BRPI1008778B1

BRPI1008778B1 - Método para aumentar a processabilidade de uma ou mais dna polimerases em pelo menos um modelo de dna rico em gc

Info

Publication number: BRPI1008778B1
Application number: BRPI1008778-8A
Authority: BR
Inventors: Gary J. Latham
Original assignee: Asuragen, Inc.
Priority date: 2009-02-13
Filing date: 2010-02-04
Publication date: 2021-03-23
Also published as: AU2010213981C1; WO2010093552A1; CN102395686A; IL214326A0; KR20110120923A; US8409805B2; EP2396426B1; AU2010213981B2; ZA201105632B; KR101784527B1; EP2396426A1; CN102395686B; US20100209970A1; BRPI1008778A2; RU2011137526A; AU2010213981A1; IL214326A

Abstract

métodos para aumentar a processabilidade de uma ou mais dna polimerases em pelo menos um modelo de dna rico em gc e para detectar um genótipo associado a um transtorno de repetição de trinucleotídeo rico em gc. a presente invenção refere-se a métodos de aumento da processabilidade de dna polimerases em modelos ricos em gc. os métodos referem-se a proporcionar intensificadores e razões de dntps desviadas, e poderão ser usados em reações de amplificação de dna. os métodos são úteis para detectar genótipos associados e repetições ricas em gc, incluindo síndrome do cromossomo x frágil.

Description

MÉTODO PARA AUMENTAR A PROCESSABILIDADE DE UMA OU MAIS DNA POLIMERASES EM PELO MENOS UM MODELO DE DNA RICO EM GC

[0001] A presente invenção refere-se ao campo de síntese de DNA, particularmente, referindo-se à síntese envolvendo modelos e produtos ricos em GC.

[0002] Uma vez que o primeiro isolamento de uma DNA polimera-se e determinação de condições sob as quais DNA pode ser sintetizado in vitro, reações de síntese de DNA são amplamente usadas para fins preparativos e analíticos em aplicações biotecnológicas, médicas e de pesquisa. Reação em cadeia da polimerase, ou PCR, é um tipo de reação de síntese de DNA por meio da qual uma sequência de DNA pode ser amplificada, rapidamente e exponencialmente. Como outras reações de síntese em ciclos, esta reação envolve repetidamente, reprodução da sequência-alvo de uma maneira cíclica. Uma implementação típica de PCR envolve proporcionar iniciadores complementares às extremidades da sequência desejada, um tampão adequado, um sal de magnésio, trifosfatos desoxinucleotídeo (dNTPs) e uma DNA polimerase termofílica. O DNA modelo ou alvo contido, por exemplo, em uma amostra de DNA genômico, é exposto a esses componentes em solução aquosa. A mistura é em ciclos por meio de etapas sob temperaturas diferentes que promovem desnaturação do modelo, recozimento dos iniciadores ao modelo, e em seguida extensão dos iniciadores pela polimerase, criando mais produto. Uma vez que o produto de cada ciclo é disponível como modelo em reações subsequentes, a quantidade de produto aumenta cerca de, exponencialmente, até que outros componentes de reação (inicialmente, presentes em excesso) sejam esgotados. Vide, por exemplo, Patente U.S. 4.683.202; M. J. McPherson & S. G. Moller, PCR: The Basics (2a. Ed., Taylor & Francis) (2006).

[0003] PCR, juntamente com outras formas de reações de síntese de ácidos nucleicos em ciclos, é uma ferramenta-padrão em biologia molecular, biotecnologia, e, cada vez mais, na medicina. Principais vantagens de PCR e técnicas correlatas são rapidez, baixo custo, sensibilidade, receptividade à análise de alto rendimento, e versatilidade. Amplificações exigem apenas algumas horas ou menos, pequenas reações individuais poderão consumir bem menos dólares em reagentes, a quantidade de modelo exigida é tipicamente, na faixa de nano-grama, automação pode resultar em milhares de processamentos de reações por dia por robô, e iniciadores podem ser projetados para amplificar quase qualquer sequência.

[0004] PCR e técnicas correlatas são amplamente adotadas tanto para aplicações analíticas quanto preparativas. Uma aplicação preparativa típica de PCR é amplificar uma sequência de modo que esta possa ser clonada em um vetor heterólogo. Uma variante especializada dessa aplicação é PCR mutagênica, em que a fidelidade da reação é deliberadamente reduzida a fim de gerar cópias da sequência-alvo contendo mutações. As cópias mutantes clonadas poderão em seguida ser utilizadas em pesquisa ou experimento a jusante. PCR mutagê-nica poderá ser realizada pelo uso de pools de dNTP desviadas, em que dATP, dCTP, dGTP e dTTP não estão presentes em razões equi-molares. Isso poderá aumentar a frequência de incorporação de combinações inadequadas durante a etapa de extensão do ciclo de PCR, resultando em produto mutante. Vide, por exemplo, PCR Methods Appl. 2: 28-33 (1992); Anal. Biochem. 224: 347-353 (1995).

[0005] Embora pools de dNTP desequilibradas sejam usadas na PCR deliberadamente propensa a erro, descrita acima, os efeitos muta-gênicos de tal desequilíbrio são desfavorecidos em outras aplicações. Mutagênese é desvantajosa em aplicações analíticas, geralmente, e em aplicações preparativas em que produto mutante não é a meta. Na verdade, a indesejabilidade geral de produto mutante tem inspirado esforços para caracterizar e aumentar a fidelidade de reações, tal como, PCR por meio de modificação da polimerase ou outros componentes de reações. Vide, por exemplo, Nucleic Acids Research 24: 3546-3551 (1996); Patente dos Estados Unidos 7.030.220; Patente dos Estados Unidos 6.881.559. Além disso, a taxa de erro elevada associada a pools desequilibradas de dNTP seria esperada limitar rendimento da reação, uma vez que combinações inadequadas reduzem tanto a processabili-dade quanto a taxa de incorporação de DNA polimerases.

[0006] Uma aplicação analítica notável de PCR é no diagnóstico de condições ou determinações de genótipos envolvendo loci genéticos com polimorfismos de tamanho.

[0007] Um exemplo de um locus que exibe polimorfismo de tamanho medicamente relevante é a região não traduzida 5’ (UTR) do gene FMR1 humano no cromossomo X. Indivíduos normais, tipicamente, apresentam repetições CGG 5-44 nessa região. Em contraste, alelos desse locus contendo 200 a 2.000 ou mais repetições CGG são indicativos de Síndrome do Cromossomo X Frágil (Fragile X Syndrome) (FXS). Tais alelos são referidos como alelos de Mutação Completa. Esses alelos são geneticamente instáveis. Indivíduos com FXS poderão apresentar várias combinações de sintomas tais como ataxia, falência ovariana prematura, incapacidade de aprendizagem, e outras condições cognitiva/comportamentais, incluindo sintomas semelhantes ao autismo.

