CH676362A5

CH676362A5 -

Info

Publication number: CH676362A5
Application number: CH4706/88A
Authority: CH
Inventors: Junichi Yano; Hisaaki Kawakatsu
Original assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd
Priority date: 1987-12-24
Filing date: 1988-12-20
Publication date: 1991-01-15
Also published as: FR2625101A1; GB8830115D0; GB2212502A; BE1001963A3; KR890009417A; FR2625101B1; EP0322768A1; GB2212502B

Description

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Description

La présente invention concerne un nouvel anticorps monoclonal, et plus particulièrement un anticorps monoclonal extrêmement utile comme médicament en ce sens qu'il reconnaît un site particulier de la protéine de cyto-squelette de la membrane qui est présent autour de la membrane cellulaire et qui est considéré comme parîcipant au système de transfert de l'information.

Ces dernières années, il a été établi, grâce au développement remarquable des techniques de la biologie moléculaire, que le système de transfert de l'information et le système de cyto-squelette, qui étaient considérés comme jouant des rôles très différents, étaient étroitement liés l'un à l'autre.

Il a été établi par de nombreuses études qu'entre autres une série de protéines nommées protéines du cyto-squelette de la membrane faisaient office de premiers véhicules pour transférer l'information dans les cellules, après qu'une stimulation physiologique provenant d'une source extérieure aux cellules ait été transformée en une information chimique précise par un récepteur sur la surface de la cellule.

Parmi ces protéines du cyto-squelette de la membrane, une série de protéines ayant une masse moléculaire d'environ 36 000 ont reçu le nom de groupe de protéines 36K (lequel est désigné par «famille 36K» dans la description) et sont connues pour être des protéines particulières qui remplissent de multiples fonctions pour prendre part au transfert d'informations telles que transformation, inflammation, immunité, etc.

Les protéines désignées collectivement sous le nom de famille 36K sont considérées comme étant la cause de l'interaction associée aux lipides et au calcium, en même temps que des protéines telles que l'ac-tine, la fodrine, etc. présentes autour d'elles.

Diverses études ont été effectuées sur la famille 36K; la présence de Calpaçtine 1 (également désignée sous le nom de lipocortine 2), de Calpaçtine 2 (également désignée sous le nom de lipocortine 1), etc. et leurs structures primaires ont été établies. [Cell, 46,201-212 (1986), Cell, 46,191-199 (1986)].

De plus, en ce qui concerne la protéine désignée sous le nom de IBC (inhibiteur de la coagulation du sang), sa structure primaire a été établie [J. Biochem. (Tokyo), 102,1261-1273 (1987)].

En outre, en ce qui concerne d'autres protéines appartenant à la famille 36K, leur présence est suggérée et on s'attend à ce que le rôle cytophysiologique de la famille 36K dans le fonctionnement et la participation à diverses maladies soit établi.

On a déjà signalé des relations entre la famille 36K et la transformation [Proc. Nati. Acad. Sci., 76. 5212-5216 (1979)], à partir desquelles il a été établi que dans des cellules de culture transformées par un virus portant un gène cancérigène, l'introduction de la phosphorylation dans leurs radicaux tyrosine augmentait fortement. On pense que la Calpaçtine 1 décrite ci-dessus a été observée dans cette étude, mais on ne sait toujours pas comment l'augmentation de la phosphorylation dans la transformation entraîne une prolifération indéfinie des cellules, etc.

Les relations entre l'importance physiologique de l'inflammation et la famille 36K ont également été étudiées.

La Prostaglandine, le leukotriène, le PAF, etc. qui sont des substances chimiques transférant l'inflammation in vivo sont libérées de la membrane cellulaire par la phospholipase Aa au site inflammatoire. II a été établi que des protéines anti-inflammatoires, désignées j'usqu'à présent sous les noms de lipomodu-line, macrocortine, rénocortine, sont des membres de la famille 36K et il a été confirmé que leur activité anti-inflammatoire se manifestait en inhibant le phospholipase A2 précitée.

