BRPI1005384B1 - Método de obtenção de rebaudiosídeo d purificado - Google Patents

Abstract

REBAUDIOSÍDEO DE ALTA PUREZA E APLICAÇÕES. A presente invenção oferece métodos para a purificação de Rebaudiosídeo D a partir de extrato da planta Stevia rebaudiana Bertoni junto com Rebaudiosídeo A. Os métodos são úteis para produzir Rebaudiosídeo D de alta pureza e Rebaudiosídeo A. A invenção oferece ainda produtos contendo o Rebaudiosídeo D purificado.

Description

Campo da Invenção

[001] A invenção refere-se a um processo para o isolamento e a purificação de glicosídeos doces individuais a partir de extrato da planta Stevia rebaudiana Bertoni, e mais particularmente ao isolamento e purificação do Rebaudiosídeo D a partir de extrato da planta Stevia rebaudiana Bertoni e ainda a produtos adoçados com adoçante de alta intensidade.

Descrição da Técnica Correlata

[002] Adoçaantes são ingredientes críticos no abastecimento de alimentos. A demanda por bebidas e produtos alimentícios de baixa caloria resulta no crescente consumo de adoçantes; por conseguinte é necessário reduzir as calorias oferecidas pelos adoçantes. Este objetivo pode ser atingido pelo uso de adoçantes de alta intensidade.

[003] Os adoçantes de alta intensidade possuem um nível de doçura muitas vezes mais alto que o da sacarose. Eles são essencialmente não calóricos e são amplamente usados na produção de alimentos diet e de caloria reduzida. Embora o adoçante calórico natural tal como sacarose, frutose e glicose proporcionem o sabor mais desejável aos consumidores, eles são calóricos. Os adoçantes de alta intensidade ãno afetam o nível de glicose no sangue e oferecem pouco ou nenhum valor nutritivo.

[004] Entretanto, os adoçantes de alta intensidade que geralmente são usados como substitutos da sacarose possuem característicos de sabor diferentes daquelas do açúcar, tais como sabor doce com perfil temporal, resposta máxima, perfil de sabor, sensação na boca, e/ou comportamento de adaptação diferentes das do açúcar. Por exemplo, o sabor doce de alguns adoçantes de alta intensidade é mais lento no início e de duração mais longa do que aquele do açúcar e, portanto, varia o equilíbrio de sabor de uma composição alimentícia. Por causa destas diferenças, o uso de um adoçante de alta potência para substituir um adoçante em massa como o açúcar em um alimento ou bebida causa um perfil temporal e/ou de sabor desequilibrados. Se o perfil de sabor dos adoçantes de alta potência puder ser modificado para conferir características de sabor desejadas, ele pode proporcionar bebidas e produtos alimentícios de baixa caloria com características de sabor mais desejáveis para os consumidores.

[005] Por outro lado, adoçantes de alta potência podem apresentar algumas vantagens em termos de custo e funcionais em comparação com o açúcar. A competição entre adoçantes de alta potência à base de açúcar e os adoçantes de alta potência sem açúcar é acirrada na indústria de bebidas leves, nos países em que seu uso e produção são permitidos e também nos países nos quais o preço do açúcar é exorbitante.

[006] Hoje em dia, adoçantes de alta intensidade são usados no mundo todo. Eles podem ser de origem sintética e natural.

[007] Exemplos não limitativos de adoçantes sintéticos incluem sucralose, acesulfame de potássio, aspartame, alitame, sacarina, derivados sintéticos de neo-hesperidina di-hidrochalcona, ciclamato, neotame, dulcin, suosan, 1-metil éster de N-[N-[3-(3-hidroxi-4-metoxifenil)propil]-L- a- aspartil]-L-fenilalanina, 1-metil éster de N-[N-[3- (3-hidroxi-4-metoxifenil)-3-metilbutil]-L- a- aspartil]-L- fenilalanina, 1-metil éster de N-[N-[3- (3-metoxi-4-hidroxifenil)propil]-L- a-aspartil]-L- fenilalanina, sais dos mesmos, entre outros, e combinações dos mesmos.

[008] Exemplos não limitativos de adoçantes naturais de alta intensidade incluem Steviosídeo, Rebaudiosídeo A, Rebaudiosídeo B, Rebaudiosídeo C, Rebaudiosídeo E, Rebaudiosídeo F, Steviolbiosídeo, Dulcosídeo A, Rubusosídeo, mogrosídeos, brazzein, neo-hesperidina di-hidrochalcona (NHDC), ácido glicizzícico e seus sais, taumatina, perilartina, pernandulcin, mucuroziosídeos, baiyunosídeos, flomisosídeo-I, ácido dimetil-hexa-hidrofluoreno- dicarboxílico, abrusosídeos, periandrin, carnosiflosídeos, ciclocariosídeo, pterocariosídeos, polipodosídeo A, brazilina, hernandulcin, filodulcin, glicifilina, florizina, trilobatina, di- hidroflavonol, di-hidroquercetin-3-acetato, neoastilibina, trans-cinamaldeído, monatina e seus sais, selligueain A, hematoxilina, monelina, osladina, pterocariosídeo A, pterocariosídeo B, mabinlina, pentadina, miraculina, curculina, neoculina, ácido clorogênico, cinarina, siamenosídeo e outros.

[009] Os adoçantes de alta intensidade podem ser derivados da modificação deadoçantes de alta intensidade naturais, por exemplo, por fermentação, tratamento enzimático, ou derivatização.

[0010] Atualmente cerca de onze adoçantes de alta intensidade são usados em todo o mundo. Estes são acesulfame-K, alitame, aspartame, ciclamato, glicirrizina, NHDC, sacarina, Steviosídeo, sucralose, taumatina, neotame, e Rebaudiosídeo A.

[0011] Os adoçantes de alta intensidade podem ser agrupados em três gerações. A primeira geração representada por ciclamato, glicirrizina e sacarina tem uma longa história de uso em alimentos. A segunda geração inclui acesulfame-K, aspartame, NHDC e taumatina. Alitame, neotame, sucralose, Steviosídeo, e Rebaudiosídeo A pertencem à terceira geração.

[0012] O poder adoçante padrão associado a cada adoçante de alta intensidade está dado na TABELA 1. No entanto, quando eles são usados em misturas, o poder adoçante pode mudar significativamente. TABELA 1

[0013] Por outro lado, alimentos e bebidas ‘naturais’ e ‘orgânicos’ tornaram-se a “área mais aquecida” na indústria alimentícia. A acombinação de desejo dos consumidores, avanços na tecnologia de alimentos, novos estudos associando dieta a doenças e prevenção de doenças criou uma oportunidade sem precedentes para abordar a saúde pública através da dieta e do estilo de vida.

[0014] Um número crescente de consumidores percebe a possibilidade de controlar a saúde melhorando sua saúde atual e/ou prevenindo-se contra doenças futuras. Isto gera uma demanda por produtos com características melhoradas e os benefícios para a saúde associados, especificamente uma tendência de mercado de alimentos e consumidores coltada para um estilo de vida com “soluções para a boa saúde”. O termo “natural” é bastante emocional no mundo de adoçantes e foi identificado como um crédito essencial, junto com “grãos integrais”, “saúde do seu coração” e “baixo teor de sódio”. O termo ‘natural’ está estreitamente associado a ‘mais saudável’.

[0015] Neste contexto, adoçantes naturais de alta intensidade podem ter um maior potencial comercial.

[0016] Açúcares calóricos naturais, tais como sacarose, frutose e glicose são utilizados pesadamente na indústria de bebidas, alimentos, higiene/cosméticos dentais e orais devido ao seu sabor agradável. Em particular, a sacarose confere um sabor desejável para os consumidores. Embora a sacarose proporcione características de doçura superiores, ela é calórica. Embora calorias sejam necessárias para o funcionamento adequado do corpo, ainda é necessário no mercado a oferta de adoçantes alternativos não calóricos ou pouco calóricos com gosto semelhante ao do açúcar para consumidores com vida sedentária ou para aqueles conscientes do abuso de calorias. Novas formulações de bebidas, alimentos e molhos com teor zero ou baixo teor de açúcar são desejáveis. No entanto, em geral, os adoçantes não calóricos ou pouco calóricos possuem gostos associados indesejáveis para os consumidores tais como início de doçura demorado; gosto residual adocicado; gosto amargo; gosto metálico; gosto adstringente; gosto refrescante; gosto licoroso; e/ou similares. Se o perfil de gosto dos adoçantes naturais e sintéticos de alta potência puder ser modificado para conferir característicos de gosto desejadas específicas de modo a ficarem mais parecidos com açúcar, o tipo e a variedades de composições que poderão ser preparados com aquele adoçante seria significativamente expandido. Por conseguinte, seria desejável modificar seletivamente as características de gosto dos adoçantes naturais e sintéticos de alta potência. Também é muito importante que produtos para diabéticos (sem açúcar) ou produtos com caloria reduzida tenham o mínimo possível de diferenças em relação aos itens convencionais.

[0017] O desenvolvimento de novas formulações, por exemplo, empregando adoçantes, flavorizantes, realçadores de sabor, agentes de encorpamento entre outros, apresenta desafios em como lidar com o amargor associado e/ou outros sabores secundários e textura. Além disso, tais desafios se apresentam tipicamente nas formulações desenvolvidas para exibir características e/ou perfis de gosto melhorados mantendo as mesmas características de textura. Também, existe uma necessidade de novas formulações que atendam satisfatoriamente a combinação de objetivos que incluem objetivos nutricionais, de sabor, de vida de prateleira, e outros objetivos.

[0018] Constitui um objetivo da invenção oferecer um produto tendo características de sabor e características físicas excelentes. O produto compreende pelo menos um adoçante natural não nutritivo em uma quantidade suficiente para proporcionar adoçamento perceptível. A composição oferece um perfil de doçura mais semelhante ao açúcar devido ao uso do novo adoçante natural de alta intensidade tal como Rebaudiosídeo D.

[0019] Stevia rebaudiana Bertoni é um arbusto perene da família Asteraceae (Compositae) nativa de certas regiões da América do Sul. As folhas da planta contêm de 10 a 20% de glicosídeos de diterpeno, que são em torno de 150 a 450 vezes mais doces que o açúcar. As folhas são tradicionalmente usadas há centenas de anos no Paraguai e no Brasil para adoçar chás e produtos medicinais locais.

[0020] Atualmente existem mais de 230 espécies de Stevia com propriedades adoçantes significativas. A planta vem sendo cultivada com sucesso em uma ampla gama de condições desde seus subtrópicos nativos até latitudes setentrionais frias.

[0021] Glicosídeos de esteviol possuem zero calorias e podem ser usados em qualquer produto no qual se usa açúcar. Eles são ideais para dietas de diabéticos e de baixa caloria. Além disso, os glicosídeos de esteviol doces possuem propriedades funcionais e sensoriais superiores àquelas de muitos adoçantes de alta potência.

[0022] O extrato da planta Stevia rebaudiana contém uma mistura de diferentes glicosídeos de diterpeno doces, que possuem uma base única - esteviol e diferem pela presença de resíduos carboidrato nas posições C13 e C19. Estes glicosídeos se acumulam nas folhas de Stevia e compõem aproximadamente 10% - 20% do peso seco total. Tipicamente, em termos de peso seco, os quatro principais glicosídeos encontrados nas folhas de Stevia são Dulcosídeo A (0,3%), Rebaudiosídeo C (0,6%), Rebaudiosídeo A (3,8%) e Steviosídeo (9,1%). Outros glicosídeos identificados no extrato de Stevia incluem Rebaudiosídeo B, C, D, E, e F, Steviolbiosídeo e Rubusosídeo (FIG. 1). Entre os glicosídeos de esteviol somente o Steviosídeo e o Rebaudiosídeo A encontram-se disponíveis em escala comercial.

[0023] As estruturas químicas dos glicosídeos de diterpeno de Stevia rebaudiana Bertoni estão apresentadas na FIG. 2.

[0024] As propriedades físicas e sensoriais só são bem estudadas para o Stevioside e o Rebaudiosídeo A. A potência adoçante do Steviosídeo é cerca de 210 vezes maior que a da sacarose, a do Rebaudiosídeo A varia entre 200 e 400 vezes, e a do Rebaudiosídeo C e Dulcosídeo A é de cerca de 30 vezes. O Rebaudiosídeo A é considerado aquele que possui atributos sensoriais mais favorável dentre os quatro principais glicosídeos de esteviol (TABELA 2).

[0025] Os glicosídeos das folhas podem ser extraídos usando extração com água ou solvente orgânico. Extração com fluido supercrítico e destilação a vapor também foram descritas. Métodos para a recuperação de glicosídeos de diterpeno doces de Stevia rebaudiana usando a tecnologia de membranas, e água ou solventes orgânicos, tais como metanol e etanol também estão descritos. TABELA 2

[0026] Existem diversas publicações sobre a purificação de alguns glicosídeos de esteviol individuais.

[0027] Geralmente a produção de extrato inclui extração do material vegetal com água ou com uma mistura de água-solvente orgânico, precipitação das substâncias de alto peso molecular, desionização, e descoloração, purificação sobre adsorventes poliméricos macroporosos específicos, concentração e secagem.

[0028] A Patente US N ° 3.723.410 apresenta a extração de Steviosídeos de Stevia rebaudiana Bertoni. O método inclui remover a gordura das folhas de Stevia por tratamento com clorofórmio por mais de 150 horas a temperaturas de ebulição e três tratamentos com dioxano na presença de carbonato de cálcio por duas horas a temperaturas de ebulição. Depois da filtração, os filtrados de dioxano foram combinados e concentrados até atingir o estado de xarope à pressão reduzida a 50°C. Um volume igual de metanol foi então acrescentado ao xarope e a solução resultante foi deixada descansar por uma noite para permitir a cristalização. Os cristais foram recolhidos por filtração e lavados abundantemente com metanol gelado. A solução residual foi concentrada, um volume igual de metanol foi acrescentado, e a mistura foi deixada descansar por uma noite para cristalizar. Os cristais foram removidos por filtração e secados a vácuo a 100 °C. O rendimento de Steviosídeo foi de 6,5% provenientedas folhas secadas ao ar. O método é muito complicado com o uso de solventes orgânicos tóxicos. Não há informações sobre a pureza do Steviosídeo, no entanto nas condições descritas Rebaudiosídeos vão precipitar junto com o Steviosídeo. O processo é de difícil aplicação em escala comercial.

[0029] Um método para a produção de extrato de Stevia com isolamento adicional de Rebaudiosídeo A foi desenvolvido na Patente US N° 4.082.858. As folhas de Stevia secadas ao ar foram extraídas com água quente, e o extrato foi secado a vácuo. A mistura resultante foi extraída com metanol e o metanol foi removido dos extratos combinados por destilação à pressão reduzida. O xarope obtido foi submetido à separação cromatográfica sobre uma coluna de sílica gel usando uma mistura de n- propanol, água e etil acetato como a fase móvel. O método é útil apenas em escala laboratorial e apresenta várias desvantagens em escala comercial.

[0030] A Patente US N° 4.171.430 descreve a purificação de Stevioside a partir de extrato de Stevia. O método inclui extrair folhas de Stevia com água, concentrar a solução e extrair com metanol. Steviosídeo cristalizou a partir da solução de metanol e foi purificado em gel tipo estireno com tetra-hidrofurano como a fase móvel. O método é útil apenas em escala laboratorial. O processo é de difícil aplicação em escala comercial.

[0031] A Patente US N° 4.361.697 apresenta a extração, separação e recuperação de glicosídeos de diterpeno a partir de Stevia rebaudiana. O processo inclui as etapas de extração sequencial de material vegetal primeiro com um solvente de polaridade intermediária (tal como clorofórmio), e em seguida com um segundo solvente de alta polaridade (tal como metanol). O extrato resultante foi submetido a uma separação por cromatografia líquida. Os glicosídeos de esteviol ficaram na fração de metanol. Os principais inconvenientes foram o uso de vários solventes tóxicos para extrair e processar os glicosídeos doces. A purificação final dos glicosídeos foi obtida por cromatografia em coluna usando sorventes como sílica gel como a fase estacionária e eluição da coluna com dois solventes passando em sequência pela coluna. O processo é prejudicial ao meio ambiente e de difícil execução em grande escala.

[0032] Um método aperfeiçoado para a recuperação de glicosídeos de esteviol a partir da planta Stevia rebaudiana Bertoni, que não requer o uso de equipamento de separação especial tal como colunas de troca iônica e/ou colunas cromatográficas foi descrito na Patente US N° 4.599.403. A extração é realizada com água. O extrato aquoso resultante é tratado com ácido cítrico para remover impurezas metálicas e outras impurezas assim como para baixar o pH para cerca de 3,0. A mistura é filtrada através de Celite e o pH do filtrado é ajustado em 10,5 por óxido de cálcio. O precipitado formado é removido por filtração. O filtrado é concentrado e extraído com n-butanol. Cristais de Steviosídeo purificado são então recuperados por resfriamento da camada de água obtida da etapa de extração com solvente. As principais desvantagens do método são as perdas de glicosídeos durante a extração com n-butanol e também o baixo rendimento de cristais de Steviosídeo provenientes da solução aquosa. O teor de sal no produto final pode ser alto. Não existem dados sobre a pureza final do Steviosídeo. O processo é de difícil aplicação em escala comercial.

[0033] A Patente US N° 4.892.938 e o documento JP N ° 01-131191 descrevem um processo de purificação no qual o extrato da planta foi obtido por meio de tratamento em água a uma temperatura que vai da temperatura ambiente a cerca de 65°C com agitação e subsequente filtração e centrifugação. Este extrato foi tratado com hidróxido de cálcio e o precipitado foi removido por filtração ou centrifugação. Este filtrado foi tratado com uma resina trocadora de íons ácidos forte e subsequentemente com uma resina trocadora de íons básicos forte. Os glicosídeos doces ficaram na água e foram recuperados por evaporação da água. A desvantagem é que o produto final tem uma pureza bem baixa. O teor de glicosídeos doces no produto final foi de apenas cerca de 70%.

[0034] A Patente US N° 5.112.610 descreve um processo de preparação de adoçante natural à base de Stevia rebaudiana. O método inclui extração do material da planta de Stevia rebaudiana com um solvente orgânico e submissão da solução à extração com gás supercrítico (CO2) para obter um resíduo, que era livre de constituintes indesejados e de constituintes que prejudicavam o sabor. De um modo geral, o método refere-se à remoção de ceras da cutícula, clorofila, outros pigmentos e especialmente componentes que prejudicam o sabor das folhas ou extrato de Stevia. No entanto o tratamento direto das folhas requer uma grande quantidade de material de partida de modo que o uso de folhas não é econômico mesmo quando se aumenta a densidade de massa das folhas desidratadas ou cominuídas por prensagem das mesmas para formar pelotas antes da extração. O tratamento do extrato em pó, que é obtido das folhas por um método convencional, permite a remoção de componentes que prejudicam o sabor em um grau muito pequeno, e sem o emprego de substâncias de arraste (álcoois de baixo peso molecular, hidrocarboneto adequado ou mistura dos solventes) não atinge resultados totalmente satisfatórios. Além disso, não existem dados quantificados sobre a pureza efetiva do extrato. O processo é de difícil aplicação em escala comercial.

