BRPI0916668B1

BRPI0916668B1 - Anticorpo monoclonal isolado, composição farmacêutica, ácido nucleico isolado e vetor

Info

Publication number: BRPI0916668B1
Application number: BRPI0916668-8A
Authority: BR
Inventors: Beate Diefenbach-Streiber; Adina Eberth; Braydon Charles Guild; Yong-In Kim; Michael Roguska; Igor Splawski
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2008-08-05
Filing date: 2009-08-03
Publication date: 2021-12-28
Also published as: US8241628B2; KR101463296B1; SI2328616T1; CN102170906A; KR20110038173A; RS54113B1; MY159396A; US20130064836A1; PE20110225A1; CN104177495B; EP2815766B1; WO2010015608A1; JO3118B1; HRP20150799T1; EP2837388A1; NZ600622A; SV2011003834A; US20100034809A1; HUE026179T2; AU2009279197B2

Abstract

inibidor de dpp-4 e seu uso em cicatrização de ferida, composição farmacêutica, comprimido para uso oral, e preparação tópica. a presente invenção refere-se a descoberta que certos inibidores de dpp-4 são particularmente adequados para cura de ferida preferivelmente em pacientes diabéticos.

Description

1. INTRODUÇÃO

[001] A presente invenção relaciona-se a anticorpos direcionadosà proteína do complemento C5 e composições e métodos de uso dos mesmos.

2. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O papel normal do complemento, que é parte do sistemaimune inato, está na defesa do hospedeiro. O complemento defende contra infecção bacteriana, conecta imunidade adaptativa e inata e descarta complexos imunes e produtos de injúria inflamatória.

[003] As funções defensivas são realizadas por produtos biologicamente ativos gerados no curso da ativação do complemento, que opsonizam agentes infecciosos, promovem inflamação ou lise de alvos suscetíveis (Marzari et al., Eur J Immunol 32:2773-2782 (2002)). O sistema de complemento consiste em aproximadamente 25 a 30 proteínas plasmáticas que desempenham um papel no sistema imune. A cascata de complemento é ativada por pelo menos três vias principais. A via clássica é tipicamente ativada pelos complexos imunes, a via alternativa pode ser ativada por superfícies celulares desprotegidas e a via lectina de ligação à manose (MBL) é iniciada pela ligação de MBL a carboidratos da superfície celular (Trendelenburg, Swiss Med Wkly 137:413-417 (2007)).

[004] Todas as três vias levam à clivagem de C5 pela C5 conver-tase. O resultado desta clivagem é a liberação do fragmento C5a, uma potente molécula inflamatória, e C5b que inicia o complexo de ataque à membrana (MAC). Os produtos do complemento, uma vez liberados, não diferenciam entre alvos estranhos e próprios e, se não estreitamente regulados, muitas vezes causam grande dano a células e teci- dos inespecíficos em condições clínicas associadas à ativação de complemento irrestrita (Marzari et al., 2002).

[005] C5 é expressa intracelularmente como um peptídeo pró-C5único de 1676 aminoácidos que consistem de uma sequência sinal de 18 resíduos e uma sequência ligadora rica em Arg (RPRR) situada entre a cadeia β N-terminal madura e a cadeia α C-terminal. A C5 madura tem um peso molecular de aproximadamente 190 kDa, e consiste em duas cadeias polipeptídicas (α, 115 kDa e β, 75 kDa) que são ligadas por ligações dissulfeto. A C5 convertase cliva C5 entre os resíduos 74 e 75 da cadeia alfa para liberar o peptídeo de C5a de 74 aminoáci- dos e o fragmento C5b que é posteriormente incorporado no complexo de ataque à membrana (MAC).

[006] Degeneração macular é uma condição médica predominantemente encontrada em pessoas idosas nas quais o centro do revestimento interior do olho, conhecido como área de mácula da retina, sofre estreitamento, atrofia e em alguns casos, hemorragia. Isto pode resultar na perda da visão central, que implica na incapacidade de vide detalhes perfeitos, ler ou reconhecer faces. A patogênese de neofor- mação de vaso coroidal é limitadamente entendida, mas fatores tais como inflamação, isquemia e produção local de fatores angiogênicos são considerados importantes.

