CA2511820A1 - Particules et ceramiques de phosphates de calcium pour la transfection in vivo et in vitro - Google Patents
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Abstract
La présente invention se rapporte à un procédé pour modifier la surface des poudres et des céramiques de phosphates de calcium comprenant une maturation dans un milieu de culture entraînant une croissance épitaxique d'apatite carbonatée à la surface desdites poudres et céramiques. L'invention porte également sur l'utilisation desdites poudres et céramiques modifiées pour la transfection de cellules in vitro et in vivo et pour la culture en réseau tridimensionnel.
Description
Particules et céramiques de phosphates de calcium pour la transfection in vivo et in vitro La présente invention se rapporte à une méthode de transfection d'ADN fixé à
surface de céramiques phosphates de calcium de caractéristiques particulières. Cette méthode peut comporter une étape de préparation du matériau dans une solution saline ou un milieu de culture cellulaire pour améliorer la fixation d'ADN et sa disponibilité pour la transfection de cellules. L'invention porte également sur l'utilisation des poudres et céramiques de phosphates de calcium modifiées pour la transfection de cellules in vitro et in vivo et pour la culture de cellules transfectées en réseau tridimensionnel.
La transfection de gènes dans les cellules eucaryotes est une étape clef de la thérapie génique. Plusieurs méthodes sont utilisables avec des rendements variables.
Elles sont utilisables in vitro ou in vivo.
A des fins de thérapie géniques, les cellules peuvent être transfectées in vitro puis réinjectées dans l'organisme ou bien transfectées directement dans les organes ou les tissus dans lesquels elles résident (Evans, C.H., Robbins, P.D., Possible orthopaedic applications of gene therapy, J Bone Joint Surg, 77-A, 7 : 1103-1114) Les différentes méthodes utilisées pour la transfection cellulaire sont résumées dans le tableau ci-dessous Mthode Avantages Inconvnients DEAE-dextran Simple Expression transitoire Phosphate de calciumSimple Inutilisable pour cellules en suspension Liposomes Simple Relativement non prouv Micro-injection Efficace Techniquement difficile Electroporation Bon pour les cellulesPas de co-transfection non
surface de céramiques phosphates de calcium de caractéristiques particulières. Cette méthode peut comporter une étape de préparation du matériau dans une solution saline ou un milieu de culture cellulaire pour améliorer la fixation d'ADN et sa disponibilité pour la transfection de cellules. L'invention porte également sur l'utilisation des poudres et céramiques de phosphates de calcium modifiées pour la transfection de cellules in vitro et in vivo et pour la culture de cellules transfectées en réseau tridimensionnel.
La transfection de gènes dans les cellules eucaryotes est une étape clef de la thérapie génique. Plusieurs méthodes sont utilisables avec des rendements variables.
Elles sont utilisables in vitro ou in vivo.
A des fins de thérapie géniques, les cellules peuvent être transfectées in vitro puis réinjectées dans l'organisme ou bien transfectées directement dans les organes ou les tissus dans lesquels elles résident (Evans, C.H., Robbins, P.D., Possible orthopaedic applications of gene therapy, J Bone Joint Surg, 77-A, 7 : 1103-1114) Les différentes méthodes utilisées pour la transfection cellulaire sont résumées dans le tableau ci-dessous Mthode Avantages Inconvnients DEAE-dextran Simple Expression transitoire Phosphate de calciumSimple Inutilisable pour cellules en suspension Liposomes Simple Relativement non prouv Micro-injection Efficace Techniquement difficile Electroporation Bon pour les cellulesPas de co-transfection non
2 adhrentes Fusion de Bon pour les cellules Rsultats variables non protoplastes adhrentes Adnovirus Forte infectivit, productionADN intgrs comme pisome, in connue, infecte les toxique, production cellules ne se de divisant pas, grande protines virales varit de cellules htes Adnovirus associsNon pathognes, ExpressionSupporte seulement des gnes stable, infecte les courts, difficile produire, cellules ne se peu divisant pas, grande dvelopp varit de cellules htes Herps simplex Infecte les cellules Toxique, expression ne se divisant transitoire, pas, supporte des gnes peu dvelopp longs, Infection par Efficace Type cellulaire rduit par le retrovirus tropisme, capacit de codage basse, Solides Simple, transfection Expression transitoire localise polycationiques Chromosome satellitePermet de transfecter Rsultats non prouvs des gnes longs Autres : polymers Faibles rendements, rsultats sous forme variables, utilisations in vivo d'hydrogel, difficile, biocompatibilit lipids polycationiques, variable polylysine, polyornithine, histones et autres proteins chromosomiques, polymres hydrogens Depuis une quinzaine d'années qu'ont débuté les essais cliniques de thérapie génique, les résultats ont été dans l'ensemble décevants pour plusieurs raisons S Quels que soient les vecteurs utilisés, adénovirus, virus associé à
l'adénovirus (AAV), rétrovirus ou formulation physico-chimiques, l'efficacité de transfert des gènes dans les cellules cibles a toujours été très faible (A. Kahn. Dix ans de thérapie génique:
déceptions et espoirs. Biofutur 202:16-21, 2000). La durée d'expression des transgènes thérapeutiques est la plupart du temps brève, limitée à quelques semaines, en raison
l'adénovirus (AAV), rétrovirus ou formulation physico-chimiques, l'efficacité de transfert des gènes dans les cellules cibles a toujours été très faible (A. Kahn. Dix ans de thérapie génique:
déceptions et espoirs. Biofutur 202:16-21, 2000). La durée d'expression des transgènes thérapeutiques est la plupart du temps brève, limitée à quelques semaines, en raison
3 d'une réaction immune qui provoque l'élimination préférentielle des cellules transduites, de la longévité intrinsèque de celles-ci ou de l'extinction des séquences d'ADN ou promoteurs qui dirigent l'expression des gènes insérés (Orlon, S.H., Motulsky, A.G., report and recommendations of the panel to assess the NIH
investment in research gene therapy.www.nih.gov/news/panelrep.html).
Enfin certains vecteurs ont manifesté un effet toxique. Des accidents sont survenus lors d'utilisation de vecteurs adénoviraux injectés dans l'organisme ayant entraîné
la mort de patients dans des essais de traitement par l'ornithine transcarbamylase (Smaglik,P., Investigators ponders what went wrong alter gene therapy death. The Scientist [21 ] : 1 ( 1999).
Ainsi, il ressort de l'analyse de tous les essais cliniques de thérapie génique que la stratégie de transfert d'un gène nécessiterait des vecteurs beaucoup plus performant, plus sûrs et capables de transfecter préférentiellement les cellules sur lesquelles un effet thérapeutique est nécessaire (Orkin, S.H., Motulsky, A.G., report and recommendations of the panel to assess the NIH investment in research gene therapy.www.nih.gov/news/panelrep.html).
C'est pour cette raison que des vecteurs polymériques polycationiques ont été
développés. Ces vecteurs sont des solides et peuvent adsorber de l'ADN sous différentes formes, en particulier, sous forme de plasmide. Ils ont la particularité de transfecter les cellules qui arrivent à leur contact avec un rendement variable. Ils ont été utilisés in vivo pour transfecter des cellules des tissus conjonctifs lâches intervenant dans la cicatrisation osseuse afin d'accélérer cette dernière (S. Goldstein and J.
Bonadio. in vivo gene transfer methods for wound healing. The Regent of the University of Michigan. Anonymous. United States:(5,962,427):1-31, 1999.
thérapie génique. A61 K 48/00. 514/44).
investment in research gene therapy.www.nih.gov/news/panelrep.html).
Enfin certains vecteurs ont manifesté un effet toxique. Des accidents sont survenus lors d'utilisation de vecteurs adénoviraux injectés dans l'organisme ayant entraîné
la mort de patients dans des essais de traitement par l'ornithine transcarbamylase (Smaglik,P., Investigators ponders what went wrong alter gene therapy death. The Scientist [21 ] : 1 ( 1999).
Ainsi, il ressort de l'analyse de tous les essais cliniques de thérapie génique que la stratégie de transfert d'un gène nécessiterait des vecteurs beaucoup plus performant, plus sûrs et capables de transfecter préférentiellement les cellules sur lesquelles un effet thérapeutique est nécessaire (Orkin, S.H., Motulsky, A.G., report and recommendations of the panel to assess the NIH investment in research gene therapy.www.nih.gov/news/panelrep.html).
