CH440310A

CH440310A - Verfahren zur Herstellung eines neuen Nonapeptidamids

Info

Publication number: CH440310A
Application number: CH386362A
Authority: CH
Inventors: Albert Dr Joehl; Rink Hans; Albert Dr Hartmann
Original assignee: Geigy Ag J R
Priority date: 1962-03-30
Filing date: 1962-03-30
Publication date: 1967-07-31
Also published as: FI40901B; US3296243A

Description

Verfahren zur Herstellung eines neuen Nonapeptidamids
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung eines neuen cyclischen Nonapeptidamids, nämlich des Ser'-IleuB-oxytocin n (S, S'-Dehydro-L-cysteinyl-L-tyrosyl- L-isoleucyl-L-seryl-L-asparaginyl-L-cysteinyl-L-prolyl L-isoleucyl-glycinamid). Dieses Nonapeptidamid unterscheidet sich vom bekannten Oxytocin durch die Anwesentheit des L-Serin-radikals anstelle des L-Glutaminradikals an vierter Stelle, und die Anwesenheit des L Isoleucinradikals anstelle des L-Leucin-radikals an achter Stelle.

Demzufolge besitzt es die nachstehende For- mel I
EMI1.1

Das cyclische Nonapeptidamid der obigen Formel zeigt eine ähnliche oxytocische Wirksamkeit wie das Oxytocin. Dagegen fehlt ihm die Blutdruckwirkung. des Oxytocins weitgehend, weshalb seine Anwendung bei verschiedenen Indikationen des letzteren von besonde- rem Interesse erscheint.

Die erfindungsgemässe Reaktionsfolge besteht darin, dass man einerseits zur Herstellung des C-terminalen Pentapeptidderivates einen N-Carbobenzyloxy-L-aspa- raginyl-S-benzyl-L-cystein-alkylester oder-arallkylester, z. B. den bekannten Methylester durch Behandlung mit Hydrazin in das N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-S- benzyl-L-cystein-hydrazid überführt und letzteres mittels salpetriger SÏure in das entsprechende S, N-geschütz- te Dipeptid-azid umwandelt, dieses mit dem bekannten L-Prolyl-L-isoleucyl glycinamid umsetzt, oder das be kannte N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-S-benzyl-Lcystei, mit dem genannten Tripeptidamid mittels eines Carbodiimids, z.

B. N, N'-Dicyclohexylcarbodiimid, kon densiert, und das in beiden Fällen erhaltene N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-propyl L-isoleucylglycinamid durch Behandlung mit Brom- wasserstoffsäure in Eisessig oder mit heisser Trifluor- essigsäure in das L-Asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L prolylL-isoleucyl-glycinamid überführt, anderseits zur Herstellung des N-terminalen Tetrapeptidderivates ein . reaktionsfähoges funktionelles Derivat des N-Carbobenz- yloxy-L-soleucin, z.

B. das gemisahteAnliydrid mit einer niederen Alkoxyameisensäure, mit einem L-Serin-alkyl- ester oder-aralkylester, z. B. dem L-Serin-methylester zu einem N-Carbobenzyloxy-L-isoleucyl-L-serin-ester, z. B. zum Methylester, oder mit einem N2-gesch tzten Serin-hydrazid wie z. B. dem L-Serin-2-carbotertiärbut- oxy-hydrazid zum entsprechenden N-Carbobenzyloxy-Lisoleucyl-L-serin-hydrazid-N2-derivat umsetzt, dieses oder den vorgenannten Ester mit katalytisch. aktiviertem Wasserstoff behandelt, den entstandenen L-Isoleucyl-L- serin-ester, z.

B. den Methylester, bzw. das entstandene L-Isoleucyl-L-serin-hydrazid-N2-derivat mit dem be- kannten S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L-tyrosin mittels eines Carbodiimids, z. B. N, N'-Dicyclohexyl-carbodi- imid, zu einem S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl- L-isoleucyl-L-serin-ester, z. B. zum Methylester, bzw. zu dem entsprechenden S, N-gesch tzten.

Tetrapeptid-hydr azid-N2-derivat kondensiert, ersteren durch Behandlung mit Hydrazin bzw. letzteres durch Acidolyse in das S Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-ser- in-hydrazid überfuhrt, dieses durch Einwirkung von salpetriger Säure in das S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L- tyrosyl-L-isoleucyl-L-serin-azid umwandelt, dieses Nterminale S,N-gesch tzte Tetrapeptidazid mit dem oben erhaltenen C-terminalen S-geschützten Pentapeptidamid zum S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl- L-seryl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-Lisoleucyl-glyci, namid umsetzt, in diesem die beiden S Benzylreste und den N-Tosylrest reduktive, z.

B. durch Behandlung mit einem Alkalimetall in Ammoniak, abspaltetund daserhaltene L-Cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleuc yl-L-seryl-L-asparaginyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-isoleuc- yl-glycinamid durch Oxydation, z. B. mittels Sauerstoff oder Kaliumferricyanid, in die S, S'-Dehydroverbindung, das Ser4-Ileus8-oxytocin berf hrt.

Als Schutzgruppen für Aminogrnvppen können durch saure oder alkalische Hydrolyse abspaltbare Reste wie der Carbotertiärbutoxyrest und derTritylrest (Triphenylmethylrest) bzw. der Trifluoracetyl, rest ; durch Acidolyse, z. B. Behandlung mit Bromwasserstoffsäure in Eisessig oder Behandlung mit Trifluoressigsäure, abspaltbare Reste wie niedere Carbalkoxyreste, der Carbobenzyloxy- rest bzw. wiederum der Carbotertiärbutoxyrest ; durch Reduktion, z. B.

Behandlung mit einem Alkalimetall in Ammoniak, abspaltbare Reste wie der Tosylrest (p Toluolsulfonylrest) oder Carbobenzyloxyrest ; oder, in cysteinfreien Komponenten, durch Hydrierung abspaltbare Reste wie wiederum der Carbobenzyloxyrest in Betracht kommen. Als Schutzgurppe der Mercaptogruppe können insbesondere der reduktiv, z. B. mittels Natrium und flüssigem Ammoniak, entfernbare Benzylrest und ferner z. B. der durch saure Hydrolyse abspaltbare Trit ylrest in Betracht kommen.

