CA2106193A1

CA2106193A1 - Means for in vitro diagnosis of constituents of cytoplasmic granules and biological applications

Info

Publication number: CA2106193A1
Application number: CA 2106193
Authority: CA
Inventors: Marilyne Sasportes; Jurg Tschopp
Original assignee: Individual
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 1991-03-14
Filing date: 1992-03-16
Publication date: 1992-09-15
Also published as: EP0575539A1; FR2673952B1; JPH06506112A; WO1992016644A1; FR2673952A1

Abstract

2106193 9216644 PCTABS00160 L'invention concerne des moyens pour la détection de constituants de granules cytoplasmiques sécrétés par des cellules T "helper" ou des cellules cytotoxiques en particulier pour la détection de granzyme ou de perforine caractérisés en ce qu'il s'agit d'anticorps monoclonaux reconnaissant spécifiquement un épitope de ces constituants en donnant lieu à une réaction immunologique de type antigène-anticorps.2106193 9216644 PCTABS00160 The invention relates to means for the detection of constituents of cytoplasmic granules secreted by T "helper" cells or cytotoxic cells in particular for the detection of granzyme or perforin, characterized in that they are monoclonal antibodies specifically recognizing an epitope of these constituents by giving rise to an antigen-antibody type immunological reaction.

Description

WO 92/1~ 3 ~, PCT/FR92/00240 . ~

MOYENS POUR LE DIAGN~STIC IN VITRO DE CONSTITUANTS DE
GRA~ .S CYTOPLASMIQUES
ET APPLICATIONS BIOLOGIQUES

L'invention concerne des moyens pour le diagnostic in v~tro de constituants des cellules cytotoxiques et des cellules T "helper" jouant un rôle dans la réponse immunitaire d'un organisme.
Le système immunitaire est capable de répondre spécifiquement ou non à l'introduction dans l'organisme d'antigènes viraux, bactériens ou allogéniques. Deux types de cellules sont responsables de la neutralisation et de l'élimination de ces différents antigènes : les lymphocytes B et les lymphocytes T. Ces cellules assurent les deux formes de la réponse immunitaire : la réponse humorale, médiée par les cellules B, et la réponse cellulaire, médiée par au moins deux populations cellulaires, à savoir les lymphocytes T cytotoxiques ~CTLs), et les cellules "natural killer" (NK).
Dans la cytotoxicité a médiation cellulaire, deux processus de lyse ont été décrits. L'un comporte la sécrétion par les cellules effectrices (CTLs et cellules NK) de protéines cytolytiques en l'absence de seconds messagers intracellulaires. Le deuxième processus, appelé
lyse régulée, comprend le stockage des protéines lytiques ou associées ~ la lyse dans les granules cytoplasmiques, en grande quantité, et leur sécrétion seulement après activation des récepteurs de surface des cellules effectrices et production de seconds messagers intracellulaires.
Dans ces granules, différentes protéines ont été
identifiées, parmi lesquelles, la perforine ou protéine qui forme des pores, une famille de protéases que l'on appel}e les granzymes, et les protéoglycanes, protéines de haut poids moléculaire, chargees du transport soit de la perforlne, soit des granzymes, vers la membrane cellulaire.

W092/1~
PCT/FR92/00~0 Au cours de l'interaction de l'effecteur avec sa cible et de son activation, il se produit une exocytose des vésicules intracytoplasmiques granulaires qui sécrètent leur contenu dans l'espace intercellulaire formé par le contact effecteur/cible, provoquant la lyse de la cellule cible.
La perforine a été isolée à partir d'une lignée cytotoxique chez le rat et chez l'homme~
Les travaux effectués ont permis d'observer qu'en présence de Ca2+, les molécules de perforine polymérisent, s'insèrent au niveau de la membrane plasmique de la cellule cible et forment des pores entrainant la destruction des cellules cibles.
Des clones d'ADNc murin et humain ont été isolés, On a rapporté récemment les séquences génomiques de la perforine chez la souris et l'homme.
Quant aux granzymes, de nombreuses équipes ont décrit leur purification à partir de granules de CTLs ou de cellules à activité NK/LAK (lymphokine activated ki~ler).
Ils représentent la majorité des protéines des granules intracytoplasmiques (85 ~ versus 10 ~ pour la perforine).
Dlfférents granzymes ont été isolés et caractérisés chez la souris ainsi que chez l'homme. Plus particulièrement, six granzymes nommés granzymes A à F ont été décrits dans les granules cytoplasmiques de CTLs murins. Un septième granzyme appelé granzyme G a été récemment caractérisé dans les CTLs de souris. Chez l'homme, on a isolé deux granzymes correspondant aux granzymes A et B, et un troisième appelé
H ne correspondant à aucun granzyme murin dé;à isolé. -~es granzymes sont synthétisés sous forme de prémolécules contenant un peptide signal caractéristique des protéines sécrétées ou ayant une localisation granulalre. Cette séquence signal est suivie d'un dipeptide acide d'actlvation qui est en général Gly-Glu ou Glu-Glu (propeptide) et doit être clivé par une dipepdityl-peptidase pour libérer la protéine mature.

WO92/l~ PCT/FR92/00240 ~ , Il existe une grande homologie entre les différents granzymes, ce qui suggère qu'ils appartiennent une famille de serines protéases granulaires.
Ils contiennent tous les résidus ~is57, ASP1O2 et Ser195 qui forment la triade catalytique des sérines estérases. Tous les granzymes matures commencent par la séquence N-terminale Ile-Ile-Gly-Gly (résidus 16-19), puis une séquence varizble (résidus 20-23), suivie d'une séquence conservée (résidus 24-30). Ce sont des protéines plus ou moins glycolysées. Six résidus Cys conservés forment trois ponts disulfures intra-chaîne.
L'approche par la biologie moléculaire a permis d'isoler des gènes codant pour des granzymes exprimés spécifiquement dans les CTLs.
lS Plusieu_s rôles ont été attribués aux granzymes.
On a rapporté notamment une action indirecte sur la perforine en augmentant son activité lytique, favorisant la fragmentation de l'ADN de la cellule cible.
Ils pourraient également intervenir dans le mécanisme du détachement du CTL de sa cible après la délivrance du coup létal par clivage du complexe TcR/
antigene (TcR = récepteur T à l'antigène) et des autres complexes récepteur/ligands impliqués dans les phénomènes d'adhésion cellulaire.
Enfin les granzymes, par protéolyse, pourraient cliver des constituants de la matrice extracellulaire ou des composants du milieu interstitiel et être ainsi lmpllqués dans les phénomenes de migration et d'lnfiltratlon des lymphocytes dans les tissus au cours de processus inflammatoires.
D'autres protéines ont été caractérisées dans les granules de CTLs et de cellules "NK" : il s'agit des protéoglycanes. Ces molécules ~oueraient notamment un role dans le "packaging" de la perforine et des granzymes. Elles peuvent également constltuer une sorte de barrière protectrice de la face interne des granules sécrétoires, protégeant ainsi la cellule cytotoxique des effets de ses propres molécules lytiques.

W092/1~ t) PCT/FR92/00240 La perforine et les granzymes ont éte très etudiés au niveau de leur expression génique par les techniques de Northern Blot et de Dot ~lot et plus récemment par la technique d'hybridation in situ utilisant des ribosondes specifiques.
Les études réalisées in vitro et, in vivo en situation pathologique chez la souris et chez l'homme, montrent que ces gènes sont inductibles au cours de 1'activation cellulaire de lymphocytes T, de cellules présentant une activité NK/LAK et ce, de façon précoce.
Chez l'homme, l'expression des gènes des granzymes et de la perforine a pu être observée dans difrérentes situations pathologiques comme les désordres hématologiques, les maladies auto-immunes, les maladies dermatologiques et les maladies infectieuses parasitaires, bactériennes ou virales. Enfin, les ARNm des granzymes et ou de la perforine ont pu etre détectés par hybridation ln_si~ au site de plusieurs types d'allogreffes.
L'expression du gène du granzyme B a été observée au niveau des cellules infiltrant des allogreffes de reins.
L'expression des gènes du granzyme B et/ou de la perforine a pu etre détectée dans les cellules préférentiellement CD8+ dans les infiltrats lymphocytaires de biopsies endomyocardiques réalisées chez des patients présentant un re~et. Une étude similaire a été réalisée au niveau de biopsies de peaux de patients atteints de GVH (Graft versus host reaction) après greffe de moelle allogénique HLA géno-ou phéno-identique.
Les études réalisées ont permis d'observer lors de la suspicion d'un rejet au cours d'une greffe d'organe (coeur, rein) ou d'une GVH après greffe de moelle osseuse, la préSence d'infiltrats lymphocytaires "silencieux"
détectés par l'histologie, caractérisés phénotypiquement par l'immunohistochimie et qui sont néanmoins dépourvus de l'expresslon des messagers des granzymes et de la perforine. L'interprétatlon de tels résultats demeure une lnterrogatlon et soulève de nombreuses questions en relation avec l'état d'immunisation des cellules de ces W092/1~ 9 ~ PCT/FR92/00~0 infiltrats, l'effet du traitement immunosuppresseur et la fonction réelle de ces cellules. Seul le suivi des patients dans le temps devrait permettre d'étudier l'évolution de ces infiltrats cellulaires, leur devenir et leur relation a l'évolution du processus de rejet ou de GVH en fonction du traitement administré.
On mesure donc l'intérêt de la recherche de l'expression génique des granzymes et de la per,orine au cours de l'activation cellulaire et/ou cytotoxique in vivo.
La plupart des études effectuées ont été réalisées par Northern Blot, Dot Blot, hybridation in situ. Bien qu'informatives, ces techniques sont lourdes et ne permettent en aucun cas d'etudier un grand nombre de patients avec le suivi nécessaire à la connaissance de l'évolution de leur pathologie.
Les infiltrats lymphocytaires détectés par l'histologie restent en fait le seul critère opérationnel sur lequel s'appuient les cliniciens pour confirmer le diagnostic clinique, qu'il s'agisse de rejet ou de GVH dans le cas des allogreffes.
Il est clair que dans toutes ces applications à la clinique, au lieu~ de détecter des messagers des granzymes et de la perforine, il serait plus aisé de détecter les protéines à l'aide d'anticorps.
L'aspect fondamental qui implique la compréhension du role biologique des granzymes et de la perforine requiert également une analyse fine et efficace à l'aide d'anticorps.
Mettant à profit leur avance technique dans ce domaine et leur grande maitrise des techniques d'isolement et de purification des granzymes et de la perforine, les inventeurs ont développé de nouveaux outils permettant de dlagnostlquer chez l'homme la présence de constituants des granules cytoplasmiques dans des échantillons biologiques à
étudier.
Utlllsant l'approche immunologique pour résoudre les problemes posés a ce jour, les inventeurs ont produit WO 92/1~ J j PCT/FR92/00240 ' :
G

des anticorps de haute spécificité vis-à-vis des protéines précitées.
L'invention a donc pour but de fournir de nouveaux moyens très spécifiques de dlagnostic in vi ~ro chez l'homme de la présence des constituants des granules évoqués ci-dessus.
Elle vise égaiement une méthode de diagnostic permettant de simplifier la détection de ces produits en recherche clinique et fondamentale.
Les anticorps de l'invention, qui sont dirigés contre les constituants des granules cytoplasmiques de cellules T "helper" ou des cellules cytotoxiques, plus spécialement des lymphocytes T cytotoxiaues et des cellules "natural killer", sont caractérisés en ce qu'il s'agit d'anticorps monoclonaux capables de reconnaître spécifiquement un épitope d'un constituant donné d'un granule humain, en particulier un épitope de granzyme humain ou de la perforine humaine, en donnant lieu à une réaction du type antigene /anticorps.
L'expression "constituant des granules" telle qu'utilisée dans la description et les revendications recouvre aussi bien la forme native du constituant, qu'une forme recombinante active telle qu'obtenue par les techniques classiques de génie génétique sur la base de la séquence d'acides aminés des granzymes ou de la perforine chez l'homme, ou des séquences d'acides aminés déduites des séquences de nucléotides des genes humains codant pour ces prot~ines. Ainsi les granzymes ou la perforine auxquels il est falt référence sont soit sous leur forme native, soit sous une orme recombinante, comportant au moins la partie active de ces granzymes ou perforine.
L'expression "capable de reconnaître spécifiquement un épitope" telle qu'utilisée dans la descrlption et les revendications signifie que les antlcorps monoclonaux réagissent avec l'épitope en question en utilisant les techniques immunologiques ELISA, Wester~
~lot ou Immunoprécipitation décrites dans les exemples.

,:. . .' , :
, ' ' . : ' W092/1~ ' PCT/FR92/OO~o ', Les anticorps monoclonaux anti-granzymes sont en particulier des anticorps anti granzyme A ou anti-granzyme B ou encore anti-granzyme H humains.
Les anticorps monoclonaux de l'invention sont encore caractérisés par le fait qu'ils appartiennent a la classe des IgG et qu'ils sont dirigés contre des protéines de poids moléculaire d'environ 25 à 30 kDa (Granzyme B), 60 kDa (Granzyme A) ou 66 à 75 kDa environ (Perforine).
L'invention vise également tout fragment des anticorps monoclonaux ci-dessus dès lors qu'il est capable d'interagir spécifiquement avec un constituant donne desdits granules, en particulier avec un granzyme ou de la perforine.
Les anticorps monoclonaux de l'invention sont également caractérisés par le .ai~ qu'ils sont tels qu'obtenus par sécrétion à partir de souches d'hybridomes résultant de la fusion d'une cellule immortelle de myélome non secréteur avec une cellule productrice d'anticorps dirigés contre un constituant donné de granules de cellules cytotoxiques humaines.
L'étape de fusion des deux types cellulaires est notamment réalisée selon la technique la plus couramment utilisée à savoir celle de K~hler et Milstein, Nature, vol 256, p. 495, 1975.
Les cellules productrices d'anticorps sont des splénocytes. Ces cellules sont récupérées après immunisation in vivo de l'animal avec l'antigène approprié.
Pour l'étape d'immunisation, on utilise les constituants des granules purifiés et on les injecte avec un adjuvant. Des résultats particulièrement satisfaisants sont obtenus en purifiant les constituants des granules cytoplasmiques selon la technique de Krahenb~hl et al, dans J. Immunol, 141, 3471-77, 1988.
Les constltuants des granules sont sous orme native ou, en varlante, sous forme recombinante. On utilise notamment un granzyme B humain recombinant ou une perforlne humaine recombinante.

W092/1~ ) ;3 PCT/FR92/00~0 Dans la description et les revendications, l'expression "anticorps monoclonal anti-granzyme" signifie que l'anticorps est tel qu'induit par la molécule native de granzyme et l'expression "anticorps monoclonal anti-granzyme recombinant" que l'anticorps monoclonal est tel qu'induit par une molécule recombinante de granzyme. Il en est de même pour les autres constituants des granules, comme la perforine.
Les cellules immortelles sont des cellules de myélome non sécréteur, ce qui permet d'obtenir des hybridomes ne sécrétant que l'immunoglobuline de la spécificité de la cellule productrice.
Conformément à la technique classique, les hybridomes obtenus sont mis en culture et clonés selon le procédé de dilution limite. On sélectionne avantageusement les hybridomes dont les surnageants de culture présentent les titres les plus élevés d'anticorps en ELISA. Pour accroitre la production d'anticorps, on les injecte à des animaux, par raison de commodité, à des souris, à des rats ou a des lapins et des ascites sont ainsi produites en grande quantité. En variante, les souches d'hybridomes sont malntenues en culture dans des incubateurs à CO2.
Les anticorps monoclonaux récupérés peuvent etre utilisés tels quels ou sont purifiés, par exemple par colonne d'affinité et conservés par congélation, ou éventuellement lyophilisés.
L'invention vise en particulier les anticorps monoclonaux anti-granzyme B humain recombinant et anti-perforine humaine recombinante.
Des anticorps de ce type ont été déposés à la D.S.M. (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen) le 13 mars 1992.
L'invention vise tout spécialement les anticorps monoclonaux anti-granzyme 8 humain et anti-granzyme A
humain respectivement produits par les clones appelés GR8 51D et GRA 66D, déposés à la Collection Nationale de Culture des Mlcroorganismes (CNCM), sous les numéros I-1060 et I-1059, le 12 mars 1991.

W092/1~ J ~ PCT/FR92/00~0 Elle décrit également les anticorps monoclonaux anti-perforine de souris déposés à la CNCM sous le n I-1058 le 12 mars 1991c L'invention vise également les souches S d'hybridomes productrices d'anticorps monoclonaux définis ci-dessus et plus spécialement les clones produisant des titres éleves d'anticorps mesurés par test ELISA.
Les souches d'hybridomes de l'invention sont caractérisées en ce qu'elles sont formées de cellules hybrides résultant de la fusion de cellules immortelles avec une cellule produisant des anticorps dirigés contre un constituant donné de granules cytoplasmiques de cellules T-"helper" ou de cellules cytotoxiques, notamment des anticorps dirigés contre les granzymes ou la perforine.
Le procédé d'obtention de ces hybridomes entre également dans le cadre de l'invention. Ce procédé comprend des étapes de fusion et de sélection définies plus haut en rapport avec les anticorps monoclonaux.
Comme indiqué ci-dessus, les protéines contre lesquelles sont dirigés les anticorps monoclonaux de l'invention sont soit des protéines natives, soit des protéines recombinantes. Ces protéines recombinantes sont des produits nouveaux et, en tant que tels, entrent dans le cadre de l'invention.
Il s'agit plus spécialement de séquences d'acides aminés renfermant au moins la partie C-terminale active de la protéine mature .
On citera en particulier les granzymes B
recombinants humains et la perforine recombinante humaine.
En opérant selon les techniques classiques du génie génétique, ces protéines sont produites dans des hôtes cellulaires, notamment dans des bactéries, transformés par introduction de vecteurs d'expression, notamment de plasmides, renfermant les fragments de gène codant pour les séquences d'acides aminés recherchées.
Ces fragments sont excisés à partir de clones d'ADN codant pour les protéines matures et sont introduits par ligaturation dans un site approprié du vecteur choisi.

