CH630662A5

CH630662A5 - Composition containing a stabilised enzyme, process for preparing it and its use

Info

Publication number: CH630662A5
Application number: CH327077A
Authority: CH
Inventors: Ivan E Modrovich
Original assignee: Modrovich Ivan Endre
Priority date: 1976-03-17
Filing date: 1977-03-16
Publication date: 1982-06-30
Also published as: DE2711754A1; FR2344568A1; DE2711754C2; FR2344568B1; CA1091174A; SE7703076L; GB1550753A; JPS52134086A; SE445045B; JPS6117466B2

Description

La présente invention a pour objets une composition liquide stable contenant un enzyme moléculairement stabilisé, définie à la revendication 1, un procédé pour sa préparation, défini à la 25 revendication 12, et une utilisation de cette composition, définie à la revendication 20. The subject of the present invention is a stable liquid composition containing a molecularly stabilized enzyme, defined in claim 1, a process for its preparation, defined in claim 12, and a use of this composition, defined in claim 20.

Il a récemment été établi que le 25 % de tous les tests diagnostiques in vitro effectués annuellement aux USA ne sont pas fiables. Des tests auxquels on ne peut pas se fier peuvent aboutir 30 à des traitements médicaux inutiles, à la suppression d'un traitement nécessaire et à des pertes de revenus. A cause de leur haute spécificité, l'utilisation de déterminations enzymatiques a augmenté de façon appréciable pendant ces dernières années et tout laisse penser que cet état de choses va continuer. Toutefois, 35 des mesures rigoureuses de contrôle de qualité sont nécessaires pour assurer l'exactitude et la fiabilité des résultats. Cette nécessité découle du fait que la nature exacte des enzymes et le mécanisme de leur action restent en grande partie onconnus. Actuellement, la plus grande limitation imposée au fabricant de réac-40 tifs enzymatiques réside, de loin, dans les caractéristiques d'instabilité de ses produits. Les techniques courantes nécessitent l'utilisation de nombreux ingrédients labiles et le nombre de ces ingrédients tend plutôt à augmenter qu'à diminuer. It has recently been established that 25% of all in vitro diagnostic tests performed annually in the USA are unreliable. Unreliable tests can result in unnecessary medical treatment, the withdrawal of necessary treatment, and loss of income. Because of their high specificity, the use of enzyme determinations has increased appreciably in recent years and everything suggests that this state of affairs will continue. However, rigorous quality control measures are necessary to ensure the accuracy and reliability of the results. This necessity arises from the fact that the exact nature of the enzymes and the mechanism of their action remain largely unknown. Currently, the greatest limitation imposed on the manufacturer of enzyme reagents is, by far, the instability characteristics of its products. Current techniques require the use of many labile ingredients and the number of these ingredients tends to increase rather than decrease.

Dans l'état commercial actuel de la technique utilisée pour 45 stabiliser la capacité réactive des enzymes, on enferme ceux-ci dans une matrice solide soit par lyophilisation soit par mélange à sec tel qu'utilisé pour la mise en tablettes de poudres sèches dans l'industrie pharmaceutique, dans l'industrie des produits diagnostiques et autres industries similaires, immobilisant ainsi 50 leur structure chimique. Contrairement à la sophistication que ces termes impliquent, ces façons de procéder ne sont ni pratiques ni désirables et en plus sont chères. Le fabricant est obligé d'enlever l'eau et de fournir un produit partiel, perdant ainsi une partie du cycle du contrôle de la qualité lors de la dilution et de 55 l'utilisation du produit final. Les laboratoires sont ni pratiques ni désirables et en plus sont chères. Le fabricant est obligé d'enlever l'eau et de fournir un produit partiel, perdant ainsi une partie du çycle du contrôle de la qualité lors de la dilution et de l'utilisation du produit final. Les laboratoires sont forcés de 60 payer le prix élevé de l'emballage, la perte de réactif, la lyophilisation et le mélange à sec, tandis que l'utilité du produit est en plus limité par les modes d'emballage et la taille de ces emballages. In the current commercial state of the art used to stabilize the reactive capacity of enzymes, these are enclosed in a solid matrix either by lyophilization or by dry mixing as used for the tableting of dry powders in the pharmaceutical industry, diagnostic industry and the like, thus immobilizing their chemical structure. Contrary to the sophistication that these terms imply, these procedures are neither practical nor desirable, and moreover are expensive. The manufacturer is obliged to remove the water and supply a partial product, thus losing part of the quality control cycle when diluting and using the final product. Laboratories are neither practical nor desirable and moreover are expensive. The manufacturer is obliged to remove the water and supply a partial product, thus losing part of the quality control cycle during dilution and use of the final product. Laboratories are forced to pay the high price for packaging, loss of reagent, freeze-drying and dry mixing, while the usefulness of the product is further limited by the packaging methods and size. packaging.