N-geschützte bzw. S, N-geschützte Aminocarbonsäuren oder Peptide können z. B. mit Aminosäurederi- vaten oder Peptidderivaten mit freier Aminogruppe und gebundener, z. B. veresterter Carboxylgruppe mittels eines Carbodiimids, z. B. mittels N, N'-Dicyclohexylcar- bodiimid in Dimethylformamid und/oder Acetonnitril, kondensiert werden. Als reaktionsfähige funktionelle Derivate von Aminosäuren und insbesondere von Peptiden mit geschützter Aminogruppe können beispiels- weise deren Azide, die z. B. durch Umsetzung der entsprechenden Ester, z. B. Methylester, mit Hydrazin und Behandlung der Hydrazide mit salpetriger Säure leicht zugänglich sind, verwendet werden.

Im weiteren können besonders als Derivate von einzelnen N-geschützten Aminosäuren auch deren reaktionsfähige Ester, wie z. B. p-Nitro-phenylester, und gemischt Anhydride mit niederen Alkoxyameisensäuren, wie sie z. B. aus den freien Säuren durch Einwirkung von Chlorameisensäurealkyl- estern entstehen, in Betracht gezogen werden. Diese reaktionsfähigen funktionellen Derivate von N-geschützten Aminosäuren oder Peptiden k¯nnen z. B. mit niederen Peptid-alkylestern oder niederen Aminosäurealkyl- estern, mit Salzen von Peptiden oder Aminosäuren oder mit N2-gesc'hutzten Hydraziden, z.

B. 2-Carbotertiär- butoxyhydraziden, von Peptiden oder Aminosäuren, deren geschützte Hydrazidgruppe sich ihrerseits nach der Umsetzung z. B. durch Acidolyse mittels Trifluoressig- säure oder mittels alkanolischer Salzsäure in die freie Hydrazidgruppe umwandeln ltÅasst, als Derivate bez glich der Carboxylgruppe von Peptiden bzw. Aminosäuren umgesetzt werden.

Das nachfolgende Beispiel erläutert die erfindungs gemässe Herstellung des Ser4-Ileu8-oxytocin, stellt jedoch keineswegs die einzige mögliche Ausf hrungsform derselben dar. Alle Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben, und die Schmelzpunkte sind korrigiert. Die spezifischen Drehungen wurden in einem Rohr von 10 cm Länge mit Hilfe des Polarimeters nach Lippich der Firma Schmidt und Haensch bestimmt.

Die zur Prüfung der Einheitlichkeit der Reaktions- produkte verwendeten Dünnschichtchromatogramme erfolgten nach E. Stahl, Chemiker-Zeitung 82, 323 (1958), vgl. auch M. Brenner und A. Niederwieser, Experentia 16, 378 (1960), auf Kieselgel G ¸Merck¯. Die Lösungs- mittelsysteme wurden durch Mischen der Komponenten in den angegebenen Volumenverhältnissen bereitet. Als Nachweismethoden für die Reaktionsprodukte dienten a) Ninhydrinmethode : wie üblich ; b) Chlormethode : nach H. N. Rydon und P. W. G.

Smith, Nature (London) 169, 922 (1952), modifiziert nach F. Reindel und W. Hoppe, Chem. Ber. 87, 1103 (1954) ; c) Folin-Methode : nach O. Folin und V. Ciocalteu, J. biol. Chem. 73, 629 (1927).

BeisDiel 1 a) N-Carbobenzyloxy-L-isoleucyl-L-serin-methylester
32, 4 g (0, 122 M) N-Carbobenzyloxy-L-isoleucin (z. B. hergestellt nach P.-A. Jaquenoud und R. A. Boissonnas, Helv. Chim. Acta 44, 113 [1961]) werden in 320 ml absolutem Tetrahydrofuran gelöst, mit 17, 2 ml (0, 124 M) Triäthylamin versetzt und auf-10 abge- kühlt. Zu dieser L¯sung tropft man bei-10 12, 1 ml (0, 126 M) Chlorameisensäureäthylester. Nach 15 Minuten wird innerhalb 5 Minuten eine auf-5 abgekühlte Lösung von 18, 67 g (0, 12 M) L-Serin-methylester- hydrochlorid (z. B. hergestellt nach St. Guttmann und R. A.

Boissonnas, Helv. Chim. Acta 41, 1852 (1958) und 16, 9 ml (0, 122 M) Triäthylamin in absolutem Chloroform zugegeben. Nach vierstündigem Rühren bei 0 wird das Reaktionsgemisch im Vakuum zur Trockne eingedampft und der Rückstand in 1200 ml Athylacetat und 200 ml Wasser aufgenommen. Die Athylacetatlösung wird sorgfältig mit Wasser, dann mit 1-n. Salzsäure, mit Wasser, mit 5 % iger Natriumbicarbonatlösung und wiederum mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Einengen der Lösung g und Zugabe von Petroläther kristallisiert der rohe Dipeptidester aus ; Smp. 179-180 .

Zur Reinigung wird das Produkt zweimal aus Essig ester/Petroläther kristallisiert ; Smp. 180, 5-181, 5 ; [&alpha;]24¯D, + 3, 9 (c = 5 in Dimethylformamid). Das Produkt ist dünnschichtenchromatographisch einheitlich im System Benzol/Aceton 7:3; Nachweis: Chlormethode. b) L-Isoleucyl-L-serin-methylester-hydrochlorid
26, 0 g (71 mM) N-Carbobenzyloxy-L-isoleucyl-L- serin-methylester werden in 380 ml Methanol und 6, 25 ml konzentrierter Salzsäure gelöst und in Gegenwart von 5 g Pd-Kohle 10 O/o im Wasserstoffstrom hydriert, bis kein Kohlendioxyd mehr entwickelt wird.

