator und 15 g Rohrzucker unter schwachem Rühren in einer Teigmaschine rasch auf 65 DEG C erhitzt und nach ca. 100 Minuten auf 15 DEG C abgekühlt: VII-Rohprodukt. In der Kälte wird gegen eine 0,2%ige p-Hydroxybenzoesäuremethylester-Natriumsalz-Lösung dialysiert. Die Wassermenge wird so gewählt, dass der Feststoffgehalt des Dialysats bei 4% liegt.
Nach Desodorierung mit Aktivkohle und Sterilfiltration des Dialysats wird ein eiweissfreier Hefeextrakt VIl erhalten, der folgende analytischen Kennzahlen (a) und Eigenschaften (b) aufweist:
a) Kennzahlen:
pH 6,5; N: 0,4%; Trockenrückstand: 4,2%; Aminosäuren: positiv, TLC: Peptide: positiv (Biuret);
Nucleinsäure-Komponenten: TLC; Proteinnachweis; negativ.
Schwermetalle: < 10 ppm: As < 2 ppm; Sterilität: keimfrei.
b) Eigenschaften:
<tb><TABLE> Columns=3 Tabelle XXI
<tb><SEP>WARBURG-Test
<tb><SEP>Atmungssteigerungsfaktor (Rattenleber-Homogenat) (S. 41-44)<SEP>4,07
<tb><SEP>Gärungssteigerungs-Faktor: Fig. 11<SEP>3,9
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>Schwimmtest Maus:
<tb><SEP>Erhöhung der Überlebenszeit bis zum Ertrinken<SEP>von 10 auf 13 min
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>Padberg-Test (S. 62-65)<SEP>60 (83)*
<tb><SEP>Wachstumstests:
<tb><SEP>Guppyfische in mm Länge nach 100 Tagen, wenn über 25 Tage Extraktgaben<SEP>24 (17)*
<tb><SEP>Kaulquappen (Xenopus laevis D.) Beginn der Metamorphose vorverlegt:
Tage gegenüber Kontrollen<SEP>16 Tage
<tb><SEP>Corneometer-Test (Methode S. 50-52)
<tb><CEL CB=2 AL=L>Verbesserung des Hautfeuchtigkeitshaltevermögens nach 14-tägiger Anwendung<SEP>22% (8%)
<tb><SEP>Radikalfänger-Test (Fig. 12 + S. 98-100)<SEP>76%
<tb>
* Kontrollen ohne Zusatz von Extrakt VII in Klammern
<tb></TABLE>
Die im Dialyseschlauch verbleibende Zellmasse inkl. Eiweiss zeigt ebenfalls hohen Wachstumseffekt bei Kaulquappen, Fischen und Nutztieren und eignet sich als umweltverträglicher Futtermittelzusatzstoff, wie auch das gesamte nicht dialysierte Produkt aus Beispiel 9: VII-Rohprodukt.
Bestimmung des Gärungssteigerungsfaktors des oben genannten Hefeextrakt-Dialysats VII:
Die Messung des Gärungssteigerungsfaktors erfolgt in einem Warburggefäss bestimmten Volumens, das mit einer aus 2,5 g Glucose, 0,4 g Caseinpepton, 50 Mg MgSO4, 7 H2O und 50 mg Bäckerhefe ad 50 ml Leitungswasser bestehenden Lösung beschickt wird. Das Gefäss wird dann mit einer bestimmten Menge der Testpräparation entsprechend einem Füllplan gefüllt. Die bei 30 DEG C abgegebene CO2-Menge wird in Abhängigkeit von der Zeit bestimmt, auf Normalbedingungen umgerechnet und durch die standardisierte CO2-Menge dividiert, die im Kontrollversuch unter ansonsten gleichen Bedingungen, jedoch ohne Testpräparation, erzeugt wird.
Die messbare Gärungsaktivierung ist für die erfindungsgemässen Präparationen bemerkenswert: Faktor 3,8.
Fig. 11 zeigt den Verlauf der CO2-Bildung im Warburg-Versuch in Abhängigkeit von der Zeit, wobei zwei Gruppen von Vergleichsversuchen einbezogen sind, d.h. die präparationsfreie Testlösung, die den Verlauf der konventionellen Gärung kennzeichnet, und die hefefreie Testlösung mit dem Präparat, die keine nennenswerte Beeinflussung der Gärung ergibt.
Die Zusammensetzung der Lösungen war wie folgt:
<tb><TABLE> Columns=2
<tb><SEP>Lösung l:<SEP>50 ml Grundmedium + 50 mg Bäckerhefe
<tb><SEP>Lösung II:<SEP>10 ml Lösung 1 + 50 mu l Extrakt VII
<tb><SEP>Lösung III:<SEP>10 ml Lösung 1 + 50 mu l Extrakt VII
<tb><SEP>Lösung lV:<SEP>10 ml Grundmedium + 50 mu l Extrakt VII
<tb><SEP>Lösung V:<SEP>10 ml Grundmedium + 50 mu l Extrakt VII
<tb></TABLE>
Beispiel 10
Kombination eines stoffwechselaktiven eiweissfreien tierischen Extrakts mit einem stoffwechselaktiven eiweissfreien pflanzlichen Extrakt, und zwar Kombination von Blutextrakt V (Beispiel 7) mit Hefeextrakt VII (Beispiel 9) unter Bildung von Extrakt VIll
Blutextrakt V und Hefeextrakt VII werden im Verhältnis 3:10 vermischt und nach pH-Einstellung auf 6,7 sterilfiltriert (0,1 mu m-Filter). Die analytischen Kennzahlen und Eigenschaften sind folgende: Extrakt VIII
<tb><TABLE> Columns=3
<tb><SEP>pH<SEP>6,7
<tb><SEP>N<SEP>0,34%
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>Trockenrückstand<SEP>4,2%
<tb><SEP>Atmungssteigerungsfaktor (Warburg)<SEP>4,07
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>Aminosäuren<SEP>positiv
<tb><SEP>Peptide<SEP>positiv
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>Nucleinsäurekomponenten<SEP>positiv
<tb><SEP>Sterilität<SEP>keimfrei
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>Pyrogenität<SEP>pyrogenfrei
<tb><SEP>Vorverlegung der Metamorphose von Xenopus laevis<CEL CB=3 AL=L>16 Tage
<tb><SEP>Kompensation KCN-geschädigter Zellatmung von Leberhomogenat<SEP>siehe Beschreibung ab S. 91
<tb><SEP>Padberg-Test<SEP>59 (80)
<tb><SEP>Corneometer-Test:
<tb><CEL CB=2 AL=L>Hautfeuchtigkeitshaltevermögen<SEP>24% Verbesserung
<tb></TABLE>
Der im Folgenden beschriebene Test zeigt, dass der hier untersuchte Extrakt VIll eine durch KCN geschädigte Zellatmung von Rattenleberhomogenat z.T. kompensieren kann:
Im Warburg-Modell wurde der Einfluss des Extrakts VIll auf ein mit KCN vergiftetes Leberhomogenat geprüft:
<tb><TABLE> Columns=3
<tb><SEP>1.1<SEP>Leberhomogenat mit dem Atmungsfaktor<SEP>F = 1,00
<tb><SEP>wird durch einen KCN-Gehalt von 3 nM (End-Konzentration im Ansatz) in seiner
Atmungsfähigkeit gemindert auf<SEP>F = 0,75
<tb><SEP>1.2<SEP>Durch Zusatz des atmungssteigernden Extrakts VIll mit dem Wert<SEP>F = 4,07
<tb><SEP>kann die Zellatmung des teilweise durch KCN vergifteten Leberhomogenats von<SEP>F = 0,75
<tb><SEP>angehoben werden auf den Wert<SEP>F = 3,22
<tb></TABLE>
Versuchsdurchführung: (vgl. auch Atmungssteigerungs-Test auf Seite 41-44 Lösungen ebenda)
Kegelförmige Warburg-Gefässe mit einem Zylindereinsatz (ZE) und einem Seitenarm (SA) und einem Volumen von ca. 13 ml werden gemäss Füllplan gefüllt (Angaben in ml): Tabelle XXII.
<tb><TABLE> Columns=11 Tabelle XXII
<tb>Head Col 2 to 3 AL=L: Thermobarometer TB
<tb>Head Col 4 to 5 AL=L: Atmung
normal
<tb>Head Col 6 to 7 AL=L: Atmung
+ VIII
<tb>Head Col 8 to 9 AL=L: Atmung
+ KCN
<tb>Head Col 10 to 11 AL=L: Atmung
+ KCN + VIll
<tb>Head Col 2 AL=L: 1
<tb>Head Col 1: 2
<tb>Head Col 2: 3
<tb>Head Col 3: 4
<tb>Head Col 4: 5
<tb>Head Col 5: 6
<tb>Head Col 6: 7
<tb>Head Col 7: 8
<tb>Head Col 8: 9
<tb>Head Col 9:
10
<tb><SEP>Puffer [HR]<SEP>3,00<SEP>3,00<SEP>1,50<SEP>1,50<SEP>1,50<CEL AL=L>1,50<SEP>1,40<SEP>1,40<SEP>1,40<SEP>1,40
<tb><SEP>Puffer [SA]<SEP>0,25<SEP>0,25<CEL AL=L>0,25<SEP>0,25<SEP>0,25<SEP>0,25
<tb><SEP>KCN [HR]<SEP>0,10<SEP>0,10<SEP>0,10<CEL AL=L>0,10
<tb><SEP>6 N KOH (ZE)<SEP>0,20<SEP>0,20<SEP>0,20<SEP>0,20<SEP>0,20<SEP>0,20<CEL AL=L>0,20<SEP>0,20<SEP>0,20<SEP>0,20
<tb><SEP>VIll<SEP>0,25<SEP>025<SEP>0,25<CEL AL=L>0,25
<tb><SEP>Leberhomogenat [HR]<SEP>1,50<SEP>1,50<SEP>1,50<SEP>1,50<SEP>1,50<CEL AL=L>1,50<SEP>1,50<SEP>1,50
<tb><SEP>Messwerte<SEP>siehe S. 94-97
<tb>
* KCN-Konzentration 3,0 nM im Gemisch (Ansatz)
<tb></TABLE>
Die Lösungen werden in der angegebenen Reihenfolge einpipettiert. Zur Erhöhung der KOH-Oberfläche werden in die Zylindereinsätze gefaltete Filterstreifen eingesetzt. Sofort nach Beendigung der Füllung werden die Gefässe mit den passenden Schlauchventilstopfen am Seitenarmansatz dicht verschlossen, die Gefässe an den Manometern befestigt und mit Klammern oder Paketgummis gesichert. Die Manometer werden bei geöffneten Hähnen in die auf 37 DEG C temperierte Apparatur eingehängt und 60 Minuten geschüttelt, um die Reaktionslösung zu temperieren und die anfänglich sehr schnelle Atmung etwas abklingen zu lassen.
Danach werden die rechten Manometerschenkel mithilfe des Quetschhahns auf die Marke "15" eingestellt, die Differenz der linken Schenkel zu "15" notiert, die Manometerhähne geschlossen und die Lösungen aus den Seitenarmen durch Kippen in die Haupträume überführt (0-Zeit). Nach je 20 Minuten wird die Schüttelvorrichtung abgestellt, die rechten Manometerschenkel auf "15" eingestellt (V = konst.) und die Differenz der linken Schenkel zu "15" (Druckdifferenz h bei konstantem Volumen und konstanter Temperatur) notiert.
Der Versuch läuft bis zu einer Messdauer von 100 Minuten. Nach der letzten Ablesung werden die Manometerhähne geöffnet und die Volumina der Gefässe und der dazugehörigen Manometer notiert.
Die für die Druckdifferenzen als Folge des Sauerstoffverbrauchs gemessenen h-Werte in mm sind in den folgenden Versuchsprotokollen a-d zusammengefasst.
Auswertung
Zunächst werden die Gefässe 3 bis 10 min den Thermobarometern (Gefäss 1/2) abgeglichen, um Luftdruck- und Temperaturschwankungen während des Versuchs auszugleichen. Danach werden die Gefässkonstanten für O2 der Gläser 3 bis 10 nach folgender Gleichung berechnet:
EMI93.1
Vg = Volumen der Gasphase (Volumen des Gefässes und des Manometers bis zur Marke "15" abzüglich Vf). Vf = Volumen der im Gefäss enthaltenen Gesamtflüssigkeit. T = Versuchstemperatur in DEG K. alpha = Bunsenscher Absorptionskoeffizient ( alpha O2 37 DEG C = 0,0239). P0 = 1 atm, gemessen in mm Brodie'sche Lösung (Manometerfüllung) 760 mm Hg = 10 000 mm Brodie'sche Lösung.
Der verbrauchte Sauerstoff kann nun direkt nach der Gleichung
X ( mu l O2) = h . K
berechnet werden, da die durch Atmung entstandene Kohlensäure durch die KOH vollständig absorbiert wurde (h = manometrische Differenz).
Versuchsprotokoll a
<tb><TABLE> Columns=6
<tb>Head Col 1 to 2 AL=L: Atmungssteigerung des Leberhomogenats ohne Zusätze (AT-Faktor 1,0)
<tb>Head Col 3 AL=L: 1
<tb>Head Col 1: 2
<tb>Head Col 2: 3
<tb>Head Col 3:
4
<tb><SEP>Manometervol.<SEP>1332<SEP>1409
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>Gefässvolumen<CEL CB=5 AL=L>14218<SEP>13950
<tb><SEP>Zeit<SEP>0 Min.<SEP>-<SEP>-<SEP>- (SEP)<->(TB><SEP>20 Min.<SEP>8<SEP>5<SEP>32<SEP>30
<tb><SEP>40 Min.<SEP>12<SEP>11<SEP>55<CEL AL=L>51
<tb><SEP>60 Min.<SEP>17<SEP>14<SEP>70<SEP>67
<tb><SEP>80 Min.<SEP>21<CEL AL=L>18<SEP>86<SEP>82
<tb><SEP>100 Min.<SEP>23<SEP>21<SEP>99<SEP>95
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>h-korrigiert<SEP> 22<SEP>77<SEP>73
<tb><SEP>KO2<SEP>1,074<CEL AL=L>1,057
<tb><SEP> mu l O2<SEP>82,7<SEP>77,2
<tb><SEP>Mittelwerte<CEL CB=5 CE=6 AL=L>80,0 mu l O2
<tb><SEP>AT-Faktor<SEP>F = 1,00
<tb></TABLE>
Versuchsprotokoll b
<tb><TABLE> Columns=6
<tb>
<tb>Head Col 1 to 2 AL=L:
Atmungssteigerung des Leberhomogenats (AT-Faktor 1,0) durch Zusatz von Extrakt VIII
<tb>Head Col 3 AL=L: 1
<tb>Head Col 1: 2
<tb>Head Col 2: 5
<tb>Head Col 3: 6
<tb><SEP>Manometervol.<SEP>1323<SEP>1346
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>Gefässvolumen<CEL CB=5 AL=L>13432<SEP>14514
<tb><SEP>Zeit<SEP>0 Min.<SEP>-<SEP>-<SEP>- (SEP)<->(TB><SEP>20 Min.<SEP>8<SEP>5<SEP>163<SEP>158
<tb><SEP>40 Min.<SEP>12<SEP>11<SEP>67<CEL AL=L>61
<tb><SEP>60 Min.<SEP>17<SEP>14<SEP>119<SEP>108
<tb><SEP>80 Min.<SEP>21<CEL AL=L>18<SEP>36<SEP>32
<tb><SEP>100 Min.<SEP>23<SEP>21<SEP>61<SEP>55
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>h-korrigiert<SEP> 22<SEP>321<SEP>299
<tb><SEP>KO2<SEP>1,004<CEL AL=L>1,101
<tb><SEP> mu l O2<SEP>322,3<SEP>329,2
<tb><SEP>Mittelwerte<SEP>325,8 mu l O2
<tb><SEP>AT-Faktor von Extrakt VIII<SEP>F = 0,75 (Steigerung
> 300%)
<tb></TABLE>
Versuchsprotokoll c
<tb><TABLE> Columns=6
<tb>Head Col 1 to 2 AL=L: Hemmung der Atmung von Leberhomogenat (AT-Faktor 1,0) durch Zusatz von 3 nM KCN
<tb>Head Col 3 AL=L: 1
<tb>Head Col 1: 2
<tb>Head Col 2: 7
<tb>Head Col 3: 8
<tb><SEP>Manometervol.<SEP>1263<SEP>1329
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>Gefässvolumen<CEL CB=5 AL=L>14415<SEP>14293
<tb><SEP>Zeit<SEP>0 Min.<SEP>-<SEP>-<SEP>- (SEP)<->(TB><SEP>20 Min.<SEP>8<SEP>5<SEP>20<SEP>21
<tb><SEP>40 Min.<SEP>12<SEP>11<SEP>36<CEL AL=L>39
<tb><SEP>60 Min.<SEP>17<SEP>14<SEP>-50<SEP>50
<tb><SEP>80 Min.<SEP>21<CEL AL=L>-18<SEP>-65<SEP>-65
<tb><SEP>100 Min.<SEP>-23<SEP>-21<SEP>-77<SEP>-77
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>h-korrigiert<SEP> 22<SEP>55<SEP>-55
<tb><SEP>KO2<SEP>1,103<CEL AL=L>1,080
<tb><SEP> mu l O2<SEP>60,7<SEP>59,4
<tb><SEP>Mittelwerte<CEL CB=5 AL=L>60,1 mu l O2
<tb><SEP>AT-Faktor von KCN<SEP>F = 0,75 (Abnahme 25%)
<tb></TABLE>
Versuchsprotokoll d
<tb><TABLE> Columns=6
<tb>Head Col 1 to 2 AL=L: Atmungssteigerung der durch KCN
gehemmten Leberhomogenat-Atmung
nach Zusatz von Extrakt VIII
<tb>Head Col 3 AL=L: 1
<tb>Head Col 1: 2
<tb>Head Col 2: 9
<tb>Head Col 3: 10
<tb><SEP>Manometervol.<SEP>1514<SEP>1323
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>Gefässvolumen<CEL CB=5 AL=L> 14535<SEP>13007
<tb><SEP>Zeit<SEP>0 Min.<SEP>-<SEP>-<SEP>- (SEP)<->(TB><SEP>20 Min.<SEP>8<SEP>5<SEP>67<SEP>64
<tb><SEP>40 Min.<SEP>12<SEP>11<SEP>151<CEL AL=L>148
<tb><SEP>60 Min.<SEP>-17<SEP>-14<SEP>-46<SEP>-76
<tb><SEP>80 Min.<CEL AL=L>-21<CEL AL=L>-18<SEP>-76<SEP>-101
<tb><SEP>100 Min.<SEP>-23<SEP>-21<SEP>-102<SEP>-142
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>h-korrigiert<SEP> -22<SEP>-233<SEP>-268
<tb><SEP>KO2<CEL CB=5 AL=L>1,102<SEP>0,966
<tb><SEP> mu l O2<SEP>256,8<SEP>258,
9
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>Mittelwerte<CEL CB=5 AL=L>257,9 mu l O2
<tb><SEP>AT-Faktor<SEP>F = 3,22
(Steigerung ca. 275%)
<tb></TABLE>
Der Extrakt VIII zeigte ausserdem aphrodisiakatische Wirkung, wie die folgenden Versuche erkennen lassen:
Der Extrakt VIII wurde zur Gewinnung des Feststoffes eingeengt und männlichen Ratten, die nicht besonders paarungsfreudig waren, 14 Tage lang täglich in Mengen von 0,15 g pro kg Extrakt VIII (fest) verabreicht. Die Ratten zeigten vom 10. Tag an eine vermehrte Ejakulation, verglichen mit den Kontrolltieren. Dieser Effekt hielt ca. 3 Wochen an und konnte verstetigt werden.
In einem anderen Versuch mit 5000 Mäusen wurde die Potenz männlicher Mäuse durch Gabe von Torula-Hefe ins Trinkwasser gehemmt, was aus der Literatur seit langem bekannt ist [Lit. 12]. Diese Potenzhemmung konnte durch Gaben des Extrakts VIII aufgehoben werden, sodass die Anzahl der neugeborenen Mäuse wieder auf ein normales Niveau anstieg. Diese Versuche sind mit 1000 männlichen und 4000 weiblichen Mäusen durchgeführt worden.
Im Folgenden wird gezeigt, dass der Extrakt VIII auch eine bemerkenswerte Radikalfängerwirkung besitzt.
Nachweismethode:
Zur Bestimmung der Radikalfängerwirkung in vitro lässt sich das System "Hyaluronsäure, Xanthin, Xanthinoxydase" (nachstehend als "HXX-System" bezeichnet) heranziehen.
Prinzip:
Es ist bekannt, dass Hyaluronsäure in Phosphatpuffer 7,4 schnell durch Hydroxyl-Radikale abgebaut wird, die durch Einwirkung des Enzyms Xanthinoxydase auf Xanthin freigesetzt werden. Die Depolymerisation der Hyaluronsäure lässt sich durch Messung der Viskositätsabnahme messen. Zusatz von Radikalfängern hemmt den Hyaluronsäure-Abbau und führt zu einer Hemmung der Viskositätsabnahme. Der Viskositätsabfall der Hyaluronsäurelösung ist ein Mass für die Wirkung freier Hydroxyl-Radikale.