[0035] A Patente US N° 5.962.678 descreve um processo multietapas de extração e purificação de Rebaudiosídeo A da planta Stevia rebaudiana. O extrato da planta é obtido por meio de tratamento em água a uma temperatura variando da temperatura ambiente a cerca de 65 ° C com agitação e subsequente filtração e centrifugação. Este extrato foi tratado com hidróxido de cálcio e o precipitado foi removido por filtração ou centrifugação. Este filtrado foi tratado com uma resina trocadora de íons ácidos forte e subsequentemente com uma resina trocadora de íons básicos fraca. Os glicosídeos doces ficaram na água e foram recuperados por evaporação da água. O teor de glicosídeos de esteviol no extrato neste estágio era de apenas 70%. Para purificação adicional o produto foi passado por uma coluna com Amberlite XAD-7, que era capaz de adsover glicosídeos de esteviol. Depois de lavagem com água, os glicosídeos foram dessorvidos com metanol. A pureza do extrato ficou em torno de 95% com uma quantidade significativa do chamado óleo amarelo. Para isolar Steviosídeo e Rebaudiosídeo A individuais o sólido seco foi refluxado em uma solução anidra de metanol e em seguida resfriado para precipitar o Steviosídeo com 91,6% de puriza. No entanto, o rendimento de Steviosídeo foi de apenas 15% do extrato de Stevia contendo 60% de Steviosídeo. O Steviosídeo pode ser ainda purificado por refluxo do mesmo em uma solução de metanol-água. A pureza do produto foi de cerca de 99%.

[0036] Um produto mais purificado pode ser produzido pelo uso combinado de microfiltração, ultrafiltração, e nanofiltração como descrito na Patente US N° 5.972.120. A extração foi efetuada ininterruptamente em colunas de fluxo contínuo. O tamanho de partícula médio ótimo das folhas tinha que ser de cerca de 20 mm. Com partículas menores, a taxa de filtração diminuía substancialmente uma que vez a coluna ficava entupida. Água inicial foi adicionada em uma quantidade de 0,05 parte por uma parte de folhas desidratadas (em peso). A temperatura da coluna foi regulada em no máximo 4°C, e a extração foi efetuada com água a um pH na faixa de 2,0-4,0 (ajustado com ácido fosfórico). A baixas temperaturas e pH, ocorreu uma extração mais seletiva e foi obtida uma solução quase incolor. O extrato foi então filtrado por membranas de cerâmica tubulares e, em seguida, por membrans de ultrafiltração. O filtrado produzido foi separado das impurezas de baixo peso molecular nas nanomembranas a temperaturas elevadas.

[0037] Um método de preparação de extrato de Stevia está descrito nas Patentes US N°s 6.031.157 e 6.080.561. As folhas desidratadas foram extraídas com 10 a 20 partes de água várias vezes. Os extratos resultantes foram combinados e passados lentamente por uma coluna cheia de resina trocadora de cátions e em seguida por uma coluna cheia de resina trocadora de ânions. A solução tratada foi então passada por uma coluna guarnecida com uma resina (Amberlite XAD-2) para adsorver os componentes adoçantes, e em seguida lavada com água. Depois que a água foi drenada da coluna, ela foi eluída com três volumes de metanol para isolar os componentes adoçantes. O efluente foi concentrado e ainda secado à pressão reduzida para obter um pó amarelo pálido. O principal inconveniente do método é a pouca quantidade de extrato. Tratamento com apenas trocadores de íons e adsorventes específicos não pode resultar em extrato de Stevia de alta qualidade de cor branca e alto teor de glicosídeos de esteviol.

[0038] O Pedido de Patente US Publicado N° 2006/0142555 apresenta um processo para a produção de Steviosídeos a partir da planta Stevia rebaudiana. O método inclui extração de pó da planta por injeção direta de vapor no extrator seguida de filtração para obter um extrato aquoso e tratamento com hidróxido de cálcio para remover as impurezas na forma de precipitado. O filtrado foi tratado com uma resina trocadora de cátions forte e em seguida com uma resina trocadora de ânions básicos fraca. O eluato aquoso contendo Steviosídeos foi concentrado para obter Steviosídeos purificados com um teor de Steviosídeos de 45,47-65,5% no produto final. O método apresentado é adequado para a produção de extrato de Stevia com teor variado de Steviosídeo mas não de glicosídeos de esteviol altamente purificados.

[0039] A Publicação do Pedido de Patente US N° 2006/0083838 reporta um método de isolamento e purificação de Rebaudiosídeo A a partir do material de partida Stevia rebaudiana comercialmente disponível. O métod compreende: (1) um estágio de formulação de EtOH para formular um solvente de EtOH selecionado, (2) um primeiro estágio de refluxo usando o material de partida Stevia e opcionalmente estágios de refluxo adicionais usando retentado isolado de uma mistura refluxada ou de uma mistura de lavagem agitada, (3) opcionalmente, um ou mais estágios de lavagem agitada, e (4) um estágio de purga de etanol e secagem. Nas modalidades que utilizaram o material de partida Stevia de qualidade inferior, um segundo estágio de refluxo foi tipicamente acrescentado antes do estágio de lavagem agitada para maximizar a pureza do produto final Rebaudiosídeo A. No método reportado, um estágio de formulação de EtOH foi conduzido para formular um solvente de refluxo desejado para uso nas etapas de refluxo. Tipicamente, o solvente de refluxo foi uma mistura de etanol e água com cerca de 5% a 15% em volume de água. O processo inclui ainda uma ou mais etapas de refluxo de energia intensificada que foram tipicamente conduzidas a uma temperatura de cerca de 89oC a 90oC por cerca de 1 hora. O método produziu declaradamente Rebaudiosídeo A solúvel em água 100% puro.

[0040] O Pedido de Patente US N° 2006/0134292 reporta um processo para recuperar glicosídeos doces a partir do material vegetal Stevia rebaudiana. As folhas desidratadas e transformadas em pó foram tratadas com água na presença de uma pectinase, celulase, e alfa-amilase. Já foi reportado que o uso de tais enzimas aumenta consideravelmente a taxa de extração e facilita os estágios de purificação seguintes. O extrato resultante foi purificado usando tratamento com hidróxido de cálcio e ultrafiltração. O permeado foi passado por uma coluna guarnecida com bentonita e concentrado a vácuo até o estado de xarope. O tratamento com etanol permitiu separar o Rebaudiosídeo A praticamente puro da mistura. O Rebaudiosídeo A com alta pureza foi obtido depois de lavagem dos cristais com 88-95% de etanol.

[0041] O Pedido de Patente US N° 2007/0082103 reporta um processo para a preparação de extrato de Stevia e Steviosídeo e Rebaudiosídeo A altamente purificados. As folhas desidratadas e transformadas em pó foram submetidas à extração com água e o extrato resultante foi purificado usando tratamento com uma base tal como hidróxido de cálcio e em seguida cloreto de ferro. O filtrado foi desionizado usando resinas trocadoras de íons, concentrado a vácuo e secado por aspersão. Rebaudiosídeo A e Steviosídeo altamente purificados foram obtidos por dissolução do extrato em metanol para precipitar Steviosídeo. A solução remanescente depois de isolamento do Steviosídeo foi secada e Rebaudiosídeo A foi isolado por tratamento com etanol. A purificação final do Rebaudiosídeo A foi desenvolvida por tratamento com uma solução de etanol-água. A pureza foi de pelo menos 98%.

[0042] O Pedido de Patente US Publicado N ° 20070292582 descreve a purificação de Rebaudiosídeo A. O método compreende as etapas de combinar Rebaudiosídeo A bruto e um solvente orgânico aquoso para formar uma solução de Rebaudiosídeo A, a solução orgânica aquosa compreendendo água em uma quantidade de cerca de 10% a cerca de 25% em peso, e cristalização a partir da solução de Rebaudiosídeo A bruto, em uma única etapa, de Rebaudiosídeo A substancialmente puro com pureza superior a 95%. No caso da mistura de etanol-metanol-água, o rendimento de Rebaudiosídeo A com pureza superior a 97% foi de 32,5% a partir do material de partida contendo 77,4% de Rebaudiosídeo A. O rendimento a partir do material de partida contendo 80,37% de Rebaudiosídeo A ficou na faixa de 54,6-72,0%. Outros cossolventes usados junto com etanol tais como etil acetato, 1- butanol, 2-butanol, ter-butanol, sec-butanol, acetonitrila, isopropanol, e 1-propanol não foram adequados para a produção de Rebaudiosídeo A com pureza superior a 97%. No caso do uso de etanol com quantidades variadas de água como o solvente de cristalização o rendimento de Rebaudiosídeo A ficou na faixa de 39,6%-76,4% a partir do material de partida contendo 80,37% Rebaudiosídeo A. O processo usou a mistura de dois solventes orgânicos, cuja recuperação e purificação em grande escala foi muito complicada. Além disso, em escala comercial, quando a centrifugação leva um tempo relativamente longo, pode ocorrer coprecipitação de Stevioside, Rebaudiosídeo C, e Rebaudiosídeo D.

[0043] O Pedido de Patente US N° 2008/0300402 e a Patente Chinesa N° 101200480 reportam um método para produzir Rebaudiosídeo A purificado compreendendo as seguintes etapas: separação de Rebaudiosídeo A em uma coluna cromatografica guarnecida com sílica gel usando uma mistura de etil acetato, etanol e água como a fase móvel. As frações de Rebaudiosídeo A foram combinadas e secadas. O sólido foi tratado com etanol contendo de 2 a 10% de água e Rebaudiosídeo A foi cristalizado por resfriamento da mistura a - 20°C. A pureza do Rebaudiosídeo A pode chegar a mais de 99%. Para a purificação do Rebaudiosídeo A, o filtrado depois da separação do Steviosídeo foi concentrado e resfriado para 0oC por uma noite por cerca de 16 horas. O precipitado de Rebaudiosídeo A resultante foi filtrado, lavado com um pequeno volume de metanol frio, e secado para obter Rebaudiosídeo A com 79,0% de pureza e 3,3% de rendimento a partir do extrato inicial. Este Rebaudiosídeo A bruto foi ainda purificado por refluxo em metanol anidro ou em uma mistura de metanol-água. A partir do material de partida contendo 90,2% de Rebaudiosídeo A o rendimento do produto ficou em torno de 67% com 98,6% de pureza. No entanto, o método para melhorar a pureza do Rebaudiosídeo A de 79% para 90,2% não se encontra disponível. O principal inconveniente do processo é baixo rendimento dos produtos finais, que faz deste um processo não adequado para a produção comercial de Steviosídeo e Rebaudiosídeo A altamente purificados.

[0044] Várias patentes japonesas também abordam a preparação de extrato a partir de Stevia rebaudiana Bertoni.

[0045] O documento JP N° 52-100500 descreve a purificação e concentração de extrato de Steviosídeo aquoso por tratamento do extrato com uma resina trocadora de íons específica de alta capacidade descolorante, seguido por tratamento com um adsorvente específico tipo Amberlite XAD. Tratamento apenas com trocadores de íons e adosrção/dessorção não consegue resultar em extrato de alta qualidade.

[0046] O documento JP N° 52-136200 apresenta a preparação deuma solução de Steviosídeo por extração com água quente ou álcool hidratado seguida de separação em membrana. Os pesos moleculares dos glicosídeos doces e da esterebinas são muito próximos e sistemas de membrana não podem resultar em resolução satisfatória desses compostos, o que vai afetar a pureza do extrato. O teor de sais no produto final será alto.

[0047] O documento JP N° 52-005800 apresenta um método de preparação de Steviosídeo purificado a partir de folhas de Stevia rebaudiana por extração e tratamento com uma resina trocadora de cátions. Tal tratamento vai resultar em um pó amarelo com teor de glicosídeos doces aparentemente baixo.

[0048] A Patente Japonesa JP54030199 apresenta um processo para a preparação do agente adoçante Stevia livre do cheiro e sabor amargo característicos, por extração de folhas de Stevia rebaudiana Bertoni com água, tratamento do extrato com uma resina adsorvente sintética não polar seguido de dessorção, e tratamento adicional com uma resina trocadora de íons. O processo é muito parecido com a tecnologia chinesa tradicional, que permite produzir extrato de Stevia com um teor de glicosídeos de esteviol de no máximo 85-86%.

[0049] O documento JP N° 54-132599 apresenta a separação e purificação de Steviosídeo por extração de folhas de Stevia com água quente, tratamento do extrato com um adsorvente sintético não polar, lavagem da resina com uma solução aquosa de cal extinta, e eluição do Steviosídeo da resina com um solvente orgânico hidrófilo ou um solvente orgânico hidrófilo hidratado. Tratamento apenas com adsorvente sintético não polar não é capaz de resultar em extrato de alta qualidade; não foram feitas medidas referentes aos sais residuais ou à cor do produto.

[0050] O documento JP N° 55-159770 refere-se à extração e purificação de Steviosídeo por extração de folhas de Stevia com água ou álcool hidratado. O extrato foi concentrado até um teor de sólidos de 10 a 50%, acrescido de 0,1-5,0% de cloreto de cálcio para coagular e precipitar as impurezas coloidais existentes no extrato. Não foi possível remover da solução concentrada usando CaCl2 a maioria das impurezas. Não há estágios de dessalinização e descoloração.

[0051] O documento JP N° 55-162953 refere-se à preparação de Steviosídeo por extração de folhas de Stevia com 10-15 volumes de água a 60-80oC. O extrato foi tratado com cal extinta com aeração, e o pH da suspensão foi ajustado em cerca de 8,0 por adição de ácido sulfúrico ou cítrico. O sal ligeiramente solúvel resultante foi removido por filtração e o filtrado foi então contatado com uma resina de poliamida para remover as impurezas. O filtrado foi ainda extraída com n-butanol e a fase orgânica foi destilada a vácuo para recuperar o Steviosídeo como cristais brancos. O teor de sais em tal produto será alto. O processo de purificação usando extração com n-butanol é de difícil aplicação em escala comercial.

[0052] O documento JP N° 55-081567 descreve a extração e purificação de Steviosídeo. O extrato de folhas de Stevia preparado por extração om álcool ou álcool hidratado foi concentrado, e um ou mais tipos de sais solúveis em água em Ca, Fe, e Al e um solvente orgânico solúvel em água, por exemplo etanol ou acetona, foram adicionados ao concentrado para precipitar e remover as impurezas coloidais. O líquido resultante com pH 3-7 foi passado por uma resina trocadora de cátions forte e uma resina trocadora de ânions fraca. A solução obtida foi passada pelo adsorvente específico. As frações de Steviosídeo foram combinadas. O processo é semelhante à tecnologia chinesa tradicional, que pode resultar em pó amarelo com um teor de apenas 85-86% de glicosídeos de esteviol.

[0053] O documento JP N° 55-120770 refere-se à purificação de uma solução de Steviosídeo. As folhas e talos de Stevia rebaudiana foram extraídos com água ou uma solução alcoólica, à qual um sal de estanho solúvel em água, por exemplo, cloreto estanoso, sulfato estanoso, sulfato estânico etc., foi adicionado e dissolvido. Uma substância alcalina, por exemplo, hidróxido de sódio ou cal foi adicionada à solução resultante para o valor do pH em torno de 5-10. O precipitado formado foi separado. Este processo não é capaz de resultar em extrato livre de sais e de outras impurezas de baixo peso molecular.

[0054] O documento JP N° 55-138372 descreve a purificação de uma solução de Steviosídeo. Steviosídeo foi extraído das folhas e talos de Stevia rebaudiana com água, água quente, ou um álcool hidratado, e o extrato ou seu concentrado foi misturado com cal extinta ou leite de cal. A mistura foi então filtrada e misturada com uma quantidade equimolar de um composto de ferro solúvel em água, por exemplo sulfato ferroso, e agitada para precipitar os íons de ferro como um hidróxido moderadamente solúvel, que foi removido com as substâncias colorantes adsorvidas sobre o mesmo. O processo não é capaz de resultar em extrato livre de sais e de outras impurezas de baixo peso molecular.

[0055] O documento JP N° 55-039731 refere-se à extração de Steviosídeo. 1kg de folhas desidratadas de Stevia rebaudiana foi extraído com 3-10 volumes de água ou álcool hidratado. O extrato foi concentrado até atingir um teor de sólidos de 10-50% e 0,1-5% de um cloreto metálico, por exemplo cloreto de cálcio, alumínio ou ferro, foram adicionados. O precipitado de impurezas foi removido por filtração. Os procedimentos de filtração subsequentes com resinas trocadoras de íons, adsorvente, e membranas de ultrafiltração podem ser adicionalmente realizados. A maioria das impurezas não podem ser removidas da solução concentrada usando sais. O teor de impurezas de baixo peso molecular pode ser alto.

[0056] O documento JP N° 56-160962 apresenta a purificação de uma solução contendo Steviosídeo por extração de folhas de Stevia com água, concentração do extrato obtido até atingir um teor de sólidos de 25-50%, misturação do concentrado com um álcool alifático de baixo peso molecular, e remoção das impurezas precipitadas da mistura. A quantidade de álcool foi pelo menos 5 vezes o volume do extrato aquoso, ou 3-6 vezes o volume do concentrado. O tratamento não é adequado para remover impurezas de baixo peso molecular. Não há estágios de descoloração. O processo é de difícil aplicação em escala comercial.

[0057] O documento JP N° 56-109568 apresenta a purificação de substâncias adoçantes de Stevia por extração de folhas de Stevia com água ou com um solvente orgânico hidrófilo. O extrato foi tratado com um solvente orgânico selecionado do grupo que consiste em 4-8C éter, 4-7C éster, e composto de 14C cloro orgânico, e o componente solúvel no solvente foi separado. Éter dietílico, éter di- isopropílico, etil acetato, metil cloreto, tetracloreto de carbono etc. podem ser citados como o solvente de purificação. O gosto amargo pode ser removido efetivamente com descoloração smimultânea. No entanto, solventes nocivos usados podem ficar no produto final. O processo é de difícil aplicação em escala comercial.

[0058] O documento JP N° 56-099768 refere-se à preparação de glicosídeos de esteviol. Uma solução contendo glicosídeos de esteviol, por exemplo um extrato aquoso de Stevia rebaudiana Bertoni, foi tratada com aluminato de silicato de magnésio para adorver impurezas, por exemplo pigmentos ou proteínas. No entanto, o teor de sais no produto final pode ser alto. Não há estágios de descoloração e purificação adicional. O teor de glicosídeos de esteviol no produto final pode ser baixo.

[0059] O documento JP N° 57-002656 refere-se à descoloração e purificação de extrato de Stevia. Extrato de Stevia foi tratado com uma solução aquosa de um composto de bário que é facilmente solúvel em água e em seguida neutralizado com ácido sulfúrico. Hidróxido de bário foi atingir até o pH atingir um valor de 7-9 e a suspensão foi novamente tratada com ácido sulfúrico até o pH atingir um valor de 3-4. O precipitado foi separado. Os principais inconvenientes são que o teor de sais no produto final pode ser alto, não há estágios de descoloração e purificação adicional, e, como resultado, o teor de glicosídeos de esteviol no produto final pode ser baixo.