Nach Entfer nung des Katalysators wird die Reaktionslösung im Vakuum zur Trockne eingedampf und der Rückstand d zweimal aus Methanol/Ather und einmal aus Methanol/ Aceton/Ather kristallisiert. Zersetzungspunkt : 203 bis 204 , [a] D240, + 12, 6 (c = 3, 01 in Methanol).

Das Produkt ist dünnschichtenchromatographisch einheitlich in den Systemen : n-Butanol/Eisessig/Wasser
3 : 1 : 1 ; MethylÏthylketon/Pyridin/Wasser 65 : 5 : 20. Nachweis : Chlormethode, Ninhydrinmethode. c) S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-
L-serin-methylester
3, 55 g (13, 2 mM) L-Isoleucyl-L-serin-methylester- hydrochlorid werden bei Raumtemperatur in 30 ml Dimethylformamid gel¯st, auf 0 abgekühlt, mit 1, 85 ml (13, 2 mM) Triäthylamin versetzt und f r 10 Minuten unter hÏufigem Umschütteln stehen gelassen. Darauf wird das abgeschiedene TriÏthylamin-hydrochlorid abfiltriert und mit 5 ml Dimethylformamid gewaschen.

Die Lösung des freien Dipeptidesters wird mit einer Lösung von 6, 98 g (13, 2 mM) S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L- tyrosin (hergestellt nach V. Du Vigneaud, M. F. Bartlett und A. J¯hl, J. Am. Chem. Soc. 79, 5572 (1957) in 35 ml Acetonitril versetzt. Die klare Reaktionslösung wird auf -10¯ abgek hlt. Nach Zugabe von 2, 72 g (13, 2 mM) N, N'-Dicyclohexyl-carbodiimid beginnen sich nach kurzer Zeit N, N'-Dicyclohexyl-harnstoff und der Tetrapeptidester abzuscheiden. Nach 55stündigem Rühren bei -10¯ werden die ausgefallenen Produkte abfiltriert und mit wenig kaltem Dimethylformamid/ Acetonitril (1 : 1) und mit Acetonitril gewaschen.

Zur Entfernung des N, N'-Dicyclohexyl-harnstoffes wird das Rohprodukt in 80 ml Dimethylformamid aufgenommen und f r 2 Stunden bei 0 gehalten. Der Harnstoff wird abfiltriert und das Reaktionsprodukt aus dem Filtrat durch Zugabe von 700 ml warmem Äthylacetat ausge- fällt. Nach dreimaliger Kristallisation aus Methanol ist der S, N-gesch tzte Tetrapeptidester dünnschichtenchro- matographisch einheitlich in den Systemen Benzol/ Aceton 1 : 1, Chloroform/Methanol/Ammoniak 17 O/o 2 : 2 : 1, n-Butanol/Eisessig/Wasser 3 : 1 : 1. Nachweis : Chlormethode und Folin-Methode.

Smp. 219-221 ; sintert bei 210 , [&alpha;]25¯D,-59,5¯ (c = 0, 99 in Ameisensäure), [&alpha;]23D, -16,2¯ (c = 0, 98 in Pyridin). d) S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl- L-serin-hydrazid
5, 57 g (7, 5 mM) S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl L- tyrosyl-L-isoleucyl-L-serin-methylester werden in 154 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf 0 ab- gekühlt, mit 4, 5 ml Hydrazinhydrat (92, 2 mM) versetzt und für 45 Stunden bei 0 stehen gelassen. Die Reak- tionslösung wird darauf unter guter Eiskühlung mit t 400 ml Eiswasser versetzt.

Das Reaktionsprodukt scheidet sich dabei als gallertiger Niederschlag ab. Nach zweistündigem Stehen im Eisschrank wird das rohe Hydrazid abfiltriert, gut mit Wasser ausgewaschen und im Vakuum uber Phosphorpentoxyd getrocknet. Das Rohprodukt wird durch zweimalige Kristallisation aus Dimethylformamid/Acetonitril gereinigt. Das erhaltene Produkt sintert bei 222 und schmilzt unter Zersetzung bei 226-229 , [&alpha;]24¯D, -69,2¯ (c = 1, 79 in Ameisensäure), [a] D230, + 7, 2 (c = 1, 99 in Dimethylformamid).

Das Produkt ist d nnschichtenchromatographisch einheitlich in den Systemen : n-Butanol/Eisessig/Wasser 3 : 1 : 1, Methyläthylketon/Pyridin/Wasser 65 : 5 : 20. Nach- weis : Chlormethode und Folin-Methode. e) N-terminales Tetrapeptid-azid
S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl L-serin-azid
0, 966 g (1, 3 mM) S-Benzyl-N-tosyl-L-cystemyl-L- tyrosyl-Lisoleucyl-L-serin-hydrazid werden in 35 ml Dimethylformamid und 3, 9 ml 1-n. Salzsäure gelöst, auf -10 abgekühlt und langsam mit 0, 29 ml 5-n. Natrium nitritlösung versetzt.

Man lässt f r 10 Minuten ruhren und fÏllt darauf das Azid bei einer Temperatur von-8 bis-5 mit 45 ml Eiswasser aus. Das gallertige Produkt wird abgenutscht, gut mit kaltem Wasser, dann mit 3''/oiger Natriumhydrogencarbonatlösung und wiederum mit kaltem Wasser gewaschen und 4 Stunden im Hochvakuum bei 0 getrocknet. Smp. 244-246 (Zersetzung) IR-Spektrum : ausgeprägte Bande bei ? = 4, 75, u (-CO. N3). f) N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-S-benzyl- L-cystein-hydrazid
14, 2 g (30 mM) N-Carbobenzoyloxy-L-asparaginyl S-benzyl-L-cystein-methylester (z. B. hergestellt nach M.