W092/1~ ;`L3J PCT/FR92/00~0 , .
~0 Les protéines exprimées sont récupérées du milieu de culture, après lyse des bactéries, et purifiées.
La mise en oeuvre de ces techniques conduit à
l'élaboration d'outils qui constituent des produits nouveaux. Ainsi, les hôtes cellulaires transformés, les vecteurs d'expression tels que plasmides, et fragments d'ADN tels qu'évoqués ci-dessus entrent dans le cadre de l'invention. Celle-ci vise plus spécialement les protéines recombinantes de perforine et de granzyme et les outils mis en oeuvre pour leur expression.
L'invention vise ainsi un fragment de la séquence de la perforine comportant la partie active C-terminale de la perforine humaine, plus spécialement le fragment tel qu'exprimé par le fragment d'ADN BalI-Bam HI par pAR 3039.
Elle vise également un fragment de la séquence du granzyme B humain tel qu'exprimé par le fragment d'ADN BalI-Bam MI
par pAR 3038.
L'invention décrit également un fragment de la séquence de la perforine comportant la partie active C-terminale de la perforine mature de souris, plus spécialement le fragment tel qu'exprimé par le fragment d'ADN SmaI-EcoRV de 1400 pb. L'invention vise en particulier la séquence d'acides aminés s'étendant de la posltion 98 a 534 sur la figure 1. Elle vise également le fragment d'ADN capable de coder pour cette séquence d'acides aminés, les vecteurs renfermant un tel fragment d'ADN, en particulier un vecteur plasmidique, ainsi que les bactéries transformées par incorporation de tels vecteurs, en particulier les bactéries transformées mPerf-PL 40 déposées a la C.N.C.M. le 12 mars 1991 sous le n I-1057.
Comme indiqué ci-dessus, les gènes des granzymes et de la perforine sont inductibles ; n vitro et ;n vi.v~ au cours de l'activation cellulaire en situation normale ou pathologigue. Les granzymes apparaissent comme des marqueurs précoces de l'activation cellulaire ; la perforlne semble être préférentiellement un marqueur de l'activité cytotoxique d'une cellule. Ces protéines W092/l~4 ~ 3 PCT/FR92/00~0 ,'-apparaissent donc comme des marqueurs fonctionnels de l'activation cellulaire et/ou cytotoxique chez l'homme.
La spécificité élevée des anticorps monoclonaux de l'invention les rend particulièrement précieux pour mettre en évidence la présence de tels marqueurs dans un fluide ou un échantillon biologique humain.
L'invention vise donc également l'application de ces anticorps monoclonaux en tant que bioréactifs pour le diagnostic in vitro dans un fluide ou échantillon biologique de la présence de constituants des granules cytoplasmiques de cellules T "helper" ou de cellules cytotoxiques plus spécialement de granzymes ou de perforine ou encore, par exemple, de protéoglycanes ou de molécules de type lymphotoxine Dans cette 2ppl~ cation, les anticorps monoclonaux sont libres. En variante, ils sont fixés sur un support solide non immunogène.
La méthode selon 1'invention de diagnostic in vitro de la présence de granzvmes ou de perforine ou autre constituant desdits granules cytoplasmiques est caractérisée par le fait qu'elle comprend les étapes suivantes :
- on met en contact l'échantillon à tester avec une préparation d'anticorps monoclonaux, ou d'un fragment tel que défini ci-dessus, immobilisé sur un support solide, dans des conditions appropriées pour la production d'un complexe antigène-anticorps avec lesdits constituants, en partlculier respectivement avec un granzyme ou la perforine lorsqu'ils sont présents dans l'échantillon, puis on met en évidence la formation d'un tel complexe de type antigène-anticorps.
Pour révéler la réaction immunologique, ledit constltuant, plus spécialement le granzyme ou la perforine comporte un groupe marqueur. Il s'agit le plus généralement d'un groupe radioactif. En varlante, on utilise un deuxième antlcorps couplé a un groupement dont l'activité peut etre mesurée telle une enzyme, comme la phosphatase alcaline ou un groupe fluorescent.

W092/1~ J PCT/FR92/00~0 -1~
Cette méthode de détection permet de révéler avec une grande sensibilité et rapidement la présence desdits constituants, en particulier de granzymes ou de perforine dans un échantillon biologique, notamment de les localiser et de les quantifier par exemple au niveau de biopsies de tissu pathologique, ou de cellules du sang périphérique.
Ainsi elle est particulièrement appropriée pour diagnostiquer un rejet dans le cas de transplantation d'organes, (rein, coeur, / poumon, foie, pancréas) et à des fins de diagnostic précoce de GVH [peau, foie, intestin] ) dans le cas de greffe de moelle osseuse.
Outre ces applications immunohistologiques, les anticorps monoclonaux de l'invention et leurs fragments, libres ou immobilisés, sont utilisés pour réaliser des diagnostics dans des patAologies où l'évolution de la maladie modifie le taux de granzyme ou de perforine.
Ils pourraient permettre par exemple de suivre le devenir d'une greffe chez un patient, et en particulier les implications du traitement immunosuppresseur qui pourrait être éventuellement modulé. Cette surveillance pourrait être éffectuée par l'étude cinétique des "infiltrats lymphocytaires" présents au niveau de biopsies prélevées au site de la greffe. Ils revetent également un grand intérêt dans le cas de maladies auto-immunes, dermatologiques, infectieuses (microbiennes, parasitaires ou virales (HIV)).
L'apport des anticorps monoclonaux de l'invention est donc important pour diagnostiquer la présence de cellules activées et/ou cytotoxiques en nombre anor~alement élevé au niveau de l'organe atteint, ou au niveau du sang périphérique.
Ils sont également utilisables pour effectuer des études de différenciation cellulaire, les granzymes étant des marqueurs de la différentiation cellulaire T ou L.
On notera que dans le cas de maladies auto-immunes les protéases lmpllquées constituent des auto-antigènes.
Elles peuvent donc ~tre utilisees pour reconnaître les auto-anticorps formés. A cet égard, les protéines recombinantes, plus particulièrement de granzyme L et de WO92/1~ PCTtF~92/00~0 - . . .
~ ;~
-~3 granzyme H de l'invention, présentent un ~rand intéret dans - une utilisation comme auto-antigènes en vue d'une reconnaissance par des auto-anticorps présents dans des sérums auto-immuns. Pour effectuer cette réaction, on opère avantageusement selon les techniques habituelles.
L'invention vise également un kit pour le diagnostic ~n vitro de la présence desdits constituants des granules cytoplzsmiques plus specialement de granzyme ou de perforine dans un échantillon biologique.
Ce kit est caractérisé en ce qu'il comprend :
- une phase solide appropriée servant de support pour le dosage, telle qu'une plaque de micro-titration, - une préparation d'anticorps monoclonal ou de fragment, libre ou immobilisé, comme défini ci-dessus, - une préparation desdits constituants, plus spécialement de granzyme ou de perforine avec le cas échéant un groupe marqueur, et lorsque ia préparation ne comporte pas de groupe marqueur, une préparation d'un deuxieme anticorps avec un groupe marqueur, - un système de détection spécifique du marqueur, - des solutions tampons appropriées pour les réactions immunologiques et pour les réactions de détection.
Les anticorps monoclonaux sont susceptibles 25 également de constituer des agents thérapeutiques de grand intéret et peuvent ~ouer le role de vecteurs d'enzymes ou de médicaments.
On rapporte dans les exemples qui suivent d'autres caractéristiques et avantages de l'invention. Les figures 1 30 a représentent respectivement - la figure 1 la séquence d'acides aminés de la perforine recombinante dont la préparation est rapportée dans les exemples, - la figure 2, le mode de construction de HLPDE3, - la figure 3, une carte de restrlction partielle du plasmide pAR 3038, - la figure 4, la séquence de nucléotides du granzyme B humain et la séquence correspondante d'acides W092/1~ 2 1 n ~ ~. 3 ~ RCT/FR92/00~0 (~
aminés (1 à 227) utilisee pour former des anticorps monoclonaux anti-granzyme B humain recombinant, - la figure 5, le mode de construction du plasmide pAR 3039-HuP, et - la figure 6, la sequence de nucléotides pAR 3039 HuP et la sequence deduite d'acides aminés de la protéine recombinante, ainsi que la sequence obtenue à partir du clone 34.
I - Matériel I-l Matériel - Les granzymes A et B sont séparés des autres protéines des granules cytoplasmiques des LGL (lymphocytes a larges granules) sur une colonne Mono S échangeuse de cations (HR/5, PHARMACIA) connectée à un système FPLC
(PHARMACIA) selon la technique décrite par (Krahenbul et al., dans J. Immunol, indiqué ci-dessus).
- Les souris utilisées sont des souris BALB/C
d'haplotype H-2d.
- Le myélome NS-l, non sécréteur d'haplotype H-2d, apporte dans la fusion son pouvoir de prolifération. Il est contre-sélectionné en milieu HAT (Hypoxanthine, Aminoptérine, Thymidine) car il porte la mutation HPRT-(Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6,292-295, 1976).
- L'anticorps polyclonal dirigé contre le granzyme B est tel qu'obtenu selon la technique décrite par Krahenb~hl (volr référence ci-dessus).
- La lignee REX est une lignée T immortalisée par le virus d'Epstein Barr.
- L'anticorps monoclonal PAb419 est dirigé contre l'antigène T de SV40 (Harlow et al., J of Virology, 861-869, 1981).

WO 92/1~ ,} ~ j' PCT/FR92/00240 I-2 Solutions MILLIEU 1 : RPMI 1640 (GIBCO), lOO u/ml pénicilline, 100 u/ml streptomycine (GIBCO), 2 mM glutamine (GIBCO).
MILIEU 2 : RPMI 1640 (GIBCO), lOO u/ml pénicilline, 100 u/ml streptomycine (GIBCO), 2 mM glutamine (GIBCO), 250 u/ml interleukine 2 (Roussel Uclaf, 0,7 106 u BRMP / échantillon).
MILIEU 3 : RPMI (GIBCO), lOO u/ml pénicilline, lOO
u/ml streptomycine (GIBCO), 2 mM glutamine (GIBCO), 1 mM
pyruvate de sodium (GIBCO), lO % sérum de veau foetal inactivé (GIBCO), 0,36 %. glucose (A.P.).
MILIEU 4 : Dubeccs's MOD Eagle Medium (GIBCO), lOO u/ml pénicilline, lOO u/ml streptomycine (GIBCO), 2 mM
glutamine (GIBCO), 1 mM pyruvate de sodium (GIBCO), lO %
sérum de veau foetal inactivé (GIBCO), lO % sérum de cheval inactivé (GIBCO), lO % NCTC 135 (GIBCO), 2 mM NaOH
(Prolabo).
MILIEU 5 : Dubecco's MOD Eagle Medium (GIBCO), lOO
u/ml pénlcilline, lOO u/ml streptomycine (GIBCO), 2 mM
glutamine (GIBCO), 1 mM pyruvate de Sodium (GIBCO), lO
sérum de veau foetal inactivé (GIBCO), lO % sérum de cheval inactivé (GIBCO), lO % NCTC 135 (GIBCO), 2 mM NaOH
(Prolabo), 2 % Hypoxanthine (GIBCO), 2 % Thymidine (GIBCO), WO 92/1 ~ 3 ~, PCT / FR92 / 00240 . ~

MEANS FOR THE DIAGN ~ STIC IN VITRO OF CONSTITUENTS OF
GRA ~ CYTOPLASMIC
AND BIOLOGICAL APPLICATIONS

The invention relates to means for diagnosis in v ~ tro of constituents of cytotoxic cells and "helper" T cells playing a role in the response immune system.
The immune system is able to respond specifically or not to the introduction into the body viral, bacterial or allogenic antigens. Two types cells are responsible for neutralizing and the elimination of these different antigens: lymphocytes B and T cells. These cells provide both forms of the immune response: the humoral response, mediated by B cells, and cellular response mediated by at least two cell populations, namely cytotoxic T lymphocytes ~ CTLs), and "natural cells killer "(NK).
In cell-mediated cytotoxicity, two lysis processes have been described. One has the secretion by effector cells (CTLs and cells NK) of cytolytic proteins in the absence of seconds intracellular messengers. The second process, called regulated lysis, includes storage of lytic proteins or associated ~ lysis in cytoplasmic granules, in large amount, and their secretion only after activation of cell surface receptors effector and production of second messengers intracellular.
In these granules, different proteins have been identified, among which, the perforin or protein which forms pores, a family of proteases called} e granzymes, and proteoglycans, high proteins molecular weight, transport loads either perforlne, or granzymes, to the cell membrane.

W092 / 1 ~
PCT / FR92 / 00 ~ 0 During the interaction of the effector with its target and its activation, an exocytosis of the granular intracytoplasmic vesicles that secrete their content in the intercellular space formed by the effector / target contact, causing cell lysis target.
Perforin was isolated from a line cytotoxic in rats and humans ~
The work carried out made it possible to observe that presence of Ca2 +, the perforin molecules polymerize, are inserted at the level of the plasma membrane of the cell targets and form pores causing destruction of target cells.
Murine and human cDNA clones were isolated, Genomic sequences for perforin in mice and humans.
As for granzymes, many teams have describes their purification from CTL granules or cells with NK / LAK activity (lymphokine activated ki ~ ler).
They represent the majority of protein in the granules intracytoplasmic (85 ~ versus 10 ~ for perforin).
Different granzymes have been isolated and characterized in mice as well as in humans. More specifically, six granzymes called granzymes A to F have been described in cytoplasmic granules of murine CTLs. A seventh granzyme called granzyme G was recently characterized in mouse CTLs. In humans, two granzymes have been isolated corresponding to granzymes A and B, and a third called H does not correspond to any isolated mouse granzyme. -~ es granzymes are synthesized in the form of premolecules containing a characteristic signal peptide proteins secreted or having a localization granular. This signal sequence is followed by a dipeptide actlvation acid which is generally Gly-Glu or Glu-Glu (propeptide) and must be cleaved by a dipepdityl-peptidase to release the mature protein.

WO92 / l ~ PCT / FR92 / 00240 ~, There is a great homology between different granzymes, which suggests that they belong a family of granular serine proteases.
They contain all the residues ~ is57, ASP1O2 and Ser195 which form the catalytic triad of serines esterases. All mature granzymes start with the Ile-Ile-Gly-Gly N-terminal sequence (residues 16-19), then a varizble sequence (residues 20-23), followed by a conserved sequence (residues 24-30). These are proteins more or less glycolysed. Six Cys residues preserved form three intra-chain disulfide bridges.
The molecular biology approach allowed to isolate genes coding for expressed granzymes specifically in CTLs.
Several roles have been assigned to the granzymes.
In particular, an indirect action on the perforin by increasing its lytic activity, promoting fragmentation of the target cell's DNA.
They could also intervene in the mechanism of detachment of the CTL from its target after the delivery of the lethal blow by cleavage of the TcR / complex antigen (TcR = T antigen receptor) and others receptor / ligand complexes involved in the phenomena cell adhesion.
Finally the granzymes, by proteolysis, could cleave constituents of the extracellular matrix or components of the interstitial medium and so be involved in migration phenomena and of lymphocyte infiltration into the tissues during inflammatory processes.
Other proteins have been characterized in granules of CTLs and "NK" cells: these are proteoglycans. These molecules ~ play a role in particular in the "packaging" of perforin and granzymes. They can also constitute a kind of barrier protective of the internal surface of the secretory granules, thus protecting the cytotoxic cell from the effects of its own lytic molecules.

W092 / 1 ~ t) PCT / FR92 / 00240 Perforin and granzymes have been extensively studied at the level of their gene expression by the techniques of Northern Blot and Dot ~ lot and more recently by the in situ hybridization technique using riboprobes specific.
Studies carried out in vitro and, in vivo in pathological situation in mice and humans, show that these genes are inducible during Cellular activation of T lymphocytes, cells exhibiting NK / LAK activity at an early stage.
In humans, the expression of genes for granzymes and perforin has been observed in different situations pathological conditions such as hematological disorders, autoimmune diseases, dermatological diseases and parasitic, bacterial or infectious diseases viral. Finally, the mRNAs of the granzymes and or of the perforin could be detected by hybridization ln_si ~ au site of several types of allografts.
Granzyme B gene expression has been observed at the level of cells infiltrating kidney allografts.
Expression of granzyme B and / or perforin genes could be detected in cells preferentially CD8 + in lymphocyte infiltrates from biopsies endomyocardia performed in patients with re ~ and. A similar study was carried out at the level of skin biopsies from GVH patients (Graft versus host reaction) after genogenic HLA allogeneic marrow transplant or pheno-identical.
The studies carried out made it possible to observe during suspicion of rejection during an organ transplant (heart, kidney) or GVHD after bone marrow transplant, the presence of "silent" lymphocytic infiltrates detected by histology, phenotypically characterized by immunohistochemistry and which are nevertheless devoid of the expression of the messengers of the granzymes and the perforin. The interpretation of such results remains a lnterrogatlon and raises many questions in relationship to the immunization state of the cells of these W092 / 1 ~ 9 ~ PCT / FR92 / 00 ~ 0 infiltrates, the effect of immunosuppressive therapy and the actual function of these cells. Only patient monitoring over time should make it possible to study the evolution of these cellular infiltrates, their fate and their relationship has the evolution of the rejection process or GVH depending on the treatment administered.
We therefore measure the interest of the search for gene expression of granzymes and per, orine at during cellular and / or cytotoxic activation in vivo.
Most of the studies have been done by Northern Blot, Dot Blot, in situ hybridization. Good only informative, these techniques are heavy and do not do not allow to study a large number of patients with the follow-up necessary to know the evolution of their pathology.
Lymphocyte infiltrates detected by histology remain in fact the only operational criterion on which clinicians rely to confirm the clinical diagnosis, whether rejection or GVHD in the case of allografts.
It is clear that in all these applications to the clinical, instead of ~ detecting messengers of granzymes and perforin, it would be easier to detect proteins using antibodies.
The fundamental aspect that involves understanding of the biological role of granzymes and perforin also requires fine and effective analysis using of antibodies.
Taking advantage of their technical lead in this domain and their great mastery of isolation techniques and purification of granzymes and perforin, inventors have developed new tools for detect in humans the presence of constituents of cytoplasmic granules in biological samples to to study.
Using the immunological approach to resolve the problems posed to date, the inventors have produced WO 92/1 ~ J j PCT / FR92 / 00240 ':
G

high specificity antibodies to proteins mentioned above.
The invention therefore aims to provide new very specific means of diagnosis in vi ~ ro in humans the presence of the constituents of the granules mentioned above above.
It also aims at a diagnostic method to simplify the detection of these products by clinical and basic research.
The antibodies of the invention, which are directed against the constituents of the cytoplasmic granules of "helper" T cells or cytotoxic cells, plus especially cytotoxic T lymphocytes and cells "natural killer", are characterized in that it is monoclonal antibodies capable of recognizing specifically an epitope of a given constituent of a human granule, in particular a granzyme epitope human or human perforin, giving rise to a antigen / antibody type reaction.
The expression "constituting granules" as as used in the description and claims covers both the native form of the constituent, and a active recombinant form as obtained by classical techniques of genetic engineering based on the amino acid sequence of granzymes or perforin in humans, or amino acid sequences deduced from nucleotide sequences of human genes encoding these proteins. Thus the granzymes or the perforin to which it is falt reference are either in their native form or under a recombinant elm, comprising at least the part active of these granzymes or perforin.
The expression "able to recognize specifically an epitope "as used in the descrlption and the claims means that the monoclonal antibodies react with the epitope in question using ELISA, Wester ~ immunological techniques ~ batch or Immunoprecipitation described in the examples.