[0060] O documento JP N° 57-005663 refere-se à purificação de Steviosídeo por meio de extração. Uma solução de folhas de Stevia extraídas com água ou álcool contendo água foi concentrada até atingir um teor de sólidos de 10-50%. Um sal ou uma base de cálcio, ferro, ou alumínio foi adicionada e o precipitado foi removido por filtração. O pH do filtrado foi ajustado entre 5-7, e o precipitado formado foi removido. O filtrado é tratado com uma resina trocadora de cátions e com uma resina trocadora de ânions e evaporado até a secura. O principal inconveniente do método é a baixa qualidade do extrato. Tratamento apenas com álcalis e trocadores de íons não é suficiente para produzir extrato de Stevia de cor branca e alto teor de glicosídeos de esteviol.

[0061] O documento JP N° 57-046998 refere-se à preparação de Steviosídeo. Folhas brutas de Stevia rebaudiana foram extraídas com 10-20 volumes de água e o filtrado foi tratado com hidróxido de cálcio em uma quantidade de 10-30% em peso das folhas brutas. O pH da suspensão foi então ajustado em 4-6 com ácido sulfúrico ou ácido cítrico. Depois da filtração o extrato foi passado por uma coluna de poliamida para absorver os glicosídeos e remover as impurezas. O extrato purificado foi então concentrado à pressão reduzida, o pH foi ajustado em 8-9 com amônia aquosa e extraído com n-butanol para dar Steviosídeo bruto, que foi então recristalizado a partir de metanol. No entanto, o teor de sais residuais pode ser alto; não há estágios de descoloração; a extração com n-butanol e recristalização a partir de metanol não é comercialmente viável.

[0062] O documento JP N° 57-075992 refere-se à purificação de Steviosídeo. O extrato aquoso de Stevia rebaudiana Bertoni foi misturado com um floculante (por exemplo cloreto de alumínio ou polialumínio) para flocular e remover as impurezas coloidais, e então tratado com uma resina não polar (por exemplo Duolite ES-861) para adsorver a substância adoçante. As substâncias adsorvidas foram eluídas com um solvente orgânico (por exemplo metanol, acetona etc.), e a solução foi descolorida e purificada com carvão ativo e argila ativa. O carvão ativo pode absorver firmemente o Steviosídeo da soluçãao aquosa e os efeitos de descoloração e purificação do carvão ativo podem ser promovidos pelo uso combinado com argila ativa. No entanto, são usados solventes nocivos, que podem estar presentes no produto final. O processo é de difícil aplicação em escala comercial.

[0063] O documento JP N° 57-086264 refere-se ao isolamento do principal componente adoçante da Stevia. Talos e folhas secos de Stevia foram extraídos com água fria, água quente, álcool hidratado etc. O extrato foi coagulado ou precipitado com um adsorvente, e o precipitado foi removido por filtração ou centrifugação para obter um líquido claro contendo os componentes adoçantes. Os componentes foram adsorvidos em um adsorvente de polímero sintético, purificados até 80-90% de pureza, concentrados, secados, e dissolvidos em 3-8 volumes de metanol quente ou de etanol quente. Steviosídeo e Rebaudiosídeo A foram cristalizados simultaneamente da solução. Depois da remoção completa do solvente, os cristais mistos foram aquecidos com 3-6 volumes de álcool e separados em uma parte de solução e uma parte sólida por filtração a quente. O Steviosídeo pode ser obtido a partir da solução e o Rebaudiosídeo A pode ser preparado por lavagem e secagem da parte sólida. O método pode resultar em Steviosídeo e Rebaudiosídeo A purificados; no entanto a qualidade do extrato pode ser baixa devido à ausência de estágios de desionização e descoloração. O teor de impurezas de baixo peso molecular pode ser alto.

[0064] Os documentos JP N° 58-212759 e N ° 58-2127 60 descrevem a purificação de substância adoçante de Stevia. As folhas de Stevia rebaudiana Bertoni foram extraídas com água ou um álcool a um pH 4. O extrato foi tratado com hidróxido de cálcio e o precipitado formado foi removido por filtração. Um solvente orgânico solúvel em água tal como metanol foi adicionado ao filtrado, e o precipitado foi removido. A quantidade de solvente orgânico solúvel em água variou de 5% a 50% com base no filtrado. O filtrado obtido foi purificado por resinas trocadoras de íons ou resinas de adsorção. O principal inconveniente é que solvente nocivo é usado, o qual pode estar no produto final. O processo é de difícil aplicação em escala comercial.

[0065] O documento JP N° 58-028246 descreve a preparação de Steviosídeo. A folha bruta de Stevia foi extraída com água, água quente ou uma mistura de água-álcool, e se necessário o extrato era então concentrado. Uma mistura de hidróxido de cálcio com cloreto de cálcio em uma quantidade de 0,5-2,0 vezes o valor do teor de sólidos no extrato foi adicionada ao extrato ou ao extrato concentrado, de preferência enquanto dióxido de carbono gasoso era soprado. As impurezas foram precipitadas na forma de um material coloidal, que foi separado por filtração. No entanto, a qualidade do extrato pode ser baixa devido ao alto teor de sais e compostos de baixo peso molecular.

[0066] O documento JP N° 58-028247 refere-se a um método de purificação de uma solução de Steviosídeo. As folhas brutas de Stevia foram extraídas com água, água quente ou uma mistura de água-álcool, e o extrato foi concentrado. Hidróxido de cálcio e um floculante polimérico alto solúvel em água, por exemplo polímero alto de poliacrilamida, em uma quantidade 1-2,5 vezes o valor do teor de sólidos no extrato foram adicionados ao extrato ou ao extrato concentrado para precipitar as impurezas, que foram então removidas por filtração. Uma solução de Steviosídeo transparente e quase incolor foi obtida. No entanto, a qualidade do extrato pode ser baixa devido ao alto teor de sais e compostos de baixo peso molecular.

[0067] O documento JP N° 59-045848 refere-se à preparação do adoçante Stevia com alto teor de Rebaudiosídeo A. Folhas desidratadas de uma variedade de Stevia contendo 1,57 vezes mais Rebaudiosídeo A do que Steviosídeo foram extraídas com água ou com um solvente contendo água. A solução extraída preparada foi tratada com uma resina trocadora de cátions e com uma resina trocadora de ânions. A solução foi adsorvida em uma resina de absorção, eluída com um solvente hidrófilo, e a solução foi concentrada para dar um adoçante natural. O processo é semelhante à tecnologia chinesa tradicional, que pode resultar no pó amarelo com um teor de glicosídeos de esteviol de até 85-86% apenas.

[0068] O documento JP N° 62-166861 refere-se à extração e purificação do componente adoçante de folhas desidratadas de Stevia. Folhas desidratadas de Stevia rebaudiana Bertoni foram extraídas com 714 volumes de água a 50-70°C por 3-6 horas com agitação para obter um extrato líquido castanho com um teor de sólidos totais de 2-3% e contendo 0,70,8% de Steviosídeo. O extrato foi concentrado 7-8 vezes a cerca de 60°C e à pressão reduzida. O líquido concentrado com tratado com 0,5-2% de CaCl2 para separar as impurezas enquanto o floculante precipitava. A solução foi tratada com um óxido de Al, Mg em uma quantidade correspondente a 15-20% do teor de sólidos a 40-55°C com agitação vigorosa. Em seguida o precipitado foi removido por filtração. O Steviosídeo pode ser ainda purificado sobre adsorventes específicos. No entanto, o processo é de difícil comercialização; a quantidade de sais usada para a purificação do extrato é alta e não há estágios de desionização e descoloração. O teor de compostos de baixo peso molecular pode ser alto.

[0069] O documento JP N° 06-007108 refere-se a um método de extração e separação de substâncias doces de Stevia rebaudiana Bertoni. Folhas de Stevia rebaudiana Bertoni foram extraídas com um álcool miscível em água tal como metanol. A solução extraída foi misturada com água e passada por membranas de ultrafiltração com uma capacidade de corte de 20 -150 kDa e em seguida por membranas de ultrafiltração com uma capacidade de corte de 1-10 kDa. No entanto, são usados solventes nocivos, que podem estar presentes no produto final. O processo é de difícil aplicação em escala comercial.

[0070] O documento JP N° 52083731 refere-se ao isolamento e purificação de Rebaudiosídeo A e Rebaudiosídeo B por cromatografia em coluna de sílica gel. Purificação adicional é desenvolvida por cristalização a partir de solventes orgânicos tais como metanol ou etanol.

[0071] O documento JP N° 55-092400 refere-se à preparação de Steviosídeo. Uma solução aquosa contendo Steviosídeo foi extraída com 1H, 1H, 5H- octafluoro-1-pentanol. Depois da separação o solvente foi removido por destilação, e o resíduo foi secado. O precipitado foi recristalizado a partir de metanol. A pureza do Steviosídeo foi superior a 95%.

[0072] O documento JP N° 56-121453, o documento JP N° 56-121454, e o documento JP N° 56-121455 creferem-se à separação de Steviosídeo e Rebaudiosídeo A. Uma mistura de Steviosídeo e Rebaudiosídeo A extraídos das folhas de Stevia rebaudiana Bertoni foi misturada com uma solução aquosa a 75% de metanol e mantida à temperatura ambiente por cerca de 3 horas. Os cristais resultantes com um teor de 65% de Steviosídeo de 25,2% de Rebaudiosídeo A foram separados por filtração e secados. No caso de aplicação de uma solução aquosa a 90% de etanol a mistura final contém 57,4% de Steviosídeo e 31,9% de Rebaudiosídeo A. Recristalização adicional a partir da solução aquosa a 90% de etanol resultou em um produto com um teor mais alto de Rebaudiosídeo A. A pureza do produto foi de cerca de 80%. O Steviosídeo pode ser ainda purificado até 86,1% por lavagem adicional com água. Foram obtidos cristais do tipo β de Steviosídeo e cristais do tipo α de Rebaudiosídeo A.

[0073] O documento JP N° 57-046998 refere-se à preparação de Steviosídeo. Folhas brutas de Stevia rebaudiana foram extraídas com 10-20 volumes de água e o filtrado foi tratado com hidróxido de cálcio em uma quantidade de 10-30% em peso das folhas brutas. O pH da suspensão foi então ajustado em 4-6 com ácido sulfúrico ou com ácido cítrico. Depois da filtração o extrato foi passado por uma coluna de poliamida para adsorver os glicosídeos e remover as impurezas. O extrato purificado foi então concentrado à pressão reduzida, o pH foi ajustado em 8-9 com amônia aquosa e extraído com n-butanol para dar Steviosídeo bruto, que foi então recristalizado a partir de metanol.

[0074] O documento JP N° 57-086264 refere-se ao isolamento do principal componente adoçante de Stevia. Talos e folhas desidratados de Stevia foram extraídos com água fria, água quente, álcool hidratado etc. O extrato foi coagulado ou precipitado com um adsorvente, e o precipitado foi removido por filtração ou centrifugação para obter um líquido claro contendo os componentes adoçantes. Os componentes foram adsorvidos sobre um adsorvente de polímero sintético, purificados até 80-90% de pureza, concentrados, secados, e dissolvidos em 3-8 volumes de metanol quente ou de etanol quente. Steviosídeo e Rebaudiosídeo A foram cristalizados simultaneamente da solução. Depois de remoção completa do solvente, os cristais mistos foram aquecidos com 3-6 volumes de álcool e os sólidos foram separados da solução por filtração a quente. O Steviosídeo pode ser obtido a partir da solução e o Rebaudiosídeo A pode ser preparado por lavagem e secagem da parte sólida.

[0075] O documento JP N° 06-192283 e o documento JP N° 08-000214 apresentam a purificação de Rebaudiosídeo A por filtração em gel em um Toyo Perl HW-40. Rebaudiosídeo C e Dulcosídeo foram obtidos por HPLC. O método só é útil em escala laboratorial.

[0076] O documento JP 63173531 descreve um método de extração de glicosídeos doces da planta Stevia rebaudiana. A primeira etapa do processo é extrair uma solução líquida de glicosídeos doces da planta Stevia rebaudiana. Em segundo lugar, a solução líquida de glicosídeos doces é passada por uma resina porosa não polar e eluída com um solvente orgânico solúvel em água, de preferência metanol. Em terceiro lugar, a solução eluída é concentrada e secada para dar um material pulverulento. Este procedimento isola uma mistura de glicosídeos doces, mas não isola um único glicosídeo doce puro tal como Rebaudiosídeo A.

[0077] O documento JP N° 07-143860 descreve a purificação de Rebaudiosídeo A por meio de cristalização e recristalização a partir de solução aquosa a 10-20% de metanol. A pureza de Rebaudiosídeo A foi de cerca de 90%.

[0078] O documento JP N° 07-177862 descreve a purificação de Rebaudiosídeo A e Steviosídeo. Extrato de Stevia purificado foi tratado com baixas concentrações de álcool para obter cristais com um teor de cerca de 75% de Steviosídeo e Rebaudiosídeo A. Os cristais foram ainda recristalizados a partir de água para dar o adoçante ligeiramente solúvel em água com uma proporção de Steviosídeo e Rebaudiosídeo A de cerca de 1:2, p/p.

[0079] O documento JP N° 2002.262.822 apresenta um adoçante extraído de folhas desidratadas da planta Stevia e seu método de extração. Este processo utiliza água ou um solvente aquoso para extrair glicosídeos de Stevia das folhas desidratadas. No produto obtido, o teor de Rebaudiosídeo A é 2,56 vezes maior que a quantidade de Steviosídeo.

[0080] Isolamento de Steviolbiosídeo, Rebaudiosídeo A, Rebaidiosídeo B foi realizado por Kohda et al., 1976. Folhas desidratadas foram extraídas com metanol quente e o filtrado foi concentrado até a secura. O resíduo foi extraído com n-butanol e, depois de secagem o resíduo foi recristalizado a partir de metanol. O licor-mãe foi submetido à separação cromatográfica sobre sílica gel usando uma mistura de clorofórmio-metanol-água como a fase móvel. Purificação adicional foi desenvolvida por cromatografia em camada fina. O método só pode ser aplicado em escala laboratorial para a produção de pequenas quantidades dos glicosídeos doces mencionados acima.

[0081] Dulcosídeo A e B foram isolados e identificados usando cristalização a partir de uma mistura de metanol-etanol e ainda purificados por cromatografia sobre sílica gel (Kobayashi et al., 1977).

[0082] A combinação de ultrafiltração, diafiltração, osmose invertida e tratamento de troca iônica foi usada para a purificação de extrato de Stevia (Fuh & Chiang, 1990). A capacidade de corte das membranas de ultrafiltração foi de 25.000 e 100.000 Daltons. As misturas de resinas trocadoras de cátions e de ânions forte e fraca foram usadas como trocadores de íons. A recuperação de glicosídeos de esteviol totais foi de cerca de 90%; no entanto a pureza do produto final foi de apenas 46%.

[0083] Um método para a purificação de glicosídeos de esteviol pela tecnologia de membranas foi descrito por Liu et al. (1991) e Zhang et al. (2000). Folhas desidratadas foram colocados em uma coluna de vidro tradicional e a extração foi realizada com água de osmose invertida. O extrato foi pré-tratado com uma membrana de cerâmica tubular e em seguida com uma membrana de ultrafiltração no modo de diafiltração. As impurezas de peso molecular mais baixo foram removidas do permeado por lavagem por uma membrana de nanofiltração no modo de diafiltração a temperaturas elevadas. A adição de cal e/ou outro agente floculante à carga de ultrafiltração melhorou significativamente o fluxo. O processo pode oferecer um concentrado de adoçante de pureza relativamente alta. No entanto, não existem dados sobre a pureza do extrato e a recuperação de glicosídeos de esteviol. Os baixos valores de pH usados para a extração exigiram reatores especiais resistentes a ácidos. As baixas temperaturas durante a extração aumentaram o custo operacional da produção. Estes dois fatores (temperaturas baixas e pH baixo) resultaram em uma grande quantidade de extrato inicial diluído. Diluição do extrato também ocorreu durante a microfiltração e a ultrafiltração. Para a purificação final é necessário um tratamento com troca iônica. Estes fatores aumentam substancialmente o custo de produção e diminuem o rendimento do produto final em unidade de tempo. O investimento inicial também é alto.

[0084] Uma série de resinas polares à base de poliestireno com grupos carbonila foram usadas para a adsorção dos glicosídeos de esteviol e separação parcial de Steviosídeo e Rebaudiosídeo A (Chen et al., 1998; 1999). A proporção de de Rebaudiosídeo A para Steviosídeo pode aumentar de 0,72 para 2,24.

[0085] A capacidade adsorptiva e a seletividade de um novo adsorvente com grupo piridila para glicosídeos de esteviol foram estudadas (Chen et al., 1999). O efeito da polaridade e da estrutura física do sorvente na seletividade foi investigado detalhadamente. Dois métodos de separação foram aplicados no enriquecimento de Rebaudiosídeo A. Estes foram eluição seletiva usando uma solução de metanol ou etanol como solvente, e separação cromatográfica dinâmica usando uma resina piridílica com alta seletividade. Os resultados mostram que o método de separação cromatográfica pode enriquecer efetivamente o Rebaudiosídeo A do extrato de Stevia com alto teor de Steviosídeo. A proporção de Rebaudiosídeo para Steviosídeo pode aumentar de 0,75 para 3,94. Purificação adicional do Rebaudiosídeo A foi possível por cristalização a partir de metanol.

[0086] Um método para a clarificação de extrato de Stevia usando zeólitos modificados foi descrito por Moraes et al. (2001) e Montovaneli et al. (2004). Zeólitos sintéticos ou naturais foram modificados por tratamento com íons de cálcio ou bário e extrato de Stevia sem qualquer pré-tratamento foi colocado em contato com o zeólito modificado. Isto resultou em 70-80% de clarificação em condições intermitentes e apenas 55-60% em condições contínuas. O processo de clarificação deveria adsorver os pigmentos que deixam o extrato acastanhado, e não os glicosídeos, que são responsáveis pelo sabor doce. No entanto, não existem dados sobre o teor de glicosídeos de esteviol no produto final. Obviamente apenas este tipo de tratamento não pode resultar em extrato altamente purificado, especialmente por causa dos polissacarídeos, metais pesados e esterebinas, que ficam no extrato clarificado. Além disso, não existem dados sobre a meia-vida e a capacidade de absorção do carreador que é muito importante quando o processo é realizado em condições contínuas.

[0087] Adsorventes poliméricos com grupos -N+(CH3)3 foram criados e aplicados à purificação de glicosídeos de esteviol e ao enriquecimento de Rebaudiosídeo A (Shi et al., 2002). Em uma série de cinco colunas o teor de Rebaudiosídeo A aumentou do produto da primeira coluna ao produto da quinta coluna. Ao mesmo tempo o adsorvente apresentou capacidade de descoloração.

[0088] Rebaudiosídeo F foi isolado por cromatografia líquida sobre sílica gel funcionalizada com 3-aminopropil de acordo com o método descrito por Starratt et al., 2002. As frações que eram ricas em Rebaudiosídeo C e Rebaudiosídeo F foram combinadas e separadas por HPLC em uma coluna de carboidratos Waters com gradiente linear de acetonitrila e água.

