CA2131384A1 - Composes polymeres de l'acide glucuronique, procede de preparation et utilisation notamment en tant que moyens gelifiants, epaississants, hydratants, stabilisants, chelatants ou floculants - Google Patents

Abstract

2131384 9318174 PCTABS00163 La présente invention concerne en tant que produit industriel nouveau un composé polymère de l'acide glucuronique caractérisé en ce qu'il est choisi parmi l'ensemble constitué par (a) les acides D-polyglucuroniques à enchaînement .beta.(1-4) de formule (I) dans laquelle n est un nombre ayant une valeur moyenne comprise entre environ 300 et 2500, (b) les esters correspondants, (c) les éthers correspondants, et (d) leurs mélanges. Elle concerne également le procédé de préparation de ce nouveau produit par fermentation, de préférence par fermentation de la souche Rhizobium meliloti NCIMB 40472. Ce nouveau produit est utile notamment (i) dans le domaine alimentaire, pharmaceutique en thérapeutique humaine ou vétérinaire, cosmétique ou de l'épuration des eaux, en particulier en tant que moyen gélifiant, épaississant, hydratant, stabilisant, chélatant ou floculant, et (ii) dans la préparation d'oligosaccharides.

Description

~131384 CO~lPOSES POLYI~ERES DE L 'ACIDE GLUC~JRO~IQ~E, P~OCED~: DE
PREPAMTION ET rJTILISATION NOTA~E~T EN TADT Q~E ~fOYENS
GELIFIAI~TS, EPAISSISSA~TS, HYDRAT~DTS, STABILISA~rTS, CHELATAJITS OU FLOC~LA~TS

DOM~INE DE L'INVENTION
La présente invention a trait, en tant que pro-duits industriels nouveaux, à des composés polymères de l'acide glucuronique, à savoir les composés polyglucuro-niques à enchainement ~ 4) de formule I ci-après. Elle concerne également le procédé de préparation de ces nouveaux composes ainsi que leur utilisation, notamment en tant que moyens gélifiants, épaississants, hydratants, sta~ilisants, chélatants, floculants, épurants et suscep-tibles de former des fibres, d'une part, et en tant que matéri~ux de départ pour la préparation de composés oligosaccharides, d'autre part.
-Elle vise également en tant que nouveau produit industriel une souche bactérienne particulière apparte-nant à l'ensemble des Rhizobium, à savoir la souche Rhizobium meliloti NCIMB 40472, qui est utile dans la préparation desdits composés polymères de l'acide glucu-ro;~ique par fermentation.
ART ANTERIEUR
Des polysaccharides, tels que les polymères de la présente invention, qui sont constitués exclusivement de motifs ou unités -acide glucuronique à enchaînement ~ 4), n'ont pas encore été décrits jusqu'a maintenant.

W093/l8l74 PCT/FR93/00205 h~ X 4 2 L'art ant~rieur le plus proche, connu du Titulai-re de la pr~sente invention comprend l'acide hyaluronique décrit notamment dans l'ouvrage ~erc~ Index, llè édition, (1989), pages 751-752 (produit No 4675), d'une part, et Sle polysaccharide décrit dans le document FR-A-2 378 092, d'autre part.
L'acide hyaluronique est un polysaccharide natu-rel constitué d'un motif rép~titif à deux unit~s : une unité acide glucuronique et une unité glucosaminidique.
Dans ce polysaccharide, ces deux unités sont alternées ;
l'unité acide glucuronique présente un enchaînement ~(1-3) et l'unité glucosaminidigue un à encha;nement ~(1-4). La formule développée de l'acide hyaluronique fournie dans le ~erc~ Index précité est la suivante :

20 ~ ~ ~ H~O o ~ ~ \,~OH
HO~Il o~H \~H o~U
H OH H NHCCH ~ H OH H NHCCH3 O O
(II) _ _ n-l Le polysaccharide du document FR-A-2 378 092 est produit par voie exocellulaire à partir d'une souche de Pseudomonas NCIB 11264 (ATCC 31260) et comprend un motif répétitif constitué de 7 unités D-glucose (une unité de glucose substitué en position 6, deux unités de glucose disubstitué en position 4, deux unités de glucose substi-tué en position 3 et deux unités de glucose disubstitué
en positions 4,6) et de 1 unité de D-galactose substitué
en position 3, ce mot~f répétitif étant estérifié avec 1 W093/18174 ` i 3 i 3 ~ PCT/FR93/0020~

unité acide acétique et l unité acide pyruvique, la chaine latérale du polymère se terminant par une unité
4,6-0-(l-carboxyéthylidène)-D-glucose.
on sait par ailleurs que la souche sauvage S Rhizobium meliloti MSNl (référence donnée par le Titulai-re de la présente invention), isol~e du sol, a été décri-te par J. COURTOIS et al., J. Bacteriol., (1988), l70, pages 5925-5927. Dans les conditions de fermentation données ci-après, cette souche produit des polysacchari-des présentant des liaisons glycosidiques ~ 3~ et en particulier le polymère répondant à la formule ~ 4)B-D-glc ~ 4)~ -g1c (l -~3)B-D-s~ 4)-a-D-g1c(l~-lS j'6 B-D-glc ~33~-0-91c(1 - 3)-~-D-glc -~1 - 6)-3-D-glc (III) 4 ¦ ¦ 6 ~ Succin~c ~cc~ate ~1 -~ui a été déterminée par A. HEYRAUD et al., Int. J.
Macromol., (1986), 8, pages 55-88.
On sait enfin de l'article de G. De RUITER et al., Carbohydrate Polymers, (1992), 18, pages 1-7 que des composés polyglucuroniques à enchainement ~ 4) ont été
isolés à partir de polysaccharides exocellulaires pro-duits par des moisissures appartenant à l'ordre des mucorales. Ces composés polyglucuroniques, qui ont un Mw compris entre 5 SOO et lO 000 daltons (i.e. un dp de 30 à
56 environ) selon les indications fournies dans le ta-W O 93/18174 P ~ /FR93/0020s ~i38~

