CA2258872A1 - Procede de preparation d'organes de mammiferes non humains transgeniques en vue de leur transplantation chez l'homme, et sequences nucleotidiques pour la mise en oeuvre de ce procede - Google Patents

Abstract

L'invention a pour objet l'utilisation de séquences nucléotidiques codant pour des anticorps dirigés contre toute molécule impliquée dans un phénomène de rejet de greffe (encore désignés ci-après anticorps anti-molécules), pour la préparation de cellules transgéniques, ou organes transgéniques, de mammifères non humains, au sein desquels lesdites molécules forment en totalité ou en partie des complexes immuns avec lesdits anticorps anti-molécules, de telle sorte que l'activité desdites molécules dans les phénomènes de rejet de greffe soit totalement ou partiellement inhibée, lesdites cellules ou lesdits organes transgéniques de mammifères non humains étant destinés à être greffés chez un patient.

Description

CA 022=,8872 1998-12-16 WO 98/036S3 PCT/P~7/01340 PROCEDE DE PREPARATION D'ORGANES DE MAMMIFERES NON
HUMAINS TRANSGENIQUES EN VUE DE LEUR TRANSPLANTATION
CHEZ L'HOMME, ET SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES POUR LA
s MISE EN OEUVRE DE CE PROCEDE

La présente invention a pour objet l'utilisation de séquences nucléotidiques 0 pour la mise en oeuvre d'un procédé de préparation d'organes de m~mmifères non hllm~in~ transgéniques susceptibles d'être greffés chez l'homme en réduisant sensiblement les risques de rejet de greffes.
La transplantation d'organes animaux chez l'homrne, ou xénotransplantation, est une technique considérée actuellement comme une 5 alternative possible, permettant de pallier le manque crucial de donneur en allogreffe. Des avancées spectaculaires dans ce domaine ont été réalisées depuisquelques années, et le porc comme animal donneur s'impose à la communauté
scientifique et médicale. Les raisons de ce choix, par opposition au choix de primates comme donneurs d'organes sont multiples: le risque de transmission de 20 virus pathogènes pour l'homme est bien moindre à partir du porc (Allan, 1996), I'élevage et le temps de reproduction des primates, à l'opposé du porc, rend leur utilisation difficile, et une barrière d'ordre éthique non négligeable existe pour l'utilisation de singes à des fins de médecine hllm~ine L'obstacle majeur à
l'utilisation de greffons de porc chez l'homme est avant tout immunologique:
2s l'homme possède des anticorps naturels (appelés xénoanticorps naturels-XAN-) dirigés contre des molécules exprimées par les cellules porcines. Lorsqu'un organe de porc est greffé chez l'homme (et chez les primates supérieurs qui possèdent aussi ces anticorps), ces anticorps réagissent avec l'endothélium vasculaire entraînant un rejet suraigu de l'organe. Il s'agit en fait de la perte, 30 induite par les XAN et le complément, de l'intégrité de l'endothélium vasculaire entrainant un oedème, une infiltration cellulaire et une destruction de l'organe~- (Bach et al., 1995). Les antigènes porcins reconnus par les XAN ont été
analysés: il s'agit majoritairement d'une structure glucidique constituée de ~ galactose branché en configuration al,3 sur le N-acétyllactosamine (épitope a-,s galactosyl) présent sur les glycolipides et les glycoprotéines de membrane (Sandrin et al., 1993).

CA 022~8872 1998-12-16 Les travaux réalisés par l'équipe de D. White (Cambridge) ont permis de résoudre partiellement ce problème de rejet hyperaigu: en bloquant l'activation du complément humain à la surface des cellules de l'endothélium porcin (Carrington et al, 1995), ils sont parvenus à réaliser des gret'fes de coeur de porc chez le macaque, dont la survie semble similaire à la survie d'une allogreft'e (greffe d'un organe de la même espèce) réalisée dans les mêmes conditions, dans la mesure où le dépôt de XAN n'est pa.s trop massif.
Techniquement, cela a été réalisé par insertion, par transgenèse germinale, d'une molécule régulatrice du complément humain, le DAF (pour decay n accelerating factor, ou CD55), dans le génome de porc. Cette molécule, spécifique d'espèce, empeche la C3 convertase humaine d'enclencher la réaction en chaîne d'activation du complément à la surface des celluies porcines. Cette molécule semble toutefois " dépassée " lorsque la quantité de complément fixée est trop importante. Dans ce cas, un rejet survient quand même.
:- La présence des épitopes oc-galactosyl, le xénoantigène majeur sur lescellules porcines, est due à l'action d'une enzyme golgienne, UDP-Gal:Gal(x1-4GlcNacoc1,3-galactosyltransférase (encore désignée enzyme al,3GT).
I 'enzyme a1,3GT participe à la fixation de galactose, en configuration o~1,3, sur le galactose du N-acétyllactosamine des glycoprotéines et glycolipides ~o membranaires, ce qui crée un épitope xénoantigénique appelé a-galactosyl constitué de l'ensemble Gal(x1,3Gal-N-acétyllactosamine. L'inactivation du gène codant pour cette enzyme chez le porc pourrait bloquer la synthèse des épitopes a-galactosyl et induirait la non reconnaissance des cellules de porc par les XANhumains. Cette inactivation, utilisée conjointement a I'expression de DAF
~5 humain chez le porc, pourrait représenter un bénéfice décisif pour la réussite de la xénogreffe d'organes de porc chez l'homme. Cependant, I'inactivation d'un gène par recombinaison homologue ("gene knock out") est une technique dont l'utilisation est actuellement restreinte à la souris, car sa mise en oeuvre nécessite la disponibilité de cellules souches embryonnaires, dites cellules ES.~o Ces cellules, malgré d'intenses recherches, n'ont jamais pu etre obtenues chez une autre espèce que la souris. L'inactivation de l'a1,3GT chez le porc ne peut donc pas être réalisée par cette technique.
A part les molécules xénoantigéniques et les molécules participant à la biosynthèse de ces dernières, il existe d ' autres molécules dont 1 ' inhibition~,~ pourrait être utile en xénotransplantation, en particulier les molécules dont 1 ' activité biologique concourt AU rejet de greffe, sans que ces molécules ne soient des xénoantigènes ou ne participent à la synthèse de xénoantigènes. Il CA 022~8872 1998-12-16 W O 98/03653 PCTA~R97/01340 s ' agit notamment de I 'ensemble des molécules à caractère intlammatoire produites par l'endothélium du greffon, en particulier lors d'une xénogreft'e:
cytokines (IL-1, IL-6), facteurs chémotactiques (IL-8, IP-10, RANTES, MCP/JE, inhibiteurs pl5E, GFM-CSF, G-CSF), molécules d'adhésion (ELAM-1, VCAM-1, ICAM-1, c-sis, GPlba, vWF, ligand LAM-1), facteurs de transcription (c-fos, NFkB, Gem), régulateurs du tonus vasculaire (iNO
syntllase, PGH synthase, endothéline), facteurs intervenant dans la coagulation (PAF acétyltransférase, facteur tissulaire, PAI-1), t'acteurs d'immunocompétence(CMH 1, CMH II). Il s'agit aussi des récepteurs, exprimés par l'endothélium du o greffon, à des molécules provenant du receveur et ayant une activité biologique concourant au rejet de greffe: récepteur au CSa, récepteur au TNFa, récepteur à l'INFy, récepteurs aux cellules NK.
La présente invention a pour but de fournir des organes de m~mmifères non humains transgéniques susceptibles d'être gref~ës chez des patients nécessitant une greffe d'organes, avec diminution du risque de phénomène de rejet du greffon, voire complète ~nn~ tion de ce risque.
La présente invention a également pour but de fournir des séquences nucléotidiques susceptibles d'être utilisées pour la transformation génétique d'animaux en vue d'obtenir les susdits organes.
~o L'invention a également pour but de fournir des m~mmifères non humains transgéniques à partir desquels sont susceptibles d ' être prélevés les susdits organes .
La présente invention a pour objet l'utilisation de séquences nucléotidiques codant pour des anticorps dirigés contre toute molécule impliquée dans un 7~ phénomène de rejet de greffe (encore désignés ci-après anticorps anti-molécules), et notamment contre toute molécule possédant une activité telle que ladite molécule représente un épitope xénoantigénique, ou participe à la biosynthèse d'épitopes xénoantigéniques dans des cellules de m~mmifères non humains (et plus particulièrement à la surface de ces cellules), ces épitopes étant .o susceptibles d'être reconnus par des xénoanticorps naturels humains lorsque lesdites cellules, ou organes constitués de ces cellules, de mammifères non humains, sont greffés chez l'homme, pour la préparation de cellules transgéniques, ou organes transgéniques, de mammifères non humains. au sein desquels lesdites molécules forment en totalité ou en partie des complexes ,~ immuns avec lesdits anticorps anti-molécules, de telle sorte que l'activité
desdites molécules dans les phénomènes de rejet de greffe soit totalement ou partiellement inhibée, en particulier que les xénoanticorps susmentionnés ne CA 022~8872 1998-12-16 W O 98/03653 PCT~R97/01340 reconnaissent plus, en totalité ou en partie, les susdits épitopes, ou au sein desquels la biosynthèse desdits épitopes xénoantigéniques est partiellement ou totalement inhibée, lesdites cellules ou lesdits organes transgéniques de mammitères non humains étant destinés à être greffés chez un patient.
Les séquences nucléotidiques utilisées dans le cadre de la présente inventioll sont avantageusement celles codant pour des anticorps dirigés contre:- tout épitope xénoantigénique, glucidique ou non glucidique, reconnu par des xénoanticorps humains, et plus particulièrement les épitopes glucidiques galactosylés situés à la surface des membranes de cellules de mammifères non humains, notamment l'épitope a-galactosyl présent à la surface de cellules de porc et constitué de l'ensemble Galal,3Gal-N-acétyllactosamine susmentionné, - toute molécule participant à la biosynthèse d'épitopes xénoantigéni4ues chez l'homme, de nature glucidique ou non glucidique, et plus particulièrement les galactosyltransférases présentes dans les cellules de mammifères non humains, notamment l'enzyme al,3GT présente dans les cellules de porc, - toute molécule à caractère inflammatoire synthétisée dans l'endothélium de mam~nifères non humains, et dont l'activité biologique conduit notamment à
la modification des propriétés anticoagulantes de l'endothélium in vivo en milieu xénogénique, telle que les cytokines et chemoattracteurs (IL-l, IL-6, IL-8, IP-~o 10, RANTES, MCP/JE, inhibiteurs plSE, GM-CSF, G-CSF), les molécules d'adhésion (ELAM-1, VCAM-1, ICAM-1, c-sis, GPlba, vWF, ligand LAM-l) les facteurs de transcription ou modifiant la transcription (c-fos, NFkB, Gem), les régulateurs du tonus vasculaire (iNO synthase, PGH synthase, endothéiine).
Ies l'acteurs intervenant dans la coagulation (PAF acétyltransférase. facteur tissulaire, PAI-1), les facteurs d'irnmunocompétence (CMH I, CMH II), - les récepteurs membranaires à des molécules présentes chez le receveur, I'action de ces molécules étant dirigée vers un rejet de greffe, dont par exemple le C5aR, ou le TNFaR, ou les récepteurs aux cellules NK.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation de molécules 30 impliquées dans un phénomène de rejet de greffe, telles que décrites ci-dessus, pour IA mise en oeuvre d'un procédé d'obtention, notarnrnent selon les méthodes décrites ci-dessous, de séquences nucléotidiques codant pour des anticorps dirigés contre les susdites molécules, ces séquences nucléotidiques étant elles-mêmes susceptibles d'être utilisées pour la préparation de cellules trans~éniques, 3~ ou d'organes transgéniques tels que définis ci-dessus selon l'invention.
Avantageusement, les séquences nucléotidiques utilisées dans le cadre de 1 ' invention sont obtenues par sélection des susdits anticorps anti-molecules à

CA 022~8872 1998-12-16 Wo 98/03653 PCT/FR97/01340 savoir des anticorps dirigés contre les molécules impliquées dans un phénomène de rejet de gref'fe, cette sélection étant effectuée A l'aide desdites molécules- utilisées en tant que molécules cibles reconnues par lesdits anticorps, et séquençage des séquences nucléotidiques codant pour lesdits anticorps ainsi - s sélectionnés.
Lesdits anticorps anti-molécules sont eux-mêmes avantageusement obtenus à partir de tout hybridome susceptible d ' être formé, par des méthodes classiques, à partir de cellules spléniques d'un animal, notamment de souris ou de rat, immunisés contre l'une desdites molécules impliquées dans un o phénomène de rejet de greffe, d 'une part, et des cellules d ' un myélome approprié d'autre part, ledit hybridome étant sélectionné par sa capacité à
produire des anticorps monoclonaux reconnaissant ladite molécule initialement mise en oeuvre pour l'immunisation des ~nim~llx.
L' ADN des hybridomes ainsi sélectionné est ensuite cloné, selon les techniques bien connues de I ' homme de métier, dans des hôtes cellulaires susceptibles de produire lesdits anticorps monoclonaux, les séquences nucléotidiques codant pour lesdits anticorps ainsi sélectionnés, étant ensuite séquencées.
Lesdits anticorps anti-molécules peuvent également être obtenus par criblage d'une banque d'anticorps (telle que la banque décrite dans l'article deNissim et al., 1994) avec lesdites molécules, ladite banque d'anticorps étant construite à partir de séquences d'ADN d'immunoglobulines h~lm~ines ou murines, ou issues d'une autre espèce, dans un hôte cellulaire (notamment dans des phages) susceptibles d'exprimer les anticorps codés par lesdites séquences ~s d'ADN d'immunoglobulines.
Avantageusement, les anticorps susmentionnés, à partir desquels sont déduites les séquences nucléotidiques utilisées dans le cadre de la présente invention sont des anticorps simple brin (encore désignés anticorps ScFv).
Ces anticorps ScFv sont avantageusement obtenus à partir d'une banque d ' anticorps telle que décrite ci-dessus, dans laquelle les séquences d ' ADN
codant pour ces anticorps sont traitées, notamment selon la méthode décrite dans- I'article de Nissim et al., 1994, de manière à obtenir des anticorps simple brin, notamment par jonction de tout ou partie d'une séquence d'ADN codant pour une chaîne lourde d' immunoglobuline avec tout ou partie d'une séquence 3~ d'ADN codant pour une chaîne légère d'immunoglobuline.
Ces anticorps ScFv peuvent également être obtenus par clonage de l'ADN
complémentaire (ADNc) issu d'hybridomes, tels que décrits ci-dessus, codant CA 022~8872 1998-12-16 W 098/03653 PCT~R97/01340 pour une immunoglobuline dirigée contre une desdites molécules impliquées dans un phénomène de rejet de greffe, suivi d'un traitement, tel que décrit ci-dessus, de manière à obtenir des anticorps simple brin par jonction de tout ou partie de la fraction dudit ADNc codant pour la chaîne lourde de I'immunoglobuline avec tout ou partie de la traction dudit ADNc codant pour la chaine légère de cette immunoglobuline.
Selon un mode préféré de réalisation de 1 ' invention, les séquences nucléotidiques utilisées pour la préparation de cellules ou organes transgéniques susmentionnés, sont celles codant pour des anticorps dirigés contre toute molécule impliquée dans la biosynthèse d'épitopes xénoantigéniques dans les cellules de mammifères non humains.
Avantageusement, les séquences nucléotidiques utilisées dans le cadre de la présente invention sont celles codant pour des anticorps dirigés contre l'uneau moins des isoformes (et avantageusement contre toutes les isoformes) des galactosyltransférases présentes chez les m~mmifères non humains, et plus particulièrement contre l'une au moins des isoformes de l'al,3GT présente chez le porc, pour la préparation d ' organes de mammifères non humains transgéniques au sein desquels la biosynthèse des épitopes a-galactosyl dans lescellules desdits organes est partiellement ou totalement inhibée.
~o A ce titre, I'invention a plus particulièrement pour objet les anticorps, le cas échéant simple brin, dirigés contre l'une au moins des isoformes de l'al,3GT lesdits anticorps étant tels qu'obtenus par mise en oeuvre d'une des méthodes décrites ci-dessus effectuées à l'aide d'une ou plusieurs isoformes de l'al,3GT, en tant que molécules impliquées dans un phénomène de rejet de s greffe .
L'invention concerne plus particulièrement les anticorps tels que décrits ci-dessus, dirigés contre l'une au moins des isoformes de l'al,3GT présentes chez le porc, et notamment contre l'une au moins des isoformes représentées par les séquences en acides aminés SEQ ID NO 2 (correspondant à l'isot'orme 1), ~o SEQ ID NO 4 (correspondant à l'isot'orme 2), SEQ ID NO 6 (correspondant à
l'isoforme 3) et SEQ ID NO 8 (correspondant à l'isoforme 4), ces isoformes 1 à
4 étant respectivement codées par les séquences nucléotidiques représentées par SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3~ SEQ ID NO 5 et SEQ ID NO 7, ou codées par toutes séquences nucléotidiques dérivées de ces dernières, notamment par ,~ dégénérescence du code génétique.
L' invention vise plus particulièrement les anticorps tels que décrits ci-dessus, dirigés contre l'une au moins des isoformes 3 et 4 de 1'(x1.3GT