Dies ergibt sich aus der beiliegenden Fig. 12, in der die Depolarisation der Hyaluronsäure, bestimmt durch Messung der Viskositätsabnahme des HXX-Systems mit verschiedenen Zusätzen grafisch dargestellt ist.
In der Fig. 12 bedeuten:
1. System HXX ohne Enzym
2. System HXX mit Enzym
3. System HXX mit Extrakt VIII (Beispiel 10)
4. System HXX mit Hefeextrakt VIl (Beispiel 9)
5. System HXX mit Thymus-Extrakt lVc (Beispiel 6)
6. System HXX mit Blutextrakt V (Beispiel 7)
7. System HXX mit Colla 120 VI mit Zusätzen (Beispiel 8)
8.
System HXX mit Extrakt Ic und proteinhaltiger Rindernieren-Extrakt (konserviert)
Versuchsansätze:
<tb><TABLE> Columns=4 Hyaluronsäurelösung
<tb>Head Col 1: Reagentien (Prüflösung pH 7,4)
<tb>Head Col 2: ohne Hydroxyl-Radikale (ml)
<tb>Head Col 3: mit Hydroxyl-Radikalen (ml)
<tb>Head Col 4: mit Hydroxyl-Radikalen
+ VIII (ml)
<tb><SEP>Hyaluronsäure<SEP>10,00<SEP>10,00<SEP>10,00
<tb><CEL AL=L>Phosphatpuffer/Xanthin-Lösung<CEL AL=L>-<SEP>2,50<SEP>2,50
<tb><SEP>Xanthinoxydase<SEP>0,15<SEP>0,15<SEP>0,15
<tb><CEL AL=L>Phosphatpuffer<SEP>2,50<SEP>- (SEP)<->(TB><SEP>VIII (Testlösung)<SEP>0,15<SEP>-<CEL AL=L>0,15
<tb><SEP>Aqua. dest.<SEP>2,20<SEP>2,35<SEP>2,20
<tb></TABLE>
Endkonzentrationen der wässrigen Prüflösungen: 0,425% Hyaluronsäure, 66,0 mM Phosphatpuffer 7,4; Xanthin 0,6 mM, Xanthinoxydase: 0,10 U/ml (vgl. auch: Lengenfelder, E., Fink, R., "Der oxydative Hyaluronsäureabbau, Mechanismus und Konsequenzen", Springer-Verlag, Berlin 1986).
Die Prüfungslösungen werden 40 min bei 37 DEG C inkubiert, 10 min auf 20 DEG C im Wasserbad abgekühlt; nach weiteren 35 min erfolgen die Viskositätsmessungen bei 20,00 DEG C mithilfe eines Präzisionsviskosimeters.
Ergebnisse in Fig. 12, für VIII vgl. Nr. 1, 2 und 3.
Beispiel 11
Verwendung tierischer und/oder pflanzlicher Organextrakte mit atmungssteigerndem, d.h. sauerstoffaktivierendem Effekt und mit Radikalfängerwirkung in der Technik
In der obigen Beschreibung ist bereits darauf hingewiesen worden, dass die für kosmetische und medizinische Anwendungen wichtige Zellstoffwechselaktivität, die unter anderem eine gesteigerte Energieproduktion zur Folge hat, weitere Anwendungsmöglichkeiten erwarten liess, und zwar auf Grund der mit der Stoffwechselaktivierung gleichzeitig einhergehenden Sauerstoffaktivierung und Radikalfängerwirkung.
Die in den vorstehenden Beispielen für biologische Anwendungen hergestellten Organextrakte sind meist stark gereinigt, z.B. auch desodoriert und sterilfiltriert worden. In einigen Fällen wurde sogar Pyrogenfreiheit angestrebt. Eine so intensive Behandlung bzw. Reinigung der Extrakte erscheint im Falle technischer Anwendungen, z.B. als Stabilisatoren für Farblösungen, insbesondere Lacken auf Wasserbasis (wie sie heute bevorzugt in der Automobilindustrie eingesetzt werden), oder gefärbte Systeme meist nicht erforderlich. Es wurden sowohl mit Roh-Organextrakten als auch mit proteinhaltigen und proteinfreien Extrakten positive Resultate erzielt. An Stelle einer Sterilfiltration reichte gute Konservierung mit Phenonip oder ähnlichen Konservierungsmitteln sowie Zugabe von geeigneten Lösungsmitteln und Lösungsvermittlern wie Propylenglycolen aus.
Auch Farbanstriche an Wänden konnten dauerhafter gemacht werden, wie entsprechende Langzeit-Reihenversuche über 1 bis 3 Jahre ergeben haben.
Eingesetzt worden sind folgende Organextrakte aus den Beispielen und analog hergestellten:
a) Der im Beispiel 2 beschriebene synthetische Roh-Nierenextrakt, hergestellt aus Teillösung I und Teillösung II, aber ohne Zusatz von Peptidkomponenten, ohne Sterilfiltration, konserviert mit 0,8% Phenonip und gegebenenfalls weiteren Konservierungsmittel(n).
Bei Farblösungen erwies sich die Zugabe von Lösungsvermittlern als vorteilhaft. Gearbeitet wurde auch mit schnell trocknender Alkydharzfarbe auf verschiedenen Materialien.
b) Die im Beispiel 3 beschriebenen eiweissfreien und eiweisshaltigen Rindernieren-Extrakte aus frischen Rindernieren und Zelllinien.
c) Der im Beispiel 6 beschriebene synthetische Thymus-Extrakt lVb, und zwar vor Sterilfiltration und ohne Peptidzusätze, konserviert. Ebenso eine Kombination aus IVa und lVc, analog IVb behandelt.
d) Der im Beispiel 7 beschriebene Serum-Blut-Extrakt synthetisch allein sowie auch in Kombination mit Blutextrakt aus frischem Kälberblut nach DE-OS 2 405 983, Seite 3, aber ohne im Vakuumrotationsverdampfer zur Trockne einzudampfen.
e) Der im Beispiel 8 beschriebene pflanzliche Extrakt Colla 120 VI und seine Rohform.
f) Die in den Beispielen 9 und 10 beschriebenen Extrakte VIl und VIll sowie das VII-Rohprodukt, wie es vor der Dialyse anfällt (Beispiel 9, erster Absatz).
In diesem Zusammenhang sei auch auf die im Beispiel 10 beschriebenen Versuche über den Nachweis der Radikalfängerwirkung von VIII und anderen hergestellten Organextrakten hingewiesen (vgl. auch Fig. 12).
Literaturverzeichnung [Lit.]
[1] Riemschneider R. und Quelle G., "Carcinogenity of Placenta-Extracts" in "Fragrance Journal", 57, 4, 115-122 (1982); 57, 6, 105-112 (1982).
[2] Weiss und Schleicher J. B., "A multisurface tissue propagator for mass-scale growth of cell monolayer culture" in "Biotechnol. Bioeng." 10, 601 (1968) und ibid, 10, 617 (1968).
[3] House Shearer M. & Maroudas N. G., "Method for bulk Culture of animal Cells on Plastic film" in "Exp. Cell. Research", 71, 293 (1972).
[4] Paul J. "Zell- und Gewebekulturen", W. de Gruyter, Berlin, 1980.
[5] Moore, George, E., Hasenpusch, Peter, Gerner, Robert E. & Burns, A. Alex, "A pilot plant for mammalian cell culture" in "Biotechnol. Bioengng." 10, 625 (1968).
[6] McCoy, T. A, Whittle, W. & Conway, E., "A glass helix perfusion chamber for massive growth of cells in vitro" in "Proc. Soc. Exp. Biol. (N. Y.)", 109, 235 (1962).
[7] Ubertini, B., Nardelli, L., Santero, G. & Panona, G., "Process report: Large-scale production of foot- und mouse decease virus" in "J. Biochem. Microbiol. Technol. Eng.", 2, 327 (1960).
[8] Riemschneider, R., und Hennig, K., "Nachweis von Stoffwechsel-Aktivierungen durch Organextrakte" in "RAK (Riechstoffe, Aromen, Kosmetika)", 1977, Heft 9 und 10, 12 Seiten.
[9] Sachs, L., "Angew. Statistik", 6. Aufl. Springer 242 (1944).
[10] Padberg, G., "J. Soc. Cosmetic Chemists", 20, 719-728 (1969).
[11] Seitler, L., Cyanophytaceae, Kryptogamen-Flora nach L. Rabenhorst, Vol. 14, VI + 1196, Academ. Verlagsgesellschaft, Leipzig 1932.
[12] Riemschneider, R., Veröffentlichungsreihe: Mitteilungen des physiologisch-chemischen Instituts der Universität Berlin, 1946.
[13] CRT-IST Ansaldo, Data Bank for Chemical Research, Animal Cell Lines Catalogue 1990 von Maniello, Parodi, Aresu und Romano, Mailand 1990.
[14] DSM Catalogue of Human and Animal Cell Lines, 5. Ausgabe 1995, Drexler, Dirks, MacLeod, Quentmeier, Steube, Braunschweig.
[15] ICN "Cell Biology Catalogue" 1995/96, ICN Biomedicals GmbH, 3340 Meckenheim.
[16] Reference Guide to ATCC Cell Lines and Hybridomas, 8. Ausgabe 1994, Rockville, MD 20852, USA, in Verbindung mit 1996 Ordering Catalog ATCC Cell Lines and Hybridomas.
[17] Riemschneider, R., Schulz, V., "Alkalische Phosphatase aus Rinderplazenten und ihre Stabilisierung durch zweiwertige Metallionen und Tripeptide" in "Mitt. d. Physiolog.-chem. Instituts der Universität Berlin", R 33 b, Januar 1950.
[18] Riemschneider, R., "Untersuchungen über Plazenta-Extrakte", Druckschrift aus dem Institut für Biochemie der FU-Berlin vom Januar 1962, Vortrag in Tokyo am 22. 01. 1962 im PULA-Kolloquium (in japanischer Sprache).
[19] Schachtschnabel, D., Fischer, R.-D., Zilliken, F., "Untersuchungen zur Kontrolle der Melaninsynthese in Zellkulturen", in "Z. für Physiologische Chemie", 351, 1402-1410 (1970).
The invention relates to aqueous organ extracts with improved biochemical efficiency, which have been obtained from cell lines of the corresponding organs of animals or parts of plants (hereinafter generally referred to as "organs"), processes for their preparation and their use individually or in the form of extract combinations in pharmaceutical, cosmetic and other compositions.
Organ extracts are of great importance as raw materials for pharmaceuticals and cosmetics. Fractionated spleen, blood, placenta and thymus extracts, for example, are used as active ingredients in pharmaceuticals and cosmetics ("Seifen - \ le - Fette - Wwachs" 112, 215-218 (1986)), whereby they are in many cases due to low molecular weight additives be supplemented.
Organ extracts are characterized by a large number of contents or active ingredients, which are used either as a complete extract or in the form of individual substances which are isolated from them. For example, over 100 components have been detected for placenta extracts (cf. "Cosmetics International" 6, 1-8 (1978)). The synthesis has so far not been successful for some of the individual substances of the organ extracts, especially since the effort required is often too great.
Numerous organ extracts are available today in more or less natural form, for example placenta extracts, blood extracts, thymus extracts, collagen extracts, connective tissue extracts, amnion extracts and the like, which are made from fresh organ material. The fresh organ material, for example fresh placenta, liver, kidneys, spleen, thymus, blood and the like, is washed, crushed (lastly in colloid mills) and extracted by treating the organ pulp obtained at -10 to -20 ° C. in organic Solvents for 6 to 12 days. In the case of blood, hemolysis is carried out for a long time at -15 ° C. with 3 times the amount of water (containing nipagin). If a roe extract (caviar extract) is obtained, the odorants must first be removed by steam distillation at a suitable pH.
Other preparatory measures are again required for connective tissue extracts and for plant extracts (cf. also Examples 8, 9 and 10 below).
After the aqueous crude extract has been obtained by centrifugation or filtration or other suitable measures, it is processed further to pure protein-containing or protein-free organ extracts which are sterile-filtered before freezing until further use, for example using a 0.2 μm Millipore <TM> filters. Such preparations usually still contain proteins or high-molecular protein breakdown products, which can have pathogenic and immunogenic properties and, with regular or repeated administration - usually combined with long incubation times - can lead to serious illnesses. In particular, those caused by unconventional viruses, i.e. Prions, caused clinical pictures, such as TSE (transmissible spongiform encephalopathies), in particular BSE (mad cow disease), and the Jacob Creutzfeld syndrome.
However, protein-containing placenta extracts are also known which can be carcinogenic when used on humans [Lit. 1].
Animal organ extracts have fallen into disrepute worldwide, above all because of the problems associated with prions, in particular with BSE prions. Proof that organ material comes from herds that were BSE-free can hardly be provided if large amounts of organs of certain ages are used. In order to prove BSE-free of an end product experimentally in a golden hamster model test, it takes at least 9 months - in many cases impracticable. A BSE rapid test has so far been lacking.
Combinations of low molecular weight components with organ extracts obtained from natural, fresh organ material are known from DE-OS 2 405 983 and DE-OS 2 021 969, but these also have the disadvantages described above.
In order to avoid such complications, EP-A-0 552 516 showed a way of producing water-soluble synthetic organ extracts, in which low-molecular components obtained synthetically, as they also occur in natural organ extracts, are combined with one another.
While the natural organ extracts have the disadvantages described above, the synthetic organ extracts have the disadvantage that for the most part they do not develop the full biochemical efficiency of the natural organ extracts because they lack certain components.
The object of the invention described in the present application is to provide organ extracts which at least achieve, but preferably significantly improve, the biochemical activity profile of natural and synthetic organ extracts, in particular free of undesirable substances, especially immunogenic and pathogenic proteins and protein degradation products, such as those found in natural products Organ extracts are found, and their undesirable effects are.
Although the use of exclusively synthetic organ extracts as described in EP-A-0 552 516 can avoid the disadvantages described above, their biochemical profile of action is not always satisfactory. An increase in the biochemical activity profile is now possible according to the invention by producing water-soluble organ extracts from cell lines of the corresponding organs, which may be combined with synthetically produced or natural organ extracts and which are free from allergological effects, as can be demonstrated, for example, using the patch test.
According to a first aspect, the invention relates to aqueous organ extracts with improved biochemical efficiency, which have been produced from cell lines of the corresponding organs of animals or parts of plants, as well as any combinations thereof and their use as active ingredients in pharmaceutical, cosmetic and other compositions.
According to a further aspect, the invention relates to a process for the production of aqueous organ extracts with improved biochemical efficiency from cell lines of the corresponding organs of animals or parts of plants, which is characterized by the following stages:
a) activation of the selected animal or
plant cells in a water bath of preferably 25 to 30 ° C.,
b) adding a preheated culture medium prescribed for the respectively selected cells with mixing and subsequent incubation in a manner known per se, preferably at about 37 ° C. and preferably in an atmosphere containing about 5% CO2,
c) obtaining the cells thus formed as a starting material for large cultures on surfaces or in suspension by decanting the nutrient medium, washing the resulting cell lawn with a suitable buffer and taking up the cells in a complete medium while adjusting a dilution suitable for mass production,
d) culturing the cells on surfaces, preferably in perfusion systems, on solid media and / or using the plastic film culture method (for animal cells) or
in suspension culture (for plant cells) on a large scale in a manner known per se by inoculating the cultivation apparatus with a cell suspension in a sterile CO2 / air mixture,
e) preparation of an extract by treatment of the suspended harvested cell material in an organic solvent and / or water, recovery of the aqueous phase, preferably by centrifugation, removal of residual lipid fractions from the aqueous phase by repeated treatment with the organic solvent to form an aqueous crude extract, optionally in the form of a suspension,
f) cleaning or
Treatment of the crude extract depending on the starting material and subsequent dialyzing, preferably using a Visking C 150 membrane, against an aqueous solution containing nipagin or another preservative to obtain an extract free of high molecular weight compounds as dialysate and
g) sterile filtration of the extract, preferably using a 0.2 or 0.1 μm (Millipore <TM>) filter or a PALL candle after adjusting the extract to the desired pH, preferably 5.0 to 7.2.
The water-soluble organ extracts according to the invention can be combined both with synthetic organ extracts as described in EP-A-0 552 516 and with natural organ extracts or both. Even in the case of these combinations, improved biochemical activity profiles are achieved which are better than those of the synthetic organ extracts alone and are free from the undesirable side effects of the natural organ extracts. According to the invention, it is in particular possible to produce virus-free and prion-free combinations of synthetic organ extracts and cell line extracts in a technically simple and particularly elegant manner, which is particularly important in connection with the very acute TSE problems today, especially BSE.
Preferred embodiments of the method according to the invention described above are characterized in that
an animal cell mass obtained in step (d) is suspended in ethyl ether or chloroform and left to stand in the cold room at about -10 to about -20 ° C. for about 8 to about 15 days and then centrifuged to obtain the aqueous phase;
the last traces of ether or chloroform are removed from the dialysate (external solution) in step (f) by blowing through nitrogen at pH 7.2 to 7.5; and or
in stage (a) cell cultures from commercially available cell lines including the non-commercial special cell lines mentioned in the description are used individually or in a mixture.
For the production of the organ extracts according to the invention and for the implementation of the method according to the invention are preferred
as animal cell lines at least one of the cell lines MDBK (bovine kidney cells DSM ACC 174 from the kidney of a normal adult bovine), P1-1A3 (thymic epithelial cells DSM ACC 280 from the thymic epithelium of a 6-month-old child), EBL (bovine lung cells DSM ACC 192 from the lungs of a 7 month old cattle fetus, frozen 110.
Passage), AM-C6SC8 (pig kidney cells DSM ACC 152 from a subclone of the cell line Am II, which was obtained from a normal pig kidney), BeWo (female human placenta cells ATCC CCL 98), AV 3 (human amnion Cells ATCC CCL 21), WISH (human amniotic cells ATCC CCL 25), B 95.8 (blood cells, Monkey, ATCC CRL 1612 ECACC 8501 1419, PK (15) (pig kidney cells) ATCC CCL 33) and FL (Human amniotic cells ATCC CCL 62 IZSBS BSCL 46); 3A-subE (human placenta cells) ATCC CRL-1584; BVDV + EJG (bovine capillary cells) ATCC CRL-8659; P-17 (calf thymus epithelial cells) Brastone by Dr. F. R. Pesserl, Curitiba, Paranà, Brazil; FB 5.Bm (bovine bone marrow) ATCC CRL-6043; R.Sp. (Bovine) ATCC CRL-6019; RPL 10 (bovine placenta cells from Prof. Dr.
Mariano da Rocha Filho, UFSM, Faculdade de Medicina, Santa Maria, Rio Grande do Sul, Brazil, SPI.K (Dolphin) ATCC CRL-6556; CF 37 Mg (Beagle dog, mammary gland) ATCC CRL 6230, SRC (rye cells from sturgeon, Acipenser huso from Dr. FR Pesserl, 80,000 Curitiba, Paranà, Brazil), calf thymus cell line WANK and NM FARIA, 10,000 pages. Paolo, SP, Brasil, by Prof. Dr. Dr. R. Riemschneider, Instituto Central de Quimica da UFSM, S. Maria RS, Brazil); XTH-2 (cells from the South African clawed frog Xenopus leavis DAUDIN, South African clawed toad) DSM ACC 190
and or
as plant cell lines at least one of the cell lines Acer pseudoplatanus L.
(Sycamore), Phaseolus vulgaris (from Hypocotyl of Pole Bean), Nicotiana tabacum, Solanum tuberosum (tetraploid strain), Ginkgo biloba, Pisum sativum (root), Centaurus cyanus, Daucus carota, Apium graveolens, Daucus catora, Ariumrovespiraens / or Saccharomaces cerevisiae or other Actinomycetes used.
The sterile-filtered organ extracts according to the invention obtained from animal cell lines are combined individually or in a mixture, preferably with at least one synthetically produced extract or with at least one extract made from fresh organs, or with both, the ratio by weight between the sterile-filtered organ extract obtained from animal cell lines and the synthetically produced organ extract and / or the extract made from fresh organs preferably (1 to 99) :( 99 to 1), in particular (1 to 50) :( 50 to 1), especially (1 to 20) :( 99 to 80). The same weight-quantity ratios are preferably also used when combining one or more of the animal cell extracts described above with one or more of the extracts obtained from a plant cell line.
When using plant cell lines, in step (e) the cell material suspended in water or in an organic solvent, if the cell wall material is important, is preferably broken up in an ultrasound generator and the digested material is centrifuged and washed with water by chemical and / or enzymatic partial hydrolysis digested and dialyzed.
Further preferred refinements of the method according to the invention result from claims 10 to 20.