bleau I page 3 dudit article, sont en fait des oligosaccharides quiSoDt structurellement différents notamsent par leur degré de polym~risation des polysaccharides selon l'invention. De plus, ledit article ne d~crit ni ne suggère les polysaccharides de dp moyen supérieur à 200, et en particulier de dp yen superieur ou égal à
300, selon l'invention. En particulier, il ne d~crit ni ne sugg~re la présence ou 1'obtention de polysaccharides exclusivement D-polyglucuroniques à enchainement ~ 4) et de dp élevé, parmi les polysaccharides exocellulaires produits par les moisissures appartenant à 1'ordre des mucorales et utilisés comme sources d'oligosaccharides de Mw allant de 5 500 à l0 000 daltons.
On sait que US-A-2 232 99o (i) décrit un procédé
d'oxydation de la cellulose, dans des conditions non-nitratantes, au moyen de NO2 gazeux, et (ii) émet l'hypothèse (voir page 3,colonne de droite, lignes 16-l9) ~If a complete.7y osidized cellulose is reacted with agueous sodiu~7 h~dro~ide or ~ sodium salt of a weak acid, the resulting copound is sodium pol~anhydroglucuronate." Or il se trouve que ce procédé ne permet qu'une oxydation partielle de la cellulose et que seuls quelques motifs D-glucose du squelette polyoside de la cellulose sont transformés en motifs acide D-glucuronique.
La cellulose oxydée obtenue selon le procédé de US-A-2 232 990 n'est pas un polysaccharide du type acide D-polyglucuronique à
enchaînement ~(1-4) selon la présente invention. Ladite cellulose oxydée est différente des polysaccharides de la présente invention eu égard notamment au fait (i) que son poids moléculaire est plus élevé (voir US-A-2 232 990, page 2 colonne de droite, lignes 60-64), où il est signalé que la chaine polyoside de la cellulose de départ n'a pas été clivée), et (ii) qu'elle est insoluble dans l'eau (les exemples de cellulose oxydée ne font état que de sa solubilité dans de l'eau contenant 2 % de NaOH), alors que les polysaccharides ~::

`' , '' WO93/18174 ~ 8 ~ PCT/FR93/00205 (ainsi que les oligosaccharides qui en dérivent) selon la présente invention sont des polymères, du type acide D-polyglucuronique à enchainement B(1-4) ne comportant que des motifs acide D-glucuronique, qui sont tous hydro-solubles.
En bref, les indications fournies dans US-A-2 232 990 mettent en évidence que ledit procédé d'oxydation ne conduit qu'~ une cellulose faiblement oxyd~e. ~'ailleurs, 1'obtention par oxydation de la cellulose d'un matériau polyosique partiellement oxydé est confirmé par A. CESARO
et al. dans l'ouvrage New De~elopments in Industrial Polysaccharides, Gordon and Breach, New York l985.
BUT DE L'INVENTION
Le but de l'invention est de fournir de nouveaux polysaccharides qui soient structurellement différents de l'acide hyaluronigue précité et des autres polysacchari-des de 1'art antérieur, notamment les produits polymères mentionnés ci-dessus et les alginates, d'une part, et qui soient industriellement utiles notamment en tant que moyens gélifiants, épaississants, hydratants, stabili-sants, chélatants, floculants, épurants et susceptibles de former des fibres, destinés notamment au domaine alimentaire, diététique, pharmaceutique (en thérapeutique humaine ~ ou vétérinaire), cosmétique, agricole, de l'épuration des eaux, des peintures, d'autre part.
On se propose également de fournir un procédé de préparation de ces nouveaux polysaccharides, qui sont.des composés polymères de l'acide glucuronique à enchainement 4).
De plus, on se propose d'utiliser ces nouveaux polysaccharides en tant que source pour l'obtention de composés appartenant à 1'ensemble des oligosaccharides.
: Il existe en particulier un besoin en matériaux polymères pour remplacer notamment 1'acide hyaluronique ~1313~
(principalement) et les alginates (à la rigueur). Pour satisfaire ce besoin, les chercheurs ont essay~ de propo-ser des produits qui soient aussi int~ressants que l'acide hyaluronique. Cet objectif particulier est atteint par la pr~sente invention. Pour remplir ce but et fournir de nouveaux produits appartenant ~ l'ensemble des polysaccharides, on a recherché ~ mettre au point de nou-veaux composés polym~res de 1'acide glucuronique qui soient utiles industriellement .

OBJET DB L'INVENTION
Selon un premier aspect de l'invention, on préco-nise un nouveau composé polymère de l'acide glucuronique c~ractérisé en ce qu'il est choisi parmi 1'ensemble cons-titué par (a) les scides D-polyglucuroniques à enchainement ~(1-4) de formule COOH
H~

H H ON

H OH

dans laquelle n est un nombre ayant une valeur moyenne comprise entre environ 300 et 2s00, (b) les esters correspondants, ~c) les ~thers correspondants, et (d) leurs mélanges.

WO93/181~4 PCT/~R93/002~5 Selon un second aspect de l'invention, on préco-nise un proc~d~ de préparation d'un tel composé polymère de l'acide glucuronique.
Plus précisément, on vise ici un procédé de pr~paration d'un composé polymère d'acide glucuronique de formule I ou de l'un de ses esters dans lesquels les fonctions alcool OH sont partiellement O-acétylées, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend la fermentation, en présence d'un milieu nutritif contenant une source d'azote, une source de carbone et des sels, d'une souche bactérienne appartenant à 1'ensemble des Rhizobium et produisant des polysaccharides quand elle est cultivée à pH 7 dans un milieu nutritif aqueux contenant l g/l de K2HPO4, 0,2 g de MgSO~.7H20, l g/l de lS ~H~NO3 et l0 g/l de glucose.
Selon un troisième aspect de l'invention, on vise en tant que produit industriel nouveau la souche Rhizo~ium meliloti NCIMB 40472 (référence donnée par le Titulaire de la présente invention : M5Nl CS) qui est obtenue par mutation de la souche sauvage M5Nl précitée.
Selon un quatrième aspect de l'invention, on pré-conise 1'utilisation desdits composés polymères de 1'aci-de glucuronique, notamment dans le domaine alimentaire, - pharmacéutique (en thérapeutique humaine ou vétérinaire), cosmétique ou de l'épuration des eaux, en particulier en tant que moyens gélifiants, épaississants, hydratants, stabilisants, plastifiants, chélatants ou floculants, ou encore en tant que moyens filmogènes ou formant des fibres et des fibres.
Selon un cinquième aspect de l'invention, on pré-conise l'utilisation desdits composés dans la préparation d'oligosaccharides notamment utiles en agriculture.
ABREVIATIONS
Par commodité, les abréviations suivantes ont été
utilisées dans le texte de la présente invention.

WO93/18174 PCT/~R93J00205 ~ 3 ~' ~ 8 ..

