CA3045080A1

CA3045080A1 - Facteur de croissance placentaire pour le traitement des troubles causes par l'alcoolisation foetale (tcaf)

Info

Publication number: CA3045080A1
Application number: CA3045080A
Authority: CA
Inventors: Bruno Jose Gonzalez; Stephane Marret; Matthieu Jean Alexandre LECUYER; Annie Laquerriere; Soumeya BEKRI; Celine Lesueur; Sylvie Marguerite Alberte JEGOU; Pascale Yvonne Josephine Marcorelles
Original assignee: Universite de Rouen; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Centre Hospitalier Universitaire de Rouen
Current assignee: Universite de Rouen; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Centre Hospitalier Universitaire de Rouen
Priority date: 2016-12-01
Filing date: 2017-12-01
Publication date: 2018-06-07
Also published as: AU2017367175A1; US20190351018A1; FR3059550B1; FR3059550A1; CN110225761A; EP3548060A1; JP2020503275A; BR112019011141A2; WO2018100143A1; KR20190109398A

Abstract

La présente invention concerne un facteur de croissance placentaire (PlGF) en tant que médicament pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des troubles causés par l'alcoolisation ftale (TCAF) choisis dans le groupe comprenant le syndrome d'alcoolisation ftale (SAF), l'atteinte vasculaire cérébrale et l'hypotrophie d'un sujet ayant été exposé à l'alcool in utero. La présente invention concerne également une composition pharmaceutique ou un produit comprenant le PlGF pour ces mêmes applications thérapeutiques.

Description

FACTEUR DE CROISSANCE PLACENTAIRE POUR LE TRAITEMENT
DES TROUBLES CAUSES PAR L'ALCOOLISATION FOETALE (TCAF) INTRODUCTION
L'alcool est un tératogène responsable d'atteintes physiques et connportemenfales. Chez l'Homme, l'exposition prénatale à l'alcool peut conduire à des altérations du développement .. cérébral. Ainsi, la consommation d'alcool au cours de la grossesse (alcoolisation foetale) constitue la première cause de handicap et notamment de retard mental d'origine non génétique au monde et également en France.
Les dommages varient selon la période où le foetus a été exposé, tes taux d'alcoolémie, les facteurs génétiques et environnementaux, le mode de consommation (chronique, binge drinking).
Le Syndrome d'Alcoolisation Foetale (SAF) constitue la manifestation la plus extrême et invalidante des troubles causés par l'alcoolisation foetale (TCAF). Son incidence est estimée en France à 1,5 % des naissances. Le SAF associe des anomalies physiques comme une hypotrophie (retard de croissance), une dysmorphie cranio-faciale et des anomalies neurocomportementales se traduisant par des troubles des fonctions cognitives (troubles de l'attention, dé la motricité, 'de l'apprentissage ou encore de la mémorisation). Des séquelles neurologiques sont également présentes chez les enfants TCAF dont l'incidence est estimée en France à près de 1% des naissances.
L'angiogenèse cérébrale est concomitante avec le processus de neurogenèse et contribue au bon développement cérébral en assurant aux cellules nerveuses un apport en nutriments, en oxygène et en facteurs trophiques. En particulier, l'angiogenèse cérébrale constitue un prérequis au bon développement du réseau neuronal. De plus, il a été récemment démontré un impact direct des vaisseaux cérébraux sur le processus de migration de populations neuronales et des oligodendrocytes. Il a également été établi précédemment par les inventeurs que .. l'alcoolisation in utero perturbe l'angiogenèse cérébrale et que cet effet concourt aux anomalies cérébrales de l'alcoolisation.
Cibler les anomalies vasculaires de l'exposition in utero à l'alcool apparaît donc comme une stratégie thérapeutique afin de réduire les atteintes neurodéveloppementales de l'alcool et corriger les fonctions cérébrales altérées. En effet, la prise en charge actuelle des enfants TCAF
vise, par une stimulation des fonctions motrices et cognitives, à réduire les troubles du langage, de l'apprentissage ou encore de l'attention qui sont diagnostiqués tardivement souvent entre 4 et 5 ans avec la scolarisation. Les résultats obtenus par un tel suivi sont limités et les troubles FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) de l'alcoolisation in utero vont impacter à long terme sur l'intégration sociale et professionnelle de ces futurs adultes. Il n'existe à ce jour aucun traitement à visée curative des effets neurodéveloppemen taux de l'alcool chez les enfants TCAF.
Il existe donc un besoin visant à développer une nouvelle thérapeutique des troubles liés à
l'alcoolisation in utero destinée à traiter en particulier une vascularisation cérébrale anormale, d'améliorer l'angiogenèse cérébrale ou encore les troubles du développement qui y sont associés.
DESCRIPTION
Les inventeurs ont précédemment démontré que le dosage placentaire du facteur de croissance placentaire (PIGE) permet d'identifier, parmi les enfants exposés in utero à
l'alcool, ceux qui ont subi des atteintes cérébrales. Ces enfants présentent notamment une diminution des taux de PIGE placentaire qui correspond à une angiogenèse cérébrale altérée.
Par la suite, dans un modèle pré-clinique d'alcoolisation in utero, les inventeurs ont découvert qu'une supplémentation en PIGE placentaire corrige l'action de l'alcool sur des paramètres morphométriques et anatomiques indicateurs de la croissance foetale tels que la taille du corps et de la tête à la naissance. De plus, les inventeurs ont démontré que l'augmentation de la quantité de PIGE permet de réduire fortement l'effet délétère de l'alcool sur la vascularisation cérébrale du foetus. Elle permet notamment d'améliorer l'angiogenèse cérébrale et de corriger la désorganisation des microvaisseaux induite par l'alcool.
Le facteur de croissance foetal (PIGE) a été décrit dans l'art antérieur comme une cible pour le traitement des maladies cardiovasculaires, des rétinopathies, des maladies cutanées ou encore de cancers (Lu et al., Discov Med, 2016 21:349-61, Aprile et al., Crit Rev Oncol Hematol, 2015 95:165-78 et Shibuya, Endocr Metab Immune Disord Drug Targets, 2015, 15:135-44). Plus spécifiquement, le PIGE a été décrit dans le traitement de rétinopathies chez l'adulte (US2015013359) et chez l'enfant (Hard et al., Fondation Act Paediatrica 2011 100, pp. 1063-1065). Néanmoins, aucune étude ne suggère l'effet thérapeutique de PIGE dans le traitement des troubles causés par l'alcoolisation foetale (TCAF). En outre, des traitements permettant de corriger l'effet néfaste de l'alcool sur la vascularisation cérébrale et la croissance d'un sujet ayant été exposé in utero à l'alcool n'ont pas été mis en évidence. La présente invention ouvre ainsi une nouvelle voie dans la prévention et/ou le traitement des TCAF et en particulier, dans la prévention et/ou le traitement des troubles neurologiques (tels que l'hyperactivité, perte de

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3 l'attention, dépression, anxiété, troubles émotionnels, irritabilité
excessive, problèmes comportementaux, etc.) dus à des migrations neuronales et oligodendrocytaires vasculo-dépendantes anormales au niveau cérébral ou des troubles de croissance (hypotrophie) suite à
la consommation d'alcool pendant la grossesse.
Dans un premier aspect, la présente invention concerne ainsi un facteur de croissance placentaire (PIGE) pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des troubles causés par l'alcoolisation foetale (TCAF) chez un sujet ayant été exposé à
l'alcool in utero.
On entend par PIGE ou Placental growth factor ou facteur de croissance placentaire (tous ces termes sont synonymes) une protéine de la famille des facteurs de croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF). Plus particulièrement, PIGE au sens de l'invention est une protéine de 149 acides aminés hautement similaire à VEGF-A qui est reconnue par le même récepteur que ce dernier, le VEGE-R1, mais qui n'est pas reconnue par le récepteur VEGF-R2.
PIGE est fortement exprimé par le placenta, mais pas par le foetus et en particulier par le cerveau foetal. PIGE glycosylé en N-terminal est sécrété et fonctionne en dimère pour contrôler l'angiogenèse. Le terme PIGE se réfère notamment à l'ensemble des 4 isoformes NUI -4:
PIGE-1 et PIGE-3 sont des isoformes qui ne lient pas l'héparine tandis que PIGE-2 et PIGE-4 contiennent des domaines supplémentaires qui permettent de fixer l'héparine.
Encore plus préférentiellement, on entend par PIGE une protéine humaine dont la séquence est choisie parmi l'une quelconque des isoformes identifiées par les numéros d'accession Uniprot P49763-2 (PIGE-1 dont la séquences d'acides aminés correspond à la SEQ ID NO :1) ;
P49763-3 (PIGE-2 dont la séquences d'acides aminés correspond à la SEQ ID NO :2) ; P49763-1 (PIGE-3 dont la séquences d'acides aminés correspond à la SEQ ID NO :3) ; P49763-4 (PIGE-4 dont la séquences d'acides aminés correspond à la SEQ ID NO :4) présentées dans le listage de séquences annexé
à la présente demande.
Selon un mode de réalisation de la présente invention, du PIGE recombinant ou des analogues protéiques du PIGE humain peuvent être également utilisés dans la prévention et/ou le traitement d'un TCAF.
Particulièrement, le PIGE de la présente invention est obtenu, en utilisant un système de production de protéine recombinante procaryote ou eucaryote, notamment en i) cultivant un microorganisme ou des cellules eucaryotes transformé(es) à l'aide d'une séquence nucléotidique codant le PIGE humain (numéro d'accession NCBI du gène 5228; numéro d'accession des transcrits NM_002632.5 (SEQ ID NO :5), NM001207012.1 (SEQ ID NO :6), NM_001293643.1 (SEQ

ID NO :7)) et ii) isolant la protéine produite par ledit microorganisme ou lesdites cellules eucaryotes. Cette technique est bien connue de l'homme du métier. Pour plus de détails la concernant, on pourra se référer à l'ouvrage ci-après : Recombinant DNA
Technology I, Editors Ales Prokop, Raskesh K Bajpai ; Annals of the New-York Academy of Sciences, Volume 646, 1991.
La protéine PIGE est de préférence purifiée / isolée à partir de lysats de cellules et/ou de surnageants de cellules par lesquelles elle est exprimée et/ou sécrétée. Cette purification peut se faire par tout moyen connu de l'homme du métier. De nombreuses techniques de purification sont décrites dans Voet D et Voet JG, Techniques de purification des protéines et des acides nucléiques.
Les systèmes de production de protéine recombinante utilisent des vecteurs nucléotidiques comprenant des acides nucléiques codant les polypeptides à synthétiser, qui sont introduits dans des cellules hôtes qui produisent lesdits polypeptides (pour plus de détails, se référer à
Recombinant DNA Technology I , Editors Ales Prokop, Raskesh K Bajpai ; Annals of the New-York Academy of Sciences, Volume 646, 1991).
.. De nombreux vecteurs dans lesquels on peut insérer une molécule d'acide nucléique d'intérêt afin de l'introduire et de la maintenir dans une cellule hôte eucaryote ou procaryote, sont connus; le choix d'un vecteur approprié dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d'intérêt, expression de cette séquence, maintien de cette séquence sous forme extrachromosomique ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte (par exemple, les plasmides sont de préférence introduits dans des cellules bactériennes, tandis que les YACs sont de préférence utilisés dans des levures). Ces vecteurs d'expression peuvent être des plasmides, des YACs, des cosmides, des rétrovirus, des épisomes dérivés d'EBV, et tous les vecteurs que l'homme du métier peut juger appropriés à l'expression desdites chaînes.
Les vecteurs selon l'invention comprennent l'acide nucléique codant le PIGE, ou une séquence similaire, ainsi que les moyens nécessaires à son expression. On entend par moyen nécessaire à l'expression d'un peptide , le terme peptide étant utilisé pour toute molécule peptidique, telle que protéine, polyprotéine, polypeptide, etc., tout moyen qui permet d'obtenir le peptide, tel que notamment un promoteur, un terminateur de transcription, une origine de réplication et de préférence un marqueur de sélection. Les moyens nécessaires à
l'expression d'un peptide sont liés de façon opérationnelle à la séquence d'acides nucléiques codant pour le fragment polypeptidique de l'invention. Par liés de façon opérationnelle , on entend une juxtaposition

