CA3216227A1 - Cardioprotection par induction d'autophagie et reprogrammation metabolique - Google Patents

Abstract

L'invention concerne des composés capables d'induire une autophagie et la reprogrammation métabolique et leur utilisation en tant que cardioprotecteurs, notamment dans le cadre d'une thérapie anti-cancéreuse.

Description

CARDIOPROTECTION PAR INDUCTION D'AUTOPHAGIE ET
REPROGRAMMATION METABOLIQUE
DOMAINE TECHNIQUE
L'invention concerne des composés capables d'induire l'autophagie et la reprogrammation métabolique et leur utilisation en tant que cardioprotecteurs, notamment dans le cadre d'une thérapie anti-cancéreuse.
ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE
Malgré les progrès récents des stratégies thérapeutiques anti-cancéreuses (e.g.
radiothérapie, chimiothérapie et immunothérapie), ces dernières sont associées à un risque élevé de complications cardiaques, notamment d'insuffisance cardiaque ou de cardiomyopathies chez de nombreux patients survivants, résultant en une morbidité et mortalité cardiovasculaires accrues. Par ailleurs, le vieillissement général de la population s'accompagne d'une augmentation du nombre de maladies cardiaques impliquant un excès de mort cellulaire, notamment d'infarctus du myocarde, d'ischémie-reperfusion et d'insuffisance cardiaque. Afin de prévenir la cardiotoxicité, une stratégie combinant une thérapie anti-cancéreuse à des molécules possédant une activité cardioprotectrice a été développée. Ainsi, la FDA (Food and Drug Administration; agence du médicament des Etats Unis d'Amérique) a autorisé
l'administration de la dexrazoxane, un antioxydant, à des patients pour contrecarrer les effets des stratégies anti-cancéreuses. Il a toutefois été observé depuis que l'emploi de dexrazoxane dans ce contexte est associé à un taux plus élevé de néoplasmes malins secondaires (Shaikh et al., J Natl Cancer Inst, 2016, 108(4)). Il existe donc toujours un besoin urgent de molécules capables de prévenir la cardiotoxicité à long terme.
RESUME DE L'INVENTION
Les inventeurs ont mis au point un test de criblage à haut débit pour identifier des inhibiteurs des principales modalités de mort cellulaire cardiaque, c'est-à-dire la nécrose induite par H202 et l'apoptose induite par la camptothécine parmi des banques

2 chimiques composées de 1600 molécules sur une lignée de cardiomyoblastes H9C2.

Ce test a ainsi permis d'identifier des molécules cardioprotectrices capables de compenser les effets cardiotoxiques des stratégies thérapeutiques anti-cancéreuses.
Les inventeurs ont pu montrer que les molécules identifiées dans le cadre de la s présente invention agissent en inhibant la mort des cardiomyocytes par l'induction d'autophagie et une reprogrammation métabolique résultant en une inhibition des phénomènes d'apoptose et de nécrose. Les molécules identifiées peuvent notamment être utilisées en combinaison avec la chimiothérapie ou la radiothérapie pour protéger les cellules cardiaques et diminuer les effets secondaires des traitements anti-cancéreux.
Ainsi, selon un premier aspect, l'invention concerne de telles molécules cardioprotectrices capable d'induire une autophagie et une reprogrammation métabolique, pour leur utilisation dans la prévention des effets secondaires cardiaques d'un traitement anti-cancéreux.
L'invention concerne plus particulièrement un composé choisi dans le groupe constitué
de SG6163F, LOPA87, VP331 et leurs analogues, pour leur utilisation en tant que cardioprotecteur. Selon un mode de réalisation, le composé est choisi parmi SG6163F, LOPA87, et leurs analogues, plus particulièrement parmi SG6163F et LOPA87.
Selon un mode de réalisation, le composé est utilisé dans le traitement d'une maladie cardiaque choisie parmi l'infarctus du myocarde, l'ischémie-reperfusion ou l'insuffisance cardiaque.
Selon un autre mode de réalisation, le composé est utilisé dans la cardioprotection contre les effets secondaires cardiotoxiques d'une thérapie induisant des effets secondaires cardiotoxiques, notamment une thérapie anticancéreuse. L'invention concerne notamment un composé choisi dans le groupe constitué de SG6163F, LOPA87, VP331 et leurs analogues, combiné à un agent thérapeutique tel qu'un agent anticancéreux, pour son utilisation dans la cardioprotection contre les effets secondaires cardiotoxiques d'une thérapie, telle qu'une thérapie contre le cancer, induisant des effets secondaires cardiotoxiques.

3 Selon un mode particulier de réalisation, le composé peut être administré
avant, pendant ou après la thérapie induisant des effets secondaires cardiotoxiques.
Selon un autre aspect, l'invention concerne un ensemble de composants comprenant:
(a) un composé choisi dans le groupe constitué de SG6163F, LOPA87, VP331 et leurs analogues; et (b) un agent thérapeutique utile pour traiter un patient, ledit agent induisant toutefois des effets secondaires cardiotoxiques;
dans lequel le composant (a) est destiné à être utilisé pour son effet cardioprotecteur lo contre les effets secondaires cardiotoxiques du composant (b).
Selon un mode particulier de réalisation, les composants (a) et (b) sont appropriés à
une administration séquentielle, séparée et/ou simultanée.
15 Selon un autre aspect, l'ensemble selon l'invention est utilisé dans le cadre du traitement d'un cancer, le composant (b) étant un agent anticancéreux chimiothérapeutique ou imnnunothérapeutique, et le composant (a) étant utilisé
pour son effet cardioprotecteur contre les effets secondaires cardiotoxiques du composant (b).
Selon un autre aspect, l'invention concerne une méthode de criblage de composés possédant une activité cardioprotectrice, ou susceptibles de posséder une activité
cardioprotectrice, ladite méthode comprenant les étapes suivantes:
a) la culture de cellules cardiaques dans un milieu de culture contenant un composé
test;
b) la culture des cellules cardiaques dans un milieu de culture contenant un inducteur de mort cellulaire; et C) la mesure de la viabilité des cellules.
DESCRIPTION DETAILLEE
Selon l'invention, les composés utilisés sont des composés capables d'induire une autophagie, une reprogrammation métabolique et d'inhiber la mort des cardionnyocytes par inhibition des phénomènes d'apoptose et de nécrose. Les inventeurs ont pu

4 démontrer que de tels composés sont cardioprotecteurs, sans effet d'induction de prolifération de cellules cancéreuses.
Composé capable d'induire une autophagie et une reprogrammation métabolique et s utilisation en tant que cardioprotecteur L'invention concerne donc un composé capable d'induire une autophagie et une reprogrammation métabolique, pour son utilisation en tant que cardioprotecteur.
L'invention concerne plus particulièrement un composé capable d'induire une autophagie et une reprogrammation métabolique et d'inhiber la mort des cardiomocytes par inhibition de l'apoptose et/ou de la nécrose, pour son utilisation en tant que cardioprotecteur.
L'autophagie joue un rôle essentiel dans l'homéostasie cellulaire. Il s'agit d'un processus catabolique conservé dans l'évolution qui implique la dégradation des composants cytoplasmiques endommagés. Les inventeurs ont pu démontrer que ce mécanisme d'autophagie peut être avantageusement mis à contribution pour prévenir les effets cardiotoxiques, notamment les effets cardiotoxiques induits par des traitements anti-cancéreux.
L'homme du métier connait bien le mécanisme d'autophagie et les moyens lui permettant d'identifier des composés capables d'induire ce mécanisme. Par ailleurs, il pourra utiliser le procédé présenté dans la partie expérimentale de la présente demande pour identifier d'autres composés possédant de telles propriétés.
Selon un mode particulier de réalisation, le composé capable d'induire une autophagie est un composé choisi parmi la digitoxigénine, la digoxine, la minaprine, SG6163F, VP331 et LOPA87, et leurs analogues. La capacité de ces composés à induire une autophagie dans les cellules cardiaques et une reprogrammation métabolique par modulation de la glycolyse et de la respiration mitochondriale impliquant un effet sur le réseau mitochondrial n'avait jamais été rapportée dans l'état de la technique. Ces propriétés nouvellement identifiées dans le cadre de la présente invention peuvent avantageusement être mise en oeuvre afin d'induire un effet cardioprotecteur chez des patients nécessitant une telle card ioprotection.

5 Les formules des composés digitoxigénine, la digoxine, la minaprine, SG6163F, VP331 et LOPA87 sont rappelées ci-dessous:
- digitoxigénine:
s 0--i-OH----r--1 H

"---õ.
HO -H
- digoxine:
o OH--..-------1 t H H
,-----"' H OH
H H
- minaprine:
H
, NKI rq,,,....õ,-,N,------....õ.
- i i l'-0 op --,.., - SG6163F:

6 re-- VP331:
N.
0, ___________ /
- LOPA87:

NH
De préférence, le composé est choisi parmi les composés SG6163F, VP331 et LOPA87, et leurs analogues. De manière plus préférée, le composé est choisi parmi les composés SG6163F, LOPA87 et leurs analogues.