Bodansky und V. DuVigneaud, J. Am. Chem. Soc. 81, 5688 [1959]) werden in 250 ml Dimethylformamid gel¯st, auf 0 abgekühlt und mit 7, 3 ml Hydrazin-hydrat (150 mM) versetzt. Die Reäktionslösung wird fUr 55 Stunden bei 0 stehen gelassen. Zur Isolierung des Hydr azides wird die Lösung mit 1800 ml ¯thanol versetzt, dabei scheidet sich dieses als Rohprodukt mit dem Smp.

213-215 (Zersetzung) ab. Nach zweimaliger Kristalli- sation aus Dimethylformamid/Acetonitril erhöht sich der Smp. auf 214, 5-215, 5 (Zersetzung), [&alpha;]25¯D, -33,9¯ (c = 2, 01 in Ameisensäure), [&alpha;]25¯D, -29,7¯ (c = 0, 25 in Dimethylformamid).

Dünnschichtenchromatographiseh ist das Produkt im System n-Butanol/Eisessig/Wasser 3 : 1 : 1 einheitlich ; Nachweis : Chlormethode. g) N-Carbbenzyloxy-L-asparaginyl-S-benzol-
L-cystein-azid
Zu emsr Lösung von 7, 103 g (15 mM) N-Carbo- benzyloxy-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cystein-hydrazid in 135 ml Dimethylformamid und 45 ml 1-n. Salzsäure werden bei-10 unter Rühren tropfenweise 3, 6 ml (18 mM) einer vorgekühlten 5-n. Natriumnitritlösung zugefügt. Das Azi scheidet sich nach ca. 2 Minuten in kristalliner Form ab. Nach 15-minütigem R hren bei -10 wird zur vollständigen Abschleidung des Azids vorsichti, mit 80 ml Wasser versetzt.

Der Niedersohlag wird abfiltriert, zunächst mit kaltem Wasser, dann mit kalter 2'Vo Natriumhydrogencarbonatlösung und nochmals mit Wasser gewaschen und während 26 Stunden bei 0 im Hochvakum getrocknet. Smp. 124 (Zersetzung), Kontrolle im IR-Spektrum : scharfe Bande bei A = 4, 75 u (-CO N3); selbst nach 10tÏgigem Stehen bei Raumtemperatur noch frei von Isocyanat (? = 4,5 Á). h) L-Isoleucyl-glycin-Ïthylester-hydrochlorid
15, 3 g (44 mM) N-Carbobenzyloxy-L-isol, eucyl-gly- cin-äthylester hergestellt nach P.-A. Jaquenoud u. R. A.

Boissons, Helv. 44, 113 [1961]), gelöst in 200 ml Eisessig, werden in Gegenwart von 1, 1-Aquivalenten konz.

Salzsäure und 5 g 10 /oiger Palladium-Kohle bei Raum- temperatur während 7t/2 Stunden mit Wasserstoff behandelt. Die Reaktionslösung wird von den leichtflüch- tigen Anteilen befreit ; das verbleibende 01 kristallisiert nach mehrmaligem Verreiben mit trockenem Ather.

Das Reaktionsprodukt schmilzt nach zweimaligem Umkristallisieren aus Athanol/Ather 1 : 5 bei 136-137 , [&alpha;]24¯D, + 13,9¯ (c = 3, 0 in abs. ¯thanol).

Es ist dünnsohichtchromatogr. aphisch einheitlich im System : n. Butanol/Eisessig/Wasser 3 : 1 : 1, Nachweis Ninhydrinmethode. i) N-Carbobenzyloxy-L-propyl-L-isoleucyl-glycin Ïthylester
12, 15 g (48 mM) L-Isoleucyl-glycin-äthylester-hydro- chlorid werden in 120 ml absolutem Chloroform gelöst, auf 0 abgekühlt, und bei 0 mit 7, 4 ml (52, 8 mM) Triäthylamin und einer Lösung von 22, 2 g (60 mM) N Carbobenzyloxy-L-prolin-p-nitro-phenylester (hergestellt nach M. Bodansky u. V. DuVigneaud, J. Am. Chem.

Soc. 81, 5688 [1959]) in 40 ml absolutem Chloroform versetzt. Die gelbe Reaktionslösung wird während 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Zur Aufarbeitung wird sie mit 400 ml Chloroform verdünnt, dreimal mit je 90 ml 1-n. Salzsäure, viermal mit je 90 ml 1-n. Ammoniak und dreimal mit je 90 ml Wasser extrahiert und ber Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt und der kristalline Rückstand zweimal aus Athylacetat umkristallisiert, Smp. 159-160 , [&alpha;]D24¯, -86,4¯ (c = 1, 99 in Methanol).

Das Produkt ist dünnschichtenchromatographisch einheitlich in den Systemen Benzol/Aceton 7 : 3 und n Butanol/EisessigiWasser 3 : 1 : 1. Nachweis : Chlormethode j) N-Carbobenzyloxy-L-prolyl-L-isoleucyl-glycinamid
Man last 15, 5 g (35, 7 mM) N-Carbobenzyloxy-L prolyl-L-jsoleucyl-glycin-äthylesterin400 ml Methanol und leitet bei 0 bis zur Sättigung trockenes Ammoniakgas ein. Nach 30stündigem Stehen bei Raumtemperatur wird die Reaktionslösung im Vakuum bei 30 C, zur Trockene eingedampft und der kristalline Rückstand aus Methanol-Wasser 1 : 3 kristallisiert. Das Produkt schmilzt bei 183-184, 5 , [&alpha;]D24¯, -65,7¯ (c = 1, 90 in Methanol).

Es ist dünnschichtchromatographisch einheitlich in den Systemen : Benzol/Aceton 3 : 7 und n-Butanol/Eis- essig/Wasser 3 : 1 : 1. Nachweis : Chlormethode. k) L-Prolyl-L-isoleucyl-glycinamid
9, 35 g (22, 3 mM) N-Carbobenzyloxy-L-prolyl-L- isoleucyl-glycinamid werden in 200 ml Methanol gelöst, mit 1, 1 ¯quivalenten wässriger Salzsäure versetzt und wahrend 5 Stunden in Gegenwart von 10 /oiger Palla dium-Kohle mit Wasserstoff behandelt. Der Katalysator wird abfiltriert und die Reaktionslösung bei 35¯ im Vakuum eingedampft. Der farblose, schaumartige Rück- stand wird einmal aus Methanol-Chloroform und zweimal aus Methanol/¯thylacetat kristallisiert.