[0089] A preparação de extrato de Stevia por extração com fluido supercrítico foi descrita por Yoda et al. 2003. Esta é um processo de duas etapas: (i) extração com CO2 a 2x107 Pa (200 bar) e 30oC, e (ii) extração com CO2 + água. Aproximadamente 72% dos compostos solúveis em CO2 foram recuperados e o composto principal foi austroinulina. O sistema Stevia + CO2 + água foi capaz de remover aproximadamente 50% do Steviosídeo original e cerca de 72% de Rebaudiosídeo A. As principais desvantagens do método são a necessidade de pressão alta e baixa taxa de extração dos compostos doces. Além disso, não há informações sobre o teor dos compostos secundários e do teor de glicosídeos de esteviol totais no extrato final. O processo é de difícil aplicação em escala comercial.

[0090] Extração com fluido pressurizado usando água ou metanol foi empregada para a extração de Steviosídeo de Stevia rebaudiana Bertoni (Pol et al., 2 007) . Uma temperatura de 110°C foi determinada como sendo ótima para a extração de Steviosídeo de folhas de Stevia rebaudiana usando água ou metanol. Uma temperatura mais alta resultou em significativa degradação do Steviosídeo no meio de ambos os solventes ou em um declínio no rendimento de extração em água. Ambos os solventes apresentaram extração de Steviosídeo com reprodutibilidade muito semelhante e os parâmetros de extração propostos são os mesmos para ambos os métodos. Água representa uma alternativa mais consciente em termos ambientais e mais barata que o metanol.

[0091] Um método de preparação e purificação de extrato de Stevia foi descrito por Kovylyaeva et al., 2007. O método inclui extração de folhas secas com 14 volumes de água destilada por 1 hora à temperatura de ebulição, filtração e concentração do filtrado até atingir o estado de xarope. O xarope foi diluído, AlCl3.6H2O foi adicionado e agitado até dissolver. A mistura foi agitada e tratada com uma solução aquosa de NaOH. O precipitado foi filtrado e o filtrado foi passado por uma coluna guarnecida com Al2O3. A coluna foi eluída com água destilada para obter uma solução castanho claro. Purificação adicional do Steviosídeo, Rebaudiosídeo A, e Rebaudiosídeo C foi feita por extração com n-butanol e cromatografia em coluna sobre Al2O3 e sílica gel. O método não é capaz de resultar em extrato de Stevia de alta pureza. Grandes quantidades de sais são usadas para o pré-tratamento. Purification process é de difícil aplicação em escala comercial.

[0092] Um eficiente processo de extração assistida com micro-ondas para extração de Steviosídeo e Rebaudiosídeo A foi descrito por Bandna et al. (2009). Folhas desidratadas e transformadas em pó de S. rebaudiana foram extraídas por técnicas convencionais de extração assistida com ultrassom e micro-ondas usando metanol, etanol e água como os únicos solventes assim como em misturas binárias. Extração a frio convencional foi efetuada a 25°C por 12 horas enquanto que a extração com ultrassom foi efetuada a uma temperatura de 35 ± 5°C por 30 minutos. A extração assistida com micro-ondas foi efetuada a uma potência de 80 W por 1 minuto a 50°C. Como resultado, a extração assistida com micro-ondas rendeu 8,64% e 2,34% de Steviosídeo e Rebaudiosídeo A, respectivamente, ao passo que as técnica convencional e aquela com ultrassom renderam 6,54 e 1,20%, e 4,20 e 1,98% de Steviosídeo e Rebaudiosídeo-A, respectivamente.

[0093] O isolamento eficiente de glicosídeos de esteviol também foi obtido usando extração com água quente pressurizada (Teo et al., 2009).

[0094] Todos os métodos existentes tratam do isolamento e purificação de um ou outro glicosídeo de esteviol do extrato inicial e não mostram uma maneira de tratamento adicional da solução residual ou de purificação de compostos secundários. Por conseguinte, faz-se ainda necessário um método eficiente e econômico para retratamento completo do extrato produzido a partir da planta Stevia rebaudiana Bertoni.

[0095] No entanto, não existem dados publicados sobre o isolamento e purificação comerciais de Rebaudiosídeo D que tenha propriedades sensoriais excelentes.

[0096] O teor de Rebaudiosídeo D no extrato é muito baixo e por isso sua purificação é muito difícil.

[0097] Por conseguinte, faz-se ainda necessário um método eficiente e econômico para a preparação de Rebaudiosídeo D de alta pureza, que possa ser usado como adoçante em alimentos, bebidas, produtos farmacêuticos, cosméticos e outras indústrias.

Sumário da Invenção

[0098] A invenção refere-se a um processo para isolamento e purificação de glicosídeos doces individuais da planta Stevia rebaudiana Bertoni, e mais particularmente para isolamento e purificação de Rebaudiosídeo D e sua aplicação como adoçante.

[0099] O principal problema técnico a ser resolvido e o principal objetivo da invenção são oferecer um método altamente eficiente para isolar e purificar diferentes glicosídeos de esteviol, particularmente Rebaudiosídeo D a partir de extrato de Stevia.

[00100] A presente invenção oferece um processo para o retratamento de extrato da planta Stevia rebaudiana Bertoni com isolamento e purificação de glicosídeos doces individuais altamente purificados, particularmente Rebaudiosídeo D.

[00101] O Rebaudiosídeo D purificado altamente isolado ou em combinação com outros adoçantes e/ou outros componentes é útil como adoçante não calórico em composições comestíveis e mastigáveis tais como bebidas, confeitos, pães, biscoitos, gomas de mascar, e similares.

[00102] De acordo com a presente invenção o isolamento e a purificação de Rebaudiosídeo D foram desenvolvidos a partir de extrato de Stevia. Em uma modalidade, o método para isolamento e purificação de Rebaudiosídeo D compreende tratar extrato de Stevia com uma primeira solução de álcool ou álcool- água para formar uma primeira mistura, obter um primeiro precipitado contendo Rebaudiosídeo A e Rebaudiosídeo D a partir da primeira mistura, tratar o primeiro precipitado com uma segunda solução de álcool ou álcool-água para formar uma segunda mistura, obter a partir da segunda mistura um segundo precipitado contendo Rebaudiosídeo A altamente purificado e um filtrado com alto teor de Rebaudiosídeo D, onde o segundo precipitado é secado para produzir Rebaudiosídeo A de alta pureza, e onde o filtrado é concentrado para produzir Rebaudiosídeo D de alta pureza. Opcionalmente, o método compreende ainda tratar o Rebaudiosídeo D purificado com uma terceira solução de álcool ou álcool-água para refinar o Rebaudiosídeo D de alta pureza.

[00103] Constitui um objetivo da invenção oferecer um produto com gosto e características físicas excelentes. O produto compreende pelo menos um adoçante natural não nutritivo em uma quantidade suficiente para proporcionar adoçamento perceptível. A composição proporciona um perfil de sabor mais parecido com açúcar devido ao uso de Rebaudiosídeo D como um adoçante natural não nutritivo em uma quantidade suficiente para proporcionar adoçamento perceptível.

[00104] Deve ficar entendido que tanto a descrição geral precedente como a descrição detalhada a seguir são exemplificativas e explicativas e destinam-se a oferecer uma melhor explicação da invenção reivindicada.

Breve Descrição dos Desenhos

[00105] Os desenhos em anexo foram incluídos para oferecer melhor compreensão da invenção. Os desenhos ilustram modalidades da invenção e junto com a descrição servem para explicar os princípios das modalidades da invenção.

[00106] A FIG. 1 mostra a estrutura química de esteviol e dos glicosídeos de esteviol presentes nas folhas de Stevia rebaudiana Bertoni.

[00107] A FIG. 2 mostra as estruturas químicas de glicosídeos de esteviol presentes em Stevia rebaudiana Bertoni.

[00108] A FIG. 3 mostra um esquema de purificação de uma etapa de Rebaudiosídeo A usando sistemas de etanol-água de acordo com uma modalidade da presente invenção.

[00109] A FIG. 4 mostra os gráficos de HPLC de Rebaudiosídeo D nas várias etapas de purificação.

[00110] A FIG. 5 mostra um esquema de purificação de Rebaudiosídeo D de acordo com uma modalidade da presente invenção.

[00111] A FIG. 6 mostra o espectro de FTIR de Rebaudiosídeo D.

Descrição Detalhada da Invenção

[00112] A presente invenção oferece um processo para isolamento e purificação de glicosídeos doces individuais a partir de extrato da planta Stevia rebaudiana Bertoni, e mais particularmente para isolamento e purificação de Rebaudiosídeo D a partir de extrato da planta Stevia rebaudiana Bertoni e sua aplicação em vários produtos.

[00113] As vantagens da presente invenção ficarão mais evidentes a partir da descrição detalhada dada mais adiante. No entanto, deve ficar entendido que a descrição detalhada e os exemplos específicos, embora indiquem modalidades preferidas da invenção, são dados a título meramente ilustrativo, uma vez que várias alterações e modificações dentro do espírito e escopo da invenção ficarão mais aparentes para os especialistas na técnica a partir desta descrição detalhada.

[00114] Entre os glicosídeos doces existentes na Stevia apenas o Steviosídeo e o Rebaudiosídeo A encontram-se disponíveis a custo moderado a uma pureza <80% e a custo alto a uma pureza >80%. A pureza mais alta do produto comercial normalmente é superior a 97%. No mercado não há quantidades comerciais de Rebaudiosídeo B, Rebaudiosídeo D, e Rebaudiosídeo C. Padrões analíticos de Rebaudiosídeos E e F em pequenas quantidades ainda não se encontram disponíveis.

[00115] Rebaudiosídeo D é um glicosídeo diterpenoide adoçante de alta potência que tem a estrutura química apresentada na FIG. 2.

[00116] O Rebaudiosídeo D é isolado e extraído, junto com outros glicosídeos de esteviol, a partir da planta Stevia rebaudiana Bertoni ("Stevia"), que atualmente é comercialmente cultivada no Japão, Taiwan, Malásia, Coreia do Sul, China, Israel, Índia, Brasil, Austrália, e Paraguai. Ele é um adoçante não calórico ideal com propriedades funcionais e sensoriais superiores àquelas de muitos adoçantes de alta potência. As formas processadas da Stevia podem ser de 30 a 400 vezes mais potentes que o açúcar. Entre os glicosídeos diterpenoides doces da Stevia, o Rebaudiosídeo D é o menos amargo, e com o sabor residual menos persistente.

[00117] No momento não existe qualquer tecnologia comercial publicada referente ao isolamento e à purificação de Rebaudiosídeo D, e certamente faz-se necessário um método eficiente e econômico para isolamento e purificação completos de glicosídeos doces individuais a partir de extrato de Stevia.

[00118] A presente invenção oferece um método para a produção de Rebaudiosídeo D altamente purificado a partir de extrato de Stevia e seu uso subsequente.

[00119] Doravante, o termo “altamente purificado” refere-se a uma composição de Rebaudiosídeo D que inclui pelo menos cerca de 91% a 100% do Rebaudiosídeo D em termos de peso seco.

[00120] Modalidades exemplificativas desta invenção estão descritas em detalhes mais adiante e ilustradas nas FIGS. 3-6.

[00121] Entretanto, na descrição detalhada, apenas algumas modalidades exemplificativas da presente invenção estão mostradas e descritas, a título ilustrativo. Como os especialistas na técnica vão perceber, a invenção pode ser praticada de muitas formas diferentes e esta não deve ser interpretada como limitada às modalidades apresentadas neste relatório.

[00122] Glicosídeos diterpenoides, incluindo substâncias de sabor adocicado, são encontrados nos caules, sementes e folhas da planta S. rebaudiana Bertoni, estando presentes na concentração mais alta nas folhas. As folhas, portanto, constituem o material de partida preferido para a recuperação de glicosídeos doces.

[00123] A purificação de Rebaudiosídeo D é desenvolvida partindo de extrato de Stevia comercial. O teor de Rebaudiosídeo D no extrato pode variar dependente da variedade da planta Stevia ou do esquema tecnológico de preparação do extrato.

[00124] Extrato de Stevia contendo Steviosídeo - 25,40%, Rebaudiosídeo A - 59,14%, Rebaudiosídeo C - 9,71%, Rebaudiosídeo D - 2,03%, Rebaudiosídeo B - 0,56%, Rebaudiosídeo E - 0,68%, Rebaudiosídeo F - 1,02%, Steviolbiosídeo - 0,11%, e Dulcosídeo A - 1,35% foi usado como um material de partida exemplificativo para ilustrar a purificação de Rebaudiosídeo D.

[00125] Com referência agora à FIG. 3, a invenção oferece uma purificação de uma etapa de Rebaudiosídeo A de alta pureza com teor relativamente alto de Rebaudiosídeo D de acordo com uma modalidade da presente invenção. Extrato de Stevia foi dissolvido em uma primeira solução de etanol-água a 50-70oC, de preferência 55-60oC, por cerca de 10-30 min, de preferência 15-20 min, e em seguida a 15-40oC, de preferência 20-22oC por cerca de 18-48 horas, de preferência 20-24 horas com agitação. Quando a temperatura atingiu 22oC, 1-2% (p/vol.) de Rebaudiosídeo A altamente purificado foram adicionados à mistura reacional como uma substância de partida para iniciar a cristalização. A proporção de extrato e da primeira solução de etanol-água dependeu do teor de glicosídeos secundários e variou entre 1,0 : 2,5 - 1,0: 10,0, p/v, de preferência 1,0 : 3,0-5,0, p/v.

[00126] Durante este tempo formou-se um primeiro precipitado, que foi separado por filtração ou centrifugação.

[00127] A concentração de etanol na primeira solução de etanol-água varia entre 75-99%, de preferência 82-88%. O teor de Rebaudiosídeo A e Rebaudiosídeo D no primeiro precipitado varia entre 79-99% e 0,8-4,0%, respectivamente.

[00128] A pureza e o rendimento de Rebaudiosídeo A dependeu da proporção de extrato para a solução de etanol-água e da concentração etanol. Os dados a várias concentrações de etanol estão resumidos na TABELA 3. A proporção extrato: etanol foi de 1:3,0, p/v.

[00129] O nível de purificação e o rendimento de Rebaudiosídeo A em vários volumes da solução de etanol a 88% estão resumidos na TABELA 4. TABELA 3 TABELA 4

[00130] O teor de Rebaudiosídeo D aumenta com o aumento da concentração de etanol até 88-90% e a redução da proporção de solução de etanol-água para extrato. Ao mesmo tempo a pureza do Rebaudiosídeo A aumentou com soluções mais diluídas de etanol e proporções mais altas de solução de etanol-água para extrato.

[00131] O rendimento do produto nesta etapa para extratos de Stevia com vários teores de Rebaudiosídeo A, depois de tratamento com proporções de 1:3 (p/vol.) de etanol a 88% está resumido na TABELA 5. Como era de se esperar, o rendimento do produto aumenta com o aumento do teor de Rebaudiosídeo A no extrato inicial. TABELA 5

[00132] O precipitado foi separado por filtração ou centrifugação, lavado com cerca de dois volumes de etanol absoluto e secado. Qualquer tipo de equipamento que permite a separação de precipitado de líquido, tal como vários tipos de centrífugas ou sistemas de filtração, pode ser usado nesta etapa. Diferentes tipos de secadores, tais como secador a vácuo giratório, secador de leito fluido, secador de túnel giratório e secador de placas, são adequados para produzir glicosídeos de esteviol purificados na forma de pó.

[00133] No caso em que o extrato inicial contém uma grande quantidade de Rebaudiosídeo B e Rebaudiosídeo D, para a purificação de Rebaudiosídeo A e posteriormente de Rebaudiosídeo D é preferível usar concentrações mais baixas de etanol e uma proporção mais alta da solução de etanol-água para o extrato (TABELA 6; TABELA 7). Nesta série de experiências o teor de Rebaudiosídeo A no extrato inicial era de 48,7%.

[00134] O rendimento do produto com alto teor de Rebaudiosídeo A e Rebaudiosídeo D pode ser aumentado com o uso de etanol para posterior precipitação. Para tanto, ao final da cristalização, 0,5-1,0, v/p, de preferência 0,5-0,8, v/p, de etanol absoluto para o sólido inicial, foi adicionado à mistura e o processo continuou por mais 2-3 horas. O rendimento e a pureza do produto proveniente do extrato com teor de Rebaudiosídeo A de 48,7% estão resumidos na TABELA 8. TABELA 6 TABELA 7 TABELA 8

[00135] Para proc uzir Rebaudiosíd leo A de alta pureza o processo pode ser realizado a 30-50oC sem uma etapa de resfriamento. Embora a pureza do Rebaudiosídeo A fosse mais alta, o processo resultou em menor rendimento do produto. A qualidade do produto aumentou a temperaturas de lavagem mais altas. Os resultados obtidos usando 3,5 volumes de etanol a 85% para uma parte de extrato depois de 24 horas e com e sem um estágio posterior de precipitação estão resumidos na TABELA 9. TABELA 9

[00136] Quando o teor de Rebaudiosídeo A no produto final era inferior a 97% principalmente devido ao alto teor de Rebaudiosídeo B e/ou Rebaudiosídeo D, o produto era adicionalmente lavado com uma solução aquosa de etanol. Para tanto, o Rebaudiosídeo A obtido depois da precipitação foi suspendido na mistura de etanol-água à temperatura ambiente por 30-40 min. Depois de obtida uma suspensão homogênea a temperatura foi aumentada até 35-50oC, de preferência 38-42oC e a suspensão foi agitada por cerca de 10-20 horas, de preferência 12-15 horas, e em seguida a 10-25oC, de preferência 20-22oC por cerca de 3-20 horas, de preferência 5-10 horas. A proporção de Rebaudiosídeo A e etanol foi de 1,0:2,0 - 1,0:5,0, p/v, de preferência 1,0:2,5-4,0, p/v. A concentração de etanol ficou entre 85-93%, de preferência 88-90%.

[00137] No caso em que a pureza do Rebaudiosídeo A era inferior a 97% devido ao alto teor de Steviosídeo, o produto era lavado com etanol absoluto da mesma maneira que aquela descrita acima para o produto contaminado com Rebaudiosídeo B e Rebaudiosídeo D. A proporção de Rebaudiosídeo A e etanol foi de 1,0:2,0 - 1,0:5,0, p/v, de preferência 1,0: 2,5-4,0, p/v.

[00138] Com referência agora à FIG. 5, oferecemos um fluxograma para a purificaçãao de Rebaudiosídeo A e Rebaudiosídeo D de acordo com uma modalidade da presente invenção.

[00139] A purificação de Rebaudiosídeo D a partir de cristais/precipitados com teor de Rebaudiosídeo A e Rebaudiosídeo D em torno de 75-80% e 2,0-3,5%, respectivamente, foi desenvolvida da seguinte maneira. Deve-se observar que os cristais com Rebaudiosídeo A e Rebaudiosídeo D podem ser obtidos pelo processo descrito em relação à FIG. 3.