Cette activité d'inhibition de la phospholipase A2 est une propriété que possèdent toutes les protéines connues jusqu'à présent appartenant à la famille 36K. Il est également connu que cette activité est perdue par phosphorylation.

Les relations entre le mécanisme physiologique de l'immunité et la famille 36K ont également été étudiées.

Il a été établi que le facteur d'inhibition de la glycosylation (GIF) produit par les limphocytes suppresseurs, les macrophages, etc. est un membre de la famille 36K [Proc. Nati. Acad. Sci., 83. 160-164 (1986)], ce qui conduit à un objet d'étude futur portant sur la relation avec des maladies immunes telles que l'allergie, les rhumatismes, etc.

On estime également que les protéines intracellulaires nommées calélectrine, chromobindine, calcimé-dine, endonexine, annexine, etc. appartiendraient à la famille 36K et on suppose qu'elles prennent part au transfert de diverses informations physiologiques.

Comme il a été indiqué ci-dessus, une série de protéines cellulaires collectivement désignées sous le nom de famille 36K sont des substances qui ont une grande importance du point de vue physiologique. Leur identification et leur détermination quantitative posaient un problème extrêmement important à étudier, pouvant conduire directement à la mise au point d'excellents médicaments.

Comme il a été indiqué ci-dessus, il est extrêmement important, pour la mise au point de médicaments, de mettre au point un moyen pour identifier et déterminer quantitativement les protéines appartenant à la famille 36K.

Comme moyen d'identifier et déterminer quantitativement une série de protéines ayant des structures similaires pour lesquelles on s'attend à des fonctions indépendantes, on a envisagé jusqu'à présent ce qui suit.

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(1) une méthode pour identifier indirectement la protéine en reconnaissant sa séquence d'ADN au moyen d'une sonde à ADN

(2) une méthode pour reconnaître la protéine par une «réaction antigène-anticorps» par récolte d'un anticorps monoclonal (désigné parfois ci-après sous le nom de «Mb»).

La méthode utilisant le Mb est considérée comme étant un moyen analytique idéal, car le Mb est capable de se lier directement avec une protéine exprimée, et chacun peut reconnaître le seul déterminant an-tigénique.

Dans la famille 36K, le Mb contre la Calpaçtine 1 était connu [Mol. Cell. Biol., 6,2745-2751 (1986)]. Cependant, par cette méthode, l'immunisation était effectuée en utilisant une protéine brute, de telle sorte qu'on ne savait pas quel site de la protéine le Mb reconnaissait, et par conséquent, la protéine brute ne convenait pas comme anticorps pour examiner une fonction spécifique.

En outre, le Mb pour lalipomodulinede lapin était également connu [J. ImmunoL 132.1286-1293 (1984)]. Cependant, son site de reconnaissance dans la protéine n'était pas clair lui non plus, comme il a été décrit ci-dessus, et un problème similaire se posait.

Problèmes à résoudre par l'invention:

L'examen de séquences de gènes de la Calpaçtine 1 et de la Calpaçtine 2 révèle que des séquences d'aminoacides de ces protéines contiennent un motif répétitif de 4 domaines similaires et différent l'une de l'autre sur des domaines définis partant de leur extrémité N-terminale (extrémité ayant un groupe ami-no)(désignés sous le nom de «domaine N-terminal» dans la description).

La Phosphorylase spécifique de la tyrosine, un site de phosphorylation par la C-kinase, un site dans lequel la modification des lipides est attendue, un site hydrolysable par la protéase etc. sont concentrés dans le domaine N-terminal.

De ce qui précède, on pourrait aisément déduire que dans une série de protéines appartenant à la famille 36K, le domaine N-terminal remplit une fonction caractéristique pour chaque protéine.

Ainsi, si l'on peut obtenir un Mb capable de reconnaître spécifiquement le domaine N-terminal, (1) le mécanisme d'action de la protéine appartenant à la famille 36K sur la maladie pourrait être expliqué et (2) l'identification pourrait être effectuée en interdisant les possibilités de réaction croisée entre des protéines appartenant à la famille 36K.