C'est pour cette raison que des vecteurs polymériques polycationiques ont été
développés. Ces vecteurs sont des solides et peuvent adsorber de l'ADN sous différentes formes, en particulier, sous forme de plasmide. Ils ont la particularité de transfecter les cellules qui arrivent à leur contact avec un rendement variable. Ils ont été utilisés in vivo pour transfecter des cellules des tissus conjonctifs lâches intervenant dans la cicatrisation osseuse afin d'accélérer cette dernière (S. Goldstein and J.
Bonadio. in vivo gene transfer methods for wound healing. The Regent of the University of Michigan. Anonymous. United States:(5,962,427):1-31, 1999.
thérapie génique. A61 K 48/00. 514/44).
4 Les coprécipités de phosphates de calcium et d'ADN ont été utilisés depuis de nombreuses années afin de transfecter les cellules in vitro (E. T. Schenborn and V.
Goiffon. Calcium phosphate transfection of mammalien cultured cens. edited by M. J.
Tymms, Totowa, NJ:Humana Press Inc, 2000, p. 135-144; W. Song and D. K.
Lahiri.
Efficient transfection of DNA by mixing cens in suspension with calcium phosphate.
Nucleic Acid Research 23 (17):3609-361 l, 1995; Y.-W. Yang and J.-C. Yang.
Calcium phosphate as a gene carrier: electron microscopy. l3iomaterials 18:213-217, 1997).
Ils sont obtenus en versant une solution de chlorure de calcium dans le milieu afin de le sursaturer en calcium et de précipiter un phosphate de calcium dans lequel sont incluses des molécules d'ADN. Ces particules composites sont ensuite phagocytées par les cellules qui intègrent le plasmide de différentes manières et expriment les gènes qui sont transportés.
Cependant, ces coprécipités ont un inconvénient majeur. Ils sont très difficilement utilisables in vivo car il est difficile d'obtenir une sursaturation en système ouvert.
D'autre part, ils ne peuvent permettre des transfections localisées dans l'espace.
Les céramiques de phosphates de calcium sont des matériaux obtenus par frittage d'une barbotine contenant des particules de phosphate de calcium en suspension. Ce sont des assemblages de grains liés par des joints de grains (Frayssinet,P., Fages, J., Bonel,G., Rouquet,N., Biotechnology, material sciences and bone repair. European Journal of Orthopaedic Surgery & Traumatology (1998) 8: 17-25).
Ces matériaux présentent une biocompatibilité particulière avec le tissu osseux, ce qui les rend particulièrement utiles comme matériau de reconstruction osseuse ou bien comme vecteur de cellules ostéogéniques (P., Frayssinet, J.L. Trouillet, N.
Rouquet, E.
Azimus, A. Autefage (1993), Osseointegration of macroporous calcium phosphate ceramics having a different chemical composition. Biomaterials, 14, 6: 423-429).
Dans le cadre de l'invention, nous avons développé des poudres et des céramiques de phosphate de calcium capables de transfecter des cellules à la fois in vivo et in vitro, notamment des cellules mésenchymateuses. La composition chimique de ces
Goiffon. Calcium phosphate transfection of mammalien cultured cens. edited by M. J.
Tymms, Totowa, NJ:Humana Press Inc, 2000, p. 135-144; W. Song and D. K.
Lahiri.
Efficient transfection of DNA by mixing cens in suspension with calcium phosphate.
Nucleic Acid Research 23 (17):3609-361 l, 1995; Y.-W. Yang and J.-C. Yang.
Calcium phosphate as a gene carrier: electron microscopy. l3iomaterials 18:213-217, 1997).
Ils sont obtenus en versant une solution de chlorure de calcium dans le milieu afin de le sursaturer en calcium et de précipiter un phosphate de calcium dans lequel sont incluses des molécules d'ADN. Ces particules composites sont ensuite phagocytées par les cellules qui intègrent le plasmide de différentes manières et expriment les gènes qui sont transportés.
Cependant, ces coprécipités ont un inconvénient majeur. Ils sont très difficilement utilisables in vivo car il est difficile d'obtenir une sursaturation en système ouvert.
D'autre part, ils ne peuvent permettre des transfections localisées dans l'espace.
Les céramiques de phosphates de calcium sont des matériaux obtenus par frittage d'une barbotine contenant des particules de phosphate de calcium en suspension. Ce sont des assemblages de grains liés par des joints de grains (Frayssinet,P., Fages, J., Bonel,G., Rouquet,N., Biotechnology, material sciences and bone repair. European Journal of Orthopaedic Surgery & Traumatology (1998) 8: 17-25).
Ces matériaux présentent une biocompatibilité particulière avec le tissu osseux, ce qui les rend particulièrement utiles comme matériau de reconstruction osseuse ou bien comme vecteur de cellules ostéogéniques (P., Frayssinet, J.L. Trouillet, N.
Rouquet, E.
Azimus, A. Autefage (1993), Osseointegration of macroporous calcium phosphate ceramics having a different chemical composition. Biomaterials, 14, 6: 423-429).
Dans le cadre de l'invention, nous avons développé des poudres et des céramiques de phosphate de calcium capables de transfecter des cellules à la fois in vivo et in vitro, notamment des cellules mésenchymateuses. La composition chimique de ces
5 céramiques peut varier car plusieurs sels de l'acide orthophosphorique peuvent rentrer dans leur composition, en particulier, le phosphate tricalcique, l'hydroxyapatite qui est la phase de synthèse la plus proche de la phase minérale du tissu osseux, et le phosphate octocalcique. Ces céramiques ont une autre particularité, elles ont des propriétés de surface très variables en fonction de différents paramètres tels que, parmi d'autres, le mode de synthèse de la poudre, la température de cuisson, ou la présence de divers éléments traces. Ces différents facteurs influent en particulier sur la charge de surface, le potentiel zeta et les capacités de substitution dans la maille du phosphate de calcium. Les céramiques phosphocalcique ont également la particularité de présenter des croissance épitaxiques d'apatite carbonatée à leur surface une fois implantées dans l'organisme ou immergées dans un milieu salin de composition comparable au liquide extracellulaire (M. Heughebaert, R. Z. LeGeros, M. Gineste, and A. Guilhem.
Hydroxyapatite (HA) ceramics implanted in non-bone-forming sites. Physico-chemical characterization. J Biomed Mat Res 22:257-268, 1988). C'est à ces croissances cristallines qu'ont été attribuées les propriétés de biocompatibilité de ces matériaux.
Les propriétés d'adsorption des phosphates de calcium vis-à-vis des acides nucléiques ont été mises à profit en chromatographie sur colonnes d'HA pour séparer et purifier l'ADN ou certains ARN. Il est essentiel de comprendre que, à composition chimique égale, toutes les poudres d'hydroxyapatite utilisées en chromatographie n'ont pas le même pouvoir séparateur des acides nucléiques (A. Eon-Duval, Purification of plasmid DNA by hydroxyapatite chromatography, Abstract of 2"° conference on hydroxyapatite. San Francisco March 2001). Les interactions entre les molécules organiques et l'hydroxyapatite dépendent des propriétés de surface de ce minerai (M.J.
Gorbunoff, Protein chromatography on hydroxyapatite columns. Methods in
Hydroxyapatite (HA) ceramics implanted in non-bone-forming sites. Physico-chemical characterization. J Biomed Mat Res 22:257-268, 1988). C'est à ces croissances cristallines qu'ont été attribuées les propriétés de biocompatibilité de ces matériaux.
Les propriétés d'adsorption des phosphates de calcium vis-à-vis des acides nucléiques ont été mises à profit en chromatographie sur colonnes d'HA pour séparer et purifier l'ADN ou certains ARN. Il est essentiel de comprendre que, à composition chimique égale, toutes les poudres d'hydroxyapatite utilisées en chromatographie n'ont pas le même pouvoir séparateur des acides nucléiques (A. Eon-Duval, Purification of plasmid DNA by hydroxyapatite chromatography, Abstract of 2"° conference on hydroxyapatite. San Francisco March 2001). Les interactions entre les molécules organiques et l'hydroxyapatite dépendent des propriétés de surface de ce minerai (M.J.
Gorbunoff, Protein chromatography on hydroxyapatite columns. Methods in
6 Enzymology, vol 182, Academic Press Inc 1985 : 329-339), qui peuvent varier d'un lot à l'autre.
II a été prouvé que la distribution des charges à la surface du solide et ses capacités d'hydratation ont une influence importante sur l'adsorption des molécules organiques à
sa surface (Norde,W., Lyklema, J., (1991) Why proteins prefer interfaces. J
Biomed Sci Polymer Edn 2, 183-202 (1991)). De même, la force ionique, et le pH du solvant des molécules organiques doivent être pris en compte.