4 desdits éléments nécessaires à l'expression du gène codant pour le fragment polypeptidique de l'invention, lesquels sont en une relation telle que cela leur permet de fonctionner de façon attendue. Par exemple, il peut exister des bases supplémentaires entre le promoteur et le gène codant le fragment polypeptidique de l'invention tant que leur relation fonctionnelle est préservée. Les moyens nécessaires à l'expression d'un peptide peuvent être des moyens homologues, c'est-à-dire naturellement compris dans le génome du vecteur utilisé, ou bien être hétérologues, c'est-à-dire rajouté de façon artificielle à partir d'un autre vecteur et/ou organisme. Dans ce dernier cas, lesdits moyens sont clonés avec le fragment polypeptidique à
exprimer. Des exemples de promoteurs hétérologues comprennent les promoteurs viraux tels que le promoteur SV40 (Virus simien 40), le promoteur du gène de la thymidine-kinase du virus simplex de l'Herpès (TK-HSV-1), le LTR du virus du sarcome de Rous (RSV), le promoteur premier immédiat du cytomégalovirus (CMV) et le promoteur dernier majeur adénoviral (MLP), ainsi que tout promoteur cellulaire qui contrôle la transcription des gènes codant pour des peptides chez des eucaryotes supérieurs, tel que le promoteur du gène de phosphoglycérate-kinase (PGK) constitutif (Adra et al., Gene Volume 60, Issue 1, 1987, Pages 65-74), le promoteur des gènes spécifiques du foie alpha1-antitrypsine et FIX et le promoteur SM22 spécifique des cellules du muscle lisse (Moessler et al., Development 1996 Aug;122(8):2415-25). Les méthodes de suppression et d'insertion de séquences d'ADN dans des vecteurs d'expression sont largement connues de l'homme du métier et consistent notamment en des étapes de digestion enzymatique et ligature. Les vecteurs de l'invention peuvent également comprendre des séquences nécessaires au ciblage des peptides vers des compartiments cellulaires particuliers. Un exemple de ciblage peut être le ciblage vers le réticulum endoplasmique obtenu en utilisant des séquences d'adressage du type de la séquence leader issue de la protéine E3 de l'adénovirus (Ciernik I. F., et al., The Journal of Immunology, vol. 162, 1999, pages 3915 -3925).
Le terme terminateur de transcription désigne ici une séquence du génome qui marque la fin de la transcription d'un gène ou d'un opéron, en ARN messager. Le mécanisme de terminaison de la transcription est différent chez les procaryotes et chez les eucaryotes.
L'homme du métier connait les signaux à utiliser en fonction des différents types cellulaires.
Par exemple, si la cellule dans laquelle le vecteur va être introduit est une bactérie, il utilisera un terminateur Rho-indépendant (séquence répétée inversée suivie d'une série de T (uraciles sur l'ARN transcrit) ou un terminateur Rho-dépendant (constitué d'une séquence consensus reconnue par la protéine Rho).

5 Le terme origine de réplication (aussi appelée oh) est une séquence unique d'ADN
permettant l'initiation de la réplication. C'est à partir de cette séquence que débute une réplication unidirectionnelle ou bidirectionnelle. L'homme du métier sait que la structure de l'origine de réplication varie d'une espèce à l'autre ; elle est donc spécifique d'une espèce bien qu'elle ait certaines caractéristiques communes entre espèces. Un complexe protéique se forme au niveau de cette séquence et permet l'ouverture de l'ADN et le démarrage de la réplication.
Les vecteurs comprenant la séquence génétique codant PIGE sont préparés par des méthodes couramment utilisées par l'homme du métier. Les clones résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standards connues de l'homme du métier pour introduire des polynucléotides dans une cellule hôte. De telles méthodes peuvent être la transformation à l'aide de dextrane, la précipitation par du phosphate de calcium, la transfection à l'aide de polybrène, la fusion de protoplastes, l'électroporation, l'encapsulation des polynucléotides dans des liposomes, l'injection biolistique et la micro-injection directe d'ADN
dans le noyau. On peut également associer ladite séquence (isolée ou insérée dans un vecteur plasmidique) avec une substance lui permettant de franchir la membrane des cellules hôtes, telle qu'un transporteur comme un nanotransporteur ou une préparation de liposomes, ou de polymères cationiques. En outre, on peut avantageusement combiner ces méthodes, par exemple en utilisant l'électroporation associée à des liposomes.
A titre d'exemples de microorganismes qui conviennent aux fins de l'invention, on peut citer les levures (Buckholz RG, Current Opinion in Biotechnology vol. 4, no. 5, 1993, pages 538 - 42) et les bactéries (Olins et Lee, Current Opinion in Biotechnology vol. 4, no. 5, 1993, pages 520 -5). A titre d'exemples de cellules eucaryotes, on peut citer les cellules provenant d'animaux tels que les mammifères (Edwards CP et Aruffo A, Current Opinion in Biotechnology vol. 4, no. 5, 1993, pages 558 - 63), les reptiles, et équivalent. On peut également utiliser les cellules de plantes. Parmi les cellules de mammifère, on peut notamment utiliser les cellules d'ovaire de hamster chinois (CHO), du singe (cellules COS et Vero), du rein de hamster nain (cellules BHK), du rein de cochon (cellules PK 15) et du rein de lapin (cellules RK13, les lignées cellulaires humaines de l'ostéosarcome (cellules 143 B), les lignées cellulaires humaines HeLa et les lignées cellulaires humaines de l'hépatome (du type cellules Hep G2). Il est également possible d'utiliser des cellules d'insectes dans lesquelles on peut utiliser des procédés mettant en uvre des baculovirus par exemple (Luckow VA, Journal of Virology vol. 67, no. 8, 1993, pages 4566 - 79).
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la cellule hôte utilisée pour produire le fragment de l'invention est une bactérie, de préférence la bactérie E. coli.

6 L'homme du métier connait les conditions dans lesquelles cultiver ces cellules, ainsi que les conditions expérimentales nécessaires à l'expression des fragments polypeptidiques par ces cellules.
Le procédé de production de PIGE recombinant peut comprendre les étapes suivantes :
a) la culture dans un milieu et conditions de culture appropriés d'une cellule hôte comprenant le vecteur codant pour PIGE ; et b) l'isolement du PIGE produit à l'étape a).
Le PIGE peut être isolé (purifié) à partir de la cellule l'exprimant. Dans ce cas, une étape préalable de lyse desdites cellules pourra être nécessaire.
Les milieux et conditions de culture associées à chaque type cellulaire utilisé pour la production de protéines recombinantes sont bien connus de l'homme du métier.
L'isolement (ou la purification) de PIGE peut se faire par tout moyen connu de l'homme du métier. On citera par exemple la précipitation différentielle ou l'ultracentrifugation. Il peut être également avantageux de purifier le PIGE par chromatographie d'échange ionique, par chromatographie d'affinité, par tamisage moléculaire, ou par isofocalisation.
Toutes ces techniques sont décrites dans Voet D et Voet JG, Techniques de purification des protéines et des acides nucléiques, chapitre 6, Biochimie, 2nde édition.
Plus précisément, dans une première étape, le matériel dont on veut extraire la protéine (tissu animal ou végétal, bactéries, etc) est généralement broyé. Divers appareils ("Waring Blender", appareil Potter-Eveljhem, "Polytron", etc) peuvent être employés à cette fin.
Cette homogénéisation se fait dans un tampon de composition appropriée, bien connue de l'homme du métier. L'homogénat ainsi obtenu est ensuite clarifié, le plus souvent par centrifugation, pour éliminer les grosses particules peu ou mal broyées ou encore pour obtenir la fraction cellulaire contenant la protéine recherchée. Si la protéine est justement dans un compartiment cellulaire, on utilise généralement un détergent doux (Triton X-100, Tween 20, Désoxycholate de sodium, etc) pour la libérer en dissolvant les membranes de ce compartiment. L'emploi de détergent doit souvent être fait de façon contrôlée car ils peuvent briser les lysosomes, ce qui libère des enzymes hydrolytiques (protéases, nucléases, etc.) qui peuvent attaquer et détruire les protéines ou autres molécules qu'on veut isoler. Des précautions particulières doivent être prises si on travaille avec des protéines sensibles à la dégradation ou peu nombreuses. Une

7 solution fréquente à ce problème est l'inclusion dans les solutions d'inhibiteurs de protéases qui sont physiologiques (inhibiteurs de trypsine, antipaïne, leupeptine, etc) ou artificiels (E64, PMSF, etc). Ensuite diverses techniques existent pour isoler la protéine recherchée.
Une des méthodes se prêtant le mieux à de gros volumes est la précipitation différentielle au sulfate d'ammonium. Les chromatographies d'échange ionique ou les chromatographies d'affinité, applicables aussi à de gros volumes d'échantillon mais ayant un assez bon pouvoir de séparation, constituent de bonnes méthodes intermédiaires. Pour finaliser la purification, le tamisage moléculaire ou l'isofocalisation sont souvent utilisés. Ces techniques permettent de raffiner la pureté, mais nécessitent de très petits volumes de protéines concentrées. Il est souvent avantageux, entre ces étapes, d'éliminer les sels ou produits utilisés dans ces chromatographies. Ceci peut être obtenu par dialyse ou par ultrafiltration.
Il peut aussi être avantageux d'utiliser un vecteur portant une séquence permettant d'identifier le PIGE de l'invention. De plus, il peut être avantageux de faciliter la sécrétion dans un système procaryote ou eucaryote. En effet, dans ce cas, la protéine recombinante d'intérêt sera présente dans le surnageant de la culture cellulaire plutôt qu'a l'intérieur des cellules hôtes.
Le PIGE peut être produit à des taux atteignant au moins lmg par litre, de préférence 2 mg par litre, de manière encore plus préférée, 5mg par litre de culture cellulaire.
De manière alternative, il est possible de préparer le PIGE par synthèse chimique. L'homme du métier connaît les procédés de synthèse chimique, par exemple les techniques mettant en uvre des phases solides ou utilisant des phases solides partielles, par condensation de la protéine ou par une synthèse en solution classique. Les fragments de l'invention peuvent par exemple être synthétisés par les techniques de la chimie de synthèse, telles que la synthèse de type Merrifield qui est avantageuse pour des raisons de pureté, de spécificité
antigénique, d'absence de produits secondaires non désirés et pour sa facilité de production. Cette synthèse chimique peut être couplée à une approche de génie génétique ou par génie génétique seul en utilisant les techniques bien connues de l'homme du métier et décrites par exemple dans Sambrook J. et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 1989. Les réactifs et produits de départ sont commercialement disponibles, ou peuvent être synthétisés par des techniques conventionnelles bien connues (voir par exemple, WO 00/12508, WO 2005/085260).
En particulier des analogues de PIGE peuvent être synthétisés en utilisant la technique décrite par Zheng et al. (Acta Ophthalmologica 2012 90(7) : e512 - e523).

