CA2753169A1 - Acides nucleiques se liant specifiquement au facteur vii/viia humain, et utilisations - Google Patents
Acides nucleiques se liant specifiquement au facteur vii/viia humain, et utilisations Download PDFInfo
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Abstract
L'invention concerne un acide nucléique ayant au moins 15 nucléotides de longueur se liant spécifiquement au facteur Vll/Vlla humain.
Description
TITRE DE L'INVENTION
Acides nucléiques se liant spécifiquement au Facteur VII/Vlla humain, et utilisations DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte au domaine de l'identification de ligands spécifiques du Facteur VII/Vlla humain, ces ligands étant destinés notamment à la purification et à la détection de cette protéine, ainsi qu'à leur utilisation dans le domaine médical.
ART ANTERIEUR
Le facteur VII (FVII) est une glycoprotéine vitamine K-dépendante qui, sous sa forme activée (FVIIa), participe au processus de coagulation en activant le facteur X et le facteur IX en présence de calcium et de facteur tissulaire. Le FVII est sécrété sous la forme d'une chaîne peptidique unique de 406 résidus d'acides aminés, dont la masse moléculaire est d'environ 50 kDa.
Le FVIIa, une glycoprotéine dépendante de la vitamine K, joue donc un rôle important dans les mécanismes de la coagulation, aboutissant à la formation de caillot sanguin. Le FVIIa présente l'intérêt de pouvoir agir localement en présence du facteur tissulaire libéré après lésion de tissus engendrant des hémorragies, même en l'absence de Facteur VIII ou IX.
C'est pourquoi le FVIla est utilisé depuis de nombreuses années pour corriger certains troubles de la coagulation se manifestant par des saignements.
Le FVII est utilisé dans le traitement des patients atteints d'hémophilie, présentant un déficit en facteur VIII (hémophilie de type A) ou en facteur IX (hémophilie de type B) , ainsi que des patients présentant d'autres déficiences des facteurs de coagulation, par exemple un déficit héréditaire en FVII. Le FVII est également préconisé dans le traitement d'accidents vasculaires cérébraux. Il est donc nécessaire de disposer de concentrés de FVIIa injectables.
La méthode la plus ancienne d'obtention de concentrés de FVIIa a consisté en la purification du FVIIa à partir de protéines plasmatiques issues du fractionnement. Le document EP 0 346 241 décrit à cet effet la préparation d'une fraction enrichie en FVIIa, obtenue après adsorption puis élution d'un sous-produit du fractionnement de protéines plasmatiques contenant le FVII et le FVIIa et d'autres protéines telles les facteurs IX
(FIX), X (FX) et Il (FII), notamment le prééluat du PPSB (P = prothrombine ou FII, P = proconvertine ou FVII, S =
facteur de Stuart ou FX et B = facteur antihémophilique B ou FIX).
L'inconvénient de ce procédé
est que le FVII obtenu contient encore quelques traces d'autres facteurs de coagulation.
De même, le document EP 0 547 932 décrit un procédé de fabrication d'un concentré de FVIIa de haute pureté essentiellement dépourvu des facteurs vitamine K
dépendants et du FVIII. Le FVII obtenu par ce procédé, malgré sa pureté, présente une activité
thrombogénique résiduelle.
Acides nucléiques se liant spécifiquement au Facteur VII/Vlla humain, et utilisations DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte au domaine de l'identification de ligands spécifiques du Facteur VII/Vlla humain, ces ligands étant destinés notamment à la purification et à la détection de cette protéine, ainsi qu'à leur utilisation dans le domaine médical.
ART ANTERIEUR
Le facteur VII (FVII) est une glycoprotéine vitamine K-dépendante qui, sous sa forme activée (FVIIa), participe au processus de coagulation en activant le facteur X et le facteur IX en présence de calcium et de facteur tissulaire. Le FVII est sécrété sous la forme d'une chaîne peptidique unique de 406 résidus d'acides aminés, dont la masse moléculaire est d'environ 50 kDa.
Le FVIIa, une glycoprotéine dépendante de la vitamine K, joue donc un rôle important dans les mécanismes de la coagulation, aboutissant à la formation de caillot sanguin. Le FVIIa présente l'intérêt de pouvoir agir localement en présence du facteur tissulaire libéré après lésion de tissus engendrant des hémorragies, même en l'absence de Facteur VIII ou IX.
C'est pourquoi le FVIla est utilisé depuis de nombreuses années pour corriger certains troubles de la coagulation se manifestant par des saignements.
Le FVII est utilisé dans le traitement des patients atteints d'hémophilie, présentant un déficit en facteur VIII (hémophilie de type A) ou en facteur IX (hémophilie de type B) , ainsi que des patients présentant d'autres déficiences des facteurs de coagulation, par exemple un déficit héréditaire en FVII. Le FVII est également préconisé dans le traitement d'accidents vasculaires cérébraux. Il est donc nécessaire de disposer de concentrés de FVIIa injectables.
La méthode la plus ancienne d'obtention de concentrés de FVIIa a consisté en la purification du FVIIa à partir de protéines plasmatiques issues du fractionnement. Le document EP 0 346 241 décrit à cet effet la préparation d'une fraction enrichie en FVIIa, obtenue après adsorption puis élution d'un sous-produit du fractionnement de protéines plasmatiques contenant le FVII et le FVIIa et d'autres protéines telles les facteurs IX
(FIX), X (FX) et Il (FII), notamment le prééluat du PPSB (P = prothrombine ou FII, P = proconvertine ou FVII, S =
facteur de Stuart ou FX et B = facteur antihémophilique B ou FIX).
L'inconvénient de ce procédé
est que le FVII obtenu contient encore quelques traces d'autres facteurs de coagulation.
De même, le document EP 0 547 932 décrit un procédé de fabrication d'un concentré de FVIIa de haute pureté essentiellement dépourvu des facteurs vitamine K
dépendants et du FVIII. Le FVII obtenu par ce procédé, malgré sa pureté, présente une activité
thrombogénique résiduelle.
2 Dans les années 1980, l'ADN codant pour le facteur VII humain a été isolé
(Hagen et al.(1 986) ; Proc. Natl . Acad. Sci. USA ; Apr 83 (8) : 2412-6) et la protéine correspondante a été
exprimée dans les cellules de mammifères BHK (Baby Hamster Kidney) (document 421) . La demande de brevet FR 06 04872 déposée par la Demanderesse décrit également la production de FVIIa dans un animal transgénique.
Ces méthodes de production permettent d'obtenir des protéines sécurisées en terme de contamination par des virus ou d'autres agents pathogènes. De plus, de tels procédés permettent d'obtenir des protéines dont la séquence primaire, c'est-à-dire un enchaînement identique entre les différents acides aminés, est identique à la séquence primaire humaine.
Toutefois, quelle que soit la source initiale de Facteur VII/Vlla, les procédés mis en oeuvre génèrent des compositions enrichies en Facteur VII/Vlla humain comprenant des substances contaminantes. Pour les procédés de purification du Facteur VII/Vlla à partir de plasma humain, il serait très avantageux de disposer d'un produit final notamment exempt, ou quasi-exempt d'activité thrombogénique résiduelle. Pour les procédés d'obtention de Facteur VII/Vlla humain recombinant purifié, il est essentiel de disposer d'un produit final notamment exempt, ou quasi-exempt, de protéines cellulaires indésirables. En particulier, pour les compositions de Facteur VII/Vlla humain purifié à partir de fluides biologiques provenant de mammifères transgéniques, il est important de disposer d'un produit final exempt, ou quasi-exempt, de Facteur VII/Vlla produit par ailleurs naturellement par ces mammifères transgéniques, susceptible d'être immunogène chez l'homme.
Pour atteindre cet objectif, il est nécessaire de disposer de moyens efficaces et spécifiques de purification du Facteur VII/Vlla humain à partir d'un échantillon comprenant ledit Facteur VII/Vlla, qui puissent être produits facilement et de manière reproductible.
RESUME DE L'INVENTION
Il est fourni selon l'invention des acides nucléiques monobrin ayant au moins nucléotides de longueur et se liant spécifiquement au facteur VII/VIIa humain.
La présente invention concerne aussi divers composés se liant spécifiquement au facteur VII/VIIa humain, qui comprennent dans leur structure au moins un acide nucléique défini ci-dessus.
Elle est également relative à des complexes entre un acide nucléique ou un composé
tels que définis ci-dessus et (ii) un facteur VII/VIIa humain.
Cette invention a également trait à un support pour l'immobilisation du Facteur VII/VIIa humain, caractérisé en ce qu'il comprend un matériau support solide sur lequel sont greffés une pluralité d'acides nucléiques ou de composés tels que définis ci-dessus.
L'invention a aussi pour objet un procédé pour l'immobilisation du facteur VII/VIIa humain sur un support, comprenant une étape au cours de laquelle on met en contact un échantillon comprenant du Facteur VII/VIIa humain avec un support tel que défini ci-dessus.
(Hagen et al.(1 986) ; Proc. Natl . Acad. Sci. USA ; Apr 83 (8) : 2412-6) et la protéine correspondante a été
exprimée dans les cellules de mammifères BHK (Baby Hamster Kidney) (document 421) . La demande de brevet FR 06 04872 déposée par la Demanderesse décrit également la production de FVIIa dans un animal transgénique.
Ces méthodes de production permettent d'obtenir des protéines sécurisées en terme de contamination par des virus ou d'autres agents pathogènes. De plus, de tels procédés permettent d'obtenir des protéines dont la séquence primaire, c'est-à-dire un enchaînement identique entre les différents acides aminés, est identique à la séquence primaire humaine.
Toutefois, quelle que soit la source initiale de Facteur VII/Vlla, les procédés mis en oeuvre génèrent des compositions enrichies en Facteur VII/Vlla humain comprenant des substances contaminantes. Pour les procédés de purification du Facteur VII/Vlla à partir de plasma humain, il serait très avantageux de disposer d'un produit final notamment exempt, ou quasi-exempt d'activité thrombogénique résiduelle. Pour les procédés d'obtention de Facteur VII/Vlla humain recombinant purifié, il est essentiel de disposer d'un produit final notamment exempt, ou quasi-exempt, de protéines cellulaires indésirables. En particulier, pour les compositions de Facteur VII/Vlla humain purifié à partir de fluides biologiques provenant de mammifères transgéniques, il est important de disposer d'un produit final exempt, ou quasi-exempt, de Facteur VII/Vlla produit par ailleurs naturellement par ces mammifères transgéniques, susceptible d'être immunogène chez l'homme.
Pour atteindre cet objectif, il est nécessaire de disposer de moyens efficaces et spécifiques de purification du Facteur VII/Vlla humain à partir d'un échantillon comprenant ledit Facteur VII/Vlla, qui puissent être produits facilement et de manière reproductible.
RESUME DE L'INVENTION
Il est fourni selon l'invention des acides nucléiques monobrin ayant au moins nucléotides de longueur et se liant spécifiquement au facteur VII/VIIa humain.
La présente invention concerne aussi divers composés se liant spécifiquement au facteur VII/VIIa humain, qui comprennent dans leur structure au moins un acide nucléique défini ci-dessus.
Elle est également relative à des complexes entre un acide nucléique ou un composé
tels que définis ci-dessus et (ii) un facteur VII/VIIa humain.
Cette invention a également trait à un support pour l'immobilisation du Facteur VII/VIIa humain, caractérisé en ce qu'il comprend un matériau support solide sur lequel sont greffés une pluralité d'acides nucléiques ou de composés tels que définis ci-dessus.
L'invention a aussi pour objet un procédé pour l'immobilisation du facteur VII/VIIa humain sur un support, comprenant une étape au cours de laquelle on met en contact un échantillon comprenant du Facteur VII/VIIa humain avec un support tel que défini ci-dessus.
3 L'invention est aussi relative à un procédé pour la purification du Facteur VII/Vlla humain comprenant les étapes suivantes :
a) mettre en contact un échantillon comprenant du Facteur VII/Vlla humain avec un acide nucléique ou avec un support tel que défini ci-dessus, afin de former un complexe entre (i) ledit acide nucléique ou ledit support et (ii) le Facteur VII/Vlla humain, et b) libérer le Facteur VII/Vlla humain à partir du complexe former à l'étape a) et récupérer le Facteur VII/Vlla humain purifié
L'invention concerne aussi un procédé pour détecter la présence de Facteur VII/Vlla humain dans un échantillon comprenant les étapes suivantes :
a) mettre en contact un acide nucléique ou un support tel que défini ci-dessus avec ledit échantillon; et b) détecter la formation de complexes entre (i) ledit acide nucléique ou ledit support et (ii) le Facteur VII/Vlla La présente invention a également trait à des utilisations médicales préventives ou curatives des acides nucléiques tels que définis ci-dessus.
DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 illustre les résultats d'un calcul du modèle de repliement d'un acide nucléique de l'invention (Mapt2). On a utilisé le le programme d'odinateur mFold , selon des paramètres identiques à ceux utilisés pour obtenir la structure rreprésentée à
la figure 1, à
savoir les conditions suivantes : (i) ADN à séquence linéaire, (ii) température de repliement 25'C, (iii) conditions ioniques : [Na+] : 150 mM; [Mg++] : 4 mM, (iv) type de correction Oligomère, (v) nombre du pourcentage de suboptimality : 2, (vi) limite supérieure du nombre de repliements calculés : 50, (vii) distance maximale entre deux paires de bases : pas de limite, et (viii) utilisation des valeurs par défaut pour les autres paramètres.
La Figure 2 illustre les courbes de liaison d'une diversité d'acides nucléiques de l'invention (Mapt2, Mapt3 et Mapt7) au Facteur VII humain plasmatique immobilisé sur un support, dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de 3o résonance arbitraires.
La Figure 3 illustre les courbes de liaison du Facteur VII humain plasmatique, utilisé à
diverses concentrations, sur un acide nucléique de l'invention (Mapt2) immobilisé sur un support, dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires. Les courbes représentent, du haut vers le bas de la figure, courbe 1 [FVII] : FVII humain plasmatique purifié à la concentration de 500 nM ;
courbe 2 [FVII]
FVII humain plasmatique purifié à la concentration de 250 nM ; courbe 3 [FVII] : FVII
humain plasmatique purifié à la concentration de 125 nM ; courbe 4 [FVII]
: FVII humain
a) mettre en contact un échantillon comprenant du Facteur VII/Vlla humain avec un acide nucléique ou avec un support tel que défini ci-dessus, afin de former un complexe entre (i) ledit acide nucléique ou ledit support et (ii) le Facteur VII/Vlla humain, et b) libérer le Facteur VII/Vlla humain à partir du complexe former à l'étape a) et récupérer le Facteur VII/Vlla humain purifié
L'invention concerne aussi un procédé pour détecter la présence de Facteur VII/Vlla humain dans un échantillon comprenant les étapes suivantes :
a) mettre en contact un acide nucléique ou un support tel que défini ci-dessus avec ledit échantillon; et b) détecter la formation de complexes entre (i) ledit acide nucléique ou ledit support et (ii) le Facteur VII/Vlla La présente invention a également trait à des utilisations médicales préventives ou curatives des acides nucléiques tels que définis ci-dessus.
DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 illustre les résultats d'un calcul du modèle de repliement d'un acide nucléique de l'invention (Mapt2). On a utilisé le le programme d'odinateur mFold , selon des paramètres identiques à ceux utilisés pour obtenir la structure rreprésentée à
la figure 1, à
savoir les conditions suivantes : (i) ADN à séquence linéaire, (ii) température de repliement 25'C, (iii) conditions ioniques : [Na+] : 150 mM; [Mg++] : 4 mM, (iv) type de correction Oligomère, (v) nombre du pourcentage de suboptimality : 2, (vi) limite supérieure du nombre de repliements calculés : 50, (vii) distance maximale entre deux paires de bases : pas de limite, et (viii) utilisation des valeurs par défaut pour les autres paramètres.
La Figure 2 illustre les courbes de liaison d'une diversité d'acides nucléiques de l'invention (Mapt2, Mapt3 et Mapt7) au Facteur VII humain plasmatique immobilisé sur un support, dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de 3o résonance arbitraires.
La Figure 3 illustre les courbes de liaison du Facteur VII humain plasmatique, utilisé à
diverses concentrations, sur un acide nucléique de l'invention (Mapt2) immobilisé sur un support, dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires. Les courbes représentent, du haut vers le bas de la figure, courbe 1 [FVII] : FVII humain plasmatique purifié à la concentration de 500 nM ;
courbe 2 [FVII]
FVII humain plasmatique purifié à la concentration de 250 nM ; courbe 3 [FVII] : FVII
humain plasmatique purifié à la concentration de 125 nM ; courbe 4 [FVII]
: FVII humain
4 plasmatique purifié à la concentration de 62.5 nM ; courbes inférieures :
préparation d'immunoglobulines purifiées aux concentrations respectives de 62, 125, 250 et 500 nM
La Figure 4 illustre la courbe de liaison (i) du facteur VII humain recombinant à un acide nucléique de l'invention (Mapt2) immobilisé sur un support, puis (ii) la courbe de liaison d'un anticorps monoclonal anti-FVII humain au complexe acide nucléique immobilisé/FVII formé en (i), dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires.
La Figure 5 illustre une courbe de saturation d'un support sur lequel est immobilisé une acide nucléique de l'invention (Mapt2), avec le Facteur VII humain plasmatique injecté de manière continue au cours du temps. Essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires. Courbe supérieure : signal obtenu avec le FVII
humain purifié à la concentration de 500 nM.
La Figure 6 illustre des courbes de cinétique de liaison du Facteur VII humain plasmatique sur un acide nucléique de l'invention (Mapt2) immobilisé sur un support, dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse :
le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires La Figure 7 illustre les courbes de liaison de protéines Facteur VII
d'origines diverses sur un acide nucléique de l'invention (Mapt2) immobilisé sur un support, dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires La Figure 8 illustre les courbes de liaison du facteur VII humain plasmatique et du Facteur VII recombinant de lapin sur un acide nucléique de l'invention (Mapt2) immobilisé sur un support, dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires.
La Figure 9 illustre la structure d'un composé de liaison spécifique au Facteur VII/Vlla humain comprenant un aptamère selon l'invention (Mapt2) couplé à une chaîne espaceur de PEG, la chaîne espaceur étant elle-même couplée à une molécule de biotine.
La Figure 10 illustre un alignement de divers aptamères se liant spécifiquement au Facteur VII/Vlla humain sélectionnés à la fin d'un cycle de mise en oeuvre d'un procédé de type SELEX. Les séquences représentées sur la figure 10 sont, du haut vers le bas de la figure, respectivement les séquences SEQ ID N 87 à SEQ ID N 100.
La figure 11 illustre un profil de chromatographie obtenu lors de la mise en oeuvre du procédé de purification d'un Facteur VII humain recombinant produit dans le lait de lapine avec le support d'affinité dans lequel sont immobilisés des aptamères nucléiques anti-FVII humain.
En abscisse ; le temps ; en ordonnées : la valeur d'absorbance (D.O.) à 254 nanomètres.
La figure 12 illustre les courbes de liaison d'une série de 27 aptamères nucléiques de l'invention au Facteur VII humain plasmatique immobilisé sur un support, dans un essai selon la
préparation d'immunoglobulines purifiées aux concentrations respectives de 62, 125, 250 et 500 nM
La Figure 4 illustre la courbe de liaison (i) du facteur VII humain recombinant à un acide nucléique de l'invention (Mapt2) immobilisé sur un support, puis (ii) la courbe de liaison d'un anticorps monoclonal anti-FVII humain au complexe acide nucléique immobilisé/FVII formé en (i), dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires.
La Figure 5 illustre une courbe de saturation d'un support sur lequel est immobilisé une acide nucléique de l'invention (Mapt2), avec le Facteur VII humain plasmatique injecté de manière continue au cours du temps. Essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires. Courbe supérieure : signal obtenu avec le FVII
humain purifié à la concentration de 500 nM.
La Figure 6 illustre des courbes de cinétique de liaison du Facteur VII humain plasmatique sur un acide nucléique de l'invention (Mapt2) immobilisé sur un support, dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse :
le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires La Figure 7 illustre les courbes de liaison de protéines Facteur VII
d'origines diverses sur un acide nucléique de l'invention (Mapt2) immobilisé sur un support, dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires La Figure 8 illustre les courbes de liaison du facteur VII humain plasmatique et du Facteur VII recombinant de lapin sur un acide nucléique de l'invention (Mapt2) immobilisé sur un support, dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires.
La Figure 9 illustre la structure d'un composé de liaison spécifique au Facteur VII/Vlla humain comprenant un aptamère selon l'invention (Mapt2) couplé à une chaîne espaceur de PEG, la chaîne espaceur étant elle-même couplée à une molécule de biotine.
La Figure 10 illustre un alignement de divers aptamères se liant spécifiquement au Facteur VII/Vlla humain sélectionnés à la fin d'un cycle de mise en oeuvre d'un procédé de type SELEX. Les séquences représentées sur la figure 10 sont, du haut vers le bas de la figure, respectivement les séquences SEQ ID N 87 à SEQ ID N 100.
La figure 11 illustre un profil de chromatographie obtenu lors de la mise en oeuvre du procédé de purification d'un Facteur VII humain recombinant produit dans le lait de lapine avec le support d'affinité dans lequel sont immobilisés des aptamères nucléiques anti-FVII humain.
En abscisse ; le temps ; en ordonnées : la valeur d'absorbance (D.O.) à 254 nanomètres.
La figure 12 illustre les courbes de liaison d'une série de 27 aptamères nucléiques de l'invention au Facteur VII humain plasmatique immobilisé sur un support, dans un essai selon la
5 technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires.
La figure 13 illustre les valeurs individuelles de signal de fixation stable de chacun des 27 aptamères testés. En abscisse : chacun des 27 aptamères testés ; en ordonnées : signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires.
La Figure 14 représente la courbe des valeurs de mesure de l'absorbance à 280 nm en fonction du temps.
La Figure 15 représente le cliché d'un gel d'électrophorèse SDS PAGE dans lequel la piste n 1 correspond à la fraction du produit de départ et la piste n 2 à la fraction d'élution.
La Figure 16 représente les courbes de liaison de l'aptamère immobilisé Mapt2 au Facteur VII humain recombinant produit dans le lait d'une lapine transgénique.
Les flèches correspondent au temps des différentes injections, respectivement de gauche à
droite sur la figure 16 : 1 : injection du Facteur VII recombinant ; 2 : injection d'un tampon à 1 M NaCI ; 3 :
injection d'un tampon à 2M NaCI, 4 : injection d'un tampon à 3 M NaCI ; 5 :
injection d'un tampon Tris 50 mM, EDTA 10 mM. En abscisse : le temps exprimé en secondes ; en ordonnées ; la valeur du signal de réponse, exprimé en unités (RU) arbitraires.
La Figure 17 représente les courbes de liaison de l'aptamère immobilisé Mapt2 au Facteur VII humain recombinant produit dans le lait d'une lapine transgénique.
Les flèches correspondent au temps des différentes injections, respectivement de gauche à
droite sur la figure 17 : 1 : propylène glycol à 50% ; 2 : EDTA à 10 mM.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Il est fourni selon l'invention de nouveaux moyens aptes à se lier de manière spécifique au Facteur VII/VIIa humain, de taille réduite, faciles et peu onéreux à
synthétiser, et qui peuvent être employés dans tous les domaines d'application dans lesquels de tels moyens sont utiles, y compris pour la purification du Facteur VII/VIIa humain, pour la détection du Facteur VII/VIIa humain et pour l'utilisation en tant que principe actif de médicaments destinés à la prévention ou au traitement des troubles de la coagulation.
Plus précisément, la demanderesse a construit une famille d'acides nucléiques monobrin aptes à se lier de manière spécifique au Facteur VII/VIIa humain, qui ont en commun de nombreuses caractéristiques structurelles, qui seront détaillées plus loin dans la présente description.
La figure 13 illustre les valeurs individuelles de signal de fixation stable de chacun des 27 aptamères testés. En abscisse : chacun des 27 aptamères testés ; en ordonnées : signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires.
La Figure 14 représente la courbe des valeurs de mesure de l'absorbance à 280 nm en fonction du temps.
La Figure 15 représente le cliché d'un gel d'électrophorèse SDS PAGE dans lequel la piste n 1 correspond à la fraction du produit de départ et la piste n 2 à la fraction d'élution.
La Figure 16 représente les courbes de liaison de l'aptamère immobilisé Mapt2 au Facteur VII humain recombinant produit dans le lait d'une lapine transgénique.
Les flèches correspondent au temps des différentes injections, respectivement de gauche à
droite sur la figure 16 : 1 : injection du Facteur VII recombinant ; 2 : injection d'un tampon à 1 M NaCI ; 3 :
injection d'un tampon à 2M NaCI, 4 : injection d'un tampon à 3 M NaCI ; 5 :
injection d'un tampon Tris 50 mM, EDTA 10 mM. En abscisse : le temps exprimé en secondes ; en ordonnées ; la valeur du signal de réponse, exprimé en unités (RU) arbitraires.
La Figure 17 représente les courbes de liaison de l'aptamère immobilisé Mapt2 au Facteur VII humain recombinant produit dans le lait d'une lapine transgénique.
Les flèches correspondent au temps des différentes injections, respectivement de gauche à
droite sur la figure 17 : 1 : propylène glycol à 50% ; 2 : EDTA à 10 mM.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Il est fourni selon l'invention de nouveaux moyens aptes à se lier de manière spécifique au Facteur VII/VIIa humain, de taille réduite, faciles et peu onéreux à
synthétiser, et qui peuvent être employés dans tous les domaines d'application dans lesquels de tels moyens sont utiles, y compris pour la purification du Facteur VII/VIIa humain, pour la détection du Facteur VII/VIIa humain et pour l'utilisation en tant que principe actif de médicaments destinés à la prévention ou au traitement des troubles de la coagulation.
Plus précisément, la demanderesse a construit une famille d'acides nucléiques monobrin aptes à se lier de manière spécifique au Facteur VII/VIIa humain, qui ont en commun de nombreuses caractéristiques structurelles, qui seront détaillées plus loin dans la présente description.
6 Comme cela sera détaillé plus loin, la famille d'acides nucléiques de l'invention, qui sont aptes à se lier de manière spécifique au Facteur VII/Vlla humain, consistent en des acides nucléiques simple brin, préférentiellement de type ADN, lesquels, du fait de certaines caractéristiques structurelles apportées par leur séquence nucléotidique, sont capables d'adopter des conformations dans l'espace qui contribuent à leur conférer leurs propriétés de liaison au Facteur VII/Vlla précitées. De manière générique, les acides nucléiques de l'invention peuvent aussi être appelés aptamères nucléotidiques, en référence à un terme couramment utilisé par l'homme du métier pour désigner ce type de molécules.
On connaît déjà dans l'état de la technique des aptamères nucléiques capables de se lier à diverses protéines impliquées dans la voie de la coagulation sanguine, y compris des aptamères liant le Facteur de Willebrand (Demande PCT n WO 2008/150495), des aptamères liant l'alpha-thrombine (demande de brevet euopéen n EP 1 972 693) ou la thrombine (Zhao et al., 2008, Anal Chem, Vol. 80(19) : 7586-7593), des aptamères liant le Facteur IX/lXa (Subash et al., 2006, Thromb Haemost, Vol. 95 : 767-771; Howard et al., 2007, Atherioscl Thromb Vasc Biol, Vol. 27 : 722-727; Demande PCT n WO 2002/096926; Brevet aux Etats-Unis n US
On connaît déjà dans l'état de la technique des aptamères nucléiques capables de se lier à diverses protéines impliquées dans la voie de la coagulation sanguine, y compris des aptamères liant le Facteur de Willebrand (Demande PCT n WO 2008/150495), des aptamères liant l'alpha-thrombine (demande de brevet euopéen n EP 1 972 693) ou la thrombine (Zhao et al., 2008, Anal Chem, Vol. 80(19) : 7586-7593), des aptamères liant le Facteur IX/lXa (Subash et al., 2006, Thromb Haemost, Vol. 95 : 767-771; Howard et al., 2007, Atherioscl Thromb Vasc Biol, Vol. 27 : 722-727; Demande PCT n WO 2002/096926; Brevet aux Etats-Unis n US
7,312,325), des aptamères liant le Facteur X/Xa ( Demande PCT n WO
2002/096926; Brevet aux Etats-Unis n US 7,312,325).
Des aptamères nucléiques se liant au facteur VII/Vlla humain ont aussi été
décrits dans l'état de la technique (Rusconi et al., 2000, Thromb Haemost, Vol. 84(5) : 841-848; Layzer et al., 2007, Spring, Vol. 17 : 1-11 La présente invention a pour objet un acide nucléique ayant au moins 15 nucléotides de longueur et se liant spécifiquement au Facteur VII/Vlla humain.
Dans la présente description, un acide nucléique simple brin se liant spécifiquement au Facteur VII/Vlla humain peut aussi être désigné aptamère nucléique , aptamère , aptamère se liant au Facteur VII/Vlla humain ou encore aptamère anti-FVII/Vlla humain .
Par Facteur VII/Vlla humain, on englobe un Facteur VII/Vlla humain d'origine naturelle et un Facteur VII/Vlla humain recombinant. Au sens de la présente description, un Facteur VII/Vlla humain est considéré en référence à sa séquence en acides aminés, c'est-à-dire indépendamment du fait que la protéine soit glycosylée ou non glycosylée, et, si la protéine est glycosylée, quel que soit le type de glycosylation.
Comme cela sera également illustré plus en détail ultérieurement, certains modes de réalisation des acides nucléiques se liant spécifiquement au Facteur VII/Vlla humain de l'invention possèdent diverses caractéristiques structurelles communes, y inclus une séquence comprenant, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', successivement (i) une séquence nucléotidique spécifique invariable d'environ 20 nucléotides de longueur, suivie de (ii) une séquence nucléotidique variable d'environ 40 à 50 nucléotides de longueur, suivie de (iii) une séquence nucléotidique spécifique invariable d'environ 20 nucléotides de longueur. On précise que les séquences nucléotidiques variables (ii) peuvent posséder entre elles une très forte identité de séquence en nucléotides.