Si la protéine en solution et le solide ont une charge opposée, ils s'attirent. Au moins si la charge de la protéine et celle de la surface du solide se compensent grossièrement. Si les charges ne se compensent pas, cela résulte en une accumulation de charges dans la région de contact causant une haut potentiel électrostatique, énergétiquement peu favorable à une adsorption. Une situation similaire est observée lorsque la surface du solide et la molécule organique sont de même signe. Néanmoins, dans de nombreux cas, l'adsorption peut se faire tout de même dans certains cas grâce à
l'incorporation d'ions de la solution à l'interface de la couche adsorbée qui prévient l'accumulation de charge.
L'hydrophobie a une influence sur l'adsorption car elle participe à la répartition des charges en particulier dans les molécules organiques qui ont une structure tertiaire et quaternaire. L'hydrophobie d'une surface (molécule ou bien solide) peut favoriser l' adsorption.
La répartition des charges ainsi que les capacités d'hydratation des apatites sont des propriétés intéressantes car elles peuvent avoir une charge de surface positive ou négative et peuvent être hydrophiles ou hydrophobes. De plus, les substitutions dans la maille pouvant être nombreuses, les groupes fonctionnels à la surface peuvent varier.
II a été prouvé que la distribution des charges à la surface du solide et ses capacités d'hydratation ont une influence importante sur l'adsorption des molécules organiques à
sa surface (Norde,W., Lyklema, J., (1991) Why proteins prefer interfaces. J
Biomed Sci Polymer Edn 2, 183-202 (1991)). De même, la force ionique, et le pH du solvant des molécules organiques doivent être pris en compte.
Si la protéine en solution et le solide ont une charge opposée, ils s'attirent. Au moins si la charge de la protéine et celle de la surface du solide se compensent grossièrement. Si les charges ne se compensent pas, cela résulte en une accumulation de charges dans la région de contact causant une haut potentiel électrostatique, énergétiquement peu favorable à une adsorption. Une situation similaire est observée lorsque la surface du solide et la molécule organique sont de même signe. Néanmoins, dans de nombreux cas, l'adsorption peut se faire tout de même dans certains cas grâce à
l'incorporation d'ions de la solution à l'interface de la couche adsorbée qui prévient l'accumulation de charge.
L'hydrophobie a une influence sur l'adsorption car elle participe à la répartition des charges en particulier dans les molécules organiques qui ont une structure tertiaire et quaternaire. L'hydrophobie d'une surface (molécule ou bien solide) peut favoriser l' adsorption.
La répartition des charges ainsi que les capacités d'hydratation des apatites sont des propriétés intéressantes car elles peuvent avoir une charge de surface positive ou négative et peuvent être hydrophiles ou hydrophobes. De plus, les substitutions dans la maille pouvant être nombreuses, les groupes fonctionnels à la surface peuvent varier.
7 PCT/FR2003/003897 Nous avons développé des poudres de phosphates de calcium à base d'hydroxyapatite capables de fixer de l'ADN sous différentes formes et de le délivrer à des cellules isolées ou dans l'organisme à des fins de transfection. Ces poudres peuvent être injectés en suspension dans un liquide ou bien un gel. Elles peuvent également être déposées à la curette ou bien servir de vecteur transfectant à des cellules cultivées en réseau tridimensionnel. Elles ont des propriétés physico-chimiques particulières afin de posséder ces propriétés de transfection. Une série d'expérimentation a été
menée permettant de juger la transfection de cellules isolées ou non avec un plasmide porteur du gène de la galactosidase pouvant être mis en évidence par histochimie. La poudre est une mise en forme particulièrement bien adaptée pour pouvoir transfecter à
la fois des cellules isolées ou des tissus à la fois in vitro et in vivo. Ces poudres permettent une internalisation de l'ADN ainsi que sa protection des nucléases intracytoplasmiques et son transfert dans le noyau.
Le mécanisme intervenant dans la fixation d'ADN (molécule organique de charge négative) à la surface de particules d'hydroxyapatite peut-être ~ Une adsorption électrostatique lorsque le matériau est de charge positive ~ Une coprécipitation des molécules d'ADN dans la couche d'apatite carbonatée apparaissant par croissance épitaxique à la surface de ces matériau et résultant de processus de dissolution/reprécipitation complexes se déroulant à la surface dans des milieux sursaturés en calcium et phosphore.
~ Un échange ionique entre la phase interfaciale et la solution L'ADN une fois fixé sur le matériau doit pénétrer dans la cellule. La composition et les caractéristiques de surface sont également importants pour la dégradation du matériau en milieu biologique et l'émission de particules transfectantes. On sait que les céramiques d'HA se dégradent aux joints de grains et que la couche d'apatite
menée permettant de juger la transfection de cellules isolées ou non avec un plasmide porteur du gène de la galactosidase pouvant être mis en évidence par histochimie. La poudre est une mise en forme particulièrement bien adaptée pour pouvoir transfecter à
la fois des cellules isolées ou des tissus à la fois in vitro et in vivo. Ces poudres permettent une internalisation de l'ADN ainsi que sa protection des nucléases intracytoplasmiques et son transfert dans le noyau.
Le mécanisme intervenant dans la fixation d'ADN (molécule organique de charge négative) à la surface de particules d'hydroxyapatite peut-être ~ Une adsorption électrostatique lorsque le matériau est de charge positive ~ Une coprécipitation des molécules d'ADN dans la couche d'apatite carbonatée apparaissant par croissance épitaxique à la surface de ces matériau et résultant de processus de dissolution/reprécipitation complexes se déroulant à la surface dans des milieux sursaturés en calcium et phosphore.
~ Un échange ionique entre la phase interfaciale et la solution L'ADN une fois fixé sur le matériau doit pénétrer dans la cellule. La composition et les caractéristiques de surface sont également importants pour la dégradation du matériau en milieu biologique et l'émission de particules transfectantes. On sait que les céramiques d'HA se dégradent aux joints de grains et que la couche d'apatite
8 carbonatée apparaissant à la surface du matériau par croissance épitaxique a une solubilité différente du matériau lui-même.
En revanche, tous les phosphates de calcium ne peuvent transfecter des cellules. Le DCPD par exemple ou bien certaines mises en forme d'HA ou de TCP ont montré
leur incapacité à le faire. Leur cytotoxicité est certainement responsable de ceci.
Au contraire, la modification de la surface des poudres et des céramiques par maturation dans un milieu de culture entraînant une croissance épitaxique d'apatite carbonatée améliore le rendement de marquage.
Description Ainsi, dans un premier aspect, la présente invention se rapporte à un procédé
pour créer un composite minéral-ADN caractérisé en ce qu'il comprend une étape consistant en une incubation dans un milieu salin ou de culture non saturé en calcium et phosphore en présence de la molécule d'ADN. Ce procédé permet d'obtenir une fixation d'ADN à
la surface de la céramique par adsorption sur une surface de céramique modifiée par croissance épitaxique ou bien par co-précipitation à la surface du matériau.
Ces particules de phosphates de calcium sont immergées dans un milieu salin ou un milieu de culture du type des milieux de culture cellulaire couramment employées en biotechnologie, notamment le DMEM, pendant environ quelques minutes, par exemple 1, 5, 10 ou 30 minutes au moins à environ 12, 24, 48 heures, quelques jours ou davantage à une température allant de 15 à 50°C, de préférence environ 37°C. Le but est d'avoir la formation d'une couche d'apatite carbonatée à la surface avant ou pendant la mise en contact avec les plasmides.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé mentionné ci-dessus est réalisé
avant la mise en contact avec les acides nucléiques, notamment des plasmides.
lternativement, cette étape entraînant une croissance épitaxique d'apatite carbonatée à
En revanche, tous les phosphates de calcium ne peuvent transfecter des cellules. Le DCPD par exemple ou bien certaines mises en forme d'HA ou de TCP ont montré
leur incapacité à le faire. Leur cytotoxicité est certainement responsable de ceci.
Au contraire, la modification de la surface des poudres et des céramiques par maturation dans un milieu de culture entraînant une croissance épitaxique d'apatite carbonatée améliore le rendement de marquage.