[0008] Uma exceção lamentável para a versatilidade de PCR é na dificuldade de amplificar cursos longos de sequência altamente rica em GC, incluindo alelos de mutação completa do 5’UTR de FMR1. Tentativas de otimizar PCR de FMR1 apresentam modificações incluídas para condições de ensaio de PCR convencional. Vide, Genome Res. Julho de 1996; 6(7): 633-8; Nucleic Acids Res. 01 de Outubro de 1997; 25(19):3957-8; J. Mol. Diagn. 01 de novembro de 2006; 8:544550; Am. J. Med. Genet. 15 de julho de 1994; 51(4):527-34. Todavia, após mais de 15 anos de desenvolvimento de ensaios de PCR de FMR1, tão recentemente quanto em 2008 (Genet. Med. 10 de outubro de 2008; 10(10):714-9) um estudo piloto de triagem publicado para detectar Síndrome do Cromossomo X Frágil em recém-nascidos relatou que "dois métodos de análise de reação em cadeia da polimerase (PCR) quantitativa... usados no processo de validação interna para determinar o número de repetição de FMR1 em mulheres que falharam para produzir resultados seguros e reprodutíveis", e, adicionalmente, que "uma segunda falência [PCR] a partir do primeiro ou segundo isolamento foi altamente sugestiva de um tamanho anormal de repetição CGG de FMR1". (Ênfase adicionada). Desse modo, aqueles instruídos no estado da técnica continuam a considerar amplificação reprodutível de PCR de alelos de Síndrome do Cromossomo X Frágil de mutação completa como um problema não resolvido.

[0009] Avaliação precisa de comprimento de repetição tríplice por PCR foi relatada até aproximadamente 100 repetições CGG, bem abaixo do tamanho de alelos de mutação completa. Além disso, detecção de qualquer banda, de modo algum, torna-se progressivamente menos visível começando em aproximadamente 100 repetições. J. Mol. Diagn. 7:605-12 (2005). Essa dificuldade, combinada com a natureza heterogênea de sintomas de FXS, resultou no uso de procedimentos, tal como, Southern blotting a fim de detectar alelos de mutação completa. Id. Southern blotting é mais demorada e cara, e muito menos receptiva a implementações de alto rendimento, do que PCR.

[00010] Esta invenção baseia-se em parte na descoberta surpreendente que proporcionando um pool de dNTP desviada resulta em melhorias significativas em relação a métodos conhecidos no estado da técnica na processabilidade de DNA polimerases em modelos ricos em GC.

[00011] Em certas modalidades, a aplicação proporciona métodos de aumento da processabilidade de uma ou mais DNA polimerases em pelo menos um modelo de DNA rico em GC, método este que compreende realização de uma reação de amplificação de DNA em uma solução aquosa que compreende dNTPs em uma razão de GC/AT maior que um.

[00012] Em outras modalidades, a aplicação proporciona métodos que compreendem amplificar o modelo rico em GC por meio de PCR em uma solução aquosa compreendendo (a) dNTPs em uma razão de GC/AT entre 2 e 10 e sob concentração total de 0,7 - 0,9 mM; (b) pelo menos um intensificador escolhido de betaína, DMSO e TWEEN-20; e (c) magnésio sob uma concentração total de 1,5 - 2 mM, em que pelo menos um modelo rico em GC compreende repetições CGG do 5’ UTR de FMR1.

[00013] E, em outra modalidade, a aplicação proporciona método de detecção de um genótipo associado a um transtorno de repetição de trinucleotídeo rico em GC tais como Síndrome do Cromossomo X Frágil, Síndrome de tremor/ataxia associada ao cromossomo X Frágil, e/ou insuficiência ovariana primária associada ao Cromossomo X Frágil, método este que compreende realização de uma reação de amplificação de DNA em pelo menos um modelo de DNA rico em GC, em que a processabilidade de uma ou mais DNA polimerases é aumentada proporcionando uma solução aquosa que compreende dNTPS em uma razão de GC/AT maior que um.

DESCRIÇÃO CONCISA DAS FIGURAS

[00014] Figura 1 é uma fotografia de um gel corado com SYBR-Gold. Lanes ("Pistas") 4 e 29 são marcadores de tamanho, e tamanhos de bandas selecionadas são indicados à direita de Lane 29. Todas as reações de PCR usaram uma mistura de modelos contendo alelos com 20, 28-29, 118, 198, e aproximadamente 330 repetições CGG no 5’ UTR de FMR1. Lanes 1-3 e 5-28 mostram processos de produtos de reação com vários níveis de razão de GC/AT, concentração de betaína e concentração total de dNTP.

[00015] Figura 2 é uma fotografia de um gel corado com SYBR-Gold. Lane 1 e Lane 20 são marcadores de tamanho, e tamanhos de bandas selecionadas são indicadas à esquerda de Lane 1. Lane 2 contém o produto de uma reação de PCR usando uma razão 1:1 de GC/AT de dNTPs. Lanes 3-18 mostram produtos de reações de PCR com razões de GC/AT de dNTPs progressivamente desviadas (biased) no sentido de G e C. Lane 19 contém o produto de uma reação de PCR de controle de nenhum modelo usando uma razão de GC/AT 1:1 de dNTPs.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES

[00016] A invenção refere-se a métodos de síntese de DNA em soluções aquosas, em que o modelo apresenta um alto nível de riqueza de GC, e dNTPs são proporcionados em uma razão de GC/AT maior que um. Mais especificamente, esta invenção refere-se a aperfeiçoamento de processabilidade de polimerase alterando a razão de GC/AT de dNTPs na reação. Os métodos desta invenção são, particularmente, relevantes para reações de síntese tal como PCR, a qual poderá ser usada em aplicações diagnósticas que envolvem loci que poderão ser altamente ricos em GC, tal como próximo o gene FMR1 associado à Síndrome do Cromossomo X Frágil.

[00017] Um "intensificador" é um produto químico ou composição que aperfeiçoa um ou mais aspectos de desempenho, tal como, processabilidade de uma DNA polimerase e/ou uma reação de síntese de DNA.

[00018] "Razão de GC/AT" entende-se a razão da concentração da soma de dCTP, dGTP, e todos os análogos de nucleotídeos destes, para a concentração da soma de dATP, dTTP, dUTP e todos os aná-logos de nucleotídeos destes, em uma dada solução ou mistura.

[00019] "dNTP" permanece para trifosfato desoxinucleotídeo e refere-se a dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dUTP, e análogos dos mesmos.

[00020] "Análogos de nucleotídeos" são moléculas ou íons que compreendem uma porção base diferente das bases naturais adenina (A), citosina (C), guanina (G), timina (T), ou uracila (U), uma porção açúcar idêntica, ou similar a desoxirribose, e pelo menos uma porção fosfato ou fosfato múltiplo (por exemplo, difosfato ou trifosfato). O análogo de nucleotídeo é um análogo de um nucleotídeo específico, em particular, dATP, dCTP, dGTP, dTTP ou dUTP, quando este compreende um trifosfato e uma porção açúcar, a estrutura e configuração de ambos, os quais são adequados para incorporação em uma hélice dupla de ácido nucleico por uma polimerase, e uma base cujas propriedades de pareamento base em uma hélice dupla de ácido nucleico e loci de incorporação por DNA polimerases em uma hélice dupla de ácido nucleico são mais similares àquelas dos cinco nucleotídeos anteriormente listados, com a exceção que análogos de dTTP geralmente também serão análogos de dUTP e vice-versa.

