CA2476048A1 - Utilisation de proteines elip pour accroitre la resistance des vegetaux au stress photo-oxydant - Google Patents

Abstract

L'invention concerne l'utilisation de protéines de la famille ELIP pour l'obtention de plantes possédant une résistance accrue au stress photo- oxydant, par surexpression desdites protéines dans des plantes transgéniques ou par sélection de plantes surexprimant naturellement lesdites protéines.</ SDOAB>

Description

UTILISATION DE PROTEINES ELIP POUR ACCROITRE LA RESISTANCE
DES VEGETAUX AU STRESS PHOTO-OXYDANT
La présente invention se rapporte à de nouveaux moyens d'augmenter la résistance des plantes au stress photo s oxydant.
L'exposition des plantes à une intensité
lumineuse élevée peut conduire à une absorption de lumïère excédant les capacités d'utilisation par la fonction photosynthétique qui entraîne l'apparition d'espèces actives de l'oxygène (superoxyde, peroxyde d'hydrogène, hydroxyle).
Ces molécules sont très réactives et si elles ne sont pas détoxifiées, elles provoquent un stress oxydant qui altère la structure et la fonction du chloroplaste conduisant à une inhibition de l'activité photosynthétique. Ce phénomène peut se manifester même sous des intensités lumineuses modérées lorsque la plante est exposée à de basses températures (WISE, Photosynth. Res. 45; 79-97, 1995), ou bien lorsqu'elle est placée en conditions de sécheresse (SMIRNOFF, New Phytol., 125, 27-58, 1993), ou de carence minérale.
he stress photo-oxydant est néfaste pour les plantes, par exemple pour des variëtés tropicales peu adaptées au froid, ou bien pour des végétaux qui sont plantés aux premiers jours du prïntemps, et doivent donc croître à
basse température. hes symptômes observés sont . blanchiment des feuilles, apparition de nécroses, baisse de la croissance.
Ainsi, la recherche de nouveaux moyens de lutte contre ce stress photo-oxydant constitue un réel besoin.
Des analyses biochimiques de plantes après exposition à une lumière de forte intensité, montrent l'accumulation de différentes protéines appartenant à la famille des LHCPs liant les chlorophylles a/b (ADAMSKA et al., Eur. J. Biochem., 2~0, 453-460, 1999 ). Parmi ces protéines on citera celles de la famille des ELIPs (Early Z,ight Induced Proteins) (ADAMSKA, Physiologia Plantarum, 100, 794-805, 1997) .
Par exemple, 2 protéines ELIP, respectivement dénommées ELIP1 et ELIP2, ont été mises en évidence chez

2 Arabidopsis thaliana (At). Des séquences homologues à celles de ces ELIPs ont également été identifiées chez d'autres plantes ; dans le cas des céréales, on citera notamment le riz (Os), le maïs (Zm) et le blé (Wh).
La Figure 1 représente l'alignement des séquences de quelques ELIPs. L'arbre généalogique de ces ELIPs, élaboré
à l'aide de séquences représentatives des différentes classes, est représenté sur la Figure 2.
Les ELIPs de riz peuvent être regroupées en 2 classes, codées respectivement par des gènes situés sur le chromosome 1 et le chromosome 7 (2 gènes ont été identifiés sur le chromosome 7). Les ELIPs de maïs peuvent également être regroupées en 2 classes ; en revanche, les séquences actuellement disponibles d'ELIPs de blé semblent appartenir à
une même classe. Certaines classes comprennent plusieurs EST
ou gènes, présentant de légères variations, laissant supposer un polymorphisme pour ces gènes.
Les ELIPs ont une expression transitoire ; leurs gènes ne sont majoritairement transcrits qu'en réponse à
différents stress environnementaux (forte intensité
lumineuse, basse température, stades spécifiques de développement de la plante, ABA) (ADAMSKA, 1997, publication précitée).
La quantité d'ELIPs dans les cellules végétales est en outre étroitement contrôlée par des rëgulations post-traductionnelles . intégration des ELIPs dans la membrane des thylakoïdes, instabilité et dégradation des ELIPs (ADAMSKA, 1997, publication précitée).
Différentes observations suggèrent une corrélation entre le stress et la présence d'ELIPs. En revanche, il n'avait jusqu'à présent pas été possible de déterminer si ces protéines jouaient un rôle effectif dans la résistance au stress . Il a au contraire été rapporté que la diminution ou la suppression partielle de l'expressïon des ELIPs n'entraînait pas de phénotype particulier (GRUBER, Thèse de Doctorat . e< Untersuchung der expression aines frühen lichtinduzierten Proteins des Tabaks », Université de

3 PCT/FR03/00673 Hanovre, 1999, cité dans MONTANE et al., Gene, 258, 1-8, 2000) .
Certains auteurs se sont d' autre part intéressés à la voie de transport des ELIPs jusqu'aux membranes des thylakoïdes . un mode d'insertion spontanée a été proposé par KRUSE et al. (Eur. J. Biochem., 208, 195-202, 1992), et KIM
et al. (J. Biol. Chem., 274, 4715-4721, 1999) qui y ajoute l'intervention d'une voie faisant intervenir des nucléotides triphosphates. Mais ces hypothèses, basées sur des expériences in vitro n'ont pas ëté confirmées in vivo.
Dans la présente invention, les Inventeurs ont mis en évidence une voie préfërentielle de transport et d'intégration in vivo des ELIPs dans les membranes des thylakoïdes des chloroplastes ; cette voie fait intervenir un complexe transporteur dénommé cpSRP (pour Chloroplast Signal Recognition Particle).
Les Inventeurs ont ainsi observé que des mutations inactivant la sous-unité cpSRP43 (mutant cha~s) du complexe cpSRP affectaient l'ensemble des ELIPs. Dans les plantes contenant la mutation chaos les ELIPs ne s'accumulent plus en conditions de stress photo-oxydant, et on observe parallèlement une forte augmentation de la sensibilité au stress.
En outre, les Inventeurs ont également constaté
que la surexpression d'ELIPs chez ces mutants restaure une résistance au stress photo-oxydant comparable à celle des plantes sauvages.
Ces résultats permettent de proposer l'utilisation des ELIPs dans des applications où 1a résistance au stress photo-oxydant est recherchée, en particulier dans le domaine végétal.
La présente invention a ainsi pour objet l'utilisation d'au moins une protéine de la famille ELIP, ou d'un polynucléotide codant pour ladite protéine, pour l'obtention de plantes présentant une résistance accrue au stress photo-oxydant.
En particulier la présente invention a pour objet un procédé pour accroître la résistance d'une plante au

4 stress photo-oxydant, comprenant la transformation de ladite plante par au moins un polynucléotide codant pour une protéine de la famille ELIP, et l'expression de ladite protéine dans ladite plante.
Ce procédé peut être mis en oeuvre par les méthodes usuelles, connues en elles-mêmes, du génie génétique et de la transgénèse végétale.
Classiquement, on utilisera une cassette d'expression, dans laquelle on placera un polynucléotide codant pour la protéine ELIP que l'on souhaite exprimer sous contrôle de séquences de régulation de l'expression (notamment promoteur et terminateur de transcription) appropriées. Le gène d'intérêt peut également être associë à
d'autres éléments de régulation tels que des activateurs.
D'autres éléments tels que les introns, enhancers, séquences de polyadénylation et dérivées peuvent également être prësents dans la séquence nucléique d'intérêt, pour améliorer l'expression ou le fonctionnement du gène transformant. La cassette d'expression peut aussi contenir des séquences 5' non traduites dites « leader ». De telles séquences peuvent améliorer la traduction.
On peut par exemple utïliser le promoteur du CsVmV (virus de la mosaïque des nervures du manioc) décrit dans la Demande PCT WO 97/48819.
On peut également utiliser un promoteur hétérologue ; de très nombreux promoteurs utilisables pour la transformation de cellules vëgétales sont connus en eux mêmes. A titre d'exemples non-limitatifs de promoteurs utilisables dans le cadre de la présente invention, on citera .
- des promoteurs constitutifs forts, tels que le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) décrit par KAY et a1. (Science, 236, 4805, 1987), ou ses dérivés, le promoteur active de riz suivi de l'intron active de riz (PAR-IAR) contenu dans le plasmide pAct1-T (McELROY et al., Mol. Gen. Genet., 213, 150-160, 1991), ou le promoteur de l'ubiquitine ;

- des promoteurs inductibles, par exemple par 1a lumière, tel que celui de la petite sous-unité de la ribulose-biphosphate-carboxylase de différentes espèces végétales, le froid, ou la sécheresse, tel que celui de l'ASR

5 (ABA-water stress-ripening-induced protein) décrit dans la Demande PCT V~10 01/83756.
Parmi les terminateurs de transcriptïon pouvant être utilisés, on citera notamment le terminateur polyA 35S
de CaMV (FRANCK et al., Cell, 21, 285-294, 1980 ; Gene Bank n° V 00141), ou le terminateur polyA NOS, qui correspond à 1a région en 3' non-codante du gène de la nopaline synthase du plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens souche à nopaline (DEPICKER et al., J. Mol. Appl. Genet., 1, 561-573, 1982).
La cassette d'expression ainsi obtenue peut éventuellement être insérée dans un vecteur capable de se répliquer dans une cellule-hôte, ou de s'insérer dans l'ADN
chromosomïque de celle-ci.
Selon un mode de réalisation, la cassette d'expression est insérée dans un vecteur nucléotidique, tel qu'un plasmide, qui peut en outre comprendre un gène marqueur, par exemple un gène permettant de sélectionner une plante transformée d'une plante qui ne contient pas l'ADN
étranger transfecté.
Parmi les gènes codant un agent de sélection (également appelés gènes marqueurs de sélection), peuvent être notamment utilisés des gènes qui confèrent une résistance à un antibiotique (Herrera-Estrella et al., 1983) tel que l'hygromycine, la kanamycine, la bléomycine ou la streptomycine ou à des herbicides (EP 242 246) tels que le glufosinate, le glyphosate ou le bromoxynil.
Préférentiellement selon l'invention, le promoteur associé au gène codant un agent de sélection est un promoteur constitutif, tel que le promoteur Actine-Intron-actine, correspondant à la région en 5' non codante du gène de l'actine 1 du riz et son premier intron (Mc Elroy et al., 1991 ; Gene Bank n° S 44221) . Za présence du premier intron active permet d'augmenter le niveau d'expression d'un gène lorsqu'il est fusionné en 3' d'un promoteur. Cette séquence