[00140] O precipitado com alto teor de Rebaudiosídeo A e Rebaudiosídeo D foi misturado com uma segunda solução de etanol-água e incubado a 45- 65oC, de preferência 50-55oC por 2-6 horas, de preferência 3-4 horas com agitação. Em seguida, a mistura foi resfriada para a temperatura ambiente por 1-3 horas, de preferência 0,5-1,0 hora. O precipitado foi separado por filtração.

[00141] A proporção preferível de sólidos para a solução aquosa de etanol foi de 1 a 5, p/v, e a concentração ótima de etanol foi de 78%. Entretanto, a concentração de etanol pode variar nos limites de 70-80% e a proporção, de 1:2,5 - 1,7, p/v.

[00142] Para facilitar a filtração do precipitado com alto teor de Rebaudiosídeo D, carvão ativo em uma quantidade de 0,5-3,0% em volume, de preferência 1,0-1,5 % em volume foi adicionado à mistura antes da filtração. O precipitado foi então misturado com 3-5 volumes de 30-50% de metanol. A suspensão foi mantida com agitação a 45-65oC, de preferência 57- 62oC por 1-5 horas, de preferência 2-3 horas e submetida à filtração. Eluição dos glicosídeos adsorvidos sobre o carvão ativo foi efetuada com metanol.

[00143] Tanto os precipitados obtidos sem aplicação de carvão quanto aqueles obtidos com aplicação de carvão contêm 19-22,1% de Rebaudiosídeo D nas condições ótimas (TABELA 10). TABELA 10

[00144] Em principalmentecípio, quanto maior o volume aplicado de metanol mais rápido pode ser o processo de eluição. O processo pôde ser terminado em um período de tempo mais curto quando uma solução aquosa de metanol foi usada.

[00145] A fração metanol foi evaporada até a secura.

[00146] Quando o material inicial contendo 95,6% de Rebaudiosídeo A e 3,5% de Rebaudiosídeo D (FIG. 4a) foi misturado com 3,5 volumes of 78,0% de etanol, a mistura foi fervida por 10-15 minutos e o material não dissolvido foi separado por filtração a quente, e a produção de precipitado variou dentro dos limites de 6-7,0% com teores de 52-53,0% e 43-45,0% de Rebaudiosídeo A e Rebaudiosídeo D (FIG. 4b), respectivamente.

[00147] Para purificação adicional, o precipitado foi suspendido em 50% de etanol a uma proporção de 1:2, p/v e a 30-40oC, de preferência 33-37oC, e mantido por 2-15 horas, de preferência 10-12 horas com agitação. A suspensão foi filtrada e secada. O rendimento de precipitado com teor de cerca de 1517,0% de Rebaudiosídeo A e 80-82% de Rebaudiosídeo D variou na faixa de 42-46,0%. Em princípio até cinco volumes de etanol aquoso podem ser aplicados nesta etapa. A concentração de etanol pode variar dentro dos limites de 10-80%, de preferência 45-52%.

[00148] O precipitado foi submetido a um tratamento semelhante. O precipitado foi separado por filtração, lavado com cerca de dois volumes de metanol anidro e secado. Qualquer tipo de equipamento, que permite separar precipitado de líquido, tal como vários tipos de centrífugas ou sistemas de filtração, pode ser usado nesta etapa. Diferentes tipos de secadores, tais como secador a vácuo giratório, secador de leito fluido, secador de túnel giratório e secador de placas, são adequados para produzir Rebaudiosídeo D purificado na forma de pó.

[00149] A pureza do Rebaudiosídeo D foi de cerca de 95-99% (FIG. 4c). O rendimento do produto foi de cerca de 58-60%.

[00150] A solução combinada remanescente depois do isolamento de Rebaudiosídeo D foi misturada com uma pequena quantidade de Rebaudiosídeo A como substância de partida e deixada cristalizar a 20- 22oC por 20-24 horas. O teor de Rebaudiosídeo A nos cristais variou entre 97,7-99,4%.

[00151] A solução remanescente da primeira precipitação pode ser usada para isolamento de Rebaudiosídeo A ou de uma mistura de glicosídeos de esteviol altamente purificada.

[00152] O Rebaudiosídeo D de alta pureza obtido nesta invenção tem um peso molecular de 1129,15, fórmula molecular C50H80O28 e a estrutura apresentada na FIG. 2, e está na forma de um pó branco e inodoro. O composto é cerca de 180-200 vezes mais doce que o açúcar quando comparado a uma solução de sacarose a 10%. O espectro de absorção no infravermelho está mostrado na FIG. 6. O Rebaudiosídeo D apresenta uma absorção característica máxima a cerca de 1730 cm-1. Outras propriedades do Rebaudiosídeo D puro são as seguintes:

[00153] Ponto de fusão: 248-249oC.

[00154] Rotação específica: [α]D25 -29,5o em 50% de etanol (C=1,0).

[00155] A solubilidade em água é de cerca de 0,2% que aumenta com o aumento da temperatura. Ele precipita novamente com o resfriamento da solução. Altamente solúvel durante a etapa de separação cromatográfica e antes da cristalização.

[00156] Solúvel em soluções diluídas de metanol, etanol, n-propanol, e isopropanol.

[00157] Insolúvel em acetona, benzeno, clorofórmio, e éter.

[00158] O Rebaudiosídeo D obtido nesta invenção é estável ao calor e ao pH.

[00159] O Rebaudiosídeo D obtido de acordo com esta invenção pode ser incorporado como um adoçante natural de alta intensidade em alimentos, bebidas, composições farmacêuticas, cosméticos, gomas de mascar, produtos de mesa, cereais, laticínios, pastas de dentes e outras composições para a cavidade oral etc. Os exemplos que se seguem mostram proporções representativas que podem ser empregadas.

[00160] Além disso, o Rebaudiosídeo D pode ser usado como adoçante não apenas em bebidas, alimentos, e outros produtos dedicados ao consumo humano, mas também em ração animal e forragem com características aperfeiçoadas.

[00161] Durante a manufatura de alimentos, bebidas, produtos farmacêuticos, cosméticos, produtos de mesa, gomas de mascar, os métodos convencionais tais como misturação, amassamento, dissolução, desoxidação, permeação, percolação, borrifação, atomização, infusão e outros métodos podem ser usados.

[00162] O adoçante obtido nesta invenção pode ser usado em formas secas ou líquidas. Ele pode ser adicionado antes ou depois do tratamento térmico dos produtos alimentícios. A quantidade de adoçante depende da finalidade de uso. Ele pode ser acrescentado isolado ou em combinação com outros compostos.

[00163] Em uma modalidade particular desta invenção o Rebaudiosídeo D, como composto adoçante, pode ser empregado como o único adoçante, ou ele pode ser usado junto com outros adoçantes naturais de alta intensidade.

[00164] A expressão “adoçantes naturais de alta intensidade”, conforme usada neste relatório, refere-se a quaisquer composições que são encontradas na natureza e que possuem poder adoçante superior ao da sacarose, frutose ou glicose.

[00165] Exemplos não limitativos de natural adoçantes de alta intensidade incluem Steviosídeo, Rebaudiosídeo A, Rebaudiosídeo B, Rebaudiosídeo C, Rebaudiosídeo E, Rebaudiosídeo F, Steviolbiosídeo, Dulcosídeo A, Rubusosídeo, mogrosídeos, brazeína, ácido glicirrízico e seus sais, taumatina, perilartina, pernandulcin, mucuroziosídeos, baiyunosídeo, flomisosídeo-I, ácido dimetil- hexahidrofluoreno-dicarboxílico, abrusosídeos, periandrina, carnosiflosídeos, ciclocariosídeo, pterocariosídeos, polipodosídeo A, brazilina, hernandulcin, filodulcin, glicifilina, florizina, trilobatina, dihidroflavonol, dihidroquercetin-3- acetato, neoastilibina, trans-cinamaldeído, monatina e seus sais, seligueaina A, hematoxilina, monelina, osladina, pterocariosídeo A, pterocariosídeo B, mabinlina, pentadina, miraculina, curculina, neoculina, ácido clorogênico, cinarina, adoçante Luo Han Guo, siamenosídeo e similares, e combinações dos mesmos.

[00166] Em uma outra modalidade particular o Rebaudiosídeo D como composto adoçante pode ser usado junto com adoçantes sintéticos ou artificiais de alta intensidade.

[00167] A expressão “adoçantes sintéticos ou artificiais de alta intensidade”, conforme usado neste relatório, refere-se a quaisquer composições que não são encontradas na natureza e que têm um poder adoçante superior ao da sacarose, frutose ou glicose.

[00168] Exemplos não limitativos adoçantes sintéticos ou artificiais de alta intensidade incluem sucralose, acesulfame potássio, aspartame, alitame, sacarina, neo-hesperidina di-hidrochalcona, ciclamato, neotame, dulcin, suosan, éster 1-metílico de N-[N-[3-(3-hidroxi-4-metoxifenil)propil]-L- a- aspartil]-L-fenilalanina, éster 1-metílico de N-[N- [3-(3-hidroxi-4-metoxifenil)-3-metilbutil]-L- a- aspartil]-L- fenilalanina, éster 1-metílico de N-[N- [3-(3-metoxi-4-hidroxifenil) propil]-L- a-aspartil]- L-fenilalanina, sais dos mesmos, entre outros, e combinações dos mesmos.

[00169] Em uma modalidade o Rebaudiosídeo D pode ser usado em combinação com supressores naturais de adoçante tais como ácido gimnêmico, hodulcin, zizifina, lactisol, entre outros.

[00170] Em uma outra modalidade o Rebaudiosídeo D pode ser combinado com vários realçadores de sabor umami.

[00171] Em uma modalidade particular o Rebaudiosídeo D pode ser formulado com aminoácidos que incluem, porém sem limitação, ácido aspártico, arginina, glicina, ácido glutâmico, prolina, treonina, teanina, cisteína, cistina, alanina, valina, tirosina, leucina, isoleucina, asparagina, serina, lisina, histidina, ornitina, metionina, camitina, ácido aminobutírico (isômeros alfa-, beta, ou gama), glutamina, hidroxiprolina, taurina, norvalina, sarcosina, e suas formas de sal tais como sais de sódio ou de potássio ou sais de ácido. Os aditivos aminoacídicos também podem estar na configuração D- ou L- ou na monoforma, diforma, ou triforma dos mesmos aminoácidos ou de aminoácidos diferentes. Adicionalmente, os aminoácidos podem ser isômeros a-, β-, y-, δ-, e ε- se apropriado. Combinações dos aminoácidos acima e seus sais correspondentes (por exemplo, sais de sódio, potássio, cálcio, magnésio ou sais de outros metais alcalinos ou alcalinos terrosos, ou sais de ácido), também podem ser aditivos adequados. Os aminoácidos podem ser naturais ou sintéticos. Os aminoácidos também podem ser modificados. Aminoácidos modificados referem-se a qualquer aminoácido no qual pelo menos um átomo fora adicionado, removido, substituído, ou combinações destes eventos (por exemplo, N-alquil aminoácido, N-acil aminoácido, ou N-metil aminoácido). Exemplos não limitativos de aminoácidos modificados incluem derivados de aminoácido tais como trimetil glicina, N-metil- glicina, e N-metil-alanina. Conforme usado neste relatório, aminoácidos abrangem aminoácidos modificados e aminoácidos não modificados. Conforme usado neste relatório, aminoácido modificado também abrange peptídios e polipeptídios (por exemplo, dipeptídios, tripeptídios, tetrapeptídios, e pentapeptídios) tais como glutationa e L-alanil-L- glutamina.

[00172] Em uma modalidade particular o Rebaudiosídeo D podem ser formulados com aditivos poliaminoacídicos que incluem ácido poli-L- aspártico, poli-L-lisina (por exemplo, poli-L- a- lisina ou poli-L- e-lisina) , poli-L-ornitina (por exemplo, poli-L- a-ornitina ou poli-L- e-ornitina) , poli-L-arginina, outras formas poliméricos de aminoácidos, e as formas de sal dos mesmos (por exemplo, sais de magnésio, cálcio, potássio, ou sódio tais como sal monossódico de ácido L- glutâmico). Os aditivos poliaminoacídicos também podem estar na configuração D- ou L-. Adicionalmente, os poliaminoácidos podem ser isômeros a -, β-, y-, δ -, e e- se apropriado. Combinações dos poliaminoácidos acima e seus sais correspondentes (por exemplo, sais de sódio, potássio, cálcio, magnésio ou sais de outros metais alcalinos ou alcalinos terrosos, ou sais de ácido), também são aditivos realçadores do sabor doce adequados nas modalidades desta invenção. Os poliaminoácidos descritos nesta invenção também podem compreender copolímeros de diferentes aminoácidos. Os poliaminoácidos podem ser naturais ou sintéticos. Os poliaminoácidos também podem ser modificados, tais como aqueles nos quais pelo menos um átomo fora adicionado, removido, substituído, ou combinações destes eventos (por exemplo, N-alquil poliaminoácido ou N-acil poliaminoácido). Conforme usado neste relatório, poliaminoácidos abrangem poliaminoácidos modificados e poliaminoácidos não modificados. De acordo com modalidades particulares, poliaminoácidos modificados incluem, porém sem limitação, poliaminoácidos de vários pesos moleculares (PM) , tais como poli-L- a-lisina com um PM de 1.500, PM de 6.000, PM de 25.200, PM de 63.000, PM de 83.000, ou PM de 300.000.

[00173] Em uma outra modalidade particular o Rebaudiosídeo D pode ser combinado com polióis ou álcoois de açúcar. O termo “poliol” refere-se a uma molécula que contém mais de um grupo hidroxil. Um poliol pode ser um diol, triol, ou um tetraol que contém 2, 3, e 4 grupos hidroxil, respectivamente. Um poliol também pode conter mais de quatro grupos hidroxil, tal como um pentaol, hexaol, heptaol, ou similar, que contêm 5, 6, ou 7 grupos hidroxil, respectivamente. Adicionalmente, um poliol também pode ser um álcool de açúcar, um álcool poli- hídrico, ou um poliálcool que é uma forma reduzida de carboidrato, no qual o grupo carbonil (aldeído ou cetona, açúcar redutor) fora reduzido para um grupo hidroxil primário ou secundário.

[00174] Exemplos não limitativos de polióis incluem eritritol, maltitol, manitol, sorbitol, lactitol, xilitol, inositol, isomalte, propileno glicol, glicerol, treitol, galactitol, isomaltulose hidrogenada, isomalto-oligossacarídeos reduzidos, xilo-oligossacarídeos reduzidos, gentio- oligossacarídeos reduzidos, xarope de maltose reduzida, xarope de glicose reduzida, hidrolisados de amido hidrogenados, poliglicitóis e álcoois de açúcar ou quaisquer outros carboidratos que podem ser reduzidos e que não afetam negativamente o sabor da composição de adoçante, e combinações dos mesmos.

[00175] Em uma modalidade particular o Rebaudiosídeo D pode ser combinado com adoçantes de calorias reduzidas tais como D-tagatose, L-açúcares, L-sorbose, L-arabinose, e outros e combinações dos mesmos.

[00176] Em uma outra modalidade particular o Rebaudiosídeo D pode ser combinado com vários carboidratos. O termo “carboidrato” refere-se em geral a compostos de aldeído ou cetona substituídos com múltiplos grupos hidroxila, da fórmula geral (CH2O) n, onde “n” é 3-30, assim como seus oligômeros e polímeros. Os carboidratos da presente invenção podem, ainda, ser substituídos ou desoxigenados em uma ou mais posições. Carboidratos, conforme usado neste relatório, abrangem carboidratos não modificados, derivados de carboidrato, carboidratos substituídos, e carboidratos modificados. Conforme usado neste relatório, as expressões “derivados de carboidrato”, “carboidrato substituído”, e “carboidratos modificados” são sinônimos. Carboidrato modificado significa qualquer carboidrato no qual pelo menos um átomo fora adicionado, removido, substituído, ou combinações destes eventos. Assim sendo, derivados de carboidrato ou carboidratos substituídos incluem monossacarídeos, dissacarídeos, oligossacarídeos, e polissacarídeos substituídos e não-substituídos. Os derivados de carboidrato ou carboidratos substituídos podem ser opcionalmente desoxigenados em qualquer posição de C correspondente, e/ou substituídos com uma ou mais porções tais como hidrogênio, halogênio, haloalquil, carboxil, acil, acilóxi, amino, amido, derivados carboxílicos, alquilamino, dialquilamino, arilamino, alcóxi, arilóxi, nitro, ciano, sulfo, mercapto, imino, sulfonyl, sulfenil, sulfinil, sulfamoil, carboalcóxi, carboxamido, fosfonil, fosfinil, fosforil, fosfino, tioéster, tioéter, oximino, hidrazino, carbamil, fosfo, fosfonato, ou qualquer outro grupo funcional viável contanto que o derivado de carboidrato ou carboidrato funcione sirva para melhorar o sabor adocicado da composição de adoçante.

[00177] Exemplos não limitativos de carboidratos nas modalidades desta invenção incluem tagatose, trealose, galactose, ramnose, várias ciclodextrinas, oligossacarídeos cíclicos, vários tipos de maltodextrinas, dextrana, sacarose, glicose, ribulose, frutose, treose, arabinose, xilose, lixose, alose, altrose, manose, idose, lactose, maltose, açúcar invertido, isotrealose, neotrealose, isomaltulose, eritrose, desoxirribose, gulose, idose, talose, eritrulose, xilulose, psicose, turanose, celobiose, amilopectina, glucosamina, manosamina, fucose, ácido glicurônico, ácido glicônico, glucono-lactona, abequose, galactosamina, oligossacarídeos de beterraba, isomalto- oligossacarídeos (isomaltose, isomaltotriose, panose, entre outros), xilo-oligossacarídeos (xilotriose, xilobiose, entre outros), oligossacarídeos xilo-terminados, gentio- oligossacarídeos (gentiobiose, gentiotriose, gentiotetraose, entre outros), sorbose, nigero- oligossacarídeos, palatinose oligossacarídeos, fruto-oligossacarídeos (questose, nistose, entre outros), maltotetraol, maltotriol, malto- oligossacarídeos (maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, malto-hexaose, malto-heptaose, entre outros), amido, inulina, inulo-oligossacarídeos, lactulose, melibiose, rafinose, ribose, açúcares líquidos isomerizados tais como xarope de milho de alto teor de frutose, açúcares de acoplamento, e oligossacarídeos da soja. Adicionalmente, os carboidratos, conforme usado neste relatório, pode estar na configuração D- ou L-. Nas formulações, quaisquer combinações dos compostos podem ser usadas.

[00178] Em uma modalidade particular o Rebaudiosídeo D podem ser formulados com ácidos de açúcar que incluem, porém sem limitação, ácido aldônico, ácido urônico, ácido aldárico, ácido algínico, ácido glicônico, ácido glicurônico, ácido glucárico, ácido galactárico, ácido galacturônico, e seus sais (por exemplo, sais de sódio, potássio, cálcio, magnésio ou outros sais fisiologicamente aceitáveis), e combinações dos mesmos.