Dans ces conditions, la demanderesse a effectué des études poussées pour obtenir un Mb capable de reconnaître spécifiquement le domaine N-terminal décrit ci-dessus, et elle a finalement abouti à la présente invention.

Moyens pour résoudre les problèmes:

Dans la présente invention, le peptide optimum est préparé par synthèse chimique, eu égard à J'antî-génicité sur le site fonctionnel en dehors du domaine N-terminal.

Pour cette raison, l'antigénicité est attendue au moyen d'une analyse par calculateur par examen d'ho-mologie etc., en utilisant la séquence d'aminoacides attendue d'une séquence d'ADN de la famille 36K et divers peptides sont préparés par synthèse chimique.

Le peptide utilisé ici pour l'immunisation peut également être purifié à partir de la protéine de la famille 36K purifiée dans le cas où un site de clivage par une enzyme de décomposition (protéase) appropriée est présent.

Dans la présente invention, le peptide ainsi acquis peut être immobilisé par liaison avec un support approprié, par exemple l'hémocyanine du gastéropode en trou de serrure (keyhole lîmpet), etc.

En outre, suivant le but recherché, une séquence de gène du domaine N-terminal de la protéine de la famille 36K est liée au plasmide de E. coli, par exemple une partie de la p-gaiactosidase pour l'exprimer sous forme de protéine condensée; la protéine condensée peut être utilisée après purification.

Pour la liaison du peptide à un support, on peut utiliser un réactif chimique approprié, par exemple le glutaraldéhyde, le carbodiimide, le MBS (m-maléimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester), etc.

On décrira ci-après un procédé de préparation du Mb conforme à la présente invention en utilisant la protéine ainsi obtenue comme antigène.

On expliquera tout d'abord la préparation de cellules immunisées.

Les cellules immunisées peuvent être obtenues en administrant l'antigène dans le corps de l'animal et en recueillant des cellules provenant de ranimai.

Comme animal, on peut utiliser des animaux tels que la souris etc. habituellement utilisés pour les expériences. Il est avantageux d'administrer l'antigène par voie intrapéritonéale, etc., et de l'administrer sous forme de mélange avec de l'adjuvant complet de Freund de la manière classique, mais dans la présente invention, on préfère répéter l'administration plusieurs fois à des intervalles de plusieurs semaines. Il suffit que l'intervalle de temps entre l'administration soit de 2 semaines, et le nombre d'administration est de préférence de 2 à 4.

Ensuite, on sacrifie l'animal et on prélève des organes, par exemple la rate, etc. pour obtenir des cellules de la manière classique.

On décrira ci-après la fusion cellulaire à des cellules de myélome en vue de conférer aux cellules immunisées un pouvoir de prolifération.

Les cellules de myélome utilisées ici peuvent être obtenues en cultivant par exemple une souche SP2/0-Ag14 etc. dans un milieu contenant par exemple du FCS (sérum de fœtus de bovin). On utilise de

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préférence des cellules dans la phase de croissance exponentielle.

Pour la fusion cellulaire, les cellules immunisées sont mélangées avec des cellules de myélome dans un rapport numérique allant de 1:1 à 10:1, puis la fusion est effectuée en utilisant un agent de fusion tel que le polyéthylèneglycol, etc. ou une stimulation électrique, etc.

Après fusion, les cellules sont cultivées dans le milieu «HAT» complété avec de l'hypoxanthine, de l'aminoptérine et de la thymidine immédiatement ou après pré-incubation dans un milieu ordinaire, grâce à quoi on peut choisir uniquement les cellules ayant subi la fusion en une combinaison de cellules immunisées et de cellules de myélome.

Dans la présente invention, les cellules produisant l'anticorps peuvent être choisies tout en confirmant le titre de l'anticorps, par exemple par dosage immunologique lié à l'utilisation d'une enzyme (ELISA), etc.

Les cellules dans lesquelles le titre de l'anticorps a pu être confirmé sont cultivées de manière répétée dans une plaque à réservoirs ou dans une boîte de Pétri, d'une manière classique, par exemple par la méthode de dilution limitante, la méthode à la gélose molle, etc., au cours de laquelle la productivité d'anticorps, l'essai immunochîmique de l'anticorps produit, l'essai de spécificité pour l'antigène etc. sont effectués, ce qui permet d'effectuer une sélection. En outre, une sélection peut également être effectuée en utilisant un micromanipulateur ou un classeur de cellules.