Description Ainsi, dans un premier aspect, la présente invention se rapporte à un procédé
pour créer un composite minéral-ADN caractérisé en ce qu'il comprend une étape consistant en une incubation dans un milieu salin ou de culture non saturé en calcium et phosphore en présence de la molécule d'ADN. Ce procédé permet d'obtenir une fixation d'ADN à
la surface de la céramique par adsorption sur une surface de céramique modifiée par croissance épitaxique ou bien par co-précipitation à la surface du matériau.
Ces particules de phosphates de calcium sont immergées dans un milieu salin ou un milieu de culture du type des milieux de culture cellulaire couramment employées en biotechnologie, notamment le DMEM, pendant environ quelques minutes, par exemple 1, 5, 10 ou 30 minutes au moins à environ 12, 24, 48 heures, quelques jours ou davantage à une température allant de 15 à 50°C, de préférence environ 37°C. Le but est d'avoir la formation d'une couche d'apatite carbonatée à la surface avant ou pendant la mise en contact avec les plasmides.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé mentionné ci-dessus est réalisé
avant la mise en contact avec les acides nucléiques, notamment des plasmides.
lternativement, cette étape entraînant une croissance épitaxique d'apatite carbonatée à
9 la surface desdites poudres et céramiques est réalisée dans un milieu contenant les acides nucléiques. Dans ce mode, la modification de surface et la fixation des acides nucléiques sont réalisées simultanément.
De préférence, les poudres et céramiques sont immergées dans un milieu de culture DMEM pendant 48 heures à 37°C avant ou simultanément à la fixation des acides nucléiques.
Dans un aspect complémentaire, l'invention porte sur un procédé pour fixer de l'ADN
sous forme plasmidique à la surface de poudre ou céramique de phosphates de calcium caractérisé en ce qu'il comprend une étape a) consistant en une hydratation de la poudre de phosphate de calcium ou de la céramique de phosphate de calcium dans une solution de tampon phosphate non saturée en calcium et phosphate et une étape b) consistant en une immersion des produits obtenus à l'étape a) dans une solution de tampon phosphate non saturée en calcium et phosphate contenant un ADN simple ou double brin pour des durées variables de quelques minutes à plusieurs heures, c) obtention de particules de phosphates de calcium comportant des molécules d'ADN
fixées à sa surface.
De préférence, la solution de l'étape a) et b) comprend un tampon phosphate à
0,12 M
(pH 6,8). L'immersion est effectuée pendant au moins 1, 5, 10 ou 30 minutes jusqu'à
environ 12, 24, ou 48 heures à une température allant de 15 à 50°C, de préférence environ 37°C. En outre, les particules de phosphates de calcium sont maintenues immergées dans un milieu de culture du type des milieux de culture cellulaire, pendant environ quelques minutes à quelques jours, et à une température allant de 15 à
50°C, de préférence environ 37°C.
Ainsi, dans ce procédé, l'hydratation réside de préférence en une immersion de la poudre de phosphate de calcium ou de la céramique de phosphate de calcium dans une solution simulant les fluides extracellulaires destinée à produire une croissance épitaxique d'apatite carbonatée à la surface desdites poudres et céramiques. A
ce titre, l'étape b) est réalisée au moyen d'un milieu simulant les fluides extracellulaires ou un milieu du type des milieux de culture cellulaires contenant les acides nucléiques, ledit milieu étant non dénaturant pour l'ADN et non saturé en calcium et phosphate.
Ce 5 milieu entraîne une croissance épitaxique d'apatite carbonatée à la surface desdites poudres et céramiques.
Les étapes a) et b) peuvent être effectuées simultanément ou successivement.
Ainsi, on peut mettre en oeuvre l'invention avec une solution contenant un ADN simple ou
De préférence, les poudres et céramiques sont immergées dans un milieu de culture DMEM pendant 48 heures à 37°C avant ou simultanément à la fixation des acides nucléiques.
Dans un aspect complémentaire, l'invention porte sur un procédé pour fixer de l'ADN
sous forme plasmidique à la surface de poudre ou céramique de phosphates de calcium caractérisé en ce qu'il comprend une étape a) consistant en une hydratation de la poudre de phosphate de calcium ou de la céramique de phosphate de calcium dans une solution de tampon phosphate non saturée en calcium et phosphate et une étape b) consistant en une immersion des produits obtenus à l'étape a) dans une solution de tampon phosphate non saturée en calcium et phosphate contenant un ADN simple ou double brin pour des durées variables de quelques minutes à plusieurs heures, c) obtention de particules de phosphates de calcium comportant des molécules d'ADN
fixées à sa surface.
De préférence, la solution de l'étape a) et b) comprend un tampon phosphate à
0,12 M
(pH 6,8). L'immersion est effectuée pendant au moins 1, 5, 10 ou 30 minutes jusqu'à
environ 12, 24, ou 48 heures à une température allant de 15 à 50°C, de préférence environ 37°C. En outre, les particules de phosphates de calcium sont maintenues immergées dans un milieu de culture du type des milieux de culture cellulaire, pendant environ quelques minutes à quelques jours, et à une température allant de 15 à
50°C, de préférence environ 37°C.
Ainsi, dans ce procédé, l'hydratation réside de préférence en une immersion de la poudre de phosphate de calcium ou de la céramique de phosphate de calcium dans une solution simulant les fluides extracellulaires destinée à produire une croissance épitaxique d'apatite carbonatée à la surface desdites poudres et céramiques. A
ce titre, l'étape b) est réalisée au moyen d'un milieu simulant les fluides extracellulaires ou un milieu du type des milieux de culture cellulaires contenant les acides nucléiques, ledit milieu étant non dénaturant pour l'ADN et non saturé en calcium et phosphate.
Ce 5 milieu entraîne une croissance épitaxique d'apatite carbonatée à la surface desdites poudres et céramiques.
Les étapes a) et b) peuvent être effectuées simultanément ou successivement.
Ainsi, on peut mettre en oeuvre l'invention avec une solution contenant un ADN simple ou
10 double brin pour des durées variables de quelques minutes à plusieurs heures à environ 37°C.
Avantageusement, ce procédé permet de fixer l'ADN à pH physiologique sur des particules de phosphate de calcium dans des conditions qui ne sont pas dénaturantes pour la molécule d'ADN. Les céramiques peuvent être des céramiques poreuses ou denses.
Dans un autre aspect, l'invention porte sur un procédé pour transfecter des cellules isolées, cultivées en monocouche ou en trois dimensions consistant en la mise en contact des cellules à transfecter avec les particules obtenues par le procédé
décrit ci-dessus pendant des durées de quelques heures à quelques semaines. Ce procédé
peut également être mise en oeuvre pour transfecter des cellules contenues dans un fragment tissulaire cultivé. Les particules. obtenues mentionné ci-dessus est particulièrement utile pour la préparation d'un médicament pour transfecter in vivo des cellules contenues dans un tissu ou dans un organe.
Dans un autre aspect, l'invention porte sur les poudres et les céramiques de phosphates de calcium susceptibles d'être obtenues à partir du procédé décrit ci-dessus, caractérisées en ce qu'elles peuvent supporter une croissance épitaxique d'apatite
Avantageusement, ce procédé permet de fixer l'ADN à pH physiologique sur des particules de phosphate de calcium dans des conditions qui ne sont pas dénaturantes pour la molécule d'ADN. Les céramiques peuvent être des céramiques poreuses ou denses.
Dans un autre aspect, l'invention porte sur un procédé pour transfecter des cellules isolées, cultivées en monocouche ou en trois dimensions consistant en la mise en contact des cellules à transfecter avec les particules obtenues par le procédé
décrit ci-dessus pendant des durées de quelques heures à quelques semaines. Ce procédé
peut également être mise en oeuvre pour transfecter des cellules contenues dans un fragment tissulaire cultivé. Les particules. obtenues mentionné ci-dessus est particulièrement utile pour la préparation d'un médicament pour transfecter in vivo des cellules contenues dans un tissu ou dans un organe.
Dans un autre aspect, l'invention porte sur les poudres et les céramiques de phosphates de calcium susceptibles d'être obtenues à partir du procédé décrit ci-dessus, caractérisées en ce qu'elles peuvent supporter une croissance épitaxique d'apatite
11 carbonatée à leur surface dans des conditions non dénaturantes, notamment dans une solution saline non saturée et non dénaturante pour les macromolécules biologiques.
L'invention vise également ces poudres et céramiques de phosphates de calcium comprenant en outre les acides nucléiques fixés à leur surface.