Ac - acétyle Bu = n-butyle dp = degré de polymérisation Et = éthyle EtO = éthyloxy gal = galactose glc = glucose A.gluc = acide glucuronique HPLC = chromatographie liquide haute performance iBu = isobutyle iBuo = isobutyloxy iPr = isopropyle iPrO = isopropyloxy Ml = milieu nutritif aqueux d'identification conte-nant l ~/l de ~2HPO4, 0,2 g de MgSO~.7H20, l g/l de NH4NO3 et l0 g/l de glucose et permettant de distinguer par culture à pH 7 les souches de Rhizobium qui produisent des PS de celles qui n'en produisent pas 20 M2 = milieu nutritif aqueux de production, préféré
selon l'invention, contenant l g/l d'extralt de levure, 1 g/l de K2HPO~, 0,2 g/l de MgSO~.7HzO et l0 g/l de glucose, fructose ou saccharose M5Nl = souche sauvage de Rhizobi~m meliloti décrite par J. COURTOIS et al.~ J. Bacteriol., (1988), l70, pages 592~-5927 M5Nl CS = souche de Rhizobium m~liloti selon l'invention, obtenue par mutation de la souche sauvage MSNl et déposée auprès du NCIMB sous le No 40472 30 Me = méthyle MeO = méthyloxy Mw = poids moléculaire moyen en poids NCIMB = National Collection of Industrial and Marine Bacteria, (il s'agit d'un organisme britannique agréé pour le dépôt de souches) WO93/18174 PCT/~R93/00205 ~13~384 OS = oligosaccharide Pr = n-propyle PS = polysaccharide RT = température ambiante (15-25C) sBu = s.-butyle sBuO = s.-butyloxy tBu = t.-butyle tBuO = t.-butyloxy ~i = viscosité intrinsèque (ou ~ ) 10 DESCRIPTION DETAILLEE DE L ' INV~ITION
Les composés polymères de l'acide glucuronique selon l'invention comprennent donc les acides polyglu~u-roniques de formule I, leurs esters, leurs éthers et leurs mélanges.
Plus précisément/ un tel composé polymère de 1'a-cid~ glucuronique est choisi parmi l'ensemble constitué
par - les acides polyglucuroniques de formule I, - les esters des acides polyglucuroniques de formule I
dans l~squels le reste OH d'au moins un groupe acide carboxylique COOH est remplace par un reste alkoxy en Cl--C~ /
- les esters des acides polyglucuroniques de formule I
dans lesquels l'atome d'hydrogèn~ d'au moins un groupe alcool OH est remplacé par un reste acyle aliphatique en C2--C~ /
- les esters des acides polyglucuroniques de formule I
dans lesquels (i) le reste OH d'au moins un groupe acide carboxylique COOH est remplacé par un reste alkoxy en Cl-C~, et (ii) l'atome d'hydrogène d'au moins un groupealcool OH est remplacé par un reste acyle aliphatique en C2--C~ /
- les éthers des acides polyglucuroniques de formule I
dans lesquels l'atome d'hydrogène d'au moins un groupe alcool OH est remplacé par un reste alkyle en Cl-C~, WO93/18174 PCT/~R93/00205 ~1~i.'38~

- les éther-esters des acides polyglucuroniques de formule I dans lesquels (i) le reste OH d'au moins un groupe acide carboxylique COOH est remplacé par un reste alkoxy en Cl- C~, et (ii) 1'atome d'hydrogène d'au moins un groupe alcool OH est remplacé par un reste al~yle en Cl-C~, et - leurs mélanges.
Le~ groupes alkoxy précités en Cl-C4 peuvent être à chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée, ils compren-nent les groupes MeO, EtO, PrO, iPr~, ~uO, i~uO, sBuO ettBuO.
Les groupes alkyle ~récités en Cl-C4 peuvent etre à chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée, ils compren-nent les groupes Me, Et, Pr, iPr, Bu, iBu, sBu et t3u.
Les groupes acyle aliphatiques en C2-C4 peuvent etre à chaine hydrocarbonée linéaire ou ramifiée, ils comprennent les groupes Ac, COEt, COPr, COiPr.
,~ Le produit préféré selon 1'invention, a un Mw de 80 000 à 400 000 daltons et est choisi parmi 1'ensemble constitué par - les acides polyglucuroniques de formule I, - les esters du type acétate correspondants dans lesquels les fonctions alcool OH sont partiellement O-acétylées, cha~ue cycle acide glucuronique de la formule I compor-tant au plus 33 % en poids de groupes O-CO-CH3 (i.e. OAc) par rapport au poids dudit cycle acide glucuronique.
Dans ce dernier cas, la fonction acétyloxy est localisée soit en position 2, soit en position 3, soit encore en positions 2 et 3 du cycle acide glucuronique~
Bien entendu, il est possible d'éliminer ladite fonction acétyloxy. ~a désacétylation est réalisée à un pH supérieur à 8,0 à RT (ie pH supérieur à 8,0 étant obtenu au moyen d'une base forte notamment un hydroxyde de métal alcalin comme NaOH ou KOH). Ainsi, 7-8 heures a RT et a pH ll suffisent pour désacétyler le composé poly-m~re comportant jusqu'à 33 % en poids de groupe OAc par rapport au poids du cycle acide glucuronique.
Le polymère désacétylé qui répond à la formule I
ci-dessus peut être représenté par la formule abrégée :
s A.gluc ~ 1-[-~4 A.gluc ~ 1-]~->4 A.gluc (Io) Les souches bact~riennes, qui conviennent pour la mise en oeuvre du procédé de préparation selon 1'inven-tion, sont celles qui (i) appartien~ent à 1'ensemble des Rhizo~ium et ( ii ) produisent des PS quand ellçs sont cultivées à pH 7 dans un milieu nutritif aqueux d'iden-tification, à savoir le milieu M1 qui contient 1 g/l de HPO~, 0,2 g de MgSO~.7H20; 1 g/l de NH~NO3 et 10 g/l de glucose.
Parmi les souches bactériennes qui conviennent, on peut notamment citer les souches de Rhizobium meliloti et les souches apparentées qui contiennent toutes un seul plasmide ayant un Mw d'environ 100 000 à 150 000 daltons.
Parmi celles-ci, la souche préférée selon 1'invention est la souche Rhizo~ium meliloti NCIMB 40472.
Le procédé de préparation d'un composé polymère de l'acide glucuronique, selon l'invention, comprend la fermentation en présence d'une source d'azote, d'une source de carbone et de sels, d'une souche bactérienne appartenant à l'ensemble des Rhizobium qui produisent des PS par culture à pH 7 dans le milieu aqueux M1 précité.
Selon ce procédé, la production dudit composé
polymère peut être soit intracellulaire soit le plus sou-vent exocellulaire. En pratique, pour une production exocellulaire, ladite fermentation est effectuée au moyen d'un milieu aqueux contenant 0,5 à 2 g/l de KzHPO~, 0,o5 a O,3 g/l de MgSO~, O,8 à 3 g/l d'extrait de levure et 7 à 20 g/l de sucre, à une température de 25 à 40~C. Le W093/181/4 l2 PCT/FR93/002~5 t.1'~ ~'3~