[007] Apesar das opções de tratamento atuais para o tratamentode doenças e desordens associadas aos componentes das vias clássica ou alternativa, particularmente AMD, há uma necessidade de se encontrar alvos específicos que levem a tratamentos que sejam eficazes e bem tolerados.

3. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[008] A presente invenção fornece moléculas de ligação à C5 docomplemento isoladas (por exemplo, anticorpos de ligação à C5 ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos), composições farma- cêuticas compreendendo tais moléculas, métodos de produção de tais moléculas e composições, e métodos de uso dos mesmos.

[009] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece anticorpos isolados ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que especificamente se ligam a uma proteína C5, em que o dito anticorpo tem uma constante de afinidade (KA) de pelo menos 1 x 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1, 1010 M-1 ou 1011 M-1.

[010] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece anticorpos isolados ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que especificamente se ligam a uma proteína C5, e inibem a via completa alternativa como medido pelo ensaio hemolítico in vitro com uma faixa de IC50 de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 200 pM.

[011] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece anticorpos isolados ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que especificamente se ligam a uma proteína C5, e competem cruzadamente com um anticorpo descrito na Tabela 1 abaixo. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece anticorpos isolados ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que se ligam ao mesmo epítopo da proteína C5 que um anticorpo descrito na Tabela 1 abaixo.

[012] Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção sãoanticorpos monoclonais isolados que especificamente se ligam a uma proteína C5. Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção são anticorpos monoclonais isolados humanos ou humanizados que especificamente se ligam a uma proteína C5. Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção são anticorpos quiméricos isolados que especificamente se ligam a uma proteína C5. Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção compreendem uma região constante da cadeia longa humana e uma região constante da cadeia curta humana.

[013] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece anticorpos isolados ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que especificamente se ligam a uma proteína C5, em que os ditos anticorpos são anticorpos de cadeia única. Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção são fragmentos Fab. Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção são scFv.

[014] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece anticorpos isolados ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que especificamente se ligam tanto a C5 humana como a C5 de cino- molgus. Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção são um isotipo IgG.

[015] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece anticorpos isolados ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos compreendendo uma região conservada na qual os aminoácidos foram substituídos na região conservada de anticorpo das respectivas sequências de linhagem germinativa de VH ou VL humana.

[016] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece anticorpos monoclonais isolados ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que especificamente se ligam a uma proteína C5, em que os ditos anticorpos compreendem pelo menos uma sequência de determinação de complementaridade (CDR) tendo identidade de sequência de pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou de pelo menos 99% à SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 33, 34, 35, 36, 37,38, 49, 50, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 77, 78, 89, 95, 101, 107, 113, 119,120, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 159,160, 161, 162, 163, 164, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 195, 196, 197,198, 199, 200, 209, 226, 235, 236, 237, 238, 239 ou 240.

[017] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece anticorpos monoclonais isolados ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que especificamente se ligam a uma proteína C5, em que os ditos anticorpos compreendem pelo menos uma sequência de CDR de cadeia longa que é idêntica à SEQ ID NO: 1, 2, 3, 17, 18, 19, 33, 34, 35, 49, 61, 62, 63, 77, 77, 95, 107, 113, 119, 132, 131, 133, 145, 146, 147, 159, 160, 161, 173, 174, 175, 195, 196, 197, 226, 235, 236 ou 237.

[018] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece anticorpos monoclonais isolados ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que especificamente se ligam a uma proteína C5, em que os ditos anticorpos compreendem pelo menos uma sequência de CDR de cadeia curta que é idêntica à SEQ ID NO: 4, 5, 6, 20, 21, 22, 36, 37, 38, 50, 64, 65, 66, 78, 89, 101, 120, 134, 135, 136, 148, 149, 150, 162, 163, 164, 176, 177, 178, 198, 199, 200, 209, 238, 239 ou 240.