[00021] O termo "análogo" usado em conjunto com termos, incluindo, mas não se limitam a "nucleotídeos", "base", "nucleobase", ou "resíduo" deve ser interpretado da mesma maneira como se fosse usado em conjunto com "nucleotídeo".

[00022] "PCR" é uma reação de síntese de DNA em que a mistura reacional é submetida a pelo menos dois ciclos de reação completa, cada ciclo de reação compreendendo um período de desnaturação e pelo menos um período de recozimento e/ou extensão, resultando, se bem-sucedida na síntese de cópias de um modelo de ácido nucleico em pelo menos, os ciclos iniciais, e cópias das cópias em pelo menos, os ciclos posteriores, geralmente, resultando em amplificação geométrica do modelo.

[00023] "DNA" é um ácido desoxirribonucleico, uma cadeia biopoli-mérica de resíduos predominantemente desoxirribonucleotídeos ligados geralmente por ligações fosfodiésteres.

[00024] "Betaína" refere-se a Ν,Ν,Ν-trimetilglicina.

[00025] Um "análogo de betaína" é qualquer composto químico neutro com um grupo funcional catiônico positivamente carregado que transporta nenhum átomo hidrogênio, por exemplo, um íon amônio ou íon fosfônio, e com um grupo funcional negativamente carregado tal como um grupo carboxilato que poderá não ser adjacente ao sítio catiônico. A invenção poderá referir-se ao uso de análogos de betaína com pesos moleculares menores ou iguais a 600 Da; menores ou iguais a 300 Da; entre 75 e 600 Da; ou entre 75 e 300 Da. A invenção poderá adicional ou alternativamente referir-se ao uso de análogos de betaína que compreendem uma porção amônio e/ou uma porção car-boxilato.

[00026] "Tm" é a temperatura sob a qual 50% em massa de uma dada amostra de DNA ou complexo de iniciador-modelo em uma dada solução é de fita simples, e 50% em massa é de fita dupla.

[00027] "TWEEN-20" é monolaurato de sorbitano polietileno glicol, o produto químico designado por CAS número 9005-64-5.

[00028] "Riqueza de GC" é a fração ou porcentagem de resíduos totais de nucleobase em um ácido nucleico que são: resíduos de gua-nina, resíduos de citosina, ou análogos dos mesmos. Por exemplo, um ácido nucleico 100 nt que contém exatamente 30 citosinas, exatamente 30 guaninas, exatamente um análogo de citosina, e exatamente um análogo de guanina apresenta uma riqueza de GC de 62%. Em algumas modalidades, um modelo rico em GC poderá conter pelo menos 51, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ou 99,5% de resíduos de guanina, resíduos de citosina, ou análogos dos mesmos.

[00029] "Processabilidade" é a capacidade de uma DNA Polimerase sintetizar cópias completas de um modelo em uma dada reação. Aumento de processabilidade poderá resultar em aumento de rendimento do produto e/ou aumento de tamanho do produto, o último sendo, particularmente, relevante para reações que envolvem modelos para que um nível inferior de processabilidade resulte em um baixo nível de síntese de cópias completas.

A. Modelo de DNA

[00030] Um modelo de DNA é uma sequência de DNA presente em uma amostra que é o alvo de síntese em uma reação catalisada por uma DNA polimerase. A riqueza de GC do modelo de DNA poderá ser maior que ou igual a 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ou 99,5% de resíduos de C e G. O modelo de DNA poderá compreender repetições di, tri, ou tetranucleotídeos compreendendo resíduos de C e G. O modelo de DNA poderá estar dentro ou próximo a um locus associado à doença. O modelo de DNA poderá compreender pelo menos parte do 5’ UTR do gene FMR1. O modelo de DNA poderá compreender repetições CGG do 5’ UTR do gene FMR1. O tamanho do modelo de DNA poderá ser aproximadamente 50, 100, 200, 300, 500 ou 700 bp, ou 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 4; 5; 7 ou 10 kb. O tamanho do modelo de DNA poderá ser entre 50 bp e 10 kb, 100 bp e 10 kb, 200 bp e 10 kb, 300 bp e 10 kb, 500 bp e 10 kb, 700 bp e 10 kb, 1 kb e 10 kb, 1,5 bp e 10 kb, 2 bp e 10 kb, 3 bp e 10 kb, 50 bp e 7 kb, 50 bp e 5 kb, 50 bp e 4 kb, 50 bp e 3 kb, 50 bp e 2 kb, 50 bp e 1,5 kb, 100 bp e 7 kb, 200 bp e 5 kb, ou 300 bp e 4 kb.

B. Razão de GC/AT e Concentração de dNTPs

[00031] A invenção refere-se a métodos que compreendem proporcionar dNTPs em uma razão de GC/AT maior que um e sob uma concentração total de dNTP conducente a síntese de DNA usando modelos ricos em GC. A razão de GC/AT poderá ser aproximadamente 1,1; 1,2; 1,4; 1,6; 2; 2,5; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18; 19; 20; 25 ou maior. A razão de GC/AT poderá ser entre 1,1 e 20, 1,1 e 15, 1,1 e 10, 1,1 e 8, 1 e 15, 1,1 e 7, 1,1 e 6, 1,1 e 5, 1,2 e 25, 1,4 e 25, 1,6 e 25, 2 e 25, 3 e 25, 4 e 25, 5 e 25, 2 e 15, 2,5 e 10, ou 4 e 10. A concentração total de dNTP poderá ser aproximadamente 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1; 1,2; 1,5; 2 ou 3 mM. A concentração de dNTP poderá ser entre 0,4 e 3 mM, 0,5 e 3 mM, 0,6 e 3 mM, 0,7 e 3 mM, 0,8 e 3 mM, 0,9 e 3 mM, 1 e 3 mM, 0,4 e 2 mM, 0,4 e 1,5 mM, 0,4 e 1,2 mM, 0,4 e 1 mM, 0,4 e 0,9 mM, 0,4 e 0,8 mM, 0,4 e 0,7 mM, 0,5 e 2 mM, 0,5 e 1 mM, ou 0,6 e 0,9 mM.

C. Processabilidade, rendimento e tamanho de produto

[00032] Em algumas modalidades, a invenção proporciona processabilidade aperfeiçoada para uma dada polimerase com um modelo fornecido rico em GC, em relação a métodos conhecidos no estado da técnica. Os aperfeiçoamentos são obtidos por meio de etapas que compreendem proporcionar dNTPS em uma razão de GC/AT maior que um. O grau de aperfeiçoamento poderá ser tal que, a reação aperfeiçoada poderá ser capaz de gerar produtos detectáveis compreendendo, aproximadamente 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 2.000 ou mais repetições CGG do que métodos conhecidos no estado da técnica.