6 promotrice permet par exemple l'expression constitutive du gène NptII.
Préférentiellement, ledit gène codant un agent de sélection est excisé. Le système d'excision pour éliminer le gène codant un agent de sélection peut être un système de transposition, tel que notamment le système Ac/Ds du maïs, ou un système de recombinaison, tel que notamment le système Cre/lox du bactériophage P1, le système FLP/FRT de 1a levure (Lyzrik et al., 1997), la recombinase Gin du pliage Mu, la recombinase Pin de E. coli ou 1e système R/RS du plasmide pSRI. Un système de co-transformation (Komari et al., 1996 ) peut également être utilisé. Préférentiellement, le système utilisé sera le système Ac/Ds du maïs.
Selon un mode préféré, ledit gène est compris à
l'intérieur de l'élément transposable Ds. Le transposon Ds utilisé est décrit dans la publication de Yoder et al., (1993). L'élément Ds est un élément Ac qui a subi d'importantes mutations ou délétions dans la séquence codant la transposase. I1 ne peut s'exciser de son site d'insertion qu'en présence d'une source de transposase active Ac. I1 est donc Ac dépendant. Un système préféré d'élimination de gène marqueur de sélection peut comprendre deux composantes .
- une première plante ne possédant aucune transposase actïve, dans laquelle un construit comprenant la cassette d'expression du gène d'intérêt et celle du gène codant un agent de sélection encadré par les séquences mobilisables d'un transposon peut y être intégré
- une deuxième plante contenant dans son génome un gène codant une transposase active endogène.
Le croisement de ces deux plantes conduit à
l'obtention de régénérants, obtenus à partir de plantes F1 ou de plantes F2 sélectionnëes pour la présence du gène d'intérêt sans gène marqueur de sélection.
La transformation de cellules végétales peut être réalisée par diverses méthodes telles que, par exemple, le transfert du polynucléotide d'intérêt dans les protoplastes végétaux après incubation de ces derniers dans une solution

7 de polyéthylène-glycol en présence de cations divalents (Ca 2+), l'ëlectroporation (FROMM et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 82, 5824, 1985), l'utilisation d'un canon à particules, notamment selon la méthode décrite par FINER et al. (Plant Cell Report, 11, 323-328, 1992), ou la micro-injection cytoplasmique ou nucléaire (NEUHAUS et al., Theor. Appl.
Genet. , 75 (1) , 30-36, 1987) .
On peut aussi infecter les cellules végétales par un hôte cellulaire bactérien comprenant le vecteur contenant le polynucléotide d'intérêt. L'hôte cellulaire peut être Agrobacterium tumefaciens (AN et al., Plant Physiol., 81, 86-91, 1986), ou A. rhizogenes (GUERCHE et al., Mol. Gen.
Genet., 206, 382, 1987). Dans ce cas, de manière préférentielle, la transformation des cellules végétales est réalisée par le transfert de la région T du plasmide circulaire extrachromosomique inducteur de tumeurs Ti d'A.
tumefaciens, en utilisant un système binaire (WATSON et al., ADN recombinant, Ed. De Boeck Université, 273-292, 1994).
Pour la transformation des monocotylédones, on pourra également appliquer par exemple la méthode décrite par ISHIDA et a1. (Nature Biotechnology, 14, 745-750, 1996).
La résistance au stress photo-oxydant des plantes transformées selon l'invention, par rapport aux plantes témoins, peut être appréciée à partir de diverses méthodes de mesures morphologiques, physiologiques et/ou biochimiques, pour des conditions de stress particulières.
L'invention concerne également les plantes transgéniques obtenues par un procédé conforme à l'invention, ainsi que les descendants de ces plantes. L'invention englobe également les produits obtenus à partir de ces plantes, tels qu'organes ou tissus végétaux, cellules, semences etc.
Les plantes transgéniques hybrides, obtenues par le croisement d'au moins une plante selon l'invention avec une autre, font aussi partie de l'invention.
La présente invention peut également être mise en ouvre dans le cadre de la sëlection de plantes possédant une résistance améliorée au stress photo-oxydant.

8 Elles présentent un intérêt tout particulier dans le cadre de la sëlection assistée par marqueurs (SAM), qui permet de mettre en ceuvre les techniques de rétrocroisements accélérés consistant à utiliser la liaison existant entre un marqueur moléculaire et un gène d'intérêt agronomique, en l'occurrence codant pour une ELIP, pour transférer celui-ci dans différents génotypes afin de leur apporter une résistance accrue au stress photo-oxydant.
La présente invention peut également être mise en ceuvre pour suivre l'intégration d'un allèle du gène ELIP
favorable à la résistance au stress photo-oxydant, par exemple dans le cadre de techniques d'introgression par croisements successifs entre plantes présentant cet allèle.
La présente invention peut également être utilisée dans le cadre d'études phylogénétiques, de la caractérisation de relations génétiques parmi les variétés végétales, de l'identification de croisements ou d'hybridations somatiques, de la localisation de segments chromosomiques affectant les caractères monogéniques, du clonage basé sur les cartes génétiques, et de l'identification de QTL (Quantitative Trait Loci) et/ou de PQL (Protein Quantitative Loci).
La présente invention a ainsi pour objet l'utilisation d'au moins une protéine de la famille SLIP, ou d'un anticorps dirigé contre ladite protéine, ou d'un polynucléotide représentant tout ou partie du gène de ladite protéine pour l'évaluation de la résistance d'une plante au stress photo-oxydant.
Dans ce cadre, l'invention a en particulier pour objet un procédé d'évaluation de la résistance d'une plante à
un stress photo-oxydant, caractérisé en ce que l'on soumet ladite plante à un stress photo-oxydant, et en ce que l'on détermine le niveau d'expression par ladite plante d'au moins une protéine de la famille SLIP.
Pour soumettre une plante à un stress photo-oxydant, on la place dans des conditions environnementales qui favorisent la production d'espèces actives de l'oxygène par la lumière. Ces conditions peuvent par exemple être

9 obtenues en soumettant la plante à une très forte lumière, éventuellement combinée au froid, et/ou à la sécheresse, et/ou à une carence minérale.
Le niveau d'expression des protéines de la famille ELIP peut être évalué par exemple par quantification des transcrits d'un ou plusieurs gènes ELIP ; cette évaluation peut s'effectuer aisément, par différentes techniques connues en elles-mêmes, par exemple à l'aide d'oligonucléotides dérivés des séquences de ces gènes.
I1 peut également être évalué par dosage direct de la ou des protéine (s) SLIP concernée (s) , en utilisant par exemple les techniques classiques de dosage immunologique, de type ELISA, transfert ïmmunoëlectrophorétique, etc.
Des anticorps anti-SLIP utilisables pour la mise en ouvre de ce procédé peuvent être obtenus facilement par les méthodes classiques de préparation d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux, en immunisant un animal avec une protéine ELIP extraite de plantes, ou bien produite par génie génétique.
On peut également identifier des allèles des gènes SLIP favorables à la résistance au stress photo-oxydant, à partir de lignées de plantes déjà connues pour présenter naturellement une résistance élevée à ce type de stress. Ces allèles peuvent être isolés et séquencés et leurs séquences comparées avec celles des gènes ELIP provenant de variétés moins tolérantes, afin d'identifier des polymorphismes associés à ces allèles, par exemple des polymorphismes situés au niveau de la séquence codante ou du promoteur du gène. Des sondes et/ou des amorces nucléotidïques permettant la détection de ces polymorphismes peuvent ensuite être utilisés pour sélectionner des plantes possédant ces allèles favorables.
Les méthodes conformes à l'invention d'identification de plantes possédant une résistance accrue au stress photo-oxydant, peuvent être mises en ouvre notamment dans le cadre de la sélection assistée par marqueurs, ou pour le suivi de l'introgression dans des plantes d'un caractère de résistance au stress photo-oxydant.

La présente invention peut être mise en ouvre chez toutes les espèces de plantes dans lesquelles un accroissement de la résistance au stress photo-oxydant est souhaitable. Il peut s'agir de dicotylédones ou de 5 monocotylédones, notamment de céréales, de plantes ornementales, ou de plantes destinées à l'alimentation humaine ou animale, etc. Elle présente un intérêt tout particulier dans le cas des plantes d'origine tropicale ou sub-tropicale (par exemple le maïs, le concombre et la

10 tomate) qui sont très sensibles aux dommages causés par le stress photo-oxydant lorsqu'elles sont cultivées sous des climats froids.
La présente invention sera mieux comprise à
l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs montrant la capacité des protéines ELIP à augmenter la résistance de plantes à un stress photo-oxydant.
EXEMPLE 1 . TRANSPORT DES EhIPs AUX MEMBRANES DES THYhAKOòDES
PAR I~A VOIE CPSRP
Les Inventeurs ont étudié le transport des ELIPs chez un double mutant déficient pour les sous-unités cpSRP43 et 54 de la voie cpSRP.
I- Obtention du double mutant chaoseffc 1) Croisement de 2 simples mutants chaos et ffc Deux mutants d'llrabidopsis thaliana sont utilisés .
- le simple mutant chaos déficient pour la sous-unité cpSRP43 du complexe de transport cpSRP de part l'insertion d'un êlément Ds à l'extrémité 3' de la région codante du gène chaos (KLIMYUK et al., Plant Cell, 11, 87-99, 1999) .
- le simple mutant ffc déficient pour la sous-unité cpSRP54 du complexe de transport cpSRP de part l' insertion d' un fragment d' ADN de 10 kb dans l' intron 8 du gène ffcl-2 (AMIN et al., Plant Physiol., 121, 61-71, 1999), Un croisement entre les simples mutants chaos et ffc produit une génération F1 de type sauvage.

