Verfahren zur Herstellung des Tetrahydrates der Cocarboxylase
1937 isolierten K. Lohmann und Ph. Schuster das Coenzym der Carboxylase aus Hefe in Form des Aneurin-pyrophosphorsäureester-chlorids. Nach Karrer [vgl. Lehrbuch der organischen Chemie von P. Karrer, Georg Thieme Verlag, Stuttgart (1948), S. 770] versteht man unter Cocarboxylase das innere Salz des Aneurin-pyrophosphorsäureesters (I)
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Inzwischen hat es sich jedoch eingebürgert, mit Cocarboxylase das Aneurin-pyrophosphorsäureester- chlorid (II)
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zu bezeichnen, obwohl diese Verbindung besser mit Cocarboxylase-hydrochlorid bezeichnet werden sollte.
Im folgenden wird mit Cocarboxylase deshalb richtigerweise das innere Salz des Aneurin-pyrophosphorsäureesters (I) bezeichnet.
Für die Herstellung des Cocarboxylase-hydrochlorids sind eine ganze Reihe Verfahren bekannt.
Stern und Hofer [vgl. Science, Bd. 85, S. 483 (1937)] synthetisierten die Verbindung durch Umsatz von Aneurin mit POC13. J. Weijhard und H. Tauber [vgl.
Journal of the American Chemical Society, Bd. 60, S. 2263 (1938)] setzten Aneurin mit einem Gemisch von Natriumpyrophosphat und Orthophosphorsäure um, während H. Weil-Malherbe [vgl. Biochemical Journal, Bd. 34, S. 980 (1940)] das 5-Bromäthyl-thiazol > Analo- gon des Aneurins mit Silberphosphat behandelten. In beiden Fällen wurde Cocarboxylase als Silbersalz isoliert. Weijhard und Tauber zersetzten dieses mit HsS und isolierten Cocarboxylase-hdyrochlorid durch Behandlung mit Salzsäure. Weil-Malherbe führte die Reinigung mit Phosphorwolframsäure durch. 1946 verbesserten Karrer und Viscontini [vgl. Helvetica Chimica Acta, Bd. 29, S. 715 (1946)] das Verfahren von Weijhard und Tauber.
Neben den bisher genannten Publikationen existieren noch eine ganze Reihe von deutschen (Nrn. 663 588, 704 172, 706 835, 708 514 und 729 905) und auslän- dischen Patenten (vgl. amerikanische Patente Nummern 2 188 323, 2 224 174, 2 415 544, 2 435 750, englische Patente Nrn. 687 674, 687 673, französisches Patent Nr. 930643), die sich alle mit der Herstellung oder Reinigung von Cocarboxylase-hydrochlorid befassen und im wesentlichen Verfahren betreffen, welche eine direkte Phosphorylierung des Aneurins gestatten. Alle bisher bekannten Verfahren, auch die Phosphorylierung mit Palyphosphorsäure, haben jedoch den Nachteil, dal3, die erzielten Ausbeuten gering sind.
Darüber hinaus lassen sich die Verfahren in vielen Fällen nicht einwandfrei reproduzieren.
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zu Grunde, ein einfaches, wirtschaftliches, technisch durchführbares und gute Ausbeuten lieferndes Verfahren zur Herstellung von Cocarboxylasesalzen zu finden.
Man hat erkannt, dass die Hauptschwierigkeit bei der Isolierung der Cocarboxylase bzw. ihrer Salze aus dem bei der Phosphorylierung von Aneurin entstehenden Gemisch in der Abtrennung stets vorhandenen Aneurinorthophosphorsäureesters liegt, und dass es dabei wesentlich ist, die Gefahr einer Hydrolyse der Cocarboxylase zu Aneurinorthophosphorsäureester durch entsprechend gewählte Bedingungen möglichst zu vermeiden. Es hat sich femer als zweckmässig erwiesen, die bei der Phosphorylierung angewendete oder gebildete überschüssige Orthophosphorsäure möglichst schon vor der eigentlichen Auftrennung des Aneurinphosphorsäure- ester-Gemisches abzutrennen.
Zur Abtrennung der Hauptmenge an Orthophosphorsäure hat man das Phosphorylierungsgemisch entweder aus wässriger Lösung mit Hilfe geeigneter organischer Lösungsmittel wieder ausgefällt und diesen Prozess einige Male wiederholt und/oder man hat das Gemisch über einen schwach basischen Anionenaustauscher z. B. vom Typ Amberlitep IRA 410, Amberlite IR 45 oder Merck Ii , quaternäre Ammoniumbasen auf Polystyrolgrundlage mit abgeschwächter Basizität bzw. sekundäre Amine auf Polystyrolbasis, laufen gelassen.
Bis auf geringe Spuren blieb bei diesem Prozess die Orthophosphorsäure im schwach basischen Anionenaustauscher hängen, und beim Eluieren mit Wasser konnte dann eine Trennung des ablaufenden Phosphorsäureestergemisches erreicht werden,. Im Bereich von pH 6, 5 bis 5, 5 lief eine wässrige Lösung des Aneurinorthophosphorsäureesters ab. Von pH 5, 5-1 enthielt das Eluat in der Hauptsache die Cocarboxylase, die mit zunehmendem saurem pH stärker mit Phosphorsäure vermischt ist.