D. DNA polimerase

[00033] A invenção refere-se a métodos que compreendem proporcionar pelo menos uma DNA polimerase para sintetizar DNA a partir de dNTPs de uma maneira dependente de modelo. A DNA polimerase poderá compreender um tipo selvagem, modificado, termofílico, quimérico, projetado por engenharia e/ou uma mistura de mais que uma polimerase. A DNA polimerase poderá compreender Exact Polymerase (5 PRIME GmbH), AccuSure™ DNA Polymerase (Bioline), Phusion™ AccuPrimeTMPfx (Invitrogen), Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen), Phire™ Hot Start DNA Polymerase (New England, Biolabs.), Phusiona Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs.), JumpStart™ REDTaq™ DNA Polymerase (Sigma-Aldrich), PfuUltra™ Hotstart DNA Polymerase (Stratagene), PfuTur-bo®Cx HotStart DNA Polymerase (Stratagene), PrimeSTAR™ HS DNA Polymerase (Takara), Extensor High-Fidelity PCR Enzyme (AB-gene), ACCUZYME™ DNA Polymerase (Bioline), SAHARA™ DNA Polymerase (Bioline), VELOCITY DNA Polymerase (Bioline), Gene-Choice® AccuPOL™ DNA Polymerase (GeneChoice, Inc.), GeneChoi-ce® UniPOL™ DNA Polymerase (GeneChoice, Inc.), Elongase Enzyme Mix (Invitrogen), Pfx50TM DNA Polymerase (Invitrogen), Phu-sion DNA Polymerase (New England Biolabs), KOD HiFi DNA Polymerase (Novagen), KOD XL DNA Polymerase (Novagen), mistura de DNA polimerase termoestável Expand 20 kb PLUS (Roche Applied Science), mistura de DNA polimerase termoestável Expand High-Fidelity PLUS (Roche Applied Science), mistura de DNA polimerase termoestável Expand High-Fidelity (Roche Applied Science), mistura de DNA polimerase termoestável Expand Long Template (Roche Applied Science), Easy-ATM High-Fidelity PCR Cloning Enzyme (Stratagene), EXLTM DNA Polymerase (Stratagene), Herculase® Enhanced DNA Polymerase (Stratagene), Herculase® II Fusion DNA Polymerase (Stratagene), Kapa LongRange™ DNA Polymerase (Kapa Biosystems), Kapa HiFiTM DNA Polymerase (Kapa Biosystems), Kapa2GTM Robust DNA Polymerase (Kapa Biosystems), Kapa2GTM Robust HotStart DNA Polymerase (Kapa Biosystems), Kapa2GTM Fast DNA Polymerase (Kapa Biosystems), Kapa2GTM Fast HotStart DNA Polymerase (Kapa Biosystems), LA TAQ DNA Polymerase (Takara), Optimase DNA Polymerase (Transgenomic, Inc.), Exo-Pfu DNA Polymerase (Stratagene), HotMaster Taq DNA Polymerase (5 PRIME GmbH), HotTaq DNA Polymerase (Abnova Corporation), AmpliTaq Gold® DNA Polymerase (Applied Biosystems), Bst DNA Polymerase Lg Frag (New England Biolabs), MasterAmp™ Tfl DNA Polymerase (EPICENTRE Biotechnologies), Red Hot DNA Polymerase (ABgene), Thermoprime Plus DNA Polymerase (ABgene), Taq-red DNA Polymerase (AppliChem GmbH), BIO-X-ACT™ Long DNA Polymerase (Bioline), BIO-X-ACT™ Short DNA Polymerase (Bioline), Bioline HybriPol™ DNA Polymerase (Bioline), BioTherm Taq DNA Polymerase (eEnzyme LLC), EU-Taq DNA Polymerase (eEnzyme LLC), Synergy Taq DNA Polymerase (eEnzyme LLC), GeneChoice® RedPOL™ DNA Polymerase (GeneChoice, Inc.), AccuPrime™ GC-Rich DNA Polymerase (Invi-trogen), PyroPhage® 3173 DNA Polymerase, Exo Minus (Lucigen), 9 Degrees North (Modified) DNA Polymerase (New England Biolabs), Therminator DNA Polymerase (New England Biolabs), Pwo DNA Polymerase (Roche Applied Science), Paq5000TM DNA Polymerase (Stratagene), YieldAce™ DNA Polymerase (Stratagene), e2TAKTM DNA Polymerase (Takara), ou DNA polimerases que ocorrem naturalmente, de P. kodakaraensis, P. furiosus, T. gorgonarius, T. zilligii, T. litoralis "VentTM", P. GB-D "Deep Vent”, T. 9N-7, T. aggregans, T. ba-rossii, T. fumicolans, T. celer, Pyrococcus sp. Cepa ST700, T. pacifi-cus, P. abysii, T. profundus, T. siculi, T. hydrothermalis, Thermococcus sp. Cepa GE8, T. thioreducens, P. horikoshii ou T. onnurineus NA1, Thermococcus sp. 9oN-7, Thermococcus sp. GI-J, Thermococcus sp. MAR-13, Thermococcus sp. GB-C, Thermococcus sp. GI-H, Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermus caldophilus, Thermus fili-formis, Thermus flavus, Thermotoga maritima, Bacillus stearother-mophilus, ou Bacillus caldotenax.

E. Amplificação de ácido nucleico, PCR

[00034] A invenção refere-se a reações que amplificam ácidos nu-cleicos. Exemplos de reações de amplificação incluem, sem limitação, PCR, NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) ABSAN (amplificação baseada em sequência de ácidos nucleicos), SDA (Strand Displacement Amplification), LAMP (loop-mediated isothermal amplification), e RCA (Rolling Circle Amplification). Ver, por exemplo, Patente dos Estados Unidos 4.683.202 (PCR); Patente dos Estados Unidos 6.326.173 e Journal of Virological Methods 151:283-293 (2008) (NASBA); Patente dos Estados Unidos 5.648.211 (SDA); Patente dos Estados Unidos 6.410.278 (LAMP); e Patente dos Estados Unidos 6.287.824 (RCA). Todas das precedentes são incorporadas neste relatório como referência. Aquele versado no estado da técnica entenderá quais reagentes são apropriados proporcionar. Cada um desses métodos envolve síntese de DNA, e como tais envolve o uso de DNA Poli-merases, nucleotídeos e cátions divalentes (supridos como um sal), particularmente, magnésio, em uma solução conducente a polimeriza-ção de DNA e em que o modelo está presente. Os métodos variam em termos de proporcionar atividades catalíticas adicionais, o uso de ter-mociclagem ou incubação isotérmica, e o uso e estrutura de iniciadores. Um tampão sob um pH adequado tais como entre 7 e 8, entre 6,5 e 8,5, entre 6 e 9, ou aproximadamente, 7,4 ou 7,5 é também, tipicamente proporcionado.

[00035] Em PCR, é proporcionado um par de iniciadores que se liga a cada extremidade de uma região-alvo, em fitas opostas de tal forma que cada síntese de iniciador na direção do outro iniciador. A reação é termociclada de modo a conduzir desnaturação do substrato em uma etapa de alta temperatura, recozimento dos iniciadores sob uma etapa de temperatura inferior, e extensão sob uma temperatura que poderá ser, mas não é necessariamente, maior que àquela da etapa de reco-zimento. Amplificação ocorre porque os produtos de um ciclo podem funcionar como modelo no ciclo seguinte.