milieu nutritif peut contenir un sucre quelconque, le sucre pre,f~ré est notamment choisi parmi le glucose, le fructose, le saccharose et leurs mélanges.
Par incubation dans un tel milieu aqueux, pen-dant une durée appropriée (de préférence inférieure ou égale ~ lOO h ou à la rigueur supérieure à lOO h), les bactéries produisent (tant dans la phase de croissance que dans la phase stationnaire de non-prolifération), un c~mpose polymère de l'acide D-glucuronique qui est le produit de formule I ou l'un de ses esters dans lequel les fonctions alcool OH sont partiellement O-acétylées. A
partir de ce composé, on obtient les autres esters et~ou éthers selon une méthode connue en soi.
De préférence, pour l'obtention dudit composé
polymère de 1'acide glucuronigue selon 1'invention, le milieu aqueux de ~ermentation-incubation renfermera 1 g/l d'extrait de levure, l g/l de K2HPO4, 0,2 g/l de MgSO~.7H20 (source de MgSO4) et lO g/l de sucre (de préférence glucose, fructose ou saccharose), à une température de 30-C, à un pH de 7 (obtenu par addition de NaOH ou KOH), avec pO2 de 30 a lOO ~ (selon le degré
d'acétylation souhaité).
De façon avantageuse, cette fermentation est mise en oeuvre à partir d'une population bactérienne supérieu-re ou égale à l02 bactéries/ml et mieux supérieure ou é-gale à lO~ bactéries/ml. On recueille le milieu liquide de fermentation incubé pendant une durée inférieure ou égale à lOo h, qui contient le composé polymère polyglu-curonique selon l'invention, dès que la population bactérienne est supérieure ou égale à lO9 bactéries/ml.
Dans cette optique, ies bactéries sont séparées du milieu de fermentation notamment par filtration ou dialyse (en particulier sur mem~rane) ou encore par centrifugation afin de recueillir ledit composé polymère polyglucuroni-que contenu dans le jus de fermentation.

8 ~

Ce composé polym~re polyglucuronique est isolé du filtrat, dialysat ou surnageant résultant, soit par pré-cipitation au moyen d'un solvant organique tel que EtOH, PrOH, iPrOH, MeCOMe ou un solvant analogue, soit par pr~cipitation en milieu acide à un pH inférieur ou égal De façon avantageuse, quand le composé polymère polyglucuronique est obtenu par précipitation au moyen d'un sol~ant organique, on recommande d'opérer à basse température, de préférence à une température de llordre de 4-C ; le précipité est alors recueilli par centrifuga-tion puis séché ~notamment sous vide à RT).
De façon également avantageuse, quand le composé
polymère polyglucuronique est obtenu par précipitation en milieu acide, il est recueilli par centrifugation, lavé à
l'eau et dispersé sous agitation dans une solution aqueu-se à pH supérieur ou egal à 8,0 pour être purifié ; le composé polymère polyglucuronique ainsi dissous en milieu alcalin est aussitôt reprécipité au moyen d'un solvant organique comme indiqué ci-dessus.
A partir du polymère désacétylé, on peut former les esters de la fonction acide carboxylique COOH par al-kylation selon une méthode connue en soi. On peut égale-ment o~tenir les esters de la fonction alcool OH par réaction du composé désacétylé de formule I avec un acide approprié selon une méthode connue en soi~ Les éthers de la fonction alcool OH sont obtenus a partir dudit composé
désacétylé par application d'un mécanisme réactionnel également connu en soi. Il en est dP même pour les esters des fonctions COOH et OH et les éther-esters.
Les composés polymeres polyglucuroniques à
encha;nement ~(1-4) selon l'invention, sont utiles dans plusieurs domaines, a savoir :
- l'industrie alimentaire tant humaine qu'animale, notamment en tant qu'agents épaississants ou texturants ;

WO93/18174 14 PCT/FR93/0020~

21'~ 1 38~
- 1'industrie des papiers et cartons, notamment en tant qu'additifs ou moyens de couchage, voire meme en tant que fibres ;
- 1'industrie textile, notamment en tant qu'agents mor-S dants et en tant que fibres ;
- l~industrie cosm~tique, notamment en tant qu'agents épaississants, texturants, hydratants et/ou stabilisants;
- l'industrie pharmaceutique (en thérapeutique humaine et vétérinaire, d'une part, en chirurgie, d'autre part, et en galénique, d'autre part), notamment en tant qu'agents de texture, d'enrobage, de stabilisation, de résorbage, en tant qu'additifs pour pansement ou peau artificielle ;
- 1'industrie photographique, notamment en tant qu'agents filmogènes ;
- 1'industrie des explosifs, notamment en tant qu'agents de dessiccation ou moyens plastifiants ;
- l'industrie des détergents et tensioactifs ;
- l'industrie des encres, peintures, vernis, laques, adhésifs et émaux, notamment en tant qu'additifs épais-sissants, texturants ou plastifiants;
- l'industrie du traitement des métaux (en particulier pour le décapage~ et celle du traitement des eaux, notam-ment en tant qu'agents chélatants ou floculants ;
- 1'industrie des forages, notamment en tant qu'additifs pour boues de forage ;
- 1'agriculture, notamment en tant que support d'enroba-ge ;
- 1'immobilisation de cellules et en tant que support de culture.
Les composés polyglucuroniques, selon l'inven-tion, se sont révélés particulièrement utiles industriel-lement en remplacement de l'acide hyaluronique dans les domaines où ledit acide hyaluronique est intervenu jusqu'a présent.

WO93/18174 l5 PCT/FR93/0020~

~1 3:L384 Les composés polyglucuroniques, selon l'inven-tion, sont plus précisément très efficaces en thérapeuti-que humaine et vétérinaire, d'une part, et en chirurgie, d'autre part, en raison de leur aptitude à former des fi-bres et des fils ou filés. En particulier, les fils enpolymère polyglucuronique selon 1'invention conviennent parfaitement pour la réalisation de points de suture, ils ont une structure éliminable par biodégradation ou trai-tement à l'eau. De ce ~ait, ils présentent une grande analogie avec les fils constitués d'acide hyaluronique et sont très intéressants dans le domaine de la viscochirur-gie .
Les fibres et fils polyglucuroniques sont égale-ment très performants dans le domaine papetier et le do-maine textile.
Les composés polyglucuroniques, selon l'inven-tion, sont également utiles dans le domaine de la prépa-ration d'oligosaccharides D-polyglucuroniques à enchalne-ment ~1-4). Plus précisément, les OS sont obtenus par hydrolyse notamment acide ou enzymatigue desdits composés polymères D-polyglucuroniques à enchainement ~(1-4).
Cette hydrolyse peut être réalisée, soit (i) en présence des bactéries Rhizobium meliloti NCIMB 40472, en continuant la fermentation dans le milieu M2 pendant plus de ioo h, soit (ii) par incubation des composés polymères polyglucuroniques à enchaînement ~ 4) ou du jus de fer-mentation les contenant pendant plus de lO0 h à une tem-pérature de 20-40C, soit (iii) par clivage enzymatique notamment au moyen d'une cellulase, soit encore (iv) par clivage en milieu acide à pH inférieur ou égal à 3, pen-dant au moins 90 h à 100C.
Les os ainsi o~tenus puis séchés ont, après iso-lation, un dp variable de 2 à lO pour les OS à chalne courte, de lO à 50 pour les OS de taille moyenne, et de 3~ 50 à lO0 environ pour ceux ayant une cha;ne longue. Les W O 93/18174 P(~r/~R93/002053~ ~ 16 OS préférés selon l'invention ont un dp compris entre 5 et 20.
Ces Os qui comportent des unité~ d'acide glucuro-nique sont en particulier utiles dans le domaine de l'agriculture, eu égard a leurs effets bén~fiques sur :
- les cultures végétales in ~itro, - les croissances racinaires (notamment la formation de poils absorbants), - l'induction d'un système de défense chez les plantes vis-à-vis des bactéries, moisissures, virus et autres agents cliniques extérieurs, et - la protection des semences, en tant qu'additifs pour enrobage.
Ces OS sont également utiles dans le domaine pharmaceutique, en thérapeutique humaine et vétérinaire ou dans le domaine du diagnostic, notamment en tant que moyen de ciblage d'ingrédients actifs.
MEILLEUR MODE
Le meilleur mode de mise en oeuvre de l'invention consiste à fournir un acide polyglucuroni~ue de formule I
ayant un Mw de l'ordre de 80 000 à 400 000 daltons. Cet acide polyglucuronique est obtenu à partir de la souche bactérienne Rhizobium meliloti NCIMB 40472.
De façon pratique, on procède à l'ensemencement d'un milieu nutritif aqueux contenant 1 g/l d'extrait de levure, 1 g/l de K2HPO~, 0,2 g/l de MgSO4.7H20 et 10 g/1 de glucose, fructose ou saccharose (i.e. le milieu M2 précité), à une température de 30 C, à un pH de 7, avec pOz de 30 à 100 % au moyen de ladite souche Rhizo~ium meliloti NCIMB 40472 de façon à avoir dans le milieu de fermentation de départ pour cette souche une population bactérienne d'au moins 10~ bactéries/ml. La fermentation est e~fectuée jusqu'à ce que l'on obtienne une population bactérienne d'au moins 109 bactéries/ml (elle peut être poursui~ie selon la production souhaitée). On sépare les bactéries du milieu de fermentation par filtration tan-W093/l8174 PCT/~R93/0020~
~:~31~

