CA2186758A1 - Utilisation des polymeres protegeant des facteurs de croissance pour le traitement de l'inflammation - Google Patents

Abstract

Utilisation d'au moins un polymère ou un biopolymère, appelés HBGFPP, protégeant spécifiquement les facteurs de croissance des familles des FGF et TGFbêta de la dégradation trypsique et n'inhibant pas de manière significative la coagulation, pour la fabrication d'un médicament pour le traitement des inflammations.

Description

21~675~
wo 95/26738 ~ P~l/r~SS t l~ ~
ut11~sat~on des polymeres protégeant des facteurs de cro1ssdnce pour le traltement de l'lnflammatlon La présente invention a pour ob~et 5 1 'utilisation de polymères ou de biopolymères pour la préparation d ' un médicament pour le traitement de f lammation .
Elle est en outre relative a une composition contenant ces polymères et destinée à un tel 10 traitement.
L' infl tion est une manifestation particulièrement complexe qui s ' installe à la suite d'u~le lésion tissulaire spontanée ou traumatique.
Caractérisée par une modification de la perméabilité
15 capillaire, elle s'accompagne d'une infiltration de composants sanguins, moléculaires et cellulaires, qui se manifeste généralement par des érythèmes et des oedèmes. De n~ ' ~eun médiateurs rhimiq~c sont libérés ou activés pendant ce processus au cours duquel des 20 éléments du sang, en particulier des globules blancs s'accumulent et relarguent différentes activités lytiques. De nombreuses substances sont employées comme agents anti-inf lammatoires . Elles peuvent grossièrement être classées en agents stéroïdiens et 25 non stéroïdiens.
Les facteurs de croissance appartenant à la famille des Heparin Binding Growth Factors (HBGF) sont naturellement relargués dans le cas d'une lésion ou d'u~ traumatisme tissulaire soit directement par ces 30 tissus au niveau de leurs cellules constitutives, à
partir des éléments de la matrice extracellulaire qui représente un site de stockage naturel de ces molécules, soit par les cellules circulantes et en particulier les cellules de l'~nflr -tion. La ~ i Wo 95/26738 ~ 1 ~3 6 7 5 8 2 1 ~ v~
réaction inflammatolre s'accompagne d'une augmentation locale des concentrations en facteurs de croissance dont certalns appartiennent à la famille des HBGF.
Le sucrose sulfate ester et son sel d'aluminium 5 le sucralfate sont des produits décrits et utilisés comme ~gents anti-inflammatoires (Brevet US
N-3,432,489) et dans différentes associations et compositions pharmaceutiques décrites dans une série de brevets (US 4.975.281, 4.885.281, US 5.013.557, US
105.164.379, US 5.196.405, US 5.240.710 et DK 102.488 et DK 505.588).
D ' autres composés ont été décrits comme des agents anti-inf lammatoires: la suramine, c os~nt organique sulphonaté par LAROCCA R et coll. (US
7479817), des compositions contenant des mélanges de bas poids moléculaires de 1 ' héparine par COHEN IR et coll. (WO9219249), des fri~, t.s d'héparine présentant des effets inhibiteurs du système du complément par EKRE H P et coll. (W09202232), des produits dérivant par modifications chimiques de protéines glycosylées par MIYAZAKI K et coll. (EP454898), des protéoglycanes heparane sulfate comme le syndecan par ~ D M et coll. (WO9305167), des oligosaccharides dérivés de dermatanes sulfates par BTANrT~TNT P et coll.
(W09305075).
Une composition contenant en association de l'héparine et du sulodexide, qui est un mélange de polymères comprenant des glycosaminoglycanes (GAG), a d'autre part été étudiée pour son action dans le traitement de traumatismes légers (Dragani et al., 1989, Minerva Medica, 80, n 4, 397-403). Néanmoins ces deux composés n'ont pas été testés séparément.
Il n'est donc pas possible de détPrminPr si 1~ 2186758 wo 95/26738 3 ~ ~ I P~llr~
1 ' un de ces deux composés est responsable de 1 ' activité thérapeutique .
L ' activité d ' un autre mélange de glycosaminoglycanes, le mésoglycan, sur les 5 hémorroïdes a été testée par S2ggioro et al., t 1985, Min. Dlet. e. Gastr, 31, 311-315). Il ressort de cette publication que le mésoglycan est très efficace à
l'encontre des hémorroïdes et permet d'Plim1nPr les symptomes tout en améliorant 1 ' aspect endoscopique .
Néanmoins cette publication est limitée à des polymères d'un type bien particulier, qui de plus présentent une composition d'origine animale mal définie et su~ette à des variations.
La synthèse d'une autre famille de polymères, 15 appelés CMDBS ~Carboxy Méthyl Dextrane Benzylamine Sulfonate) a été décrite dans le brevet PR 2 461 724 ainsi que dans le brevet US 4 740 594. Certains de ces polymères miment 1 ' héparine et peuvent être utilisés en tant que produits de remplacement de 1 ' héparine du 20 plasma, grâce a leurs propriétés anticoagulante et anticomplément .
Parmi 1 ' ensemble des polymbres CMDBS, certains miment une autre propriété de 1 ' héparine qui consiste en une sf Ahi 1 i !'2ation, protection et potentialisation 25 in vitro de l'activité biologique des facteurs de croissance de la famille FGF . (Tardieu et coll, Journal of Cellular Physiology,1992,150 pages 194 à

2 03 ) .
Le brevet FR 2 644 . 066 décrit 1 ' utilisation de 30 certains CMD3S associés aux FGF pour la cicatrisation de la peau et de la cornée. Des expériences ont été
réalisées en provoquant une blessure cutanée à l'aide d ' un emporte pièce de 6 mm de diametre chez le rat .