CA 022~8872 1998-12-16 W O g8/036S3 PCT~R97/01340 présentes chez le porc et représentées par les séquences en acides aminés SEQ
ID NO 6 et SEQ ID NO 8.
Avantageusement les anticorps anti-al,3GT susmentionnés de l'invention sont des anticorps simple brin dont les séquences en acides aminés sont telles qu'elles contiennent les parties CDR1, CDR2 et CDR3 de la chaîne lourde desdits anticorps anti-al,3GT reliés par une séquence liante (linker) d'environ 6 à environ 36 acides aminés, à tout ou partie de la chaîne légère V~3 des anticorps anti-al,3GT susmentionnés.
Un linker particulièrement préféré est celui constitué de trois répétitions successives de la séquence en acides suivante:
Gly - Gly- Gly- Gly- Ser Des anticorps particuliers selon l'invention sont ceux représentés par les séquences en acides aminés SEQ ID NO 10 (anticorps désigné ScFvl), SEQ ID
NO 12 (anticorps désigné ScFv2), SEQ ID NO 14 (anticorps désigné ScFv3), SEQ ID NO 16 (anticorps désigné ScFv4) et SEQ ID NO 18 (anticorps désigné
ScFv5), ou par toute séquence en acides aminés dérivée de ces dernières, notamment par addition, suppression ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés, ou par tout fragment des séquences susmentionnées ou de leurs séquences dérivées, lesdites séquences dérivées et lesdits fragments étant ~o susceptibles de reconnaître l'une au moins des isoformes de 1'~1,3GT.
L'invention a également pour objet les séquences nucléotidiques codant pour un anticorps anti-Gc1,3GT tel que décrit ci-dessus, et comportant notamment les séquences nucléotidiques représentées par SEQ ID NO 9 (codant pour ScFvl),SEQ ID NO 11 (codant pour ScFv2),SEQ ID NO 13 (codant pour ~5 ScFv3), SEQ ID NO 15 (codant pour ScFv4), SEQ ID NO 17 (codant pour ScFv5), ou toute séquence nucléotidique dérivée de ces dernières, notamment les séquences dérivées par dégénérescence du code génétique, et étant néanmoins capables de coder pour les anticorps ScFvl, ScFv2, ScFv3, ScFv4 ou ScFv5, ou les séquences dérivées par addition, suppression ou substitution io d'un ou plusieurs nucléotides, ou tout fragment des séquences nucléotidiques susmentionnées ou de leurs séquences dérivées, lesdites séquences dérivées et - lesdits t'ragments étant susceptibles de coder pour un anticorps susceptible de reconnaître l'une au moins des isoformes de 1'1x1,3GT.
Les séquences nucléotidiques SEQ ID NO 9,SEQ ID NO ll,SEQ ID NO
i~ 13~ SEQ ID NO 15 et SEQ ID NO 17 susmentionnées sont avantageusement obtenues par séquençage des ADNc codant pour les anticorps représentés par SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 16 et SEQ ID

CA 022~8872 1998-12-16 W O 98/03653 PCT~FR97/01340 NO 18 respectivement, ces ADNc provenant de clones cellulaires sélectiolmé~s pOUl leur capacité à produire lesdits anticorps, la sélection desdits clones cellulaires étant effectuée à l'aide de l'isoforme 2 de 1'(x1,3 GT (à savoir du polypeptide représenté par SEQ ID NO 4) utilisée en tant que molécule cible reconnue par lesdits anticorps, lesdits clones cellulaires, étant eux-mêmes obtenus par transformation de cellules, notamment de bactéries ou de pha~es, avec des séquences nucléotidiques provenant d'une banque d'ADNc codant pour des anticorps, telle que la banque susmentionnée décrite par Nissim et al., 1994, ou provenant d'hybridomes obtenus selon la technique indiquée ci-dessus par immunisation d'un animal avec ladite isoforme n~ 2 de 1'o~1,3GT.
E' invention a également pour objet tout vecteur, notamment plasmide, contenant l'une au moins des séquences nucléotidiques décrites ci-dessus selon l'invention, notamment l'une au moins des séquences SEQ ID NO 9, SEQ ID
NO 11, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 15 ou SEQ ID NO 17, et les éléments nécessaires à l'expression des anticorps anti-molécules, et plus particulièrement des anticorps anti-oc1,3GT susmentionnés.
L'invention concerne également tout hôte cellulaire (telle qu'une cellule eucaryote) contenant l'un au moins des vecteurs tels que décrits ci-dessus, selon l ' invention.
L'invention concerne également tout mammifère transgénique non humain.
ou toute cellule de m~mmifère transgénique non humain, comprenant dans leur génome au moins une séquence nucléotidique décrite ci-dessus, codant pour des anticorps anti-molécules tels que décrits ci-dessus, et plus particulièrement pour des anticorps anti-oc1,3GT susmentionnés.
L'invention a plus particulièrement pour objet tout mammifère transgénique non humain, ou toute cellule de m~mmifère transgénique non humain, tels que décrits ci-dessus, comprenant dans leur génome au moins une des séquences nucléotidiques représentées par SEQ ID NO 9, SEQ ID NO ll SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 15 et SEQ ID NO 17, ou au moins une séquence dérivée ou fragment tels que définis ci-dessus, desdites séquences nucléotidiques .
Avantageusement, les mammifères transgéniques non humains, selon l'hlvention sont tels qu'obtenus par introduction, notamment par microinjection,dallS Ull ovocyte fécondé, d'au moins une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, codant pour un anticorps anti-molécules tel que défini ci-dessus~ et plus particulièrement d'au moins une des séquences nucléotidiques représentées par SEQ ID NO 9, SEQ ID NO ll, SEQ ID NO 13, SEQ NO 15 CA 022~8872 1998-12-16 W 098/03653 PCT~R97/01340 et SEQ ID NO 17, ou leur séquence dérivée ou tragment tels que définis ci-dessus. et insertion de l'embryon dans la matrice d'une mère de substitution et développement de l'embryon à terme.
L,' invention a également pour objet tout mammifère transgénique non humain défini ci-dessus, tel que produit par croisement d'animaux transgéniques exprimant au moins une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, codant pour un anticorps anti-molécules, et plus particulièrement au moins une des séquences nucléotidiques représentées par SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 15 et SEQ ID NO 17, ou leur séquence dérivée ou 0 fragment tels que définis ci-dessus.
A titre d'illustration~ les mamrnifères transgéniques non humains, selon-I' invention, peuvent être obtenus selon la méthode décrite dans l'article de DePamphilis M.L., et al., 1988.
Parmi les m~mmifères transgéniques non humains susceptibles d'être obtenus dans le cadre de la présente invention, on peut citer la souris, le rat. Ie porc ou le lapin.
L' invention a plus particulièrement pour objet les porcs transgéniques contenant dans leur génome au moins une des séquences nucléotidiques représentées par SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO
~o lS et SEQ ID NO 17, ou leur séquence dérivée ou fragment tels que définis ci-dessus .
L'invention concerne également les cellules cultivées à partir des animaux transgéniques non humains tels que décrits ci-dessus.
L' invention a également pour objet les organes de m~mmifères non ~s humains, et plus particulièrement les organes de porc, notamment les reins, le foie le pancréas ou le coeur, colllplenant dans le génome des cellules les constituant au moins une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, codant pour un anticorps anti-molécules, et plus particulièrement d'au moins unedes séquences nucléotidiques représentées par SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 15 et SEQ ID NO 17,ou leur séquence dérivée ou fra ment tels que définis ci-dessus, lesdits organes étant tels qu'obtenus par - prélèvement sur des mammifères transgéniques non humains selon l'invention.
L'invention concerne également tout polypeptide comprenant la séquence - d'acides aminés telle que représentée par SEQ ID NO 6 (correspondant à
3~ l'isoforme 3 de l'al,3GT) ou SEQ ID NO 8 (correspondant à l'isoforme 4 de 1'c~1~3GT), ou tout polypeptide contenant tout fragment d'au moins environ 6 acides aminés, de l'une des susdites séquences d'acides aminés, ledit , , CA 022~8872 1998-12-16 WO 98/03653 PCTtFR97/01340 polypeptide contenant ce fragment étant susceptible de générer des anticorps reconnaissant l'une au moins des quatre isoformes de l'al,3GT, ou comprenant toute séquence dérivée de ces dernières, notamment par addition, suppression ou modification d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que la séquence s dérivée soit susceptible de générer des anticorps reconnaissant l'une au moins des quatre susdites isoformes.
L' invention a également pour objet les séquences nucléotidiques col-nprenant les séquences représentées par SEQ ID NO S et SEQ ID NO 7, ou toutes séquences dérivées, notamment les séquences dérivées par dégénérescence 0 du code génétique, et étant néanmoins capables de coder pour les polypeptides représentés par les séquences en acides aminés représentées par SEQ ID NO 6-et SEQ ID NO 8 respectivement, ou les séquences dérivées par addition, suppression ou substitution d'un ou plusieurs nucléotides, ou tout fragment des séquences nucléotidiques susmentionnées ou de leur séquences dérivées, lesdites s séquences dérivées et lesdits fragments étant susceptibles de coder pour un anticorps susceptible de reconnaître l'une au moins des isoformes de l'al,3GT.
L' invention concerne également tout vecteur, notamment plasmide, comprenant au moins une séquence nucléotidique codant pour les séquences représentées par SEQ ID NO 5 ou SEQ ID NO 6, ou par une séquence dérivée ~o ou fragment ce ces dernières, tels que définis ci-dessus, ainsi que les éléments nécessaires à l'expression des isoformes de l'al,3GT codées par lesdites séquences nucléotidiques.
L'invention vise également tout hôte cellulaire transformé par un vecteur tel que décrit ci-dessus, ainsi que tout procédé de préparation des isoformes 3 et ~5 4 susmentionnées de l'al,3GT par mise en culture dudit hôte cellulaire dans un milieu de culture approprié, et séparation desdites isoformes des autres constituants du milieu de culture.
L' invention a plus particulièrement pour objet toutes séquences nucléotidiques avantageusement obtenues par séquençage des ADNc codant pour ,o les anticorps dirigés contre les isoformes 3 et 4 susmentionnées de l'al.3GT.ces ADNc provenant de clones cellulaires sélectionnés pour leur capacité à
produire lesdits anticorps, la sélection desdits clones cellulaires étant effectuée à
l'aide de l'isoforme 3 et/ou 4 de l'al,3 GT (à savoir des polypeptides représentés par SEQ ID NO 6 et SEQ ID NO 8, respectivement) utilisées en tant ,s que molécules cibles reconnues par lesdits anticorps, lesdits clones cellulaires, étant eux-mêmes obtenus par transformation de cellules, notamment de bactéries ou de phages, avec des séquences nucléotidiques provenant d ' une banque CA 022~8872 1998-12-16 d'ADNc codant pour des anticorps, telle que la banque susmentionnée décrite par Nissim et al., 1994~ ou provenant d'hybridomes obtenus selon la technique indiquée ci-dessus par immllni~a~ion d'un animal avec ladite isoforme 3 ou ladite isotorme 4 de 1'al,3GT.
L' invention a également pour objet toute méthode, notarnment chirurgicale, de traitement de patients nécessitant une greffe de cellules ou d ' organes, par implantation desdites cellules transgéniques selon I ' invention dans des tissus appropriés dudit patient, ou par suppression de 1 ' organe dét'ectueux du patient et remplacement de cet organe défectueux par un organe de mammifère non humain transgénique selon l'invention.
L'invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit de l'obtention des différentes isoformes de l'al,3GT de porc, ainsi que de la transformation de cellules animales à l'aide de séquences nucléotidiques codant pour des anticorps anti-al,3GT selon l'invention, et de procédures d'obtention d'animaux transgéniques selon l'invention.