Eine bessere Trennung hat man erreicht, wenn man die aus dem schwach basischen Anionenaustauscher ablaufende Lösung über einen stark basischen Anionenaustauscher z. B. des Typs Permutait ES oder Am- berlite IRA 400, quaternäre Ammoniumbasen auf Polystyrolgrundlage leitete. Durch Aufteilung des Eluats in die oben angegebenen, pH-Fraktionen erreichte man eine bessere Trennung als bei Anwendung eines schwach basischen Austauschers. Noch einfacher konnte man den Trennungsprozess gestalten, wenn man die aus einem schwach basischen Anionenaustauscher ablaufende Lösung über einen Kationenaustauscher, wie z.
B. Amberlites. IRC 50, IR 100, IR 105 oder IR 120, schwachsaure Polyacrylsäureharze bzw. ein sulfoniertes Polystyrolharz, laufen liess, da solche Kationenaustauscher den Thiaminorthophosphorsäureester festhalten und die freie Cocarboxylase durchlassen.
Die vorliegende Erfindung betrifft nun ein Verfahren zur Herstellung des Tetrahydrates der Cocarboxylase, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man das bei der Phosphorylierung von Aneurin anfallende Gemisch aus Orthophosphorsäure, Aneurin- (orthophos- phorsäure)-ester, Cocarboxylase und Estern des Aneurins mit höheren Phosphorsäuren in Wasser löst, aus dieser Lösung mit Hilfe eines oder mehrerer Ionenaustauscher eine wässrige Lösung des Tetrahydrats der Cocarboxylase gewinnt und diese daraus durch Ent fernung des als Lösungsmittel dienenden Wassers oder durch Zusatz eines niederen Alkohols oder von Aceton in kristalliner Form isoliert.
Es hat sich gezeigt, dass man sowohl aus dem Eluat eines Kationenaustauschers bzw. aus den Eluat Fraktionen vom pH 5, 5-1 von Anionenaustauschern durch Eindampfen der wässrigen Lösung das kristalline Cocarboxylase-tetrahydrat gewinnen kann. Diese bisher nicht beschriebene Substanz besitzt einen Zersetzungspunkt von 220-225 (bei etwa 140 Aufblähen unter Wasserabgabe) und lässt sich aus wässriger Lösung nach Zusatz von niederen Alkoholen oder Aceton oder sonstigen geeigneten organischen Lösungsmitteln um- kristallisieren. Der pH-Wert einer 5 % igen wässrigen Lösung von Cocarboxylase-tetrahydrat liegt bei 20 bei 3, 0 (gemessen an einer Gaselektrode).
Da das Co carboxylase-tetrahydrat in wässriger Lösung nur schwach sauer reagiert, tritt eine Spaltung zu Aneurinorthophosphorsäureester praktisch nicht ein. Man kann deshalb Cocarboxylase-tetrahydrat beliebig oft aus wässriger Lösung umkristallisieren und die Substanz in höchster Reinheit gewinnen, ohne dass wesentliche Verluste durch Hydrolyse eintreten. Im Warburg-Test zeigt das Cocarboxylase-tetrahydrat die volle Cocarboxylasewirksamkeit, so dass, besonders auch im Hinblick auf seinen günstigen pH-Wert, es für eine di rekte therapeutische Anwendung sehr geeignet ist.
Darüber hinaus besitzt Cocarboxylase-tetrahydrat, weil es kaum zur Hydrolyse neigt, eine wesentlich bessere Haltbarkeit als Cocarboxylase-hydrochlorid, welches das heutige Handelsprodukt für Cocarboxylase darstellt.
Aus dem erfindungsgemäss erhaltenen Cocarboxylasetetrahydrat lassen sich auf einfache Weise durch Umsatz mit wässrigen, alkoholischen, acetonischen oder andern Lösungen von Säuren in organischen Lösungsmitteln die entsprechenden Salze der Cocarboxylase in guten Ausbeuten herstellen. Die Salzbildung gelingt mit anorganischen und organischen Säuren.
Die Ausbeuten an Cocarboxylasesalzen, die durch Umsatz von kristallinem Cocarboxylase-tetrahydrat mit Säuren erhalten werden, sind wesentlich besser als die bei der Herstellung der Salze durch Umsatz von Säuren : mit wässriger Cocarboxylaselösung erzielten. Die aus dem Tetrahydrat der Cocarboxylase hergestellten Salze der Cocarboxylase sind analysenrein und brauchen nicht mehr umkristallisiert zu werden. Zweckmässigerweise arbeitet man so, dass man die Lösung einer Säure in einem organischen Lösungsmittel gegebenenfaIls bei Gegenwart von Wasser vorlegt und das Cocarboxylasetetrahydrat in kristalliner Form zugibt, hierauf abwartet, bis sich das gebildete Salz der Cocarboxylase ausgeschieden hat (was in der Regel nach wenigen Minuten der Fall ist) und anschliessend unter Anwendung der üblichen Methoden, z.
B. durch Absaugen oder Abfiltrieren, die gebildeten Cocarboxylasesalze abtrennt.
Auf diesem Weg wurden z. B. die folgenden Salze der Cocarboxylase hergestellt, von denen bisher nur das-Cocarboxylase-hydrochlorid bekannt war.