,:. . . ' ,::
, '' : ' W092 / 1 ~ 'PCT / FR92 / OO ~ o ', The monoclonal anti-granzyme antibodies are in particular of anti granzyme A or anti-granzyme antibodies B or human anti-granzyme H.
The monoclonal antibodies of the invention are still characterized by the fact that they belong to the class of IgG and that they are directed against proteins molecular weight about 25 to 30 kDa (Granzyme B), 60 kDa (Granzyme A) or approximately 66 to 75 kDa (Perforine).
The invention also relates to any fragment of monoclonal antibodies above as soon as it is capable to interact specifically with a constituent gives said granules, in particular with a granzyme or perforin.
The monoclonal antibodies of the invention are also characterized by the .ai ~ that they are such only obtained by secretion from hybridoma strains resulting from the fusion of an immortal myeloma cell non-secretor with an antibody-producing cell directed against a given constituent of cell granules human cytotoxics.
The stage of fusion of the two cell types is especially performed using the most commonly used technique used namely that of K ~ hler and Milstein, Nature, vol 256, p. 495, 1975.
Antibody producing cells are splenocytes. These cells are recovered after in vivo immunization of the animal with the appropriate antigen.
For the immunization step, the constituents of the purified granules and they are injected with an adjuvant. Particularly satisfactory results are obtained by purifying the constituents of the granules cytoplasmics according to the technique of Krahenb ~ hl et al, in J. Immunol, 141, 3471-77, 1988.
The constituents of the granules are in elm native or, as a variant, in recombinant form. We use in particular a recombinant human granzyme B or a perforlne recombinant human.

W092 / 1 ~); 3 PCT / FR92 / 00 ~ 0 In the description and the claims, the expression "anti-granzyme monoclonal antibody" means that the antibody is as induced by the native molecule of granzyme and the expression "anti-monoclonal antibody recombinant granzyme "that the monoclonal antibody is such that induced by a recombinant granzyme molecule. It the same is true for the other constituents of the granules, like perforin.
Immortal cells are cells of non-secreting myeloma, which makes it possible to obtain hybridomas secreting only the immunoglobulin of the specificity of the producer cell.
In accordance with conventional technique, the hybridomas obtained are cultured and cloned according to the limiting dilution process. We advantageously select hybridomas whose culture supernatants have the highest antibody ELISA titers. For increase the production of antibodies, we inject them into animals, for convenience, mice, rats or to rabbits and ascites are thus produced in large quantity. Alternatively, the hybridoma strains are poorly cultured in CO2 incubators.
The monoclonal antibodies recovered can be used as is or are purified, for example by affinity column and stored by freezing, or possibly freeze-dried.
The invention relates in particular to antibodies recombinant human anti-granzyme B monoclonals and anti recombinant human perforin.
Antibodies of this type have been deposited at the DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen) March 13 1992.
The invention relates especially to antibodies anti-human granzyme 8 and anti-granzyme A monoclonals human respectively produced by clones called GR8 51D and GRA 66D, deposited at the National Collection of Culture of microorganisms (CNCM), under the numbers I-1060 and I-1059, March 12, 1991.

W092 / 1 ~ J ~ PCT / FR92 / 00 ~ 0 It also describes monoclonal antibodies mouse anti-perforin deposited at the CNCM under the n I-1058 March 12, 1991c The invention also relates to the strains S of hybridomas producing defined monoclonal antibodies above and more especially the clones producing high titer of antibodies measured by ELISA test.
The hybridoma strains of the invention are characterized in that they are formed of cells hybrids resulting from the fusion of immortal cells with a cell producing antibodies to a given constituent of T- cell cytoplasmic granules "helper" or cytotoxic cells, in particular antibodies to granzymes or perforin.
The process for obtaining these hybridomas between also in the context of the invention. This process includes the merging and selection steps defined above in relationship with monoclonal antibodies.
As noted above, the proteins against which are directed the monoclonal antibodies of the invention are either native proteins or recombinant proteins. These recombinant proteins are new products and, as such, enter the part of the invention.
These are more specifically acid sequences amines containing at least the active C-terminal part of the mature protein.
Mention will in particular be made of granzymes B
human recombinants and human recombinant perforin.
By operating according to classic techniques of genetic engineering, these proteins are produced in cellular hosts, especially in bacteria, transformed by introduction of expression vectors, including plasmids, containing the gene fragments coding for the desired amino acid sequences.
These fragments are excised from clones of DNA encoding mature proteins and are introduced by ligating in an appropriate site of the chosen vector.

W092 / 1 ~; `L3J PCT / FR92 / 00 ~ 0 ,.
~ 0 The expressed proteins are recovered from the medium of culture, after lysis of the bacteria, and purified.
The implementation of these techniques leads to the development of tools that constitute products new. So, transformed cell hosts, expression vectors such as plasmids, and fragments of DNA as mentioned above are part of the invention. This more specifically targets proteins recombinants of perforin and granzyme and the tools at work for their expression.
The invention thus relates to a fragment of the sequence of perforin comprising the C-terminal active part of human perforin, especially the fragment such as expressed by the DNA fragment BalI-Bam HI by pAR 3039.
It also targets a fragment of the granzyme sequence Human B as expressed by the BalI-Bam MI DNA fragment by pAR 3038.
The invention also describes a fragment of the perforin sequence comprising the active part C-mature mouse perforin, plus especially the fragment as expressed by the fragment of 1400 bp SmaI-EcoRV DNA. The invention aims at particularly the amino acid sequence extending from the position 98 to 534 in FIG. 1. It also targets the DNA fragment capable of coding for this sequence amino acids, the vectors containing such a fragment DNA, in particular a plasmid vector, as well as the bacteria transformed by incorporation of such vectors, in particular the transformed bacteria mPerf-PL 40 deposited with the CNCM on March 12, 1991 under number I-1057.
As indicated above, the genes of granzymes and perforin are inducible; n vitro and; n vi.v ~ au during normal cell activation or pathological. The granzymes appear as early markers of cell activation; the performance seems preferentially to be a marker of cytotoxic activity of a cell. These proteins W092 / l ~ 4 ~ 3 PCT / FR92 / 00 ~ 0 , '-therefore appear as functional markers of cellular and / or cytotoxic activation in humans.
The high specificity of monoclonal antibodies the invention makes them particularly valuable for putting demonstrate the presence of such markers in a fluid or a human biological sample.
The invention therefore also relates to the application of these monoclonal antibodies as bioreagents for the in vitro diagnosis in a fluid or sample biological of the presence of constituents of the granules cytoplasmic helper T cells or cells cytotoxic agents, especially granzymes or perforin or, for example, proteoglycans or lymphotoxin-like molecules In this 2ppl ~ cation, the monoclonal antibodies are free. Alternatively, they are fixed on a support non-immunogenic solid.
The method according to the invention of diagnostic in in vitro of the presence of granzvmes or perforin or other constituting said cytoplasmic granules is characterized by the fact that it includes the stages following:
- the sample to be tested is brought into contact with a preparation of monoclonal antibodies, or a fragment as defined above, immobilized on a solid support, under conditions suitable for the production of a antigen-antibody complex with said constituents, in individual with a granzyme or perforin respectively when they are present in the sample, then we set evidence of the formation of such an antigen-like complex antibody.
To reveal the immunological reaction, said constltuant, more particularly granzyme or perforin has a marker group. It is most generally of a radioactive group. In variant, we use a second antibody coupled to a group whose activity can be measured like an enzyme, like alkaline phosphatase or a fluorescent group.

W092 / 1 ~ J PCT / FR92 / 00 ~ 0 -1 ~
This detection method allows to reveal with great sensitivity and quickly the presence of said constituents, in particular of granzymes or perforin in a biological sample, including locating them and quantify them for example at the level of biopsies of pathological tissue, or peripheral blood cells.
So it is particularly suitable for diagnose rejection in the case of transplantation organs, (kidney, heart, / lung, liver, pancreas) and for early diagnosis of GVHD [skin, liver, gut]) in the case of bone marrow transplant.
In addition to these immunohistological applications, monoclonal antibodies of the invention and their fragments, free or immobilized, are used to carry out diagnostics in pathologies where the evolution of disease changes the level of granzyme or perforin.
They could allow for example to follow the become of a transplant in a patient, and in particular implications of immunosuppressive therapy which could possibly be modulated. This monitoring could be carried out by the kinetic study of "infiltrates lymphocytes "present at the level of biopsies taken at graft site. They are also of great interest in the case of autoimmune, dermatological diseases, infectious (microbial, parasitic or viral (HIV)).
The contribution of the monoclonal antibodies of the invention is therefore important for diagnosing the presence of activated and / or cytotoxic cells in number anor ~ alement high in the affected organ, or in the blood peripheral.
They can also be used to perform cell differentiation studies, the granzymes being T or L cell differentiation markers Note that in the case of autoimmune diseases the proteases lmpllquées constitute auto-antigens.
They can therefore be used to recognize autoantibodies formed. In this regard, proteins recombinant, more particularly of granzyme L and WO92 / 1 ~ PCTtF ~ 92/00 ~ 0 -. . .
~; ~
- ~ 3 granzyme H of the invention have a ~ interest rand in - use as autoantigens for recognition by autoantibodies present in autoimmune sera. To carry out this reaction, we operate advantageously according to the usual techniques.
The invention also relates to a kit for the ~ n in vitro diagnosis of the presence of said constituents of more specifically cytoskeletal granules of granzyme or perforin in a biological sample.
This kit is characterized in that it includes:
- an appropriate solid phase serving as a support for the assay, such as a micro-titration plate, - a preparation of monoclonal antibody or fragment, free or immobilized, as defined above, - a preparation of said constituents, more especially granzyme or perforin with the case a marker group, and when the preparation does not does not have a marker group, a preparation of a second antibody with a marker group, - a specific marker detection system, - suitable buffer solutions for immunological reactions and for the reactions of detection.
Monoclonal antibodies are susceptible 25 also to constitute therapeutic agents of great interest and can ~ play the role of enzyme vectors or of drugs.
In the examples which follow, other characteristics and advantages of the invention. Figures 1 30a respectively represent - Figure 1 the amino acid sequence of the recombinant perforin whose preparation is reported in the examples, FIG. 2, the construction method of HLPDE3, - Figure 3, a partial restriction map plasmid pAR 3038, - Figure 4, the nucleotide sequence of human granzyme B and the corresponding acid sequence W092 / 1 ~ 2 1 n ~ ~. 3 ~ RCT / FR92 / 00 ~ 0 (~
amines (1 to 227) used to form antibodies recombinant human anti-granzyme B monoclonals, - Figure 5, the mode of construction of the plasmid pAR 3039-HuP, and - Figure 6, the nucleotide sequence pAR 3039 HuP and the deduced amino acid sequence of the protein recombinant, as well as the sequence obtained from clone 34.
I - Hardware Hardware - Granzymes A and B are separated from the others proteins from LGL (lymphocyte) cytoplasmic granules with large granules) on a Mono S column exchanging cations (HR / 5, PHARMACIA) connected to an FPLC system (PHARMACIA) according to the technique described by (Krahenbul and al., in J. Immunol, indicated above).
- The mice used are BALB / C mice H-2d haplotype.
- NS-1 myeloma, non-secretor of H-2d haplotype, brings in the power of proliferation. It is counter-selected in HAT medium (Hypoxanthine, Aminopterin, Thymidine) because it carries the HPRT- mutation (Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6,292-295, 1976).
- The polyclonal antibody directed against granzyme B is as obtained according to the technique described by Krahenb ~ hl (volr reference above).
- The REX line is a T line immortalized by the Epstein Barr virus.
- The monoclonal antibody PAb419 is directed against SV40 T antigen (Harlow et al., J of Virology, 861-869, 1981).

WO 92/1 ~,} ~ i 'PCT / FR92 / 00240 I-2 Solutions MILLIEU 1: RPMI 1640 (GIBCO), 100 u / ml penicillin, 100 u / ml streptomycin (GIBCO), 2 mM glutamine (GIBCO).
MEDIUM 2: RPMI 1640 (GIBCO), 100 u / ml penicillin, 100 u / ml streptomycin (GIBCO), 2 mM glutamine (GIBCO), 250 u / ml interleukin 2 (Roussel Uclaf, 0.7 106 u BRMP / sample).
MEDIUM 3: RPMI (GIBCO), lOO u / ml penicillin, lOO
u / ml streptomycin (GIBCO), 2 mM glutamine (GIBCO), 1 mM
sodium pyruvate (GIBCO), 10% fetal calf serum inactivated (GIBCO), 0.36%. glucose (AP).
MIDDLE 4: Dubeccs's MOD Eagle Medium (GIBCO), 100 u / ml penicillin, 100 u / ml streptomycin (GIBCO), 2 mM
glutamine (GIBCO), 1 mM sodium pyruvate (GIBCO), 10%
inactivated fetal calf serum (GIBCO), 10% horse serum inactivated (GIBCO), 10% NCTC 135 (GIBCO), 2 mM NaOH
(Prolabo).
MIDDLE 5: Dubecco's MOD Eagle Medium (GIBCO), lOO
u / ml penlcillin, 100 u / ml streptomycin (GIBCO), 2 mM
glutamine (GIBCO), 1 mM Sodium pyruvate (GIBCO), lO
inactivated fetal calf serum (GIBCO), 10% horse serum inactivated (GIBCO), 10% NCTC 135 (GIBCO), 2 mM NaOH
(Prolabo), 2% Hypoxanthine (GIBCO), 2% Thymidine (GIBCO),

2 % Aminoptérine (GIBCO).
RIPA : lO mM Tris pH 8,1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1 %
NP40, 1 % desoxycholate de Na, O,l % SDS.
Tampon de lavage des immunoprécipitations : lOO mM
Tris pH 9, 0,5 M LiCl, 1 % mercaptoéthanol.
Tampon Laemmli (Laemmli, Nature 227, 680-685, 1970) : 62,5 mM Tris pH 6,8, 2 % SDS, 15 % glycérol, 5 % ~-~ mercapto~thanol, O,Ol % bleu de bromophénol.

,~ ., W092/1~ s~ PCT/FR92/0024 II - Méthodes II-1 Isolement des LGL du sang périphérique On opère comme décrit par Chouaib et al., dans Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 6875-6879, 1988.
Les lympAocytes sont isolés du sang périphérique par gradient de ~icoll (PHARMACIA). Après 2 lavages en milieu 5, les cellules sont numérées en solution de Hayem et incubées à raison de 3 x 108 cellules dans des flacons de culture (COSTAR) prétraités avec du ~N inactivé pendant 1 heure à 37C. Les cellules non adhérentes sont alors collectées, lavées en RPMI SHN 10 ~ et fractionnées par centrifugation sur un gradient discontinu de percoll (PHARMACIA). 4 solutions de concentration différente de percoll sont préparées (31 %, 34 %, 37 % et 41 %). Une solution sur deux est préparée dans du milieu RPMI (rouge), ou dans une solution de chlorure de Na isotonique (incolore), permettant ainsi une bonne visualisation des interfaces. Après avoir coulé 4 ml de la solution à 41 ~
puis déposé délicatement sur celle-ci 2 ml de chaque solution par concentration décroissante dans des tubes coniques de 15 ml (NUNCLON DELTA, PAUL BLOCK), 3 x 108 lymphocytes contenus dans 2 ml de RPMI sont déposés à la surface du gradient. Les tubes sont centrifugés 30 min à
1400 t/min sans frein à température ambiante. Les anneaux de LGL situés à l'interface 37 - 41 ~ sont récupérés à la pipette Pasteur, lavés 3 fois en ~PMI, puis regroupés~ Les cellules sont numérées et mises en culture dans du milieu 2 a raison de 5 x 105 cellules par ml. Les LGL représentent 2 a 5 ~ de la population totale des lymphocytes.

II-2 Immunisation de souris avec les granzymes A
et B purifiés a partir de LGL du sang périphérique ou de cellules NK.

W092~]~ PCT/FR92/00~0 10 ,ug de protéines purifiées (granzyme A et B) dissoutes dans 200 ~g de VaccicoxR (109 unités), adjuvant, sont injectées par voie intra-péritonéale à une souris BALB/C. 21 jours après, on effectue un rappel grâce à une 2ème injection par voie intra-veineuse (10 ug de protéines dissoutes dans 200 ,ug de sérum physiologique).

II-3 Fusion cellulaire On opère comme décrit par Oi et Her~enberg, dans Selected methods in cellular immunology. Freeman and co.
Mishell, Shiigi, eds. 1980) Trois jours après le rappel, la souris est sacrifiée et sa rate est prélevée en milieu stérile. Elle est dilacérée avec un piston de seringue de 5 ml dans une boîte de Pétri stérile contenant 5 ml de RPMI. La solution de splénocytes est ensuite lavée avec 50 ml de RPMI. Après centrifugation, les culots cellulaires sont conservés à
température ambiante.
Les cellules de myélome NS-1 mis en culture dans du milieu 2 sont centrifugés pendant 7 min à 1500 t/min, puis lavés dans 50 ml de RPMI. Les culots cellulaires sont resuspendus dans 10 ml de RPMI, et transférés dans le tube contenant les splénocytes selon le rapport de 1 cellule de myélome pour 2 splénocytes. Ce mélange est ajusté à 40 ml avec du RPMI, puis centrifugé pendant 7 min a 1500 t/min à
20C.
Le culot cellulaire mixte est resuspendu avec 1 ml de PEG (polyéthylene glycol 1500, BOEHRINGER), (agent fusionnant), en tournant doucement ia pipette dans le tube pendant 1 min. Le PEG est dilué en a;outant en 1 min 1 ml de RPMI 1640 préchauffé à 37C puis 7 ml du même milieu en 2 min pour atténuer la toxicité de ce produit. Apres centrifugatlon a 1800 t/min pendant 4 min sans frein, le culot cellulaire est remis en suspension dans 10 ml de mllleu (4) préchauffé a 37C. Les cellules sont distribuées , . ' ' ' .
:, ' , W092/]~ 3 PCT/FR92/00240 1~ .
dans des plaques stériles de 96 puits à fond plat a raison de 105 cellules du myélome dans 100 ~1 par puits (temps 0).
24 heures après la fusion (jour 1), 100 ,ul de milieu 5 (sélection HAT) préchauffé à 37C sont ajoutés dans chaque puits. Ce milieu sélectionne les hybridomes et tue les cellules de myélome qui n'ont pas fusionné.
Au jour 7, 100 ul de milieu sont aspirés et remplacés par 100 ,ul de milieu 4 neuf. Au jour 10, le contenu des puits positifs (test ELISA ; kit AMERSHAM), est transféré sur plaque à fond plat de 24 puits dans lesquels on ajoute l ml de milieu de culture 4. Au jour 13, les hybridomes sécréteurs peuvent etre conservés par congélation en azote liquide dans du SVF/10~ DMS0.