[00036] Em NASBA, é proporcionada uma RNA polimerase (RNAP) além da DNA polimerase, a qual poderá também ser uma transcriptase reversa (TR) (por exemplo, uma enzima que pode catalisar síntese de DNA usando um modelo de RNA ou DNA). São proporcionados iniciadores que são similares àqueles usados em PCR, exceto que pelo menos um iniciador adicionalmente compreende uma sequência promotora que é reconhecida pela RNAP. Desse modo, o produto da TR funciona como modelo para a RNAP, a qual sintetiza RNA que funciona como modelo para a TR, levando à amplificação. Em algumas formas de NASBA, RNase H é proporcionada para produzir DNA de fita simples após síntese de um híbrido de RNA-DNA por TR. Amplificação ocorre via a ação combinada da TR e RNAP, na ausência de desnaturação térmica repetida.

[00037] SDA é uma técnica em que DNA é amplificado de uma maneira isotérmica e assíncrona, significando que desnaturação térmica cíclica não é usada para separar as fitas; em vez disso, deslocamento das fitas ocorre por meio da própria síntese de DNA, em que extensão de um 3’-OH causa deslocamento da fita a jusante. O 3’-OH é proporcionado inicialmente, por um iniciador exterior e, subsequentemente, por uma reação de corte. Dois pares de iniciadores são proporcionados. Um par "interior" liga-se circundante a amplicon e, adicionalmente, compreende 5’ abas contendo um sítio de restrição. O outro, par "exterior" é posicionado distante do centro, isto é, adicionalmente, a partir da região-alvo. Um iniciador interior poderá ligar-se ao modelo, ser estendido, e em seguida ser deslocado por meio de síntese do iniciador exterior correspondente. Subsequentemente, o DNA deslocado é produzido em fita dupla, por exemplo, por meio de síntese de fitas. A etapa seguinte é para cortar uma fita da molécula de fita dupla, a qual poderá ser feita usando nucleotídeos modificados e um sítio de restrição em que o sítio de clivagem é inativado em uma fita (mas não a outra) pelo nucleotídeo modificado. A enzima de restrição correspondendo a esse sítio é proporcionada na reação e gera o corte. O 3’-OH no corte resultante é em seguida estendido pela DNA polimerase, deslo-cando uma fita (a qual poderá novamente funcionar como um modelo1) e a molécula de fita dupla regenerada é novamente um substrato de corte (nicking) seguido por extensão e deslocamento, levando à amplificação. Desnaturação térmica repetida não é necessária.

[00038] LAMP é um procedimento de amplificação destinado a ser altamente específico, isto é, pode distinguir entre modelos que diferem por apenas um polimorfismo único de nucleotídeo (SNP), em que um alelo é um substrato de amplificação e o outro não é. É também isotérmico. Como em SDA, dois pares de iniciadores, interior e exterior, são proporcionados; os iniciadores interiores também apresentam uma aba 5’. Contudo, em LAMP, a aba 5’ de cada iniciador interior contém uma sequência que emparelha uma sequência dentro da fita do modelo a qual se liga, interna ao sítio onde a porção 3’ do iniciador se liga. Por exemplo, se o iniciador anela-se à fita (+) de uma molécula-modelo, a qual contém uma sequência a jusante A, em seguida a aba do iniciador poderá também conter a sequência A. Notavelmente, o locus SNP que deve ser distinguido por essa reação é localizado na borda da região ligada pela aba, correspondendo à última base na extremidade 5’ da aba. A última base na extremidade 5’ da aba do iniciador interior reverso também corresponde ao locus SNP. Como em SDA, o iniciador interno é estendido e em seguida deslocado por extensão do iniciador externo. Quando isso ocorre, a aba 5’ forma uma alça ligando seu complemento (que é agora parte da mesma molécula; que continua o exemplo acima, a fita deslocada contém o complemento reverso de sequência A, designado sequência T, e a sequência A na aba liga-se intramolecularmente à sequência T). O iniciador interno reverso anela-se à fita deslocada em alças, internas à sua extremidade 3’ (que corresponde ao iniciador externo reverso) e síntese de iniciadores, a qual desloca a alça e forma um DNA parcialmente de fita dupla, parcialmente de fita simples. Em seguida, o iniciador externo reverso anela-se à porção de fita simples e síntese de iniciadores, causando deslocamento de fitas. A fita deslocada pode agora formar uma alça em que sua extremidade 3’ é pareada a uma porção interna da molécula. Apenas, se o locus SNP emparelha-se à extremidade 3’ (que é derivada de uma aba do iniciador interno que foi exogenamente suprido) ocorre extensão. Adicionalmente, eventos de recozimento do iniciador, formação de alça e extensão/deslocamento, descritos na referência citada acima, resultam na amplificação seletiva de modelos com o alelo de SNP que se emparelha a aba do iniciador.

[00039] Em RCA, utiliza-se um modelo circular de DNA. Um iniciador anela-se ao círculo e é estendido continuamente, com a polimera-se que desloca o DNA sintetizado durante a revolução anterior à medida que se prossegue. Essa reação prossegue com cinética linear e produz produtos longos, concatemerizados. Em RCA de iniciadores duplos, é proporcionado um segundo iniciador que se anela ao produto concatemerizado da reação acima. Esta versão da reação permite uso de produto como modelo, e, portanto, resulta na cinética exponencial. Como em outras reações isotérmicas, o produto torna-se adequado para recozimento a iniciador em RCA de iniciadores duplos por meio de deslocamento das fitas devido à extensão de iniciadores a montante; nesse caso os iniciadores são ligados com outros concatâmeros, adicionalmente a montante na fita do modelo.

[00040] Uma modalidade da invenção, por exemplo, é amplificar um DNA modelo rico em GC por meio de PCR em que dNTPs são proporcionados com uma razão de GC/AT maior que um. Em reações de amplificação em ciclos, tal como, por exemplo, PCR, o número de ci-clos da reação poderá ser entre 20 e 40, por exemplo, aproximadamente 20, 25, 30, 35 ou 40 ciclos. A invenção, adicionalmente, refere-se a outras reações de amplificação em que um modelo rico em GC é amplificado em uma reação em que dNTPs são proporcionados com uma razão de GC/AT maior que um; a reação poderá ser, por exemplo, NASBA, SDA, LAMP ou RCA.

F. Iniciadores de PCR

[00041] A invenção refere-se a métodos que compreendem proporcionar iniciadores forward e reverse. Os iniciadores poderão ser destinados a recozer-se à aproximadamente 15-30, 15-25, 15-20, 20-30, ou 20-25 nucleotídeos em cada extremidade da sequência do modelo.