7 Selon un mode particulier de réalisation, l'analogue du composé 5G6163F est un composé de formule (I):
o ,e (I) dans laquelle:
Ar est un groupement aryle en C6-14 ou un groupement hétéroaryle en C5-C10, ledit groupement aryle ou hétéroaryle étant éventuellement substitué par 1 à 5 groupements choisis parmi les groupements aryle en C6-014, les groupements hétéroaryle en C5-C10, les atomes d'halogène, les groupements alkyle en C1-C6, le groupement hydroxyle, les groupements alcoxyle en C1-C6, le groupement NH2, le groupement NO2, les groupements mono-(C1-C6)-alkylamino et les groupements di-(C1-06)-al kylamino; et R est choisi parmi les groupements aryle en C6-C14, les groupements hétéroaryle en 05-C10, les atomes d'halogène, les groupements alkyle en C1-C6, le groupement hydroxyle, les groupements alcoxyle en C1-C6, le groupement NH2, le groupement NO2, les groupements mono-(C1-06)-alkylamino et les groupements di-(C1-06)-alkylamino.
Selon un mode particulier de réalisation, le groupement Ar est un groupement aryle en C6-C10. Selon un autre mode particulier de réalisation, le groupement aryle en 010 est choisi parmi les groupements phényle, fluorényle, anthracényle ou naphtyle.
Selon un autre mode particulier de réalisation, Ar est un groupement aryle non substitué, notamment un groupement phényle ou naphtyle non substitué, plus particulièrement un groupement phényle non substitué. Selon une variante de réalisation, Ar est un groupement aryle en C6-C10 substitué par 1 à 5 groupements tels que définis ci-dessus. Selon un autre mode réalisation, Ar est un groupement aryle en 06-C10 substitué par un groupement choisi parmi les groupements aryle en C6-C14, les groupements hétéroaryle en C5-C10, les atomes d'halogène, les

8 groupements alkyle en C1-06, le groupement hydroxyle, les groupements alcoxyle en Cl -C6, le groupement NH2, le groupement NO2, les groupements mono-(C1-06)-alkylamino et les groupements di-(C1-C6)-alkylamino. Selon un autre mode de réalisation, Ar est un groupement aryle en C6-C10 substitué par un groupement choisi s parmi les groupements aryle en 06-014, notamment phényle, les atomes d'halogène, les groupements alkyle en Cl -C6 et les groupements alcoxyle en Cl -C6. Selon un autre mode de réalisation, Ar est un groupement aryle en 06-C10 substitué par un groupement choisi parmi les groupements aryle en C6-014, notamment phényle, les atomes d'halogène et les groupements alcoxyle en Cl -C6. Selon un autre mode de réalisation, Ar est un groupement phényle monosubstitué par un groupement phényle, un atome d'halogène, notamment un atome de fluor, ou un groupement méthoxyle.
Selon une variante, Ar est un groupement naphtyle nnonosubstitué par un atome d'halogène ou un groupement méthoxyle. Selon une variante, Ar est un groupement naphtyle nnonosubstitué par un groupement méthoxyle.
Selon un mode particulier de réalisation, le groupement Ar est un groupement hétéroaryle en C5-C10. Selon un autre mode particulier de réalisation, Ar est un groupement hétéroaryle non substitué. Selon une variante de réalisation, Ar est un groupement hétéroaryle substitué par 1 à 5 groupements tels que définis ci-dessus.
Selon un autre mode réalisation, Ar est un groupement hétéroaryle substitué
par un groupement choisi parmi les groupements aryle en C6-C14, les groupements hétéroaryle en 05-010, les atomes d'halogène, les groupements alkyle en C1-06, le groupement hydroxyle, les groupements alcoxyle en C1-06, le groupement NH2, le groupement NO2, les groupements mono-(C1-06)-alkylamino et les groupements di-(01-06)-alkylamino. Selon un autre mode de réalisation, Ar est un groupement hétéroaryle, notamment imidazolyle, substitué par un groupement choisi parmi les atomes d'halogène, les groupements alkyle en C1-06 et les groupements alcoxyle en C1-06. Selon un autre mode particulier de réalisation, Ar est un groupement hétéroaryle, notamment imidazolyle, substitué par un groupement alkyle en C1-06.
Selon une variante, Ar est un groupement hétéroaryle, notamment imidazolyle, substitué par un groupement méthyle.
Selon un autre mode de réalisation, R est choisi parmi les atomes d'halogène, les groupements alkyle en Cl -C6, les groupements alcoxyle en C1-06 et le groupement

9 NO2. Selon un mode particulier de réalisation, R est choisi parmi les atomes d'halogène, les groupements alcoxyle en C1-C6 et le groupement NO2. De manière plus particulière, R est choisi parmi les atomes d'halogène, plus particulièrement l'atome de chlore, le groupement méthoxyle et le groupement NO2.
Parmi les analogues spécifiques du composé SG6163F utilisables dans le cadre de la présente invention, nous pouvons citer les composés SG6144, SG6146, SG6149, LOPA90, LOPA93, LOPA99, LOPA101, LOPA104, LOPA105 et LOPA106:
- SG6144:
I / \
r - SG6146:
s, Il - SG61 49:
c).==
õ
- LOPA90:

=
- LOPA93:

0, &====-..ss,.c.1 e - LOPA99:
>in .:5 *
- LOPA101:

T' , ....õ.,__., ... --õ
, \ , \
.",7------',\ 4.).--"---,,,, ..'S e ... ,...--. .. ...$
..
Il , - LOPA104:
.4 \ ....
'...:>. ,....ei4. .>µ.
r'. . '.. , 0....a..,......õ.., \
e"
f \
---.-L- e [ ,....--,,-,,, ==-e-'s\le -..,õ,..., - LOPA105:
o\...,...........m /
,.., . .:-,-,,...,.....
I '\ __ õ."
.A
.... ,t.
Il , j - LOPA106:

,õ /
Selon un mode particulier de réalisation, l'analogue du composé LOPA87 est un composé de formule (II):
o ss, R2 ________________________________________ 1 (Il) dans laquelle:
R1 et R2, identiques ou différents, sont choisis parmi les groupements suivants: atome d'hydrogène, atome d'halogène, aryle en C6-C14, alkyle en C1-C6, hydroxyle, alcoxyle en C1-C6, NH2, NO2, mono-(C1-C6)-alkylamino et di-(C1-C6)-alkylamino.
Selon un mode particulier de réalisation, dans le composé de formule (II), R1 est choisi parmi l'hydrogène et un atome d'halogène. Selon un mode particulier de réalisation, dans le composé de formule (II),R1 est un atome d'hydrogène. Selon un autre mode de réalisation, dans le composé de formule (II), R2 est un aryle en C6-C14, plus particulièrement un groupement phényle.
Selon un mode particulier de réalisation, l'analogue du composé LOPA87 est le composé LOPA86:

ù
-1 : E
= e E
r i L'homme du métier pourra se référer à l'article de Gabillet et al. pour la synthèse de des composés SG6163F, LOPA87 et leurs analogues (Gabillet et al., J. Org.
Chem.
2014, 79, p. 9894-9898).
Dans un mode particulier de réalisation, le composé est choisi parmi le composé
VP331 et ses analogues.
Selon un mode particulier de réalisation, l'analogue du composé VP331 est un composé de formule (III):
.õ----H-s'''''' r k (III) dans laquelle R est choisi parmi un groupement aryle en 06-014, notamment en 010, plus particulièrement un groupement phényle; un atome d'halogène; un alkyle en C1-C6; OH; un alcoxyle en C1-06; NH2; NO2, mono-(C1-C6)-alkylamino et di-(C1-C6)-alkylamino.
L'homme du métier pourra se référer aux demandes de brevets EP3476389 et EP3095688 pour la synthèse du composé VP331 et ses analogues.

Dans un autre mode particulier de réalisation, le composé utilisé est la minaprine ou l'un de ses sels acceptables sur le plan pharmaceutique, plus particulièrement le dichlorhydrate de minaprine.
s Les composés selon l'invention peuvent être utilisés sous forme de sels acceptables sur le plan pharmaceutique, en particulier les sels d'acides inorganiques et organiques.
Des exemples représentatifs d'acides inorganiques incluent l'acide chlorhydrique, bromhydrique, iodhydrique, phosphorique, etc. Des exemples représentatifs d'acides organiques incluent l'acide formique, acétique, trichloroacétique, trifluoroacétique, propionique, benzoïque, cinnamique, citrique, fumarique, maléique, méthanesulfonique, etc. D'autres sels d'addition d'acide organique ou inorganique incluent les sels pharmaceutiquement acceptables décrits dans J. Pharm. Sci.
1977, 66, 2, et dans le "Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use"
édité par P. Heinrich Stahl and Camille G. VVermuth 2002.
Les composés utilisés selon la présente invention peuvent être incorporés dans une composition pharmaceutique, comprenant dans un support acceptable sur le plan pharmaceutique au moins un composé selon l'invention tel que décrit ci-dessus, éventuellement en association avec un autre actif thérapeutique.
Par l'expression "support acceptable sur le plan pharmaceutique", on entend tout support (par exemple excipient, substance, solvant, etc.) qui n'interfère pas avec l'efficacité de l'activité biologique du ou des actifs thérapeutiques présents dans la composition pharmaceutique et qui n'est pas toxique pour le patient à qui la composition est administrée. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention comprennent avantageusement un ou plusieurs excipients ou véhicules, acceptables sur le plan pharmaceutique. On peut citer par exemple des solutions salines, physiologiques, isotoniques, tamponnées, etc., compatibles avec un usage pharmaceutique et connues de l'homme du métier. Les compositions peuvent contenir un ou plusieurs agents ou véhicules choisis parmi les dispersants, solubilisants, stabilisants, conservateurs, solvants, etc.
Les composés ou compositions selon l'invention peuvent être administrés de différentes manières et sous différentes formes. Ainsi, ils peuvent être administrés par voie orale ou systémique, comme par exemple par voie intraveineuse, intra-musculaire, sous-cutanée, transderm igue, intra-artérielle, intracérébrale, etc. Pour les injections, les composés sont généralement conditionnés sous forme de suspensions liquides, qui peuvent être injectées au moyen de seringues ou de perfusions, par s exemple. Il est entendu que le débit et/ou la dose injectée peuvent être adaptés par l'homme du métier en fonction du patient, de la pathologie, du mode d'administration, etc. Typiquement, les composés sont administrés à des doses pouvant varier entre 1 pg et 2 g/administration, préférentiellement de 0,1 mg à 1 g/administration.
Les administrations peuvent être quotidiennes ou répétées plusieurs fois par jour, le cas