According to a further aspect, the invention relates to the use of the aqueous organ extracts described above individually or in the form of mixtures or combinations thereof as a replacement or supplement for placenta, thymus, blood, serum, spleen, liver, collagen, connective tissue -, Amniotic fluid, jellyfish, roe and udder extracts or combinations thereof as well as for the manufacture of cosmetic formulations and for the manufacture of medical preparations for strengthening the immune system, for activating the cell metabolism or for the treatment of gastroenterological diseases, in particular ulcers, and for topical, subcutaneous, intravenous or intramuscular application for the purpose of external or internal wound healing, for the treatment of arteriosclerosis or radiation damage.
The aqueous organ extracts and extract combinations according to the invention described above are also suitable for the preparation of preparations with an aphrodisiac effect. This applies in particular to the extracts obtained from plant cell lines, preferably Ginkgo biloba, Sycamore, Saccharomyces, Torula or Cyanophyten, and their combinations with extracts based on animal cell lines, which can be used as active ingredients in preparations with aphrodisiac activity.
In addition, the invention relates to the use of the extracts and extract mixtures according to the invention, including the crude extracts, crude extract mixtures and their precursors for stabilizing and preserving colored fabrics, paints and varnishes, in particular those with water-based varnishes, and for the production of culture solutions, nutrient solutions and dietary solutions.
The invention, in particular the individual stages of the method according to the invention, are explained in more detail below with reference to the accompanying drawings.
Ad 1) Thawing frozen cell cultures from competent sources, from our own breeding or cell lines as they are commercially available (see e.g. [Ref. 13, 14, 15]), e.g. from animal cell lines, such as
MDBK (DSM ACC 174 bovine kidney cells from a normal adult bovine kidney in a medium of 95% Dulbecco's MEM + 5% FCS (fetal calf serum) as described by Martin and Darby in "Proc. Soc. Expr. Biol. Med." 98, 574 (1958), deposited with Dr. R. Riebe, BFA, Insel, Riems (Germany),
P1-1A3 (thymic epithelial cells DSM ACC 280 from the thymic epithelium of a 6 month old child in a medium of 80% RMPI 1640 + 20% FCS, as described by Fernandez in "Blood", 83, 3245-3254 (1994), described, deposited with E. Fernandez, Dr. Toribio, University of Madrid (Spain),
EBL, DSM ACC 192 bovine lung cells from the lungs of a 7-month-old bovine fetus, frozen 110.
Passage, in a medium made of 85% RPMI 1640 or MEM + 15% FCS, as described by Bechman and Schöss in "Deutsche Tieräztl. Wochenschrift." 95, 283 (1988) and ibid., 98, 310 (1992), and by Rutter and Luther in "Vet. Rec." 114, 393 (1984), deposited with Dr. V. \ ppling, Paul Ehrlich-Institut Langen (Germany),
AM-C6SC8, pig kidney cells DSM ACC 152 from a subclone of the cell line Am II, which was obtained from a normal pig kidney, in a medium of 80% medium 199 (Hanks salts) + 20% FCS), as described by Limezewski in "Mycotoxin Res." 3, 69-76 (1967), described, deposited with Dr.
Limezewski, Federal Milk Research Institute (Kiel),
BeWo, female human placenta cells ATCC CCL 98 in a medium from Waymouth's + Gey's BBS + 10% Newborn Calf Serum [Lit. 13],
AV 3, human amnion cells ATCC CCL 21 in a medium from M199 with Earle's BBS + 20% FCS [Lit. 13],
WISH, human amniotic cells ATCC CCL 25 in a medium from Eagle's MEM with Eagle's-BSB + 10% FCS *, and PK (15), pig kidney cells ATCC CCL 33 in a medium from Eagle's MEM with Eagle's BSS + 10% FCS + Na Pyruvate [Lit. 13],
B95.8 (Blood cells, Strain Marmaset, suspension culture ATCC CRL 1612 ECAGC 85011419. Medium: RPMI 1640 + 10% FCS + L-glutamine + Na pyruvate + non-essential amino acids + 2-mercaptoethanol, deposited with G.B.
Ferrara, Servizia di lmmunogenetica, Istituto Nazionale per la Ricerca, 16132 Genoa (Italy),
FL (human amnion cells ATCC CCL62 IZSBS BSCL46 in a medium Eagle's MEM with Earle's BSS + 10% FCS, described in "Proc. Soc. Exp. Biol. Medicine", 94, 532 (1957), deposited with: M. Ferrari, Istituto Zooprofilattico Sperimentale, 25100 Brescia, Italy);
RPL 10 (bovine placenta cells, bos taurus, in a medium from Waymouth's + Gey's BBS + 8% Newborn Calf serum, origin: Professor Dr. Mariano da Rocha Filho, Reitor da UFSM, Faculdade de Medicina, Santa Maria Rio Grande do Sul , Brazil, and Dr. G. da Roche Filho da UFSM, Bioquìmica, lstituto Central de Química, Santa Maria, RS, Brazil;
SRC, rye cells from sturgeon, Acipenser huso, Volga, in a medium made from 85% Dulbecco's MEM + 10% Gay's BBS + 5% FCS, deposited with Brastone, Dr. F. R.
Pesserl, 82500 Curitiba, Parana, Brazil;
P-17, thymic epithelial cells from thymic epithelium of a 4-month-old calf in a medium of 80% RMPI 1640 + 20% FCS, deposited with Dr. F.R. Pesserl, Brastone, 82500 Curitiba, Parana, Brazil;
CHSE-214 Fish: Chinook Salmon Embryo NBL-4 (EB Tr) Bovine embryonic trachea [Lit. 15];
3A-sub E (human placenta cells) ATCC-CRL-1584 in medium from Waymouth's + Gay's BBS + 15% Newborn Calf Serum, catalog: "ATCC Cell lines and Hybridomas", Rockville, MD 20852, USA, 1996;
BVDV + EJG (cattle, bos taurus, capillary epithelium ATCC CRL-8659 in medium Eagle's MEM + 20% FCS;
Catalog: "ATCC Cell lines and Hybridomas", USA 1996 (see above));
FB 3 Sp / Thy (beef, bos taurus, normal) ATCC-CRL 6039, catalog as above;
E.g.
(Beef, bos taurus, normal) ATCC-CRL 6019, catalog as above;
CF 37 Mg (dog, Canis familiaris, Beagle ATCC CRL 6230, Mammary gland, normal), catalog as above;
PTI.Sp. (Chimpanzee, Pan troglodytes spleen) ATCC CRL 6315, catalog as above;
FB5.BM (cattle, bos taurus, bone marrow, normal) ATCC CRL 6043, catalog as above;
DBI. Tes (Delphin, Pacific common, Delphinus bairdi, Testes, normal) ATCC CRL 6258, catalog as above;
Spl.K (dolphin, stenella plagiodon, kidney, normal) ATCC CRL 6262, catalog as above; and
L01.HT (sea turtle, Lepidochelys olivacea, heart) ATCC CRL 6556, catalog as above, or
of suitable plant cell lines, e.g. can be grown in suspension cultures, such as
Acer pseudoplatanus L. (Sycamore) after D.T. A. Lamport & D.H. Northcote, "Nature (London)" 188, 665-666 (1960) and L.G. Nickell, "Proc. U.S. Nat. Acad.
Sci. "42, 848 (1956), (see also Example 8 below),
Phaseolus vulgaris (from Hypocotyl of Pole Bean) in modified White's medium, grown according to L.G. Nickell, "Proc. U.S. Nat. Acad. Sci." 42, 848-850 (1956),
Nicotiana tabacum after D. K. Dougall & K. Shimbayshi, "Plant Physiology" 33, 396-404 (1960),
Solanum tuberosum (tetraploid strain) according to D.T. A. Lamport, "Adv. Bot.
Research "2, 168 (1965): Michigan State University Atomic Energy Commission Plant Research Laboratory,
Ginkgo biloba, Pisum sativum (root), Centaurus cyanus, Daucus carota, Apium graveolens (as above),
Saccharomyces cerevisiae Hansen from the Asmussen yeast factory, Elmshorn near Hamburg (baking yeasts, distillery yeasts, top-fermented beer yeasts), commercial brewery and baker's yeasts or yeasts such as Torula utilis, Saccharomyces cerevisiae var Saccharomyces lactis (milk sugar-fermenting yeasts), Candida utilis (formerly Torulopsis utilis) and Candida tropicalis (technical feed and nutritional yeasts) and others,
Nostoc commune VAUCHER and other cyanophytes such as Arthrospira, Nostoc mucosum etc. Rabenhorst, Algae. Eur. No. 28 etc. Wittr. Nordst., Alg. Exsicc. No. 497 etc.
Occurrence: cosmopolitan, on the edge of salt marshes [Lit. 11];
Tree pollen cells: Acer negundo (Box Elder);
Betual alba (White Birch; Olea europeae (Evergreen olive);
Ulmus pumila (Chinese Elm); Quercus rubra (Northern Red Oak).
Pollen (grass pollen): Cynodon dectylon (Bermuda);
Poa pratensis (Kentucky Blue); Secale cerate (Cultivated Rye).
Become pollen: Artemisia absinthum (Wormwood); Iva xantifolia (Giant Poverty);
Ambrosia elatior (Short Rogweed).
Rivularia bullata (poir), Berkeley, Glean, Brit. Alg. P. 1833.
Occurrence: cosmopolitan, in the ebb and flow zone; [Lit. 11],
Calothrix pulvinata Kg., Syth. Alg., P. 71, 1824. Occurrence on rocks, wood, algae (Europe, North America, Australia); [Lit. 11], and
Romeria elegans Wollszynska, found in Koczw, in a pond near Lwòw.
Ad 2) Incubate the respective cell cultures according to the supplier's instructions.
Ad 3) Obtaining cells as the starting material for large cultures on surfaces or in suspension in a manner known per se, namely animal cells on surfaces, vegetable cells in suspension.
Culturing the cells on surfaces e.g. in perfusion systems (according to Weiss and Schleicher [Ref. 2]), on solid media and / or according to the plastic film culture method (according to House, Scherer and Maroudas [Ref. 3]) on a large scale.
Extraction by treatment of the suspended harvested cell material at preferably -10 to -20 ° C. in organic solvents for preferably 6 to 12 days.
Ad 4) Production of an extract by obtaining the aqueous crude extract, preferably by centrifuging at, for example, 3000 rpm and
Further processing to pure, protein-containing or protein-free organ extracts, which are sterile filtered before being stored.
In the event that the selected cell line grows in suspension culture, the "Rotary Shaker Technique", e.g. in the roller bottle apparatus (according to the attached Fig. 1), and then in suspension culture bottles, e.g. according to the accompanying FIGS. 2 and 3, continued to work.
The suspension cultures on a very large scale are then in 50 L to 1500 L fermenters, e.g. according to Moore et al. [Lit. 5].
Pipe coil cultivators IGV from 50 L up to 2000 L for biomass production of plant cells according to the attached FIG. 6 have also proven successful.
The invention is explained in more detail below with reference to the accompanying drawings. Show it:
Fig. 1 is a Burler or roller bottle apparatus in which the cells grow on the inner surface of the Winchester or Baxter bottles, which are slowly rotated by rollers or wheels on which they lie [Lit. 4];
Fig. 2 shows a suspension culture bottle, which is made from a feeding bottle. In order to be able to add culture medium and take samples in between, the tube for renewing the culture medium and the sample tube are squeezed off with a clamp. For "feeding" the clamp is removed from the tube for renewing the culture medium and culture medium is injected through the rubber cap. The clamp is removed from the sample tube for taking samples. Then the universal container is replaced by a sterile one.
The container should not be more than a quarter full. It should be noted that the "collar" around the magnetic rod serves to keep the contact between the magnet and the bottom of the bottle as small as possible;
Fig. 3 shows a vessel that is used to grow cells in suspension. The plastic-coated magnet is rotated by a magnetic stirrer located outside the vessel;
4 shows a tissue culture apparatus with a much enlarged surface according to Weiss and Schleicher [Lit. 2] (available in Abbot laboratories), in which the principle of a perfusion system with a solid matrix according to McCoy et al. [Lit. 6] is applied.
The titanium plates placed one above the other are held together by a support frame within a glass culture vessel.
Layers of titanium plates are held together with metal rods in a cylindrical culture vessel. The amount of cell vaccination is pumped into the vessel through the access tube. The medium is pumped around inside the vessel by means of an air pump (when the gas has passed through the gas pipe, the bubbles rise in the pump pipe, causing the medium to be carried away). After the inoculation, the cells circulate in this way for some time, then the pumps are stopped for a few hours so that the cells can settle. The gas pump can then be replaced. Medium can be added or removed through the fill tube. At the end of the cycle, all medium is removed and replaced with trypsin.
The cell suspension is then removed through the fill tube.
The device is inoculated by pumping in a cell suspension. The device is charged with a sterile carbon dioxide-air mixture using the air pump in order to distribute the cells evenly. The supply of carbonated air is stopped for 2 hours for the cells to settle, then it is continued. As soon as a sufficient cell density is reached, the culture medium is pumped out and replaced with a trypsin solution. After incubation, the cell suspension can be pumped out of the machine.
This type of apparatus has the advantage that it is suitable for a very simple, closed circuit system.
5 an apparatus according to House, Scherer and Maracoudas [Lit. 3] in which a spiral made of flexible plastic in the form of a polystyrene film is used to create a large surface. Culture medium and gas are introduced through the openings. The cells grow on the plastic spiral.
A spiral made of flexible plastic with a pitch of about 4 cm is made with a suitable former and inserted vertically into a cylindrical container with an air pump that runs through the center of the spiral. To inoculate the apparatus, culture medium with the cell suspension is added.
The cells are then allowed to settle and are distributed evenly over both surfaces of the film by rotating them horizontally at a speed of 2 rpm on a roller frame. As soon as the cells adhere completely (after 3 to 18 hours, depending on the cell type), the bottles are removed from the roller and placed upright for fumigation. To ensure precise fumigation with air containing carbon dioxide, it is necessary to add an anti-foaming agent (e.g. Midland silicone, Antifoam Emulsion RD).
When growth is complete, the cells can be harvested using trypsin, like a normal roller bottle, or by scraping;
6 shows a pipe coil cultivator IGV for the production of plant cells in suspension cultures;
7a shows a device for measuring skin moisture (Corneometer CM 820 PC);
7b shows the sensor of the Corneometer CM 820 PC with a flat capacitor as the end face, which is pressed onto the skin for measuring the skin moisture;
8 shows a graphical representation of the moisture retention capacity of the skin (in h) after a single application of a skin cream without additives (control) or a skin cream with added amnion extract IIb or IIa according to Example 4 below;
9 shows a graphical representation of the change in the surface structure of human skin when viewed microscopically using the percentage change in the profile line areas (FA) and the profile line length (LL) as a function of the use of emulsion preparations containing placenta extract according to Example 5 below;
FIG. 10 shows the DC finished plate moving image of the blood extract described in Example 7 below, after two-dimensional development, from which the different amino acids contained in the blood extract can be seen;
11 is a graphic representation of the increase in fermentation of yeast by the yeast extract dialysate (according to Example 9) and
12 shows a graphic representation of the hydroxyl radical inhibitions by organ extracts as radical scavengers (scavengers on the viscosity of hyaluronic acid) (according to Example 10).
In all cases, it is important that sterile conditions are strictly adhered to, both with regard to the apparatus and with regard to the culture media which are required in considerable quantities and which have to be tested and sterilized beforehand.
With regard to cell proliferation, it can be expected on the basis of arithmetic considerations that the described large culture methods will deliver sufficient amounts of cell material, starting from a frozen cell culture, within relatively short times. Slowly growing cells multiply 10-fold in a week and 10-fold in 6 weeks <6> fold. 10 cells can be removed from one cell within 12 weeks <1> <2> cells (4 kg), within 15 weeks 10 <1> <5> cells (4000 kg) are formed.
When developing and using suitable nutrient solutions, it is important to ensure that only components are used that do not cause any pharmacologically toxicological and dermatologically undesirable effects in the desired organ extract. This applies especially in the case of a medical application of the organ extracts produced according to the invention.
The water-soluble organ extracts produced according to the invention can be combined both with synthetic organ extracts as described in EP-A-0 552 516 and with natural organ extracts or both. Even in the case of these combinations, improved biochemical activity profiles are achieved which are better than those of the synthetic organ extracts and are free from the undesirable side effects of the natural organ extracts. The invention allows in particular a technically simple and particularly elegant production of guaranteed virus-free and prion-free organ extracts which are a combination of synthetic and cell line extracts, which is particularly important in connection with the TSE problems, especially BSE.
The weight-quantity ratios to be used when combining cell extracts from animal and / or plant cell lines with corresponding synthetic cell extracts can be varied within a wide range, e.g. between (1 to 50) :( 98 to 50), preferably (1 to 20) :( 99 to 80), in particular (1 to 10) :( 99 to 90). The same applies to the extract combination, which are made from fresh organs and associated cell lines. Combinations of all three types of extract are also of interest, in many areas, for example (1 to 20) :( 1 to 10) :( rest of synthetic extract), preferably (1 to 10) :( 1 to 5) :( Rest of synthetic extract), in particular (1 to 5) :( 1 to 5) :( rest of synthetic extract), for cell line extract to the corresponding natural organ extract to the corresponding synthetic organ extract.
The stated proportions are intended to make the invention easier to understand, but the invention is not restricted to this.
As stated in EP-A-0 552 516, cited several times, by increasing the proportions of certain components, e.g. Glycine up to 4.5%, by increasing the proportions of sorbitol, mannitol up to 6% and by increasing the proportions of panthenol up to 35%, achieve special cosmetic effects that natural extracts are lacking (cf. Example 2, Table 11, of EP-A-0 552 516). In Example 8 below, a corresponding measure is described for the Sycamore extract VI.
Table I below summarizes some of the animal cell lines used for extract production in the examples described below and which can be used according to the invention.
The preparation of a bovine kidney extract from the MDBK cell line is described in Example 1 below.
The preparation of a combination of the extract obtained in Example 1 with an aqueous synthetic bovine kidney extract is described in Example 2.
The combination of the extract obtained in Example 1 with an extract made from fresh beef kidneys is described in Example 3.
Other extract productions in which e.g. Plant cell lines are also used, are described in Examples 4 to 11.
<Tb> <TABLE> Columns = 5 Table I
<tb> Head Col 1: No.
<tb> Head Col 2: cell line
<tb> Head Col 3: cell line type
<tb> Head Col 4: description
<tb> Head Col 5: culture medium
<Tb> <September> 1 <September> MDBK <September> bovine kidney
DSM ACC 174 <SEP> from a kidney of a normal adult cattle <SEP> 95% Dulbecco's MEM +
5% FCS <1)>
<Tb> <September> 2 <September> P1-1A3 <September> thymic epithelial cells
DSM ACC 280 <SEP> from the thymic epithelium one
6 month old child <SEP> 80% RPMI 1640 +
20% FCS <2)>
<Tb> <September> 3 <September> EBL <September> bovine lung cells
DSM ACC 192 <SEP> from the lungs of a 7 month old bovine fetus; frozen, 110.
passage <SEP> 85% RPMI 1640 or MEM + 15% FCS <3)>
<Tb> <September> 4 <September> AM C6SC8 <CEL AL = L> Pig kidney cells
DSM-ACC 152 <SEP> from a subclone of the cell line AM II, which was obtained from a normal pig kidney <SEP> 80% medium 199 (Hanks-
Salts) + 20% FCS <4)>
<Tb> <September> 5 <September> Bewo <September> human placental cells,
female ATCC CCL 98 <SEP> Waymouth's + Gay's BBS + 10% Newborn Calf Serum <5)>
<Tb> <September> 6 <SEP> AV 3 <CEL AL = L> Human amniotic cells
ATCC CCL 21 <September> Medium:
M199 with Eagle's BBS + 20% FCS <5)>
<Tb> <September> 7 <September> WISH <CEL AL = L> Human amniotic cells
ATCC CCL 25 <SEP> Eagle's MEM with Eagle's BSB + 10% FCS <5)>
<Tb> <September> 8 <SEP> PK (15) <CEL AL = L> Pig kidney cells ATCC CCL 33 <SEP> Eagle's MEM with Eagle's BSS + 10% FCS + Na pyruvate <5)>
<Tb> <CEL AL = L> 9 <September> B95.8 <September> blood cells
Strain marmoset
ATCC CRL 1612
ECACC 85011419 <SEP> RPMI 1640 + 10% FCS +
L-glutamine + Na pyruvate + non-essential amino acids + 2-mercaptoethanol <6)>
<Tb> <September> 10 <September> FL <September> human amniotic cells
ATCC CCL 62
IZSBS BSCL46 <SEP> Eagle's MEM with Earle's BSS + 10% FCS <7)>
<Tb>
<1)> Madin & Darby, "Proc. Soc. Exp. Biol. Med.", 98, 574 (1958). Filing: Dr. R. Riebe, BFA, Insel, Riems, Germany
<2)> Fernandez, "Blood", 83, 3245-3254 (1994). Filing: E. Fernandez, Dr.