La demanderesse a donc construit une famille d'aptamères nucléiques se liant spécifiquement au Facteur VII/Vlla humain dont elle a pu montrer l'existence de relations entre (i) les caractéristiques structurelles communes et (ii) la ou les caractéristiques fonctionnelles communes.
D'un point de vue structurel, la famille d'acides nucléiques, ou aptamères nucléiques, se liant spécifiquement au Facteur VII/Vlla humain de l'invention comprend au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 40% d'identité en nucléotides avec l'acide nucléique de formule (I) suivante :
5'-[SEQ ID N 1]x-[SEQ ID N X]-[SEQ ID N 2]y-3' (I), dans laquelle :
- SEQ ID N X consiste en un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des acides nucléiques de séquences SEQ ID NO3 à SEQ ID N 85 et SEQ ID N 87 à SEQ
ID
N 100, x est un entier égal à 0 ou 1, et y est un entier égal à 0 ou 1.
Dans certains modes de réalisation, l'acide de séquence SEQ ID N X a une longueur de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ou 50 nucléotides.
Dans d'autres modes de réalisation, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N X a une longueur de 43, 44, 45, 46, 47, 48 ou 49 nucléotides de longueur.
Dans certains autres modes de réalisation préférés, l'acide nucléique de séquence SEQ
ID N X a une longueur de 43, 44 ou 45 nucléotides de longueur.
Comme déjà mentionné précédemment, l'acide nucléique de formule (I) a au moins nucléotides de longueur.
Dans certains modes de réalisation, l'acide nucléique de formule (I) a au moins 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80 ou 81 nucléotides de longueur, ce qui englobe les acides nucléiques possédant exactement chacune des longueurs spécifiées.
Dans certains modes de réalisation, du procédé d'obtention des aptamères de formule (I), les cycles successifs de sélection réalisés pour construire la famille d'acides nucléiques d'intérêt se liant spécifiquement au Facteur VII/Vlla humain ont abouti à
isoler et caractériser, à
chaque étape successive de sélection, des ensembles et sous-ensembles d'aptamères nucléiques comprenant, à leurs extrémités, 5' et 3', respectivement les séquences SEQ ID N 1 et SEQ ID N 2, encadrant structurellement une séquence variable SEQ ID N X.
Dans la famille principale d'aptamères nucléiques de l'invention, l'ensemble des séquences variables SEQ ID
2002/096926; Brevet aux Etats-Unis n US 7,312,325).
Des aptamères nucléiques se liant au facteur VII/Vlla humain ont aussi été
décrits dans l'état de la technique (Rusconi et al., 2000, Thromb Haemost, Vol. 84(5) : 841-848; Layzer et al., 2007, Spring, Vol. 17 : 1-11 La présente invention a pour objet un acide nucléique ayant au moins 15 nucléotides de longueur et se liant spécifiquement au Facteur VII/Vlla humain.
Dans la présente description, un acide nucléique simple brin se liant spécifiquement au Facteur VII/Vlla humain peut aussi être désigné aptamère nucléique , aptamère , aptamère se liant au Facteur VII/Vlla humain ou encore aptamère anti-FVII/Vlla humain .
Par Facteur VII/Vlla humain, on englobe un Facteur VII/Vlla humain d'origine naturelle et un Facteur VII/Vlla humain recombinant. Au sens de la présente description, un Facteur VII/Vlla humain est considéré en référence à sa séquence en acides aminés, c'est-à-dire indépendamment du fait que la protéine soit glycosylée ou non glycosylée, et, si la protéine est glycosylée, quel que soit le type de glycosylation.
Comme cela sera également illustré plus en détail ultérieurement, certains modes de réalisation des acides nucléiques se liant spécifiquement au Facteur VII/Vlla humain de l'invention possèdent diverses caractéristiques structurelles communes, y inclus une séquence comprenant, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', successivement (i) une séquence nucléotidique spécifique invariable d'environ 20 nucléotides de longueur, suivie de (ii) une séquence nucléotidique variable d'environ 40 à 50 nucléotides de longueur, suivie de (iii) une séquence nucléotidique spécifique invariable d'environ 20 nucléotides de longueur. On précise que les séquences nucléotidiques variables (ii) peuvent posséder entre elles une très forte identité de séquence en nucléotides.
La demanderesse a donc construit une famille d'aptamères nucléiques se liant spécifiquement au Facteur VII/Vlla humain dont elle a pu montrer l'existence de relations entre (i) les caractéristiques structurelles communes et (ii) la ou les caractéristiques fonctionnelles communes.
D'un point de vue structurel, la famille d'acides nucléiques, ou aptamères nucléiques, se liant spécifiquement au Facteur VII/Vlla humain de l'invention comprend au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 40% d'identité en nucléotides avec l'acide nucléique de formule (I) suivante :
5'-[SEQ ID N 1]x-[SEQ ID N X]-[SEQ ID N 2]y-3' (I), dans laquelle :
- SEQ ID N X consiste en un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des acides nucléiques de séquences SEQ ID NO3 à SEQ ID N 85 et SEQ ID N 87 à SEQ
ID
N 100, x est un entier égal à 0 ou 1, et y est un entier égal à 0 ou 1.
Dans certains modes de réalisation, l'acide de séquence SEQ ID N X a une longueur de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ou 50 nucléotides.
Dans d'autres modes de réalisation, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N X a une longueur de 43, 44, 45, 46, 47, 48 ou 49 nucléotides de longueur.
Dans certains autres modes de réalisation préférés, l'acide nucléique de séquence SEQ
ID N X a une longueur de 43, 44 ou 45 nucléotides de longueur.
Comme déjà mentionné précédemment, l'acide nucléique de formule (I) a au moins nucléotides de longueur.
Dans certains modes de réalisation, l'acide nucléique de formule (I) a au moins 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80 ou 81 nucléotides de longueur, ce qui englobe les acides nucléiques possédant exactement chacune des longueurs spécifiées.
Dans certains modes de réalisation, du procédé d'obtention des aptamères de formule (I), les cycles successifs de sélection réalisés pour construire la famille d'acides nucléiques d'intérêt se liant spécifiquement au Facteur VII/Vlla humain ont abouti à
isoler et caractériser, à
chaque étape successive de sélection, des ensembles et sous-ensembles d'aptamères nucléiques comprenant, à leurs extrémités, 5' et 3', respectivement les séquences SEQ ID N 1 et SEQ ID N 2, encadrant structurellement une séquence variable SEQ ID N X.
Dans la famille principale d'aptamères nucléiques de l'invention, l'ensemble des séquences variables SEQ ID
8 N X ont, entre elles une identité de séquence en nucléotides d'au moins 40%.
Cela signifie que, pour la séquence SEQ ID N X, les contraintes de structure, pour conserver la propriété de liaison au Facteur VII/Vlla humain, sont beaucoup moindres que les contraintes de structure pour les séquences localisées respectivement aux extrémités 5' et 3' de ces aptamères nucléiques.
Lorsque l'entier x est égal à 0 et l'entier y est égal à 1, les aptamères nucléiques de l'invention, englobent les acides nucléiques comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 40% d'identité en nucléotides avec l'acide nucléique de formule (1-1) suivante 5' -[SEQ ID N X]-[SEQ ID N 2] -3' (1-1), Lorsque l'entier x est égal à 1 et l'entier y est égal à 0, les aptamères nucléiques de l'invention, englobent les acides nucléiques comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 40% d'identité en nucléotides avec l'acide nucléique de formule (1-2) suivante 5'-[SEQ ID N 1] -[SEQ ID N X]-3' (1-2) Lorsque l'entier x est égal à 0 et l'entier y est égal à 0, les aptamères nucléiques de l'invention, englobent les acides nucléiques comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 40% d'identité en nucléotides avec l'acide nucléique de formule (1-3) suivante :
5'-[SEQ ID N X]-3' (1-3) Les aptamères nucléiques ci-dessus englobent donc les acides nucléiques comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 40%
d'identité en nucléotides avec un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des acides nucléiques de séquences SEQ ID N 3 à SEQ ID N 85 et SEQ ID N 87 à SEQ ID N 100.
De manière générale, un premier polynucléotide ayant au moins 40% d'identité
en nucléotides avec un second polynucléotide ou acide nucléique possède au moins 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 100% d'identité en nucléotides avec ledit second polynucléotide ou acide nucléique.
Dans certains modes de réalisation d'un acide nucléique de l'invention comprenant la séquence SEQ ID N X, ladite séquence SEQ ID N O X est choisie dans le groupe constitué des acides nucléiques ayant au moins 15 nucléotides consécutifs d'une séquence possédant au moins 40% d'identité en nucléotides avec au moins l'une des séquences SEQ ID N
3 à SEQ ID
N 85 et SEQ ID N 87 à SEQ ID N 100.
Dans certains modes de réalisation d'un acide nucléique de l'invention comprenant la séquence SEQ ID N X, ladite séquence SEQ ID N X est choisie dans le groupe constitué des
Cela signifie que, pour la séquence SEQ ID N X, les contraintes de structure, pour conserver la propriété de liaison au Facteur VII/Vlla humain, sont beaucoup moindres que les contraintes de structure pour les séquences localisées respectivement aux extrémités 5' et 3' de ces aptamères nucléiques.
Lorsque l'entier x est égal à 0 et l'entier y est égal à 1, les aptamères nucléiques de l'invention, englobent les acides nucléiques comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 40% d'identité en nucléotides avec l'acide nucléique de formule (1-1) suivante 5' -[SEQ ID N X]-[SEQ ID N 2] -3' (1-1), Lorsque l'entier x est égal à 1 et l'entier y est égal à 0, les aptamères nucléiques de l'invention, englobent les acides nucléiques comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 40% d'identité en nucléotides avec l'acide nucléique de formule (1-2) suivante 5'-[SEQ ID N 1] -[SEQ ID N X]-3' (1-2) Lorsque l'entier x est égal à 0 et l'entier y est égal à 0, les aptamères nucléiques de l'invention, englobent les acides nucléiques comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 40% d'identité en nucléotides avec l'acide nucléique de formule (1-3) suivante :
5'-[SEQ ID N X]-3' (1-3) Les aptamères nucléiques ci-dessus englobent donc les acides nucléiques comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 40%
d'identité en nucléotides avec un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des acides nucléiques de séquences SEQ ID N 3 à SEQ ID N 85 et SEQ ID N 87 à SEQ ID N 100.
De manière générale, un premier polynucléotide ayant au moins 40% d'identité
en nucléotides avec un second polynucléotide ou acide nucléique possède au moins 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 100% d'identité en nucléotides avec ledit second polynucléotide ou acide nucléique.
Dans certains modes de réalisation d'un acide nucléique de l'invention comprenant la séquence SEQ ID N X, ladite séquence SEQ ID N O X est choisie dans le groupe constitué des acides nucléiques ayant au moins 15 nucléotides consécutifs d'une séquence possédant au moins 40% d'identité en nucléotides avec au moins l'une des séquences SEQ ID N
3 à SEQ ID
N 85 et SEQ ID N 87 à SEQ ID N 100.
Dans certains modes de réalisation d'un acide nucléique de l'invention comprenant la séquence SEQ ID N X, ladite séquence SEQ ID N X est choisie dans le groupe constitué des
9 PCT/FR2010/050291 acides nucléiques possédant au moins 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 100% d'identité en nucléotides avec au moins l'une des séquences SEQ ID
N 3 à
SEQ ID N 85 et SEQ ID N 87 à SEQ ID N 100.
Il résulte de ce qui précède que la présente invention englobe une famille d'acides nucléiques monobrin ayant au moins 15 nucléotides consécutifs de l'enchaînement de formule (I) défini ci-dessus.
Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques, au sens de la présente invention, est déterminé en comparant les deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison.
La partie de la séquence nucléotidique dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des gaps ) par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à
obtenir un alignement optimal entre les deux séquences.
Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles une base nucléique identique est observé pour les deux séquences comparées, puis en divisant le nombre de positions auxquelles il y a identité entre les deux bases nucléiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité en nucléotides des deux séquences entre elles.
L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus.
De manière tout à fait préférée, le pourcentage d'identité de séquence est déterminé à l'aide du logiciel CLUSTAL W (version 1.82) les paramètres étant fixés comme suit : (1) CPU MODE =
ClustalW mp; (2) ALIGNMENT = full ; (3) OUTPUT FORMAT = aln w/numbers ; (4) OUTPUT ORDER = aligned ; (5) COLOR ALIGNMENT = no ; (6) KTUP (word size) =
default ; (7) WINDOW LENGTH = default ; (8) SCORE TYPE = percent ;
(9) TOPDIAG = default ; (10) PAIRGAP = default ; (11) PHYLOGENETIC
TREE/TREE
TYPE _ none ; (12) MATRIX = default ; (13) GAP OPEN = default ;
(14) END
GAPS = default ; (15) GAP EXTENSION = default ; (16) GAP DISTANCES =
default ; (17) TREE TYPE = cladogram et (18) TREE GRAP DISTANCES =
hide .
Sur la base de la structure d'un acide nucléique de l'invention qui est représentée sur la figure 1, l'homme du métier peut aisément déterminer les séquences spécifiques possibles pour la séquence SEQ ID N X , au sein de l'ensemble du nombre fini des enchaînements de nucléotides possibles.
A titre illustratif et pour certains modes de réalisation d'un aptamère nucléique de l'invention, l'homme du métier peut aisément, sur la base de la définition structurelle ci-dessus des aptamères nucléiques de formule (I), générer de manière automatique, par exemple à
l'aide d'un calculateur numérique dont la mémoire est chargée avec un ensemble d'instructions approprié, l'ensemble des séquences SEQ ID N X possibles. Le cas échéant, l'homme du métier peut ensuite déterminer automatiquement, à l'aide dudit calculateur numérique, 5 respectivement (i) celles des séquences dont le modèle de structure dans l'espace est similaire ou identique à celle de l'aptamère nucléique de la figure 1, et (ii) celles dont la structure de l'aptamère nucléique est distincte de celle de l'aptamère nucléique de la figure 1.
Les aptamères nucléiques ayant une structure dans l'espace similaire ou identique à
celle de l'aptamère nucléique de la figure 1 englobent ceux qui comprennent l'enchaînement de
N 3 à
SEQ ID N 85 et SEQ ID N 87 à SEQ ID N 100.
Il résulte de ce qui précède que la présente invention englobe une famille d'acides nucléiques monobrin ayant au moins 15 nucléotides consécutifs de l'enchaînement de formule (I) défini ci-dessus.
Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques, au sens de la présente invention, est déterminé en comparant les deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison.
La partie de la séquence nucléotidique dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des gaps ) par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à
obtenir un alignement optimal entre les deux séquences.
Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles une base nucléique identique est observé pour les deux séquences comparées, puis en divisant le nombre de positions auxquelles il y a identité entre les deux bases nucléiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité en nucléotides des deux séquences entre elles.
L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus.
De manière tout à fait préférée, le pourcentage d'identité de séquence est déterminé à l'aide du logiciel CLUSTAL W (version 1.82) les paramètres étant fixés comme suit : (1) CPU MODE =
ClustalW mp; (2) ALIGNMENT = full ; (3) OUTPUT FORMAT = aln w/numbers ; (4) OUTPUT ORDER = aligned ; (5) COLOR ALIGNMENT = no ; (6) KTUP (word size) =
default ; (7) WINDOW LENGTH = default ; (8) SCORE TYPE = percent ;
(9) TOPDIAG = default ; (10) PAIRGAP = default ; (11) PHYLOGENETIC
TREE/TREE
TYPE _ none ; (12) MATRIX = default ; (13) GAP OPEN = default ;
(14) END
GAPS = default ; (15) GAP EXTENSION = default ; (16) GAP DISTANCES =
default ; (17) TREE TYPE = cladogram et (18) TREE GRAP DISTANCES =
hide .
Sur la base de la structure d'un acide nucléique de l'invention qui est représentée sur la figure 1, l'homme du métier peut aisément déterminer les séquences spécifiques possibles pour la séquence SEQ ID N X , au sein de l'ensemble du nombre fini des enchaînements de nucléotides possibles.
A titre illustratif et pour certains modes de réalisation d'un aptamère nucléique de l'invention, l'homme du métier peut aisément, sur la base de la définition structurelle ci-dessus des aptamères nucléiques de formule (I), générer de manière automatique, par exemple à
l'aide d'un calculateur numérique dont la mémoire est chargée avec un ensemble d'instructions approprié, l'ensemble des séquences SEQ ID N X possibles. Le cas échéant, l'homme du métier peut ensuite déterminer automatiquement, à l'aide dudit calculateur numérique, 5 respectivement (i) celles des séquences dont le modèle de structure dans l'espace est similaire ou identique à celle de l'aptamère nucléique de la figure 1, et (ii) celles dont la structure de l'aptamère nucléique est distincte de celle de l'aptamère nucléique de la figure 1.
Les aptamères nucléiques ayant une structure dans l'espace similaire ou identique à
celle de l'aptamère nucléique de la figure 1 englobent ceux qui comprennent l'enchaînement de
10 boucles et de tiges qui a été décrit précédemment pour cet aptamère nucléique.
Pour déterminer la structure dans l'espace d'un acide nucléique de formule (I), l'homme du métier peut notamment, sur la base de la description de sa séquence en nucléotides, générer un modèle structurel en utilisant le programme d'ordinateur mFold décrit par Zuker (2003, Nucleic Acids Research, Vol. 231(13) : 3406-3413), et qui peut aussi être utilisé à
l'adresse Web suivante : http://mfold.bioinfo.rpi.edu/.
Préférentiellement, on utilise le programme d'ordinateur mFold , selon des paramètres identiques à ceux utilisés pour obtenir la structure représentée à la figure 1, à savoir les conditions suivantes : (i) ADN à séquence linéaire, (ii) température de repliement : 25 C, (iii) conditions ioniques : [Na+] : 150 mM; [Mg++] : 4 mM, (iv) type de correction :
Oligomère, (v) nombre du pourcentage de suboptimality : 2, (vi) limite supérieure du nombre de repliements calculés : 50, (vii) distance maximale entre deux paires de bases : pas de limite, et (viii) utilisation des valeurs par défaut pour les autres paramètres.
Puis, l'homme du métier réalise une étape de comparaison entre (i) le modèle de structure de l'aptamère de la figure 1 et (ii) le modèle de structure de l'aptamère de formule (I) qui vient d'être généré, et il sélectionne positivement l'aptamère de formule (I) qui vient d'être généré si son modèle structurel est identique ou similaire à celui de l'aptamère représenté à la figure 1.
Dans tous les cas, afin de confirmer la sélection positive de l'aptamère de formule (I) nouvellement généré, l'homme du métier peut vérifier ses propriétés de liaison au Facteur VII/Vlla humain, par exemple selon l'une des méthodes spécifiées dans la présente description, en particulier dans les exemples.
Dans certains modes de réalisation préférés d'un aptamère nucléique de l'invention, ledit aptamère nucléique comprend au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec l'acide nucléique de formule (I), ce qui englobe les aptamères comprenant 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 100% d'identité en nucléotides avec ledit acide nucléique de formule (I).
Pour déterminer la structure dans l'espace d'un acide nucléique de formule (I), l'homme du métier peut notamment, sur la base de la description de sa séquence en nucléotides, générer un modèle structurel en utilisant le programme d'ordinateur mFold décrit par Zuker (2003, Nucleic Acids Research, Vol. 231(13) : 3406-3413), et qui peut aussi être utilisé à
l'adresse Web suivante : http://mfold.bioinfo.rpi.edu/.
Préférentiellement, on utilise le programme d'ordinateur mFold , selon des paramètres identiques à ceux utilisés pour obtenir la structure représentée à la figure 1, à savoir les conditions suivantes : (i) ADN à séquence linéaire, (ii) température de repliement : 25 C, (iii) conditions ioniques : [Na+] : 150 mM; [Mg++] : 4 mM, (iv) type de correction :
Oligomère, (v) nombre du pourcentage de suboptimality : 2, (vi) limite supérieure du nombre de repliements calculés : 50, (vii) distance maximale entre deux paires de bases : pas de limite, et (viii) utilisation des valeurs par défaut pour les autres paramètres.
Puis, l'homme du métier réalise une étape de comparaison entre (i) le modèle de structure de l'aptamère de la figure 1 et (ii) le modèle de structure de l'aptamère de formule (I) qui vient d'être généré, et il sélectionne positivement l'aptamère de formule (I) qui vient d'être généré si son modèle structurel est identique ou similaire à celui de l'aptamère représenté à la figure 1.
Dans tous les cas, afin de confirmer la sélection positive de l'aptamère de formule (I) nouvellement généré, l'homme du métier peut vérifier ses propriétés de liaison au Facteur VII/Vlla humain, par exemple selon l'une des méthodes spécifiées dans la présente description, en particulier dans les exemples.
Dans certains modes de réalisation préférés d'un aptamère nucléique de l'invention, ledit aptamère nucléique comprend au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec l'acide nucléique de formule (I), ce qui englobe les aptamères comprenant 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 100% d'identité en nucléotides avec ledit acide nucléique de formule (I).
11 Dans des modes de réalisation préférés d'un acide nucléique de formule (I) la séquence SEQ ID N X possède au moins 80% d'identité en nucléotides avec au moins l'une des séquences SEQ ID N 3 à SEQ ID N 85 et SEQ ID N 87 à SEQ ID N 100, ce qui englobe les séquences possédant au moins 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 100% d'identité en nucléotides avec au moins l'une des séquences SEQ ID N 3 à SEQ ID N 85 et SEQ ID N 87 à SEQ ID N 100.
Dans d'autres modes de réalisation préférés d'un acide nucléique de formule (I) la séquence SEQ ID N X est choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID
N 3 à
SEQ ID N085 et SEQ ID N 87 à SEQ ID N0100.
Dans encore d'autres modes de réalisation préférés d'un acide nucléique de formule (I), la séquence SEQ ID N X est choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID N03, 5, 6, 10, 11, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 23, 24, 25, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 and 40.
Selon l'invention, un acide nucléique se liant au Facteur VII/Vlla humain consiste en un acide nucléique monobrin capable de former un complexe avec le Facteur VII/Vlla humain, lorsqu'il est mis en contact avec ce dernier.
Les acides nucléiques se liant au Facteur VII/Vlla humain englobent donc ceux pour lesquels on peut détecter des complexes avec le Facteur VII/Vlla humain après une étape préalable de mise en contact desdits partenaires respectivement nucléique et protéique.
La détection de complexes formés entre un acide nucléique se liant au Facteur VII/Vlla humain peut être aisément réalisée par l'homme du métier, par exemple en mettant en oeuvre une technique de détection par résonance plasmonique de surface, y compris la technique Biacore , comme cela est illustré dans les exemples. L'homme du métier peut aussi aisément détecter la formation de complexes entre un acide nucléique d'intérêt et le Facteur VII/Vlla humain par des techniques classiques du type ELISA, comme cela est également illustré dans les exemples.
Comme cela est illustré dans les exemples, un acide nucléique de formule (I) possède une forte capacité de liaison à tout type de Facteur VII/Vlla humain. En particulier, un acide nucléique de formule (I) se lie à la fois au Facteur VII/Vlla humain naturel et au Facteur VII/Vlla humain recombinant.
Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, le demandeur pense que les résultats présentés dans les exemples montrent qu'un acide nucléique de formule (I) selon l'invention possède une forte capacité à se lier à des facteurs VII/Vlla humains ayant des types distincts de glycosylation. En d'autres termes, le demandeur pense qu'un acide nucléique de formule (I) est capable de se lier efficacement, non seulement au Facteur VII/Vlla provenant de sources naturelles, y compris le plasma humain, mais également à un Facteur VII/Vlla humain recombinant produit dans un animal transgénique, préférentiellement un mammifère transgénique, de différentes espèces, y compris le lapin, dont les types de glycosylation
Dans d'autres modes de réalisation préférés d'un acide nucléique de formule (I) la séquence SEQ ID N X est choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID
N 3 à
SEQ ID N085 et SEQ ID N 87 à SEQ ID N0100.
Dans encore d'autres modes de réalisation préférés d'un acide nucléique de formule (I), la séquence SEQ ID N X est choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID N03, 5, 6, 10, 11, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 23, 24, 25, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 and 40.
Selon l'invention, un acide nucléique se liant au Facteur VII/Vlla humain consiste en un acide nucléique monobrin capable de former un complexe avec le Facteur VII/Vlla humain, lorsqu'il est mis en contact avec ce dernier.
Les acides nucléiques se liant au Facteur VII/Vlla humain englobent donc ceux pour lesquels on peut détecter des complexes avec le Facteur VII/Vlla humain après une étape préalable de mise en contact desdits partenaires respectivement nucléique et protéique.
La détection de complexes formés entre un acide nucléique se liant au Facteur VII/Vlla humain peut être aisément réalisée par l'homme du métier, par exemple en mettant en oeuvre une technique de détection par résonance plasmonique de surface, y compris la technique Biacore , comme cela est illustré dans les exemples. L'homme du métier peut aussi aisément détecter la formation de complexes entre un acide nucléique d'intérêt et le Facteur VII/Vlla humain par des techniques classiques du type ELISA, comme cela est également illustré dans les exemples.
Comme cela est illustré dans les exemples, un acide nucléique de formule (I) possède une forte capacité de liaison à tout type de Facteur VII/Vlla humain. En particulier, un acide nucléique de formule (I) se lie à la fois au Facteur VII/Vlla humain naturel et au Facteur VII/Vlla humain recombinant.
Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, le demandeur pense que les résultats présentés dans les exemples montrent qu'un acide nucléique de formule (I) selon l'invention possède une forte capacité à se lier à des facteurs VII/Vlla humains ayant des types distincts de glycosylation. En d'autres termes, le demandeur pense qu'un acide nucléique de formule (I) est capable de se lier efficacement, non seulement au Facteur VII/Vlla provenant de sources naturelles, y compris le plasma humain, mais également à un Facteur VII/Vlla humain recombinant produit dans un animal transgénique, préférentiellement un mammifère transgénique, de différentes espèces, y compris le lapin, dont les types de glycosylation
12 peuvent différer, même légèrement du type de glycosylation du Facteur VII/Vlla humain produit naturellement dans le plasma sanguin.
Selon l'invention, un acide nucléique se liant spécifiquement au Facteur VII/Vlla humain consiste en un acide nucléique possédant une capacité à se lier au Facteur VII/Vlla humain supérieure à sa capacité à se lier à toute autre protéine, y compris aux Facteurs VII/Vlla codés par le génome d'un mammifère non humain, tels que le Facteur VII/Vlla de lapin.
Au sens de la présente description, un premier acide nucléique possède une capacité à
se lier au Facteur VII/Vlla humain, supérieure à celle d'un second acide nucléique, lorsque, en utilisant l'une quelconque des techniques de détection de liaison ci-dessus, et dans les mêmes conditions d'essai, une valeur de signal de liaison supérieure statistiquement significative est obtenue avec le premier acide nucléique, par rapport à celle obtenue avec les seconds acides nucléiques. De manière illustrative, lorsque la technique de détection de liaison utilisée est la technique Biacore , comme dans les exemples, un premier acide nucléique possède une capacité à se lier au Facteur VII/Vlla humain, supérieure à celle d'un second acide nucléique, lorsque la valeur de signal de résonance pour le premier acide nucléique, quelle que soit l'unité
de mesure de résonance exprimée, est statistiquement supérieure à la valeur de signal de résonance mesurée pour le second acide nucléique. Deux valeurs de mesure statistiquement distinctes englobent deux valeurs qui ont entre elles un écart supérieur à
l'erreur de mesure de la technique de détection de liaison utilisée.
Comme cela est illustré dans les exemples, on a testé la capacité des acides nucléiques de l'invention à se lier spécifiquement au Facteur VII/Vlla humain.
De manière générale, un acide nucléique de formule (I) possède une valeur de constante de dissociation pour le facteur VII/VIIA humain d'au plus 500 nM, mieux d'au plus 200 nM.
On a montré que les acides nucléiques de formule (I) ont une capacité à se lier au Facteur VII/Vlla humain qui est significativement supérieure à leur capacité
de liaison à
n'importe quel Facteur VII/Vlla provenant d'un mammifère non humain. En particulier, alors qu'un acide nucléique de formule (I) possède une forte capacité à se lier à
tout type de Facteur VII/Vlla humain, y compris naturel ou recombinant, il a une capacité faible ou nulle à se lier à
un Facteur VII/Vlla codé par le génome d'un mammifère non humain, y compris un Facteur VII/Vlla de lapin.
Cette caractéristique avantageuse d'un acide nucléique de formule (I) est illustrée dans les exemples notamment avec l'acide nucléique de séquence SEQ ID N 86, qui consiste en un acide nucléique de formule (I) dans lequel la séquence SEQ ID N X consiste en la séquence SEQ ID N 85 et dont la structure, après son couplage avec du PEG et de la biotine, est représentée sur la figure 9.
Ainsi, pour l'acide nucléique de formule (I) de séquence SEQ ID N 86, on a déterminé
selon la technique Biacore , que la valeur de capacité de liaison au Facteur VII/Vlla humain,
Selon l'invention, un acide nucléique se liant spécifiquement au Facteur VII/Vlla humain consiste en un acide nucléique possédant une capacité à se lier au Facteur VII/Vlla humain supérieure à sa capacité à se lier à toute autre protéine, y compris aux Facteurs VII/Vlla codés par le génome d'un mammifère non humain, tels que le Facteur VII/Vlla de lapin.
Au sens de la présente description, un premier acide nucléique possède une capacité à
se lier au Facteur VII/Vlla humain, supérieure à celle d'un second acide nucléique, lorsque, en utilisant l'une quelconque des techniques de détection de liaison ci-dessus, et dans les mêmes conditions d'essai, une valeur de signal de liaison supérieure statistiquement significative est obtenue avec le premier acide nucléique, par rapport à celle obtenue avec les seconds acides nucléiques. De manière illustrative, lorsque la technique de détection de liaison utilisée est la technique Biacore , comme dans les exemples, un premier acide nucléique possède une capacité à se lier au Facteur VII/Vlla humain, supérieure à celle d'un second acide nucléique, lorsque la valeur de signal de résonance pour le premier acide nucléique, quelle que soit l'unité
de mesure de résonance exprimée, est statistiquement supérieure à la valeur de signal de résonance mesurée pour le second acide nucléique. Deux valeurs de mesure statistiquement distinctes englobent deux valeurs qui ont entre elles un écart supérieur à
l'erreur de mesure de la technique de détection de liaison utilisée.