8 Comme indiqué précédemment, la présente invention a pour objet un PIGE pour son utilisation dans la prévention et le traitement des TCAF. On entend par Troubles Causés par l'Alcoolisation Foetale (TCAF) l'ensemble des troubles chez l'enfant résultant de l'exposition à l'alcool durant la gestation. Ce terme comprend entre autres l'ensemble des troubles comportementaux qui vont se révéler progressivement avec l'âge. Les enfants présentant ces troubles sont appelés des enfants TCAF. Dans leur version la plus sévère, les TCAF
correspondent au syndrome d'alcoolisation foetale (SAF). Celui-ci se traduit par une dysmorphie craniofaciale (comprenant des fentes palpébrales raccourcies, un sillon naso-labial lisse, allongé, effacé et une lèvre supérieure mince) ; un retard de croissance non spécifique (taille ou poids ou périmètre crânien) prénatal ou postnatal ou les deux ; des malformations diversement associées (cardiopathies, malformations uro-génitales, malformations digestives ou troubles de l'architecture cérébrale) et des troubles du développement neurologique s'exprimant parfois par un retard mental et plus souvent par des difficultés d'apprentissage.
Les enfants atteints de SAF sont appelés des enfants SAF .
La majorité des enfants TCAF présente des troubles d'inadaptation et du comportement qui se révèlent progressivement avec l'âge (comprenant des difficultés d'allaitement et d'alimentation, des troubles du sommeil puis, à l'âge scolaire, des anomalies du comportement, des troubles cognitifs retentissant sur l'apprentissage, des déficits intellectuels avec un QI
abaissé de 20 points (1 à 2 écarts type), des difficultés d'apprentissage de la lecture (dyslexie) et plus encore du calcul (dyscalculie), des troubles de l'attention accompagnés d'hyperactivité
ou d'hypercinésie. Ils sont connus sous le nom de Syndrome Déficitaire de l'Attention avec hyper kinésie (SDAH) (ou Attention Deficit Hyperactivity Desorder (ADHD) en anglais). Le terme TCAF
est parfois substitué par le terme TSAF (Troubles du Spectre de l'Alcoolisation Foetale) correspondant (ou Fetal Alcohol Spectrum Discorder (FASD) en anglais). Une définition complète des TCAF est donnée dans le Rapport de l'Académie Nationale Française de Médecine relatif à
l'alcoolisation foetale (adopté le 22 mars 2016).
Les inventeurs ont précédemment montré que l'exposition à l'alcool cause des atteintes vasculaires cérébrales. Par atteinte vasculaire cérébrale , on entend ici toute altération du système vasculaire cérébral, notamment une altération entrainant un fonctionnement altéré, voire défectueux dudit système. Une atteinte vasculaire cérébrale dans le contexte de l'invention peut notamment être une désorganisation du système vasculaire cérébral. Plus particulièrement, l'alcoolisation foetale induit une orientation aléatoire des vaisseaux cérébraux. Selon un mode de réalisation particulier, le trouble de l'alcoolisation foetale est lié

9 à une atteinte vasculaire cérébrale. Encore plus particulièrement, ledit trouble de l'alcoolisation foetale est lié à une désorganisation du système vasculaire cérébral.
Les inventeurs ont également démontré par leurs travaux précédents que l'alcoolisation foetale provoque une défaillance dans l'angiogenèse cérébrale. L'angiogenèse cérébrale est le processus de formation de vaisseaux sanguins dans le cerveau.
Selon un mode de réalisation de la présente invention, le PIGE est utilisé
pour stimuler l'angiogenèse cérébrale et ainsi améliorer le fonctionnement cérébral.
Selon encore un autre mode de réalisation de l'invention, le PIGE peut être utilisé pour prévenir et/ou traiter au moins un TCAF choisi parmi un quelconque des troubles de l'inadaptation et du comportement cités ci-dessus. Le PIGE peut aussi être utilisé pour prévenir et/ou traiter le syndrome d'alcoolisation foetale (SAF), notamment lorsque le SAF se manifeste sous forme d'une hypotrophie.
Dans le contexte de la présente invention, le terme Syndrome d'Alcoolisation Foetale (SAF) désigne la manifestation la plus extrême et invalidante des troubles causés par l'alcoolisation foetale (TCAF). Elle associe des anomalies physiques comme une hypotrophie (retard de croissance), une dysmorphie cranio-faciale et des anomalies neurocomportementales se traduisant par des troubles des fonctions cognitives (troubles de l'attention, de la motricité, de l'apprentissage ou encore de la mémorisation). On parle de SAF partiel lorsque l'enfant ne présente qu'une partie des symptômes SAF. Les enfants SAF partiels présentent toutefois toujours une ou des anomalies neurocomportementales.
Dans le contexte de l'invention, un enfant SAF, en particulier un nouveau-né, est considéré
comme "hypotrophique" si son poids et sa taille sont en dessous du 10e percentile des courbes de référence. C'est souvent le cas des nouveau-nés prématurés et des nouveau-nés exposés in utero à l'alcool. L'hypotrophie peut aussi être diagnostiquée avant terme, par échographie : on parle alors d'hypotrophie foetale ou de retard de croissance intra-utérin.
Les inventeurs ont en outre démontré que l'augmentation de la quantité de PIGE
permet d'augmenter la taille du corps entier d'un foetus ou de l'une ou plusieurs de ses parties, en particulier la taille du crâne, la taille du corps, la taille d'abdomen et sa profondeur. Cela permet ainsi le rétablissement partiel ou complet de l'aspect morphométrique normal.
L'administration de PIGE permet donc de compenser l'hypotrophie des sujets SAF
qui représentent les formes les plus graves de TCAF.