Les cellules conformes à la présente invention peuvent produire du Mb en continu conformément à la présente invention. En conséquence, dans le cas de l'utilisation de Mb conformément à la présente invention, le liquide surnageant de la solution de culture conforme à la présente invention peut être utilisé directement tel quel comme solution de Mb conforme à la présente invention.

En outre, le Mb conforme à la présente invention peut également être produit en administrant de cellules produisant de l'anticorps dans l'organisme d'un animal tel que souris, etc. habituellement utilisé pour l'essai (par exemple par voie intrapéritonéale) et en recueillant un fluide corporel de l'animal, par exemple, des ascites, etc.

Pour purifier et recueillir le Mb conforme à la présente invention à partir de la solution de culture des cellules conforme à la présente invention ou d'ascites, on peut récolter le Mb par exemple par précipita-ton par le sulfate d'ammonium, par Chromatographie d'échange d'ions, etc.

Le Mb ainsi recueilli peut être stocké sous forme d'une substance stable, en ajoutant par exempte diverses solutions tampons, et si nécessaire, un sel et un azide, etc., ou par lyophilisation etc.

L'identification de chaque classe d'immunoglobuline de ces anticorps peut être effectuée par ELISA en utilisant l'anticorps spécifique contre cette classe.

En ce qui concerne le Mb ainsi obtenu, capable de reconnaître chaque domaine N-terminal de la famille 36K, on peut confirmer que le Mb se lie spécifiquement à chacune des protéines appartenant à la famille 36K par les moyens immunobiochimiques suivants.

Une technique d'identification utilisant du Mb conforme à la présente invention, en le soumettant à une analyse par la technique du western blot, est expliquée ci-dessous.

Cette technique peut être appliquée à l'identification et à la détermination quantitative d'un peptide dans un échantillon provenant d'un organisme vivant. Dans celle-ci, un échantillon provenant d'un organisme vivant est fractionné par un électrophorèse sur gel de SDS Polyacrylamide d'une manière classique, suivie d'un «buvardage» sur une membrane de nylon ou sur une membrane de nitrocellulose. Le peptide transféré sur la membrane est lié au Mb, qui est ensuite lié à la protéine A marquée avec du 35S ou du issi. Dans ce cas, un excès de Mb et de protéine A est éliminé à chaque fois par un lavage soigné.

En opérant ainsi, du 35S ou du 125l est théoriquement présent en proportion de la quantité de Mb à la position du peptide, en correspondance avec la spécificité du Mb utilisé. Le ass ou le 125l présent sur la membrane est détecté au moyen d'un détecteur radîo-immunologique (RI scanner) ou par autoradiographie, grâce à quoi on peut effectuer l'identification et la détermination quantitatives du peptide.

On décrira ensuite ci-dessous une technique pour l'identification du peptide, caractérisée en ce qu'on utilise un moyen de RIP (radio-immunoprécipltation).

Dans la RIP, un échantillon de cellule est cultivé dans une solution de culture contenant de la méthio-nine marquée par exemple par du 35S, etc., Incorporant ainsi le traceur dans l'échantillon de cellule. On y ajoute une solution tampon pour la solubilisation et on recueille le lysat. On ajoute au lysat du Mb conforme à ta présente Invention. En mélangeant, on réalise une réaction antigène-anticorps.

Puis, on ajoute de la manière classique une protéine A-Sépharose, etc. Par des centrifugations et des lavages au tampon répétés, tes impuretés autres que le peptide conforme à la présente invention sont éliminées. On effectue ensuite l'électrophorèse d'une manière classique pour détecter te radio-isotope. Dans le cas où le peptide est présent dans les cellules de l'échantillon, des bandes correspondant à la spécificité du Mb utilisé apparaissent.