II-4 Recherche des h~bridomes secrétant des anticorps anti-granzymes A et B humains par test ELISA
(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay).
(kit Anti-IG de souris, anticorps entier lié a de la peroxydase de raifort, AMERSHAM) La préparation des plaques de 96 puits à fond plat est réalisée 24 heures avant le test. A cet effet, lO0 ,ul d'antigene (granzymes A ou B purifiés), à l ,ug/ml (dans du PBS) sont distribués dans les puits. Les plaques sont mises a 4C pendant 24 heures.
2 à 5 lavages avec 200 ,ul par puits de PBS, 0,1 %
Tween 20 sont effectués avant de tester les surnageants de culture des hybridomes. Les plaques sont incubées 1 heure à
37 C avec 50 ,ul par puits de surnageant de culture de l'hybridome à tester.
Après 3 lavages avec du PBS, 0,1 ~ Tween 20, 50 ~1 d'anticorps secondaire (conjugué à la peroxydase et dilué
au l/5ooe dans du PBS, 0,2 % Tween 20) sont ajoutés dans cha~ue puits. L'incubation se fait ~ 37C pendant 30 min.
Les plaques sont de nouveau lavées 3 fois avec du PBS, 0,1 ~ Tween 20. La révélation est effectuée en a~outant 100 ,ul d'une solution contenant le substrat (10 ,ul PBS, 3 ~ H202 dans 12,5 ml d'ABTS 180 mg/l).

W092/1~ ~ t ~ ri t ~ ~ PCT/FR92/00240 Les plaques sont lues par mesure de la DO à 405 nm 15 à 25 min après l'addition du substrat.
Après fusion des cellules du myélome NSl avec les splenocytes provenant de la souris immunisée avec le granzyme B, en opérant comme indiqué ci-dessus, les surnageants de 28 hybridomes désignés GRB se sont avérés être specifiques du granzyme B en test ELISA (test réalisé
avec de la protéine purifiée).
La même démarche suivie avec le granzyme A, a conduit à isoler 15 hybridomes appelés GRA secrétant des anticorps spécifiques du granzyme A, en test ELISA (test réalisé avec de la protéine purifiée).
Le pourcentage d'hybridomes sécréteurs d'anticorps spécifiques est particulièrement satisfaisant, en effet sur 300 hybridomes issus de la fusion entre les cellules du myélome NSl et les splénocytes de la souris immunisée avec le granzyme B purifié, lO ~ secrètent des anticorps spécifiques en test ELISA. Dans le cas du granzyme A, 5 des hybridomes de la seconde fusion sont spécifiques dans les memes conditions.

II-5 Clonage des hybridomes par dilution limite.

Les hybridomes dont les surnageants présentent la plus forte positivité en test ELISA sont clonés dans des plaques de 96 puits à fond plat. Plusieurs dilutions sont testées. Le clonage est effectué à lOO cellules, lO
cellules, 1 cellule et 0,25 cellules par puits à raison de lOO ,ul de milieu 4 par puits.
Les cellules sont nourries 3 jours apres le clonage avec lOO ~ul de milieu 4, puis tous les 7 jours.
Lorsque la croissance cellulaire, contrôlée sur microscope inversé, semble lmportante, le surnageant de culture de ces puits est testé en ELISA sur les granzymes purifiés sur du granzyme A ou B et sur le lyzozyme comme contrôle négatif, Les hybridomes positifs sont transférés dans les plaques de 24 puits puis sur des plaques de 6 puits et par la suite en flacon pour maintenir la croissance .

W092/1~ PCT/FR92/00240 21~9 ~

exponentielle des cellules. Ces hybridomes sont injectés dans le péritoine des souris pour produire des ascites. Ils peuvent être laissés en culture jusqu'à la mort cellulaire afin d'obtenir des surnageants très concentrés étudiés en Western Blot ou en immunoprécipitation.
On récupère deux hybridomes secrétant des anticorps reconnaissant le granzyme B, appelés respectivement GRB98C et GRB51D et trois au~res souches secrétant des anticorps reconnaissant le granzyme A, appelés GRA66D, GRA382E et GRAlOD. Les hybridomes restants seront clonés afin de constituer un panel d'anticorps dirigés contre les granzymes humains A et B.

II-6 Caractérisation de l'isotype des anticorps clonés Le surnageant de culture de l'hybridome à tester est dilué au 1/l0e en 20 mM Tris pH 7,6, 137 mM NaCl (TBS).
La bandelette du kit est incubée 15 min à température ambiante avec le surnageant dilué. Après 3 lavages en TBS, 0,1 % Tween 20 (TBS-T), la bandelette est incubée dans une solution d'anticorps anti-souris couplés à la peroxydase (dilués au l/5ooe dans du TBS-T).
La révélation s'effectue par incubation de la bandelette durant 15 min a température ambiante dans 3 ml d'une solution contenant le substrat (1 pastille de chloro-naphtol dissoute dans 10 ml de méthanol froid, mélangés extemporanément à 50 ml de TBS contenant une goutte de peroxyde d'hydrogene). Après 3 lavages en eau distillée, les bandelettes sont séchées et peuvent etre interprétées.
La technique d'immunisation utilisée dans cette étude a permis d'obtenir des hybridomes sécrétant des anticorps d'isotype IgG. L'isotype des anticorps a été
confirmé par le kit commercialisé par Amersham d'anticorps monoclonaux de souris. Les anticorps monoclonaux GRB98C, GRA66D, GRA382E et GRAlOD présentent l'isotype IgGl. Celui sécrété par l'hybridome GRB51D présente l'isotype IgG2a. La tltration des surnageants de culture des hybridomes clonés W092/l~W ~ t ~ l '3 3 PCT/FR92/00~0 par test ELISA a permis de déterminer un titre du surnageant de culture de l'hybridome GRB98C de 1000. Ceux des surnageants de culture des hybridomes GRB51D, GRA66D et GRAlOD sont de 10 000. Le titre du surnageant de culture de l'hybridome GRA382E est de 100 000. Il convient de noter les valeurs élevees de ces titres.

II-7 Détermination de la specificité de ces anticorps par les techniques d' électro-transfert de protéines et d'immunorévélation (Western blot). On opère comme décrit par Towbin et al., dans Proc. Natl. Acad. Sci.
76, 4350-4354, 1979.

La protéine (antigbne puririé : granzymes A ou B, ou témoin négatif) est incubée dans du tampon de Laemmli à
100C pendant 10 min (1 ,ug/gel de 12 cm de largeur), migre sur un gel de polyacrylamide dénaturant, puis est électrotransférée sur filtre de nitrocellulose (BA83, CERA
LABO) dans un appareil a électrodes en graphite (CERA
LABO), dans un tampon 39 mM de glycine, 48 mM Tris pH 8,3, 0,037 ~ SDS, 20 % méthanol sous un courant de 1 mA/cm2 de filtre pendant 1,5 à 2 heures. Après transfert, le filtre de nitrocellulose est coloré avec du rouge ponceau 0,2 ~, et de l'acide trichloracétique 0,3 % pour vérifier l'efficacité du transfert, puis découpé en bandelettes de 0,6 cm de largeur.
Les bandelettes sont préincubées dans un tampon PBS avec 0,2 % de Tween 20 et 5 ~ de lait écrémé pendant heure à 4~C. Un jeu de bandelettes, représentant dif~érentes protéines a tester, sont incubées 1 nuit a 4C
avec le surnageant d'hybridome dilué au 1/10 dans le tampon PBS contenant 0,2 % de Tween 20 et 5 ~ de lait ecrémé. Les bandelettes sont ensuite lavées dans du tampon PBS
contenant 0,2 % de Tween 20 sous agitation moyenne pendant 5 fols 5 min a température du laboratoire. Les bandelettes sont incubées avec un anticorps anti-immunoglobulines de souris couplé a la phosphatase alcaline (dilué au l/lOOOe dans le tampon PBS ci-dessus) pendant 2 heures à

W092/1~ PCT/FR92/00240 température du laboratoire. Après 5 lavages de 5 min dans du PBS, les bandelettes sont équilibrées dans le tampon de réaction de la phosphatase alcaline (lOO mM Tris pH 9,5, lOO mM NaCl, 50 mM MgCl2) et mises en présence du substrat de la phosphatase (lO ml de tampon de réaction, 44 ~l de chlorure de tétrazolium nitro-bleu, 33 ,ul de sel de (5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphatase p-toluidine) pendant 15 minutes à température ambiante. La réaction peut etre stoppée en lavant les bandelettes avec H2O.
Le granzyme B, réduit et dénaturé, est électrotransféré sur un filtre de nitrocellulose. Les bandelettes de nitrocellulose sont incubées avec les différents anticorps à tester, puis avec un anticorps an~i-souris conjugué à la phosphatase alcaline.
Dans ces conditions, une bande à 31 XD est observée sur la bandelette incubée avec le sérum polyclonal anti-granzyme B. En revanche, cette bande n'est pas détectée sur les bandelettes incubées avec les anticorps anti-granzyme B GRB51D et GRB98C. Les controles (bandelettes incubées avec l'anticorps dirigé contre l'antigène T de SV 40, avec les anticorps anti-granzyme A
GRA66D, GRA382E et GRAlOD) sont également négatifs. Les anticorps anti-granzyme B ne reconnaissent donc pas le granzyme B dans les conditions de cette expérience de Western blot.

II-8 Marquage des cellules in vitro et immunoprécipitation.

Les LGL sont mis en culture (milieu : RPMI déplété
en méthionine, complémenté en 35S méthionine : 20 à 50 ,uCi/ml et en 1 % SHN inactivé) a raison de 3 a 5 x 105 cellules par ml. Le marquage peut être effectué dans un mllieu RPMI déplété en leucine et complémenté par 20 ~ 50 ,uC1/ml de 3H leucine. Après une incubation de 4 heures à
37C, les cellules sont lavées 2 fois en P~S. Le culot cellulaire est repris dans 500 ~l de RIPA-O,O1 ~ BSA
(B2518, SIGMA), puis soniqué pendant 15 s (micro . :: ,.... . .. .

W092/1~ PCT/FR92/00~0 : ., sonicateur, puissance 40 watts, sonde 0,3-87, BIOBLOCK).
L ' incorporation de radioactivite est suivie par comptage d'une fraction précipitée au TCA. L'extrait cellulaire est aliquoté par 5 x 106 cpm.

- Immunoprécipitation (selon Xress et al., dans J.
Virol. 31, 472-483, 1979).

L'incubation, pendant 30 min à 4C avec agitation sur roue, de l'extrait cellulaire avec 60 ~l de protéine A
SépharoseR (PHARMACIA, CL4B SépharoseR) permet de diminuer le bruit de fond. L'échantillon est ensuite filtré sur un frité (polyéthylène poreux). lO ,ul de sérum normal de souris et 30 ,ul de protéine A SépharoseR sont ajoutés à
l'éluat et laissés 1 heure à 4C avec agitation. Cette solution est filtrée sur le meme filtre. La dernière étape de diminution du bruit de fond est réalisée grace à
l'addition de 30 ~l de protéine A SépharoseR au filtrat et à une incubation de 30 min à 4C avec agitation. Après filtration, l'éluat est incubé, 4 heures à 4~C avec agitation, en présence de 200 ,ul de surnageant de culture à
tester ; 40 ,ul de protéine A SépharoseR et 20 ~l de RIPA-0,01 ~ BSA (B2518, SIGMA). Le complexe antigène-anticorps-protéine A SépharoseR est filtré, puis lavé, élué par 45 ,ul de tampon de Laemmli et bouilli 10 min à 100C.
Les échantillons sont déposés sur un gel de polyacrylamide (12,5 ~) en présence de SDS. Après migration a 40 mA 200 V, le gel est fixé, traité au EN3HANCE (DUPONT
de NEMOURS) lavé en eau dlstillée, séché 1 heure à 80C et fluorographié sur Hyperfilm-MP (AMERSHAM) à -80C.
On rapporte ci-après les résultats d'expériences d'immunoprécipitation suivies de séparation sur gel d'acrylamlde, réalisées pour vérifier la capacité des anticorps monoclonaux anti-granzymes ~ d'immunoprécipiter les granzymes B contenus dans les granules des LGL. Dans cette expérience, on utilise des extraits de cellules (LGL
ou REX) marqu~es à la 35S-méthionine. L'immunoprécipitation est réalisée ~ l'aide des surnageants de culture des W092/l~ PCT/FR92/00~0 l '3 ~

hybridomes à tester. Les protéines immunoprécipitées sont séparées sur un gel de polyacrylamide dénaturant à 12,5 ~.
Le temps d'autoradiographie est de 7 jours.
On observe une bande à 31 KD correspondant à la migration de l'extrait cellulaire de LGL, immunoprécipité
par les anticorps anti-granzyme B, GRB51D et GRB98C. Cette bande à 31 KD est aussi observée pour le meme extrait cellulaire immunoprécipité par le sérum polyclonal anti-granzyme B. En revanche, cette bande n'est pas détectée avec un controle négatif. La migration de l'extrait cellulaire REX (cellules n'exprimant pas les granzymes) immunoprécipité par les anticorps décrits précédemment ne révèle aucune bande à ce poids moléculaire. Ces résultats montrent que les anticorps GR~51D et GR~98C reconnaissent bien le granzyme B.
Pour la caractérisation des anticorps anti-granzyme A (GRA66D, GRA382E, GRAlOD), les immunoprécipitations ont été réalisées sur des extraits de LGL et de lignées cellulaires REX marqués à la leucine 3H ;
en effet la séquence en acides aminés du granzyme A est pauvre en méthionine, mais elle contient à l'inverse 26 leucines. Les protéines immunoprécipitées sont séparées sur un gel de polyacrylamide dénaturant à 12,5 %. Le temps d'autoradiographie est de 1 mois. Une bande supplémentaire de faible intensité à 32 Kd est observée uniquement avec l'extrait cellulaire de LGL immunoprécipité par l'anticorps GRA66D, mais non par les anticorps GRA382E et GRAlOD, ni par un anticorps servant de contrôle négatif~

II-9 Production d'ascites Une lnJection de 500 ,ul de tetra-méthyl-penta-décane (JANSSEN) est effectuée en intrapéritonéal à une sourls BALB/C. On opère comme décrit par Hoogenraad et Wraight, dans Methods Enzymol, 121, 375-381, 1986. Dix Jours plus tard, 107 hybrldomes lavés dans du sérum physlologlque sont lnJectés en intra-pérltonéal. Les souris sont ponctlonnées chaque Jour. Le llquide péritonéal est WO92/1~ f~ PCT/RR92/00240 centrifugé pendant 7 min à lS00 t/min à 4C. L'ascite récupérée à l'aide d'une pipette Pasteur est filtrée sur 0,2 ~m (NALGENE), puis centrifugée à 4C pendant 30 min à
12000 g pour éliminer les lipides et conservée à -80C.
s II-10 Purification des anticorps (ImmunoPure IgG Purification kit, PIERCE) La colonne de protéine A, stoc~ée en 0,02 ~ azide 10de Na, est lavée avec S ml de tampon de liaison. 2 ml d'ascite, diluée au 1/2 dans le tampon de liaison, sont déposes sur la colonne. Après lavage avec 15 ml de tampon de liaison, les IgG (immunoglobulines G) sont éluées avec S
ml de tampon d'élution. Cette colonne est régénérée avec 8 15ml 0,1 M d'acide citrique pH 3 et stockée en 0,02 % azide de Na.
Les fractions éluées sont dessalees sur des colonnes d'Exocellulose avec 10 ml de PBS. Ces colonnes de dessalage sont régénérées avec lS ml de PBS et stockées en 200,02 % azide de Na. Les fractions dessalées des IgG sont dosées par mesure de la D0 à 280 nm pour déterminer la concentration des immunoglobulines dans chaque fraction selon la formule : [IgG] en mg/l = D0 a 280 nm/1,4.

25II-11 Détection des granzymes au niveau des LGL
par immunocytochimie.

Les LGL ont été incubés avec des anticorps reconnaissant les granzymes A et B, sélectionnés par le 30test ELISA comme rapporté plus haut.
2 x 105 celluleq par lames sont cytocentrifugées pendant 5 mln a 250 t/min et fixées dans l'acétone pendant 10 min a 4C. Apres 2 lavages en PBS, 10 ,ul par lame de l'anticorps à tester (dilué au 1/2 dans du PBS, 1 ~ BSA) 35sont a~outés et laissés pendant 1 heure a 37C. Les lames 90nt lavées 2 fois en PBS puis 200 ,ul par lame de l'anticorps anti Ig de souris (dilué au l/5ooe dans du PBS, 1 % BSA) sont a~outes et laissés 30 min a 37C. Apres 2 W092/l~4 PCT/FR92/00240 ~ l n ~

lavages en P8S, la révélation est effectuée en incubant pendant 10 min à température ambiante la lame recouverte par 200 ,ul d'une solution contenant le substrat, 1 pastille (10 mg) de 3,3' diaminobenzidine (SIGMA) dissoute dans 10 ml de 50 mM Tris pH 7,6, mélangés extemporanément à 100 ,ul de H22 à 0,3 ~. Les lames sont lavées et les cellules sont colorées par de l'Hémalun de Meyer (MERCK) pendant 1 min à température ambiante. Les cellules sont lavées, déshydratées dans des bains d'éthanol (70 ~, 90 % et 100 ~), passées dans du toluene et montées avec une goutte de résine de montage (BIOLYON).
L'analyse est faite en microscopie photonique.
Dans ces conditions, une coloration marron du cytoplasme est observée, révélant la fixation de ces antisorps. Aucune coloration n'est obtenue avec un anticorps utilisé comme contrôle négatif. Lorsque les LGL
sont activés une nuit en présence d'IL-2 recombinant (250 U/ml), une partie seulement de la population cellulaire est colorée. Après sept jours de culture en présence d'IL2 à la même concentration toute la population cellulaire est colorée.