De plus, une bonne uniformisation du produit est difficile à 65 obtenir. Ceci ressort d'ailleurs du fait que la plupart des sérums de contrôle lyophilisés du commerce (sérums de référence) affichent la variation acceptable de flacon à flacon des constituants enzymatiques à ± 10% de la moyenne. In addition, good uniformity of the product is difficult to obtain. This is moreover apparent from the fact that most of the lyophilized control sera on the market (reference sera) display the acceptable variation from bottle to bottle of the enzymatic constituents to ± 10% of the average.

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Selon un mode d'exécution du procédé selon l'invention, on stabilise des enzymes labiles en les traitant avec un solvant organique concentré, tel que 30% de propanediol aqueux, en présence d'une petite quantité d'un polymère, telle que 0,1 % de gélatine, puis en diluant avec de l'eau jusqu'à 1 % de solvant tout en maintenant la concentration en polymère à au moins 0,01 %. La composition diluée peut être stockée pendant de longues périodes sans perte appréciable de l'activité catalytique enzymatique. On peut améliorer la stabilité en incluant de 1 à 8% ou plus de sels et de 0,1 % d'agents bactériostatiques dans la composition diluée. Ainsi l'enzyme stabilité liquide peut être conditionné avec un substrat et des sels tampons. According to one embodiment of the method according to the invention, labile enzymes are stabilized by treating them with a concentrated organic solvent, such as 30% aqueous propanediol, in the presence of a small amount of a polymer, such as 0 , 1% gelatin, then diluting with water to 1% solvent while maintaining the polymer concentration at least 0.01%. The diluted composition can be stored for long periods without appreciable loss of the enzymatic catalytic activity. Stability can be improved by including from 1 to 8% or more of salts and 0.1% of bacteriostatic agents in the diluted composition. Thus the liquid stability enzyme can be conditioned with a substrate and buffer salts.

Les enzymes labiles sont chimiquement modifiés de façon à leur conférer un état stable à long terme sans influencer la réactivité enzymatique. The labile enzymes are chemically modified so as to give them a stable long-term state without influencing the enzymatic reactivity.

Le procédé selon l'invention fournit des réactifs ou des compositions de réactifs dans lesquels le contrôle de la qualité est assuré tout au long de la fabrication, de l'emballage, du stockage et de l'utilisation. L'inconvénient de la grandeur fixe de l'emballage est ainsi éliminié comme d'ailleurs les frais élevés d'emballage, la lyophilisation et les pertes de réactif. Des systèmes liquides d'enzymes fournissent une flexibilité d'application et la séparation des ingrédients est facilement effectuée à peu de frais de fabrication réalisant la flexibilité de la mise en route de la réaction désirée lorsque toutes les autres réactions connexes se sont dissipées. The process according to the invention provides reagents or reagent compositions in which quality control is ensured throughout the manufacturing, packaging, storage and use. The disadvantage of the fixed size of the package is thus eliminated, as are the high packaging costs, freeze-drying and loss of reagent. Liquid enzyme systems provide flexibility in application and separation of ingredients is easily accomplished at low manufacturing cost achieving flexibility in starting the desired reaction when all other related reactions have dissipated.

Les enzymes stabilisés ainsi ont été évalués au cours d'études lors desquelles on compare des réactifs enzymatiques liquides avec des réactifs frais. Ces études montrent une corrélation de 1 à 1 entre des réactifs liquides et des réactifs frais avec une sensibilité et une précision comparables. La fourniture de réactifs enzymatiques sous forme liquide améliore l'application colorimétrique des méthodes couplées NAD/NADH2 actuelles, principalement du fait que la séparation des ingrédients est facilement accomplie. Des réactifs liquides sont spécialement avantageux lorsque la consommation du NADH2 est la base de la mesure et que le réactif coloré doit être séparé du NADH2 et de la réaction principale. Dans le mode ultraviolet, le système liquide d'enzymes assure une meilleures homogénéité et un meilleur amballage du réactif, ainsi qu'une meilleure flexibilité à l'usage, contrairement aux préparations lyophilisées ou les préparations en milieu sec. The enzymes thus stabilized have been evaluated in studies in which liquid enzyme reagents are compared with fresh reagents. These studies show a 1 to 1 correlation between liquid reagents and fresh reagents with comparable sensitivity and precision. The provision of enzyme reagents in liquid form improves the colorimetric application of the current NAD / NADH2 coupled methods, mainly because the separation of the ingredients is easily accomplished. Liquid reagents are especially advantageous when the consumption of NADH2 is the basis of the measurement and the colored reagent has to be separated from NADH2 and the main reaction. In the ultraviolet mode, the liquid enzyme system ensures better homogeneity and better packaging of the reagent, as well as better flexibility in use, unlike lyophilized preparations or preparations in a dry environment.