11 Des doubles mutants (chaos/ffc) déficients pour les sous-unités cpSRP54 et 43 sont sélectionnés à partir de la génëration F2.
2) Sélection des doubles mutants chaos/ffc Les protëines membranaires d'Arabidopsis thaliana de type sauvage (WT), simple mutant (ffc, chaos) et double mutant (chaos/ffc) sont extraites comme décrit par GILLET et al. (Plant. J., 16, 257-262, 1998) et leur concentration est dosée en utilisant la méthode de Lowry (Sigma-Aldrich).
10 E.tg de chacun des extraits de protéines membranaires sont séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en condition dénaturante et transférées sur des membranes de nitrocellulose comme décrit par AMIN et al, 1999, précité.
Les membranes sont ïncubées avec des anticorps anti-cpSRP43 (dilution au 1:10 000) et anti-cpSRP54 (dilution 1:2 500) couplés à la phosphatase alcaline, puis révélées par le ligand de la phosphatase alcaline. Les résultats sont représentés dans la Figure 3.
Légende de la Figure 3 ligne cpSRP43 = détection par anticorps anti-cpSRP43 ligne cpSRP54 = détection par anticorps anti-cpSRP54 piste WT = type sauvage piste chaos = simple mutant chaos (cpSRP43-) piste ffc = simple mutant ffc (cpSRP54-) piste chaos/ffc = double mutant chaos/ffc (cpSRP43-/cpSRP54-) Les résultats révèlent une bande correspondant à
la présence de la sous-unité cpSRP43 chez le WT et le simple mutant ffc, et une bande correspondant à la présence de la sous-unité cpSRP54 chez le WT et le simple mutant chaos.
Les résultats montrent que les effets des mutations chez les simples mutants ffc et chaos sont additifs chez le double mutant ffc/chaos. Le double mutant chaos/ffc est déficient pour les sous-unités cpSRP 43 et 54 (double mutation cpSRP43-/cpSRP54-) .

12 II- Caractérisation du double mutant ffc/chaos Après une germination in vitro des graines à
23/17°C (jour/nuit), pendant une photopériode de 8 heures/jour, les jeunes plantes de 2 semaines sont transférées dans le sol, dans une chambre de croissance à
23/17°C (jour/nuit), sous une densité de flux de photons de 300 ~mol/m~/seconde, avec une photopériode de 8 heures/jour et 60/85 d'humidité.
Toutes les analyses sont effectuées sur, des feuilles collectées au stade végétatif, avant la floraison (stade de la rosette).
1) Analyse phénotypique Les simples mutants chaos et ffc présentent une chlorose vert pâle due à la perte de pigments photosynthétiques.
Les doubles mutants chaos/ffc contiennent beaucoup moins de pigments que l'un ou l'autre des simples mutants et de ce fait apparaissent plus jaunes que ces derniers.
2) Analyses physiologiques a) Analyse des pigments photosynthétiques Des disques de 0,8 cm de diamètre sont découpés dans les feuilles issues de plants d'Arabidopsis de type sauvage(WT), simple mutant (chaos, ffc) et double mutant (chaos/ffc) puis congelés dans l'azote liquide.
Les pigments photosynthétiques sont analysés par HPLC selon le procédé décrit par HAVAUX et TARDY (Plant Physiol., 113, 913-923, 1996). Les résultats sont représentés dans la Figure 4.
Légende de la Figure 4 En abscisse .
ffc/chaos = double mutant cpSRP54-/cpSRP43-ffc = simple mutant cpSRP54-chaos = simple mutant cpSRP43-WT = sauvage

13 PCT/FR03/00673 En ordonnée . pigments photosynthétiques (ng/mm~) 0 - chlorophylle a O - chlorophylle b D - néoxanthine ~ - violaxanthine, anthéraxanthine, zéaxanthine D - lutéine - J3-carotène Les résultats montrent que les simples mutants chaos et ffc ont perdu respectivement 40~ et 60â de leurs pigments photosynthétiques. Le double mutant chaos/ffc présente une diminution de 85ô des chlorophylles, une diminution de 67~ des caroténoïdes et une diminution de 87~
du (3-carotène. Toutefois, la diminution de ces pigments n'altère pas le rapport chlorophylle a/b, lequel est similaire chez les doubles mutants chaos/ffc et le contrôle WT (2,0~0,1).
b) Analyse de l'ultrastructure des chloroplastes et des thylakoïdes Des échantillons de feuille d'environ 1 mm~ sont fixés comme décrit par CARDE et al. (Biol. Cell, 44, 315-324, 1982). Les micrographes de ces échantillons sont réalisés avec un microscope électronique à transmission CM10 ou TECNAI
(FEI) à 80 kV.
Les micrographes électroniques des chloroplastes des doubles mutants chaos/ffc révèlent une diminution considérable de la taille des grana et des lamellae par rapport au WT, contrairement à l'ultrastructure chloroplastique des simples mutants ffc et chaos qui n'est pas altérée. Néanmoins, la taille et le nombre des chloroplastes par cellule déterminés par microscopie confocale ne sont pas différents du WT. De ce fait, la diminution de la pigmentation chez le double mutant est associée à un défaut de développement des membranes des thylakoïdes.

14 c) Analyse de la concentratïon en chlorophylle dans les systèmes photosynthétiques I et II (PSI et PSII) Les spectres d'émission de fluorescence de la chlorophylle de suspensions de membranes de thylakoïdes sont enregistrés dans l'azote liquide (77 K).
Les membranes des thylakoïdes sont préparées comme déprit par ROBINSON et YOKUM (Biochem. Biophys. Acta, 590, 97-106, 1980), et la concentration en chlorophylle des préparations membranaires est déterminée dans 80ô d'acétone (ARNON, Plant Physiol., 24, 1-15, 1949).
Les spectres d'émission de fluorescence de la chlorophylle sont mesurés à l'aide d'un spectrofluorimètre à
fibres optiques (Perkin-Elmer LS50B) en utilisant les préparations de thylakoïdes diluées à des concentrations en chlorophylle de 50 ~,g/ml dans 20 mM HEPES/NaOH, 3 mM MgCl2, pH 7,5. Les spectres d'émissïon de fluorescence de la chlorophylle présentent généralement 3 pics distincts . pics à X80 nm et 690 nm dus à la chlorophylle a associée au PSII
(apoprotéines CP43 et CP47 de la chlorophylle a des antennes internes de PSII avec une contribution des protéines LHCII), et pic à 730 nm du à la chlorophylle a associée principalement au PSI (protéines LHCI) (GOVINDJEE, Aust. J.
Plant Physiol., 22, 131-160, 1995).
Les membranes des thylakoïdes (400 Vil) sont congelées dans l'azote liquide et l'émission de fluorescence de la chlorophylle est excitée à 440 nm. Les résultats sont représentés dans la Figure 5.
Légende de la Figure 5 En abscisse . longueur d'onde (nm) En ordonnée . intensité de fluorescence relative - - type sauvage (WT) +++ = double mutant cpSRP43-/cpSRP54- (chaos/ffc) Les résultats montrent que les spectres d'émission de fluorescence de la chlorophylle présentent 3 pics distincts à environ 680 nm (F680), 690 nm (F690) et 730 nm (F730). Les pies F680 et F690 sont attrïbués aux chlorophylles associées au photosystème PSII. Le pic F730 est attribué aux molécules de chlorophylle associëes principalement au système photosynthétique PSI. Les résultats montrent également que le pic de fluorescence PSI (F730) est significativement réduit chez le double mutant chaos/ffc par 5 rapport au WT, contrairement aux bandes de fluorescence PSII
(pics F680 et F690), suggérant une diminution drastique des protéines LHCIs en comparaison de PSII.
L'efficacité photochimique maximale de PSII est déterminée in vivo en mesurant la fluorescence de la l0 chlorophylle (Fv/Fm) dans les feuilles adaptées à l'obscurité
pendant 30 minutes, à température ambiante, comme précédemment décrit par KLIMYUK et al., 1999, précité. Les résultats sont représentés dans la Figure 6a.
Légende de la Figure 6a

15 En abscisse .
wT = type sauvage chaos = simple mutant cpSRP43-ffc = simple mutant cpSRP54' chaos/ffc = double mutant cpSRP43-/cpSRP54-En ordonnée . efficacitë photochimique . Fv/Fm (obscurité) Ces résultats montrent que le paramètre de fluorescence Fv/Fm du double mutant (chaos/ffc) est proche de celui mesuré dans les feuilles du type sauvage (WT) et des simples mutants (chaos, ffc), indiquant que le photosystème PSII est correctement assemblé et photochïmiquement compétent chez le double mutant.
Le rendement quantique réel de la photochimie de PSII (~) dans des feuilles exposées à la lumière est évalué
en présence de densités croissantes de flux de photons. Les résultats sont représentés dans la Figure 6b.
Légende de la Figure 6b En abscisse . densité de flux de photons (~mol/m~/sec) En ordonnée . rendement quantique ~ - type sauvage (WT) t - simple mutant cpSRP43' (chaos) - simple mutant cpSRP54' (ffc) - double mutant cpSRP43'/cpSRP54' (chaos/ffc)

16 Les résultats montrent que 1e rendement quantique de la photochimie de PSII du double mutant est très différent des autres génotypes (WT, simples mutants), ïndiquant un transport photosynthétique d'électrons dans les feuilles du double mutant rapidement saturé à mesure que la densité du flux de photons augmente, jusqu'à un rendement quantique de PSII presque nul à une densité d'environ 500 ~,mol/m2/sec. Le transport d'électrons n'est pas inhibé dans le simple mutant chaos par rapport au WT (rendements quantiques similaires), alors que le simple mutant ffc présente un transport d'électrons intermédiaïre entre celui du WT et celui du simple mutant chaos.
L'ensemble de ces résultats indique chez le double mutant, un blocage du transport d'électrons à un site différent du système PSII, suggérant que ce transport est limité par 1e faible taux de complexes PSI.
3) Analyses biochimiques a) Analyse du taux de LHCPs et d'ELIPs L'analyse du contenu en LHCPs et en ELIPs est réalisée chez des plantes au stade rosette, en conditions normales (CC . densité de flux de photons de 300 ~mol/mz/sec) ou soumises à un stress lumineux (LL . densité de flux de photons de 5 ~mol/m2/sec ; HL . densité de photons de 500-1000 ~mol/m2/sec, respectivement).
2 5 .LHCPs Les protéines membranaires sont extraites et analysées par Western blot comme décrit au paragraphe I- 2).
Les échantillons de protéines membranaires sont déposés sur le gel à 2 ou 3 concentrations différentes pour assurer une linéarité de l'immunodétection colorimétrique. Chaque expérience est répétée au moins 3 fois.
Dans une première série d'expériences, le taux en LHCPs est évalué chez les plantes en conditions normales (CC) .
La dilution des sérums polyclonaux utilisés est indiquée entre parenthèses suivie des quantités de protéine membranaire chargées sur le gel . anti-Lhca1 (1:3000)