21~7~8~ --Woss/2673s 4 ~I/rl~ r Dans cet exemple, le CMDBS associé au FGF 2 permet d'obtenir un effet net sur la vitesse et la qualité de la réparation de la peau.
Il ressort donc de l'analyse de l'état de la 5 technique que des polymeres de type CMDBS ont de~ a ete utilisés en association avec des facteurs de croissance sur certaines lésions d ' un type bien précis de tissu, le tissu cutane.
Du fait de l'imprévisibilité des effets 10 thérapeutiques d'une molecule donnée, il n'etait pas evident que ces polymeres, seuls , et non associés a des facteurs de croissance, puissent avoir un effet sur d'autres tissus que ceux de la peau.
En effet, il est bien connu que les differents 15 tissus du corps humain ou animal presentent des specificites tant structurelles que fonctionnelles qui rendent impossible toute prediction quant à l'effet de la molecule, connue pour son ef~et sur 1~
cicatrisation du tissu cutane, sur des tissus de 20 diverses origines soumis a une inflammation.
De même , il est bien connu qu'il est impossible de predire l'activite in vivo d'une molecule sur un tissu particulier à partir de resultats obtenus in vitro sur un modèle experimental 25 specifique.
De manière surprenante, il a ete trouve; selon 1 ' invention, que certains polymeres definis comme appartenant a la classe des EIBGFPP et en particulier des CMDBS avaient un effet sur l'intensite de la 30 réaction inflammatoire qu'ils diminuent de façon tres marquee tout en accelérant les processus de réparation, de régénération et de restauration de tissus lésés. A une augmentation de la vitesse et de 21~67~8 W0 gs/26738 5 P~ l/rl ~ I ~ ~
la qualité de la cicatrisation des lésions des tissus du tractus digestif, des tissus cutanés, des tissus - osseux, les HBGFPP associent des effets anti-inf lammatoires .
Il a en outre été montre que des doses très faibles de ces polymères permettent d'obtenir des e f f ets therapeutiques .
La presente invention a pour objet une utilisation d'au moins un polymère ou d'un 10 biopolymère, appeles HBGFPP, a l'exclusion du mésoglycan, protégeant specifiquement les facteurs de croi ssance des familles des FGF et TGF bêta de la degrad2tion trypsique et n' inhibant pas de manière significative la coagulation, pour la fabrication d'un med$cament pour le traitement des infli ~tions de divers tissus.
Un tel polymère presente particulierement une activité anti-coagulante inférieure à S0 unites internationales par mg de polymère mesurée selon Maillet et al (Mol. Immunol, 1988, 25, 915-923).
Ava~ltageusement, il potentialise les FGF in vitro.
Préferentiellement, il n'actlve substantiellement pas le système du complement, c'est-à-dire qu'il possede une activite anti-complément superieure à 0,5 yg pour le ~H50 (selon ~auzac et al., Biomaterials, 6, 61-63, 1985 ) .
Selon la présente invention on entend par polymères toutes substances naturelles, naturelles modif iées chimiquement ou totalement synthetiques répondant à la definition donnée ci-dessus.
Ainsi il peut s ' agir de :
- polymères obtenus à partir de dextranes mais modifiés par d'autres types de substitutions avec ` !-WO 95/26738 r n5- c d'autres types de radlcaux, - polymères naturels autres que ceux dérivant de dextranes mais comportant des résidus osidiques (cellulose, chitine, fucanes, etc. . . ), - polymères obtenus par polymérisation de es de natures non osidiques (poly acide malique, poly acide oxalique, poly acide lactique, polystyrène, polyéthylène glycol) modifiés ou non.
Avantageusement, ledit polymère ou biopolymère lO est un polysaccharide qui peut etre composé
principalement de résidus glucose.
Il peut aussi ~ dL~: des résidus gll-cos~m~ne et/ou d'acide uronique, particulièrement sous la forme de dimère glucosi~minf~-acide uronique.
Des polysaccharides particulièrement préférés sont des dextranes substitués, des glycos~mi nr~lycanes eventuellement associés à un lipide, un peptide ou un protide ou des sulfates de ces polymères.
Un tel polymère présente avantageusement un poids moléculaire d'au moins 10 kDa et preférentiellement d' environ 40 kDa .
La présente invention est en outre relative à
une composition pharmaceutique contenant ces polymères .
Les polymères et/ou biopolymères peuvent etre selectionnés à partir de substances naturelles qui peuvent ensuite etre éventuellement modifiées par additions de yl~Ju~ ts chimiques appropriés, ou encore etre obtenus entièrement par synthèse . Ces polymères naturels, semi synthétiques ou entièrement synthétiques sont ensuite sélectionnés sur la base de leurs capacités à lnteragir spécifiquement avec plusieurs facteurs de croissance notamment ceux de la 2~ 86758 W0 95/~6738 7 ~ r~SS,.
- famille des FGF et des TGF bêta. Ils peuvent être également sélectionnés pour leurs capacité à protéger - ce ou ces facteurs contre des dégradations protéolytiques, et à agir comme des inhibiteurs 5 d ' activités protéinasiques impliquées dans le processus inflammatoire comme l'élastase leucocytaire, et la plAcmine par exemple, et pour leur activité
anti-coagulante. Ces polymères sont désignés sous le sigle générique de HBGFPP (heparin bLnding growth 10 factor protectors and promotors). Deux prototypes de ces polymeres ou bio polymères sont donnés comme exemples ainsi que les procédés et critères de sélectlon de ces polymères.
Le premier exemple de HBGFPP appartient à la 15 famille de~ CMDBS qui sont des produits connus, à
savoir des dextranes biospécifiques fonctionnalisés, substitués par des résidus carboxyméthyle, benzylamide et benzylamine sulfonate. Ces polymères illustrent 1 ' obtention de HBGFPP à partir de produits naturels 20 (de~trans ) subséquemment chimiquement substitués . Le deu~ième exemple décrit la sélection de produits complètement naturels comme les glycosaminoglycanes sulfates purifiés à partir d'extraits tissulaires.
Ces deux exemples illustrent les capacités de 25 ces HBGFPP à d'interagir, a stabiliser, a protéger et a potentialiser les facteurs de croissances des familles FGF et TGF bêta et leur utilisation dans une composition pharmaceutique permettant le traitement d'lnfl~ -tions de toutes origines.
Les dif férents exemples décrits dans cette invention montrent qu'en plus des effets cicatrisants propres des CMDBS sur différents types de régéneration ou de cicatrisation tissulaire, l'intensité de la t ~
W0 95/26738 2 1 8 6 7 5 8 8 r~llrl ~ t t I ~ --réaction inflammatoire locale est très fortement diminuée .
On entend, dans la présente demande, par traitement toute operation curative ou preventive 5 effectuee pour la prophylaxie ou la resorption d'inflammations faisant intervenir en particulier des activites protéinasiques comme 1 ' élastase leucocytaire, la plasmine, les métalloprotéinases en supplement d'effets stimulateurs de la regénération et 10 de la cicatrisation tissulaire.
Les exemples ci-après illustrent une diminution de 1 ' intensité de la réaction inflammatoire observee dans des tissus léses traites par une fraction efficace de HBGFPP par exemple de CMDBS associé a un 15 ou plusieurs vehicules compatibles et pharmaceutiquement acceptables avec le type de lesion.
La composition ph~ ceutique peut être également associee a des agents comme par exemple des antibacteriens, des antifongiques, des vitamines ou 20 analogues, des antiseptiques, des analgesiques, des agents protecteurs des rayonnements solaires et d'autres agents anti-inflammatoires ou tous autres types de composes associes pour leur effets specifiques et administrée sous toute formes 25 galléniques pharmaceutiques acceptables et compatibles avec le type de traitement envisage.
Avantageusement, une telle composition est conçue pour être directement a~sorbée par voie orale, déposée sur la lésion ou injectée si celle ci est 30 directement accessible notamment dans les lesions sous cutanees, buccales ou rectales ou encore lors des interventions chirurgicales en déposant ou in~ectant les tissus. La dose unitaire est de 10 à 2500 ~g CMDBS