Ces produits sont particulièrement efficaces pour la transfection de cellules in vitro et in vivo.
Avantageusement, les poudres et céramiques obtenues possèdent au moins l'une des propriétés décrites ci-après avant la modification de surface - Nature des groupes chargés à la surface : P04 -, OH-, Cap - pH de surface basique - Potentiel électrocinétique négatif - Hydrophobe - granulométrie comprise entre 0-200 pm, en particulier entre 80-125 gm et 0-25 ~tm.
De préférence, les produits de l'invention comprennent l'ensemble des caractéristiques décrites ci-dessus.
En outre, les poudres et céramiques de phosphates de calcium mentionnées ci-dessus peuvent comporter un noyau composé d'un autre matériau polymérique, céramique ou métallique, de préférence magnétique.
L'invention vise également les particules formées à base de poudres de phosphates de calcium décrites ci-dessus, lesdites particules étant comprises dans une matrice minérale ou polymérique, en particulier dans des ciments de phosphate ou de sulfate de calcium.
L'invention vise également ces poudres et céramiques de phosphates de calcium comprenant en outre les acides nucléiques fixés à leur surface.
Ces produits sont particulièrement efficaces pour la transfection de cellules in vitro et in vivo.
Avantageusement, les poudres et céramiques obtenues possèdent au moins l'une des propriétés décrites ci-après avant la modification de surface - Nature des groupes chargés à la surface : P04 -, OH-, Cap - pH de surface basique - Potentiel électrocinétique négatif - Hydrophobe - granulométrie comprise entre 0-200 pm, en particulier entre 80-125 gm et 0-25 ~tm.
De préférence, les produits de l'invention comprennent l'ensemble des caractéristiques décrites ci-dessus.
En outre, les poudres et céramiques de phosphates de calcium mentionnées ci-dessus peuvent comporter un noyau composé d'un autre matériau polymérique, céramique ou métallique, de préférence magnétique.
L'invention vise également les particules formées à base de poudres de phosphates de calcium décrites ci-dessus, lesdites particules étant comprises dans une matrice minérale ou polymérique, en particulier dans des ciments de phosphate ou de sulfate de calcium.
12 Dans un autre aspect, l'invention se rapporte à un revêtement de céramiques de prothèses articulaires ayant les caractéristiques de la céramique définie ci-dessus.
L'invention vise également l'utilisation desdites poudres et céramiques de phosphate de calcium chargée en ADN à leur surface comme support pour la culture cellulaire, notamment pour la culture en réseau tridimensionnel de cellules transfectées par le support et pour la transfection de cellules in vitro et in vivo.
Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif. Ils constituent des modes de réalisations préférés de l'invention.
Exemple 1 : Caractéristique des poudres utilisées Type P15: poudre sphérique de surface spécif que 0,62 m2/g. Elles ont été
calcinées à
1180°C et leur granulométrie est comprise entre 80-125 gym.
Type Pl: poudre de forme quelconque de surface spécifique 56,84 mz/g, non calcinée (brute) de granulométrie comprise entre 0-25 gym.
L'étude granulométrique des poudres utilisées montre que les poudres sphériques (P15) ont une tranche granulométrique bien définie alors que celles de forme quelconque (P1) a des tranches granulométriques beaucoup plus larges avec beaucoup de particules fines. Le pH de charge nulle varie avec la température de calcination des poudres. Le potentiel zéta de la poudre P1 mesuré dans de l'eau déminéralisée est de -27,5 mV et le pH de surface est de 9,08.
En fonction de la température de frittage de la poudre, le pH de charge nul est variable mais largement inférieur au pH physiologique. Ceci signifie que quelque soit la
L'invention vise également l'utilisation desdites poudres et céramiques de phosphate de calcium chargée en ADN à leur surface comme support pour la culture cellulaire, notamment pour la culture en réseau tridimensionnel de cellules transfectées par le support et pour la transfection de cellules in vitro et in vivo.
Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif. Ils constituent des modes de réalisations préférés de l'invention.
Exemple 1 : Caractéristique des poudres utilisées Type P15: poudre sphérique de surface spécif que 0,62 m2/g. Elles ont été
calcinées à
1180°C et leur granulométrie est comprise entre 80-125 gym.
Type Pl: poudre de forme quelconque de surface spécifique 56,84 mz/g, non calcinée (brute) de granulométrie comprise entre 0-25 gym.
L'étude granulométrique des poudres utilisées montre que les poudres sphériques (P15) ont une tranche granulométrique bien définie alors que celles de forme quelconque (P1) a des tranches granulométriques beaucoup plus larges avec beaucoup de particules fines. Le pH de charge nulle varie avec la température de calcination des poudres. Le potentiel zéta de la poudre P1 mesuré dans de l'eau déminéralisée est de -27,5 mV et le pH de surface est de 9,08.
En fonction de la température de frittage de la poudre, le pH de charge nul est variable mais largement inférieur au pH physiologique. Ceci signifie que quelque soit la
13 température de frittage, le potentiel électrocinétique des poudres, au pH
neutre, est négatif.
L'examen en microscopie à balayage des poudres sphériques montre qu'elles sont constituées par des grains assemblés par des joints de grains. Il existe des irrégularités de surface sur certaines des faces des grains à fort grossissement.
Poudre P 1 P 15 Nature des groupe chargsP04 -, OH-, Ca++ P04--, OH-, Ca++
Potentiel lectrocintique-27,5 -35 (mV) Hydrophobicit + +
PH de surface 9,8 7,8 Granulomtrie (pm) 0-25 80-125 Surface spcifique (m'/gr)56,84 0,62 pH de charge nul Forme des poudre anguleuse sphrique Exemple 2 : Méthode de fixation de l'ADN sur le vecteur Le vecteur peut être utilisé de deux manières différentes Méthode A : Il peut être incubé directement avec le plasmide dans une solution de tampon phosphate. Il est alors maintenu incubé dans celui-ci pendant plusieurs heures alors que sa surface est modifiée par croissance épitaxique d'apatite carbonatée. La fixation peut alors se faire par coprécipitation à la surface du matériau.
Méthode B : Il peut également être mis en présence d'une solution saline pendant plusieurs jours afin de modifier la surface. Une fois que celle-ci est équilibrée, le matériau est ensuite mis dans la solution contenant le plasmide. La fixation de l'ADN
est supposée se faire alors à la surface de la du matériau modifié.
neutre, est négatif.
L'examen en microscopie à balayage des poudres sphériques montre qu'elles sont constituées par des grains assemblés par des joints de grains. Il existe des irrégularités de surface sur certaines des faces des grains à fort grossissement.
Poudre P 1 P 15 Nature des groupe chargsP04 -, OH-, Ca++ P04--, OH-, Ca++
Potentiel lectrocintique-27,5 -35 (mV) Hydrophobicit + +
PH de surface 9,8 7,8 Granulomtrie (pm) 0-25 80-125 Surface spcifique (m'/gr)56,84 0,62 pH de charge nul Forme des poudre anguleuse sphrique Exemple 2 : Méthode de fixation de l'ADN sur le vecteur Le vecteur peut être utilisé de deux manières différentes Méthode A : Il peut être incubé directement avec le plasmide dans une solution de tampon phosphate. Il est alors maintenu incubé dans celui-ci pendant plusieurs heures alors que sa surface est modifiée par croissance épitaxique d'apatite carbonatée. La fixation peut alors se faire par coprécipitation à la surface du matériau.
Méthode B : Il peut également être mis en présence d'une solution saline pendant plusieurs jours afin de modifier la surface. Une fois que celle-ci est équilibrée, le matériau est ensuite mis dans la solution contenant le plasmide. La fixation de l'ADN
est supposée se faire alors à la surface de la du matériau modifié.
14 Fixation du plasmide sur la surface des particules natives (méthode A):
L'ADN double brin a une affinité marquée pour l'HA lorsqu'il est dissous dans de faibles concentrations de tampon phosphate. Ils sont élués dans des concentrations supérieures de tampon phosphate. 1 m2 de surface de poudre a été disposé dans les boîtes de Pétri soit 1,61 gr pour le type A et 0,017 g dans le type B.
~ Hydratation de la poudre d'HA (2m1/g) dans lOml de tampon phosphate 0,12M à pH 6,8. Chauffage 15 à 30 mn à 100°C.