On expliquera ensuite ci-dessous une technique pour détecter les peptides dans un organisme vivant, caractérisée en ce qu'on utilise Pimmunocytochîmie.

Dans le cas de cellules cultivées, les cellules sont immobilisées avec une solution de fixage appropriée, telle qu'une solution formaldéhyde-sérum physiologique tamponné au phosphate (PBS), etc., après quoi on effectue un traitement par le Triton pour fournir des échantillons. Du Mb conforme à la présente invention est ajouté à ces échantillons pour achever une réaction antigène anticorps, après quoi on lave soigneusement avec un tampon phosphate. Après avoir fait réagir de t'anti-immunoglobuline

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liée à la biotine comme anticorps secondaire, on effectue un lavage soigné. De l'avîdine marquée par fluorescence est mise à réagir avec le complexe peptide-Mb-anticorps secondaire lié à la biotine. Sa fluorescence est observée au moyen d'un microscope à fluorescence pour détecter le peptide dans des cellules.

Dans le cas d'un tissu pathologique, le tissu est fixé avec du formol ou une autre solution de fixation appropriée, pour faire une tranche, ou bien une tranche lyophilisée est ensuite fixée avec du formaldé-hyde, etc., si nécessaire, traitée ensuite par un agent tensio-actif; le tissu ainsi obtenu est utilisé comme échantillon. L'échantillon est traité d'une manière similaire pour effectuer Pimmunocytochimie.

Conformément à la présente invention, il est possible d'obtenir un Mb capable de reconnaître spécifiquement le domaine N-terminal de chaque protéine de la famille 36K. En appliquant des techniques immu-nobiochimiques telles que le «western blotting», l'immunocytochimie, etc., décrites en détail ci-dessus, chacune des protéines appartenant à la famille 36K peut être identifiée même si elle est présente à l'état de trace. Ceci signifie qu'on dispose désormais d'une méthode qui fait date pour établir la fonction de chacune des protéines étudiées, leur rapport de présence dans chaque tissu, leur état de répartition (traitement, phosphorylation), etc.

En outre, ce Mb est capable de reconnaître spécifiquement le domaine N-terminal de chacune des protéines de la famille 36K et il est par conséquent possible d'incorporer le système d'inhibition de la phosphorylation, du sucre, de la modification des lipides, de la liaison à la protéine 10K dans la Calpaçtine 1, etc. couplé à un anticorps approprié. Par conséquent, ces phénomènes peuvent être des matières utiles pour étudier la façon dont ces phénomènes participent à l'expression de la fonction de chaque protéine de la famille 36K.

Il résulte de ce qui précède que le Mb de la présente invention est utile pour la clarification du mécanisme de transfert de l'information in vivo dans des maladies telles que transformation, maladies immunes, inflammation, etc. et est considéré comme essentiel pour établir le traitement de ces maladies.

(EXEMPLES^

L'invention sera décrite ci-après de manière plus detaillée en se référant aux exemples ci-dessous, mais ces exemples sont destinés simplement à illustrer les modes de réalisation de la présente invention qui ne doit pas être considérée comme limitée à ceux-ci.

EXEMPLE 1

Préparation du Mb pour le domaine N-terminal de la Calpaçtine 1

(1Ì Préparation de l'antigène

Dans la séquence d'aminoacides attendue à partir de la séquence de gènes, 28 aminoacides depuis le premier (méthionine) jusqu'au 28ème (lysine) ont été préparés par synthèse chimique d'une manière classique.

Une solution de 10 mg de ce peptide dans 2 ml d'eau distillée purifiée a été mélangée avec 4 mg/ml de solution de sérumalbumine de bovin (Fraction V fabriquée par la société Sigma Inc.) et un carbodiimide soluble dans l'eau (fabriqué par la Protein Study Promotion Association) a été ajouté au mélange comme agent de couplage, à une concentration finale de 0,2 M.

Tout en maintenant le pH à 6,0, on a effectué la réaction de couplage pendant 30 minutes à une heure jusqu'à ce qu'on n'observe plus de modification du pH. Puis on a effectué une dialyse à 4°C avec du PBS (-) et on a éliminé les matières n'ayant pas réagi à travers une colonne de filtration sur gel. On a obtenu ainsi 12 mg de complexe peptide-sérumalbumine de bovin.