gentielle sur un filtre ou une membrane filtrante de 200 nm de porosité. Le filtrat qui contient l'acide polyglucuronique éventuellement acétylé est traité avec EtOH, iPrOH ou MeCOMe à 4C. Le précipité ainsi obtenu est recueilli par filtration puis séché. Le po.lymère, ainsi obtenu, remis en solution peut être ensuite désacétylé à pH ll, pendant au moins 7 h et au plus 24 h à RT.
En pratique, la durée totale de fermentation-incubation du milieu nutritif (milieu M2 ou milieu analo-gue contenant un sucre différent du glucose, du fructose et du sacchdrose) avec la souche Rhizobium meliloti NCIMB
40472 pour la production des. polysaccharides de formule I
et de leurs esters correspondants (dans lesquels la fonc-tion alcool OH est partiellement acétylée) est inférieureégale ou supérieure à 100 h, à 30C et à pH 7. cette production est réalisée (a) pendant la phase de croissance de la souche, et/ou (b) pendant la phase de non-prolifération de celle-ci après que la population bac~érienne ait atteint au moins la valeur de 109 bactéries/ml. Quand la durée est nettement inférieure à
100 h, on favorise la production des PS de l'invention ayant un Mw se situant dans la partie haute de l'inter-valle 80 000-400 000 daltons ; quand la durée est supé-rieure à 100 h, on favorise la production des PS ayant unMw se situant dans la partie basse de cet intervalle, et des OS.
D'autres avantages et caractéristiques de l'in-vention seront mieux compris à la lecture d'exemples~ de préparation et de résultats d'essais qui suivent. Bien entendu, l'ensemble de ces éléments n'est nullement limitatif mais donné à titre d'illustration.
P~EPARA~I ON I
Obtention de la souche Rhizo~ium meliloti NCIMB 40472 ~) Mutation On procède à la mutation de la souche sauvage W093/l8l74 PCT/FR93/00205 ~ 3~ 18 ~

MSNl pre~citée au moyen de N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosogua-nidine.
b) S~lection Le mélange des bactéries vivantes obtenues après mutation est ensemencé sur le milieu Ml. Ce milieu sert a éliminer les bact~ries jugées ici non intéressantes selon un caractère d'auxotrophie. Le glucose contenu dans Ml remplit deux fonctions : il intervient en tant que source de carbone, d'une part, et il permet de distinguer les bactéries mutées ou non-mutées, qui ne produisent pas de PS, des bactéries mutées produisant des PS en présence dudit glucose.
Les colonies produisant des PS sont cultivées sur milieu au bleu d'aniline. Le milieu au bleu d'aniline permet de distinguer les souches, qui répondent positive-ment audit milieu et ont des liai~ons glycosidiques ~ 3), des souches répondant négativement que l'on i recueille.
Les souches ainsi recueillies sont analysées quant à leur contenu en DNA extrachromosomique (i.e. leur contenu plasmidigue3. On applique le protocole de lyse directe ~s au point par T.ECgHARDT, Plasmid, ( 1 9 7 8 ), 1, pages 584-588, sur lesdites souches.
Les profils plasmidiques desdites souches sont comparés a celui de la souche sauvage M5Nl de départ, afin de repérer et de ne retenir que les souches présen-tant un contenu plasmidique modifié. On a ainsi retenu une souche, qui ne comporte qu'un seul plasmide de Mw compris entre 100 ooo et 150 ooo daltons, et qui ne com-porte plus les plasmides constitutifs de la souche M5N1,à savoir : 2 plasmides de Mw = 1 000 ooo daltons et 1 plasmide de Mw = 90 ooo daltons.
Cette souche ainsi sélectionnée a été (i) contrô-lée en ce qui concerne son pouvoir d'infectivité vis-à-35 YiS de la luzerne (légumineuse spécifique de Rhizobiummeliloti ; la réponse a l'infection étant positi~e puis-que des nodules sont apparus sur des racines de luzerne), WO93~18174 PCT/FR93/00205 ~ 13:~38~
puis (ii) deposée aupr~s d'un organisme agréé. Cette sou-che est référencée NCIMB 40472.
PREPARA~ION II
Fermentation en condition de croissance Dans un fermenteur de 20 litres contenant l5 li-tres de milieu M2, on introduit l'inoculum de la souche Rhizobium meliloti NCIMB 40472 [l'inoculum est constitué
ici par l litre de M2 (en fiole d'Erlenmeyer) contenant la souche NCIMB 40472]. L'inoculum est utilisé quand la suspension bactérienne est de llordre de 109 bactéries/
ml. La fermentation est effectuée avec les paramètres suivants :
temperature 30 C ~ -pH maintenu à 7 (addi~ion de ROH lM ou plus) pO2 30 à 100 % (seloD le degré d'acétylation souhaité) agitation 100 t/min A l'issue du processus de fermentation, le milieu peut contenir 1 à 5 g.l-l.jour-l de polymère polyglucuro-nique à encha;nement ~ 4) selon l'invention. Le rende-ment par rapport au sucre du milieu N2 varie ainsi entre 20 et 85 % (les mesures sont effectuées en chromatogra-phie HPLC avec une colonne Beckman TSK 2000 SW et détec-tion par réfractométrie).
PREPARATI O~ I I I
~ 25 Fermentation en condition de non-prolifération Les cellules sont cultivées dans les conditions (inoculum/milieu) décrites dans la préparation II ci-dessus. Lorsque la suspension dans le fermenteur atteint 10~ bactéries/ml de Rhizobium meliloti NCIMB 40472, on fait passer le milieu de fermentation au travers de mem-branes de microfiltration (200 nm de porosité), les cel-lules sont lavées et récupérées (elles peuvent être récu-pérées directement par centrifugation en continu dans des conditions stériles);
Ces cellules sont lavées au moyen d'un milieu exempt d'azote comprenant :