Cocarboxylase-hydrochlorid :
Zersetzungspunkt 240 Cocarboxylase-hydrobromid :
Zersetzungspunkt 246-248'
Cocarboxylase-hydrojodid :
Zersetzungspunkt 205-207
Cocarboxylase-nitrat : Zersetzungspunkt 208-210 Cocarboxylase-sulfat : Zersetzungspunkt 120 Cocarboxylase-sulfanilat : Zersetzungspunkt 228-230 Cocarboxylase-naphthalin-ss-sulfonat :
Zersetzungspunkt 198-200
Aus den Salzen der Cocarboxylase kann man das Cocarboxylase-tetrahydrat wieder zurückgewinnen, indem man die Salze der Cocarboxylase über einen geeigneten Ionenaustauscher, wie z. B. Amberlite) IR 45, IRA 400, IRA 401 oder IRA 410 laufen lässt.
Auf diese Weise kann das Cocarboxylase-tetrahydrat auch aus dem reinen Cocarboxylase-hydrochlorid hergestellt werden.
Nach Teruo Tanaka [vgl. Journal of the Pharma ceutical Society Japan, Bd. 76, S. 1314-1318 (1956), referiert in Chemical Abstracts, Bd. 51, S. 3607 (1957)] gelangt man zum Cocarboxylase-hydrochlorid, indem man das bei der Phosphorylierung von Vitamin-Bl mit Polyphosphorsäure erhaltene Gemisch nach mehr maligem Umfällen aus Wasser mit Athanol wieder in Wasser löst, mit NH40H auf pH 7 einstellt und über eine mit dem Dowex-1 X 8 -Austauscher gefüllte Säule laufen lässt.
Hierauf wird Aneurinorthophosphorsäureester, der als Nebenprodukt im Gemisch vorliegt, mit Wasser eluiert und anschliessend durch Eluieren mit 0, 005molarer wässriger HCl eine wässrige Lösung von Cocarboxylase-hydrochlorid erhalten, die einge- engt und durch Versetzen mit Athanol auf kristallisiertes Cocarboxylase-hydrochlorid aufgearbeitet wird. Diese Methode liefert, abgesehen von der schlechten Ausbeute, nur ein Cocarboxylase-hydrochlorid vom Zersetzungspunkt 215-216 . Dieses Cocarboxylase-hydrochlorid muss demnach noch einen erheblichen Prozent- satz an Verunreinigungen, wie z. B. Orthophosphorsäureester, enthalten.
Demgegenüber wird nach dem vor- liegenden Verfahren Cocarboxylase-hydrochlorid in wesentlich besserer Ausbeute und in höchster Reinheit erhalten (der Zersetzungspunkt des nach dem vorliegenden Verfahren gewonnenen Cocarboxylase-hydrochlorids liegt bei 240 ). Durch Umkristallisation aus wässrig-alkoholischer Lösung lässt sich Cocarboxylasehydrochlorid zwar etwas aufreinigen, aber man muss dabei grosse Ausbeuteverluste in Kauf nehmen, weil das Cocarboxylase-hydrochlorid durch Hydrolyse zu einem erheblichen Prozentsatz in das Orthophosphat bzw. Chlorid des Aneurinorthophosphorsäureesters übergeht.
Ahnliche Nachteile weisen die in den belgischen Patenten Nrn. 548 447 und 550 722 beschriebenen Verfahren zur Herstellung bzw. Reinigung von Cocarboxylase-hydrochlorid auf. Nach dem Verfahren des belgischen Patentes Nr. 548 477 wird das bei der Phosphorylierung von Vitamin Bi erhaltene Phosphorylierungsgemisch mit Hilfe eines Anionenaustauschers aufgetrennt und die Cocarboxylase enthaltende Eluatfraktion anschliessend mit Säuren zu den entsprechenden Salzen (angegeben ist lediglich Cocarboxylasehydrochlorid) umgesetzt. Verständlicherweise ist die dabei erzielte Ausbeute ausserordentlich gering, weil es sich nicht vermeiden lässt, dass sich Cocarboxylasehydrochlorid in wässrigem Medium stark hydrolytisch zersetzt. Es bildet sich z.
B. das Orthophosphat oder das Chlorid des Aneurin-orthophosphorsäureesters.
Dieses Verfahren ist deswegen wirtschaftlich uninteressant. Auch das im belgischen Patent Nr. 550 772 beschrieben, Reinigungsverfahren vermeidet diese Ka lamität nicht. Nach dem dort beschriebenen Verfahren wird Cocarboxylase-hydrochlorid ebenfalls durch Fäl- lung mit wäBriger Salzsäure aus wässriger Cocarboxylaselösung erhalten. Die hierbei auftretenden Nachteile sind dieselben wie oben beschrieben.
Demgegenüber bedeutet das erfindungsgemässe Verfahren einen wesentlichen technischen Fortschritt, weit es den Reinigungsprozess vom jeweiligen Salz der Cocarboxylase auf das Cocarboxylase-tetrahydrat verlegt und dadurch Umkristallisationen der aus dem Cocarboxylase-tetrahydrat hergestellten Salze überflüssig werden. Darüber hinaus ist das neue Cocarboxylasetetrahydrat selbst eine therapeutisch wichtige Anwendungsform der Cocarboxylase und bildet gleichzeitig die Schlüsselsubstanz für viele daraus herstellbare physiolo gisch interessante Salze der Cocarboxylase.
Beispiel 1
2 kg Vitamin B1 werden auf die übliche Weise phosphoryliert, die Phosphorylierungsschmelze in 6-8 Liter Wasser (+ Eis) unter starkem Rühren bei einer Temperatur unterhalb 10 gelöst, die wässrige Lösung in 100 Liter 96 % igen Alkohol eingerührt und über Nacht zum Absitzen stehengelassen. Das überstehende Lösungsmittel wird von einem ausgeschiedenen Sirup abdekantiert, letzterer in 4 Liter Wasser aufgenommen.