[019] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece anticorpos monoclonais isolados ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que especificamente se ligam a uma proteína C5, em que os ditos anticorpos compreendem uma CDR 1 de cadeia longa selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 1, 17, 33, 61, 131, 145, 159, 173, 195 e 235; uma cadeia longa CDR2 selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 49, 62, 77, 95, 107, 113, 119, 132, 146, 160, 174, 196, 226 e 236; e uma cadeia longa CDR3 selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 3, 19, 35, 63, 133, 147, 161, 175, 197 e 237. Em algumas modalidades, tais anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos compreendem ainda uma cadeia curta CDR1 selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 4, 20, 36, 64, 134, 148, 162, 176, 198 e 238; uma cadeia curta CDR2 selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 5, 21, 37, 65, 135, 149, 163, 177, 199 e 239; e uma cadeia curta CDR3 selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 6, 22, 38, 50, 66, 78, 89, 101, 120, 136, 150, 164, 178, 200, 209 e 240.

[020] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece anticorpos monoclonais isolados ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que especificamente se ligam a uma proteína C5, em que os ditos anticorpos compreendem uma CDR1 de cadeia curta selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 4, 20, 36, 64, 134, 148, 162, 176, 198 e 238; uma cadeia curta CDR2 selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 5, 21, 37, 65, 135, 149, 163, 177, 199 e 239; e uma cadeia curta CDR3 selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 6, 22, 38, 50, 66, 78, 89, 101, 120, 136, 150, 164, 178, 200, 209 e 240.

[021] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece anticorpos monoclonais isolados ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que especificamente se ligam a uma proteína C5, em que os ditos anticorpos compreendem uma região variável de cadeia longa tendo identidade de sequência de pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou de pelo menos 99% à SEQ ID NO: 7, 23, 39, 51, 67, 79, 96, 108, 114, 121, 137, 151, 165, 179, 187, 201, 210, 218, 227, 241, 253, 257, 273, 277 ou 281. Em algumas modalidades, tais anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos compreendem ainda uma região variável de cadeia curta tendo identidade de sequência de pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou de pelo menos 99% à SEQ ID NO: 8, 24, 40, 52, 68, 80, 90, 102, 122, 138, 152, 166, 180, 188, 202, 211, 219, 228, 242, 261, 265, 269, 285 e 289.

[022] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece anticorpos monoclonais isolados ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que especificamente se ligam a uma proteína C5, em que os ditos anticorpos compreendem uma região variável de cadeia curta tendo identidade de sequência de pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou de pelo menos 99% à SEQ ID NO: 8, 24, 40, 52, 68, 80, 90, 102, 122, 138, 152, 166, 180, 188, 202, 211, 219, 228, 242, 261, 265, 269, 285 e 289.

[023] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece an- ticorpos monoclonais isolados ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que especificamente se ligam a uma proteína C5, em que os ditos anticorpos compreendem uma cadeia longa tendo identidade de sequência de pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou de pelo menos 99% à SEQ ID NO: 9, 25, 41, 53, 69, 81, 97, 109, 115, 123, 139, 153, 167, 181, 189, 203, 212, 220, 229, 243, 249, 254, 258, 274, 278 ou 282. Em algumas modalidades, tais anticorpos compreendem ainda uma cadeia curta tendo identidade de sequência de pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou de pelo menos 99% à SEQ ID NO: 10, 26, 42, 54, 70, 82, 91, 103, 124, 140, 154, 168, 182, 190, 204, 213, 221, 230, 244, 251, 262, 266, 270, 286 ou 290.

[024] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece anticorpos monoclonais isolados ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que especificamente se ligam a uma proteína C5, em que os ditos anticorpos compreendem uma cadeia curta tendo identidade de sequência de pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou de pelo menos 99% à SEQ ID NO: 10, 26, 42, 54, 70, 82, 91, 103, 124, 140, 154, 168, 182, 190, 204, 213, 221, 230, 244, 251, 262, 266, 270, 286 ou 290.

[025] A presente invenção também compreende composiçõesfarmacêuticas que compreendem uma ou mais moléculas de ligação à C5 da invenção (por exemplo, anticorpos de ligação à C5 ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos) e veículo farmaceuticamente aceitável.

[026] Em algumas modalidades, a presente invenção forneceácidos nucleicos que compreendem uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo que compreende uma região variável de cadeia longa tendo identidade de sequência de pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou de pelo menos 99% à SEQ ID NO: 7, 23, 39, 51, 67, 79, 96, 108, 114, 121, 137, 151, 165, 179, 187, 201, 210, 218, 227, 241, 253, 257, 273, 277 ou 281.