10 échéant.
D'autre part, la composition selon l'invention peut comprendre, en outre, au moins un autre agent ou principe actif thérapeutique.
15 Les composés selon l'invention, grâce à leur activité cardioprotectrice, peuvent être avantageusement utilisés dans le traitement d'une maladie cardiaque. En particulier, la maladie cardiaque peut être l'infarctus du myocarde, l'ischémie-reperfusion ou l'insuffisance cardiaque.
Par "traitement" ou "traiter", on entend selon l'invention une amélioration, une prophylaxie du désordre ou de la maladie, ou d'au moins un de ses symptômes.
Ceci inclut l'amélioration ou la prévention d'au moins un paramètre physique mesurable de la maladie à traiter, qui n'est pas nécessairement discernable chez le sujet.
Les termes "traitement" ou "traiter" se réfèrent également à l'inhibition ou au ralentissement de la progression de la maladie, ou la stabilisation d'un des symptômes de la maladie. Il peut s'agir aussi du retard du déclenchement d'au moins un symptôme de la maladie.
Selon certains modes, les composés de l'invention sont administrés par mesure préventive. Dans ce contexte, les termes "traitement" ou "traiter" se réfèrent à la réduction du risque de développer la maladie.
Les composés selon l'invention sont particulièrement adaptés à la prévention des effets cardiototoxiques de certaines stratégies thérapeutiques. L'invention vise donc également un composé selon l'invention, pour son utilisation en tant que cardioprotecteur contre les effets secondaires cardiotoxiques d'une thérapie administrée au patient, ladite thérapie étant susceptible d'induire lesdits effets cardiotoxiques. L'invention vise également un composé selon l'invention, pour son utilisation dans une méthode de prévention des effets cardiotoxiques d'un traitement administré à un patient. Ainsi, avantageusement, les composés de l'invention peuvent s notamment être utilisés dans un traitement combiné, pour exploiter de manière avantageuse leurs propriétés cardioprotectrices. Un traitement combiné
comprend l'administration d'un composé selon l'invention en combinaison avec une stratégie thérapeutique visant le traitement d'une pathologie dont le patient est atteint, ladite stratégie thérapeutique étant susceptible d'avoir des effets cardiotoxiques.
Selon un lo mode de réalisation, le composé selon l'invention est administré à un patient souffrant d'un cancer, auquel est administré un traitement anti-cancéreux.
Selon la présente invention, l'expression "traitement anti-cancéreux", ou ses déclinaisons, vise un traitement utilisé pour ralentir la croissance ou détruire des 15 cellules cancéreuses. Le traitement anti-cancéreux peut être médicamenteux ou non-médicamenteux. Parmi les traitements anti-cancéreux médicamenteux, peuvent être cités notamment les chimiothérapies et immunothérapies.
Le terme "chimiothérapie" fait référence à un type de traitement du cancer qui utilise 20 un ou plusieurs médicaments anti-cancéreux ("agents chimiothérapeutiques"). La chimiothérapie peut être administrée avec une visée curative ou peut être destinée à
prolonger la vie ou réduire les symptômes d'un cancer dont est atteint le patient. Les agents chimiothérapeutiques sont par exemple sélectionnés parmi des agents d'alkylation anti-cancéreux, des anti-métabolites anti-cancéreux, des antibiotiques 25 anti-cancéreux, des agents anti-cancéreux dérivés de plantes, des composés de coordination du platine anti-cancéreux et toute combinaison de ceux-ci. Parmi les agents chimiothérapeutiques utilisables dans le cadre de l'invention, dont l'effet cardiotoxique peut être avantageusement prévenus au moyen des composés de l'invention, nous pouvons citer les anthracyclines, notamment la doxorubicine, la 30 daunorubicine, l'épirubicine, l'idarubicine, plus particulièrement la doxorubicine, les inhibiteurs de tyrosine kinase tels l'imatinib, les taxanes (ex : docetaxel, paclitaxel), les anthracenediones (ex: mitoxantrone (MTX), les inhibiteurs de PARP , les anti-métabolites comme le méthotrexate et les anti-HER2 comme le trastuzumab.

Le terme "immunothérapie" fait référence à une thérapie visant à induire et/ou améliorer une réponse immunitaire envers une cible spécifique, par exemple envers des cellules cancéreuses. L'immunothérapie peut impliquer l'utilisation d'inhibiteurs de points de contrôle, d'agonistes de points de contrôle (également dénommés agonistes s des lymphocytes T), d'inhibiteurs d'IDO, d'inhibiteurs de PI3K, d'inhibiteurs des récepteurs de l'adénosine, d'inhibiteurs des enzymes produisant l'adénosine, d'un transfert adoptif, de vaccins thérapeutiques, et de combinaisons de ceux-ci.
Parmi les agents immunothérapeutiques utilisables dans le cadre de l'invention, dont l'effet cardiotoxique peut être avantageusement prévenu au moyen des composés de l'invention, nous pouvons citer les anticorps anti-PD-1 et les anticorps anti-CTLA-4.
Selon un mode particulier de réalisation, le traitement immunothérapeutique est une combinaison d'un anticorps anti-PD-1 et d'un anticorps anti-CTLA-4.
La radiothérapie peut être citée, de manière non-limitative, parmi les traitements non-médicamenteux. L'expression "radiothérapie" se réfère à un traitement locorégional des cancers utilisant des radiations, notamment les rayons X, les rayons gamma, un rayonnement de neutrons, un faisceau d'électrons, un faisceau de protons et des sources de rayonnement, pour détruire les cellules cancéreuses en bloquant leur capacité à se multiplier. Toute forme de radiothérapie est utilisable dans le cadre de la présente invention, notamment la radiothérapie externe, la radiothérapie interne (ou "curiethérapie"), la radio-immunothérapie, ou encore la radiothérapie métabolique impliquant l'administration par voie orale ou par injection intravasculaire (notamment intraveineuse), d'une substance radioactive qui se fixe préférentiellement sur les cellules cancéreuses pour les détruire.
Les composés selon l'invention sont administrés à tout patient qui bénéficiera ou qui est susceptible de bénéficier de leur effet cardioprotecteur. Le patient peut souffrir d'un cancer de n'importe quel stade, notamment un cancer non invasif précoce ou un cancer à un stade tardif qui a déjà progressé pour former des métastases dans le corps.
Par le terme "cancer", on entend toute forme de cancer ou de tumeurs. Des exemples non limitatifs de cancers comprennent le cancer du cerveau (par exemple, le gliome), le cancer gastrique, le cancer de la tête et du cou, le cancer du pancréas, le cancer du poumon non à petites cellules, le cancer du poumon à petites cellules, le cancer de la prostate, le cancer du côlon, le lymphome non hodgkinien, le sarcome, le cancer du testicule, la leucémie non lymphocytaire aiguë et le cancer du sein. Dans un mode de réalisation particulier, le cancer du cerveau est un astrocytome, et plus s particulièrement le glioblastome multiforme; le cancer du poumon est soit un carcinome pulmonaire à petites cellules soit un carcinome pulmonaire à petites cellules; et le cancer de la tête et du cou est un carcinome malpighien ou un adénocarcinome. Selon un autre mode de réalisation, le cancer est un cancer pédiatrique. A titre illustratif, on peut citer parmi ces cancers pédiatriques les neuroblastomes, le cancer d'Ewing, les ostéosarcomes, les médulloblastomes, les rabdomyosarcomes et les glioblastomes de l'enfant.
Les composés peuvent être administrés avant, en même temps, ou après le traitement anti-cancéreux. Le composé ou la composition pharmaceutique selon l'invention est plus spécifiquement pour une utilisation ou administration simultanée, séparée ou séquentielle du composé selon l'invention et d'au moins un autre agent ou principe actif thérapeutique ou tout autre stratégie thérapeutique non médicamenteuse.
Ainsi, l'invention concerne également un ensemble de composants comprenant:
(a) un composé choisi dans le groupe constitué de la digitoxigénine, la digoxine, la minaprine SG6163F, LOPA87, VP331 et leurs analogues; et (b) un agent chimiothérapeutique ou immunothérapeutique;
dans lequel le composant (a) est utilisé pour son effet cardioprotecteur contre les effets secondaires cardiotoxiques du composant (b).
Dans un mode particulier de réalisation, le composant (a) est choisi parmi SG6163F, LOPA87, VP331 et leurs analogues, plus particulièrement parmi SG6163F, LOPA87 et leurs analogues, préférentiellement parmi SG6163F et LOPA87. De préférence, le composant (a) est le composé SG6163F. L'ensemble de composants selon l'invention comprend notamment des composants (a) et (b) appropriés à une administration séquentielle, séparée et/ou simultanée. Avantageusement, l'ensemble de composants selon l'invention peut être utilisé dans le traitement d'un cancer, le composant (a) étant utilisé pour son effet cardioprotecteur contre les effets secondaires cardiotoxiques du composant (b).
Méthode de criblage de composés cardioprotecteurs Un second aspect, l'invention concerne une méthode de criblage de composés susceptible de posséder une activité cardioprotectrice, ladite méthode comprenant les étapes suivantes:
s a) la culture de cellules cardiaques dans un milieu de culture contenant un composé
test;
b) la culture des cellules cardiaques dans un milieu de culture contenant un inducteur de mort cellulaire; et c) la mesure de la viabilité des cellules.
Les cellules utilisées sont choisies parmi les cellules cardiaques connues de l'homme du métier, notamment parmi des cellules cardiaques primaires ou des lignées cellulaires cardiaques. Selon un mode particulier de réalisation, les cellules cardiaques sont des cellules de rongeur, notamment de rat ou de souris, plus particulièrement de rat. Par exemple, les cellules sont des cellules H9C2.
Les cellules sont cultivées dans un milieu adapté à leur culture. On peut notamment citer le milieu DMEM supplémenté avec des additifs adéquats. Parmi les additifs utilisables, on peut citer le sérum de veau foetal, la glutamine et les antibiotiques, notamment pour la culture des cellules H902.
Dans l'étape a), le milieu de culture est également supplémenté avec un composé test.
Selon un mode particulier de réalisation, le milieu de culture contenant le composé test ne contient pas de sérum de veau foetal et/ou d'antibiotique. En particulier, selon une variante de l'invention, le milieu de culture contenant le composé test ne contient pas de sérum de veau foetal et ne contient pas d'antibiotique. Par "composé test", on entend un composé dont on souhaite déterminer s'il possède une activité
cardioprotectrice. Le composé test sera utilisé à une concentration susceptible de permettre d'identifier ladite activité. Bien entendu, l'homme du métier pourra choisir d'utiliser une gamme de concentration au cours de la méthode selon l'invention pour identifier l'activité du composé et la concentration efficace. Les cellules sont cultivées en présence du composé test pendant un temps suffisant pour permettre audit composé test d'agir sur les cellules. A titre illustratif, la culture des cellules en présence du composé test peut être réalisée pendant un temps compris entre 1 minute et heures, par exemple entre 15 minutes et 10 heures, notamment entre 1 heure et heures, plus particulièrement pendant 2 heures.
A l'étape b), les cellules sont mises en culture dans un milieu complet comprenant du s sérum et les antibiotiques, qui comprend en outre un inducteur de mort cellulaire. Selon un mode particulier de réalisation, à l'étape b) l'inducteur de mort cellulaire est introduit dans le milieu de culture de l'étape a). Selon un autre mode de réalisation, à
l'étape b) le milieu de culture de l'étape a) est remplacé par un milieu de culture contenant un inducteur de mort cellulaire et le composé test. Selon un autre mode de réalisation, Io préféré, à l'étape b) le milieu de culture de l'étape a) est remplacé un milieu de culture contenant un inducteur de mort cellulaire mais ne contenant pas le composé
test.
Parmi les inducteurs de mort cellulaire, on peut citer les inducteurs d'apoptose ou les inducteurs de nécrose. On peut citer la camptothécine parmi les inducteurs d'apoptose utilisable dans le cadre de la méthode selon l'invention. Le péroxyde d'hydrogène 15 (H202) peut être utilisé comme inducteur de nécrose. Les cellules sont cultivées en présence de l'inducteur de mort cellulaire à une concentration et pendant un temps adaptés pour permettre l'observation d'une mort cellulaire dans les cellules non traitées avec un composé test, et l'observation d'une absence ou réduction de la mort cellulaire dans les cellules traitées avec un composé test qui s'avère avoir une activité
20 cardioprotectrice. Par exemple, la cannptothécine peut être utilisée à
une concentration comprise entre 1 et 100 pM, notamment entre 5 et 15 pM, plus particulièrement de 10 pM, pendant une durée allant de 10h à 14h, notamment 12h à 36h, plus particulièrement 24h. Selon un autre exemple, le péroxyde d'hydrogène est utilisé
durant 30 minutes à 5h, plus particulièrement durant 1h à 3h, en particulier pendant 2h, à une concentration comprise entre 100 et 600 pM, en particulier entre 200 et 400 pM, notamment de 300 pM.
L'étape c) est mise en oeuvre pour déterminer la viabilité cellulaire. Les techniques pour déterminer la viabilité des cellules sont bien connues de l'homme du métier. On pourra notamment citer la technique de coloration au bleu de méthylène, la coloration à l'iodure de propidium, ou encore le test de libération de l'enzyme lactate déshydrogénase (LDH).

