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CA2325599A1 - Novel nep ii membrane metalloprotease and its use for screening inhibitors useful in therapy - Google Patents

Novel nep ii membrane metalloprotease and its use for screening inhibitors useful in therapy Download PDF

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CA2325599A1
CA2325599A1 CA002325599A CA2325599A CA2325599A1 CA 2325599 A1 CA2325599 A1 CA 2325599A1 CA 002325599 A CA002325599 A CA 002325599A CA 2325599 A CA2325599 A CA 2325599A CA 2325599 A1 CA2325599 A1 CA 2325599A1
Authority
CA
Canada
Prior art keywords
nep
polypeptide
sequence
seq
tissue
Prior art date
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Abandoned
Application number
CA002325599A
Other languages
French (fr)
Inventor
Tanja Ouimet
Claude Gros
Christiane Rose
Marie-Chantal Bonhomme
Patricia Facchinetti
Jean-Charles Schwartz
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of CA2325599A1 publication Critical patent/CA2325599A1/en
Abandoned legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6489—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

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Abstract

The invention concerns an isolated polypeptide comprising an amino acid sequence selected among the sequence SEQ ID n· 2 or n· 4, a sequence derived from or homologous with said sequence SEQ ID n· 2 or n· 4, or a biologically active fragment of said sequence SEQ ID n· 2 or n· 4, said isolated polypeptide being designated as "NEP II", and the use of said NEP II polypeptide for screening inhibitors useful in therapy.

Description

" Nouvelle métalloprotéase membranaire NEP II et son utilisa-tion pour Ie criblage d'inhibiteurs utiles en thérapie".
La présente invention a pour objet une nouvelle métalloprotéase membranaire appelée NEP II et son utilisation, notamment pour le criblage d'inhibiteurs utiles en thérapie.
Les métalloprotéases membranaires telles que la néprilysine (NEP I, EC 3.4.24.11 ) jouent un rôle important dans l'activation ou l'inactivation des messagers peptidiques neuronaux ou hormonaux. Leur inhibition sélective par des composés synthétiques a déjà conduit â des medicaments couramment utilisés en thérapeutique ou en cours de développement clinique, to notamment dans les domaines gastroentérologique (Baumer et coll., Gut, 1992, 33 : 753-758) et cardiovascuiaire (Gros et coll., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 1991, 88 : 4210-4214). L'isolement des ADNc de gènes de nouvelle métalloprotéases apparentées est de nature à permettre le développement de nouvelles classes d'inhibiteurs spécifiques à applications thérapeutiques t> prometteuses. C'est ainsi que le clonage et l'expression du gène de l'enzyme de conversion de l'endothéline (ECE) (Xu et coll., Cell, 1994, 78 : 473-485) a permis la mise au point d'inhibiteurs potentiellement utiles dans certaines affections cardiovasculaires. "New NEP II membrane metalloprotease and its use for the screening of inhibitors useful in therapy ".
The present invention relates to a new metalloprotease membrane called NEP II and its use, especially for screening inhibitors useful in therapy.
Membrane metalloproteases such as neprilysine (NEP I, EC 3.4.24.11) play an important role in the activation or inactivation neuronal or hormonal peptide messengers. Their selective inhibition by synthetic compounds has already led to drugs commonly used in therapy or during clinical development, to especially in the gastroenterological fields (Baumer et al., Gut, 1992, 33: 753-758) and cardiovascular (Gros et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 1991, 88: 4210-4214). Isolation of cDNAs from New Genes related metalloproteases is likely to allow the development of new classes of specific inhibitors for therapeutic applications t> promising. This is how the cloning and expression of the gene for the enzyme of endothelin conversion (ECE) (Xu et al., Cell, 1994, 78: 473-485) a allowed the development of potentially useful inhibitors in some cardiovascular conditions.

2« Les auteurs de la présente invention ont mis en évidence une nouvelle métalloprotéase membranaire appartenant à la famille ECEINEP/Kell (Lee S. et coll., 1991, PNAS 88(14):6353-57), qu'ils ont appelée NEP II.
La présente invention a donc pour objet un polypeptide isolé
comprenant une séquence d'acides aminés choisie parmi la séquence SEQ ID
?s n°2 ou SEQ ID n° 4, une séquence dérivée ou homologue de ladite séquence SEQ ID n°2 ou SEQ ID n° 4, ou un fragment biologiquement actif de ladite séquence SEQ ID n°2 ou SEQ ID n° 4, ledit polypeptide isolé
étant désigné
par «NEP ll ».
La séquence SEQ ID n° 2 est la séquence d'acides aminés de NEP II identifiée chez le rat.
La séquence SEQ ID n° 4 est une séquence (partielle) d'acides aminés de NEP II identifiée chez l'homme.

Par polypeptide "dérivé", on entend tout polypeptide résultant d'une modification de nature génétique et/ou chimïque de la séquence SEQ ID
n° 2 ou SEQ ID n° 4, c'est-à-dire par mutation, délétion, addition, substitution etlou modification chimique d'au moins un acide aminé, ou toute isoforme ayant une séquence identique à la séquence SEQ ID n° 2 ou SEQ ID
n° 4 mais contenant au moins un acide aminé sous la forme D.
Lesdites substitutions sont de préférence des substitutions conservatives, c'est-à-dire des substitutions d'acides aminés de même classe, tels que des substitutions d'acides aminés aux chaînes latérales non chargées m (tels que l'asparagine, la glutamine, la serine, la thréonine, et la tyrosine), d'acides aminés aux chaînes latérales basiques {tels que la lysine, l'arginine, et l'histidine), d'acides aminés aux chaînes latérales acides (tels que l'acide asp'artique et l'acide glutamique) ; d'acides aminés aux chaïnes latérales r apolaires (tels que la glycine, l'alanine, la valine, la leucine, l'isoleucine, la i~ profine, la phénylalanine, la méthionine, fe tryptophane, et la cystéine).
Par polypeptide "homologue", on entend plus particulièrement tout polypeptide isolable chez d'autres espèces de mammifères que le rat ou l'homme.
Lesdits polypeptides homologues présentent préférentiellement ?u une homologie de séquence supérieure à 70 %, de préférence encore supérieure à 75 %, avec la séquence SEQ ID n° 2 ou SEQ ID n° 4 complète, l'homologie étant particulièrement élevée dans la partie dudit polypeptide, contenant le site actif.
L'homologie est généralement déterminée en utilisant un logiciel ?~ d'analyse de séquence (par exemple, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Des séquences d'acides aminés similaires sont alignées pour obtenir le maximum de degré d'homologie (i.e. identité). A cette fin, il peut ëtre nécessaire d'introduire de manière n~ artificielle des espaces (« gaps ») dans la séquence. Une fois l'alignement optimal réalisé, le degré d'homologie (i.e. identité) est établi par enregistrement de toutes les positions pour lesqueües les acides aminés des _, deux séquences comparées sont identiques, par rapport au nombre total de positions.
Lesdits polypeptides dérivés, homologues ou les fragments polypeptidiques du pofypeptide de séquence SEQ ID n° 2 ou SEQ ID
n° 4 sont biologiquement actifs, c'est-à-dire présentent des propriétés biologiques identiques ou similaires des propriétés biologiques du polypeptide NEP II de séquence SEQ ID n° 2 ou SEQ ID n° 4, à savoir une activité
métalloprotéasique.
Les fragments polypeptidiques préférés comprennent la io séquence du site actif responsable de la liaison de l'atome de zinc indispensable à la catalyse. Ce site actif a été identifié comme englobant les résidus HEX,XZH, X, et XZ représentant des acides aminés variables. II s'agit en particulier de la séquence HEITH (acides aminés 608 à 612 de la séquence SEQ ID n° 2) dans le polypeptide NEP II chez le rat et l'homme.
ta La présente invention a également pour objet un acide nucléique isolé comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi la séquence SEQ
ID n°1 ou SEQ ID n° 3, une séquence dérivée ou homologue de ladite séquence SEQ ID n°1 ou SEQ ID n° 3, ou leurs séquences complémentaires.
La séquence SEQ ID n° 1 est la séquence d'ADNc comprenant fa 2u phase codante pour NEP II identifiée chez le rat.
La séquence SEQ ID n° 3 est la séquence d'ADNc comprenant (partiellement) la phase codante pour NEP II identifiée chez l'homme.
Par séquence nucléotidique "dérivée", on entend toute séquence nucléotidique codant pour un polypeptide dérivé de NEP II tel que défini 2~ précédemment, c'est-à-dire une séquence résultant d'une modification de la séquence SEQ ID n° 1 ou SEQ ID n° 3, notamment par mutation, délétion, addition ou substitution d'au moins un nucléotide. Sont en particulier comprises les séquences dérivées de la séquence SEQ ID n° 1 ou SEQ ID
n° 2 “The authors of the present invention have demonstrated a new membrane metalloprotease belonging to the ECEINEP / Kell family (Lee S. et al., 1991, PNAS 88 (14): 6353-57), which they called NEP II.
The present invention therefore relates to an isolated polypeptide comprising an amino acid sequence chosen from the sequence SEQ ID
? sn ° 2 or SEQ ID n ° 4, a sequence derived or homologous to said sequence SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 4, or a biologically fragment active of said sequence SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 4, said isolated polypeptide being designated with "NEP ll".
The sequence SEQ ID No. 2 is the amino acid sequence of NEP II identified in rats.
The sequence SEQ ID No. 4 is a (partial) sequence of acids NEP II amines identified in humans.