Comme cela est illustré dans les exemples, on a testé la capacité des acides nucléiques de l'invention à se lier spécifiquement au Facteur VII/Vlla humain.
De manière générale, un acide nucléique de formule (I) possède une valeur de constante de dissociation pour le facteur VII/VIIA humain d'au plus 500 nM, mieux d'au plus 200 nM.
On a montré que les acides nucléiques de formule (I) ont une capacité à se lier au Facteur VII/Vlla humain qui est significativement supérieure à leur capacité
de liaison à
n'importe quel Facteur VII/Vlla provenant d'un mammifère non humain. En particulier, alors qu'un acide nucléique de formule (I) possède une forte capacité à se lier à
tout type de Facteur VII/Vlla humain, y compris naturel ou recombinant, il a une capacité faible ou nulle à se lier à
un Facteur VII/Vlla codé par le génome d'un mammifère non humain, y compris un Facteur VII/Vlla de lapin.
Cette caractéristique avantageuse d'un acide nucléique de formule (I) est illustrée dans les exemples notamment avec l'acide nucléique de séquence SEQ ID N 86, qui consiste en un acide nucléique de formule (I) dans lequel la séquence SEQ ID N X consiste en la séquence SEQ ID N 85 et dont la structure, après son couplage avec du PEG et de la biotine, est représentée sur la figure 9.
Ainsi, pour l'acide nucléique de formule (I) de séquence SEQ ID N 86, on a déterminé
selon la technique Biacore , que la valeur de capacité de liaison au Facteur VII/Vlla humain,
13 exprimée comme la constante de dissociation Kd, est d'environ 100 nM. De plus, ledit acide nucléique de formule (I) possède une capacité de liaison du même ordre de grandeur à la fois au Facteur VII/Vlla humain plasmatique et à un Facteur VII/VIIa humain recombinant, par exemple produit chez un lapin transgénique.
On a aussi montré dans les exemples que les complexes entre un acide nucléique de formule (I) et un Facteur VII/VIIa humain sont stoechiométriques, c'est à dire que le rapport du nombre de molécules d'acide nucléique de formule (I) au nombre de molécules de Facteur VII/VIIa humain complexées est d'environ 1::1, et peut être plus particulièrement de 1::1.
Ainsi, selon un autre aspect, la capacité d'un acide nucléique de formule (I) à de lier spécifiquement au Facteur VII/VIIa humain peut aussi être exprimé comme le rapport des constantes de dissociation Kd, respectivement pour le Facteur VII/VIIa humain et un Facteur VII/VIIa non humain.
Selon encore une autre caractéristique d'un acide nucléique de formule (I) selon l'invention, la capacité dudit acide nucléique à se lier spécifiquement au Facteur VII/VIIa humain peut aussi être exprimée par la condition (A) suivante :
Kd humain/Kd non-humain < 0,01 (A), dans laquelle :
Kd humain est la constante de dissociation d'un acide nucléique de formule (I) pour la Facteur VII/VIIa humain, exprimée en unités molaires, et Kd non-humain est la constante de dissociation dudit acide nucléique de formule (I) pour un Facteur VII/VIIa non humain, exprimée dans les mêmes unités molaires.
Ainsi, pour un acide nucléique se liant spécifiquement au Facteur VII/VIIa humain selon l'invention, le rapport Kd humain/Kd non-humain est préférentiellement inférieur à 0,01, mieux inférieur à 0,001.
Ces caractéristiques de spécificité de la liaison d'un acide nucléique de formule (I) selon l'invention au Facteur VII/VIIa humain illustrent que les acides nucléiques aptamères de l'invention peuvent être avantageusement utilisés pour discriminer entre un Facteur VII/VIIa humain et un Facteur VII/VIIa provenant d'un mammifère non humain, par exemple un Facteur VII/VIla de lapin.
En particulier, un acide nucléique de formule (I) selon l'invention peut être avantageusement utilisé dans un moyen de purification d'un Facteur VII/VIIa humain, y compris à partir d'un milieu de départ complexe susceptible de contenir un Facteur VII/VIIa provenant d'un mammifère non humain. Notamment, un acide nucléique de formule (I) peut être utilisé
dans un moyen de purification du Facteur VII/VIIa recombinant dans un fluide biologique d'un lapin transgénique pour le Facteur VII/VIIa humain, ledit fluide biologique étant susceptible de contenir un Facteur VII/VIIa produit naturellement par le lapin.
Comme cela est illustré dans les exemples, une autre caractéristique d'un acide nucléique de formule (I) est son aptitude, dans un complexe avec le Facteur VII/VIIa humain, à
On a aussi montré dans les exemples que les complexes entre un acide nucléique de formule (I) et un Facteur VII/VIIa humain sont stoechiométriques, c'est à dire que le rapport du nombre de molécules d'acide nucléique de formule (I) au nombre de molécules de Facteur VII/VIIa humain complexées est d'environ 1::1, et peut être plus particulièrement de 1::1.
Ainsi, selon un autre aspect, la capacité d'un acide nucléique de formule (I) à de lier spécifiquement au Facteur VII/VIIa humain peut aussi être exprimé comme le rapport des constantes de dissociation Kd, respectivement pour le Facteur VII/VIIa humain et un Facteur VII/VIIa non humain.
Selon encore une autre caractéristique d'un acide nucléique de formule (I) selon l'invention, la capacité dudit acide nucléique à se lier spécifiquement au Facteur VII/VIIa humain peut aussi être exprimée par la condition (A) suivante :
Kd humain/Kd non-humain < 0,01 (A), dans laquelle :
Kd humain est la constante de dissociation d'un acide nucléique de formule (I) pour la Facteur VII/VIIa humain, exprimée en unités molaires, et Kd non-humain est la constante de dissociation dudit acide nucléique de formule (I) pour un Facteur VII/VIIa non humain, exprimée dans les mêmes unités molaires.
Ainsi, pour un acide nucléique se liant spécifiquement au Facteur VII/VIIa humain selon l'invention, le rapport Kd humain/Kd non-humain est préférentiellement inférieur à 0,01, mieux inférieur à 0,001.
Ces caractéristiques de spécificité de la liaison d'un acide nucléique de formule (I) selon l'invention au Facteur VII/VIIa humain illustrent que les acides nucléiques aptamères de l'invention peuvent être avantageusement utilisés pour discriminer entre un Facteur VII/VIIa humain et un Facteur VII/VIIa provenant d'un mammifère non humain, par exemple un Facteur VII/VIla de lapin.
En particulier, un acide nucléique de formule (I) selon l'invention peut être avantageusement utilisé dans un moyen de purification d'un Facteur VII/VIIa humain, y compris à partir d'un milieu de départ complexe susceptible de contenir un Facteur VII/VIIa provenant d'un mammifère non humain. Notamment, un acide nucléique de formule (I) peut être utilisé
dans un moyen de purification du Facteur VII/VIIa recombinant dans un fluide biologique d'un lapin transgénique pour le Facteur VII/VIIa humain, ledit fluide biologique étant susceptible de contenir un Facteur VII/VIIa produit naturellement par le lapin.
Comme cela est illustré dans les exemples, une autre caractéristique d'un acide nucléique de formule (I) est son aptitude, dans un complexe avec le Facteur VII/VIIa humain, à
14 libérer le Facteur VII/Vlla humain par incubation dudit complexe avec un agent chélateur de cations métalliques. On a notamment montré que les molécules de Facteur VII/VIIa complexées avec un acide nucléique de formule (I) sont libérées desdits complexes par mise en contact avec un agent chélateur de cations métalliques tel que l'EDTA.
Ainsi, selon encore un autre aspect, la liaison d'un acide nucléique de formule (I) selon l'invention au facteur VII/VIIa humain peut être dissociée par mise en contact avec un agent chélateur des cations métalliques, y compris par mise en contact avec de I'EDTA.
Cette caractéristique additionnelle d'un acide nucléique de formule (I) selon l'invention est particulièrement avantageuse pour l'utilisation dudit acide nucléique dans un moyen de purification du Facteur VII/VIIa humain. En effet, dans un telle application pour la purification, le Facteur VII/VIIa humain, immobilisé dans un complexe avec un acide nucléique de formule (I), peut ensuite être récupéré sous forme purifiée par simple mise en contact ou incubation avec un agent chélateur des cations métalliques, donc sans nécessiter l'emploi de substances connues pour dénaturer, au moins partiellement, le Facteur VII/VIIa humain, comme les conditions acides ou l'urée.
Pour son utilisation dans un moyen de purification du Facteur VII/VIIa humain, un acide nucléique de formule (I) selon l'invention est préférentiellement immobilisé
sur un support solide. Ledit support solide englobe des particules solides, des supports de chromatographie, etc. Les techniques d'immobilisation d'acides nucléiques d'intérêt sur des types très variés de supports solides sont bien connues par l'homme du métier.
Le support solide peut être une colonne de chromatographie d'affinité composée d'un gel dérivé de l'agarose, de la cellulose ou d'un gel synthétique tel qu'un dérivé acrylamide, méthacrylate ou polystyrène, une puce telle qu'une puce adaptée à la résonance plasmonique de surface, une membrane telle qu'une membrane polyamide, polyacrylonitrile ou polyester ou encore une bille magnétique ou paramagnétique.
Pour son utilisation dans un moyen de purification du Facteur VII/VIIa humain, un acide nucléique de formule (I) selon l'invention est préférentiellement inclus dans une structure chimique comprenant également un moyen espaceur et, le cas échéant, un moyen d'immobilisation sur un support solide.
Ainsi, la présente invention est également relative à un composé se liant spécifiquement au facteur VII/VIIa humain, caractérisé en ce qu'il est de formule (II) suivante [SPAC]- [NUCL] (II), dans laquelle :
- [SPAC] signifie une chaîne espaceur, et - [NUCL] signifie un acide nucléique se liant spécifiquement au Facteur VII/VIIa humain comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 40%
d'identité en nucléotides avec l'acide nucléique de formule (I).
Le composé ci-dessus constitue un mode de réalisation particulier d'un moyen de purification du Facteur VII/VIIa humain.
La chaîne espaceur désignée [SPAC] dans le composé de formule (II) peut être de tout type connu. Ladite chaîne espaceur a pour fonction d'éloigner physiquement l'acide nucléique [NUCL] de la surface du support solide sur lequel ledit composé peut être immobilisé
et de permettre une mobilité relative de l'acide nucléique [NUCL], par rapport à la surface du 5 support solide sur lequel il peut être immobilisé. La chaîne espaceur limite ou évite que des encombrements stériques, dus à une trop grande proximité du support solide avec l'acide nucléique de formule (I), gênent les évènements de liaison entre ledit acide nucléique et des molécules de Facteur VII/Vlla humain susceptibles d'être mises en contact avec celui-ci.
Dans le composé de formule (II), la chaîne espaceur est liée préférentiellement à
10 l'extrémité 5' ou à l'extrémité 3' de l'acide nucléique [NUCL].
Avantageusement la chaîne espaceur est liée à la fois à une extrémité de l'aptamère et au support solide. Cette construction avec espaceur a pour avantage de ne pas immobiliser directement l'aptamère sur le support solide. De préférence la chaîne espaceur est un oligonucléotide non spécifique ou du Polyéthylène Glycol (PEG). Lorsque la chaîne espaceur
Ainsi, selon encore un autre aspect, la liaison d'un acide nucléique de formule (I) selon l'invention au facteur VII/VIIa humain peut être dissociée par mise en contact avec un agent chélateur des cations métalliques, y compris par mise en contact avec de I'EDTA.
Cette caractéristique additionnelle d'un acide nucléique de formule (I) selon l'invention est particulièrement avantageuse pour l'utilisation dudit acide nucléique dans un moyen de purification du Facteur VII/VIIa humain. En effet, dans un telle application pour la purification, le Facteur VII/VIIa humain, immobilisé dans un complexe avec un acide nucléique de formule (I), peut ensuite être récupéré sous forme purifiée par simple mise en contact ou incubation avec un agent chélateur des cations métalliques, donc sans nécessiter l'emploi de substances connues pour dénaturer, au moins partiellement, le Facteur VII/VIIa humain, comme les conditions acides ou l'urée.
Pour son utilisation dans un moyen de purification du Facteur VII/VIIa humain, un acide nucléique de formule (I) selon l'invention est préférentiellement immobilisé
sur un support solide. Ledit support solide englobe des particules solides, des supports de chromatographie, etc. Les techniques d'immobilisation d'acides nucléiques d'intérêt sur des types très variés de supports solides sont bien connues par l'homme du métier.
Le support solide peut être une colonne de chromatographie d'affinité composée d'un gel dérivé de l'agarose, de la cellulose ou d'un gel synthétique tel qu'un dérivé acrylamide, méthacrylate ou polystyrène, une puce telle qu'une puce adaptée à la résonance plasmonique de surface, une membrane telle qu'une membrane polyamide, polyacrylonitrile ou polyester ou encore une bille magnétique ou paramagnétique.
Pour son utilisation dans un moyen de purification du Facteur VII/VIIa humain, un acide nucléique de formule (I) selon l'invention est préférentiellement inclus dans une structure chimique comprenant également un moyen espaceur et, le cas échéant, un moyen d'immobilisation sur un support solide.
Ainsi, la présente invention est également relative à un composé se liant spécifiquement au facteur VII/VIIa humain, caractérisé en ce qu'il est de formule (II) suivante [SPAC]- [NUCL] (II), dans laquelle :
- [SPAC] signifie une chaîne espaceur, et - [NUCL] signifie un acide nucléique se liant spécifiquement au Facteur VII/VIIa humain comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 40%
d'identité en nucléotides avec l'acide nucléique de formule (I).
Le composé ci-dessus constitue un mode de réalisation particulier d'un moyen de purification du Facteur VII/VIIa humain.
La chaîne espaceur désignée [SPAC] dans le composé de formule (II) peut être de tout type connu. Ladite chaîne espaceur a pour fonction d'éloigner physiquement l'acide nucléique [NUCL] de la surface du support solide sur lequel ledit composé peut être immobilisé
et de permettre une mobilité relative de l'acide nucléique [NUCL], par rapport à la surface du 5 support solide sur lequel il peut être immobilisé. La chaîne espaceur limite ou évite que des encombrements stériques, dus à une trop grande proximité du support solide avec l'acide nucléique de formule (I), gênent les évènements de liaison entre ledit acide nucléique et des molécules de Facteur VII/Vlla humain susceptibles d'être mises en contact avec celui-ci.
Dans le composé de formule (II), la chaîne espaceur est liée préférentiellement à
10 l'extrémité 5' ou à l'extrémité 3' de l'acide nucléique [NUCL].
Avantageusement la chaîne espaceur est liée à la fois à une extrémité de l'aptamère et au support solide. Cette construction avec espaceur a pour avantage de ne pas immobiliser directement l'aptamère sur le support solide. De préférence la chaîne espaceur est un oligonucléotide non spécifique ou du Polyéthylène Glycol (PEG). Lorsque la chaîne espaceur
15 consiste en un oligonucléotide non spécifique, ledit oligonucléotide comprend avantageusement au moins 5 nucléotides de longueur, de préférence entre 5 et 15 nucléotides de longueur.
Dans les modes de réalisation d'un composé de formule (II) dans lesquels la chaîne espaceur consiste en un Polyéthylène Glycol, ladite chaîne espaceur englobe un polyéthylène glycol de type PEG(C18).
Pour immobiliser l'aptamère directement sur le support solide, ou sur la chaîne espaceur, l'acide nucléique [NUCL] peut être modifié chimiquement avec différents groupements chimiques tels que des groupements permettant d'immobiliser ledit acide nucléique de façon covalente, tels que des thiols, des amines ou tout autre groupement capable de réagir avec des groupements chimiques présents sur le support solide. Dans certains modes de réalisation, la chaîne espaceur est-elle-même apte à être immobilisée sur le support solide, le cas échéant après modification de ladite chaîne espaceur avec un ou plusieurs groupements chimiques appropriés. Dans encore d'autres modes de réalisation, la chaîne espaceur est liée à
un composé permettant l'immobilisation du composé d'intérêt comprenant l'aptamère nucléique sur le support mobile.
Ainsi, la présente invention est également relative à un composé se liant spécifiquement au facteur VII/Vlla humain, caractérisé en ce qu'il est de formule (III) suivante [FIX]-[SPAC]- [NUCL] (III), dans laquelle :
- [FIX] signifie un composé d'immobilisation sur un support, - [SPAC] signifie une chaîne espaceur, et - [NUCL] signifie un acide nucléique se liant spécifiquement au Facteur VII/Vlla humain comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 40%
d'identité en nucléotides avec l'acide nucléique de formule (I).
Dans les modes de réalisation d'un composé de formule (II) dans lesquels la chaîne espaceur consiste en un Polyéthylène Glycol, ladite chaîne espaceur englobe un polyéthylène glycol de type PEG(C18).
Pour immobiliser l'aptamère directement sur le support solide, ou sur la chaîne espaceur, l'acide nucléique [NUCL] peut être modifié chimiquement avec différents groupements chimiques tels que des groupements permettant d'immobiliser ledit acide nucléique de façon covalente, tels que des thiols, des amines ou tout autre groupement capable de réagir avec des groupements chimiques présents sur le support solide. Dans certains modes de réalisation, la chaîne espaceur est-elle-même apte à être immobilisée sur le support solide, le cas échéant après modification de ladite chaîne espaceur avec un ou plusieurs groupements chimiques appropriés. Dans encore d'autres modes de réalisation, la chaîne espaceur est liée à
un composé permettant l'immobilisation du composé d'intérêt comprenant l'aptamère nucléique sur le support mobile.
Ainsi, la présente invention est également relative à un composé se liant spécifiquement au facteur VII/Vlla humain, caractérisé en ce qu'il est de formule (III) suivante [FIX]-[SPAC]- [NUCL] (III), dans laquelle :
- [FIX] signifie un composé d'immobilisation sur un support, - [SPAC] signifie une chaîne espaceur, et - [NUCL] signifie un acide nucléique se liant spécifiquement au Facteur VII/Vlla humain comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 40%
d'identité en nucléotides avec l'acide nucléique de formule (I).
16 Le composé de formule (III) ci-dessus constitue un mode de réalisation d'un moyen de purification du Facteur VII/Vlla humain.
Ledit moyen de purification du Facteur VII/Vlla humain de formule (II) ou de formule (III) se présente préférentiellement sous une forme liée à un support solide.
Dans le composé de formule (III) le composé [FIX] consiste en un composé
choisi parmi (i) un composé capable de former une ou plusieurs liaisons covalente avec le matériau de surface d'un support solide et (ii) un composé capable de se lier spécifiquement sur le support solide par l'intermédiaire de liaison faibles non covalentes, y compris des liaisons hydrogènes, des forces électrostatiques ou des forces de Van der Waals.
Le premier type de composé [FIX] englobe les agents de couplage bifonctionnels, comme le glutaraldéhyde, le SIAB ou encore le SMCC.
Le composé SIAB, décrit par Hermanson G.T. (1996, Bioconjugate techniques, San Diego : Academic Press, pp 239-242), est le composé de formule (I) suivante Na+ I - O
O=S
I~ N-O O
O
O
(I) Le composé SIAB comprend deux groupes réactifs, respectivement un groupe iodoacétate et un groupe ester Sulfo-NHS, ces groupes réagissant respectivement sur des groupes amino et sulfhydryl.
Le composé SMCC, qui est décrit par Samoszuk M.K. et al. (1989, Antibody, Immunoconjugates Radiopharm., 2(l) : 37-46), est le composé de formule (II) suivante :
Na+ O
O
N-O
O
O
K_:>_ 25 (II) Le composé SMCC comprend deux groupes réactifs, respectivement un groupe ester Sulfo-NHS et un groupe maléimide, qui réagissent respectivement avec un groupe amino et un groupe sulfhydryl.
Ledit moyen de purification du Facteur VII/Vlla humain de formule (II) ou de formule (III) se présente préférentiellement sous une forme liée à un support solide.
Dans le composé de formule (III) le composé [FIX] consiste en un composé
choisi parmi (i) un composé capable de former une ou plusieurs liaisons covalente avec le matériau de surface d'un support solide et (ii) un composé capable de se lier spécifiquement sur le support solide par l'intermédiaire de liaison faibles non covalentes, y compris des liaisons hydrogènes, des forces électrostatiques ou des forces de Van der Waals.
Le premier type de composé [FIX] englobe les agents de couplage bifonctionnels, comme le glutaraldéhyde, le SIAB ou encore le SMCC.
Le composé SIAB, décrit par Hermanson G.T. (1996, Bioconjugate techniques, San Diego : Academic Press, pp 239-242), est le composé de formule (I) suivante Na+ I - O
O=S
I~ N-O O
O
O
(I) Le composé SIAB comprend deux groupes réactifs, respectivement un groupe iodoacétate et un groupe ester Sulfo-NHS, ces groupes réagissant respectivement sur des groupes amino et sulfhydryl.
Le composé SMCC, qui est décrit par Samoszuk M.K. et al. (1989, Antibody, Immunoconjugates Radiopharm., 2(l) : 37-46), est le composé de formule (II) suivante :
Na+ O
O
N-O
O
O
K_:>_ 25 (II) Le composé SMCC comprend deux groupes réactifs, respectivement un groupe ester Sulfo-NHS et un groupe maléimide, qui réagissent respectivement avec un groupe amino et un groupe sulfhydryl.
17 Le second type de composé [FIX] englobe la biotine, qui est capable de se lier de manière spécifique non covalente à des molécules d'avidine ou de streptavidine présentes sur le support solide.
Dans certains modes de réalisation, une fois immobilisé sur le support solide via la chaîne espaceur, l'aptamère est avantageusement modifié à son extrémité libre (extrémité non liée à l'espaceur) grâce à, et sans s'y limiter, un nucléotide chimiquement modifié (tel que 2'-O-methyl ou 2'-fluoropyrimidine, 2'-ribopurine, phosphoramidite), un nucléotide inversé ou un groupement chimique (PEG, polycations, cholestérol). Ces modifications permettent de protéger certains aptamères des dégradations enzymatiques.
Le support solide peut être une colonne de chromatographie d'affinité composée d'un gel dérivé de l'agarose, de la cellulose ou d'un gel synthétique tel qu'un dérivé acrylamide, méthacrylate ou polystyrène, une puce telle qu'une puce adaptée à la résonance plasmonique de surface, une membrane telle qu'une membrane polyamide, polyacrylonitrile ou polyester, une bille magnétique ou paramagnétique.
La présente invention est également relative à un complexe entre :
(i) une substance choisie parmi un acide nucléique de formule (I), un composé
de formule (II) et un composé de formule (III), et (ii) un Facteur Vll/Vlla humain.
La présente invention a aussi pour objet un support pour l'immobilisation du Facteur VII/Vlla humain, caractérisé en ce qu'il comprend un matériau support solide sur lequel sont greffées une pluralité de molécules consistant chacune en, ou comprenant chacune, un aptamère nucléique, lesdites molécules étant choisies parmi (a) un acide nucléique de formule (I), (b) un composé de formule (II) et (c) un composé de formule (III).
Le support ci-dessus peut être utilisé pratiquement dans toutes les applications pour lesquelles on cherche à immobiliser le Facteur VII/Vlla humain, ce qui englobe les applications à des fins de purification du Facteur VII/Vlla et les applications à des fins de détection du Facteur VII/Vlla humain.
La réalisation de supports sur lesquels sont immobilisés des aptamères nucléiques de l'invention se liant spécifiquement au Facteur VII/Vlla humain sont largement illustrés dans les exemples, dans lesquels les aptamères de l'invention sont utilisés notamment comme agents de capture du FVII/Vlla humain, utilisables pour la purification ou pour la détection du FVII/Vlla humain dans des échantillons.
La présente invention concerne donc aussi un procédé pour l'immobilisation du facteur VII/Vlla humain sur un support, comprenant une étape au cours de laquelle on met en contact un échantillon comprenant du Facteur VII/Vlla humain avec un support solide sur lequel a été
préalablement immobilisée une substance choisie parmi un acide nucléique de formule (I), un composé de formule (II) et un composé de formule (III). Ledit procédé peut comprendre, selon les objectifs techniques poursuivis, une étape additionnelle de récupération des molécules de
Dans certains modes de réalisation, une fois immobilisé sur le support solide via la chaîne espaceur, l'aptamère est avantageusement modifié à son extrémité libre (extrémité non liée à l'espaceur) grâce à, et sans s'y limiter, un nucléotide chimiquement modifié (tel que 2'-O-methyl ou 2'-fluoropyrimidine, 2'-ribopurine, phosphoramidite), un nucléotide inversé ou un groupement chimique (PEG, polycations, cholestérol). Ces modifications permettent de protéger certains aptamères des dégradations enzymatiques.
Le support solide peut être une colonne de chromatographie d'affinité composée d'un gel dérivé de l'agarose, de la cellulose ou d'un gel synthétique tel qu'un dérivé acrylamide, méthacrylate ou polystyrène, une puce telle qu'une puce adaptée à la résonance plasmonique de surface, une membrane telle qu'une membrane polyamide, polyacrylonitrile ou polyester, une bille magnétique ou paramagnétique.
La présente invention est également relative à un complexe entre :
(i) une substance choisie parmi un acide nucléique de formule (I), un composé
de formule (II) et un composé de formule (III), et (ii) un Facteur Vll/Vlla humain.
La présente invention a aussi pour objet un support pour l'immobilisation du Facteur VII/Vlla humain, caractérisé en ce qu'il comprend un matériau support solide sur lequel sont greffées une pluralité de molécules consistant chacune en, ou comprenant chacune, un aptamère nucléique, lesdites molécules étant choisies parmi (a) un acide nucléique de formule (I), (b) un composé de formule (II) et (c) un composé de formule (III).
Le support ci-dessus peut être utilisé pratiquement dans toutes les applications pour lesquelles on cherche à immobiliser le Facteur VII/Vlla humain, ce qui englobe les applications à des fins de purification du Facteur VII/Vlla et les applications à des fins de détection du Facteur VII/Vlla humain.
La réalisation de supports sur lesquels sont immobilisés des aptamères nucléiques de l'invention se liant spécifiquement au Facteur VII/Vlla humain sont largement illustrés dans les exemples, dans lesquels les aptamères de l'invention sont utilisés notamment comme agents de capture du FVII/Vlla humain, utilisables pour la purification ou pour la détection du FVII/Vlla humain dans des échantillons.
La présente invention concerne donc aussi un procédé pour l'immobilisation du facteur VII/Vlla humain sur un support, comprenant une étape au cours de laquelle on met en contact un échantillon comprenant du Facteur VII/Vlla humain avec un support solide sur lequel a été
préalablement immobilisée une substance choisie parmi un acide nucléique de formule (I), un composé de formule (II) et un composé de formule (III). Ledit procédé peut comprendre, selon les objectifs techniques poursuivis, une étape additionnelle de récupération des molécules de
18 Facteur VII/Vlla humain immobilisées, complexées avec les molécules d'acides nucléiques de formule (I). L'étape additionnelle de récupération du Facteur VII/Vlla consiste préférentiellement en une étape de mise en contact des complexes de Facteur VII/Vlla avec les acides nucléiques de formule (I) avec un agent chélateur des cations métalliques, tel que l'EDTA.
La présente invention a encore pour objet un procédé pour la purification du Facteur VII/Vlla humain comprenant les étapes suivantes :
a) mettre en contact un échantillon comprenant du Facteur VII/Vlla humain avec un acide nucléique de formule (I), un composé de formule (II), un composé de formule (III) ou avec un support solide tel que défini dans la présente description, afin de former un complexe entre (i) ledit acide nucléique ou ledit support et (ii) le Facteur VII/Vlla humain, et b) libérer le Facteur VII/Vlla humain à partir du complexe former à l'étape a) et récupérer le Facteur Vll/Vlla humain purifié.
Pour la réalisation de procédés de purification de protéine par chromatographie d'affinité
en utilisant des supports solides sur lesquels sont immobilisés les aptamères d'intérêt, l'homme du métier peut se référer aux travaux décrits par Romig et al. (1999, J
Chomatogr B Biomed Sci Apl, Vol. 731(2) : 275-284).
On a montré dans les exemples que les conditions de capture du Facteur VII
sont améliorées lorsqu'on utilise à l'étape a) un tampon à concentration réduite en MgCl2 ou même un tampon exempt de MgCl2.
Par tampon à concentration réduite en MgCl2, on entend selon l'invention un tampon dont la concentration finale en MgCl2 est inférieure à 1 mM.
Un tampon dont la concentration en MgCl2 est inférieure à 1 mM englobe les tampons dont la concentration en MgCl2 est inférieure à 0,5 mM, 0,1 mM, 0,05 mM et 0,01 mM, avantageusement égale à 0 mM.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé comprend une étape a'), l'étape a' suivant l'étape a) et précédant l'étape b), qui consiste en une étape de lavage du support d'affinité avec un tampon de lavage. Avantageusement, le procédé comprend une étape a') de lavage du support d'affinité au cours de laquelle on augmente la force ionique, c'est à dire qu'on utilise un tampon de lavage dont la force ionique est augmentée par rapport à
la force ionique du tampon utilisé à l'étape a). Avantageusement, la force ionique du tampon de lavage utilisé à
l'étape a') est supérieure de 2 à 500 fois par rapport à la force ionique du tampon utilisé à
l'étape a). Avantageusement, la force ionique du tampon de lavage est supérieure de 100 à 500 fois, de préférence de 200 à 500 fois, par rapport à la force ionique du tampon utilisé à l'étape a).