I - Obtention des différents isoformes de l'al,3 GT

1) Procédures expérimentales ~o a) Cellules et tissus Les organes porcins ont été obtenus à partir de porcs d'environ 200 à 300 kg. L'isolement enzymatique et la culture des cellules endothéliales aortiques de porc (PAEC) ont été réalisés selon la méthode décrite dans l'article de Warren, ~5 1990. Les PAEC sont stimulées avec 100 U/ml de TNFa humain (Genzyme, Cambridge, USA) en présence ou non delO ,ug/ml de cycloheximide.

b) Oligonucléotides Les oligonucléotides suivants ont été utilisés:
- oligonucléotide 1 5'-AGGAAGAGTGGTTCTGTC-3' hybridant aux nucléotides 24 à 41 de la séquence SEQ ID NO 1, -oligonucléotide 2 5'-GTTATGGTCACGACCTCT-3' hybridant aux nucléotides 323 à 306 de la ,5 séquence SEQ ID NO 1, -oligonucléotide 3 5 ' -TATAGAATTCGAAAATAATGAATGTCAAAGGAATAGTGGTTCTGTC

CA 022~8872 1998-12-16 W 0 98/03653 PCT~R97/01340 -3' hybridant à un site EcoRI situé en amont des nucléotides l à 41 de la séquence SEQ ID NO 1, - oligonucléotide 4 5'-ATATAACTAGTGGAAGCTCTCCTCTGTTG-3'- hybridant aux nucléotides s 278 à 255 de la séquence SEQ ID NO 1, et introduisant une mutation de G en A
dans la troisième base du codon codant pour une proline, - oligonucléotide 5 5'-ATATACTAGTGGACTGGTTTAATC-3' hybridant aux nucléotides 275 à
292 de la séquence SEQ ID NO 1, et introduisant la même mutation de G261 en n A comme dans le cas de l'oligonucléotide 4, - oligonucléotide 6 5 ' -GAGTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAATCGATGTTATTTCTAACCA
AATT-3' hybridant aux nucléotides 1105 à 1123 de la séquence SEQ ID NO 1, et additionné en phase à un oligonucléotide codant pour un peptide FLAG
(Kodak, New Haven, USA) un codon stop et un site Xhol.

o c) clonage et construction Un clone d'ADNc al,3GT de 2 Kb (pCDNA-aGT) a été isolé d'une banque d'ADNc construite dans le vecteur pCDNA-1 (Invitrogen, Leek, Pays-Bas) par hybridation de transfert en utilisant une sonde PCR amplifiée avec les amorces 1 et 2 (dérivées de la séquence publiée dans l'article de Sandrin et al., ~s 1994. Ce clone correspond à celui de l'isoforme n~ 2.
Les isoformes 1, 3 et 4 de l'al,3GT porcine ont été isolées par amplification par PCR d'une région comprenant les exons 4 à 7 avec les amorces 1 et 2, en utilisant l'ARN rétro-transcript des PAEC. Les fragments amplifiés sont traités par la polymérase de Klenow, pour obtenir des extrémités franches, et clonés dans le site Smal du plasmide pUC18. Troi.s clones contenantdes fragments de 300, 237 et 201 pb ont été obtenus et utilisés en tant que matrice pour introduire, par amplification PCR secondaire, un site EcoRI à
l'extrémité 5' (avec l'oligo 3) et un site SpeI dans l'exon 7 (avec l'oligo 4).
L'introduction de ce site SpeI ne modifie pas la séquence en acides aminés. Les 3s produits de PCR ont été ligués dans un plasmide pKS digéré par EcoRI-SpeI. La partie 3' restante de la séquence codante a été amplifiée par PCR à partir du clone pCDNA-aGT avec les amorces 5 et 6, traitée pour obtenir des extrémités CA 022~8872 1998-12-16 WO 98/03653 PCTtFRs7/01340 t'ranches et clonée dans le site EcoRV d'un plasmide pKS. A partir de ce plasmide recombinant, un fragment Spel portant la région codante du nucléotide 262 à 1125, en phase avec une séquence FLAG (contenue dans l'oligonucléotide 6)~ a été isolée et clonée dans les sites SpeI des plasmides pKS contenant les régions 5' variables. Les construits résultant ont été contrôlés par séquençage, et les fragments EcoRI, contenant les séquences codantes entières ont été sous-clonés dans le vecteur d'expression encaryotique pCDAAS-néo conduisant l'expression du transgène sous contrôle du promoteur du CMV. L'isoforme 2 de l'o~GT porcine a été isolée de la même manière, en utilisant le clone pcDNA-~GT comme matrice initiale.

d) transfection de cellules Des cellules HeLa cultivées en RPMI - 10 % FCS ont été traitées par la :- trypsine, resuspendues à raison de 5.106 cellules/ml dans un milieu glacé et mélangées avec 20 ~g/ml d'ADN plasmidique portant le transgène et un gène de résistance à la néomycine. Les cellules ont été traitées par électroporation à 250 V, 350 ,uF, laissées dans la glace pendant 10 mn et ensemencées à raison de 2000 cellules/cm2. Après 24 h, 500 ,ug/ml G418 ont été additiormés et les cellules ont été cultivées pendant deux semaines. Les clones ont été isolés et cultivés en présence de G418.

e) immunofluorescence Les clones de cellules HeLa exprimant une des quatre isoformes de l'a ~5 1,3GT ont été ensemencées sur des lamelles à 4 chambres pour microscope (Nunc, Rookilde, Danemark), pour l'analyse de l'expression des épitopes o~-galactosyl sur les membranes cellulaires. Deux jours après l'ensemencement, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS, fixées pendant 10 mn à
température ambiante avec du paraformaldéhyde 3 %, lavées encore et incubées 30 pendant une heure à température ambiante avec l ' isolectine B4 - FITC de Banderaea simplicifolia (Sigma, St Louis, USA), dilution au 1.100 dans du PBS. Les lamelles ont été lavées 4 fois dans du PBS avant montage. Pour la localisation subcellulaire, les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde 3 % et perméabilisées par trois incubations séquentielles de 5 mn avec 50 %, 100 3~ % et 50 % d'acétone glacée. Après trois lavages avec du PBS/Tween-20 0,5 %, les cellules ont été incubées avec l'anticolps anti-FLAG M2 (1:200; Kodak, New Haven, USA), puis incubées pendant une heure avec un anticorps CA 022~8872 1998-12-16 secondaire d'âne anti-souris marqué au FITC (1: 500; Jackson, Baltimore, USA). Les préparations ont été montées dans un fluide FA (Dit'co, Grayson, IJSA) et visualisées avec un microscope à épiiluorescence Nikon.

l) Analyses par transfert d'ADN (Northern blot) L'ARN cellulaire total a été isolé à partir de cellules cultivées et d'organes décrits par Zipfel et al.., 1989. Dix ~g d'ARN total ont été fractionnés sur un gel d'agarose/formaldéhyde, transférés sur une membrane Hybond N
(Amersham, Little Chalfont, UK) par action capillaire dans 20 X SSC pendant 16 h et immobilisés par réticulation aux UV. Les filtres ont été pré-hybridés pendant 6 h dans une solution contenant 50 % de formamide, 5 X SSPE (0,18 M NaCl, 10 mM phosphate de sodium, pH7,7, 1 mM EDTA), 5 X Denhart's, 0.5 % SDS, et 100 ~lg/ml d'ADN dénaturé de sperme de saumon. L'ARN lié
aux membranes a été hybridé avec des sondes d ' ADNc marquées au p32 correspondant à la région codante de l'isoforme 1 de 1'o~1,3 GT, à la ~-actine porcine ou à l'ARN 28S. L'hybridation a été réalisée pendant une nuit à 42~C
dans une solution de pré-hybridation contenant 106 cpm/ml d'une sonde. Les filtres ont été lavés deux fois dans 2 X SSPE, 0,5 % de SDS à température ambiante pendant 15 mn, et trois fois dans 0,5 X SSPE, 0,5 % SDS à 65 ~C
~o pendant 15 mn. L'hybridation a été visualisée et les signaux quantifiés avec un dispositif phosphorimage (Molecular Dynamics, Sunnyvale, USA).

g) test de protection à la RNase Les tests de protection à la RNase ont été réalisés selon la méthode décrite 5 par Melton et al., 1984. Deux sondes d'ARN, complémentaires des exons 5 et 6, et des exons. 4 et 7, ont été préparées de la manière suivante: deux fragments EcoRI-Spe~, correspondant aux nucléotides 7 à 266 du clone c~G Tiso 1, et aux nucléotides - 7 à 174 du clone o~T iso4 (Fig. 1) ont été sous-clonés dans les sites EcoRI-SpeI des plasmides pKS. En utilisant l'ARN polymérase ,o T7~ les sondes d'ARN antisens ont été synthétisées et du 32p dUTP a été
incorporé. L'ADN plasmidique matrice a été digéré avec l'ADNase I, et 500 000 cpm de chaque sonde ont été hybridés pendant 16 h à 10 ~g d'ARN total d'or~alles porcins ou de cellules dans 30 ,ul de tampon d'hybridation contenant 80 ~ de t'ormamide, à 50 ~C. Les échantillons de contrôle contiennent 10 ~g " d ' ARN de levure. Les mélanges d ' hybridation été dilués à 400 ~l avant l'addition de 5 ~g/ml de RNase A et 10 U/ml de RNase Tl. Après 1 h à 30 ~C, 50 %g de protéinase K et de SDS à 0,5 % ont été ajoutés. Le mélange a ensuite CA 022~8872 1998-12-16 été extrait au phénol/chloroforme et précipité à l'éthanol. Les produits de digestion ont été analysés sur des gels de polyacrylamide à 6 %. Les gels ont été
exposés pendant 16 h contre des films Kodak AR à - 80~C.

:- 2) Résultats a) Clonage de quatre isoformes de 1'oc1,3GT
Comme décrit précédemment, une banque d'expression d'ADNc porcin construite en utilisant l'ARN LLC-PK1 (Guerif et al, 1995), a été criblée en n utilisant une sonde correspondant à l'extrémité 5' de la séquence codante. Un clone d ' ADNc, pcDNA-oLGT, avec la région codante correspondant à une (x1,3GT porcine déjà décrite (Sandrin et al, 1994), a été isolé. Cette oc1,3 GT
correspond à I ' isoforme 2 représentée par SEQ ID NO 4 et codée par la séquence SEQ ID NO 3. Ce clone pcDNA-ocGT contient une région 3' non traduite longue de 770 pb, une région codante de 1080 pb contenant les homologues porcins de ce qui a été défini dans le.cas de la souris comme étant les exons.. 4, et 6 à 9 (Joziasse et al., 1992) et une région 5' non traduite de150 pb. En utilisant des amorces adjacentes aux exons. 4 et 7, I'amplification PCR de l'ADN des PAEC a été réalisée. Des produits d'amplification d'environ ~o 200 pb à 300 pb ont été trouvés, suggérant l'existence de transcrits supplémentaires. Trois produits différents ont été clonés, l'un deux étant identique à la séquence décrite par Strahan et al, 1995 (et désignée ici comme étant l'isoforme 1, Fig. 1, à savoir l'isoforme représentée par SEQ ID NO 2 codée par la séquence SEQ ID NO 1 ) . En comparaison avec l ' isoforme 2 ~s susmentionnée (provenant du clone pcDNA-o~GT), il contient un segment supplémentaire de 36 pb après le nucléotide 80. Un autre produit, l'isoforme 3, à savoir l'isoforme représentée par SEQ ID NO6 codée par la séquence SEQ ID
NO5, ne comporte pas un segment de 63 pb du nucléotide 117 au nucléotide 179~ et le dernier produit, l'isoforme 4, à savoir l'isot'orme représentée par SEQ
30 ID NO 8, et codée par la séquence SEQ ID NO7, ne comporte pas le segment cle 36 pb du nucléotide 81 au nucléotide 116, et le segment de 63 pb du nucléotide 117 au nucléotide 179 (Fig. 1). La traduction des ARNm correspondant à chacun des transcripts identifiés, prédit la synthèse de quatre formes du polypeptide o~1,3GT, de 372, 360, 351 et 339 acides aminés qui ,~ diffèrent seulement dans la longueur de leurs régions "stem" (tiges) respectives.
LA situation décrite ici est comparable à celle décrite dans le cas de la souris(Joziasse et al., 1992), puisque quatre ARNm différents ont été trouvés, CA 022~8872 1998-12-16 contenant les exons 5 et 6, ou contenant seulement l'exon 5 ou l'exon 6, ou ne contenant ni l'exon 5 ni l'exon 6. Les segments porcins de 36 pb et 63 pb correspondent bien aux exons 5 et 6 murins, à l'exception du fait que, dans la souris~ l'exon 6 est long de 66 pb au lieu de 63 pb chez le porc (Fig. 1).
-h) Activité al,3GT des isoformes La présence ou l'absence des exons 5 et 6 détermine quatre variations delcmgueul dans la région stem de l'al,3GT. Cette région, localisée à l'intérieur de l'appareil de Golgi, lie le signal d'ancrage transmembranaire au domaine l(~ luminal catalytiquement actif. Afin de vérifier si les quatre isoformes définies par I'épissage alternatif des exons 5 et 6 sont catalytiquement actifs, des cellules Hel,a humaines ont été transformées avec des plasmides recombinants exprimant chacune des quatre isoformes de l'al,3GT porcine sous le contrôle du promoteur CMV. Le produit de cette enzyme sur les surfaces des cellules a été
analysé par immunofluorescence, en utilisant la lectine IB-4 réagissant spécifiquement avec les résidus Gala. L'épitope Gala pouvait être détecté à la surface des cellules HeLa traduites avec les quatre isoformes de l'enzyme, comme le montre la liaison à la lectine IB-4 (Fig. 2), indiquant que ces isoenzymes possèdent toutes une activité a-galactosyltransférase. Les niveaux ~o d'expression des ARNm de l'al,3GT dans les clones HeLa-al,3GT de porc, ont été contrôlés par Northern blot, et sont légèrement supérieurs dans les clones contenant les isoformes 1 et 2, et légèrement inférieurs pour le clone contenant les isoformes 2 et 3, par rapport au niveau trouvé dans les PAEC.

c) Localisation subcellulaire des isoformes al,3GT
La localisation Golgienne de l'al,3GT est due à la présence dans l'exon 4 d'un domaine signal d'ancrage. Les variations de longueur dans la région stem, c'est-à-dire la présence ou l'absence des exons 5 et 6, peuvent également influencer la rétention dans le Golgi (Dahdal et al., 1993) ou exposent un site de .o clivage sensible aux protéases sur certaines isoformes (Weinstein et al., 1987;
Lammers and Jamieson, 1989, Shaper et al., 1986; Yadav and Brew, 1991).
Afin de vérifier si ces variations de la région stem de l'al,3GT pourraient modifier la localisation dans le Golgi, la localisation cellulaire des différentes isoformes a été analysée. Les quatre vecteurs d'expression basés sur le CMV
,~ décrits ci-dessus, expriment les isoformes al,3 GT avec un marqueur FLAG
tusionné à l'extrémité C-terminale ce qui permet de détecter la protéine par immunofluorescence indirecte dans les cellules HeLa transfectées avec un CA 022~8872 1998-12-16 W 0 98/03653 PCT~Rg7/01340 anticorps anti-FLAG. Comme observé par microscopie à tluorescence, les quatre isoformes sont localisées de façon similaire et forment une structure juxtanucléaire compacte correspondant à celle de l'appareil de Golgi (Roth et Bergel-, 1982). De façon surprenante, alors que 100 % des cellules expriment ~ I'enzyme, comme cela a été mis en évidence par coloration uniforme obtenue avec la lectine ~B4, I'enzyme n'est pas détectable sur la totalité de ces cellules en utilisant l'anticorps anti-FLAG. Cela peut être due à une expression irrégulière de l'enzyme associée à une sensibilité limitée de l'anticorps, ou à la réorganisation de l'appareil de Golgi durant le cycle cellulaire.