En enzymologie diagnostique, la stabilisation de réactifs enzymatiques sous la forme de liquides prêts à l'emploi est une conception nouvelle et intéressante pour satisfaire les besoins des laboratoires cliniques et les exigences de fiabilité des autorités de réglementation. La flexibilité des systèmes liquides d'enzymes implique leur application à l'instrumentation automatique tout en facilitant les tests manuels. In diagnostic enzymology, the stabilization of enzymatic reagents in the form of ready-to-use liquids is a new and interesting design to meet the needs of clinical laboratories and the reliability requirements of regulatory authorities. The flexibility of liquid enzyme systems implies their application to automatic instrumentation while facilitating manual testing.

La stabilisation des enzymes labiles est accomplie suivant un mode d'exécution du procédé selon l'invention en dissolvant des enzymes secs, lyophilisés, dans une base enzymatique aqueuse comprenant au moins 0,05 % d'un polymère et au moins 20% V/V d'un solvant organique. On maintient la solution en-dessous du point de dénaturation, convenablement en-dessous de 60 °C et dans la plupart des cas en-dessous de 40 °C, pendant au moins 30 minutes, d'habitude 2 à 3 jours. On dilue alors la solution avec de l'eau, pour produire une dilution de l'ordre d'au moins 20 fois, généralement à une dilution de 30 fois, tout en rajoutant davantage de polymère pour y maintenir un niveau de diltuion d'au moins 0,05 en poids %. La solution diluée convenablement à une concentration en enzymes de 100 à 10 000 U.I. par litre peut alors être emballée dans des récipients séparés et scellés et est stockée sous réfrigération à une température de 30 °C ou moins. Stabilization of labile enzymes is accomplished according to an embodiment of the process according to the invention by dissolving dry, lyophilized enzymes in an aqueous enzymatic base comprising at least 0.05% of a polymer and at least 20% V / V of an organic solvent. The solution is kept below the denaturation point, suitably below 60 ° C and in most cases below 40 ° C, for at least 30 minutes, usually 2 to 3 days. The solution is then diluted with water, to produce a dilution of the order of at least 20 times, generally at a dilution of 30 times, while adding more polymer to maintain a level of dilution of at least minus 0.05 wt%. The solution diluted appropriately to an enzyme concentration of 100 to 10,000 IU per liter can then be packaged in separate, sealed containers and is stored under refrigeration at a temperature of 30 ° C or less.

La solution diluée peut également renfermer un substrat tamponné, un agent bactériostatique et d'autres composés si cela était nécessaire. Si ces autres ingrédients sont rajoutés, la solution diluée est mélangée pour obtenir une solution de substrat homogénéisée avant d'être répartie en flacons individuels, scellée et stockée. The diluted solution may also contain a buffered substrate, a bacteriostatic agent and other compounds if necessary. If these other ingredients are added, the diluted solution is mixed to obtain a homogenized substrate solution before being divided into individual bottles, sealed and stored.

Les substrats sont des produits chimiques organiques de 5 structure connue dont les réactions ou les interactions sont catalysées par des enzymes, produisant un changement de la structure du composé, de sa composition atomique ou de sa rotation stéréochimique, par exemple l'acide lactique, le L-aspartate ou l'alphacétoglutarate, la L-alanine ou d'autres produits analo-10 gues. Substrates are organic chemicals of known structure whose reactions or interactions are catalyzed by enzymes, producing a change in the structure of the compound, its atomic composition or its stereochemical rotation, for example lactic acid, L-aspartate or alpha-ketoglutarate, L-alanine or other analogues.