By "derived" polypeptide is meant any resulting polypeptide a modification of a genetic and / or chemical nature of the sequence SEQ ID
n ° 2 or SEQ ID n ° 4, i.e. by mutation, deletion, addition, substitution andor chemical modification of at least one amino acid, or any isoform having a sequence identical to the sequence SEQ ID No. 2 or SEQ ID
# 4 but containing at least one amino acid in the D form.
Said substitutions are preferably substitutions conservatives, i.e. substitutions of amino acids of the same class, such as amino acid substitutions for uncharged side chains m (such as asparagine, glutamine, serine, threonine, and tyrosine), amino acids with basic side chains {such as lysine, arginine, and histidine), amino acids with acid side chains (such as acid asp'artic and glutamic acid); amino acids to the side chains r apolar (such as glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, the i ~ profine, phenylalanine, methionine, fe tryptophan, and cysteine).
By "homologous" polypeptide is meant more particularly any polypeptide that can be isolated from mammalian species other than the rat or the man.
Said homologous polypeptides preferably have - a sequence homology greater than 70%, more preferably greater than 75%, with the sequence SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 4 complete, the homology being particularly high in the part of said polypeptide, containing the active site.
Homology is usually determined using software sequence analysis (for example, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Acid sequences similar amines are aligned to obtain the maximum degree of homology (ie identity). To this end, it may be necessary to introduce n ~ artificial gaps in the sequence. Once the alignment optimal achieved, the degree of homology (ie identity) is established by recording of all the positions for which the amino acids of _, two compared sequences are identical, compared to the total number of positions.
Said derived polypeptides, homologs or the fragments polypeptides of the pofypeptide of sequence SEQ ID No. 2 or SEQ ID
n ° 4 are biologically active, i.e. have biological properties identical or similar to the biological properties of the NEP II polypeptide from sequence SEQ ID n ° 2 or SEQ ID n ° 4, namely an activity metalloprotease.
Preferred polypeptide fragments include io sequence of the active site responsible for the binding of the zinc atom essential for catalysis. This active site has been identified as encompassing HEX, XZH, X, and XZ residues representing variable amino acids. It's about in particular of the HEITH sequence (amino acids 608 to 612 of the sequence SEQ ID No. 2) in the NEP II polypeptide in rats and humans.
ta The present invention also relates to a nucleic acid isolated comprising a nucleotide sequence chosen from the sequence SEQ
ID # 1 or SEQ ID # 3, a sequence derived or homologous to said sequence SEQ ID n ° 1 or SEQ ID n ° 3, or their sequences complementary.
The sequence SEQ ID No. 1 is the cDNA sequence comprising fa 2u coding phase for NEP II identified in rats.
The sequence SEQ ID No. 3 is the cDNA sequence comprising (partially) the coding phase for NEP II identified in humans.
By "derived" nucleotide sequence is meant any sequence nucleotide encoding a NEP II-derived polypeptide as defined 2 ~ previously, that is to say a sequence resulting from a modification of the sequence SEQ ID n ° 1 or SEQ ID n ° 3, in particular by mutation, deletion, addition or substitution of at least one nucleotide. Are in particular including the sequences derived from the sequence SEQ ID No. 1 or SEQ ID
n °

3 par dégénérescence du code génétique.
Par séquence "homologue", on entend plus particulièrement toute séquence nucléotidique codant pour un polypeptide NEP II homologue WO 99/53077 ~ PCT/FR99/00807 du polypeptide NEP II de séquence SEQ ID n° 2 ou SEQ ID n° 4 chez d'autres espèces de mammifères que le rat ou l'homme.
Une telle séquence homologue présente préférentiellement une homologie supérieure à 70 %, de préférence encore supérieure à 75 %, avec la séquence SEQ ID n° 1 ou SEQ ID n° 3, l'homologie étant particulièrement élevée dans la partie centrale de la séquence codant pour le polypeptide NEP
De manière préférentielle, une telle séquence nucléotidique homologue hybride spécifiquement aux séquences complémentaires de la m séquence SEQ ID n° 1 ou n° 3, dans des conditions stringentes.
Les paramètres définissant les conditions de stringence dépendent de la température à laquelle 50% des brins appariés se séparent (Tm).
Pour les séquences comprenant plus de 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm=81,5+0,41(%G+C)+16,6Log(concentration en cations) -m 0,63(%formamide) -(600/nombre de bases) (Sambrook et al, Molecular Cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, 1989, pages 9.54-9.62).
Pour les séquences de longueur inférieure à 30 bases, Tm est définie par fa relation : Tm= 4(G+C) + 2 (A+T).
Zu Dans des conditions de stringence appropriées, auxquelles les séquences aspécifiques n'hybrident pas, la température d'hybridation est approximativement de 5 à 30°C, de préférence de 5 à 15°C en dessous de Tm, de préférence encore de 5 à 10°C en dessous de Tm (forte stringence), et les tampons d'hybridation utilisés sont de préférence des solutions de force 2~ ionique élevée telle qu'une solution 6xSSC par exemple.
Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent ëtre utilisées pour la production d'une protéine recombinante NEP II selon l'invention, selon des techniques de production de produits recombinants îc~ connues de l'homme du métier.

WO 99/53077 ~ PCT/FR99/00807 Un système efficace de production d'une protéine recombinante nécessite de disposer d'un vecteur, par exemple d'origine plasmidique ou virale, et d'une cellule hôte compatible.
L'hôte cellulaire peut être choisi parmi des systèmes procaryotes, comme les bactéries, ou eucaryotes, comme par exemple des levures, des cellules d'insectes, de mammifères, telles que les cellules CHO (cellules d'ovaires de hamster chinois) ou tout autre système avantageusement disponible.
Le vecteur doit comporter un promoteur, des signaux d'initiation »~ et de terminaison de la traduction, ainsi que les régions appropriées de régulation de la transcription. II doit pouvoir être intégré dans la cellule et peut éventuellement posséder des signaux particuliers spécifiant la sécrétion de la protéine traduite.
Ces différents signaux de contrôle sont choisis en fonction de t~ l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi. De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un ?« hôte approprié par des méthodes standard, telles que par exemple l'électroporation.
Des exemples de vecteurs d'intérêt sont les plasmides pcDNA
3.1, PCR2.1 (Invitrogen), ou pMbac (Stratagene).
L'invention vise les vecteurs de clonage et/ou d'expression ?~ contenant une séquence nucléotidique selon l'invention, et vise en outre les cellules hôtes transfectées par ces vecteurs. Ces cellules peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes d'une séquence nucléotidique insérée dans un vecteur tel que défini ci-dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la réplication et/ou _,o l'expression de la séquence nucléotidique transfectée.
Ces cellules sont utilisables dans une méthode de production d'un polypeptide recombinant selon l'invention.

G
La méthode de production d'un polypeptide de l'invention sous forme recombinante est elle-même comprise dans la présente invention, et se caractérise en ce que l'on cultive les cellules transfectées dans des conditions permettant l'expression d'un pofypeptide recombinant selon l'invention, et que l'on récupère ledit polypeptide recombinant.
Les procédés de purification utilisés sont connus de l'homme du métier. Le polypeptide recombinant peut être purifié à partir de lysats et extraits cellulaires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes utilisées séparément ou en combinaison, telles que le fractionnement, les to méthodes de chromatographie, les techniques d'immunoaffinité à l'aide d'anticorps monoclonaux ou de sérum polyclonal, etc.
La présente invention a également pour objet les sondes nucléotidiques, capables de s'hybrider fortement et spécifiquement avec une i ~ séquence d'acide nucléique, d'un ADN génomique ou d'un ARN messager, codant pour un polypeptide selon l'invention. Les conditions d'hybridation appropriées correspondent aux conditions de température et de force ionique usuellement utilisées par l'homme du métier (Sambrook et al., 1989), de préférence à des conditions de forte stringence, c'est-à-dire des conditions de au température comprises entre (Tm moins 5° C) et (Tm moins 15°
C) et de préférence encore, à des conditions de température comprises entre Tm et (Tm moins 10° C} (forte stringence).
Les sondes préférées sont notamment les sondes oligonucléotidiques choisies parmi les séquences SEQ ID n°5 à SEQ ID
n°27.
De telles sondes sont utiles pour des réactions de séquençage ou d'amplification spécifique selon la technique dite de PCR (réaction en chaïne par polymérase) ou toute autre variante de celle-ci.
De telles sondes sont égaiement utiles dans un procédé de détection de l'expression du polypeptide NEP II dans un échantillon cellulaire .~« ou tissulaire ou dans des cellules ou un tissu par hybridation in situ, comprenant les étapes consistant à

WO 99/53077 ~ PCT/FR99/00807 - préparer TARN dudit échantillon ou desdites cellules ou dudit tissu;
- mettre en contact ledit ARN obtenu avec au moins une sonde ayant une séquence nucléotidique capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence nucléotidique selon l'invention, ladite sonde pouvant être notamment une sonde oligonucféotidique de séquence SEQ ID n° 5 à SEQ ID
n° 27 ;
- détecter la présence d'ARNm hybridant avec ladite sonde indicatrice de l'expression du polypeptide NEP II.
L'invention a également pour objet les anticorps mono- ou polyclonaux ou leurs fragments, anticorps chimériques ou immunoconjugués, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus à partir d'un polypeptide selon l'invention administré à un animal, et sont capables de reconnaître u spécifiquement un polypeptide selon l'invention. L'invention a en outre pour objet l'utilisation de ces anticorps pour la purification ou la détection d'un poiypeptide NEP II dans un échantillon biologique.
Les anticorps polyclonaux peuvent être obtenus à partir du sérum d'un animal immunisé contre la protéine NEP II, produite par exemple par 2u recombinaison génétique suivant la méthode décrite ci-dessus, selon les modes opératoires usuels.
Les anticorps monoclonaux peuvent ëtre obtenus selon la méthode classique de culture d'hybridomes décrite par Kdhler et Milstein (Nature, 1975, vol. 256, pp 495-497).
Les anticorps peuvent être des anticorps chimériques, des anticorps humanisés, des fragments Fab et F(ab')2. Ils peuvent également se présenter sous forme d'immunoconjugués ou d'anticorps marqués.
Les anticorps selon l'invention sont particulièrement utiles pour détecter la présence de NEP II.
La présente invention a donc pour objet un procédé de détection immunologique de NEP II dans un échantillon cellulaire ou tissulaire ou dans des cellules ou un tissu comprenant les étapes consistant à