17 5/3,5/2,5 ~g ; anti-Lhca2 (1:200) 5/3,5/2,5 ~g ; anti-Lhca3 (1:1000) 2,5/1,5/0,75 ~.g ; antï-Lhca4 (1:3000) 10/7/5 ~g ;
anti-Lhcb1 (1:5000) 1/0,5/0,2 ~g ; anti-Lhcb2 (1 :1000) 1,5/1/0,75 ~.g ~ anti-Lhcb3. (1:30) 3/2/1,5 mg ~ antï-Lhcb4 (1:2500) 2,5/1/0,5 ~g ~ anti-Lhcb5 (1:100) 1,5/1/0,75 mg ;
anti-Lhcb6 (1:750) 6/4/3 ~g. Les résultats sont représentés dans les figures 7a et 7b.
Légende des Figures 7a et 7b pistes 1 à 3 = type sauvage (WT) pistes 4 à 6 = double mutant (chaos/ffc) (a) ligne Lhca1 = détection par des anticorps anti-Lhca1 ligne Lhca2 = détection par des anticorps anti-Lhca2 ligne Lhca3 = détection par des anticorps anti-Lhca3 ligne Lhca4 = détection par des anticorps anti-Lhca4 (b) ligne Lhcb1 = détection par des anticorps anti-Lhcb1 ligne Lhcb2 = détection par des anticorps anti-Lhcb2 ligne Lhcb3 = détection par des anticorps anti-Lhcb3 ligne Lhcb4 = détection par des anticorps anti-Lhcb4 ligne Lhcb5 = détection par des anticorps anti-Lhcb5 ligne Lhcb6 = détection par des anticorps anti-Lhcb6 Les résultats montrent qu'en conditions normales tous les contenus en LHCPs testées sont diminués par la double mutation cpSRP43-/cpSRP54-, à l'exception de la protéine Lheb4 dont le contenu représente environ 130 de celui du WT. Les protéines Lhcal, Lhca3 et Lhcb3 ne sont plus détectées dans le double mutant chaos/ffc. Les protéines Lhca4, Lhcb2 et Lhcb5 sont détectées à l'état de trace, n'excédant pas 10~ du contenu du WT. Les protéines Lhca2, Lhcbl et Lhcb6 sont détectées à un taux équivalent à 50% du contenu du WT.
Dans une seconde série d'expériences, le contenu en protéines Lhcb1 et Lhcb3 a été évalué chez les plantes en conditions normales (CC) et en condition de stress lumineux (LL) .
La dilution des sérums utilisés est indiquée (entre parenthèses) suivie des quantités de protéines membranaires chargées sur gel . anti-Lhcb1 (1 :5000) 1/0,2

18 ~g ~ anti-Lhcb3 (1 :30) 3/1,5 ~.tg. Les résultats sont représentés dans la Figure 7c.
Légende de la Figure 7c pistes 1 à 4 = type sauvage (WT) pistes 5 à 8 = double mutant (chaos/ffe) pïstes 1, 2, 5 et 6 - croissance en conditions de stress lumineux (LL) pistes 3, 4, 7 et 8 = croissance en conditions normales (CC) ligne Lhcb1 = détection par anticorps anti-Lhcb1 ligne Lhcb3 = détection par anticorps anti-Lhcb3 Les résultats montrent que le WT présente une légère diminutïon du contenu en LHCPs lorsque l'intensité
lumineuse décroît. En revanche, le double mutant présente des contenus en protéine Lhcb3 indétectables quelle que soit l'intensité lumineuse, et le contenu en protëine Lhcbl, bien que légèrement augmenté quand l'intensité lumineuse est faible, demeure toujours inférieur à celui du WT à la même intensité lumineuse.
Ces résultats montrent que la diminution du ~0 contenu en LHCPs est due à l'absence des sous-unités cpSRP43 et 54 et non à un effet secondaire généré chez 1e double mutant par un stress lumineux.
EZIPs La teneur en ELIPs a été évaluée chez les plantes en conditions normales (CC) et en condition de stress lumineux (HL).
L'extraction et la quantification des protéines sont réalisées comme décrit par P~TTER et KLOPPSTECH, Eur. J.
Biochem., 214, 779-786, 1993.
La détection des ELIPs à deux concentrations (20 et 0,5 ~g) est effectuée en utilisant un sérum de lapin anti-ELIP dilué au 1:2000 et un anticorps secondaire de chèvre anti-lapin couplé à la phosphatase alcaline (Sigma, Munich, Allemagne). Les résultats sont représentés dans la Figure 8.

19 Légende de la Figure 8 pistes 1 à 4 = type sauvage (WT) pistes 5 à 8 = double mutant (chaos/ffc) pistes 1, 2, 5 et 6 = croissance en conditions normales (CC) pistes 3, 4, 7 et 8 - croissance en conditions de stress lumineux (HL) Les résultats montrent que très peu d'ELIPs sont détectées chez le double mutant chaos/ffc par rapport au WT, et ce quelle que soit l'intensité lumineuse.
L'ensemble de ces résultats indique que la double mutation cpSRP43-/cpSRP54- affecte de façon similaire le contenu en LHCPs et en ELIPs, et que la voie cpSRP est impliquée dans le transport des LHCPs et des ELIPs vers les membranes des thylakoïdes.
b) Analyse du taux de protéines importées par les voïes autres que cpSRP
Outre la voie cpSRP, il existe 3 autres voies de transport des protéines du stroma vers les membranes des thylakoïdes ou le lumen . les voies ~pH, Sec, et d'insertion spontanée.
L'influence de la double mutation cpSRP43-/cpSRP54- est évaluée par la détection à l'aide d'anticorps spécifiques de protéines importées spécifiquement par chacune de ces voies . la protéine OE23 transportée par la voie ~pH, les protéïnes psbS et psbW transportëes par la voie d'insertion spontanée et la protéine PC transportée par la voie Sec. L'influence de la double mutation est également évaluée vis à vis de la protéine d'enveloppe chloroplastique (E37) et un composant de la machinerie de transport chloroplastique (ClpC).
La dilution des sérums polyclonaux utilisés est indiquée (entre parenthèse) suivie des quantités de protéine membranaire chargées sur le gel . anti-E37 (1 :6000) 10/5/2 ~.g, anti-ClpC (1 :4000) 5/3,5/2 ~.g, anti-PC (1 :5000) 10/5/2 ~.g, anti-OE23 (1 :10000) 3/1,25/0,5 ~.g, anti-psbS (1 :4000) 10/5/2 ~g, anti-psbW (1 :2000) 60/40/30 ~.g. les résultats sont représentés dans les Figures 9a, 9b, 9c et 9d.

Légende de la Figure 9a ligne E37 = détection par anticorps anti-E37 ligne Clpc = détection par anticorps anti-Clpc pistes 1 à 3 = type sauvage (WT) 5 pistes 4 à 6 = double mutant cpSRP43-/cpSRP54- (chaos/ffc) Les résultats montrent un excès de 30~ des protéines E37 et Clpc chez le double mutant chaos/ffc par rapport au WT.
Légendes des Figures 9b, 9c et 9d pistes 1 à 3 = type sauvage (WT) 10 pistes 4 à 6 = double mutant cpSRP43-/cpSRP54- (chaos/ffc) (a) ligne OE23 = détection par anticorps anti-OE23 (b) ligne psbS = détection par anticorps anti-psbS
ligne psbW = détection par anticorps anti-psbW
(c) ligne PC = détection par anticorps anti-PC
15 Les résultats montrent, pour les 3 voies de transport OpH, Sec et d'insertion spontanée, des quantités plus élevées de protéines importées spécifiquement par chacune de ces voies chez le double mutant, en comparaison du WT.

20 Ces résultats montrent que les voies de transport vers les thylakoïdes ou le lumen, autres que la voie cpSRP, ne sont pas affectées par la double mutation.
III- CONCLUSION
Les ELIPS ne sont pas présentes chez le double mutant. Elles sont également absentes chez le simple mutant cpSRP43. En revanche, elles sont présentes chez le simple mutant cpSRP54, et ce, à un niveau comparable au WT (niveau normal).
D'après les résultats des précédentes analyses, la sous-unité cpSRP43 est impliquée dans 1e transport des ELIPs jusqu'aux membranes des thylakoïdes.
De plus, l'étude des taux de LHCPs et d'ELIPs, par les analyses physiologiques et biochimiques montrent le rôle indépendant mais additif des sous-unités du complexe cpSRP.