On a montré dans les exemples que l'utilisation, à l'étape a') de lavage, d'un tampon de lavage ayant une force ionique élevée, en particulier un tampon ayant une concentration élevée en NaCI, permet d'éliminer efficacement les substances liées de manière non-spécifique au
La présente invention a encore pour objet un procédé pour la purification du Facteur VII/Vlla humain comprenant les étapes suivantes :
a) mettre en contact un échantillon comprenant du Facteur VII/Vlla humain avec un acide nucléique de formule (I), un composé de formule (II), un composé de formule (III) ou avec un support solide tel que défini dans la présente description, afin de former un complexe entre (i) ledit acide nucléique ou ledit support et (ii) le Facteur VII/Vlla humain, et b) libérer le Facteur VII/Vlla humain à partir du complexe former à l'étape a) et récupérer le Facteur Vll/Vlla humain purifié.
Pour la réalisation de procédés de purification de protéine par chromatographie d'affinité
en utilisant des supports solides sur lesquels sont immobilisés les aptamères d'intérêt, l'homme du métier peut se référer aux travaux décrits par Romig et al. (1999, J
Chomatogr B Biomed Sci Apl, Vol. 731(2) : 275-284).
On a montré dans les exemples que les conditions de capture du Facteur VII
sont améliorées lorsqu'on utilise à l'étape a) un tampon à concentration réduite en MgCl2 ou même un tampon exempt de MgCl2.
Par tampon à concentration réduite en MgCl2, on entend selon l'invention un tampon dont la concentration finale en MgCl2 est inférieure à 1 mM.
Un tampon dont la concentration en MgCl2 est inférieure à 1 mM englobe les tampons dont la concentration en MgCl2 est inférieure à 0,5 mM, 0,1 mM, 0,05 mM et 0,01 mM, avantageusement égale à 0 mM.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé comprend une étape a'), l'étape a' suivant l'étape a) et précédant l'étape b), qui consiste en une étape de lavage du support d'affinité avec un tampon de lavage. Avantageusement, le procédé comprend une étape a') de lavage du support d'affinité au cours de laquelle on augmente la force ionique, c'est à dire qu'on utilise un tampon de lavage dont la force ionique est augmentée par rapport à
la force ionique du tampon utilisé à l'étape a). Avantageusement, la force ionique du tampon de lavage utilisé à
l'étape a') est supérieure de 2 à 500 fois par rapport à la force ionique du tampon utilisé à
l'étape a). Avantageusement, la force ionique du tampon de lavage est supérieure de 100 à 500 fois, de préférence de 200 à 500 fois, par rapport à la force ionique du tampon utilisé à l'étape a).
On a montré dans les exemples que l'utilisation, à l'étape a') de lavage, d'un tampon de lavage ayant une force ionique élevée, en particulier un tampon ayant une concentration élevée en NaCI, permet d'éliminer efficacement les substances liées de manière non-spécifique au
19 support d'affinité sans simultanément affecter de manière détectable la liaison du Facteur VII au support d'affinité.
A l'étape a'), on utilise ainsi de préférence un tampon de lavage ayant une concentration finale en NaCI d'au moins 1 M.
Selon l'invention, un tampon de lavage ayant une concentration finale en NaCI
d'au moins 1 M englobe les tampons de lavage ayant une concentration finale en NaCI
d'au moins 1,5 M, 2 M, 2,5 M ou au moins 3 M.
De préférence un tampon de lavage utilisé à l'étape a') du procédé a une concentration finale en NaCI d'au plus 3,5 M. Avantageusement, un tampon de lavage utilisé à
l'étape a') du procédé a une concentration finale en NaCI comprise entre 1,5 et 3,5, de préférence entre 2 et 3,5, y compris de préférence entre 2,5 et 3,5, par exemple de préférence entre 3 et 3,5.
On a également montré dans les exemples que l'utilisation à l'étape a') d'un tampon de lavage ayant une hydrophobicité élevée, en particulier une concentration élevée en propylène glycol, permet d'éliminer efficacement les substances liées de manière non-spécifique au support d'affinité sans simultanément affecter de manière détectable la liaison du Facteur VII au support d'affinité.
A l'étape a'), on utilise ainsi de préférence un tampon de lavage ayant une teneur finale en propylène glycol d'au moins 20% (v/v).
Selon l'invention, un tampon de lavage ayant une teneur finale en propylène glycol d'au moins 20% englobe les tampons de lavage ayant une teneur finale en propylène glycol d'au moins 25% M, 30%, 35%, 40% , 45%, 50%, 55%, ou au moins 60% en volume, par rapport au volume total du tampon de lavage.
De préférence un tampon de lavage utilisé à l'étape a') du procédé a une teneur finale en propylène glycol d'au plus 50%. Avantageusement, un tampon de lavage utilisé à l'étape a') du procédé a une teneur finale en propylène glycol comprise entre 20% et 50%, de préférence entre 30% et 50%.
Selon un mode de réalisation particulier, le tampon de lavage utilisé à
l'étape a') contient à la fois du NaCI et du propylène glycol comme décrit ci-dessus.
De plus, dans certains modes de réalisation du procédé de purification ci-dessus, l'étape 3o b) est réalisée par la mise en contact du support d'affinité avec un tampon d'élution contenant un agent chélateur des ions divalents, de préférence l'EDTA.
A titre illustratif, le tampon d'élution peut contenir une concentration finale d'EDTA d'au moins 1 mM et d'au plus 30 mM.
L'expression au moins 1 mM englobe au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 mM.
L'expression au plus 30 mM englobe au plus 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 ou 11 mM.
De plus, la fabrication d'un support d'affinité comprenant un aptamère nucléique de l'invention et la réalisation d'un procédé de purification du Facteur VII
humain avec ledit support d'affinité est illustré dans les exemples.
De manière générale, les supports solides sur lesquels peuvent être immobilisés les 5 aptamères de l'invention englobe tout type de support ayant la structure et la composition retrouvée communément pour les supports de filtre, de support de silicium pour des puces, des membranes, etc. Les supports solides englobent notamment les résines, les résines pour colonne de chromatographie d'affinité, les billes de polymères, les billes magnétiques, etc. Les supports solides englobent aussi notamment les matériaux à base de verre ou de métal, tels 10 que l'acier, l'or, l'argent, l'aluminium, le cuivre, le silicium, le verre, la céramique. Les supports solides englobent aussi notamment des matériaux polymères, tels qu'un polyéthylène, un polypropylène, un polyamide, un fluorure de polyvinylidène, et des combinaisons de ceux-ci.
Le support solide peut être revêtu avec un matériau facilitant l'attachement, la fixation, la formation de complexes, l'immobilisation ou l'interaction avec les aptamères.
15 Dans certains modes de réalisation, le support solide est une lame de verre dont la surface est revêtue d'une couche d'or, d'une couche ayant subi un traitement par carboxyméthylation, d'une couche de dextran, de collagène, d'avidine, de streptavidine, etc.
De cette manière, les aptamères selon l'invention peuvent être immobilisés sur le support solide par l'intermédiaire d'un revêtement d'attachement, comme par exemple décrit ci-2o dessus, soit par réaction chimique avec création de liaisons covalentes, soit par association par des liaisons non covalentes telles que des liaisons hydrogène, des forces électrostatiques, des forces de Van der Waals, etc.
Selon l'invention, par support d'affinité , on entend de manière générale un support formé d'un matériau solide sur lequel on a immobilisé des aptamères nucléiques tels que définis dans la présente description.
Les exemples décrivent des modes de réalisation de supports solides sur lesquels sont immobilisés, par des liaisons non covalentes, les aptamères de l'invention.
Dans les exemples, on décrit notamment des supports solides consistant en une lame de verre revêtue d'une couche de molécules de streptavidine, et des aptamères de l'invention conjugués à une molécule de biotine qui sont immobilisé sur le support par association non covalente biotine/streptavidine.
Dans les exemples, on décrit aussi des supports solides consistant en un matériau de polystyrène revêtu d'une couche de molécules de streptavidine, et des aptamères de l'invention conjugués à une molécule de biotine qui sont immobilisé sur le support par association non covalente biotine/streptavidine.
Dans certains modes de réalisation, les aptamères de l'invention peuvent être immobilisés sur un support solide adapté pour la chromatographie d'affinité, l'électrochromatographie et l'électrophorèse capillaire, comme décrit par exemple par Ravelet et al. (2006, J Chromatogr A, Vol. 117(1) : 1-10), Connor et al. (2006, J
Chromatogr A, Vol.
111(2) : 115-119), Cho et al. (2004, Electrophoresis, Vol. 25 (21-22) : 3730-3739) ou encore Zhao et al. (2008, Anal Chem, Vol. 80(10) : 3915-3920).
Un aptamère de formule (I) ayant au moins 15 nucléotides de longueur et se liant spécifiquement au Facteur VII/VIIA humain, un composé de formule (11), ou un composé de formule (III), peut être aussi avantageusement utilisé comme agent de capture du FVII/Vlla humain, dans des procédés et dispositifs de détection ou de diagnostic.
Selon encore un autre aspect, la présente invention concerne aussi un procédé
pour détecter la présence de Facteur VII/Vlla humain dans un échantillon comprenant les étapes suivantes :
a) mettre en contact (i) un acide nucléique de formule (I), un composé de formule (ll) ou un composé de formule (III) ou un support solide sur lequel sont immobilisés une pluralité de molécules dudit acide nucléique ou dudit composé, avec (ii) ledit échantillon;
et b) détecter la formation de complexes entre (i) ledit acide nucléique de formule (I), ledit composé de formule (ll) ou ledit composé de formule (III) ou ledit support et (ii) le Facteur VII/Vl la.
Les exemples de la présente demande de brevet fournissent divers modes de réalisation de procédés de détection du FVII/Vlla humain avec des aptamères de l'invention préalablement immobilisés sur un support solide.
Pour la réalisation d'un procédé de détection selon l'invention, le support solide utilisé
peut être un support solide choisi parmi les supports solides décrits précédemment en relation avec le procédé de purification du Facteur VII/Vlla humain.
Pour la réalisation d'un procédé ou d'un dispositif de détection du Facteur VII/Vlla humain, l'homme du métier peut se référer notamment aux techniques décrites dans la demande de brevet européen n EP 1 972 693, la demande PCT n WO 2008/038696, la demande PCT n WO 2008/025830, ou encore la demande PCT n WO 2007/0322359.
Dans certains modes de réalisation, l'étape b) de détection de la formation de complexes entre (i) ledit acide nucléique ou ledit support solide et (ii) le Facteur VII/Vlla humain peut être réalisé par mesure du signal de résonance plasmonique de surface, comme cela est 3o décrit dans les exemples.
Dans certains autres modes de réalisation, l'étape b) de détection de la formation de complexes entre (i) ledit acide nucléique ou ledit support solide et (ii) le Facteur VII/Vlla humain peut être réalisée par la mise en contact desdits complexes éventuellement formés avec un ligand du Facteur VII/Vlla humain, ledit ligand étant détectable. Dans les exemples, on décrit ces modes de réalisation dans lesquels on utilise, comme ligand détectable du Facteur VII/Vlla humain, des anticorps monoclonaux ou polyclonaux anti-FVII/Vlla humain, marqués avec une enzyme, en l'occurrence la peroxydase de raifort, comme cela est conventionnellement utilisé
dans les tests de type ELISA.
Avantageusement, l'échantillon comprenant, ou susceptible de comprendre, du Facteur VII/Vlla humain consiste en un échantillon liquide qui contient le Facteur VII/Vlla humain, y compris un échantillon liquide comprenant le Facteur VII/Vlla humain et qui est susceptible de contenir aussi des molécules de Facteur VII/Vlla d'un mammifère non humain.
Dans certains modes de réalisation du procédé de purification ou du procédé de détection ci-dessus, ledit échantillon consiste en une solution biologique, tels qu'un fluide corporel, une cellule, un broyat cellulaire, un tissu, un broyat tissulaire, un organe ou un organisme entier.
Dans certains modes de réalisation du procédé de purification ou du procédé de détection ci-dessus, ledit échantillon consiste en une solution biologique liquide provenant d'un animal tel que du sang, un dérivé du sang (dérivé sanguin), du lait de mammifère ou un dérivé
du lait de mammifère. Ledit échantillon peut consister en du plasma, du cryoprécipité du plasma, du lait clarifié ou leurs dérivés.
Dans des modes de réalisation particulièrement préférés du procédé de purification ou du procédé de détection ci-dessus, ledit échantillon provient d'un animal transgénique pour le Facteur VII/Vlla humain. Avantageusement la solution est du lait de mammifère ou un dérivé du lait de mammifère transgénique pour le Facteur VII/Vlla humain. Au sens de l'invention, les animaux transgéniques englobent (i) les mammifères non humains tels que les vaches, les chèvres, les lapins, les porcs, les singes, les rats ou les souris, (ii) les oiseaux ou encore (iii) les insectes tels que les moustiques, les mouches ou les vers à soie. Dans certains modes de réalisation préférés, l'animal transgénique pour le Facteur VII/Vlla humain est un mammifère transgénique non humain, de manière tout à fait préférée une lapine transgénique pour le Facteur VII/Vlla humain. Avantageusement, le mammifère transgénique produit le Facteur VII/Vlla recombinant dans ses glandes mammaires, du fait de l'insertion dans son génome d'une cassette d'expression comprenant acide nucléique codant le Facteur VII/Vlla humain qui est placé sous le contrôle d'un promoteur spécifique permettant l'expression de la protéine transgénique dans le lait dudit mammifère transgénique.
Une méthode de production du Facteur VII/Vlla humain dans le lait d'un animal transgénique peut comporter les étapes suivantes : une molécule d'ADN
comprenant un gène codant le Facteur VII/Vlla humain, ledit gène étant sous le contrôle d'un promoteur d'une protéine sécrétée naturellement dans le lait (tels que le promoteur de la caséine, de la béta-caséine, de la lactalbumine, de la béta-lactoglobuline ou le promoteur WAP) est intégrée dans un embryon d'un mammifère non humain. L'embryon est ensuite placé dans une femelle de mammifère de la même espèce. Une fois que le mammifère issu de l'embryon s'est suffisamment développé, la lactation du mammifère est induite, puis le lait collecté. Le lait contient alors le Facteur VII/Vlla humain.
Un exemple de procédé de préparation de protéine dans le lait d'une femelle de mammifère autre que l'être humain est donné dans le document EP 0 527 063, dont l'enseignement peut être repris pour la production de la protéine de l'invention. Un plasmide contenant le promoteur WAP (Whey Acidic Protein) est fabriqué par introduction d'une séquence comportant le promoteur du gène WAP, ce plasmide étant réalisé de manière à
pouvoir recevoir un gène étranger placé sous la dépendance du promoteur WAP.
Le plasmide contenant le promoteur et le gène codant pour la protéine de l'invention sont utilisés pour obtenir des lapines transgéniques, par microinjection dans le pronucléus mâle d'embryons de lapines. Les embryons sont ensuite transférés dans l'oviducte de femelles hormonalement préparées. La présence des transgènes est révélée par la technique de Southern à partir de l'ADN extrait des lapereaux transgéniques obtenus. Les concentrations dans le lait des animaux sont évaluées à l'aide de tests radioimmunologiques spécifiques.
D'autres documents décrivent des procédés de préparation de protéines dans le lait d'une femelle de mammifère autre que l'homme. On peut citer, sans s'y limiter les documents US 7,045,676 (souris transgénique) et EP 1 739 170. (production de facteur von Willebrand dans un mammifère transgénique).
Selon d'autres aspects de la présente invention, un acide nucléique ayant au moins 15 nucléotides de longueur et se liant spécifiquement au Facteur VII/Vlla humain peut être utilisé in vivo, dans des situations physiologiques nécessitant de provoquer une inhibition de l'activation du Facteur X par le Facteur Vlla, par exemple en inhibant la formation d'un complexe fonctionnel Facteur VII/Facteur tissulaire ( Tissue Factor ).
En d'autres termes, un acide nucléique aptamère tel que défini dans la présente description peut aussi être utilisé, à titre préventif ou curatif, en tant que principe actif anticoagulant d'un médicament.
En particulier, un acide nucléique aptamère tel que défini dans la présente description peut être utilisé comme principe actif préventif ou curatif anticoagulant, notamment pour le traitement de troubles de la coagulation incluant les thromboses veineuses, les thromboses artérielles, les thromboses post-chirurgicales, les troubles associés aux pontages coronariens (CABG), les accidents vasculaires cérébraux, les angioplasties coronariennes percutanées transdermiques (PTCA), les métastases tumorales, les réactions inflammatoires non-sévères ou sévères, les chocs septiques, l'hypotension, le syndrome de détresse respiratoire aigu (ARDS), les embolismes pulmonaires, la coagulation intravasculaire disséminée (DIC), les 3o resténoses vasculaires, le dépôt de plaquettes, l'infarctus du myocarde, l'angiogénèse, et tout traitement prohylactique d'hommes ou de femmes ayant un risque de développer une thrombose.
La présente invention a aussi pour objet une composition pharmaceutique comprenant un acide nucléique ayant au moins 15 nucléotides de longueur se liant spécifiquement au facteur VII/Vlla humain tel que défini dans la présente description, en combinaison avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables.
La quantité d'acide nucléique aptamère anti-FVII/FVIIa humain selon l'invention, dans une composition pharmaceutique, est adaptée pour permettre l'administration d'une quantité
efficace de ce principe actif aux patients.
Les gammes de doses de l'aptamère anti-FVII/Vlla humain de l'invention peut être aisément déterminée par le médecin ou le pharmacien. En général, la quantité
de principe actif à administrer varie avec l'âge, la condition médicale, et le sexe du patient, ainsi qu'avec le degré d'extension de la maladie ou du degré du risque de développer la maladie, et peut être aisément déterminée par l'homme du métier.
En général, une composition pharmaceutique comprend une quantité d'un aptamère anti-FVII/Vlla humain allant de 1 nanogramme à 100 milligrammes par dose unitaire, mieux allant de 100 nanogrammes à 10 milligrammes par dose unitaire.
En général, une composition pharmaceutique selon l'invention comprend de 0,01%
à
99,9% en poids d'un aptamère anti-FVII/Vlla, ou d'une combinaison de plusieurs aptamères anti-FVII/Vlla, et de 99,9% à 0,01% en poids d'un excipient, ou d'une combinaison d'excipients, par rapport au poids total de ladite composition.
Dans certains modes de réalisation, ladite composition pharmaceutique comprend 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 aptamères anti-FVII/Vlla distincts.
Pour réaliser une composition pharmaceutique selon l'invention, l'homme du métier peut avantageusement se référer à l'ouvrage de Remington.
La composition pharmaceutique selon l'invention peut être utilisée pour une administration parentérale, topique ou locale et de manière prophylactique et/ou thérapeutique.
Ainsi un aptamère anti-FVII/Vlla humain selon la présente invention est préparé sous une forme adaptée au type d'administration choisi, par exemple sous forme liquide ou sous forme lyophilisée. Les compositions pharmaceutiques d'aptamères anti-FVII/Vlla humain selon la présente invention peuvent contenir un excipient et/ou un véhicule pharmaceutiquement acceptable, de préférence aqueux. De nombreux excipients et/ou véhicules pharmaceutiquement acceptables peuvent être utilisés, par exemple, l'eau, l'eau tamponnée, une solution saline, une solution de glycine et leurs dérivés ainsi que des agents nécessaires pour reproduire les conditions physiologiques comme par exemple des agents tampons et ajusteurs de pH, des surfactants comme l'acétate de sodium, le lactate de sodium, le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, le chlorure de calcium, cette liste n'étant pas limitative. De plus, la composition pharmaceutique peut être stérilisée par des techniques de stérilisation bien connues de l'homme du métier. De manière générale, pour fabriquer une composition pharmaceutique conforme à l'invention, l'homme du métier peut avantageusement se référer également à la dernière édition de la Pharmacopée Européenne, par exemple à la 5è édition de la Pharmacopée Européenne publiée en janvier 2005, ou bien encore à la 6è
édition de la Pharmacopée Européenne, disponible au public en juin 2007.
Pour la fabrication d'une composition pharmaceutique comprenant un aptamère comme principe actif, l'homme du métier peut également se référer au contenu de la demande PCT n WO 2007/058801, de la demande PCT n WO 2005/084412 et la demande PCT n WO
2004/047742. ou encore dans la demande PCT n WO 2008/150495.
5 Dans certains modes de réalisation d'une composition pharmaceutique selon l'invention, le ou les principes actifs aptamères anti-FVII/Vlla humain peut (peuvent) être utilisé(s) seul(s) ou en combinaison avec une ou plusieurs autres molécules pharmaceutiquement actives, y compris avec un ou plusieurs autres principes actifs anticoagulants.
L'invention est également relative à un acide nucléique ayant au moins 15 nucléotides 10 de longueur se liant spécifiquement au facteur VII/Vlla humain, tel que défini dans la présente description, pour son utilisation en tant que médicament.
L'invention a aussi trait à l'utilisation d'un acide nucléique ayant au moins 15 nucléotides de longueur se liant spécifiquement au facteur VII/Vlla humain, tel que défini dans la présente description, pour la fabrication d'un médicament pour le traitement des troubles de la 15 coagulation.
L'invention concerne aussi l'utilisation d'un acide nucléique ayant au moins nucléotides de longueur se liant spécifiquement au facteur VII/Vlla humain, tel que défini dans la présente description, pour le traitement des troubles de la coagulation.
L'invention a aussi pour objet une méthode de prévention ou de traitement d'un trouble
A l'étape a'), on utilise ainsi de préférence un tampon de lavage ayant une concentration finale en NaCI d'au moins 1 M.
Selon l'invention, un tampon de lavage ayant une concentration finale en NaCI
d'au moins 1 M englobe les tampons de lavage ayant une concentration finale en NaCI
d'au moins 1,5 M, 2 M, 2,5 M ou au moins 3 M.
De préférence un tampon de lavage utilisé à l'étape a') du procédé a une concentration finale en NaCI d'au plus 3,5 M. Avantageusement, un tampon de lavage utilisé à
l'étape a') du procédé a une concentration finale en NaCI comprise entre 1,5 et 3,5, de préférence entre 2 et 3,5, y compris de préférence entre 2,5 et 3,5, par exemple de préférence entre 3 et 3,5.
On a également montré dans les exemples que l'utilisation à l'étape a') d'un tampon de lavage ayant une hydrophobicité élevée, en particulier une concentration élevée en propylène glycol, permet d'éliminer efficacement les substances liées de manière non-spécifique au support d'affinité sans simultanément affecter de manière détectable la liaison du Facteur VII au support d'affinité.
A l'étape a'), on utilise ainsi de préférence un tampon de lavage ayant une teneur finale en propylène glycol d'au moins 20% (v/v).
Selon l'invention, un tampon de lavage ayant une teneur finale en propylène glycol d'au moins 20% englobe les tampons de lavage ayant une teneur finale en propylène glycol d'au moins 25% M, 30%, 35%, 40% , 45%, 50%, 55%, ou au moins 60% en volume, par rapport au volume total du tampon de lavage.
De préférence un tampon de lavage utilisé à l'étape a') du procédé a une teneur finale en propylène glycol d'au plus 50%. Avantageusement, un tampon de lavage utilisé à l'étape a') du procédé a une teneur finale en propylène glycol comprise entre 20% et 50%, de préférence entre 30% et 50%.
Selon un mode de réalisation particulier, le tampon de lavage utilisé à
l'étape a') contient à la fois du NaCI et du propylène glycol comme décrit ci-dessus.
De plus, dans certains modes de réalisation du procédé de purification ci-dessus, l'étape 3o b) est réalisée par la mise en contact du support d'affinité avec un tampon d'élution contenant un agent chélateur des ions divalents, de préférence l'EDTA.
A titre illustratif, le tampon d'élution peut contenir une concentration finale d'EDTA d'au moins 1 mM et d'au plus 30 mM.
L'expression au moins 1 mM englobe au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 mM.
L'expression au plus 30 mM englobe au plus 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 ou 11 mM.
De plus, la fabrication d'un support d'affinité comprenant un aptamère nucléique de l'invention et la réalisation d'un procédé de purification du Facteur VII
humain avec ledit support d'affinité est illustré dans les exemples.
De manière générale, les supports solides sur lesquels peuvent être immobilisés les 5 aptamères de l'invention englobe tout type de support ayant la structure et la composition retrouvée communément pour les supports de filtre, de support de silicium pour des puces, des membranes, etc. Les supports solides englobent notamment les résines, les résines pour colonne de chromatographie d'affinité, les billes de polymères, les billes magnétiques, etc. Les supports solides englobent aussi notamment les matériaux à base de verre ou de métal, tels 10 que l'acier, l'or, l'argent, l'aluminium, le cuivre, le silicium, le verre, la céramique. Les supports solides englobent aussi notamment des matériaux polymères, tels qu'un polyéthylène, un polypropylène, un polyamide, un fluorure de polyvinylidène, et des combinaisons de ceux-ci.
Le support solide peut être revêtu avec un matériau facilitant l'attachement, la fixation, la formation de complexes, l'immobilisation ou l'interaction avec les aptamères.
15 Dans certains modes de réalisation, le support solide est une lame de verre dont la surface est revêtue d'une couche d'or, d'une couche ayant subi un traitement par carboxyméthylation, d'une couche de dextran, de collagène, d'avidine, de streptavidine, etc.
De cette manière, les aptamères selon l'invention peuvent être immobilisés sur le support solide par l'intermédiaire d'un revêtement d'attachement, comme par exemple décrit ci-2o dessus, soit par réaction chimique avec création de liaisons covalentes, soit par association par des liaisons non covalentes telles que des liaisons hydrogène, des forces électrostatiques, des forces de Van der Waals, etc.
Selon l'invention, par support d'affinité , on entend de manière générale un support formé d'un matériau solide sur lequel on a immobilisé des aptamères nucléiques tels que définis dans la présente description.
Les exemples décrivent des modes de réalisation de supports solides sur lesquels sont immobilisés, par des liaisons non covalentes, les aptamères de l'invention.
Dans les exemples, on décrit notamment des supports solides consistant en une lame de verre revêtue d'une couche de molécules de streptavidine, et des aptamères de l'invention conjugués à une molécule de biotine qui sont immobilisé sur le support par association non covalente biotine/streptavidine.
Dans les exemples, on décrit aussi des supports solides consistant en un matériau de polystyrène revêtu d'une couche de molécules de streptavidine, et des aptamères de l'invention conjugués à une molécule de biotine qui sont immobilisé sur le support par association non covalente biotine/streptavidine.
Dans certains modes de réalisation, les aptamères de l'invention peuvent être immobilisés sur un support solide adapté pour la chromatographie d'affinité, l'électrochromatographie et l'électrophorèse capillaire, comme décrit par exemple par Ravelet et al. (2006, J Chromatogr A, Vol. 117(1) : 1-10), Connor et al. (2006, J
Chromatogr A, Vol.
111(2) : 115-119), Cho et al. (2004, Electrophoresis, Vol. 25 (21-22) : 3730-3739) ou encore Zhao et al. (2008, Anal Chem, Vol. 80(10) : 3915-3920).
Un aptamère de formule (I) ayant au moins 15 nucléotides de longueur et se liant spécifiquement au Facteur VII/VIIA humain, un composé de formule (11), ou un composé de formule (III), peut être aussi avantageusement utilisé comme agent de capture du FVII/Vlla humain, dans des procédés et dispositifs de détection ou de diagnostic.
Selon encore un autre aspect, la présente invention concerne aussi un procédé
pour détecter la présence de Facteur VII/Vlla humain dans un échantillon comprenant les étapes suivantes :
a) mettre en contact (i) un acide nucléique de formule (I), un composé de formule (ll) ou un composé de formule (III) ou un support solide sur lequel sont immobilisés une pluralité de molécules dudit acide nucléique ou dudit composé, avec (ii) ledit échantillon;
et b) détecter la formation de complexes entre (i) ledit acide nucléique de formule (I), ledit composé de formule (ll) ou ledit composé de formule (III) ou ledit support et (ii) le Facteur VII/Vl la.
Les exemples de la présente demande de brevet fournissent divers modes de réalisation de procédés de détection du FVII/Vlla humain avec des aptamères de l'invention préalablement immobilisés sur un support solide.
Pour la réalisation d'un procédé de détection selon l'invention, le support solide utilisé
peut être un support solide choisi parmi les supports solides décrits précédemment en relation avec le procédé de purification du Facteur VII/Vlla humain.
Pour la réalisation d'un procédé ou d'un dispositif de détection du Facteur VII/Vlla humain, l'homme du métier peut se référer notamment aux techniques décrites dans la demande de brevet européen n EP 1 972 693, la demande PCT n WO 2008/038696, la demande PCT n WO 2008/025830, ou encore la demande PCT n WO 2007/0322359.
Dans certains modes de réalisation, l'étape b) de détection de la formation de complexes entre (i) ledit acide nucléique ou ledit support solide et (ii) le Facteur VII/Vlla humain peut être réalisé par mesure du signal de résonance plasmonique de surface, comme cela est 3o décrit dans les exemples.
Dans certains autres modes de réalisation, l'étape b) de détection de la formation de complexes entre (i) ledit acide nucléique ou ledit support solide et (ii) le Facteur VII/Vlla humain peut être réalisée par la mise en contact desdits complexes éventuellement formés avec un ligand du Facteur VII/Vlla humain, ledit ligand étant détectable. Dans les exemples, on décrit ces modes de réalisation dans lesquels on utilise, comme ligand détectable du Facteur VII/Vlla humain, des anticorps monoclonaux ou polyclonaux anti-FVII/Vlla humain, marqués avec une enzyme, en l'occurrence la peroxydase de raifort, comme cela est conventionnellement utilisé
dans les tests de type ELISA.
Avantageusement, l'échantillon comprenant, ou susceptible de comprendre, du Facteur VII/Vlla humain consiste en un échantillon liquide qui contient le Facteur VII/Vlla humain, y compris un échantillon liquide comprenant le Facteur VII/Vlla humain et qui est susceptible de contenir aussi des molécules de Facteur VII/Vlla d'un mammifère non humain.
Dans certains modes de réalisation du procédé de purification ou du procédé de détection ci-dessus, ledit échantillon consiste en une solution biologique, tels qu'un fluide corporel, une cellule, un broyat cellulaire, un tissu, un broyat tissulaire, un organe ou un organisme entier.