d) Expression des isoformes de l'al,3GT
L'épitope Galal,3Gal, résultant de l'activité de l'u1,3GT, n'est pas exprimé de façon homogène dans les tissus de porc (Oriol et al., 1993). Dans le but d'étudier ces variations au niveau enzymatique, le niveau des transcripts a 5 1,3GT a été étudié par Northern blot, et la distribution des isoformes a été
étudiée par test de protection à la RNase.
L ' analyse par Northern blot montre I ' expression dans tous les tissus étudiés, mais avec une différence frappante entre les tissus. Les reins contiennent environ 50 % de ce ~ue l'on trouve dans la rate, le thymus 40 % et 20 le coeur et les ovaires, 20 à 25 %. Les poumons et le foie contiennent moins de 10 % de ce qui a été trouvé dans la rate. La stimulation des cellules endothéliales avec les cytokines inflAmm~toires induit une augmentation de la régulation ou la synthèse de beaucoup de gènes, dont les molécules d'adhésion, à savoir les molécules liées à l'infl~mm~tion et la coagulation. Une 75 augmentation de la régulation de 1'al,3GT n'a jamais été décrite dans les cellules endothéliales. En lltili.s:~n~ des PAEC stimulées pendant 6 heures avec100 U/ml de TNFa humain, une augmentation de deux fois le niveau global d'ARNm codant pour l'al,3GT a été observée. L'incubation des PAEC en présence de cycloheximide augmente également le niveau d'ARNm codant pour 30 1'o~1,3GT probablement par stabilisation du messager. De façon surprenante, la stimulation par TNF(x + cycloheximide ne conduit pas à une augmentation du - niveau de l'ARNm codant pour l'al,3GT, mais plutôt à une légère diminution Cet effet est peut-être relié à la découverte du fait que la cycloheximide t'acilite l'apoptose due au TNFo~ conduisant à une diminution de la régulation de certains antigènes (Malorni et al., 1993).
L'expression des isoformes de l'al,3GT a été analysée par test de protection à I ' ARNase dans les tissus de porc . Deux sondes antisens CA 022~8872 1998-12-16 W O 98/036~3 PCT/FR97/01340 radiomarquées ont été utilisées pour analyser les quatre espèces d'ARN
identifiées .
Le transcript de l'ARNm de l'isoforme 1 hybride avec un t'ragment de 273 pb SUI la sonde 1 correspondant à une séquence délimitée par les nucléotides 7 à 266 sur le transcript (les numéros des nucléotides correspondentci la séquence représentée sur la figure 1, isoforme l). L'hybridation de la sonde 1 avec l'ARNm codant pour l'isoforme 2 conduit à un fragment de 87 pb délimité par les nucléotides - 7 à 80, et un t'ragment plus grand de 150 pb délimité par les nucléotides 117 à 266. L'hybridation de la sonde 1 avec lO I'ARNm codant pour l'isoforme 3 conduit à un fragment de 123 pb délimité par les nucléotides - 7 à 116 et un plus petit fragment de 87 pb délimité par les nucléotides 180 à 266. L'hybridation de la sonde l avec l'ARNm de l'isoforme 4 de l'al,3 GT conduit à deux fragments de 87 pb délimités par les nucléotides - 7 à 80 et par les nucléotides 180 à 266. La deuxième sonde, sonde 4, est un ~S t'ragment d'ARNm de 174 pb correspondant à l'isoforme 4. Il est entièrement protégé par l'ARNm codant pour l'isoforme 4, et conduit à deux fragments de 87 pb avec les isoformes 1, 2 et 3.
Les fragments de sonde protégés par les ARNm codant pour les isot'ormes 1, 2 et 3 sont ceux de 273, 150 et 123 pb, respectivement, la sonde 4 proté~ée ~o par l'ARNm codant pour l'isoforme 4 conduit à une bande de 174 pb. La répartition des produits de transcription diffère d'un tissu à un autre: dans lerein. I ' isoforme 3 seule est exprimée, alors que dans les ovaires, seule l'isot'orme 4 est exprimée. Dans le coeur, les poumons et la rate, on trouve lesisoformes 1 et 2, alors que les isoformes 2 et 4 sont trouvée.s dans le foie. Les ~s cellules endothéliales expriment les isoformes 1, 2 et 4. Dans les thymus, on peut observer les 4 isoformes.

.o Il - Transformation de cellules animales à l'aide de séquencesnucléotidiques codant pour des anticorps anti-al,3 GT selon I'invention 1) Matériels et méthodes ,s a) Banques d'ADNc, cellules et plasmides:
La banque d'ADNc provient de cellules épithéliales porcines LLC-PK1.
Elle est construite dans le vecteur pCDNA-1. Les souches bactériennes utilisées CA 022~8872 1998-12-16 W O 98/03653 PCT~R97/01340 sont: E. coli-TGl sup ~, E. coli-XL-1, SURE, M15, MC 1061/P3, et DHSa.
Le plasmide d'expression procaryote pQE-30 vient de Qiagen. Le plasmide d'expression eucaryote pCDAAS-9, contient UII gène de résistance à la néomycine et entraîne la transcription d'ADNc qu'il porte sous le contrôle du s promoteur du cytomégalovirus. La banque d'immunoglobulines humaines ScFv est construite dans le plasmide pHEN-l et a été utilisée comme décrit dans l'article de Nissim et al., 1994. La préparation des phages recombinants est également décrite b) Système d'expression recombinante et purification:
Le système de production et de purification de l'a1,3GT recombinante provient de Qiagen. La transcription a été induite par culture des E.coli-M15 transformées par l'ADNc de l'enzyme avec 2mM IPTG, pour 5 heures. La protéine recombinante dans le Iysat cellulaire a été alors purifiée sur une colonne échangeuse d'ions, en conditions dénaturantes. La protéine purifiée a été dialysée en PBS et stockée à -20~C jusqu'à son utilisation.

c) ELISA:
~o Des plaques de microtitration (Nunc) ont été glacées une nuit à 4~C avec 5 ~/ml de protéine al,3GT purifiée, en tampon carbonate à pH 9,5. Elles ont ensuite été saturées 2h à 37~C en 2% lait écrémé, puis incubées 2h, 37~C avec une suspension de phages recombinants exprimant un fragment ScFv d'anticorps provenant de la banque ScFv. Après lavage, les plaques ont été incubées lh, ~s 37~C avec un anticorps anti-phage M13 marqué à la peroxydase (Pharmacia), dilué 1/500. La révélation a été effectuée par réaction de la peroxydase avec dela diaminobenzidine en présence d'eau oxygénée.

d) Transfection et cellules porcines:
,o Des cellules de porc LLC-PK1 ont été transfectées avec des plasmides pCDAAS portant l'ADNc de clones anti-al,3 GT positifs. La transfection a été
réalisée par électroporation d'un mélange de 500.000 cellules et de 20 ,ug d ' ADN plasmidique, à 250V et 350~F. Les clones ont été sélectionnés par culture de 15 jours en présence de 1500 ~/ml de néomycine (G418). isolés à
,s l'aide d'anneaux de clonage et cultivés séparément en présence de G418 jusqu'à
1 ' analyse .

CA 022~8872 1998-12-16 W O 98/03653 PCT~R97/01340 e) Immunofluorescence et cytofluorométrie:
Les cellules ont été marquées par 1 ' isolectine B4 de Bandeiraea .5i~np~icifolia marquée à la fluorescéine (IB-4-FITC, Sigma), lectine spécifiquedes structures a-galactose: les cellules ont été lavées à 4~C en PBS-2%BSA, incubées a 4~C pendant 30 mn. avec 20 ~g/ml IB-4-FITC, relavées 3 fois et analysées par cytofluorométrie en utilisant un FACS-can (Becton Dickinson).

I) Séquence:
Lcs réactions de séquence ont été effectuées avec la D-taq (Amersham), en utilisant comme amorces deux oligonucléotides situes dans la partie 5 ' du segment V~3. Oligo 1, permettant la lecture de la partie 5' de l'ADNc 5'-TTCTGAGGCTGTCTCCTT-3'. Oligo 2, permettant la lecture de la partie 3' de l'ADNc 5'-ATCGTCTGAGCTGACTCA-3'.

g) Ciblage moléculaire des ScFv anti-al,3-GT dans le Golgi:
Dans le but de faire exprimer les anticorps ScFv dans le même compartiment cellulaire que l'al,3 GT, c'est-à-dire dans le Golgi, des séquences signal et de rétention golgienne ont été ajoutées aux clones ScFv en N-terminal et en C-terminal, respectivement. Les séquences signal et de ~o rétention choisies ont été adaptées à partir des données rapportées par Richardson et al., 1995. Elles ont été introduites par amplification PCR des clones ScFv de départ, à l'aide d'amorces contenant l'ADNc de ces séquences, et des sites de restriction pour le clonage. La séquence de ces amorces est la suivante:
~s - amorce encodant la séquence signal:
5 ' -TTTGAATTCATGGAAAGGCACTGGATCTTTCTCTTCCAGGT
GCAGCTGGTGCAG-3 ' .
- amorce encodant la séquence de rétention golgienne:
5 ' -TTTCTCGAGTTATTACAGCTCGTCCTTTTCGCTACCTAGGA
CGGTGCAGCTT-3'.

2~ RESULTATS

a) Clonage de l'al,3GT de porc

3~ Un fragment de 313bp correspondant à l'extrémité 5' de l'ADNc de 1'~
1,3GT de porc a été amplifié par RT-PCR à partir d'ARN de cellules endothéliales aortiques de porc. Ce fragment a servi de sonde pour le clonage de CA 022~8872 1998-12-16 W O 98/03653 PCT~R97/01340 l'ADNc entier dans une banque de cellules épithéliales de porc exprimée en E.
Cc)li MC1061 P3, dans le plasmide pCDNA-1. Le clone isolé mesure environ 2Kb. comporte une partie 5' non codante de 147 pb suivie d'une phase ouverte de lecture de 1104 pb et d'une partie 3' non codante d'environ 750 pb. Il correspond à 1 ' isoforme de I 'enzyme dont l 'exon 5 est absent (à savoir l ' isoforme 2 représentée par SEQ ID NO 4). L ' ADNc porcin isolé est fonctionnel car il confère une activité al,3GT à des cellules Cos, naturellementdépourvues de cette activité, après transfection. Cette activité peut être démontrée par l'acquisition d'une réactivité avec l'isolectine B4 de Bandeiraea si~7lplicifoli~, marquant spécifiquement les résidus ~-galactosylés.

h) Expression protéique de l'al,3GT recombinante.
La partie codante de 1'oc1,3GT a été sous-clonée par PCR dans le vecteur d'expression procaryote pQE30 (Quiagen), en fusion en 5' avec une queue de s six llistidines servant à la purification de la protéine recombinante sur une matrice chargée (Ni-NTA). Le clone ainsi obtenu a été entièrement séquencé
pOUI s'assurer de l'absence de mutations par rapport au clone de départ, qui auraient pu être introduites lors de l'amplification PCR. Le plasmide pQE30-~1,3GT a été introduit dans E. Coli M15 et la protéine recombinante produite in o vitro par induction de la transcription à l'IPTG, et purifiée.
c) Production d'anticorps ScFv anti-al,3GT
La banque d'immunoglobulines (Ig) hllm~in~s est constituée par 50 séquences de parties variables de chaînes lourdes d'Ig en configuration germinale, associées à un peptide contenant de 4 à 12 acides aminés aléatoires, ~s codant par la partie CDR3 de la chaîne lourde, et insérées dans le phagemide pHEN1-V~3, en fusion avec la partie plasmidique codant pour la protéine g3p de l'enveloppe phagique. I,es phages pouvant être dérivés de ces plasmides expriment donc un fragment (ScFv) d'Ig fonctionnel en fusion avec une protéine d'enveloppe, et se comportent, au niveau de leur propriétés de reconnaissance ,o d'un antigène, cornme l'Ig dont ils expriment la séquence. Les phages dérivés de cette banque d'Ig ont fait l'objet de 4 tris successifs par "panning" sur la - protéine recombinante purifiée, comme décrit dans Nissim et al., 1994 d) Test ELISA de la positivité des anticorps ScFv anti-al,3GT.
~s Quatre-vingt-seize colonies individuelles de bactéries E. Coli-TGl sllpE
contenant chacune un clone pHEN1-ScFv ont été isolées, de manière aléatoire, après les 4 cycles d'enrichissement à l'encontre de la protéine al,3GT. Ces CA 022~8872 1998-12-16 WO 98/036s3 pcTlFRs7lol34o colonies ont été cultivées une nuit dans 200111 de milieu LB, en plaque de microtitration. Le surnageant, contenant des phages exposant sur leur enveloppe 1 à 3 molécules de f-ragment ScFv d'anticorps, a été testé par ELISA pour mesurer la réactivité relative des différents clones à l'encontre de 1'o~1,3GT. Sur les 96 clones testés, 15 montraient une réactivité supérieure à trois fois le niveau du contrôle (Figure 2). Les six clones les plus positifs ont été réamplifiés et des phages purifiés ont été préparés à partir de 500 ml de surnageant de bactéries TG-l. Les phage purifiés, et concentrés par précipitation et resuspension en PBSont un titre supérieur à 101~ cfu/ml. Cette préparation de phages concentrés a été re-testée en ELISA. Les résultats, montrés à la figure 2, reproduisent l'ordre de réactivité observé dans la Fig. 2.

e) Séquence de l'ADNc des fragments d'anticorps ScFv anti-~1,3GT
Les clones ScFv anti-al,3GT sélectionnés ont été séquencés pour s'assurer de la non introduction d'erreurs lors du sous-clonage par PCR et pour déterminer les associations chaîne lourde génomique-peptide aléatoire (de 4 à 12acides aminés)-chaîne légère V~3 qui produisent un anticorps réactif à
l'encontre de l'al,3GT. Sur les six séquences analysées, deux sont identiques (n~ 2 et 6), et deux ne diffèrent que par deux acides aminés dans la partie CDR3~o (n~ 1 et 5). La séquence n~ 3 présente un codon ambre (codon reconnu comme un stop traductionnel dans un système eucaryote, mais considéré cotnrne une glutamine dans la souche E. coli-TG 1 supE utilisée pour le clonage) à la jonction CD3-peptide linker reliant les chaînes lourdes à la chaîne légère V?~3.Un codon stop à cette position est une conséquence prévisible de l'association 2~ aléatoire des fragments d'ADNc qui se produit lors de la fabrication de la banque ScFv. Le remplacement du nucléotide T en position 313 par un C
permet d'obtenir un codon correspondant à une glutamine en position 105 (voir SEQ ID NO 13). Les chaînes lourdes (désignées séquences VH) sélectionnées ainsi que la séquence des régions CDR3 sont décrites dans le tableau 1; la ~o séquence de clone ScFvl correspond à la séquence représentée par SEQ ID NO
9, la séquence du clone ScFv2 et celle du clone ScFv6 correspondent à la séquence représentée par SEQ ID NO 11, la séquence du clone ScFv3 correspond à la séquence représentée par SEQ ID NO 13, la séquence du clone ScFv4 correspond à la séquence représentée par SEQ ID NO 15 et la séquence ,~ du clone ScFvS correspond à la séquence représentée par SEQ ID NO 17.