La séquence d'aminoacides (28 aminoacides du premier au 28ème) correspondant au domaine N-terminal de la Calpaçtine 1 est connue et est la suivante:

Met-Ser-Thr-Val-His-Glu-lle-Leu-Cys-Lys-Leu-Ser-Leu-GIu-Gly-Asp-His-Ser-Thr-Pro-Pro-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Val-Lys.

(2) Production de cellules immunisées

Un mélange de 0,1 ml d'une solution contenant 100 pg de la substance obtenue en (1) et 0,1 ml d'adjuvant complet de Freund (fabriqué par là société DIFCO, Ltd.) a été administré par voie intrapéritonéale à des souris femelles BALB/c âgées de 10 semaines. Puis, un mélange en solution de la solution décrite ci-des-sus et d'adjuvant incomplet (fabriqué par DIFCO, Ltd.) a été administré deux fois par voie intrapéritonéale à 2 semaines d'intervalle. La souris a ensuite été sacrifiée par dislocation cervicale et la rate a été prélevée aseptiquement.

Sur un sélecteur (fabriqué par la société BELCO, Ltd.), on a placé environ 1 g de la rate décrite ci-dessus et on l'a fait passer à travers un tamis d'environ 10 p. tout en apportant du milieu MEM (D-MEM)

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modifié de Dulbecco, ce qui donne des cellules de rate à l'état de suspension dans le D-MEM. La suspension a été centrifugée à 100G pendant 5 minutes pour recueillir les cellules de rate.

Les cellules décrites ci-dessus ont été ajoutées à 1 ml d'une solution obtenue en ajoutant du tampon HEPES 20 mM (pH 7,4) à 0,84% de la solution de chlorure d'ammonium pour provoquer une hémolyse. Les cellules ont été obtenues par centrifugation sous 1000G pendant 5 minutes. Lés cellules ont été remises en suspension dans du D-MEM.

(3Y Production de cellules de mvélome

On cultive une souche SP2/0-Ag14 de la lignée cellulaire de myélome de souris du type résistant à la 8-azaguanine et ne sécrétant pas d'immunoglobuline dans un milieu D-MEM contenant 20% de sérum de foetus de bovin (FCS) dans un incubateur à 37°C sous CO2 à 10%. On recueille les cellules dans la phase de croissance exponentielle et on les utilise pour l'opération suivante.

Par centrifugation à 1000G pendant 5 minutes, on recueille seulement les cellules et on les remet en suspension dans du milieu D-MEM. On compte les cellules avec un hémacytomètre. Après une nouvelle centrifugation a 1000G pendant 5 minutes, on remet les cellules en suspension dans du milieu D-MEM.

Fusion cellulaire

On mélange le milieu D-MEM contenant 108 à 3 x 108 cellules, obtenues en (2) avec le milieu D-MEM contenant 108 cellules de myélome obtenue en (3). Après homogénéisation, on centrifuge le mélange sous 1000G pendant 5 minutes. On élimine le liquide surnageant, on recueille le précipité et on ajoute goutte à goutte 1 ml d'une solution contenant 25% (P/V) de polyéthylèneglycol 1500 (PEG 1500, fabriqué par la société Boehrïnger, Ltd.) et 37,5 mM de HEPES sur une durée d'une minute. Puis on dilue progressivement le mélange avec du milieu D-MEM pour amener le tout à 10 ml.

On y ajoute 10 ml de milieu D-MEM contenant 20% de FCS, après quoi on centrifuge à 1000G pendant 5 minutes. On ajoute aux cellules obtenues du D-MEM contenant 20% de FCS dans 106 cellules/ml. On répartit le mélange dans une plaque de culture à 24 réservoirs, fabriquée par la société Corning Glass

Inc., à raison de 1 ml par réservoir après quoi on les cultive à 37°C pendant 24 heures sous COz à 10% dans un incubateur.