- mettre en contact ledit échantillon cellulaire ou tissulaire, lesdites cellules ou ledit tissu avec un anticorps détectable selon l'invention ;
- détecter la présence dudit anticorps, indicatrice de la présence du polypeptide NEP II.
Par "anticorps détectable", on entend soit un anticorps marqué
par un groupement détectable, tel qu'un groupement radioactif, enzymatique, fluorogène ou fluorescent, etc., soit un anticorps auquel se lie un autre anticorps lui-même marqué de manière détectable.
Les anticorps selon l'invention peuvent ainsi permettre d'évaluer iu une surexpression du polypeptide II, qui peut ëtre indicatrice de cellules tumorales neuroendocriniennes notamment.
L'invention a également pour objet un procédé d'identification de composés substrats du polypeptide NEP II tel que défini précédemment, dans i ~ lequel on met en contact lesdits composés, éventuellement marqués, avec le polypeptide NEP II, et on évalue la coupure desdits composés par NEP Il, indicatrice de l'activité métalloprotéasique de NEP II envers lesdits composés substrats.
De tels substrats spécifiques de NEP II peuvent être en 2« particulier utilisés dans un procédé de détection de l'activité
métalloprotéasique de NEP II dans un échantillon cellulaire ou tissulaire ou dans des cellules ou un tissu comprenant les étapes consistant à
- mettre en contact ledit échantillon cellulaire ou tissulaire, lesdites cellules ou ledit tissu avec un composé substrat du polypeptide ?~ NEP II obtenu selon l'invention, ledit composé substrat étant éventuellement marqué ;
- évaluer la coupure dudit composé substrat, indicatrice de l'activité métalloprotéasique de NEP II.
Les cellules susceptibles d'être ainsi testées sont notamment les cellules transfectées par un polynucléotide codant pour le polypeptide NEP II
tel que défini précédemment. Les extraits tissulaires susceptibles d'être testés sont en particulier les membranes de testicule, particulièrement riches en ~) métalloprotéase NEP II.
L'invention a par ailleurs pour objet un procédé de criblage de composés susceptibles d'inhiber l'activité métalloprotéasique du polypeptide NEP II selon l'invention, dans lequel on met en contact lesdits composés avec ledit polypeptide NEP II et on évalue le taux d'inhibition de l'activité
métalloprotéasique de NEP li.
Les composés susceptibles d'inhiber l'activité métalloprotéasique de NEP II sont de préférence des peptides courts de 2 ou 3 acides aminés ~o naturels ou modifiés.
Les peptides synthétiques identifiés comme inhibiteurs de l'activité métalloprotéasique de NEP II par ce procédé de criblage peuvent ëtre couplés à un groupe chélateur de zinc tels que les groupes thiol, phosphate o~
acide hydroxamique, selon les techniques classiques connues de l'homme du i~ métier. Le composé inhibiteur obtenu est un bon candidat en tant que principe actif d'un médicament, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Ledit groupe chélateur peut éventuellement être protégé de manière transitoire, par exempte par un ester de thiol, pour améliorer la biodisponibilité dudit principe actif.
zo Le polypeptide NEP II selon l'invention est particulièrement utile pour le criblage de composés inhibiteurs de l'activité métalloprotéasique de NEP II utiles pour la fabrication de médicament destiné à traiter les troubles impliquant les transmissions peptidergiques auxquelles participe NEP II.
Parmi les troubles en cause, on peut citer notamment les z, maladies cardiovasculaires, neurodégénératives, les troubles de la croissance d'origine endocrinienne, tes perturbations de l'axe hypothalamo-hypophysaire et les affections endocriniennes. Sont plus particulièrement visés les troubles affectant le métabolisme des neurohormones ou facteurs de ia sphère corticotrope.
~c~

Les composés substrats de NEP II ou inhibiteurs de l'activité
métalloprotéasique de NEP ll obtenus selon les procédés décrits précédemment peuvent également être utiles pour détecter la protéine NEP II.
La présente invention a donc également pour objet un procédé
s de détection de NEP II dans un échantillon cellulaire ou tissulaire ou dans des cellules ou un tissu comprenant les étapes consistant à
- mettre en contact ledit échantillon cellulaire ou tissulaire, lesdites cellules ou ledit tissu avec un composé substrat du polypeptide NEP
II
obtenu tel que défini précédemment ou avec un composé inhibiteur de m l'activité métalloprotéasique de NEP II obtenu selon le procédé de criblage tel que défini précédemment, ledit composé substrat ou ledit composé inhibiteur étant marqué;
- détecter la présence dudit composé substrat ou dudit composé
inhibiteur, indicatrice de la présence du polypeptide NEP II
Par "composé substrat marqué" ou "inhibiteur marqué", on entend un composé substrat ou un composé inhibiteur marqué de manière détectable, par exemple par un groupement radioactif, enzymatique, fluorogène ou fluorescent, etc.
2« Les exemples suivants illustrent l'invention sans la limiter.

Clonage de l'ADNc codant pour NEP II chez le rat Des oligonucléotides dégénérés ont été obtenus à partir de l'alignement des séquences peptidiques des enzymes ECE, NEP I et Kell et de la délimitation des zones de forte homologie.
L'ARN total de différents tissus de rat (cerveau, intestin et testicules) a été soumis à une transcription inverse (RT) et amplifié par réaction en chaîne à la polymérise (PCR), à l'aide d'une paire d'oligonucléotides dégénérés sur la région N-terminale riche en résidus cystéine Les séquences de ces oligonucléotides dégénérés sont les suivantes DCYS2 CCC AAG (G/T)CG (A/G)G(AIG) CTG GTC
DCYS3 T(A/T)(C/T) GC(AIC/TIG) GG(AIT) GG(A/C) TGG
Ceci a permis d'amplifier un fragment de 420 paires de bases à
partir de l'ARNt de testicule codant pour une phase ouverte de lecture qui présente une homologie de 76% avec la protéine NEP I. Cette séquence a été
complétée par 3' et 5' RACE {rapid amplification of cDNA ends), à partir lo d'ARNt de cerveau de de testicules. Les séquences ont été confirmées par la vérification de cinq clones différents pour chaque tissu et chaque amplification.
L'ADNc complet (SEQ ID n° 1 ) a alors été cloné dans les vecteurs PCR2.1 et pcDNA3.1 (Invitrogen).
ts Caractéristigues du polypeptide NEP II de rat Le nouveau gène isolé code pour une protéine de 774 acides 2o aminés (SEQ ID n° 2) qui, outre de fortes homologies avec les enzymes NEP I, ECE et Kell (52%, 40% et 28% d'identité en acides aminés, respectivement) possède la séquence consensus du site actif HEXXH, une région transmembranaire (acides aminés 24 à 40 sur la séquence SEQ ID n° 2) suivie de quatre résidus cystéine caractéristiques de cette famille, et sept sites 2, potentiels de glycosylation. Trois épissages alternatifs ont été identifiés par séquençage des RACE et par RT-PCR. Un de ces épissages alternatifs élimine un site potentiel de glycosylation et pourrait affecter le transit de la protéine à la surface de la cellule ou son activité. Chaque épissage correspond par ailleurs à un exon de la NEP I, ce qui suggère une structure de ~o gène similaire. Ces données démontrent une appartenance de cette nouvelle enzyme à la famille des métalloprotéases ECEINEP/Kell. Son homologie marquante avec NEP I a conduit à la nommer NEP II.

Clonage de l'ADNc codant pour NEP II chez l'homme Afin de cloner l'homologue humain de NEP II, deux oligonucléotides ont été conçus, basés sur la séquence protéique de NEP II de rat. Les séquences ont été choisies d'une part pour leur faible dégénérescence (comme par exemple un tryptophane, représenté par un seul codon dans le code génétique) et d'autre part pour leur degré de conservation m (comme le site de liaison du zinc).
1- (H)EITHFD (SEQ ID n°28) ou 5' - CGA GAT CAC ACA TGG CTT TGA
TGA - 3' (S) (SEQ ID n°22) 2- QVWCGS (SEQ ID n°29) ou 5'- GGA CCC ACA CCA CAC CTG - 3' (AS) (SEQ !D n°23) Une réaction en chaîne à la polymérase a été effectuée sur de l'ADNc d'hippocampe humain obtenu à partir d'une banque (Stratagene), et une bande de 330 pb a été amplifiée, sous-clonée et séquencée (SEQ ID
n°3).
La séquence obtenue présente une homologie de séquence de 82 % avec la NEPII de rat, ce qui permet d'affirmer qu'elle code pour l'homologue humain.
?« La présence du site de liaison du zinc HEITH a été confirmée par 5' RACE à l'aide des oligonucléotides HNII-2 et HNII-3, spécifiques à
l'humain. De même, les oligonucléotides HNII-1 et HNII-2 permettront l'amplification de la région 3' par la technique de 3' RACE.
HNII-1 , 5'- CGG CCT GGA TCT CAC CCA TGA G - 3' (SEQ ID n°24) 2s HNII-2 5'- CTG ACT GCT CCC GGA AGT GCT GGG TG - 3' (SEQ ID n°25) HNII-3 5'- GAG CAG CTC TTC TTC ATC - 3' (SEQ ID n°26) HNII-4 5'- CTC CAC CAA TCC ATC ATG TTG C - 3' (SEQ ID n°27) I .î

Expression tissulaire de NEP II
Des études de Northern-blot et de RT-PCR montrent que NEP II
est codé par un transcrit de 2,8 Kb très fortement exprimé dans les testicules de rat et, modérément, dans le coeur, le foie, le système digestif et le cerveau.
Des études de RT-PCR semi-quantitatives montrent un profil d'expression similaire dans ces tissus ainsi qu'une prédominance des formes longues.
lo Toutes ces caractéristiques indiquent clairement que fa protéine identifiée pour la première fois est une métalloprotéase membranaire (ectoprotéase) responsable du métabolisme de peptides messagers neuronaux et/ou hormonaux.
Le polypeptide NEP II natif est exprimé de manière hétérogène I, dans le système nerveux, les glandes (hypophyse, testicule), l'appareil digestif (intestin grêle notamment), l'appareil cardiovasculaire (coeur notamment).
Les techniques d'hybridation in situ indiquent en outre une forte expression de la protéine NEP II dans les neurones et les cellules adénohypophysaires exprimant le gène de la POMC (propiomélanocortine}, 2o précurseur de l'ACTH.
Ces localisations indiquent la participation de NEP II dans la protéolyse d'hormones et de neurotransmetteurs peptidergiques ou de leurs précurseurs émanant de ou agissant sur ces divers organes. II devient dès lors intéressant dans un but thérapeutique d'affecter les transmissions 2~ peptidergiques correspondantes en inhibant NEP II.