Toribio, university
Madrid, Spain
<3)> Beckmann and Schöss, "Deutsche Tierärztliche Wochenschrift", 95, 283 (1988); ibid, 98, 310, Rutter and Luther, "Vet. Rec.", 114, 393 (1984). Filing: Dr. V. \ ppling, Paul Ehrlich Institute, Langen, Germany
<4)> Limezewski, "Mycotoxin Res.", 3, 69-76 (1987). Filing: Dr. Limezewski, Federal Institute for Milk Research, Kiel
<5)> CRC-IST Ansaldo, Data Bank for Biochemical Research, Animal Cell Lines Catalog 1990 by Manniello, Parodi, Aresu, Romano, Milan 1990
<6)> Deposit: G.B. Ferrara, Servizion di Immunogenetica, Istituto Nazionale per la Ricerca,
16132 Genova, Italy
<7)> "Proc. Soc. Exp. Biol. Medicine", 94, 532 (1957): Filing: M. Ferrari, Istituto Zooprofilattico Sperimentale, 25100 Brescia, Italy.
<Tb>
<Tb> </ TABLE>
The extracts are usually characterized by the following key figures:
pH value, dry residue (5 h at 105 ° C), N content (according to Kjeldahl), amino acid determination: qualitative using ninhydrin and thin-layer chromatography (TLC), peptide detection: using a biuret reagent, protein freedom (using sulfosalicylic acid), nucleic acid components : TLC, carbohydrate components: TLC, UV spectrum (1:50 or 1: 100), HPLC, sterility tests according to DAB 10.
In the case of medical use of extracts, testing for pyrogens in the rabbit or LAL test is required. Particular key figures that are used to characterize extracts are the hydroxyproline determination e.g. for connective tissue extracts and plant extracts, as can be obtained from cyanophytes, or as described for Colla 120 in Example 8 of this invention. Roe extracts can be characterized by appropriate fatty acid determinations. The protein-free yeast extract treated in Example 9 can be characterized by its high fermentation-increasing activity in the WARBURG test (cf. FIG. 11). The same applies to the increase in breathing.
Dermatological tolerance and toxicology were tested in the usual way using the following methods:
Table II
Acute toxicity test after intravenous application to the mouse.
Cumulative toxicity test after 7 days of oral application to the mouse.
Clinical-toxicological observations after intravenous administration in the mouse (screening by R. T. Turner): 2 g / kg, 10 g / kg, 20 g / kg mouse.
Open epicutaneous sensitization test on guinea pigs over 3 weeks (according to Bühler).
Rabbit eye irritation test based on "Appraisal of the Safety of Chemicals in Foods, Drugs and Cosmetics" by The Staff of Division of Pharmacology, FDA, Evaluation of Eye Lesions according to Draize, 1959.
Testing for primary skin irritation in rabbits based on "Appraisal of the Safety of Chemicals in Foods, Drugs and Cosmetics" by The Staff of Division of Pharmacology, FAD, Skin Toxicity according to Draize, 1959.
Clinical-allergological test in a patch test in humans.
Ames test: To test for mutagenic effects, the Ames test is used without and with metabolic activation: mutagenicity test (screening).
Absence of viruses and prions: It can be guaranteed by using cell cultures from competent sources. The problems with fresh organ material mentioned in the introduction to the description above (p. 2) are completely eliminated according to the invention.
The lege artis i.e. Organ extracts according to the invention produced according to GMP (good manufacturing practice) passed all the tests mentioned without any problems - as has also been observed for the already known synthetic organ extracts and also for the organ extracts obtained from fresh organ material, provided that they have been properly produced. Further information can be found in the examples below.
The mode of action of all of the above extracts was compared and supported using the following tests (biochemical and biological tests):
<Tb> <TABLE> Columns = 3 Table III
Methods for testing the effects of organ extracts
<tb> Head Col 1: No.
<tb> Head Col 2: method
<tb> Head Col 3: Description [Lit.]
<Tb> <September> 1 <SEP> measuring the increase in tissue respiration e.g. of liver homogenate from a rat or guinea pig in the Warburg test to determine the
Breathing increase factor (breathing of the liver homogenate is fixed at 1.0):
factor statement <SEP> from p. 41 [lit. 8th]
<Tb> <September> 2 <SEP> growth test to assess the increase in metabolic activity, for example by measuring the growth of
<Tb> <SEP> a) Guppy fishing by measuring the length in mm after 20 days [Tp 80-100], (control values in parentheses) <September> S. 74/75
<Tb> <SEP> b) tadpoles of Xenopus laevis DAUDIN by length measurement,
Weight gain and advance of the metamorphosis (start and end when converting to frog) in days <September> S. 73-74
<Tb> <September> 3 <SEP> measurement of skin smoothing using the modified PADBERG method using 3% w / w emulsions after 14 days of use;
Measurement of the photometer values in% of "treated" compared to the initial state (control values in brackets) <SEP> from p. 62 [lit. 10]
<Tb> <September> 4 <SEP> profile line measurement after image analysis;
the profile line areas FA and the line length LL are assessed <SEP> from p. 55
(see also Fig. 9)
<Tb> <September> 5 <SEP> Comparison of fibroblast growth using thymidine incorporation rate with and without formalin damage; Checking compensation of the formalin-damaged fibroblasts after 6 days <SEP> from p. 71/72
<Tb> <September> 6 <SEP> Measurement of water retention using a corneometer <SEP> from p. 49
<Tb> <September> 7 <CEL AL = L> Patch test on humans, i.e. allergological test <SEP> from p. 84
<Tb> <September> 8 <SEP> Measurement of the increase in skin tension in the wound healing test
after 21 days (DELTA values) <September> S. 39/40
<Tb> </ TABLE>
Some of the results obtained are summarized in Tables IV and V, which relate to Examples 1 to 4 of the present application.
Table IV
Comparison of the effectiveness of the bovine kidney extracts la, lb and Ic prepared according to Examples 1, 2 and 3
The serial numbers in the left column refer to the test methods listed in Table III under No. 1-8:
<Tb> <TABLE> Columns = 2
<Tb> <September> la: <SEP> bovine kidney extract from the MDBK cell line
<Tb> <September> lb: <SEP> cell line extract la combined with a synthetic bovine kidney extract
<Tb> <September> lc: <SEP> cell line extract la combined with a natural beef kidney extract from fresh beef kidneys
<Tb> </ TABLE>
<Tb> <TABLE> Columns = 5
<tb> Head Col 1: No.
<tb> Head Col 2: (according to Table III)
<tb> Head Col 3: la
<tb> Head Col 4: lb
<tb> Head Col 5:
ic
<Tb> <September> 1 <September> factor <September> 1.9 <September> 2.4 <September> 1.7
<Tb> <September> 2a <SEP> length in mm <CEL AL = L> 22.0 (18.0) <SEP> 23.2 (18.0) <SEP> 21.0 (18.0)
<Tb> <September> 2b <SEP> abbreviated to metamorphosis <SEP> 6 days <CEL AL = L> 10 days <SEP> 4 days
<Tb> <September> 3 <SEP> 70 (85) <SEP> 60 (85) <SEP> 70 (85)
<Tb> <September> 4 <CEL CB = 3 AL = L> FA + 6
LL -2.8 <September> +10
-2 <September> +4
-4
<Tb> <September> 5 <SEP> thymidine incorporation rate after 6 days
<Tb> <SEP> without HCHO <SEP> 350x10 <3> <SEP> 350x10 <3> <CEL AL = L> 350 x 10 <3>
<Tb> <SEP> with HCHO <SEP> 10 x 10 <3> <SEP> 10 x 10 <3> <SEP> 10 x 10 <3>
<Tb> <SEP> with HCHO + addition of <September> la <September> lb <September> lc
<Tb> <September> offset: <SEP> 280x10 <3> <SEP> 330 x 10 <3> <SEP> 250 x 10 <3>
<Tb> <September> 6 <September> ++ <SEP> +++ (SEP) <+> (TB> <September> 7 <September> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <CEL AL = L> 8 <SEP> DELTA value <September> 290 <September> 320 <September> 230 *
<Tb>
* see. also Table VIII on page 19
<Tb> </ TABLE>
The table above shows that the optimum effectiveness is achieved by combining synthetic extract with the extract obtained from a cell line: data below 1b.
Table V
Comparison of the effectiveness of the amnion extracts Ia and IIb prepared according to Example 4
The serial numbers in the left column refer to the test methods listed in Table III
<Tb> <TABLE> Columns = 2
<Tb> <September> Ila: <SEP> Amnion extract from the WISH cell line (human)
<Tb> <September> IIb: <SEP> cell line extract lIa combined with a synthetic human amniotic extract
<Tb> </ TABLE>
<Tb> <TABLE> Columns = 4
<tb> Head Col 1: No.
<tb> Head Col 2: (according to Table III)
<tb> Head Col 3: Ila
<tb> Head Col 4:
IIb
<Tb> <September> 1 <September> 2.0 <September> 2.3
<Tb> <September> 2a <SEP> 21.0 (17.0) <SEP> 22.5 (17.0)
<Tb> <September> 2b <SEP> abbreviated to metamorphosis <SEP> 2 days <SEP> 6 days
<Tb> <September> 3 <SEP> 60 (80) <SEP> 55 (80)
<Tb> <September> 4 <SEP> no measurements
<Tb> <September> 5 <SEP> without HCHO <SEP> 360 x 10 <3> <CEL AL = L> 360 x 10 <3>
<Tb> <SEP> with HCHO <SEP> 20 x 10 <3> <SEP> 20 x 10 <3>
<Tb> <SEP> with HCHO, compensated <CEL AL = L> 280 x 10 <3> <SEP> 340x10 <3>
<Tb> <September> 6 <September> ++ <September> ++
<Tb> <September> 7 <September> 0 <September> 0
<Tb> <CEL AL = L> 8 <SEP> DELTA value <September> 260 <September> 300
<Tb> </ TABLE>
From the table above it follows that an optimal effectiveness is achieved when combining (lIb) a synthetic extract with the extract (Ila) obtained from a cell line: data under Ilb.
While above it was mainly talked about water-soluble organ extracts from cell lines of corresponding animal organs, from fresh animal organs or extracts obtained by the synthetic route and a combination thereof - especially with regard to their cosmetic use as cosmetic additives and with regard to their medical use In the following, plant extracts are discussed, which can also be obtained from corresponding plant cell lines (see also p. 7). As already mentioned, this is generally carried out in suspension cultures, which is to be shown using the example below of Sycamore cell cultures (Acer pseudoplatanus L.) and of yeasts (see also Examples 8, 9, 10 below).
The further processing of the plant cell mass obtained on a large scale then depends very much on the desired plant extract itself. In the case of the extracts obtained from Sycamore, the cell wall material that contains glycoproteins in a protein-carbohydrate ratio of approx. 50:50 and whose protein components are characterized by a high content of hydroxyproline, serine, glycine etc. and thus animal is of particular interest Getting close to collagen (as is well known, hydroxyproline is the amino acid typical of collagens, which has many special features; hydroxyproline is not a building block of protein biosynthesis, only proline).
The production scheme for a "collagen-like plant extract" from Sycamore cultures is shown in Table VI. A description of how it works can be found in Example 8.
<Tb> <TABLE> Columns = 3 Table VI
Scheme of obtaining a plant extract (Colla 120) from Sycamore cell cultures (Acer pseudoplatanus L.) and use as a plant cosmetic additive in the sense of collagen replacement
<Tb> <September> 1) <SEP> Obtaining Sycamore plant material from suspension cultures:
<Tb> <SEP> Sycamore in cell culture suspension (50 ml)
<Tb> <CEL CB = 3 AL = L> & darr &
<Tb> <SEP> propagation according to the rotary shaker technique (500 ml)
<Tb> <SEP> & darr &
<Tb> <CEL CB = 2 CE = 3 AL = L> in suspension culture bottles (Bekkico Glass Inc.) (5-20 L)
<Tb> <SEP> & darr &
<Tb> <SEP> in 50 L to 4000 L fermenters or in 2000 L coil cultivators
<Tb> <SEP> & darr &
<Tb> <SEP> harvesting Sycamore cell material as powder or
suspension
<Tb> <CEL AL = L> 2) <CEL CB = 2 CE = 3 AL = L> cell wall breaking:
<Tb> <SEP> & darr &
<Tb> <SEP> broken Sycamore cell material broken in a kilowatt ultrasonic generator
<Tb> <SEP> & darr &
<Tb> <SEP> centrifuge the digested material and wash with water
<Tb> <SEP> & darr &
<Tb> <September> 3) <SEP> splitting and deproteinization:
<Tb> <CEL CB = 3 AL = L> & darr &
<Tb> <SEP> through chemical and enzymatic partial hydrolysis
<Tb> <SEP> & darr &
<Tb> <CEL CB = 2 CE = 3 AL = L> Concentration in vacuum on 10 to 15% extract
<Tb> <SEP> & darr &
<Tb> <SEP> Use as a cosmetic additive analogous to collagen in creams, lotions, masks and the like.
<Tb> </ TABLE>
A similar procedure can also be followed when starting from Solanum tuberosum, namely a tetraploid strain in suspension cultures.
The molecular weight of the cosmetic additives obtained is less than 3000. Moisture-holding capacity and other cosmetic effects of these hydrolysates are likely to be related to the low-molecular peptides contained therein, for example oligopeptides, in accordance with DE-OS 4 127 790 or constitutionally similar derivatives.
The organ extracts according to the invention and / or their combinations can not only be used cosmetically and medicinally. There are other possible uses if you consider that the cellular metabolism activation that can be demonstrated as an increase in respiration (or by other systems) also means an activation of oxygen and, in connection with this, also an influencing of radical-generating systems (radical scavenging effect). As a result, the influence of organ extracts of various types was also to be expected in areas where stabilization and preservation are desired. Corresponding tests with paint coats and dyed fabrics have shown positive effects:
Paint coats of color solutions to which animal or vegetable extracts or extract mixtures according to the invention have been added, optionally concentrated to 10-15% solids and optionally with the addition of solubilizers or solvents, have been found to be more color-stable in long-term trials and in model trials under UV radiation than the control experiments without additives. Corresponding results have also been achieved with dyed fabrics and water-based car paints of various types: longer lasting colors and less sensitive to washing out. Particularly good effects have been achieved with the extracts mentioned in Example 11 below.
The radical scavenging effect of the plant and animal organ extracts according to the invention determined for biological systems should also play a role in the effects described above. We would like to emphasize the model experiments described below in Example 10 below about the radical scavenging effect of hydroxyl radicals on hyaluronic acid and its inhibition by the organ extracts (cf. FIG. 12).
The invention is explained in more detail by the following examples, but without being restricted thereto.
example 1
Production of a bovine kidney extract from the MDBK cell line
1.1 Provision of the cell material
1.2 Extraction and processing to protein-free or protein-containing beef kidney extract
Ad 1.1
The MDBK cell line (DSM ACC 174) serves as the starting material for the production of a bovine kidney extract.
The cells come from a kidney of a normal adult bull from 1957. The cells are free of BVD. These are adherent epithelial-like cells.
The following is required as the culture medium: 95% Dulbecco's + 5% FCS.
The following applies to the subculture routine: optimal division rate 1: 4 to 1: 6 with trypsin / EDTA. The cells grow together within 2 to 3 days. Sowing: (2-4) x 10 <5> cells / 80 cm <2>; Harvest (4-6) x 10 <6> cells / 80 cm <2>; 5% CO2, 37 DEG C.
Starting from the frozen cell culture of the MDBK line, this is first thawed in a water bath at 30 ° C. and transferred to a 15 ml tube. 10 ml preheated culture medium are added, mixed with it, incubated (37 ° C., 5% CO <2>). After the formation of the cell lawn, work continues in the following manner, avoiding centrifugation, in order to avoid cell damage:
Decant the medium, wash the cell lawn once with a phosphate buffer, wet the cell lawn with trypsin / EDTA (1 ml per 25 cm <2> bottle) by swirling the cell culture bottle 3 to 4 times, aspirating trypsin, incubating at 37 ° C. for 2 to 3 min;
after detachment of the cell lawn (gentle shaking or tapping on the culture vessel), the cells are taken up in complete medium;
the desired cell concentration of 4 x 10 <5> cells per 80 cm <2> is made by microscopic counting and appropriate dilution.
In this way, the starting material for a large culture of cells on surfaces is provided in a large number of bottles.
It is used with a solid matrix perfusion system according to McCoy, Wittle, Conway and Weiss [Lit. 6], Schleicher, Weiss [Lit. 2] from the Abott laboratories.
The culture surfaces consisted of layers of titanium plates placed one above the other, which are held together by a support frame within the culture vessel (cf. FIG. 4). A simple air pump can be used.
The apparatus is inoculated with a cell suspension which is pumped in from the culture bottles. The apparatus is then - always under strictly sterile conditions - charged with a sterile CO2-air mixture using the air pump in order to distribute the cells evenly. The CO2-containing air supply is stopped for 2 hours so that the cells can settle, then the feeding is continued. As soon as a sufficient cell density is reached (see harvest), the culture medium is pumped out and replaced with a trypsin solution. After an incubation, the cell suspension can be pumped out of the apparatus. Up to 20 g of cell material are obtained in each cycle.
At the same time, the plastic film culture method was used on an industrial scale.
In this way, it was not a problem to grow 10 kg of bovine kidney cells within a relatively short period of time, which were then treated further for extract extraction, with the same procedure as with fresh bovine kidney organ material after washing and crushing in colloid mills.
Ad 1.2
10 kg of thawed cell material according to section 1.1 are suspended in ethyl ether and left to stand in the cold room at -20 ° C. for about 10 days. After centrifuging in a suitable apparatus, for example an explosion-proof drum centrifuge, 4 l of crude extract are obtained, which are first filtered for further purification, at least twice intensively etherified and then dialyzed against a solution containing 0.3% nipagin.
Ether residues can be removed from the dialysate (external solution) by blowing through nitrogen at pH 7.2. The dialysate is a protein-free beef kidney extract. There is a protein-rich bovine kidney extract in the dialysis tubes.
The yield of protein-free bovine kidney extract la was 25 L. Ultrafiltration of the extract la is not necessary since the starting material was BSE-free and contained no prions.
The one with a 0.2 µm (Millipore <TM>) - Filter sterile-filtered beef kidney extract la has the following key figures after setting the pH:
<Tb> <TABLE> Columns = 3
<Tb> <September> pH <September> 6.8
<Tb> <September> dry residue <SEP> 7 mg / ml
<Tb> <CEL CB = 1 CE = 2 AL = L> N content (Kjeldahl) (SEP) <> 0.03%
<Tb> <SEP> amino acids (ninhydrin) <September> positive
<Tb> <CEL CB = 1 CE = 2 AL = L> peptides (biuret) <September> positive
<Tb> <September> Proteins <September> negative
<Tb> <September> metabolic activity:
<Tb> <SEP> Warburg respiratory increase factor (homogenate, rat)
<September> 1.9
<Tb> <September> Heavy metals <September> <10 ppm
<Tb> <September> Arsenic <September> <2 ppm
<Tb> <September> Sterility <SEP> germ-free and free of hormones, prions and viruses
<Tb> </ TABLE>
Example 2
Combination of an aqueous synthetic bovine kidney extract with a bovine kidney extract produced from the MDBK cell line according to Example 1
5 L of the sterile, protein-free bovine kidney extract la prepared according to Example 1 are combined with 19.8 L aqueous synthetic bovine kidney extract, prepared according to EPA 92 250 349.5, made up to 6.8 L after adjusting the pH to 6.8 and with a 0.2 µm (Millipore <TM>) - filter sterile filtered (combined beef kidney extract lb).
The preparation of 20 l of aqueous synthetic bovine kidney extract was carried out as follows:
The constituents given in the table below were dissolved under sterile conditions and with stirring in 8 L of double-distilled water, the pH of the solution being kept between 6.0 and 7.5 during the preparation (partial solution I, the pH of which was Conclusion was set to 6.7).
Table VII
To prepare partial solution I, dissolve in 8 L of double-distilled water (the stated amounts are calculated for a final solution of 20 L):
<Tb> <TABLE> Columns = 2
<Tb> <September> L-glutamic acid <SEP> 6.0 g
<Tb> <September> D-ornithine <September> 1.6
<Tb> <September> L-aspartic acid <CEL AL = L> 3.0
<Tb> <September> L-tyrosine <September> 0.6
<Tb> <September> L-hydroxyproline <September> 4.0
<Tb> <September> creatinine <CEL AL = L> 0.2
<Tb> <September> L-isoleucine <September> 0.02
<Tb> <September> L-leucine <September> 1.0
<Tb> <September> cysteine <CEL AL = L> 0.04
<Tb> <CEL AL = L> glycine <September> 12.0
<Tb> <September> L-serine <September> 6.0
<Tb> <September> L-lysine <September> 7.0
<Tb> <September> urea <CEL AL = L> 1.6
<Tb> <September> L-histidine <SEP> 1.2 g
<Tb> <September> L-asparagine <September> 1.0
<Tb> <September> L-valine <CEL AL = L> 1.0
<Tb> <September> DL-threonine <September> 0.8
<Tb> <September> L-phenylalanine <September> 0.8
<Tb> <September> L-methionine <CEL AL = L> 0.4
<Tb> <September> L-tryptophan <September> 0.4
<Tb> <SEP> beta alanine <September> 0.7
<Tb> <September> L-alanine <CEL AL = L> 4.8
<Tb> <CEL AL = L> L-proline <September> 4.8
<Tb> <September> L-arginine <September> 7.0
<Tb> <September> hippuric <September> 0.02
<Tb> <September> adenine <SEP> 0.4 g
<Tb> <September> guanine <September> 0.2
<Tb> <September> hypoxanthine <September> 0.4
<Tb> <CEL AL = L> uracil <September> 0,
4
<Tb> <September> uric acid <September> 0.02
<Tb> <September> AMP <September> 0.2
<Tb> <September> glucose <CEL AL = L> 3.0
<Tb> <September> adenosine <SEP> 0.4 g
<Tb> <September> cytosine <September> 0.6
<Tb> <September> inosine <CEL AL = L> 2.0
<Tb> <CEL AL = L> uridine <September> 0.6
<Tb> <September> orotic <September> 0.02
<Tb> <September> sorbitol <September> 40.0
<Tb> <September> cytidine <CEL AL = L> 0.8 g
<Tb> <September> guanosine <September> 0.4
<Tb> <September> thymine <September> 0.8
<Tb> <September> xanthine <September> 0.2
<Tb> <CEL AL = L> Cycl.