~ 21867~8 Wo 95l26738 9 P~l/r~ S '~ ~ :c [
ou de HBGFPP par ml ou cm2 de tissu à traiter sous un volume adapté à la spécificité de la pathologie. La dose de produit CMDBS ou HaGFP utilisée correspond selon la surface de la plaie a une fraction d'une solution de départ de 10 a 2500 ~lg par millilLtre (ce qui pour une application locale sur des plaies courantes implique une dépose rarement supérieure a que]Lques centaines de microlitres de la solution) cett:e dose étant appliquée une ou deux fois par 24 heures. Les compositions utilisées de sucralfate sont de 0.01 a 5~ (selon le brevet US N- 5 196 405 ) soient des concentrations au moins 10 fois supérieures à celles décrites dans la présente invention et les effets decrits dans tous les exemples de ce brevet US
N-5 196405 sont obtenus à partir de compositions 50 milligrammes par mlllilitre.
Le véhicule peut être du sérum physiologique ou des tampons tels que le PBS contenant NaCl 0.15 molaire ou toute autre sorte de solution comp~tible et non irritante pour le tissu lésé. Des formulations permettant d ' obtenir des solutions pâteuses ou en gel ou en aérosol selon les techniques courantes connues de 1 ' homme de 1 ' art peuvent être proposées selon le typ,e et 1 ' accessibilité de la lésion.
Les 1, ineS d'applications de ces composés correspondent sur un plan thérapeutique ou prophylactique aux pathologies associees aux activités de 1 ' élastase et/ou de la plasmine.
Les principales pathologies associées à une activité de type élastase recouvrent les principaux domaines suivants:
- les lésions cutanées incluant les lèvres, la cavité buccale, la gencive ( les maladies 21~17~8, ~
Wo 95/26738 1 0 parodontales ), les muqueuses par exemple vagLnale et les surfaces anales pour des eruptions superficielles inflammatoires, pruritiques, érythémateuse, l'acne ou les rosacées comme l'infli ~tion de type séborrhée ou 5 pustulaire, les furoncles, les abcès;
- les infections bactériennes, fungiques, virales du revètement cutané comme candida ou herpès, - les dermatites à 1 ' état aigu ou chronique en réponse à différents agents comme les coups de solell 10 ou brûlures superf icielles, - les réactions inflammatoires en réaction à
des corps étrangers comme des pansements, des cathéters et les hémorroïdes;
- les vulvites ou prurits périanaux;
- les pathologies et désordres habituels de la sphère oto-rhino-laryngologigue et pulmonaires comme les sinusites ou les rhinites allergiques, aiguës ou chroniques, les otites, les réactions inflammatoires p..1 ~ res, les oedèmes, les emphysèmes, les 20 fibroses, des réactions secondaires à des bronchites, 1 ' asthme;
- les pathologies oculaires en rapport avec des désordres de l~nfli -tion des produits de beauté
allergisants, les con~onctivltes, kératites ponctuées, 25 les ulcères;
- les maladies liées à des désordres immunologiques ou viraux comme les arthrites et la polyarthrite rhumatoïde, les synovites, la goutte et différentes formes d'inflammation arthritiques, le 30 lupus érythémateux, l'anaphylaxie, les septicémies bactériennes, le SIDA;
- les maladies parasitaires comme la toxoplasmose, le cytomegalovirus, la malaria, la ~ ;~18~758 Wo 95/2Z738 1 1 A ~,l/r~ r polyomélyte, etc.;
- le traitement des ré2ctions infli -toires - des organes comme les glomérulonéphrities par exemple pour le rein, ou celles associées à des procédures 5 chirurgicales supposant ou non 1 ' implantation de matériaux étrangers a 1 ' organisme;
- les pathologies vasculaires avec notamment les anévrismes athéromateux ou celles liées au vieillissement comme celle de type artériocleromateux.
Les principales pathologies associées aux activites de type plA~ n~ Le:COUVL~ t en outre les ,i, - i n~i de la progression tumorale et des complications induites.
L'invention sera illustrée, sans être 15 aucuinement limitée par les exemples qui suivent, dans lesquels:
La iigure 1 L~L~sente la formule du CMiD~3S.
La f igure 2 illustre la potentialisation de l'activite biologique des FGFl (2a) et FGF2 (2b) par 20 l'héparine, le mesoglycan et le sulodexide. La mesure de l'activité ibiologique est effectuée sur des cellules CCL39 par la mesure de 1 ' augmentation de 1 ' incorporation de thymidine tritiée en f onction de la dose de FGFl et de FGF2 ajoutée seule ou en présence 25 de 20 yg d'héparine, de 10 yg de mésoglycan, ou de lOyg de sulodexide.
Les figures 3 et 4 illustrent l'effet protecteur de 1 ' héparine, du mésoglycan et du sulodexide contre une dégradation thermique du FGFl ~ 3 ) 30 et FGF2 ( 4 ) . Les échantillons de FGF sont incubés seuls ou en présence de 20 1~g d'héparine, de 10 11g de mésoglycan ou de 10 llg de sulodexide à 20-C (a) et 37 ~ (b) pendant 1, 7, 15, 30 jours. La mesure de 21867 ~8 WO95/~6738 12 P~ l/rhS~
1 ' activité biologique presentée en abscisse correspond aux valeurs des unites de stimulation (ED50) de 1 ' in~orporation de thymidlne tritiee dans des cellules CCL3 9 .
La figure 5a illustre l'effet protecteur de 1 ' héparine, du mesoglycan et du sulodexide contre une dégradation protéolytique du 125I-FGFl. La digestion protéolytique a été effectuée a~ 37-C et les echantillons ont été séparés par électrophorese sur gel de polyacrylamide à 18~ . Les gels sont séchés et autoradiographiés. La premiere piste contient le 125I-FGFl seul, dans la deuxième (piste 2) le 125I-FGFl est incubé en présence de trypsine et d'héparine (piste

3), de mesoglycan (piste 4) ou de sulodexide (piste 5) La figure 5b illustre l'efet protecteur de l'héparine, du mésoglycan et du sulodexide contre une dégradation protéolytique du 125I-FGF2. La disposition des pistes est identique à celle présentée pour le 125I_FGFl en 5a-Les figures 6A et 6B sont des profils d'élution sur colonne de DEAE-~risacryl respectivement des fractions HSM (Fig.6A) et HSS (Fig.6B), en présence de fractions chondroïtines sulfates (CSA) pour le calibrage de la colonne.
Les figures 7A et 7B représentent respectivement des tissus osseux présentant une inflammation traitée par un pansement de collagène imbibé de sérum physiologique (7A), et le meme pansement imbibé de CMDBS (78).
Les f igures 8A a 8C d ' une part et 8D à 8F
d'autre part représentent respectivement des coupes de plaies cutanées traitées avec du collagène imbibé de 21867~8 ~
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CMD3S et du collagène imbibé d ' une solution phyl3iologique .
- La figure 9 illustre l'expression de met2110-pro~éinases à J = 5 (pistes 1 à 11) et J = 6 (pistes 12 à 17) dans des tissus sains (pistes 1 et 12), des tis.sus cicatriciels traités par le CMDBS ( pistes 2 a

4 et 13 à 15 ), et des tissus cicatriciels traités par de la solution physiologique (pistes 5 à 11, 16 et 17) .
EXEMPLE 1: PréParation et sélection des CMDBS
a ) Préparation des CMDBS
Les CMDBS sont des dextranes substitués par des U,lUI~p. Ls caLl,o,.y ~hyl, benzylamide et benzylamide sulfonate. La méthode de synthèse des CMDBS peut etre 15 celle décrite par M.MAUZAC et J.J~ UV1CZ dans Biomaterials 1984, 5, 301-304 .
Selon ce procédé, le carboxyl méthyle dextrane ( CMD ) est préparé à partir de dextrane par sub~titution de quelques unités glycosylées avec des gro~pes carboxyliques sur le carbone en position 5 ou 6.
Dans une deuxième étape, la benzylamide est couplée aux groupes carboxyliques pour former le carboxymétllyl-benzylamide dextrane ( ou CMBD ) . Enf in 25 quelques noyaux aromatiques du benzylamide sont sulfonés pour aboutir au calLo~y thyle dextrane benzylamide sulfonate ou CMDBS.
Les sels de sodium de ces dérivés sont ultrafiltrés, lyophilisés et dissous dans le tampon 30 approprié avant utilisation.
La formule génerale des CMDBS est representee sur la figure 1.
Les CMDBS possèdent une distribution 21867~i8:
Wo 95/26738 ; ~ r~
statisti~ue des differents substituants. Les poul~e~Lages pour chaque type de CMDBS sont detPrn in~5 par les méthodes classiques.
b) Sélection des CMDBS
i:Tests de Protection et de stabilisation des FGFs Lors de la synthèse des CMDBS il est possible de contrôler le taux de substitution de chacun des ~lUUl_ -ts par modification des conditions de la réaction de substitution. Le contrôle des paramètres comme la température, le temps de réaction, les concentrations relatives des constituants et le nombre de réaction de substitution etc . . permettent d ' obtenir un très grand nombre de polymères substitués. La substitution des hydroxyles par le carboxymethyl sur les carbones en position 5 et 6 permet d'obtenir des taux de carboxyméthylation allant de 0 à 200$ ( 10096 pour chacun des r~rhonr~c en position 5 et 6 ) . Le groupement cal~ohy Lhyl peut être a son tour partiellement ou totalement utilisé pour la fixation de la benzylamide. Les groupes benzylamides peuvent être partiellement ou totalement utilisés pour la sulfonation. Les dextranes substitués fonctionnalisés utilisés selon 1 ' invention sont parmi ceux speci~1~ t décrits dans le brevet français n-2.461.724. Outre la capacité à stabiliser et protéger les facteurs de croissance de la famille FGF
comme décrit dans la publication de Tardieu et coll J.Cell.Physio.1992 150 p 194 à 203; et dans le brevet Français N-2.461.724; le CMDBS selectionné doit pouvoir interagir avec au moins un membre de la famille des facteurs de croissance de la famille TGF
bêta selon une méthode d ' évaluation décrite ci-dessous et protéger les TGF bêta contre une protéolyse.