LISTE DE SÉQUENCES
<110> IIdSERM
<120> Idouvelle mëtalloprotéase mernbranaire NEP II et son utilisation pour le criblage d'inhibiteurs utiles en thérapie <130> BET 99/0150 <140>
<141>
<150> FR/9804389 <151> 1998-04-08 <160> 29 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2765 <212> DNA

<213> Rattus rattus <220>

<221> CDS

<222> (107)... (24281 <400> 1 TGCTCAAGGC

GTGTGCCTTC ATG

Met Gly Lys AGC GGG ATG TGT

Ser Glu Ser Val Met GluArg AlaAspAsn Gly Arg Ser Gly Met Cys CTA GTG TGT CTG

Arg Arg Gly Phe Glu GlyLeu LeuValLeu Thr Leu Leu Val Cys Leu Leu Leu Met Gly Ala Ile Val Thr Leu Gly Val Phe Tyr Ser Ile Gly Lys Gln Leu Pro Leu Leu Asn Ser Leu Leu His Val Ser Arg His Glu AAA AAG

ArgThr ValValLys ArgValLeu ArgAspSerSer GlnLys SerAsp IleCys ThrThrPro SerCysVal IleAlaAlaAla ArgIle LeuGln AsnMet AspGlnSer LysLysPro CysAspAsnPhe TyrGln TyrAla CysGly GlyTrpLeu ArgHisHis ValIleProGlu ThrAsn SerArg TyrSer ValPheAsp IleLeuArg AspGluLeuGlu ValIle LeuLys GlyVal LeuGluAsp SerSerVal GlnHisArgPro AlaVal GluLys AlaLys ThrLeuTyr ArgSerCys MetAsnGlnSer ValIle GluLys ArgAsp SerGluPro LeuLeuAsn ValLeuAspMet IleGly GlyTrp ProValAlaMet AspLysTrp AsnGluThr MetGlyPro LysTrpGlu LeuGluArgG1n LeuAlaVal LeuAsnSer GlnPheAsn ArgArgVal LeuIleAspLeu PheIleTrp AsnAspAsp GlnAsnSer SerArgHis ValIleTyrIle AspGlnPro ThrLeuGly MetProSer ArgGluTyr TyrPheLysGlu AspSerHis ArgValArg GluAlaTyr LeuGlnPhe MetThrSerVal AlaThrMet LeuArgArg AspLeuAsn LeuProGly GluThrAspLeu ValGlnGlu GluMetAla GlnValLeu HisLeuGlu ThrHisLeuAla AsnAlaThr ValProGln GluLysArg HisAspVal ThrAlaLeuTyr HisArgMet GlyLeuGlu GluLeuGln GluArgPhe GlyLeuLysGly PheAsnTrp ThrLeuPhe IleGlnAsn ValLeuSer SerValGlnVal GluLeuLeu ProAsnGlu GluValVal ValTyrGly WO 99/53077 PCT/E'R99/00807 3 by degeneration of the genetic code.
By "homologous" sequence is meant more particularly any nucleotide sequence encoding a homologous NEP II polypeptide WO 99/53077 ~ PCT / FR99 / 00807 NEP II polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 4 at others mammal species than the rat or man.
Such a homologous sequence preferably has a homology greater than 70%, more preferably greater than 75%, with the sequence SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 3, the homology being particularly high in the central part of the sequence coding for the NEP polypeptide Preferably, such a nucleotide sequence hybrid homolog specifically to the complementary sequences of the m sequence SEQ ID No. 1 or No. 3, under stringent conditions.
The parameters defining the stringency conditions depend on the temperature at which 50% of the paired strands separate (Tm).
For sequences comprising more than 30 bases, Tm is defined by the relation: Tm = 81.5 + 0.41 (% G + C) + 16.6 Log (concentration of cations) -m 0.63 (% formamide) - (600 / number of bases) (Sambrook et al, Molecular Cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, 1989, pages 9.54-9.62).
For sequences of length less than 30 bases, Tm is defined by fa relation: Tm = 4 (G + C) + 2 (A + T).
Zu Under appropriate stringency conditions, to which the aspecific sequences do not hybridize, the hybridization temperature is approximately 5 to 30 ° C, preferably 5 to 15 ° C in below Tm, more preferably 5 to 10 ° C below Tm (strong stringency), and the hybridization buffers used are preferably force solutions 2 ~ high ionic such as a 6xSSC solution for example.
The nucleotide sequences according to the invention can be used for the production of a recombinant NEP II protein according to the invention, according to techniques for producing recombinant products îc ~ known to those skilled in the art.

WO 99/53077 ~ PCT / FR99 / 00807 An efficient system for producing a recombinant protein requires a vector, for example of plasmid origin or viral, and a compatible host cell.
The cell host can be chosen from prokaryotic systems, such as bacteria, or eukaryotes, such as yeasts, insect, mammalian cells, such as CHO cells (cells Chinese hamster ovaries) or any other system advantageously available.
The vector must include a promoter, initiation signals "~ And translation termination, as well as the appropriate regions of regulation of transcription. It must be able to be integrated into the cell and can possibly possess particular signals specifying the secretion of the translated protein.
These different control signals are chosen according to t ~ the cell host used. To this end, the nucleotide sequences according to the invention can be inserted into vectors with autonomous replication at within the chosen host, or integrative vectors of the chosen host. Such vectors will be prepared using the methods commonly used by those skilled in the art, and the resulting clones can be introduced into a ? "Suitable host by standard methods, such as for example electroporation.
Examples of vectors of interest are the pcDNA plasmids 3.1, PCR2.1 (Invitrogen), or pMbac (Stratagene).
The invention relates to cloning and / or expression vectors containing a nucleotide sequence according to the invention, and further aims the host cells transfected with these vectors. These cells can be obtained by the introduction into host cells of a sequence nucleotide inserted into a vector as defined above, then placing in culture of said cells under conditions allowing replication and / or _, o the expression of the transfected nucleotide sequence.
These cells can be used in a production method of a recombinant polypeptide according to the invention.

G
The method for producing a polypeptide of the invention under recombinant form is itself included in the present invention, and is characterized in that the transfected cells are cultivated in conditions allowing the expression of a recombinant pofypeptide according to the invention, and that said recombinant polypeptide is recovered.
The purification methods used are known to those skilled in the art job. The recombinant polypeptide can be purified from lysates and cell extracts, of the culture medium supernatant, by methods used separately or in combination, such as fractionation, to chromatography methods, immunoaffinity techniques using monoclonal antibodies or polyclonal serum, etc.
The present invention also relates to probes nucleotides, capable of hybridizing strongly and specifically with a i ~ nucleic acid sequence, genomic DNA or messenger RNA, encoding a polypeptide according to the invention. Hybridization conditions appropriate for temperature and ionic strength usually used by those skilled in the art (Sambrook et al., 1989), preference for high stringency conditions, i.e. conditions of at a temperature between (Tm minus 5 ° C) and (Tm minus 15 °
C) and more preferably, at temperature conditions between Tm and (Tm minus 10 ° C} (high stringency).
The preferred probes are in particular the probes oligonucleotides chosen from sequences SEQ ID No. 5 to SEQ ID
# 27.
Such probes are useful for sequencing reactions or specific amplification according to the so-called PCR technique (reaction in polymerase chain) or any other variant thereof.
Such probes are also useful in a method of detection of expression of NEP II polypeptide in a cell sample . ~ "Or tissue or in cells or tissue by in situ hybridization, including the steps of WO 99/53077 ~ PCT / FR99 / 00807 - prepare TARN of said sample or of said cells or of said fabric;
- contacting said RNA obtained with at least one probe having a nucleotide sequence capable of specifically hybridizing with a nucleotide sequence according to the invention, said probe possibly being in particular an oligonucleotide probe of sequence SEQ ID No. 5 to SEQ ID
# 27;
- detect the presence of mRNA hybridizing with said probe indicative of expression of the NEP II polypeptide.
A subject of the invention is also the antibodies mono- or polyclonal or their fragments, chimeric or immunoconjugate antibodies, characterized in that they are obtained from a polypeptide according to the invention administered to an animal, and are able to recognize u specifically a polypeptide according to the invention. The invention further has for subject use of these antibodies for the purification or detection of a NEP II polypeptide in a biological sample.
Polyclonal antibodies can be obtained from the serum of an animal immunized against the NEP II protein, produced for example by 2u genetic recombination according to the method described above, according to the usual operating modes.
Monoclonal antibodies can be obtained according to the classic hybridoma culture method described by Kdhler and Milstein (Nature, 1975, vol. 256, pp 495-497).
The antibodies can be chimeric antibodies, humanized antibodies, Fab and F (ab ') fragments 2. They can also present in the form of immunoconjugates or labeled antibodies.
The antibodies according to the invention are particularly useful for detect the presence of CIP II.
The present invention therefore relates to a detection method NEP II immunoassay in a cell or tissue sample or in cells or tissue comprising the steps of - bringing said cell or tissue sample into contact, said cells or said tissue with an antibody detectable according to the invention;
- detect the presence of said antibody, indicative of the presence NEP II polypeptide.
By "detectable antibody" is meant either a labeled antibody by a detectable group, such as a radioactive, enzymatic group, fluorogenic or fluorescent, etc., or an antibody to which another antibody itself detectably labeled.
The antibodies according to the invention can thus make it possible to evaluate or an overexpression of polypeptide II, which can be indicative of cells neuroendocrine tumors in particular.
The invention also relates to a method for identifying substrate compounds of the NEP II polypeptide as defined above, in i ~ which puts said compounds, possibly labeled, in contact with the NEP II polypeptide, and the cleavage of said compounds is evaluated by NEP II, indicative of the metalloprotease activity of NEP II towards said compounds substrates.
Such specific NEP II substrates may be in 2 "particular used in an activity detection process metalloprotease of NEP II in a cell or tissue sample or in cells or tissue comprising the steps of - bringing said cell or tissue sample into contact, said cells or tissue with a substrate compound of the polypeptide ~ NEP II obtained according to the invention, said substrate compound being possibly marked;
- evaluate the cleavage of said substrate compound, indicative of NEP II metalloprotease activity.
The cells likely to be thus tested are in particular the cells transfected with a polynucleotide encoding the NEP II polypeptide as defined above. Tissue extracts likely to be tested are in particular the testicle membranes, which are particularly rich in ~) NEP II metalloprotease.
The subject of the invention is also a method of screening for compounds capable of inhibiting the metalloprotease activity of the polypeptide CIP II according to the invention, in which said compounds are brought into contact with said NEP II polypeptide and the activity inhibition rate is evaluated metalloprotease of NEP li.
Compounds capable of inhibiting metalloprotease activity of NEP II are preferably short peptides of 2 or 3 amino acids ~ o natural or modified.
Synthetic peptides identified as inhibitors of metalloprotease activity of NEP II by this screening process can to be coupled to a zinc chelating group such as thiol groups, phosphate o ~
hydroxamic acid, according to conventional techniques known to those skilled in the art i ~ profession. The inhibitor compound obtained is a good candidate as principle active ingredient of a drug, in combination with a pharmaceutical carrier acceptable. Said chelating group can optionally be protected from transiently, for example with a thiol ester, to improve the bioavailability of said active ingredient.
zo The NEP II polypeptide according to the invention is particularly useful for the screening of compounds that inhibit the metalloprotease activity of CIP II useful for the manufacture of medicament for the treatment of disorders involving peptidergic transmissions in which NEP II participates.
Among the disorders in question, mention may be made in particular of:
z, cardiovascular disease, neurodegenerative, disorders of the growth of endocrine origin, your disturbances of the hypothalamic-pituitary axis and endocrine conditions. The following are more particularly targeted:
troubles affecting the metabolism of neurohormones or sphere factors corticotrope.
~ c ~

NEP II substrate compounds or activity inhibitors NEP ll metalloprotease obtained by the methods described previously may also be useful in detecting the NEP II protein.
The present invention therefore also relates to a method s detection of CIP II in a cell or tissue sample or in of cells or tissue comprising the steps of - bringing said cell or tissue sample into contact, said cells or tissue with a substrate compound of the NEP polypeptide II
obtained as defined above or with a compound that inhibits m metalloprotease activity of NEP II obtained according to the screening process Phone as defined above, said substrate compound or said inhibitor compound being marked;
- detect the presence of said substrate compound or said compound inhibitor, indicator of the presence of the NEP II polypeptide By "labeled substrate compound" or "labeled inhibitor", we mean means a substrate compound or an inhibitor compound marked so detectable, for example by an radioactive, enzymatic group, fluorogenic or fluorescent, etc.
2 “The following examples illustrate the invention without limiting it.