II-12 Détection des granzymes A et B sur les biopsies de peau de patients présentant une GVH par immunohistochimie.

Lors d'une greffe de moelle allogénique réalisée en identité HLA, le syndrome clinique de la réaction du greffon contre l'hôte ou GVH est fréquemment observé. Les manifestations cliniques de la GVH se caractérisent par des atteintes de la peau, de l'intestin et du foie. Les biopsies de peaux sont considérées comme le meilleur matériel pour établir le diagnostic de GVH grâce l'histologle et l'immunohistochimie. Les biopsies de 2 patlents (RAP : leucémie myelo~de chronique (LMC) ; REN :
leucémie aiguë myelo~de (LAM)) présentant des lésions compatlbles avec une GVH ont été étudiées.

WO92/1~ PCT/FR92/00~0 . ......................... .
~t Les biopsies de peau congelées en OCT (Tissue-Tek, MILES), fixées en acétone pendant 10 min a 4C, sont coupées à froid à 5 ,um. Les coupes de tissus sont saturées avec du sérum de cheval (kit Vectastin, VECTOR) pendant 20 min à température ambiante. Après un lavage en PBS, 2,5 ,ug de l'anticorps à tester sont déposés sur la coupe pendant ~0 min à température ambiante. On rapporte les résultats d'expériences réalisées avec les anticorps anti-granzymes GRA51D et GRA66D. Les lames sont lavées 3 fois en PBS puis incubées avec 50 ,ul d'anticorps anti Ig de souris biotinylés (kit Vectastin) pendant 30 min à température ambiante, puis avec de l'avidine mélangée à de la peroxidase biotinylée (kit Vectastin) pendant 1 heure à
température ambiante. Après 2 lavages en P8S, la révélation est effec~uée en incubant pendant 10 min à température ambiante la lame recouverte par 50 ~1 d'une solution contenant le substrat (1 pastille (10 mg) de diaminobenzidine, dissoute dans 10 ml de Tris 50 mM pH 7,6, mélangés extemporanément a 100 ,ul de H22 à 0,03 %). Les lames sont lavées et les coupes de tissus sont colorées par de l'Hémalun de Meyer pendant 1 min a température ambiante.
Les coupes de tissus sont lavées, déshydratées dans des bains d'éthanol (70 %, 90 % et 100 %), passées dans du toluène et montées avec une gout~e de résine de montage.
L'analyse est faite en microscopie photonique.
On observe comme précédemment ~_vitro, dans le cas des LGL, une coloration du cytoplasme des lymphocytes lnfiltrant la peau. Aucune coloration n'est obtenue avec l'antlcorps controle utilisé comme témoin négatif.
De plus, la coloration indiquant la fixation des différents anticorps anti-granzymes se trouve etre locallsée au niveau des infiltrats lymphocytaires qui ont été caractérisés en immunohistochimie par les marqueurs membranaires de différenciation des lymphocytes (CD3, CD4, CD8).

WO92/1~ PCT/FR92/00240 ~g III - Production de ~erforine recombinante de ~.

S Pour produire de la perfprine recombinante de souris, on utilise un vecteur d'expression procaryote pAR3039 qui exprime les protéines sous le contrôle des signaux de transcription et de traduction du phage T 7 (voir Studier et al., : J. Mol. Biol., 189, 113-130, 1986).
On excise un fragment SmaI-EcoRV de 1400 pb d'un clone d'ADNc complet de perforine de souris. Ce segment code pour la partie C-terminale de la perforine de souris mature recouvrant les résidus 98 à 534 (voir figure unique).
L'extrémité franche du segment est ligaturée dans le site BamH1 du vecteur pAR3039 à l'aide de linkers phosphorylés (5'- CCG GAT CCGG-3').
Ce plasmide est appelé pAR3039-perf.
On transforme avec ce plasmide des bacteries E.co1i DE3 qui contiennent dans leur génome le gene de la polymérase T7 sous le controle d'un promoteur inductible IPTG. Des bactéries correspondantes ont été déposées à la C.N.C.M. le 12 mars 1991 sous le n I-1057.
La synthèse de la perforine recombinante est induite par IPTG dans les bactéries transformées.
On purifie la perforine recombinante de 45 kDa en lysant le culot bactérien (à partir de 100 ml de culture) avec 20 ml d'une solution contenant 50 mM de Tris-HCl, pH
7,5, 0,5 mM d'EDTA et 10 ~g/ml de lypozyme pendant 12 heures sur de la glace.
Après addition de 1,5 ml de NaCl 5M et de 1,5 ml de NP-40 à 10 %, on maintient les bactéries lysées 20 minutes sur de la glace.
L'ADN bactérien est ensuite fragmenté par sonlcation et les corps d'inclusion protéiques sont centrlfuges, 15 mlnutes a 12 000 t/mln.

W092~ .? .?. i~ Ç .~ PCT/FR92/00~0 ~g Le culot est lavé à trois reprises avec une solution de S0 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 mM d'EDTA et 300 mM de NaCl et dissous dans du tampon SDS-PAGE.
La protéine recombinante de 45 kDa est séparée de la majorité des protéines bactériennes par SDS-PAGE (10 ~
de gel de polyacrylamide) et soumise à une électroélution en utilisant le dispositif d'élution de protéines ISC0.
On obtient en routine de 1 a 2 mg de perforine recombinante à partir de 100 ml de culture bactérienne.

IV - ~roduction de l'anticor~s monoclonal anti-perfor;ne CE2.10 1) Pr~cessus d';mmunis2tion :

Des rats males OFA sont immunisés par voie intrapéritonéale avec 50 ,ug de perforine recombinante murine (ou rMup) puis par une seconde injection, par voie intraperitonéale, 3 semaines plus tard. 3 jours avant de prélever les splénocytes (pour la production d'hybridomes), on in~ecte 50 ,ug de rMuP dans la veine de la queue sans ad;uvant.

2).~roduct;on d'hybridome~ et sélection :

En opérant comme décrit par Harlow et Lane dans Cold Spring Harbor Laboratory - New-York, 1988, on réalise la fusion de cellules de myélome Sp2/O-Ag86 ne produisant pas d'immunoglobulines avec des splénocytes de rats immunlsés avec la rMuP. Brievement, les splénocytes sont récupérés en lntroduisant avec précaution dans les tissus de la rate avec une aiguille et une seringue du milieu RPMI
dépourvu de sérum. Les splénocytes sont lavés avec le milieu comme effectué avec les cellules de myélome. 108 splénocytes sont alors mélangés avec 107 cellules de myélome dans un tube FA~CON de 50 ml et soumis a centrifugation pendant 10 minutes ~ 1 000 t/min. On élimine W092/l~ PCT/FR92/00240 21~r3~ 93 ~.~
3o autant de surnageant que possible. Les cellules sont remises en suspension en tapant doucement sur les parois du tube et on ajoute goutte à goutte 0,4 ml de polyéthylene glycol 1500 chaud 50 % (p/v) (PEG, Serva, cat. N 33123) tout en maintenant le tube dans un bain marie à 37C. Après l'addition de tout le PEG, le tube est maintenu à 37C
pendant 3 min puis centrifugé à 800 t~min pendant 5 min.
Sans enlever le surnageant, on ajoute 5 ml de milieu RPMI
dépourvu de sérum (à 37C) en 2 min, puis à nouveau 5 ml en une fois. Les cellules sont centrifugées à l 000 t/min pendant 5 min. Le surnageant est éliminé et on ajoute 50 ml d'un milieu RPMI complet - 5 % de FCS. La suspension cellulaire est distribuée dans dix plaques de 96 puits auxquelles on a ajouté au préalable des monocytes péritonéaux/macrophages (cellules nourricières) provenant de souris Balb/c (l à 5 jours avant). Les plaques sont incubées à 37C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2 pendant 24 heures, avant de remplacer le milieu avec un milieu frais cRPMI-5% FCS supplémenté avec l % de HAT
(Gibco). On laisse les cellules croltre pendant environ l0 jours. A ce stade, environ 70 ~ des puits comportent des clones qui se sont développés, beaucoup d'entr'eux possédant plus d'un seul clone. Environ 20 jours après la fusion, les cellules dans la majorité des puits contenant des hybridomes ont atteint une densité pratiquement maximale et l00 ,ul de chaque puits sont prélevées pour effectuer un test ELISA sur de la rMuP et de la perforine de murin native. Des hybridomes fortement positifs sont 90us-clonés comme décrit dans l'article de Harlo~ dont questlon ci-dessus et soumis à une autre opération de sélection.

Sélect1On par test ~ISA pour obtenir un antiCorps Des plaques de mlcrotitratlon de 96 puits (Dynatech, MIC 2000) sont recouvertes pendant environ 14 heures à 4C avec l00 ,ul de rMuP (l0 ~g/ml dans PBS). En W092tl~ ? ~ PCT/FR92/00~0 2% Aminopterin (GIBCO).
RIPA: 10 mM Tris pH 8.1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1%
NP40, 1% Na, O deoxycholate, 1.1% SDS.
Immunoprecipitation wash buffer: 100 mM
Tris pH 9, 0.5 M LiCl, 1% mercaptoethanol.
Laemmli stamp (Laemmli, Nature 227, 680-685, 1970): 62.5 mM Tris pH 6.8, 2% SDS, 15% glycerol, 5% ~ -~ mercapto ~ thanol, O, Ol% bromophenol blue.

, ~., W092 / 1 ~ s ~ PCT / FR92 / 0024 II - Methods II-1 Isolation of LGL from peripheral blood We operate as described by Chouaib et al., In Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 6875-6879, 1988.
LympAocytes are isolated from peripheral blood by gradient of ~ icoll (PHARMACIA). After 2 washes in medium 5, the cells are counted in Hayem solution and incubated at the rate of 3 x 108 cells in flasks of culture (COSTAR) pretreated with ~ N inactivated for 1 hour at 37C. The non-adherent cells are then collected, washed in RPMI SHN 10 ~ and fractionated by centrifugation on a discontinuous percoll gradient (PHARMACIA). 4 solutions of different concentration from percoll are prepared (31%, 34%, 37% and 41%). A
solution out of two is prepared in RPMI medium (red), or in an isotonic Na chloride solution (colorless), allowing good visualization of interfaces. After pouring 4 ml of the 41 ~ solution then delicately placed on it 2 ml of each solution by decreasing concentration in tubes 15 ml conical (NUNCLON DELTA, PAUL BLOCK), 3 x 108 lymphocytes contained in 2 ml of RPMI are deposited at the gradient surface. The tubes are centrifuged for 30 min at 1400 rpm without brake at room temperature. Rings of LGL located at interface 37 - 41 ~ are collected at the Pasteur pipette, washed 3 times in ~ PMI, then combined ~ The cells are counted and cultured in medium 2 at a rate of 5 x 105 cells per ml. LGLs represent 2 at 5 ~ of the total lymphocyte population.

II-2 Immunization of mice with granzymes A
and B purified from LGL from peripheral blood or NK cells.

W092 ~] ~ PCT / FR92 / 00 ~ 0 10, ug of purified protein (granzyme A and B) dissolved in 200 ~ g of VaccicoxR (109 units), adjuvant, are injected intraperitoneally into a mouse BALB / C. 21 days later, a reminder is made using a 2nd intravenous injection (10 ug of protein dissolved in 200 µg of saline).

II-3 Cell fusion We operate as described by Oi and Her ~ enberg, in Selected methods in cellular immunology. Freeman and co.
Mishell, Shiigi, eds. 1980) Three days after the recall, the mouse is sacrificed and his spleen is removed in a sterile environment. She is dilated with a 5 ml syringe plunger in a sterile Petri dish containing 5 ml RPMI. The solution of splenocytes is then washed with 50 ml of RPMI. After centrifugation, cell pellets are stored at ambient temperature.
NS-1 myeloma cells cultured in of medium 2 are centrifuged for 7 min at 1500 rpm, then washed in 50 ml of RPMI. The cell pellets are resuspended in 10 ml RPMI, and transferred to the tube containing the splenocytes according to the ratio of 1 cell of myeloma for 2 splenocytes. This mixture is adjusted to 40 ml with RPMI, then centrifuged for 7 min at 1500 rpm at 20C.
The mixed cell pellet is resuspended with 1 ml PEG (polyethylene glycol 1500, BOEHRINGER), (agent merging), gently turning the pipette into the tube for 1 min. PEG is diluted to a; out in 1 min 1 ml RPMI 1640 preheated to 37C then 7 ml of the same medium in 2 min to reduce the toxicity of this product. After centrifugation at 1800 rpm for 4 min without brake, the cell pellet is resuspended in 10 ml of mllleu (4) preheated to 37C. Cells are distributed ,. '''' .
:, ', W092 /] ~ 3 PCT / FR92 / 00240 1 ~.
in sterile 96-well flat bottom plates of 105 myeloma cells in 100 ~ 1 per well (time 0).
24 hours after fusion (day 1), 100, ul of medium 5 (HAT selection) preheated to 37C are added in each well. This medium selects hybridomas and kills myeloma cells that haven't fused.
On day 7, 100 μl of medium are aspirated and replaced with 100 μl of new medium 4. On day 10, the content of positive wells (ELISA test; AMERSHAM kit), is transferred to a 24-well flat-bottom plate in which 1 ml of culture medium 4 are added. On day 13, the secretory hybridomas can be retained by freezing in liquid nitrogen in SVF / 10 ~ DMS0.

II-4 Search for bridomes secreting anti-human A and B antibodies by ELISA test (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay).
(Mouse anti-IG kit, whole antibody linked to horseradish peroxidase, AMERSHAM) Preparation of 96-well flat-bottom plates is performed 24 hours before the test. For this purpose, l00, ul antigen (purified granzymes A or B), at lg / ml (in PBS) are distributed in the wells. The plates are put at 4C for 24 hours.
2 to 5 washes with 200 µl per well of PBS, 0.1%
Tween 20 are performed before testing the supernatants of culture of hybridomas. The plates are incubated for 1 hour at 37 C with 50 µl per well of culture supernatant the hybridoma to be tested.
After 3 washes with PBS, 0.1 ~ Tween 20, 50 ~ 1 secondary antibody (conjugated to peroxidase and diluted 0.25% in PBS, 0.2% Tween 20) are added to each well. Incubation is done at 37C for 30 min.
The plates are again washed 3 times with PBS, 0.1 ~ Tween 20. The revelation is carried out in a ~ outant 100, ul of a solution containing the substrate (10, ul PBS, 3 ~ H2O2 in 12.5 ml of ABTS 180 mg / l).

W092 / 1 ~ ~ t ~ ri t ~ ~ PCT / FR92 / 00240 The plates are read by measuring the OD at 405 nm 15 to 25 min after the addition of the substrate.
After fusion of NSl myeloma cells with splenocytes from mice immunized with granzyme B, by operating as indicated above, the supernatants from 28 GRB-designated hybridomas were found be specific to granzyme B in an ELISA test (test carried out with purified protein).
The same approach followed with granzyme A, has leads to the isolation of 15 hybridomas called GRA secreting antibodies specific for granzyme A, in ELISA test (test made with purified protein).
Percentage of antibody-secreting hybridomas specific is particularly satisfactory, indeed on 300 hybridomas resulting from the fusion between the cells of NS1 myeloma and splenocytes in mice immunized with purified granzyme B, lO ~ secrete antibodies specific in ELISA test. In the case of granzyme A, 5 hybridomas of the second fusion are specific in the same conditions.

II-5 Cloning of hybridomas by limiting dilution.

Hybridomas whose supernatants exhibit the highest positivity in ELISA test are cloned into 96-well flat bottom plates. Several dilutions are tested. Cloning is carried out at 100 cells, 10 cells, 1 cell and 0.25 cells per well at a rate of 100 µl of medium 4 per well.
The cells are fed 3 days after cloning with 100 μl of medium 4, then every 7 days.
When cell growth, checked on microscope inverted, seems important, the culture supernatant of these well is tested in ELISA on the purified granzymes on granzyme A or B and on lyzozyme as a negative control, Positive hybridomas are transferred to 24-well plates then on 6-well plates and by the continuation in bottle to maintain growth .

W092 / 1 ~ PCT / FR92 / 00240 21 ~ 9 ~

exponential of cells. These hybridomas are injected in the peritoneum of mice to produce ascites. They can be left in culture until cell death in order to obtain highly concentrated supernatants studied in Western blot or immunoprecipitation.
Two hybridomas secreting antibodies recognizing granzyme B, called GRB98C and GRB51D respectively and three other strains secreting antibodies recognizing granzyme A, called GRA66D, GRA382E and GRAlOD. The remaining hybridomas will be cloned in order to constitute a panel of antibodies raised against human granzymes A and B.

II-6 Characterization of the antibody isotype cloned Culture supernatant of the hybridoma to be tested is diluted to 1/10 in 20 mM Tris pH 7.6, 137 mM NaCl (TBS).
The kit strip is incubated for 15 min at temperature room with diluted supernatant. After 3 washes in TBS, 0.1% Tween 20 (TBS-T), the strip is incubated in a anti-mouse antibody solution coupled to peroxidase (diluted to l / 5ooe in TBS-T).
The revelation is carried out by incubation of the strip for 15 min at room temperature in 3 ml of a solution containing the substrate (1 tablet of chloro-naphthol dissolved in 10 ml of cold methanol, mixed extemporaneously with 50 ml of TBS containing a drop of hydrogen peroxide). After 3 washes in distilled water, the strips are dried and can be interpreted.
The immunization technique used in this study made it possible to obtain hybridomas secreting IgG isotype antibody. The antibody isotype has been confirmed by the kit marketed by Amersham of antibodies mouse monoclonals. GRB98C monoclonal antibodies, GRA66D, GRA382E and GRAlOD have the IgG1 isotype. The one secreted by the GRB51D hybridoma has the IgG2a isotype. The filtration of culture supernatants from cloned hybridomas W092 / l ~ W ~ t ~ l '3 3 PCT / FR92 / 00 ~ 0 by ELISA test made it possible to determine a titer of the culture supernatant of the GRB98C hybridoma of 1000. Those culture supernatants of hybridomas GRB51D, GRA66D and GRAlOD are 10,000. The title of the culture supernatant of GRA382E hybridoma is 100,000. It should be noted the high values of these titles.