La méthode selon l'invention peut avantageusement être mise en oeuvre pour réaliser un criblage à haut débit de plusieurs composés tests. Ainsi, les cellules pourront notamment être cultivées dans des dispositifs adaptés à un tel criblage à haut débit, notamment dans des plaques multipuits, par exemple des plaques d'au moins 6 puits, s au moins 12 puits, au moins 24 puits ou au moins 96 puits. Selon un mode particulier de réalisation, la méthode de criblage selon l'invention est mise en oeuvre sur plaque 96 puits.
Les composés tests sélectionnés selon la méthode de criblage décrite ci-dessus peuvent ensuite être testés pour leur capacité à induire l'autophagie et/ou une reprogrammation métabolique. L'évaluation de la capacité des composés tests à
induire l'autophagie peut notamment être réalisée selon la méthode décrite dans les exemples. En bref, les étapes de la méthode de criblage décrite ci-dessus sont mises en oeuvre sur des cellules cardiaques dans lesquels l'expression ou l'activité
de protéines impliquées dans le mécanisme d'autophagie est inhibé. Si les composés sélectionnés ne sont plus capables d'inhiber la mort cellulaire dans ces conditions, il peut être conclut que leur activité cardioprotectrice dépend d'une induction de l'autophagie. L'inhibition de l'expression ou de l'activité de protéines impliquées dans le mécanisme d'autophagie peut être réalisée par tout moyen connu dans l'art, notamment par transfection d'un acide nucléique inhibiteur, notamment un siRNA, ciblant l'ARNm codant une ou plusieurs protéines impliquées dans le mécanisme d'autophagie. On peut notamment citer l'inhibition de la protéine Atg5 ou de la protéine Beclin-1, en particulier par inhibition de leur expression. Selon un mode de réalisation, la méthode comprend l'inhibition d'Atg5 et de Beclin-1. Selon un mode particulier de réalisation, la méthode comprend l'inhibition de l'expression d'Atg5 et de Beclin-1.
Dans un mode plus particulier de réalisation, la méthode comprend l'inhibition d'Atg5 et de Beclin-1 par transfection de siRNA.
La capacité des composés à induire l'autophagie peut également être évaluée par mesure de la conversation de LC3 I et II dans des cellules traitées avec le composé
test sélectionné au moyen de la méthode de criblage selon l'invention. Une augmentation de la conversion de LC3 I en LC3 II montre une induction de l'autophagie. Par ailleurs, la capacité des composés sélectionnés à induire la formation de l'autophagosome pourra être déterminée afin d'évaluer la capacité desdits composés à induire l'autophagie.

La capacité des composés sélectionnés à reprogrammer le métabolisme énergétique peut être déterminée par des techniques connues de l'homme du métier. Il peut être ainsi envisagé notamment d'évaluer la capacité des composés sélectionnés à
élevé le s niveau local d'espèces réactives de l'oxygène dans des cellules cardiaques traitées avec le composé sélectionné suite au criblage selon l'invention. L'homme du métier pourra avantageusement utiliser des techniques de détection du niveau de superoxyde d'anion, notamment celles basées sur l'utilisation de la sonde fluorescente MitoSOX
en microscopie confocale. Par ailleurs, le métabolisme énergétique peut également être analysé en temps réel, notamment par la mesure de la consommation d'oxygène proportionnelle à la respiration mitochondriale et la mesure de la production et sécrétion de protons dans le milieu de culture proportionnel à la glycolyse.
L'homme du métier dispose de méthodes permettant une telle analyse, notamment au moyen de la technologie Seahorse utilisée dans la partie utilisée ci-dessous et la mesure des deux voies de synthèse de l'ATP énoncées ci-dessus et dénommés: oxygen consumption rate (OCR) et extracellular acidification rate (ECAR). Ces deux paramètres peuvent être déterminés de manière dynamique dans les cellules après traitement séquentiel par des inhibiteurs de référence des complexes de la chaine respiratoire mitochondriale (e.g. rotenone, antimycine, oligomycine).
L'absence d'effets toxiques des composés sélectionnés peut également être évaluée.
Ainsi, l'absence d'effets prolifératifs pourra-t-elle être évaluée selon des techniques bien connues de l'homme du métier.
Les capacités cardioprotectrices des composés sélectionnés au moyen de la méthode de criblage selon l'invention peuvent également être vérifiée dans chez l'animal.
Par ailleurs, les effets des composés tests peuvent être comparés à des composés dont les effets cardioprotecteurs et les propriétés d'induction d'autophagie et de reprogrammation métabolique sont déjà connus. A ce titre, l'homme du métier pourra utiliser avantageusement un ou plusieurs composés choisis parmi SG6163F, VP331, LOPA87 et leurs analogues comme référence dans la méthode de criblage de l'invention.

LEGENDE DES FIGURES
Figure 1. Criblage haut-débit d'inhibiteurs de la mort des cellules cardiaques pour l'identification de hits.
s La figure 1A représente un organigramme du criblage.
La figure 1B montre le classement des hits sur le pourcentage de survie révélé
par marquage au bleu de méthylène. Les molécules ont été utilisées à 10 pM en prétraitement avant induction de la mort cellulaire.
La figure 1C représente la confirmation des 6 meilleurs hits sur la viabilité
des cellules H9C2, mesurée par un essai de libération de LDH.
Chaque expérience a été reproduite au moins 3 fois. LB, tampon de lyse. SD, écart type. ****, p< 0.0001 par rapport à H202, ns., non significatif. SD est calculé par ANOVA
à un facteur, avec comparaisons multiples de Sidak.
Figure 2. Effets cellulaires des hits sur des cardiornyocytes ventriculaires néonatals primaires de rat (RNVC) et la lignée cellulaire de cancer du poumon (A549).
La figure 2Amontre que les hits protègent la viabilité des RNVC contre H202 à
300 pM.
La figure2B montre que les hits protègent la viabilité des RNVC contre la camptothécine à 10 pM.
La figure2C présente l'influence des hits sur la viabilité des cellules H9C2.
Les cellules ont été cultivées en présence des hits à 10 pM pendant 48 h. Enfin, les cellules ont été lysées dans du tampon de lyse et la quantité de LDH a été mesurée pour évaluer la croissance cellulaire totale.
La figure2D montre l'influence des hits sur la viabilité des cellules cancéreuse A549.
Les cellules ont été cultivées pendant 6 h en présence ou en l'absence des hits, puis pendant 42 h. Enfin, les cellules ont été lysées avec du tampon de lyse et la quantité
de LDH a été mesurée pour évaluer la croissance cellulaire totale.
Chaque expérience a été reproduite au moins 3 fois. LB, tampon de lyse. LDH, lactate déshydrogènase. Les données sont présentées en moyenne erreur type de la moyenne (s.e.m) par ANOVA à un facteur, avec comparaisons multiples de Sidak.
*, p< 0.05, **, p< 0.01, ***, p< 0.001, ****, p< 0.0001, par rapport à 300 pM
H202 (A), 10 pM camptothécine (B) ou 0,01 % DMSO (C).