Cloning of the NEP II coding cDNA in rats Degenerate oligonucleotides were obtained from the alignment of the peptide sequences of the enzymes ECE, NEP I and Kell and of the delimitation of areas of strong homology.
Total RNA from different rat tissues (brain, gut and testes) was subjected to reverse transcription (RT) and amplified by polymer chain reaction (PCR), using a pair of degenerate oligonucleotides on the N-terminal region rich in residues cysteine The sequences of these degenerate oligonucleotides are the following DCYS2 CCC AAG (G / T) CG (A / G) G (AIG) CTG GTC
DCYS3 T (A / T) (C / T) GC (AIC / TIG) GG (AIT) GG (A / C) TGG
This made it possible to amplify a fragment of 420 base pairs at from the testis tRNA encoding an open reading phase which has 76% homology to the NEP I protein. This sequence has been supplemented by 3 'and 5' RACE (rapid amplification of cDNA ends), from lo of testis brain tRNA. The sequences have been confirmed by the verification of five different clones for each tissue and each amplification.
The complete cDNA (SEQ ID No. 1) was then cloned into the vectors PCR2.1 and pcDNA3.1 (Invitrogen).
ts Characteristics of the rat NEP II polypeptide New isolated gene codes for 774 acid protein 2o amines (SEQ ID n ° 2) which, in addition to strong homologies with CIP I enzymes, ECE and Kell (52%, 40% and 28% amino acid identity, respectively) has the consensus sequence of the active site HEXXH, a region transmembrane (amino acids 24 to 40 on the sequence SEQ ID No. 2) followed of four cysteine residues characteristic of this family, and seven sites 2, glycosylation potentials. Three alternative splices have been identified through RACE sequencing and by RT-PCR. One of these alternative splices eliminates a potential glycosylation site and could affect the transit of the protein on the cell surface or its activity. Each splicing also corresponds to a NEP I exon, which suggests a structure of ~ o similar gene. These data demonstrate that this new affiliation enzyme to the ECEINEP / Kell metalloprotease family. Its homology significant with NEP I led to naming it NEP II.

Cloning of the cDNA encoding NEP II in humans In order to clone the human NEP II counterpart, two oligonucleotides were designed, based on the NEP II protein sequence of rat. The sequences were chosen on the one hand for their low degeneration (such as a tryptophan, represented by a single codon in the genetic code) and secondly for their degree of conservation m (such as the zinc binding site).
1- (H) EITHFD (SEQ ID n ° 28) or 5 '- CGA GAT CAC ACA TGG CTT TGA
TGA - 3 '(S) (SEQ ID n ° 22) 2- QVWCGS (SEQ ID n ° 29) or 5'- GGA CCC ACA CCA CAC CTG - 3 '(AS) (SEQ! D n ° 23) A polymerase chain reaction was performed on human hippocampus cDNA obtained from a bank (Stratagene), and a band of 330 bp was amplified, subcloned and sequenced (SEQ ID
n ° 3).
The sequence obtained has a 82% sequence homology with the NEPII of rat, which allows to affirm that it codes for the human counterpart.
? "The presence of the HEITH zinc binding site has been confirmed by 5 'RACE using the oligonucleotides HNII-2 and HNII-3, specific to the human. Similarly, the oligonucleotides HNII-1 and HNII-2 will allow amplification of the 3 'region by the 3' RACE technique.
HNII-1, 5'- CGG CCT GGA TCT CAC CCA TGA G - 3 '(SEQ ID n ° 24) 2s HNII-2 5'- CTG ACT GCT CCC GGA AGT GCT GGG TG - 3 '(SEQ ID n ° 25) HNII-3 5'- GAG CAG CTC TTC TTC ATC - 3 '(SEQ ID n ° 26) HNII-4 5'- CTC CAC CAA TCC ATC ATG TTG C - 3 '(SEQ ID n ° 27) I .î

NEP II tissue expression Northern-blot and RT-PCR studies show that NEP II
is coded by a 2.8 Kb transcript very strongly expressed in the testes rat and, moderately, in the heart, liver, digestive system and brain.
Semi-quantitative RT-PCR studies show an expression profile similar in these fabrics as well as a predominance of long forms.
lo All these characteristics clearly indicate that the protein identified for the first time is a membrane metalloprotease (ectoprotease) responsible for the metabolism of messenger peptides neuronal and / or hormonal.
Native NEP II polypeptide is expressed heterogeneously I, in the nervous system, the glands (pituitary gland, testicle), the apparatus digestive (small intestine in particular), the cardiovascular system (especially the heart).
In situ hybridization techniques also indicate strong expression of the NEP II protein in neurons and cells adenohypophyseal expressing the POMC gene (propiomelanocortin}, 2o precursor of ACTH.
These locations indicate the participation of NEP II in the proteolysis of hormones and peptidergic neurotransmitters or their precursors emanating from or acting on these various organs. It therefore becomes interesting for therapeutic purposes to affect transmissions 2 ~ corresponding peptidergics by inhibiting NEP II.

SEQUENCE LIST
<110> IIdSERM
<120> Idouvelle metalloprotéase mernbranaire NEP II and its use for screening for inhibitors useful in therapy <130> BET 99/0150 <140>
<141>
<150> FR / 9804389 <151> 1998-04-08 <160> 29 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2765 <212> DNA

<213> Rattus rattus <220>

<221> CDS

<222> (107) ... (24281 <400> 1 TGCTCAAGGC

GTGTGCCTTC ATG

Met Gly Lys AGC GGG ATG TGT

Ser Glu Ser Val Met GluArg AlaAspAsn Gly Arg Ser Gly Met Cys CTA GTG TGT CTG

Arg Arg Gly Phe Glu GlyLeu LeuValLeu Thr Leu Leu Val Cys Leu Leu Leu Met Gly Ala Ile Val Thr Leu Gly Val Phe Tyr Ser Ile Gly Lys Gln Leu Pro Leu Leu Asn Ser Leu Leu His Val Ser Arg His Glu AAA AAG

ArgThr ValValLys ArgValLeu ArgAspSerSer GlnLys SerAsp IleCys ThrThrPro SerCysVal IleAlaAlaAla ArgIle LeuGln AsnMet AspGlnSer LysLysPro CysAspAsnPhe TyrGln TyrAla CysGly GlyTrpLeu ArgHisHis ValIleProGlu ThrAsn SerArg TyrSer ValPheAsp IleLeuArg AspGluLeuGlu ValIle LeuLys GlyVal LeuGluAsp SerSerVal GlnHisArgPro AlaVal GluLys AlaLys ThrLeuTyr ArgSerCys MetAsnGlnSer ValIle GluLys ArgAsp SerGluPro LeuLeuAsn ValLeuAspMet IleGly GlyTrp ProValAlaMet AspLysTrp AsnGluThr MetGlyPro LysTrpGlu LeuGluArgG1n LeuAlaVal LeuAsnSer GlnPheAsn ArgArgVal LeuIleAspLeu PheIleTrp AsnAspAsp GlnAsnSer SerArgHis ValIleTyrIle AspGlnPro ThrLeuGly MetProSer ArgGluTyr TyrPheLysGlu AspSerHis ArgValArg GluAlaTyr LeuGlnPhe MetThrSerVal AlaThrMet LeuArgArg AspLeuAsn LeuProGly GluThrAspLeu ValGlnGlu GluMetAla GlnValLeu HisLeuGlu 295,300,305 ThrHisLeuAla AsnAlaThr ValProGln GluLysArg HisAspVal ThrAlaLeuTyr HisArgMet GlyLeuGlu GluLeuGln GluArgPhe GlyLeuLysGly PheAsnTrp ThrLeuPhe IleGlnAsn ValLeuSer SerValGlnVal GluLeuLeu ProAsnGlu GluValVal ValTyrGly WO 99/53077 PCT / E'R99 / 00807

4 AAT

IleProT~r LeuGluAsn LeuGluGlu IleIleAsp ValPhePro Ala GlnThrLeu GlnAsnTyr LeuValTrp ArgLeuVal LeuAspArg Ile GlySerLeu SerGlnArg PheLysGlu AlaArgVal AspTyrArg Lys AlaLeuTyr GlyThrThr MetGluGlu ValArgTrp ArgGluCys Val SerTyrVal AsnSerAsn MetGluSer AlaValGly SerLeuTyr Ile LysArgAla PheSerLys AspSerLys SerIleVal SerGluLeu Ile GluLysIle ArgSerVal PheValAsp AsnLeuAsp GluLeuAsn Trp MetAspGlu GluSerLys LysLysAla GlnGluLys AlaLeuAsn Ile 485 490 qg5 ArgGluGln IleGlyTyr ProAspTyr IleLeuGlu AspAsnAsn Arg HisLeuAsp GluGluTyr SerSerLeu ThrPheSer G.luAspLeu Tyr PheGluAsnGly LeuGlnAsn LeuLysAsn AsnAlaGln ArgSerLeu AAGAt;ACTTCGG GAAAAGGTG GACCAGAAT CTCTGGATC ATTGGGGCT 1795 LysLysLeuArg GluLysVal AspGlnAsn LeuTrpIle IleGlyAla AlaValValAsn AlaPheTyr SerProAsn ArgAsnLeu IleValPhe ProAlaGlyIle LeuGlnPro ProPhePhe SerLysRsp GlnProGln AlaLeuAsnPhe GlyGlyIle GlyMetVal IleGlyHis GluIleThr HisGlyPheAsp AspAsnGly ArgAsnPhe AspLysAsn GlyAsnMet LeuAspTrpTrp SerAsnPhe SerAlaArg HisPheArg GlnGlnSer GlnCysMetIle TyrGlnTyr SerAsnPhe SerTrpGlu LeuAlaAsp AsnGlnAsnVal AsnGlyPhe SerThrLeu GlyGluAsn IleAlaAsp AsnGlyGlyVal ArgGlnAla TyrLysAla TyrLeuGln TrpLeuAla GluGlyGlyArg AspGlnArg LeuProGly LeuAsnLeu ThrTyrAla G

GlnLeu PhePheIle AsnTyrAla GlnValTrp CysGlySer TyrArg ProGlu PheAlaIle GlnSerIle LysThrAsp ValHisSer ProLeu LysTyr ArgValLeu GlySerLeu GlnAsnLeu ProGlyPhe SerGlu AIaPhe HisCysPro ArgGlySer ProMetHis ProMetAsn RrgCys TGAGCTATGC
TGCGGCCCAC