Die so erhaltene Lösung wird je nach der Menge der darin enthaltenen Phosphorsäure über 20-30 Liter eines schwach basischen Anionenaustauschers (beispielsweise ein sekundäres Amin auf Polyesterbasis, wie z. B. Amberlite IRA 45 , laufen gelassen. Anschliessend wird so lange mit Wasser nachgewaschen, bis das ablaufende Eluat keine Reaktion mehr auf Thiamin zeigt. Es fallen etwa 25 Liter einer Lösung an, die bei 30 und 12 Torr auf 6 Liter konzentriert werden. Der eingeengte Rückstand wird zur Trennung des Thiamin-orthophosphorsäureesters von dem Thiamin-pyrophosphorsäureester auf 20-30 Liter Kationenaustauscher ( Amberlite IRC 50 ) gegeben und mit Wasser nachgespült, bis das Eluat thiaminfrei ist.
Erhalten werden 70-80 Liter einer Lösung, die im Umlaufverdampfer bei 30 und 12 Torr auf 1, 5 Liter eingeengt wird. Zu dem Konzentrat werden langsam unter Rühren 7, 5 Liter 96 % iger Alkohol zugegeben.
Das Cocarboxylase-tetrahydrat scheidet sich in Form feiner Stäbchen aus. Die Ausbeute beträgt 530 g mit einem Schmelzpunkt von 220-225 unter Zersetzung (Sintern unter Wasserabgabe bei 140 ). Der Thiaminorthophosphorsäureester, der im Kationenaustauscher haftet, wird durch Auswaschen mit 10% iger Salzsäure abgelöst, die wässrige salzsaure Lösung (etwa 50 bis 60 Liter) auf 3 Liter bei 40-45 und 12 Torr eingedampft und der Rückstand mit der Sfachen Menge Alkohol gefällt. Es scheiden sich 1, 3 kg Thiaminorthophosphorsäureesterchlorid-hydrochlorid ab. Aus 2 kg Vitamin Bi entstehen demnach :
530 g Cocarboxylase-tetrahydrat und
1, 3 kg Thiamin-orthophosphorsäureesterchlorid- hydrochlorid.
Beispiel 2
2 kg Vitamin B1 werden wie im Beispiel 1 phosphoryliert, gelöst und das erhaltene Phosphorsäureester- gemisch durch Fällen mit Alkohol von der Hauptmenge Phosphorsäure befreit. Der Sirup wird in 5 Liter Wasser aufgenommen, die gesamte Menge Lösung auf einmal über 25 Liter eines stark basischen Austauschers (Permutit ES) gegeben, und mit Wasser nachgewaschen.
Es werden drei Fraktionen abgetrennt. Von pH 6, 6-6, 0 läuft im Eluat Thiamin-orthophosphorsäureester ab. Als zweite Fraktion folgt von pH 6, 6-5, 4 Cocarboxylasetetrahydrat, verunreinigt mit etwa 25-30% Thiamin orthophosphorsäureester. Zum Schluss wird eine Fraktion von pH 5, 4-2 erhalten, die praktisch reines Cocarboxylase-tetrahydrat enthält. Die erste Fraktion wird bei 12 Torr und 35 eingedampft und der Thiamin-orthophosphorsÏureester durch Fällung des Konzentrates mit Alkohol zur Kristallisation gebracht.
Aus der zweiten Fraktion werden auf die gleiche Weise 746 g eines Estergemisches auskristallisiert, das durch Lösen in 1, 5 Liter Wasser und unter Zusatz von 3, 5 Liter Alkohol umkristallisiert wird. An reinem Cocarboxylase-tetrahydrat werden 412 g erhalten. In der Mutterlauge ist der Thiamin-orthophosphorsäureester enthalten, der auf bekannte Weise isoliert wird. Durch Einengen der dritten Fraktion und Fällen mit Alkohol werden nochmals 81 g Cocarboxylase-tetrahydrat ge wonnen. Insgesamt ergibt dieser Ansatz :
493 g Cocarboxylase-tetrahydrat und
1, 0 kg Thiamin-orthophosphorsäureester.
Beispiel 3
Ein Gemisch von 20 g Thiamin-orthophosphorsäure- esterphosphat, 20 g Cocarboxylase-tetrahydrat und 20 g Orthophosphorsäure werden in 100 cm3 Wasser gelöst, über 300 cm3 eines schwach basischen Austauschers Merck II geschickt und mit Wasser nachgewaschen.
In der Hauptfraktion von pH 6, 7 bis 6, 3 fällt eine Lö sung an, die ein Gemisch des Thiamin-ortho-und -pyrophosphorsäureesters enthält (30 g), das nach Beispiel 2 aufgearbeitet wird. Im pH-Bereich von 6, 3 bis 4, 9 läuft ein Eluat ab, das reines Cocarboxylase-tetra- hydrat enthält und wie im Beispiel 2 isoliert wird (3 g).
Beispiel 4
Ein Gemisch nach Beispiel 3 wird mit Hilfe eines schwach basischen Ionenaustauschers ( Amberlite IRA 410 oder Merck II ) von der Phosphorsäure befreit, mit Wasser nachgewaschen und das Eluat, das sowohl den Thiamin-orthophosphorsäureester als auch Cocarboxylase enthält, eingedampft. Das Konzentrat von etwa 200 cm3 läuft anschliessend über 250 cm3 eines stark basischen Austauschers ( Permutit ES), in dem die Trennung nach Beispiel 2 vorgenommen wird.