Figure 3. Effets sur l'expression des membres pro- et anti-apoptotiques de la famille Bd-2 Niveaux d'expression protéique de BCL-2 (figure 3A et figure 3B) BXL-XL
(figure 3C) et BAX (figure 3C), dans les RNVC après 6h de traitement (Fig. 3A, Fig. 3C, Fig. 3D) s ou 24h (Fig. 3B). Co., contrôle des cellules non traitées. Chaque expérience a été
reproduite au moins trois fois. Les images représentatives de Western-blot et la quantification de trois expériences indépendantes sont présentées sous forme de moyenne SEM avec ANOVA à un facteur, avec comparaisons multiples de Sidak.
*, p <0,05 par rapport au DMSO.
Figure 4. L'inhibition de la mort cellulaire des RNVC par les hits nécessite Atg5 et Becl in-1 figure 4A: les RNVCs ont été transfectés avec des siRNA ciblant Atg5 et Beclin-1 et les niveaux d'expression des deux protéines ont été évalués par Western-blot.
Figure 4B et figure 4C: après transfection de siRNA Atg5 et Beclin-1 respectivement, la libération de LDH a été mesurée dans les RNVC traités par 300 pM H202, 2h.
Les données sont présentées sous forme de moyenne SEM avec ANOVA à un facteur, et comparaisons multiples de Sidak. ns., non significatif par rapport aux cellules traitées par H202 et transfectées avec les siRNA.
Figure 4D: après la transfection du plasmide GFP-LC3, les points fluorescents verts GFP-LC3 ont été visualisés par microscopie à fluorescence et quantifiés avec Image J pour contrôler la formation de l'autophagosome. Les données sont présentées sous forme de moyenne SEM avec ANOVA à un facteur, et comparaisons multiples de Sidak. ***, p <0,001 par rapport à 0,01% de DMSO.
Figure 4E: niveaux de protéines de LC3-I / Il dans les RNVC. Les données sont présentées sous forme de moyenne SEM avec ANOVA à un facteur, et comparaisons multiples de Sidak. *, p <0,05, **, p <0,01 par rapport au DMSO.
Figure 5. SG6163F stimule le flux d'autophagie dans les RNVC
Figure 5A: niveaux de protéines LC3-I / Il et p62 dans les RNVC traités avec de la 3-méthyladénine (3MA), de la chloroquine (CQ) et SG6163F pendant 6 h. La rapamycine à 3 pM a été utilisée comme contrôle positif. Les données sont présentées sous forme de moyenne SEM avec ANOVA à un facteur, et comparaisons multiples de Sida k.

p <0,05, **, p <0,01, ns., non significatif.

Figure 5B: après traitement avec SG6163F, la rapamycine, la 3-méthyl adénine (MA), la chloroquine (CQ), les points fluorescents verts GFP-LC3 ont été visualisés par microscopie à fluorescence et quantifiés avec Image J. Les données sont présentées sous forme de moyenne SEM avec ANOVA à un facteur, et comparaisons multiples s de Sidak, *, p <0,05, **, p <0,01. Les expériences ont été reproduites trois fois.
Figure 6. Effets sur la dynamique nn itochond ria le par microscopie à
fluorescence Les RNVC ont été traités par des hits 1 pM (figure 6A) et 10 pM (figure 6B) pendant 6 h et le réseau nnitochondrial a été marqué par 200 nM de Mitotracker. Le réseau 10 mitochondrial et les mitochondries individuelles ont ensuite été
analysés à l'aide du microscope confocal Leica et du logiciel IMARIS. Les données sont présentées sous forme de moyenne SEM avec ANOVA à un facteur, et comparaisons multiples de Sidak. *, p <0,05, **, p <0,01, ***, p <0,001 par rapport au DMSO.
Figure 6C: niveaux de protéines MFN1 et MFN2 dans les RNVC analysés par western-Figure 6D: niveaux de protéines Drp-1 et p-Drp-1 dans les RNVC analysées par western-blot. p <0,05, **, p <0,01, ***, p <0,001 par rapport au DMSO. Les expériences ont été reproduites 3 fois. Les images représentatives de Western-blot et la quantification de trois expériences indépendantes sont présentées sous forme de moyenne SEM avec ANOVA à un facteur, et comparaisons multiples de Sidak.
Figure 7. Effets du SG6163F et de la digoxine sur la morphologie et l'abondance des mitochondries par microscopie électronique à transmission.
Les cellules ont été traitées avec un véhicule (0,01% DMSO), 1 pM de digoxine, 1 pM
de SG6163F, 10 pM de SG6163F, fixées avec du glutaraldéhyde et analysées par microscopie électronique à transmission. Les cellules traitées à la digoxine et avec 10 pM de SG6163F présentent de nombreuses mitochondries rondes plus courtes par rapport au contrôle qui présente des mitochondries longues et minces (figure 7B, figure 7D contre figure 7A). Le traitement avec 1 pM de SG6163F n'a pas affecté la morphologie des mitochondries (figure 7D versus figure 7C). L'encart droit en dans la figure 7D présente une figure de fission mitochondriale.
Figure 8. Effets de reprogrammation métabolique des hits.

Figure 8A: Les cellules H9c2 ont été traitées avec les composés pendant 6 h, puis la fonction glycolytique a été mesurée par test de stress glycolytique sur l'analyseur de flux extracellulaire XFe96 (Agilent, USA), les données sont présentées sous forme de moyenne SEM avec ANOVA unidirectionnelle, et comparaisons multiples de Sidak s tester. *, p <0,05, **, p <0,01, ***, p <0,001 par rapport au DMSO.
Figure 8B: les cellules H9c2 ont été traitées avec les composés pendant 6 h, puis un test de stress de respiration nnitochondriale a été effectué.
Figure 8C: l'oxydation des acides gras exogènes a été mesurée simultanément en utilisant le kit de substrat XF Palmitate-BSA FAO avec le test de stress nnito sur cellules XF. Avant de commencer le test, 30 pL de substrat XF Palmitate-BSA FAO ou contrôle BSA ont été ajoutés aux puits appropriés.
Figure 8D: niveaux de protéines AMPK a1pha2 et de phospho-AMPK dans les RNVC.
Les données sont présentées sous forme de moyenne SEM avec ANOVA à un facteur, et comparaisons multiples de Sidak. *, p <0,05, **, p <0,01, ***, p <0,001 par rapport au DMSO.
Figure 9. Effets cellulaires des composés sur les RNVC et H9c2.
La pernnéabilisation de la membrane cellulaire des RNVC (figure 9A et figure 9B) a été
mesurée avec de l'iodure de propidium. Les données sont présentées sous forme de moyenne SEM avec ANOVA à un facteur, et comparaisons multiples de Sidak. *, p <0,05, **, p <0,01, ***, p <0,001 par rapport au DMSO.
Figure 10. Effets cellulaires de composés analogues sur les RNVC.
la protection des cellules RNVC contre H202 par des composés analogues de SG6163F et LOPA87 a été mesurée par un test de libération de LDH et une mesure d'absorbance à 490 nm. Les données sont présentées sous forme de moyenne SEM

avec ANOVA à un facteur, et comparaisons multiples de Sidak. ***, p <0,001 par rapport au DMSO.
Figure 11. Effets des composés sur le volume cellulaire total.
Figure 11: suite au traitement des RNVC avec les composés comme indiqué, le volume cellulaire est marqué avec 4 pM de calcéine-AM. Le volume des cellules a ensuite été
analysé à l'aide du logiciel IMARIS.

Figure 12. Effets des composés sur la production mitochondriale de ROS.
Figure 12: Les RNVC ont été traités avec 0,1% de DMSO, 3 pM de rapamycine, 1 pM
de digitoxigénine, 1 pM de digoxine, 1 pM de minaprine, 1 pM de VP331, 1 pM de LOPA87, 10 pM de SG6163F pendant 6 h, puis la production de ROS a été marquée s avec la sonde fluorescente MitoSOX.
Figure 12A: la fluorescence a été capturée avec un microscope confocal Leica.
Figure 12B: la quantification de l'intensité de fluorescence nnitochondriale a été
réalisée avec le logiciel Image J. Les données sont présentées sous forme de moyenne SEM avec ANOVA à un facteur, et comparaisons multiples de Sidak. *, p <0,05, **, p <0,01, ***, p <0,001 par rapport au DMSO.
EXEMPLES
Matériel et méthodes Criblage à haut débit Banques chimiques. Les composés ont été obtenus à partir de deux bibliothèques chimiques: la bibliothèque Prestwick (1.200 molécules) et la bibliothèque CEA
Saclay (400 molécules). Tous les composés ont été fournis à 10 nnM dans 100% de DMSO.
Traitement cellulaire et induction de la mort cellulaire. Des cellules H9C2 ont été
cultivées dans du milieu DMEM (ATCCO 30-2002 TM) connplémenté avec du sérum de veau foetal 10% (BSA; BioWhittaker DE14-801F) et de la pénicilline-streptomycine (Gibcoe # 15070063). Les cellules H902 ont été ensemencées dans des plaques à
96 puits (5 000 cellules / puits), laissées adhérer pendant 48 heures (h) et traitées avec des composés des banques à 10 pM pendant 2h à 37 C. Ensuite, les composés ont été éliminés et remplacés par un inducteur de mort cellulaire: traitement pendant 24 h avec 10 pM de camptothécine (Sigma 09911) pour l'apoptose ou traitement pendant 2 h avec 300 pM de H202 (Sigma 216763) pour la nécrose.
Mesure de viabilité et sélection des hits. Après traitement, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS et fixées avec de l'éthanol à 95% pendant 30 minutes (min) à
température ambiante. Les plaques ont été vidées et séchées pendant une nuit.