Dans certains modes de réalisation du procédé de purification ou du procédé de détection ci-dessus, ledit échantillon consiste en une solution biologique liquide provenant d'un animal tel que du sang, un dérivé du sang (dérivé sanguin), du lait de mammifère ou un dérivé
du lait de mammifère. Ledit échantillon peut consister en du plasma, du cryoprécipité du plasma, du lait clarifié ou leurs dérivés.
Dans des modes de réalisation particulièrement préférés du procédé de purification ou du procédé de détection ci-dessus, ledit échantillon provient d'un animal transgénique pour le Facteur VII/Vlla humain. Avantageusement la solution est du lait de mammifère ou un dérivé du lait de mammifère transgénique pour le Facteur VII/Vlla humain. Au sens de l'invention, les animaux transgéniques englobent (i) les mammifères non humains tels que les vaches, les chèvres, les lapins, les porcs, les singes, les rats ou les souris, (ii) les oiseaux ou encore (iii) les insectes tels que les moustiques, les mouches ou les vers à soie. Dans certains modes de réalisation préférés, l'animal transgénique pour le Facteur VII/Vlla humain est un mammifère transgénique non humain, de manière tout à fait préférée une lapine transgénique pour le Facteur VII/Vlla humain. Avantageusement, le mammifère transgénique produit le Facteur VII/Vlla recombinant dans ses glandes mammaires, du fait de l'insertion dans son génome d'une cassette d'expression comprenant acide nucléique codant le Facteur VII/Vlla humain qui est placé sous le contrôle d'un promoteur spécifique permettant l'expression de la protéine transgénique dans le lait dudit mammifère transgénique.
Une méthode de production du Facteur VII/Vlla humain dans le lait d'un animal transgénique peut comporter les étapes suivantes : une molécule d'ADN
comprenant un gène codant le Facteur VII/Vlla humain, ledit gène étant sous le contrôle d'un promoteur d'une protéine sécrétée naturellement dans le lait (tels que le promoteur de la caséine, de la béta-caséine, de la lactalbumine, de la béta-lactoglobuline ou le promoteur WAP) est intégrée dans un embryon d'un mammifère non humain. L'embryon est ensuite placé dans une femelle de mammifère de la même espèce. Une fois que le mammifère issu de l'embryon s'est suffisamment développé, la lactation du mammifère est induite, puis le lait collecté. Le lait contient alors le Facteur VII/Vlla humain.
Un exemple de procédé de préparation de protéine dans le lait d'une femelle de mammifère autre que l'être humain est donné dans le document EP 0 527 063, dont l'enseignement peut être repris pour la production de la protéine de l'invention. Un plasmide contenant le promoteur WAP (Whey Acidic Protein) est fabriqué par introduction d'une séquence comportant le promoteur du gène WAP, ce plasmide étant réalisé de manière à
pouvoir recevoir un gène étranger placé sous la dépendance du promoteur WAP.
Le plasmide contenant le promoteur et le gène codant pour la protéine de l'invention sont utilisés pour obtenir des lapines transgéniques, par microinjection dans le pronucléus mâle d'embryons de lapines. Les embryons sont ensuite transférés dans l'oviducte de femelles hormonalement préparées. La présence des transgènes est révélée par la technique de Southern à partir de l'ADN extrait des lapereaux transgéniques obtenus. Les concentrations dans le lait des animaux sont évaluées à l'aide de tests radioimmunologiques spécifiques.
D'autres documents décrivent des procédés de préparation de protéines dans le lait d'une femelle de mammifère autre que l'homme. On peut citer, sans s'y limiter les documents US 7,045,676 (souris transgénique) et EP 1 739 170. (production de facteur von Willebrand dans un mammifère transgénique).
Selon d'autres aspects de la présente invention, un acide nucléique ayant au moins 15 nucléotides de longueur et se liant spécifiquement au Facteur VII/Vlla humain peut être utilisé in vivo, dans des situations physiologiques nécessitant de provoquer une inhibition de l'activation du Facteur X par le Facteur Vlla, par exemple en inhibant la formation d'un complexe fonctionnel Facteur VII/Facteur tissulaire ( Tissue Factor ).
En d'autres termes, un acide nucléique aptamère tel que défini dans la présente description peut aussi être utilisé, à titre préventif ou curatif, en tant que principe actif anticoagulant d'un médicament.
En particulier, un acide nucléique aptamère tel que défini dans la présente description peut être utilisé comme principe actif préventif ou curatif anticoagulant, notamment pour le traitement de troubles de la coagulation incluant les thromboses veineuses, les thromboses artérielles, les thromboses post-chirurgicales, les troubles associés aux pontages coronariens (CABG), les accidents vasculaires cérébraux, les angioplasties coronariennes percutanées transdermiques (PTCA), les métastases tumorales, les réactions inflammatoires non-sévères ou sévères, les chocs septiques, l'hypotension, le syndrome de détresse respiratoire aigu (ARDS), les embolismes pulmonaires, la coagulation intravasculaire disséminée (DIC), les 3o resténoses vasculaires, le dépôt de plaquettes, l'infarctus du myocarde, l'angiogénèse, et tout traitement prohylactique d'hommes ou de femmes ayant un risque de développer une thrombose.
La présente invention a aussi pour objet une composition pharmaceutique comprenant un acide nucléique ayant au moins 15 nucléotides de longueur se liant spécifiquement au facteur VII/Vlla humain tel que défini dans la présente description, en combinaison avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables.
La quantité d'acide nucléique aptamère anti-FVII/FVIIa humain selon l'invention, dans une composition pharmaceutique, est adaptée pour permettre l'administration d'une quantité
efficace de ce principe actif aux patients.
Les gammes de doses de l'aptamère anti-FVII/Vlla humain de l'invention peut être aisément déterminée par le médecin ou le pharmacien. En général, la quantité
de principe actif à administrer varie avec l'âge, la condition médicale, et le sexe du patient, ainsi qu'avec le degré d'extension de la maladie ou du degré du risque de développer la maladie, et peut être aisément déterminée par l'homme du métier.
En général, une composition pharmaceutique comprend une quantité d'un aptamère anti-FVII/Vlla humain allant de 1 nanogramme à 100 milligrammes par dose unitaire, mieux allant de 100 nanogrammes à 10 milligrammes par dose unitaire.
En général, une composition pharmaceutique selon l'invention comprend de 0,01%
à
99,9% en poids d'un aptamère anti-FVII/Vlla, ou d'une combinaison de plusieurs aptamères anti-FVII/Vlla, et de 99,9% à 0,01% en poids d'un excipient, ou d'une combinaison d'excipients, par rapport au poids total de ladite composition.
Dans certains modes de réalisation, ladite composition pharmaceutique comprend 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 aptamères anti-FVII/Vlla distincts.
Pour réaliser une composition pharmaceutique selon l'invention, l'homme du métier peut avantageusement se référer à l'ouvrage de Remington.
La composition pharmaceutique selon l'invention peut être utilisée pour une administration parentérale, topique ou locale et de manière prophylactique et/ou thérapeutique.
Ainsi un aptamère anti-FVII/Vlla humain selon la présente invention est préparé sous une forme adaptée au type d'administration choisi, par exemple sous forme liquide ou sous forme lyophilisée. Les compositions pharmaceutiques d'aptamères anti-FVII/Vlla humain selon la présente invention peuvent contenir un excipient et/ou un véhicule pharmaceutiquement acceptable, de préférence aqueux. De nombreux excipients et/ou véhicules pharmaceutiquement acceptables peuvent être utilisés, par exemple, l'eau, l'eau tamponnée, une solution saline, une solution de glycine et leurs dérivés ainsi que des agents nécessaires pour reproduire les conditions physiologiques comme par exemple des agents tampons et ajusteurs de pH, des surfactants comme l'acétate de sodium, le lactate de sodium, le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, le chlorure de calcium, cette liste n'étant pas limitative. De plus, la composition pharmaceutique peut être stérilisée par des techniques de stérilisation bien connues de l'homme du métier. De manière générale, pour fabriquer une composition pharmaceutique conforme à l'invention, l'homme du métier peut avantageusement se référer également à la dernière édition de la Pharmacopée Européenne, par exemple à la 5è édition de la Pharmacopée Européenne publiée en janvier 2005, ou bien encore à la 6è
édition de la Pharmacopée Européenne, disponible au public en juin 2007.
Pour la fabrication d'une composition pharmaceutique comprenant un aptamère comme principe actif, l'homme du métier peut également se référer au contenu de la demande PCT n WO 2007/058801, de la demande PCT n WO 2005/084412 et la demande PCT n WO
2004/047742. ou encore dans la demande PCT n WO 2008/150495.
5 Dans certains modes de réalisation d'une composition pharmaceutique selon l'invention, le ou les principes actifs aptamères anti-FVII/Vlla humain peut (peuvent) être utilisé(s) seul(s) ou en combinaison avec une ou plusieurs autres molécules pharmaceutiquement actives, y compris avec un ou plusieurs autres principes actifs anticoagulants.
L'invention est également relative à un acide nucléique ayant au moins 15 nucléotides 10 de longueur se liant spécifiquement au facteur VII/Vlla humain, tel que défini dans la présente description, pour son utilisation en tant que médicament.
L'invention a aussi trait à l'utilisation d'un acide nucléique ayant au moins 15 nucléotides de longueur se liant spécifiquement au facteur VII/Vlla humain, tel que défini dans la présente description, pour la fabrication d'un médicament pour le traitement des troubles de la 15 coagulation.
L'invention concerne aussi l'utilisation d'un acide nucléique ayant au moins nucléotides de longueur se liant spécifiquement au facteur VII/Vlla humain, tel que défini dans la présente description, pour le traitement des troubles de la coagulation.
L'invention a aussi pour objet une méthode de prévention ou de traitement d'un trouble
20 de la coagulation, comprenant une étape au cours de laquelle on administre, à un patient nécessitant un traitement préventif ou curatif d'un trouble de la coagulation, une composition pharmaceutique aptamère anti-FVII/Vlla humain tel que défini dans la présente description.
En général, on administre une dose quotidienne d'un aptamère anti-FVII/Vlla humain tel que défini dans la présente description allant de 1 nanogramme à 100 milligrammes, mieux 25 allant de 100 nanogrammes à 10 milligrammes, pour un patient de 80 kgs.
La présente invention est également illustrée ci-après, sans y être limitée, aux exemples suivants.
EXEMPLES
3o Exemple 1 : Capture d'acides nucléiques aptamères selon l'invention par du Facteur VII/Vlla humain immobilisé sur un support.
On a fabriqué un support solide sur lequel ont été immobilisées des molécules de Facteur VII/Vlla humain purifié d'origine plasmatique.
On réalise une immobilisation du Facteur VII humain sur dextran carboxymethyl activé
par NHS-EDC et se liant aux amines libres présentes sur le FVII/Vlla.
Le Facteur VII/Vlla humain est ainsi immobilisé avec un taux d'immobilisation de 2743 RU (1 RU correspond approximativement à 1 pg de produit immobilisé par mm2).
Des aptamères nucléiques de l'invention (pureté : 99%), respectivement l'aptamère Mapt 2 (SEQ ID N 86), l'aptamère Mapt 3 (SEQ ID N 41) et l'aptamère Mapt 7 (SEQ ID
N 58), ont été dilués dans du tampon de course (Tris 50 mM, NaCI 50 mM, CaCl2 10 mM, MgCl2 4 mM, pH
7,4) de manière à obtenir trois échantillons d'aptamères.
Chaque échantillon a été injecté de façon séquentielle sur une même puce (support solide) contenant le FVII humain immobilisé. Des contrôles sont obtenus en injectant des blancs ne contenant que du tampon de course. Toutes les injections ont été réalisées avec un débit 30 I/min pendant 60 sec, après l'injection, du tampon de course a été injecté
sur la puce à un débit identique pendant 120 sec. Du tampon d'élution (EDTA, 5mM) a ensuite été
injecté
pendant 60 sec avec un débit de 30 I/min pour décrocher l'aptamère du FVII
humain immobilisé. La puce permet d'étudier en temps réel la formation et la rupture des interactions entre le FVII humain immobilisé et chacun des aptamères Mapt2, Mapt3 et Mapt 7 testés, grâce à la résonance plasmonique de surface (RPS). Une liaison sur le FVII humain immobilisé se traduit par une augmentation du signal en unité de résonance (RU) enregistré
par l'appareil (Figure 2). Ces analyses sont effectuées avec l'appareil de RPS Biacore T100 (GE). La modélisation des interactions enregistrées sont effectuées à l'aide du Logiciel Biaevaluation (G E).
Les résultats obtenus montrent que tous les aptamères nucléiques testés se lient avec une affinité significative au Facteur VII humain plasmatique.
Exemple 2 : Capture du Facteur VII/Vlla humain par un acide nucléique aptamère selon l'invention, immobilisé sur un support.
On a fabriqué un support solide sur lequel ont été immobilisées des molécules de l'aptamère nucléique de l'invention de séquence SEQ ID N 86, aussi désigné
ici Mapt2 .
Préalablement à sa fixation sur le support solide, l'extrémité 5' de l'aptamère Mapt2 a été
chimiquement couplée à une chaîne espaceur constituée de 4 molécules de PEG(C18). Puis, l'extrémité libre de la chaîne espaceur, opposée à l'extrémité couplée à
l'aptamère, a été
couplée à une molécule de biotine.
On dispose d'un support solide contenant des molécules de streptavidine immobilisées (Serie S sensor Chip SA, GE) Puis, on a mis en contact le support solide ci-dessus avec les composés aptamères ci-dessus afin d'immobiliser les acides nucléiques de séquence SEQ ID N 86, par association non covalente entre les molécules de streptavidine du support et les molécules de biotine des composés aptamères.
L'aptamère Mapt2 est ainsi immobilisé avec un taux d'immobilisation de 983 RU
(1 RU
correspond approximativement à 1 pg de produit immobilisé par mm2) .
Du FVII humain purifié à partir du plasma (FVII HP, pureté : 99%) a été dilué
dans du tampon de course (Tris 50 mM, NaCI 50 mM, CaCl2 10 mM, MgCl2 4 mM, pH 7,4) de manière à
obtenir quatre échantillons de concentration en FVII HP de 62, 125, 250 et 500 nM.
Séparément, une préparation d'immunoglobulines polyvalentes (Tégéline , commercialisée par le LFB, France) a été diluée dans du tampon de course (Tris 50 mM, NaCI
50 mM, CaCl2 10 mM, MgCl2 4 mM, pH 7,4) de manière à obtenir quatre échantillons de concentration en immunoglobulines polyvalentes de 62, 125, 250 et 500 nM.
Chaque échantillon a été injecté de façon séquentielle sur une même puce (support solide) contenant l'aptamère Mapt2 immobilisé par une interaction biotine-streptavidine. Des contrôles sont obtenus en injectant des blancs ne contenant que du tampon de course. Toutes les injections ont été réalisées avec un débit 30 I/min pendant 60 sec, après l'injection, du tampon de course a été injecté sur la puce à un débit identique pendant 120 sec. Du tampon d'élution (EDTA, 5mM) a ensuite été injecté pendant 30 sec avec un débit de 30 I/min pour décrocher le FVII HP de l'aptamère..La puce permet d'étudier en temps réel la formation et la rupture des interactions entre le FVII HP, ou les immunoglobulines polyvalentes, et l'aptamère immobilisé grâce à la résonance plasmonique de surface (RPS). Une liaison sur l'aptamère immobilisé se traduit par une augmentation du signal en unité de résonance (RU) enregistré par l'appareil (Figure 3). Ces analyses sont effectuées avec l'appareil de RPS
Biacore T100 (GE).
La modélisation des interactions enregistrées sont effectuée à l'aide du Logiciel Biaevaluation (GE).
Cet exemple montre que l'aptamère Mapt2, une fois immobilisé se lie spécifiquement au FVII HP, avec une affinité significative. L'aptamère Mapt2 ne se lie pas aux immunoglobulines polyvalentes.
Exemple 3 : Capture du Facteur VII/Vlla humain par un acide nucléique aptamère selon l'invention, immobilisé sur un support.
On a fabriqué un support solide sur lequel ont été immobilisées des molécules de l'aptamère nucléique de l'invention de séquence SEQ ID N 86, aussi désigné
ici Mapt2 .
Préalablement à sa fixation sur le support solide, l'extrémité 5' de l'aptamère Mapt2 a été
chimiquement couplée à une chaîne espaceur constituée de 4 molécules de PEG(C18). Puis, l'extrémité libre de la chaîne espaceur, opposée à l'extrémité couplée à
l'aptamère, a été
couplée à une molécule de biotine.
On dispose d'un support solide contenant des molécules de streptavidine immobilisées (Serie S sensor Chip SA, GE) Puis, on a mis en contact le support solide ci-dessus avec les composés aptamères ci-dessus afin d'immobiliser les acides nucléiques de séquence SEQ ID N 86, par association non covalente entre les molécules de streptavidine du support et les molécules de biotine des composés aptamères.
L'aptamère Mapt2 est ainsi immobilisé avec un taux d'immobilisation de 424,9 RU (1 RU
correspond approximativement à 1 pg de produit immobilisé par mm2).
Du FVII humain purifié à partir du plasma (FVII HP, pureté : 99%) a été dilué
dans du tampon de course (Tris 50 mM, NaCI 50 mM, CaCl2 10 mM, MgCl2 4 mM, pH 7,4) de manière à
obtenir un échantillon de concentration en FVII HP de 500 nM.
Chaque échantillon a été injecté de façon séquentielle sur une même puce (support solide) contenant l'aptamère Mapt2 immobilisé par une interaction biotine-streptavidine. Des contrôles sont obtenus en injectant des blancs ne contenant que du tampon de course. Toutes les injections ont été réalisées avec un débit 30 I/min pendant 60 sec, après l'injection, du tampon de course a été injecté sur la puce à un débit identique pendant 120 sec. Du tampon d'élution (EDTA, 5mM) a ensuite été injecté pendant 30 sec avec un débit de 30 I/min pour décrocher le FVII HP de l'aptamère. La puce permet d'étudier en temps réel la formation et la rupture des interactions entre le FVII HP et l'aptamère immobilisé grâce à la résonance plasmonique de surface (RPS). Une liaison sur l'aptamère immobilisé se traduit par une augmentation du signal en unité de résonance (RU) enregistré par l'appareil (Figure 4). Ces analyses sont effectuées avec l'appareil de RPS Biacore T100 (GE).
Afin de vérifier que le produit qui se lie à l'aptamère immobilisé est bien le FVII, une séquence d'injection comprenant (i) le FVII HP à 500nM et (ii) un anticorps monoclonal anti-FVII
à 1 M (Sigma, Ref Clone n MC1476/E.A.8.1) a été réalisée sur la même puce.
Les conditions d'injection et d'analyse sont identiques à celle décrites précédemment. Si l'aptamère retient effectivement du FVII, l'injection d'anticorps monoclonal anti-FVII doit se traduire par une augmentation du signal en RU consécutif à la liaison des anticorps sur le FVII
lui même lié à
l'aptamère. En témoins des anticorps seuls sont injectés. L'augmentation de signal en RU
montre bien que l'aptamère reconnaît le FVII (Figure 4).
La modélisation des interactions enregistrées sont effectuée à l'aide du Logiciel Biaevaluation (GE).
Les résultats de cet exemple montrent que l'aptamère, une fois immobilisé, se lie spécifiquement au FVII HP, avec une affinité significative et que le signal observé est bien du à
la rétention du FVII sur l'aptamère.
Exemple 4 : Stoechiométrie aptamère Mapt2/FVII humain plasmatique On a fabriqué un support solide sur lequel ont été immobilisées des molécules de l'aptamère nucléique de l'invention de séquence SEQ ID N 86, aussi désigné
ici Mapt2 .
Préalablement à sa fixation sur le support solide, l'extrémité 5' de l'aptamère Mapt2 a été
chimiquement couplée à une chaîne espaceur constituée de 4 molécules de PEG(C18). Puis, l'extrémité libre de la chaîne espaceur, opposée à l'extrémité couplée à
l'aptamère, a été
couplée à une molécule de biotine.
On dispose d'un support solide contenant des molécules de streptavidine immobilisées (Série S sensor Chip SA, GE) Puis, on a mis en contact le support solide ci-dessus avec les composés aptamères ci-dessus afin d'immobiliser les acides nucléiques de séquence SEQ ID N 86, par association non covalente entre les molécules de streptavidine du support et les molécules de biotine des composés aptamères.
L'aptamère Mapt2 est ainsi immobilisé avec un taux d'immobilisation de 983 RU
(1 RU
correspond approximativement à 1 pg de produit immobilisé par mm2).
Du FVII humain purifié à partir du plasma (FVII HP, pureté : 99%) a été dilué
dans du tampon de course (Tris 50 mM, NaCI 50 mM, CaCl2 10 mM, MgCl2 4 mM, pH 7,4) de manière à
obtenir un échantillon de concentration en FVII HP de 1 M.
Chaque échantillon a été injecté de façon séquentielle sur une même puce (support solide) contenant l'aptamère Mapt2 immobilisé par une interaction biotine-streptavidine. Des contrôles sont obtenus en injectant des blancs ne contenant que du tampon de course. Toutes les injections ont été réalisées avec un débit 30 I/min pendant 700 sec, après l'injection, du tampon de course a été injecté sur la puce à un débit identique pendant 120 sec. Du tampon d'élution (EDTA, 20mM) a ensuite été injecté pendant 30 sec avec un débit de 30 I/min pour décrocher le FVII HP de l'aptamère. La puce permet d'étudier en temps réel la formation et la rupture des interactions entre le FVII HP, et l'aptamère immobilisé grâce à la résonance plasmonique de surface (RPS). Une liaison sur l'aptamère immobilisé se traduit par une augmentation du signal en unité de résonance (RU) enregistré par l'appareil (Figure 5). Ces analyses sont effectuées avec l'appareil de RPS Biacore T100 (GE).
La modélisation des interactions enregistrées sont effectuée à l'aide du Logiciel Biaevaluation (GE).
Les résultats de cet exemple montrent que des quantités croissantes de FVII
humain se lient à l'aptamère Mapt2 au cours du temps d'injection et que la saturation des sites aptamères par les molécules de FVII humain n'est pas encore atteinte à la fin de la durée d'injection (700 sec).
Les résultats montrent qu'une grande partie des molécules d'aptamère Mapt2 immobilisées à la surface du support solide sont capables de lier le FVII
humain. Ces résultats signifient que la conformation dans laquelle l'aptamère est apte à lier sa cible est suffisamment stable pour que la grande majorité des aptamères soient sous cette forme et que cette conformation n'est pas significativement altérée ou gênée par l'immobilisation.
Ces résultats montrent aussi que la stoechiométrie de liaison Mapt2/FVII
humain est d'environ 1/1.
Pour la liaison Mapt2/FVII humain, le signal maximum attendu était de [MW FVII/MW Mapt2]*niveau immobilisation*stoechio, avec :
- MW FVII signifie le poids moléculaire du FVII humain, égal à 50 kDa - MW Mapt2 signifie le poids moléculaire de Mapt2, égal à 27 kDa, - niveau d'immobilisation est dans cet exemple de 983,3, et - steochio signifie la stoechiométrie Mapt2/FVII, qui est égale à 1.
5 Avec la formule ci-dessus, la valeur du signal maximum attendu était de :
1820 RU.
On calcule ensuite le pourcentage d'aptamères Mapt2 ayant lié une molécule de Facteur VII
humain, selon la formule : Signal Mesuré/Signal Attendu, avec :
- Signal Mesuré qui est égal à 1124 RU, et 10 - Signal Attendu qui est égal à 1820 RU
Selon la formule ci-dessus, le pourcentage de molécules de l'aptamère Mapt2 ayant lié
une molécule de FVII humain à la fin de l'injection est de 62%.
Exemple 5 : Cinétique de la liaison de l'aptamère Mapt2 au FVII humain plasmatique 15 On a fabriqué un support solide sur lequel ont été immobilisées des molécules de l'aptamère nucléique de l'invention de séquence SEQ ID N 86, aussi désigné
ici Mapt2 .
Préalablement à sa fixation sur le support solide, l'extrémité 5' de l'aptamère Mapt2 a été
chimiquement couplée à une chaîne espaceur constituée de 4 molécules de PEG(C18). Puis, l'extrémité libre de la chaîne espaceur, opposée à l'extrémité couplée à
l'aptamère, a été
20 couplée à une molécule de biotine.
On dispose d'un support solide contenant des molécules de streptavidine immobilisées (Serie S sensor Chip SA, GE) Puis, on a mis en contact le support solide ci-dessus avec les composés aptamères ci-dessus afin d'immobiliser les acides nucléiques de séquence SEQ ID N 86, par association 25 non covalente entre les molécules de streptavidine du support et les molécules de biotine des composés aptamères.
L'aptamère Mapt2 est ainsi immobilisé avec un taux d'immobilisation de 425 RU
(1 RU
correspond approximativement à 1 pg de produit immobilisé par mm2) .
Du FVII humain purifié à partir du plasma (FVII HP, pureté : 99%) a été dilué
dans du 30 tampon de course (Tris 50 mM, NaCI 50 mM, CaCl2 10 mM, MgCl2 4 mM, pH 7,4) de manière à
obtenir quatre échantillons de concentration en FVII HP de 125, 250 (en duplicate), 500 nM et 1000 mM.
Chaque échantillon a été injecté de façon séquentielle sur une même puce (support solide) contenant l'aptamère Mapt2 immobilisé par une interaction biotine-streptavidine. Des contrôles sont obtenus en injectant des blancs ne contenant que du tampon de course. Toutes les injections ont été réalisées avec un débit 30 I/min pendant 60 sec, après l'injection, du tampon de course a été injecté sur la puce à un débit identique pendant 120 sec. Du tampon d'élution (EDTA, 20mM) a ensuite été injecté pendant 75 sec avec un débit de 30 I/min pour décrocher le FVII HP de l'aptamère.
Ces analyses sont effectuées avec l'appareil de RPS Biacore T100 (GE). La modélisation des interactions enregistrées sont effectuée à l'aide du Logiciel Biaevaluation (GE).
Les courbes de la cinétique de liaison de l'aptamère immobilisé Mapt2 au FVII
humain plasmatique ont été calculées avec le module dédié du logiciel Biacore control Software, version 1.2.
Les courbes de la cinétique de liaison de l'aptamère immobilisé Mapt2 au FVII
humain plasmatique sont représentées sur la Figure 6.
Les résultats du calcul de cinétique de liaison de l'aptamère Mapt2 au FVII
humain ont permis de déterminer que :
- la constante de dissociation Kd de Mapt2 est de 99,9 nM, et - la constante d'association Ka (= 6,25.103 M-'s-1) de Mapt2 est de 6,25.10-4 s' Exemple 6 : Elution du FVII humain recombinant par l'EDTA
On a fabriqué un support solide sur lequel ont été immobilisées des molécules de l'aptamère nucléique de l'invention de séquence SEQ ID N 86, aussi désigné
ici Mapt2 .
Préalablement à sa fixation sur le support solide, l'extrémité 5' de l'aptamère Mapt2 a été
chimiquement couplée à une chaîne espaceur constituée de 4 molécules de PEG(C18). Puis, l'extrémité libre de la chaîne espaceur, opposée à l'extrémité couplée à
l'aptamère, a été
couplée à une molécule de biotine.
On dispose d'un support solide contenant des molécules de streptavidine immobilisées Puis, on a mis en contact le support solide ci dessus ci-dessus avec les composés aptamères ci-dessus afin d'immobiliser les acides nucléiques de séquence SEQ
ID N 86, par association non covalente entre les molécules de streptavidine du support et les molécules de biotine des composés aptamères.
On a aussi fabriqué un support solide sur lequel ont été immobilisées des molécules d'un anticorps polyclonal anti-FVII biotinylé.
Les supports solides avec l'aptamère Mapt2 ou avec l'anticorps polyclonal anti-FVII
humain consistent en des plaques de 96 puits pour test ELISA;
Pour la révélation, on a utilisé un anticorps polyclonal anti-FVII humain marqué par la peroxydase de raifort.
Les conditions de l'essai sont détaillées ci-dessous.
- Plaque : Biobind Streptavidin coated (Thermo ref : 95029293) Tampons :
- Immobilisation : Tris 5OmM, NaCI l5OmM, Tween 20 0,1% / pH = 7,5 Lavage Ca2+/Mg2+: Tris 50mM, NaCI 50mM, CaCl2 10mM, MgCl2 4mM, Tween 20 0,1%
/pH
= 7,4 Lavage EDTA : EDTA 1OmM dans eau PPI + Tween 20 0,1%
Ligand : Mapt 2 obtenue par synthèse chimique chez Eurogentec. Concentration pour l'immobilisation 200nM, volume = 100 I, 1 h à température ambiante - Ligands témoins : Anticorps polyclonnal anti-FVII purifié sur chromatographie d'affinité FVII
(R&D system, ref :BAF 2338) Concentration pour l'immobilisation 200nM, volume = 100 I, 1 h à
température ambiante - Echantillon : FVII humain transgénique produit chez le lapin stabilisé avec 1% BSA, lot:
479186. Concentration = 100nM, volume déposé = 100 I, 1 H15 à température ambiante - Anticorps de révélation : issu du kit Asserachrom FVII:Ag (diagnostica Stago) préparé selon les recommandations du fournisseur. Volume = 100 I, 45min à température ambiante - Révélation : 100 I par puits d'une solution d'OPD + H202 - Arrêt de la réaction : H2SO4 50 I par puits - Lecture à 492 nm Les résultats, exprimés en D.O. à 492 nm, sont présentés dans le Tableau 1 ci-dessous.
Tableau 1 Lavage : Ca2+/Mg2+ Lavage : EDTA
3,53/3,56 0,093/0,09 3,53/3,79 0,094/0,085 3,75/3,75 0,097/0,09 3,9/4,0 3,45/3,27 4,0/4,2 3,52/3,54 - Résultats en caractères gras : aptamère Mapt2 (SEQ ID N 86) immobilisé
- Résultats en caractères normaux : anticorps polyclonal anti-FVII humain immobilisé
Les résultats de cet exemple montrent que seule une fixation du FVII humain avec l'aptamère Mapt 2 permet une élution avec de l'EDTA.