Das so erhaltene Hydrochlorid des Tripeptidamids schmilzt, nach
Sintern bei 214 , bei 215, 5-218 unter Zersetzung, M,-42, 4 (c = 2, 1 in 95 %igem Athanol).

Zur Freisetzung der Base wird das obige Hydro chlorid in 50 ml Methanol gelöst und die Lösung durch eine mit Methanol vorbehandelte lonenaustauschersäule von 100 g Dowex-21K (OH-Form) filtriert. Die Säule wird mit insgesamt 400 ml Methanol nachgewaschen und das chlorfreie Eluat im Vakuum bei 30 zur Trok- kene eingedampft. Das Tripeptidamid bleibt als Nadel büschel vom Smp. 171, 5-173 zur ck, [&alpha;]D24¯, -65, 5 (c = 2, 02 in Eisessig).

Es ist dünnschichtenchromatographisch einheitlich in den Systemen : n-Butanol/Eisessig/Wasser 3 : 1 : 1, Meth yläthylketon/Pyridin/Wasser 65 : 5 : 20. Nachweis : Nin hydrinmethode.

Das obige Tripeptidamid wurde bereits von P.-A.

Jaquenoud und R. A. Boissonnas, Helv. Chim. Acta 44, 113 (1961) hergestellt nach einer ähnlichen, von der vorstehend angegebenen Synthese durch die Abspaltung der Carbobenzyloxygruppen mittels BromwasserstoffsÏure in Eisessig und die Verwendung des gemischten N-Carbobenzyloxy-proli, n-äthoxyameise, nsäure-anhydrids anstelle des N-Carbobenzyloxy-prolin-p-nitro-phenyl- esters abweichenden Reaktionsfolge, wobei das erhaltene Tripeptidamid den Smp. 118 und die spezifische Dre hung [&alpha;]D24¯, -63¯ ¯ 1¯ (c = 2 in Eisessig) zeigte.

1) N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-S-benzyl-cysteinyl-
L-prolyl-L-isoleucyl-glyciamid
Das unter g) hergestellte N-Carbobenzyloxy-L-aspa- raginyl-S-benzyl-L-cysteinazid wird in 150 ml kaltem D, imethylformamid gelöst und zu einer Lösung von 4, 264 g (15 mM) L-Prolyl-L-isoleucylglycinamid [vgl. k]) und 2, 1 ml (15 mM) Triäthylamin in 50 ml Dimethyl- formamid gegeben. Man rührt die Reaktionslösung wäh- rend 56 Stunden bei 0 bis +3¯. Nach dieser Zeit ist im IR-Spektrum die Azid-Bande bei 4,75 Á nicht mehr er kennbar.

Zur Isolierung des Reaktionsproduktes wird die Reaktionslösung auf-10 abgekühlt und das Reaktionsprodukt durch vorsichtige Zugabe von 750 ml eiskaltem Wasser als gallertige Masse ausfällt. Der Niedersehlag wird abgenutscht, mit kaltem Wasser gut gewaschen und ber P2O5 im Vakuum getrocknet. Zur Entfernung von Verunreinigungen wird das feingepulverte Rohprodukt dreimal mit je 40 ml Acetonitril/Methanol 4 : 1 innig ver- rieben und abfiltriert. Nach zweimaligem Umfällen aus Dimethylformamid/Acetonitril 1:4 erhÏlt man das S,Ngesch tzte Pentapeptidamid mit dem Smp. 232-234¯ (Zersetzung), [&alpha;]D23¯, -51,3¯ (c = 1, 03 in Dimethylform amid), [&alpha;]D25¯, -79,3¯ (c = 1,03 in Eisessig).

Das Produkt ist d nnschichtenchromatographisch einheitlich in den Systemen : n-Butanol/Eisessig/Wasser 3 : 1 : 1 ; MethylÏthylketon/Pyridin/Wasser 65 : 5 : 20 ; Meth anol/Chloroform 2 : 1. Nachweis : Chlormethode. m) C-terminales Pentapeptidamid: L-Asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-
L-isoleucyl-glycinamid
2, 01 g (2, 78 mM) N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl- S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-isoleucyl-glycinamid werden mit 12 ml 2-n. Bromwasserstoffsäure in Eisessig versetzt. Die Carbobenzyloxy-Verbindung ist nach 40 Minuten vollständig gelöst.

Nach 2l/2stündigem Rühren bei 20 wird zur tiefgelben Lösung 35 ml abs. Ather gegeben, wobei das Hydrobromid des S-geschützen Penta peptidamids als harzige Masse ausfällt. Der Niederschlag wird nach wiederholtem Verreiben mit absolutem Ather körnig. Er wird abfiltriert und zweimal aus Athanol/ Ather umgefällt.

Das gleiche Hydrobromid wird bei Verwendung von Bromwasserstoffsäure in Trifluoressigsäure erhalten, während man bei alleiniger Verwendung von Trifluoressigsäure bei Rückflusstemperatur das entsprechende
Trifluoracetat erhält.

Zur Freisetzung des S-geschützten Pentapeptidamids werden 2, 46 g (3, 66 mM) L-Asparaginyl-S-benzyleL- cysteinyl-L-prolyl-L-isoleucyl-glycinamid-hydrobromid in 30 ml Methanol gel¯st und durch eine mit Methanol vorbehandelte IonenaustauschersÏule von 60 g Dowex
21K (OH-Form) filtriert. Das freie Pentapeptid-amid wird mit 250 ml Methanol eluiert und das bromfreie Eluat bei 30¯ im Vakuum unter Feuchtigkeitsausschluss zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird einmal aus abs. Athanol/abs.