[027] Em algumas modalidades, a presente invenção forneceácidos nucleicos compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo compreendendo uma região variável de cadeia curta tendo identidade de sequência de pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou de pelo menos 99% à SEQ ID NO: 8, 24, 40, 52, 68, 80, 90, 102, 122, 138, 152, 166, 180, 188, 202, 211, 219, 228, 242, 261, 265, 269, 285 e 289.

[028] A presente invenção também fornece vetores e célulashospedeiras que compreendem tais ácidos nucleicos. Em uma modalidade, a presente invenção fornece células hospedeiras isoladas que compreendem (1) um segmento de DNA recombinante que codifica uma cadeia longa dos anticorpos da invenção, e (2) um segundo segmento de DNA recombinante que codifica uma cadeia curta dos anticorpos da invenção; em que os ditos segmentos de DNA são respectivamente operacionalmente ligados a um primeiro e um segundo promotor, e são capazes de serem expressos na dita célula hospedeira. Em outra modalidade, a presente invenção fornece células hospedeiras isoladas que compreendem um segmento de DNA recombinante que codifica uma cadeia longa, e uma cadeia curta dos anticorpos da invenção, respectivamente, em que o dito segmento de DNA é opera-cionalmente ligado a um promotor, e é capaz de ser expresso nas ditas células hospedeiras. Em algumas modalidades, as células hospedeiras são linhagem celular mamífera não humana. Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos são um anticorpo monoclonal humano, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo.

[029] A presente invenção fornece ainda tratamento de métodosdiagnósticos usando as moléculas de ligação à C5 (por exemplo, anticorpos de ligação à C5 ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos) da invenção. Em uma modalidade, a presente invenção for- nece métodos de tratamento de degeneração macular relacionada à idade compreendendo administração a um indivíduo em necessidade dos mesmos de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo da invenção.

[030] Em outra modalidade, a presente invenção fornece métodos de tratamento de uma doença compreendendo administração a um indivíduo em necessidade dos mesmos de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo da invenção, em que a dita doença é asma, artrite, doença cardíaca autoimune, esclerose múltipla, doença inflamatória intestinal, injúrias de reperfusão isquêmica, Síndrome de Barraquer-Simons, hemodiálise, lúpus sistêmico, lúpus eritematoso, psoríase, esclerose múltipla, transplante, doença de Alzheimer, glome- rulonefrite ou MPGN II.

[031] A presente invenção também fornece métodos de tratamento de hemoglobinúria paroxística noturna (PNH) compreendendo administração a um indivíduo em necessidade dos mesmos de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo da invenção.

[032] A presente invenção fornece ainda métodos de melhora deum sintoma associados à circulação extracorpórea compreendendo administração a um indivíduo em necessidade dos mesmos de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo da invenção.

3.1. Definições

[033] A menos que definido de outra maneira, todos os termostécnicos e científicos usados neste pedido têm o mesmo significado que comumente entendido por aqueles versados ordinários na técnica à qual esta invenção pertence.

[034] O termo "anticorpo" como usado neste pedido inclui anticorpos completos e qualquer fragmento de ligação a antígeno (isto é, "porção de ligação a antígeno") ou cadeias únicas dos mesmos. Um "anticorpo" de ocorrência natural é uma glicoproteína compreendendo pelo menos duas cadeias longas (H) e duas cadeias curtas (L) interligadas por ligações dissulfeto. Cada cadeia longa é compreendida de uma região variável de cadeia longa (abreviada neste pedido como VH) e uma região constante de cadeia longa. A região constante de cadeia longa é compreendida de três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia curta é compreendida de uma região variável de cadeia curta (abreviado neste pedido como VL) e uma região constante de cadeia curta. A região constante de cadeia curta é compreendida de um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões de determinação de complementaridade (CDR), entremeadas por regiões que são mais conservadas, denominadas regiões conservadas (FR). Cada VH e VL é composta de três CDRs e quatro FRs arranjadas do amino-terminal ao carbóxi-terminal na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis da cadeia longa e leve contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina a tecidos ou fatores hospedeiros, incluindo várias células do sistema imune (por exemplo, células efetoras) e ao primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico.