Beispiel 5 a) 10 g gemäss Beispiel 1 erhaltenen Cocarboxylasetetrahydrat werden in 25 cm3 5 % iger wϯriger Salzsäure gelöst und unter R hren 75 cm3 Aceton einge- tropft. Das abgeschiedene Hydrochlorid der Cocarboxylase wird abgesaugt. Die Ausbeute beträgt 9, 5 g. Die Substanz schmilzt bei 240 unter Zersetzung.
Anstelle von wässriger Salzsäure kann vorteilhafte auch methanolische Salzsäure verwendet werden. Dabei geht das Tetrahydrat zunächst in Lösung und scheidet sich nach einigen Minuten als Chlorid in der gleichen Ausbeute und derselben Qualität wie aus der wässrigen Lösung aus. b) 10 g Cocarboxylase-tetrahydrat werden in einer Mischung von 7 cm3 48% iger Bromwasserstoffsiiure und 18 cm3 Wasser gelöst und wie im Beispiel 6 mit Aceton gefällt. Es werden 9, 8 g Cocarboxylase-hydrobromid vom Schmelzpunkt 246-248 (unter Zersetzung) erhalten. c) 10 g Cocarboxylase-tetrahydrat werden in 10 cm3 57% iger Jodwasserstoffsäure und 15 cm3 Wasser gelöst und wie im Beispiel 5 a) gefällt.
Es werden 10, 5 g Cocarboxylase-hydrojodid vom Schmelzpunkt 205 bis 207 (unter Zersetzung) erhalten. Diese Substanz enthält 1 Mol Kristallwasser. d) 10 g Cocarboxylase-tetrahydrat werden in 10 cm3 25 iger Salpetersäure und 15 cm3 Wasser gelöst. Die Aufarbeitung erfolgt nach Beispiel 5. Als Ausbeute werden 9, 5 g Cocarboxylasenitrat vom Schmelzpunkt 208-210 (unter Zersetzung) erhalten. Das Nitrat enthält 1 Mol Kristallwasser. e) 10 g Cocarboxylase-tetrahydrat löst man in 30 cm3 10 % iger Schwefelsäure und versetzt die Lösung wie im Beispiel 5 a) mit Aceton. Isoliert werden 10, 0 g Cocarboxylasesulfat vom Schmelzpunkt 120 (unter Zersetzung).
Das Sulfat enthält 1 Mol Kristallwasser. f) 5 g Cocarboxylase-tetrahydrat werden in einer Lösung von 2, 2 g Sulfanilsäure in 80 cm3 60-70 hei¯em Wasser gelöst, auf Zimmertemperatur abgekühlt und wie im Beispiel 5 a) mit Aceton gefällt. Die Ausbeute beträgt 6 g Cocarboxylase-sulfanilat vom Schmelzpunkt 228-230 (unter Zersetzung). g) 5 g Cocarboxylase-tetrahydrat werden in einer Lösung von 2, 5 g/NaphthaIinsulfonsäure in 300 cm3 Wasser gelöst und nach Beispiel 5 a) aufgearbeitet.
Es entstehen 6, 4 g Cocarboxylase-naphthalin-ss*sulfonat vom Schmelzpunkt 198-200 unter Zersetzung. Das Sulfonat enthält l Mol Kristallwasser.
Process for the preparation of the tetrahydrate of cocarboxylase
In 1937, K. Lohmann and Ph. Schuster isolated the carboxylase coenzyme from yeast in the form of aneurine pyrophosphoric acid ester chloride. According to Karrer [cf. Textbook of organic chemistry by P. Karrer, Georg Thieme Verlag, Stuttgart (1948), p. 770], cocarboxylase means the inner salt of the aneurine pyrophosphoric acid ester (I)
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In the meantime, however, it has become common to use cocarboxylase to produce the aneurine pyrophosphoric acid ester chloride (II)
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although this compound should better be called cocarboxylase hydrochloride.
In the following, cocarboxylase is therefore correctly referred to as the inner salt of the aneurine pyrophosphoric ester (I).
A number of processes are known for the production of cocarboxylase hydrochloride.
Stern and Hofer [cf. Science, Vol. 85, p. 483 (1937)] synthesized the compound by reacting aneurine with POC13. J. Weijhard and H. Tauber [cf.
Journal of the American Chemical Society, Vol. 60, p. 2263 (1938)] reacted aneurine with a mixture of sodium pyrophosphate and orthophosphoric acid, while H. Weil-Malherbe [cf. Biochemical Journal, Vol. 34, p. 980 (1940)] treated the 5-bromoethyl-thiazole analogue of aneurine with silver phosphate. In both cases cocarboxylase was isolated as the silver salt. Weijhard and Tauber decomposed this with HsS and isolated cocarboxylase hydrochloride by treatment with hydrochloric acid. Weil-Malherbe carried out the cleaning with phosphotungstic acid. In 1946 Karrer and Viscontini [cf. Helvetica Chimica Acta, Vol. 29, p. 715 (1946)] the method of Weijhard and Tauber.