En général, les substrats sont susceptibles d'être attaqués par dégradation microbienne car ils servent de nourriture pour des bactéries, des champignons ou autres micro-organismes. Autrement, ces composés restent stables en milieux aqueux à un 15 pH neutre ou proche de la neutralité, normalement de 4 à 10. Ainsi, si on ajoute le substrat à une composition enzymatique, le milieu de stabilisation devrait contenir également un tampon pour contrôler le pH de la réaction, par exemple un phosphate acide d'un métal alcalin et des agents bactéricides et/ou fongi-20 cides qui ne réagissent pas chimiquement avec le substrat ou qui n'inhibent pas la réaction enzymatique du substrat. Des exemples typiques sont l'azide de sodium, l'acide benzolique, le phénol, le thymol ou le pentachlorophénol, tous à 0,1 %. In general, substrates are susceptible to attack by microbial degradation because they serve as food for bacteria, fungi or other microorganisms. Otherwise, these compounds remain stable in aqueous media at a neutral or near neutral pH, normally 4 to 10. Thus, if the substrate is added to an enzyme composition, the stabilization medium should also contain a buffer to control the pH of the reaction, for example an acid phosphate of an alkali metal and bactericidal and / or fungal agents which do not chemically react with the substrate or which do not inhibit the enzymatic reaction of the substrate. Typical examples are sodium azide, benzolic acid, phenol, thymol or pentachlorophenol, all at 0.1%.

On pense que le solvant organique choisi stabilise l'enzyme 25 en milieu liquide en protégeant le site du groupement fonctionnel, c'est-à-dire la partie de la molécule où la réaction avec le substrat s'effectue effectivement ou est catalysée et en protégeant l'enzyme contre une contamination microbienne et la dégradation qui s'ensuivrait. Il se produit évidemment une cer-30 taine réaction physique ou chimique dans le milieu concentré en solvant puisque l'enzyme n'a aucune activité catalytique sur le substrat à cette concentration en solvant. Toutefois lors de la dilution, l'enzyme récupère sa plein activité et maintient cette réactivité pleinement à des hauts niveaux pendant de longues 35 périodes de stockage allant de quelques mois à plusieurs années. La structure chimique interne de la molécule d'enzyme n'a pas besoin d'être préservée. Aussi longtemps que le site réactif est préservé, l'activité catalytique de l'enzyme rest intact. It is believed that the organic solvent chosen stabilizes the enzyme in a liquid medium by protecting the site of the functional group, that is to say the part of the molecule where the reaction with the substrate actually takes place or is catalyzed and in protecting the enzyme against microbial contamination and subsequent degradation. Obviously, a certain physical or chemical reaction takes place in the solvent-concentrated medium since the enzyme has no catalytic activity on the substrate at this solvent concentration. However upon dilution, the enzyme recovers its full activity and maintains this reactivity fully at high levels for long periods of storage ranging from a few months to several years. The internal chemical structure of the enzyme molecule does not need to be preserved. As long as the reactive site is preserved, the catalytic activity of the enzyme remains intact.

La dégradation microbienne peut aussi être contrôlée en 40 utilisant une forte concentration en sels, par exemple d'au moins 1 % en poids, typiquement de 2 à 8 % en poids, ou même davantage. Les molécules de sels peuvent également protéger les sites actifs en formant des liaisons électrostatiques protégeant la configuration spatiale de l'enzyme et des sites actifs. 45 La description qui va suivre permettra de mieux faire ressortir et de rendre plus clair les divers aspects et avantages de l'invention. Microbial degradation can also be controlled by using a high concentration of salts, for example at least 1% by weight, typically 2 to 8% by weight, or even more. The salt molecules can also protect the active sites by forming electrostatic bonds protecting the spatial configuration of the enzyme and the active sites. The following description will make it possible to bring out more clearly and to make more clear the various aspects and advantages of the invention.

Les enzymes sont des molécules de protéines complexes à haut poids moléculaire, généralement de structure chimique in-50 connue. Ils sont, à présent, classifiés par leur activité catalytique et leur spécificité extrême envers un substrat. Les enzymes peuvent être redéfinis comme étant des catalyseurs biologiques, aptes à catalyser la réaction d'un seul substrat ou la réaction d'un groupe de substrats analogues. Enzymes are complex protein molecules of high molecular weight, generally of known in-50 chemical structure. They are now classified by their catalytic activity and their extreme specificity towards a substrate. Enzymes can be redefined as biological catalysts, capable of catalyzing the reaction of a single substrate or the reaction of a group of analogous substrates.