[00179] Em uma modalidade particular o Rebaudiosídeo D pode ser usado em combinação com várias substâncias fisiologicamente ativas ou ingredientes funcionais. Os ingredientes funcionais geralmente são classificados em categorias tais como carotenoides, fibras dietéticas, ácidos graxos, saponinas, antioxidantes, nutracêuticos, flavonoides, isotiocianatos, fenóis, esteróis e estanóis de plantas (fitosteróis e fitostanóis); polióis; prebióticos, probióticos; fitoestrogênios; proteínas da soja; sulfetos/tióis; aminoácidos; proteínas; vitaminas; e minerais. Os ingredientes funcionais também podem ser classificados com base em seus benefícios para a saúde, tais como cardiovasculares, redutores de colesterol, e anti- inflamatórios.

[00180] A composição com Rebaudiosídeo D pode incluir um agente flavorizante que pode ser de origem natural ou artificial. Conforme usado neste relatório, a menos que de outra indicado, o termo “flavorizante” significa qualquer material de grau alimentício que pode ser adicionado às presentes composições para proporcionar um sabor desejado ao alimento. Flavorizantes úteis na presente invenção incluem, por exemplo, um óleo essencial, tal como um óleo derivado de uma planta ou de uma fruta, óleo de hortelã-pimenta, óleo de hortelã verde, óleos de outras mentas, óleo de cravo-da-índia, óleo de canela, óleo de gualtéria, louro, tomilho, folha de cedro, noz-moscada, pimenta-da-jamaica, sálvia, flor da noz-moscada, e amêndoas. O agente flavorizante pode ser um extrato vegetal ou uma essência de fruta tal como maçã, banana, melancia, pera, pêssego, uva, morando, framboesa, cereja, ameixa, abacaxi, damasco, e misturas das mesmas. O agente flavorizante pode ser um sabor cítrico, tal como um extrato, essência, ou óleo de limão, lima, laranja, tangerina, toronja, cidra, ou kumquat. Sabores úteis na presente invenção também podem incluir creme, avelã, baunilha, chocolate, canela, noz-pecã, limão, lima, framboesa, pêssego, manga, vanilina, manteiga, caramelo, chá, laranja, tangerina, açúcar queimado, morango, banana, uva, ameixa, cereja, mirtilo, abacaxi, baga de sabugueiro, melancia, goma de mascar, cantalupo, goiaba, kiwi, papaya, coco, menta, hortelã verde, derivados, e combinações dos mesmos.

[00181] A composição com Rebaudiosídeo D pode incluir um componente aromatizante. Conforme usado neste relatório, unless otherwise indicated, the term "componente aromatizante " significa uma substância volátil de grau alimentício que pode ser empregada para produzir um perfume desejado, por exemplo, quando misturado com um produto alimentício. Aromas úteis na presente invenção incluem, por exemplo, óleos essenciais (óleo de cítrico), óleos expressos (óleo de laranja), óleos destilados (óleo de rosas), extratos (frutas), anetol (alcaçuz, semente de anis, ouzo, funcho), anisol (semente de anis), benzaldeído (marzipã, amêndoa), álcool benzílico (marzipã, amêndoa), cânfora (cinamomo-cânfora), cinamaldeído (canela), citral (óleo de citronela, óleo limão), d-limoneno (laranja), etil butanoato (abacaxi), eugenol (óleo de cravo-da-índia), furaneol (morango), furfural (caramelo), linalool (coentro, pau-rosa), mentol (hortelã-pimenta), metil butanoato (maçã, abacaxi), metil salicilato (óleo de gualtéria), neral (flores da laranja), nerolina (flores da laranja), pentil butanoato (pera, damasco), pentil pentanoato (maçã, abacaxi), sotolon (xarope de bordo, curry, feno- grego), cetona de morango (morango), pirazinas substituídas, por exemplo, 2-etoxi-3- isopropilpirazina; 2-metoxi-3-sec-butilpirazina; e 2-metoxi-3-metilpirazina (sementes torradas de feno- grego, cominho, e coetro), tujona (junípero, sálvia comum, cipreste de Nootka, e absinto), timol (semelhante à confora), trimetilamina (peixe), vanilina (baunilha), e combinações dos mesmos. Componentes aromatizantes preferidos de acordo com a presente invenção incluem óleos essenciais (óleo cítrico), óleos expressos (óleo de laranja), óleos destilados (óleo de rosas), extratos (frutas), benzaldeído, d-limoneno, furfural, mentol, metil butanoato, pentil butanoato, sais, derivados, e combinações dos mesmos.

[00182] As composições com Rebaudiosídeo D podem compreender um aditivo nucleotídico para uso nas modalidades desta invenção. Eles incluem, porém sem limitação, monofosfato de inosina, monofosfato de guanosina, monofosfato de adenosina, monofosfato de citosina, monofosfato de uracil, difosfato de inosina, difosfato de guanosina, difosfato de adenosina, difosfato de citosina, difosfato de uracil, trifosfato de inosina, trifosfato de guanosina, trifosfato de adenosina, trifosfato de citosina, trifosfato de uracil, e seus sais de metais alcalinos e de metais alcalinos terrosos, e combinações dos mesmos. Os nucleotídeos descritos nesta invenção também podem compreender aditivos relacionados com nucleotídeos tais como nucleosídeos ou bases de ácidos nucleicos (por exemplo, guanina, citosina, adenina, timina, uracil).

[00183] As composições com Rebaudiosídeo D podem compreender um aditivo do tipo ácido orgânico. Ácidos orgânicos são compostos que compreendem uma porção -COOH. Aditivos do tipo ácido orgânico adequados para uso nas modalidades desta invenção incluem, porém sem limitação, ácidos carboxílicos C2-C30, ácidos carboxílicos C1-C30 substituídos, ácido benzoico, ácidos benzoicos substituídos (por exemplo ácido 2,4-dihidroxibenzoico), ácidos cinâmicos substituídos, hidroxiácidos, ácidos hidroxibenzoicos substituídos, ácidos ciclo-hexil carboxílicos substituídos, ácido tânico, ácido láctico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido glicônico, ácidos glico-heptônicos, ácido adípico, ácido hidroxicítrico, ácido málico, ácido frutárico (uma mistura de ácidos málico, fumárico e tartárico), ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico, ácido clorogênico, ácido salicílico, creatina, cloridrato de glicosamina, glucono delta lactona, ácido cafeico, ácidos biliares, ácido acético, ácido ascórbico, ácido algínico, ácido critórbico, ácido poliglutâmico, e seus derivados do tipo sais de metais alcalinos ou alcalinos terrosos. Além disso, os aditivos do tipo ácido orgânico também podem estar na configuração D- ou L-.

[00184] As composições com Rebaudiosídeo D podem compreender um aditivo do tipo sal de ácido orgânico. Eles incluem, porém sem limitação, sais de sódio, cálcio, potássio, e magnésio de todos os ácidos orgânicos, tais como sais de ácido cítrico, ácido málico, ácido tartárico, ácido flunárico, ácido láctico (por exemplo, lactato de sódio), ácido algínico (por exemplo, alginato de sódio), ácido ascórbico (por exemplo, ascorbato de sódio), ácido benzoico (por exemplo, benzoato de sódio ou benzoato de potássio), e ácido adípico. Os exemplos dos aditivos do tipo sal de ácido orgânico que melhoram o sabor adocicado descritos acima podem ser opcionalmente substituídos com uma ou mais das seguintes porções selecionadas do grupo que consiste em hidrogênio, alquil, alquenil, alquinil, halo, haloalquil, carboxil, acil, acilóxi, amino, amido, derivados carboxílicos, alquilamino, dialquilamino, arilamino, alcóxi, arilóxi, nitro, ciano, sulfo, tiol, imina, sulfonil, sulfenil, sulfinil, sulfamil, carboxalcóxi, carboxamido, fosfonil, fosfinil, fosforil, fosfino, tioéster, tioéter, anidrido, oximino, hidrazino, carbamil, fosfo, fosfonato, e qualquer outro grupo funcional viável, contanto que o aditivo do tipo sal de ácido orgânico substituído sirva para melhorar o sabor adocicado da composição de adoçante.

[00185] As composições com Rebaudiosídeo D podem compreender um aditivo do tipo ácido inorgânico para uso nas modalidades desta invenção. Eles incluem, porém sem limitação, ácido fosfórico, ácido fosforoso, ácido polifosfórico, ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido carbônico, fosfato diácido de sódio, e seus sais de metais alcalinos ou alcalinos terrosos correspondentes (por exemplo, hexafosfato Mg/Ca de inositol).

[00186] As composições com Rebaudiosídeo D podem compreender um composto amargo como aditivo para uso nas modalidades desta invenção, porém sem limitação, cafeína, quinino, ureia, óleo de laranja amargo, naringina, quassia, e sais dos mesmos.

[00187] As composições com Rebaudiosídeo D podem compreender realçadores de doçura artificiais ou naturais e combinações dos mesmos.

[00188] A formulação de Rebaudiosídeo D pode incluir um aditivo polimérico para uso nas modalidades desta invenção, porém sem limitação, quitosano, pectina, ácido péctico, pectínico, poliurônico, ácido poligalacturônico, amido, hidrocoloide de grau alimentício ou extratos brutos do mesmo (goma acácia senegal (Fibergum.TM.), goma acácia seyal, carragenana), poli-L-lisina (por exemplo, poli-L- α-lisina ou poli-L- e-lisina), poli- L-ornitina (por exemplo, poli-L- a-ornitina ou poli- L- e-ornitina), poliarginina, polipropileno glicol, polietileno glicol, poli(etileno glicol metil éter), ácido poliaspártico, ácido poliglutâmico, polietilenoimina, ácido algínico, alginato de sódio, alginato de propileno glicol, hexametafosfato de sódio (SHMP) e seus sais, e polietilenoglicolalginato de sódio e outros polímeros catiônicos e aniônicos.

[00189] A formulação de Rebaudiosídeo D pode incluir uma proteína ou hidrolisados de proteína como aditivos para uso nas modalidades desta invenção, porém sem limitação, albumina sérica bovina, proteína de soro de leite (incluindo frações ou concentrados da mesma tais como isolado proteína de soro de leite instantâneo a 90%, proteína de soro de leite a 34%, proteína de soro de leite hidrolisada a 50%, e 80% concentrado de proteína de soro de leite), proteína de arroz solúvel, proteína de soja, isolados de proteínas, hidrolisasdos de proteínas, produtos reacionais de hidrolisasdos de proteínas, glicoproteínas, e/ou proteoglicanos contendo aminoácidos (por exemplo, glicina, alanina, “senrne”, treonina, asparagina, glutamina, arginina, valina, isoleucina, leucina, norvalina, metionina, prolina, tirosina, hidroxiprolina, entre outros), colágeno (por exemplo, gelatina), colágeno parcialmente hidrolisado (por exemplo, colágeno de peixe hidrolisado), e hidrolisados de colágeno (por exemplo, hidrolisados de colágeno de porco).

[00190] A formulação de Rebaudiosídeo D pode incluir aditivos do tipo tensoativo para uso nas modalidades desta invenção, porém sem limitação, polissorbatos (por exemplo, polioxietileno sorbitan monooleato (polissorbato 80), polissorbato 20, polissorbato 60), dodecilbenzenesulfonato de sódio, dioctil sulfosuccinato ou dioctil sulfosuccinato de sódio, dodecil sulfato de sódio, cloreto de cetilpiridínio (cloreto de hexadecilpiridínio), brometo de hexadeciltrimetilamônio, colato de sódio, carbamoil, cloreto de colina, glicocolato de sódio, taurodeoxicolato de sódio, arginato láurico, estearoil lactilato de sódio, taurocolato de sódio, lecitinas, ésteres de oleato de sacarose, ésteres de estearato de sacarose, ésteres de palmitato de sacarose, ésteres de laurato de sacarose, e outros emulsificantes, entre outros.

[00191] A formulação de Rebaudiosídeo D pode incluir um aditivo do tipo flavonoide para uso nas modalidades desta invenção que geralmente são classificados como flavonóis, flavonas, flavanonas, flavan-3-óis, isoflavonas ou antocianidinas. Exemplos não limitativos de aditivos do tipo flavonoide incluem catequinas (por exemplo, extratos de chá verde), polifenóis, rutinas, neo-hesperidina, naringina, neo-hesperidina di-hidrochalcona, entre outros.

[00192] A formulação pode incluir um aditivo do tipo álcool para uso nas modalidades desta invenção incluem, porém sem limitação, etanol.

[00193] A formulação pode incluir um composto adstringente como aditivo que inclui, porém sem limitação, ácido tânico, cloreto de európio (EuC3), cloreto de gadolínio (GdCl3), cloreto de térbio (TbCl3), alúmen, ácido tânico, e polifenóis (por exemplo, polifenóis do chá).

[00194] A formulação pode incluir uma vitamina. Vitaminas são compostos orgânicos que o corpo humano precisa em quantidades pequenas para seu funcionamento normal. O corpo utiliza as vitaminas sem quebrá-las, ao contrário de outros nutrientes tais como carboidratos e proteínas. As vitaminas para uso na modalidade incluem, porém sem limitação, vitamina A (retinol, retinaldeído, ácido retinoico, retinoides, retinal, ácido retinoico), vitamina D (vitaminas D1-D5; colecalciferol, lumisterol, ergocalciferol, di-hidrotaquisterol, 7- desidrocolesterol), vitamina E (eocoferol, tocotrienol), vitamina K (filoquinona, naftoquinona), vitamina B1 (tiamina), vitamina B2 (riboflavina, vitamina G), vitamina B3 (niacina, ácido nicotínico, vitamina PP), vitamina B5 (ácido pantotênico), vitamina B6 (piridoxina, piridoxal, piridoxamina), vitamina B7 (biotina, vitamina H), vitamina B9 (ácido fólico, folato, folacina, vitamina M, ácido pteroil-L-glutâmico), vitamina B12 (cobalamina, cianocobalamina), e vitamina C (ácido ascórbico).

[00195] Vários outros compostos foram classificados como vitaminas por alguns órgãos. Esses compostos podem ser chamados de pseudo-vitaminas e incluem, porém sem limitação, compostos tais como ubiquinona (coenzima Q10), ácido pangâmico, dimetilglicina, taestrile, amigdalina, flavanoides, ácido para- aminobenzoico, adenina, ácido adenílico, e s- metilmetionina. Conforme usado neste relatório, o termo vitamina inclui pseudo-vitaminas.

[00196] A formulação com Rebaudiosídeo D pode incluir uma fibra dietética. Fibra dietética, também conhecida como cargas ou substâncias não digeríveis, é a porção do alimento resistente à hidrólise pelas enzimas digestivas humanas e geralmente compreende a porção não digerível de materiais de planta que se desloca através do sistema digestivo e estimula o intestino ao peristaltismo.

[00197] Numerosos carboidratos polímeros tendo estruturas significativamente diferentes tanto em suas composições como em suas ligações se enquadram na definição de fibra dietética. Tais compostos são bastante conhecidos pelos especialistas na técnica, exemplos não limitativos que incluem polissacarídeos diferentes de amido, lignina, celulose, metilcelulose, hemiceluloses, β -glicanos, pectinas, gomas, mucilagem, ceras, inulina, oligossacarídeos, fructo-oligossacarídeos, ciclodextrinas, quitinsa, e combinações dos mesmos.

[00198] Fontes alimentícias de fibra dietética incluem, porém sem limitação, grãos, legumes, frutas e verduras. Grãos que fornecem fibra dietética incluem, porém sem limitação, aveia, centeio, cevada, trigo. Legumes que fornecem fibra incluem, porém sem limitação, ervilhas e favas tais como feijão de soja. Frutas e verduras que fornecem uma fonte de fibra incluem, porém sem limitação, maçã, laranja, pera, banana, cereja, tomate, vagem, brócoli, couve-flor, cenoura, batata, aipo. Alimentos vegetais tais como farelo, nozes e sementes (tais como semente de linhaça) também são fontes de fibra dietética. Partes de plantas que fornecem fibra dietética incluem, porém sem limitação, caules, raízes, folhas, sementes, polpa e casca.

[00199] Embora a fibra dietética geralmente seja derivada de fontes vegetais, produtos animais não digeríveis tais como quitinas também são classificados como fibra dietética. A quitina é um polissacarídeo composto de unidades de acetilglicosamina unidades por ligações β(1-4), semelhantes às ligações de celulose.

[00200] A formulação contendo Rebaudiosídeo D pode compreender um antioxidante. Exemplos de antioxidantes adequados para as modalidades desta invenção incluem, porém sem limitação, vitaminas, cofatores vitamínicos, minerais, hormônios, carotenoides, terpenoides carotenoides, terpenoides não carotenoides, flavonoides, polifenólicos flavonoides (por exemplo, bioflavonoides), flavonóis, flavonas, fenóis, polifenóis, ésteres de fenóis, ésteres de polifenóis, fenólicos não flavonoides, isotiocianatos, e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, o antioxidante pode incluir vitamina A, vitamina C, vitamina E, ubiquinona, selênio mineral, manganês, melatonina, α-caroteno, β-caroteno, licopeno, luteína, zeantina, cripoxantina, reservatol, eugenol, quercetina, catequina, gossipol, hesperetina, curcumina, ácido ferúlico, timol, hidroxitirosol, tumérico, tomilho, óleo de oliva, ácido lipoico, glutatinona, gulamina, ácido oxálico, compostos derivados de tocoferol, hidroxianisol butilado, hidroxiolueno butilado, ácido etilenodiaminatetra-acético, ter-butil- hidroquinona, ácido acético, pectina, tocotrienol, tocoferol, coenzima Q10, zeaxantina, astaxantina, cantaxantina, saponinas, limonoides, kaempfedrol, miricetina, isorhamnetina, proantocianidinas, quercetina, rutina, luteolina, apigenina, tangeritina, hesperetina, naringenina, erodictiol, flavan-3-óis (por exemplo, antocianidinas), galocatequinas, epicatequina e suas formas de galato, epigalocatequina e suas formas de galato, teaflavina e suas formas de galato, tearubiginas, fitoestrogênios de isotlavona, genisteína, daidzeína, gliciteína, anitocianinas, cianiding, delfinidina, malvidina, pelargonidina, peonidina, petunidina, ácido elágico, ácido gálico, ácido salicílico, ácido rosmarínico, ácido cinâmico e seus derivados (por exemplo, ácido ferúlico), ácido clorogênico, ácido chicórico, galotanninas, elagitaninas, antoxantinas, betacianinas e outros pigmentos vegetais, silimarina, ácido cítrico, lignano, antinutrientes, bilirubina, ácido úrico, ácido R-. alfa.-lipoico, N-acetilcisteína, emblicanina, extrato de maçã, extrato de casca de maçã (“applefenon”), extrato de chá vermelho, extrato de chá de rooibos, extrato de baga de pilriteiro verde, extrato de framboesa vermelha, antioxidante de café verde, extrato de semente de uva a 20% de extrato de aronia, extrato de cacau, extrato de lúpulo, extrato de mangostão, extrato de casca de mangostão, extrato de arando, extrato de romã, extrato de casca de romã, extrato de semente de romã, extrato de baga de pilriteiro, extrato de romã pomela, extrato de casca de canela, extrato de casca de uva, extrato de arando, extrato de casca de abacaxi, picnogenol, extrato de baga de sabugueiro, extrato de raiz de amora, extrato de sinforina (gogi), extrato de amora-preta, extrato de mirtilo, extrato de folha de mirtilo, extrato de framboesa, extrato de turmérico, bioflavonoides cítricos, groselha preta, gengibre, pó de açaí, extrato de grão de café verde, extrato de chá verde, e ácido fítico, ou combinações dos mesmos. Em modalidades alternativas, o antioxidante pode compreender um antioxidante sintético tal como hidroxitolueno butilado ou hidroxianisol butilado, por exemplo. Outras fontes de antioxidantes adequados para as modalidades desta invenção incluem, porém sem limitação, frutas, verduras, chá, cacau, chocolote, especiarias, ervas, arroz, carne de gado, levedura, grãos integrais, ou grãos de cereais.