`~, 13 ~3~ ~

~HPO~, l g MgSO~.7H20, 0,2 g H20 qsp l l et introduites ensuite dans un fermenteur contenant l5 5 litres de mulieu dépourvu d'azote mais additionné de lO
g/l de glucose, fructose ou saccharose.
Le fermenteur ainsi inoculé à une concentration bactérienne d'environ 109 bactéries/ml est soumis aux mêmes paramètres que dans le cas d'une production en croissance.
A l'issue de la fermentation, le milieu contient le même polymère que celui de la préparation II à une concentration analogue à celle de la fermentation en croissance.
15 PRF,PARATION lV
Fermentation en continu Le protocole opératoire est le même que selon la production en croissance. En cours de production, on pré-lève un volume de milieu qui est soumis en continu à une microfiltration, le filtrat contenant le polymère poly-glucuronique à enchainement ~(1-4) est récupéré, les bac-téries pouvant le cas échéant être recyclées dans le fer-menteur avec un milieu de fermentation stérile correspon-dant à celui qui a été sous-tiré. - :~
25 PREPA~ATIO~ V Isolation du polymère (a) Les bactéries sont éliminées du milieu de fermen-tation par filtration (en particulier filtration tangen-tielle sur filtre de 200 nm de porosité, notamment filtre MICROSART MINI commercialisé par la société SARTORIUS) ou par centrifugation du milieu de fermentation de la préparation II, III ou IV.
(b3 Le composé polyglucuronique à enchaînement ~(l-4~
est récupéré du filtrat ou du surnageant par précipita-tion avec un solvant organique tel que EtOH, iPrOH ou MeCOMe. Quand on utilise iPrOH, ce solvant est ajouté au W093/18174 PCT/~R93/00205 ~ 1 3 ~
filtrat selon une proportion de 70 % v/v, le cas échéant en prés~nce de NaCl lM. On homogénéise 1'ensemble résultant et il se forme un précipité de composé poly-glucuronique (la précipitation est favorisée -à basse température, notamment à + 4C). Le précipité est re-cueilli par centrifugation et séché sous vide à RT.
PREPARATION VI
Isolation du polymère Après l'étape (a) de la préparation V, on procède à la précipitation selon les modalités suivantes.
(b) La précipitation est réalisée en milieu acide (on peut utiliser HCl) et inteEv,ent à un pH voisin de 3. Le précipité obtenu est récupéré par centrifugation, lavé à
l'eau pl~is dispersé sous agitation dans une solution aqueuse à pH 8 ; le polymère se redissout, il est récupé-ré par filtration avec un solvant organique comme indiqué
à l'étape (b) de la préparation V, ou directement par sé-chage ou déshydratation.
PREPARATION VII I solation du polymère ~e composé polyglucuronique à enchainement ~ 4) isolé selon les modalités des préparations V et VI étant peu purifié, 1'on recommande d'utiliser les conditions opératoires qui suivent pour obtenir un produit hautement purifié.
Le filtrat ou surnageant obtenu selon l'étape ~a) de la préparation V est purifié par ultrafiltration tan-gentielle avec une membrane dont la porosité est comprise entre 60 ooo et 80 000 daltons. Pour purifier le concen-trat, on écarte le filtrat et l'on remplace par de l'eau distillée. Cette opération est répétée jusqu'à ce que la purification désirée soit atteinte. Le polymère polyglu-~uroni~ue à enchainement ~ 4) est isolé par évaporation s~us vide à RT.
PREPARA~I ON VI I I
Désacétylation r ~ 22 ~

Le polymère isolé, obtenu selon la pr~paration VII qui contient au plus 33 % en poids de groupe OAc par rapport au poids de l'unité répétitive acide glucuronique est traité à un pH supérieur à 8 au moyen de NaOH. Une s nuit à RT et à pH ll permet de désacétyler la molécule.
AlgALYSES
(a) Les analyses effectuées sur les produits polymè-res obtenus selon les préparations V-VII, d'une part, et la préparation VIII, d'autre part, ont permis de mettre en évidence que :
l-) les produits des préparations V-VIII sont des compo-sés polymères D-polyglucuro~iques exclusivement consti-tués d'unités acide D-glucuronique, et présentant un enchaînement ~ 4) ;

2-) les produits des préparations v-VII sont des composés polymères de 1'acide D-glucuronique partiellement acéty-lés (au plus 33 % en poids comme indiqué ci-dessus) en position 2, en position 3 ou en positions 2 et 3 ;

3') le produit de la préparation VIII est désacétylé.
(b) En ce qui concerne la sta~ilité, on constate que les solutions du composé polyglucuronique selon les préparations V-VIII sont stables à froid en milieu alca- -lin, notamment à pH ll ; si la température s'élève, les substituants OAc sont clivés. Ce composé polyglucuronique est également stable en milieu acide mais précipite à un pH de l'ordre de 3.
(c) En ce qui concerne la viscosité, on constate que la viscosité intrinsèque (Vi) dans NaCl O,l M est de 650 ml/g pour un Mw de l~o 000 (le Mw peut varier en fonction de la durée de fermentation entre 80 ooo et 400 000 dal-tons et mieux entre lOO 000 et 350 000 daltons). Cette viscosité intrinsèque est faible par comparaison avec celle du succinoglycanne produit par la souche sauvage