AMP <September> 0.8
<Tb> <September> mannitol <September> 3.0
<Tb> <September> succinic acid <SEP> 30.0 g
<Tb> <CEL AL = L> ethanol <CEL AL = L> 40 ml
<Tb> <September> malic acid <SEP> 0.2 g
<Tb> <September> citric <SEP> 2.0 g
<Tb> <CEL AL = L> benzyl alcohol <SEP> 3 ml
<Tb> <September> Thiamindichlorid <SEP> 0.04 g
<Tb> <September> Ca-pantothenate <CEL AL = L> 0.04
<Tb> <SEP> pyridoxol HCI <September> 0.08
<Tb> <September> tocopherol succinate <September> 0.08
<Tb> <September> panthenol <September> 20.0
<Tb> <September> Mg-aspartate <CEL AL = L> 0.4
<Tb> <September> Mn gluconate <September> 0.2
<Tb> <September> N-methylglucamine <September> 8.0
<Tb> <CEL AL = L> p-Hydroxybenzoic acid methyl ester Na salt <September> 14
<Tb> <September> nicotinamide <September> 0.2
<Tb> <CEL AL = L> myo-inositol <September> 1.0
<Tb> <September> Biotin <September> 0.2
<Tb> <September> MgSO47H2O <September> 2.0
<Tb> <September> Co-gluconate <CEL AL = L> 0.01
<Tb> <September> NaH2PO4H2O <September> 1.0
<Tb> <SEP> Na lactate 50% <September> 20.0
<Tb> </ TABLE>
In parallel, a partial solution II was prepared by dissolving a peptone amount of 80 g, obtained from soy, corn and partially dehydrated yeast in a weight ratio of 1: 1: 10, for deodorization and decolorization in 9 L of double-distilled water with vigorous stirring and overnight with 15 g fresh activated carbon has been treated.
The solution thus obtained was filtered through a 0.2 μm (Millipore <TM>) - filter combined with partial solution I. The synthetic peptide fragments glutathione (180 mg) and Gly-His-Lys (2.3 mg) and 0.2 mg H-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu were then added to the approach -Leu-Val-Tyr-Ser-OH + 0.08 mg H-Arg-Lys-Glu-Val-Tyr-OH + 5 ml renin hydrolyzate added and made up to 20 L after adjusting the pH, with a 0.2 µm filter sterile filtered and analyzed:
<Tb> <TABLE> Columns = 2
<Tb> <September> pH <September> 6.7
<Tb> <September> dry residue <September> 1.6%
<Tb> <SEP> N content (Kjeldahl) (SEP) <> 0.05%
<Tb> <SEP> Warburg factor (increased breathing) <September> 2.0
<Tb> <SEP> amino acids (ninhydrin) <September> positive
<Tb> <CEL AL = L> peptide (biuret) <September> positive
<Tb> <September> Heavy metals <September> <10 ppm
<Tb> <September> Arsenic <September> <2 ppm
<Tb> <September> Sterility <September> sterile
<Tb> </ TABLE>
When preparing partial solution I, it should be noted that the amino acids L-Glu, L-Asp, L-Val, L-Tyr, L-Phe, L-Isoleu of the constituents listed in Table I are pre-dissolved in 2N NAOH have to. The carboxylic acids, citric acid, succinic acid and malic acid are then added. After adjusting the pH to 6.4, the other components are added. The components xanthine and guanine must be pre-dissolved in 3 n NAOH and 3 n HCl and neutralized before the addition.
For a technical application of a synthetic bovine kidney extract that only consists of partial solutions I and II, preserved but not sterile filtered, cf. Example 11 below.
The same applies to the preserved, but not dialyzed, crude extract described in Example 3 below and made from fresh beef kidneys.
Example 3
Combination of an extract made from fresh bovine kidneys with an bovine kidney extract made from the MDBK cell line according to Example 1
5 L of the sterile-filtered bovine kidney extract la prepared according to Example 1 are combined with 19.8 L aqueous bovine kidney extract, which was prepared from fresh bovine kidneys as described below. After the pH value has been adjusted to 6.8, the volume is made up to 25 L and sterile filtered with a 0.2 μm filter, the combined bovine kidney extract Ic being obtained.
The bovine kidney extract from fresh, washed, minced bovine kidneys from BSE-free herds was prepared as follows:
The prepared and shredded (finally in a colloid mill) beef kidneys are suspended in ethyl ether and left in the cold room at -20 ° C. for about 10 days. After centrifuging in a suitable apparatus, for example an (explosion-proof) drum centrifuge, about 25 L of aqueous crude extract are obtained from 100 kg of beef kidneys. For further purification, this is first filtered, intensively etherified at least twice and then dialyzed against a solution containing 0.3% nipagin.
After standing for 4 days at 5 ° C., the protein-free dialysate on the outside is freed of traces of ether by passing nitrogen at pH 7.2 and, after the pH has been adjusted again, is ultrafiltered (Filtron, Centrasette, type OMEGA, NMWL 8K).
This protein-free sterile dialysate is the bovine kidney extract, which is combined with the cell line extract la to form the combined bovine kidney extract Ic.
The protein-containing bovine kidney extract contained in the dialysis tubes can be used for other purposes, for example to obtain bovine kidney peptides after partial hydrolysis, which are important for the production of synthetic extracts. The bovine kidney extract remaining in the dialysis tube, its dialysate and a combination Ic have been tested for free radical scavenging activity, positive results being achieved in all cases (cf. Example 10 and FIG. 12 below).
The following key figures have been determined for the combined cattle kidney extract Ic: <September>
<Tb> <TABLE> Columns = 3
<Tb> <September> pH <September> 6.8
<Tb> <September> dry residue <SEP> 8 mg / ml
<Tb> <CEL CB = 1 CE = 2 AL = L> N content (Kjeldahl) (SEP) <> 0.03%
<Tb> <SEP> amino acids (ninhydrin) <September> positive
<Tb> <CEL CB = 1 CE = 2 AL = L> peptides (biuret) <September> positive
<Tb> <September> Proteins <September> protein-free
<Tb> <CEL CB = 1 CE = 2 AL = L> Metabolic activity:
<Tb> <September> breathing increase factor
(Liver homogenate, rat) <September> 1.7
<Tb> <September> Sterility <September> sterile
<Tb> </ TABLE>
The protein-free dialysate used for the combination to produce the combined extract lc had a Warburg factor of 1.55.
Extensive efficacy tests have been carried out on various types of bovine kidney extracts prepared according to Examples 1, 2 and 3, the results of which have been reported in Table IV (according to the key in Table III).
Among other things, to demonstrate the effectiveness of the extract according to the invention, wound healing tests in rats according to DE-PS 3 711 054 and subsequently skin tension measurements were carried out (cf. also EP-A-0 552 516, Table 11). These results are shown in Table VIII:
<Tb> <TABLE> Columns = 4 Table VIlI
<tb> Head Col 1: time after betting
the wound
<tb> Head Col 2: test group
<tb> Head Col 3: control group
<tb> Head Col 4:
Difference DELTA
<Tb> <SEP> a) bovine kidney extract according to Example 1 (la), made from cell line MDBK
<Tb> <SEP> 5 days <September> 240 <September> 142 <September> 98
<Tb> <SEP> 12 days <September> 490 <September> 412 <CEL AL = L> 78
<Tb> <SEP> 21 days <September> 1630 <September> 1340 <September> 290 *
<Tb> <SEP> b) bovine kidney extract according to Example 2 (1b), produced by combining cell line extract with synthetic bovine kidney extract
<Tb> <SEP> 5 days <September> 250 <September> 140 <September> 110
<Tb> <SEP> 12 days <September> 530 <CEL AL = L> 429 <CEL AL = L> 101
<Tb> <SEP> 21 days <September> 1800 <September> 1480 <September> 320 *
<Tb> <SEP> c) bovine kidney extract according to Example 3, produced from cell line extract and natural bovine kidney extract from fresh bovine kidneys
<Tb> <SEP> 5 days <September> 190 <September> 110 <September> 80
<Tb> <SEP> 12 days <September> 460 <CEL AL = L> 390 <CEL AL = L> 70
<Tb> <SEP> 21 days <September> 1530 <September> 1300 <September> 230 *
<Tb>
* Values in Table IV under No. 8
<Tb> </ TABLE>
The results of the skin tension measurements listed in Table VIII document the superior effectiveness of the preparations according to the invention under a) and b) and in all cases over the control groups.
The breathing increase factors stated in Table IV under No. 1 and all other breathing increase factors specified in the application were obtained according to the following working procedure on "Efficacy test of test solutions for increasing breathing in rat liver homogenate (Warburg method)" [Lit. 8th].
Method and work plan
A. Solutions
1. Sörensen buffer, pH 7.4 from 80.4 ml of a solution of 11.87 g of Na2HPO4.2H2O / l and 19.6 ml of a solution of 9.08 g of KH2PO4 / l.
After combining the stated amounts of solution, the pH is checked and, if necessary, corrected by adding one or the other solution.
2. Rat liver homogenate: The liver is removed from a 24-hour hunger rat after decapitation and bleeding and immediately cooled on ice. After washing and drying with cellulose, 6 g of chopped liver are made up to 30 ml in a Potter-Elvehjem homogenizer using a light Teflon pestle with chilled Sörensen buffer and homogenized for 2 to 3 minutes with ice-water cooling. The finished homogenate is left under ice cooling for approx. 3 min in order to allow the air whisked in during the homogenization to escape.
3. KOH 6n
4. Test solutions, e.g. the bovine kidney extracts la, lb and Ic see Table IV and others.
5. Aqua dest.
B. Execution of the experiment
Conical Warburg vessels with a cylinder insert (ZE) and a side arm (SA) and a volume of approx. 13 ml are filled as follows:
<Tb> <TABLE> Columns = 6 filling plan, the information is in ml
<tb> Head Col 1: glasses no.
<tb> Head Col 3 AL = L: 1/2
<tb> Head Col 2: 3/4
<tb> Head Col 3: 5/6
<tb> Head Col 4: 7/8
<Tb> <September> Solution <September> filling location
<Tb> <September> 1 <September> HR) <September> 3.0 <September> 1.5 <CEL AL = L> 3.0 <CEL AL = L> 1.5
<Tb> <September> 5 <September> SA <September> 0.25 <September> 0.25 <SEP> - (SEP) <-> (TB> <September> 4 <September> SA <September> - <CEL AL = L> - <September> 0.25 <September> 0.25
<Tb> <September> 3 <September> ZE <September> 0.2 <September> 0.2 <September> 0.2 <September> 0.2
<Tb> <CEL AL = L> 2 <September> HR <September> - <September> 1.5 <September> - <September> 1.5
<Tb> <SEP> *) HR = main room
<Tb> </ TABLE>
The solutions are pipetted in the order given. Folded filter strips are used in the cylinder inserts to increase the KOH surface. Immediately after the filling is complete, the tubes are sealed with the appropriate hose valve plugs on the side arm attachment, the tubes are attached to the pressure gauges and secured with clips or rubber packs. With the taps open, the pressure gauges are suspended in the apparatus, which is heated to 37 ° C., and shaken for 60 minutes in order to heat the reaction solution and to let the breathing, which was initially very rapid, subside.
Then the right pressure gauge legs are set to mark "5" using the pinch tap, the difference between the left legs is noted at "15", the pressure gauge taps are closed and the solutions from the side arms are transferred to the main rooms by tilting (zero time). After every 20 minutes the shaking device is switched off, the right manometer legs set to "15" (V = const.) And the difference between the left legs is noted at "15".
The test runs up to a measurement duration of 100 minutes. If the oxygen consumption in some glasses is so great that the manometer length is not sufficient, pressure equalization is created in good time by opening the manometer tap immediately after reading, setting the right leg back to "15", the difference of the left leg to "15 "noted and immediately closes the pressure tap. After the last reading, the manometer taps are opened and the volumes of the vessels and the associated manometers are noted.
C. Evaluation
First, the vessels 3/4 and 7/8 are compared with the corresponding thermobarometers (TB: vessel 1/2 and 5/6) in order to compensate for fluctuations in air pressure and temperature during the test. The vessel constants for O2 of glasses 3/4 and 7/8 are then calculated using the following equation:
EMI43.1
Vg = volume of the gas phase (volume of the vessel and the manometer up to the mark "15" minus Vf). Vf = volume of the total liquid contained in the vessel. T = test temperature in DEG K. alpha = Bunsian absorption coefficient (O2 37 DEG C = 0.0239).
P0 = 1 atm, measured in mm Brodie solution (manometer filling) at 0.1 MPa (760 mm Hg) = 10,000 Brodie solution.
The oxygen used can now be used according to the equation
X (mu l O2) = h. k
are calculated because the carbonic acid produced by breathing has been completely absorbed by the KOH (h = manometric difference). If you divide the used mu l O2 of glasses 7/8 by that of glasses 3/4, you get a factor that represents the measure of the increase in breathing. [Lit. 8th].
Example 4
Preparation of an aqueous amnion extract by combining an extract from the WISH cell line with a synthetic amnion extract analogous to EPA 0 522 516
4.1 Provision of the cell material, starting from the Amnion cell line WISH (human)
4.2 Extraction of the amnion cell material and processing to a protein-free amnion extract Ila
4.3 Preparation of a synthetic amnion extract according to EP-A-0 522 516
4.4 Combination of the two Amnion extracts to the extract Ib
4.5 Test trials with Ila and lIb.
Ad 4.1
The cell line WISH, ATCC CCL 25, IZSBS BS C192 served as the starting material for the production of the amnion extract.
The culture medium required is: Eagle's MEM with Earle's BSS + 10% FCS (details can be found in "Exp. Cell. Res.", 23, 14 (1961)).
The procedure was as described in Example 1.1. With regard to the production of a large culture, the plastic film culture method was used on a large scale. The cell material obtained was frozen until further processing.
Ad 4.2
1 kg of thawed cell material according to 4.1 is suspended in ethyl ether and left to stand in the cold room at -20 ° C. for 12 days. The crude extract obtained by centrifugation is filtered before further processing, treated intensively several times with diethyl ether (here always called "ether") and / or chloroform and then dialyzed against a solution containing 0.3% nipagin. The protein-free dialysate is ultrafiltered (FILTRON <TM>): yield 2.4 L.
The analytical data of the amnion extract Ila obtained are as follows:
<Tb> <TABLE> Columns = 2
<Tb> <September> pH <September> 6.7
<Tb> <September> dry residue <September> 1.0%
<Tb> <SEP> N content (Kjeldahl) <CEL AL = L> 0.02%
<Tb> <September> amino acid <September> positive
<Tb> <September> Proteins <September> negative
<Tb> <September> peptides <CEL AL = L> positive
<Tb> <September> breathing increase factor <September> 2.0
<Tb> <September> Sterility <September> sterile
<Tb> </ TABLE>
Ad 4.3
The synthetic amnion extract is produced in the following way:
The constituents listed in the following table are dissolved under sterile conditions and with stirring in 300 ml of double-distilled water to prepare partial solution I with a pH of 6.7.
Table IX
To prepare partial solution I, the following components are dissolved in 300 ml of double-distilled water (the stated amounts are calculated for a final solution of 1000 ml).
<Tb> <TABLE> Columns = 2
<Tb> <September> L-glutamic acid <SEP> 0.3 g
<Tb> <September> L-histidine <SEP> 0.06 g
<Tb> <September> L-ornithine <SEP> 0.08 g
<Tb> <September> L-asparagine <SEP> 0.05 g
<Tb> <September> L-aspartic acid <SEP> 0.15 g
<Tb> <September> L-valine <SEP> 0.05 g
<Tb> <September> L-tyrosine <SEP> 0.03 g
<Tb> <September> DL-threonine <SEP> 0.04 g
<Tb> <September> L-hydroxyproline <SEP> 0.2 g
<Tb> <September> L-phenylalanine <SEP> 0.04 g
<Tb> <September> creatinine <SEP> 0.01 g
<Tb> <September> L-methionine <SEP> 0.02 g
<Tb> <September> L-isoleucine <SEP> 0.001 g
<Tb> <September> L-tryptophan <SEP> 0.02 g
<Tb> <September> L-leucine <SEP> 0.05 g
<Tb> <SEP> beta alanine <SEP> 0.035 g
<Tb> <September> cysteine <SEP> 0.2 g
<Tb> <September> L-alanine <SEP> 0.24 g
<Tb> <CEL AL = L> glycine <SEP> 4.0 g
<Tb> <September> L-proline <SEP> 0.24 g
<Tb> <September> L-serine <September> 0,
26 g
<Tb> <CEL AL = L> L-arginine <CEL AL = L> 0.3 g
<Tb> <September> L-lysine <SEP> 0.3 g
<Tb> <September> urea <SEP> 0.8 g
<Tb> <September> adenine <SEP> 0.02 g
<Tb> <September> adenosine <SEP> 0.02 g
<Tb> <September> cytidine <SEP> 0.04 g
<Tb> <CEL AL = L> guanine <SEP> 0.01 g
<Tb> <September> cytosine <SEP> 0.03 g
<Tb> <September> guanosine <SEP> 0.02 g
<Tb> <CEL AL = L> hypoxanthine <SEP> 0.02 g
<Tb> <September> inosine <SEP> 0.1 g
<Tb> <September> thymine <SEP> 0.04 g
<Tb> <CEL AL = L> uracil <CEL AL = L> 0.02 g
<Tb> <September> uridine <SEP> 0.03 g
<Tb> <September> xanthine <SEP> 0.01 g
<Tb> <September> orotic <SEP> 0.001 g
<Tb> <SEP> cyclic AMP <SEP> 0.04 g
<Tb> <September> adenosine monophosphate <SEP> 0.01 g
<Tb> <September> glucose <CEL AL = L> 0.45 g
<Tb> <September> sorbitol <SEP> 4.0 g
<Tb> <September> mannitol <SEP> 0.5 g
<Tb> <September> succinic acid <CEL AL = L> 1.5 g
<Tb> <September> malic acid <SEP> 0.01 g
<Tb> <September> citric <SEP> 0.1 g
<Tb> <September> Ethanol <SEP> 2.0 ml
<Tb> <September> Glycerin <SEP> 0.4 ml
<Tb> <September> Thiamindichlorid <SEP> 0.002 g
<Tb> <September> nicotinamide <CEL AL = L> 0,
01 g
<Tb> <September> Calcium <SEP> 0.002 g
<Tb> <September> myo-inositol <SEP> 0.05 g
<Tb> <September> Pyridoxol. HCI <SEP> 0.6 mg
<Tb> <September> Biotin <SEP> 0.1 mg
<Tb> <September> Tocophenolsuccinat <SEP> 0.002 g
<Tb> <September> magnesium sulfate <CEL AL = L> 0.05 g
<Tb> <September> magnesium aspartate <SEP> 0.05 g
<Tb> <September> manganese gluconate <SEP> 0.01 mg
<Tb> <CEL AL = L> NaH2PO4H2O <SEP> 0.05 g
<Tb> <September> N-methylglucamine <SEP> 0.2 g
<Tb> <SEP> sodium lactate, 50% solution <CEL AL = L> 2.0 g
<Tb> </ TABLE>
preservatives
<Tb> <TABLE> Columns = 2
<Tb> <SEP> methyl p-hydroxybenzoate sodium salt (nipagin)
<SEP> 0.2 g
<Tb> <September> dehydroacetic <SEP> 3.5 g
<Tb> </ TABLE>
To prepare partial solution II, 2 g of Collagel Sol (Stoess company) and 2 g of partially dehydrated yeast are dissolved in 300 ml of bidistilled water with vigorous stirring and treated with 2 g of activated carbon overnight. After suction filtering and sterile filtering, this mixture (partial solution II) is combined with partial solution I and, before filling to 750 ml with 0.02 mg tripeptides Gly-His-Lys, Gly-Pro-His and Gly-Ala-Lys in a ratio of 1 : 1: 1 and 0.4 g of glutathione were added.