Exemple 7 : Liaison des aptamères à différents types de Facteur VII humain On a fabriqué un support solide sur lequel ont été immobilisées des molécules de l'aptamère nucléique de l'invention de séquence SEQ ID N 86, aussi désigné
ici Mapt2 .
Préalablement à sa fixation sur le support solide, l'extrémité 5' de l'aptamère Mapt2 a été
chimiquement couplée à une chaîne espaceur constituée de 4 molécules de PEG(C18). Puis, l'extrémité libre de la chaîne espaceur, opposée à l'extrémité couplée à
l'aptamère, a été
couplée à une molécule de biotine.
On dispose d'un support solide contenant des molécules de streptavidine immobilisées (Serie S sensor Chip SA, GE) Puis, on a mis en contact le support solide ci-dessus avec les composés aptamères ci-dessus afin d'immobiliser les acides nucléiques de séquence SEQ ID N 86, par association non covalente entre les molécules de streptavidine du support et les molécules de biotine des composés aptamères.
L'aptamère Mapt2 est ainsi immobilisé avec un taux d'immobilisation de 4326 RU
(1 RU
correspond approximativement à 1 pg de produit immobilisé par mm2). La partie du support solide sur laquelle est immobilisée Mapt2 est appelée cellule active.
Selon la même technique, on a immobilisé sur une partie indépendante du support solide appelée cellule de référence des molécules d'acide nucléique quelconques, avec un taux d'immobilisation de 4069 RU.
On a utilisé différents types de Facteur VII humain, respectivement :
- du FVII humain plasmatique obtenu selon le procédé de purification Acset, - du FVII humain recombinant produit chez le lapin, - du FVII humain recombinant produit chez la chèvre, et - du FVII humain recombinant (Novoseven commercialisé par Novo) Chaque échantillon a été injecté de façon séquentielle sur la même cellule active (support solide) contenant l'aptamère Mapt2 immobilisé par une interaction biotine-streptavidine. Des contrôles sont obtenus en injectant des blancs ne contenant que du tampon de course. Des signaux correspondant au bruit de fond sont obtenus en injectant les mêmes échantillons sur la cellule de référence contenant les acides nucléiques quelconques immobilisés, ces signaux sont retranchés aux signaux obtenus sur la cellule active. Toutes les injections ont été réalisées avec un débit 30 I/min pendant 60 sec, après l'injection, du tampon de course a été injecté sur la puce à un débit identique pendant 120 sec. Du tampon d'élution (EDTA, 15mM) a ensuite été injecté pendant 30 sec avec un débit de 30 I/min pour décrocher le FVII de l'aptamère.. La puce permet d'étudier en temps réel la formation et la rupture des interactions entre le FVII et l'aptamère immobilisé grâce à la résonance plasmonique de surface (RPS). Une liaison sur l'aptamère immobilisé se traduit par une augmentation du signal en unité de résonance (RU) enregistré par l'appareil (Figure 7). Ces analyses sont effectuées avec l'appareil de RPS Biacore T100 (GE).
La modélisation des interactions enregistrées sont effectuée à l'aide du Logiciel Biaevaluation (GE).
Les résultats sont représentés sur la Figure 7.
Les résultats de cet exemple montrent que l'aptamère, une fois immobilisé, se lie spécifiquement à une grande variété de Facteur VII humain, y compris du Facteur VII humain plasmatique et des facteurs VII humains recombinants produits dans divers animaux transgéniques, incluant le lapin et la chèvre.
Exemple 8 : Liaison spécifique des aptamères au Facteur VII humain On a fabriqué un support solide sur lequel ont été immobilisées des molécules de l'aptamère nucléique de l'invention de séquence SEQ ID N 86, aussi désigné
ici Mapt2 .
Préalablement à sa fixation sur le support solide, l'extrémité 5' de l'aptamère Mapt2 a été
chimiquement couplée à une chaîne espaceur constituée de 4 molécules de PEG(C18). Puis, l'extrémité libre de la chaîne espaceur, opposée à l'extrémité couplée à
l'aptamère, a été
couplée à une molécule de biotine.
On dispose d'un support solide contenant des molécules de streptavidine immobilisées (Serie S sensor Chip SA, GE) Puis, on a mis en contact le support solide ci-dessus avec les composés aptamères ci-dessus afin d'immobiliser les acides nucléiques de séquence SEQ ID N 86, par association non covalente entre les molécules de streptavidine du support et les molécules de biotine des composés aptamères.
L'aptamère Mapt2 est ainsi immobilisé avec un taux d'immobilisation de 4326 RU
(1 RU
correspond approximativement à 1 pg de produit immobilisé par mm2).
La partie du support solide sur laquelle est immobilisée Mapt2 est appelée cellule active.
Selon la même technique, on a immobilisé sur une partie indépendante du support solide appelée cellule de référence des molécules d'acide nucléique quelconques, avec un taux d'immobilisation de 4069 RU.
On a utilisé différents types de Facteur VII, respectivement :
- du FVII humain plasmatique obtenu selon le procédé de purification Acset, - du FVII de lapin recombinant commercialisé par la société American Diagnostica (Ref 407RAB, Lot n 080818).
Chaque échantillon a été injecté de façon séquentielle sur une même puce (support solide) contenant l'aptamère Mapt2 immobilisé par une interaction biotine-streptavidine. Des contrôles sont obtenus en injectant des blancs ne contenant que du tampon de course. Des signaux correspondant au bruit de fond sont obtenus en injectant les mêmes échantillons sur la cellule de référence contenant les acides nucléiques quelconques immobilisés, ces signaux sont retranchés aux signaux obtenus sur la cellule active.Toutes les injections ont été réalisées avec un débit 30 I/min pendant 60 sec, après l'injection, du tampon de course a été injecté sur la puce à un débit identique pendant 120 sec. Du tampon d'élution (EDTA, 15mM) a ensuite été
injecté pendant 30 sec avec un débit de 30 I/min pour décrocher le FVII humain ou de lapin de l'aptamère.. La puce permet d'étudier en temps réel la formation et la rupture des interactions entre le FVII HP et l'aptamère immobilisé grâce à la résonance plasmonique de surface (RPS).
5 Une liaison sur l'aptamère immobilisé se traduit par une augmentation du signal en unité de résonance (RU) enregistré par l'appareil (Figure 8). Ces analyses sont effectuées avec l'appareil de RPS Biacore T100 (GE).
La modélisation des interactions enregistrées sont effectuée à l'aide du Logiciel Biaevaluation (GE).
10 Les résultats de cet exemple montrent que l'aptamère, une fois immobilisé, est très spécifique du FVII/Vlla humain et ne se lie pas au FVII/Vlla de lapin.
Exemple 9 : préparation d'un support d'affinité
Le support d'affinité a été réalisé à partir d'un matériau de support solide consistant en 15 une matrice sur laquelle on a greffé de la streptavidine (streptavidin-agarose - Novagen ).
On a introduit un volume de 1 ml de gel dans un conteneur consistant en une colonne (i.d. 11 mm). On a lavé le gel avec de l'eau purifiée, pour éliminer le solvant de stockage Les caractéristique du ciel sont :
20 - Capacité d'adsorption de biotine : > 85 nanomole / ml de gel - Test fonctionnel : Capture >99% de thrombine biotinylée en 30 minutes à TA
- Autres tests : Protease-free , endo/exonucléase-free, RNase-free.
- Conservateur : 100 mM sodium phosphate pH7,5 + NaN3 0,02 25 La sortie de la colonne conditionnée ( packée ) (Hauteur de lit de gel =
1cm) est connectée à un détecteur d'absorbance équipé d'un filtre UV à 254 nm et d'un enregistreur.
Les aptamères nucléiques anti-FVII humain biotinylés de séquence SEQ ID N 86 sont solubilisés dans de l'eau purifiée à la concentration finale de 0,5 mg/0,187 ml, soit une concentration molaire finale de 0,1 mM. La solution d'aptamères nucléiques a été activée à
30 95 C selon le cycle standard, pour l'immobilisation des aptamères sur le matériau support solide..
La solution d'aptamères nucléiques a été préalablement diluée par 4,8 ml d'eau purifiée puis 1,5 ml de tampon Me" (5 x concentré).
35 Le détecteur d'absorbance est ajusté à 1 AUFS (Absorbance Unit Full Scale) et on enregistre la DO à 254 nm de cette solution à 0,575 UA254.
La solution d'aptamères nucléiques biotinylés est injectée sur le gel streptavidin-agarose pré-conditionnée ( prépackée ) et mise en recirculation avec une pompe péristaltique à un débit de 2,5 ml/minute, soit un temps de contact sur le gel de 24 secondes (entrée/sortie E/S).
Dans ces conditions, la DO à 254 nm se stabilise rapidement à 0,05 UA254, soit une valeur de 91% de couplage théorique, c'est-à-dire 0,455 mg d'aptamères nucléiques par millilitre de gel.
Un lavage avec un tampon 10 mM CaCl2 + 4 mM MgCl2 puis en NaCI 2M est réalisé, afin d'éliminer les aptamères nucléiques qui ne sont pas fixées spécifiquement aux molécules de streptavidine greffées sur le matériau de support solide.
Example 10 : Procédé de purification du Facteur VII recombinant humain Les supports d'affinité aptamères ont été testés à partir d'une préparation purifiée en FVII/FVIIa préparée selon la technique décrite dans la demande PCT n W02008/099077.
Préparation de l'échantillon à purifier La matière biologique de départ est du lait de lapine transgénique contenant du FVII
humain recombinant. La cassette d'expression comprend le transgène FVII humain placé sous le contrôle du promoteur du gène de la R-caseine.
Brièvement, 140 millilitres de lait ont été collectés sur 2 lapines en première lactation entre le Jour 4 et le Jour 12 après mise bas.
Le titre moyen en FVII amidolytique (FVII biologiquement activable) dans le lait collecté
est de 928 UI/ml. Les laits sont conservés à une température de -80 C.
Pour l'essai, les laits de lapine sont décongelés au bain-marie à la température de 37 C, puis sont dilués par une solution de Citrate de Sodium pour une concentration finale en citrate de 62 g/l à un pH de 7,5.
Le traitement par le citrate de sodium permet la déstabilisation des micelles phosphocalciques de caséines.
La solution protéique riche en lipides du lait est ensuite clarifiée sur une séquence de filtres, respectivement (i) filtre profondeur de 15 à 0,5 pm de seuil de porosité puis (i) filtre membrane à 0,2 m.
Un volume de 360 ml de solution filtrée ayant un titre en FVII de 198 UI/ml, soit 36 mg de FVII transgénique, est pré-purifié sur un gel de chromatographie MEP-HyperCel (Pall 3o BioSepra) d'un volume de 16 mL. Ce gel de capture permet d'éliminer 95% des protéines du lait, dont la plus grande partie des caséines, tout en conservant 60% de la quantité de FVII
initiale.
Une quantité de 17,5 mg de FVII de faible pureté (-5%) obtenu à la fin de l'étape ci-dessus est purifiée par chromatographie d'échanges d'ions, en utilisant un gel de Q-sepharose XL (GE Healthcare) d'un volume de 20 mL, Le FVII humain est élué
avec un volume de 78 ml de tampon comprenant 5 mM de chlorure de calcium. La concentration en FVII
amydolitique est de 337 UI/ml, soit 0,17 mg de FVII/ml et la concentration en protéines totales est estimée à 0,18 mg/ml par mesure de DO à 280 nm et c" = 13, soit une pureté
en FVII de 94%.
Les protéines résiduelles provenant du lait de lapine sont difficilement séparables du FVII à ce stade, soit parce qu'il existe des homologies de structures telles que des protéines à
GLA-domaines ou à domaine EGF, ou bien des homologies physico-chimiques (charge ionique et/ou taille moléculaire proche). Les techniques classiques permettent une amélioration de la pureté jusqu'à 99,95% par des techniques orthogonales (combinaison de séparation sur gel d'hydroxyapatite et par chromatographie d'exclusion de taille). Cependant, pour l'injection répétée à l'homme, la charge en protéines exogènes admises pour les protéines de recombinaison génétique ne doit pas dépasser 50 ppm soit une pureté > 99,995%.
Une telle pureté ne semble atteignable qu'après purification sur matrice d'affinité.
Etape de purification du FVII recombinant humain sur le support d'affinité de l'invention Un volume de 6 ml de la solution de FVII humain purifié (1,1 mg de FVII) obtenue à la fin de l'étape précédente est utilisé pour l'étape de purification à un haut niveau de pureté du FVII
humain recombinant avec le support d'affinité de l'invention.
La solution de FVII obtenue à l'étape précédente, préalablement ajustée à 4 mM
MgCl2 et 10 mM CaCl2 et pH 7,5, est injectée sur le gel Aptamère-agarose (support d'affinité) avec une pompe péristaltique à un débit de 0,1 ml/minute soit un temps de contact avec le support d'affinité de 10 minutes (E/S).
Après injection, le gel est lavé en tampon tris 50 mM + NaCI 5OmM + 4 mM MgCl2 + 10 mM CaCl2 à pH 7,5.
Un volume de 10 ml de solution non adsorbé est collecté.
Le FVII est élué par un tampon tris 50mM + EDTA 10 mM à pH 7,5. La collecte du pic d'élution est réalisée suivant le profil de DO.
Selon les calculs molaires, la quantité d'aptamères nucléiques immobilisés dans le support d'affinité est de 17 nanomoles, ce qui correspond, pour une interaction mole à mole avec les molécules de FVII, à une capacité absolue du support d'affinité de 0,9 mg de FVII.
La figure 11 illustre un profil de chromatographie du FVII humain recombinant produit dans le lait de lapine, avec un suivi en continu des valeurs d'absorbance (D.O.) à 254 nanomètres.
Sur la Figure 11, l'inflexion (2) de la courbe d'absorption, après le moment de l'injection (1) illustre le début de la saturation du support d'affinité avec le FVII
humain recombinant. Au temps (3) l'injection de FVII humain recombinant est stoppée. Pour illustrer l'échelle linéaire des temps sur la Figure 1, on indique que la durée entre le temps de début d'injection (1) et le temps de fin d'injection (2) est de 10 minutes. Le support d'affinité continue de se saturer avec la protéine de la coagulation d'intérêt : des complexes entre (i) les aptamères nucléiques anti-FVII du support d'affinité et (ii) les molécules de FVII humain recombinant initialement contenues dans la composition à purifier ont été formés. Après passage de la composition à
purifier, on procède à une étape de lavage (6) de la colonne avec le tampon de lavage spécifié
précédemment. Puis on réalise l'étape d'élution, par injection au temps (4) de la solution tampon comprenant une concentration finale de 10 mM en EDTA. Le pic d'absorption illustre la libération du FVII humain recombinant à partir des complexes Aptamères nucléiques/FVII
recombinant. On note que les molécules de FVII humain recombinant sont libérées rapidement et donc dans un faible volume. En conséquence, grâce au support d'affinité de l'invention, on obtient une solution d'élution de forte concentration en protéine FVII humain recombinant. Au temps (5), on a réalisé une étape de régénération du support d'affinité, avec un tampon Tris à
50 mM. Le pic d'absorbance visible en (7) correspond aux substances libérées du support d'affinité du fait de l'étape de régénération Capacité dynamique d'absorption du support d'affinité
Le tableau 1 ci-dessous présente les résultats de l'essai, qui montrent une capacité
dynamique d'adsorption de 0,45 à 0,49 mg/ml des matrices d'affinité soit 50 à
55% de ligands bio-disponibles.
En EDTA, on calcule un rendement dynamique d'élution d'environ 75%.
Tableau 2 : bilan FVII recombinant humain et Protéines totales des essais de matrices Aptamères- aaarose:
FVII recombinant Protéines (total mg) DBC DE(%) (mg/m)l Départ 2228 100% 1,42 100%
Final Non 924 41% 0,57 40%
adsorbé
éluat 971 44% 0,61 43% 0,49 74%
Résultats 85% 83%
pondéraux Départ : échantillon de départ Final : composition des fractions BDC : capacité dynamique d'absorption (pour Dynamic Binding Capacity ) DE : Rendement dynamique d'élution (pour Dynamic Elution ) ; qui représente le rapport entre le FVII recombinant élué et le FVII recombinant adsorbé, exprimé en pourcentage Capacité de séparation Spécifique du Support d'affinité
Les supports d'affinité ont été évalués en spécificité par un dosage ELISA
spécifique des protéines du lait de lapines.
Les résultats sont représentés dans le Tableau 3 ci-dessous.
Tableau 3 : bilan de la spécificité des supports d'affinité :
FVII recombinant Protéines du lait de RMP % pureté
(total mg) lapine (RMP) (ppm) FVII
Départ 1,11 100% 16992 100% 16782 98,32%
Final Non 0,46 41% 14590 40% 34738 96,53%
adsorbé
éluat 0,49 44% 217 43% 492 99,95%
Résultats 85% 83%
pondéraux Les résultats du Tableau 3 ci-dessus montrent que l'on obtient une moyenne de 2 logo d'élimination des Aptamères-agarose portant la pureté du FVII humain transgénique de 98,3%
à 99,95%. Ceci montre une bonne spécificité des aptamères vis-à-vis du FVII
humain et très peu d'interactions aux protéines résiduelles du lait de lapines.
Une amélioration est possible par des lavages intermédiaires avant élution par des solutions telles que NaCI 2M et/ou Propylène Glycol ou Ethylène Glycol à 50%
si dans ces conditions le FVII ne s'élue pas.
Les résultats de l'exemple 10 illustrent les excellentes caractéristiques des supports d'affinité sur gel Aptamère-agarose avec une capacité dynamique d'adsorption d'au moins 1 mg de FVII par mg de ligand avec un rendement d'élution d'au moins 75%. La spécificité est également bien établie avec une nette amélioration de la pureté (99,95%), une élimination de 2 logo des RMP rabbit milk proteins résiduelles. Le taux final s'établit à
environ 500 ppm sur ces 2 essais non optimisés.
Exemple 11 : Capture d'acides nucléiques aptamères selon l'invention par du Facteur VII/Vlla humain immobilisé sur un support On a fabriqué un support solide sur lequel ont été immobilisées des molécules de Facteur VII/Vlla humain purifié d'origine plasmatique.
On réalise une immobilisation du Facteur VII humain sur dextran carboxymethyl activé
par NHS-EDC et se liant aux amines libres présentes sur le FVII/Vlla.
5 Le Facteur VII/Vlla humain est ainsi immobilisé avec un taux d'immobilisation de 2525 RU (1 RU correspond approximativement à 1 pg de produit immobilisé par mm2).
Une série de 27 aptamères nucléiques de l'invention (pureté : 99%), d'une longueur variant de 43 à 66 nucléotides selon les aptamères, ont été dilués dans du tampon de course (Tris 50 mM, NaCI 50 mM, CaCl2 10 mM, MgCl2 4 mM, pH 7,5) de manière à obtenir trois 10 échantillons d'aptamères. Chaque aptamère testé a été injecté à la concentration finale de 1 pM
dans le tampon de course.
Chaque échantillon a été injecté de façon séquentielle sur une même puce (support solide) contenant le FVII humain immobilisé. Des contrôles sont obtenus en injectant des blancs ne contenant que du tampon de course. Toutes les injections ont été réalisées avec un débit 15 30 I/min pendant 60 sec, après l'injection, du tampon de course a été
injecté sur la puce à un débit identique pendant 120 sec. Du tampon d'élution (EDTA, 5mM) a ensuite été
injecté
pendant 60 sec avec un débit de 30 I/min pour décrocher l'aptamère du FVII
humain immobilisé. La puce permet d'étudier en temps réel la formation et la rupture des interactions entre le FVII humain immobilisé et chacun des aptamères testés, grâce à la résonance 20 plasmonique de surface (RPS). Une liaison sur le FVII humain immobilisé se traduit par une augmentation du signal en unité de résonance (RU) enregistré par l'appareil (Figure El). Ces analyses sont effectuées avec l'appareil de RPS Biacore T100 (GE). La modélisation des interactions enregistrées sont effectuées à l'aide du Logiciel Biaevaluation (GE).
25 Les résultats sont présentés dans les figures 12 et 13.
La figure 12 illustre les courbes de liaison d'une série de 27 aptamères nucléiques de l'invention au Facteur VII humain plasmatique immobilisé sur un support, dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires.
30 La figure 13 illustre les valeurs individuelles de signal de fixation stable de chacun des 27 aptamères testés. En abscisse : chacun des 27 aptamères testés ; en ordonnées : signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires.
On observe quatre groupes d'aptamères se distinguant par leur affinité pour le Facteur VII humain.
35 Mapt2 core sequence se trouve dans le groupe d'affinité faible. Un représentant de la famille 2 possède une affinité trés supérieure aux autres. Cet aptamère est nommé Mapt 2.2 et possède la core sequence suivante :
5'CCGCACGCTACGCGCATGAACCCGCGCACACGACTTGAAGTAGC3' (SEQ ID N 33) Les résultats obtenus montrent néanmoins que tous les aptamères nucléiques testés se lient avec une affinité significative au Facteur VII humain plasmatique.
Exemple 12 : Procédé de purification du Facteur VII plasmatique humain A. Matériel et Méthodes A.1. Le support de chromatographie d'affinité
Matière Gel d'affinité sur lequel on a immobilisé l'aptamère Mapt-2 core couplé directement à la biotine, sans chaîne espaceur entre l'aptamère et la biotine. L'aptamère est immobilisé sur un gel streptavidine (Fournisseur Novagen) grâce à une biotine en 5' terminal avec une densité
de ligand théorique 0,4 mg/ml : volume 1 ml packé dans une colonne XK1 6 (GE) L'aptamère utilisé est l'aptamère de séquence SEQ ID N 20. Ce produit de départ comprend des impuretés, des formes tronquées de Facteur VII et des formes dégradées de Facteur VII. Une forme dégradée de Facteur VII peut comprendre une forme de Facteur VII
dont la gamma-carboxylation est altérée.
A.3. Le protocole de purification Equilibration gel : Tris-HCI 0,050 M, CaC12 0,010 M, MgC12 0,05mM pH 7,5, Elution : Tris-HCI 0,020 M, EDTA 0,010 M, pH 7,5, 240 g de FVII VII plasmatique humain purifié à 98% est injecté avec un débit de 0,5m1/min en tampon d'équilibration Après détection du pic de non retenu 2 volumes de colonne de tampon d'élution est injecté.
On détecte les pics de protéines par mesure de la valeur d'absorbance à la longueur d'onde de 280 nanomètres.
B. Résultats Les résultats sont illustrés sur les figures 14 et 15.
La Figure 14 représente la courbe des valeurs de mesure de l'absorbance à 280 nm en fonction du temps. Sur la Figure 14, le pic n 1 correspond à la fraction du produit de départ qui n'a pas été retenue sur la colonne. Le pic n 2 correspond à la fraction d'élution.
Le produit de départ ainsi que le produit élué a été analysé en SDS PAGE avec coloration au nitrate d'argent afin de visualiser l'élimination des impuretés.
La Figure 15 représente ce gel : la piste n 1 correspond à la fraction du produit de départ et la piste n 2 à la fraction d'élution. Malgré la pureté importante du produit de départ on constate que la fraction éluée ne contient plus de contaminant ou de formes dégradées Les résultats de des figures 14 et 15 montrent que l'aptamère de séquence SEQ
ID N
20 est capable de lier le FVII humain et de l'éluer spécifiquement en présence d'EDTA.
Exemple 13 : Absence de liaison de l'aptamère au FVII de lapin A. Matériel et Méthodes A.1. Le support de chromatographie d'affinité
Gel d'affinité couplé à la streptavidine sur lequel on a immobilisé l'aptamère de séquence SEQ
ID N 86 par l'intermédiaire d'une chaîne espaceur (Fournisseur Novagen) via une biotine en 5' terminal avec une densité de ligand théorique 0,35 mg/ml : volume 1 ml, L'aptamère utilisé est l'aptamère de séquence SEQ I D N 86 A.2. Le produit de départ Eluât d'hydroxyapatite enrichi en FVII de lapin obtenu par purification à
partir de plasma de lapin, temps de contact 10 minutes, débit 0,5m1/min A.3. Le protocole de purification Equilibration gel Tris-HCI 0,050 M, CaC12 0,010 M, MgSO3 0,05mM pH 7,5, Elution Tris-HCI 0,050 M, EDTA 0,010 M, pH 7,5, 36 g injecté dans le gel avec temps de contact 10 minutes, l'élution est réalisée par injection de 2m1 de tampon d'élution On détecte les pics de protéines par mesure de la valeur d'absorbance à la longueur d'onde de 280 nanomètres.
A.4. les protocoles d'analyse des fractions en protéines et en Facteur VII
Les fractions sont analysées pour leur activité amidolytique en dosage chromogénique grâce à un kit Stago selon les recommandations du fournisseur (Kit Facteur Vlla StatClot).
L'activité amidolytique est ensuite convertie en g de FVII contenu dans ladite fraction.
B. Résultats Les résultats sont illustrés sur le Tableau 4 ci-dessous.
Tableau 4 Etapes Protéines FVllam Volume Quantité Pureté (%) Rdt étape (mg/ml) (UI/ml) (ml) FVII (pg) (%) Starting material 1.38 57 2.5 71 2% 100%
Eluat Dialysé 0.97 21.8 3.4 36.7 1 % 52%
Eluat Mapt-2 NA 0.04 .0 0.08 NA 0.2%
Les résultats du tableau 4 montrent que le Facteur VII de lapin n'est pas retenu sur le gel d'affinité sur lequel est immobilisé l'aptamère Mapt-2 de séquence SEQ ID N
86.
Exemple 14 : Modes de réalisation spécifiques d'un protocole d'interaction du Facteur VII
humain avec un aptamère sur Biacore (résistance au NaCI) A. Matériel et Méthodes On a fabriqué un support solide sur lequel ont été immobilisées des molécules de l'aptamère nucléique de l'invention de séquence SEQ ID N 86, aussi désigné
ici Mapt2 .
Préalablement à sa fixation sur le support solide, l'extrémité 5' de l'aptamère Mapt2 a été
chimiquement couplée à une chaîne espaceur constituée de 4 molécules de PEG(C18). Puis, l'extrémité libre de la chaîne espaceur, opposée à l'extrémité couplée à
l'aptamère, a été
couplée à une molécule de biotine.
On dispose d'un support solide contenant des molécules de streptavidine immobilisées (Serie S sensor Chip SA, GE) Puis, on a mis en contact le support solide ci-dessus avec les composés aptamères ci-dessus afin d'immobiliser les acides nucléiques de séquence SEQ ID N 86, par association non covalente entre les molécules de streptavidine du support et les molécules de biotine des composés aptamères.
L'aptamère Mapt2 est ainsi immobilisé avec un taux d'immobilisation de 3772 RU
(1 RU
correspond approximativement à 1 pg de produit immobilisé par mm2) .
Du FVII humain transgénique purifié obtenu à partir de lait de lapine transgénique (FVII
HPTG, pureté : 98%) a été dilué dans du tampon de course (Tris 50 mM, NaCI 50 mM, CaCl2 10 mM, MgCl2 4 mM, pH 7,4) de manière à obtenir un échantillon de concentration 200mM en FVII.
L'échantillon a été injecté sur la puce (support solide) contenant l'aptamère Mapt2 immobilisé par une interaction biotine-streptavidine. Ensuite, des tampons de concentration croissante en NaCI ont été injectés sur le support solide (3 séries d'injection allant de 1 M de NaCI à 3 M de NaCI). Toutes les injections ont été réalisées avec un débit 30 I/min pendant 60 sec après l'injection. Après les 3 séries d'injection avec les 3 tampons contenant du NaCI, du tampon d'élution (EDTA, 10mM) a ensuite été injecté pendant 75 sec avec un débit de 30 I/min pour décrocher le FVII HPTG de l'aptamère.
Ces analyses sont effectuées avec l'appareil de RPS Biacore T100 (GE). La modélisation des interactions enregistrées sont effectuée à l'aide du Logiciel Biaevaluation (GE).
Les courbes de liaison de l'aptamère immobilisé Mapt2 au FVII humain transgénique ont été calculées avec le module dédié du logiciel Biacore control Software, version 1.2.
Les résultats liaison de l'aptamère Mapt2 au FVII humain ont permis de déterminer que la liaison de l'aptamère Mapt2 au FVII humain n'est pas altérée par l'injection des tampons contenant du NaCI.
B. Résultats Les résultats sont illustrés dans la figure 16 Exemple 15 : Modes de réalisation spécifiques d'un protocole d'interaction du Facteur VII
humain avec un aptamère sur Biacore (résistance au propylène glycol) A. Matériel et Méthodes On a fabriqué un support solide sur lequel ont été immobilisées des molécules de l'aptamère nucléique de l'invention de séquence SEQ ID N 86, aussi désigné ici Mapt2 . Préalablement à sa fixation sur le support solide, l'extrémité 5' de l'aptamère Mapt2 a été
chimiquement couplée à une chaîne espaceur constituée de 4 molécules de PEG(C18). Puis, l'extrémité libre de la chaîne espaceur, opposée à l'extrémité couplée à l'aptamère, a été
couplée à une molécule de biotine.
On dispose d'un support solide contenant des molécules de streptavidine immobilisées (Serie S sensor Chip SA, GE) Puis, on a mis en contact le support solide ci-dessus avec les composés aptamères ci-2o dessus afin d'immobiliser les acides nucléiques de séquence SEQ ID N 86, par association non covalente entre les molécules de streptavidine du support et les molécules de biotine des composés aptamères.
L'aptamère Mapt2 est ainsi immobilisé avec un taux d'immobilisation de 5319 RU
(1 RU
correspond approximativement à 1 pg de produit immobilisé par mm2) .
Du FVII humain transgénique purifié obtenu à partir de lait de lapine transgénique (FVII
HPTG, pureté : 98%) a été dilué dans du tampon de course (Tris 50 mM, CaCl2 10 mM, MgCl2 4 mM, pH 7,4) de manière à obtenir un échantillon de concentration 200mM en FVII.
L'échantillon a été injecté sur la puce (support solide) contenant l'aptamère Mapt2 immobilisé par une interaction biotine-streptavidine. Ensuite, un tampon contenant 50% de propylène glycol a été injecté sur le support solide. Toutes les injections ont été réalisées avec un débit 30 I/min pendant 60 sec après l'injection. Après l'injection avec le tampon contenant 50% de propylène glycol, du tampon d'élution (EDTA, lOmM) a ensuite été
injecté pendant 75 sec avec un débit de 30 I/min pour décrocher le FVII HPTG de l'aptamère.