[00042] Os iniciadores poderão recozer-se com sequências que flanqueiam a região de repetição CGG no 5’ UTR de FMR1. Exemplos de tais iniciadores forward incluem CGG TGG AGG GCC GCC TCT GAG C (ID SEQ NO: 1), CAG GCG CTC AGC TCC GTT TCG GTT T (ID SEQ NO: 2), CAG TCA GGC GCT CAG CTC CGT TTC G (ID SEQ NO: 3), TCC GGT GGA GGG CCG CCT CTG AGC (ID SEQ NO: 4), GGT TCG GCC TCA GTC AGG CGC TCA GCT CCG TTT CG (ID SEQ NO: 5), GGG TTC GGC CTC AGT CAG GCG CTC AGC TCC GTT TCG (ID SEQ NO: 6), GCG GGC CGG GGG TTC GGC CTC AGT CA (ID SEQ NO: 7), CAG CGG GCC GGG GGT TCG GCC TCA G (ID SEQ NO: 8), GCA GCG GGC CGG GGG TTC GGC CTC A (ID SEQ NO: 9), GGG CCG GGG GTT CGG CCT CAG TCA G (ID SEQ NO: 10), GGG GTT CGG CCT CAG TCA GGC GCT CA (ID SEQ NO: 11), GGG GTT CGG CCT CAG TCA GGC GCT CAG (ID SEQ NO: 12), GGC GCT CAG CTC CGT TTC GGT TTC ACT TCC (ID SEQ NO: 13), TCA GGC GCT CAG CTC CGT TTC GGT TTC A (ID SEQ NO: 14), CAC TTC CGG TGG AGG GCC GCC TCT GA (ID SEQ NO: 15), e TTC CGG TGG AGG GCC GCC TCT GAG C (ID SEQ NO: 16). Exemplos de tais iniciadores reverse incluem CGC ACT TCC ACC ACC AGC TCC TCC A (ID SEQ NO: 17), GGA GCC CGC CCC CGA GAG GTG (ID SEQ NO: 18), GGG AGC CCG CCC CCG AGA GGT (ID SEQ NO: 19), CGC ACT TCC ACC AGC TCC TCC AT (ID SEQ NO: 20), CGG GAG CCC GCC CCC GAG AGG TG (ID SEQ NO: 21), CCG GGA GCC CGC CCC CGA GAG GT (ID SEQ NO: 22), CCG GGA GCC CGC CCC CGA GAG GTG (ID SEQ NO: 23), CGC CGG GAG CCC GCC CCC GAG AGG TG (ID SEQ NO: 24), GCG CCG GGA GCC CGC CCC CGA GAG GT (ID SEQ NO: 25), CGC CGG GAG CCC GCC CCC GAG AGG T (ID SEQ NO: 26), GCG CCA TTG GAG CCC CGC ACT TCC ACC A (ID SEQ NO: 27), GCG CCA TTG GAG CCC CGC ACT TCC A (ID SEQ NO: 28), AGC GCC ATT GGA GCC CCG CAC TTC C (ID SEQ NO: 29), CGC CAT TGG AGC CCC GCA CTT CCA C (ID SEQ NO: 30), TTG GAG CCC CGC ACT TCC ACC ACC A (ID SEQ NO: 31), AGC CCC GCA CTT CCA CCA CCA GCT CCT C (ID SEQ NO: 32), GAG CCC CGC ACT TCC ACC ACC AGC TCC T (ID SEQ NO: 33), CAT TGG AGC CCC GCA CTT CCA CCA CCA G (ID SEQ NO: 34), CCC GCA CTT CCA CCA GCT CCT CCA TCT (ID SEQ NO: 35), TAG AAA GCG CCA TTG GAG CCC CGC ACT TCC (ID SEQ NO: 36), e AAG CGC CAT TGG AGC CCC GCA CTT CC (ID SEQ NO: 37).

G. Intensificadores

[00043] Em algumas modalidades, intensificadores poderão ser proporcionados. Os intensificadores contribuem para o sucesso de reações que geram produto rico em GC. Uma variedade de intensificadores poderá ser incluída em reações de PCR, em geral, para aumentar rendimento, especificidade e consistência, e poderá operar reduzindo a Tm de DNA modelo. Intensificadores poderão funcionar por meio de desestabilização helicoidal, neutralização de inibidores de reação, ou outros mecanismos, incluindo mecanismos desconhecidos. Intensificadores incluem, sem limitação, betaína, análogos de betaína, glicerol, albumina sérica bovina (BSA), polietileno glicol, cloreto de te-trametilamônio, 7-desaza-GTP, detergentes neutros, sulfóxido de di-metila (DMSO), metanol, etanol, isopropanol, formamida, acetona, acetamida, N-metilformamida, N,N-dimetilformamida, acetona, aceti-mida, N-metilacetimida, N,N-dimetilacetimida, 2-pirrolidona, N-metilpir-rolidona, propionamida, e isobutiramida. Detergentes neutros incluem, sem se limitar aos mesmos, TWEEN-20, β-octil-glicosídeo, octil-β-tio-glicopiranosídeo, Triton X-100, Triton X-114, NP-40, Brij-35, Brij-58, Tween-80, Pluronic F-68, Pluronic F-127, Deoxy Big CHAP, CHAPS, CHES, nonilfenoxilpolietoxiletanol (Tergitol-tipo NP-40), e octilfenoxil-polietoxiletanol (Igepal CA-630). Análogos de betaína incluem, mas sem se limitar aos mesmos, homodeanol betaína, deanol betaína, pro-pio betaína, homoglicerol betaína, dietanol homobetaína, trietanol ho-mobetaína, hidroxipropil homobetaína, N-metil-N-(2-carboxietil)morfolí-nio sal interno, N-metil-N-(2-carboxietil)piperidínio sal interno, N-metil-N-(2-carboxietil)pirrolidínio sal interno, N,N-dimetil-N-(2-hidroxietil)-N-(2-sulfoetil)amônio sal interno, N,N-dimetil-N-(2-hidroxietil)-N-(3-sulfo-propil)amônio sal interno, N,N-diidroxietil-N-metil-N-(3-sulfopropil)amô-nio sal interno, N,N-dimetil-N-(2-hidroxietil)-N-(4-sulfobutil)amônio sal interno, N-metil-N-(3-sulfopropil)morfolínio sal interno, e N-metil-N-(3-sulfopropil)piperidínio sal interno.

[00044] Betaína, análogos de betaína e/ou outros intensificadores poderão ser proporcionados em concentrações molares entre 0,01 e 5 M, 0,01 e 4 M, 0,01 e 3 M, 0,01 e 2,5 M, 0,02 e 5 M, 0,03 e 5 M, 0,04 e 5 M, 0,05 e 5 M, 0,07 e 5 M, 0,1 e 5 M, 0,2 e 5 M, 0,3 e 5 M, 0,4 e 5 M, 0,5 e 5 M, 0,7 e 5 M, 1 e 5 M, 1,5 e 5 M, 0,1 e 4 M, 0,5 e 3 M, 1 e 2,5 M, ou 1,5 e 2,5 M, por exemplo, aproximadamente, 0,01; 0,02; 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 0,75; 1; 1,25; 1,5; 1,6; 1,7; 1,8; 1,9; 2,0; 2,1; 2,2; 2,3; 2,4; 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5; ou 5 M. Alternativamente, intensificadores poderão ser proporcionados em concentrações percentuais de p/v ou v/v de entre 0,1 e 50%, 0,2 e 50%, 0,5 e 50%, 1 e 50%, 2 e 50%, 5 e 50%, 0,1 e 40%, 0,1 e 30%, 0,1 e 20%, 0,5 e 40%, 1 e 30%, ou 2 e 20%, por exemplo, aproximadamente 0,1; 0,2; 0,5; 1; 2; 5; 10; 15; 20; 25; 30; 35; 40; 45 ou 50% em volume. Detergentes neutros poderão ser proporcionados em, entre 0,0001 e 10% em volume, 0,0002 e 10%, 0,0005 e 10%, 0,001 e 10%, 0,002 e 10%, 0,005 e 10%, 0,01 e 10%, 0,02 e 10%, 0,05 e 10%, 0,0001 e 5%, 0,0001 e 2%, 0,0001 e 1%, 0,0005 e 1%, ou 0,001 e 1%, por exemplo, aproximadamente 0,0001; 0,0002; 0,0003; 0,0004; 0,0005; 0,0006; 0,0007; 0,0008; 0,0009; 0,001; 0,002; 0,003; 0,004; 0,005; 0,006; 0,007; 0,008; 0,009; 0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,06; 0,07; 0,08; 0,09; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9 ou 10% em volume. Aqueles versados na técnica reconhecerão concentrações apropriadas para vários intensificadores.