Ensuite, les cellules ont été colorées avec du bleu de méthylène (0,1 g / L) pendant 5 minutes. Après trois lavages à l'eau, du HCI 0,1 M a été ajouté dans les plaques. La lecture d'absorbance a été effectuée à 665 nm (spectrofluorimètre Envision, Perkin Elmer). Les résultats ont été normalisés avec un contrôle non traité et les hits ont été
s sélectionnés si la valeur d'absorbance était supérieure à la valeur moyenne contrôle de de la mort cellulaire + 3 déviation standard.
Isolement des cardiomyocytes néonatals Des cardiomyocytes néonatals de rats ont été isolés comme décrit précédemment (Wang et al., Cell Death Dis, 2016, 7:e2198).
Test de libération de LDH
Un test colorimétrique a été utilisé pour mesurer la lactate déshydrogénase (LDH), une enzyme cytosolique qui est libérée lors de la pernnéabilisation de la membrane plasmique (Promega G1780). Le dosage a été réalisé en utilisant des surnageants de culture cellulaire obtenus à partir de cellules H9C2 ou RNVC (rat neonatal ventricular myocytes) et du tampon de lyse (LB) a été utilisé comme contrôle positif de la lyse cellulaire totale. La libération de LDH a été mesurée par lecture d'absorbance à 490 nm (spectrofluorimètre lnfinite, Tecan).
Test de perméabilisation de la membrane plasmique cellulaire L'iodure de propidium, un marqueur ADN fluorescent non perméable, a été
utilisé pour mesurer l'intégrité de la membrane. De l'iodure de propidium à 10 pM a été
ajouté
dans le milieu de culture et une lecture de fluorescence a été effectuée (ex:
530 nm;
em: 620 nm), le LB a été utilisé comme contrôle positif de la lyse cellulaire totale.
Pharmacologie L'évaluation de la liaison des composés au canal hERG potassique humain a été
réalisée comme décrit précédemment (Eurofins).

Transfection de plasmides Au jour 0, 4 x 105 cardiomyocytes néonatals ont été étalés pendant une nuit dans des boîtes de culture de 35 mm revêtues de laminine (10 pg / m1). Au jour 1, les cellules s ont été transfectées avec 1 pg de plasmide GFP-LC3 en utilisant le réactif de transfection Lipofectamine0 2000 (1 pg de GFP-LC3 correspond à 2,5 pl de réactif de transfection), pendant 48 h, puis la fluorescence verte a été détectée avec un microscope confocal Leica (SP5). Les analyses ont été réalisées avec le programme Image J (Wayne Rasband, National Institutes of Health, Etats Unis).
Analyse du réseau mitochondrial par microscopie Microscopie confocale. Au jour 0, 4 x 105 cardiomyocytes néonatals ont été
étalés pendant une nuit sur des boîtes de culture de 35 mm revêtues de lanninine (10 pg /
ml). Au jour 1, les cellules ont été traitées avec différents composés à 1 ou 10 pM
pendant 6 heures. Les cellules ont été incubées avec du Mitotracker Red 580 à

nM pendant 20 minutes à 37 C, puis 4 pM de calcéine (calcéine AM, Life technologies, St Aubin, France) pendant 10 min à 37 C. Les images ont été acquises avec un microscope confocal Leica (SP5) (Mannheim, Allemagne). Le réseau mitochondrial et le modèle 3D du volume cellulaire ont été reconstruits en utilisant le logiciel IMARIS
(Bitplane Company, Zurich, Suisse), par conséquent le volume cellulaire, le nombre mitochondrial et le volume ont été analysés.
Microscopie électronique à transmission. Pour l'analyse ultrastructurale, les cellules ont été fixées dans 1,6% de glutaraldéhyde dans un tampon phosphate 0,1 M, rincées dans un tampon cacodylate 0,1 M, post-fixées pendant 1h dans 1% de tétroxyde d'osmium et 1% de ferrocyanure de potassium dans un tampon cacodylate 0,1 M
pour améliorer la coloration des membranes. Les cellules ont été rincées dans de l'eau distillée, déshydratées dans des alcools et enfin noyées dans de la résine époxy. Des coupes ultrafines contrastées (70 nm) ont été analysées sous un microscope électronique à transmission JEOL 1400 disposant d'une caméra Morada Olympus CCD.
Détection de ROS dans les RNVC

Les RNVC ont été traités avec 0,01% de DMSO, 3 pM de rapamycine, 1 pM de digitoxigénine, 1 pM de digoxine, 1 pM de minaprine, 1 pM de VP331, 1 pM de LOPA87, 10 pM de SG6163F dans un milieu de culture cellulaire sans sérum pendant s 6 heures. Le contenu (50 pg) d'un flacon d'indicateur de superoxyde mitochondrial MitoSOX TM (ThermoFisher, M36008) a été dissous dans 13 pL de diméthylsulfoxyde (DMSO) pour préparer une solution mère de réactif MitoSOX TM 5 mM. Ensuite, la solution mère de réactif MitoSOX TM 5 mM dans du PBS a été diluée pour préparer une solution de travail de réactif MitoSOX TM 5 pM. Après traitement, les cellules ont 10 été rincées 2 fois avec du PBS chaud, puis incubées avec une solution de travail de réactif MitoSOX pendant 10 minutes à 37 C. Les cellules ont été délicatement rincées trois fois avec du PBS chaud. La fluorescence rouge a été détectée au microscope confocal Leica. La fluorescence nucléaire a été supprimée et l'intensité de fluorescence mitochondriale a été mesurée en utilisant le logiciel ImageJ.
Analyse du profil bioénergétique en temps réel des cardiomyocytes H9C2 L'analyseur de flux extracellulaire XFe96 (Seahorse Biosciences, North Billerica, MA, Etats Unis) a été utilisé pour mesurer la fonction bioénergétique des cardiomyocytes H9C2. Les cellules H902 ont été ensemencées à 20 000 cellules par puits dans des microplaques de culture cellulaire XF96, tous les prétraitements ont été
réalisés avec du milieu de culture cellulaire sans sérum. Le test de stress de glycolyse Agilent Seahorse XF a été réalisé pour mesurer la fonction glycolytique dans les cellules H9C2, le taux d'acidification extracellulaire (ECAR) a été mesuré
séquentiellement par 3 injections, 10 mM de glucose, 2 pM d'oligomycine et 50 mM de 2-désoxy-D-glucose (2-DG). Le test de stress Agilent Seahorse XF Oeil Mito a mesuré des paramètres clés de la fonction mitochondriale en mesurant directement le taux de consommation d'oxygène (OCR) des cellules H9C2. Le test a utilisé les ports d'injection intégrés sur les cartouches de capteur XF pour ajouter des modulateurs de respiration dans le puits cellulaire pendant le test afin de révéler les paramètres clés de la fonction mitochondriale. De l'oligomycine à 2 pM a été injectée en premier après les mesures basales. Puis 1 pM de cyanure de carbonyle-4 (trifluorométhoxy) phénylhydrazone (FCCP) a été injecté. La troisième injection correspond à 0,5 pM d'antimycine A, pour arrêter la respiration mitochondriale. L'oxydation des acides gras exogènes a été

mesurée simultanément en utilisant le kit de substrat XF Palmitate-BSA FAO
avec le test de stress mitochondrial sur cellules XF. Le milieu limité en substrat est le DMEM
avec 0,5 mM de glucose, 1 mM de GlutaMAX, 0,5 mM de carnitine et 1% de sérum de veau foetal. De la carnitine a été ajoutée fraîchement le jour du changement de milieu.
s Le milieu de test FAO contient 111 mM NaCI, 4,7 mM KCI, 1,25 mM CaCl2, 2 mM
MgSO4, 1,2 mM NaH2PO4, supplémenté avec 2,5 mM de glucose, 0,5 mM de carnitine et 5 mM HEPES le jour du test, ajusté à pH 7,4 à 37 C. Les cellules H902 ont été
ensemencées à 20 000 cellules par puits dans des microplaques de culture cellulaire XF96. Tous les prétraitements ont été réalisés avec du milieu de culture cellulaire sans sérum. 24 heures avant le dosage, le milieu de croissance a été remplacé par un milieu limité en substrat. 45 minutes avant le dosage, les cellules ont été lavées deux fois avec du milieu de test FAO, 150 pL / puits de milieu de dosage FAO ont été
ajoutés aux cellules. L'incubation a été réalisée dans un incubateur sans CO2 pendant 30 à 45 minutes à 37 C. La cartouche d'essai a été chargée avec des composés XF Cell Mito Stress Test (concentrations finales: 2 pM d'oligomycine, 1 pM de FCCP, 0,5 pM
d'antinnycine A). Juste avant de commencer le test, 30 pL de substrat XF
Palmitate-BSA FAO ou BSA ont été ajoutés aux puits appropriés, puis la microplaque de culture cellulaire XF a immédiatement été insérée dans l'analyseur XFe96 pour analyse.
SDS-PAGE et western blot Les cellules H9C2 et les RNVC ont été détachées dans du LB contenant: Tris 50 mM, NaCI 150 mM, EDTA 1 mM, 0,5% de désoxycholate, 1% Triton X 100, 0,1% SDS (pH
8,0). Les cellules ont été collectées et placées sur de la glace pendant 30 minutes.
Ensuite, les cellules ont été centrifugées à 2000 g pendant 20 minutes à 4 C.
Le surnageant a été transféré dans un nouveau tube et conservé sur de la glace.
La concentration en protéines a été déterminée par dosage BCA. Les échantillons de protéines ont été dilués avec du tampon d'échantillon (Laemmli 2x, Sigma), mélangés et chauffés pendant 5 minutes à 95 C. Ensuite, les échantillons ont été
chargés dans un gel précoulé à gradient de 4 à 20% et ont migré pendant 15 minutes à 300 V.
Après la migration, la membrane et le gel ont été placés sur la base d'une cassette Trans Blot Turbo (Bio Rad) et les protéines ont été transférées pendant 3 minutes à
2,5V.
Après le transfert, la membrane a été bloquée avec 5% de lait dans du PBS-Tween et incubée avec un anticorps primaire dilué dans du PBS-Tween à 5% p/v de lait à