Ather und einmal aus Aceton/Äthyl acetat/Äther umgefällt. Man erhält das S-gesch tzte Pentapeptidamid als farbloses, hygroskopisches Pulver, welches direkt zur Kupplung mit dem gemäss e) erhal- tenen S, N-gesch tzten Tetrapeptid-azid verwendet wird.

n) S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl L-seryl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-
L-isoleucyl-glycinamid
Das unter e) hergestellte S, N-gesch tzte Tetrapeptid- azid wird in 35 ml auf-10 abgekühltem Dimethyl- formamid gelöst und mit einer auf-10 abgekühlten Lösung von 0, 769 g (1, 3 mM) L-Asparaginyl-S-benzyl L-cysteinyl-L-prolyl-L-isoleucyl-glycinamid (hergestellt unter m) und 0, 18 ml (1, 3 mM) Triäthylamin in 5 ml Dimethylformamid versetzt. Man lässt die Temperatur auf-7 bis-5 steigen und riihrt die Reaktionslösung bei dieser Temperatur während 22 Stunden.

Nach dieser Zeit fehlt im IR-Spektrum die aharakteristische Azid-Bande bei 4, 75,.

Das N, S, S'-geschützte Nonapeptidamid wird durch sorgfältige Zugabe von 130 ml Eiswasser ausgefällt, abfiltriert, mit kaltem Wasser, 0, 5-n. Salzsäure, Wasser, 3 %iger Natriumhydrogencarbonatl¯sung und Wasser gewaschen und ber Phosphorpentoxyd in Vakuum getrocknet.

Das Produkt sintert bei 205 und schmilzt bei 211-217 . Zur Reinigung wird es viermal aus Dimefhyl- formamid/Acetonitril 1 : 6 umgefällt und jeweils mit Di methylformamid/Acetonitril 1 : 7, Methan, ol/Acetonitril 1 : 5, Acetonitril, Athylacetat und Ather gewaschen, Smp. nach Sintern bei 211 ;

223-226 (Zersetzung), [&alpha;]D24¯, =-22, 7 (c = 1, 44 in Dimethylformamid). o) S,S'-Dehydro-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L seryl-L-asparaginyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-isoleucyl glycinamid = Ser4-Ileu8-oxytocin
100 mg (0, 767 mM) N-Tosyl-S-benzyl-L-cysteinyl- L-tyrosyl-L-seryl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L prolyl-L-isoleucyl-glycinamid werden in 150 ml flüssigem Ammoniak (über Natrium destilliert) gelöst und die Lösung solange mit Natrium versetzt, bis die blaue Farbe während 5 Minuten bestehen bleibt. Das überschüssige Natrium wird mit Ammoniumehlorid zerstört, das Ammoniak abgedampft und der Rückstand im Vakuumexsikkator ber konz.

Schwefelsäure von den letzten Reste, Ammoniak befreit. Dann wird der Rückstand in 200 ml Eiswasser gelöst, die Lösung mit 2-n. Essi, gsäure auf pH 6, 6 gebracht und solange ein Luftstrom durchgeleitet, bis die Reaktion mit Natriumnitroprussiat nega- tiv ausfällt. Die Reaktionslösung wird darauf mit 2-n.

Essigsäure auf pH 4 gestellt, durch einen Hyflofilter filtriert und lyophilisiert. Das Rohprodukt wird durch Gegenstrom-Verteilung nach Craig (L. C. Craig, Analytic. Chemistry, 22, 1346 [1950]) im System sek. Butanol/0, 017-n. Essigsäure gereinigt. Die Hauptfraktion mit einem Verteilungskoeffizient K von 0, 53 bei 25 besitzt am isolierten Ratten-Uterus eine oxytocische Aktivität von ca. 130 I. E./mg.

Beispiel 2 a) 1- (N-Carbobenzyloxy-L-seryl)-2- (t-butoxycarbonyl)- hydrazin
3, 59 g (15 mM) N-Carbobenzyloxy-L-serin (z. B. hergestellt nach Vorschriften von St. Guttmann u. R. A.

Boissonas, Helv. 41, 1852 [1958] oder E. Baer u. J.

Maurukas, J. Biol. Chem. 212, 25 [1955]) und 2,18 g (16,5 mM) t-Butoxycarbonyl-hydrazin (z. B. erhalten nach den Angaben von L. A. Carpino, C. A. Ciza u.

B. A. Carpino, ibid. 81, 955 [1959]) werden in 35 ml Methanol gelöst und bei 0 innerhalb einer Stunde mit einer Lösung von 6, 99 g (16, 5 mM) l-Cyclohexyl-3 (2-morpholinyl- (4)-äthyl)-carbodiimidmethyl-p-toluol- sulfonat in 15 ml Methanol versetzt. Nach 20stündigem Stehen bei 0 wird das Methanol im Vakuum abdestil- liert und das zurückbleibende Íl in Essigester-Wasser aufgenommen. Die Essigesterlösung wird sorgfältig mit Wasser, 2-n. ZitronensÏure, Wasser, 5 % Natriumhydrogencarbonat und Wasser gewaschen und ber Natriumsulfat getrocknet.

Nach Entfernung des Essigesters im Vakuum bleibt das Produkt als Ol zurück, welches beim Verreiben mit Ather kristallisiert. Das Rohprodukt wird aus Essigester/Hexan kristallisiert, Smp. 99-101 oder 112-113 (Polymorphie ; Identität der IR-Spektren in Lösung, gleiche optische Aktivität ; gleiches dünnsdbich tenchromatographisches Verhalten.

[&alpha;]D25¯, -25,9¯ (c = 2, 11 in Methanol) Ausbeute : 2, 95 g (56 %).

Das Produkt ist im Dünnschichtenchromatogramm in den Systemen Benzol/Aceton 6 : 4, MethylÏthylketon/ Pyridin/Wasser 65 : 5 : 20, n-Butanol/Eisessig/Wasser 3 : 1 : 1 einheihlich. Nachweis : Chlormethode.