Selon un autre mode de réalisation, la présente invention concerne ainsi un PIGE pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement du SAF, notamment lorsque le SAF se manifeste sous forme d'une hypotrophie due à l'exposition intra-utérine à
l'alcool. En particulier, il s'agit d'une hypotrophie du corps entier d'un sujet ou de l'une ou plusieurs de ses parties choisies parmi le torse (ou encore appelé le corps), l'abdomen et le crâne. En particulier le sujet est un foetus ou un enfant, en particulier un prématuré.
Selon un mode de réalisation de la présente invention le sujet ayant été
exposé in utero à
l'alcool est choisi parmi un embryon, un foetus ou un enfant, de préférence un foetus ou un enfant, en particulier, un enfant prématuré.
La période entre la 30ème semaine gestationnelle et le terme de la grossesse est celle pendant laquelle l'angiogenèse cérébrale est la plus importante. Il est ainsi particulièrement préféré
d'administrer le PIGE à un foetus exposé in utero à l'alcool à cette période précisément.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, lorsque le sujet TCAF
est un enfant prématuré, le traitement consistera à supplémenter en PIGE ce sujet sur la période ex utero correspondante aux semaines de vie intra-utérines perdues. De préférence, la fenêtre de traitement peut s'étendre de la 30ème semaine gestationnelle au terme théorique (40 semaines gestationnelles), période durant laquelle l'angiogenèse cérébrale chez l'Homme est particulièrement intense.
On entend par sujet selon l'invention un humain, et de préférence un embryon, un foetus ou un enfant. Un embryon , tel qu'on l'entend ici, correspond à un ovocyte fécondé de moins de trois mois. Par foetus , on entend ici un individu pris avant la naissance et dont l'âge gestationnel est compris entre 3 et 9 mois. Après l'accouchement, le sujet devient un enfant.
Par enfant , on entend selon l'invention un individu dont l'âge est inférieur à 3 ans. Sont ainsi compris dans la catégorie des enfants selon l'invention, les nouveau-nés, dont l'âge est compris entre 0 et 1 mois, les nourrissons, qui ont entre 1 mois et 2 ans, et les enfants proprement dits, qui sont âgés d'au moins 2 ans. Un nouveau-né , comme on l'entend ici, peut aussi bien être né à terme qu'être prématuré. Dans le contexte de la présente demande le terme prématuré désigne un enfant né vivant avant 37 semaines d'aménorrhée. Ce terme recouvre trois sous-catégories : la prématurité extrême (<28 semaines); la grande prématurité
(entre la 28e et la 32e semaine); la prématurité moyenne, voire tardive (entre la 32e et la 37e semaine). Dans la présente invention les enfants prématurés traités par PIGE
sont de préférence dans la catégorie de prématurité moyenne, voire tardive.
L'expression un sujet avec des troubles d'alcoolisation foetale ou sujet TCAF telle qu'utilisée ici se rapporte à un embryon, un foetus ou un sujet, en particulier humain, qui est exposé ou susceptible d'être exposé à l'alcool in utero et qui souffre de troubles d'alcoolisation foetale ou qui est en danger de développer en raison de la consommation maternelle d'alcool une des conditions liées aux troubles d'alcoolisation foetale, y compris les effets décrits ci-dessus. En particulier, un sujet TCAF peut avoir une taille du corps entier ou de ses parties inférieure à la normale et un réseau vasculaire cérébral désorganisé, ladite désorganisation étant notamment liée à une orientation aléatoire des vaisseaux cérébraux.
Lorsqu'un sujet TCAF
est atteint en particulier par un SAF, on parle dans ce cas d'un sujet SAF
.
Par traitement , on entend ici toute action permettant de diminuer ou d'éradiquer les symptômes ou les causes des TCAF. Un traitement au sens de l'invention peut comprendre l'administration de PIGE, d'une composition pharmaceutique ou d'un produit le comprenant avec ou sans un suivi psychothérapeutique.
Par prévention , on entend ici toute action permettant de prévenir complétement ou partiellement le risque d'apparition des symptômes ou les causes des TCAF. Une prévention au sens de la présente invention comprend l'administration de PIGE, d'une composition pharmaceutique, à un sujet exposé in utero à l'alcool ou à un sujet ayant été
exposé in utero à l'alcool mais pour lequel les symptômes de TCAF ne sont pas encore apparus et l'angiogenèse cérébrale toujours en cours. Les inventeurs mettent à profit le fait que le PIGE est un facteur angiogénique naturellement présent à ces stades du développement foetal chez un sujet sain ce qui présente l'avantage d'une utilisation aisée de PIGE par compensation dans la prévention de TCAF.
Selon un mode de réalisation de la présente invention, le facteur de croissance placentaire est administré en une quantité thérapeutiquement efficace à un sujet ayant été
exposé à l'alcool in utero.
Dans le contexte de l'invention, une quantité thérapeutiquement efficace signifie une quantité suffisante pour influencer le cours thérapeutique d'un état pathologique particulier.
Une quantité thérapeutiquement efficace est également celle à laquelle tous les effets toxiques ou secondaires de l'agent sont compensés par les effets thérapeutiquement bénéfiques du principe actif utilisé.
Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, le facteur de croissance placentaire (PIGE) est administré in utero et/ou ex utero. Il est ainsi envisageable de débuter un traitement .. (ou une prévention) par l'administration de PIGE durant la période intra-utérine et de le continuer après l'accouchement notamment lorsque l'enfant est né prématurément et qu'il perd par conséquent l'apport physiologique du PIGE placentaire.
De préférence, le PIGE sera administré seul ou dans une composition pharmaceutique par voie systémique, en particulier par voie intraveineuse, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale, sous-cutanée, ou orale. De manière plus préférée, le PIGE
sera administré à
plusieurs reprises, de manière étalée dans le temps.
En particulier, lorsque l'administration de PIGE est effectuée in utero, celle-ci a lieu de préférence directement au niveau placentaire afin d'atteindre plus rapidement le cerveau foetal et éviter la dégradation de la protéine par l'organisme maternel.
Lorsque l'administration de PIGE a lieu après la naissance, de préférence, celui-ci est administré
par voie parentérale, de préférence intraveineuse surtout s'il s'agit d'un enfant prématuré ou d'un nouveau-né.
Les modes d'administration, posologies et formes galéniques optimaux peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement adapté à
un patient comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité
de son état général, la tolérance au traitement et les effets secondaires constatés.
Lorsque le PIGE est administré sous forme de compositions pharmaceutiques, pour l'administration sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, transdermique locale, le PIGE
peut être administré sous formes unitaires d'administration, en mélange avec des supports pharmaceutiques classiques au sujet en ayant besoin. Les formes unitaires d'administration appropriées comprennent les formes par voie intramusculaire, intraveineuse.
Comme indiqué ci-dessus, le choix de la voix d'administration la plus appropriée dépendra du moment où cette administration sera effectuée. En particulier, lorsque l'administration d'une composition cosmétique comprenant PIGE est effectuée in utero, celle-ci se fera par voie .. intermusculaire ou voie intraveineuse, de préférence au niveau placentaire.
L'administration de la composition pharmaceutique comprenant le PIGE à un enfant nouveau-né ou un en enfant prématuré est faite de préférence par voie intraveineuse.
Pour une administration parentérale, intranasale ou intraoculaire, on utilise des suspensions aqueuses, des solutions salines isotoniques ou des solutions stériles et injectables qui -- contiennent des agents de dispersion et/ou des agents mouillants pharmacologiquement compatibles.
Les formes pour l'administration parentérale sont obtenues de façon conventionnelle par mélange du PIGE avec des tampons, des agents stabilisants, des conservateurs, des agents solubilisants, des agents isotoniques et des agents de mise en suspension.
Conformément aux -- techniques connues, ces mélanges sont ensuite stérilisés puis conditionnés sous la forme d'injections intraveineuses.
A titre de tampon, l'homme du métier pourra utiliser des tampons à base de sels de phosphate organique. Des exemples d'agents de mise en suspension englobent le méthylcellulose, l'hydroxyéthylcellulose, l'hydroxypropylcellulose, l'acacia et la carboxyméthylcellulose sodique.
-- En outre, des stabilisants utiles selon l'invention sont le sulfite de sodium et le métasulfite de sodium, tandis que l'on peut citer le p-hydroxybenzoate de sodium, l'acide sorbique, le crésol et le chlorocrésol en tant que conservateurs.
Les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent être formulées de manière à être administrées au patient par une unique voie ou par des voies différentes.
-- La posologie dépend naturellement de la forme sous laquelle le PIGE sera administré, du mode d'administration, de l'indication thérapeutique, de l'âge du patient et de son état.
La dose à administrer est préférablement de 0,001 à 250 mg/kg de PIGE par jour, de préférence de 0,01 à 100 mg/kg de PIGE par jour, de manière plus préférée de 0,1 à 50 mg/kg de PIGE par jour et de manière encore plus préférée de 1 à 25 mg/kg de PIGE par jour.
-- La dose unitaire du PIGE comprend de préférence de 0,1 à 50 mg/kg de ce composé.
Selon un mode de réalisation de la présente invention, la dose initialement administrée du PIGE
pourra être ajustée si nécessaire au cours d'un traitement en fonction de la réponse à ce traitement du sujet traité. L'Homme du métier se basant sur ces connaissances générales et sur la présente description saura ajuster la dose de PIGE de manière à optimiser son effet thérapeutique.
Comme mentionné plus haut dans la description, le facteur de croissance placentaire (PIGE) peut être utilisé également sous la forme de principe actif dans une composition pharmaceutique.
Selon un second aspect, la présente invention concerne ainsi une composition pharmaceutique comprenant un facteur de croissance placentaire (PIGE) tel que défini ci-dessus et un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des troubles causés par l'alcoolisation foetale (TCAF).
.. La composition pharmaceutique selon la présente invention peut être utilisée dans la prévention et/ou le traitement de différents types de TCAF comme décrit pour le PIGE ci-dessous. En particulier, ces TCAF sont choisis dans le groupe comprenant les troubles d'inadaptation et du comportement ou le syndrome d'alcoolisation foetale (SAF), notamment lorsqu'il se manifeste sous forme d'une hypotrophie et l'atteinte vasculaire cérébrale due à
l'exposition à l'alcool in .. utero.
La composition de la présente invention peut être également utilisée pour améliorer l'angiogenèse cérébrale d'un sujet ayant été exposé à l'alcool in utero.
On entend par véhicule pharmaceutiquement acceptable au sens de la présente invention, toute matière qui est appropriée à une utilisation dans un produit pharmaceutique. A titre d'exemple de véhicule pharmaceutiquement acceptable, on peut citer le lactose, l'amidon éventuellement modifié, la cellulose, l'hydroxypropylméthyl cellulose, le mannitol, le sorbitol, le xylitol, le dextrose, le sulfate de calcium, le phosphate de calcium, le lactate de calcium, les dextrates, l'inositol, le carbonate de calcium, la glycine, la bentonite et leurs mélanges.
La composition pharmaceutique selon l'invention peut se présenter sous différentes formes et être administrée de différentes manières comme indiquées plus haut en détails.
Selon un mode de réalisation, la composition pharmaceutique de la présente invention comprend un PIGE en tant que principe actif en une concentration comprise entre 0.001 mg/kg et 250 mg/kg en poids par rapport au poids total du sujet auquel la composition pharmaceutique sera administrée.

Préférentiellement, la concentration de PIGE est comprise entre 0,01 mg/kg et 100 mg/kg en poids par rapport au poids du sujet auquel la composition pharmaceutique sera administrée et encore plus particulièrement, entre 0,15 mg/kg et 50 mg/kg en poids par rapport au poids du sujet auquel la composition pharmaceutique sera administrée ou encore, entre 1 mg/kg et 25 mg/kg en poids par rapport au poids total du sujet auquel la composition sera administrée.
Les inventeurs ont démontré que l'augmentation de la quantité de PIGE est particulièrement efficace dans le rétablissement de l'atteinte de la vascularisation cérébrale permettant ainsi de ramener la fonction neuronale à un état normal.
Selon un mode de réalisation de la présente invention, le PIGE ou la composition pharmaceutique le comprenant est donc utilisé pour le traitement et/ou la prévention des atteintes de la vascularisation cérébrale dues à l'exposition à l'alcool in utero.
En outre, les inventeurs ont également démontré que l'augmentation de la quantité de PIGE
permet d'augmenter la taille du corps entier d'un foetus ou l'une ou plusieurs de ses parties, en particulier la taille du crâne, la taille du corps, la taille d'abdomen et sa profondeur après une exposition à l'alcool pendant la période intra-utérine. Cela permet ainsi le rétablissement partiel ou complet de l'aspect morphométrique normal.
Selon un autre mode de réalisation, la présente invention concerne ainsi un PIGE ou une composition pharmaceutique le comprenant pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement de l'hypotrophie due à l'exposition intra-utérine à l'alcool, notamment lorsque cette hypertrophie est une manifestation du SAF. En particulier, il s'agit d'une hypotrophie du corps entier d'un sujet ou de l'une ou plusieurs de ses parties choisies parmi le torse (ou encore appelé le corps), l'abdomen et le crâne. En particulier le sujet est un sujet SAF qui est un foetus ou un nouveau-né, en particulier un prématuré.
Un quatrième aspect de l'invention a pour objet une méthode de traitement de troubles de l'alcoolisation foetale chez un sujet. Ladite méthode comprend une étape d'administration ou surexpression de PIGE ou l'administration d'une composition pharmaceutique le comprenant à
un sujet présentant des TCAF comprenant en particulier le syndrome d'alcoolisation foetale (SAF), notamment lorsqu'il se manifeste sous forme d'une hypotrophie et/ou une atteinte vasculaire cérébrale d'un sujet ayant été exposé à l'alcool in utero.
Cette méthode de traitement peut comprendre au préalable une étape de diagnostic de TCAF.

Selon un cinquième aspect la présente invention concerne le facteur de croissance placentaire (PIGE), une composition pharmaceutique ou un produit le comprenant selon l'invention pour l'utilisation dans le traitement des TCAF, ladite utilisation comprenant une étape préalable à
l'dentification du sujet, ladite identification comprenant les étapes suivantes:
a) mesure de la quantité de PIGE dans un échantillon biologique dudit sujet, de préférence provenant du placenta ou du sang du cordon ;
b) comparaison de la quantité de PIGE de l'étape a) avec une référence qui est une mesure de la quantité de PIGE dans un individu sain, et c) détermination d'un TCAF ou du risque de développer un TCAF chez ledit sujet.
On entend par échantillon biologique selon l'invention tout échantillon qui peut être prélevé
à partir d'un sujet. Alternativement, l'échantillon biologique est un échantillon provenant du placenta, notamment du cordon ombilical. En effet, le PIGE est exprimé par des cellules du placenta tout au long de la grossesse. Cela permet de doser le PIGE sans attenter à l'intégrité
du sujet, en particulier quand celui-ci est un embryon ou un foetus. De façon générale, l'échantillon biologique doit permettre la détermination du taux d'expression de PIGE.
L'échantillon à tester peut être utilisé comme obtenu directement à partir de la source biologique ou à la suite d'un prétraitement pour modifier le caractère de l'échantillon. Par exemple, un tel prétraitement peut inclure la préparation de plasma à partir de sang, la dilution de fluides visqueux et ainsi de suite. Des procédés de prétraitement peuvent aussi impliquer la .. filtration, la précipitation, la dilution, la distillation, le mélange, la concentration, l'inactivation de composants perturbateurs, l'addition des réactifs, une lyse, etc. En outre, il peut être bénéfique de modifier un échantillon d'essai solide pour former un milieu liquide ou pour libérer l'analyte.
La protéine PIGE est une protéine sécrétée (DeFalco, Exp Mol Med. 44(1): 1-9, 2012). Les échantillons biologiques préférés pour la détermination du taux d'expression de ladite protéine comprennent en particulier les échantillons de sang, de plasma, ou de lymphe.
De préférence, l'échantillon biologique est un échantillon de sang. De façon encore plus préférée, l'échantillon biologique est un échantillon de sang du placenta ou de sang de cordon. Celui-ci est en effet habituellement recueilli lors de l'accouchement. Le sang des vaisseaux placentaires peut alors être obtenu pour mesurer le taux de PIGE.