sous agitation douce, pendant une nuit. Le jour suivant, la membrane a été
lavée avec du PBS-Tween pendant 6 x 5 min et incubée avec un anticorps secondaire conjugué
à la peroxydase de raifort pendant 1 h à température ambiante. La membrane a été
lavée à nouveau avec du PBS-Tween pendant 6 x 5 minutes après l'anticorps s secondaire. Ensuite, la membrane a été incubée avec un substrat chimioluminescent amélioré ultra-sensible pendant 5 minutes. Les images ont été enregistrées avec un système d'imagerie sur gel (Bio Rad). Pour la détection des protéines, les anticorps suivants ont été utilisés: anti-Mitofusin 1 (ab126575, Abcam, États-Unis), anti-Mitofusin 2 (ab124773, Abcam, États-Unis), BOL-2 (C-2) (sc-7382, Santa Cruz, États-Unis), BAX (B-9) (sc-7480, Santa Cruz, États-Unis), BCL-XL (# 2764, Oeil Signaling, États-Unis), AMPK a1pha2 (# 2757, Cell Signaling, États-Unis), LC3B (D11) ( # 3868, Oeil Signaling, États-Unis), 13-Actin (04) (sc-47778, Santa Cruz, États-Unis), phospho-DRP1 (Ser616) (D9A1) (# 4494, Cell Signaling, États-Unis), DLP1 (# 611112, BD
Biosciences, États-Unis).
RT-PCR quantitative L'ARN total a été purifié à partir de 0,5 million de cellules H9C2 de rat en utilisant le RNeasy Mini Kit (Qiagen). Les quantités d'ARN ont été quantifiées en utilisant le spectrophotomètre Nanodrop 2000 (Thermo Scientific). L'intégrité des ARN a été

vérifiée en utilisant le bioanalyseur Agilent 2100 avec le test RNA 6000 Nano (Agilent Technologies). 1 pg d'ARN total ont été rétrotranscrits dans un volume de réaction final de 20 pl en utilisant le kit High Capacity cDNA Reverse Transcription (Life Technologies) avec un inhibiteur de RNase et des amorces aléatoires en suivant les instructions du fabricant. La PCR quantitative a été réalisée avec le système de PCR
en temps réel QuantStudio 12K Flex en utilisant le protocole de détection TaqMan. 6 ng d'ADNc ont été mélangés avec du TaqMan Universel Master Mix 2 et chaque test TaqMan dans un volume final de 10 pl. Le mélange réactionnel a été chargé sur des microplaques à 384 puits et soumis à 40 cycles de PCR (50 C /2 min; 95 C / 10 min;
(95 C /15 s; 60 C / 1 min) X 40). Une analyse qPCR en l'absence d'une étape de rétrotranscription a été réalisée sur tous les échantillons d'ARN pour vérifier l'absence de toute contamination d'ADN. Chaque mesure d'échantillon a été faite en double et trois échantillons biologiques d'ARN indépendants ont été préparés pour chaque condition. Les valeurs Ct ont ensuite été utilisées pour la quantification, et la détermination du rapport relatif d'expression génique a été réalisée en utilisant la méthode AACt et normalisée par la moyenne géométrique d'un ensemble de gènes domestiques stables.
s Analyses statistiques Les résultats sont exprimés en moyenne erreur type de la moyenne (s.e.nn).
Le logiciel Origin et Graphpad Prism 6 ont été utilisés pour l'analyse statistique. Les différences entre 2 groupes ont été analysées par ANOVA à un facteur et les lo différences entre les groupes de deux génotypes ont été analysées par ANOVA

bidirectionnelle, avec comparaisons multiples de Sidak. La signification statistique est indiquée comme suit: * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, **** P <0,0001. Le nombre de cellules et d'expériences indépendantes réalisées est indiqué dans les légendes des figures.
Résultats 1. Identification d'inhibiteurs de la mort des cardiornyocytes par criblage à
haut débit Deux criblages à haut débit ont été développés pour identifier les inhibiteurs de la mort cellulaire due à une nécrose induite par H202 et à une apoptose induite par la camptothécine, dans la chimiothèque commerciale Prestwick (1200 molécules) et une bibliothèque maison du CEA Saclay (400 molécules). Les cardiomyoblastes H9C2 ont été prétraités par les composés à 10 pM pendant 2 h avec 0,01% de DMSO comme véhicule, lavés et incubés avec un inducteur de mort cellulaire (i.e. H202 ou camptothécine) pendant la période indiquée (figure 1A). Ensuite, le pourcentage de cellules viables a été évalué par coloration au bleu de méthylène, et les hits ont été
classés en fonction de leur efficacité à protéger de la mort cellulaire, révélant 21 hits statistiquement significatifs (figure 1B). Ensuite, 6 hits ont été confirmés manuellement sur des cellules H9C2 avec de nouveaux lots de molécules en utilisant le test de libération de lactate déshydrogénase (LDH) (figures 1C, 1D) et la coloration à l'iodure de propidium (Figure 9) indépendamment. Trois hits appartiennent à
la bibliothèque de Prestwick, à savoir la digitoxigénine, la digoxine et la minaprine, et 3 hits appartiennent à la banque du CEA: SG6163F, VP331 et LOPA87 (Gabillet, Loreau et al. 2014). Les structures chimiques des 6 hits sont présentées sur la figure 1E.
Certains analogues de SG6163F et LOPA87 ont ensuite été analysés pour leur capacité à protéger contre les effets de H202 et ont montré une efficacité.
Ensuite, l'effet des composés a été évalué sur les cardiomyocytes ventriculaires néonatals primaires de rat (RNVC) en utilisant le test LDH et la coloration à
l'iodure de propidium. Les 6 composés se sont avérés inhiber efficacement à la fois la nécrose et l'apoptose des RNVC, à l'exception de LOPA87 qui ne protégeait pas de l'apoptose Io induite par la camptothécine lorsqu'elle était détectée par la libération de LDH (figures 2A, 2B, figure 10), sans toxicité détectable à 48h dans les cellules H9C2 (figure 2C).
L'absence d'effets prolifératifs des composés ont également été évalués sur la lignée cellulaire de cancer du poumon A549 pendant 48 h (figure 2C). Ainsi, la digitoxigénine, la digoxine et la minaprine on réduit significativement la croissance cellulaire et ont 15 induit la mort cellulaire, tandis que SG6163F, VP331 et LOPA87 n'ont montré aucun effet prolifératif sur la croissance cellulaire A549 pendant cette période (figure 2C).
Le blocage du canal potassique humain du canal hERG pouvant être responsable de fibrillations cardiaques entraînant un arrêt cardiaque et la mort du patient, la liaison 20 des 3 molécules SG6163F, VP331 et LOPA87 à ce récepteur a été
évaluée. Pour ce faire, nous avons mesuré la capacité des molécules à inhiber la liaison spécifique du [3H] dofétilide au canal in vitro et constaté que la liaison de SG6163F, VP331 et LOPA87 est négligeable (tableau 1).
25 Tableau 1. Test de la liaison au canal hERG. L'inhibition de la fixation du Dofetilide titriée a été mesurée en duplicata lors de deux mesures indépendantes et la moyenne calculée. Seulement les valeurs> 50% sont considérées comme efficaces % inhibition Concentration Composé (p.tM) ler test 2eme test Moyenne SG6163F 10 40,5 36,6 38,5 VP331 10 -4 5,4 0,7 L0P87 10 14,6 5,3 2. Effets des composés sur l'expression des membres de la famille BCL-2 Pour déterminer les mécanismes cellulaires par lesquels les composés identifiés inhibent la mort cellulaire, nous avons déterminé le niveau d'expression des membres s de la famille d'anti-apoptotiques BCL-2 après un traitement court (6h) ou plus long (24h) de RNVC. Les composés n'ont pas modifié l'expression de BOL-2 indépendamment de la durée du traitement (figures 3A, 3B), tandis que la digoxine a entraîné une diminution de l'expression de BCL-XL (figure 3C). De plus, la digoxine et SG6163F ont considérablement diminué l'expression de la protéine pro-apoptotique 10 BAX. (figure 3D). Pour comparer nos résultats avec des molécules de référence, nous avons utilisé la rapamycine, un inhibiteur sérine / thréonine kinase de mTOR
et un inducteur d'autophagie (Foster et al., 2010, Journal of Biological Chemistry 285(19):
14071-14077), qui n'a montré aucun effet sur l'expression des membres de la famille BOL 2 dans les RNVC (figure 3).
3. Dépendance des hits à Atg5 et Beclin-1 et induction de l'autophagie par Ensuite, nous avons émis l'hypothèse que les composés pourraient protéger les cellules cardiaques en activant l'autophagie, un processus catabolique conservé dans l'évolution qui implique la dégradation des composants cytoplasmiques endommagés.
Ainsi, pour explorer la dépendance des hits à la machinerie des protéines de l'autophagie (Yin et al., 2016, Cell Death Dis.7:e2198), l'expression d'Atg5 et Beclin-1, deux acteurs principaux de l'autophagie (Kang et al., 2011, Cell death and differentiation 18(4): 571), a été inhibé par transfection de siRNA dans des RNVC
pendant 24h (figure 4A). Ensuite, les cellules ont été traitées par les hits et par H202 pendant 2 heures et leur survie a été analysée 4 heures plus tard en mesurant la libération de LDH (figures 4B, 4C). Les résultats montrent que tous les composés ont perdu leur capacité à protéger les RNVC de la nécrose. Tous les composés ont également perdu leur capacité à inhiber la mort cellulaire induite par la camptothécine (non montré). Ces résultats suggérant la capacité des hits à induire une autophagie en tant qu'activité cardioprotectrice, nous avons mesuré la conversion de LC3 I et II et avons constaté que le niveau d'expression de LC3I1 est significativement augmenté
par un traitement des cellules avec 1 pM de SG6163F (> 1,5 fois) et de rapamycine (>