Ces analyses sont effectuées avec l'appareil de RPS Biacore T100 (GE). La modélisation des interactions enregistrées sont effectuée à l'aide du Logiciel Biaevaluation (GE).
Les courbes de liaison de l'aptamère immobilisé Mapt2 au FVII humain transgénique ont été calculées avec le module dédié du logiciel Biacore control Software, version 1.2.
Les résultats liaison de l'aptamère Mapt2 au FVII humain ont permis de déterminer que la liaison de l'aptamère Mapt2 au FVII humain n'est pas altérée par l'injection du tampon contenant du propylène glycol.
5 B. Résultats Les résultats sont illustrés dans la figure 17
En général, on administre une dose quotidienne d'un aptamère anti-FVII/Vlla humain tel que défini dans la présente description allant de 1 nanogramme à 100 milligrammes, mieux 25 allant de 100 nanogrammes à 10 milligrammes, pour un patient de 80 kgs.
La présente invention est également illustrée ci-après, sans y être limitée, aux exemples suivants.
EXEMPLES
3o Exemple 1 : Capture d'acides nucléiques aptamères selon l'invention par du Facteur VII/Vlla humain immobilisé sur un support.
On a fabriqué un support solide sur lequel ont été immobilisées des molécules de Facteur VII/Vlla humain purifié d'origine plasmatique.
On réalise une immobilisation du Facteur VII humain sur dextran carboxymethyl activé
par NHS-EDC et se liant aux amines libres présentes sur le FVII/Vlla.
Le Facteur VII/Vlla humain est ainsi immobilisé avec un taux d'immobilisation de 2743 RU (1 RU correspond approximativement à 1 pg de produit immobilisé par mm2).
Des aptamères nucléiques de l'invention (pureté : 99%), respectivement l'aptamère Mapt 2 (SEQ ID N 86), l'aptamère Mapt 3 (SEQ ID N 41) et l'aptamère Mapt 7 (SEQ ID
N 58), ont été dilués dans du tampon de course (Tris 50 mM, NaCI 50 mM, CaCl2 10 mM, MgCl2 4 mM, pH
7,4) de manière à obtenir trois échantillons d'aptamères.
Chaque échantillon a été injecté de façon séquentielle sur une même puce (support solide) contenant le FVII humain immobilisé. Des contrôles sont obtenus en injectant des blancs ne contenant que du tampon de course. Toutes les injections ont été réalisées avec un débit 30 I/min pendant 60 sec, après l'injection, du tampon de course a été injecté
sur la puce à un débit identique pendant 120 sec. Du tampon d'élution (EDTA, 5mM) a ensuite été
injecté
pendant 60 sec avec un débit de 30 I/min pour décrocher l'aptamère du FVII
humain immobilisé. La puce permet d'étudier en temps réel la formation et la rupture des interactions entre le FVII humain immobilisé et chacun des aptamères Mapt2, Mapt3 et Mapt 7 testés, grâce à la résonance plasmonique de surface (RPS). Une liaison sur le FVII humain immobilisé se traduit par une augmentation du signal en unité de résonance (RU) enregistré
par l'appareil (Figure 2). Ces analyses sont effectuées avec l'appareil de RPS Biacore T100 (GE). La modélisation des interactions enregistrées sont effectuées à l'aide du Logiciel Biaevaluation (G E).
Les résultats obtenus montrent que tous les aptamères nucléiques testés se lient avec une affinité significative au Facteur VII humain plasmatique.
Exemple 2 : Capture du Facteur VII/Vlla humain par un acide nucléique aptamère selon l'invention, immobilisé sur un support.
On a fabriqué un support solide sur lequel ont été immobilisées des molécules de l'aptamère nucléique de l'invention de séquence SEQ ID N 86, aussi désigné
ici Mapt2 .
Préalablement à sa fixation sur le support solide, l'extrémité 5' de l'aptamère Mapt2 a été
chimiquement couplée à une chaîne espaceur constituée de 4 molécules de PEG(C18). Puis, l'extrémité libre de la chaîne espaceur, opposée à l'extrémité couplée à
l'aptamère, a été
couplée à une molécule de biotine.
On dispose d'un support solide contenant des molécules de streptavidine immobilisées (Serie S sensor Chip SA, GE) Puis, on a mis en contact le support solide ci-dessus avec les composés aptamères ci-dessus afin d'immobiliser les acides nucléiques de séquence SEQ ID N 86, par association non covalente entre les molécules de streptavidine du support et les molécules de biotine des composés aptamères.
L'aptamère Mapt2 est ainsi immobilisé avec un taux d'immobilisation de 983 RU
(1 RU
correspond approximativement à 1 pg de produit immobilisé par mm2) .
Du FVII humain purifié à partir du plasma (FVII HP, pureté : 99%) a été dilué
dans du tampon de course (Tris 50 mM, NaCI 50 mM, CaCl2 10 mM, MgCl2 4 mM, pH 7,4) de manière à
obtenir quatre échantillons de concentration en FVII HP de 62, 125, 250 et 500 nM.
Séparément, une préparation d'immunoglobulines polyvalentes (Tégéline , commercialisée par le LFB, France) a été diluée dans du tampon de course (Tris 50 mM, NaCI
50 mM, CaCl2 10 mM, MgCl2 4 mM, pH 7,4) de manière à obtenir quatre échantillons de concentration en immunoglobulines polyvalentes de 62, 125, 250 et 500 nM.
Chaque échantillon a été injecté de façon séquentielle sur une même puce (support solide) contenant l'aptamère Mapt2 immobilisé par une interaction biotine-streptavidine. Des contrôles sont obtenus en injectant des blancs ne contenant que du tampon de course. Toutes les injections ont été réalisées avec un débit 30 I/min pendant 60 sec, après l'injection, du tampon de course a été injecté sur la puce à un débit identique pendant 120 sec. Du tampon d'élution (EDTA, 5mM) a ensuite été injecté pendant 30 sec avec un débit de 30 I/min pour décrocher le FVII HP de l'aptamère..La puce permet d'étudier en temps réel la formation et la rupture des interactions entre le FVII HP, ou les immunoglobulines polyvalentes, et l'aptamère immobilisé grâce à la résonance plasmonique de surface (RPS). Une liaison sur l'aptamère immobilisé se traduit par une augmentation du signal en unité de résonance (RU) enregistré par l'appareil (Figure 3). Ces analyses sont effectuées avec l'appareil de RPS
Biacore T100 (GE).
La modélisation des interactions enregistrées sont effectuée à l'aide du Logiciel Biaevaluation (GE).
Cet exemple montre que l'aptamère Mapt2, une fois immobilisé se lie spécifiquement au FVII HP, avec une affinité significative. L'aptamère Mapt2 ne se lie pas aux immunoglobulines polyvalentes.
Exemple 3 : Capture du Facteur VII/Vlla humain par un acide nucléique aptamère selon l'invention, immobilisé sur un support.
On a fabriqué un support solide sur lequel ont été immobilisées des molécules de l'aptamère nucléique de l'invention de séquence SEQ ID N 86, aussi désigné
ici Mapt2 .
Préalablement à sa fixation sur le support solide, l'extrémité 5' de l'aptamère Mapt2 a été
chimiquement couplée à une chaîne espaceur constituée de 4 molécules de PEG(C18). Puis, l'extrémité libre de la chaîne espaceur, opposée à l'extrémité couplée à
l'aptamère, a été
couplée à une molécule de biotine.
On dispose d'un support solide contenant des molécules de streptavidine immobilisées (Serie S sensor Chip SA, GE) Puis, on a mis en contact le support solide ci-dessus avec les composés aptamères ci-dessus afin d'immobiliser les acides nucléiques de séquence SEQ ID N 86, par association non covalente entre les molécules de streptavidine du support et les molécules de biotine des composés aptamères.
L'aptamère Mapt2 est ainsi immobilisé avec un taux d'immobilisation de 424,9 RU (1 RU
correspond approximativement à 1 pg de produit immobilisé par mm2).
Du FVII humain purifié à partir du plasma (FVII HP, pureté : 99%) a été dilué
dans du tampon de course (Tris 50 mM, NaCI 50 mM, CaCl2 10 mM, MgCl2 4 mM, pH 7,4) de manière à
obtenir un échantillon de concentration en FVII HP de 500 nM.
Chaque échantillon a été injecté de façon séquentielle sur une même puce (support solide) contenant l'aptamère Mapt2 immobilisé par une interaction biotine-streptavidine. Des contrôles sont obtenus en injectant des blancs ne contenant que du tampon de course. Toutes les injections ont été réalisées avec un débit 30 I/min pendant 60 sec, après l'injection, du tampon de course a été injecté sur la puce à un débit identique pendant 120 sec. Du tampon d'élution (EDTA, 5mM) a ensuite été injecté pendant 30 sec avec un débit de 30 I/min pour décrocher le FVII HP de l'aptamère. La puce permet d'étudier en temps réel la formation et la rupture des interactions entre le FVII HP et l'aptamère immobilisé grâce à la résonance plasmonique de surface (RPS). Une liaison sur l'aptamère immobilisé se traduit par une augmentation du signal en unité de résonance (RU) enregistré par l'appareil (Figure 4). Ces analyses sont effectuées avec l'appareil de RPS Biacore T100 (GE).
Afin de vérifier que le produit qui se lie à l'aptamère immobilisé est bien le FVII, une séquence d'injection comprenant (i) le FVII HP à 500nM et (ii) un anticorps monoclonal anti-FVII
à 1 M (Sigma, Ref Clone n MC1476/E.A.8.1) a été réalisée sur la même puce.
Les conditions d'injection et d'analyse sont identiques à celle décrites précédemment. Si l'aptamère retient effectivement du FVII, l'injection d'anticorps monoclonal anti-FVII doit se traduire par une augmentation du signal en RU consécutif à la liaison des anticorps sur le FVII
lui même lié à
l'aptamère. En témoins des anticorps seuls sont injectés. L'augmentation de signal en RU
montre bien que l'aptamère reconnaît le FVII (Figure 4).
La modélisation des interactions enregistrées sont effectuée à l'aide du Logiciel Biaevaluation (GE).
Les résultats de cet exemple montrent que l'aptamère, une fois immobilisé, se lie spécifiquement au FVII HP, avec une affinité significative et que le signal observé est bien du à
la rétention du FVII sur l'aptamère.
Exemple 4 : Stoechiométrie aptamère Mapt2/FVII humain plasmatique On a fabriqué un support solide sur lequel ont été immobilisées des molécules de l'aptamère nucléique de l'invention de séquence SEQ ID N 86, aussi désigné
ici Mapt2 .
Préalablement à sa fixation sur le support solide, l'extrémité 5' de l'aptamère Mapt2 a été
chimiquement couplée à une chaîne espaceur constituée de 4 molécules de PEG(C18). Puis, l'extrémité libre de la chaîne espaceur, opposée à l'extrémité couplée à
l'aptamère, a été
couplée à une molécule de biotine.
On dispose d'un support solide contenant des molécules de streptavidine immobilisées (Série S sensor Chip SA, GE) Puis, on a mis en contact le support solide ci-dessus avec les composés aptamères ci-dessus afin d'immobiliser les acides nucléiques de séquence SEQ ID N 86, par association non covalente entre les molécules de streptavidine du support et les molécules de biotine des composés aptamères.
L'aptamère Mapt2 est ainsi immobilisé avec un taux d'immobilisation de 983 RU
(1 RU
correspond approximativement à 1 pg de produit immobilisé par mm2).
Du FVII humain purifié à partir du plasma (FVII HP, pureté : 99%) a été dilué
dans du tampon de course (Tris 50 mM, NaCI 50 mM, CaCl2 10 mM, MgCl2 4 mM, pH 7,4) de manière à
obtenir un échantillon de concentration en FVII HP de 1 M.
Chaque échantillon a été injecté de façon séquentielle sur une même puce (support solide) contenant l'aptamère Mapt2 immobilisé par une interaction biotine-streptavidine. Des contrôles sont obtenus en injectant des blancs ne contenant que du tampon de course. Toutes les injections ont été réalisées avec un débit 30 I/min pendant 700 sec, après l'injection, du tampon de course a été injecté sur la puce à un débit identique pendant 120 sec. Du tampon d'élution (EDTA, 20mM) a ensuite été injecté pendant 30 sec avec un débit de 30 I/min pour décrocher le FVII HP de l'aptamère. La puce permet d'étudier en temps réel la formation et la rupture des interactions entre le FVII HP, et l'aptamère immobilisé grâce à la résonance plasmonique de surface (RPS). Une liaison sur l'aptamère immobilisé se traduit par une augmentation du signal en unité de résonance (RU) enregistré par l'appareil (Figure 5). Ces analyses sont effectuées avec l'appareil de RPS Biacore T100 (GE).
La modélisation des interactions enregistrées sont effectuée à l'aide du Logiciel Biaevaluation (GE).
Les résultats de cet exemple montrent que des quantités croissantes de FVII
humain se lient à l'aptamère Mapt2 au cours du temps d'injection et que la saturation des sites aptamères par les molécules de FVII humain n'est pas encore atteinte à la fin de la durée d'injection (700 sec).
Les résultats montrent qu'une grande partie des molécules d'aptamère Mapt2 immobilisées à la surface du support solide sont capables de lier le FVII
humain. Ces résultats signifient que la conformation dans laquelle l'aptamère est apte à lier sa cible est suffisamment stable pour que la grande majorité des aptamères soient sous cette forme et que cette conformation n'est pas significativement altérée ou gênée par l'immobilisation.
Ces résultats montrent aussi que la stoechiométrie de liaison Mapt2/FVII
humain est d'environ 1/1.
Pour la liaison Mapt2/FVII humain, le signal maximum attendu était de [MW FVII/MW Mapt2]*niveau immobilisation*stoechio, avec :
- MW FVII signifie le poids moléculaire du FVII humain, égal à 50 kDa - MW Mapt2 signifie le poids moléculaire de Mapt2, égal à 27 kDa, - niveau d'immobilisation est dans cet exemple de 983,3, et - steochio signifie la stoechiométrie Mapt2/FVII, qui est égale à 1.
5 Avec la formule ci-dessus, la valeur du signal maximum attendu était de :
1820 RU.
On calcule ensuite le pourcentage d'aptamères Mapt2 ayant lié une molécule de Facteur VII
humain, selon la formule : Signal Mesuré/Signal Attendu, avec :
- Signal Mesuré qui est égal à 1124 RU, et 10 - Signal Attendu qui est égal à 1820 RU
Selon la formule ci-dessus, le pourcentage de molécules de l'aptamère Mapt2 ayant lié
une molécule de FVII humain à la fin de l'injection est de 62%.
Exemple 5 : Cinétique de la liaison de l'aptamère Mapt2 au FVII humain plasmatique 15 On a fabriqué un support solide sur lequel ont été immobilisées des molécules de l'aptamère nucléique de l'invention de séquence SEQ ID N 86, aussi désigné
ici Mapt2 .
Préalablement à sa fixation sur le support solide, l'extrémité 5' de l'aptamère Mapt2 a été
chimiquement couplée à une chaîne espaceur constituée de 4 molécules de PEG(C18). Puis, l'extrémité libre de la chaîne espaceur, opposée à l'extrémité couplée à
l'aptamère, a été
20 couplée à une molécule de biotine.
On dispose d'un support solide contenant des molécules de streptavidine immobilisées (Serie S sensor Chip SA, GE) Puis, on a mis en contact le support solide ci-dessus avec les composés aptamères ci-dessus afin d'immobiliser les acides nucléiques de séquence SEQ ID N 86, par association 25 non covalente entre les molécules de streptavidine du support et les molécules de biotine des composés aptamères.
L'aptamère Mapt2 est ainsi immobilisé avec un taux d'immobilisation de 425 RU
(1 RU
correspond approximativement à 1 pg de produit immobilisé par mm2) .
Du FVII humain purifié à partir du plasma (FVII HP, pureté : 99%) a été dilué
dans du 30 tampon de course (Tris 50 mM, NaCI 50 mM, CaCl2 10 mM, MgCl2 4 mM, pH 7,4) de manière à
obtenir quatre échantillons de concentration en FVII HP de 125, 250 (en duplicate), 500 nM et 1000 mM.
Chaque échantillon a été injecté de façon séquentielle sur une même puce (support solide) contenant l'aptamère Mapt2 immobilisé par une interaction biotine-streptavidine. Des contrôles sont obtenus en injectant des blancs ne contenant que du tampon de course. Toutes les injections ont été réalisées avec un débit 30 I/min pendant 60 sec, après l'injection, du tampon de course a été injecté sur la puce à un débit identique pendant 120 sec. Du tampon d'élution (EDTA, 20mM) a ensuite été injecté pendant 75 sec avec un débit de 30 I/min pour décrocher le FVII HP de l'aptamère.
Ces analyses sont effectuées avec l'appareil de RPS Biacore T100 (GE). La modélisation des interactions enregistrées sont effectuée à l'aide du Logiciel Biaevaluation (GE).
Les courbes de la cinétique de liaison de l'aptamère immobilisé Mapt2 au FVII
humain plasmatique ont été calculées avec le module dédié du logiciel Biacore control Software, version 1.2.
Les courbes de la cinétique de liaison de l'aptamère immobilisé Mapt2 au FVII
humain plasmatique sont représentées sur la Figure 6.
Les résultats du calcul de cinétique de liaison de l'aptamère Mapt2 au FVII
humain ont permis de déterminer que :
- la constante de dissociation Kd de Mapt2 est de 99,9 nM, et - la constante d'association Ka (= 6,25.103 M-'s-1) de Mapt2 est de 6,25.10-4 s' Exemple 6 : Elution du FVII humain recombinant par l'EDTA
On a fabriqué un support solide sur lequel ont été immobilisées des molécules de l'aptamère nucléique de l'invention de séquence SEQ ID N 86, aussi désigné
ici Mapt2 .
Préalablement à sa fixation sur le support solide, l'extrémité 5' de l'aptamère Mapt2 a été
chimiquement couplée à une chaîne espaceur constituée de 4 molécules de PEG(C18). Puis, l'extrémité libre de la chaîne espaceur, opposée à l'extrémité couplée à
l'aptamère, a été
couplée à une molécule de biotine.
On dispose d'un support solide contenant des molécules de streptavidine immobilisées Puis, on a mis en contact le support solide ci dessus ci-dessus avec les composés aptamères ci-dessus afin d'immobiliser les acides nucléiques de séquence SEQ
ID N 86, par association non covalente entre les molécules de streptavidine du support et les molécules de biotine des composés aptamères.
On a aussi fabriqué un support solide sur lequel ont été immobilisées des molécules d'un anticorps polyclonal anti-FVII biotinylé.
Les supports solides avec l'aptamère Mapt2 ou avec l'anticorps polyclonal anti-FVII
humain consistent en des plaques de 96 puits pour test ELISA;
Pour la révélation, on a utilisé un anticorps polyclonal anti-FVII humain marqué par la peroxydase de raifort.
Les conditions de l'essai sont détaillées ci-dessous.
- Plaque : Biobind Streptavidin coated (Thermo ref : 95029293) Tampons :
- Immobilisation : Tris 5OmM, NaCI l5OmM, Tween 20 0,1% / pH = 7,5 Lavage Ca2+/Mg2+: Tris 50mM, NaCI 50mM, CaCl2 10mM, MgCl2 4mM, Tween 20 0,1%
/pH
= 7,4 Lavage EDTA : EDTA 1OmM dans eau PPI + Tween 20 0,1%
Ligand : Mapt 2 obtenue par synthèse chimique chez Eurogentec. Concentration pour l'immobilisation 200nM, volume = 100 I, 1 h à température ambiante - Ligands témoins : Anticorps polyclonnal anti-FVII purifié sur chromatographie d'affinité FVII
(R&D system, ref :BAF 2338) Concentration pour l'immobilisation 200nM, volume = 100 I, 1 h à
température ambiante - Echantillon : FVII humain transgénique produit chez le lapin stabilisé avec 1% BSA, lot:
479186. Concentration = 100nM, volume déposé = 100 I, 1 H15 à température ambiante - Anticorps de révélation : issu du kit Asserachrom FVII:Ag (diagnostica Stago) préparé selon les recommandations du fournisseur. Volume = 100 I, 45min à température ambiante - Révélation : 100 I par puits d'une solution d'OPD + H202 - Arrêt de la réaction : H2SO4 50 I par puits - Lecture à 492 nm Les résultats, exprimés en D.O. à 492 nm, sont présentés dans le Tableau 1 ci-dessous.
Tableau 1 Lavage : Ca2+/Mg2+ Lavage : EDTA
3,53/3,56 0,093/0,09 3,53/3,79 0,094/0,085 3,75/3,75 0,097/0,09 3,9/4,0 3,45/3,27 4,0/4,2 3,52/3,54 - Résultats en caractères gras : aptamère Mapt2 (SEQ ID N 86) immobilisé
- Résultats en caractères normaux : anticorps polyclonal anti-FVII humain immobilisé
Les résultats de cet exemple montrent que seule une fixation du FVII humain avec l'aptamère Mapt 2 permet une élution avec de l'EDTA.
Exemple 7 : Liaison des aptamères à différents types de Facteur VII humain On a fabriqué un support solide sur lequel ont été immobilisées des molécules de l'aptamère nucléique de l'invention de séquence SEQ ID N 86, aussi désigné
ici Mapt2 .
Préalablement à sa fixation sur le support solide, l'extrémité 5' de l'aptamère Mapt2 a été
chimiquement couplée à une chaîne espaceur constituée de 4 molécules de PEG(C18). Puis, l'extrémité libre de la chaîne espaceur, opposée à l'extrémité couplée à
l'aptamère, a été
couplée à une molécule de biotine.
On dispose d'un support solide contenant des molécules de streptavidine immobilisées (Serie S sensor Chip SA, GE) Puis, on a mis en contact le support solide ci-dessus avec les composés aptamères ci-dessus afin d'immobiliser les acides nucléiques de séquence SEQ ID N 86, par association non covalente entre les molécules de streptavidine du support et les molécules de biotine des composés aptamères.
L'aptamère Mapt2 est ainsi immobilisé avec un taux d'immobilisation de 4326 RU
(1 RU
correspond approximativement à 1 pg de produit immobilisé par mm2). La partie du support solide sur laquelle est immobilisée Mapt2 est appelée cellule active.
Selon la même technique, on a immobilisé sur une partie indépendante du support solide appelée cellule de référence des molécules d'acide nucléique quelconques, avec un taux d'immobilisation de 4069 RU.
On a utilisé différents types de Facteur VII humain, respectivement :
- du FVII humain plasmatique obtenu selon le procédé de purification Acset, - du FVII humain recombinant produit chez le lapin, - du FVII humain recombinant produit chez la chèvre, et - du FVII humain recombinant (Novoseven commercialisé par Novo) Chaque échantillon a été injecté de façon séquentielle sur la même cellule active (support solide) contenant l'aptamère Mapt2 immobilisé par une interaction biotine-streptavidine. Des contrôles sont obtenus en injectant des blancs ne contenant que du tampon de course. Des signaux correspondant au bruit de fond sont obtenus en injectant les mêmes échantillons sur la cellule de référence contenant les acides nucléiques quelconques immobilisés, ces signaux sont retranchés aux signaux obtenus sur la cellule active. Toutes les injections ont été réalisées avec un débit 30 I/min pendant 60 sec, après l'injection, du tampon de course a été injecté sur la puce à un débit identique pendant 120 sec. Du tampon d'élution (EDTA, 15mM) a ensuite été injecté pendant 30 sec avec un débit de 30 I/min pour décrocher le FVII de l'aptamère.. La puce permet d'étudier en temps réel la formation et la rupture des interactions entre le FVII et l'aptamère immobilisé grâce à la résonance plasmonique de surface (RPS). Une liaison sur l'aptamère immobilisé se traduit par une augmentation du signal en unité de résonance (RU) enregistré par l'appareil (Figure 7). Ces analyses sont effectuées avec l'appareil de RPS Biacore T100 (GE).
La modélisation des interactions enregistrées sont effectuée à l'aide du Logiciel Biaevaluation (GE).
Les résultats sont représentés sur la Figure 7.
Les résultats de cet exemple montrent que l'aptamère, une fois immobilisé, se lie spécifiquement à une grande variété de Facteur VII humain, y compris du Facteur VII humain plasmatique et des facteurs VII humains recombinants produits dans divers animaux transgéniques, incluant le lapin et la chèvre.
Exemple 8 : Liaison spécifique des aptamères au Facteur VII humain On a fabriqué un support solide sur lequel ont été immobilisées des molécules de l'aptamère nucléique de l'invention de séquence SEQ ID N 86, aussi désigné
ici Mapt2 .
Préalablement à sa fixation sur le support solide, l'extrémité 5' de l'aptamère Mapt2 a été
chimiquement couplée à une chaîne espaceur constituée de 4 molécules de PEG(C18). Puis, l'extrémité libre de la chaîne espaceur, opposée à l'extrémité couplée à
l'aptamère, a été
couplée à une molécule de biotine.
On dispose d'un support solide contenant des molécules de streptavidine immobilisées (Serie S sensor Chip SA, GE) Puis, on a mis en contact le support solide ci-dessus avec les composés aptamères ci-dessus afin d'immobiliser les acides nucléiques de séquence SEQ ID N 86, par association non covalente entre les molécules de streptavidine du support et les molécules de biotine des composés aptamères.
L'aptamère Mapt2 est ainsi immobilisé avec un taux d'immobilisation de 4326 RU
(1 RU
correspond approximativement à 1 pg de produit immobilisé par mm2).
La partie du support solide sur laquelle est immobilisée Mapt2 est appelée cellule active.
Selon la même technique, on a immobilisé sur une partie indépendante du support solide appelée cellule de référence des molécules d'acide nucléique quelconques, avec un taux d'immobilisation de 4069 RU.
On a utilisé différents types de Facteur VII, respectivement :
- du FVII humain plasmatique obtenu selon le procédé de purification Acset, - du FVII de lapin recombinant commercialisé par la société American Diagnostica (Ref 407RAB, Lot n 080818).
Chaque échantillon a été injecté de façon séquentielle sur une même puce (support solide) contenant l'aptamère Mapt2 immobilisé par une interaction biotine-streptavidine. Des contrôles sont obtenus en injectant des blancs ne contenant que du tampon de course. Des signaux correspondant au bruit de fond sont obtenus en injectant les mêmes échantillons sur la cellule de référence contenant les acides nucléiques quelconques immobilisés, ces signaux sont retranchés aux signaux obtenus sur la cellule active.Toutes les injections ont été réalisées avec un débit 30 I/min pendant 60 sec, après l'injection, du tampon de course a été injecté sur la puce à un débit identique pendant 120 sec. Du tampon d'élution (EDTA, 15mM) a ensuite été
injecté pendant 30 sec avec un débit de 30 I/min pour décrocher le FVII humain ou de lapin de l'aptamère.. La puce permet d'étudier en temps réel la formation et la rupture des interactions entre le FVII HP et l'aptamère immobilisé grâce à la résonance plasmonique de surface (RPS).
5 Une liaison sur l'aptamère immobilisé se traduit par une augmentation du signal en unité de résonance (RU) enregistré par l'appareil (Figure 8). Ces analyses sont effectuées avec l'appareil de RPS Biacore T100 (GE).
La modélisation des interactions enregistrées sont effectuée à l'aide du Logiciel Biaevaluation (GE).
10 Les résultats de cet exemple montrent que l'aptamère, une fois immobilisé, est très spécifique du FVII/Vlla humain et ne se lie pas au FVII/Vlla de lapin.
Exemple 9 : préparation d'un support d'affinité
Le support d'affinité a été réalisé à partir d'un matériau de support solide consistant en 15 une matrice sur laquelle on a greffé de la streptavidine (streptavidin-agarose - Novagen ).
On a introduit un volume de 1 ml de gel dans un conteneur consistant en une colonne (i.d. 11 mm). On a lavé le gel avec de l'eau purifiée, pour éliminer le solvant de stockage Les caractéristique du ciel sont :
20 - Capacité d'adsorption de biotine : > 85 nanomole / ml de gel - Test fonctionnel : Capture >99% de thrombine biotinylée en 30 minutes à TA
- Autres tests : Protease-free , endo/exonucléase-free, RNase-free.
- Conservateur : 100 mM sodium phosphate pH7,5 + NaN3 0,02 25 La sortie de la colonne conditionnée ( packée ) (Hauteur de lit de gel =
1cm) est connectée à un détecteur d'absorbance équipé d'un filtre UV à 254 nm et d'un enregistreur.
Les aptamères nucléiques anti-FVII humain biotinylés de séquence SEQ ID N 86 sont solubilisés dans de l'eau purifiée à la concentration finale de 0,5 mg/0,187 ml, soit une concentration molaire finale de 0,1 mM. La solution d'aptamères nucléiques a été activée à
30 95 C selon le cycle standard, pour l'immobilisation des aptamères sur le matériau support solide..
La solution d'aptamères nucléiques a été préalablement diluée par 4,8 ml d'eau purifiée puis 1,5 ml de tampon Me" (5 x concentré).
35 Le détecteur d'absorbance est ajusté à 1 AUFS (Absorbance Unit Full Scale) et on enregistre la DO à 254 nm de cette solution à 0,575 UA254.
La solution d'aptamères nucléiques biotinylés est injectée sur le gel streptavidin-agarose pré-conditionnée ( prépackée ) et mise en recirculation avec une pompe péristaltique à un débit de 2,5 ml/minute, soit un temps de contact sur le gel de 24 secondes (entrée/sortie E/S).
Dans ces conditions, la DO à 254 nm se stabilise rapidement à 0,05 UA254, soit une valeur de 91% de couplage théorique, c'est-à-dire 0,455 mg d'aptamères nucléiques par millilitre de gel.
Un lavage avec un tampon 10 mM CaCl2 + 4 mM MgCl2 puis en NaCI 2M est réalisé, afin d'éliminer les aptamères nucléiques qui ne sont pas fixées spécifiquement aux molécules de streptavidine greffées sur le matériau de support solide.