Selon un mode de réalisation, lorsque la quantité de PIGE mesurée à l'étape a) est inférieure à
la référence le sujet est déterminé comme souffrant de ou ayant un risque de développer un TCAF et en particulier une atteinte de la vascularisation cérébrale ou un SAF, notamment une hypotrophie.
Selon la présente invention, la quantité de PIGE est mesurée lorsqu'un sujet présente au moins un trouble pouvant être lié à l'exposition à l'alcool intra-utérine. La quantité de PIGE sera également mesurée lorsqu'un sujet ne présente pas un ou plusieurs troubles particuliers liés à
l'exposition d'alcool intra-utérine mais pour qui l'exposition à l'alcool pendant cette période a été avérée ou supposée. Ainsi, la mesure de la quantité de PIGE comme décrit ci-dessus permettra de confirmer ou d'infirmer un TCAF ou le risque d'en développer un avant la prise en charge thérapeutique.
Selon un mode de réalisation, la quantité de PIGE est déterminée en mesurant la quantité de transcrits codant le PIGE ou la quantité du polypeptide.
Le taux d'expression génique ou protéique peut être mesuré par de nombreuses méthodes qui sont à la disposition de l'homme du métier. Il peut y avoir plusieurs étapes intermédiaires entre le prélèvement de l'échantillon biologique et la mesure de l'expression de PIGE, lesdites étapes correspondant à l'extraction à partir dudit échantillon d'un échantillon d'ARNm (ou de l'ADNc correspondant) ou d'un échantillon de protéine. Celui-ci peut ensuite être directement utilisé
pour mesurer l'expression de PIGE. La préparation ou l'extraction d'ARNm (ainsi que la rétrotranscription de celui-ci en ADNc) ou de protéines à partir d'un échantillon cellulaire ne sont que des procédures de routine bien connues de l'homme du métier.
Une fois qu'un échantillon d'ARNm (ou d'ADNc correspondant) ou de protéine est obtenu, l'expression de PIGE, au niveau soit des ARNm (c'est-à-dire dans l'ensemble des ARNm ou des ADNc présents dans l'échantillon), soit des protéines (c'est-à-dire dans l'ensemble des protéines présentes dans l'échantillon), peut être mesurée. La méthode utilisée pour ce faire dépend alors du type de transformation (ARNm, ADNc ou protéine) et du type d'échantillon disponible.
Quand l'expression de PIGE est mesurée au niveau de l'ARNm (ou d'ADNc correspondant), n'importe quelle technologie habituellement utilisée par l'homme du métier peut être mise en uvre. Ces technologies d'analyse du niveau d'expression des gènes, comme par exemple l'analyse du transcriptome, incluent des méthodes bien connues telles que la PCR (Polymerase Chain Reaction, si on part d'ADN), la RT-PCR (Reverse Transcription-PCR, si on part d'ARN) ou la RT-PCR quantitative ou encore les puces d'acides nucléiques (dont les puces à ADN et les puces à oligonucléotides) pour un plus haut débit.
Par puces d'acides nucléiques , on entend ici plusieurs sondes d'acides nucléiques différentes qui sont attachées à un substrat, lequel peut être une micropuce, une lame de verre, ou une bille de la taille d'une microsphère. La micropuce peut être constituée de polymères, de plastiques, de résines, de polysaccharides, de silice ou d'un matériau à base de silice, de carbone, de métaux, de verre inorganique, ou de nitrocellulose.
Les sondes peuvent être des acides nucléiques tels que les ADNc ( puce à ADNc ), les ARNm ( puce à ARNm ) ou des oligonucléotides ( puce à oligonucléotides ), lesdits oligonucléotides pouvant typiquement avoir une longueur comprise entre environ 25 et 60 nucléotides.
Pour déterminer le profil d'expression d'un gène particulier, un acide nucléique correspondant à tout ou partie dudit gène est marqué, puis mis en contact avec la puce dans des conditions d'hybridation, conduisant à la formation de complexes entre ledit acide nucléique cible marqué
et les sondes attachées à la surface de la puce qui sont complémentaires de cet acide nucléique.
La présence de complexes hybridés marqués est ensuite détectée.
Ces technologies permettent de suivre le niveau d'expression d'un gène en particulier ou de plusieurs gènes voire même de tous les gènes du génome (full genome ou full transcriptome) dans un échantillon biologique (cellules, tissus ...). Ces technologies sont utilisées en routine par l'homme du métier et il n'est donc pas besoin de les détailler ici.
Alternativement, il est possible d'utiliser toute technologie actuelle ou future permettant de déterminer l'expression des gènes sur la base de la quantité d'ARNm dans l'échantillon. Par exemple, l'homme du métier peut mesurer l'expression d'un gène par hybridation avec une sonde d'acide nucléique marquée, comme par exemple par Northern blot (pour l'ARNm) ou par Southern blot (pour l'ADNc), mais aussi par des techniques telles que la méthode d'analyse sérielle de l'expression des gènes (SAGE) et ses dérivés, tels que LongSAGE, SuperSAGE, DeepSAGE, etc. Il est aussi possible d'utiliser des puces à tissu (aussi connues en tant que TMAs :
tissue microarrays ). Les tests habituellement employés avec les puces à
tissu comprennent l'immunohistochimie et l'hybridation fluorescente in situ. Pour l'analyse au niveau de l'ARNm, les puces à tissu peuvent être couplées avec l'hybridation fluorescente in situ. Enfin, il est possible d'utiliser le séquençage massif en parallèle pour déterminer la quantité d'ARNm dans l'échantillon (RNA-Seq ou Whole Transcriptome Shotgun Sequencing ). A cet effet, plusieurs méthodes de séquençage massif en parallèle sont disponibles. De telles méthodes sont décrites dans, par exemple, US 4,882,127, U.S. 4,849,077; U.S. 7,556,922; U.S.
6,723,513;
W003/066896; WO 2007/111924; US 2008/0020392; WO 2006/084132; US 2009/0186349;
US
2009/0181860; US 2009/0181385; US 2006/0275782; EP-B1-1141399; Shendure Et Ji, Nat Biotechnol., 26(10): 1135-45. 2008; Pihlak et al., Nat Biotechnol., 26(6) :
676- 684, 2008 ;
Fuller et al., Nature Biotechnol., 27(11): 1013-1023, 2009; Mardis, Genome Med., 1(4): 40, 2009; Metzker, Nature Rev. Genet., 11 (1 ): 31-46, 2010.
De préférence, l'expression du PIGE est mesurée au niveau protéique par une méthode sélectionnée parmi l'immunohistologie, l'immunoprécipitation, le western blot, le dot blot, l'ELISA ou l'ELISPOT, les puces à protéines, les puces à anticorps, ou les puces à tissu couplées à l'immunohistochimie, les techniques de FRET ou de BRET, les méthodes de microscopie ou d'histochimie, dont notamment les méthodes de microscopie confocale et de microscopie électronique, les méthodes basées sur l'utilisation d'une ou plusieurs longueurs d'onde d'excitation et d'une méthode optique adaptée, comme une méthode électrochimique (les techniques voltamétrie et d'ampérométrie), le microscope à force atomique, et les méthodes de radiofréquence, comme la spectroscopie résonance multipolaire, confocale et non-confocale, détection de fluorescence, luminescence, chemiluminescence, absorbance, réflectance, transmittance, and biréfringence ou index de réfraction (par exemple, par résonance des plasmons de surface, par ellipsométrie, par méthode de miroir résonnant, etc), cytométrie de flux, imagerie par résonance radioisotopique ou magnétique, analyse par électrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE); par spectrophotométrie HPLC-Mass, par chromatographie liquide/spectrophotométrie de masse/ spectrométrie de masse (LC-MS/MS).
Plus préférentiellement, la quantité de PIGE est déterminée par une méthode choisie parmi l'immunoprécipitation, l'immunohistologie, le western blot, le dot blot, l'ELISA ou l'ELISPOT, les puces à protéines, les puces à anticorps, ou les puces à tissu couplées à
l'immunohistochimie. Des anticorps dirigés contre PIGE sont disponibles commercialement (voir par exemple, RELD Systems, Santa Cruz, Abcam, etc.) et peuvent être utilisés dans les méthodes de l'invention. Encore plus préférablement, l'expression du PIGE est mesurée par Western Blot ou par ELISA.

En outre, la quantité de PIGE est normalisée par rapport à un marqueur témoin qui peut être un gène choisi parmi B2M, TFRC, YWHAZ, RPLO, 18S, GUSB, UBC, TBP, GAPDH, PPIA, POLR2A, ACTB, PGK1, HPRT1, IP08 et HMBS, ou un polypeptide choisi parmi le produit desdits gènes.
Le taux de PIGE ainsi mesuré est comparé par la suite à un taux d'expression de PIGE de référence afin de déterminer s'il s'agit d'un sujet TCAF.
Par un taux d'expression de PIGE de référence , on entend au sens de la présente demande tout taux d'expression dudit facteur utilisé à titre de référence. Par exemple, un taux d'expression de référence peut être obtenu en mesurant le taux d'expression de PIGE dans un échantillon biologique, par exemple un placenta ou le sang ombilical, d'un sujet sain, c'est-à-dire un sujet qui n'a pas été exposé à l'alcool in utero.
L'invention sera décrite plus précisément au moyen des exemples ci-dessous.
Lesdits exemples sont fournis ici à titre d'illustration et ne sont pas, sauf indication contraire, destinés à être limitatifs.
LÉGENDES DES FIGURES
Figure 1. Effets de l'exposition alcoolique in utero sur l'angiogénèse corticale chez les embryons E20 de Souris. A,B: Effets de l'exposition alcoolique foetale de GD15 à GD20 sur l'organisation des microvaisseaux corticaux chez des animaux témoin (A) et exposés à l'alcool (B). Les microvaisseaux du cerveau ont été visualisés par immunohistochimie contre CD31. Les flèches indiquent les microvaisseaux du cerveau présentant une orientation radiale dans le groupe Témoin . Il faut noter une perte de l'organisation radiale dans le groupe Alcool .
I-VI: Couches corticales; CC: Corpus callosum. C: Distribution de l'orientation (catégories d'angles) des microvaisseaux corticaux dans le cortex immature de foetus GD20.
L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du test x2. D: Quantification par western blot des effets de l'exposition alcoolique foetale durant la dernière semaine de gestation sur l'expression corticale de CD31 à GD20. ns vs le groupe Témoin à l'aide d'un test t non-apparié.
Figure 2. Effets de l'exposition alcoolique in utero sur l'expression des membres de la famille VEGF/PlGF chez les embryons E20 de Souris. A-E: Quantification par western blot des niveaux protéiques de VEGFA (A), PIGE (B), sVEGE-R1 (C), mVEGE-R1 (D) et VEGF-R2 dans le cortex des groupes Témoin et Alcool . F: Comparaison par western blot des niveaux protéiques de PIGE dans le cortex et le placenta des embryons E20 du groupe Témoin .
*p<0.05 ; ***p<0.001 vs le groupe Témoin à l'aide d'un test t non-apparié.