55 Des enzymes typiques sont la LDH (déhydrogénase lactique), la MDH (déhydrogénase malique), la CPK (créatine Phosphokinase) et analogues. L'enzyme est présent dans la composition stabilisée diluée, typiquement en une quantité de 100 à 10 000 U.I. par litre. 55 Typical enzymes are LDH (lactic dehydrogenase), MDH (malic dehydrogenase), CPK (creatine Phosphokinase) and the like. The enzyme is present in the diluted stabilized composition, typically in an amount of 100 to 10,000 IU per liter.

60 Des substrats typiques sont la L-alanine, le pyruvate, le L-aspartate, l'alphacétoglutarate et analogues. Les substrats sont sous forme de sels et font partie de la concentration en sels utile pour améliorer la stabilité de l'enzyme. La stabilité enzymatique augmente avec la concentration en substrat. Toutefois, 65 à des concentrations élévées en substrat, au-dessus d'environ 8%, l'activité enzymatique est inhibée. Il y a donc lieu d'optimaliser la concentration en substrat, généralement autour des 2 à 4%. Typical substrates are L-alanine, pyruvate, L-aspartate, alpha ketoglutarate and the like. The substrates are in the form of salts and are part of the salt concentration useful for improving the stability of the enzyme. The enzymatic stability increases with the concentration of substrate. However, 65 at high substrate concentrations, above about 8%, the enzyme activity is inhibited. It is therefore necessary to optimize the substrate concentration, generally around 2 to 4%.

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Le sel tampon fournit également une partie de la concentration en sels mentionnée ci-dessus. Le sel tampon est ajouté en une quantité suffisante pour maintenir le pH entre 4 et 10, typiquement entre 6 et 8. En général le tampon est un mélange de 0,1 à 1 % d'un hydroxyde de métal alcalin et de 0,5 à 3 % d'un phosphate ou d'un carbonate acide d'un métal alcalin. La quantité totale de la concentration en sel influence aussi la quantité de polymère nécessaire. Avec de plus fortes concentrations en sels, par exemple au-dessus de 4% en poids, il faut moins de polymère, ceci étant dû à la stabilisation électrostatique produite par le sel. Toutefois, avec de plus fortes concentrations en sel, le polymère peut obscurcir la solution ou même précipiter, nécessitant un chauffage de la solution pour assurer une redissolution. The buffer salt also provides part of the salt concentration mentioned above. The buffer salt is added in an amount sufficient to maintain the pH between 4 and 10, typically between 6 and 8. In general, the buffer is a mixture of 0.1 to 1% of an alkali metal hydroxide and 0.5 3% of an acidic phosphate or carbonate of an alkali metal. The total amount of the salt concentration also influences the amount of polymer required. With higher salt concentrations, for example above 4% by weight, less polymer is required, this being due to the electrostatic stabilization produced by the salt. However, with higher salt concentrations, the polymer can cloud the solution or even precipitate, requiring heating of the solution to ensure redissolution.

Le polymère qu'on ajoute dans la solution stabilisée diluée est de préférence prévu jusqu'à une quantité qui reste en suspension homogène sous réfrigération sans précipiter. Le polymère est présent en une quantité allant de 0,01 à 0,5 %, de préférence entre 0,05 et 0,25%. Les polymères solubles dans l'eau qui sont utiles en tant qu'agents de stabilisation sont ceux qui n'inhibent pas l'activité enzymatique et qui sont aptes à piéger l'enzyme dans la matrice de polymère. Ce polymère peut être une matière organique synthétique telle que la polyvinyl-pyrrolidone ou le dextranne d'origine biologique, par exemple la gélatine qui est du collagène dénaturé. The polymer which is added to the diluted stabilized solution is preferably provided up to an amount which remains in homogeneous suspension under refrigeration without precipitating. The polymer is present in an amount ranging from 0.01 to 0.5%, preferably between 0.05 and 0.25%. The water-soluble polymers which are useful as stabilizers are those which do not inhibit enzyme activity and which are capable of trapping the enzyme in the polymer matrix. This polymer can be a synthetic organic material such as polyvinyl-pyrrolidone or dextran of biological origin, for example gelatin which is denatured collagen.