CA 022~8872 1998-12-16 WO 98/03653 PcTlFRs7lol34o Tableau l Clone n~ Segment VH Séquence CDR3 -ScFvl DP - 25 Ser - Gly - Met - Phe ScFv2 DP - 5 Pro - Glu - Ile - Asp - Gln ScFv3 DP - 21 Ser - Asn - Asp - Pro - Ala -Asp - Glu ScFv4 DP - 51 Ala - Trp - Arg - Thr - Asp ScFv5 DP - 25 Ser - Gly - Val - Tyr ScFv6 DP - 5 Pro - Glu - Ile- Asp - Gln Séquences VH d'origine génomique et CDR3 des anticorps synthétiques 5 spécifiques de l'al,3GT porcine: Les séquences nucléotidiques des clones ScFv sélectionnés en ELISA pour leur affinité à l'encontre de l'al,3GT de porc ont été effectuées. Le tableau montre les séquences des troisièmes régions de complémentarité des anticorps (CDR3). La nomenclature des segments variables des chaînes lourdes en configuration germinale est celle utilisée dans Tomlinson~o et al ., 1992 .

g) Evaluation de l'efficacité de l'immllni~ion intracellulaire Les ADNc codant pour les anticorps anti-al,3GT n~ 1 à 6, natifs ou ~5 possédant les séquences signal et de localisation golgienne, ont été sous-clonés dans le vecteur d'expression eucaryote pCDAAS, sous le contrôle du promoteur de CMV. Pour tester la conséquence de l'expression des ScFv anti-al,3GT sur la diminution de l'expression de l'épitope a-galactosyl sur la membrane des cellules de porc, des cellules LLC-PK1 ont été transfectées avec les différents 30 plasmides pCDAAS-ScFv, et des clones ont été isolés. La présence de l'épitopexénoantigénique a-galactosyl a été évaluée en immunofluorescence avec la lectine IB4-FITC (spécifique du galactose branché en configuration a)~ en comparaison avec les memes cellules, non transfectées. Les résultats montrent que l'anticorps ScFv n~ 2 (à savoir celui représenté par SEQ ID NO 12) ,~ encodant la séquence VH DP-5, associée une partie CD3 artificielle composée des acides aminés PEIDQ, reliée à la séquence V~3, sans adjonction de séquences signal et de rétention golgienne, lorsqu'il est exprimé dans une cellule . " . . . . . ... . . . ..

CA 022~8872 1998-12-16 de porc, entraîne jusqu'à 95% de ~iminntion de l'expression du galactose branché en configuration a. En effet, la fluorescence moyenne des cellules LLC-PK1 est de 465 unités lorsque le marquage est réalisé avec 20 ~g/ml IB-4-FITC. et elle tombe à 49 unités pour le clone LLC-PK1-ScFv6.
-En conclusion, dans le contexte de la xénotransplantation, la possibilitéd'inhiber dans une cellule de porc l'expression de l'a1,3GT en utilisant cette ~echnique, conduit à des applications très claires: la disponibilité de porcs transgéniques n'exprimant pas ou peu d'épitopes o~-galactosyl, conséquence de l'inhibition de 1'oc1,3GT, et exprimant un inhibiteur du complément humain, comme cela existe déjà, permet d'effectuer des xénogreffes en évitant la réaction des cellules du greffon avec les anticorps et avec le complément du receveur humam.
Les résultats qui sont présentés ci-dessus, montrent que des cellules d'origine porcine exprimant un anticorps ScFv anti-al,3GT peuvent être obtenues, et que cette expression résulte en une diminution importante du niveaude xénoépitopes exprimés III - Anticorps monoclonaux anti-al,3GT
~o La partie codante de l'al,3GT, isoforme n~ 2 a été sous-clonée par PCR
dans le vecteur d'expression procaryote pQE30 (Quiagen), en fusion en 5' avec une queue de six histidines servant à la purification de la protéine recombinante sur une matrice chargée (Ni-NTA). Le clone ainsi obtenu a été entièrement 2s séquencé pour s'assurer de l'absence de mutations par rapport au clone de départ, qui auraient pu être introduites lors de l'amplification PCR. Le plasmide pQE30-al,3GT a été introduit dans E. Coli M15 et la protéine recombinante produite in vitro par induction de la transcription à l'IPTG. Après purification, l'al,3GT a été dialysée en PBS et injectée à une souris BALB/C à raison de ,o 3 injections de 40 ~g chacune tous les 15 jours. Les Iymphocytes spléniques ont été collectés et fusionnés avec l'hybridome de souris SP2-O. La sélection des hybridomes sécrétant une irnmunoglobuline reconnaissant l'al,3GT s'est effectuée par test ELISA: des plaques de microtitration ont été glacées avec 10microg/ml de protéine a1,3GT recombinante, 16h à 4~C à pH 9.5. puis ,~ saturées 2h, 37~C avec PBS-BSA1%, Tween 20 0.5%. Les surnageants de hybridomes ont été incubés lh, 37~C et les anticorps immunoabsorbés révélés à

CA 022~8872 1998-12-16 W O 98/03653 PCT~FR97/01340 l'aide d'un anti-Ig marqué à la peroxydase. Les hybridomes fournissant une densité optique au moins trois fois supérieure au bruit de fond ont été retenus.
IV - Clonage d'anticorps ScFv (Single chain Fv) à partir d'hybridomes :, Le clonage de fragments d'immunoglobulines sous t'orme de fragments ScFv est décrit dans Clackson et al. (1991)). En bref, de l'ARN est préparé à
partir de 5X108 cellules d'hybridome, et l'ARN messager est sélectionné sur oligo(dT)-cellulose. Un premier brin d'ADNc est synthétisé comme suit: 10,ug d'ARNm sont incubés avec 20 pmoles des oligos VHlFOR ou VKlFOR
(Clackson et al., 1991), 250 ~M de chaque dNTP, 10 m M DTT, 100 m M
Tris.HCI (pH8.3), 10 mM MgCl2, et 140 mM KCI, 10 min. à 70~C, puis lh à
42 ~C en présence de 50 unités de Transcriptase Reverse. L'amplification par PCR des fragments VH et VL est réalisée en mélangeant 2 ,ul de réaction RT
5 avec 25 pmoles des amorces VHlFOR ou VKlFOR, et VHlBACK ou VKlBACK (Clackson et al.., 1991), 250 ,uM de chaque dNTP, 67 mM
Tris.HCl (pH 8.8), 17 mM (NH4)2S04, 10 mM MgCl2, et 2 unités de Taq polymérase, pour 30 cycles d'amplification. Les fragments obtenus sont alors purifiés et 1 ~g de chaque sont mélangés avec 300 ng de linker (gly4Ser)3, et ~o amplifiés par 7 cycles de PCR destinés à relier les fragments. Les fragments VH
et VL reliés sont alors amplifiés en 20 cycles avec les oligos VHlBACK et VK4~0R. Les fragments obtenus sont alors ré-amplifiés avec les oligos VHlBACK-BarnHl et VK4FOR-BamH1, digérés par BamH1 et clonés dans le vecteur d'expression eucaryote PCDAAS, sous le contrôle du promoteur CMV.
2s V -Voies d'action intracellulaire des anticorps anti-al,3GT

l,e méc:lrlisme moléculaire par lequel un anticorps exprimé dans une cellule interfère avec la fonction d'une molécule portant le site antigénique 30 contre lequel cet anticorps est exprimé n'est pas élucidé. Cependant, plusieurs explications ont été proposées. Dans le cas de 1' inhibition de la reverse transcriptase de HIV (Maciejewski et al., 1995), l'anticorps anti-RT n'est pas neutralisant dans un test in vitro. Les auteurs proposent que le complexe anti~ène/anticorps formé dans la cellule puisse bloquer stériquement le ,s mouvement de l'enzyme le long de la molécule d'ARN, ou bien puisse modifier sa structure secondaire. Dans le cas de l'inhibition de la chaîne a du récepteur à
l'IL-2 (Richardson et al., 199S), un processus de dégradation du complexe . .

CA 022~8872 1998-12-16 W 0 98/03653 PCT~R97/01340 antigène/anticorps a été proposé. Ce processus semble non Iysosomial, car la méthionine méthyl ester (un inhibiteur Iysosomial) n'entraîne pas d'accumulation du complexe. La dégradation ne se produit pas non plus dans le compartiment Golgien car la brefeldin A (qui détruit le Golgi) est sans effet. La dégradation se produit donc précocement, sans doute au niveau du réticulum endoplasmique. Dans plusieurs cas où la localisation intracellulaire de la molécule cible conditionne sa fonction, il est possible que 1 ' anticorps intracellulaire retienne cette molécule dans un compartiment qui lui est étranger.
Richardson et al. ont en effet montré que l'expression d'un anticorps anti-RT, 0 retenu dans le réticulum endoplasmique par incorporation d'une séquence de rétention KDEL, retient la RT dans ce compartiment.
Dans le cas de l'inhibition de 1'(x1,3GT par des anticorps ScFv, on peut supposer que: 1) soit les anticorps modulent l'activité de l'enzyme (par exempleen modifiant sa structure), 2) soit ils la retiennent dans un compartiment intracellulaire autre que le trans-Golgi (compartiment dans lequel le branchement de galactose en o~1,3 sur le galactose du N-acélyllactosamine est effectué), 3) soit ils entraînent la dégradation du complexe antigène/anticorps par un mécanisme non élucidé. Il pourrait s'agir par exemple d'une ubiquitination suivie d'une dégradation par le complexe protéasome.
~o VI - Construction d'~nim~llx transgéniques avec les ScFv proposés L'obtention d'~nim~-lx transgéniques pour un ScFv anti-al,3GT présente des intérêts en recherche et en clinique. Pour la recherche, la transgenèse chez25 le rat convient particulièrement car ses organes peuvent être greffés chez lesinge, où ils subissent un rejet semblable au rejet de xénogreffe dans le modèleporc-primate Pour l'utilisation thérapeutique de greffons, le porc est l'animal de choix .

a) Transgenèse chez le rat:
Les embryons au stade unicellulaire sont obtenus à l'issue d'un protocole de super-ovulation appliqué à des rates de souche CD âgées de 28 à 38 jours (Amstrong et Opavoky, 1988). Ce protocole permet d'obtenir de façon régulière une moyenne de 40 à 50 embryons par femelle. La construction portant l'ADNc 3:, codant pour l'anticorps anti-al,3GT (deux exemples de constructions pouvant être utilisées sont montrés sur les figures 4 et 5) est injectée à raison de quelques milliers de copies par embryon. Les embryons traités sont alors réimplantés CA 022~8872 1998-12-16 W 0 98/03653 PCT~R97/01340 dans la matrice. Les rats issus de ces embryons sont ensuite testés pour sélectionner les animaux ayant effectivement incorporé dans leur génome l'ADN
transoénique. Ces tests sont effectués au niveau de l'ADN et de l'ARN, que l'on peut détecter par hybridation avec une sonde ADN correspondant au transgène, ~ et au niveau protéique. La détection de la protéine ScFv peut être effectuée par réaction avec un anticorps anti Fab humain, ou par un anticorps anti-épitope, sil'ADNc ScFv est en fusion avec un ADNc codant pour un peptide portant cet épitope.

h) Transgenèse chez le porc:
Des embryons fécondés au stade pronucléaire sont obtenus par laparotomie à partir des oviductes de truies matures âgées de 7 à 10 mois, 50 heures après 1 ' induction de la superovulation et 20 à 26 heures après I'insémination. Le Pronucleus, dans lequel est injecté l'ADN, est visualisé par une centrifugation de l'ovocyte à 15000 g pendant 3 minutes. Les résultats aprèsréimplantation d'ovocytes traités de cette manière montrent que 10 % d'entre eux se développent et donnent un animal, et que 15 % d'entre eux ont incorporé
l'ADN transgénique, soit 1,5 % des ovocytes traités. Parmi ces ;lnim~llx positifs - quant à I ' intégration d'ADN, 67 % expriment effectivement la protéine ~o correspondant au transgène (White et al., 1994; Cozzi et White, 1995).

VII - Etude de l'expression intracellulaire des séquences nucléotidiques codant pour des anticorps anti-al,3GT selon l'invention, sur la production de l'épitope Galal,3Gal Une analyse des conséquences de l'expression intracellulaire des séquences nucléotidiques codant pour des anticorps single chain (ScFv) anti-al,3 galactosyltransférase porcine (al,3GT), sur la production de l'épitope sucré
Gala1,3Gal par des cellules porcines, a été effectuée au niveau de l'expression ,o membranaire du sucre lui-même, et au niveau de 1 ' activité enzymatique intracellulaire. L'analyse porte également sur les conséquences de la diminutionde l'expression de ce sucre sur la toxicité du sérum humain vis à vis des cellules porcines .
Dans le but d'étudier l'incidence de la valence de l'anticorps intracellulaire ,s Sc~v anti-al,3GT sur le fonctionnement de cette enzyme, un anticorps ScFv a été di- et tétramérisé, et testé in vitro dans des cellules de porc.

CA 022~8872 l998-l2-l6 W 098/03653 PCT~R97/01340 a) Etude de la diminution de l'expression de l'épitope Galoc1,3Gal à la surt'ace de cellules porcines LLC-PK1 exprimant des ScFv anti-(x1,3GT.
Les séquences nucléotidiques indiquées dans la figure 6, ainsi qu ' une séquence contrôle (codant pour un anticorps ScFv analogue mais ne recolmaissant pas l'al,3GT), ont été clonées dans un vecteur d'expression eucaryote, sous le contrôle du promoteur du CMV. Des cellules porcines LLC-PK1 ont é~e transfectées avec ces vecteurs d'expression et des clones ont été
dél-ivés. Les résultats de la figure 6 montrent une diminution significative de l'expression de l'expression du sucre Galal,3Gal de l'ordre de 30 à 40 %.
1~
b) Etude de la (liminlltion de l'activité enzymatique al,3GT dans les cellules porcines LLC-PK1 exprimant des ScFv anti-c~1,3GT.
Des Iysats cellulaires totaux provenant des clones de cellules porcines LLC-PKl présentés à la figure 7 (exprimant des séquences codant pour des 5 ScFv anti-(x1 ,3GT, avec ou sans la séquence KDEL de rétention dans le réticulum endoplasmique) ont été analysés par une technique biochimique mesurant spécifiquement l'activité de l'enzyme ~1,3GT (Cho et al., 1996, J.
Biol. Chem. 271:3238). Les résultats sont exprimés en moyennes +/- SD des pourcentages d'activité par rapport à celles obtenues à partir de cellules LLC-~o PKl non transfectées. Ils montrent une diminution significative de l'activitéenzymatique de l'ordre de 40 à 60 % lorsque des séquences ScFv anti-(x1,3GT
ScFv-l ou ScFv-2, le cas échéant associées à la séquence codant KDEL, sont exprimées.

~s c) Etude de la ~limimltion de la cytotoxicité du sérum humain à
l'encontre des cellules porcines LLC-PK1 exprimant des ScFv anti-oc1,3GT.
Certains clones de cellules porcines LLC-PKl présentés à la figure 8 (exprimant des séquences codant pour des ScFv anti-oc1,3GT) ont été marqués au 51Cr puis incubés en présence de sérum humain contenant des xénoanticorps 30 anti-Galo~1,3Gal et du complément. Le relar~age de 51Cr, comme estimation de la Iyse cellulaire, a été mesuré. 100 % de Iyse correspond à une Iyse totale induite par un agent chimique, et 0 % de Iyse correspond à une incubation avec le sérum décomplémenté. Les résultats montrent une diminution importante de la sensibilité à la Iyse par le complément humain des clones exprimant les 3~ séquences SEQ ID NO 9 (ScFv-1) ou SEQ ID NO 11 (ScFv-2/6).