[035] O termo "porção de ligação a antígeno" de um anticorpo,como usado neste pedido, refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo intacto que conservam a capacidade de se ligar especificamente a um dado antígeno (por exemplo, C5). Funções de ligação a antígeno de um anticorpo podem ser realizadas por fragmentos de um anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de ligação englobados den- tro do termo "porção de ligação a antígeno" de um anticorpo incluem um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo em domínios VL, VH, CL e CH1; um fragmento F(ab)2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de dobradiça; um fragmento Fd consistindo em domínios VH e CH1; um fragmento Fv consistindo de domínios VL e VH de um braço único de um anticorpo; um fragmento de anticorpo de domínio único (dAb) (Ala et al., 1989 Nature 341:544-546), que consiste em um domínio VH; e uma região de determinação de complementaridade isolada (CDR).

[036] Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VLe VH, sejam codificados por genes separados, podem ser unidos, usando métodos recombinantes, por um ligador peptídico artificial que os permita ser produzidos como uma cadeia proteica única em que as regiões VL e VH se pareiam para formar moléculas monovalentes (conhecido como Fv de cadeia única (scFv); vide, por exemplo, Bird et al., 1988 Science 242:423-426; e Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883). Tais anticorpos de cadeia única incluem uma ou mais "porções de ligação a antígeno" de um anticorpo. Estes fragmentos de anticorpo são obtidos usando técnicas convencionais conhecidas por aqueles versados na técnica, e os fragmentos são rastreados para utilidade da mesma maneira que são os anticorpos intactos.

[037] Porções de ligação a antígeno também podem ser incorporadas em anticorpos de domínio único, maxicorpos, minicorpos, intra- corpos, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, v-NAR e bis-scFv (vide, por exemplo, Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136). Porções de ligação a antígeno de anticorpos podem ser enxertadas em proteínas estruturais baseadas em polipeptídeos, tais como Fibronectina tipo III (Fn3) (vide Patente U.S.U.S. n°. 6.703.199, que descreve monocorpos polipeptídicos de fibronectina).

[038] Porções de ligação a antígeno podem ser incorporadas emmoléculas de cadeia única compreendendo um par de segmentos de Fv em tandem (VH-CH1-VH-CH1) que, em conjunto com polipeptídeos de cadeia curta complementares, formam um par de regiões de ligação a antígeno (Zapata et al., 1995 Protein Eng. 8 (10):1057-1062; e Patente U.S.U.S. n°. 5.641.870).

[039] Como usado neste pedido, o termo "afinidade" refere-se àforça de interação entre anticorpo e antígeno em sítios antigênicos únicos. Dentro de cada sítio antigênico, a região variável do anticorpo "braço" interage por forças não covalentes fracas no antígeno em numerosos sítios; quanto mais interações, mais forte a afinidade.

[040] Como usado neste pedido, o termo "avidez" refere-se auma medida informativa da estabilidade global ou à força do complexo anticorpo-antígeno. É controlado por três fatores principais: afinidade do epítopo pelo anticorpo; a valência tanto do antígeno como do anticorpo; e o arranjo estrutural das partes que interagem. Enfim estes fatores definem a especificidade do anticorpo, isto é, a probabilidade que o anticorpo particular esteja ligado a um epítopo exato do antígeno.

[041] O termo "aminoácido" refere-se a aminoácidos naturais esintéticos, bem como análogos de aminoácido e miméticos de aminoá- cido que funcionam de uma maneira similar aos aminoácidos naturais. Os aminoácidos naturais são aqueles codificados pelo código genético, bem como aqueles aminoácidos que são após modificados, por exemplo, hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato e O-fosfosserina. Análogos de aminoácido referem-se a compostos que têm a mesma estrutura química básica que um aminoácido natural, isto é, um carbono alfa que está ligado a um hidrogênio, um grupo carboxila, um grupo amino e um grupo R, por exemplo, homosserina, norleucina, sulfóxido de me- tionina, metilsulfônio de metionina. Tais análogos tiveram os grupos R modificados (por exemplo, norleucine) ou tiveram as cadeias principais peptídicas modificadas, mas conservam a mesma estrutura química básica que um aminoácido natural. Miméticos de aminoácido referem- se a compostos químicos que têm uma estrutura que é diferente da estrutura química geral de um aminoácido, mas este funciona de uma maneira similar a um aminoácido natural.