Le solvant doit être miscible avec l'eau, d'un pH neutre ou alcalin, liquide à la température ambiante et au réfrigérateur et non réactif avec dégradation des sites réactifs de l'enzyme, sauf par formation de liaisons électrostatiques. Des solvant utiles sont en général des solvants polaires organiques tels que les éthers, les cétones, les sulfones, les sulfoxydes et les alcools, par exemple le méthanol, l'éthanol, le propanol, le butanol, l'acétone, le dioxane, le DMSO, la diméthylsulfone et le THF. Toutefois, pour l'opération de traitement on obtient une plus forte activité avec des concentrations plus faibles dans le cas de solvants liquides polyols comprenant de 2 à 4 groupes OH et contenant de 2 à 10 atomes de carbone tels que le glycérol, le propanediol, le butanediol, l'éthylène glycol et leurs analogues. The solvent must be miscible with water, of neutral or alkaline pH, liquid at room temperature and in the refrigerator and not reactive with degradation of the reactive sites of the enzyme, except by the formation of electrostatic bonds. Useful solvents are generally polar organic solvents such as ethers, ketones, sulfones, sulfoxides and alcohols, for example methanol, ethanol, propanol, butanol, acetone, dioxane, DMSO, dimethylsulfone and THF. However, for the treatment operation, a higher activity is obtained with lower concentrations in the case of liquid polyol solvents comprising from 2 to 4 OH groups and containing from 2 to 10 carbon atoms such as glycerol, propanediol, butanediol, ethylene glycol and their analogs.

Le solvant doit être présent en une quantité d'au moins 20% pendant l'opération de traitement, typiquement de 25 à 50%. Certains solvants nécessitent des concentrations aussi élevées que 70% afin de maintenir une activité stabilisée au-dessus de 60% de réactivité enzymatique. The solvent must be present in an amount of at least 20% during the treatment operation, typically from 25 to 50%. Certain solvents require concentrations as high as 70% in order to maintain a stabilized activity above 60% of enzymatic reactivity.

Des modes d'exécution seront maintenant donnés: Execution modes will now be given:

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Exemple 1 Example 1

Quantités 0,1%P/P 30% V/V 70% V/V Quantities 0.1% P / P 30% V / V 70% V / V

On dissout une suspension de sulfate d'ammonium (2,2M) et de l'enzyme LDH (déhydrogénase lactique) sec lyophilisé, en io une quantité équivalente à 22 500 U.I./litre, dans la base enzymatique et on maintient le tout entre 4 et 30 °C pendant 2 à 3 jours. A suspension of ammonium sulphate (2.2M) and of the dry lyophilized enzyme LDH (lactic dehydrogenase) is dissolved, in an amount equivalent to 22,500 IU / liter, in the enzymatic base and the whole is kept between 4 and 30 ° C for 2 to 3 days.

Réactif de substrat Substrate reagent

15 Matières Quantités 15 Materials Quantities

L-alanine 22 g/1 Acide alpha-cétoglutarique 1,6 L-alanine 22 g / 1 Alpha ketoglutaric acid 1.6

KH2P04 14 KH2P04 14

NaOH 5 NaOH 5

20 NaN2 1 20 NaN2 1

Gélatine 1 Gelatin 1

On dilue la base enzymatique trente fois par addition à la suspension du réactif de substrat et on mélange en rajoutant de la gélatine de manière à obtenir une suspension homogène. La 25 suspension est stockée sous réfrigération. On estime la vie en rayon sous réfrigération, à 3 ans avec une activité restante de 50 à 90% The enzymatic base is diluted thirty times by addition to the suspension of the substrate reagent and mixed by adding gelatin so as to obtain a homogeneous suspension. The suspension is stored under refrigeration. Estimated shelf life under refrigeration, 3 years with 50 to 90% remaining activity

Dans le domaine des diagnostics cliniques, l'application commerciale de ces compositions d'enzymes stabilisés est repré-30 sentée par (sans y être limitée) les réactifs diagnostiques utilisés pour déterminer et quantifier les constituants suivants qu'on trouve dans des fluides biologiques (sans toutefois être limitée à ces réactifs): In the field of clinical diagnostics, the commercial application of these stabilized enzyme compositions is represented by (but not limited to) the diagnostic reagents used to determine and quantify the following constituents found in biological fluids ( without however being limited to these reagents):

1. Transaminase glutamique-oxalacétique (SGOT) 35 2. Transaminase glutamique-pyruvique (SGPT) 1. Glutamic-oxalacetic transaminase (SGOT) 35 2. Glutamic-pyruvic transaminase (SGPT)

3. Déhydrogénase lactique (LDH) 3. Lactic dehydrogenase (LDH)

4. Créatine phosphokinase (CPK) 4. Creatine phosphokinase (CPK)

5. Déhydrogénase a-hydroxybutyrique (a-HBD) 5. a-hydroxybutyric dehydrogenase (a-HBD)

6. Glucose (par hexokinase-G-6-PDH) 6. Glucose (by hexokinase-G-6-PDH)

40 Ces réactifs réagissent de manière analogue, contiennent des ingrédients labiles communs, et certaines des réactions qui se produisent sont communes. Le schéma de réaction chimique suivant est présenté comme un modèle pour illustrer la nature générale des réactions impliquées. These reagents react analogously, contain common labile ingredients, and some of the reactions that occur are common. The following chemical reaction scheme is presented as a model to illustrate the general nature of the reactions involved.