218~7~8 ~ .
WO 9512673~ 15 P~I/rn75'~
Evaluation des caDacités d ' inter~ctions entre CND3S et les f acteurs de croissance de la ~amille TGF
bêta.
Afin de mesurer la capacité de certains CMDBS à

5 interagir avec les membres de la ~amille TGF bêta et de par cette interaction ~ proteger les TGF bêta, un test de criblage a ete établi. Ce test consiste à
mesurer la capacité du CMDBS sélectionné à permettre au TGP bêta de garder son activité biologique malgré
10 un traitement protéasique.
Dans 1 ' exemple ci dessous le CNDBS utilisé est le lot 26.2 défini par un taux de substitution de 11096 de motifs carboxyméthyles, 3,6~ de motifs benzylamides et 36,5% de motifs sulfonates et possède une activité
15 anti coagulante de 4 UI/mg (Unités Internationales).
L ' activité anti-complément de ce lot est de 1,1 yg de Cl;50, mesurée selon Mauzac et al tprécédemment cités).
L'héparine utilisée comme témoin provient des établissements Sanofi. ( Institut Choay) et présente une 20 activité anticoagulante de 175 UI~mg Le TFG bêta 1 est préparé à partir de plaquettes sanguines I - i nPc selon le protocole décrit dans de nl ' t:uses publications et CUUL L
utilisés p2r l'homme de l'art, par exemple dans la 25 publication Growth Factors and their Receptors 1992, vol. 1 PP 419-472 par A. Roberts et N.Sporn édité par A. Roberts et N. Sporn et publiée par Springer Yerlag Berlin. Le test d'activité biologique du TGF bêta utilisé dans cet exemple est celui de 1 ' inhibition de 30 croissance des cellules CCL64 (provenant de l'Amerlcan Tissue Culture Collection). Cette inhibition est mesurée par la capacité du TGF b à inhiber 1 ' incorporation de Thymidine tritiée d ' une manière 218675~
W0 95126738 1 6 , ~
dose dépendante dans ces cellules CCL64 stimulées par le facteur de croissance FGF ou par du sérum de veau foetal selon le protocole décrit par Van Zolen dans Progress in Growth Factor Resarch, l990 ,2 p. 131 à
5 152 . Le TGF beta est utilisé a deux doses, l ' une correspondant à la capacité d'inhibition de 5096 de 1 ' incorporation de Thymidine tritiée (définie comme 1 ' unité d ' activité inhibitrice ) 1 ' autre, correspondant ~ la capacité d'inhibition de 100%. Dans cet exemple lO les valeurs obtenues sont de 250 pg de TGF b8ta pour obtenir l ' unité d ' activité d ' inhibition sur les cellules CCL64 cultivées dans l ml de milieu de culture. Le lO0~ d'inhibition est obtenu avec lng de TGF beta dans l ml de milieu de culture.
Un échantillon de 50ng de TGF bata dans du tampon phosphate salin contenant 0.1% de serum ~lhllmin~ bovine (provenant de la société SIGMA à Saint Louis USA) est incubé seul, ou associé soit a 5000 ug de C~DBS, soit à 5000 yg d'héparine, avec ou sans 500 20 yg de trypsine. Le volume final de la solution incubée est a~usté à 1 ml et l'incubation est effectuée à 37-C
durant un temps variable ( 10 minutes dans l ' exemple décrit tableau 1 ) .
Des échantillons d'un volume de 20 yl de 25 chacune des réactions d ' incubation sont prélevés et a~outés aux cellules CCL64 cultivées dans des plateaux de 24 puits contenant chacuns un millilitre de milieu de culture selon le protocole décrit par E . Zohlen mentionné ci dessus. Dans ces conditions la 30 concentration finale de TGF bata par puits est de lng/ml. La tableau 1 résume les résultats obtenus dans diverses conditions et montre l'effet protecteur du CMDBS. Ainsi apres lO mn d'incubation a 37-C, 7S% de ~ 21867~8 W095/26738 17 ~ r~S,'~:~[[
1 ' activité biologique du TGF bêta est encore présente, alors que 1 ' héparine qui pourtant peut se f ixer au TGF
- bêta (Mac Caffrey et al., J. of Cell Physiology, 1992, vol.52, 430-440) ne protege pas le TGF bêta contre 5 cette degradation protéolytique ( il reste moins de 20%
d~activité biologique). Il est à rappeler que dans le cas des FGFs 1 ' héparine assure une protection contre la protéolyse induite par la trypsine. (Tardieu et al., Journal of C~ Ar Physiology, 1992, 150: 194-203 ) .
Il a été vérifié que le CMDBS n'avait pas de pouvoir inhibiteur sur 1 ' activité de la trypsine ~ta~leAU 2). Ainsi,10 yg de trypsine ont été incubés soit avec un substrat ( S . 87 fourni par la societé
Serbio, Paris et utilisé selon les Lec -n~Ations de ce fournisseur) ou soit avec ce substrat et un Lnhibiteur de la trypsine tel celui provenant du so~a ( comme le Soyabean trypsin inhibitor ou STI de chez Sigma) ces incubations étant faites en l'absence ou en présence de quantités variables de C~DBS ( lot AM26 ) .
L ' activité enzymatique de la trypsine a été mesurée par absorption spectrophotométrique du produit de transformation du S 87 en fonction du temps d ' incubation .
ExemPle 2: Sélection d ' autres HBGFPP
Une préparation commerciale de protéoglycosa-minoglycane et glycosaminoglycanes, le sulodexide a été sélectionnee selon sa capacité a interagir avec les facteurs de croissance de la famille des FGF ainsi qu ' avec ceux de la famille des TGF bêta .
Des préparations d'héparane sulfate obtenues par fractionnement du mésoglycan et du sulodexide ont d ' autre part été testees .
Le mésoglycan et le sulodexide ont été fournis rj 7 `
Wo 95/26738 ~ 1 ~ 6 7 ~; 8 18 1 ~, l /r r~
par la Société Sigma Chemical Co, Saint Louis MO USA.
Leurs propriétés sont résumées dans le tableau 3.
Les cellules utilisées dans cet exemple sont les cellules CCL39 qui proviennent de 1 ' American Tissue Culture Collection. Les conditions de culture et de tests de mesure d ' activité biologique des FGFs sont les mêmes que celles décrltes dans la publication Tardieu et coll J.Cell.Physiol. 1992. Les facteurs de croissance FGF utilisés sont les formes recombinantes FGFl et FGF 2.
a) Effet du sulodexide sur l'activité biolQgique des FGFs in vitro. _ Dans ces expériences le FGF1 ou 2 est utilisé a une dose ~oLla_,~ondant à la dose F~ffir~rf~ (notée ED50) pour induire une stimulation de 1 ' activité biologique de 50% de la dose n~7~ Ant la stimulatlon maximale .
L ' activité biologique est mesurée par la capacité
d ' induire une augmentation de 1 ' incorporation de thymidlne tritiée dans les cellules selon les protocoles largement décrits dans de nombreuses publications dont celle de Tardieu et coll mentionnée précedemment et également dans le brevet français N' 2 644 066.
Dans cet exemple 1 ' ED50 est de 5 ng/ml pour le FGF1 et de 3 ng/ml pour le FGF 2, valeurs mesurées experimentalement (Figs.2a et 2b). La même expérience de stimulation en fonction de la dose de FGF est effectuée en présence de 10 llg/ml de Sulodexide ou 20 ug/ml d "léparine . La f igure 2 montre que dans ces conditions l'ED50 devient 0.4 ng/ml et 0.2 ng/ml respectivement pour les FGFl et FGF2 en présence de ces doses de Sulodexide ou d ' Héparine . Outre cette capacité à potentialiser 1 ' activité biologique des ~86758 , .
WO95/26738 19 ` I_I/r~5~. I r FGFs les HBGFPP protègent les FGFs contre les dégradations thermiques alnsi que contre - 1 ' inactivation induite par 1 ' action protéolytique de la trypsine. (Figs.4 et 5) . De la meme manière ces HBGFPP protègent FGF1 et 2 contre une inactivation induite par 1 ' actLvité proteolytique de la trypsine (Figs.5a et 5b).
b) Effets ~rotecteurs du sulodexine, du dextrane. du dextrane sulfate et de la sucrase vis-à-vis des TGFbeta.
Plusieurs autres composés ont ete evalues: le dextrane sulfate (Sigma Chemical, de poids moléculaire 40.000, le dextrane ayant servi à la synthèse du CMDBS
( egalement de chez Signa ) de la sucrase ou sucrose octasulfate ( fournie par D. Bar Shalom, societé BUKH
MED]:C, au Danemark). Certains de ces conposes ont éte cho~isis car ils protègent et stabilisent les FGF tels que la sucrase se confère au brevet US N 5202311 ou le dextrane sulfate se confère au brevet japonais n-138 907/88 ) . Le dextrane est celui qui a servi a la synt;hèse du CMDBS AM26.
L ' experience de protection de 1 ' activite biologique des TGFbêta a eté realisée de la meme manière qu ' avec les CMDBS ainsi que decrit dans l'e~cemple 1 ii. Le melange d'incubation contient 50 ng de TGF beta (dans 0.1 ~ d'Alh~lminp serique de bovin) et de la trypsine (500 yg). Le Mesoglycan ou le Sulodexide ou le dextran sulfate ou le dextran ou la sucrase sont utilisés à la dose de 5000 ~g.
L ' activité biologique du TGFbeta est mesurée comme décrit ci-dessus après une dilution de 50 fois et en utilisant des cellules CCL64.
Les résultats sont présentés dans le tableau 4.