[042] O termo "especificidade de ligação" como usado neste pedido refere-se à capacidade de um sítio de combinação de anticorpo individual de reagir com somente um determinante antigênico. O sítio de combinação do anticorpo é localizado na porção Fab da molécula e é construído das regiões hipervariáveis das cadeias longas e curtas. Afinidade de ligação de um anticorpo é a força de reação entre um determinante antigênico único e um sítio de combinação único no anticorpo. É a soma das forças atrativas e repulsivas que agem entre o determinante antigênico e o sítio de combinação do anticorpo.

[043] A ligação específica entre duas entidades significa uma ligação com uma constante de equilíbrio (KA) de pelo menos 1 x 107 M1, 108 M-1, 109 M-1, 1010 M-1 ou 1011 M-1. A frase "especificamente (ou seletivamente) se liga" a um anticorpo (por exemplo, um anticorpo de ligação à C5) refere-se a uma reação de ligação que é determinativa da presença de um antígeno cognato (por exemplo, uma C5 humana ou C5 de cinomolgus) em uma população heterogênea de proteínas e outros produtos biológicos. Além da constante de equilíbrio (KA) observada acima, um anticorpo de ligação à C5 da invenção tipicamente também tem uma taxa de constante de dissociação (Kd) de aproximadamente 1 x 10-2 s-1, 1 x 10-3 s-1, 1 x 10-4 s-1, 1 x 10-4 s-1, ou mais baixa, e liga-se à C5 com uma afinidade que é pelo menos duas vezes maior do que sua afinidade de ligação a um antígeno não específico (por exemplo, C3, C4, BSA). As frases "um anticorpo que reconhece um antígeno" e "um anticorpo específico para um antígeno" são usadas intercambiavelmente neste pedido com o termo "um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno".

[044] O termo "anticorpo quimérico" é uma molécula de anticorpoem que (a) região constante, ou porção da mesma, é alterada, substituída ou modificada para que o sítio de ligação a antígeno (região variável) seja ligado a uma região constante de uma classe diferente ou alterada, função e/ou espécie efetora, ou uma molécula inteiramente diferente que confere novas propriedades ao anticorpo quimérico, por exemplo, uma enzima, toxina, hormônio, fator de crescimento, fárma- co, etc.; ou (b) a região variável, ou porção da mesma, seja alterada, substituída ou modificada com uma região variável tendo uma especificidade por antígeno diferente ou alterada. Por exemplo, um anticorpo de camundongo pode ser modificado pela substituição de sua região constante pela a região constante de uma imunoglobulina humana. Devido à substituição por uma região constante humana, o anticorpo quimérico pode conservar sua especificidade no reconhecimento do antígeno embora tenha reduzida antigenicidade em humano em comparação ao anticorpo de camundongo original.

[045] O termo "proteína do complemento C5" ou "C5" são usadosintercambiavelmente, e refere-se à proteína C5 em diferentes espécies. Por exemplo, C5 humana tem a sequência como estabelecida na SEQ ID NO: 296, C5 de cinomolgus tem a sequência como estabelecida na SEQ ID NO: 297 (Macaca fascicularis) (vide Tabela 1). C5 humana pode ser obtida de Quidel (Cat. Number A403). C5 de cinomol- gus pode ser produzida como ilustrado na seção Exemplo abaixo.