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Base enzymatique Enzymatic base

Matières Gélatine 51,2-propanediol Eau Material Gelatin 51,2-propanediol Water

(1) Substrat(s) —Enzyme 1 ^ pro(juit(s) (1) Substrate (s) —Enzyme 1 ^ pro (juit (s)

^ pH ^ pH

(2) Produit/substrat + NAD-NADH2 Enzyme 2 ^ NADH2-NAD + produit (2) Product / substrate + NAD-NADH2 Enzyme 2 ^ NADH2-NAD + product

PH PH

(3) NADH2 + Chromogène Catalyseur ^ Chromogène + NAD (3) NADH2 + Chromogenic Catalyst ^ Chromogenic + NAD

Toutes les réactions enzymatiques indiquées ci-dessus suivront ce schéma général, dans lequel la réaction (2) est généralement nommée la réaction de couplage, les réactions (2) et (3) sont les réactions de mesure et la réaction (1) peut être caractérisée comme étant la réaction primaire. Il doit être entendu, All the enzymatic reactions indicated above will follow this general scheme, in which reaction (2) is generally called the coupling reaction, reactions (2) and (3) are the measurement reactions and reaction (1) can be characterized as the primary reaction. It must be heard,

toutefois, que ces trois réactions ne seront pas toutes nécessaires 65 lors d'une mesure ; en fait, elle peuvent être limitées à deux ou à une seule. Dans le cas de la mesure en ultraviolet de l'activité de la déhydrogénase lactique (LDH), seule la réaction (2) est concernée, comme suit: however, that these three reactions will not all be necessary 65 during a measurement; in fact, they can be limited to two or just one. In the case of the ultraviolet measurement of the activity of lactic dehydrogenase (LDH), only the reaction (2) is concerned, as follows:

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Schéma de réaction 2. - LDH LDH Reaction scheme 2. - LDH LDH

Pyruvate + NADH2 ^ ^ NAD + Lactate Pyruvate + NADH2 ^ ^ NAD + Lactate

A l'inverse, le nombre de réactions requises peut être supérieur aux trois réactions indiquées, comme dans le cas de la mesure de la phosphokinase creatine (CPK): Conversely, the number of reactions required can be greater than the three reactions indicated, as in the case of the measurement of phosphokinase creatine (CPK):

Schéma de réaction 3. - CPK CPK^ Reaction scheme 3. - CPK CPK ^

(1) CP + ADP ATP+ Créatine (1) CP + ADP ATP + Creatine

HK HK

(2) ATP + Glucose ^1 Glucose-6-phosphate + ADP (2) ATP + Glucose ^ 1 Glucose-6-phosphate + ADP

G-6-PDH„ G-6-PDH „

(3) Glucose-6-phosphate + NAD ^ NADH2 (3) Glucose-6-phosphate + NAD ^ NADH2

PMS^ PMS ^

(4) NADH2 + INT^ INT + NAD (4) NADH2 + INT ^ INT + NAD

(ox.) (réd.) (ox.) (red.)

= Phosphate de créatine = Adénosine-5'-diphosphate = Adénosine-triphosphate = Hexokinase = Creatine phosphate = Adenosine-5'-diphosphate = Adenosine triphosphate = Hexokinase

= Dinucléotide nicotamide-adénine = Dinucléotide-nicotamide-adénine réduit = Déhydrogénase glucose-6-phosphate = Sel de tétrazolium = Méthosulfate de phénazine = Nicotamide-adenine dinucleotide = Reduced nicotamide-adenine dinucleotide = Glucose-6-phosphate dehydrogenase = Tetrazolium salt = Phenazine methosulfate

Dans ce cas, les réactions (2) et (3) peuvent être considérées comme les réactions de couplage, les réactions (3) ou (4) comme étant les réactions de mesure, et la réaction (1) sera la réaction 15 primaire. In this case, reactions (2) and (3) can be considered as the coupling reactions, reactions (3) or (4) as the measurement reactions, and reaction (1) will be the primary reaction.