In addition to the publications mentioned above, there are also a number of German (nos. 663 588, 704 172, 706 835, 708 514 and 729 905) and foreign patents (cf. American patents numbers 2,188,323, 2,224,174, 2 415 544, 2,435,750, English Patents Nos. 687,674, 687,673, French Patent Nos. 930643), all of which are concerned with the preparation or purification of cocarboxylase hydrochloride and essentially relate to processes which permit direct phosphorylation of aneurine . However, all previously known processes, including phosphorylation with palyphosphoric acid, have the disadvantage that the yields achieved are low.
In addition, in many cases the procedures cannot be reproduced perfectly.
The present invention was based on the object of finding a simple, economical, technically feasible and good yield-producing process for the preparation of cocarboxylase salts.
It has been recognized that the main difficulty in isolating cocarboxylase or its salts from the mixture formed during the phosphorylation of aneurine lies in the separation of the aneurine orthophosphoric acid ester that is always present, and that it is essential to avoid the risk of hydrolysis of the cocarboxylase to aneurine orthophosphoric acid ester accordingly to avoid selected conditions as far as possible. It has also proven to be expedient to separate off the excess orthophosphoric acid used or formed during the phosphorylation, if possible before the actual separation of the aneurine phosphoric acid ester mixture.
To separate the main amount of orthophosphoric acid, the phosphorylation mixture has either been precipitated from aqueous solution with the aid of suitable organic solvents and this process has been repeated a few times and / or the mixture has been passed through a weakly basic anion exchanger, e.g. B. of the type Amberlitep IRA 410, Amberlite IR 45 or Merck II, quaternary ammonium bases based on polystyrene with weakened basicity or secondary amines based on polystyrene, are allowed to run.
With the exception of small traces, the orthophosphoric acid remained in the weakly basic anion exchanger during this process, and when eluting with water, a separation of the phosphoric acid ester mixture running off could be achieved. In the range from pH 6.5 to 5.5, an aqueous solution of the aneurine orthophosphoric acid ester ran off. From pH 5.5 to 1, the eluate contained mainly cocarboxylase, which is more mixed with phosphoric acid with increasing acidic pH.
A better separation has been achieved if the solution running off the weakly basic anion exchanger is passed through a strongly basic anion exchanger z. B. of the type Permutait ES or Amberlite IRA 400, quaternary ammonium bases based on polystyrene conducted. By dividing the eluate into the pH fractions indicated above, a better separation was achieved than when using a weakly basic exchanger. The separation process could be made even easier if the solution running off from a weakly basic anion exchanger was passed through a cation exchanger, such as
B. Amberlites. IRC 50, IR 100, IR 105 or IR 120, weakly acidic polyacrylic acid resins or a sulfonated polystyrene resin, let run, since such cation exchangers hold the thiamine orthophosphoric acid ester and allow the free cocarboxylase to pass through.
The present invention relates to a process for the preparation of the tetrahydrate of cocarboxylase, which is characterized in that the mixture of orthophosphoric acid, aneurine (orthophosphoric acid) ester, cocarboxylase and esters of aneurine with higher phosphoric acids is obtained during the phosphorylation of aneurine Dissolves in water, an aqueous solution of the tetrahydrate of cocarboxylase is obtained from this solution with the help of one or more ion exchangers and this is isolated in crystalline form by removing the water used as the solvent or by adding a lower alcohol or acetone.
It has been shown that the crystalline cocarboxylase tetrahydrate can be obtained from the eluate of a cation exchanger or from the eluate fractions with a pH of 5.5-1 of anion exchangers by evaporating the aqueous solution. This substance, which has not yet been described, has a decomposition point of 220-225 (when about 140 swells with the release of water) and can be recrystallized from aqueous solution after the addition of lower alcohols or acetone or other suitable organic solvents. The pH of a 5% aqueous solution of cocarboxylase tetrahydrate is 20 at 3.0 (measured on a gas electrode).
Since the co-carboxylase tetrahydrate reacts only slightly acidic in aqueous solution, there is practically no cleavage to aneurine-orthophosphoric acid ester. Cocarboxylase tetrahydrate can therefore be recrystallized from aqueous solution any number of times and the substance can be obtained in the highest purity without significant losses occurring through hydrolysis. In the Warburg test, the cocarboxylase tetrahydrate shows the full cocarboxylase effectiveness, so that it is very suitable for direct therapeutic use, especially with regard to its favorable pH value.
In addition, because cocarboxylase tetrahydrate has little tendency to hydrolyze, it has a much better shelf life than cocarboxylase hydrochloride, which is today's commercial product for cocarboxylase.
The corresponding salts of cocarboxylase can be prepared in good yields in a simple manner from the cocarboxylase tetrahydrate obtained according to the invention by reacting with aqueous, alcoholic, acetonic or other solutions of acids in organic solvents. The salt formation succeeds with inorganic and organic acids.
The yields of cocarboxylase salts obtained by reacting crystalline cocarboxylase tetrahydrate with acids are significantly better than those obtained in the preparation of the salts by reacting acids: with aqueous cocarboxylase solution. The cocarboxylase salts produced from the tetrahydrate of cocarboxylase are analytically pure and no longer need to be recrystallized. It is practical to work in such a way that the solution of an acid in an organic solvent is initially introduced in the presence of water, if necessary, and the cocarboxylase tetrahydrate is added in crystalline form, then waiting until the salt of the cocarboxylase formed has precipitated (which usually takes a few minutes Case) and then using the usual methods, e.g.