2186~8 ~
W095l26738 20 r~l,rl~5s~
Ces résultats illustrent que, comme certains CMDBS capables de répondre aux deux criteres de selection vis-a-vis des FGF et TGFbeta, le sulodexide presente une activité protectrice significative pour 5 les TGFbeta.
c) Isolement de la f~action HeParane Sulfate du Sulodexide et du Méso~lycan Le Sulodexide et le Mésoglycan correspondent à
des mélanges de plusieurs substances dont 1 ' essentiel 10 est constitue de différents glycosAm~noglycanes (GAG).
Par une premiere ét~pe de purification, il a été etabli qu ' un gramme de produit sec de chacun de ces deux produits contenait respectivement 874 mg pour le mesoglycan et 795 mg pour le sulodexide de GAG
15 totaux.
Cette puri~ication a éte obtenue en soumettant ces produits solubilisés a une chromatographie echangeuse d'ions (DEAE - Trisacryl) pour enlever tous les contaminants proteiques. Les GAG totaux ont alors 20 été purifiés en eluant le gel de DEAE avec une solution d'acetate de sodium, pH 4, contenant 1,5 M
NaCl .
Après une phase de dialyse extensive contre de l'eau, 60 mg de chaque produit de GAG ont ete digeres 25 par la chondroïtinase ABC pendant une nuit à 37-C ( 1 unite par mg de GAG). Cette enzyme degrade tous les GAG à l'exclusion des héparanes sulfates (HS). Les produits de digestion ont éte soumis à une chromatographie sur tamis moleculaire (G50 Sephadex, 30 colonne de 1,8 x 95 cm). L'élution est ensuite réalisee en tampon bicarbonate d'ammonium sous un débit de 18 ml/h. Le matériel non digéré qui correspond à des GAG de nature HS est collecté dans le ~ -~18~S8 W095/26738 21 I_l/r~
volu--e mort d ' elution de la colonne .
Les concentrations en GAG sont calculées à
- partir de leur contenu en acide uronique par la methode au carbazole (Bitter T. et Muir H.M., 1962, Anal. Biochem 4, 330-334).
Ces dosages ont permis de préciser la composition suivante de chacun des produits:
Sulodexide Mésoglycan GAG totaux 79 ~ 87 %
Fraction Héparane Sulfate (HS) 48 % 52 %
Autres GAG 31 % 35 %
Les fractLons HS de chacun de ces deux produits ont été chromatographiées à nouveau sur un gel de DEAE
Trisacryl. 1 mg de chaque fraction HS, purifiée à
partir du mésoglycan ~Fig. 6A) ou du sulodexide ( Fig.
6B), dans 3 ml a ete deposé sur une colonne équilibrée avec du tampon 0,05 M NaCI, 0,05 M TMS-Hel pH 7,5.
Après un lavage de la colonne par 10 volumes du meme tampon suivi d'un lavage par 10 volumes d'un tampon 0,05 M NaCl, 0,05 M d'acétate de sodium pH 4, le matériel fixé à la colonne est désorbé par un gradient salin allant de 0,05 M NaCl à 1,5 M NaCl dans le meme tampon acétate. 1 ml de chaque fraction collectée a éte dose par la methode au carbazole.
Le matériel correspondant aux constituants HS
de chacun des produits d ' origine présente approximativement le meme profil d'élution et donc à
peu près la meme charge apparente. Ce maximum du pic d ' élution est obtenu pour une concentration saline de 0, 94 M NaCl . Une fraction définie de chondroïtine sulfate (CSA) a eté soumise au meme protocole en vue de calibrer la chromatographie. Cette fraction CSA qui ne contient qu'un groupe sulfate par disaccharide est W0 95/26738 218 6 7; 9 r~