Figure 3. Effets de l'exposition alcoolique in utero sur les caractéristiques ultrastructurelles du placenta chez les souris GD20. A: Observation par marquage au violet de Cresyl de l'effet de l'exposition alcoolique sur la structure laminaire du placenta. Le côté
maternel du placenta est orienté vers le haut. L'alcool affecte la ségrégation des zones de jonction et du labyrinthe (lignes pointillées). B: Quantification par analyse d'images des effets de l'alcool sur l'épaisseur de la membrane de Reichert. C,D: Observation à faible grossissement de la couche des trophoblastes géants dans les groupes Témoin (C) et Alcool (D). Les flèches indiquent les trophoblastes géants. Ceux-ci ont une forme rectangulaire typique dans le placenta du groupe Témoin , alors que dans le groupe Alcool , ils ont une forme arrondie. E-H: Images acquises par microscopie électronique à grossissement moyen (E,F) et fort (G,H) montrant la morphologie cellulaire des trophoblastes géants et la présence de zonula occludens (flèches) dans les groupes Témoin (E,G) et Alcool (F,H). La zonula occludens (étoiles) n'est plus visible dans les animaux traités à l'alcool. Les inserts dans E et F indiquent la zone observée à plus fort grossissement en G et H, respectivement. D: maternai decidua; J: zone de jonction; L: zone du labyrinthe; Tg: couche de trophoblastes géants. ***p<0.001 vs le groupe Témoin à l'aide d'un test t non-apparié.
Figure 4. Effets de l'exposition alcoolique in utero sur l'expression des protéines participant à la barrière placentaire et au métabolisme énergétique placentaire. A,B:
Observation par immunohistochimie de la protéine ZO-1 dans la zone du labyrinthe du placenta de souris des groupes Témoin (A) et Alcool (B). La protéine ZO-1 apparait comme formant des groupes de points (flèches) dans le groupe Témoin tandis que le marquage est diffus dans le groupe Alcool . Les couches de trophoblastes ont été mises en évidence par immunoréactivité avec le transporteur de glucose Glut-1. Les noyaux ont été marqués au Hoechst. C:
Double marquage avec des anticorps contre les transporteurs de monocarboxylate MCT-1 et de glucose dans la zone du labyrinthe d'un placenta Témoin . Par contraste avec Glut-1, l'expression de MCT-1 est associée avec la couche maternelle du syncytiotrophoblaste. Les noyaux ont été marqués au Hoechst. D: Quantification par western blot des niveaux d'expression des protéines ZO-1 et MCT-1 dans les placentas des groupes Témoin et Alcool . *p<0.05, **p<0.01 vs le groupe Témoin à l'aide d'un test t non-apparié. Les analyses par Western blot ont montré que le taux de ZO-1 a diminué de façon significative dans les placentas des animaux exposés à l'alcool tandis que le taux de la protéine MCT-1 a augmenté significativement. * P
<0,05, ** p <0,01 par rapport au groupe témoin en utilisant le test t non apparié. E-H : Des essais d'immunohistochimie illustrent la distribution du VEGE-R1 (E), Glut-1 (F,G) et du PIGE (H) dans les couches de syncytiotrophoblastes du placenta de souris. Les noyaux ont été
marqués au Hoechst.
Figure 5. Effets de l'exposition alcoolique in utero sur l'expression des membres de la famille VEGF/PlGF dans des placentas murins. A-F: Quantification par western blot des effets de l'exposition à l'alcool pendant la dernière semaine de gestation sur l'expression placentaire of VEGF-A (A), PIGE (B), sVEGF-R1 (C), mVEGF-R1 (D), VEGF-R2 (E) et CD31 (F) à
GD20. G,H:
Marquage par immunohistochimie montrant la distribution de VEGF-R2 (G) dans les couches de syncytiotrophoblastes du placenta marquées avec Glut-1 (H). Les noyaux ont été
marqués au Hoechst. *p<0.05 vs le groupe Témoin à l'aide d'un test t non-apparié.
Figure 6. Diffusion du Bleu Evans et du PlGF recombinant humain injectés in utero du placenta dans le cerveau du foetus et effet de la répression placentaire du PlGF sur la vascularisation cérébrale. A,B: Visualisation au cours du temps du Bleu Evans administré par microinjection dans le placenta d'une souris gravide à GD15. La fluorescence a été détectée par illumination aux UV (A) et est représentée à l'aide d'une échelle de couleurs factices (B).
C,D: Visualisation au cours du temps de la fluorescence du Bleu Evans dans le cerveau des foetus après une microinjection placentaire à GD15. La fluorescence a été détectée par illumination aux UV (C) et est représentée à l'aide d'une échelle de couleurs factices (D).
E,F: Quantification au cours du temps par spectrophotométrie de l'absorbance à 595 nm du signal du Bleu Evans injecté dans les placentas (E) et de la suite dans les cerveaux des foetus correspondants (F). G:
Quantification par ELISA du PIGE humain dans le cerveau de foetus de souris 30 min après injection du hPIGF dans les placentas des souris gravides à GD15. *p<0.05 vs le groupe Témoin à l'aide d'un test t non-apparié. H : Microphotographie visualisant l'expression d'eGFP 48 heures après la transfection in utero de placentas de souris gravide GD15 avec un plasmide codant pour une eGFP. I,J : Triple coloration eGFP / Glut-1 / Hoechst indiquant que la fluorescence d'eGFP (I) est principalement associée à la couche trophoblastique foetale (J) marquée avec Glut-1 (têtes de flèches). La partie foetale des couches trophoblastiques est identifié par la présence de globules rouges nucléés spécifiques de la circulation foetale (flèches). K: Visualisation par Western blot de PIGE, la GFP et les protéines d'actine dans les placentas des animaux non-transfectées (sh- / GFP -), GFP-transfectées (sh- /
GFP +) et shPLGF/GFP transfectées (sh + / GFP +). L,M : Quantification par Western Blot des taux de PIGE
(L) et l'expression de GFP (M) dans les placentas des animaux non-transfectées (sh- / GFP -), GFP-transfectées (sh- / GFP +) et shPLGF/GFP transfectées (sh + / GFP +) quatre jours après la transfection. N : Quantification par transfert de Western des taux d'expression du VEGF-R1 dans le cerveau de foetus à partir des placentas non-transfectées (sh- / GFP -), GFP-transfectées (sh-/ GFP +) et shPLGF/GFP transfectées (sh + / GFP +) quatre jours post-transfection. * P <0,05 vs le groupe "sh- / GFP" en utilisant le test ANOVA à sens unique suivie d'un test post-hoc de Tukey.
O-R : Visualisation du système vasculaire dans le cortex de foetus à partir des placentas non transfectés (Sh- / GFP -) (0), GFP transfectés (Sh- / GFP +) (P) et shPLGF /
GFP transfectés (Sh + / GFP +) (Q) Analyse statistique de la désorganisation des vaisseaux corticaux réalisée à l'aide du test de x2 (R).
Figure 7. Caractérisation morphométrique des effets de l'exposition alcoolique in utero sur le placenta humain des semaines gestationnelles 20 à 25. A,B: Marquage immunohistochimique réalisé contre CD31 et contre-coloration au bleu de toluidine pour visualiser les microvaisseaux (marrons) présents dans les villosités placentaires (bleu) des groupes Témoin (A) et "FAS/pFAS" (B) à des âges de gestation [20-25 WG[.
C: Pourcentage de villosités classées par taille dans les placentas des groupes Témoin et "FAS/pFAS" à des âges de gestation [20-25 WG[. D: Répartition des vaisseaux par taille de villosités dans les placentas des groupes Témoin et "FAS/pFAS" à des âges de gestation [20-25 WG[. E: Surface vasculaire par taille de villosités dans les placentas des groupes Témoin et "FAS/pFAS" à
des âges de gestation [20-25 WGrp<0,05 vs le groupe Témoin à l'aide d'un test t non-apparié.
Figure 8. Caractérisation morphométrique des effets de l'exposition alcoolique in utero sur le placenta humain des semaines gestationnelles 25 à 35. A,B: Marquage immunohistochimique réalisé contre CD31 et marquage au bleu de toluidine pour visualiser les microvaisseaux (marrons) présents dans les villosités placentaires (bleu) des groupes Témoin (A) et "FAS/pFAS" (B) à des âges de gestation [25-35 WG[. C: Pourcentage de villosités classées par taille dans les placentas des groupes Témoin et "FAS/pFAS" à des âges de gestation [25-35 WG[. D: Répartition des vaisseaux par taille de villosités dans les placentas des groupes Témoin et "FAS/pFAS" à des âges de gestation [25-35 WG[. E: Surface vasculaire par taille de villosités dans les placentas des groupes Témoin et "FAS/pFAS" à des âges de gestation [25-WG[. *p<0,05 vs le groupe Témoin à l'aide d'un test t non-apparié.
Figure 9. Caractérisation morphométrique des effets de l'exposition alcoolique in utero sur 30 le placenta humain des semaines gestationnelles 35 à 42. A,B: Marquage immunohistochimique réalisé contre CD31 et marquage au bleu de toluidine pour visualiser les microvaisseaux (marrons) présents dans les villosités placentaires (bleu) des groupes Témoin (A) et "FAS/pFAS" (B) à des âges de gestation allant de [35-42 WG[. La région luminale des microvaisseaux est fortement réduite dans le groupe "FAS/pFas". C: Pourcentage de villosités classées par taille dans les placentas des groupes Témoin et "FAS/pFAS" à
des âges de gestation allant de [35-42 WG[. D: Répartition des vaisseaux par taille de villosités dans les placentas des groupes Témoin et "FAS/pFAS" à des âges de gestation allant de [35-42 WG[.
E: Surface vasculaire par taille de villosités dans les placentas des groupes Témoin et "FAS/pFAS" à des âges de gestation allant de [35-42 WGrp<0,05 vs le groupe Témoin à
l'aide d'un test t non-apparié.
Figure 10. Effets au cours du temps de l'exposition alcoolique in utero sur les densités de villosités et de vaisseaux dans des placentas humains et caractérisation par western blot de protéines pro-angiogéniques et du métabolisme énergétique. A: Evolution des densités de villosités dans les placentas des groupes Témoin (A) et "FAS/pFAS" (B) à
des âges de gestation [20-25 WG[, [25-35 WG[ et [35-42 WG[. B: Evolution des densités de vaisseaux dans les placentas des groupes Témoin et "FAS/pFAS" à des âges de gestation [20-25 WG[, [25-35 WG[ et [35-42 WG[. #p<0,05, ep<0.01 vs le groupe Témoin comme indiqué
sur le graphe.
*p<0,05, ***p<0.001 pour les groupes Témoin vs Alcool pour une classe donnée d'âge gestationnel. C-H: Quantification par western Plot des niveaux protéiques de ZO-1 (C), MCT-1 (D), PIGE (E), VEGFA (F), VEGF-R1 (G) et VEGF-R2 (H) dans les placentas des groupes Témoin et "FAS/pFAS". *p<0,05 vs le groupe Témoin à l'aide d'un test t non-apparié.
Figure 11. Comparaison des atteintes cérébrales et placentaires observées chez les foetus humains et induites par l'exposition alcoolique in utero et corrélation statistique. A-H:
Organisation vasculaire dans les cerveaux (A,D) et les placentas (E, H) de patients du groupe Témoin a WG22 (A,E) et WG31 (C,G) et organisation vasculaire dans les cerveaux (B,D) et les placentas (F,H) des patients du groupe "FAS/pFAS" à WG21 (B,F) et WG33 (D,H).
I,J: Corrélation statistique entre la désorganisation vasculaire corticale et la densité
vasculaire placentaire dans les patients des groupes Témoin (I) et FAS/pFAS (J).
Figure 12. Effets de la surexpression de PlGF in utero sur la croissance du foetus et de la vascularisation corticale lors de l'exposition intra-utérine à l'alcool. A,B :
Une approche d'activation PGF/CRISPR/dCas9 couplée à une électroporation du placenta in utero a été
réalisée à GD13 (A) et la surexpression de PIGE a été contrôlée à GD20 (B).
Dans le groupe Alcool , l'exposition à l'alcool in utero a lieu entre GD15 et GD20. C,D :
Visualisation de foetus E20 issues de souris gravides exposées à du NaCl (C) ou l'alcool (D).
Il est à noter la petite taille des foetus exposés à l'alcool. Les barres indiquent des mesures morphométriques qui ont été réalisées (taille de la tête (a); la taille du corps (b), la taille de l'abdomen (c) et la taille du foetus entier (a + b)). E,F : Visualisation de foetus E20 issues de souris gravides après électroporation in utero des plasmides PGE/CRISPR-dCas9 dans les placentas de groupes Témoin (E) ou des souris gravides exposées à l'alcool (F). G,H :
Quantification de la taille de l'abdomen (G) et du foetus entier (H) dans le groupe Témoin (NaCl) et dans le groupe Alcool . Dans une même corne utérine certains placentas n'ont pas subis d'électroporation (barres noires), d'autres ont subis une électroporation avec le plasmide CRISPR-cas9 de contrôle (barres grises) ou une électroporation avec les plasmides PGE/CRISPR-dCas9 (barres blanches) ## p <0,01; ### p < 0,001; p <0,0001 vs le groupe Témoin et *p <0,05;
**p <0,01; ****p <0,0001 comme indiqué en utilisant le test ANOVA à deux voies suivi d'un test post-hoc de Tukey.
I-K : Visualisation du système vasculaire dans le cortex du foetus E20 à
partir des placentas de contrôle (NaCl) / non transfectés (I), d'alcool / contrôle de CRISPR-cas9 transfectés (J) et d'alcool PGE/CRISPR-dCas9 transfectés. On note que la surexpression du PIGE au niveau .. placentaire corrige la désorganisation de la vascularisation cérébrale induite par l'alcoolisation in utero. L: Quantification du pourcentage des vaisseaux radiaux dans le cortex des foetus E20 à partir des placentas n'ayant pas subi d'électroporation (barres noires), ayant subis une électroporation avec des plasmides contrôle CRISPR-cas9 (barres grises) et une électroporation avec des plasmides PGF CRISPR-dCas9 (barres blanches). #p <0,05 ; ##p<0,01 vs le groupe Témoin et *p <0,05 comme indiqué en utilisant le test ANOVA à deux voies suivi d'un test post-hoc de Tukey.
Figure 13. Effets de la surexpression placentaire de PlGF sur la taille de la tête et du corps du foetus E20 dans les groupes Témoin et Alcool . A,B : Quantification de la taille de la tête (A) et du corps (B) dans le groupe Témoin (NaCl) et le groupe Alcool . Dans une même corne utérine certains placentas n'ont pas subi d'électroporation (barres noires), d'autres ont subis une électroporation avec les plasmides de contrôle CRISPR-cas9 (barres grises) ou une électroporation avec des plasmides PGF CRISPR-dCas9 (barres blanches). ## P
<0,01; ### P <0,001; P <0,0001 par rapport au groupe Témoin et * p <0,05; ** P <0,01 comme indiqué en utilisant le test ANOVA à deux voies suivi d'un test post-hoc de Tukey.
EXEMPLES