II-7 Determination of the specificity of these antibodies by electro-transfer techniques protein and immuno-revelation (Western blot). We operate as described by Towbin et al., in Proc. Natl. Acad. Sci.
76, 4350-4354, 1979.

Protein (purified antibody: granzymes A or B, or negative control) is incubated in Laemmli buffer at 100C for 10 min (1, ug / gel 12 cm wide), migrates on a denaturing polyacrylamide gel and then is electrotransferred on nitrocellulose filter (BA83, CERA
LABO) in a graphite electrode device (CERA
LABO), in a 39 mM glycine buffer, 48 mM Tris pH 8.3, 0.037 ~ SDS, 20% methanol under a current of 1 mA / cm2 of filters for 1.5 to 2 hours. After transfer, the filter nitrocellulose is colored with culvert red 0.2 ~, and 0.3% trichloroacetic acid to check transfer efficiency, then cut into strips of 0.6 cm wide.
The strips are preincubated in a buffer PBS with 0.2% Tween 20 and 5 ~ skim milk for hour at 4 ~ C. A set of strips, representing different proteins to be tested, are incubated for 1 night at 4C
with hybridoma supernatant diluted 1/10 in buffer PBS containing 0.2% Tween 20 and 5 ~ of skimmed milk. The strips are then washed in PBS buffer containing 0.2% Tween 20 with moderate stirring for 5 x 5 min at laboratory temperature. The strips are incubated with an anti-immunoglobulin antibody mouse coupled with alkaline phosphatase (diluted to l / lOOOe in the PBS buffer above) for 2 hours at W092 / 1 ~ PCT / FR92 / 00240 laboratory temperature. After 5 washes of 5 min in PBS, the strips are balanced in the buffer alkaline phosphatase reaction (100 mM Tris pH 9.5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2) and placed in the presence of the substrate phosphatase (10 ml reaction buffer, 44 ~ l nitro-blue tetrazolium chloride, 33, ul of (5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphatase p-toluidine) for 15 minutes at room temperature. The reaction may be stopped by washing the strips with H2O.
Granzyme B, reduced and denatured, is electrotransferred on a nitrocellulose filter. The nitrocellulose strips are incubated with different antibodies to be tested, then with an antibody an ~ i-mouse conjugated to alkaline phosphatase.
Under these conditions, a band at 31 XD is observed on the strip incubated with the polyclonal serum anti-granzyme B. However, this band is not detected on strips incubated with antibodies anti-granzyme B GRB51D and GRB98C. Controls (strips incubated with the antibody directed against SV 40 T antigen, with anti-granzyme A antibodies GRA66D, GRA382E and GRAlOD) are also negative. The anti-granzyme B antibodies therefore do not recognize the granzyme B under the conditions of this experiment of Western blot.

II-8 Labeling of cells in vitro and immunoprecipitation.

LGLs are cultured (medium: RPMI depleted in methionine, supplemented in 35S methionine: 20 to 50 , uCi / ml and in 1% SHN inactivated) at a rate of 3 to 5 x 105 cells per ml. Marking can be done in a mllieu RPMI depleted in leucine and supplemented by 20 ~ 50 , uC1 / ml of 3H leucine. After a 4 hour incubation at 37C, the cells are washed twice in P ~ S. The nerve cell is taken up in 500 ~ l of RIPA-O, O1 ~ BSA
(B2518, SIGMA), then sonicated for 15 s (microphone . ::, ..... ...

W092 / 1 ~ PCT / FR92 / 00 ~ 0 :., sonicator, power 40 watts, probe 0.3-87, BIOBLOCK).
The incorporation of radioactivity is followed by counting of a fraction precipitated with TCA. The cell extract is aliquoted by 5 x 106 cpm.

- Immunoprecipitation (according to Xress et al., In J.
Virol. 31, 472-483, 1979).

Incubation, for 30 min at 4C with shaking on wheel, cell extract with 60 ~ l of protein A
SepharoseR (PHARMACIA, CL4B SepharoseR) reduces background noise. The sample is then filtered through a fried (porous polyethylene). 10 µl of normal serum mice and 30 µl of protein A SepharoseR are added to the eluate and left for 1 hour at 4C with stirring. This solution is filtered on the same filter. The last step reduction of background noise is achieved thanks to the addition of 30 ~ l of protein A SepharoseR to the filtrate and to a 30 min incubation at 4C with shaking. After filtration, the eluate is incubated for 4 hours at 4 ° C. with shaking, in the presence of 200 μl of culture supernatant to test ; 40 µl protein A SepharoseR and 20 ~ l RIPA-0.01 ~ BSA (B2518, SIGMA). The antigen-antibody complex protein A Sepharose R is filtered, then washed, eluted with 45 μl of Laemmli buffer and boiled for 10 min at 100C.
The samples are deposited on a gel of polyacrylamide (12.5 ~) in the presence of SDS. After migration at 40 mA 200 V, the gel is fixed, treated with EN3HANCE (DUPONT
of NEMOURS) washed in distilled water, dried for 1 hour at 80C and fluorographed on Hyperfilm-MP (AMERSHAM) at -80C.
The results of experiments are reported below immunoprecipitation followed by gel separation acrylamide, performed to check the capacity of anti-granzymes monoclonal antibodies ~ to immunoprecipitate the B-enzymes contained in the LGL granules. In this experiment, we use cell extracts (LGL
or REX) marked with 35S-methionine. Immunoprecipitation is carried out using culture supernatants from W092 / l ~ PCT / FR92 / 00 ~ 0 the 3 ~

hybridomas to be tested. Immunoprecipitated proteins are separated on a denaturing polyacrylamide gel at 12.5 ~.
The autoradiography time is 7 days.
We observe a band at 31 KD corresponding to the migration of LGL cell extract, immunoprecipitate by anti-granzyme B antibodies, GRB51D and GRB98C. This band at 31 KD is also observed for the same extract cell immunoprecipitated by anti-polyclonal serum granzyme B. However, this band is not detected with a negative control. The migration of the extract REX cell (cells that do not express granzymes) immunoprecipitated by the antibodies described above do not reveals no band at this molecular weight. These results show that the GR ~ 51D and GR ~ 98C antibodies recognize well the granzyme B.
For the characterization of anti-granzyme A (GRA66D, GRA382E, GRAlOD), the immunoprecipitations were performed on extracts of LGL and 3X leucine labeled REX cell lines;
indeed the amino acid sequence of granzyme A is low in methionine, but conversely it contains 26 leucines. Immunoprecipitated proteins are separated on a 12.5% denaturing polyacrylamide gel. The weather autoradiography is 1 month. An additional strip low intensity at 32 Kd is observed only with cell extract of LGL immunoprecipitated by the antibody GRA66D, but not by antibodies GRA382E and GRAlOD, nor by an antibody serving as a negative control ~

II-9 Production of ascites One lnJection of 500 ul of tetra-methyl-penta-decane (JANSSEN) is performed intraperitoneally at a sourls BALB / C. We operate as described by Hoogenraad and Wraight, in Methods Enzymol, 121, 375-381, 1986. Ten Days Later, 107 Hybridomas Washed in Serum Physlologlque are lnJectées intra-perltonéal. Mice are punctuated every day. The peritoneal fluid is WO92 / 1 ~ f ~ PCT / RR92 / 00240 centrifuged for 7 min at lS00 rpm at 4C. Ascites collected using a Pasteur pipette is filtered through 0.2 ~ m (NALGENE), then centrifuged at 4C for 30 min at 12000 g to remove lipids and stored at -80C.
s II-10 Purification of antibodies (ImmunoPure IgG Purification kit, PIERCE) The protein A column, stored in 0.02 ~ azide 10 of Na, is washed with S ml of binding buffer. 2 ml ascites, diluted 1/2 in the binding buffer, are deposited on the column. After washing with 15 ml of buffer IgG (immunoglobulins G) are eluted with S
ml of elution buffer. This column is regenerated with 8 15ml 0.1 M citric acid pH 3 and stored in 0.02% azide of Na.
The eluted fractions are desalted on Exocellulose columns with 10 ml of PBS. These columns of desalting are regenerated with lS ml of PBS and stored in 200.02% Na azide. The desalted fractions of IgG are measured by measuring the D0 at 280 nm to determine the concentration of immunoglobulins in each fraction according to the formula: [IgG] in mg / l = D0 at 280 nm / 1.4.

25II-11 Detection of granzymes at LGL level by immunocytochemistry.

LGL were incubated with antibodies recognizing the granzymes A and B, selected by the 30 ELISA test as reported above.
2 x 105 cells per slide are cytocentrifuged for 5 mln at 250 rpm and fixed in acetone for 10 min at 4C. After 2 washes in PBS, 10 μl per slide of the antibody to be tested (diluted 1/2 in PBS, 1 ~ BSA) 35 are ~ outed and left for 1 hour at 37C. The blades 90nt washed 2 times in PBS then 200 μl per slide of anti mouse Ig antibody (diluted 1/50 in PBS, 1% BSA) are a ~ all and left 30 min at 37C. After 2 W092 / l ~ 4 PCT / FR92 / 00240 ~ ln ~

washes in P8S, the revelation is carried out by incubating for 10 min at room temperature with the slide covered per 200 μl of a solution containing the substrate, 1 tablet (10 mg) of 3.3 'diaminobenzidine (SIGMA) dissolved in 10 ml 50 mM Tris pH 7.6, mixed immediately to 100, ul from H22 to 0.3 ~. The slides are washed and the cells are colored with Meyer's Hemalun (MERCK) for 1 min at room temperature. The cells are washed, dehydrated in ethanol baths (70 ~, 90% and 100 ~), passed through toluene and mounted with a drop of mounting resin (BIOLYON).
The analysis is done by light microscopy.
Under these conditions, a brown coloration of the cytoplasm is observed, revealing the fixation of these antibody. No coloring is obtained with a antibody used as negative control. When LGL
are activated overnight in the presence of recombinant IL-2 (250 U / ml), only part of the cell population is colorful. After seven days of culture in the presence of IL2 at same concentration the entire cell population is colorful.

II-12 Detection of granzymes A and B on skin biopsies of patients with GVHD by immunohistochemistry.

During an allogeneic bone marrow transplant in HLA identity, the clinical syndrome of the reaction of graft versus host or GVH is commonly seen. The clinical manifestations of GVH are characterized by skin, intestine and liver. The skin biopsies are considered the best material to establish the diagnosis of GVH thanks histology and immunohistochemistry. Biopsies of 2 patlents (RAP: chronic myelo ~ leukemia (CML); REN:
acute myelo ~ leukemia (AML)) with lesions compatibles with GVH have been studied.

WO92 / 1 ~ PCT / FR92 / 00 ~ 0 . ..........................
~ t Skin biopsies frozen in OCT (Tissue-Tek, MILES), fixed in acetone for 10 min at 4C, are cold cut to 5, um. Tissue sections are saturated with horse serum (Vectastin kit, VECTOR) for 20 min at room temperature. After washing in PBS, 2.5, ug of the antibody to be tested are deposited on the section for ~ 0 min at room temperature. The results are reported of experiments carried out with anti-granzyme antibodies GRA51D and GRA66D. The slides are washed 3 times in PBS then incubated with 50 µl anti mouse Ig antibodies biotinylated (Vectastin kit) for 30 min at temperature room, then with avidin mixed with biotinylated peroxidase (Vectastin kit) for 1 hour at ambient temperature. After 2 washes in P8S, the revelation is effected by incubating for 10 min at temperature ambient the slide covered with 50 ~ 1 of a solution containing the substrate (1 tablet (10 mg) of diaminobenzidine, dissolved in 10 ml of 50 mM Tris pH 7.6, mixed extemporaneously with 100 μl of 0.03% H22). The slides are washed and tissue sections are stained by Meyer's Hemalun for 1 min at room temperature.
The tissue sections are washed, dehydrated in ethanol baths (70%, 90% and 100%), passed through toluene and mounted with a drop of mounting resin.
The analysis is done by light microscopy.
We observe as before ~ _vitro, in the case of LGL, a staining of the lymphocyte cytoplasm lnfiltrating the skin. No coloring is obtained with the control antibody used as a negative control.
In addition, the coloration indicating the fixation of the different anti-granzyme antibodies happen to be located at the level of the lymphocyte infiltrates which have have been characterized in immunohistochemistry by markers lymphocyte differentiation membranes (CD3, CD4, CD8).

WO92 / 1 ~ PCT / FR92 / 00240 ~ g III - Production of ~ recombinant erforin from ~.

S To produce recombinant perfprine from mouse, we use a prokaryotic expression vector pAR3039 which expresses proteins under the control of phage T 7 transcription and translation signals (see Studier et al.,: J. Mol. Biol., 189, 113-130, 1986).
A 1400 bp SmaI-EcoRV fragment is excised from a complete mouse perforin cDNA clone. This segment code for the C-terminal part of mouse perforin mature covering residues 98 to 534 (see figure unique).
The blunt end of the segment is ligated in the BamH1 site of the vector pAR3039 using linkers phosphorylated (5'- CCG GAT CCGG-3 ').
This plasmid is called pAR3039-perf.
We transform bacteria with this plasmid E.co1i DE3 which contain in their genome the gene for T7 polymerase under the control of an inducible promoter IPTG. Corresponding bacteria have been deposited at the CNCM on March 12, 1991 under the number I-1057.
The synthesis of recombinant perforin is induced by IPTG in transformed bacteria.
The recombinant 45 kDa perforin is purified by lysing the bacterial pellet (from 100 ml of culture) with 20 ml of a solution containing 50 mM Tris-HCl, pH
7.5, 0.5 mM EDTA and 10 ~ g / ml lypozyme for 12 hours on ice.
After adding 1.5 ml of 5M NaCl and 1.5 ml from NP-40 to 10%, the lysed bacteria are maintained 20 minutes on ice.
The bacterial DNA is then fragmented by sonlcation and protein inclusion bodies are centrlfuges, 15 minutes at 12,000 t / mln.

W092 ~.? .?. i ~ Ç. ~ PCT / FR92 / 00 ~ 0 ~ g The base is washed three times with a SO mM solution of Tris-HCl, pH 7.5, 0.5 mM EDTA and 300 mM NaCl and dissolved in SDS-PAGE buffer.
The 45 kDa recombinant protein is separated from the majority of bacterial proteins by SDS-PAGE (10 ~
polyacrylamide gel) and electroeluted using the ISC0 protein eluting device.
1 to 2 mg of perforin are routinely obtained recombinant from 100 ml of bacterial culture.

IV - ~ roduction of the anti-monoclonal anti-s perfor; ne CE2.10 1) Preamble of mmunis2tion:

OFA male rats are immunized by the intraperitoneally with 50 ug of recombinant perforin murine (or rMup) then by a second injection, by intraperitoneally, 3 weeks later. 3 days before collect splenocytes (for the production of hybridomas), 50 µg rMuP is injected into the tail vein without before;

2). ~ Roduct; one of hybridoma ~ and selection:

By operating as described by Harlow and Lane in Cold Spring Harbor Laboratory - New-York, 1988, we realize fusion of Sp2 / O-Ag86 myeloma cells producing no no immunoglobulins with rat splenocytes immunized with rMuP. Briefly, the splenocytes are recovered by carefully introducing it into the tissues of the spleen with a needle and a syringe of RPMI medium devoid of serum. The splenocytes are washed with the medium as performed with myeloma cells. 108 splenocytes are then mixed with 107 cells of myeloma in a 50 ml FA ~ CON tube and subjected to centrifugation for 10 minutes ~ 1000 rpm. We eliminate W092 / l ~ PCT / FR92 / 00240 21 ~ r3 ~ 93 ~. ~
3o as much supernatant as possible. The cells are resuspended by gently tapping the walls of the tube and 0.4 ml of polyethylene is added dropwise glycol 1500 hot 50% (w / v) (PEG, Serva, cat. N 33123) while maintaining the tube in a 37C water bath. After adding all the PEG, the tube is maintained at 37C
for 3 min then centrifuged at 800 rpm for 5 min.
Without removing the supernatant, 5 ml of RPMI medium is added devoid of serum (at 37C) in 2 min, then again 5 ml in Once. The cells are centrifuged at 1000 rpm for 5 min. The supernatant is removed and 50 ml are added.
a complete RPMI medium - 5% FCS. Suspension cell is distributed in ten 96-well plates to which monocytes have been added beforehand peritoneal / macrophages (feeder cells) from Balb / c mice (1 to 5 days before). The plates are incubated at 37C in a humidified atmosphere with 5% CO2 for 24 hours, before replacing the medium with a fresh medium cRPMI-5% FCS supplemented with 1% HAT
(Gibco). The cells are left to grow for about 10 days. At this stage, about 70 ~ of the wells have clones that have grown, many of them having more than one clone. About 20 days after fusion, cells in the majority of wells containing hybridomas have reached a density practically maximum and l00, ul of each well are withdrawn for perform an ELISA test on rMuP and perforin native murine. Strongly positive hybridomas are 90us-cloned as described in the article by Harlo ~ of which questlon above and subjected to another operation of selection.

Select1On by test ~ ISA to obtain an antibody 96-well mlcrotitratlon plates (Dynatech, MIC 2000) are covered for approximately 14 hours at 4C with 100 µl rMuP (10 ~ g / ml in PBS). In W092tl ~? ~ PCT / FR92 / 00 ~ 0

3~
variante, les puits sont recouverts de granules dérivés de CTL B6.1 de murin (solubilisés dans 1,5 M de NaCl, ultracentrifugés et dilués à 1/10 dans l'eau) ou de granules de cellules LAK humaines (solubilisés dans du phosphate 0,5 M, ultracentrifugés et dilués à 1/5 dans l'eau). Après lavage des puits à trois reprises avec P~S
0,02 ~ Tween-20, on ajoute 100 ul de surnageant d'hybridomes dans chaque puits en 2 h à température ambiante. Les puits sont lavés comme indiqué plus haut et on ajoute 50 ,ul d'immunoglobulines de chèvre anti-rat conjuguées à de la phosphatase alcaline (Sigma) en 1 heure.
Après le lavage, on ajoute 100 ,ul de substrat de phosphatase (p-nitrophényl phosphate, Sigma 104 tablettes) et on mesure le A40snm dès que la couleur commence à
apparaltre. Les puits témoins négatifs sont incubés avec cRPMI-5 % FCS au lieu d'être incubés avec des surnageants d'hybridomes. On récupère ainsi l'anticorps monoclonal anti-perforine désigné par l'abréviation CE2.10 déposé à la CNCM sous le n I-1058 le 12 mars 1991.
V -en ~ytométrie en flux.