H. Sal de Magnésio

[00045] A invenção refere-se a métodos que compreendem proporcionar sais de magnésio. Um sal de magnésio é um composto químico contendo magnésio e a base conjugada de um ácido. Os sais de magnésio poderão compreender, por exemplo, e sem limitação, cloreto de magnésio, acetato de magnésio, sulfato de magnésio, brometo de magnésio, ou iodeto de magnésio. Os sais de magnésio são proporcionados em tal quantidade que a concentração final de magnésio poderá ser entre 1 e 5 mM, 1 e 4,5 mM, 1 e 4 mM, 1 e 3,5 mM, 1 e 3 mM, 1,5 e 5 mM, 2 e 5 mM, 2,5 e 5 mM, 3 e 5 mM, 1,5 e 4,5 mM, ou 2 e 4 mM. Por exemplo, a concentração final de magnésio poderá ser aproximadamente 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5 ou 5 mM.

I. Tampão

[00046] A invenção refere-se a métodos que compreendem proporcionar tampões. Os tampões poderão compreender, por exemplo, e sem limitação, tris (hidroximetil)aminometano(Tris), bis-tris propano, bicarbonato, fosfato, glicina, histidina, ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinoetanos-sulfônico (HEPES), ácido 3-(N-morfolino)propanossulfônico (MOPS), e várias bases conjugadas/ácidos e sais destes.

J. Dados, Produtos e Usos

[00047] Em algumas modalidades, os produtos gerados pelos métodos da invenção poderão compreender aproximadamente 5, 10, 20, 30, 40, 50, 70, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 700, 800, 900, 1.000, 2.000 ou mais repetições CGG. Em algumas modalidades, as reações de amplificação da invenção envolvem amplificação de alelos contendo mais repetições do que os padrões 5’ UTR de FMR1 Coriell contendo 20, 28-29, 118, 198, ou aproximadamente 330 repetições CGG. Os produtos gerados pelos métodos da invenção poderão compreender várias repetições CGG entre 5 e 2.000, 10 e 2.000, 20 e 2.000, 30 e 2.000, 40 e 2.000, 50 e 2.000, 70 e 2.000, 100 e 2.000, 150 e 2.000, 200 e 2.000, 250 e 2.000, 300 e 2.000, 5 e 1.000, 5 e 700, 5 e 500, 5 e 400, 5 e 300, 10 e 1.000, 10 e 700, 20 e 500, 30 e 400, ou 100 e 300. Os dados obtidos por meio da invenção, os resultados dos testes, poderão ser usados para diagnosticar a presença ou ausência de uma condição ou doença. Os dados obtidos por meio do uso da invenção poderão ser utilizados na determinação do genótipo de um indivíduo. Os dados obtidos por meio da invenção poderão ser usados para detectar genótipos associados à Síndrome do Cromossomo X Frágil, Síndrome de tremor/ataxia associada ao cromossomo X Frágil, e insuficiência ovariana primária associada ao Cromossomo X Frágil. Loci genéticos associados a essas condições são conhecidos no estado da técnica e, incluem sem limitação, FMR1, FMR2, o 5’ UTR de FMR1, o 5’ UTR de FMR2, as repetições CGG no 5’ UTR de FMR1, e as repetições CGG no 5’ UTR de FMR2. Em uma modalidade adicional, os dados obtidos por meio da invenção poderão ser usados para detectar genótipos associados a transtornos de repetição de trinucleo-tídeos ricos em GC, tais como Síndrome do Cromossomo X Frágil, Síndrome de tremor/ataxia associada ao cromossomo X Frágil, e insuficiência ovariana primária associada ao Cromossomo X Frágil, distro-fia miotônica, doença de Huntington, atrofia muscular espinobulbar, atrofia dentatorubral-palidoluisiana, e/ou ataxia espinocerebelar. Loci genéticos associados a essas condições são conhecidos na técnica e incluem sem limitação, FMR1, FMR2, DMPK, ZNF9, HTT, AR, ATN1, ATXN1-3, ATXN7, ATXN10, CACNA1A, SCA8, PPP2R2B e TBP. Vide, por exemplo, Nat. Genet. Maio de 1996; 13(1):105-8; Nat. Genet. Maio de 1996; 13(1):109-13.

Exemplo 1

[00048] O efeito de razões variáveis de GC/AT, concentração total de dNTP, e concentração de betaína foi medido por meio de processamento de uma série de reações com razões GC/AT de 1, 5 ou 10; concentrações totais de dNTP (Roche, GMP Grade Cat. N° G 04631129103, C 04631072103, A 04631056103, T 04631137103) de 0,75, 1,0, ou 1,25 mM; e concentrações de betaína (Sigma Cat. N° B0300-1VL) de 1,7, 2,0 ou 2,2 mM. Os modelos foram uma mistura de 10 ng de cada um dos DNAs genômicos mostrados na tabela 1. Expand Long Template PCR System Tampão 2 (Roche Cat. N° 11681834001) foi utilizado juntamente com Taq Polimerase recombi-nante (Roche Cat. N° 03734935001) em 1.125 unidades por reação. Os iniciadores foram como in Saluto e outros J. Mol. Diagn. 7: 605-12 (2005) em 1 μM para cada iniciador. O perfil de ciclagem de PCR foi como in Saluto e outros, exceto para o número de ciclos, resumidamente, descritos em linha gerais como segue: desnaturação sob 98°C por 10 minutos; 10 ciclos sob 97°C por 35 segundos, 64°C por 35 segundos, 68°C por 4 minutos; 15 ciclos a 97°C por 35 segundos, 64°C por 35 segundos, 68°C por 4 minutos, mais um incremento de 20 segundos para cada ciclo; e uma extensão final a 68°C por 10 minutos. Seis microlitros de produto de PCR foram submetidos à eletroforese em 5 v/cm por 45 minutos em um gel de agarose NuSieve a 1,75% com 1 X tampão biônico seguido por coloração Gold SYBR e visualização por luz UV.

[00049] Razão de GC:AT, concentração de betaína, e concentração total de dNTP em relação a lanes 1-3 e 5-28 são mostradas na tabela 2.