élué à la force ionique de 0, 72 M NaCl .
Ces résultats montrent que la fraction HS
contient plus de yluu~ --ts sulfates que les CSA de référence. La fraction HS présente environ deux 5 groupes sulfates par unité ~ sArhAridique.
Ces fractions ont été testées pour connaître leur pouvoir protecteur vis-à-vis du TGF ~ et du FGF
en comparaison des pouvoirs établis avec les produits bruts respectifs.
Evaluation semi-auantitative de~ eifets ProteCteurS du FGF par dii'férents pol~mères.
Comme décrit ci-dessus, une quantité constante de FGF radioactif est incubée dans des conditions différentes. Après autoradiographie des produits de la réaction, la quantité de FGF radioactif non dégradé
est quantifiée par densitométrie. Les valeurs C UL~ c:a~ondent au pourcentage de FGF radiomarque retrouve par rapport à la quantite deposee en début de réaction. (~ableau 5).
Les résultats des tableaux 4 et 5 montrent que les fractions HSM et HSS issues respectivement du mésoglycan et du sulodexide presentent des effets protecteurs supérieurs à ces deux compositions et proches de 10096.
EXEMPLE 3: Effets inhibiteu~s in vitro des CMD9S et des alYcosaminoal~canes sur 1 ' activité de l ' élastase leucoc~rtaire et sur la plasmine.
Les pouvoirs d' inhibition de différents CMDBS
et de leurs composes intPrmPrl;Aires de leur synthèse, ont été etablis pour l ' elastase leucocytaire et la plasmine .
L'élastase leucocytaire purifiée a éte obtenue par Elastin Products Co (Owenville, MO, USA) et la 218~758 W09S/26738 23 P~l~rl~9s~
plasmine chez SIGMA.
L'inhibition des activités enzymatiques par ces - différents composés est effectuée à 37-C dans un bain th~ Laté. Les enzymes considerées sont mises en solution dans un tampon Tris-HCL 100 mM, pH8 pour l'élastase et pH 7,4 pour la rl~cminP, en présence de 0,02% d'azide de sodium et de 0,01~ Triton Xl00 pour la plasmine. Les concentrations des substrats et celles des enzymes.sont: 0,10 mM MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA (paranitroanilide) pour l'élastase à 8,3 nM et 0,20 mM dVal-Leu-dLys-pNA pour la plasmine à 77 nM.
Pour chacune des conditions est établi l ' IC50 .
Le tableau 6 donne les resultats obtenus dans lesquels, le lot AM6 ~o.- ~a~ond à un dextrane T40 de 40 000 kD. Le lot EN5 correspond à un dextrane T10 de 10 000 kD . Les produits int~ i res de synthèse sont repertoriés d'apras les sigles designés ci-dessus indexés d ' un numéro qui précise le nombre de chacune des réactions de substitution.
Les valeurs des IC50 démontrent que les CMDBS
ont des effets inhibiteurs de type hyperbolique non competitif sur l'activité de l'élastase leucocytaire comparables à ceux de l'heparine, l'un des meilleurs inhibiteurs de cette activite (Ki de l'ordre de 1 nM).
Les CMDBS exercent de plus et à l ' inverse de l'héparine des effets inhibiteurs sur la plasmine.
Il ressort en outre du tableau 6 que les effets inhibiteurs des fractions HSM et HSS sont supérieurs à
ceux du mésoglycan et du sulodexide, respectivement.
EXEMPLE 4: Effet anti-inflammatoire des CMDBS dans le tissu osseux.
Afin d'étudier l'effet anti-inflammatoire des CMD13S dans le tissu osseux on a utilisé un modele de 218'~7~'''` --W095/26738 24 ~I/r~5, " 1 régeneration de l ' os calvaria chez le lapin . Après avoir effectué une découpe de cet os dans sa demi epAicsellr on a comparé la réaction inflammatoire dans le tissu de granulation en présence ou en absence de 5 CMDBS.
Des lapins adultes blancs de la race New Zealand ayant f ini leur crn i CsAn~-e osseuse et pesant 3 à 4 kg sont repartis en 2 groupes de 8 lapins des deux sexes . Ces lapins ont eté anesthesies par 10 in~ection intrapéritonéale d'hydrochloride kétamine (100 mg/kg) et d'a- ~pL, -7in-~ (100 mg/kg) . Une incision paL -S-iAn~ fronto-parietale a été réalisée pour accéder à la calvaria. Quatre defauts osseux de 5 mm de diamètres et 3 mm de profondeur ont éte réalises 15 à l'aide d'une fraise . Durant l'intervention, le coté
opéré a été constamment irrigue pour éviter des accidents thermiques. Les deux régions céphaliques n ' ont pas été comblees et de ce f ait, servent de controle alors que les cotes posterieurs gauche et 20 droit sont combles avec du collagène (collagène hémostatique microfllaire (Pangen) provenant des laboratoires Fournier Di~on, France) ou du collagene imprégné la nuit dans une solution de CMDBS à 100 ~Ig~ml. Une hemostase appropriée a été réalisée avant 25 de proceder à la suture de la plaie. Les plaies sont refermées avec du fil en nylon de suture et le coté
operé est recouvert d'un pansement sterile. Les animaux ont éte laissés en convalescence et aucune complication post-operatoire n'a eté constatee. Les 30 animaux ont été euthanasiés aux jours 3, 4, 8 et durant les 12 semaines qui ont suivi l ' intervention.
Tous les animaux ont reçu un traitement identique et ont servi pour leur propre contrôle. Après examen ~1 8~.~5~8..
.. ,.; .
WQ 95l26738 25 ~I/r~
macroscopique du site de l ' operation, les crânes sont décalcifiés et inclus dans de la paraffine. Le coté
opéré a été étudié au microscope pour etre mLs en culture. Après que les modeles soient décalclfiés et 5 posés dans de la paraffine, des sections sagittales (5 mm d'épaisseur) des zones correspondants aux défauts ainsi créés ont été découpées a l'aide d'un microtome et colorées a l'hématoxylin et à l'éosine. Ces coupes sont étudiées au microscope et les défauts ont été
100 fois grossis, en utilisant une grille de 2,5 x 2.5 mm normalisée par 10 divisions de 0,25 mm de chaque coté. Ces mesures ont été ensuite rapportées sur un graphique pour comparer les résultats suivant les différents groupes traités.
Dans ce travail, on a utilisé le CMDBS , lot AM26, dont le contenu en acide méthylcarboxylique est de 110 %, celui en benzylamide de 2, 5 % et en benzylamide sulfoné de 36,5% . L'activité anti-coagulante spécifique de ce CMDBS est 4 IU/mg 20 comparé a l'heparine standard (echantLllon n 108, Sanofi-Choay Recherches, GentLlly, France) qui a une activité anticoagulante de 173 IU/mg.
Les figures 7A et 7B montrent la différence de la réaction inf lammatoire observée apres 3 semaines 25 dans le tissu de granulation correspondant au comblement du défaut osseux réalisé expérimentalement.
Dans la figure 7A qui correspond au pansement de collagene imbibé uniquement de sérum physiologique, la réaction inflammatoire est très forte; le tissu de 30 granulation contient un grand nombre de cellules inf lammatoires et peu de cellules ostéoblastiques Par contre, le meme traitement avec un collagene imbibé de la solution de CMDBS a fait 2~6758 Wo 95/26738 : 2 6 r _ 1 /r ~ S.'t ~: ~ ~
régresser très nettement cette réaction lnflammatoire, favorisant la réparation du défaut osseux et démontrant ainsi l'effet anti infli -toire du CNDBS.
FXFMPLE 5: Effet anti-inflammatoire du CMDBS sur la 5 muqueuse ~astriaue.
princiDe L'administration par voie orale d'l ml d ' éthanol absolu chez le rat provoque dans 1 ' heure qui suit 1 ' apparition de lésions hémorragiques de la 10 muqueuse gastrique.
Méthodes Des groupes de 6 rats mâles Sprague Dawley, d'environ 200g, sont mis en ~eûne hydrique 24H avant 1 ' essai . Le jour du test, 1 ml est administré par voie 15 orale et les animaux sont sacrifiés 1 h 30 après.
L'estomac est préleve, ouvert selon la grande courbure et rincé.
L ' atteinte de la muqueuse est côtee selon le barème suivant.
20 0: muqueuse normale 1: petites stries roses hémorragiques superficielles 2: stries hémorragiques superficielles rouges, courtes et larges 4: stries hémorragiques superficielles rouges-noires, 25 longues et larges 5: perforation Trai tement: _ _ Le CMDBS a été dissous dans l'eau distillée, la PGE2 dans l'éthanol à 10~ puis dilué dans le soluté
30 physiologique. Les traitements sont effectués par voie orale, 1 heure avant 1 ' éthanol et 45 mn après sous un volume de 5ml/kg.
Expression des résultats _ _ ~18~75g ~
W095~26738 27 P~llrh~S,~[~
Pour chaque lot d'animaux, les valeurs moyennes +/- e . s . m . des scores d ' altération ont été calculées .
-. Elles sont présentées dans le tableau 7. La comparaison statistique est effectuée a l'aide du test 5 non parametrique de White, par rapport au groupe témoin avec une dLfférence significative notée p <
0,01 .
Résultats Comme 1 ' illustrent ces résultats, 10 l'administration d'éthanol absolu induit chez la ma jorité des animaux 1 ' apparition de larges stries hémorragiques conf luentes . Chez les animaux témoins le score d'alteration est de 3,75 +/ - 0,17.
Le CMDBS administré per os à la dose de 100 yg~kg (2 fois par jour ~ réduit en 24 heures de 56~
(p~al,01) la gravité des lésions. Aux doses supérieures l'activité cytoprotectrice n'est pas L~LLuuvee. Le CMDBS exerce des ef f ets comparables a la prostaglandine E2 considérée comme un agent 20 protecteur de la muqueuse gastrique contre des agents topiques irritants qui induisent une reaction inflammatoire intense locale (réduction de 63t des lés ions ) .
EXEMPLE 6: Effet anti-inflammatoire sur des colites 25 ind~.ites Par le TNB chez le rat.
Princil~e:
L ' administration intrarectale d ' acide trinlitrobenzène sulfonique (TNB) entralne chez le rat l'apparition d'un colite chronique, associée à de 30 graves lésions de la muqueuse produites par une reaction inflammatoire aigUe avec libération de mediateurs (PAF, interleukines, eicosanoïdes), et accompagnée d'un oedème important quantifiable au Bleu ~ ~. A ~J; 1 ~