21 Ces résultats montrent que l'importation dans les membranes des thylakoïdes des ELIPs s'effectue de façon prédominante, voire exclusive, par la voie cpSRP.
Analyses biochimiques . Le taux de LHCPs baisse de moitié chez les simples mutants, et est pratiquement nul chez les doubles mutants.
Le taux d'ELIPs est pratiquement nul chez le double mutant, ainsi que chez le simple mutant cpSRP43-.
Les protéines acheminées par les 3 autres voies (insertion spontanée, OpH, et Sec) sont présentes à des taux comparables au WT chez le double et les simples mutants.
Analyses microscopiques . Le nombre et la forme des chloroplastes sont les mêmes chez les mutants et le WT.
La structure des thylakoïdes est affectée uniquement chez le double mutant. On n'observe pas de différence notable entre le simple mutant cpSRP43- et le WT.
La photosynthèse chez le simple mutant cpSRP 43-n'est pas inhibée, contrairement à celle du double mutant cpSRP43-/cpSRP54-Une très faible quantité d'ELIPs est trouvée chez le double mutant, indiquant que la voie cpSRP est impliquée dans le transport de ces protéines vers les membranes des thylakoïdes. Le simple mutant chaos affecté pour les LHCPs intègre également moins d'ELIPs. Ainsi, 1a double mutation affecte les LHCPs et les ELIPs.
EXEMPLE 2: hE ROhE DES EhIPs DANS hA RESISTANCE AU STRESS
PHOTO-OXYDANT
I- Choix d'un modèle d'étude le mutant c SRP43 1) I,e mutant chaos (cpSRP43-) Le simple mutant chaos a été identifié au sein d'une population constituée de 217 lignées indépendantes d'Arabidopsis thaliana d'écotype Landsberg erecta contenant un élément dérivé de l'élément transposable de la dissociation du maïs (Ds). L'auto-pollinisation d'une plante de la lignée 348/74/A conduit à une descendance présentant un phénotype de mutant chlorotique récessif (KLIMYUK et al., Pol. Gen. Genet., 249, 357-365, 1995). Le mutant a été nommé

22 chaos. üne pâle coloration est observée tout au long du cycle végétatif de la plante et affecte uniformément tous les tissus aériens.
2) Analyse du contenu en ELIPs en conditions de stress photo-s oxydant Des plantes âgées de 4 à 5 semaines, portant la simple mutation cpSRP43' (mutant chaos) sont soumises à un stress lumineux (1000 ~mol/m2/sec) associé à un stress froid (6-7°C) pendant 4 jours, avec une photopériode de 8 heures/jour. Les protéines membranaires sont extraites et 10 ~g sont analysés par Western blot tel que décrit au paragraphe I- 2) de l'Exemple 1. Les résultats sont représentés dans 1a Figure 10.
Légende de la Figure 10 piste M = marqueur de poids moléculaire (kDa) piste 1 = protéines membranaires du WT
piste 2 = protéines membranaires du mutant chaos Les résultats montrent qu'au cours du stress, le contr~le sauvage accumule les ELIPs contrairement au mutant chaos qui est presque totalement dépourvu d'ELIPs.
Par contre, les ELIPs sont toujours présentes chez les mutants cpSRP54' (résultat non représenté).
3) Observations des lignées cpSRP43' (mutant chaos) et cpSRP54- (mutant ffc) en conditions de stress photo-oxydant Les analyses des lignées sont réalisées chez des plantes au stade rosette, en conditions normales (50 ~.mol/m2/sec à 23°C) ou soumises à un stress lumineux (1000 ~mol/m2/sec) associé à un stress froid à 6-7°C.
a) Analyse phénotypique des mutants chaos et ffc En conditions normales, les mutants chaos et ffc présentent une couleur vert pâle en comparaison du WT.
En conditions de stress, on remarque l'apparition de pigments anthocyanes chez le WT et le mutant ffc.
En revanche, on remarque chez le mutant chaos l'apparition de nécroses et de taches blanches, indiquant une sensibilité au stress oxydant.

23 b) Analyse biochimique des mutants chaos (cpSRP43-) et ffc (cpSRP54-) Les résultats phénotypiques sont confirmés par des expériences de mesure de la thermoluminescence de la chlorophylle à l'aide d'un tube photomultiplicateur d'Hamamatsu (R36) comme décrit par HAVAUX, Israel J. Chem., 38, 246-256, 1998.
Les échantillons de feuilles adaptés à
l'obscurité pendant 15 minutes sont chauffés de 25 à 170°C, à
un rythme de 7°C/minute. Les résultats sont représentés dans la Figure 11.
Légende de la Figure 11 En abscisse . température (°C) En ordonnée . thermoluminescence (au = unités arbitraires) W = type sauvage chaos = simple mutant cpSRP43' (2 mutants alléliques) ffc = simple mutant cpSRP54' Les résultats montrent que la thermoluminescence du simple mutant ffc est similaire à celle du WT. En revanche, la thermoluminescence de 2 simples mutants alléliques chaos est considérablement augmentée par rapport au WT.
Les résultats indiquent que le mutant ffc est résistant au stress photo-oxydant au même titre que le WT. En revanche, le mutant chaos est sensible au stress photo-oxydant.
4) Contrôle de la nature du stress Les mêmes expériences ont été réalisées en absence d'oxygène.
Les résultats montrent une disparition des symptômes décrits précédemment au paragraphe 3) de l'Exemple 2. Ce contrôle confirme que c'est bien un stress oxydant qui est la cause de tels symptômes. Ces résultats suggèrent donc une corrélation entre la sensibilité au stress oxydant et l'absence d'ELIPs.

24 II- Surexpression des EZIPs dans le mutant cpSRP43 Pour démontrer la relation entre la présence d'ELIPs et la résistance au stress photo-oxydant la complémentation spécifique en ELIPs de la lignée dépourvue de sous-unité cpSRP 43 (mutant chaos) a été effectuée. Cette expérience a été menée à bien grâce à la surproduction d'ELIPs chez le mutant chaos (cpSRP 43-).
1) Vecteurs et prëparation des constructions utilisëes A partir de deux clones génomiques d'Arabidopsis thaliana (numéros d'accession GenBank AB022223 et 297336), les séquences codant pour deux ELIPs, ELIP1 et ELIP2, respectivement, sont amplifiées par RT PCR en utilisant les amorces suivantes .
Amorces pour ELIP1 en 3' CGGGATCCTTTAGCTTTAGACTAGAGTCCC (SEQ ID NO . 12) en 5' ATAAGAATGCGGCCGCCATGCAGTCAGTTTTCGCTGCT (SEQ ID NO . 13) Amorces pour ELIP2 en 3' CGGGATCCATTCATGGGCAAATCGTATTAA (SEQ ID NO . 14) en 5' ATAAGAATGCGGCCGCAATGGCAACAGCATCGTTCAAC (SEQ ID NO . 15) Les séquences soulignées conduisent à l'insertion du site de restriction BamHI (G/GATCC) en 3' et du site de restriction NotI (GC/GGCCGC) en 5' des fragments de PCR.
Les principales étapes du clonage sont schématisëes dans 1a Figure 12.
Chacun des fragments de PCR est intégré dans le vecteur pRT-S2/NotI/Ascl, qui dérive du vecteur pRT 100 comme décrit par ÜBERLACKER et WERR (Molecular Breeding, 2, 293-295, 1996), en aval du promoteur 35S . P35S~ELIP1 (E1) et P35S~ELIP2 (E2). Une fois que la construction chimérique est créée dans pRT-S~/NotI/AscI, elle est associée à un marqueur de sélection (gène de résistance à l'hygromycine). Les fragments E1 et E2 flanqués par des sites de restriction AscI
sont liés au site unique SmaI, préalablement converti en site AscI, du vecteur pGPTV, et permettent ainsi le transfert de la totalité de la cassette d'expression dans le vecteur binaire (pGPTV-E1 et pGPTV-E2).

2 ) Transformation d' Arabidopsis La transformation d'Arabidopsis thaliana déficiente en cpSRP43 (mutant chaos) par la construction pGPTV-El ou pGPTV-E2 est réalisée via Agrobacterium 5 tumefaciens, par infiltration sous vide (CLOUGH et BENT, The Plant Journal, 16, 735-743, 1998). La plupart des descendants (transformants chaos) sont génétiquement uniformes (non chimériques) et la variation clonale associée à la culture de tissus et leur régénération est minimisée. La descendance 10 transformée est hémizygote pour le transgène à un locus donné.
3) .Analyse biochimique du contenu en EhIPs de transformants chaos Le niveau d'expression des ELIPs en absence de 15 stress dans des transformants chaos comprenant la construction 35S-ELIP2 a été estimé par Western bloc.
Les résultats sont représentés dans la Figure 13.
Légende de la Figure 13 piste M = marqueur de poids moléculaire (kDa) 20 piste 1 = mutant chaos pistes 2 et 3 - transformants chaos E2-3 et E2-4, respectivement ; la bande correspondant aux ELIPs est indiquée par une flèche.
Les résultats montrent que les 2 transformants

25 sont capables d'accumuler les ELIPs contrairement au mutant chaos. Ils indiquent également que le transformant E2-4 (piste 3) accumule plus d'ELIPs que le transformant E2-3 (piste 2). Bien que la voie principale ait besoin de protéines chaos, une surexpression avec un promoteur fort conduit à une accumulation d'ELIPs.
4) Observations des transformants chaos a) Analyse phénotypique Des plants âgés de 4 à 5 semaines du mutant chaos et des deux transformants chaos E2-3 et E2-4, sont soumis à
un stress lumineux (1000 ~mol/m2/sec) associé à un stress

26 froid (6-7°C) pendant 4 jours, avec une photopériode de 8 heures/jour.
En conditions de stress froid/lumière, on peut remarquer une gamme de résistance corrélëe au niveau d'expression des ELIPs.
Cette gamme se caractérise par des nécroses et des taches blanches chez les plantes sensibles (mutants chaos), qui diminuent chez les plantes transgéniques ayant acquis une résistance intermédiaire (transformant E2-3) jusqu'à disparaître chez le transformant E2-4 ce qui témoigne de la restauration de la résistance au stress photo-oxydant.
Ces rësultats indiquent que les transformants chaos comprenant la construction 35S-ELIP2 sont capables de développer une résistance au stress froid/lumière, et que cette résistance est fonction du niveau d'expression du transgène.
b) Analyse biochimique L'analyse de la thermoluminescence de la chlorophylle chez des transformants chaos comprenant la construction 35S-ELIP2 est réalisée comme décrit au paragraphe I- 3) b) de l'Exemple 2.
Les résultats sont représentés dans la Figure 14.
Légende de la Figure 14 En abscisse . température (°C) En ordonnée . thermoluminescence (au = unités arbitraires) wt = type sauvage cao = mutant chaos E1-11, E2-1, E1-4, E2-3, E2-4 - transformants à différents niveaux d'expression d'ELIPs (E1-11<E2-1<El-4<E2-3<E2-4).
Les résultats montrent que la thermoluminescence de la chlorophylle est maximale (>2000) pour le mutant chaos sensible au stress photo-oxydant et minimale (<5000) pour le WT résistant au stress photo-oxydant. Les transformants chaos E1-11, E2-1, E1-4 et E2-3 présentent une thermoluminescence variable comprise entre 1400 et 6000, indiquant une résistance partielle au stress photo-oxydant.
Seul le transformant E2-4 présente une thermoluminescence