Puis on ajoute une solution de HAT pour éliminer les cellules autres que les cellules ayant fusionné. On continue l'incubation pendant 2 semaines supplémentaires.

(5) Mesure du titre en anticorps par ELISA

Ghacun des réservoirs de la plaque de microtitrage (N° 001-010-2101 fabriqué par la société Dinatec Laboratories, Ltd.) est revêtu de 1 ng/ml du peptide obtenu en (1). Le liquide surnageant, 150 p.l, contenant l'anticorps comme substance à analyser, est placé dans le réservoir, on le laisse séjourner à 37°C pendant 2 heures dans l'incubateur, puis on le lave avec du PBS (tampon phosphate-solution saline). On y ajoute un anticorps anti-souris de chèvre complet lié à de la Peroxydase et on laisse séjourner à 37°C pendant une heure dans l'incubateur. Après lavage avec du PBS, on ajoute un colorant (ABTS), pour former une couleur pendant 15 minutes. On ajoute une solution d'arrêt (citrate 0,1 M-azide de sodium 0,02%) pour arrêter la réaction. Puis on mesure l'absorbance du réservoir avec un multiscanner fabriqué par la société Titertec, Ltd.

(G) Choix des cellules produisant l'anticorps

Les cellules présentes dans le réservoir qui ont été confirmées par ELISA sont inoculées sur du milieu à la gélose molle dans une boîte de Pétri de 60 mm de diamètre. L'incubation est effectuée à 37°C, sous CO2 a 10% pendant 2 semaines dans un incubateur pour former une colonie.

La colonie formée est prélevée et placée dans une plaque de culture à 24 réservoirs. L'activité de l'anticorps est à nouveau confirmée par ELISA. Les cellules présentes dans le réservoir qui ont été confirmées par l'activité d'anticorps sont inoculées sur un milieu à la gélose molle dans une boîte de Pétri de 60 mm de diamètre. L'incubation est effectuée à 37°C sous CO2 à 10% pendant 2 semaines dans un incubateur pour former une colonie. La colonie formée est retirée et placée sur une plaque de culture à 24 réservoirs. L'activité d'anticorps est à nouveau confirmée par ELISA pour choisir des cellules utilisables.

(7) Collection de l'anticorps

(1) Les cellules produisant de l'anticorps obtenues en (6) sont capables de produire toujours l'anticorps de la présente invention. En conséquence, le liquide surnageant de la solution de culture dans laquelle les cellules produisant de l'anticorps ont été cultivées peut être utilisé directement comme solution de l'anticorps de la présente invention.

(2) Du sulfate d'ammonium est ajouté à la solution de culture des cellules produisant de l'anticorps ob-

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tenues en (6) à une concentration finale de 30%. Après centrifugation, le précipité est recueilli et on leur ajoute 20 mM de tampon phosphate présentant un pH de 7,4. Une dialyse est effectuée en utilisant le même tampon phosphate (contenant 0,02% d'azide de sodium) pour éliminer le sulfate d'ammonium. Après dialyse, la solution est lyophilisée pour donner une poudre blanche.

(3) Du Pristane, 0,5 mg, est injecté par voie intrapéritonéale à des souris mâles BALB/C et les souris sont élevées pendant 2 semaines. Les cellules produisant de l'anticorps obtenues en (6) sont injectées à la souris à raison de 10e à 3 x 106 cellules/souris après quoi on les élève pendant 10 jours. On recueille au moyen d'une seringue environ 10 ml des ascites présentes dans la cavité péritonéale.

Du sulfate d'ammonium est ajouté aux ascites à une concentration finale de 30%. Puis on leur ajoute 20 mM d'un tampon phosphate présentant un pH de 7,4. Une dialyse est effectuée en utilisant le même tampon phosphate (contenant 0,02% d'azide de sodium) pour éliminer le sulfate d'ammonium. Après dialyse, la solution est lyophilisée pour donner une poudre blanche.