d ' Evans .
ethodes .
. , . . . _ . . . _ _ . . .
Des groupes de 6 rats mâles Sprague Dawley, d'environ 200g, sont mis en ~eune hydrique 24 heures avant l'essai. Le ~our du test, les animaux sont anesthesiés au pentobarbital ( 30 mg/kg3 par voie intraperitoneale. 20 mg de TNB dissous dans 0,25 ml d'éthanol a 50~ sont instilles dans le colon à 6 cm de 1 ' anus . Les animaux sont remis dans leur cage apres le réveil avec nourriture et boisson a volonté.
4 ~ours plus tard, les animaux sont sacrifiés et le colon est prélevé. 30 mn avant le sacrifice, 1 ml de Bleu Evans est administré par voie veineuse pour evaluer 1 ' oedeme a ~Ant la colite selon le protocole suivant: Le colon est mis dans un tube contenant 9 ml de forr-mide. Apres centrifugation, le surnageant est prelevé et un dosage spectrometrique est effectue a 620nm de longueur d'ondes.
Traitement:
Le CMDBS a ete dissous dans la carboxymethylcellulose a 0, 596 . Les traitements ont éte effectués par voie intrarectale sous un volume de 1 ml~kg, 4 heures avant le TNB 1 fois par ~our jusqu'au s~crifice de l'animal.
Resultats Pour chaque lot d ' animaux, les valeurs moyennes +/- e.s.m. des scores d'altération ont eté calculées.
Elles sont presentees dans le tableau 8. La comparaison statistique est effectuee a l'aide du test "t" de variance par rapport au groupe témoin avec une différence significative notée p ~ 0,05.
Dans cet exemple, le CMDBS a un effet anti-inflammatoire comme le montre le ~ n~ nt des 218~75g` ' -Woss/26738 29 1'~l/r~5,.~
cellules inflammatolres révélées par coloration au bleu d ' Evans . 300 llg de CMDBS par kg réduisent de - moitié cette coloration ( p S 0,05).
EXEMPLE 7: Effet sur l'inflammation cutanée chez le rat.
A. Animaux Les expérimentations ont été effectuées sur des rats males Hairless OFA-hr/hr Ico, EOPS, exempts d ' or~A n i ! - - pathogènes spéci f ~ ques, ages . ia . EOPS
(Exempts d'or~ni - pathogènes spéci~iques); de 9 à
10 semaines (250-300 gr) (IFFA CREDO, France). Ces rats se caracterisent par un système pileux très peu développe du à un gène recessif hr, defini par le terme "Hairless". Dès reception, les rats sont stabulés et hébergés selon les directives de la r ~-]té Economique Européenne, décret d'Avril 1986, n 86/609/CEE.
B. Mode ol~ératolre Les rats sont anesthésies par injection intra-peritonéale de pentobarbital sodique ( 0 .1 ml/100 g pour les rats sains et 0 . 05 ml/100 g pour les rats diabétiques ) . Trois défauts cutanés dermo-épidermiques sont pratiqués de part et d ' autre de la colonne vertébrale à 1 ' aide d ' un emporte pièce de 6 mm de diamètre. Des compresses de collagène bovin inactivé
(PA~GEN, Fournier) sont découpées à l'emporte pièce, imbibées de la solution à tester ou d'une solution de PBS . ia . PBS; pendant 2 heures à température ambiante avant d ' etre déposées dans chaque plaie . L ' ensemble est alors recouvert d'un pansement occlusif (OPSI~E) gardant le collagène hydraté, puis d ' un élastoplaste empêchant le rat de se débarrasser de son pansement.
Les rats sont placés dans des cages individuelles avec 21gB~ ~8 W0~5126738 30 1~I~r~
eau et nourriture à volonte. Chaque condition experimentale regroupe des lcts de 6 à 10 animaux. Le processus cicatriciel est considere à des temps variables exprimes en ~ours (Jx) apres la date de 5 1 ' operation ( J0 ) .
C. Traitement des l~laies Les plaies des rats sains sont traitees avec des pansements de collagène imbibes d ' une solution physiologiques contenant ou non du CMDBS-AM6 a 50 10 ~g/ml.
D. Prelevements des Plaies Les lots d'animaux temoins (sans CMDBS) ou traites (avec CMDBS) sont sacrifies par in~ection d'un exces de pentobarbital sodique. Les contours de la 15 plaie sont reportes sur un calque, puis la plaie est prelevee a 1 ' aide du même emporte-pièce de la meme dimension que celui utilise a J0 et conservee a -80 C.
Pour 1 ' etude histologique, les pieces sont prelevees en prévoyant un exces de 5 mm de peau non lesee autour 20 des contours d'origine puis placees dans un fixateur dont la composition varie en fonction de l'etude envisagee .
E. Etude histolo~icue Les prélavements de tissus sont places pendant 25 24 à 48 heures dans un exces de fixateur (paraformaldehyde 4%, glutaraldehyde 0.1~, saccharose 5~, PBS lOOmM, pH7) puis déshydratés progressivement avant d'etre inclus dans du Paraplast Plus (Prolabo).
Des coupes de 5 mm sont realisées avec un microtome a 30 paraffine (Reichert-Yung) et colorees au trichrome de Masson (GABE, 1988).
Les resultats des observations histologiques sont presentés sur les figures 8A a 8F qui rapportent 21867~8 ~
Wo 95~26738 3 1 ~ r~lrr~
cette étude histologique de la cicatrisation cutanée à
J6 post-operatoire, (coloration des coupes au - Trichrome de Masson).
Les f igures 8A a 8C présentent les plaies traitées avec du CMDBS ( 5 0 yg/ml ) et les f igures 8D à
8F représentent les plaies traitées avec le véhicule seul. Ces figures montrent une inégalité dans la qualité du tissu de granulation. Il existe un aspe~t plus mature de la cicatrice (Fig.8A, x4) par rapport au témoin (Fig.8D, x4). Un agrandissemnt (x25) de la région épidermique montre une reconstitution de ceLle-ci dans les deux cas (Fig.8B et 8E x25).
La différence réside dans la maturation du tissu de granulation: la plaie traitée (Fig.8C x25) avec du CMDBS montre la présence de fibroblastes (fléche) qui _ ~~e a s'orienter et qui produisent une matrice en quantité plus lmportante que dans la plaie témoin. Les cellules inflammatoires dans les plaies traitées avec du CMDBS sont en nombre restreint par rapport au témoin (Fig.8F x25) qui montre la persistance de rh~n, ` O imfli -toires importants.
EXEMPLE 8: Mise en évidence des activités métallo-protéinases matricielles extraits des tissus cutanes en cours de cicatrisation.
Des prélevements de tissu cutane sont effectues selon le meme protocole et les memes conditions expérimentales que ceux présentés dans l'exemple précédent .
Traitement des Plaies Les plaies des rats sains sont traitées avec des pansements de collagène imbibés d'une solution physiologique contenant ou non du CMDBS-AM6 a 50 yg/ml .

Wo 95/26738 ~ ~ 8 3 2 r~ "r ~ t Les métalloprotéinases matricielles tMMPs ) et, plus particulierement les collagénases 92 kD
(collagenase de type V) et 72 kD ( collagénase de type IV), sont mises en évidence grâce a la technlque du zymogramme.
La peau préleYée à J0 est nommée contrôle (C).
Le prélevement effectué au jour x ~Jx) au même emplacement selon les contours d ' origine est nommé
plaie (P). C et P sont toujours traités en même temps et selon le même protocole.
Chaque prélèvement est pulvérise une minute dans un broyeur à azote liquide (Bioblock). La poudre est pesée et mélangée dans un tampon 100 mM phosphate pH7.4, lM NaCl (lml pour 100 mg de poudre). L'ensemble est homogénéisé a l'Ultra-turax pendant 30 secondes, laissé 1 heure a 4-C puis centrifugé a 43700g (Beckman J2-21) à 4-C pendant 30 minutes. Le volume du surnageant est mesure puis aliquoté avant d ' être conservé a -80 C.Le culot, pesé, est conservé a -80 C.
Les extraits obtenus à partir de broyats de peau cicatricielle ou non ( 25 mg de protéines en tampon non réducteur, non chauffés), sont déposés sur des gels de polyacrylamide 10% contenant 1 mg/ml de gelatine (Sigma, ref G2500). Après migration en tampon de Laemmli, les protélnes déposées sur gels sont renaturées avec une solution de Tris-HCl 100 mM, pH
7.4 contenant 2.596 de triton xlO0 (2 fois 30 minutes).
Le Triton est éliminé par deux lavages en tampon Tris-HCl 100 mM. Les gels d ' électrophorèse sont incubes à
37 C durant 48 heures dans un tampon Tris-HCl 100 mM
contenant 10 mM de CaC12, 0.001~ NaN3, 0.001596 Bri;
35, 1 mM ZnC12. Apres avoir éliminé soigneusement le tampon d'incubation, les gels sont colorés durant 20 ~ 186~8 w095/26738 33 ~l/r~
- minutes sous agitation avec une solution de Bleue de Coomasie R250 (5mg/ml) contenant de l'acide acetique - (10%~, du propanol-2 (30%), puis decolores ~acide acét~Lque 10%, méthanol 40%), jusqu'à visualisation des 5 bandes. Les gels sont photographies. Afin de s'assurer que les differentes bandes de digestion obtenues sont bien dues a des MMPs, les echantillons sont incubes en présence d'inhibiteurs spécifiques; Phenyl méthyl sulfonyl fluoride ou PMSF (2 mM final) inhibiteur des 10 serines endopeptidases, l'acide ethylene dlamine tetracetique ou EDTA ( 2 0 mM f inal ) inhibiteur des métallo-endopeptidases, le N-ethyl maleimide ou ~EM (2 mM f inal ) .
La f igure 9 montre 1 ' expression des Métallo-15 Prot~inases Matricielles detectees dans les extraitsde plaies en fonction du traitement ou non par le CMDBS et en fonction du temps de la cicatrisation.
25 mg de protéines obtenues a partir des extralts de broyats de peau saine ou de peau 20 cicatricielle à J5 et J6 post-operatoires sont deposes sur un gel de polyacrylamide 10% contenant comme substrat 1 mg/ml de gelatine. Les pistes 1,12 representent la peau saine qui sert de temion interne de migration. Les pistes 2, 3, 4 et 13, 14, 15 25 representent les extraits obtenus a partir de cicatrices traitees avec du CMD~S a raison de 50 mq~ml (6 rats differents). Les pistes 5 à 11 et 16, 17 representent les témoins correspondants. Chaque piste represente un rat different.
Deux types de collagenases sont retrouvés dans la peau saine: La forme de 72 kDa et sa forme activee la 68 kDa. Par contre, a J5 et J6, dans les plaies traitees ou non avec le CMDBS, la 92 kDa est presente W0 95l26738 ~ i 8 ~ 7 ~i 8 ; r~llr~
O ~ ~ 34 de manière identique. La différence reside dans les niveaux d'expression de la 72 kDa et de sa forme z~ctivee, la 68 kDa. A J5, dans les plaies temoins la 72 kDa et la 68 kDA sont exprimees de manière tras 5 importante par rapport aux plaies traitees avec du CMDBS . De plus, il y a apparition d ' espèces de bas poids moleculaires qui n ' existent pas dans les plaies traitées avec le CMDBS. A ~6, cette difference se confirme puisque pour le même depôt protéique qu'à J5, 10 1 ' activité des col 1 A~PnAReS est telle que les pistes 16 et 17 apparaissent sous forme de deux traces blanches . Cette activité qui n ' existe pas chez les rats traités au CMDBS.
Les CMDBS modulent donc les niveaux 15 d'expression des MMPs soit directement soit indirectement à travers leur rôle inhibiteur sur la plasmine qui est un de leurs activateurs.