1,4 fois), comme le montre l'analyse par Western blot (figure 4D). Afin de confirmer par une autre approche l'induction de l'autophagie, les RVNC ont été
transfectées avec un plasmide GFP-LC3 et la formation de l'autophagosome a été contrôlée 24 heures plus tard. Les résultats présentés dans la figure 4E montrent que SG6163F est s capable de provoquer la formation d'autophagosomes. La rapamycine a été
utilisée à
3 pM comme témoin positif d'induction de l'autophagie. Ensuite, pour préciser les mécanismes de l'activité de SG6163F, nous avons mesuré le flux autophagique à
l'aide de deux inhibiteurs de référence, la 3-méthyladénine (3MA) et la chloroquine (CQ), en utilisant les techniques de Western blot LC3 I / Il (figure 5A) et de microscopie à fluorescence après transfection de GFP- LC3 (figure 5B).
Dans l'ensemble, ces résultats révèlent que tous les hits nécessitent Atg5 et Beclin1 pour exercer leur activité inhibitrice de la mort cellulaire, et stimulent le flux d'autophagie par des mécanismes post-transcriptionnels.
4. Impact sur le réseau mitochondrial et les espèces réactives de l'oxygène dans les RVNC
En raison de l'importance des mitochondries et des niveaux d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) pour le devenir des cellules cardionnyocytes, l'hypothèse selon laquelle les composés pourraient avoir un impact sur le réseau des mitochondries a été explorée. Suite au traitement des RNVCs par les composés testés, le réseau mitochondrial a été marqué par 200 nM de Mitotracker et le volume cellulaire par 4 pM
de calcéine-AM. Ainsi, le réseau mitochondrial et les mitochondries individuelles ont ensuite été analysés à l'aide du logiciel IMARIS. Si tous les composés ont diminué de manière significative le volume cellulaire par rapport au véhicule (figure

11), à 1 et 10 pM, la digitoxigénine, la digoxine et le SG6163F ont augmenté le nombre de mitochondries et le volume mitochondrial total par cellule suggérant l'induction de la biogenèse mitochondriale (figures 6A, B). En revanche, VP331, LOPA87 et minaprine n'ont eu aucun effet sur le réseau mitochondrial et le nombre de mitochondries à
l'exception de 10 pM minaprine et 3 pM rapamycine, qui ont diminué la masse mitochondriale (figures 6A, B). En conséquence, la digitoxigénine et la digoxine ont diminué l'expression des protéines de fusion, MFN1 et MNF2 (figure 6C) et la digoxine et SG 6163F ont stimulé la fission par la phosphorylation de Drp-1 au niveau de Ser616 comme le montre la mesure du rapport (DRP1-P) / (DRP-1 total) par western-blot (figure 6D). Les effets sur la dynamique mitochondriale ont été confirmés par microscopie électronique à transmission montrant une augmentation du nombre de mitochondries et une diminution de leur taille dans les cellules H9C2 traitées par 10 s pM de SG6163F et 1pM de digoxine par rapport aux mitochondries traitées au DMSO
et 1 pM de SG6163F (figure 7).
Les ROS sont produites ou accumulées en tant que sous-produit du métabolisme de l'activité mitochondriale. Ainsi, les ROS peuvent être une conséquence de la fonction mitochondriale ou refléter un défaut du système antioxydant mitochondrial.
Ici, en utilisant le marquage au superoxyde d'anion dans les RVNC par la sonde fluorescente MitoSOX après traitement cellulaire par les composés pendant 6h, nous avons pu montrer que la rapamycine, la digitoxigénine, VP331, LOPA87 et la Minaprine induisaient une élévation du niveau local de superoxyde d'anion mitochondrial, mais pas la digoxine et SG6163F (figure 12).
5. Les hits identifiés reprogramment le métabolisme énergétique des cellules Ensuite, nous avons analysé le métabolisme énergétique en temps réel en utilisant la technologie Seahorse dans les cellules H9C2. En premier lieu, tous les composés ont favorisé une acidification extracellulaire (augmentation de l'ECAR) suggérant une augmentation de la production d'ATP par glycolyse anaérobie, à l'exception de la rapamycine (figure 8A). La digitoxigénine et la minaprine ont amélioré la production d'ATP par phosphorylation oxydative (OXPHOS) en utilisant le glucose et le pyruvate comme substrats (figure 8B), mais pas les acides gras (figure 8C). VP331 et la digoxine ont amélioré la phosphorylation oxydative en utilisant des acides gras comme substrat (figure 8C), mais pas le glucose (figure 8B). SG6163F s'est avéré
booster OXPHOS bien que la rapamycine l'ait diminuée, indépendamment des substrats comme prévu (Schieke et al., 2006, Journal of Biological Chemistry 281(37):

27652) (figures 8B, C). Enfin, pour préciser les mécanismes de reprogrammation métabolique, nous avons étudié l'activation de la protéine kinase activée par l'AMP
(AMPK), un maître régulateur du métabolisme et avons constaté que seul LOPA87 stimule la phosphorylation de l'AMPK par 1,5 fois par rapport au contrôle DMSO

(figure 80).
Conclusion Nous avons mis au point deux essais de criblage à haut débit de composés inhibiteurs de la mort cellulaire. Ces essais nous ont permis d'identifier 6 composés inhibiteurs de la mort des cellules cardiaques par induction de l'autophagie et par reprogrammation métabolique. Nous avons plus particulièrement identifié 3 molécules d'intérêt (SG6163-F, LOPA87 et VP331), et les avons validés manuellement dans la lignée de cellules H9C2 et dans des myocytes ventriculaires néonataux de rat (RNVC) en utilisant la mesure de la libération de lactate déshydrogénase et le test fluorescent de perméabilité de l'iodure de propidium. De plus, pour chaque molécule, nous avons identifié l'implication des mécanismes pro-survie telles que les protéines Atg5 et 15 Beclin-1 de la machinerie d'autophagie, la modulation de l'expression de l'oncoprotéine BCL-2, l'impact sur le réseau nnitochondrial et la biogenèse mitochondriale, la production des espèces réactives de l'oxygène et la reprogrammation métabolique. Nous avons comparé les nouvelles molécules à
quatre molécules commerciales dont 3 identifiées dans le crible à savoir la digitoxigénine, la 20 digoxine et la minaprine, et molécule commerciale étant un inducteur d'autophagie contrôle, la rapamycine. Les 3 molécules d'intérêt n'ont pas montré d'activité

cytotoxique sur les cardiomyocytes, n'ont pas augmenté la prolifération de cellules cancéreuses et ne se fixent pas sur le canal cardiaque hHERG. Leurs mécanismes d'action sont différents de ceux de la rapamycine. Ainsi, les molécules identifiées 25 peuvent être utilisées en combinaison avec la chimiothérapie ou la radiothérapie, notamment, pour protéger les cellules cardiaques et diminuer les effets secondaires des traitements anti-cancéreux.

Claims (10)

REVENDICATIONS

1. Composé choisi dans le groupe constitué de SG6163F, LOPA87, VP331 et leurs analogues, pour leur utilisation en tant que cardioprotecteur.

2. Composé pour son utilisation selon la revendication 1, choisi parmi SG6163F, LOPA87, et leurs analogues.

3. Cornposé pour son utilisation selon la revendication 1 ou 2, choisi parmi et LOPA87.

4. Composé pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à
3, pour son utilisation dans le traitement d'une maladie cardiaque choisie parmi l'infarctus du myocarde, l'ischémie-reperfusion ou l'insuffisance cardiaque.

5. Composé pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à
3, pour son utilisation dans la cardioprotection contre les effets secondaires cardiotoxiques d'une thérapie induisant des effets secondaires cardiotoxiques

6. Composé pour son utilisation selon la revendication 5, le composé étant administré
avant, pendant ou après la thérapie induisant des effets secondaires cardiotoxiques.

7. Composé pour son utilisation selon la revendication 5 ou 6, ladite thérapie induisant des effets secondaires cardiotoxique étant une thérapie anticancéreuse.

8. Ensemble de composants comprenant:
(a) un composé choisi dans le groupe constitué de SG6163F, LOPA87, VP331 et leurs analogues; et (b) un agent thérapeutique utile pour traiter un patient, ledit agent induisant toutefois des effets secondaires cardiotoxiques;
dans lequel le cornposant (a) est utilisé pour son effet cardioprotecteur contre les effets secondaires cardiotoxiques du composant (b).

9. Ensemble de composants selon la revendication 8, dans lequel les composants (a) et (b) sont appropriés à une administration séquentielle, séparée et/ou simultanée.

10. Ensemble de composants selon la revendication 8 ou 9, pour son utilisation dans s le cadre du traitement d'un cancer, le composant (b) étant un agent anticancéreux chimiothérapeutique ou immunothérapeutique, et le composant (a) étant utilisé
pour son effet cardioprotecteur contre les effets secondaires cardiotoxiques du composant (b).
io 11. Méthode de criblage de composés de posséder une activité
cardioprotectrice, ladite méthode comprenant les étapes suivantes:
a) la culture de cellules cardiaques dans un milieu de culture contenant un composé
test;
b) la culture des cellules cardiaques dans un milieu de culture contenant un inducteur 15 de mort cellulaire; et c) la mesure de la viabilité des cellules.