~ Laisser reposer à température ambiante et sortir le tampon. Re-suspendre dans 5 à 10 ml de 0,12 M de tampon phosphate à pH 6,8 à 60°C, décanter et resuspendre dans 5 ml du même tampon à 60°C.
Ajouter l'échantillon de l'acide nucléique dans 1 ml de tampon phosphate 0,12M à pH 6,8 à 40°C (l'élution des acides nucléiques doubles brins peut se faire en lavant l'HA 8 à 10 fois avec 0,5 ml de tampon phosphate (0,4M)).
Fixation du plasmide à la surface des particules modifiées par croissance épitaxiques (méthode B):
~ Les particules ont été incubées à 37°C dans du milieu de culture DMEM
pendant 48 heures.
~ . Elles sont lavées dans une solution de tampon phosphate 0,12M à pH
6,8 ~ On ajoute l'échantillon de l'acide nucléique dans 1 ml de tampon phosphate 0,12M à pH 6,8 à 40°C
Exemple 3 : Transfection de cellules in vitro Trois lignées ont été utilisées:
~ Cartilage de croissance de lapin ~ Périoste de lapin ~ Cellules de calvaria de rat Elles sont obtenues en digérant la matrice collagénique dans une solution de collagénase suivie d'une centrifugation.
3.1 Matériau à surface non modifiée La quantité de poudre (type B) a toujours été la même : 10 mg.
Lors de la transfection les cellules n'étaient pas à confluence. Les cellules ont été
transfectées à JO et la première évaluation par histochimie de l'expression de la 10 galoctosidase a été faite à J4, J21, J30.
A J4:
Toutes les lignées présentent des zones de marquage. Dans les puits transfectés avec des particules, les cellules marquées sont groupés autour des particules bien que certaines en soient néanmoins éloignées. Cet éloignement peut s'expliquer par le fait
L'ADN double brin a une affinité marquée pour l'HA lorsqu'il est dissous dans de faibles concentrations de tampon phosphate. Ils sont élués dans des concentrations supérieures de tampon phosphate. 1 m2 de surface de poudre a été disposé dans les boîtes de Pétri soit 1,61 gr pour le type A et 0,017 g dans le type B.
~ Hydratation de la poudre d'HA (2m1/g) dans lOml de tampon phosphate 0,12M à pH 6,8. Chauffage 15 à 30 mn à 100°C.
~ Laisser reposer à température ambiante et sortir le tampon. Re-suspendre dans 5 à 10 ml de 0,12 M de tampon phosphate à pH 6,8 à 60°C, décanter et resuspendre dans 5 ml du même tampon à 60°C.
Ajouter l'échantillon de l'acide nucléique dans 1 ml de tampon phosphate 0,12M à pH 6,8 à 40°C (l'élution des acides nucléiques doubles brins peut se faire en lavant l'HA 8 à 10 fois avec 0,5 ml de tampon phosphate (0,4M)).
Fixation du plasmide à la surface des particules modifiées par croissance épitaxiques (méthode B):
~ Les particules ont été incubées à 37°C dans du milieu de culture DMEM
pendant 48 heures.
~ . Elles sont lavées dans une solution de tampon phosphate 0,12M à pH
6,8 ~ On ajoute l'échantillon de l'acide nucléique dans 1 ml de tampon phosphate 0,12M à pH 6,8 à 40°C
Exemple 3 : Transfection de cellules in vitro Trois lignées ont été utilisées:
~ Cartilage de croissance de lapin ~ Périoste de lapin ~ Cellules de calvaria de rat Elles sont obtenues en digérant la matrice collagénique dans une solution de collagénase suivie d'une centrifugation.
3.1 Matériau à surface non modifiée La quantité de poudre (type B) a toujours été la même : 10 mg.
Lors de la transfection les cellules n'étaient pas à confluence. Les cellules ont été
transfectées à JO et la première évaluation par histochimie de l'expression de la 10 galoctosidase a été faite à J4, J21, J30.
A J4:
Toutes les lignées présentent des zones de marquage. Dans les puits transfectés avec des particules, les cellules marquées sont groupés autour des particules bien que certaines en soient néanmoins éloignées. Cet éloignement peut s'expliquer par le fait
15 que les particules émettent des débris avec une surface spécifique élevée.
On les voit au microscope au milieu de groupes de cellules marquées. Cellules de cartilage de croissance: en valeur absolue, c'est la série qui a été le plus marquée.
En ce qui concerne les cellules de cartilage, le nombre de cellules transfectées est important. Les cellules des calvarias de rats sont fortement positives.
Les cellules ont une inhibition de contact relative, elles sont quasiment en trois dimensions et arrondies. La plupart des cellules des trois groupes sont positives. Le nombre de cellules positives et le taux de croissance précédent semblent indiquer que les plasmides sont transmis d'une cellule à l'autre ou bien que le relargage de particules d'ADN s'étale dans le temps, le pourcentage de cellules positives aurait été
très faible dans le cas contraire. Il est également possible que les relargages de particules transfectantes soient progressifs. Les cellules marquées préférentiellement sont celles au contact des particules.
On les voit au microscope au milieu de groupes de cellules marquées. Cellules de cartilage de croissance: en valeur absolue, c'est la série qui a été le plus marquée.
En ce qui concerne les cellules de cartilage, le nombre de cellules transfectées est important. Les cellules des calvarias de rats sont fortement positives.
Les cellules ont une inhibition de contact relative, elles sont quasiment en trois dimensions et arrondies. La plupart des cellules des trois groupes sont positives. Le nombre de cellules positives et le taux de croissance précédent semblent indiquer que les plasmides sont transmis d'une cellule à l'autre ou bien que le relargage de particules d'ADN s'étale dans le temps, le pourcentage de cellules positives aurait été
très faible dans le cas contraire. Il est également possible que les relargages de particules transfectantes soient progressifs. Les cellules marquées préférentiellement sont celles au contact des particules.
16 Pourcentage des cellules marquées en fonction des lignées utilisées Temps (jours) calvaria Cartilage de prioste conjugaison 3.2 Matériau à surface modifiée par croissance épitaxique Dès les premiers temps de la culture, la plupart des cellules sont marquées.
3.2.1 Transfection de fart et d'autre d'une membrane héminerméable Les grains ont été disposés au contact des cellules soit séparés de celles-ci par une membrane poreuse (0,2~m) en polycarbonate les séparant du tapis cellulaire. Le marquage cellulaire par la galactosidase est évalué par histochimie à J4.
Les cellules en contact direct avec les particules sont marquées sporadiquement. Les cellules qui ne sont pas au contact des particules (séparées par la membrane) sont également marquées. Il existe donc des particules transfectantes de taille inférieure à
1 S 0,2 pm passant à travers les pores de la membrane en polycarbonate.
3.2.2 Transfection de cellules en réseau tridimensionnel Les lignées cellulaires précédemment décrites sont mises en suspension dans le milieu de culture. Le lit est disposé au fond d'une boîte de culture. La suspension sert à
ensemencer un lit de microbilles (1.5-2 105 cellules/0,05 gr de billes) vectrices de plasmides portant le gène la galactosidase. Le lit est disposé au fond d'une boîte de culture. Les cellules sont cultivées 10 à 15 jours. On obtient la formation d'une couche cellulaire tridimentionnelle pontant et agglomérant les billes. Cette couche contient également une matrice collagénique abondante.
3.2.1 Transfection de fart et d'autre d'une membrane héminerméable Les grains ont été disposés au contact des cellules soit séparés de celles-ci par une membrane poreuse (0,2~m) en polycarbonate les séparant du tapis cellulaire. Le marquage cellulaire par la galactosidase est évalué par histochimie à J4.
Les cellules en contact direct avec les particules sont marquées sporadiquement. Les cellules qui ne sont pas au contact des particules (séparées par la membrane) sont également marquées. Il existe donc des particules transfectantes de taille inférieure à
1 S 0,2 pm passant à travers les pores de la membrane en polycarbonate.
3.2.2 Transfection de cellules en réseau tridimensionnel Les lignées cellulaires précédemment décrites sont mises en suspension dans le milieu de culture. Le lit est disposé au fond d'une boîte de culture. La suspension sert à
ensemencer un lit de microbilles (1.5-2 105 cellules/0,05 gr de billes) vectrices de plasmides portant le gène la galactosidase. Le lit est disposé au fond d'une boîte de culture. Les cellules sont cultivées 10 à 15 jours. On obtient la formation d'une couche cellulaire tridimentionnelle pontant et agglomérant les billes. Cette couche contient également une matrice collagénique abondante.