An Stelle von Methanol kann auch Acetonitril als Lösungsmittel verwendet werden und 1-Cyclohexyl-3- (2-morpholinyl- (4)-äthyl)-carbodiimid kann durch N, N' Dicyclahexyl-carbodiimid ersetzt werden. b) 1- (L-Seryl)-2- (t-butoxycarbonyl)-hydrazin- benzolsulf onat
14, 8 g (41, 9 mM) l- (N-Carbobenzyloxy-L-seryl)-2- (t-butoxy-carbonyl)-hydrazin werden in 250 ml Meth anol gelöst und in Gegenwart von Pd-Kohle (10 %Pd) im Wasserstoffstrom hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert und die Reaktionslösung im Vakuum eingeengt.

Das zurückbleibende Öl wird zweimal mit absolutem Athor extrahiert und im Vakuum getrocknet. Das Produkt welches als fester Schaum anfällt, wird direlkt wei- terverarbeitet.

Zur Charkterisierung wird das Rohprodukt wie folgt in das kristalline Benzolsulfonat übergeführt : 2, 8 g Ben, zolsulfonsäure werden in 6 ml Methanol gelöst, auf 0 abgekühlt und zu einer eiskalten Lösung von 3 g (13, 7 mM) l-(L-Seryl)-2-(t-butoxycarbonyl) hydrazin in 6 ml Methanol gegeben. Das Benzolsulfonat scheidet sich nach Zugabe von 150 ml trockenem Ather als 51 ab, welches durch Kratzen zur Kristallisation gebracht wird.

Das Produkt wird abfiltriert, mit Methanol/Ather gewaschen und zur Reinigung zweimal aus ¯thanol/¯ther kristallisiert. Smp. 151, 5-153, 5 (Zersetzung) ; [a] D25¯, + 14, 4 (c = 1, 96 in Methanol).

Im D nnschichten chromatogramm liefert das Produkt in den Systemen Benzol/Äthanol 7 : 3, Methanol/Chloroform/17 % NH3 2 : 2 : 1 undn-Butanol/Pyridin/Eisessig/Wasser90 : 60 : 18 : 72 nur einen Fleck, Nachweis : Ninhydrinmethode. c) 1- (N-Carbobenzyloxy-L-isoleucyl-L-seryl)-2- (t-butoxycarbonyl)-hydrazin
Eine Lösung von 2, 7 g (12, 35 mM) l- (L-Seryl)-2 (tibutoxyvarbonyl)-hydrazin und 4, 77 g (12, 35 mM) N-Carbobenzyloxy-L-isoleucin-p-nitrophenylester, hergestellt z. B. nach M. Bodansky u. V. DuVigneaud, J.

Am. Chem. Soc. 81, 5688 (1959), in 24 ml Essigester wird f r 48 Stunden bei 13-14 gerührt. Nach ca. 7 Stunden beginnt das geschützte Dipeptid sich abzuschei- den. Zum Sohluss wird das Reaktionsgemisch auf 0 ab- gekühlt, das Produkt abfiltriert und sorgfältig mit kaltem Essigester gewaschen. Nach zweimaliger Kristallisation aus heissem Essigester schmilzt es bei 187-188 unter Zersetzung. [&alpha;]D25¯ , -36¯ (c = 2,01 in Methanol).

Es ist d nnschichtenchromatographisch einheitlich im System Benzol/¯thanol 7: 3, Nachweis : Chlormethode. d) 1- (L-Isoleucyl-L-seryl)-2- (t-butoxycarbonyl)- Ay'azM
13,4 g (28,8 mM) 1-(N-Carbobenzyloxy-L-isoleucyl L-seryl)-2-(t-butoxycarbonyl)-hydrazin werden in 300 ml Methanol in Gegenwart von Pd-Kohle (10% Pd) hydriert. Nach Entfernung des Katalysators wird das Methanol im Vakuum abgedampft. Der ölige Rückstand wird mehrmals mit Ather und Äther/Petroläther behan- delt und die Lösungsmittel jeweils abdestilliert. Der re- sultierende pulvrige Rückstand wird darauf mit Essig- ester verrieben und abfiltriert. Zur Reinigung wird das Produkt zweimal aus Acetonitril kristallisiert. Smp.

133-134 (Zersetzung ab 134¯), [&alpha;]26¯D, -36,1¯ (c = 1, 99 in Methanol). Dünnschidbtendhromatographisch ist das Produkt einheitlich im System Benzol/¯thanol 8 : 2, Nachweis : Ninhydrinmethode. e) 1-(S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl L-isoleucyl-L-seryl)-2- (t-butoxycarbonyl)-hydrazin
Eine auf-10 abgekiihlte Lösung von 2, 22 g (4, 2 mM) S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L-tyrosin (hergestellt nach V. DuVigneaud, M. F. Bartlett u. A. Johl, J. Am.

Chem. Soc. 79, 5572 [1957]) und 1, 41 g (4, 2 mM) 1- (L-Isoleucyl-L-seryl)-2-(t-butoxycarbonyl)-hydrazin in 22 ml Dimethylformamid/Acetonitril 1 : 1 wird mit 0, 89 g (4, 3 mM) N, N'-Dicyclohexyl-carbodiimid versetzt und wÏhrend 52 Stunden bei-10 gerührt. Im Verlaufe der Reaktion scheiden sich N, N'-D, icyolohexyl-Harnstoff und das gesch tzte Tetrapeptid-hydrazid ab. Das Reaktionsgemisch wird mit 70 ml eiskaltem Wasser versetzt, der Niederschlag abfiltriert und sorgfÏltig mit Wasser, 3% Natriumhydrogencarbonat und zum Schluss nochmals mit Wasser gewaschen.