27 égale à celle du WT, indiquant une réapparition d'une résistance au stress photo-oxydant du type WT.
Ces résultats confirment que l'expression des SLIP confère une résistance au stress photo-oxydant.
5) Modèle proposé
Ces résultats sont en accord avec l'une des hypothèses de fonction des ELIPs qui piègeraient les chlorophylles a libres, empêchant ainsi la production d'espèces actives d'oxygène, et procurant de ce fait une protection contre la photo-oxydation. Ce modèle est représenté dans la Figure 15.
6) Activité des photosystèmes L'activité du photosystème II (PSII) est évaluée par la mesure de la fluorescence de la chlorophylle (Fv/Fm) comme décrit au paragraphe II- 2) c) de l'Exemple 1. Les résultats sont représentés dans la Figure 16.
Légende de la Figure 16 En abscisse . type sauvage (wt), mutant chaos (chaos), transformants chaos (E1-11, E2-l, E2-3, E1-4 et E2-4) En ordonnée . Rendement quantique maximum de la photochimie du PSII mesuré par le paramètre de fluorescence (Fv/Fm) Les résultats montrent l'efficacité photochimique du PSII pour le WT. Les transformants E1-11 et E2-1 ont une activité photochimique du PSII similaire à celle du mutant chaos (environ 0,3) ; les transformants E1-4 et E2-3 ont une activité photochimique du PSTI intermédiaire (environ 0,5) ;
seul le transformant E2-4 possède une activité photochimique du PSII comparable à celle du WT (environ 0,6).
Ces résultats indiquent que la présence d'ELIPs préserve les photosystèmes.
EXEMPLE 3 Transformation du maïs - Surexpression des ELIPs chez le maïs Afin de conférer aux plantes de maïs une meilleure résistance au stress photo-oxydant et/ou au froid, les gènes d'Arabidopsis codants pour les ELIPs (ELIP 1 et/ou SLIP 2) sous contrôle d'un promoteur constitutif fort sont

28 introduits et exprimés de manière ectopique chez le maïs transformé et régénéré.
I- Vecteurs et préparation des constructions utilisées A partir de deux clones génomiques d' Arabidopsis thaliana (numéros d'accession GenBank AB022223 et 297336), les séquences codant pour deux ELIPs, ELIP1 et ELIP2, respectivement, sont amplifiées par RT-PCR en utilisant les amorces suivantes .
Amorces pour ELIP1 en 3' CGGGATCCTTTAGCTTTAGACTAGAGTCCC (SEQ ID NO . 12) en 5' ATAAGAATGAATTCATGCAGTCAGTTTTCGCTGCT (SEQ ID N0 . 16) Amorces pour ELIP2 en 3' CGGGATCCATTCATGGGCAAATCGTATTAA (SEQ ID N0 . 14) en 5' ATA.AGAATGAATTCAATGGCAACAGCATCGTTCAAC (SEQ ID NO . 17) Les séquences soulignées conduisent à l'insertion du site de restriction BamHI (GJGATCC) en 3' et du site de restriction EcoRI (G/AATTC) en 5' des fragments de PCR.
Les princïpales étapes du clonage sont schématisées dans la Figure 17.
Chacun des fragments de PCR est intégré en aval du promoteur CsVMV entre les sites EcoRI et BamHI du vecteur pBIOS 432 et en amont du terminateur polyA NOS dans un vecteur de type pBluescriptII de Stratagene. Il s'agit de remplacer le gène existant entre le promoteur et le terminateur du plasmide pBIOS 432 par le gène SLIP-E1 ou SLIP-E2. Une fois ces constructions chimériques réalisëes, elles sont associées à un marqueur de sélection (gène de résistance à la kanamycine). Pour cela les cassettes promoteur CsVMV - ELIP E1 ou E2 - terminateur polyA NOS sont isolées en tant que fragments Xba1 (site rendu bout franc par la klenow) et XhoI et introduites dans le vecteur pBIOS 340 digéré par les enzymes Pme I (à bouts francs) et Xho I, puis déphosphorylé à la SAP. Le vecteur pBIOS 340 est un vecteur contenant les séquences plasmidiques du vecteur pSBl2 (Japan Tobacco, EP 672 752) et la cassette élément Ds - promoteur Actine - intron actine - gène NPTII - terminateur Nos -élément Ds (Demande PCT WO 02/101061). Ainsi sont générés les

29 vecteurs pBIOS 340-CsVMV-ELIP-E1 et pBIOS 340-CsVMV-SLIP-E2 qui serviront à la génération du vecteur « super-binaire a>
utilisé pour la transformation du maïs par Agrobacterium.
Le vecteur utilisé pour la transformation du maïs par Agrobacterium tumefaciens se présente sous la forme d'un plasmide superbinaire d'environ 50 kb.
Le vecteur superbinaire utilisé pour la transformation contient .
- une région ori . origine de réplication plasmidique Col EI, nécessaire au maintien et à la multiplication du plasmide dans Escherichia coli. Cette origine de rëplication n'est pas fonctionnelle dans Agrobacterium tumefaciens, - une origine de réplication fonctionnelle dans Agrobacterium tumefaciens et dans Eschericia coli, - la région cos du bactériophage lambda, pouvant présenter une utilité pour la manipulation du vecteur in vitro, - les régions vira, virC et vire supplémentaires d'Agrobacterium tumefaciens qui augmentent l'effïcacité de transformation, - les gènes de résistance à la tétracycline (Tetra) et à la spectinomycine (Spect) qui s'expriment uniquement dans les bactéries, - un ADN-T porteur des gènes SLIP E1 ou E2, et NptII inséré dans un élément Ds, conférant la résistance à la kanamycine, ces deux gènes étant opérationnellement liés à
des éléments permettant leur transcription. Dans le présent exemple, le gène ELIP E1 ou E2 est sous le contrôle du promoteur CsVMV et du terminateur polyA de NOS ; le gène NptII inséré dans un élément Ds étant sous le contrôle du promoteur Actine et du premier intron et du terminateur polyA
de Nos.
Le gène NptII a été isolé à partir du transposon Tn5 d'Escherichia coli (BERG et al., Genetics, 105, 813-828, 1983). Ce gène onde pour l'enzyme néomycine phosphotransférase de type II qui catalyse la 0 phosphorylation d'antibiotiques aminoglycosides tels que néomycine, kanamycine, gentamycine et 6418 (DAVIES et SMITH, Annu. Rev. Microbiol., 32, 469-518, 1978). Ce gène confère la résïstance à la kanamycine, qui est utilisée comme agent de sélection lors de la transformation génétique végétale. Il 5 est décrit par Bevan et al. (Genbank n°U00004).
Ce vecteur superbinaire est obtenu par recombinaison homologue d'un plasmide accepteur pSB1 (EP 672 752) dérivé d'un plasmide Tï d'Agrobacterium tumefaciens avec les plasmides donneurs pBIOS 340-CsVMV-SLIP-El ou pBIOS 340-10 CsVMV-ELIP-E2 dérivés de pUC (MESSING, Methods Enzymol., 101, 20-78, 1983).
II- Transformation du maïs La transformation du maïs est effectuée selon le protocole décrit par ISHIDA et al (Nature Biotechnology, 14, 15 745-750, 1996), notamment à partir d'embryons immatures prélevés 10 jours après la fécondation. Tous les milieux utilisés sont référencés dans la référence citée. La transformation débute avec une phase de co-culture où les embryons immatures des plantes de maïs sont mis en contact 20 pendant au moins 5 minutes avec Agrobacterium tumefaciens LBA
4404 contenant les vecteurs superbinaires. Le plasmide superbinaire est le résultat d'une recombinaison homologue entre un vecteur intermédiaire porteur de l'ADN-T contenant le gène d'intérêt et/ou le marqueur de sélection dérivé des 25 plasmides décrits dans les exemples précédents, et le vecteur pSB1 de Japan Tobacco (EP 672 752) quï contient . les gènes vira et vire du plasmide pTiBo542 présent dans la souche supervirulente A281 d'Agrobacterium tumefaciens (ATCC 37349) et une région homologue retrouvée dans le vecteur

30 intermédiaire permettant cette recombinaison homologue. Les embryons sont ensuite placés sur milieu LSAs pendant 3 jours à l'obscurité et à 25°C. Une première sélection est effectuée sur les cals transformés . les cals embryogènes sont transférés sur milieu LSD5 contenant de la phosphinotricine à
5 mg/1 et de la céfotaxime à 250 mg/1 (élimination ou limitation de la contamination par Agrobacterium tumefaciens) . Cette étape est menée 2 semaines à l' obscurité

31 et à 25°C. La deuxième étape de sélection est réalisée par transfert des embryons qui se sont développés sur milieu LSD5, sur milieu LSD10 (phosphinotricine à 10 mg/1) en présence de cëfotaxime, pendant 3 semaines dans les mêmes conditions que précédemment. La troisième étape de sélection consiste à exciser les cals de type I (fragments de 1 à 2 mm) et à les transférer 3 semaines à l'obscurité et à 25°C sur milieu LSD 10 en présence de céfotaxime.
La régénération des plantules est effectuée en excisant les cals de type I qui ont proliféré et en les transférant sur milieu LSZ en présence de phosphinotricine à
5 mg/1 et de céfotaxime pendant 2 semaines à 22°C et sous lumière continue.
Les plantules ayant régénéré sont transférées sur milieu RM + G2 contenant 100mg/1 d'Augmentin°
(amoxicilline/acide clavulanique) pendant 2 semaines à 22°C
et sous illumination continue pour l'étape de développement.
Les plantes obtenues sont alors transférées au phytotron en vue de leur acclimatation.
La descendance transformée est hémizygote pour le transgène à un locus donné.
Afin d'identifier les plantules résistantes à la kanamycine et donc ayant intégré 1e transgène, une étape de sélection (test goutte cornet) est effectuée avec une solution de kanamycine de concentration 500 mg/1 additionnée de 1~ de Tween. 2 à 3 gouttes de cette solution sont appliquées sur les plantes de maïs au stade 4-5 feuilles.
L'analyse des plantes s'effectue 5 jours après l'application de la kanamycine. Les plantes sensibles présentent l'apparition de zones blanchâtres (mort des tissus chlorophylliens). Les plantes résistantes ne présentent pas l'apparition de zones blanchâtres 5 jours après l'application de la kanamycine.
Caractérisation moléculaire des transformants La méthodologie Southern (1975) est utilisée pour démontrer l'insertion du transgène dans le génome de la

32 plante et pour évaluer le nombre de copies et caractériser le profil d'intégration.
L'ADN génomique est extrait à partir des feuïlles des plantes suivant un protocole d'extraetïon au CTAB, selon le protocole de Keller J (DNAP 6701 San Pablo Ave Oakland CA
94608 USA) modifié par Bancroft I. (Department of Molecular, Genetics, Cambridge Laboratory, John Innes Center for Plant Science Research, Colney lane, Norwich, England). L'ADN
obtenu est digéré par l'enzyme de restriction NcoI, séparé
par électrophorèse sur gel d'agarose et transféré sur membrane hybond N+ puis hybridé avec des sondes radioactives (sonde CsVMV et sonde intron-actine. Les transformants sont ainsi caractérisés.
Les plantules résistantes à la kanamycine, ayant donc intégré le transgène présentent une résistance accrue au stress photo-oxydant.
Le gène codant l'agent de sélection (gène NptTI) est avantageusement éliminé selon le système d'élimination Ac/Ds (Demande PCT W0 02/101061).