On rapporte ci-après les résultats obtenus en suivant la méthode, légerement modifiée, de Schmid I et al.
Cytometry, 12 : 279-285, 1991.

Matér1el :

Toutes les solutions sont préparées en PBS.

- Paraformaldéhyde Solution mère à 3 ~ (PFA), - Sérum de veau foetal (SVF) flltré a 0,2 ,u, - Tween 20. Solution mere à 2 ~, - Aride NaN3. Solution mere à 200 mM

W092~

211~`19 Techni~ue :

Fixation :
1.106 cellules lavées en PBS sont remises en suspension dans 850 ul de PBS (4C), 150 ,ul de PFA (4C) sont ajoutés et la suspension homogénéisée. Les échantillons sont mis à incuber à 4C pendant 1 heure, puis centrifugés 8 min à 250 g.
p~erm~abili~i~n :
Les cellules fixées sont remises en suspension dans 1 ml Pss 0,2 ~. Tween (900 ,ul PBS + 100 ul de solution mère Tween 2 ~).
Les échantillons sont ensuite mis à incuber pendant 15 min à 37C. On ajoute alors 2 ml d'une solution de lavage 1 (solution de lavage 1 = PBS 2 ~ de SVF, 10 mM
inal de NaN3). La suspension est centrifugée 8 min à 250 t/min.
Le surnageant est re;eté ; les échantillons cellulaires sont ensuite accessibles à l'étude des protélnes intra-granulaires.

Incubation :
anticorps primaire :
De façon à réduire la fixation non spécifique, on aJoute au culot cellulaire 50 ul d'une solution tampon pour anticorps.
On remet en suspension, puis on aJoute 50 ,ul d'antlcorps antiperforine 1/3000 (soit 1/6000 final) et d'anticorps anti-granzyme B 0,25 ,ug.

T~moln~ ut~ c témoin négatif : une immunoglobuline irre~evante de souris, de type IgGl est utilisée sur la suspension cellulaire à étudier.
- Contrôle de perméabilisation : un anticorps anti-cytosquelette, l'antitubuline a, (la tubuline a étant W092/1~ f~ ~ PCT/FR92/00~0 une protéine strictement intra-cellulaire), est testé sur toutes les populations cellulaires.
- Temoin positif cellulaire : cellules LGL en culture, - témoin négatif cellulaire : lignée lymphoïde MOLT 4.
Les échantillons ainsi traités sont incubés 30 min à 4C, puis lavés 2 fois en solution de lavage (2) (solution de lavage (2) = PBS 0,2 ~, Tween 20, 2 ~ SVF, 10 mM NaN3 final). On effectue une centrifugation 8 min à
250 g.

Anticor~s secondaire : 60 ng de GAM sont ajoutés dans 50 ,ul de PBS au culot cellulaire remis en suspension dans 50 ~1 de tampon pour anticorps. On laisse incuber 30 min à 4C, puis on procède à deux lavages en solution (2)~
Anticorps tertiaire : de fa,con à realiser une étude simultanée en cytofluorométrie de l'expression de la perforine et du granzyme B en fonction du phénotype et de l'état fonctionnel des lymphocytes une incubation avec des antlco.ps reconnaissant des antigènes de membrane est réalisee.
On utilise des anticorps . anti CD3, a raison de 0,125 ,ug (2,5 ,ul/test), . anti CD8 ~ raison de 0,03 ,ug (2,5 ,ul/test) et . anti CD25 à raison de 7,5 ,ul/test sous un volume de 50 ,ul PBS.
On a~oute aux cellules 50 ,ul de tampon pour anticorps et 50 ,ul d'anticorps. On laisse incuber 30 min à 3 ~
variant, the wells are covered with granules derived from Murine CTL B6.1 (dissolved in 1.5 M NaCl, ultracentrifuged and diluted 1/10 in water) or granules of human LAK cells (dissolved in 0.5 M phosphate, ultracentrifuged and diluted 1/5 in the water). After washing the wells three times with P ~ S
0.02 ~ Tween-20, 100 μl of supernatant is added hybridomas in each well in 2 h at temperature ambient. The wells are washed as indicated above and 50 μl of anti-rat goat immunoglobulins are added conjugated to alkaline phosphatase (Sigma) in 1 hour.
After washing, 100 μl of substrate of phosphatase (p-nitrophenyl phosphate, Sigma 104 tablets) and we measure the A40snm as soon as the color starts to appear. Negative control wells are incubated with cRPMI-5% FCS instead of being incubated with supernatants hybridomas. The monoclonal antibody is thus recovered anti-perforin designated by the abbreviation CE2.10 deposited at the CNCM under number I-1058 on March 12, 1991.
V -in ~ ytometry in flow.

The results obtained in according to the slightly modified method of Schmid I et al.
Cytometry, 12: 279-285, 1991.

Material:

All solutions are prepared in PBS.

- Paraformaldehyde Stock solution at 3 ~ (PFA), - Fetal calf serum (SVF) filtered at 0.2, u, - Tween 20. Mother solution at 2 ~, - Arid NaN3. Mother solution at 200 mM

W092 ~

211 ~ `19 Techni ~ ue:

Fixation :
1.106 cells washed in PBS are returned to suspension in 850 µl PBS (4C), 150 µl PFA (4C) are added and the suspension homogenized. The samples are incubated at 4C for 1 hour and then centrifuged 8 min at 250 g.
p ~ erm ~ abili ~ i ~ n:
Fixed cells are resuspended in 1 ml Pss 0.2 ~. Tween (900, µl PBS + 100 µl solution mother Tween 2 ~).
The samples are then incubated for 15 min at 37C. 2 ml of a solution are then added wash 1 (wash solution 1 = PBS 2 ~ FCS, 10 mM
inal of NaN3). The suspension is centrifuged for 8 min at 250 rpm.
The supernatant is removed; the samples cells are then accessible for the study of intragranular proteins.

Incubation :
primary antibody:
In order to reduce non-specific fixation, we add to the cell pellet 50 μl of a buffer solution for antibody.
We resuspend, then we add 50, ul 1/3000 antiperforin antibody (i.e. 1/6000 final) and 0.25 µg anti-granzyme B antibody.

T ~ moln ~ ut ~ c negative control: an irreventive immunoglobulin mouse, type IgGl is used on the suspension cell to study.
- Permeabilization check: an antibody anti-cytoskeleton, anti-tubulin a, (tubulin a being W092 / 1 ~ f ~ ~ PCT / FR92 / 00 ~ 0 a strictly intra-cellular protein), is tested on all cell populations.
- Cell positive witness: LGL cells in culture, - cell negative control: lymphoid line MOLT 4.
The samples thus treated are incubated for 30 min.
at 4C, then washed twice in washing solution (2) (washing solution (2) = PBS 0.2 ~, Tween 20, 2 ~ SVF, 10 mM NaN3 final). Centrifugation is carried out 8 min at 250 g.

Secondary anticor ~ s: 60 ng of GAM are added in 50 µl resuspended cell pellet PBS
in 50 ~ 1 of antibody buffer. Incubate 30 min at 4C, then we wash twice in solution (2) ~
Tertiary antibody: in order to con simultaneous cytofluorometry study of the expression of perforin and granzyme B depending on the phenotype and functional status of lymphocytes incubation with antlco.ps recognizing membrane antigens is realized.
We use antibodies . anti CD3, 0.125, ug (2.5, ul / test), . anti CD8 ~ 0.03, ug (2.5, ul / test) and . anti CD25 at 7.5, ul / test in a volume of 50 µl PBS.
We have ~ 50 cells, ul of buffer for antibody and 50 µl of antibody. Incubate 30 min at

4~C, puis on effectue deux lavages à l'aide d'un mélange PBS-azide.
Les cellules alnsi traitées sont remises en suspension en milieu P~S-azide et analysées dans les deux heureg qui sulvent. Si les cellules sont analysées plus tardlvement, elles sont remises en milieu PBS-PFA 1 %.
Cette technique a été utilisée pour comparer l'expression du granzyme B et de la perforine dans des lymphocytes du sang de cordon ombilical avec celle de , W092/1~ PCT/FR92/00~0 21~161 ~.,'~ ,, lymphocytes adultes et évaluer la cytoxicité dans le cas de greffes.

VI - ~plicatio~c clin~ues :
On rapporte ci-après les résultats d'études concernant l'utilisation des anticorps de l'invention dans différentes situations pathologiques telles que :
- les rejets de coeur après transplantation, - les rejets de poumons après transplantation.
Ces deux modèles permettent d'étudier l'activation cytotoxique de cellules qui infiltrent un greffon.
Cette approche permet d'etre étendue à tous les modèles de rejets de greffes quels qu'ils soient. Le matériel utilisé est constitué par des biopsies congelées et des lavages bronchoalvéolaires pour les rejets de poumon.
D'autres modèles impliquant un role des cellules cytotoxiques dans la pathologie elle-meme ou dans la réponse immunitaire générée par cette pathologie ont également été étudiés, à savoir - les tumeurs cutanées, - la réponse cellulaire T dans les lymphomes malins non Hodgkinien.
La technique utilisée dans tous ces modèles est la technique APAAP, en trois couches On suit le protocole suivant :
1 - décongélation des lames gardées au congélateur a température ambiante 15 min, 2 - inscription sur chaque lame au crayon de l'anticorps à tester, 3 - fixation dans un bain d'acétone 10 min à
température ambiante, 4 - séchage 3 - 4 min, 4 ~ C, then two washes are carried out using a mixture PBS-azide.
The treated alnsi cells are returned to suspension in P ~ S-azide medium and analyzed in both heureg qui sulvent. If the cells are analyzed more late, they are returned to PBS-PFA 1% medium.
This technique was used to compare the expression of granzyme B and perforin in umbilical cord blood lymphocytes with that of , W092 / 1 ~ PCT / FR92 / 00 ~ 0 21 ~ 161 ~., '~ ,, adult lymphocytes and assess cytoxicity in the case of transplants.

VI - ~ plicatio ~ c clin ~ ues:
The results of studies are reported below concerning the use of the antibodies of the invention in different pathological situations such as:
- heart rejections after transplantation, - rejection of lungs after transplantation.
These two models are used to study activation cytotoxic of cells that infiltrate a graft.
This approach allows it to be extended to all any transplant rejection models. The material used consists of frozen biopsies and bronchoalveolar washes for discharges of lung.
Other models involving a role of cells cytotoxic in the pathology itself or in the immune response generated by this pathology have also been studied, namely - skin tumors, - the T cell response in lymphomas non-Hodgkin's clever.
The technique used in all these models is the APAAP technique, in three layers We follow the following protocol:
1 - thawing of the blades kept in the freezer at room temperature 15 min, 2 - inscription on each blade in pencil the antibody to be tested, 3 - fixation in an acetone bath 10 min at ambient temperature, 4 - drying 3 - 4 min,

5 - réhydratation 10 min dans du tampon TBS pH
7,6, 30 ~ de SVF, 5 - rehydration 10 min in TBS pH buffer 7,6, 30 ~ SVF,

6 - application d'une première couche et incubation à température ambiante en chambre humide 30 min, W092/]~ tj~ PCT/FR92/00240 3~ 6 - application of a first coat and incubation at room temperature in a humid chamber for 30 min, W092 /] ~ tj ~ PCT / FR92 / 00240 3 ~

7 - rin~ages dans TBS pH 7,6 à deux reprises 5 min, 7 - rinse ~ ages in TBS pH 7.6 twice 5 min,

8 - incubation avec la deuxième couche (anticorps de lapin anti Ig souris), 8 - incubation with the second layer (antibody anti mouse Ig rabbit),

9 - rinçages deux à trois fois en TBS pH 7,6, 9 - rinses two to three times in TBS pH 7.6,

10 - application d'une troisième couche d'anti-corps (complexe P.A. couplé à un anticorps de souris anti P.A. 30 min en chambre humide), 10 - application of a third layer of anti body (PA complex coupled to an anti mouse antibody PA 30 min in humid room),

11 - rinçages deux fois en T.B.S. pH 7,6 puis 10 T.B.SpH 8,2, 11 - rinses twice in TBS pH 7.6 then 10 TBSpH 8.2,

12~ - révélation de la phosphatase alcaline 20 à
30 min dans l'obscurité, 12 ~ - revelation of alkaline phosphatase 20 to 30 min in the dark,

13 - rinça~e, 13 - flushed,

14 - contrecoloration, 14 - counter-coloring,

15 - montage en milieu aqueux.

produits utilises :
* tampon T.B.S. 0,05 M, pH 7,6 solution A TRIS = 60,55 g dans 11 H20 distillée, p~ 7,6 solution B + Nacl = 87,66 dans 11 H20 distillées, pH 7,6 * tampon TBS 0,05 M 5 Solution A 100 ~l + solution B 100 ,ul + 800 ~l ED pH 7,6 * Révélateur : pour 100 ml de Tris 1/ Naphtol ASTR phosphate 20 mg 2/ Dimethylformamide 2 ml 3/ TRIS pH 8,2, 0,01 M 100 ml 4/ Levamisol 2,4 g pour 10 ml d'ED 130 ,ul 5/ Fast Red TR salt 100 mg 6/ Flltration * Antlcorps monoclonaux deuxibme couche: Dako lOg 20 ~, Z 259 80 % dilué dans TBS
7,6 a utili8er 1/20 de Ac2 20 ~ SHN Ab trol8bme couche : A.PAAP D 651 1/50 dilué dans 20 ~ SHN

W092/1~ PCT/FR92/00~0 VII - Expr~ssion du ~ranzyme a humain,recombinant et de la ~erforine humaine recombinante d~ns des hôtes ~actéri~,ns -(T7 POLl.

On opère comme décrit ci-dessus par Studier et al.
dans J. Mol. Biol (1986), 184, P 113-130.

MATERIEL

Plasmide Site amont Fusion Cadre Terminaison aval site de ouvert clonage pAR3038 ~al I ~a_HI(8mères) ATC To ~QRV
pAR3039 ~al I BamHI(10mères) GAT To ~QRV

2 3 ~ 5 6 7 8 9 10 11 Met Al- Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln M-t Gly Arg CAT ATC GCT AGC ATG ACT GGT GGA CAC CAA ATG GGT CGG ATC'C a~ro-C~ilL5~ lO~ere~

M9 + CAA, Trp. Amp milieu M9 milieu plus 2 g/l casaminoacides 3,3 ml de tryptophane à
10 mg/ml -50 mM Trls-Cl (pH 7.5) Stock : 1 M pH7,5 0,5 m EDTA Stock : 0,5 M
10 mg/ml lysozyme fraichement préparé
IPTG dans H20 stérile (stock à 20C, 20 mg/ml = 0,084M, dllué 210 fois) 5 M NaCl 10 ~ NP-40 dans H20 TEN : 50 mM Tris et 0,5 mM EDTA + 300 mM NaCl W092/~ ? ~ PCT/FR92/00~0 ~ 3~
Souche DE3 (E.coli) contenant un chromosome avec le gène de la T7 polymérase soue le controle d'un promoteur inductible par IPTG
(1) Croissance des cellules :
Exemple : E.coli DE3 ; T7 HLP ; à des fins analytiques le volume est réduit de 5 fois.
1. On démarre sur 14 h environ (inoculum) à partir de plaques fraichement préparees (moins de 48 h) de LB-Amp (50 ug/ml) dans M9 + CAA, Trp. Amp~ On prélève pour déposer dans un Erlen de 100 ml. Le volume doit etre de 10 % du volume souhaité pour la culture (il est également possible de faire croître les cellules dans LB).
2. On dilue à 1:10 les cultures dans M9 + Amp.
CAA, trp. On laisse la croissance s'effectuer jusqu'à une mesure de DO~Qn = 0,8 - 0,9 (habituellement 2 à 3 heures) à
37C avec une bonne aeration.
3. On induit le gène de l'ARN polymérase T7 avec IPTG 0,4 mM.
4. On laisse la croissance s'effectuer pendant 3 heures.
5. On récupere les cellules et les conserve sur la glace avant la centrifugation réalisée dans des tubes de 50 ml, a 3500 t/min, 30 min a 4C.
6. Le culot est congelé jusqu'à -20C si nécessaire.
(2) lyse cellulaire et préparation de fractions de proteines insolubles.

1. Pour 50 ul de culture, on remet en suspension (50 mM Tris + HCl (pH 7,5~, 0,5 mM EDTA, et on a;oute 150 ,ul 25 mg/ml de lysozyme (fraichement préparé dans l'eau).
2. On laisse la lyse s'effectuer sur de la glace 30 mln a 2 heures.
3. On a~oute 0,75 ml de NaCl 5M, ce qui doit entrainer la lyse des cellules. On utilise un Vortex puis on a~oute 0,75 ml 10 % NP-40. On réutilise le Vortex. Le mélange est très vlsqueux et conservé sur de la glace 10 a 30 m~n pour obtenir la lyse de toutes les cellules.

W092/1~ PCT/FR92/00~0 '21 0~1 9 4. On applique un traitement de sonication pour casser l'ADN (pulsations de 2 x 10 - 15 sec. jusqu'à
l'obtention d'un milieu liquide).
5. On fait tourner les protéines ppr.
6. On lave le culot deux à trois fois dans TEA
puis on effectue une sonication pour clarifier le milieu si nécessaire.
7. On reprend le culot dans 500 ~ul de tampon SDS.
Pour ~ne extraction cellulaire complète, on remet en suspension 1 ml de culot cellulaire dans environ 200 ,ul de tampon SDS.
On prépare également un témoin sans induction par IPTG ou un plasmide avec un insert dans une mauvaise orientation.
VIII - Granzyme R humain ~combinant . Construction du vecteur pAR - 3038 - GraB

Toutes les techniques de clonage utilisées sont réalisées en opérant selon Maniatis et al. dans Molecular Cloning. A laboratory manual New York ; Cold Spring Harbor, Laboratory Press - Schmidt et al., 1987 /J. Immunol. 139, 250-256.
A partir d'un clone HLP, on isole un insert d'ADN-c complet de granzyme B humain (mobilisation de l'insert avec BamH1). L'ADN-c entier est sous-cloné dans le site BamHl de ml3mp8.
En utilisant la technique de Kunkel (kit ~io-Rad, Kunkel et al. Methods in Enzymology, 1987, 154, 367, 382), on change le nucléotide 116 d'un A en T par mutagénèse in vitro, ce qui entraine un changement dans le site de l'acide aminé du granzyme 3 (de glu en val).
Ce changement de nucléotide génere un nouveau site de restrlction Ball qui permet d'isoler le fragment Ball -BamH1 du clone du granzyme B correspondant aux acides amines de la région 6 à 227, plus une région de nucléotides non tradults (volr les igures 2 et 3).