(8) Identification de chaque classe d'immunoalobuline

L'identification de chaque classe d'immunoglobuline est effectuée de la manière suivante. Des anticorps spécifiques des classes (comme IgA, IgCI, lgG2a, lgG2b, lgG3 et IgM, on a utilisé ceux fabriqués par la société Biorad Ltd.), sont ajoutés, après quoi on fait réagir à 37°C pendant 2 heures. Puis on lave soigneusement le système avec du PBS. On y ajoute de l'anticorps complet anti-souris de chèvre lié à de la Peroxydase. On laisse reposer le mélange à 37°C pendant une heure dans un incubateur. Après lavage avec du PBS, on ajoute un colorant (ABTS) pour former une coloration pendant 15 minutes, grâce à quoi on identifie chacune des classes. Les résultats sont donnés en partie dans le Tableau 1.

Tableau 1

N° de référence

Lignée cellulaire

Sous-classe

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3,11A

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4,5 E

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4,7 G

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5,2 A

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6,9 F

Gl

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9,2 E

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10,9 B

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EXEMPLE 2

Préparation du Mb pour le domaine N-terminal de la Calpaçtine 2

La séquence d'aminoacides (23 aminoacides du 13ème au 35ème) correspondant au domaine N-terminal de la Calpaçtine 2 était connue et elle est la suivante.

Phe-IIe-Glu-Asn-Glu-Glu-GIn-Glu-Tyr-Val-GIn-Thr-Val-Lys-Ser-Ser-Lys-Gly-Gly-Pro-Gly-Ser-Ala.

Un peptide dont la séquence d'aminoacides était composée des 23 aminoacides a été obtenu par synthèse chimique.

On a ensuite opéré d'une manière similaire l'Exemple 1 pour obtenir le Mb recherché.

L'identification de chaque classe d'immunoglobuline a été effectuée d'une manière similaire à l'Exemple 1 pour donner les résultats donnés dans le Tableau 2.

7

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

CH 676 362 A5

Tableau 2

N°de référence

Lignée cellulaire

Sous-classe

1

1,5 A

G2b

2

2,5C

G1

3

2,10D

G2a

4

5,3B

G2a

5

5,5 E

G3

6

5,8 A

G2b

7

7,1 B

G1

8

7,5 D

G2a

9

10,5 A

G2b to

10,10A

M

EXEMPLE3

Production de Mb pour le domaine N-terminal de l'IBC

La séquence d'aminoacides (22 aminoacides du premier au 22ème) correspondant au domaine N-terminal de l'IBC était connue et elle est la suivante:

Met-Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp-Phe-Pro-Gly-Phe-Asp-Glu-Arg-Ala-Asp-Ala-Glu Un peptide ayant une séquence d'aminoacides composée des 22 aminoacides a été obtenu par synthèse chimique.

On a ensuite opéré d'une manière similaire à l'Exemple 1 pour obtenir le Mb recherché.

L'identification de chaque classe d'immunoglobuline a été effectuée d'une manière similaire à l'Exemple 1, pour donner les résultats figurant dans le Tableau 3.

Tableau 3

N° de référence

Lignée cellulaire

Sous-classe

1

1,4B

G3

2

2,2 B

G2a

3

2,50A

G2a

4

5,2 B

G2b

5

5,5 D

G2a

6

5,7 A

G2a

7

6,1 B

G2b

8

7.8D

G3

g

11,5A

G2a

10

12,30B

G2a

La présente invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation qui viennent d'être décrits, elle est au contraire susceptible de modifications et de variantes qui apparaîtront à l'homme de l'art.

Claims

Revendications

1. Anticorps monoclonal capable de reconnaître spécifiquement une protéine appartenant à la famille 36K.

2. Procédé de préparation d'un anticorps monoclonal capable de reconnaître spécifiquement une protéine appartenant à la famille 36K, qui comprend la synthèse chimique d'un peptide correspondant à une séquence d'aminoacides dans la région N-terminale d'une protéine appartenant à la famille 36K et la collecte d'un anticorps, en utilisant ce peptide comme antigène.

3. Procédé d'identification ou de détermination quantitative d'une protéine appartenant à la famille 36K en utilisant un anticorps monoclonal capable de reconnaître spécifiquement une protéine appartenant à la famille 36K.

4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit peptide est lié à un support.

8