B. by suction or filtration, separates the cocarboxylase salts formed.
In this way z. B. produced the following salts of cocarboxylase, of which only the cocarboxylase hydrochloride was previously known.
Cocarboxylase hydrochloride:
Decomposition point 240 cocarboxylase hydrobromide:
Decomposition point 246-248 '
Cocarboxylase hydroiodide:
Decomposition point 205-207
Cocarboxylase nitrate: decomposition point 208-210 cocarboxylase sulfate: decomposition point 120 cocarboxylase sulfanilate: decomposition point 228-230 cocarboxylase naphthalene-ss-sulfonate:
Decomposition point 198-200
The cocarboxylase tetrahydrate can be recovered from the salts of cocarboxylase by using the salts of cocarboxylase over a suitable ion exchanger, such as. B. Amberlite) IR 45, IRA 400, IRA 401 or IRA 410.
In this way, the cocarboxylase tetrahydrate can also be produced from the pure cocarboxylase hydrochloride.
According to Teruo Tanaka [cf. Journal of the Pharmaceutical Society Japan, Vol. 76, pp. 1314-1318 (1956), reported in Chemical Abstracts, Vol. 51, p. 3607 (1957)], cocarboxylase hydrochloride is obtained by phosphorylation The mixture obtained from vitamin B1 with polyphosphoric acid is redissolved in water after repeated reprecipitation from water with ethanol, adjusted to pH 7 with NH40H and allowed to run over a column filled with the Dowex 1 X 8 exchanger.
Aneurine orthophosphoric acid ester, which is a by-product in the mixture, is then eluted with water and then an aqueous solution of cocarboxylase hydrochloride is obtained by eluting with 0.005 molar aqueous HCl, which is concentrated and worked up to crystallized cocarboxylase hydrochloride by adding ethanol. Apart from the poor yield, this method only gives a cocarboxylase hydrochloride with a decomposition point of 215-216. This cocarboxylase hydrochloride must therefore still contain a considerable percentage of impurities, such as B. orthophosphoric acid ester included.
In contrast, according to the present process, cocarboxylase hydrochloride is obtained in significantly better yield and in the highest purity (the decomposition point of the cocarboxylase hydrochloride obtained according to the present process is 240). Cocarboxylase hydrochloride can be purified somewhat by recrystallization from aqueous-alcoholic solution, but you have to accept major losses in yield because a considerable percentage of the cocarboxylase hydrochloride is converted into the orthophosphate or chloride of the aneurine orthophosphoric acid ester through hydrolysis.
The processes described in Belgian Pat. Nos. 548 447 and 550 722 for the production or purification of cocarboxylase hydrochloride have similar disadvantages. According to the process of Belgian patent No. 548 477, the phosphorylation mixture obtained in the phosphorylation of vitamin Bi is separated with the help of an anion exchanger and the eluate fraction containing cocarboxylase is then reacted with acids to form the corresponding salts (only cocarboxylase hydrochloride is indicated). Understandably, the yield achieved is extremely low because it cannot be avoided that cocarboxylase hydrochloride is strongly hydrolytically decomposed in an aqueous medium. It forms z.
B. the orthophosphate or the chloride of the aneurine-orthophosphoric acid ester.
This process is therefore of no economic interest. The cleaning process described in Belgian patent no. 550 772 does not avoid this calamity. According to the process described there, cocarboxylase hydrochloride is likewise obtained from aqueous cocarboxylase solution by precipitation with aqueous hydrochloric acid. The disadvantages involved here are the same as those described above.
In contrast, the process according to the invention represents a significant technical advance in that it relocates the purification process from the respective salt of the cocarboxylase to the cocarboxylase tetrahydrate, thereby making recrystallizations of the salts produced from the cocarboxylase tetrahydrate superfluous. In addition, the new cocarboxylase tetrahydrate itself is a therapeutically important form of application of cocarboxylase and at the same time forms the key substance for many physiologically interesting salts of cocarboxylase that can be produced from it.
example 1
2 kg of vitamin B1 are phosphorylated in the usual way, the phosphorylation melt is dissolved in 6-8 liters of water (+ ice) with vigorous stirring at a temperature below 10, the aqueous solution is stirred into 100 liters of 96% alcohol and left to sit overnight . The supernatant solvent is decanted off from a precipitated syrup, the latter being taken up in 4 liters of water.
The solution obtained in this way is, depending on the amount of phosphoric acid contained therein, run over 20-30 liters of a weakly basic anion exchanger (for example a secondary amine based on polyester, such as Amberlite IRA 45. It is then washed with water for as long as until the eluate running off shows no more reaction to thiamine. About 25 liters of a solution are obtained, which are concentrated to 6 liters at 30 and 12 torr. The concentrated residue is reduced to 20 liters to separate the thiamine-orthophosphoric acid ester from the thiamine-pyrophosphoric acid ester. Add 30 liters of cation exchanger (Amberlite IRC 50) and rinse with water until the eluate is free of thiamine.
70-80 liters of a solution are obtained, which is concentrated to 1.5 liters in a circulation evaporator at 30 and 12 Torr. 7.5 liters of 96% alcohol are slowly added to the concentrate with stirring.