Ad 4.4
250 ml of the sterile, protein-free amnion extract lIa prepared according to section 4.2 are combined with 725 ml of aqueous synthetic amnion extract according to section 4.3 after adjusting the pH to 6.7 and made up to 1000 ml to form the combined extract lIb.
The analytical data of extract Ilb are as follows:
<Tb> <TABLE> Columns = 2
<Tb> <September> pH <September> 6.7
<Tb> <September> dry residue <September> 1.72%
<Tb> <SEP> N content (Kjeldahl) (SEP) <> 0.03
<Tb> <September> breathing increase factor <September> 2.3
<Tb> <CEL AL = L> amino acids <September> positive
<Tb> <September> peptides <September> positive
<Tb> <September> Proteins <September> negative
<Tb> <CEL AL = L> sterility <September> sterile
<Tb> </ TABLE>
Ad 4.5
A comparison of the effectiveness of the amnion extracts Ilb and Ila can be found in Table V. The following test results are given to demonstrate the cosmetic effects in creams in which Ila and Ilb have been incorporated:
4% of the amnion extract lIb produced was incorporated into a day cream of the following composition: It is a moisturizing cream of the \ l-in-water type:
<Tb> <TABLE> Columns = 3
<Tb> <September> cetyl alcohol <September> 3%
<Tb> <SEP> Myrj 51 <September> 3%
<Tb> <SEP> Arlatone 983 <CEL CB = 3 AL = L> 2%
<Tb> <SEP> Arlamol HD <September> 2%
<Tb> <SEP> Miglyol 812 <September> 6%
<Tb> <CEL AL = L> 1,2-propylene glycol <September> 3%
<Tb> <September> Glycerin <September> 0.5%
<Tb> <SEP> Nipasteril 30K <CEL CB = 3 AL = L> 0.2%
<Tb> <SEP> Amnion extract Ilb <September> 4%
<Tb> <September> perfume \ l <September> 0.2%
<Tb> <September> Water <CEL AL = L> ad <September> 100%
<Tb> </ TABLE>
The oily phase including miglyol is heated to 75 ° C. and homogenized. At the same time, propylene glycol, glycerin and nipasteril 30 K are dissolved in water and heated to 75 ° C.
The emulsification is carried out by adding the water phase to the oil phase with vigorous stirring. The mixture is then kept at temperature for 5 min with gentle stirring and then cooled to 35 ° C. Amnion extract and perfume oils are added with stirring. All operations must be carried out under strictly sterile conditions.
In a corresponding manner, creams are then produced using amnion extract lIa and a control cream without amnion extract and compared with the lIb cream in terms of moisture retention:
The Corneometer CM 820 PC (Courage & Khazaka GmbH, Cologne) according to FIG. 7a was used to measure the skin moisture. The device uses the relatively high dielectric constant of water. 7b has a flat capacitor as the end face.
If the measuring head is pressed onto the skin, the horny layer reaches the scattering area of the capacitor field. A certain capacitance of the capacitor is set in proportion to the water content. The device was chosen because it delivers a reliable measured value in seconds. The measuring head is so robust due to the glass vaporization that it can be cleaned with alcohol. Influences from pollution are almost impossible.
Carrying out the measurements
A. 10 female volunteers aged 40 to 76 years (X = 58.2; s = 13.0) were acclimatized for 30 minutes at 20 ° C and 65% relative humidity.
B. To determine the initial values, 3 measurement results were averaged from different locations per test field. The volar sides of the forearms served as test fields.
C. After a single application of a consumer-friendly amount of product, the moisture was measured every 15 minutes. The time after which the moisture had dropped back to the initial value was noted. During the entire measurement period, the test subjects sat on special chairs in the climate laboratory.
D. A 14-day application test followed. The products were issued with the instructions to use them in the assigned areas for a period of 14 days in the morning and in the evening.
E. After the application phase, 12 hours after the last application, acclimatized again for 30 minutes and the moisture was measured.
Results:
a) Skin moisture measurements after a single application: the time is shown in hours after application after the initial moisture has been reached again: cf. Fig. 8 and Table X.
The difference between the control cream without additives and creams with 4% lla and 4% lIb is in the paired t-test [Lit. 9] highly significant and with the probability of error p <0.01.
b) Application test over 14 days: Table XI:
The second measurement was made 12 hours after the last application.
<Tb> <TABLE> Columns = 2 table X
Skin moisture measurements after a single application of creams containing amnion extract llb and lIa
<tb> Head Col 1: tested
<tb> Head Col 2: skin moisture retention in hours *
<Tb> <SEP> base (control cream) <September> 4.1
<Tb> <SEP> base + 4% Ilb <September> 6.0
<Tb> <SEP> base + 4% Ila <September> 5.8
<Tb> <SEP> * Time in hours after application of the test creams when the initial moisture level is reached again.
<Tb> </ TABLE>
<Tb> <TABLE> Columns = 2 Table XI
Skin moisture measurements after 14 days of application of the Amnion extract Ilb and lIa containing creams
<tb> Head Col 1: tested
<tb> Head Col 2: improvement in skin moisture in%
<Tb> <SEP> base (control cream) <September> 9.2
<Tb> <SEP> base + 4% Ilb <CEL AL = L> 25.0
<Tb> <SEP> base + 4% Ila <September> 24.0
<Tb> </ TABLE>
For the amnion extract lIb, a strong positive effect was demonstrated in the melanin inhibitor test using Sarcoma B 16 cells. When using 5% Ilb, a "whitening effect" of +++ (whitening degree: white-greyish white) was found, corresponding to an authentic commercial preparation. [Lit. 19].
Example 5
Production of an aqueous placenta extract Illb by combining an extract from the placenta cell line JAR with a synthetic placenta extract according to EP-A-0 552 516.
5.1. Provision of the cell material starting from the placenta cell line JAR-placenta cell line ATCC HTB 144
5.2 Extraction of the placental cell material and processing to protein-free placenta extract IIa
5.3. Preparation of the synthetic placenta extract analogous to EP-A-0 552 516
5.4. Combination of the two placenta extracts from 5.2 and 5.3 to Illb
5.5 Test results with lIla, Illb and llIc (placenta extract from fresh placenta)
Ad 5.1
The cell line JAR served as the starting material for the production of IIIb. Epithelial-like morphology.
Medium: RPMI 1640 + 10% FCS. Split: 1: 4-6.
Bibliography: "In Vitro", 6, 398 (1971).
Filing: Paolo Paolucci, Lb. lmmunologia-Citogenetica e Biologia Cellulare, III Clinica Pediatrica Osp. S. Orsola-Malpighi, 40138 Bologna, Italy.
The procedure was as described in Example 1.1. With regard to large culture, the plastic film culture method was used. The cell mass obtained was frozen until further processing.
Ad 5.2
10 kg of thawed cell material from 5.1. are suspended in ethyl ether and left to stand in the cold room at -15 ° C. for 2 weeks. The crude extract obtained by centrifugation is filtered before further processing, intensively etherified at least three times and then dialyzed against a solution containing 0.3% nipagin. The protein-free dialysate is ultrafiltered (FILTRON <TM>). Yield 35 L: Illa. The analytical data of the placenta extract obtained are: pH 6.5; Dry residue: 0.9%; N: 0.08%; Amino acids: positive (TLC: 18 amino acids); Proteins: negative; Peptides: positive; Breath increase factor: 1.8; Sterility: sterile.
Ad 5.3
The synthetic placenta extract was prepared according to EP-A-0 552 516.
In the event that the synthetic placenta extract produced according to Example 1 of EP-A-0 552 516 is to contain alkaline phosphatase, the amount of 0.03 g of alkaline placenta phosphatase can be added per liter of final volume. In order to guarantee freedom from BSE in this case too, the phosphatase must be isolated from placentas that come from herds in which no BSE has occurred (ideally from countries such as New Zealand or Brazil).
The specified amount of phosphatase brings the synthetic placenta extract to a King Armstrong value of more than 180 U.
A suitable regulation for the production of alkaline phosphatase from bovine placenta and the stabilization of the phosphatase by magnesium salts such as magnesium gluconate, magnesium acetate and the like have R. Riemschneider and V. Schulz in [Lit. 16] developed.
The importance of alkaline phosphatase for cosmetics is controversial. According to relevant literature, the content of alkaline phosphatase was evaluated as a criterion for the lege artis production of placenta extracts, but not as a characteristic for the cosmetic properties of placenta extracts that are used as cosmetic additives [Lit. 17].
Ad 5.4
30 L of the protein-free placenta extract ILA prepared according to 5.2 are mixed with 90 L aqueous synthetic placenta extract from 5.3. combined, after pH adjustment to 6.7 at 0.2 μm, filtered as extract Illb.
Analytical data from IIIb: pH 6.7; Dry residue: 1%.
N: 0.1%; all other data like lIla.
Ad 5.5
Test results of the image analysis with emulsion preparations which contain the placenta extracts IIIa, IIIb and IIIc (placenta extract from fresh placentas, produced analogously to Example 3, page 38, lines 5 to 20) in amounts of 1%, 1.5% and Contained 2%.
The image analysis allows an assessment of the influence of the surface structure of human skin by the emulsion preparations containing placenta extract.
35 subjects between the ages of 39 and 61 were pulled down for the test. You were instructed not to use other cosmetics in the test areas (forearms) 4 days before the start of the test and for the duration of the test. For each subject, 12 test fields were marked on both forearms (6 per arm). The areas were assigned in such a way that the specimens were distributed equally frequently among the 35 test subjects (uniform permutation). In addition to the test emulsions, an empty field was also checked. After the blank values of all areas had been determined, the test subjects applied the preparations themselves over a period of 2 weeks, morning and evening. 4 hours after the last application, the image analysis was carried out.
Method: After the subjects had acclimated for 45 minutes at 22 ° C. and 65% relative atmospheric humidity, slides coated with a silicone material (layer thickness 500 μm) were pressed onto the test areas. The impression compound hardened within 2 minutes. The same procedure was repeated after 2 weeks of application. The impressions obtained in this way were evaluated under the transmission light microscope using image analysis. The image drawn into the image computer via a TV camera is electronically reshaped so that the area of the profile lines of an image that appear dark in the microscope (corresponding to parameter FA = area area, profile line area, profile line area) and their length (as total length) in this image ( Have parameter LL = line length) determined.
This image analysis method captures relatively macroscopic surface properties of the skin, namely the changes in the profile lines that occur during drying and moistening processes. Depletion of the profile, i.e. Decrease in FA and LL indicate skin dehydration, while with improved moisture penetration the opposite effect occurs. The profile becomes richer in profile lines. 4 hours after the last application, an overlapping "smearing effect" can be excluded for the products, so that the actual skin profile was recorded and measured at the respective time. The percentage change in FA and LL is shown in FIG. 9 as a function of the concentration of the preparations.
In order to determine enough data that can be statistically evaluated, 5 images were taken from each skin imprint (at different points), so that sufficient FA and LL data per residual substance concentration were determined and stored at the time "untreated" and also at the time "treated" (for 3 preparations a total of more than 6000 data). Since the data often do not meet the conditions of normal distribution, the untreated data per product were checked in pairs in a Wilcoxon test for significant differences. For the parameters FA and LL, mean values and standard deviations were determined for all 35 subjects per product. The percentage change from "untreated" to "treated" was then calculated and the values corrected with the blank value were determined.
The formulations with 1.5% and 2% placenta extract Illb show a clear improvement in the skin structure. The FA data are better differentiated: (Fig. 9)
A placenta extract based on a bovine placenta cell line RPL 10, which has been bred and deposited with Prof. Dr. Mariano da Rocha Filho, Reitor da UFSM (Universidade de Santa Maria), Faculdade de Medicina, Santa Maria, Rio Grande do Sul, Brazil, and Dr. G. da Rocha Filho, UFSM, Bioquìmica, lstituto Central de Quimica, Santa Maria RS, Brazil.
Example 6
Production of an aqueous thymus extract by combining an extract from cell line P1-1A3 (thymus epithelial cells DSM ACC 280) or a cell line from calf thymus (A. Wank) with a synthetic thymus extract analogous to EP-A-0 552 516
6.1. Provision of the cell material, starting from the thymus cell line P1-1A3 or from the thymus cell line Kalb WANK
6.2. Extraction of the thymus cell material and processing to a protein-free thymus extract IVa
6.3. Preparation of a synthetic thymus extract IVb according to EP-A-0 552516
6.4. Combination of the two thymus extracts from 6.2 and 6.3 to the extract IVC
6.5. Test experiments with the thymus extract IVc obtained under 6.4 and comparison with synthetic thymus extract IVb and with thymus extract IVd from fresh calf thymus glands.
Ad 6.1
The cell line P1-1A3, thymus epithelial cells DSM ACC 280 served as the starting material for the production of the thymus extract IVa.
The culture medium required is 80% RPMI + 20% FCS [details can be found in "Blood" 83, 3245-3254 (1994) "].
In October 1973, a 2-2.5-month-old calf was used to breed the calf thymus epithelial cells WANK in Brazil. Culture medium analogous to P1-1A3.
The procedure was as described in Example 1. With regard to large-scale culture, the plastic-film-culture method was used on a large scale. The cell material obtained was frozen until further processing. Yield in 5 weeks: 25 kg mass.
In the case of working with the calf thymus cell line (bos taurus) WANK, the procedure was completely analogous, yield 30 kg. Origin of said cell line: Hwa Sook Chang and A. Wank, Bethesda, Md. 20014, Clarandon, USA, and N.M. Faria, Pc. Carlos Gomez, 10000 S. Paolo, SP, Brazil. Prof. Dr. Dr. R. Riemschneider, Istituto Central de Quimica da UFSM, Santa Maria, RS, Brazil.
Ad 6.2
25 kg of thawed cell material from P1-1A3, prepared according to 6.1, were suspended in ethyl ether and left to stand in a cold cell at -15 ° C. for 10 days. The crude extract obtained by centrifugation is filtered before further processing, thoroughly etherified and then dialyzed against 0.3% nipagin (p-hydroxybenzoic acid methyl ester sodium salt) in water. The protein-free dialysate is ultrafiltered (FILTRON <TM>): yield 30 L.
The analytical data of the thymus extract IVa obtained are as follows:
<Tb> <TABLE> Columns = 3
<Tb> <September> pH <September> 6.8
<Tb> <September> dry residue <September> 2.8%
<Tb> <CEL CB = 1 CE = 2 AL = L> N (Kjeldahl) <September> 0.6%
<Tb> <SEP> amino acids (ninhydrin) <SEP> positive and TLC
<Tb> <CEL CB = 1 CE = 2 AL = L> peptides (biuret) <SEP> positive and TLC
<Tb> <September> nucleic acid components <SEP> positive TLC (9 components detected)
<Tb> <September> metabolic activity
<Tb> <September> (Warburg factor) <CEL CB = 3 AL = L >> 2.3
<Tb> <September> Heavy metals <September> <10 ppm
<Tb> <September> As <September> <2 ppm
<Tb> <September> Sterility <September> sterile
<Tb> <SEP> durability (SEP) <> 2 years
<Tb> <CEL CB = 1 CE = 2 AL = L> acute toxicity in mice (60 animals)
<Tb> <September> DL50 <September> i.v. > 20 ml / kg
<Tb> <CEL CB = 2 AL = L> DL50 <CEL AL = L> i.p. > 30 ml / kg
<Tb> <September> DL50 <September> p.o. > 25 ml / kg
<Tb> <SEP> Study of chronic toxicity in albino rats (40 days):
<SEP> no toxicity
<Tb> <SEP> Toxicity in dogs (10 beagle dogs, 26 weeks): <SEP> no toxicity
<Tb> </ TABLE>
Ad 6.3
The synthetic thymus extract IVb is prepared as described below:
150 g methyl p-hydroxybenzoate in 0.7 L ethanol (94%) and
20 g of benzyl alcohol are dissolved or diluted to 20 L in bidistilled water. The following are added with stirring and under sterile conditions:
<Tb> <TABLE> Columns = 4
<Tb> <TABLE> Columns = 2
<Tb> <SEP> control group I: <SEP> undamaged fibroblasts and epithelial cells
<Tb> <SEP> group II: <SEP> with CHOH-damaged fibroblasts and epithelial cells (reversibly damaged),
<Tb> <SEP> group III: <SEP> fibroblasts and epithelial cells damaged with CHOH and treated with the addition of synthetic serum extract,
<Tb> <SEP> Group IV: <SEP> damaged with CHOH and by adding V.
<Tb> </ TABLE>
Results
<Tb> <TABLE> Columns = 5 Table XV
<tb> Head Col 1: group
<tb> Head Col 2 to 5 AL = L:
Thymidine incorporation rates 1 x 10 <3> / min
<tb> Head Col 2 AL = L: day 0
<tb> Head Col 2: Day 2
<tb> Head Col 3: Day 4
<tb> Head Col 4: Day 6
<Tb> <SEP> I control <September> 0 <September> 35 <September> 200 <September> 450
<Tb> <September> II <September> 0 <CEL AL = L> 3 <September> 30 <September> 30
<Tb> <September> III <September> 0 <September> 25 <September> 90 <September> 350
<Tb> <September> IV <September> 0 <CEL AL = L> 30 <September> 120 <September> 410
<Tb> </ TABLE>
The values given represent mean values from 10 experiments each. They make it clear that the fibroblast culture damaged by CHOH could be adapted to the culture group I, which served as a control, with regard to its DNA synthesis rate, both with the additions in group III and IV.
7.5.2. Influence of V
on the growth and metamorphosis of tadpoles (Xenopus laevis DAUDIN)
The growth of tadpoles was observed from day 1 (spawned by the pair of frogs) to day 67 and measured from day 3 after the free-swimming tadpoles were obtained. Water temperature 24 ° C. On day 7, the tadpoles were divided into 5 groups in order to carry out a test with blood extract V and 3 controls. Each test group comprised approximately 100 tadpoles.
The amount of water was increased to 2.5 L by day 21, to 5 L by day 35 and to 7.5 L per group from day 36 to 67. Aeration using commercially available porous aquarium stones. Water changes in the pools every 7 days.
Food from day 7 nettle powder, before Liquifry.
Add V per week in 3 portions, amount 0.2%.
Length measurements not noted here.
* Start of metamorphosis at V on day 51, in the controls only from day 56: Table XVII.
The frogs of Xenopus laevis are carnivores and get fresh liver as feed.
<Tb> <TABLE> Columns = 5 Table XVI
Metamorphoses and Frogs, d 51-67
<tb> Head Col 1: test group
<tb> Head Col 2: 1
<tb> Head Col 3: 2
<tb> Head Col 4: 3
<tb> Head Col 5: 4
<Tb> <September> d51 <SEP> 1 + 0 <SEP> 1 + 0
<Tb> <September> d53 <SEP> 1 + 1 <SEP> 1 + 0
<Tb> <CEL AL = L> d56 <SEP> 0 + 2 <SEP> 1 + 1 <SEP> 1 + 2
<Tb> <September> d58 <SEP> 0 + 3 <SEP> 0 + 1 <SEP> 1 + 1 <CEL AL = L> 1 + 2
<Tb> <September> d60 <SEP> 0 + 3 <SEP> 0 + 1 <SEP> 1 + 2 <SEP> 1 + 2
<Tb> <September> d63 <SEP> 0 + 4 <SEP> 1 + 1 <SEP> 2 + 2 <SEP> 2 + 4
<Tb> <September> d65 <SEP> 1 + 3 <SEP> 1 + 1 <SEP> 2 + 3 <SEP> 2 + 4
<Tb> <CEL AL = L> d67 <CEL AL = L> 2 + 2 <SEP> 1 + 0 <SEP> 2 + 5 <SEP> 3 + 4
<Tb>
First number: number of frogs.
Second number: number of metamorphoses (the metamorphosis ends when the tail has been completely or almost completely absorbed).
1, 2: controls. 3, 4:
Blood extract V
<Tb> </ TABLE>
7.5.3 Report on the influence of blood extract V
on the growth of guppy fish from day 75 to 100
All of the guppy fish used were the same age.
115 guppies were tested in 5 groups of approx. 22 to 24 each in 5 L aquariums, water temperature 24.0-24.6 ° C.
The samples to be tested were added every other day.
Amount per week is given in the table.
The results of the length growth x in mm after 100 days (start of experiment on day 75) are summarized in Table XVII.
<Tb> <TABLE> Columns = 4 Table XVII
Mean values d <1> <0> <0>
<tb> Head Col 1: group
<tb> Head Col 2: 1
<tb> Head Col 3: 2
<tb> Head Col 4: 3
<Tb> <SEP> addition sample / week (absolute) <SEP> 0 per 1000 checks <SEP> 1 per 1000 V <SEP> 1 per 1000 V
<Tb> <CEL AL = L> addition sample / week (dry residue) <SEP> 0 per 1000 checks <SEP> 0.95 per 1000 V <SEP> 0.94 per 1000 V
<Tb> <SEP> x (mm) <CEL AL = L> 19.91 <CEL AL = L> 23.24 <September> 22.95
<Tb> </ TABLE>
7.5.4. For the radical scavenging effect of blood extract V cf.
12 and for the description of the methodology, see Example 10 below.