SEQUENCE LISTING
<l10> CEA
BIOGEMMA
NUSSAUME, Laurent HAVAUX, Michel HUTIN, Claire <l20> UTILISATION DE PROTÉINES ELIP POUR ACCROITRE LA RÉSISTANCE DES
VÉGÉTAUX AU STRESS PHOTO-OXYDANT
<130> MJPbv1468-2 <150> FR 02/02623 <l51> 2002-03-Ol <160> 17 <170> PatentIn version 3.1 <2l0> l <211> l56 <212> PRT
<2l3> Oryza sativa <400> 1 Met Ala Ala A1a Thr Met Ala Leu Ser Ser Ser Phe Ala Ala Val A1a A1a Ala Ala Gly Gly Ala Pro Trp Arg Ala Ala Val Arg Phe Pro Pro Arg Arg Arg Val Ala Leu Val Val Arg A1a Gln Ala Glu Pro Glu Val Glu Pro Thr Lys Glu Glu Thr Ala Thr Ser Ser Ser Pro Thr Pro Ser Pro Ala Ala Ala Ala Pro Arg Ala Lys Pro Ala A1a Ser Thr Gly Leu Trp Asp Val Leu Ala Phe Ser G1y Pro Ala Pro Glu Arg Ile Asn Gly Arg Leu Ala Met Val Gly Phe Val Ser Ala Leu Ala Val Glu A1a Ser 100 105 l10 Arg G1y Gly Gly Leu Leu Arg Pro Ala Ala Gly Thr Gly Ser Arg Gly ll5 l20 125 Ser Pro Pro Pro Pro Pro Cys Ser Pro Arg Arg Arg Trp Cys Arg Cys Ser Ala Ala Arg Ala Arg Arg Arg Gly Ala Ala Ala <210> 2 <211> 164 <212> PRT