Example 10 : Procédé de purification du Facteur VII recombinant humain Les supports d'affinité aptamères ont été testés à partir d'une préparation purifiée en FVII/FVIIa préparée selon la technique décrite dans la demande PCT n W02008/099077.
Préparation de l'échantillon à purifier La matière biologique de départ est du lait de lapine transgénique contenant du FVII
humain recombinant. La cassette d'expression comprend le transgène FVII humain placé sous le contrôle du promoteur du gène de la R-caseine.
Brièvement, 140 millilitres de lait ont été collectés sur 2 lapines en première lactation entre le Jour 4 et le Jour 12 après mise bas.
Le titre moyen en FVII amidolytique (FVII biologiquement activable) dans le lait collecté
est de 928 UI/ml. Les laits sont conservés à une température de -80 C.
Pour l'essai, les laits de lapine sont décongelés au bain-marie à la température de 37 C, puis sont dilués par une solution de Citrate de Sodium pour une concentration finale en citrate de 62 g/l à un pH de 7,5.
Le traitement par le citrate de sodium permet la déstabilisation des micelles phosphocalciques de caséines.
La solution protéique riche en lipides du lait est ensuite clarifiée sur une séquence de filtres, respectivement (i) filtre profondeur de 15 à 0,5 pm de seuil de porosité puis (i) filtre membrane à 0,2 m.
Un volume de 360 ml de solution filtrée ayant un titre en FVII de 198 UI/ml, soit 36 mg de FVII transgénique, est pré-purifié sur un gel de chromatographie MEP-HyperCel (Pall 3o BioSepra) d'un volume de 16 mL. Ce gel de capture permet d'éliminer 95% des protéines du lait, dont la plus grande partie des caséines, tout en conservant 60% de la quantité de FVII
initiale.
Une quantité de 17,5 mg de FVII de faible pureté (-5%) obtenu à la fin de l'étape ci-dessus est purifiée par chromatographie d'échanges d'ions, en utilisant un gel de Q-sepharose XL (GE Healthcare) d'un volume de 20 mL, Le FVII humain est élué
avec un volume de 78 ml de tampon comprenant 5 mM de chlorure de calcium. La concentration en FVII
amydolitique est de 337 UI/ml, soit 0,17 mg de FVII/ml et la concentration en protéines totales est estimée à 0,18 mg/ml par mesure de DO à 280 nm et c" = 13, soit une pureté
en FVII de 94%.
Les protéines résiduelles provenant du lait de lapine sont difficilement séparables du FVII à ce stade, soit parce qu'il existe des homologies de structures telles que des protéines à
GLA-domaines ou à domaine EGF, ou bien des homologies physico-chimiques (charge ionique et/ou taille moléculaire proche). Les techniques classiques permettent une amélioration de la pureté jusqu'à 99,95% par des techniques orthogonales (combinaison de séparation sur gel d'hydroxyapatite et par chromatographie d'exclusion de taille). Cependant, pour l'injection répétée à l'homme, la charge en protéines exogènes admises pour les protéines de recombinaison génétique ne doit pas dépasser 50 ppm soit une pureté > 99,995%.
Une telle pureté ne semble atteignable qu'après purification sur matrice d'affinité.
Etape de purification du FVII recombinant humain sur le support d'affinité de l'invention Un volume de 6 ml de la solution de FVII humain purifié (1,1 mg de FVII) obtenue à la fin de l'étape précédente est utilisé pour l'étape de purification à un haut niveau de pureté du FVII
humain recombinant avec le support d'affinité de l'invention.
La solution de FVII obtenue à l'étape précédente, préalablement ajustée à 4 mM
MgCl2 et 10 mM CaCl2 et pH 7,5, est injectée sur le gel Aptamère-agarose (support d'affinité) avec une pompe péristaltique à un débit de 0,1 ml/minute soit un temps de contact avec le support d'affinité de 10 minutes (E/S).
Après injection, le gel est lavé en tampon tris 50 mM + NaCI 5OmM + 4 mM MgCl2 + 10 mM CaCl2 à pH 7,5.
Un volume de 10 ml de solution non adsorbé est collecté.
Le FVII est élué par un tampon tris 50mM + EDTA 10 mM à pH 7,5. La collecte du pic d'élution est réalisée suivant le profil de DO.
Selon les calculs molaires, la quantité d'aptamères nucléiques immobilisés dans le support d'affinité est de 17 nanomoles, ce qui correspond, pour une interaction mole à mole avec les molécules de FVII, à une capacité absolue du support d'affinité de 0,9 mg de FVII.
La figure 11 illustre un profil de chromatographie du FVII humain recombinant produit dans le lait de lapine, avec un suivi en continu des valeurs d'absorbance (D.O.) à 254 nanomètres.
Sur la Figure 11, l'inflexion (2) de la courbe d'absorption, après le moment de l'injection (1) illustre le début de la saturation du support d'affinité avec le FVII
humain recombinant. Au temps (3) l'injection de FVII humain recombinant est stoppée. Pour illustrer l'échelle linéaire des temps sur la Figure 1, on indique que la durée entre le temps de début d'injection (1) et le temps de fin d'injection (2) est de 10 minutes. Le support d'affinité continue de se saturer avec la protéine de la coagulation d'intérêt : des complexes entre (i) les aptamères nucléiques anti-FVII du support d'affinité et (ii) les molécules de FVII humain recombinant initialement contenues dans la composition à purifier ont été formés. Après passage de la composition à
purifier, on procède à une étape de lavage (6) de la colonne avec le tampon de lavage spécifié
précédemment. Puis on réalise l'étape d'élution, par injection au temps (4) de la solution tampon comprenant une concentration finale de 10 mM en EDTA. Le pic d'absorption illustre la libération du FVII humain recombinant à partir des complexes Aptamères nucléiques/FVII
recombinant. On note que les molécules de FVII humain recombinant sont libérées rapidement et donc dans un faible volume. En conséquence, grâce au support d'affinité de l'invention, on obtient une solution d'élution de forte concentration en protéine FVII humain recombinant. Au temps (5), on a réalisé une étape de régénération du support d'affinité, avec un tampon Tris à
50 mM. Le pic d'absorbance visible en (7) correspond aux substances libérées du support d'affinité du fait de l'étape de régénération Capacité dynamique d'absorption du support d'affinité
Le tableau 1 ci-dessous présente les résultats de l'essai, qui montrent une capacité
dynamique d'adsorption de 0,45 à 0,49 mg/ml des matrices d'affinité soit 50 à
55% de ligands bio-disponibles.
En EDTA, on calcule un rendement dynamique d'élution d'environ 75%.
Tableau 2 : bilan FVII recombinant humain et Protéines totales des essais de matrices Aptamères- aaarose:
FVII recombinant Protéines (total mg) DBC DE(%) (mg/m)l Départ 2228 100% 1,42 100%
Final Non 924 41% 0,57 40%
adsorbé
éluat 971 44% 0,61 43% 0,49 74%
Résultats 85% 83%
pondéraux Départ : échantillon de départ Final : composition des fractions BDC : capacité dynamique d'absorption (pour Dynamic Binding Capacity ) DE : Rendement dynamique d'élution (pour Dynamic Elution ) ; qui représente le rapport entre le FVII recombinant élué et le FVII recombinant adsorbé, exprimé en pourcentage Capacité de séparation Spécifique du Support d'affinité
Les supports d'affinité ont été évalués en spécificité par un dosage ELISA
spécifique des protéines du lait de lapines.
Les résultats sont représentés dans le Tableau 3 ci-dessous.
Tableau 3 : bilan de la spécificité des supports d'affinité :
FVII recombinant Protéines du lait de RMP % pureté
(total mg) lapine (RMP) (ppm) FVII
Départ 1,11 100% 16992 100% 16782 98,32%
Final Non 0,46 41% 14590 40% 34738 96,53%
adsorbé
éluat 0,49 44% 217 43% 492 99,95%
Résultats 85% 83%
pondéraux Les résultats du Tableau 3 ci-dessus montrent que l'on obtient une moyenne de 2 logo d'élimination des Aptamères-agarose portant la pureté du FVII humain transgénique de 98,3%
à 99,95%. Ceci montre une bonne spécificité des aptamères vis-à-vis du FVII
humain et très peu d'interactions aux protéines résiduelles du lait de lapines.
Une amélioration est possible par des lavages intermédiaires avant élution par des solutions telles que NaCI 2M et/ou Propylène Glycol ou Ethylène Glycol à 50%
si dans ces conditions le FVII ne s'élue pas.
Les résultats de l'exemple 10 illustrent les excellentes caractéristiques des supports d'affinité sur gel Aptamère-agarose avec une capacité dynamique d'adsorption d'au moins 1 mg de FVII par mg de ligand avec un rendement d'élution d'au moins 75%. La spécificité est également bien établie avec une nette amélioration de la pureté (99,95%), une élimination de 2 logo des RMP rabbit milk proteins résiduelles. Le taux final s'établit à
environ 500 ppm sur ces 2 essais non optimisés.
Exemple 11 : Capture d'acides nucléiques aptamères selon l'invention par du Facteur VII/Vlla humain immobilisé sur un support On a fabriqué un support solide sur lequel ont été immobilisées des molécules de Facteur VII/Vlla humain purifié d'origine plasmatique.
On réalise une immobilisation du Facteur VII humain sur dextran carboxymethyl activé
par NHS-EDC et se liant aux amines libres présentes sur le FVII/Vlla.
5 Le Facteur VII/Vlla humain est ainsi immobilisé avec un taux d'immobilisation de 2525 RU (1 RU correspond approximativement à 1 pg de produit immobilisé par mm2).
Une série de 27 aptamères nucléiques de l'invention (pureté : 99%), d'une longueur variant de 43 à 66 nucléotides selon les aptamères, ont été dilués dans du tampon de course (Tris 50 mM, NaCI 50 mM, CaCl2 10 mM, MgCl2 4 mM, pH 7,5) de manière à obtenir trois 10 échantillons d'aptamères. Chaque aptamère testé a été injecté à la concentration finale de 1 pM
dans le tampon de course.
Chaque échantillon a été injecté de façon séquentielle sur une même puce (support solide) contenant le FVII humain immobilisé. Des contrôles sont obtenus en injectant des blancs ne contenant que du tampon de course. Toutes les injections ont été réalisées avec un débit 15 30 I/min pendant 60 sec, après l'injection, du tampon de course a été
injecté sur la puce à un débit identique pendant 120 sec. Du tampon d'élution (EDTA, 5mM) a ensuite été
injecté
pendant 60 sec avec un débit de 30 I/min pour décrocher l'aptamère du FVII
humain immobilisé. La puce permet d'étudier en temps réel la formation et la rupture des interactions entre le FVII humain immobilisé et chacun des aptamères testés, grâce à la résonance 20 plasmonique de surface (RPS). Une liaison sur le FVII humain immobilisé se traduit par une augmentation du signal en unité de résonance (RU) enregistré par l'appareil (Figure El). Ces analyses sont effectuées avec l'appareil de RPS Biacore T100 (GE). La modélisation des interactions enregistrées sont effectuées à l'aide du Logiciel Biaevaluation (GE).
25 Les résultats sont présentés dans les figures 12 et 13.
La figure 12 illustre les courbes de liaison d'une série de 27 aptamères nucléiques de l'invention au Facteur VII humain plasmatique immobilisé sur un support, dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires.
30 La figure 13 illustre les valeurs individuelles de signal de fixation stable de chacun des 27 aptamères testés. En abscisse : chacun des 27 aptamères testés ; en ordonnées : signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires.
On observe quatre groupes d'aptamères se distinguant par leur affinité pour le Facteur VII humain.
35 Mapt2 core sequence se trouve dans le groupe d'affinité faible. Un représentant de la famille 2 possède une affinité trés supérieure aux autres. Cet aptamère est nommé Mapt 2.2 et possède la core sequence suivante :
5'CCGCACGCTACGCGCATGAACCCGCGCACACGACTTGAAGTAGC3' (SEQ ID N 33) Les résultats obtenus montrent néanmoins que tous les aptamères nucléiques testés se lient avec une affinité significative au Facteur VII humain plasmatique.
Exemple 12 : Procédé de purification du Facteur VII plasmatique humain A. Matériel et Méthodes A.1. Le support de chromatographie d'affinité
Matière Gel d'affinité sur lequel on a immobilisé l'aptamère Mapt-2 core couplé directement à la biotine, sans chaîne espaceur entre l'aptamère et la biotine. L'aptamère est immobilisé sur un gel streptavidine (Fournisseur Novagen) grâce à une biotine en 5' terminal avec une densité
de ligand théorique 0,4 mg/ml : volume 1 ml packé dans une colonne XK1 6 (GE) L'aptamère utilisé est l'aptamère de séquence SEQ ID N 20. Ce produit de départ comprend des impuretés, des formes tronquées de Facteur VII et des formes dégradées de Facteur VII. Une forme dégradée de Facteur VII peut comprendre une forme de Facteur VII
dont la gamma-carboxylation est altérée.
A.3. Le protocole de purification Equilibration gel : Tris-HCI 0,050 M, CaC12 0,010 M, MgC12 0,05mM pH 7,5, Elution : Tris-HCI 0,020 M, EDTA 0,010 M, pH 7,5, 240 g de FVII VII plasmatique humain purifié à 98% est injecté avec un débit de 0,5m1/min en tampon d'équilibration Après détection du pic de non retenu 2 volumes de colonne de tampon d'élution est injecté.
On détecte les pics de protéines par mesure de la valeur d'absorbance à la longueur d'onde de 280 nanomètres.
B. Résultats Les résultats sont illustrés sur les figures 14 et 15.
La Figure 14 représente la courbe des valeurs de mesure de l'absorbance à 280 nm en fonction du temps. Sur la Figure 14, le pic n 1 correspond à la fraction du produit de départ qui n'a pas été retenue sur la colonne. Le pic n 2 correspond à la fraction d'élution.
Le produit de départ ainsi que le produit élué a été analysé en SDS PAGE avec coloration au nitrate d'argent afin de visualiser l'élimination des impuretés.
La Figure 15 représente ce gel : la piste n 1 correspond à la fraction du produit de départ et la piste n 2 à la fraction d'élution. Malgré la pureté importante du produit de départ on constate que la fraction éluée ne contient plus de contaminant ou de formes dégradées Les résultats de des figures 14 et 15 montrent que l'aptamère de séquence SEQ
ID N
20 est capable de lier le FVII humain et de l'éluer spécifiquement en présence d'EDTA.
Exemple 13 : Absence de liaison de l'aptamère au FVII de lapin A. Matériel et Méthodes A.1. Le support de chromatographie d'affinité
Gel d'affinité couplé à la streptavidine sur lequel on a immobilisé l'aptamère de séquence SEQ
ID N 86 par l'intermédiaire d'une chaîne espaceur (Fournisseur Novagen) via une biotine en 5' terminal avec une densité de ligand théorique 0,35 mg/ml : volume 1 ml, L'aptamère utilisé est l'aptamère de séquence SEQ I D N 86 A.2. Le produit de départ Eluât d'hydroxyapatite enrichi en FVII de lapin obtenu par purification à
partir de plasma de lapin, temps de contact 10 minutes, débit 0,5m1/min A.3. Le protocole de purification Equilibration gel Tris-HCI 0,050 M, CaC12 0,010 M, MgSO3 0,05mM pH 7,5, Elution Tris-HCI 0,050 M, EDTA 0,010 M, pH 7,5, 36 g injecté dans le gel avec temps de contact 10 minutes, l'élution est réalisée par injection de 2m1 de tampon d'élution On détecte les pics de protéines par mesure de la valeur d'absorbance à la longueur d'onde de 280 nanomètres.
A.4. les protocoles d'analyse des fractions en protéines et en Facteur VII
Les fractions sont analysées pour leur activité amidolytique en dosage chromogénique grâce à un kit Stago selon les recommandations du fournisseur (Kit Facteur Vlla StatClot).
L'activité amidolytique est ensuite convertie en g de FVII contenu dans ladite fraction.
B. Résultats Les résultats sont illustrés sur le Tableau 4 ci-dessous.
Tableau 4 Etapes Protéines FVllam Volume Quantité Pureté (%) Rdt étape (mg/ml) (UI/ml) (ml) FVII (pg) (%) Starting material 1.38 57 2.5 71 2% 100%
Eluat Dialysé 0.97 21.8 3.4 36.7 1 % 52%
Eluat Mapt-2 NA 0.04 .0 0.08 NA 0.2%
Les résultats du tableau 4 montrent que le Facteur VII de lapin n'est pas retenu sur le gel d'affinité sur lequel est immobilisé l'aptamère Mapt-2 de séquence SEQ ID N
86.
Exemple 14 : Modes de réalisation spécifiques d'un protocole d'interaction du Facteur VII
humain avec un aptamère sur Biacore (résistance au NaCI) A. Matériel et Méthodes On a fabriqué un support solide sur lequel ont été immobilisées des molécules de l'aptamère nucléique de l'invention de séquence SEQ ID N 86, aussi désigné
ici Mapt2 .
Préalablement à sa fixation sur le support solide, l'extrémité 5' de l'aptamère Mapt2 a été
chimiquement couplée à une chaîne espaceur constituée de 4 molécules de PEG(C18). Puis, l'extrémité libre de la chaîne espaceur, opposée à l'extrémité couplée à
l'aptamère, a été
couplée à une molécule de biotine.
On dispose d'un support solide contenant des molécules de streptavidine immobilisées (Serie S sensor Chip SA, GE) Puis, on a mis en contact le support solide ci-dessus avec les composés aptamères ci-dessus afin d'immobiliser les acides nucléiques de séquence SEQ ID N 86, par association non covalente entre les molécules de streptavidine du support et les molécules de biotine des composés aptamères.
L'aptamère Mapt2 est ainsi immobilisé avec un taux d'immobilisation de 3772 RU
(1 RU
correspond approximativement à 1 pg de produit immobilisé par mm2) .
Du FVII humain transgénique purifié obtenu à partir de lait de lapine transgénique (FVII
HPTG, pureté : 98%) a été dilué dans du tampon de course (Tris 50 mM, NaCI 50 mM, CaCl2 10 mM, MgCl2 4 mM, pH 7,4) de manière à obtenir un échantillon de concentration 200mM en FVII.
L'échantillon a été injecté sur la puce (support solide) contenant l'aptamère Mapt2 immobilisé par une interaction biotine-streptavidine. Ensuite, des tampons de concentration croissante en NaCI ont été injectés sur le support solide (3 séries d'injection allant de 1 M de NaCI à 3 M de NaCI). Toutes les injections ont été réalisées avec un débit 30 I/min pendant 60 sec après l'injection. Après les 3 séries d'injection avec les 3 tampons contenant du NaCI, du tampon d'élution (EDTA, 10mM) a ensuite été injecté pendant 75 sec avec un débit de 30 I/min pour décrocher le FVII HPTG de l'aptamère.
Ces analyses sont effectuées avec l'appareil de RPS Biacore T100 (GE). La modélisation des interactions enregistrées sont effectuée à l'aide du Logiciel Biaevaluation (GE).
Les courbes de liaison de l'aptamère immobilisé Mapt2 au FVII humain transgénique ont été calculées avec le module dédié du logiciel Biacore control Software, version 1.2.
Les résultats liaison de l'aptamère Mapt2 au FVII humain ont permis de déterminer que la liaison de l'aptamère Mapt2 au FVII humain n'est pas altérée par l'injection des tampons contenant du NaCI.
B. Résultats Les résultats sont illustrés dans la figure 16 Exemple 15 : Modes de réalisation spécifiques d'un protocole d'interaction du Facteur VII
humain avec un aptamère sur Biacore (résistance au propylène glycol) A. Matériel et Méthodes On a fabriqué un support solide sur lequel ont été immobilisées des molécules de l'aptamère nucléique de l'invention de séquence SEQ ID N 86, aussi désigné ici Mapt2 . Préalablement à sa fixation sur le support solide, l'extrémité 5' de l'aptamère Mapt2 a été
chimiquement couplée à une chaîne espaceur constituée de 4 molécules de PEG(C18). Puis, l'extrémité libre de la chaîne espaceur, opposée à l'extrémité couplée à l'aptamère, a été
couplée à une molécule de biotine.
On dispose d'un support solide contenant des molécules de streptavidine immobilisées (Serie S sensor Chip SA, GE) Puis, on a mis en contact le support solide ci-dessus avec les composés aptamères ci-2o dessus afin d'immobiliser les acides nucléiques de séquence SEQ ID N 86, par association non covalente entre les molécules de streptavidine du support et les molécules de biotine des composés aptamères.
L'aptamère Mapt2 est ainsi immobilisé avec un taux d'immobilisation de 5319 RU
(1 RU
correspond approximativement à 1 pg de produit immobilisé par mm2) .
Du FVII humain transgénique purifié obtenu à partir de lait de lapine transgénique (FVII
HPTG, pureté : 98%) a été dilué dans du tampon de course (Tris 50 mM, CaCl2 10 mM, MgCl2 4 mM, pH 7,4) de manière à obtenir un échantillon de concentration 200mM en FVII.
L'échantillon a été injecté sur la puce (support solide) contenant l'aptamère Mapt2 immobilisé par une interaction biotine-streptavidine. Ensuite, un tampon contenant 50% de propylène glycol a été injecté sur le support solide. Toutes les injections ont été réalisées avec un débit 30 I/min pendant 60 sec après l'injection. Après l'injection avec le tampon contenant 50% de propylène glycol, du tampon d'élution (EDTA, lOmM) a ensuite été
injecté pendant 75 sec avec un débit de 30 I/min pour décrocher le FVII HPTG de l'aptamère.
Ces analyses sont effectuées avec l'appareil de RPS Biacore T100 (GE). La modélisation des interactions enregistrées sont effectuée à l'aide du Logiciel Biaevaluation (GE).
Les courbes de liaison de l'aptamère immobilisé Mapt2 au FVII humain transgénique ont été calculées avec le module dédié du logiciel Biacore control Software, version 1.2.
Les résultats liaison de l'aptamère Mapt2 au FVII humain ont permis de déterminer que la liaison de l'aptamère Mapt2 au FVII humain n'est pas altérée par l'injection du tampon contenant du propylène glycol.
5 B. Résultats Les résultats sont illustrés dans la figure 17
Claims (20)
1. Acide nucléique se liant spécifiquement au Facteur VII/VIIa humain, ledit acide nucléique comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 40%
d'identité en nucléotides avec l'acide nucléique de formule (I) suivante :
5'-[SEQ ID N o 1]x-[SEQ ID N o X]-[SEQ ID N o 2]y-3' (I), dans laquelle :
- SEQ ID N o X consiste en un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des acides nucléiques de séquences SEQ ID N o 3 à SEQ ID N o 85 et SEQ ID N o 87 à
SEQ ID
N o 100, x est un entier égal à 0 ou 1, et y est un entier égal à 0 ou 1.
d'identité en nucléotides avec l'acide nucléique de formule (I) suivante :
5'-[SEQ ID N o 1]x-[SEQ ID N o X]-[SEQ ID N o 2]y-3' (I), dans laquelle :
- SEQ ID N o X consiste en un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des acides nucléiques de séquences SEQ ID N o 3 à SEQ ID N o 85 et SEQ ID N o 87 à
SEQ ID
N o 100, x est un entier égal à 0 ou 1, et y est un entier égal à 0 ou 1.
2. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence SEQ ID N o X est choisie dans le groupe constitué des acides nucléiques possédant au moins 40%
d'identité en nucléotides, mieux au moins 80% d'identité en nucléotides, avec au moins l'une des séquences SEQ ID N o 3 à SEQ ID N o 85 et SEQ ID N o 87 à SEQ ID N o 100.
d'identité en nucléotides, mieux au moins 80% d'identité en nucléotides, avec au moins l'une des séquences SEQ ID N o 3 à SEQ ID N o 85 et SEQ ID N o 87 à SEQ ID N o 100.
3. Acide nucléique selon la revendication 2, caractérisé en ce que la séquence SEQ ID N o X est choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID N o 3 à SEQ ID N o 85 et SEQ ID N o 87 à SEQ ID N o 100.
4. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 40%
d'identité en nucléotides avec un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des acides nucléiques de séquences SEQ ID N o 3 à SEQ ID N o 85 et SEQ ID N o 87 à SEQ ID N o 100
d'identité en nucléotides avec un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des acides nucléiques de séquences SEQ ID N o 3 à SEQ ID N o 85 et SEQ ID N o 87 à SEQ ID N o 100
5. Acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence SEQ ID N o 86.
6. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il possède une capacité à se lier spécifiquement au Facteur VII/VIIa humain exprimée par la condition (A) suivante :
Kd humain/Kd non-humain < 0,01 (A), dans laquelle :
- Kd humain est la constante de dissociation d'un acide nucléique de formule (I) pour la Facteur VII/VIIa humain, estimée en unités molaires, et - Kd non-humain est la constante de dissociation dudit acide nucléique de formule (I) pour un Facteur VII/VIIa non humain, exprimée dans les mêmes unités molaires.
Kd humain/Kd non-humain < 0,01 (A), dans laquelle :
- Kd humain est la constante de dissociation d'un acide nucléique de formule (I) pour la Facteur VII/VIIa humain, estimée en unités molaires, et - Kd non-humain est la constante de dissociation dudit acide nucléique de formule (I) pour un Facteur VII/VIIa non humain, exprimée dans les mêmes unités molaires.
7. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il possède une valeur de constante de dissociation pour le facteur VII/VIIA humain d'au plus 500 nM, mieux d'au plus 200 nM.
8. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce sa liaison au facteur VII/VIIa humain peut être dissociée par mise en contact avec un agent chélateur des cations métalliques.
9. Composé se liant spécifiquement au facteur VII/VIIa humain, caractérisé en ce qu'il est de formule (II) suivante :
[SPAC]- [NUCL] (II), dans laquelle :
-[SPAC] signifie une chaîne espaceur, et - NUCL signifie un acide nucléique se liant spécifiquement au Facteur VII/VIIa humain comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 40%
d'identité en nucléotides avec l'acide nucléique de formule (I) tel que défini dans la revendication 1.
[SPAC]- [NUCL] (II), dans laquelle :
-[SPAC] signifie une chaîne espaceur, et - NUCL signifie un acide nucléique se liant spécifiquement au Facteur VII/VIIa humain comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 40%
d'identité en nucléotides avec l'acide nucléique de formule (I) tel que défini dans la revendication 1.
10. Composé se liant spécifiquement au facteur VII/VIIa humain, caractérisé en ce qu'il est de formule (III) suivante :
[FIX]-[SPAC]- [NUCL] (III), dans laquelle :
- [FIX] signifie un composé d'immobilisation sur un support, -[SPAC] signifie une chaîne espaceur, et - NUCL signifie un acide nucléique se liant spécifiquement au Facteur VII/VIIa humain comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 40%
d'identité en nucléotides avec l'acide nucléique de formule (I) tel que défini dans la revendication 1.
[FIX]-[SPAC]- [NUCL] (III), dans laquelle :
- [FIX] signifie un composé d'immobilisation sur un support, -[SPAC] signifie une chaîne espaceur, et - NUCL signifie un acide nucléique se liant spécifiquement au Facteur VII/VIIa humain comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 40%
d'identité en nucléotides avec l'acide nucléique de formule (I) tel que défini dans la revendication 1.
11. Complexe entre (i) un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 8 ou un composé
selon l'une des revendications 9 et 10 et (ii) un facteur VII/VIIa humain.
selon l'une des revendications 9 et 10 et (ii) un facteur VII/VIIa humain.
12. Support pour l'immobilisation du Facteur VII/VIIa humain, caractérisé en ce qu'il comprend un matériau support solide sur lequel sont greffés une pluralité d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 8 ou de composés selon l'une des revendications 9 et 10.
13. Procédé pour l'immobilisation du facteur VII/Vlla humain sur un support, comprenant une étape au cours de laquelle on met en contact un échantillon comprenant du Facteur VII/Vlla humain avec un support selon la revendication 12.
14. Procédé pour la purification du Facteur VII/Vlla humain comprenant les étapes suivantes :
a) mettre en contact un échantillon comprenant du Facteur VII/Vlla humain avec un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 8, ou avec un composé selon l'une des revendications 9 et 10, ou avec un support selon la revendication 12, afin de former un complexe entre (i) ledit acide nucléique, ou ledit composé, ou ledit support et (ii) le Facteur VII/Vlla humain, et b) libérer le Facteur VII/Vlla humain à partir du complexe formé à l'étape a) et récupérer le Facteur Vll/Vlla humain purifié.
a) mettre en contact un échantillon comprenant du Facteur VII/Vlla humain avec un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 8, ou avec un composé selon l'une des revendications 9 et 10, ou avec un support selon la revendication 12, afin de former un complexe entre (i) ledit acide nucléique, ou ledit composé, ou ledit support et (ii) le Facteur VII/Vlla humain, et b) libérer le Facteur VII/Vlla humain à partir du complexe formé à l'étape a) et récupérer le Facteur Vll/Vlla humain purifié.
15. Procédé selon la revendication 14, comprenant l'étape a') laver le support d'affinité avec un tampon de lavage.
16. Procédé pour détecter la présence de Facteur VII/Vlla humain dans un échantillon comprenant les étapes suivantes :
a) mettre en contact un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 8 ou avec un composé selon l'une des revendications 9 et 10 ou avec un support selon la revendication 12 avec ledit échantillon; et b) détecter la formation de complexes entre (i) ledit acide nucléique, ou ledit composé, ou ledit support et (ii) le Facteur VII/Vlla.
a) mettre en contact un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 8 ou avec un composé selon l'une des revendications 9 et 10 ou avec un support selon la revendication 12 avec ledit échantillon; et b) détecter la formation de complexes entre (i) ledit acide nucléique, ou ledit composé, ou ledit support et (ii) le Facteur VII/Vlla.
17. Composition pharmaceutique comprenant un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, en combinaison avec un plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables.
18. Acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, pour son utilisation comme médicament.
19. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, pour la fabrication d'un médicament pour le traitement des troubles de la coagulation.
20. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, pour le traitement des troubles
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