Exemples A : Anomalies suite à une alcoolisation in utero Les exemples A ci-dessous regroupent plusieurs résultats des tests réalisés antérieurement à la présente invention démontrant que chez la Souris et l'Homme :
= l'alcoolisation foetale impacte l'angiogenèse cérébrale et l'organisation du réseau vasculaire cérébral, = ces altérations cérébrales sont corrélées avec des anomalies vasculaires du placenta, = un facteur pro-angiogénique placentaire est en mesure d'atteindre le cerveau foetal, = les anomalies neurodéveloppementales de l'angiogenèse cérébrale chez les enfants TCAF sont associées à une dérégulation du système PIGE placentaire/VEGE-R1 cérébral, = une invalidation placentaire du PIGE reproduit les effets de l'alcoolisation foetale sur le VEGE-R1 cérébral, et = une dérégulation des taux placentaires de PIGE suite à une alcoolisation foetale permet de prédire une atteinte cérébrale.
Anomalies de l'angiogenèse cérébrale suite à une alcoolisation in utero Effets d'une exposition in utero à l'alcool sur le développement du réseau vasculaire cérébral Les présents inventeurs ont précédemment démontré qu'une alcoolisation prénatale à l'alcool induit une désorganisation vasculaire cérébrale. En particulier, l'effet de l'alcool est associé
à une diminution significative du nombre de vaisseaux corticaux présentant une orientation radiale au profit du nombre de microvaisseaux possédant une orientation aléatoire (Figure 1).
Parallèlement à l'étude effectuée chez la Souris, une analyse du système microvasculaire cérébral chez l'Homme a montré que, comme chez la Souris, les microvaisseaux corticaux qui ont une orientation radiale dans le groupe Témoin sont totalement désorganisés dans le groupe FAS/pFAS (Figure11 et Jegou et al., vol. 72, no. 6, 31 december 2012, pages 952-960).
Effets d'une exposition in utero à l'alcool sur l'expression de gènes représentatifs du système vasculaire chez la Souris Les études de RT-PCR quantitative (ARNm) et de Western blot (protéine) ont révélé une dérégulation marquée des taux de récepteurs VEGE-R1 et VEGF-R2 qui relaient les effets pro-angiogéniques de facteurs comme le VEGFA ou encore le PIGE. Les anomalies du réseau vasculaire cérébral sont donc associées à une dérégulation de l'expression de récepteurs pro-angiogéniques cérébraux (Figure 2 et Jegou et al., vol. 72, no. 6, 31 december 2012, pages 952-960).
Anomalies de l'angiogenèse placentaire suite à une alcoolisation in utero Différents paramètres placentaires ont été étudiés chez la Souris (Figures 3-5) et chez l'Homme (Figures 7-9) par une approche immunohistochimique couplée à une analyse morphométrique comprenant notamment la densité et la taille des villosités placentaires, la densité et la surface vasculaire ou encore la proportion de vaisseaux par villosité. Chez l'Homme, ces paramètres ont été mesurés et comparés entre 34 placentas d'individus témoins et 36 placentas provenant d'individus exposés in utero à l'alcool. Les placentas ont été répartis en trois classes d'âges comparables à celles de l'étude cérébrale (Jegou et al., vol. 72, no. 6, 31 december 2012, pages 952-960). Sont présentés dans ce document les résultats concernant les classes d'âge [20-25GW[, [25-35GW] et [35-42GW].
En particulier, l'analyse morphométrique indique que la répartition des vaisseaux placentaires par tailles de villosité et la surface vasculaire sont significativement impactées par l'alcoolisation (Figure 10). De plus, une analyse longitudinale de la densité
vasculaire prenant en compte le facteur âge indique que dans le groupe Témoins l'angiogenèse placentaire augmente fortement entre les classes d'âge [20-25GW[ et [25-35GW[. Cette forte augmentation de la vascularisation placentaire s'explique par un développement important du cerveau au cours du troisième trimestre de la grossesse qui nécessite des besoins accrus en oxygène et en nutriments. En revanche, l'alcoolisation foetale induit une stagnation voire une baisse de la densité vasculaire placentaire (Figure 10).
En conclusion, les présents résultats indiquent qu'il existe dans le placenta humain comme dans le cortex cérébral des anomalies vasculaires chez les sujets ayant été
exposés à
l'alcool. Ces résultats confortent donc l'hypothèse d'un corrélat entre troubles cérébraux et déficits placentaires de l'angiogenèse.
Démonstration d'une corrélation entre les anomalies vasculaires placentaires et cérébrales Les anomalies vasculaires placentaires et cérébrales observées chez l'Homme suite à une alcoolisation in utero peuvent être le fruit de processus totalement indépendants sans lien de cause à effet ou, au contraire, étroitement intriqués. Le fait que la source de PIGE soit unique et d'origine placentaire plaide en faveur de la seconde hypothèse. Toutefois, afin de démontrer un lien entre les atteintes vasculaires cérébrales et placentaires, nous avons effectué une étude de corrélation d'une part chez les sujets du groupe Témoin et, d'autre part, chez les individus du groupe FAS/pFAS (Figure 11).
Les résultats démontrent que dans le groupe Témoin , l'accroissement de la vascularisation placentaire n'impacte pas l'organisation radiale des vaisseaux corticaux (R2 0,4719). En revanche, le défaut de vascularisation placentaire observé dans le groupe FAS/pFAS est étroitement corrélé avec l'orientation aléatoire des vaisseaux corticaux (R2 0,9995). Il existe donc une interaction très significative entre les altérations vasculaires placentaires et cérébrales.
Démonstration d'un lien fonctionnel entre le P1GF placentaire et son récepteur cérébral L'administration in utero d'une molécule fluorescente au niveau placentaire chez la Souris gestante (GD15) est retrouvée après 20-30 min dans le cerveau du foetus (Figure 6). De plus, du PIGE recombinant humain injecté chez la Souris au niveau du placenta est détecté après 30 min par ELISA au niveau du cerveau foetal (Figure 6). Ces données indiquent que des molécules placentaires et notamment le PIGE sont en mesure d'atteindre le cerveau du foetus.
L'invalidation par transfection in utero placentaire du PIGE murin par des shRNA se traduit par une répression des taux protéiques de PIGE placentaire après 48 heures (Figure 6). Cet effet est associé au niveau cérébral par une chute des niveaux protéiques du récepteur VEGF-R1 (Figure 6). Ces résultats indiquent que i) la répression spécifique du PIGE
placentaire impacte directement l'expression du récepteur cérébral, ii) la répression spécifique du PIGE placentaire mime les effets de l'alcool sur l'expression du VEGF-R1 cérébral (Figures 2 et 6).
Les niveaux d'expression de protéines connues pour être soit des acteurs de l'angiogenèse soit des protéines spécifiques du système vasculaire ont été quantifiés par western blot. Ce travail a été effectué chez l'animal (Souris ; placenta/cerveau) et chez l'Homme (placenta).
Chez la Souris, la quantification des taux d'expression de VEGFA et de PIGE
placentaires démontre une diminution significative uniquement du PIGE (dont le placenta est la seule source dans l'organisme ; Figure 5). Parallèlement, la quantification des récepteurs au VEGFA et au PIGE indique que l'expression du VEGFR1 (unique récepteur du PIGE) est diminuée aussi bien dans le placenta que dans le cerveau (Figures 2 et 5). Cette diminution, très marquée, est de l'ordre de 50%. L'expression de VEGFR2 au niveau cérébral n'est quant à elle pas affectée. De plus, la quantification de la protéine vasculaire ZO-1, impliquée dans l'établissement de la barrière placentaire et hématoencéphalique est fortement diminuée dans le placenta (Figure 4).
Parallèlement aux travaux menés chez la Souris, l'analyse d'expression protéique a été menée sur des placentas humains dont l'alcoolisation maternelle était avérée et les enfants vivants.
Nous avons recueilli 7 placentas Témoins et 6 placentas Alcool et quantifié par western blot les marqueurs candidats identifiés chez la Souris. Les résultats indiquent que dans le groupe Alcool les expressions du PlGF et de ZO-1 sont très fortement diminuées comme chez la Souris (Figure 10). Ces données indiquent que les effets de l'alcoolisation foetale observés aux niveaux placentaire et cérébral sont retrouvés chez deux espèces différentes, la Souris et l'Homme.
Exemples B : Effet thérapeutique de P1GF
Ces exemples correspondent aux résultats obtenus par des tests de surexpression de PlGF au niveau placentaire permettant ainsi de reverser l'effet délétère de l'alcool sur la morphologie et la taille de foetus ainsi que sur l'angiogenèse cérébrale.
1. Matériels et méthodes Surexpression placentaire de PlGF par activation in vivo du gène PGF dans un système CRISPR-dCas9 Associée à l'électroporation in vivo, l'approche CRISPR-dCas9 est une méthode de surexpression génique innovante pour l'identification du rôle de protéines endogènes dans les processus de développement. Les plasmides d'activation PGF CRISPR-dCas9 (sc-422211-ACT) constituant un complexe des médiateurs de l'activation synergique (SAM) ont été conçus et fournis par Santa Cruz Biotechnology. SAM se lie à un site spécifique situé en amont du site de-d'initiation de la transcription du gène PGF, activant ainsi la transcription endogène du gène cible. En pratique, les plasmides d'activation PGF-CRISPR dCas9 sont transfectés par électroporation in utero à
GD13 dans deux groupes de souris ( Témoin et Alcool ). L'exposition à
l'alcool a lieu entre GD15 à GD20. Un délai de deux jours entre la transfection des plasmides d'activation PGF
CRISPR-dCas9 et le traitement par l'alcool est nécessaire pour permettre l'expression de plasmide et la surexpression de PLGF. Pour une souris gravide donnée, 3 placentas ont été
transfectés avec les plasmides d'activation PGF CRISPR-dCas9, 3 placentas ont été transfectés avec les plasmides contrôle CRISPR-cas9 (sc-418922) ciblant un ARN guide non-spécifique de 20 nt (contrôle négatif). Les autres placentas ne sont pas transfectés et sont utilisés comme contrôle (groupe Témoin ).
2. Résultats La surexpression placentaire du gène PGF permet de rétablir l'angiogenèse cérébrale du foetus altérée par l'exposition à l'alcool in utero.
Une stratégie d'activation par le système CRISPR-dCas9 couplée à une transfection in utero a été utilisée pour permettre l'induction d'une forte expression du gène endogène PGF dans le placenta des souris gravides n'ayant pas été traitées à l'alcool (groupe Témoin ) et des souris gravides ayant été exposées à l'alcool (groupe Alcool ) (Fig. 12, A et B).
A GD20, il a été
observé que l'exposition à l'alcool in utero conduit à une diminution de la croissance intra-utérine du foetus (figure 12, C et D.) avec une diminution significative de la taille de la tête (p <0,01; figure 13), de la taille du corps (p <0,0001; fig. S2) de la taille de l'abdomen (p <##;. la figure 12, G) et de la taille du foetus entier (p < ; la figure 12, H).
Dans le groupe Témoin , la surexpression de PGF induit une évolution macromorphique du foetus (figure 12, C et E), avec une augmentation significative de la taille de l'abdomen (p <0,01; figure 12, G) et de la taille du foetus entier (p <0,01; figure 12 H). Dans le groupe Alcool , la surexpression de PGF
augmente de manière significative la taille du corps (p <0,05; figure 13) et la taille du foetus entier (p <0,01; figure 12, H). En comparaison avec le groupe Témoin , la surexpression de PGF a supprimé les effets délétères de l'alcool sur la taille de la tête (figure 13) et sur la taille de l'abdomen (figure 12,G) et a réduit de 38,6 2,8% et 46,8 2,9% les effets de l'alcool sur la taille du corps (figure 13) et la taille des foetus entiers (figure 12, H), respectivement. Aucun effet sur la morphologie du foetus n'a été observé chez des souris gravides transfectées avec le plasmide contrôle CRISPR-cas9 (figure 12, G et H). Comme, il a été démontré
précédemment, dans le cerveau de foetus de souris à E20, l'exposition à l'alcool in utero conduit à une désorganisation du système vasculaire cortical (figures 1, A et B). La transfection du placenta avec un plasmide de contrôle CRISPR-cas9 n'a aucun effet sur les altérations angiogéniques induites par l'exposition à l'alcool in utero (figures. 12, I, J et L). En revanche, chez des souris gravides dont le placenta a été transfecté avec un plasmide d'activation CRISPR-PGF dCas9, l'organisation radiale des microvaisseaux corticaux a été rétablie de manière significative (p <0,05; fig. 4, K, L). Ces données constituent la première démonstration que la surexpression du PLGF dans le placenta permet de rétablir partiellement ou entièrement les déficiences morphologiques et les altérations de l'angiogenèse cérébrale induites par exposition à l'alcool in utero.
Conclusion Au vu des différents résultats obtenus par les inventeurs chez la Souris gravide, il apparait que :
= la surexpression de PIGE dans le placenta d'une souris gravide exposée à
l'alcool permet la disparition complète des anomalies morphométriques au niveau de l'abdomen et du crâne du foetus causées par l'exposition à l'alcool. Ainsi, la taille du crâne et de l'abdomen qui se trouve réduite suite à l'exposition à l'alcool revient à la normale après la surexpression de PIGE, = la surexpression de PIGE dans le placenta d'une souris gravide exposée à
l'alcool permet la diminution des anomalies morphométriques au niveau de corps du foetus et du foetus entier causées par l'exposition à l'alcool. Ainsi, la taille du corps du foetus ainsi que la taille du foetus entier réduites lors de l'exposition à l'alcool revient quasiment à la normale après la surexpression de PIGE, = la surexpression de PIGE au niveau placentaire permet l'amélioration de l'angiogenèse cérébrale du foetus altérée par l'exposition à l'alcool d'une souris gravide.
La fonction neuronale de ce foetus se trouvera ainsi améliorée, = la surexpression de PIGE peut être utilisée efficacement en tant que médicament dans le traitement des anomalies de type TCAF, en particulier pour améliorer l'angiogenèse cérébrale et/ou rétablir l'aspect morphologique normal de la vascularisation du foetus atteint de TCAF.