[046] O termo "variante conservativamente modificada" aplica-setanto a sequências de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Com relação a sequências particulares de ácidos nucleicos, variantes con- servativamente modificadas referem-se àqueles ácidos nucleicos que codificam sequências de aminoácidos idênticas ou essencialmente idênticas, ou onde o ácido nucleico não codifica uma sequência de aminoácidos, em sequências essencialmente idênticas. Em razão da degeneração do código genético, um grande número de ácidos nuclei- cos funcionalmente idênticos codifica qualquer dada proteína. Por exemplo, os códons GCA, GCC, GCG e GCU todos codificam o ami- noácido alanina. Dessa forma, em cada posição onde uma alanina é especificada por um códon, o códon pode ser alterado para qualquer um dos códons correspondentes descritos sem alterar o polipeptídeo codificado. Tais variações de ácidos nucleicos são "variações silenciosas", que são uma espécie de variações conservativamente modificadas. Cada sequência de ácido nucleico neste pedido que codifica um polipeptídeo também descreve cada variação silenciosa possível do ácido nucleico. Um versado reconhecerá que cada códon em um ácido nucleico (exceto AUG, que é ordinariamente o único códon para meti- onina, e TGG, que é ordinariamente o único códon para triptofano) pode ser modificado para produzir uma molécula funcionalmente idêntica. Consequentemente, cada variação silenciosa de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo é implícita em cada sequência descrita.

[047] Para sequências polipeptídicas, "variantes conservativa-mente modificadas" incluem substituições individuais, deleções ou adições em uma sequência polipeptídica que resultam na substituição de um aminoácido por um aminoácido quimicamente similar. Tabelas de substituição conservativa que fornecem aminoácidos funcionalmente similares são bem conhecidas na técnica. Tais variantes conservati- vamente modificadas estão além de e não excluem variantes polimór- ficas, homólogos interespecíficos e alelos da invenção. Os oito seguintes grupos contêm aminoácidos que são substituições conservativas entre si: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glu- tâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), metionina (M), Valina (V); 6) Fenila- lanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); e 8) Cisteína (C), metionina (M) (vide, por exemplo, Creighton, Proteins (1984)). Em algumas modalidades, o termo "modificações conservati- vas de sequência" é usado para referir-se a modificações de aminoá- cido que não afetam ou alteram significativamente as características de ligação do anticorpo contendo a sequência de aminoácidos.

[048] Os termos "bloqueio cruzado", "cruzadamente bloqueado" e"bloquear cruzadamente" são usados intercambiavelmente neste pedido para referir-se a capacidade de um anticorpo ou outro agente de ligação de interferir na ligação de outros anticorpos ou agentes de ligação à C5 em um ensaio de ligação competitiva padrão.

[049] A capacidade ou extensão até a qual um anticorpo ou outroagente de ligação é capaz de interferir na ligação de outro anticorpo ou molécula de ligação à C5, e por isso se pode ser dito bloqueio cruzado de acordo com a invenção, pode ser determinada usando ensaios de ligação de competição padrão. Um ensaio adequado envolve o uso da tecnologia Biacore (por exemplo, pelo uso do instrumento BIAcore 3000 (Biacore, Uppsala, Suécia)), que pode medir a extensão das interações usando tecnologia de ressonância de plásmons de superfície. Outro ensaio para medir o bloqueio cruzado usa uma abordagem baseada em ELISA.

[050] O termo "epítopo" significa um determinante proteico capazde ligação específica a um anticorpo. Epítopos normalmente consistem de agrupamentos superficiais quimicamente ativos de moléculas, tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e normalmente têm características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específica. Epítopos conformacionais e não conformacionais são distinguidos a medida que a ligação ao anterior mas não ao último é perdida na presença de solventes desnaturantes.

[051] Como usado neste pedido, o termo "alta afinidade" para umanticorpo IgG refere-se a um anticorpo que tem um KD de 10-8 M ou menos, 10-9 M ou menos, ou 10-10 M, ou 10-11 M ou menos por um an- tígeno alvo. Entretanto, ligação de "alta afinidade" pode variar para outros isotipos de anticorpo. Por exemplo, ligação de "alta afinidade" para um isotipo IgM refere-se a um anticorpo que tem um KD de 10-7 M ou menos ou 10-8 M ou menos.

[052] O termo "anticorpo humano", como usado neste pedido, édestinado a incluir anticorpos tendo regiões variáveis nas quais tanto a região conservada como as regiões CDR são derivadas de sequências de origem humana. Além disso, se o anticorpo contém uma região constante, a região constante também é derivada de tais sequências humanas, por exemplo, sequências de linhagem germinativa humana, ou versões mutadas de sequências de linhagem germinativa humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de amino- ácidos não codificados por sequências humanas (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese randômica ou sítio-específica in vitro ou por mutação somática in vivo).