Si l'on se réfère au Schéma de réaction 1. - Modèle général, il est clair et bien connu que l'utilisation de la séquence de réactions permet l'analyse quantitative soit de la réaction substrat/produits, soit des enzymes catalyseurs. If one refers to reaction scheme 1. - General model, it is clear and well known that the use of the reaction sequence allows quantitative analysis either of the substrate / product reaction, or of catalyst enzymes.

20 L'analyse quantitative de ces constituants dans les fluides biologiques est un outil diagnostique bien accepté et largement utilisé pour le diagnostic et le traitement des états pathologiques chez les humains et les animaux. The quantitative analysis of these constituents in biological fluids is a well accepted and widely used diagnostic tool for the diagnosis and treatment of disease states in humans and animals.

Symboles CP ADP ATP sHK NAD NADH2 G-6-PDH INT io PMS Symbols CP ADP ATP sHK NAD NADH2 G-6-PDH INT io PMS

C VS

Claims

630,662

1. Stable liquid composition containing a stabilized molecular enzyme, characterized in that it comprises an aqueous vehicle containing at least 100 IU per liter of stabilized enzyme, which would otherwise be labile and unstable in aqueous media, up to 5% a non-reactive organic solvent, miscible with water, which is liquid at least at room temperature, and at least 0.01% of a water-soluble polymer.

2. Composition according to claim 1, characterized in that it comprises, in addition, when it is capable of being in the presence of a bacterial degrading agent, at least 0.01% of bactericidal agent in order to preserve the stability of the composition.

2

3. Composition according to claim 1 or 2, characterized in that the solvent is chosen from ketones, ethers, sulfones, sulfoxides and alcohols.

4. Composition according to claim 3, characterized in that the solvent is 1,2-propanediol.

5 that, L-aspartate, alpha-ketoglutarate, L-alanine and pyruvate, in an amount between 2 and 4%.

19. Method according to any one of claims 12 to 18, characterized in that the enzyme is malic dehydrogenase or lactic dehydrogenase.

20. Use of the stable liquid composition according to claim 1, for medical determinations of human and animal functions.

21. Use according to claim 20 of the composition according to any one of claims 2 to 10.

5. Composition according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the solvent is present in an amount between 0.05 and 5%.

6. Composition according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the polymer is present in an amount between 0.05 and 0.5%.

7. Composition according to claim 6, characterized in that the polymer is gelatin.

8. Composition according to claim 6, characterized in that the pH is from 4 to 10.

9. Composition according to any one of claims 1 to 8, characterized in that it comprises from 1 to 8% of salts, including a substrate, and from 0.01 to 0.3% of a bactericidal agent.

10. Composition according to claim 9, characterized in that the salts comprise a substrate chosen from lactic acid, L-aspartate, alpha-ketoglutarate, L-alanine and pyru-vate, in an amount between 2 and 4%.

11. Composition according to any one of claims 1 to 10, characterized in that the enzyme is malic dehydrogenase or lactic dehydrogenase.

12. A method of preparing a stable liquid composition containing a molecularly stabilized enzyme, according to claim 1, characterized in that a solution of the enzyme molecule is formed in an aqueous medium containing at least 20% of a non-reactivated organic solvent, miscible with water, which is liquid at least at room temperature, and at least 0.05% by weight of a water-soluble polymer, the enzyme is kept in the solution for sufficient time to stabilize its reactive sites, and the solution is then diluted with an aqueous medium so as to have an enzyme content of at least 100 IU per liter and a solvent content of up to 5%, while maintaining the water-soluble polymer content at least 0.01%.

13. A method of preparation according to claim 12 of a stable composition according to claim 2, characterized in that gold, dilutes the solution with an aqueous medium containing a bactericidal agent.

14. Method according to claim 12 or 13, characterized in that the solvent is chosen from ketones, ethers, sulfones, sulfoxides and alcohols.

15. The method of claim 14, characterized in that the solvent is 1,2-propanediol, which is present in an amount between 20 and 40% before dilution.

16. Method according to any one of claims 12 to

15, characterized in that the polymer is gelatin, which is present in an amount between 0.05 and 0.5% before dilution.

17. Method according to any one of claims 12 to

16, characterized in that the solution is diluted with an aqueous medium containing from 1 to 8% of salts, including a substrate, and from 0.01 to 0.3% of a bactericidal agent.

18. The method of claim 17, characterized in that the aqueous medium comprises a substrate chosen from lactic acid.

22. Use according to claim 20 of the composition according to claim 11 for the determination of glutamic-oxal-acetic (SGOT) and glutamic-pyruvic-only transamiases (SGPT).