Claims

REVENDICATIONS

1. Facteur de croissance placentaire (KGF) pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des troubles causés par l'alcoolisation foetale (TCAF) chez un sujet ayant été
exposé à l'alcool in utero.

2. KGF pour son utilisation selon la revendication 1, caractérisé en ce que le TCAF est lié
à une atteinte vasculaire cérébrale.

3. KGF pour son utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que ledit KGF stimule l'angiogenèse cérébrale.

4. KGF pour son utilisation selon la revendication 1, caractérisé en ce que le TCAF est le syndrome d'alcoolisation foetale (SAF), notamment lorsqu'il se manifeste sous forme d'une hypotrophie chez un sujet ayant été exposé à l'alcool in utero.

5. KGF pour son utilisation selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'hypotrophie est une hypotrophie du sujet entier ou d'une de ses parties choisies parmi le torse, l'abdomen et le crâne.

6. KGF pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit KGF possède la séquence représentée par une parmi SEQ ID NO : 1 à
SEQ ID
NO :4.

7. KGF pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il est obtenu par génie génétique ou par synthèse chimique.

8. PLGF pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que le sujet ayant été exposé à l'alcool in utero est choisi parmi un embryon, un foetus et un enfant, en particulier un enfant prématuré.

9. PLGF pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé
en ce qu'il est administré in utero ou ex utero ou in utero puis ex utero.

10. KGF pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il est administré ex-utero à un enfant prématuré.

11. Composition pharmaceutique pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des troubles causés par l'alcoolisation foetale (TCAF) comprenant un KGF tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 10 et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

12. KGF pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ou composition pharmaceutique pour son utilisation selon la revendication 11, ladite utilisation comprenant une étape préalable d'identification du sujet, ladite identification comprenant les étapes suivantes :
a) mesure de la quantité de PIGF dans un échantillon biologique dudit sujet, de préférence provenant du placenta ou du sang du cordon ombilical ;
b) comparaison de la quantité de KGF de l'étape a) avec une référence qui est une mesure de la quantité de KGF chez un sujet sain, et c) détermination d'un TCAF ou d'un risque de développer un TCAF chez ledit sujet.

13. KGF ou composition pour leur utilisation selon la revendication 12 caractérisés en ce que le sujet souffre d'un TCAF ou a été identifié à risque de développer un TCAF si la quantité mesurée de KGF à l'étape a) est inférieure à la référence de l'étape b).

14. KGF ou composition pour leur utilisation selon la revendication 12, caractérisés en ce que la quantité de KGF est déterminée en mesurant la quantité d'acide nucléique KGF
ou la quantité du polypeptide KGF.

15. KGF ou composition pour leur utilisation selon l'une quelconque des revendications 12 à 14 caractérisés en ce que la quantité de KGF est mesurée par une méthode sélectionnée parmi le Northern blot, le Southern blot, la PCR, la RT-PCR, la RT-PCR
quantitative, le SAGE et ses dérivés, les puces d'acides nucléiques, notamment les puces à ADNc, les puces à oligonucléotides et les puces à ARNm, les puces à tissu et le RNA-Seq et/ou par une méthode sélectionnée parmi l'immunohistologie, l'immunoprécipitation, le western blot, le dot blot, l'ELISA ou l'ELISPOT, les puces à
protéines, les puces à anticorps, ou les puces à tissu couplées à
l'immunohistochimie, les techniques de FRET ou de BRET, les méthodes de microscopie ou d'histochimie, dont notamment les méthodes de microscopie confocale et de microscopie électronique, les méthodes basées sur l'utilisation d'une ou plusieurs longueurs d'onde d'excitation et d'une méthode optique adaptée, comme une méthode électrochimique (les techniques voltamétrie et d'ampérométrie), le microscope à force atomique, et les méthodes de radiofréquence, comme la spectroscopie résonance multipolaire, confocale et non-confocale, détection de fluorescence, luminescence, chemiluminescence, absorbance, réflectance, transmittance, and biréfringence ou index de réfraction (par exemple, par résonance des plasmons de surface, par ellipsométrie, par méthode de miroir résonnant, etc), cytométrie de flux, imagerie par résonance radioisotopique ou magnétique, analyse par électrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE); par spectrophotométrie HPLC-Mass, par chromatographie liquide/spectrophotométrie de masse/spectrométrie de masse (LC-MS/MS).