Example 8
Production of a plant extract VI from the Sycamore cell line (Acer pseudoplatanus L.) (Colla 120) and use as a cosmetic additive in the sense of a collagen replacement (see also Table VI above)
The starting material is a Sycamore cell culture (origin: Botanical Institute of the UFSM, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, Rio Grande do Sul, Brazil. The Sycamore cell culture was derived from the callus tissue, which originally came from explants of secondary cambial tissue from the Sycamore tree originates).
The cultures of Sycamore (Acer pseudoplatanus L.) were grown in suspension as described by Stoddart, Barrett and Northcode in "Biochemical Journal", 102, 194 (1967). The tissue in suspension was harvested by centrifugation and washed with water.
The culture medium was a modified White's medium, which contained the following components in g / L:
<Tb> <TABLE> Columns = 2
<Tb> <September> Ca (NO3) 2 <SEP> 0.2 g
<Tb> <September> MgSO4.7H2O <SEP> 0.36 g
<Tb> <September> KCI <SEP> 0.055 g
<Tb> <CEL AL = L> KNO3 <SEP> 0.08 g
<Tb> <September> Na2SO4 <SEP> 0.2 g
<Tb> <September> MnSO4.4H2O <September> 0.009
<Tb> <CEL AL = L> ZnSO4.7H2O <CEL AL = L> 0.003
<Tb> <September> H3BO3 <September> 0.003
<Tb> <September> KJ <September> 0.0015
<Tb> <September> NaH2PO4.H2O <CEL AL = L> 0.0165
<Tb> <CEL AL = L> Fe2 (SO4) 3.6H2O <September> 0.0025
<Tb> <September> Thiamin.HCI: <September> 0.0001,
<Tb> <September> Ca pantothenate <CEL AL = L> 0.0001
<Tb> <September> glycine <September> 0.003
<Tb> <September> cysteine-HCI <SEP> 0.001 g
<Tb> <September> sucrose <SEP> 20.0 g
<Tb> <SEP> with: coconut milk 20%
(deproteinized [15 min 15 at] and sterilized).
<Tb> </ TABLE>
For further extract production it is advisable to refer to the scheme in Table VI above.
The cells are first multiplied using the rotary shaker technique, then in a number of Bekkino glass suspension culture bottles of 10 L, then on a large scale in fermenters (1000-4000 L) or pipe coil cultivators (1000-2000 L).
The harvested cell material is dried and suspended in batches of 10 kg of water and processed in a kilowatt ultrasound generator, which provides a strong oscillation.
The centrifuge residue obtained contains the desired cell wall material, which serves as the basis for the following enzymatic and chemical hydrolysis processes.
After 4 days of treatment with 10% cellulase at 35 ° C., the mixture is centrifuged: residue I is stored at 4 ° C. for further treatment. The supernatant solution I is brought to a concentration of 2 N with sulfuric acid and autoclaved for 4 days at 15 at for partial hydrolysis. The separation leads to residue II (stored as 1 at 4 ° C.) and solution II, which is brought to pH 5.3. Working temperatures at 4 to 10 ° C.
The residues I and II are partially hydrolyzed in an autoclave in 3N HCl and then combined with the hydrolyzate II (from I) and dialyzed.
Concentration of the dialysate in vacuo at 20 ° C. to about 10% dry residue, adjustment to pH 5.3. Sterile filtration through a 0.2 µm Millipore <TM> filter.
The resulting protein-free cosmetic additive VI (Colla 120) has the following analytical key figures:
pH: 5.3, dry residue: 10.5%; N: 0.95%; Amino acids: 4.5% (after hydrolysis); Hydroxyproline: 0.3%; Carbohydrates: 5.2% (after hydrolysis); Metabolic activity: 1.8 (Warburg factor): Sterility: aseptic; Preservative: 0.3% Phenonip proteins: protein free.
If necessary, the addition of 5% mannitol and 10% panthenol can increase the dry residue to 25%, which can improve the cosmetic effects of the skin's moisture retention capacity and the radical scavenging effect of extract VI (cf. also Fig. 12).
The Sycamore extract VI with a dry residue of 10.5%, hereinafter referred to as "Colla 120", was used in a number of cosmetic formulations and compared with a collagen preparation.
1) Skin moisture measurements after a single application and after 14 days of application of cream containing VI (corneometer)
2) Skin roughness measurements using the modified PADBERG method
3) Influence of a VI-containing \ l water emulsion on the skin temperature of subjects with dry skin
4) Skin conditioning by formulations containing VI
5) Patch test for testing for allergic effects.
Ad 1)
Colla 120 (VI) was incorporated 5% into the following recipe:
Phase I melting to 70 ° C: C: 10% Cetiol V, 10% Lanette N; 5% Miglyol 812.2% Adeps lanae; 0.3% phenonip,
Heat phase II to about 70 ° C., containing: 0.3% phenonip; 5% Karion fl., Karion F; 62.3% water,
Stir phase II into phase I, continue stirring until the mixture has cooled to 32 ° C., then stir in Colla 120 5% (VI) and perfume oils and homogenize.
Analogously prepare a cream with 5% collagen (1%), as well as a control cream without the addition of an additive.
The measurements, carried out analogously to Example 4.5, gave the following for the moisture retention capacity:
<Tb> <TABLE> Columns = 2
<tb> Head Col 1: tested after a single application
<tb> Head Col 2: skin moisture retention in hours
<Tb> <SEP> base (control cream) <September> 4.5
<Tb> <SEP> Basis + 5% VI Colla 120 <September> 6.5
<Tb> <SEP> base + 5% collagen <September> 6.3
<Tb> </ TABLE>
<Tb> <TABLE> Columns = 2
<tb> Head Col 1: tested after 14 days of application
<tb> Head Col 2: improvement in skin moisture in%
<Tb> <SEP> base (control cream) <September> 8.4
<Tb> <SEP> Basis + Colla 120 VI 5% <September> 22
<Tb> <SEP> base + collagen 5% <September> 19
<Tb> </ TABLE>
Ad 2)
Description of the Padberg method
Padbergmethode:
In the Padberg test, the roughness of a skin is assessed on the basis of the amount of methylene blue that is absorbed by the skin depending on the skin conditions. Studies with "subjectively rough skin" or with "skin damaged by surfactants" showed that the amount of methylene blue absorbed is proportional to the roughness of the skin. In contrast, good skin or well-cared for skin only absorbs a small amount of methylene blue.
Ten subjects between the ages of 40 and 66 were used for the test. The test subjects volunteered for this test. You were instructed not to use other cosmetics on the test areas (forearms) three days before the start of the test and for the entire duration of the test. For each subject, six test fields were marked on both inner sides of the forearm (three per arm). The areas were assigned in such a way that the products were distributed equally frequently among the ten test subjects across the six test fields (uniform permutation). In addition to the five emulsions, an empty field was also checked. After the blank values of all areas were determined using both methods, the test subjects applied the products themselves at home in the morning and evening for a period of 14 days.
After that, 4 hours after the last application it was checked again for Padberg.
The following steps are used to carry out the Padberg test:
(1) Marking the test fields
(2) Pretreatment of the test fields with a 1% solution of a nonionic surfactant in water
(3) Rinse with tap water at 35 ° C
(4) Dab the test fields
(5) after acclimatization of the test persons for 30 minutes at 22 ° C. and 60% relative atmospheric humidity
(6) Apply 20 μl of color solution (the color solution consists of 0.5% methylene blue (20%) and 80% of a 1% solution of a nonionic surfactant) and allow to spread for 30 s
(7) Let the paint dry for 30 s
(8) Remove excess color with 2 ml of a 0.25% nonionic surfactant solution
(9) Extraction with 2 x 2 ml of a mixture of:
2.0% sodium lauryl sulfate
48.0% water
50.0% isopropyl alcohol
every 60 s
(10) Measure the eluate in the spectrophotometer at 660 nm against air
(11) Result = skin absorbance (baseline)
(12) The products were then issued with the instruction to apply them to the designated places for 14 days in the morning and in the evening.
It was previously ensured that no other cosmetic products were used on the test areas 3 days before the start of the test and for the entire duration of the test.
(13) Repeat steps (1) through (9) on day 15. The last application before the test was made 4 hours earlier.
Result = absorbance after application
(14)
EMI81.1
Discussion of the Padberg method:
The Padberg method provides data on the adsorption of methylene blue on the skin. Depending on the condition of the skin, the dye has more or fewer binding sites on the skin. Years of experience have repeatedly confirmed that subjectively "rough" skin or, for example, skin damaged by detergents has more binding sites for methylene blue, depending on the degree of damage. Conversely, skin improved with creams shows a decrease in the binding sites, and proportional to the duration of use. The differentiation between different products is very good and reliable; here too, correlation is always achieved with the subjective assessment. For more details, see [Lit. 10].
Results of the Padberg test:
The photometer values, expressed as a percentage of the value for treated skin and based on the initial state, are summarized in Table XVIII below. The calculated mean values are also given in the table.
The results show that the test emulsions can be used to smooth the skin.
<Tb> <TABLE> Columns = 4 Table XVIII
Roughness test according to the Padberg method with water / I emulsions with and without the addition of tripeptides (application time 14 days)
<tb> Head Col 1: age of subjects
<tb> Head Col 2: placebo
<tb> Head Col 3 to 4 AL = L:
Water \ l emulsions of the invention Colla 120 (VI)
<Tb> <September> 46 <September> 81.0 <CEL AL = L> 50.1 <September> 60.0
<Tb> <September> 41 <September> 91.0 <September> 64.4 <September> 64.9
<Tb> <September> 47 <September> 80.0 <CEL AL = L> 76.5 <CEL AL = L> 40.0
<Tb> <September> 50 <September> 76.6 <September> 33.0 <September> 41.2
<Tb> <September> 51 <September> 75.3 <September> 56.8 <CEL AL = L> 70.0
<Tb> <September> 40 <September> 95.0 <September> 37.5 <September> 40.5
<Tb> <September> 65 <September> 89.0 <September> 72.5 <CEL AL = L> 68.0
<Tb> <September> 66 <September> 97.8 <September> 57.8 <September> 55.0
<Tb> <September> 62 <September> 92.6 <September> 70.0 <CEL AL = L> 60.0
<Tb> <September> 45 <September> 76.9 <September> 60.7 <September> 62.7
<Tb> <September> averages: <September> 85.6 <September> 58.2 <CEL AL = L> 56.4
<Tb> </ TABLE>
Ad 3)
Influence of a Colla-120-Sycamore extract (VI) (produced according to Example 8) \ l / water emulsion on the skin temperature of test subjects
The influence of the emulsion on skin temperature was tested on 30 test subjects aged 40 to 60 with dry skin. The results are shown in Table XIX below.
<Tb> <TABLE> Columns = 4 table XIX
<tb> Head Col 1: temperature (DEG C)
before application
<tb> Head Col 2: \ l water emulsion
<tb> Head Col 3: temperature (DEG C)
after application
<tb> Head Col 4: DELTA T
<Tb> <September> 30.6 to 33.0 <SEP> Colla 120 (VI) <September> 32.7 to 32.9 <September> 0.2
<Tb> <CEL AL = L> 30.5-34.0 <CEL AL = L> control emulsion <September> 30.5 to 33.6 <September> 3.1
<Tb> </ TABLE>
Without Colla 120 (VI) there was no noticeable stabilization (small DELTA T value) of the skin temperature, hence a high DELTA T value when using the control emulsion.
Ad 4)
A hand cream containing lanolin was formulated in accordance with the following instructions, in which Colla 120 (VI) was incorporated. The final composition of the cream formulation was as follows:
<Tb> <TABLE> Columns = 3
<Tb> <SEP> soluble lanolin derivative <SEP> 1.0% by weight
<Tb> <SEP> acetylated lanolin alcohols <SEP> 5.0% by weight
<Tb> <SEP> liquid multisterol extract <SEP> 5.0% by weight
<Tb> <September> Vaseline <SEP> 5.0% by weight
<Tb> <CEL AL = L> polyvinyl alcohol gel <SEP> 0.75% by weight
<Tb> <SEP> 10% NaOH <SEP> 2.25% by weight
<Tb> <SEP> Colla 120 (VI) <SEP> 6.0% by weight
<Tb> <SEP> ethoxylated fatty amines <SEP> 3.75% by weight
<Tb> <September> perfume oil <CEL CB = 3 AL = L> 0.3% by weight
<Tb> <SEP> water, bidist. <September> ad <SEP> 100.00% by weight
<Tb> </ TABLE>
To make this hand cream, the fat phase components and petroleum jelly were heated to approx. 75 ° C. At the same time, the PVA gel was dispersed in hot water at approx. 80 ° C. and gradually dissolved. The ethoxylated fatty amine (with about 25 EO units) and optionally an emulsifier were added to the latter dispersion, after which the previously heated fat phase was emulsified therein. After stirring for 5 minutes at the mixing temperature, the mixture was cooled to 60 ° C., then 10% sodium hydroxide solution was added and the mixture was cooled further to below 40 ° C. 6% Colla 120 (VI) and the perfume were then added with slow stirring. The approach was well homogenized. The hand cream was made up stably and showed an improving skin conditioning, compared to an approach without Colla 120 (VI).
A baby shampoo was made from the following composition:
<Tb> <TABLE> Columns = 2
<Tb> <SEP> sulfosuccinic acid half-ester sodium salt, diluted (Steinapol SBFA 30 and Steinapol SBZ)
<SEP> 700 g
<Tb> <September> Alkylethersulfat <SEP> 10 g
<Tb> <SEP> Colla 120 (VI) <SEP> 50 g
<Tb> <SEP> gum arabic <SEP> 5 g
<Tb> <September> surface fat <SEP> 10 g
<Tb> <September> Water <SEP> 275 g
<Tb> <CEL AL = L> potassium sorbate <CEL AL = L> 1.5 g
<Tb> <September> manganese <SEP> 1.0 g
<Tb> </ TABLE>
The pH of the mixture was adjusted to a final value of 6.5.
A cream base was compounded as follows:
<Tb> <TABLE> Columns = 3
<Tb> <September> Vaseline <SEP> 40% by weight
<Tb> <September> cetanol <SEP> 18% by weight
<Tb> <CEL AL = L> sorbitan sesquioleate <CEL CB = 3 AL = L> 5% by weight
<Tb> <September> polyoxyethylene <SEP> 0.5% by weight
<Tb> <September> p-Hydroxyalkylbenzoat <CEL CB = 3 AL = L> 0.2% by weight
<Tb> <SEP> Colla 120 (VI) <SEP> 5.0% by weight
<Tb> <September> Water <September> ad <SEP> 100.00% by weight
<Tb> </ TABLE>
Ad 5)
Clinical-allergological examination of Colla 120 (Sycamore extract VI) in a patch test on humans
Summary: Colla 120 has been tested in a patch test for allergic potential. The local tolerance was clarified in a preclinical examination. This test showed no concerns about the use of the product in a human clinical trial (see also Table II above).
The clinical examination in the patch test did not raise any concerns regarding the question of the use of Colla 120 in the face of humans from an allergological point of view, since there was no reaction to this in the 60 tested subjects.
Test method: This was carried out under the conditions of an epicutaneous lobule test. A small amount of test substance is applied to hygroscopic test slides and attached to the back skin of patients who have been tested in the clinic's allergological laboratory because of the suspected presence of contact allergy. After 24 hours, the platelets loaded with the test substance were removed and the local skin reaction at the contact point of the test platelets was read half an hour after the test plasters had been removed. Further readings were made after 48 hours and 72 hours: Table XIX
Evaluation: 0 = negative, (-) = questionably positive, + = weakly positive, ++ = positive, +++ = strongly positive
The test is carried out under an extreme load that is not given under normal conditions.
<Tb> <TABLE> Columns = 5 Table XX
<tb> Head Col 1: patient no.
<tb> Head Col 2: test reaction to other substances
<tb> Head Col 3 to 5 AL = L: Reactions from Colla 120
<tb> Head Col 3 AL = L: after 24
<tb> Head Col 3:48
<tb> Head Col 4:
72 h
<Tb> <September> 1 <September> p-phenylenediamine <September> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <September> 2 <CEL AL = L> potassium bichromate <September> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <September> 3 <September> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <September> 4 <CEL CB = 3 AL = L> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <September> 5 <September> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <September> 6 <September> 0 <September> 0 <CEL AL = L> 0
<Tb> <September> 7 <September> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <September> 8 <September> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <CEL AL = L> 9 <September> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <September> 10 <September> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <September> 11 <CEL AL = L> cinnamaldehyde <September> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <September> 12 <September> rosin <September> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <CEL AL = L> 13 <September> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <September> 14 <September> Nickel sulfate <September> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <CEL AL = L> 15 <September> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <September> 16 <September> epoxy <September> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <CEL AL = L> 17 <September> Eucerin <September> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <September> 18 <September> Peru Balsam <September> 0 <September> 0 <CEL AL = L> 0
<Tb> <September> 19 <September> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <September> 20 <September> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <CEL AL = L> 21 <September> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <September> 22 <September> formaldehyde <September> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <CEL
AL = L> 23 <September> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <September> 24 <September> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <September> 25 <CEL AL = L> cobalt chloride <September> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <September> 26 <September> Chloramphenocol <September> 0 <September> 0 <CEL AL = L> 0
<Tb> <September> 27 <September> Mercury <September> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <September> 28 <September> 0 <September> 0 <CEL AL = L> 0
<Tb> <September> 29 <September> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <September> 30 <September> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <CEL AL = L> 31 <SEP> Lanette N <September> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <September> 32 <September> Bufexamac <September> 0 <September> 0 <CEL AL = L> 0
<Tb> <September> 33 <September> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <September> 34 <September> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <CEL AL = L> 35 <September> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <September> 36 <September> formaldehyde <September> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <CEL AL = L> 37 <September> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <September> 38 <September> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <September> 39 <CEL CB = 3 AL = L> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <September> 40 <September> Hydroxycitronellal <September> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <September> 41 <CEL AL = L> Abitol <September> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <September> 42 <September> rosin <September> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <CEL AL = L> 43 <September> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <September> 44 <September> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <September> 45 <CEL CB = 3
AL = L> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <September> 46 <September> formaldehyde <September> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <September> 47 <CEL CB = 3 AL = L> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <September> 48 <September> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <September> 49 <September> Clotriazol <CEL AL = L> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> <September> 50-50 <September> 0 <September> 0 <September> 0
<Tb> </ TABLE>
Results: Colla 120 was tolerated without reaction by all 60 patients in the patch test when used undiluted.
As can be seen from the test protocol, 20 of the 60 people tested proved to be allergic to various allergens in everyday life and work life.
Example 9
Production of a protein-free yeast extract VII from partially dehydrated cells from Saccharomyces cerevisiae Hansen
10 kg of an approximately 20% suspension of freshly grown yeast Saccharomyces cerevisiae in water (so-called yeast milk) are mixed with 200 g metabolically active extract VIl (as a starter) and with 150 g of a mixture of 114 g NaCl, 20 g MgSO4.7H2O, 1 g of activator and 15 g of cane sugar are rapidly heated to 65 ° C. in a dough machine with gentle stirring and cooled to 15 ° C. after about 100 minutes: VII crude product. In the cold, dialysis is carried out against a 0.2% strength p-hydroxybenzoic acid sodium ester solution. The amount of water is chosen so that the solids content of the dialysate is 4%.
After deodorization with activated carbon and sterile filtration of the dialysate, a protein-free yeast extract VI1 is obtained, which has the following analytical characteristics (a) and properties (b):
a) Key figures:
pH 6.5; N: 0.4%; Dry residue: 4.2%; Amino acids: positive, TLC: peptides: positive (biuret);
Nucleic acid components: TLC; Protein detection; negative.
Heavy metals: <10 ppm: As <2 ppm; Sterility: sterile.
b) Properties:
<Tb> <TABLE> Columns = 3 Table XXI
<Tb> <September> Warburg test
<Tb> <SEP> respiratory increase factor (rat liver homogenate) (p. 41-44) <September> 4.07
<Tb> <SEP> fermentation increase factor: Fig. 11 <September> 3.9
<Tb> <CEL CB = 1 CE = 2 AL = L> Mouse swimming test:
<Tb> <SEP> increase survival time to drowning <SEP> from 10 to 13 min
<Tb> <CEL CB = 1 CE = 2 AL = L> Padberg test (p. 62-65) <SEP> 60 (83) *
<Tb> <September> Growth tests:
<Tb> <SEP> Guppy fish in mm length after 100 days, if more than 25 days of extract <SEP> 24 (17) *
<Tb> <SEP> tadpoles (Xenopus laevis D.) brought forward the beginning of the metamorphosis:
Days versus controls <SEP> 16 days
<Tb> <SEP> Corneometer test (method p. 50-52)
<Tb> <CEL CB = 2 AL = L> Improvement in skin moisture retention after 14 days of use <SEP> 22% (8%)
<Tb> <SEP> radical scavenger test (Fig. 12 + p. 98-100) <September> 76%
<Tb>
* Controls without the addition of extract VII in brackets
<Tb> </ TABLE>
The cell mass including protein remaining in the dialysis tube also shows a high growth effect in tadpoles, fish and farm animals and is suitable as an environmentally compatible feed additive, as is the entire non-dialyzed product from Example 9: VII crude product.