[00050] Amplificação dos alelos com números maiores de repetições CGG foi claramente aperfeiçoada sob razões maiores de concentrações de betaína e GC/AT (Fig. 1).

Exemplo 2

[00051] Para teste adicional o efeito de razões GC/AT desviadas, um conjunto de reações de PCR foi processado usando diferentes graus de desvio com razões de 1,1 a 25 (figura 2), mais uma reação de controle com uma razão GC/AT de 1. Concentração total de dNTP (Roche, GMP Grade Cat. N° G 04631129103, C 04631072103, A 04631056103, T 04631137103) foi mantida constante em 1 mM. Uma mistura de modelos, totalizando 10 ng, contendo fragmentos de alelos do 5’ UTR de FMR1 apresentando 20, 28, 118, 198 e 336 repetições CGG foi proporcionada. Expand Long Template PCR System Buffer 2 (Roche Cat. N° 11681834001) foi utilizado juntamente com Taq Poli-merase recombinante (Roche, Cat. N° 03734935001) sob 1.125 unidades por reação. Betaína (Sigma Cat. N° B0300-1VL) estava presente em 2,2 M. Os iniciadores foram como in Saluto e outros J. Mol. Diagn. 7:605-12 (2005) em 1 μΜ para cada iniciador. O perfil de ciclagem de PCR foi como in Saluto e outros, exceto para o número de ciclos, resumidamente, descrito em linhas gerais como segue: desnaturação a 98°C por 10 minutos; 10 ciclos a 97°C por 35 segundos, 64°C por 35 segundos, 68°C por 4 minutos; 15 ciclos a 97°C por 35 segundos, 64°C por 35 segundos, 68°C por 4 minutos, mais um incremento por 20 segundos para cada ciclo; e uma extensão final a 68°C por 10 minutos. Seis microlitros de produto de PCR foram submetidos à eletroforese em 5 V/cm por 45 minutos em um gel de Agarose NuSieve a 2,0% com 1 X Tampão Biônico seguido por coloração SYBR Gold e visualização por luz UV.

[00052] Razões de GC:AT para Lanes 2-18 são mostradas na tabela 3.

[00053] Síntese e rendimento de produtos de peso molecular superior, contendo números maiores de repetições CGG e uma riqueza maior total de GC foi claramente aperfeiçoada em relação a Pista 1 sobre uma faixa ampla de razões de GC/AT.

[00054] O relatório descritivo é mais minuciosamente entendido à luz dos ensinamentos das referências citadas no relatório descritivo. As modalidades no relatório descritivo proporcionam uma ilustração de modalidades da invenção, e não devem ser interpretadas para limitar o escopo da invenção. Aquele versado na técnica prontamente reconhece que muitas outras modalidades são abrangidas pela invenção. Todas as publicações e patentes citadas nesta descrição são incorporadas como referência em sua totalidade. Na medida em que o material incorporado como referência contradiz, ou é inconsistente com este relatório descritivo, o relatório descritivo substituirá qualquer tal material. A citação de quaisquer referências neste relatório, não é uma admissão de que tais referências são técnica anterior da presente invenção.

[00055] A não ser que de outra maneira indicado, todos os números expressando quantidades de ingredientes, condições de reação e, assim por diante, usados no relatório descritivo, incluindo reivindicações, devem ser entendidos como sendo modificados em todos os exemplos pelo termo "aproximadamente". Consequentemente, a não ser que de outra maneira indicado ao contrário, os parâmetros numéricos são aproximações e poderão variar dependendo das propriedades desejadas procuradas ser obtidas pela presente invenção. No mínimo, e não como uma tentativa de limitar à aplicação da doutrina de equivalentes para o escopo das reivindicações, cada parâmetro numérico deve-se ser interpretado, levando em consideração o número de dígitos significativos e abordagens comuns de arredondamento.

[00056] A não ser que de outra maneira indicado, o termo "pelo menos" que precede uma série de elementos deve ser entendido referir-se a cada elemento na série. Aqueles versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de verificar que se utilizam não mais do que experimento rotineiro, muitos equivalentes para as modalidades específicas da invenção descritas neste relatório. Tais equivalentes são entendidos ser abrangidos pelas reivindicações seguintes.

Claims

Método para aumentar a processabilidade de uma ou mais DNA polimerases em pelo menos um modelo de DNA rico em GC, o método caracterizado pelo fato de que compreende realizar uma reação de amplificação de DNA em uma solução aquosa compreendendo dNTPS em uma razão de GC/AT de entre 1,2 e 25.
Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o modelo de DNA rico em GC apresenta uma riqueza de GC de pelo menos 65% ou pelo menos 90%.
Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que o modelo de DNA rico em GC compreende pelo menos cinco repetições consecutivas de um di, tri, ou tetranucleotídeo que consistem em resíduos G e C.
Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o modelo de DNA rico em GC compreende repetições CGG do 5’ UTR de Retardo Mental Frágil X 1 (FMR1) ou repetições CGG do 5’ UTR de Retardo Mental Frágil X 2 (FMR2).
Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a solução aquosa adicionalmente compreende pelo menos um intensificador.
Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que pelo menos um intensificador compreende:
- a. betaína ou um análogo de betaína; e
- b. pelo menos um composto selecionado a partir do grupo que consiste de DMSO, um detergente neutro e 7-desaza-GTP.
Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 5, caracterizado pelo fato de que compreende amplificação do modelo rico em GC em uma solução aquosa que compreende:
- a. pelo menos um modelo de DNA rico em GC;
- b. pelo menos um sal de magnésio;
- c. pelo menos uma DNA polimerase;
- d. pelo menos um tampão; e
- e. dNTPS em uma razão GC/AT de 1,2 ou superior;
e submeter à solução, a pelo menos um período de incubação, durante o qual ocorre amplificação.
Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que pelo menos um modelo rico em GC é amplificado por meio de um procedimento escolhido de pelo menos um de SDA, NASBA, LAMP, RCA ou LCR.
Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente proporcionar pelo menos um iniciador que se anela a pelo menos um modelo rico em GC.
Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende amplificar o modelo por meio de PCR em uma solução aquosa que compreende:
- a. dNTPS em uma razão de GC/AT entre 2 e 10;
- b. pelo menos um intensificador escolhido de betaína, DMSO e um detergente neutro;
- c. pelo menos uma DNA polimerase;
- d. uma concentração total de magnésio de 1,5 - 2 mM; e
- e. uma concentração total de dNTP de 0,7 - 0,9 mM;
sendo que o pelo menos um modelo rico em GC compreende repetições CGG do 5’ UTR de FMR1.
Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o detergente neutro compreende TWEEN-20.
Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a PCR produz o produto que compreende pelo menos 200 repetições CGG ou pelo menos 300 repetições CGG.
Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um genótipo associado a um transtorno de repetição de trinucleotídeo rico em GC é detectado, compreendendo realizar uma reação de amplificação de DNA em pelo menos um genótipo associado a repetições ricas em GC.
Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o genótipo detectado é associado à Síndrome de Cromossomo X Frágil, Síndrome de tremor ataxia associada ao cromossomo X Frágil, e/ou insuficiência ovariana primária associada ao Cromossomo X Frágil.