Zur Entfernung des N, N'-Di- cyclohexyl-Harnstoffes wird das Rohprodukt in 8, 3 ml Dimcthylformamid aufgenommen. Nach zweistündigem Stehen bei 0 wirld der Harnstoff abfiltriert, mit 1, 5 ml Dimethylformamid gewaschen, und das Filtrat mit 50 ml Acetonitril versetzt. Dabei fällt das geschiitzte Tetrapeptidhydrazid als Gallerte aus. Es wird abgenutscht, mit kaltem Acetonitril und ¯ther gewaschen und zweimal aus Dimethylformamid/Acetonitril kristallisiert. Smp.

227-229¯ (Zersetzung). [&alpha;]26¯D, -30,2¯ (c= 1, 96 in Pyridin).

Im Dünnschichtenchromatogramm ist das Produkt einheitlich in den Systemen : Methyläthylieton/Pyridin/ Wasser 65 : 5 : 20, Benzol/Athanol 8 : 2, n-Butanol/Pyridin/ Eisessig/Wasser 90 : 60 : 18 : 72. Nachweis : Chlor-und Fo lin-Methode. f) S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl L-serin-hydrazid
0, 506 g (0, 6 mM) l- (S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-seryl)-2- (t-butoxycarbonyl)- hydrazin werden in 10 ml kalter 90% TrifluoressigsÏure gelöst und 1 1/4 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen.

Darauf wird die Reaktionslösung auf 0 abge- kühlt und das Produkt mit 65 ml Eiswasser ausgefällt.

Es wird abfiltriert, mit Wasser, 3 /o Natriumhydrogen- canbonat, Wasser und zum Schluss mit Acetonitril gewaschen. Nach Kristallisation aus Dimethylformamid/ Acetonitril oder Dimethylformamid/Methanol zeigt dieses Tetrapeptidhydrazid die gleichen Eigenschaften (Smp., dünnschichtenchromatographisches Verhalten und opt. Aktivität) wie das durch Hydrazinolyse des S Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L-tyrosol-L-isoleucyl-L-se rin-methylesters gewonnene Hydrazid, (vgl. Beispiel ld) Schmp. 124-128 , Zersetzung bei 230-231¯. [&alpha;]26¯D = + 6, 3¯ (c= 2,11 in Dimethylformamid) [&alpha;]26¯D = -69,3¯ (c = 2, 06 in Ameisensäure).

Claims

PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung des Ser-Ileus-oxytocin (S,S'-Dehydro-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-seryl L-asparaginyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-isoleucyl-glycin amid, dadurch gekennzeichnet, dass man einerseits zur Herstellung des C-terminalen Penta peptidderiivates einen N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl- S-benzyl-L-cystein-al, kylester oder-aralkylester durch Behandlung mit Hydrazin in das N-Carbobenzyloxy-L- asparaginyl-S-benzyl-L-cystein-hydrazin iiberFiihrt und letzteres mittels salpetriger Säure in das ent sprechende S, N-geschützte Dipeptid-azid umwandelt, dieses mit L-Prolyl-L-isoleucyl-glycinamid umsetzt,

und das erhaltene N-Carbobenzyloxy-L-asparagtinyl- S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-isoleucyl-glycinamid durch Behandlung mit Bromwasserstoffsäure in Eisessig in das L-Asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L- isoleucyl-glycinamid überführt, anderseits zur Herstellung des N-terminalen Tetra peptidderivates ein reaktionsfähiges funktionelles Derivat des N-Carbobenzyloxy-L-isoleucin, mit einem L-Serinalkylester oder-aralkylester oder mit einem N2-gesch tzten SerinJhydrazid zu einem N-Carbobenzyloxy-L-iso- leucylzL-serin ester oder zum entsprechenden N-Carbobenzyloxy-L-isoleucyl-L-serin-hydrazin-N2-derivat umsetzt,

dieses oder den vorgenannten Ester mit katalytisch aktiviertem Wasserstoff behandelt, den entstandenen L-Isoleucyl-L-serin-ester bzw. das entstandene L-Tsoleucyl-L-serin-hydrazid-N2-derivat mit S-Benzyl-N¯tosyl-L-cysteinyl-L-tyrosin mittels eines Car bodiimids zu einem S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L-ty- rosyl-L-isoleucyl-L-serin, ester, bzw. dem entsprechen- den S, N-gesch tzten Tetrapeptid-hydrazid-N2-derivat kondensiert, ersteren durch Behandlung mit Hydrazin bzw.

letzteres durch säurekatalysierte Solvolyse in das S-Benzyl- N-tosyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-s erin-hydrazid überführt, dieses durch Einwickung von salpetriger Säure in das S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L- serin-azid umwandelt, dieses N-terminale S, N-gesch tzte Tetrapeptidazid mit dem oben erhaltenen C-terminalen S-geschiitzten Pentapeptidamid zum S-Benzyl-N-tosyl-L-cysteinyl-L- tyrosyl-L-isoleucyl-L-se !-L-asparaginyl-S-benzyl-L- cysteinyl-L-prolyl-L-isoleucyl-glycinamid umsetzt,

in diesem die beiden S Benzylreste und den N-Tosyl- rest reduktiv abspaltet und das erhaltene L-Cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl- L-seryl-L-asparaginyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-isoleucylglycinamid mittels Sauerstoff oder Kaliumferricyanid in die S, S'-Dehydroverbindung, das Ser4-Ileu8-oxytocin überführt.

UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Herstellung des C-terminalen Pentapeptidderivates N-Carbobenzyloxy-L-asparginyl-Sbenzyl-L-cystein mit L-Prolyl-L-isobenzyl-glycinamid mittels eines Carbodiimids kondensiert und das ethaltene N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-5-benzyl-L-cysteinyl L-prolyl-L-isoleucyl-glycinamid durch Behandlung mit Bromwasserstoffsäure in Eisessig in das L-Asparaginyl- S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-isoleucyl-glycinamid überführt.

2. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man als reaktionsfähiges funktionelles Derivat des N-Carbobenzoxyleucins das gemischte An- hydrid mit einer niederen Alkoxyameisensäure verwendet.