ArgIle Trp GACTTGAGCTAAGTRAACGCTTCAAAGARGGCAAAAAAAAp,F~AAAAAAAAAAAAGGG 2765 <210>

<211>

<212>
PRT

<213>
Rattus rattus <900> 2 Met Gly Lys Ser Glu Ser Ser Val Gly Met Met Glu Arg Ala Asp Asn Cys Gl~ Arg Arg Arg Leu Gly Phe Val Glu Cys Gly Leu Leu Val Leu Leu Thr Leu Leu Leu Met Gly Ala Ile Val Thr Leu Gly Val Phe Tyr Ser Ile Gly Lys Gln Leu Pro Leu Leu Asn Ser Leu Leu His Val Ser Arg His Glu Arg Thr Val Val Lys Arg Val Leu Arg Asp Ser Ser Gln Lys Ser Asp Ile Cys Thr Thr Pro Ser Cys Val Ile Ala Ala Ala Arg Ile Leu Gln Asn Met Asp Gln Ser Lys Lys Pro Cys Asp Asn Phe Tyr Gln Tyr Ala Cys Gly Gly Trp Leu Arg His His Val Ile Pro Glu Thr Asn Ser Arg Tyr Ser Val Phe Rsp Ile Leu Arg Rsp Glu Leu Glu Val Ile Leu Lys Gly Val Leu Glu Asp Ser 5er Val Gln His Arg Pro Ala Val Glu Lys Ala Lys Thr Leu Tyr Arg Ser Cys Met Asn Gln Ser Val Ile Glu Lys Arg Asp Ser Glu Pro Leu Leu Rsn Val Leu Asp Met Ile Gly Gly Trp Pro Val Ala Met Asp Lys Trp Asn Glu Thr Met Gly Pro Lys Trp Glu Leu Glu Arg Gln Leu Ala Val Leu Asn Ser Gln Phe Asn Arg Arg Val Leu Ile Asp Leu Phe Ile Trp Asn Asp Asp Gln Asn Ser 225. 230 235 240 Ser Arg His Val Ile Tyr Ile Asp Gln Pro Thr Leu Gly Met Pro Ser Arg Glu Tyr Tyr Phe Lys Glu Asp Ser His Arg Val Arg Glu Ala Tyr Leu Gln Phe Met Thr Ser Val Ala Thr Met Leu Arg Arg Asp Leu Asn Leu Pro Gly Glu Thr Asp Leu Val Gln Glu Glu Met Ala Gln Val Leu 2q0 295 300 His Leu Glu Thr His Leu Ala Asn Ala Thr Val Pro Gln Glu Lys Arg His Asp Val Thr Ala Leu Tyr His Arg Met Gly Leu Glu Glu Leu Gln Glu Arg Phe Gly Leu Lys Gly Phe Asn Trp Thr Leu Phe Ile Gln Asn Val Leu Ser Ser Val Gln Val Glu Leu Leu Pro Asn Glu Glu Val Val Val Tyr Gly Ile Pro Tyr Leu Glu Asn Leu Glu Glu Ile Ile Asp Val Phe Pro Ala Gln Thr Leu Gln Asn Tyr Leu Val Trp Arg Leu Val Leu Asp Arg Ile Gly Ser Leu Ser Gln Arg Phe Lys Glu Ala Arg Val Asp Tyr Arg Lys Ala Leu Tyr Gly Thr Thr Met Glu Glu Val Arg Trp Arg Glu Cys Val Ser Tyr Val Asn Ser Asn Met Glu Ser Ala Val Gly Ser Leu Tyr Ile Lys Arg Ala Phe Ser Lys Asp Ser Lys Ser Ile Val Ser Glu Leu Ile Glu Lys Ile Arg Ser Val Phe Val Asp Asn Leu Asp Glu Leu Asn~Trp Met Asp Glu Glu Ser Lys Lys Lys Ala Gln Glu Lys Ala Leu Asn Ile Arg Glu Gln Ile Gly Tyr Pro Asp Tyr Ile Leu Glu Asp Asn Asn Arg His Leu Asp Glu Glu Tyr Ser Ser Leu Thr Phe Ser Glu Asp Leu Tyr Phe Glu Asn Gly Leu Gln Asn Leu Lys Asn Asn Ala Gln Arg Ser Leu Lys Lys Leu Arg Glu Lys Val Asp Gln Asn Leu Trp Ile Ile Gly Ala Ala Val Val Asn Ala Phe Tyr Ser Pro Asn Arg Asn Leu Ile Val Phe Pro Ala Gly Ile Leu Gln Pro Pro Phe Phe Ser Lys Asp Gln Pro Gln Ala Leu Asn Phe Gly Gly Ile Gly Met Val Ile Gly His Glu Ile Thr His Gly Phe Asp Asp Asn Gly Arg Asn Phe Asp Lys Asn nl~~ 615 620 Gly Asn Met Leu Asp Trp Trp Ser Asn Phe Ser Ala Arg His Phe Arg Gln Gln Ser Gln Cys Met IIe Tyr Gln Tyr Ser Asn Phe Ser Trp Glu Leu Ala Asp Asn Gln Asn Val Asn Gly Phe Ser Thr Leu Gly Glu Asn Ile Ala Asp Asn Gly Gly Val Arg Gln Ala Tyr Lys Ala Tyr Leu Gln 675 6eo 6e5 Trp Leu Ala Glu Gly Gly Arg Asp Gln Arg Leu Pro Gly Leu Asn Leu C~ G ~l Thr Tyr Ala Gln Leu Phe Phe Ile Asn Tyr Ala Gln Val Trp Cys Gly Ser Tyr Arg Pro Glu Phe Ala Ile Gln Ser Ile Lys Thr Asp Val His Ser Pro Leu Lys Tyr Arg Val Leu Gly Ser Leu Gln Rsn Leu Pro Gly Phe Ser Glu Ala Phe His Cys Pro Arg Gly Ser Pro Met His Pro Met Asn Arg Cys Arg Ile Trp <210> 3 <211> 327 <212> DbIA
<~13> Homo sapiens <900> 3 <210> 4 <211> 116 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> ~1 Gly His Glu Ile Thr His Gly Phe Asp Asp Asn Gly Arg Asn Phe Asp i 5 10 15 Lys Asn Gly Asn Met Met Asp Trp Trp Ser Asn Phe Ser Thr Gln His Phe Arg Glu Gln Ser Glu Cys Met Ile Tyr Gln Tyr Gly Asn Tyr Ser Trp Asp Leu Ala Asp Glu Gln Asn Val Asn Gly Phe Asn Thr Leu Gly 4 AAT

IleProT ~ r LeuGluAsn LeuGluGlu IleIleAsp ValPhePro Ala GlnThrLeu GlnAsnTyr LeuValTrp ArgLeuVal LeuAspArg Ile GlySerLeu SerGlnArg PheLysGlu AlaArgVal AspTyrArg Lys 405,910,415 AlaLeuTyr GlyThrThr MetGluGlu ValArgTrp ArgGluCys Val SerTyrVal AsnSerAsn MetGluSer AlaValGly SerLeuTyr Ile LysArgAla PheSerLys AspSerLys SerIleVal SerGluLeu Ile 455,460,465 GluLysIle ArgSerVal PheValAsp AsnLeuAsp GluLeuAsn Trp MetAspGlu GluSerLys LysLysAla GlnGluLys AlaLeuAsn Ile 485 490 qg5 ArgGluGln IleGlyTyr ProAspTyr IleLeuGlu AspAsnAsn Arg HisLeuAsp GluGluTyr SerSerLeu ThrPheSer G.luAspLeu Tyr PheGluAsnGly LeuGlnAsn LeuLysAsn AsnAlaGln ArgSerLeu AAGAt; ACTTCGG GAAAAGGTG GACCAGAAT CTCTGGATC ATTGGGGCT 1795 LysLysLeuArg GluLysVal AspGlnAsn LeuTrpIle IleGlyAla AlaValValAsn AlaPheTyr SerProAsn ArgAsnLeu IleValPhe 565,570,575 ProAlaGlyIle LeuGlnPro ProPhePhe SerLysRsp GlnProGln AlaLeuAsnPhe GlyGlyIle GlyMetVal IleGlyHis GluIleThr HisGlyPheAsp AspAsnGly ArgAsnPhe AspLysAsn GlyAsnMet LeuAspTrpTrp SerAsnPhe SerAlaArg HisPheArg GlnGlnSer GlnCysMetIle TyrGlnTyr SerAsnPhe SerTrpGlu LeuAlaAsp AsnGlnAsnVal AsnGlyPhe SerThrLeu GlyGluAsn IleAlaAsp 660,665 670,675 AsnGlyGlyVal ArgGlnAla TyrLysAla TyrLeuGln TrpLeuAla GluGlyGlyArg AspGlnArg LeuProGly LeuAsnLeu ThrTyrAla 695,700,705 G

GlnLeu PhePheIle AsnTyrAla GlnValTrp CysGlySer TyrArg ProGlu PheAlaIle GlnSerIle LysThrAsp ValHisSer ProLeu LysTyr ArgValLeu GlySerLeu GlnAsnLeu ProGlyPhe SerGlu AIaPhe HisCysPro ArgGlySer ProMetHis ProMetAsn RrgCys 760,765,770 TGAGCTATGC
TGCGGCCCAC