[00201] Alguns antioxidantes pertencem à classe de fitonutrientes chamados polifenóis (também conhecidos como “polifenólicos”), que constituem um grupo de substâncias químicas encontradas em plantas, caracterizadas pela presença de mais de um grupo fenol por molécula. Diversos benefícios para a saúde podem ser derivados dos polifenóis, incluindo prevenção contra câncer, doenças cardíacas, e doenças inflamatórias crônicas e resistência mental e resistência física melhoradas, por exemplo. Polifenóis adequados para as modalidades desta invenção incluem catequinas, proantocianidinas, procianidinas, antocianinas, quercerina, rutina, reservatrol, isoflavonas, curcumina, punicalagina, elagitanina, hesperidina, naringina, flavonoides cítricos, ácido clorogênico, outros materiais semelhantes, e combinações dos mesmos.

[00202] Fontes adequadas de catequinas para as modalidades desta invenção incluem, porém sem limitação, chá verde, chá branco, chá preto, chá oolong, chocolate, cacau, vinho tinto, semente de uva, casca de uva vermelha, casca de uva roxa, suco de uva vermelha, suco de uva roxa, bagas, picnogenol, e casca de maçã vermelha. Fontes adequadas de antioxidantes tais como proantocianidinas e procianidinas para as modalidades desta invenção incluem, porém sem limitação, uva vermelha, uva roxa, cacau, chocolate, semente de uva, vinho tinto, grãos de cacau, arando, casca de maçã, ameixa, mirtilo, groselha preta, arônia, chá vrede, sorgo, canela, cevada, feijão roxo, feijão cavalo, lúpulo, amêndoa, avelã, noz- pecã, pistache, picnogenol, e bagas coloridas. Fontes adequadas de antocianinas para as modalidades desta invenção incluem, porém sem limitação, frutas vermelhas, mirtilo, arando, oxicoco, framboesa, cereja, romã, morango, baga de sabugueiro, arônia, casca de uva vermelha, casca de uva roxa, semente de uva, vinho tinto, groselha preta, groselha vermelha, cacau, ameixa, casca de maçã, pêssego, pera vermelha, repolho roxo, cebola roxa, laranja vermelha, e amora-preta. Fontes adequadas de quercetina e rutina para as modalidades desta invenção incluem, porém sem limitação, maçã vermelha, cebola, couve, arando do pântano, “lingonberrys”, arânio, oxicoco, amora-preta, mirtilo, morango, framboesa, groselha preta, chá verde, chá preto, ameixa, damasco, salsa, alho-poró, brócoli, pimenta chilli, “berry wine”, e gingo. Fontes adequadas de resveratrol para as modalidades desta invenção incluem, porém sem limitação, uva vermelha, amendoim, oxicoco, mirtilo, arando, amora, chá de Itadori, e vinho tinto. Fontes adequadas de isoflavonas para as modalidades desta invenção incluem, porém sem limitação, feijão se soja, produtos de soja, legumes, grão de alfalfa, grão-de- bico, amendoim, e trevo vermelho. Fontes adequadas de curcuma para as modalidades desta invenção incluem, porém sem limitação, turmérico e mostarda. Fontes adequadas de punicalagina e elagitanina para as modalidades desta invenção incluem, porém sem limitação, romã, framboesa, morango, noz, e vinho tinto envelhecido em carvalho. Fontes adequadas de flavonides cítricos, tais como hesperidina ou naringina, para as modalidades desta invenção incluem, porém sem limitação, laranja, toronja, e sucos cítricos. Fontes adequadas de ácido clorogênico para as modalidades desta invenção incluem, porém sem limitação, café verde, erva mate, vinho tinto, semente de uva, casca de uva vermelha, casca de uva roxa, suco de uva vermelha, suco de uva roxa, suco de maçã, oxicoco, romã, mirtilo, morango, girassol, Echinacea, picnogenol, e casca de maçã.

[00203] A composição de Rebaudiosídeo D pode incluir ácidos graxos. Conforme usado neste relatório, “ácido graxo” refere-se a qualquer ácido monocarboxílico de cadeia reta e inclui ácidos graxos saturados, ácidos graxos insaturados, ácidos graxos de cadeia longa, ácidos graxos de cadeia média, ácidos graxos de cadeia curta, precursores de ácidos graxos (inclusive precursores de ácidos graxos ômega-9), e ácidos graxos esterificados. Conforme usado neste relatório, “ácido graxo poli- insaturado de cadeia longa” refere-se a qualquer ácido carboxílico ou ácido orgânico poli-insaturado com uma cauda alifática longa. Conforme usado neste relatório, “ácido graxo ômega-3” refere-se a qualquer ácido graxo poli-insaturado tendo uma primeira ligação dupla como a terceira ligação carbono-carbono a partir da extremidade metil terminal de sua cadeia de carbonos. Em modalidades particulares, o ácido graxo ômega-3 pode compreender um ácido graxo ômega-3 de cadeia longa. Conforme usado neste relatório, “ácido graxo ômega-6” refere- se a qualquer ácido graxo poli-insaturado tendo uma primeira ligação dupla como a sexta ligação carbono- carbono a partir da extremidade metil terminal de sua cadeia de carbonos.

[00204] A composição com Rebaudiosídeo D pode incluir um sal. O termo “sal” também se refere a complexos que retêm a atividade química desejada das composições que melhoram o sabor doce da presente invenção e são seguros para consumo humano ou animal dentro de um limite geralmente aceito. Sais de metais alcalinos (por exemplo, sódio ou potássio) ou de metais alcalinos terrosos (por exemplo, cálcio ou magnésio) também podem ser feitos. Sais também podem incluir combinações de metais alcalinos e de metais alcalinos alcalinos. Exemplos não limitativos de tais sais são (a) sais de adição de ácido formados com ácidos inorgânicos e sais formados com ácidos orgânicos; (b) sais de adição de base formados com cátions metálicos tais como cálcio, bismuto, bário, magnésio, alumínio, cobre, cobalto, níquel, cádmio, sódio, potássio, entre outros, ou com um cátion formado de amônia, N, N-dibenziletilenodiamina, D- glicosamina, tetraetilamônio, ou etilenodiamina; ou (c) combinações de (a) e (b). Por conseguinte, qualquer forma de sal que pode ser derivado das composições que melhoram o sabor doce pode ser usada com as modalidades da presente invenção contanto que os sais dos aditivos que melhoram o sabor doce não afetem negativamente o sabor das composições de adoçante compreendendo o pelo menos adoçante natural e/ou sintético de alta potência. As formas de sal dos aditivos podem ser adicionadas à composição de adoçante natural e/ou sintética nas mesmas quais que suas formas de ácido ou de base.

[00205] Em modalidades particulares, sais inorgânicos adequados úteis nessas modalidades incluem, porém sem limitação, cloreto de sódio, cloreto de potássio, sulfato de sódio, citrato de potássio, cloreto de európio (EuCl3), cloreto de gadolínio (GdCl3), cloreto de térbio (TbCl3), sulfato de magnésio, alúmen, cloreto de magnésio, sais sódicos ou potássicos monobásicos, dibásicos e tribásicos de ácido fosfórico (por exemplo, fosfatos inorgânicos), sais de ácido clorídrico (por exemplo, cloretos inorgânicos), carbonato de sódio, bissulfato de sódio, e bicarbonato de sódio. Além disso, em modalidades particulares, sais orgânicos adequados úteis como aditivos que melhoram o sabor doce incluem, porém sem limitação, cloreto de colina, sal sódico de ácido algínico (alginato de sódio), sal sódico de ácido glico-heptônico, sal sódico de ácido glicônico (gliconato de sódio), sal potássico de ácido glicônico (gliconato de potássio), guanidina HCl, glicosamina HCl, amrilorida HCl, glutamato monossódico, sal de monofosfato de adenosina, gliconato de magnésio, tartarato de potássio (mono-hidratado), e tartarado de sódio (di-hidratado).

[00206] A composição de Rebaudiosídeo D obtida de acordo com esta invenção pode ser aplicada como adoçante de alta intensidade para a produção de bebidas e produtos alimentícios de zero caloria, caloria reduzida ou para diabéticos com características de sabor melhoradas. Ela também pode ser usada drinques, gêneros alimentícios, produtos farmacêuticos, e outros produtos nos quais não se pode usar açúcar.

[00207] Além disso, a composição de Rebaudiosídeo D pode ser usada como adoçante não apenas em drinques, gêneros alimentícios, e outros produtos dedicados ao consumo humano, mas também em ração animal e forragem com características melhoradas.

[00208] Exemplos de produtos nos quais as composições de Rebaudiosídeo D podem ser usadas como composto adoçante podem ser bebidas alcólicas tais como vodka, vinho, cerveja, licor, saquê etc.; sucos naturais, bebidas refrescantes, refrigerantes, bebidas dietéticas, bebidas de zero caloria, bebidas e alimentos de caloria reduzida, iogurtes, sucos instantâneos, café instantâneo, bebidas instantâneas em pó, produtos enlatados, xaropes, pasta de soja fermentada, molho de soja, vinagre, molhos, maionese, ketchup, curry, sopa, caldos instantâneos, molho de soja em pó, vinagre em pó, tipos de biscoitos, biscoito de arroz, bolachas, pão, chocolates, caramelos, balas, gomas de mascar, gelatina, pudim, frutas e verduras em conserva, creme fresco, geleia, marmelada, flores em pasta, leite em pó, sorvete, sorbet, verduras e frutas acondicionados em frascos, feijão enlatado e cozido, carne e alimentos cozidos em molho adocicado, produtos alimentícios à base de hortaliças, frutos do mar, presunto, salsicha, embutido de peixe, salsicha de peixe, pasta de peixe, produtos fritos à base de peixe, produtos fritos à base de frutos do mar, produtos alimentícios congelados, algas marinhas em conserva, carne em conserva, tabaco, produtos medicinais, e muitos outros. Em princípio, ela pode ter aplicações ilimitadas.

[00209] A composição adoçada compreende uma bebida, exemplos não limitativos da qual incluem bebidas não gasosas e bebidas gasosas tais como colas, ginger ales, bebidas não alcoólicas feitas de raízes, cidras, bebidas leves flavorizadas com frutas por exemplo, bebidas leves flavorizadas com cítricos tais como lima-limão ou laranja), bebidas leves em pó, entre outros; sucos de fruta provenientes de frutas ou verduras, sucos de fruta incluindo sucos espremidos entre outros, sucos de furta contendo pedaços de fruta, bebidas à base de fruta, bebidas à base de suco de fruta, bebidas contendo sucos de fruta, bebidas com sabor de fruta, sucos de verdura, sucos contendo verduras, e sucos mistos contendo frutas e verduras; bebidas esportivas, bebidas energéticas, água maltada (“near water”) e bebidas similares (por exemplo, água com flavorizantes naturais ou sintéticos); bebidas tipo chá ou bebidas populares tais como café, cacau, chá preto, chá verde, chá oolong, entre outras; bebidas contendo componentes lácteos tais como bebidas lácteas, café contendo componentes lácteos, café com leite, chá com leite, bebidas lácteas à base de frutas, iogurte para beber, bebidas com bactérias do ácido láctico, entre outras; e laticínios.

[00210] Geralmente, a quantidade de adoçante presente em uma composição adoçada varia amplamente dependendo do tipo particular de composição adoçada e sua doçura desejada. Os especialistas na técnica vão perceber facilmente qual a quantidade apropriada de adoçante a ser usada na composição adoçada.

[00211] Na descrição detalhada, apenas algumas modalidades exemplificativas da presente invenção estão mostradas e descritas, a título de ilustração. Os especialistas na técnica vão perceber que a invenção pode ser praticada de muitas formas diferentes e que ela não deve ser interpretada como estando limitada às modalidades apresentadas neste relatório.

[00212] O adoçante obtido nesta invenção pode ser obtida em formas secas ou líquidas. Ele pode ser adicionado antes ou depois do tratamento térmico dos produtos alimentícios. A quantidade de adoçante depende da finalidade de uso. Ele pode adicionado isolado ou em combinação com outros compostos.

[00213] Durante a manufatura de gêneros alimentícios, bebidas, produtos farmacêuticos, cosméticos, produtos de mesa, gomas de mascar, os métodos convencionais tais como misturação, amassamento, dissolução, desoxidação, permeação, percolação, borrifação, atomização, infusão e outros métodos podem ser usados.

[00214] Portanto, as composições da presente invenção podem ser feitas por qualquer método conhecido pelos especialistas na técnica que resulte em misturas homogêneas uniformes ou homogêneas dos ingredientes. Esses métodos incluem misturação a seco, secagem por aspersão, aglomeração, granulação por via úmida, compactação, cocristalização, entre outros.

[00215] Na forma sólida a composição adoçante da presente invenção pode ser apresentada aos consumidores em qualquer forma adequada para aplicação a comestíveis a serem adoçados, as quais incluem sachês, pacotes, sacos ou caixas com o adoçante a granel, cubos, tabletes, névoas, ou tiras solúveis. A composição pode ser apresentada na forma de uma dose unitária ou a granel.

[00216] Para sistemas e composições de adoçante líquido podem ser criadas variedades convenientes de formas fluidas, semifluidas, em pasta e em creme, apropriadas para serem acondicionadas usando material de embalagem apropriado de qualquer formato ou forma que sejam convenientes para levar ou dispensar ou armazenar ou transportar qualquer combinação contendo qualquer produto adoçante acima ou combinação de produtos produzidos acima.

[00217] Estudos realizados mostraram que a combinação de Rebaudiosídeo D com outros glicosídeos de esteviol, adoçantes naturais de alta intensidade e adoçantes artificiais de alta intensidade produz uma composição adoçante com perfil de sabor melhorado.

[00218] Rebaudiosídeo D e outros adoçantes de alta intensidade foram combinados em várias misturas onde a contribuição do Rebaudiosídeo D na doçura da composição variou de 10% a 90%.

[00219] Quanto mais alto era o teor de Rebaudiosídeo D na mistura, mais considerável era o efeito de melhoria.

[00220] A composição pode incluir vários agentes de encorpamento, ingredientes funcionais, corante, flavorizantes.

[00221] Os exemplos a seguir ilustram modalidades preferidas da invenção para o isolamento e a purificação de Rebaudiosídeo D e compostos relacionados e o uso dos mesmos em gêneros alimentícios e produtos farmacêuticos. Ficará entendido que a invenção não se limita aos materiais, proporções, condições e procedimentos apresentados nos exemplos, que são apenas ilustrativos.

EXEMPLO 1

[00222] Purificação de Rebaudiosídeo D

[00223] Um kg de extrato de Stevia contendo extrato de Stevia contendo Steviosídeo - 25,40%, Rebaudiosídeo A - 59,14%, Rebaudiosídeo C - 9,71%, Rebaudiosídeo D - 2,03%, Rebaudiosídeo B - 0,56%, Rebaudiosídeo E - 0,68%, Rebaudiosídeo F - 1,02%, Steviolbiosídeo- 0,11%, e Dulcosídeo A - 1,35% foi dissolvido em 3000 ml de álcool etílico a 95% e a solução foi mantida a 80 ° C por 35 minutos, e em seguida a 15 ° C por 12 horas com agitação. Quando a temperatura atingiu 22oC, 1,0% de Rebaudiosídeo A altamente purificado foi adicionado à mistura reacional como substância de partida para iniciar a cristalização.

[00224] O precipitado foi separado por filtração e lavado com cerca de dois volumes de 99,5% de etanol.

[00225] O rendimento do material cristalino foi de 47,1% com teor de Steviosídeo (8,8%), Rebaudiosídeo A (81,7%), Rebaudiosídeo C (5. 1%), Rebaudiosídeo D (3,3%), Rebaudiosídeo B (0,1%), Rebaudiosídeo E (0,3%), Rebaudiosídeo F (0,4%), e Dulcoside A (0,3%).

[00226] A solução remanescente contém Steviosídeo (40,2%), Rebaudiosídeo A (39,1%), Rebaudiosídeo C (13,8%), Rebaudiosídeo D (0,9%), Rebaudiosídeo B (1,0%), Rebaudiosídeo E (1,0%), Rebaudiosídeo F (1,6%), Steviolbiosídeo (0,2%), e Dulcosídeo A (2,3%), e pode ser usada para o isolamento de Rebaudiosídeo A ou de uma mistura altamente purificada de glicosídeos de esteviol.

[00227] O precipitado foi misturado com 3,5 volumes de 77,7% de etanol e incubado a 50°C por 3 horas com agitação. Em seguida, a mistura foi resfriada para a temperatura ambiente e o precipitado foi separado por filtração. O rendimento de cristais ficou em torno de 14% e 65,9 g de produto foram obtidos com um teor de Steviosídeo (1,4%), Rebaudiosídeo A (72,8%), Rebaudiosídeo C (1,5%), Rebaudiosídeo D (21,4%), Rebaudiosídeo B (0,1%), Rebaudiosídeo E (2,1%), e Rebaudiosídeo F (0,7%).

[00228] O teor dos vários glicosídeos no filtrado foi o seguinte: Steviosídeo (10,0%), Rebaudiosídeo A (83,15%), Rebaudiosídeo C (5,69%), Rebaudiosídeo D (0,35%), Rebaudiosídeo B (0,1%), Rebaudiosídeo E (0,01%), Rebaudiosídeo F (0,35%), e Dulcosídeo A (0,35%).

[00229] Para purificação adicional do Rebaudiosídeo D o precipitado foi suspendido em 50% de etanol a uma proporção de 1:2 p/v e mantido por 12 horas a 35 ° C com agitação. A suspensão foi filtrada e o precipitado foi secado. O rendimento de precipitado ficou em torno de 23% e ele contém Steviosídeo (0,8%), Rebaudiosídeo A (16,2%), Rebaudiosídeo C (0,7%), Rebaudiosídeo D (81,6%), Rebaudiosídeo E (0,5%), e Rebaudiosídeo F (0,2%). Cerca de 15,2 g de material seco foram obtidos neste estágio.

[00230] O teor dos vários glicosídeos no filtrado resultante foi o seguinte: Steviosídeo (1,6%), Rebaudiosídeo A (89,7%), Rebaudiosídeo C (1,7%), Rebaudiosídeo D (3,4%), Rebaudiosídeo B (0,1%), Rebaudiosídeo E (2,6%), e Rebaudiosídeo F (0,8%). Ele foi combinado com o filtrado do estágio anterior.