The cocarboxylase tetrahydrate separates out in the form of fine rods. The yield is 530 g with a melting point of 220-225 with decomposition (sintering with release of water at 140). The thiamine orthophosphoric acid ester, which sticks in the cation exchanger, is removed by washing out with 10% hydrochloric acid, the aqueous hydrochloric acid solution (about 50 to 60 liters) is evaporated to 3 liters at 40-45 and 12 torr and the residue is precipitated with six times the amount of alcohol. 1.3 kg of thiamine orthophosphoric acid ester chloride hydrochloride are deposited. From 2 kg of vitamin Bi arise:
530 g cocarboxylase tetrahydrate and
1.3 kg of thiamine orthophosphoric acid ester chloride hydrochloride.
Example 2
2 kg of vitamin B1 are phosphorylated and dissolved as in Example 1, and the phosphoric acid ester mixture obtained is freed from the majority of phosphoric acid by precipitation with alcohol. The syrup is taken up in 5 liters of water, the entire amount of solution is poured over 25 liters of a strongly basic exchanger (Permutit ES) all at once and washed with water.
Three fractions are separated. From pH 6.6 to 6.0, thiamine-orthophosphoric acid ester runs off in the eluate. The second fraction follows from pH 6.66-5.4 cocarboxylase tetrahydrate, contaminated with about 25-30% thiamine orthophosphoric acid ester. Finally, a fraction of pH 5.4-2 is obtained which contains practically pure cocarboxylase tetrahydrate. The first fraction is evaporated at 12 Torr and 35 and the thiamine-orthophosphoric acid ester crystallized by precipitation of the concentrate with alcohol.
From the second fraction, 746 g of an ester mixture are crystallized out in the same way, which is recrystallized by dissolving in 1.5 liters of water and adding 3.5 liters of alcohol. 412 g of pure cocarboxylase tetrahydrate are obtained. The mother liquor contains the thiamine orthophosphoric acid ester, which is isolated in a known manner. By concentrating the third fraction and precipitating with alcohol, another 81 g of cocarboxylase tetrahydrate are obtained. Overall, this approach results in:
493 g cocarboxylase tetrahydrate and
1.0 kg of thiamine orthophosphoric acid ester.
Example 3
A mixture of 20 g of thiamine orthophosphoric acid ester phosphate, 20 g of cocarboxylase tetrahydrate and 20 g of orthophosphoric acid are dissolved in 100 cm3 of water, sent over 300 cm3 of a weakly basic exchanger Merck II and washed with water.
In the main fraction of pH 6.7 to 6.3, a solution is obtained which contains a mixture of thiamine ortho and pyrophosphoric acid ester (30 g), which is worked up according to Example 2. In the pH range from 6.3 to 4.9 an eluate runs off which contains pure cocarboxylase tetrahydrate and is isolated as in Example 2 (3 g).
Example 4
A mixture according to Example 3 is freed from phosphoric acid using a weakly basic ion exchanger (Amberlite IRA 410 or Merck II), washed with water and the eluate, which contains both the thiamine-orthophosphoric acid ester and cocarboxylase, evaporated. The concentrate of about 200 cm3 then runs over 250 cm3 of a strongly basic exchanger (Permutit ES), in which the separation according to Example 2 is carried out.
Example 5 a) 10 g of cocarboxylase tetrahydrate obtained in accordance with Example 1 are dissolved in 25 cm3 of 5% strength aqueous hydrochloric acid and 75 cm3 of acetone are added dropwise with stirring. The deposited cocarboxylase hydrochloride is filtered off with suction. The yield is 9.5 g. The substance melts at 240 with decomposition.
Instead of aqueous hydrochloric acid, methanolic hydrochloric acid can also advantageously be used. The tetrahydrate initially dissolves and after a few minutes separates out as chloride in the same yield and quality as from the aqueous solution. b) 10 g of cocarboxylase tetrahydrate are dissolved in a mixture of 7 cm3 of 48% hydrobromic acid and 18 cm3 of water and precipitated with acetone as in Example 6. 9.8 g of cocarboxylase hydrobromide with a melting point of 246-248 (with decomposition) are obtained. c) 10 g of cocarboxylase tetrahydrate are dissolved in 10 cm3 of 57% strength hydriodic acid and 15 cm3 of water and precipitated as in Example 5 a).
10.5 g of cocarboxylase hydroiodide with a melting point of 205 to 207 (with decomposition) are obtained. This substance contains 1 mole of crystal water. d) 10 g of cocarboxylase tetrahydrate are dissolved in 10 cm3 of 25 strength nitric acid and 15 cm3 of water. Working up is carried out according to Example 5. The yield obtained is 9.5 g of cocarboxylase nitrate with a melting point of 208-210 (with decomposition). The nitrate contains 1 mol of crystal water. e) 10 g of cocarboxylase tetrahydrate are dissolved in 30 cm3 of 10% strength sulfuric acid and acetone is added to the solution as in Example 5 a). 10.0 g of cocarboxylase sulfate with a melting point of 120 (with decomposition) are isolated.
The sulfate contains 1 mol of water of crystallization. f) 5 g of cocarboxylase tetrahydrate are dissolved in a solution of 2.2 g of sulfanilic acid in 80 cm3 of 60-70 hot water, cooled to room temperature and precipitated with acetone as in Example 5 a). The yield is 6 g of cocarboxylase sulfanilate with a melting point of 228-230 (with decomposition). g) 5 g of cocarboxylase tetrahydrate are dissolved in a solution of 2.5 g / naphthalenesulfonic acid in 300 cm3 of water and worked up according to Example 5 a).
6.4 g of cocarboxylase naphthalene ss * sulfonate with a melting point of 198-200 are formed with decomposition. The sulfonate contains 1 mole of water of crystallization.