17 A la date d'observation les cellules forment un réseau tridimensionnel pontant les différentes particules et les assemblant. La microscopie optique révèle que les cellules contenues dans l'amas de particules sont marquées par la galactosidase.
3.2.3 Transfection de cellules dans des cultures de tissu Matériau utilisé pour le marquage: Type A: poudre sphérique de surface spécifique 0,62 m2/g. Elles ont été calcinées à 1180°C et leur granulométrie est 80-125 pm. La quantité de poudre est de quelques dizaines de particules par boites (P 15).
Quelques billes ont été placées au contact des fragments osseux après avoir été
incubées sans pré-immersion (méthode A).
Les fragments osseux proviennent de fémurs, tibias et calvaria de rats nouveaux-nés agés de 3 jours. Les pièces osseuses ont été nettoyés des tissus mous attenants. Les os longs ont été coupés en trois morceaux: 2 épiphyses et la diaphyse. Les calvarias ont été coupées en petits fragments de 2 à 3 mm de côté. Ces différents fragments ont été
déposés à la surface d'un gel à 3% d'agar dans du DMEM. Le milieu de culture (DMEM+SVF) a été ensuite rajouté de façon à ce que les fragments affleurent à
l'interface liquide-air.
Les billes ont été maintenues en contact des tissus pendant 2 à 30 jours, date à laquelle l'activité galactosidase des cellules est mise en évidence avant de faire des coupes histologiques.
A 2 jours de mise en contact, des zones de marquage sporadiques sont identifiables. Le marquage se fait à distance et au contact des billes d'HA. Il a lieu également au contact de ces mêmes billes.
3.2.3 Transfection de cellules dans des cultures de tissu Matériau utilisé pour le marquage: Type A: poudre sphérique de surface spécifique 0,62 m2/g. Elles ont été calcinées à 1180°C et leur granulométrie est 80-125 pm. La quantité de poudre est de quelques dizaines de particules par boites (P 15).
Quelques billes ont été placées au contact des fragments osseux après avoir été
incubées sans pré-immersion (méthode A).
Les fragments osseux proviennent de fémurs, tibias et calvaria de rats nouveaux-nés agés de 3 jours. Les pièces osseuses ont été nettoyés des tissus mous attenants. Les os longs ont été coupés en trois morceaux: 2 épiphyses et la diaphyse. Les calvarias ont été coupées en petits fragments de 2 à 3 mm de côté. Ces différents fragments ont été
déposés à la surface d'un gel à 3% d'agar dans du DMEM. Le milieu de culture (DMEM+SVF) a été ensuite rajouté de façon à ce que les fragments affleurent à
l'interface liquide-air.
Les billes ont été maintenues en contact des tissus pendant 2 à 30 jours, date à laquelle l'activité galactosidase des cellules est mise en évidence avant de faire des coupes histologiques.
A 2 jours de mise en contact, des zones de marquage sporadiques sont identifiables. Le marquage se fait à distance et au contact des billes d'HA. Il a lieu également au contact de ces mêmes billes.
18 A 30 jours, la totalité des fragments osseux a viré au bleu macroscopiquement (figure 1).
La figure 1 représente une macrophotographie d'une culture de tissu osseux en présence de poudre transfectante pendant 30 jours. Le fragment osseux est entièrement bleu en raison de la transfection des cellules par le plasmide vecteur de la galactosidase. En microscopie optique par réflexion, il n'est pas possible de voir une zone qui ne soit pas marquée. Les billes sont engluées dans une matrice marquée par la réaction à la galactosidase.
Les coupes des différents échantillons de tissu osseux cultivés 30j montrent que les cellules osseuses (ostéoblastes, chondroblastes, cellules périchondrales, cellules périostées, ostéoclastes) sont marquées (la figure 2 est une coupe histologique du même tissu montrant que toutes les cellules ont été transfectées par la galoctosidase X
30).
Les cellules des lignées hématopoïétiques ne sont pas marquées. Il faut noter que:
~ Toutes les cellules osseuses sont marquées ~ Elles le sont quelle que soit la distance des cellules aux billes.
3.2.4 Transfection in vivo Un groupe de 10 lapins mates NZW âgés de 4 semaines est sélectionné de manière aléatoire. Ces lapins sont divisés en deux groupes : Lot A et Lot B. Un lapin de chaque groupe sert de témoin.
La .zone opératoire se situe sur la mandibule coté gauche en arrière des incisives mandibulaires. Il est à noter qu'une étude préliminaire a permis de sélectionner ce site dans lequel l'os est le plus abondant. Le type de poudre P15 a été utilisé.
L'ADN a été
fixé par la méthode A.
Après la pose de champs stériles et la désinfection cutanée et muqueuse une incision vestibulaire intrabuccale est réalisée à l'aide d'un bistouri. Un lambeau de pleine
La figure 1 représente une macrophotographie d'une culture de tissu osseux en présence de poudre transfectante pendant 30 jours. Le fragment osseux est entièrement bleu en raison de la transfection des cellules par le plasmide vecteur de la galactosidase. En microscopie optique par réflexion, il n'est pas possible de voir une zone qui ne soit pas marquée. Les billes sont engluées dans une matrice marquée par la réaction à la galactosidase.
Les coupes des différents échantillons de tissu osseux cultivés 30j montrent que les cellules osseuses (ostéoblastes, chondroblastes, cellules périchondrales, cellules périostées, ostéoclastes) sont marquées (la figure 2 est une coupe histologique du même tissu montrant que toutes les cellules ont été transfectées par la galoctosidase X
30).
Les cellules des lignées hématopoïétiques ne sont pas marquées. Il faut noter que:
~ Toutes les cellules osseuses sont marquées ~ Elles le sont quelle que soit la distance des cellules aux billes.
3.2.4 Transfection in vivo Un groupe de 10 lapins mates NZW âgés de 4 semaines est sélectionné de manière aléatoire. Ces lapins sont divisés en deux groupes : Lot A et Lot B. Un lapin de chaque groupe sert de témoin.
La .zone opératoire se situe sur la mandibule coté gauche en arrière des incisives mandibulaires. Il est à noter qu'une étude préliminaire a permis de sélectionner ce site dans lequel l'os est le plus abondant. Le type de poudre P15 a été utilisé.
L'ADN a été
fixé par la méthode A.
Après la pose de champs stériles et la désinfection cutanée et muqueuse une incision vestibulaire intrabuccale est réalisée à l'aide d'un bistouri. Un lambeau de pleine
19 épaisseur est récliné pour accéder à la zone osseuse mandibulaire à la base des incisives. Un trépan de 3mm est utilisé pour systématiser l'effraction osseuse. Le défaut osseux réalisé est de l'ordre de 2 mm de profondeur. Le volet osseux est éliminé
à l'aide de ciseau à os. Le biomatériau est aspiré à l'aide d'une seringue de 5 ml et déposé dans le défaut osseux de telle manière qu'il le remplisse. Une légère pression est utilisée avec une gaze stérile pour maintenir en place le biomatériau. Le lambeau repositionné est ensuite suturé
Deux témoins subissent une deuxième opération controlatérale sans dépose de biomatériau.
Les lapins ont été sacrifiés à 3 et 6 semaines. Les mandibules ont été
prélevées, fixées dans l'éthanol et incluse dans de l'hydroxy-ethylmethacrylate. Des coupes de 5 ~m d'épaisseur ont été réalisées et l'activité galactosidase mise en évidence ~ A 3 semaines Dans les sites témoins:
Les coupes histologiques montrent un os spongieux avec peu de trabécules dont les pores sont occupés par un tissu stromal très lâche. Il existe des cellules multinucléées d'allure ostéoclastique à la surface des trabécules. Ces cellules sont toutes marquées par la réaction à la galactosidase. De la même manière, tous les monocytes sont également marqués. Ce sont les seules cellules qui sont marquées.
Dans le.s sites implantés Les coupes passant à travers les billes de phosphate de calcium montrent que les billes sont incluses dans un tissu conjonctif relativement dense avec de nombreuses cellules multinucléées à leur surface. Toutes les cellules, fibroblastiques ou multinucléées sont marquées par la galactosidase.
Lorsque les coupes s'éloignent des billes, il existe moins de cellules marquées néanmoins les structures tissulaires n'ayant pas été perturbées par l'acte opératoire donnent des informations intéressantes. Les fibroblastes des ligaments dentaires sont marquées. Il existe des îlots de cellules d'aspect fibroblastique marqués dans le tissu stromal des pores entre les trabécules. Dans certains cas, il semble même que des cellules de la lignée ostéoblastique soient également marquées.