[00231] O precipitado foi submetido a um tratamento similar com uma solução de etanol a 50% para obter um produto com um teor de 3,8% de Rebaudiosídeo A e 95,7% de Rebaudiosídeo D. O produto também contém Steviosídeo, Rebaudiosídeo C e Rebaudiosídeo F 0,1% cada, assim como 0,2% de Rebaudiosídeo E. O rendimento deste produto ficou em torno de 75% e foram obtidos cerca de 11,4g de cristais.

[00232] A quantidade de filtrado neste estágio foi de cerca de 3,8g com 39,3% e 53,4% de Rebaudiosídeo D e Rebaudiosídeo A, respectivamente.

[00233] O Rebaudiosídeo D obtido foi dissolvido em 2 volumes de metanol a 30% e tratado com 0,3% de carvão ativo a 60°C por 30 minutos e então submetido a filtração a quente. O Rebaudiosídeo D precipitou espontaneamente depois da filtração.

[00234] Os cristais foram separados por filtração e secados a 80oC por 12 horas. O rendimento de precipitado ficou em torno de 8,8 g e ele contém 98,4% Rebaudiosídeo D em termos secos.

[00235] O filtrado combinado do segundo e terceiro estágios de precipitação pesa 455,8 g e contém Steviosídeo (9,1%), Rebaudiosídeo A (83,9%), Rebaudiosídeo C (5,2%), Rebaudiosídeo D (0,7%), Rebaudiosídeo B (0,1%), Rebaudiosídeo E (0,3%), Rebaudiosídeo F (0,4%), e Dulcosídeo A (0,3%). Ele foi misturado com 1% de Rebaudiosídeo A como substância de partida e deixado cristalizar a 22°C por 12 horas. Os cristais foram separados por filtração e lavados com cerca de dois volumes de etanol. O teor de Rebaudiosídeo A nos cristais foi de 98,8% em termos secos. A quantidade foi de 273,5 g depois da secagem.

[00236] A pureza do Rebaudiosídeo D foi determinada usando HPLC que foi realizada usando uma coluna ZORBAX NH2 (150 x 4,6 mm, 5 μm) a uma temperatura de 30°C. A fase móvel compreendia uma solução de 20% de tampão (0,0125% de ácido acético e 0,0125% de acetato de amônio) e 80% de acetonitrila uma taxa de fluxo de 1,0mL/min. 12μL de cada amostra foram injetados em duplicata e a amostra foi analisada usando um detector de UV a 210nm (largura de faixa 4nm) com uma referência de 260nm (largura de faixa 100nm). A análise requereu um tempo de operação de 40 a 60 min.

[00237] Uma solução tampão de 0,0125% de ácido acético e 0,0125% de acetato de amônio foi preparada por dissolução de 0,125g de acetato de amônio e 125μL de ácido acético glacial em um litro de água. O tempo de retenção do Rebaudiosídeo B foi ajustado variando-se a proporção de acetato de amônio para ácido acético enquanto era mantido um total de 0,025% dos dois combinados. O aumento da quantidade de ácido acético diminuiu o tempo de retenção do Rebaudiosídeo B.

[00238] Uma solução diluente foi preparada por misturação de 500mL de álcool etílico e 500mL da solução tampão. Padrões de Rebaudiosídeo D foram preparados por diluição de 10,0 ± 0,5mg (registrado com aproximação de 0,1mg) do padrão de Rebaudiosídeo D com 4mL da solução diluente para fazer uma solução padrão de aproximadamente 2500mg/L. A solução padrão de Rebaudiosídeo D foi injetada a 10,8, 11,4, 12,6 e 13,2μL. O teor de umidade foi medido por análise de Karl Fischer toda vez que um padrão era preparado e as correções foram feitas com base na pureza do solvente de acordo com o certificado de análise.

[00239] Padrões de Steviosídeo foram preparados por diluição de 12,5 ±0,5mg (registrado com aproximação de 0,1mg) do padrão de Steviosídeo com 5mL da solução diluente para fazer uma solução padrão de aproximadamente 2500mg/L (estoque A) (correção da umidade e da pureza). O padrão de Steviosídeo foi então diluído usando um mL do estoque A para dez mL de diluente para produzir um padrão de 250mg/L (estoque B), e padrões de estoque foram diluídos até concentrações finais de 2,5 a 50mg/L.

[00240] Amostras das composições de Rebaudiosídeo D foram preparadas por diluição de 125 ±2mg (registrado com aproximação de 0,1 mg) da composição de Rebaudiosídeo D com 50 mL da solução diluente para fazer uma solução padrão de aproximadamente 2500mg/L (correção da umidade). Amostras em duplicada preparadas individualmente foram injetadas a 12μL. Se as amostras não fossem analisadas imediatamente, elas eram armazenadas sem folga, em uma atmosfera de nitrogênio, e desidratadas.

[00241] A TABELA 11 oferece um guia para os tempos de retenção para o ebaudiosídeo D e outros glicosídeos de esteviol. No entanto, os especialistas na técnica vão perceber que os tempos de retenção podem ser modificados conforme necessário. TABELA 11

EXEMPLO 2

[00242] Suco de laranja de baixa caloria

[00243] 60g de suco de laranja concentrado foram misturados com 1,1g de ácido cítrico, 0,24g de vitamina C, 1,0g de essência de laranja, 0,76g de Rebaudiosídeo D e água para criar uma mistura homogeneamente dissolvida de 1000mL de quantidade total. Em seguida, a mistura foi pasteurizada por um período de 20 segundos a cerca de 95°C para preparar um suco de laranja semelhante àquele feito pelo método convencional. O produto apresentou um perfil de sabor excelente.

[00244] Sucos de outras frutas, tais como maçã, limão, damasco, cereja, abacaxi etc., podem ser preparados usando a mesma abordagem.

EXEMPLO 3

[00245] Sorvete

[00246] 1,50kg de leite integral foi aquecido até 45oC, e 300 gramas de creme de leite, 100 gramas de tagatose, 90 gramas de sorbitol, 6 gramas de carragenano como estabilizante, 3 gramas de polissorbato-80 como emulsificante, e 1,0 grama de Rebaudiosídeo D como no EXEMPLO 10, foram acrescentados ao leite e a mistura foi agitada ate os ingredientes dissolverem completamente. A mistura foi então pasteurizada a uma temperatura de 80oC por 25 segundos. Depois da homogeneização as amostras foram mantidas a uma temperatura de 4oC oor 24 horas para completar o processo de envelhecimento. Sabor baunilha (1,0% em peso da mistura) e corante (0,025% em peso da mistura) foram adicionados à mistura depois de envelhecida. A mistura foi então transferida para uma máquina de sorvete para produzir sorvete automaticamente. Amostras do sorvete produzido foram transferidas para recipientes vedados e foram mantidas na geladeira a uma temperatura de -18oC.

[00247] A aplicação de adoçantes não afeta as propriedades físico-químicas do sorvete, assim como as qualidades gerais de cor, suavidade, textura superficial, célula aerada, intensidade do aroma de baunilha, sabor de baunilha, gredosidade, congelação e taxa de fusão.

EXEMPLO 4

[00248] Iogurte

[00249] Em 1kg de leite desnatado, foi dissolvido 0,8 grama de Rebaudiosídeo D de alta pureza, preparado de acordo com a invenção. Depois de pasteurizar a 82oC por 20 minutos, o leite foi resfriado para 40oC. Um fermento em uma quantidade de 30 gramas foi adicionado e a mistura foi incubada a 37oC por 6 horas. Em seguida, a massa fermentada foi mantida a 10-15oC por 12 horas.

[00250] O produto é um iogurte de baixa caloria e pouco cariogênico, sem sabor e odor estranhos.

EXEMPLO 5

[00251] Ice tea de limão

[00252] A fórmula para a bebida foi a seguinte:

[00253] Todos os ingredientes foram misturados e dissolvidos na água, e pasteurizados. O produto possui gosto e aroma excelentes.

EXEMPLO 6

[00254] Pão

[00255] 1kg de farinha, 37,38 gramas de xarope de fruto-oligossacarídeo, 80 gramas de margarina, 20 gramas de sal, 20 gramas de levedura, e 0,25 grama de Rebaudiosídeo D de alta pureza, obtido de acordo com a invenção foram colocados no liquidificador e bem misturados. 600 ml de água foram despejados na mistura e a mistura foi amassada o suficiente. Ao término do processo de amassamento, a massa foi modelada e deixada crescer por 30 a 45 minutos. A massa pronta foi colocada no forno e assada oor 45 minutos. As amostras de pão tinham uma cor branca cremosa, e uma textura lisa.

EXEMPLO 7

[00256] Diet cookie

[00257] Farinha, 50,0%; margarina, 30,0%; frutose, 10,0%; maltitol, 8,0%; leite integral, 1,0%; sal, 0,2%; fermento, 0,15%; baunilha, 0,1%; Rebaudiosídeo D, 0,55%; obtido de acordo com esta invenção foram bem amassados em uma máquina de misturar massa. Depois de modelagem da massa os cookies foram assados a 200oC por 15 minutos.

[00258] O produto é um diet cookie de baixa caloria com gosto excelente e doçura apropriada.

EXEMPLO 8

[00259] Molho de soja

[00260] 0,8 g de Rebaudiosídeo D foi adicionado a 1000mL de molho de soja e misturado homogeneamente. O produto apresentou um gosto e textura excelentes.

EXEMPLO 9

[00261] Pasta de dente

[00262] Uma pasta de dente foi preparada amassando- se uma composição compreendendo fosfato de cálcio, 45,0%; carboximetilcelulose, 1,5%; carragenano, 0,5%; glicerol, 18,0%; polioxietileno sorbitan monoéster, 2,0%; beta-ciclodextrina, 1,5%; laurilsarcosinato de sódio, 0,2%; flavorizante, 1,0%; preservativo, 0,1%; Rebaudiosídeo D, obtido de acordo com esta invenção, 0,2%; e água para totalizar 100%, da maneira usual. O produto possui bom poder de espumação e limpeza com a doçura apropriada.

EXEMPLO 10

[00263] Bolo

[00264] 123g de ovo de galinha, 45g de açúcar, 345g de sorbitol líquido, 2,0g de éster de ácido graxo de sacarose, 0,35g de Rebaudiosídeo D com 95% de pureza foram misturados com 100g de farinha de trigo e 200g de água para preparar um bolo de acordo com um método convencional. O produto teve um gosto excelente e um ótimo sabor doce.

EXEMPLO 11

[00265] Bebida gasosa de baixa caloria

[00266] A fórmula para a bebida foi a seguinte:

[00267] As bebidas preparadas com diferentes adoçantes foram dadas a 10 juízes para serem comparadas.

[00268] A TABELA 3 mostra os resultados. TABELA 3

[00269] Os resultados acima mostram que as bebidas preparadas usando Rebaudiosídeo D altamente purificado possuem boas características organolépticas.

EXEMPLO 12

[00270] Chocolate

[00271] Uma composição contendo 30kg de licor de cacau, 11,5kg de manteiga de cacau, 14kg de leite em pó, 44kg de sorbitol, 0,1kg de sal, e 0,1kg de Rebaudiosídeo D de alta pureza foi amassada o suficiente, e a mistura foi então colocada em um refinador para reduzir seu tamanho de partícula por 24 horas. Em seguida, o conteúdo foi transferido para uma concha, 300 gramas de lecitina foram adicionados, e a composição foi amassada a 50°C por 48 horas. Em seguida, o conteúdo foi colocado em um aparelho de modelar, e solidificou.

[00272] Os produtos são chocolate pouco catiogênicos e de baixa caloria com excelente textura. Também, o teste organoléptico realizado com 20 degustadores revelou que não havia sabor residual prlongado. Os produtos mais desejáveis foram aqueles com Rebaudiosídeo D com pelo menos 95% de pureza.

EXEMPLO 13

[00273] Tablete de mesa

[00274] Uma mistura, consistindo em 58,5% de lactose, 10% de silicato de cálcio, 5% de croscarmelose, 5% de L-leucina, 1% de aerosol 200, 0,5% de estearato de magnésio, e 20% de Rebaudiosídeo D foi amassada o suficiente. Em seguida a mistura foi modelada com o uso de uma máquina de fazer tabletes, equipada com saca-bocados de 6,2mm de diâmetro, em tabletes de 70mg cada, 3,0mm de espessura, e 10±1 kg de dureza.

[00275] Os tabletes podem ser facilmente administrados devido a sua doçura apropriada. No entanto, as formulações que utilizam baixo grau de Rebaudiosídeo D ficaram um pouco pegajosas com uma solubilidade de cerca de 3-4 minutos em água a 25 °C. Os tabletes, preparados com Rebaudiosídeo D altamente purificado mostram as melhores características com a solubilidade em torno de 20-30 segundos.

[00276] Deve ficar entendido que as descrições e modalidades específicas precedentes aqui mostradas são meramente ilustrativas do melhor modo da invenção e de seus princípios, e que modificações e adições podem ser facilmente feitas pelos especialistas na técnica sem se afastarem do espírito e escopo da invenção, que por conseguinte fica limitada apenas pelo escopo das reivindicações anexas. Referências 1 Kovylyaeva, G.I., Bakaleinik, G.A., Strobykina, I.Y., Gubskaya, V.I., Sharipova, R.R., Alfonsov, V.A., Kataev, V.E., and Tolstikov, A.G. 2007. Glycosides from Stevia rebaudiana. Chemistry of Natural Compounds. V,43, No,1, 81-85. 2 Kohda, H., Kasai, R., Yamazaki, K., Murakami, K., and Tanaka, O. 1976. New sweet diterpene glucosides from Stevia rebaudiana. Phytochemistry. V,15, 981-983. 3 Starratt, A.N., Kirbi, C.W., Pocs, R., and Brandle J.E. 2002. Rebaudioside F, a diterpene glycoside from Stevia rebaudiana. Phytochemistry. V,59, 367-370. 4 Kobayashi, M., Horikawa, S., Dergandi, I.H., Ueno, J., and Mitsuhashi, H. 1977. Dulcoside A and B, New diterpene glycosides from Stevia rebaudiana. Phytochemistry. V/16. 1405-1408. 5 Shi, R., Xu, M., Shi, Z., Fan, Y., Guo, X., Liu, Y., Wang, C., and He, B. 2002. Synthesis of bifunctional polymeric adsorbent and its application in purification of Stevia glycosides. Reactive & Functional Polymers. V,50. 107-116 6 Chen, T., Zhang, Y., Liu, X., Shi, Z., Sun, J. and He, B. 1998. Science in China. V,41. N4. 436 - 441. 7 Chen, T., Zhang, Y., Liu, X., Shi, Z., Sun, J. and He, B. 1999. Science in China. V,42. N3. 277 282. 8 Fuh, W-S., Chiang, B-H. 1990. Purification of steviosides by membrane and ion exchange process. Journal of Food Science. V,55. N5. 1454-1457. 9 Zhang, S.Q., Kumar, A., Kutowy, O. 2000. Membrane-based separation scheme for processing sweetener from Stevia leaves. Food Research International. V,33. 617-620. 10 Liu, Y., Yiming, C., Lining, W., and J. Jianhua. 1991. Study of stevioside preparation by membrane separation process. Desalination. V,83. 375-382. 11 Chen, T., Zhang, Y., Liu, X., and He, B. 1999. Studies on the adsorptive selectivity of the polar resin with carbonyl group on rebaudioside A. Acta Polymeric Scnica. N4. 398-403. 12 Moraes, E., Machado., N.R. 2001. Clarification of Stevia rebaudiana (Bert.) Bertoni extract by adsorption in modified zeolites. Acta Scientiarum. V,23. N6. 1375-1380. 13 Montovaneli, I.C.C., Ferretti, E.C., Simxes, M.R., and C. Silva. 2004. The effect of temperature and flow rate on the clarification of the aqueous Stevia-extract in fixed-bed column with zeolites. Brazilian Journal of Chemical Engineering. V,21. N3. 449-458. 14 Pol, J., Ostra, E.V., Karasek, P., Roth, M., Benesova, K., Kotlarikova, P., and J.Caslavsky. 2007. V,388. 1847-1857. 15 Bandna, V.J., Singh, B., and V.K.Kaul. 2009. An efficient microwave-assisted extraction process of stevioside and rebaudioside A from Stevia rebaudiana (Bertoni). Phytochemical Analysis. V,20. 240-245. 16 Teo, C.C., Tan, S.N., Yong, J.W.H., Hew, C.S., and E.S.Ong. 2009. Validation of green-solvent extraction combined with chromatographic chemical fingerprint to evaluate quality of Stevia rebaudiana Bertoni. J.Sep.Sci. V,32. 613-622. 17 Yoda, S.K., Marques, M.O.M., Ademir J. Petenate, A.J., and M. A. Meireles. 2003. Supercritical fluid extraction from Stevia rebaudiana Bertoni using CO2 and CO2+ water: extraction kinetics and identification of extracted components. Journal of Food Engineering. V, 57. 125-134.

Claims (1)

1. Método de obtenção de rebaudiosídeo D purificado caracterizado pelas etapas de: fornecer um extrato da planta Stevia rebaudiana Bertoni; dissolver o extrato em uma primeira solução aquosa de solvente orgânico para resultar em uma primeira mistura de glicosídeos de esteviol; induzir a cristalização na primeira mistura; filtrar a primeira mistura para obter um primeiro precipitado e um primeiro filtrado; dissolver o primeiro precipitado em uma segunda solução aquosa de solvente orgânico para resultar em uma segunda mistura; induzir a cristalização na segunda mistura; filtrar a segunda mistura para obter um segundo precipitado e um segundo filtrado; dissolver o segundo precipitado em uma terceira solução aquosa de solvente orgânico para resultar em uma terceira mistura; induzir a cristalização na terceira mistura; e filtrar a terceira mistura para obter um terceiro precipitado e um terceiro filtrado; secagem do terceiro precipitado fornecendo o Rebaudiosídeo D purificado; onde: a primeira solução aquosa de solvente orgânico é uma solução de etanol-água com 75-99% de etanol; a segunda solução aquosa de solvente orgânico é uma solução de etanol-água com 70-80% de etanol; a terceira solução aquosa de solvente orgânico é uma solução de etanol-água com 10-80% de etanol; a etapa de induzir a cristalização na primeira mistura compreende adicionar Rebaudiosídeo A para promover a cristalização; o primeiro filtrado é concentrado formando uma mistura de glicosídeo de esteviol; ao segundo filtrado é adicionado Rebaudiosídeo Apara promover a cristalização de Rebaudiosídeo A; e assim o Rebaudiosídeo A cristalizado é recuperado para dar o Rebaudiosídeo A com uma pureza de 97-99% em peso em termos secos; e ainda as etapas de: dissolver o terceiro precipitado em uma quarta solução aquosa de solvente orgânico, em que a solução aquosa contém etanol a 50%, para resultar em uma quarta mistura; induzir a cristalização na quarta mistura; filtrar a quarta mistura para obter um quarto precipitado; e secagem do quarto precipitado proporcionando o Rebaudiosídeo D com uma pureza superior a 95%.