CA 022~8872 1998-12-16 W O 98/036S3 PCTn~R97/01340 d) Etude de l'augmentation de la valence d'un ScFv anti-al,3GT
intracellulaire sur le fonctionnement de l'enzyme.
- Cette augmentation a été testée par fusion des séquences de dimérisation et de tétramérisation zip et T-zip dérivées du facteur GCN4 (Pack et al., 1995) à
I'extrémité C-terminale de la séquence nucléotidique SEQ ID NO 1 1; les séquences résultantes sont désignées ScFv-zip et ScFv-tetrazip sur la figure 9.
Les constructions obtenues ont été sous-clonées dans le vecteur d'expression eucaryote pHook (Invitrogen) permettant l'identification en cytométrie de flux des cellules exprimant ces plasmides (car possédant une séquence codant pour un marqueur membranaire identifiable). Après transfection transitoire de cellules porcines LLC-PK1 avec la séquence SEQ ID NO 11 comportant une séquence de dimérisation (ScFv-zip), une diminntion de l'expression de l'épitopeGalal,3Gal de 31 % par rapport aux cellules de départ a été observée dans les cellules exprimant le vecteur. Dans les mêmes cellules transfectées avec la séquence SEQ ID NO 11 comportant une séquence de tétramérisation (ScFv-tetrazip), une ~liminlltion de l'expression de l'épitope Galal,3Gal de 45 % par rapport aux cellules de départ a été observée.

En conclusion, I'expression dans des cellules de porc des séquences 20 nucléotidiques SEQ ID NO 9 et SEQ ID NO 11 entralnent une dimimltion importante de l'activité enzymatique al,3GT et une (~iminlnion significative de la présence du sucre Galal,3Gal à la surface des cellules. Cette diminution est suffisante pour entraîner une protection très importante vis à vis de la Iyse induite par le complément humain. Ces résultats démontrent 1 ' intérêt de ~5 I'expression des séquences ScFv anti-al,3GT chez le porc dans une situation de xénogreffe porc-homme. L'augmentation de la valence de l'anticorps intracellulaire codé par la séquence SEQ ID NO 11 entraîne une augmentation de son efficacité inhibitrice.

~o CA 022~8872 1998-12-16 W O 98/03653 PCT~R97/01340 Légendes des figures:

- Figure 1:
Analyse des séquences des transcripts des isoformes de 1'~1,3GT de porc, :- et alignement sur une carte de transcript primaire murine. Les ADNc des isoformes 1, 3 et 4 ont été clonés à partir d'ARNm rétrotranscripts et amplifiéspar PCR provenant de PAEC et l'ADNc correspondant à l'isoforme 2 a été
cloné à partir d'une banque LLC-pK1, comme décrit ci-dessus. La séquence nucléotidique a été déterminée par utilisation de Séquenase (USB), et comparée par contrôle avec les séquences correspondant aux isoformes 1 et 2 décrites par Strahan et al., 1995 et Sandrin et al., 1994. Les numéros en gras sur le côté
gauche de la figure correspondant aux isoformes 1 à 4. Les premières bases des exons 5, 6 et 7 sont numérotées sur la séquence correspondant à l'isoforme 1.
Les chift'res représentés en italique indiquent le nombre de bases manquantes 5 dans l'exon épissé correspondant. La carte primaire de transcription de la souris avec ses 9 exons, telle que décrite par Joziasse et al., 1992, est comparée avecles séquences des isoformes 1 à 4.
La queue cytoplasmique (encadré noir) et la région transmembranaire (encadré avec lignes verticales) sont codées par l'exon 4. Les régions d'origineo (encadré grise) comprend les exons 5 et 6. Les exons 5 et 6 sont épissés alternativement chez la souris et le porc. Le domaine catalytique est codé par les exons 7, 8 et 9.

- Figure 2:
Réactivité mesurée par ELISA de préparations non purifiées de phages correspondant à 15 clones reconn~i.cs~n~ la protéine ~1,3GT: Quatre vingt seize colonies individuelles de bactéries TG1 contenant un clone pHEN-1-ScFv, présélectionnées par une procédure d'enrichissement décrite dans Nissim et al., 1994, ont été cultivées et leur surnageant (contenant les phages exprimant 30 I'anticorps) testé en ELISA comrne décrit dans Matériels et Méthodes ci-dessus.
Les 15 surnageants positifs (numérotés 1 à 15) sont représentés en abscisse sur la figure. Le contrôle négatif (-) est constitué d'un blanc et le contrôle positif (+) par la mesure de la densité optique obtenue par la réaction d'un phage M13 (Pharmacia) sur une IgG de souris anti-phage M13 (Pharmacia) déposée sur la 35 plaque. Les valeurs de densité optique (DO) sont indiquées en ordonnée.

-r CA 022~8872 1998-12-16 W O 98/03653 PCT~FR97/01340 - Figure 3:
Réactivité mesurée par ELISA de phages purifiés eorrespondant à 6 clones reeonnaissant la protéine al,3GT: Les six elones les plus positifs dans l'ELISA
ci-dessus (Fig.2) ont été amplifiés en vue de la préparation de phages purifiés.Les phages purifiés et eoneentrés ont été re-testés en ELISA, de manière similaire à ee qui est déerit dans la figure 2. Ces phages ont été testés à une dilution de I à 1/8. Les dilutions effeetuées sont représentées en abseisse, et la densité optique (DO) mesurée est indiquée en ordonnée. Ia courbe correspondant au contrôle positif passe par des points représentés par des croix, celle lO correspondant au phage contenant SeFvl (M13-ScFvl) passe par des points représentés par un point noir au eentre de earrés blancs, celle correspondant auphage contenant ScFv2 (M13-SeFv2) passe par des points représentés par des losanges noirs, eelle correspondant au phage eontenant ScFv3 (M13-SeFv3) passe par des points représentés par des points représentés par un point blanc au centre de carrés noirs, celle eorrespondant au phage eontenant ScFv4 (M13-ScFv4) passe par des points représentés par des losanges blancs, celle correspondant au phage eontenant SeFv5 (M13-SeFv5) passe par des points représentés par des earrés noirs, eelle eorrespondant au phage eontenant SeFv6 (M13-ScPv6) passe par des points représentés par des carrés blanes, le blanc étant représenté par un rond noir.

- Figure 4:
Cet exemple de eonstruetion eonsiste en 1 ' utilisation du promoteur du CMH-l de souris H-2Kb, permettant l'insertion du transgène (ADNc ScFv;
~s 0,7Kb) entre la partie promotrice proprement dite (promoteur H-2kb; 4Kb) et une série d'introns/exons (5,5 Kb) appartenant au gène H-2Kb, cette série étant suivie par pA SV40 de 0,3 Kb. Ces introns eontiennent des séquenees régulatriees permettant d'obtenir une bonne aetivité du promoteur, et done une bonne expression du transgène. Le promotéur H-2Kb permet une expression 30 constitutive et ubiquitaire de l'ADNc dont il eontrôle l'expression (Kimura et al., 1986; Byrne et al., 1995).

- Figure 5:
Cet exemple de construction consiste en l'utilisation du minigène DAF
,~ (Cozzi et al., 1996), dont l'effieaeité a déjà été démontrée en transgenèse ehez le porc. De manière analogue à la eonstruction H-2Kb, ee minigène plaee l'ADNc ScFv (0,7 Kb) sous le eontrôle du promoteur du DAF, lui-même eontrôlé par . ~ . .

CA 022~8872 1998-12-16 WO 98/03653 PCT~FR97/01340 des séquences introniques (I'ensemble constitué par le promoteur DAF, les exons et les introns représentant 4,6 Kb), I'ADNc ScFv étant suivie par pA
SV40 de 0,3 Kb.

- Flgure 6:
Cette figure représente l'analyse en cytométrie de flux (FACscan) de la reconnaissance des épitopes Galal,3Gal par la lectine I134-FITC, en comparaisoll avec des cellules LLC-PK1 non transfectées. Les résultats sont des pourcenta~es moyens +/- SD de fluorescence par rapport à la fluorescence o obtenue a partir des LLC-PK1 non transfectées. n : nombre de clones indépendants analysés par groupe; ScFv-neg: cellules LLC-PK1 non transt'ectées; ScFv-1 : cellules LLC-PK1 transfectées avec le clone ScFv-1;
ScFv-2/6: cellules LLC-PK1 transfectées avec le clone ScFv-2 ou ScFv-6: les pourcentages de fluorescence sont indiqués en ordonnée.
I ~
- Figure 7:
Mesure de l'activité al,3GT dans les cellules porcines LLC-PK1 transfectées avec le clone ScFv-1, ou ScFv-2, avec ou sans la séquence KDEL
de rétention dans le réticulum endoplasmique. n: nombre de clones indépendants analysés par groupe; ScFv-neg: cellules LLC-PK1 non transt'ectées; ScFv-1: cellules LLC-PK1 transfectées avec le clone ScFv-1;
ScFv-2: cellules LLC-PK1 transfectées avec le clone ScFv-2; ScFv-lKDEL:
cellules LLC-PK1 transfectées avec le clone ScFv-1 et contenant la séquence codant KDEL; ScFv-2KDEL: cellules LLC-PK1 transfectées avec le clone ~5 ScFv-2 et contenant la séquence codant KDEL; les pourcentages d'activité
1,3GT sont indiqués en ordonnée.

- Figure 8:
Mesure de la Iyse par le complément des cellules LLC-PKl transfectées ou ,(~ non avec des séquences ScFv anti-al,3GT, et incubées avec du sérum humain contenant des xénoanticorps naturels. Ies dilutions de sérum sont indiquées en ahscisse, et le pourcentage de cytotoxicité en ordonnée (moyenne de deux expérience~s indépendantes); carrés creux: cellules LLC-PK1 non transfectées:
carrés pleins: cellules LLC-PK1 transfectées avec un plasmide contrôle; cercles ,5 creux: cellules LLC-PK1 exprimant le ScFv correspondant à la séquence SEQ
ID NO 9 (clone 1.7-7); cercles pleins: cellules LLC-PK1 exprimant le ScF~
correspondant à la séquence SEQ ID NO 11 (clone 2.6-2).

CA 022~8872 1998-12-16 W O 98/03653 PCT~R97101340 - Figure 9:
Mesure de l'augmentation de la valence d'un ScFv anti-ul,3GT
intracellulaire sur le fonctionnement de l'enzyme. L'intensité de fluorescence est indiquée en ordonnée (unités arbitraires); LLC-PKl: cellules LLC-PK1 non transl'ectées; ScFv-neg: cellules LLC-PK1 transfectées avec un plasmide de contrôle ne contenant pas de séquence ScFv; ScFv2zip : cellules LLC-PKl transfectées avec la séquence SEQ ID NO l l comportant une séquence de dimérisation (ScFv-zip); ScFv2tetrazip: cellules LLC-PKl transfectées avec la l0 sé4uence SEQ ID NO 11 comportant une séquence de tétramérisation (ScFv-tetrazip).

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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Biol. 9, 1041-1048 CA 022~8872 1998-12-16 W O 98/036S3 PCT~FR97/01340 LISTE DE SEQUENCES

(1) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: INSERM
(B) RUE: 101, rue de Tolbiac (C) VILLE: Paris (E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75654 Cedex 13 (ii) TITRE DE L' INVENTION: PROCEDE DE PREPARATION D'ORGANES DE
MAMMIFERES NON HUMAINS TRANSGENIQUES EN W E DE LEUR
TRANSPLANTATION CHEZ L'HOMME, ET SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES
POUR LA MISE EN OE W RE DE CE PROCEDE
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 18 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1128 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 1..1128 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:

Asn Ser Lys Ile Met Asn Val Lys Gly Arg Val Val Leu Ser Met Leu CTT GTC TCA ACT GTA ATG GTT GTG TTT TGG GAA TAC ATC AAC AGC CCA ~6 Leu Val Ser Thr Val Met Val Val Phe Trp Glu Tyr Ile Asn Ser Pro GAA GGT TCT TTG TTC TGG ATA TAC CAG TCA A~A AAC CCA GAA GTT GGC 144 Glu Gly Ser Leu Phe Trp Ile Tyr Gln Ser Lys Asn Pro Glu Val Gly CA 022~8872 1998-12-16 W 0 98/03653 PCT~R97/01340 Ser Ser Ala Gln Arg Gly Trp Trp Phe Pro Ser Trp Phe Asn Asn Gly Thr His Ser Tyr His Glu Glu Glu Asp Ala Ile Gly Asn Glu Lys Glu Gln Arg Lys Glu Asp Asn Arg Gly Glu Leu Pro Leu Val Asp Trp Phe Asn Pro Glu Lys Arg Pro Glu Val Val Thr Ile Thr Arg Trp Lys Ala Pro Val Val Trp Glu Gly Thr Tyr Asn Arg Ala Val Leu Asp Asn Tyr Tyr Ala Lys Gln Lys Ile Thr Val Gly Leu Thr Val Leu Ala Val Gly Arg Tyr Ile Glu His Tyr Leu Glu Glu Phe Leu Ile Ser Ala Asn Thr Tyr Phe Met Val Gly His Lys Val Ile Phe Tyr Ile Met Val Asp Asp Ile Ser Arg Met Pro Leu Ile Glu Leu Gly Pro Leu Arg Ser Phe Lys Val Phe Glu Ile Lys Ser Glu Lys Arg Trp Gln Asp Ile Ser Met Met Arg Met Lys Thr Ile Gly Glu His Ile Leu Ala His Ile Gln His Glu Val Asp Phe Leu Phe Cys Met Asp Val Asp Gln Val Phe Gln Asn Asn Phe Gly Val Glu Thr Leu Gly Gln Ser Val Ala Gln Leu Gln Ala Trp Trp Tyr Lys Ala His Pro Asp Glu Phe Thr Tyr Glu Arg Arg Lys Glu CA 022~8872 l998-l2-l6 W 0 98/036S3 PCT~FR97t01340 Ser Ala Ala Tyr Ile Pro Phe Gly Gln Gly Asp Phe Tyr Tyr His Ala Ala Ile Phe Gly Gly Thr Pro Thr Gln Val Leu Asn Ile Thr Gln Glu Cys Phe Lys Gly Ile Leu Gln Asp Lys Glu Asn Asp Ile Glu Ala Glu Trp His Asp Glu Ser His Leu Asn Lys Tyr Phe Leu Leu Asn Lys Pro Thr Lys Ile Leu Ser Pro Glu Tyr Cys Trp Asp Tyr His Ile Gly Met Ser Val Asp Ile Arg Ile Val Lys Ile Ala Trp Gln Lys Lys Glu Tyr Asn Leu Val Arg Asn Asn Ile (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
~i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
~A) LONGUEUR: 375 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire ~ii) TYPE DE MOLECULE: protéine ~xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Asn Ser Lys Ile Met Asn Val Lys Gly Arg Val Val Leu Ser Met Leu l 5 10 15 ~eu Val Ser Thr Val Met Val Val Phe Trp Glu Tyr Ile Asn Ser Pro Glu Gly Ser Leu Phe Trp Ile Tyr Gln Ser Lys Asn Pro Glu Val Gly Ser Ser Ala Gln Arg Gly Trp Trp Phe Pro Ser Trp Phe Asn Asn Gly Thr His Ser Tyr His Glu Glu Glu Asp Ala Ile Gly Asn Glu Lys Glu CA 022~8872 1998-12-16 W 098103653 PCTA~R97/01340 40~ln Arg Lys Glu Asp Asn Arg Gly Glu Leu Pro Leu Val Asp Trp Phe ~sn Pro Glu Lys Arg Pro Glu Val Val Thr Ile Thr Arg Trp Lys Ala lO0 105 110 Pro Val Val Trp Glu Gly Thr Tyr Asn Arg Ala Val Leu Asp Asn Tyr Tyr Ala Lys Gln Lys Ile Thr Val Gly Leu Thr Val Leu Ala Val Gly Arg Tyr Ile Glu His Tyr Leu Glu Glu Phe Leu Ile Ser Ala Asn Thr ~yr Phe Met Val Gly His Lys Val Ile Phe Tyr Ile Met Val Asp Asp ~le Ser Arg Met Pro Leu Ile Glu Leu Gly Pro Leu Arg Ser Phe Lys Val Phe Glu Ile Lys Ser Glu Lys Arg Trp Gln Asp Ile Ser Met Met Arg Met Lys Thr Ile Gly Glu His Ile Leu Ala His Ile Gln His Glu Val Asp Phe Leu Phe Cys Met Asp Val Asp Gln Val Phe Gln Asn Asn ~he Gly Val Glu Thr Leu Gly Gln Ser Val Ala Gln Leu Gln Ala Trp ~rp Tyr Lys Ala His Pro Asp Glu Phe Thr Tyr Glu Arg Arg Lys Glu Ser Ala Ala Tyr Ile Pro Phe Gly Gln Gly Asp Phe Tyr Tyr His Ala Ala Ile Phe Gly Gly Thr Pro Thr Gln Val Leu Asn lle Thr Gln Glu Cys Phe Lys Gly Ile Leu Gln Asp Lys Glu Asn Asp Ile Glu Ala Glu ~rp His Asp Glu Ser His Leu Asn Lys Tyr Phe Leu Leu Asn Lys Pro ~hr Lys Ile Leu Ser Pro Glu Tyr Cys Trp Asp Tyr His Ile Gly Met Ser Val Asp Ile Arg Ile Val Lys Ile Ala Trp Gln Lys Lys Glu Tyr Asn Leu Val Arg Asn Asn Ile CA 022~8872 l998-l2-l6 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1092 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: si~ple (D) CONFIGURATION: linéaire (li) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
~A) NOM/CLE: CDS
~B) EMPLACEMENT: 1..1092 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:

Asn Ser Lys Ile Met Asn Val Lys Gly Arg Val Val Leu Ser Met Leu l 5 10 15 Leu Val Ser Thr Val Met Val Val Phe Trp Glu Tyr Ile Asn Arg Asn Pro Glu Val Gly Ser Ser Ala Gln Arg Gly Trp Trp Phe Pro Ser Trp Phe Asn Asn Gly Thr His Ser Tyr His Glu Glu Glu Asp Ala Ile Gly Asn Glu Lys Glu Gln Arg Lys Glu Asp Asn Arg Gly Glu Leu Pro Leu 65 70 75 ~0 Val Asp Trp Phe Asn Pro Glu Lys Arg Pro Glu Val Val Thr Ile Thr Arg Trp Lys Ala Pro Val Val Trp Glu Gly Thr Tyr Asn Arg Ala Val Leu Asp Asn Tyr Tyr Ala Lys Gln Lys Ile Thr Val Gly Leu Thr Val Leu Ala Val Gly Arg Tyr Ile Glu His Tyr Leu Glu Glu Phe Leu Ile .

CA 022~8872 1998-12-16 W O 98/03653 PCT~R97/01340

4~

Ser Ala Asn Thr Tyr Phe Met Val Gly His Lys Val Ile Phe Tyr Ile Met Val Asp Asp Ile Ser Arg Met Pro Leu Ile Glu Leu Gly Pro Leu Arg Ser Phe Lys Val Phe Glu Ile Lys Ser Glu Lys Arg Trp Gln Asp Ile Ser Met Met Arg Met Lys Thr Ile Gly Glu His Ile Leu Ala His Ile Gln His Glu Val Asp Phe Leu Phe Cys Met Asp Val Asp Gln Val Phe Gln Asn Asn Phe Gly Val Glu Thr Leu Gly Gln Ser Val Ala Gln Leu Gln Ala Trp Trp Tyr Lys Ala His Pro Asp Glu Phe Thr Tyr Glu Arg Arg Lys Glu Ser Ala Ala Tyr Ile Pro Phe Gly Gln Gly Asp Phe Tyr Tyr His Ala Ala Ile Phe Gly Gly Thr Pro Thr Gln Val Leu Asn Ile Thr Gln Glu Cys Phe Lys Gly Ile Leu Gln Asp Lys Glu Asn Asp Ile Glu Ala Glu Trp His Asp Glu Ser His Leu Asn Lys Tyr Phe Leu Leu Asn Lys Pro Thr Lys Ile Leu Ser Pro Glu Tyr Cys Trp Asp Tyr His Ile Gly Met Ser Val Asp Ile Arg Ile Val Lys Ile Ala Trp Gln Lys Lys Glu Tyr Asn Leu Val Arg Asn Asn Ile CA 022~8872 l998-l2-l6 WO 98/03653 PCT~R97/0}340 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4:
) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 363 acldes aminés (B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
Asn Ser Lys Ile Met Asn Val Lys Gly Arg Val Val Leu Ser Met Leu ~eu Val Ser Thr Val Met Val Val Phe Trp Glu Tyr Ile Asn Arg Asn Pro Glu Val Gly Ser Ser Ala Gln Arg Gly Trp Trp Phe Pro Ser Trp Phe Asn Asn Gly Thr His Ser Tyr His Glu Glu Glu Asp Ala Ile Gly Asn Glu Lys Glu Gln Arg Lys Glu Asp Asn Arg Gly Glu Leu Pro Leu ~al Asp Trp Phe Asn Pro Glu Lys Arg Pro Glu Val Val Thr Ile Thr ~rg Trp Lys Ala Pro Val Val Trp Glu Gly Thr Tyr Asn Arg Ala Val Leu Asp Asn Tyr Tyr Ala Lys Gln Lys Ile Thr Val Gly Leu Thr Val Leu Ala Val Gly Arg Tyr Ile Glu His Tyr Leu Glu Glu Phe Leu Ile Ser Ala Asn Thr Tyr Phe Met Val Gly His Lys Val Ile Phe Tyr Ile ~et Val Asp Asp Ile Ser Arg Met Pro Leu Ile Glu Leu Gly Pro Leu ~rg Ser Phe Lys Val Phe Glu Ile Lys Ser Glu Lys Arg Trp Gln Asp Ile Ser Met Met Arg Met Lys Thr Ile Gly Glu His Ile Leu Ala His Ile Gln His Glu Val Asp Phe Leu Phe Cys Met Asp Val Asp Gln Val Phe Gln Asn Asn Phe Gly Val Glu Thr Leu Gly Gln Ser Val Ala Gln . .

CA 022~8872 l998-l2-l6 W O 98/03653 PCT~R97/01340 Leu Gln Ala Trp Trp Tyr Lys Ala His Pro Asp Glu Phe Thr Tyr Glu ~rg Arg Lys Glu Ser Ala Ala Tyr Ile Pro Phe Gly Gln Gly Asp Phe Tyr Tyr His Ala Ala Ile Phe Gly Gly Thr Pro Thr Gln Val Leu Asn Ile Thr Gln Glu Cys Phe Lys Gly Ile Leu Gln Asp Lys Glu Asn Asp Ile Glu Ala Glu Trp His Asp Glu Ser His Leu Asn Lys Tyr Phe Leu ~eu Asn Lys Pro Thr Lys Ile Leu Ser Pro Glu Tyr Cys Trp Asp Tyr ~is Ile Gly Met Ser Val Asp Ile Arg Ile Val Lys Ile Ala Trp Gln Lys Lys Glu Tyr Asn Leu Val Arg Asn Asn Ile (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1065 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
~B) EMPLACEMENT: 1..1065 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:

Asn Ser Lys Ile Met Asn Val Lys Gly Arg Val Val Leu Ser Met Leu Leu Val Ser Thr Val Met Val Val Phe Trp Glu Tyr Ile Asn Ser Pro Glu Gly Ser Leu Phe Trp Ile Tyr Gln Ser Lys Thr His Ser Tyr His CA 022~8872 1998-12-16 W O 98/03653 PCT~R97/01340 Glu Glu Glu Asp Ala Ile Gly Asn Glu Lys Glu Gln Arg Lys Glu Asp Asn Arg Gly Glu Leu Pro Leu Val Asp Trp Phe Asn Pro Glu Lys Arg Pro Glu Val Val Thr Ile Thr Arg Trp Lys Ala Pro Val Val Trp Glu 85 90 ~5 Gly Thr Tyr Asn Arg Ala Val Leu Asp Asn Tyr Tyr Ala Lys Gln Lys Ile Thr Val Gly Leu Thr Val Leu Ala Val Gly Arg Tyr Ile Glu His Tyr Leu Glu Glu Phe Leu Ile Ser Ala Asn Thr Tyr Phe Met Val Gly His Lys Val Ile Phe Tyr Ile Met Val Asp Asp Ile Ser Arg Met Pro Leu Ile Glu Leu Gly Pro Leu Arg Ser Phe Lys Val Phe Glu Ile Lys Ser Glu Lys Arg Trp Gln Asp Ile Ser Met Met Arg Met Lys Thr Ile Gly Glu His Ile Leu Ala His Ile Gln His Glu Val Asp Phe Leu Phe Cys Met Asp Val Asp Gln Val Phe Gln Asn Asn Phe Gly Val Glu Thr Leu Gly Gln Ser Val Ala Gln Leu Gln Ala Trp Trp Tyr Lys Ala His -Pro Asp Glu Phe Thr Tyr Glu Arg Arg Lys Glu Ser Ala Ala Tyr Ile Pro Phe Gly Gln Gly Asp Phe Tyr Tyr His Ala Ala Ile Phe Gly Gly CA 022~8872 1998-12-16 W O 98/03653 PCTtFR97tO1340 Thr Pro Thr Gln Val Leu Asn Ile Thr Gln Glu Cys Phe Lys Gly Ile Leu Gln Asp Lys Glu Asn Asp Ile Glu Ala Glu Trp His Asp Glu Ser His Leu Asn Lys Tyr Phe Leu Leu Asn Lys Pro Thr Lys Ile Leu Ser Pro Glu Tyr Cys Trp Asp Tyr His Ile Gly Met Ser Val Asp Ile Arg Ile Val Lys Ile Ala Trp Gln Lys Lys Glu Tyr Asn Leu Val Arg Asn ~ Asn Ile (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 354 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
Asn Ser Lys Ile Met Asn Val Lys Gly Arg Val Val Leu Ser Met Leu l 5 10 15 Leu Val Ser Thr Val Met Val Val Phe Trp Glu Tyr Ile Asn Ser Pro Glu Gly Ser Leu Phe Trp Ile Tyr Gln Ser Lys Thr His Ser Tyr His Glu Glu Glu Asp Ala Ile Gly Asn Glu Lys Glu Gln Arg Lys Glu Asp Asn Arg Gly Glu Leu Pro Leu Val Asp Trp Phe Asn Pro Glu Lys Arg Pro Glu Val Val Thr Ile Thr Arg Trp Lys Ala Pro Val Val Trp Glu CA 022~8872 1998-12-16 W O 98/03653 PCTA~R97/01340 Gly Thr Tyr Asn Arg Ala Val Leu Asp Asn Tyr Tyr Ala Lys Gln Lys Ile Thr Val Gly Leu Thr Val Leu Ala Val Gly Arg Tyr Ile Glu His Tyr Leu Glu Glu Phe Leu Ile Ser Ala Asn Thr Tyr Phe Met Val Gly His Lys Val Ile Phe Tyr Ile Met Val Asp Asp Ile Ser Arg Met Pro ~eu Ile Glu Leu Gly Pro Leu Arg Ser Phe Lys Val Phe Glu Ile Lys ~er Glu Lys Arg Trp Gln Asp Ile Ser Met Met Arg Met Lys Thr Ile Gly Glu His Ile Leu Ala His Ile Gln His Glu Val Asp Phe Leu Phe Cys Met Asp Val Asp Gln Val Phe Gln Asn Asn Phe Gly Val Glu Thr Leu Gly Gln Ser Val Ala Gln Leu Gln Ala Trp Trp Tyr Lys Ala His ~ro Asp Glu Phe Thr Tyr Glu Arg Arg Lys Glu Ser Ala Ala Tyr Ile ~ro Phe Gly Gln Gly Asp Phe Tyr Tyr His Ala Ala Ile Phe Gly Gly Thr Pro Thr Gln Val Leu Asn Ile Thr Gln Glu Cys Phe Lys Gly Ile Leu Gln Asp Lys Glu Asn Asp Ile Glu Ala Glu Trp His Asp Glu Ser His Leu Asn Lys Tyr Phe Leu Leu Asn Lys Pro Thr Lys Ile Leu Ser ~ro Glu Tyr Cys Trp Asp Tyr His Ile Gly Met Ser Val Asp Ile Arg ~le Val Lys Ile Ala Trp Gln Lys Lys Glu Tyr Asn Leu Val Arg Asn ~sn Ile CA 022~8872 l998-l2-l6 WO 98t03653 PCT~R97/01340 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1029 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 1..1029 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:

Asn Ser Lys Ile Met Asn Val Lys Gly Arg Val Val Leu Ser Met Leu Leu Val Ser Thr Val Met Val Val Phe Trp Glu Tyr Ile Asn Arg Thr His Ser Tyr His Glu Glu Glu Asp Ala Ile Gly Asn Glu Lys Glu Gln Arg Lys Glu Asp Asn Arg Gly Glu Leu Pro Leu Val Asp Trp Phe Asn Pro Glu Lys Arg Pro Glu Val Val Thr Ile Thr Arg Trp Lys Ala Pro Val Val Trp Glu Gly Thr Tyr Asn Arg Ala Val Leu Asp Asn Tyr Tyr Ala Lys Gln Lys Ile Thr Val Gly Leu Thr Val Leu Ala Val Gly Arg Tyr Ile Glu His Tyr Leu Glu Glu Phe Leu Ile Ser Ala Asn Thr Tyr Phe Met Val Gly His Lys Val Ile Phe Tyr Ile Met Val Asp Asp Ile CA 022~8872 l998-l2-l6 W 0 98/03653 PCTn~R97/01340 Ser Arg Met Pro Leu Ile Glu Leu Gly Pro Leu Arg Ser Phe Lys Val Phe Glu Ile Lys Ser Glu Lys Arg Trp Gln Asp Ile Ser Met Met Arg Met Lys Thr Ile Gly Glu His Ile Leu Ala His Ile Gln His Glu Val Asp Phe Leu Phe Cys Met Asp Val Asp Gln Val Phe Gln Asn Asn Phe Gly Val Glu Thr Leu Gly Gln Ser Val Ala Gln Leu Gln Ala Trp Trp Tyr Lys Ala His Pro Asp Glu Phe Thr Tyr Glu Arg Arg Lys Glu Ser Ala Ala Tyr Ile Pro Phe Gly Gln Gly Asp Phe Tyr Tyr His Ala Ala _ 245 250 255 Ile Phe Gly Gly Thr Pro Thr Gln Val Leu Asn Ile Thr Gln Glu Cys Phe Lys Gly Ile Leu Gln Asp Lys Glu Asn Asp Ile Glu Ala Glu Trp His Asp Glu Ser His Leu Asn Lys Tyr Phe Leu Leu Asn Lys Pro Thr Lys Ile Leu Ser Pro Glu Tyr Cys Trp Asp Tyr His Ile Gly Met Ser Val Asp Ile Arg Ile Val Lys Ile Ala Trp Gln Lys Lys Glu Tyr Asn Leu Val Arg Asn Asn Ile CA 022~8872 l998-l2-l6 W 0 98/03653 PCT~R97/01340 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 342 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (xi~ DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
Asn Ser Lys Ile Met Asn Val Lys Gly Arg Val Val Leu Ser Met Leu ~eu Val Ser Thr Val Met Val Val Phe Trp Glu Tyr Ile Asn Arg Thr His Ser Tyr His Glu Glu Glu Asp Ala Ile Gly Asn Glu Lys Glu Gln Arg Lys Glu Asp Asn Arg Gly Glu Leu Pro Leu Val Asp Trp Phe Asn Pro Glu Lys Arg Pro Glu Val Val Thr Ile Thr Arg Trp Lys Ala Pro ~al Val Trp Glu Gly Thr Tyr Asn Arg Ala Val Leu Asp Asn Tyr Tyr ~la Lys Gln Lys Ile Thr Val Gly Leu Thr Val Leu Ala Val Gly Arg Tyr Ile Glu His Tyr Leu Glu Glu Phe Leu Ile Ser Ala Asn Thr Tyr Phe Met Val Gly His Lys Val Ile Phe Tyr Ile Met Val Asp Asp Ile Ser Arg Met Pro Leu Ile Glu Leu Gly Pro Leu Arg Ser Phe Lys Val ~he Glu Ile Lys Ser Glu Lys Arg Trp Gln Asp Ile Ser Met Met Arg ~et Lys Thr Ile Gly Glu His Ile Leu Ala His Ile Gln His Glu Val Asp Phe Leu Phe Cys Met Asp Val Asp Gln Val Phe Gln Asn Asn Phe Gly Val Glu Thr Leu Gly Gln Ser Val Ala Gln Leu Gln Ala Trp Trp Tyr Lys Ala His Pro Asp Glu Phe Thr Tyr Glu Arg Arg Lys Glu Ser CA 022~8872 1998-12-16 W O 98/03653 PCT~FR97/01340 ~la Ala Tyr Ile Pro Phe Gly Gln Gly Asp Phe Tyr Tyr His Ala Ala ~le Phe Gly Gly Thr Pro Thr Gln Val Leu Asn Ile Thr Gln Glu Cys Phe Lys Gly Ile Leu Gln Asp Lys Glu Asn Asp Ile Glu Ala Glu Trp His Asp Glu Ser His Leu Asn Lys Tyr Phe Leu Leu Asn Lys Pro Thr Lys Ile Leu Ser Pro Glu Tyr Cys Trp Asp Tyr His Ile Gly Met Ser Val Asp Ile Arg Ile Val Lys Ile Ala Trp Gln Lys Lys Glu Tyr Asn ~eu Val Arg Asn Asn Ile ~2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 708 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A~ NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 1..708 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe CA 022~8872 1998-12-16 WO 98/03653 P~TA~R97/01340 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Met Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly ~2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 236 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:

CA 022~8872 l998-l2-l6 WO 98/03653 PCT/~Rg7/01340 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala ~er Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr ~et Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys ~la Arg Ser Gly Met Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser ~rp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly ~ys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO~
~i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 711 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm CA 022~8872 1998-12-16 WO 98/03653 PCT~FRg7/01340 (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 1..711 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cy5 Ala Arg Pro Glu Ile Asp Gln Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser CA 022~8872 1998-12-16 Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 237 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cy5 Ala Arg Pro Glu Ile Asp Gln Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr , .

CA 022~8872 1998-12-16 WO 98/036S3 PCT/FRg7/01340 Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 717 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (li) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 1..717 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13:

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Cys Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys CA 022~8872 1998-12-16 W Og8/~3653 PCTAFR97/01340 Ala Arg Ser Asn Asp Pro Ala Asp Gln Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val ATC TAT GGT A~A AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT 576 Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 14:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 239 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr ... . .. . .. .

CA 022~8872 1998-12-16 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr ~eu Gln Ile Cys Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys ~la Arg Ser Asn Asp Pro Ala Asp Gln Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr ~yr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val ~le Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 15:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 762 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 1..762 CA 022~8872 1998-12-16 (xl) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15:

Arg Phe Met Glu Arg Hls Trp Ile Phe Leu Phe Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Ala Trp Arg Thr Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr ~ , .

CA 022~8872 1998-12-16 WO 98/03653 PCTAFRg7/01340 Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Glu Lys Asp Glu Leu (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 16:
~i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 254 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (Y~i ) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16:
Arg Phe Met Glu Arg His Trp Ile Phe Leu Phe Gln Val Gln Leu Val ~ln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr ~le Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser ~eu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Ala Trp Arg Thr Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln CA 022~8872 1998-12-16 WO 98/03653 PCT~R97/01340 Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Glu Lys Asp Glu Leu (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 17:
(i~ CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 687 paires de bases (B) TYPE: acide nucléi~ue (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
~A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 1..687 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17:

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val CA 022~8872 1998-12-16 Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln 180 ~85 190 Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Glu Lys Asp Glu Leu (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 18:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 229 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18:
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe ~hr Ser Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser CA 022~8872 1998-12-16 Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val ~yr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val ~hr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val ~le Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser ~ly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Glu Lys Asp Glu Leu .. . .. .

Claims (16)

REVENDICATIONS

1. Utilisation de séquences nucléotidiques codant pour des anticorps dirigés contre toute molécule impliquée dans un phénomène de rejet de greffe (encore désignés ci-après anticorps anti-molécules), et notamment contre toute molécule possédant une activité telle que ladite molécule représente un épitope xénoantigénique, ou participe à la biosynthèse d'épitopes xénoantigéniques dans des cellules de mammifères non humains (et plus particulièrement à la surface de ces cellules), ces épitopes étant susceptibles d'être reconnus par des xénoanticorps naturels humains lorsque lesdites cellules, ou organes constitués de ces cellules, de mammifères non humains, sont greffés chez l'homme, pour la préparation de cellules transgéniques, ou organes transgéniques, de mammifères non humains, au sein desquels lesdites molécules forment en totalité ou en partie des complexes immuns avec lesdits anticorps anti-molécules, de telle sorte que l'activité desdites molécules dans les phénomènes de rejet de greffe soit totalement ou partiellement inhibée, en particulier que les xénoanticorps susmentionnés ne reconnaissent plus, en totalité ou en partie, lessusdits épitopes, ou au sein desquels la biosynthèse desdits épitopes xénoantigéniques est partiellement ou totalement inhibée, lesdites cellules ou lesdits organes transgéniques de mammifères non humains étant destinés à être greffés chez un patient.

2. Utilisation selon la revendication 1, de séquences nucléotidiques codant pour des anticorps dirigés contre:
- tout épitope xénoantigénique, glucidique ou non glucidique, reconnu par des xénoanticorps humains, et plus particulièrement les épitopes glucidiques galactosylés situés à la surface des membranes de cellules de mammifères non humains, notamment l'épitope .alpha. galactosyl présent à la surface de cellules de porc et constitué de l'ensemble Gal.alpha.1,3Gal-N-acétyllactosamine susmensionné, - toute molécule participant à la biosynthèse d'épitopes xénoantigéniques chez l'homme, de nature glucidique ou non glucidique, et plus particulièrement les galactosyltransférases présentes dans les cellules de mammifères non humains, notamment l'enzyme .alpha.1,3GT présente dans les cellules de porc, - toute molécule à caractère inflammatoire synthétisée dans l'endothélium de mammifères non humains, et dont l'activité biologique conduit notamment à
la modification des propriétés anticoagulantes de l'endothélium in vivo en milieu xénogénique, telle que les cytokines et chemoattracteurs (IL-1, IL-6, IL-8.

IP-10, RANTES, MCP;JE, inhibiteurs p15E, GM-CSF. G-CSF), les molécules d'dhésion (ELAM-1. VCAM-1, c-sis, GPlb.alpha.. vWF, ligand LAM-1) les facteurs de transcription ou modifiant la transcription (c-fos, NFkB,GEM), les régulateurs du tonus vasculaire (NO synthase, PGF synthase, endothéline), les facteurs intervenant dans la coagulation (PAF acétyleransférase, facteur tissulaire, PAl-1), les facteurs d'immunocompétence (CMHI, CMH II), -les récepteurs membranaires à des molécules présentes chez le receveur.
l'action de ces molécules étant dirigée vers un rejet de greffe, dont par exemple le C5aR, ou le TNF.alpha.R, ou les récepteurs aux cellules NK.

3. Utilisation selon la revendication 1 ou la revendicatior 2, de séquences nucléotide codant pour des articorps dirigés contre l'une au monis des isoformes (et avantageusement contre toutes les isoformes) des galactosyl transférases présentes chez les mammifères non humains, et plus particulèrement de l'enzyme .alpha.-1.3GT présente chez le pore, porc la préparation d'organes de mammiferès non humains transgéniques au sein desquels la biosynttèse des épitopes .alpha.-galacrosyl dans les cellules desdits organes est partiellement ou totalement inhibée.

4. Anticorps, les cas échéant simple dirigés contre l'une au moins des isoformes de l'.alpha.-1.3GT, et plus particulièrement dirigés contre l'une au moi des isoformes de l'.alpha.-1.3GT présentes chez le porc et representées par les séquences en acides aminés SEQ ID NO 2 (correspondant à l'isoforme 1), SEQ
ID NO 4 (correspondant à l'isoforme 2), SEQ ID NO 6 (correspondant à
l'isoforme 3) et SEQ ID NO 8 (correspondant à l'isoforme 4) ces isoformes 1 à
4 étant respectivement codées par les séquences nucléotidiques représentées par SEQ ID NO 1 SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 5 et SEQ ID NO 7, ou codées par toutes séquences aucléitidiques détrives de ces dernières, notammeur par dégérerescence du code génétique.

5. Anticorps selon la revendication 4, dirigés contre l'une au moins des isoformes 3 et 4 de l'.alpha.-1.3GT présentes chez le porc et représentées par les séquences en acides aminés SEQ ID NO 6 et SEQ ID NO 8.

6. Anticorps selon la revendication 4 ou la revendication 5, caracterisés en ce qu'ils sont représentés par les séquences en acides amines SEQ ID NO 10 (anticorps désigné ScFv1, SEQ ID NO 12 tansticorps désigné SeFv2), SEQ ID
NO 14 (anticorps designe ScFv3) SEQ ID NO 16 (anticorps désigné ScFv4) et SEQ ID NO 18 (ScFv8), ou par toute séquence en acides aminés dérivée de ces dernières, notamment par addition, suppréssion ou substitution d'un ou plusieursacides aminés, ou par tout fragment des séquences susmentionnées ou de leurs séquences dérivées, lesdites séquences et lesdits fragments étant susceptibles de reconnaitre l'une au moins des isoformes de l'.alpha.-1.3GT.

7. Séquences nucléotidiques codant pour un anticorps selon l'un des revendications 4 à 6, et comportant notamment les séquences nucléotidiques représentées par SEQ ID NO 9 (codant pour ScFv1), SEQ ID NO 11 (codant pour ScFv2), SEQ ID NO 13 (codant pour ScFv3), SEQ ID NO 15 (codant pour ScFv4), SEQ ID NO 17 (codant pour ScFv5), ou toute séquence nucléotidique dérivée de ces dernières, notamment les séquences dérivées par dégénérescence du code génétique, et étant néanmoins capables de coder pour les anticorps ScFv1, ScFv2, ScFv3, ScFv4 ou ScFv5, ou les séquences dérivées par addition, suppression ou substitution d'un ou plusieurs nucléotides, ou tout fragment des séquences nucléotidiques susmentionnées ou de leurs séquences dérivées lesdites séquences dérivées et lesdits fragments étant susceptibles de coder pour un anticorps susceptible de reconnaitre l'une au moins des isoformes de l'.alpha.
1.3GT.

8. Vecteur contenant l'une au moins des séquences nucléotidiques selon la revendication 7 et les éléments nécessaires à l'expression des anticorps selon l'une des revendications 1 à 6.

9. Hôte cellulaire contenant l'un au moins des vecteurs selon la revendication 8.

10. Mammifère transgénique non humain, ou cellules de mammifères, comprenant dans son génome au moins une séquence nucléotidique codant pour des anticorps dirigés contre toute molécule impliquée dans un phénomène de rejet de greffe (encore désignés ci-apres anticorps anti-molécules), et notamment contre toute molécule possédant une activité telle que ladite molécule représente un épitope xénoantigénique ou participe à la biosynthèse d'épitopes xénoantigéniques dans des cellules de mammifères non humains (et plus particulièrement à la surface de ces cellules), ces épitopes étant susceptibles d'étre reconnus par des xénoanticorps naturels humains lorsque lesdites cellules, ou organes constitués de ces cellules, de mammifères non humains, sont greffés chez l'homme, et plus particulièrement au moins une séquence nucléotidique selon la revendication 7.

11. Mammifère transgénique non humain tel qu'obtenu par introduction notamment par microinjection, dans un ovocyte fécondé, d'au moins une séquence nucléotidique telle que définie dans la revendication 10, et plus particulièrement de l'une des séquences nucléotidiques selon la revendication 7,et insertion de l'embryon dans la matrice d'une mère de substitution et développement de l'embryon à terme.

12. Mammifère transgénique non humain selon l'une des revendications 10 a 11, tel que produit par croisement d'animaux transgéniques exprimant au moins une séquence nucléotidique telle que définie dans la revendication 10, et plus particulièrement au moins une des séquences nucléotidique selon la revendication 7.

13. Cellules cultivées à partir des animaux transgéniques non humains selon l'une des revendications 10 à 12.

14. Organes de mammifères non humains, comprenant dans le génome des cellules les constituant au moins une séquence nucléotidique telle que définie dans la revendication 10, et plus particulièrement au moins une des séquences nucléotidiques selon la revendication 7, tels qu'obtenus par prélèvement sur desmammifères transgéniques non humains selon l'une des revendications 10 à 12.

15. Polypeptide comprenant la séquence d'acides amines telle que représentée par la SEQ ID NO 6 (correspondant à l'isoforme 3 de l'.alpha.1,3-GT)ou SEQ ID NO 8 (correspondant à l'isoforme 4 de l'.alpha.1,3-GT), ou tout polypeptide contenant tout fragment d'au moins environ 6 acides aminés, de l'une des susdites séquences d'acides aminés, ledit polypeptide contenant ce fragment étant susceptible de générer des anticorps reconnaissant l'une au moinsdes quatre isoformes de l'.alpha.-1,3GT, ou toute séquence dérivée de ces dernières, notamment par addition, suppression ou modification d'un ou plusieurs acides aminés, sous reserve que la séquence dérivée soit susceptible de générer des anticorps reconnaissant l'une au moins des quatre susdites isoformes, la séquence SEQ ID NO 2 étant exclue

16. Séquences nucléotiques comprenant les séquences représentées par SEQ ID NO 5 et SEQ ID NO 7, ou toutes séquences dérivées, notamment par les séquences dérivées par dégénérescence du code génétique, et étant néanmoins capables de coder pour les polypeptides représentés par les séquences en acides aminés représentées par SEQ ID NO 6 et SEQ ID NO 8 respectivement, ou les séquences dérivées par addition, suppression ou substitution d'un ou plusieurs nucléotides, ou tout fragment des séquences nucléotidiques susmentionnées ou de leurs séquences dérivées, lesdites séquences dérivées et lesdits fragments étant susceptibles de coder puis un anticorps susceptible de reconnaître l'un au moins des isoformes de l'~1,3 GT, la séquence SEQ ID NO 1 étant exclue.