ArgIle Trp GACTTGAGCTAAGTRAACGCTTCAAAGARGGCAAAAAAAAp, F ~ AAAAAAAAAAAAGGG 2765 <210>

<211>

<212>
PRT

<213>
Rattus rattus <900> 2 Met Gly Lys Ser Glu Ser Ser Val Gly Met Met Glu Arg Ala Asp Asn Cys Gl ~ Arg Arg Arg Leu Gly Phe Val Glu Cys Gly Leu Leu Val Leu Leu Thr Leu Leu Leu Met Gly Ala Ile Val Thr Leu Gly Val Phe Tyr Ser Ile Gly Lys Gln Leu Pro Leu Leu Asn Ser Leu Leu His Val Ser Arg His Glu Arg Thr Val Val Lys Arg Val Leu Arg Asp Ser Ser Gln Lys Ser Asp Ile Cys Thr Thr Pro Ser Cys Val Ile Ala Ala Ala Arg Ile Leu Gln Asn Met Asp Gln Ser Lys Lys Pro Cys Asp Asn Phe Tyr Gln Tyr Ala Cys Gly Gly Trp Leu Arg His His Val Ile Pro Glu Thr Asn Ser Arg Tyr Ser Val Phe Rsp Ile Leu Arg Rsp Glu Leu Glu Val Ile Leu Lys Gly Val Leu Glu Asp Ser 5er Val Gln His Arg Pro Ala Val Glu Lys Ala Lys Thr Leu Tyr Arg Ser Cys Met Asn Gln Ser Val Ile Glu Lys Arg Asp Ser Glu Pro Leu Leu Rsn Val Leu Asp Met Ile Gly Gly Trp Pro Val Ala Met Asp Lys Trp Asn Glu Thr Met Gly Pro Lys Trp Glu Leu Glu Arg Gln Leu Ala Val Leu Asn Ser Gln Phe Asn Arg Arg Val Leu Ile Asp Leu Phe Ile Trp Asn Asp Asp Gln Asn Ser 225. 230 235 240 Ser Arg His Val Ile Tyr Ile Asp Gln Pro Thr Leu Gly Met Pro Ser Arg Glu Tyr Tyr Phe Lys Glu Asp Ser His Arg Val Arg Glu Ala Tyr Leu Gln Phe Met Thr Ser Val Ala Thr Met Leu Arg Arg Asp Leu Asn Leu Pro Gly Glu Thr Asp Leu Val Gln Glu Glu Met Ala Gln Val Leu 2q0 295 300 His Leu Glu Thr His Leu Ala Asn Ala Thr Val Pro Gln Glu Lys Arg His Asp Val Thr Ala Leu Tyr His Arg Met Gly Leu Glu Glu Leu Gln Glu Arg Phe Gly Leu Lys Gly Phe Asn Trp Thr Leu Phe Ile Gln Asn Val Leu Ser Ser Val Gln Val Glu Leu Leu Pro Asn Glu Glu Val Val Val Tyr Gly Ile Pro Tyr Leu Glu Asn Leu Glu Glu Ile Ile Asp Val 375,380 Phe Pro Ala Gln Thr Leu Gln Asn Tyr Leu Val Trp Arg Leu Val Leu Asp Arg Ile Gly Ser Leu Ser Gln Arg Phe Lys Glu Ala Arg Val Asp Tyr Arg Lys Ala Leu Tyr Gly Thr Thr Met Glu Glu Val Arg Trp Arg Glu Cys Val Ser Tyr Val Asn Ser Asn Met Glu Ser Ala Val Gly Ser Leu Tyr Ile Lys Arg Ala Phe Ser Lys Asp Ser Lys Ser Ile Val Ser Glu Leu Ile Glu Lys Ile Arg Ser Val Phe Val Asp Asn Leu Asp Glu Leu Asn ~ Trp Met Asp Glu Glu Ser Lys Lys Lys Ala Gln Glu Lys Ala Leu Asn Ile Arg Glu Gln Ile Gly Tyr Pro Asp Tyr Ile Leu Glu Asp Asn Asn Arg His Leu Asp Glu Glu Tyr Ser Ser Leu Thr Phe Ser Glu Asp Leu Tyr Phe Glu Asn Gly Leu Gln Asn Leu Lys Asn Asn Ala Gln Arg Ser Leu Lys Lys Leu Arg Glu Lys Val Asp Gln Asn Leu Trp Ile Ile Gly Ala Ala Val Val Asn Ala Phe Tyr Ser Pro Asn Arg Asn Leu 565,570,575 Ile Val Phe Pro Ala Gly Ile Leu Gln Pro Pro Phe Phe Ser Lys Asp Gln Pro Gln Ala Leu Asn Phe Gly Gly Ile Gly Met Val Ile Gly His Glu Ile Thr His Gly Phe Asp Asp Asn Gly Arg Asn Phe Asp Lys Asn nl ~~ 615 620 Gly Asn Met Leu Asp Trp Trp Ser Asn Phe Ser Ala Arg His Phe Arg Gln Gln Ser Gln Cys Met IIe Tyr Gln Tyr Ser Asn Phe Ser Trp Glu Leu Ala Asp Asn Gln Asn Val Asn Gly Phe Ser Thr Leu Gly Glu Asn Ile Ala Asp Asn Gly Gly Val Arg Gln Ala Tyr Lys Ala Tyr Leu Gln 675 6eo 6e5 Trp Leu Ala Glu Gly Gly Arg Asp Gln Arg Leu Pro Gly Leu Asn Leu C ~ G ~ l 695,700 Thr Tyr Ala Gln Leu Phe Phe Ile Asn Tyr Ala Gln Val Trp Cys Gly 705,710,715,720 Ser Tyr Arg Pro Glu Phe Ala Ile Gln Ser Ile Lys Thr Asp Val His Ser Pro Leu Lys Tyr Arg Val Leu Gly Ser Leu Gln Rsn Leu Pro Gly Phe Ser Glu Ala Phe His Cys Pro Arg Gly Ser Pro Met His Pro Met 755,760,765 Asn Arg Cys Arg Ile Trp <210> 3 <211> 327 <212> DbIA
<~ 13> Homo sapiens <900> 3 <210> 4 <211> 116 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> ~ 1 Gly His Glu Ile Thr His Gly Phe Asp Asp Asn Gly Arg Asn Phe Asp i 5 10 15 Lys Asn Gly Asn Met Met Asp Trp Trp Ser Asn Phe Ser Thr Gln His Phe Arg Glu Gln Ser Glu Cys Met Ile Tyr Gln Tyr Gly Asn Tyr Ser Trp Asp Leu Ala Asp Glu Gln Asn Val Asn Gly Phe Asn Thr Leu Gly

5~~ 55 60 Glu Asn I1e Ala Asp Asn Gly Gly Val Arg Gln Ala Tyr Lys Ala Tyr Leu Lys Trp Met Ala Glu Gly Gly Lys Asp Gln Gln Leu Pro Gly Leu Asp Leu Thr His Glu Gln Leu Phe Phe Ile Asn Tyr Ala Gln Val Trp Cys Gly Cys Lys <210> 5 <211> 20 <212> DIQA
<213> séquence artificielle <223> oligonucléotide <400> 5 <210> 6 <211> 21 <212> DNA
<213> séquence artificielle <223> oligonucléotide <900> 6 <210>
<211> 20 <212> DPIA
<213> séquence artificielle <223> oligonucléotide <400> 7 <210> 3 <211> 19 <212> DNA
<213> séquence artificielle <223> oligonucléotide <400> 8 <210> 4 <211> 21 <212> DNA
<213> séquence artificielle <223> oligonucléotide <400> ç

<210> 10 <211> ~1 <212> DNA
<213> séquence artificielle <223> oligonucléotide <400> 10 <210> 11 <211> 2~' <212 > DD1A
<213> séquence artificielle <223> oligonucléotide ls <400> 11 GCAA.~GCACT AGCTTCAGTG TG

<21O> 12 <211> ~?

<212> DNA

<2I3> squence artificielle <223> oligonuclotide <400> l' <210> 13 <211> 20 <212> DNA

<213> squence artificielle <223> oligonuclotide <400> 13 CGATGAGGAC GCGCCTGTTG

<210> 14 <211> 20 <212> DNA

<213> squence artificielle <223> oligonuclotide <400> 14 TGCAGGAAAG GTTTGGTCTG

<210> 15 <211> LO

<212> DNA

<213> squence artificielle <223> oligonuclotide <400> 15 GAACGCCTCA GAGAAGCCTG

<210> l <211> 20 1.1 <212> DDIA
<213> séquence artificielle <2~3> oligonucléotide <400> lô

<210> 17 <211> 21 <212> DI~1A
<213> séquence artificielle <223> oligonucléotide <400> 17 <210> 18 <211> G1 <212> DNA
<213> séquence artificielle <223> oligonucléotide <400> 18 <210> 19 <211> 19 <212> DNA
<213> séquence artificielle <223> oligonucléotide <900> 19 <210> 20 <211> 19 <212> DNA
<213> séquence artificielle <223> oligonucléotide <900> 20 1~

<~10> 21 <211> ~O
<212> DNA
<213> séquence artificielle <223> oligonucléotide <900> 21 <210> 22 <211> 24 <212> DNA
<213> sëquence artificielle <223> oligonucléotide <400> 22 cgagatcaca catggctttg atga 24 <210> 23 <211> 18 <212> DNA
<213> séquence artificielle <223> oligonucléotide <400> 23 ggacccacac cacacctg 18 <210> 24 <211> ~._~
<212> DNA
<213> séquence artificielle <223> oligonucléotide <400> 24 cggcctggat ctcacccatg ag 22 <210> 25 <211> 26 <212> DNA
<213> séquence artificielle <223> oligonuclëotide <400> ~5 ctgactgctc ccggaagtgc tgggtg 26 <210> 26 <211> 18 <212> DNA
<213> séquence artificielle <223> oligonuclëotide <400> 2ô
gagcagctct tcttcatc 18 <210> 27 <211> 22 <212> DNA
<213> séquence artificielle <223> oligonucléotide <400> ~7 ctccaccaat ccatcatgtt gc 22 <210> 28 <211> 6 <212> PRT
<213> séquence artificielle <223> séquence protéique correspondant à la sonde oligonucléotidique SEQ ID
n°22 <400> 28 Glu Ile Thr His Phe Asp <210> 29 <211> 6 <212> PRT
<213> séquence artificielle <223> séquence protéique correspondant à la sonde oligonucléotidique SEQ ID
n°23 <400> 29 Gln Val Trp Cys Gly Ser 5 ~~ 55 60 Glu Asn I1e Ala Asp Asn Gly Gly Val Arg Gln Ala Tyr Lys Ala Tyr Leu Lys Trp Met Ala Glu Gly Gly Lys Asp Gln Gln Leu Pro Gly Leu Asp Leu Thr His Glu Gln Leu Phe Phe Ile Asn Tyr Ala Gln Val Trp Cys Gly Cys Lys <210> 5 <211> 20 <212> DIQA
<213> artificial sequence <223> oligonucleotide <400> 5 <210> 6 <211> 21 <212> DNA
<213> artificial sequence <223> oligonucleotide <900> 6 <210>
<211> 20 <212> DPIA
<213> artificial sequence <223> oligonucleotide <400> 7 <210> 3 <211> 19 <212> DNA
<213> artificial sequence <223> oligonucleotide <400> 8 <210> 4 <211> 21 <212> DNA
<213> artificial sequence <223> oligonucleotide <400> ç

<210> 10 <211> ~ 1 <212> DNA
<213> artificial sequence <223> oligonucleotide <400> 10 <210> 11 <211> 2 ~ ' <212> DD1A
<213> artificial sequence <223> oligonucleotide ls <400> 11 GCAA. ~ GCACT AGCTTCAGTG TG

<21O> 12 <211> ~?