4 PCT/FR93/0020 3 ~S 4 Rhizo~ium melilo~i M5Nl ~ui a une Vi de 5480 ml/g pour un w de 4 000 000 daltons. Les résultats obtenus en ce qui concerne cette viscosité intrinsèque sont comparables à
ceux d'un alginate ayant un Mw de 270 000 daltons.
5Les solutions de composés polymères polyglucuro-niques selon l'invention ayant un Mw supérieur à 300 000 daltons à des concentrations de 20 à 30 g/l forment quelques minutes après leur homogénéisation des gels fermes thermoréversibles.
10~ux mêmes concentrations dans 1'eau, le polymère selon l'invention ayant un Mw de l'ordre de 80 000 dal-tons, donne quelques minutes après son homogénéisation un gel souple. Aux concentrations plus faibles; les solu-tions des polymères selon l'invention se comportent comme des épaississants.
(d) Intelaction avec les ions monovalents Les ions monovalents forment des gels avec les solutions des polymères polyglucuroni~ues selon l'inven-tion. Ces gels sont thermoréversibles. La formation du gel dépend de la nature du cation, de la force ioni~ue et de la concentration, la sélectivité ionique étant la sui-vante : Na~ < Li' < K+ < NH4+.
Avec NH~, on observe une transition conforma-tionnelle : la température de transition dépend de la concentration en NH4~ ~NH~Cl de o,5 M à l,5 M ou plus) et du taux d'acétate dans la molécule.
Le gel, formé avec NH~Cl 0,5 M et le composé po-lyglucuronique selon l'invention à une concentration de lO à 15 g/l, portée à lOoC pendant 24 h n'est pratique-ment pas dégradé.(e~ Interaction avec les ions divalents En association avec des ions métalliques diva-lents notamment ceux des calcium, baryum, strontium, magnésium, zinc et cuivre divalent, des gels sont formés.
35 Avec 1 ' ion calcium, le polysaccharide forme un gel qui est comparable à ceux des acides pectiniques (substances du type acide polygalacturonique) et des alginates (sub-stances du type copolymère acide mannuronique/acide guluronique). Contrairement aux acides pectiniques et s alginiques, le composé polymère polyglucuroniqué selon l'invention, en solution dans l'eau et mis en présence de MgCl2 est capable de former un gel thermoréversible.
Les gels peuvent être formés directement au con-tact de Ca21 et des composés polymères polyglucuroniques à enchainement ~ 4) par dialyse ou toute autre méthode permettant un contact progressif entre 1'ion et lesdits composés polymères. En particulier, ces gels peuvent être formés en utilisant des réactifs permettant une gélifica-~ion progressive : il est ainsi possi~le de former un gel a partir d'un composé polymère à l0 g/l dans l'eau et de CaXPO~.2H20 (à la concentration de l,2 à l,5 g/l) et de gluconolactone (à la concentration de 4,5 g/l), après homogénéisation, le gel se forme dans la préparation mai~tenue immobile.
Des gels fermes peuvent être obtenus à partir de concen~rations en composé polymère polyglucuronique selon l'invention de l'ordre de 3 g/l.
En ce qui concerne la stabilité des gels déter-minée à partir de solutions aqueuses de composé polymère polyglucuronique selon l'invention en présence de Ca, on a constaté ce qui suit ;
à 100C
- dans l'eau, le gel porté à une température de l00~C
pendant l,5 h ne subit pas de modification, la force du gel (module) est inchangée après 24 h (mesure de compres-sion effectuée sur appareil INSTRON), - dans HCl, le gel placé à 100C à des pH inférieurs à 2 est stable pendant au moins l h, - dans NaOH, le gel placé à l00~C à des pH de 8-13 est stable pendant au moins l h, ~ 4 - dans CaCl2, 0,34 M, le gel est stable pendant au moins 24 h ;
à RT
- dans l'eau, le gel est stable (en une semaine, le module passe de l,8 à l,3 N/cm2), - dans la soude, le gel se maintient pendant au moins une semaine, - dans HCl, il n'y a pas de modification apparente de la qualité du gel pendant plus d'une semaine, - dans CaCl2, il n'y a pas de changement du module du gel après une semaine, On constate par ailleurs que les gels obtenus avec CaCl2, mis en présence de NaCl donnent lieu à un échange entre les ions Ca2+ et Na~. L'échange est prati-quement total avec NaCl 4M, mais le module reste inchan-ge.
On observe en outre que le taux d'acétate dans le polymère ne semble pas modifier sa stabilité dans l'en-semble des conditions opératoires précitées.
(f) Interaction avec les ions trivalents On a observé que les gels formés avec 1PS ions tri~alents, notamment Fe3+ et Cr3+, sont stables thermi-quement dans les conditions opératoires précitées.
(g) Divers On a constaté que les composés polymères polyglu-curoniques à enchainement ~(1-4) selon l'invention sont substantiellement solubles dans les lipides, les huiles.
En présence de calcium, les solutions lipidiques ou hui-leuses peuvent former des gels.
On a également constaté que des solutions dans l'eau desdits polymeres polyglucuroniques à partir de la concentration de 3 g/l, mises en contact avec un alcool, notamment EtOH, forment des gels.
Par ailleurs, des fibres peuvent être obtenues à
partir de gels de polymere/CaCl2. Des clichés de rayons X

WO93/18174 PCT/FR93/0020~
~ ~3 ~3~ 26 ~

sur des fibres polymères/CaClz montrent une p~riodicité
le long de llaxe de chaque fibre de l'ordre de 103 nm.
Une telle périodicité est analogue à celle trouvée pour la cellulose.

5 PREPAMTIO~ I~
Obtention d'un composé oligosaccharide La présente préparation illustre l'obtention d'OS
dans le milieu de croissance et en présence de bactéries Rhizobium meliloti NCIMB 40472.
(a) On procède à une fermentation en milieu de crois-sance selon les modalités opératoires décrites dans la préparation II ci-dessus, avec la différence que la durée de ladite fermentation est supérieure (de préférence) ou égale à l00 h à RT pour obtenir une quantité relativement importante d'OS. Cette hydrolyse prolongée conduit à la formation d'OS dans le milieu.
(b) On sépare les bactéries du milieu de fermentation par centrifugation ou microfiltration tangentielle au moyen de filtres de porosité de 200 nm. Le composé OS est récupéré par ultrafiltration, purifié par chromatographie et séché. Il présente un dp de 5-60 et peut être séparé
en trois fractions de (a) dp 5-l0, (b) dp 10-50 et (c) dp 50-60, notamment par chromatographie.
P~EPARATI ON ~
Obtention d'un composé oligosaccharide La présente préparation illustre l'obtention d'OS
en l'absence de bactéries.
(a) On incube le milieu liquide de fermentation, obtenu après élimination des bactéries selon l'étape (a) de la préparation V, pendant l00 h à une température com-prise entre 20 et 40C.
(b) Llisolation du composé OS formé dans ledit milieu liquide est effectuée comme indiqué à l'étape (b) de la préparation IY.. Après ultrafiltration, purification et séchage, on obtient un 0S ayant un d? de 5-60 et sépara-WO93/18174 PCT/~R93/00205 27 , 3 ~ ~
ble en trois fractions de dp 5-l0, 10-50 et 50-60.
PREPARA~IOl~
Obtention d'un composé oligosaccharide La présente préparation illustre l'obtention d'OS
par hydrolyse enzymatique.
~a) On soumet le composé polymère polyglucuronique à
enchainement ~ 4) obtenu selon les modalités opératoi-res décrites dans la préparation V, VI ou VII, à une dé-gradation enzymatique au moyen d'une cellulase.
(b) L'isolation du composé oS ainsi obtenu est effec-tuée comme indiqué à l'étape (b) de la préparation IX.
Après ultrafiltration, purification puis séchage, on ob-tient un OS ayant un dp de 5-60 séparable en trois frac-tions de dp 5-l0, 10-50 et 50-60.
1 5 PREPA~TTO~
Obtention d'un composé ~ligosaccharide La présente préparation illustre l'obtention d'OS
par hydrolyse acide.
(a) On soumet le composé polymère polyglucuronique à
enchalnement B(1-4) obtenu selon les modalités opératoi-res decrites dans la préparation V, VI ou VII, à une hy-drolyse acide pendant 96 h à pH 3 au moyen de HCl.
(b) L'isolation du composé oS ainsi obtenu est effec-tuée comme indiqué à l'étape (b) de la préparation IX.
Apres ultrafiltration, purification puis séchage, on ob-tient un OS ayant un dp de 5-60 séparable en trois frac-tions de dp 5-l0, 10-50 et 50-60.
Les OS des trois fractions obtenues suivant les préparations IX-XII peuvent être isolés par chromatogra-phie du type gel-filtration ou par toute autre méthode permettant de séparer les molécules en fonction de leur taille et/ou de leur masse.
P~:PARA~ION ~III
obtention de l'acide glucuronique L'acide polyglucuronique de formule I obtenu par WOg3/18174 PCT/FR93/0020S
~,~ 3 ~3~i~ 28 désacétylation selon les modalités opératoires décrites dans la préparation VIII a été soumis à une hydrolyse enzymatique poussée de façon à fournir 1'acide glucuroni-que.
L'acide glucuronique ainsi formé peut être isolé
par ultrafiltration et purifié par chromatographie d'échanges d'ions, par électrodialyse ou toute autre mé-thode appropriée permettant de séparer ledit acide des molécules plus grandes et des sels présents dans le milieu d'hydrolyse enzymatique.