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'5 ~ ~ ~ ~ O C O _ O Ir, o .IJ ~ 04 -' m - . ~ o o ~ ~ j G ~ O _~
a r ~ . _ o c a _ ~ 8 ~

~1867~ 36 WO95/26738 ~ rl~ 5 ~ IRT~T~lT 2 E~fet non i~h~l-iteur du CNDR~i vis-à-vi5 de la tr~rPsine 'rrvpsinc tlOu~ml)+ SX7 1.00 'rrypsinc+S87+5uolml 100 ~ iDl~S
Tr~rsinc+~R7+.~nll~lml 100 'rr~llsinc+SX7+:5nn~ ml Inn 0~1nn~
'I'r~ sinc+S~7+!i'i'1~1 t) 218~758 .. (, .~, ..
WO95/26738 r~llr~ r 1-Oriqine . activité anticoaqulante et comvosition D~rtlelle du Meso~lvc~n et du Sulodexide (informations du fournisseur) 5~1or~Y1~ Nesoglycan Origine duodenum aorte de porc Activite 50-70 IU/mg < 50 ~U /mg Antlcoagulante Composition chlmiSIue Dermatane 8uli'ate 20 - 35 96 25 - 60 96 Chondroitine 2-7% 3-15 Sulfate Héparane sulf~te + +

{, ,~ t ~
W095/26738 ~18~7~8 38 r~l/r~5.~ D~

Protect~ on du TGFbêta par divers Pol~rmères 5TGF beta 100 TGF bêta + tsypsine 0 %
TG~ ~eta + ~ gly~l 100 %
T&F beta + ~ Gly~l + trypsinc 50 %
TGF~+~S~ IW%
TGF ~ + HSM + trypsine 75 %
TGF beta + sul~dcxide 100 %
TGF beta + sulodcxide + trypsine 20 %
TGF ~ + HSS 10() %
TGF ~ + HSS + Irypsine 4~ %
TCFbêta + Dextrane 100 %
TGF bêta + Dext~ane + ~ypsine 0 %
TGF b~ta + Dexlranc Sulfate 100 %
TGF beta + Dextrane Sul&te + ~rypsine 0 %
T&F b~ta + Sucrase 100 %
TGF b~ta + SucTase + tlypsine 0 Y0 HSM = Héparanes Sulfatcs pur;fiés à panir du Mcsoglycan HSS = llApan nes Suln~les pun nii; A p~r~ir ~ Sulod~i~c wog5n6738 39 ~ r~llr~5 Protection du FGF Par divers Polvmeres PROTECTION EN %
FGF seul 100 5FGF + Trypsine o FGF + Trypsine + Héparine 100 FGF + Trypsine + Mésoglycan 75 FGF + Trypsine + Sulodexide 70 FGF + Trypsine + Mésoglycan traité 0 10Héparinase FGF + Tryps ine + Sulodexide traité 0 Heparinase FGF + Trypsine + Héparine Traité 0 Héparinase 15FGF + HSM + Trypsine 95 FGF + HSS + Trypsine 90 WO951~6738 ~1g 67~8 40 lt~ llr~9' ~
:. ' TABI,EAU 6 Tnh;hition des activités de 1'elastase et de la P1asmine Compos~s tcst~s ~;lasta~ R~ rl~LSm;ne ~C50 en ~ ml 1C50 en ~Ig~ml C~)BS lotAM6 2.2 1,5 10T40 ~ lO0 ~ ~00 CMDBS lot EM5 lO 7 TlO CMD2B 50 53 T105CMDIB > 100 ~100 T103CMD > 100 ~ I01) 15TlO > I00 ~ 100 r ~ 72 65 RS M~u~ 20 22 Sulodexidc 79 75 HS Sulndexide 25 20 20H~parine l,8 Lip~héparine 0~5 HSM = Hcpar~nes Sulfate~ purifi~s ~ partir du M~ ;l HSS = Héparanes Sulfi~tes purifiés à p~rtir de Sulodcxide ~1867~-8 WO9S/26738 41 ._llrnS',~

Traitcment Doses en llg/kg Scores Variations PO
Témoins - 3,75 ./ 0.17 PGE2 200 1,4 ., 0,35 -63%
100 1,6 ./ 0,25 -56%
CMDBS 300 3,2~, 0,33 -16%
1000 3,1 ., 0.35 -17%

Traitements Doses Nombres de Concentration de Bleu rats ~vans en llg/g de côlon T~moins 5 0,17 ., 0,03 TN!3 5 0,87 ., 0,14 100 ug/kg 6 0,54 ., 0,16 CMDBS 300 llg/};g 6 0,45 ~ 0,12 l~'e/ke 6 0, .~0.11

Claims (15)

REVENDICATIONS

1. Utilisation d'au moins un polymère ou un biopolymère, appelés HBGFPP, à l'exclusion du mésoglycan, protégeant spécifiquement les facteurs de croissance des familles des FGF et TGFbêta de la dégradation trypsique et n'inhibant pas de manière significative la coagulation, pour la fabrication d'un médicament pour le traitement des inflammations.

2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le polymère ou biopolymère présente une activité anti-coagulante inférieure à 50 unités internationales par mg de polymère.

3. Utilisation selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que ledit polymère présente une activité anti-complément.

4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit polymère n'active substantiellement pas le système du complément.

5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ledit polymère inhibe substantiellement les activités protéasiques de l'élastase et/ou de la plasmine.

6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ledit polymère ou biopolymère est un polysaccharide.

7. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que ledit polysaccharide est principalement composé de résidus glucose.

8. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que le polysaccharide comprend des résidus glucosamine et/ou d'acide uronique.

9. Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que le polysaccharide comprend des dimères glucosamine-acide uronique.

10. Utilisation selon l'une des revendications 8 et 9, caractérisée en ce que ledit polysaccharide est un glycosaminoglycane éventuellement associé à un lipide, un peptide ou un protide, ou un sulfate d'un de ces composés.

11. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ledit polysaccharide est un dextrane substitué.

12. Utilisation selon la revendication 11, caractérisée en ce que ledit polysaccharide est un CMDBS.

13. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ledit polymère est de nature non-osidique.

14. Composition pharmaceutique pour le traitement des inflammations contenant au moins un polymère tel que défini dans l'une des revendications 1 à 13 en association avec au moins un excipient pharmacologiquement acceptable.

15. Composition selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'elle contient entre environ 10 et 2500 µg de polymère ou de biopolymère/ml de composition.