<313> Oryza satina <400> 2 Met Ala Val A1a Thr Met Ala Leu Ser Ser Ser Phe Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser A1a Pro Trp Arg Gly Val Val Ala Ala Gly Arg Ala Ala Val Gly Phe Pro Pro Arg Arg Arg Ala Ala Ala Leu Val Val Arg Ala Gln Ala Glu Pro Glu Val Glu Pro Thr Lys Glu Glu Ala Ala Thr Ser Ser Ser Pro Thr Pro Thr Pro Ser Pro Ala Ala Ala Ala Pro Arg Ala Lys Pro Ala Ala Ser Thr Gly Leu Trp Asp Val Leu Ala Phe Ser Gly Pro Ala Pro Glu Arg Ile Asn Gly Arg Leu A1a Met Val Gly Phe Val Ser Ala Leu Ala Val Glu Ala Ser Arg Gly Gly Gly Leu Leu Arg Pro A1a Ala Gly Ala Gly Ser Arg Gly Ser Pro Pro Pro Pro Pro Cys Ser Pro Arg Arg Arg Trp Cys Arg Cys Ser Ala Ala Arg Ala Arg Arg Arg 145 150 155 16d Gly Ala Ala Ala <310> 3 <311> 195 <313> PRT
<313> Arabidopsis thaliana <400> 3 Met A1a Thr Ala Ser Phe Asn Met Gln Ser Val Phe Ala Gly Gly Leu Thr Thr Arg Lys Ile Asn Thr Asn Lys Leu Phe Ser Ala Gly Ser Phe Pro Asn Leu Lys Arg Asn Tyr Pro Val Gly Val Arg Cys Met A1a Glu Gly Gly Pro Thr Asn Glu Asp Ser Ser Pro Ala Pro Ser Thr Ser Ala Ala Gln Pro Leu Pro Lys Ser Pro Ser Pro Pro Pro Pro Met Lys Pro ~5 70 75 80 Lys Val Ser Thr Lys Phe Ser Asp Leu Leu Ala Phe Ser Gly Pro Ala Pro Glu Arg Ile Asn Gly Arg Leu Ala Met Val Gly Phe Val Ala Ala Leu Ala Val G1u Leu Ser Lys Gly Glu Asn Val Leu Ala Gln Ile 5er Asp Gly Gly Val Ser Trp Phe Leu Gly Thr Thr Ala Ile Leu Thr Leu Ala Ser Leu Val Pro Leu Phe Lys Gly Ile Ser Val Glu Ser Lys Ser Lys Gly Ile Met Thr Ser Asp Ala Glu Leu Trp Asn Gly Arg Phe Ala Met Leu Gly Leu Val Ala Leu Ala Phe Thr Glu Phe Val Lys Gly Gly Thr Leu Va1 <210> 4 <211> 193 <212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana <400> 4 Met Ala Thr Ala Ser Phe Asn Met Gln Ser Val Phe Ala Ala Pro Ser Gly Val Leu Thr Thr Arg Asn Ile Arg Asn Thr Asn Gln Leu Phe Phe Lys Arg Ile A1a Pro Val G1y Val Arg Cys Met A1a Gln Gly Asp Pro I1e Lys Glu Asp Pro Ser Val Pro 5er Thr Ser Thr Ser Ala Thr Pro Pro Gln Met Pro Gln Ser Pro Pro Pro Pro Val Ser Lys Pro Lys Val Ser Thr Lys Phe Gly Asp Leu Leu Ala Phe Ser Gly Pro Ala Pro Glu Arg I1e Asn Gly Arg Leu Ala Met Va1 Gly Phe Val Ala Ala I1e Ala Met G1u Leu Ser Lys Gly Glu Asn Val Phe Ala Gln Ile Ser Asp Gly Gly Val Gly Trp Phe Leu Gly Thr Thr Ala Leu Leu Thr Leu Ala 5er Met Val Pro Leu Phe Lys Gly Ile Arg Ala Glu Ala Lys Ser Lys Gly Phe Met Thr Ser Asp Ala Glu Leu Trp Asn Gly Arg Phe Ala Met Leu Gly Leu Val A1a Leu Ala Phe Thr Glu Tyr Val Thr Gly Gly Thr Leu Val <210> 5 <211> 182 <212> PRT
<213> Zea mays <400> 5 Met Ala Thr Thr Val Met Ala Ser Ala Thr Ala Ser Ser Pro Ala Phe Ser Ala Pro Gly Pro Arg Gln Ala Ala Arg Leu Pro Ala Gly Phe Arg Gly Arg Val Ala Ala Arg Arg Ala Ala Ser Cys Cys Ser Pro Gly Pro Pro Ser Arg Pro Met Thr Leu Pro Pro Thr Arg Ala Arg Ala Ala Pro Ala Ala Arg Lys Leu Gly Leu Trp Asp Ala Leu Ala Phe Ser Gly Pro Ala Pro Glu Arg Ile Asn Gly Arg Leu Ala Met Val Gly Phe Val Ser Ala Leu Ala Val Glu Ala Thr Arg Gly Asp Gly Ile Leu Ser Pro Gly Asn Gly Ala Gly Leu Ala Trp Phe Ala Tyr Thr Ala Ala Val Leu Ser Ala Ala Ser Leu Val Pro Leu Leu Gln G1y Glu Ser Ala Glu Gly Arg Ser Gly Arg Phe Met Thr Ala Asp Ala Glu Leu Trp Asn Gly Arg Phe Ala Met Leu Gly Leu Val Ala Leu Ala Va1 Thr Glu Tyr Leu Thr Gly 165 170 l75 Ala Pro Phe Val Asn Val <210> 6 <211> 169 <212> PRT
<213> Zea mays <400> 6 Ser Ala Pro Arg Arg Ala Pro Ala Arg Arg Pro Ala Ser Gly G1y Val Pro Arg Pro Cys Arg Arg Arg Arg Ala Ala Ser Arg Cys Ser Pro Gly Pro Pro Ser Arg Pro Met Thr Leu Pro Pro Thr Arg Ala Arg Ala Arg Arg Arg Leu Leu Gly Ser Trp Gly Ser Gly Asp Ala Leu Ala Phe Ser G1y Pro Ala Pro Glu Arg Ile Asn Gly Arg Leu Ala Met Val Gly Phe Val Ser Ala Leu Ala Val Glu Ala Thr Arg Gly Asp Gly Ile Leu Ser Gln Ala G1y Asn Gly Ala Gly Leu Ala Trp Phe Ala Tyr Thr Ala Ala Val Leu Ser Ala Ala Ser Leu Val Pro Leu Leu Gln Gly Glu Ser A1a Glu Gly Arg Ser Gly Arg Phe Met Thr Ala Asp Ala Glu Leu Trp Asn Gly Arg Leu Ala Met Leu Gly Leu Val Ala Leu Ala Val Thr Glu Tyr Leu Thr Gly Ala Pro Phe Val Asn Val <210> 7 <211> 189 <212> PRT
<213> Triticum aestivum <400> 7 Met Thr Thr Met Val Ala Leu Ser Ser Phe Ala Gly Ala Ala Val Val Gly Arg Pro Ser Ser Trp Ser Pro Ala Val Pro His Arg Arg Thr Leu Leu Val Arg Ala Gln Thr Glu Pro Asp Ile Glu Ser Thr Lys Asp Thr Thr Ser Ala Ser Thr Ser Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Ser Pro Val Ala Pro Lys Pro Lys Pro Lys Ala Asn Pro Ser Val Trp Asp Ala Leu Ala Phe Ser Gly Pro Ala Pro Glu Arg Ile Asn G1y Arg Leu Ala Met Val Gly Phe Val Ala Ala Leu Ser Val Glu Ala Ala Arg Gly Gly Ala Leu Leu Asp Gln Ala Gly Ser Gly Ala Gly Leu Gly Trp Phe Leu Thr Thr Ala Ala Val Phe Ser Val Ala Ser Leu Va1 Pro Leu Leu Gln Gly Gln Ser Val Glu Ser Lys Ser Ser Gly Val Trp Ser Ala Asp Ala Glu Leu Trp Asn Gly Arg Phe Ala Met Leu Gly Leu Val Ala Leu Ala Val Thr Glu Phe Ile Thr Gly Thr Pro Phe Val Asn Val <210> 8 <211> 193 <212> PRT
<213> Triticum aestivum <400> 8 Ala Arg A1a Thr Met Val Ala Leu Ser Ser Phe Ala Gly Ala Ala Val Val Gly Arg Ser Ala Ser Trp Ser Pro Ala Val Pro Arg Arg Arg A1a Leu Leu Val Arg Ala Gln Thr Glu Pro Asp Val Glu Pro Thr Lys Glu Thr Met Thr Ser Ala Ser Thr Ser Ser Pro Ser Pro Thr Pro Ser Pro Ser Pro Thr Pro Val Ala Pro Lys Pro Lys Ala Lys Ala Asn Pro Ser Val Trp Asp Ala Leu Ala Phe Ser Gly Pro Ala Pro Glu Arg Ile Asn Gly Arg Leu Ala Met Val Gly Phe Va1 Ala Ala Leu Ser Va1 Glu Ala Ala Arg Gly Gly Gly Leu Leu Asp Gln Val Gly Ser Gly Ala Gly Leu Gly Trp Phe Leu Thr Thr Ala Ala Val Phe Ser Val Ala Ser Leu Va1 Pro Leu Leu Gln Gly Gln Ser Val Glu Ser Lys Ser Ser Gly Val Trp Thr Ala Asp Ala Glu Leu Trp Asn Gly Arg Phe Ala Met Leu Gly Leu Val Ala Leu Ala Val Thr Glu Phe Ile Thr Gly Thr Pro Phe Val Asn Val <210> 9 <211> 206 Ala Leu Leu Asp Gln Ala Gly Ser Gl <212> PRT
<213> Triticum aestivum <220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (197)..(197) <223> Xaa = Acide aminé non déterminé
<400> 9 Met Ala Thr Met Val Ala Leu Ser Ser Phe Ala Val Val Gly Arg Ser Ala Thr Arg Ser Pro Val Ala Ala Pro Arg Arg Arg Ala Leu Val Val Arg Ala Gln Thr Glu Pro Gly Met Glu Ser Thr Lys Glu Thr Thr Ser Ala Ser Thr Ser Ser Ser Ser Pro 5er Thr Ser Ala Ala Pro Thr Pro Ile Pro Ala Ala Pro Lys Pro Met Thr Lys Lys A1a Asn Pro Ser Val Trp Asp Ala Leu Ala Phe Ser Gly Pro Ala Pro Glu Arg I1e Asn Gly Arg Leu Ala Met Val Gly Phe Val Ala Ala Leu Thr Val Glu Ala A1a Arg Gly Gly Gly Leu Leu Asp Gln Ala Gly Ser Gly Ala Gly Leu Gly Trp Phe Leu Val Thr Gly Gly Val Phe Ser Val Ala Ser Leu Val Pro 130 l35 140 Leu Leu Gln Gly Gln Ser Val Glu Ser Lys Ser Ser Gly Phe Trp Ser Ala Asp A1a Glu Leu Trp Asn Gly Arg Phe Ala Met Leu Gly Leu Val Ala Leu Ala Arg Thr Glu Phe Ile Thr Arg Ala Pro Phe Leu Thr Ser Lys Thr Ala Tyr Xaa Ser Ala Ala Gly Ser Phe Phe Ile Ser <210> l0 <211> 202 <212> PRT
<213> Oryza sativa <400> 10 Met Ala A1a Ala Thr Met Ala Leu Ser Ser Ser Phe Ala Val A1a Ala 1 5 l0 15 Ala Ala Ala Gly Gly Ala Pro Trp Arg Gly Val Val Ser Ala Gly Arg AlaAlaPro ArgArg ArgValAla LeuValVal ArgAlaGln SerGlu ProGluVal GluPro ThrLysGlu GluThrAla ThrSerSer SerSer ProSerPro AlaThr ThrProThr ProSerPro AlaAlaAla AlaPro LysAlaLys ProA1a AlaSerThr LysLeuTrp AspValLeu AlaPhe SerG1yPro AlaPro GluArgIle AsnGlyArg LeuAlaMet ValGly PheValSer AlaLeu AlaValGlu AlaSerArg GlyGlyGly LeuLeu AspGlnAla GlySer TrpSerGly LeuAlaTrp PheAlaAla ThrAla AlaValLeu SerAla AlaSerLeu ValProLeu LeuArgGly GluThr AlaGluAla ArgSer GlyGlyVal MetSerAla AspAlaGlu LeuTrp l65 170 175 AsnGlyArg PheAla MetLeuGly LeuValAla LeuAlaPhe ThrGlu PheLeuThr GlySer ProLeuVal AsnVa1 <210> 11 <211> 211 <212> PRT
<213> Zea mays <400> 11 Met A1a Ala Thr Val Met Ala Ser Met Ser Pro Leu Ala Ser Ala Thr Pro Gly Ala Arg Arg Ala Phe Pro Val Arg Leu Leu Leu G1n Ala Ser Ala Leu Ala Pro Arg G1n Arg Ala Leu Ala Val Thr Val Arg Ala Gln Ser Asp Asp Ala Glu Ala G1u Pro Lys Glu Glu Ala Ala Ala Ala Thr Thr Pro Ala Pro Lys Ser Lys Ala Ala Ala Thr A1a Ser Pro Gly Leu Trp Asp Ala Leu Ala Phe Ser Gly Pro Ala Pro Glu Arg Ile Asn Gly Arg Leu Ala Met Val Gly Phe Val Ser Ala Leu Ala Val Glu Ala Ser Arg Gly Gly Gly Leu Leu 5er Gln Ala Gly Ser Gly Ser Gly Leu Ala 115 l20 125 Trp Phe Ala Ala Thr Ala Ala Val Leu Ser Val Ala Ser Leu Val Pro Leu Leu Arg G1y Asp Ser Ala Glu Ala Arg Ser Gly Ala Val Met Ser Ala Asp Ala Glu Leu Trp Asn Gly Arg Ser Pro Cys Ser Ala Ser Ser Arg Ser Pro Ser Leu Ser Thr Ser Pro Ala His Arg Ser Ser Thr Arg 180 l85 190 Arg Cys Val Val Tyr Phe Gly Thr Val Tyr Ala Ser Gln Leu Ala Ala Pro Cys Ala <210> 12 <211> 30 <212> DNA
<213> Artificial sequence <220>
<223> Amorce PCR
<400> 12 cgggatcctt tagctttaga ctagagtccc 30 <210> 13 <211> 38 <212> DNA
<213> Artificial sequence <220>
<223> Amorce PCR
<400> 13 ataagaatgc ggccgccatg cagtcagttt tcgctgct 38 <210> 14 <211> 30 <212> DNA
<213> Artificial sequence <220>
<223> Amorce PCR
<400> 14 cgggatccat tcatgggcaa atcgtattaa 30 <210> 15 <211> 38 <212> DNA

<213> Artificial sequence <220>
<223> Amorce PCR
<400> 15 ataagaatgc ggccgcaatg gcaacagcat cgttcaac 38 <210> l6 <211> 35 <212> DNA
<213> Artificial sequence <220>
<223> Amorce PCR
<400> 16 ataagaatga attcatgcag tcagttttcg ctgct 35 <210> 17 <211> 36 <212> DNA
<213> Artificial sequence <220>
<223> Amorce PCR
<400> 17 ataagaatga attcaatggc aacagcatcg ttcaac 36

Claims (10)

REVENDICATIONS

1) Utilisation d'au moins une protéine de la famille SLIP, ou d'un polynucléotide codant pour ladite protéine pour l'obtention de plantes présentant une résistance accrue au stress photo-oxydant.

2) Procédé pour accroître la résistance d'une plante au stress photo-oxydant, caractérisé en ce qu'il comprend la transformation de ladite plante par au moins un polynucléotide codant pour une protéine de la famille ELIP, et l'expression de ladite protéine dans ladite plante.

3) Plante transgénique susceptible d'être obtenue par un procédé selon la revendication 2.

4) Plante transgénique selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une céréale.

5) Produit obtenu à partir d'une plante transgénique selon une quelconque des revendications 3 ou 4, choisi parmi les organes ou tissus végétaux, les cellules et les semences.

6) Utilisation d'au moins une protéine de la famille ELIP, ou d'un anticorps dirigé contre ladite protéine, ou d'un polynucléotide représentant tout ou partie du gène de ladite protéine, pour l'évaluation de la résistance d'une plante au stress photo-oxydant.

7) Procédé d'évaluation de la résistance d'une plante à un stress photo-oxydant, caractérisé en ce que l'on soumet ladite plante à un stress photo-oxydant modéré, et en ce que l'on détermine 1e niveau d'expression par ladite plante d'au moins une protéine de la famille SLIP.

8) Procédé selon la revendication 7, caractérisé
en ce que le niveau d'expression de ladite protéine de la famille ELIP est déterminé par quantification des transcrits du gène codant pour ladite protéine.

9) Procédé selon la revendication 7, caractérisé
en ce que le niveau d'expression de ladite protéine de la famille ELIP est déterminé par dosage immunologique de ladite protéine.

10) Utilisation d'au moins une protéine de la famille ELIP, ou d'un anticorps dirigé contre ladite protéine, ou d'un polynucléotide représentant tout ou partie du gène de ladite protéine, pour la sélection de plantes résistantes au stress photo-oxydant.