Claims (13)

REVENDICATIONS

1. Composé polymère de l'acide glucuronique caracté-risé en ce qu'il est choisi parmi l'ensemble constitué
par (a) les acides D-polyglucuroniques à enchaînement .beta.(1-4) de formule (I) dans laquelle n est un nombre ayant une valeur moyenne comprise entre environ 300 et 2500, (b) les esters correspondants, (c) les éthers correspondants, et (d) leurs mélanges.

2. Composé suivant la revendication 1, caractérisé
en ce qu'il est choisi parmi l'ensemble constitué par - les esters des acides polyglucuroniques de formule I
dans lesquels le reste OH d'au moins un groupe acide carboxylique COOH est remplacé par un reste alkoxy en C1-C4, - les esters des acides polyglucuroniques de formule I
dans lesquels l'atome d'hydrogène d'au moins un groupe alcool OH est remplacé par un reste acyle aliphatique en C2-C4, - les esters des acides polyglucuroniques de formule I
dans lesquels (i) le reste OH d'au moins un groupe acide carboxylique COOH est remplacé par un reste alkoxy en C1-C4, et (ii) l'atome d'hydrogène d'au moins un groupe alcool OH est remplacé par un reste acyle aliphatique en C2-C4, - les éthers des acides polyglucuroniques de formule I
dans lesquels l'atome d'hydrogène d'au moins un groupe alcool OH est remplacé par un reste alkyle en C1-C4, - les éther-esters des acides polyglucuroniques de formule I dans lesquels (i) le reste OH d'au moins un groupe acide carboxylique COOH est remplacé par un reste alkoxy en C1-C4, et (ii) l'atome d'hydrogène d'au moins un groupe alcool OH est remplacé par un reste alkyle en C1-C4, et - leurs mélanges.

3. Composé suivant la revendication 1, caractérisé
en ce qu'il a un poids moléculaire moyen en poids de 80 000 à 400 000 daltons et est choisi parmi l'ensemble constitué par - les acides polyglucuroniques de formule I selon la revendication 1, - les esters acétate correspondants dans lesquels les fonctions alcool OH sont partiellement O-acétylées, cha-que cycle acide glucuronique de la formule I comportant au plus 33 % en poids de groupes O-CO-CH3 par rapport-au poids dudit cycle acide glucuronique.

4. Procédé de préparation d'un composé polymère d'acide glucuronique de formule I selon la revendication 1 ou de l'un de ses esters dans lesquels les fonctions alcool OH sont partiellement O-acétylées, ledit procédé
étant caractérisé en ce qu'il comprend la fermentation, en présence d'un milieu nutritif contenant une source d'azote, une source de carbone et des sels, d'une souche bactérienne appartenant à l'ensemble des Rhizobium et produisant des polysaccharides quand elle est cultivée à
pH 7 dans un milieu nutritif aqueux contenant 1 g/l de K2HPO4, 0,2 g de MgSO4.7H2O, 1 g/l de NH4NO3 et 10 g/l de glucose.

5. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé
en ce que ladite souche contient un seul plasmide ayant un poids moléculaire moyen en poids d'environ 100 000 à
150 000 daltons.

6. Procédé suivant la revendication 4 ou 5, caracté-risé en ce qu'il comprend la fermentation de la souche Rhizobium meliloti NCIMB 40472.

7. Procédé suivant l'une quelconque des revendica-tions 4 à 6, caractérisé en ce que la fermentation est effectuée dans un milieu aqueux contenant 0,5 à 2 g/l de K2HPO4, 0,05 à 0,3 g/l de MgSO4, 0,8 à 3 g/l d'extrait de levure et 7 à 20 g/l de sucre, à une température de 25 à
40°C, ledit sucre étant notamment choisi parmi le gluco-se, le fructose, le saccharose et leurs mélanges.

8. Procédé suivant l'une quelconque des revendica-tions 4 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend (i) le recueil du milieu de fermentation incubé pendant une durée appropriée, après que la population bactérienne ait atteint une valeur supérieure ou égale à 109 bactéries/
ml, puis (ii) l'isolation du composé polymère de l'acide glucuronique.

9. Souche bactérienne appartenant à l'ensemble des Rhizobium, caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche Rhizobium meliloti NCIMB 40472.

10. Utilisation du composé polymère de l'acide glucu-ronique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, notamment dans le domaine alimentaire, pharmaceutique en thérapeutique humaine ou vétérinaire, cosmétique ou de l'épuration des eaux, en particulier en tant que moyen gélifiant, épaississant, hydratant, stabilisant, chéla-tant ou floculant.

11. Utilisation du composé polymère de l'acide glucu-ronique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour la fabrication de fibres ou fils polyglucuroniques.

12. Utilisation du composé polymère de l'acide glucu-ronique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans la préparation de composés oligosaccharides D-poly-glucuroniques à enchaînement .beta.(1-4).

13. Composé oligosaccharide, caractérisé en ce qu'il est obtenu par hydrolyse, notamment acide ou enzymatique, d'un composé polymère de l'acide glucuronique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, et en ce qu'il a un degré de polymérisation notamment compris entre 2 et 100 et de préférence compris entre 5 et 20.