W092/1~ ~' ~` PCT/FR92/00240 ' `' ' 3~
Par ligation le fragment Ball - BamH1 est introduit dans le vecteur PAR-3038, qui a éte coupé par Nde I et BamHl et déphosphorylé. On utilise un linker synthétique NdeI - Ball qui comprend les 6 premiers résidus du granzyme B pour adapter le site NdeI du vecteur et le site Ball du granzyme B.
Cette construction permet l'expression du granzyme B recombinant dont la séquence diffère de celle du granzyme B humain natif par le fait qu'elle est précédée par Met et que l'acide aminé 6 n'est pas Glu mais Val.

. Fxpression du ~ranzvme B recnm~n~nt Le vecteur d'expression bactérien PAR 3038 utilise le promoteur du bactériophage T7 pour exprimer sélectivement les protéines recombinantes.
Les bactéries DE3 de la souche d'E,coli contenant un gene de la polymérase T7 chromosomale endogène sous le contrôle d'un promoteur inductible par IPTG, sont transformées par le plasmide AR-3038 B.
La synthèse de la protéine recombinante est induite dans les cellules DE3, transfectées avec le plasmide PAR-3038. GraB comme suit :
un inoculum de 14 heures environ, provenant de plaques sur lesquelles ont récemment été appliqués L Broth-50 ,ug/ml d'ampicilline, est dilué au 1/lOeme dans le même milieu. On laisse pousser les cellules 2 a 3 heures jusqu'à
une absorbance A 600 nm de 0,8 a 0,9.
Le gene de la TA polymérase est alors induit pendant 3 heures par addition de 0,4 mM d'IPTG.
Les cellules sont recueillies et la protéine recombinante est isolée de la fraction protéique insoluble.
En bref, le culot cellulaire (de 50 ,ul de culture) est remls en suspension dans 5 ml de Tris Hcl (~0 mM), 0,5 mM d'EDTA, pH 7,5, supplémenté avec 0,75 mg/ml de lysozyme et lalssé sur de la glace pendant deux heures.
On a~oute 750 ~l de NaCl 5 M et 750 ,ul de BP-40 a 10 % sous agitation vigoureuse.

W092/1~ PCT/FR92/00~0 2 ~
On maintient le milieu 30 min sur de la glace, puis on casse les chaines d'ADN bactérien par sonication (trois impulsions de 15 sec) jusqu'a ce que la solution perde sa viscosité et devienne liquide.
Le précipité de protéine est récupéré par centrifugation (6000 g, 30 min, 40C) lavé à trois reprises dans 50 mM de Tris-HCl, 0,5 mM d'EDTA, 300 mM de NaCl, pH
7,5 et dissous dans un tampon SDS-PAGE. La protéine recombinante de 25 kDa est séparée des protéines bactériennes principales par SDS-PAGE et électro-éluées en utilisant le dispositif d'élution de protéines Biorad, en suivant les instructions du constructeur.
A partir de 400 ml de culture bactérienne, on obtient environ 1 a 2 mg de protéine recombinante de manière répétée.
La figure 4 donne la séquence de nucléotides du granzyme B humain et la séquence correspondante d'acides aminés.

IX - ~ :

On utilise un ADNc de perforine humaine tel qu'isolé à partir d'une banque d'ADNc (lambda ZAP-LAK) dans un vecteur pBs/clone 15. Le plasmide renfermant un insert d'ADNc de la perforine humaine est appelé pAR 3039 ~uP. Ce plasmide comporte un gène de résistance à l'ampicilline. Le mode de construction est représenté sur la fi~ure 5.
L'insert d'ADNc Sma/Eco RI comporte 1600 paires de base ;
ce fragment code pour la séquence d'acides aminés allant de la position Arg98 à ~rp534.
La transcription en ARN est induite par IPTG. Pour la construction, pAR 3039 est adapté avec BamHI à SmaI en utilisant comme adaptateur GATCCCCGGG (Pharmacia). Le fragment ~u periorine Sma I (de pSS/clone 15) est soumis à
une étape de ligation. Le cadre ouvert de lecture est contr~lé par séquençage.

WOg2/1~ tl-li PCT/FR92/00~0 - 4~
La figure 6 represente le nucléotide pAR 3039 -HuP et la séquence d'acides aminés déduite de la protéine recombinante. On indique également la séquence du clone 34. 15 - mounting in an aqueous medium.

products used:
* 0.05 M TBS buffer, pH 7.6 solution A TRIS = 60.55 g in 11 H 20 distilled, p ~ 7.6 solution B + Nacl = 87.66 in 11 H20 distilled, pH 7.6 * 0.05 M TBS buffer 5 Solution A 100 ~ l + solution B 100, ul + 800 ~ l ED pH 7.6 * Developer: for 100 ml of Tris 1 / Naphtol ASTR phosphate 20 mg 2 / Dimethylformamide 2 ml 3 / TRIS pH 8.2, 0.01 M 100 ml 4 / Levamisol 2.4 g per 10 ml of ED 130, ul 5 / Fast Red TR salt 100 mg 6 / Flltration * Monoclonal antibodies second layer: Dako lOg 20 ~, Z 259 80% diluted in TBS
7.6 to use 1/20 of Ac2 20 ~ SHN Ab trol8bme layer: A.PAAP D 651 1/50 diluted in 20 ~ SHN

W092 / 1 ~ PCT / FR92 / 00 ~ 0 VII - Expression of human ranzyme a, recombinant and ~ recombinant human erforine from ~ ns hosts ~ acteri ~, ns -(T7 POLl.

The procedure is as described above by Studier et al.
in J. Mol. Biol (1986), 184, P 113-130.

EQUIPMENT

Plasmid Upstream site Fusion Frame Termination downstream open site cloning pAR3038 ~ al I ~ a_HI (8 mothers) ATC To ~ QRV
pAR3039 ~ al I BamHI (10 mothers) GAT To ~ QRV

2 3 ~ 5 6 7 8 9 10 11 Met Al- Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Mt Gly Arg CAT ATC GCT AGC ATG ACT GGT GGA CAC CAA ATG GGT CGG ATC'C a ~ ro-C ~ ilL5 ~ lO ~ ere ~

M9 + CAA, Trp. Middle amp M9 medium plus 2 g / l casamino acids 3.3 ml tryptophan to 10 mg / ml -50 mM Trls-Cl (pH 7.5) Stock: 1 M pH7.5 0.5 m EDTA Stock: 0.5 M
10 mg / ml freshly prepared lysozyme IPTG in sterile H2O (stock at 20C, 20 mg / ml = 0.084M, 210 times) 5 M NaCl 10 ~ NP-40 in H20 TEN: 50 mM Tris and 0.5 mM EDTA + 300 mM NaCl W092 / ~? ~ PCT / FR92 / 00 ~ 0 ~ 3 ~
DE3 strain (E. coli) containing a chromosome with the gene T7 polymerase under the control of an inducible promoter by IPTG
(1) Growth of cells:
Example: E.coli DE3; T7 HLP; for analytical purposes the volume is reduced by 5 times.
1. We start at around 2 p.m. (inoculum) from freshly prepared plates (less than 48 h) of LB-Amp (50 ug / ml) in M9 + CAA, Trp. Amp ~ We take to deposit in a 100 ml Erlenmeyer flask. The volume must be 10% of the desired volume for cultivation (it is also possible to grow cells in LB).
2. The cultures are diluted 1:10 in M9 + Amp.
CAA, trp. Let growth take place until DO measurement ~ Qn = 0.8 - 0.9 (usually 2 to 3 hours) at 37C with good ventilation.
3. The T7 RNA polymerase gene is induced with IPTG 0.4 mM.
4. Let growth take place for 3 hours.
5. The cells are recovered and stored on the ice before centrifugation carried out in tubes of 50 ml, at 3500 rpm, 30 min at 4C.
6. The pellet is frozen up to -20C if necessary.
(2) cell lysis and preparation of fractions of insoluble proteins.

1. For 50 μl of culture, resuspend (50 mM Tris + HCl (pH 7.5 ~, 0.5 mM EDTA, and we have; out 150 , ul 25 mg / ml lysozyme (freshly prepared in water).
2. Let the lysis take place on ice 30 mln at 2 hours.
3. We have ~ 0.75 ml of 5M NaCl, which should cause cell lysis. We use a Vortex then we have ~ all 0.75 ml 10% NP-40. We re-use the Vortex. The mixture is very viscous and stored on ice 10 a 30 min to obtain the lysis of all the cells.

W092 / 1 ~ PCT / FR92 / 00 ~ 0 '21 0 ~ 1 9 4. Sonication treatment is applied to break the DNA (pulses of 2 x 10 - 15 sec. until obtaining a liquid medium).
5. We rotate the ppr proteins.
6. Wash the pellet two to three times in TEA
then we perform a sonication to clarify the environment if necessary.
7. The pellet is taken up in 500 μl of SDS buffer.
For ~ no complete cell extraction, we put back suspended 1 ml cell pellet in approximately 200 μl SDS buffer.
A control is also prepared without induction by IPTG or a plasmid with an insert in a bad orientation.
VIII - Human Granzyme R ~ combining . Construction of the vector pAR - 3038 - GraB

All the cloning techniques used are performed by operating according to Maniatis et al. in Molecular Cloning. A laboratory manual New York; Cold Spring Harbor, Laboratory Press - Schmidt et al., 1987 / J. Immunol. 139, 250-256.
From an HLP clone, a DNA insert is isolated.
c complete with human granzyme B (mobilization of the insert with BamH1). Entire cDNA is subcloned into the site BamHl of ml3mp8.
Using the Kunkel technique (kit ~ io-Rad, Kunkel et al. Methods in Enzymology, 1987, 154, 367, 382), we change nucleotide 116 from A to T by in mutagenesis in vitro, which causes a change in the site of the amino acid of granzyme 3 (from glue to val).
This nucleotide change generates a new site of Ball restrlction which allows to isolate the Ball fragment -BamH1 of the granzyme B clone corresponding to the acids amines from region 6 to 227, plus a region of nucleotides not tradults (see Figures 2 and 3).

W092 / 1 ~ ~ '~ `PCT / FR92 / 00240 '''' 3 ~
By ligation the Ball - BamH1 fragment is introduced into the vector PAR-3038, which was cut by Nde I and BamHI and dephosphorylated. We use a linker synthetic NdeI - Ball which includes the first 6 residues of granzyme B to adapt the NdeI site of the vector and the Granzyme B Ball site This construction allows the expression of the granzyme B recombinant whose sequence differs from that of granzyme B native human by the fact that it is preceded by Met and that amino acid 6 is not Glu but Val.

. Fxpression du ~ ranzvme B recnm ~ n ~ nt The bacterial expression vector PAR 3038 uses the promoter of bacteriophage T7 to express selectively recombinant proteins.
DE3 bacteria from the E, coli strain an endogenous chromosomal T7 polymerase gene under the control of an inducible promoter by IPTG, are transformed by plasmid AR-3038 B.
The synthesis of the recombinant protein is induced in DE3 cells, transfected with plasmid PAR-3038. GraB as follows:
an inoculum of approximately 14 hours, coming from plates to which L Broth has recently been applied-50, ug / ml ampicillin, is diluted 1 / lOeme in the same middle. The cells are allowed to grow for 2 to 3 hours until an absorbance at 600 nm of 0.8 to 0.9.
The TA polymerase gene is then induced for 3 hours by adding 0.4 mM IPTG.
The cells are collected and the protein recombinant is isolated from the insoluble protein fraction.
In short, the cell pellet (50, ul culture) is resuspended in 5 ml Tris Hcl (~ 0 mM), 0.5 mM EDTA, pH 7.5, supplemented with 0.75 mg / ml lysozyme and lalssé on ice for two hours.
We have ~ 750 ~ l of 5 M NaCl and 750, ul of BP-40 a 10% with vigorous stirring.

W092 / 1 ~ PCT / FR92 / 00 ~ 0 2 ~
The medium is maintained for 30 min on ice, then we break the bacterial DNA chains by sonication (three 15 sec pulses) until the solution loses its viscosity and becomes liquid.
The protein precipitate is recovered by centrifugation (6000 g, 30 min, 40C) washed three times in 50 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA, 300 mM NaCl, pH
7.5 and dissolved in SDS-PAGE buffer. Protein 25 kDa recombinant is separated from proteins main bacteria by SDS-PAGE and electroeluted in using the Biorad protein elution device, following the manufacturer's instructions.
From 400 ml of bacterial culture, obtains approximately 1 to 2 mg of recombinant protein from repeatedly.
FIG. 4 gives the nucleotide sequence of the human granzyme B and the corresponding acid sequence amines.

IX - ~:

We use a human perforin cDNA such that isolated from a cDNA library (lambda ZAP-LAK) in a vector pBs / clone 15. The plasmid containing an insert of human perforin cDNA is called pAR 3039 ~ uP. This plasmid contains an ampicillin resistance gene. The method of construction is shown in fi ~ ure 5.
The Sma / Eco RI cDNA insert has 1600 base pairs;
this fragment codes for the amino acid sequence ranging from position Arg98 at ~ rp534.
Transcription into RNA is induced by IPTG. For construction, pAR 3039 is adapted with BamHI to SmaI in using as adapter GATCCCCGGG (Pharmacia). The fragment ~ u periorin Sma I (from pSS / clone 15) is subjected to a ligation step. The open reading frame is contr ~ lé by sequencing.

WOg2 / 1 ~ tl-li PCT / FR92 / 00 ~ 0 - 4 ~
FIG. 6 represents the nucleotide pAR 3039 -HuP and the deduced amino acid sequence of the protein recombinant. The sequence of clone 34 is also indicated.

Claims

1/ Antibodies directed against the constituents of cytoplasmic granules of activated T "helper" cells or cytotoxic cells, especially lymphocytes Cytotoxic T cells and "natural killer" cells, characterized in that they are monoclonal antibodies capable of reacting specifically with an epitope of a given constituent of a human granule, in native or in recombinant form, in particular an epitope of human granzyme or human perforin, in native form or recombinant, giving rise to a compound of the type antigen-antibody.

2 / Antibody according to claim 1, characterized in that the monoclonal antibodies anti-granzymes are anti-granzyme A, B monoclonal antibodies or H humans.

3 / Antibody according to claim 1 or 2, characterized in that they belong to the class of IgG, that they are directed against weight proteins molecular approximately 25–30 kDa (granzyme B), 60 kDa (granzyme A) or approximately 66-75 kDa (perforin).

4 / Antibody according to one of claims 1 to 3, as induced by a process comprising the steps:
- fusion of non-secretory myeloma cells with cells that produce antibodies against a given constituent of cytoplasmic granules of cells cytotoxic or "helper" T cells, in particular antibodies directed against granzymes or perforin.
- selection of hybrid cells capable of produce specific antibodies against said constituents, - cloning of these hybridomas, and - purification of monoclonal antibodies such as produced for example from ascites fluids or of culture media.

5 / Antibody according to claim 4, characterized in that the antibodies produced by the cells used in the fusion step are induced by granule constituents in native form.

6 / Antibody according to claim 4, characterized in that the antibodies produced by the cells used in the fusion step are induced by granule constituents in recombinant form, in particular by a recombinant human granzyme B or a recombinant human perforin.

7/ Monoclonal antibodies characterized in that they are anti-human granzyme B monoclonal antibodies and anti-human granzyme A as secreted by GRB clones 51D and GRA 66D filed with the CNCM under numbers I-1060 and I-1059 on March 12, 1991, or anti-granzyme B antibodies recombinant human or recombinant human anti-perforin as secreted by the clones deposited at the DSM on March 13, 1992.

8/ Hybridoma strains characterized in that they are able to secrete antibodies monoclonals according to any one of the claims previous ones.

9 / strains of hybridomas according to claim 8, characterized in that they are formed of cells hybrids resulting from the fusion of myeloma cells with cells producing specific antibodies after immunization with a given constituent of the pellets cytoplasmic cytotoxic cells, more specifically with purified granzymes or perforin, or recombinant granzymes and perforin.

10/ Clones producing monoclonal antibodies anti-granzyme deposited at the CNCM under the numbers I-1060 and I-1059 on March 12, 1991 and at the DSM on March 13, 1992.

11/ Clone producer of monoclonal antibodies anti-recombinant human perforin filed at the DSM on March 13 1992.

12/ Process for the preparation of a hybridoma according to any one of claims 8 to 11, characterized in that it comprises the steps of melting and selection defined in claim 4.

13 / A method according to claim 12, characterized in that the myeloma cells are cells of NS1 myelon and antibody-producing cells monoclonals are splenocytes.

14/ In vitro detection method of the presence constituents of cytoplasmic granules of T cells "helper" or cytotoxic cells, in particular of granzymes or perforin in a biological sample, characterized in that it comprises:
- contacting the sample from of a patient who may be affected by a disease accompanied by the exocytosis of said constituents, in particular of granzyme or perforin, with a preparation of monoclonal antibody or fragment thereof last, as defined above, under conditions suitable for the production of an antigen-antibodies, and detection of immunological binding.

15/ Kit for the in vitro detection of the presence constituents of cytoplasmic granules of T cells "helper" or cytotoxic cells in particular from granzyme or perforin in a biological sample, characterized in that it comprises:
- a suitable solid phase serving as a support for assay, such as a microtiter plate, - a monoclonal antibody preparation specific or fragment, free or immobilized, such as defined above, - a preparation of said constituents, plus specially granzyme or perforin with the case optionally a labeling group, and, when the preparation does not does not contain a marker group, a preparation of a second antibody with such a group, - a marker-specific detection system, - appropriate buffer solutions for immunological reactions and for reactions of detection.

16/ Application of monoclonal antibodies according to any one of claims 1 to 7 to the detection of the presence of cytoplasmic granule constituents secreted by cytotoxic cells.

17/ Proteins of cytoplasmic granules of T "helper" cells or cytotoxic cells, characterized in that they are recombinant proteins as obtained, by genetic engineering, in hosts cells, in particular bacteria, transformed by introduction of expression vectors, including plasmids, containing gene fragments coding for the desired amino acid sequences.

18/ DNA fragments characterized in that they are consisting of the coding sequence vis-à-vis a protein according to claim 17, or that they comprise such sequence, and that they are, where appropriate, incorporated into a expression vector such as a plasmid.

19/ Expression vectors in particular plasmid containing a DNA fragment according to claim 18, and cell hosts transformed by these vectors.