<212> DNA

<2I3> artificial sequence <223> oligonuclotide <400> the <210> 13 <211> 20 <212> DNA

<213> artificial sequence <223> oligonuclotide <400> 13 CGATGAGGAC GCGCCTGTTG

<210> 14 <211> 20 <212> DNA

<213> artificial sequence <223> oligonuclotide <400> 14 TGCAGGAAAG GTTTGGTCTG

<210> 15 <211> LO

<212> DNA

<213> artificial sequence <223> oligonuclotide <400> 15 GAACGCCTCA GAGAAGCCTG

<210> l <211> 20 1.1 <212> DDIA
<213> artificial sequence <2 ~ 3> oligonucleotide <400> lô

<210> 17 <211> 21 <212> DI ~ 1A
<213> artificial sequence <223> oligonucleotide <400> 17 <210> 18 <211> G1 <212> DNA
<213> artificial sequence <223> oligonucleotide <400> 18 <210> 19 <211> 19 <212> DNA
<213> artificial sequence <223> oligonucleotide <900> 19 <210> 20 <211> 19 <212> DNA
<213> artificial sequence <223> oligonucleotide <900> 20 1 ~

<~ 10> 21 <211> ~ O
<212> DNA
<213> artificial sequence <223> oligonucleotide <900> 21 <210> 22 <211> 24 <212> DNA
<213> artificial sequence <223> oligonucleotide <400> 22 cgagatcaca catggctttg atga 24 <210> 23 <211> 18 <212> DNA
<213> artificial sequence <223> oligonucleotide <400> 23 ggacccacac cacacctg 18 <210> 24 <211> ~ ._ ~
<212> DNA
<213> artificial sequence <223> oligonucleotide <400> 24 cggcctggat ctcacccatg ag 22 <210> 25 <211> 26 <212> DNA
<213> artificial sequence <223> oligonucleotide <400> ~ 5 ctgactgctc ccggaagtgc tgggtg 26 <210> 26 <211> 18 <212> DNA
<213> artificial sequence <223> oligonucleotide <400> 2ô
gagcagctct tcttcatc 18 <210> 27 <211> 22 <212> DNA
<213> artificial sequence <223> oligonucleotide <400> ~ 7 ctccaccaat ccatcatgtt gc 22 <210> 28 <211> 6 <212> PRT
<213> artificial sequence <223> protein sequence corresponding to the oligonucleotide probe SEQ ID
# 22 <400> 28 Glu Ile Thr His Phe Asp <210> 29 <211> 6 <212> PRT
<213> artificial sequence <223> protein sequence corresponding to the oligonucleotide probe SEQ ID
n ° 23 <400> 29 Gln Val Trp Cys Gly Ser

Claims (14)

REVENDICATIONS 1. Polypeptide isolé comprenant une séquence d'acides aminés choisie parmi la séquence SEQ ID n°2 ou SEQ ID n° 4, une séquence dérivée ou homologue de ladite séquence SEQ ID n°2 ou SEQ ID n° 4, ou un fragment biologiquement actif de ladite séquence SEQ ID n°2 ou SEQ ID n°
4, ledit polypeptide isolé étant désigné par «NEP II». 1. Isolated polypeptide comprising an amino acid sequence chosen from the sequence SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 4, a derived sequence or homolog of said sequence SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 4, or a fragment biologically active of said sequence SEQ ID No. 2 or SEQ ID No.
4, said isolated polypeptide being referred to as “NEP II”. 2. Acide nucléique isolé comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi la séquence SEQ ID n°1 ou SEQ ID n° 3, une séquence dérivée ou homologue de ladite séquence SEQ ID n°1 ou n° 3, ou leurs séquences complémentaires. 2. Isolated nucleic acid comprising a selected nucleotide sequence from among the sequence SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 3, a sequence derived or homolog of said sequence SEQ ID No. 1 or No. 3, or their sequences complementary. 3. Sonde oligonucléotidique hybridant spécifiquement avec une séquence nucléotidique selon la revendication 2, ladite sonde ayant une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID n°5 à SEQ ID
n°27. 3. Oligonucleotide probe hybridizing specifically with a sequence nucleotide according to claim 2, said probe having a sequence nucleotide chosen from the sequences SEQ ID No. 5 to SEQ ID
#27. 4. Vecteur de clonage et/ou d'expression contenant une séquence nucléotidique selon la revendication 2. 4. Cloning and/or expression vector containing a sequence nucleotide according to claim 2. 5. Cellule hôte transfectée par un vecteur selon la revendication 4. 5. Host cell transfected with a vector according to claim 4. 6. Anticorps mono- ou polyclonaux ou leurs fragments, anticorps chimériques ou immunoconjugués, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus à partir d'un polypeptide selon la revendication 1 administré à un animal, et sont capables be reconnaître spécifiquement un poiypeptide selon la revendication 1. 6. Mono- or polyclonal antibodies or their fragments, chimeric antibodies or immunoconjugates, characterized in that they are obtained from a polypeptide according to claim 1 administered to an animal, and are capable of specifically recognizing a polypeptide according to the claim 1. 7. Procédé de détection immunologique de NEP II dans un échantillon cellulaire ou tissulaire ou dans des cellules ou un tissu comprenant les étapes consistant à:
- mettre en contact ledit échantillon cellulaire ou tissulaire, lesdites cellules ou ledit tissu avec un anticorps détectable selon la revendication 6;
- détecter la présence dudit anticorps, indicatrice de la présence du polypeptide NEP II. 7. Method for immunological detection of NEP II in a sample cell or tissue or in cells or tissue comprising the steps consisting of:
- bringing said cellular or tissue sample into contact, said cells or said tissue with a detectable antibody according to the claim 6;
- detect the presence of said antibody, indicative of the presence NEP II polypeptide. 8. Procédé de détection de l'expression du polypeptide NEP II dans un échantillon cellulaire ou tissulaire ou dans des cellules ou un tissu par hybridation in situ, comprenant les étapes consistant à :
- préparer l'ARN dudit échantillon ou desdites cellules ou dudit tissu;
- mettre en contact ledit ARN obtenu avec au moins une sonde ayant une séquence nucléotidique capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence nucléotidique selon la revendication 2, ladite sonde pouvant être notamment une sonde oligonucléotidique selon la revendication 3 ;
- détecter la présence d'ARNm hybridant avec ladite sonde, indicatrice de l'expression du polypeptide NEP II. 8. Method for detecting the expression of the NEP II polypeptide in a cell or tissue sample or in cells or tissue by in situ hybridization, comprising the steps of:
- preparing the RNA of said sample or of said cells or of said tissue;
- contacting said RNA obtained with at least one probe having a nucleotide sequence capable of hybridizing specifically with a nucleotide sequence according to claim 2, said probe being able be in particular an oligonucleotide probe according to claim 3;
- detecting the presence of mRNA hybridizing with said probe, indicator of the expression of the NEP II polypeptide. 9. Procédé d'identification de composés substrats du polypeptide NEP II
selon la revendication 1, dans lequel on met en contact lesdits composés, éventuellement marqués, avec le polypeptide NEP II, et on évalue la coupure desdits composés par NEP II, indicatrice de l'activité
métalloprotéasique de NEP II envers lesdits composés substrats. 9. Method for Identifying NEP II Polypeptide Substrate Compounds according to Claim 1, in which the said compounds are brought into contact, optionally labeled with the NEP II polypeptide, and the cleavage of said compounds by NEP II, indicative of the activity NEP II metalloproteinase to said substrate compounds. 10. Procédé de détection de l'activité métalloprotéasique de NEP II dans un échantillon cellulaire ou tissulaire ou dans des cellules ou un tissu comprenant les étapes consistant à :
- mettre en contact ledit échantillon cellulaire ou tissulaire, lesdites cellules ou ledit tissu avec un composé substrat du polypeptide NEP II obtenu selon le procédé de fa revendication 9, ledit composé
substrat étant éventuellement marqué ;
- évaluer la coupure dudit composé substrat, indicatrice de l'activité métalloprotéasique de NEP II. 10. Method for detecting the metalloprotease activity of NEP II in a cell or tissue sample or in cells or tissue comprising the steps of:
- bringing said cellular or tissue sample into contact, said cells or said tissue with a substrate compound of the polypeptide NEP II obtained according to the process of claim 9, said compound substrate optionally being labeled;
- evaluating the cleavage of said substrate compound, indicative of the metalloprotease activity of NEP II. 11. Procédé de criblage de composés susceptibles d'inhiber l'activité
métalloprotéasique du polypeptide NEP II selon la revendication 1, dans lequel on met en contact lesdits composés avec ledit polypeptide NEP II et on évalue le taux d'inhibition de l'activité métalloprotéasique de NEP II. 11. Method for screening compounds capable of inhibiting the activity metalloprotease of the NEP II polypeptide according to claim 1, in which said compounds are contacted with said NEP II polypeptide and the level of inhibition of the metalloprotease activity of NEP II is evaluated. 12. Procédé de détection de NEP II dans un échantillon cellulaire ou tissulaire ou dans des cellules ou un tissu comprenant les étapes consistant à :

- mettre en contact ledit échantillon cellulaire ou tissulaire, lesdites cellules ou ledit tissu avec un composé substrat du polypeptide NEP
II
obtenu selon le procédé de la revendication 9 ou avec un composé inhibiteur de l'activité métalloprotéasique de NEP II obtenu selon le procédé de criblage de la revendication 11, ledit composé substrat ou ledit composé inhibiteur étant marqué ;
- détecter la présence dudit composé substrat ou dudit composé
inhibiteur, indicatrice de la présence du polypeptide NEP II. 12. Method for detecting NEP II in a cell sample or tissue or in cells or tissue comprising the steps of:

- bringing said cellular or tissue sample into contact, said cells or tissue with an NEP polypeptide substrate compound II
obtained according to the process of claim 9 or with an inhibitor compound of the metalloprotease activity of NEP II obtained according to the screening method of claim 11, said substrate compound or said inhibitor compound being marked;
- detecting the presence of said substrate compound or said compound inhibitor, indicative of the presence of the NEP II polypeptide. 13. Utilisation du polypeptide NEP II selon la revendication 1 pour le criblage de composés inhibiteurs de l'activité métalloprotéasique de NEP II utiles pour la fabrication de médicament destiné à traiter les troubles impliquant les transmissions peptidergiques auxquelles participe NEP II. 13. Use of the NEP II polypeptide according to claim 1 for the screening useful NEP II metalloprotease activity inhibitor compounds for the manufacture of medicaments for treating disorders involving the peptidergic transmissions in which NEP II participates. 14. Utilisation selon la revendication 13 dans laquelle lesdits troubles sont choisis parmi les maladies cardiovasculaires, neurodégénératives, les troubles de la croissance d'origine endocrinienne, les perturbations de l'axe hypothalamo-hypophysaire et les affections endocriniennes. 14. Use according to claim 13 wherein said disorders are selected from cardiovascular and neurodegenerative diseases, growth disorders of endocrine origin, disturbances of the hypothalamic-pituitary axis and endocrine disorders.
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