~ 6 semaines 5 Macroscopiquement, il existe un marquage autour des grains d'HA. Les coupes montrent des cellules stromales positives, les cellules des ligaments dentaires ainsi que les odontoblastes expriment le gène.
à l'aide de ciseau à os. Le biomatériau est aspiré à l'aide d'une seringue de 5 ml et déposé dans le défaut osseux de telle manière qu'il le remplisse. Une légère pression est utilisée avec une gaze stérile pour maintenir en place le biomatériau. Le lambeau repositionné est ensuite suturé
Deux témoins subissent une deuxième opération controlatérale sans dépose de biomatériau.
Les lapins ont été sacrifiés à 3 et 6 semaines. Les mandibules ont été
prélevées, fixées dans l'éthanol et incluse dans de l'hydroxy-ethylmethacrylate. Des coupes de 5 ~m d'épaisseur ont été réalisées et l'activité galactosidase mise en évidence ~ A 3 semaines Dans les sites témoins:
Les coupes histologiques montrent un os spongieux avec peu de trabécules dont les pores sont occupés par un tissu stromal très lâche. Il existe des cellules multinucléées d'allure ostéoclastique à la surface des trabécules. Ces cellules sont toutes marquées par la réaction à la galactosidase. De la même manière, tous les monocytes sont également marqués. Ce sont les seules cellules qui sont marquées.
Dans le.s sites implantés Les coupes passant à travers les billes de phosphate de calcium montrent que les billes sont incluses dans un tissu conjonctif relativement dense avec de nombreuses cellules multinucléées à leur surface. Toutes les cellules, fibroblastiques ou multinucléées sont marquées par la galactosidase.
Lorsque les coupes s'éloignent des billes, il existe moins de cellules marquées néanmoins les structures tissulaires n'ayant pas été perturbées par l'acte opératoire donnent des informations intéressantes. Les fibroblastes des ligaments dentaires sont marquées. Il existe des îlots de cellules d'aspect fibroblastique marqués dans le tissu stromal des pores entre les trabécules. Dans certains cas, il semble même que des cellules de la lignée ostéoblastique soient également marquées.
~ 6 semaines 5 Macroscopiquement, il existe un marquage autour des grains d'HA. Les coupes montrent des cellules stromales positives, les cellules des ligaments dentaires ainsi que les odontoblastes expriment le gène.
Claims (20)
1. Procédé pour fixer de l'ADN sous forme plasmidique à la surface de poudre ou céramique de phosphates de calcium caractérisé en ce qu'il comprend une étape a) consistant en une hydratation de la poudre de phosphate de calcium ou de la céramique de phosphate de calcium dans une solution de tampon phosphate non saturée en calcium et phosphate et une étape b) consistant en une immersion des produits obtenus à l'étape a) dans une solution de tampon phosphate non saturée en calcium et phosphate contenant un ADN simple ou double brin pour des durées variables de quelques minutes à plusieurs heures, c) obtention de particules de phosphates de calcium comportant des molécules d'ADN fixées à sa surface.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la solution de l'étape a) et b) comprend un tampon phosphate à 0,12 M (pH 6,8).
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'immersion est effectuée pendant au moins 1, 5, 10 ou 30 minutes jusqu'à environ 12, 24, ou 48 heures à
une température allant de 15 à 50°C, de préférence environ 37°C.
une température allant de 15 à 50°C, de préférence environ 37°C.
4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les particules de phosphates de calcium sont maintenues immergées dans un milieu de culture du type des milieux de culture cellulaire.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que les particules de phosphates de calcium sont immergées pendant environ quelques minutes à quelques jours.
6. Procédé selon l'une des revendications 4 et 5, caractérisé en ce que les particules de phosphates de calcium sont immergées à une température allant de 15 à
50°C, de préférence environ 37°C.
50°C, de préférence environ 37°C.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'étape b) est réalisée au moyen d'un milieu simulant les fluides extracellulaires ou un milieu du type des milieux de culture cellulaires contenant les acides nucléiques, ledit milieu étant non dénaturant pour l'ADN et non saturé en calcium et phosphate; entraînant une croissance épitaxique d'apatite carbonatée à la surface desdites poudres et céramiques.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 et 7, caractérisé en ce que les étapes a) et b) sont effectuées simultanément ou successivement.
9. Utilisation du procédé selon l'une des revendications 7 et 8 pour de fixer l'ADN
dans des conditions de pH physiologique sur des particules de phosphate de calcium.
dans des conditions de pH physiologique sur des particules de phosphate de calcium.
10. Procédé pour transfecter des cellules isolées, cultivées en monocouche ou en trois dimensions consistant en la mise en contact des cellules à transfecter avec les particules obtenues par le procédé selon l'une des revendications 1 à 8 pendant des durées de quelques heures à quelques semaines.
11. Procédé pour transfecter des cellules contenues dans un fragment tissulaire cultivé
consistant en la mise en contact des cellules à transfecter avec les particules obtenues par le procédé selon l'une des revendications 1 à 8 pendant des durées de quelques heures à quelques semaines.
consistant en la mise en contact des cellules à transfecter avec les particules obtenues par le procédé selon l'une des revendications 1 à 8 pendant des durées de quelques heures à quelques semaines.
12. Utilisation des particules obtenues par le procédé selon l'une des revendications 1 à
8 pour la préparation d'un médicament pour transfecter in vivo des cellules contenues dans un tissu ou dans un organe.
8 pour la préparation d'un médicament pour transfecter in vivo des cellules contenues dans un tissu ou dans un organe.
13. Poudres et céramiques de phosphates de calcium susceptibles d'être obtenues à
partir du procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisées en ce qu'elles supportent une croissance épitaxique d'apatite carbonatée à leur surface dans des conditions non dénaturantes.
partir du procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisées en ce qu'elles supportent une croissance épitaxique d'apatite carbonatée à leur surface dans des conditions non dénaturantes.
14. Poudres et céramiques de phosphates de calcium selon la revendication 13 comprenant en outre les acides nucléiques fixés à leur surface.
15. Poudres et céramiques de phosphates de calcium selon l'une des revendications 13 et 14 caractérisées en ce qu'elles possèdent au moins l'une des propriétés suivantes:
- Nature des groupes chargés à la surface : PO4-, OH-, Ca++
- pH de surface basique - Potentiel électrocinétique négatif - Hydrophobe - granulométrie comprise entre 0-200 µm, en particulier entre 80-125 µm et 0-25 µm.
- Nature des groupes chargés à la surface : PO4-, OH-, Ca++
- pH de surface basique - Potentiel électrocinétique négatif - Hydrophobe - granulométrie comprise entre 0-200 µm, en particulier entre 80-125 µm et 0-25 µm.
16. Poudres et céramiques de phosphates de calcium selon l'une des revendications 13 à 15 caractérisées en ce qu'elles comprennent en outre un noyau composé d'un autre matériau polymérique, céramique ou métallique, de préférence magnétique.
17. Particules formées à base de poudres de phosphates de calcium selon l'une des revendications 13 à 16 comprises dans une matrice minérale ou polymérique en particulier dans des ciments de phosphate ou de sulfate de calcium.
18. Utilisation des poudres et céramiques de phosphates de calcium selon l'une des revendications 13 à 16 pour la transfection de cellules in vitro
19. Utilisation des poudres et céramiques de phosphates de calcium selon l'une des revendications 13 à 16 pour la fabrication d'un médicament pour la transfection de cellules in vivo.
20. Utilisation des poudres et céramiques de phosphates de calcium selon l'une des revendications 13 à 16 pour la culture de cellules transfectées en trois dimensions avec formation d'une matrice cellulaire et extracellulaire agrégeant les particules.
Applications Claiming Priority (3)
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|---|---|---|---|
| FR0216785A FR2849436B1 (fr) | 2002-12-27 | 2002-12-27 | Particules et ceramiques de phosphates de calcium pour transfection in vivo et in vitro |
| FR02/16785 | 2002-12-27 | ||
| PCT/FR2003/003897 WO2004060407A1 (fr) | 2002-12-27 | 2003-12-24 | Particules et ceramiques de phosphates de calcium pour la transfection in vivo et in vitro |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CA2511820A1 true CA2511820A1 (fr) | 2004-07-22 |
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ID=32480241
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