Determination of the fermentation increase factor of the above-mentioned yeast extract dialysate VII:
The fermentation increase factor is measured in a volume determined in a Warburg vessel, which is charged with a solution consisting of 2.5 g glucose, 0.4 g casein peptone, 50 mg MgSO4, 7 H2O and 50 mg baker's yeast and 50 ml tap water. The vessel is then filled with a certain amount of the test preparation according to a filling plan. The amount of CO2 emitted at 30 ° C is determined as a function of time, converted to normal conditions and divided by the standardized amount of CO2 that is generated in the control test under otherwise identical conditions, but without test preparation.
The measurable fermentation activation is remarkable for the preparations according to the invention: factor 3.8.
Fig. 11 shows the course of CO2 formation in the Warburg test as a function of time, with two groups of comparative tests being included, i.e. the preparation-free test solution, which characterizes the course of the conventional fermentation, and the yeast-free test solution with the preparation, which has no significant influence on the fermentation.
The composition of the solutions was as follows:
<Tb> <TABLE> Columns = 2
<Tb> <SEP> solution l: <SEP> 50 ml basic medium + 50 mg baker's yeast
<Tb> <SEP> solution II: <SEP> 10 ml solution 1 + 50 ml extract VII
<Tb> <SEP> solution III: <SEP> 10 ml solution 1 + 50 ml extract VII
<Tb> <SEP> solution IV: <SEP> 10 ml base medium + 50 ml extract VII
<Tb> <SEP> solution V: <SEP> 10 ml base medium + 50 ml extract VII
<Tb> </ TABLE>
Example 10
Combination of a metabolically active, protein-free animal extract with a metabolically active, protein-free vegetable extract, specifically a combination of blood extract V (example 7) with yeast extract VII (example 9) to form extract VIll
Blood extract V and yeast extract VII are mixed in a ratio of 3:10 and sterile filtered after adjusting the pH to 6.7 (0.1 μm filter). The analytical indicators and properties are as follows: Extract VIII
<Tb> <TABLE> Columns = 3
<Tb> <September> pH <September> 6.7
<Tb> <September> N <September> 0.34%
<Tb> <CEL CB = 1 CE = 2 AL = L> dry residue <September> 4.2%
<Tb> <SEP> respiratory increase factor (Warburg) <September> 4.07
<Tb> <CEL CB = 1 CE = 2 AL = L> amino acids <September> positive
<Tb> <September> peptides <September> positive
<Tb> <CEL CB = 1 CE = 2 AL = L> nucleic acid components <September> positive
<Tb> <September> Sterility <September> sterile
<Tb> <CEL CB = 1 CE = 2 AL = L> pyrogenicity <September> pyrogenic
<Tb> <SEP> Advancement of the metamorphosis of Xenopus laevis <CEL CB = 3 AL = L> 16 days
<Tb> <SEP> Compensation for KCN-damaged cell respiration from liver homogenate <SEP> see description from p. 91
<Tb> <September> Padberg test <SEP> 59 (80)
<Tb> <September> Corneometer test:
<Tb> <CEL CB = 2 AL = L> skin moisture retention <SEP> 24% improvement
<Tb> </ TABLE>
The test described below shows that the extract VIll investigated here has KCN-damaged cell respiration of rat liver homogenate. can compensate:
In the Warburg model, the influence of extract VIll on a liver homogenate poisoned with KCN was tested:
<Tb> <TABLE> Columns = 3
<Tb> <September> 1.1 <SEP> liver homogenate with the respiratory factor <SEP> F = 1.00
<Tb> <SEP> is characterized by a KCN content of 3 nM (final concentration in the approach)
Breathability decreased <SEP> F = 0.75
<Tb> <September> 1.2 <SEP> By adding the breath-increasing extract VIll with the value <SEP> F = 4.07
<Tb> <SEP> can cause cellular respiration of the liver homogenate partially poisoned by KCN <SEP> F = 0.75
<Tb> <SEP> are raised to the value <SEP> F = 3.22
<Tb> </ TABLE>
Carrying out the experiment: (cf. also breath increase test on page 41-44 solutions ibid.)
Cone-shaped Warburg vessels with a cylinder insert (ZE) and a side arm (SA) and a volume of approx. 13 ml are filled according to the filling plan (details in ml): Table XXII.
<Tb> <TABLE> Columns = 11 Table XXII
<tb> Head Col 2 to 3 AL = L: Thermobarometer TB
<tb> Head Col 4 to 5 AL = L: breathing
normal
<tb> Head Col 6 to 7 AL = L: breathing
+ VIII
<tb> Head Col 8 to 9 AL = L: breathing
+ KCN
<tb> Head Col 10 to 11 AL = L: breathing
+ KCN + VIll
<tb> Head Col 2 AL = L: 1
<tb> Head Col 1: 2
<tb> Head Col 2: 3
<tb> Head Col 3: 4
<tb> Head Col 4: 5
<tb> Head Col 5: 6
<tb> Head Col 6: 7
<tb> Head Col 7: 8
<tb> Head Col 8: 9
<tb> Head Col 9:
10
<Tb> <SEP> buffer [HR] <September> 3.00 <September> 3.00 <September> 1.50 <September> 1.50 <September> 1.50 <CEL AL = L> 1.50 <September> 1.40 <September> 1.40 <September> 1.40 <September> 1.40
<Tb> <SEP> buffer [SA] <September> 0.25 <September> 0.25 <CEL AL = L> 0.25 <September> 0.25 <September> 0.25 <September> 0.25
<Tb> <SEP> KCN [HR] <September> 0.10 <September> 0.10 <September> 0.10 <CEL AL = L> 0.10
<Tb> <SEP> 6 N KOH (ZE) <September> 0.20 <September> 0.20 <September> 0.20 <September> 0.20 <September> 0.20 <September> 0.20 <CEL AL = L> 0.20 <September> 0.20 <September> 0.20 <September> 0.20
<Tb> <September> Vill <September> 0.25 <September> 025 <September> 0.25 <CEL AL = L> 0.25
<Tb> <SEP> liver homogenate [HR] <September> 1.50 <September> 1.50 <September> 1.50 <September> 1.50 <September> 1.50 <CEL AL = L> 1.50 <September> 1.50 <September> 1.50
<Tb> <September> readings <SEP> see p. 94-97
<Tb>
* KCN concentration 3.0 nM in the mixture (batch)
<Tb> </ TABLE>
The solutions are pipetted in the order given. Folded filter strips are used in the cylinder inserts to increase the KOH surface. Immediately after the filling is complete, the tubes are sealed with the appropriate hose valve plugs on the side arm attachment, the tubes are attached to the pressure gauges and secured with clips or rubber packs. With the taps open, the pressure gauges are suspended in the apparatus, which is heated to 37 ° C., and shaken for 60 minutes in order to heat the reaction solution and to let the initially very rapid breathing subside somewhat.
Then the right pressure gauge legs are set to the mark "15" using the pinch valve, the difference between the left leg to "15" is noted, the pressure gauge cocks are closed and the solutions from the side arms are transferred to the main rooms by tilting (0-time). After every 20 minutes the shaking device is switched off, the right manometer legs set to "15" (V = const.) And the difference between the left legs to "15" (pressure difference h at constant volume and constant temperature) noted.
The test runs up to a measurement duration of 100 minutes. After the last reading, the manometer taps are opened and the volumes of the vessels and the associated manometers are noted.
The h values in mm measured for the pressure differences as a result of the oxygen consumption are summarized in the following test protocols a-d.
evaluation
First, the tubes are adjusted to the thermobarometers (tube 1/2) for 3 to 10 minutes to compensate for air pressure and temperature fluctuations during the test. The vessel constants for O2 of glasses 3 to 10 are then calculated using the following equation:
EMI93.1
Vg = volume of the gas phase (volume of the vessel and the manometer up to the mark "15" minus Vf). Vf = volume of the total liquid contained in the vessel. T = test temperature in DEG K. alpha = Bunsian absorption coefficient (alpha O2 37 DEG C = 0.0239). P0 = 1 atm, measured in mm Brodie solution (manometer filling) 760 mm Hg = 10,000 mm Brodie solution.
The oxygen used can now be used according to the equation
X (mu l O2) = h. K
can be calculated because the carbonic acid produced by breathing has been completely absorbed by the KOH (h = manometric difference).
Test protocol a
<Tb> <TABLE> Columns = 6
<tb> Head Col 1 to 2 AL = L: increased breathing of the liver homogenate without additives (AT factor 1.0)
<tb> Head Col 3 AL = L: 1
<tb> Head Col 1: 2
<tb> Head Col 2: 3
<tb> Head Col 3:
4
<Tb> <September> Manometervol. <September> 1332 <September> 1409
<Tb> <CEL CB = 1 CE = 2 AL = L> vessel volume <CEL CB = 5 AL = L> 14218 <September> 13950
<Tb> <September> Time <SEP> 0 min <September> - <September> - <SEP> - (SEP) <-> (TB> <SEP> 20 min <September> 8 <September> 5 <September> 32 <September> 30
<Tb> <SEP> 40 min <September> 12 <September> 11 <September> 55 <CEL AL = L> 51
<Tb> <SEP> 60 min <September> 17 <September> 14 <September> 70 <September> 67
<Tb> <SEP> 80 min <September> 21 <CEL AL = L> 18 <September> 86 <September> 82
<Tb> <SEP> 100 min <September> 23 <September> 21 <September> 99 <September> 95
<Tb> <CEL CB = 1 CE = 2 AL = L> h corrected <SEP> 22 <September> 77 <September> 73
<Tb> <September> KO2 <September> 1,074 <CEL AL = L> 1.057
<Tb> <SEP> must O2 <September> 82.7 <September> 77.2
<Tb> <September> averages <CEL CB = 5 CE = 6 AL = L> 80.0 mu l O2
<Tb> <September> AT-factor <SEP> F = 1.00
<Tb> </ TABLE>
Test protocol b
<Tb> <TABLE> Columns = 6
<Tb>
<tb> Head Col 1 to 2 AL = L:
Increased breathing of the liver homogenate (AT factor 1.0) by adding extract VIII
<tb> Head Col 3 AL = L: 1
<tb> Head Col 1: 2
<tb> Head Col 2: 5
<tb> Head Col 3: 6
<Tb> <September> Manometervol. <September> 1323 <September> 1346
<Tb> <CEL CB = 1 CE = 2 AL = L> vessel volume <CEL CB = 5 AL = L> 13432 <September> 14514
<Tb> <September> Time <SEP> 0 min <September> - <September> - <SEP> - (SEP) <-> (TB> <SEP> 20 min <September> 8 <September> 5 <September> 163 <September> 158
<Tb> <SEP> 40 min <September> 12 <September> 11 <September> 67 <CEL AL = L> 61
<Tb> <SEP> 60 min <September> 17 <September> 14 <September> 119 <September> 108
<Tb> <SEP> 80 min <September> 21 <CEL AL = L> 18 <September> 36 <September> 32
<Tb> <SEP> 100 min <September> 23 <September> 21 <September> 61 <September> 55
<Tb> <CEL CB = 1 CE = 2 AL = L> h corrected <SEP> 22 <September> 321 <September> 299
<Tb> <September> KO2 <September> 1.004 <CEL AL = L> 1.101
<Tb> <SEP> must O2 <September> 322.3 <September> 329.2
<Tb> <September> averages <SEP> 325.8 ml O2
<Tb> <SEP> AT factor of extract VIII <SEP> F = 0.75 (increase
> 300%)
<Tb> </ TABLE>
Test protocol c
<Tb> <TABLE> Columns = 6
<tb> Head Col 1 to 2 AL = L: Inhibition of breathing of liver homogenate (AT factor 1.0) by adding 3 nM KCN
<tb> Head Col 3 AL = L: 1
<tb> Head Col 1: 2
<tb> Head Col 2: 7
<tb> Head Col 3: 8
<Tb> <September> Manometervol. <September> 1263 <September> 1329
<Tb> <CEL CB = 1 CE = 2 AL = L> vessel volume <CEL CB = 5 AL = L> 14415 <September> 14293
<Tb> <September> Time <SEP> 0 min <September> - <September> - <SEP> - (SEP) <-> (TB> <SEP> 20 min <September> 8 <September> 5 <September> 20 <September> 21
<Tb> <SEP> 40 min <September> 12 <September> 11 <September> 36 <CEL AL = L> 39
<Tb> <SEP> 60 min <September> 17 <September> 14 <September> -50 <September> 50
<Tb> <SEP> 80 min <September> 21 <CEL AL = L> -18 <September> -65 <September> -65
<Tb> <SEP> 100 min <September> -23 <September> -21 <September> -77 <September> -77
<Tb> <CEL CB = 1 CE = 2 AL = L> h corrected <SEP> 22 <September> 55 <September> -55
<Tb> <September> KO2 <September> 1,103 <CEL AL = L> 1.080
<Tb> <SEP> must O2 <September> 60.7 <September> 59.4
<Tb> <September> averages <CEL CB = 5 AL = L> 60.1 μl O2
<Tb> <SEP> AT factor from KCN <SEP> F = 0.75 (decrease 25%)
<Tb> </ TABLE>
Test protocol d
<Tb> <TABLE> Columns = 6
<tb> Head Col 1 to 2 AL = L: increased breathing through the KCN
inhibited liver homogenate breathing
after adding extract VIII
<tb> Head Col 3 AL = L: 1
<tb> Head Col 1: 2
<tb> Head Col 2: 9
<tb> Head Col 3:10
<Tb> <September> Manometervol. <September> 1514 <September> 1323
<Tb> <CEL CB = 1 CE = 2 AL = L> vessel volume <CEL CB = 5 AL = L> 14535 <September> 13007
<Tb> <September> Time <SEP> 0 min <September> - <September> - <SEP> - (SEP) <-> (TB> <SEP> 20 min <September> 8 <September> 5 <September> 67 <September> 64
<Tb> <SEP> 40 min <September> 12 <September> 11 <September> 151 <CEL AL = L> 148
<Tb> <SEP> 60 min <September> -17 <September> -14 <September> -46 <September> -76
<Tb> <SEP> 80 min <CEL AL = L> -21 <CEL AL = L> -18 <September> -76 <September> -101
<Tb> <SEP> 100 min <September> -23 <September> -21 <September> -102 <September> -142
<Tb> <CEL CB = 1 CE = 2 AL = L> h corrected <SEP> -22 <September> -233 <September> -268
<Tb> <September> KO2 <CEL CB = 5 AL = L> 1.102 <September> 0.966
<Tb> <SEP> must O2 <September> 256.8 <September> 258,
9
<Tb> <CEL CB = 1 CE = 2 AL = L> mean values <CEL CB = 5 AL = L> 257.9 ml O2
<Tb> <September> AT-factor <SEP> F = 3.22
(Increase approx. 275%)
<Tb> </ TABLE>
Extract VIII also had an aphrodisiac effect, as can be seen from the following experiments:
Extract VIII was concentrated to recover the solid and administered to male rats, which were not particularly keen on mating, daily in amounts of 0.15 g per kg of extract VIII (solid) for 14 days. The rats showed increased ejaculation from day 10 compared to the control animals. This effect lasted for about 3 weeks and could be sustained.
In another experiment with 5000 mice, the potency of male mice was inhibited by adding torula yeast to drinking water, which has long been known from the literature [Lit. 12]. This inhibition of potency could be abolished by administering extract VIII, so that the number of newborn mice rose again to a normal level. These experiments were carried out on 1000 male and 4000 female mice.
The following shows that extract VIII also has a remarkable free radical scavenging effect.
Detection method:
The system "hyaluronic acid, xanthine, xanthine oxidase" (hereinafter referred to as "HXX system") can be used to determine the radical scavenging effect in vitro.
Principle:
It is known that hyaluronic acid in phosphate buffer 7.4 is rapidly broken down by hydroxyl radicals which are released by the action of the enzyme xanthine oxidase on xanthine. The depolymerization of hyaluronic acid can be measured by measuring the decrease in viscosity. The addition of radical scavengers inhibits the breakdown of hyaluronic acid and leads to an inhibition of the decrease in viscosity. The drop in viscosity of the hyaluronic acid solution is a measure of the action of free hydroxyl radicals.
This results from the attached FIG. 12, in which the depolarization of the hyaluronic acid, determined by measuring the decrease in viscosity of the HXX system, is shown graphically with various additives.
12 mean:
1. HXX system without enzyme
2. System HXX with enzyme
3. System HXX with extract VIII (example 10)
4. System HXX with yeast extract VIl (example 9)
5. System HXX with thymus extract IVC (example 6)
6. System HXX with blood extract V (example 7)
7. System HXX with Colla 120 VI with additives (example 8)
8th.
System HXX with extract Ic and protein-containing beef kidney extract (preserved)
Experimental approaches:
<Tb> <TABLE> Columns = 4 hyaluronic acid solution
<tb> Head Col 1: reagents (test solution pH 7.4)
<tb> Head Col 2: without hydroxyl radicals (ml)
<tb> Head Col 3: with hydroxyl radicals (ml)
<tb> Head Col 4: with hydroxyl radicals
+ VIII (ml)
<Tb> <September> hyaluronic acid <September> 10.00 <September> 10.00 <September> 10.00
<Tb> <CEL AL = L> phosphate buffer / xanthine solution <CEL AL = L> - <September> 2.50 <September> 2.50
<Tb> <September> xanthine oxidase <September> 0.15 <September> 0.15 <September> 0.15
<Tb> <CEL AL = L> phosphate buffer <September> 2.50 <SEP> - (SEP) <-> (TB> <SEP> VIII (test solution) <September> 0.15 <September> - <CEL AL = L> 0.15
<Tb> <September> Aqua. least. <September> 2.20 <September> 2.35 <September> 2.20
<Tb> </ TABLE>
Final concentrations of the aqueous test solutions: 0.425% hyaluronic acid, 66.0 mM phosphate buffer 7.4; Xanthine 0.6 mM, xanthine oxidase: 0.10 U / ml (cf. also: Lengenfelder, E., Fink, R., "The oxidative hyaluronic acid degradation, mechanism and consequences", Springer-Verlag, Berlin 1986).
The test solutions are incubated at 37 ° C. for 40 minutes, cooled to 20 ° C. in a water bath for 10 minutes; after a further 35 min, the viscosity measurements are carried out at 20.00 ° C. using a precision viscometer.
Results in Fig. 12, for VIII cf. Nos. 1, 2 and 3.
Example 11
Use of animal and / or vegetable organ extracts with breath-increasing, i.e. oxygen-activating effect and with radical scavenging effect in technology
In the above description, it has already been pointed out that the cell metabolism activity, which is important for cosmetic and medical applications and which, among other things, results in increased energy production, has led to the expectation of further possible uses, owing to the oxygen activation and free radical scavenging effect which is associated with the metabolism activation.
The organ extracts produced in the above examples of biological applications are mostly heavily purified, e.g. also deodorized and sterile filtered. In some cases, freedom from pyrogens was even sought. Such intensive treatment or cleaning of the extracts appears in the case of technical applications, e.g. as stabilizers for color solutions, especially water-based paints (as they are preferred today in the automotive industry), or colored systems are usually not required. Positive results were obtained both with raw organ extracts and with protein-containing and protein-free extracts. Instead of sterile filtration, good preservation with phenonip or similar preservatives and addition of suitable solvents and solubilizers such as propylene glycols were sufficient.
Paint coatings on walls could also be made more permanent, as corresponding long-term series tests over 1 to 3 years have shown.
The following organ extracts from the examples and prepared analogously were used:
a) The synthetic crude kidney extract described in Example 2, made from partial solution I and partial solution II, but without the addition of peptide components, without sterile filtration, preserved with 0.8% Phenonip and optionally other preservatives.
In the case of color solutions, the addition of solubilizers has proven to be advantageous. They also worked with quick-drying alkyd resin paint on various materials.
b) The protein-free and protein-containing bovine kidney extracts from fresh bovine kidneys and cell lines described in Example 3.
c) The synthetic thymus extract IVb described in Example 6, namely before sterile filtration and without peptide additives, is preserved. Likewise a combination of IVa and IVc, treated analogously to IVb.
d) The serum blood extract described in Example 7 synthetically alone and also in combination with blood extract from fresh calf blood according to DE-OS 2 405 983, page 3, but without evaporating to dryness in a vacuum rotary evaporator.
e) The vegetable extract Colla 120 VI described in Example 8 and its raw form.
f) The extracts VIl and VIll described in Examples 9 and 10 and the VII crude product as obtained before dialysis (Example 9, first paragraph).
In this context, reference should also be made to the experiments described in Example 10 for the detection of the radical scavenger effect of VIII and other organ extracts produced (cf. also FIG. 12).
Bibliography [Lit.]
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[18] Riemschneider, R., "Studies on placenta extracts", publication from the Institute for Biochemistry at the Free University of Berlin in January 1962, lecture in Tokyo on January 22nd, 1962 in the PULA colloquium (in Japanese).
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