[053] O termo "anticorpo monoclonal humano" refere-se a anticorpos que exibem uma especificidade de ligação única tendo regiões variáveis nas quais tanto a região conservada como as regiões CDR são derivadas de sequências humanas. Em uma modalidade, os anticorpos monoclonais humanos são produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal não humano transgênico, por exemplo, um camundongo transgênico, tendo um genoma compreendendo um transgene de cadeia longa e um transgene de cadeia curta humana fusionados a uma célula imortalizada.

[054] Um anticorpo "humanizado" é um anticorpo que conserva areatividade de um anticorpo não humano sendo menos imunogênico em humanos. Isto pode ser alcançado, por exemplo, pela retenção das regiões CDR não humanas e substituição das partes restantes do anticorpo por suas contrapartes humanas (isto é, a região constante bem como as porções de região conservada da região variável). Vide, por exemplo, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984; Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1988; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun., 28:489498, 1991; e Padlan, Molec. Immun., 31:169-217, 1994. Outros exemplos de tecnologia de engenharia humana incluem, mas não são limitados à tecnologia Xoma revelada em US 5.766.886.

[055] Os termos "idêntico" ou "identidade" percentual, no contexto de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos ou polipeptídicas, referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são as mesmas. Duas sequências são "substancialmente idênticas" se duas sequências tiverem uma porcentagem especificada de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos que é a mesma (isto é, identidade de 60%, opcionalmente identidade de 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% sobre uma região especificada, ou, quando não especificada, sobre a sequência inteira), quando comparadas e alinhadas à correspondência máxima sobre uma janela de comparação, ou região designada como medida usando um dos seguintes algoritmos de com-paração de sequência ou por alinhamento manual e inspeção visual. Opcionalmente, a identidade existe sobre uma região que tem pelo menos aproximadamente 50 nucleotídeos (ou 10 aminoácidos) de comprimento, ou mais preferencialmente sobre uma região que tem 100 a 500 ou 1000 ou mais nucleotídeos (ou 20, 50, 200 ou mais ami- noácidos) de comprimento.

[056] Para comparação de sequência, tipicamente uma sequência atua como uma sequência de referência, com a qual as sequências teste são comparadas. Usando um algoritmo de comparação de sequência, sequências teste e de referência são introduzidas em um computador, coordenadas de subsequência são designadas, se necessário, e parâmetros do programa de algoritmo de sequência são designados. Parâmetros de programa pré-configurados podem ser usados, ou parâmetros alternativos podem ser designados. O algoritmo de comparação de sequência então calcula a identidade de sequência percentual das sequências teste em relação à sequência de referência, baseada nos parâmetros do programa.

[057] Uma "janela de comparação", como usada neste pedido,inclui referência a um segmento de qualquer um dos números de posições contíguas selecionadas a partir do grupo consistindo de 20 a 600, normalmente e aproximadamente 50 a aproximadamente 200, mais normalmente e aproximadamente 100 a aproximadamente 150 em que uma sequência pode ser comparada a uma sequência de referência do mesmo número de posições contíguas após as duas sequências serem otimamente alinhadas. Métodos para o alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. Alinhamento ótimo de sequências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970, pela pesquisa de método de similaridade de Pearson e Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988, por implementações computadorizadas destesalgoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science doutor. Madison, Wisconsin), ou por alinhamento manual e inspeção visual (vide, por exemplo, Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc (ringbou ed., 2003)).

[058] Dois exemplos de algoritmos que são adequados para determinar a identidade percentual de sequência e a similaridade de sequência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977; e Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990, respectivamente. O programa para reali- zação de análises por BLAST é publicamente disponível por National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo envolve primeiro a identificação de pares de sequência de alto escore (HSPs) pela identificação das palavras curtas de comprimento W na sequência de questionamento, que combinem ou satisfaçam algum escore limiar T de valor positivo quando alinhadas a uma palavra de mesmo comprimento em uma sequência do banco de dados. T é referido como o limiar de escore de palavra de vizinhança (Altschul et al., supra). Estes acertos de palavra de vizinhança inicial atuam como sementes para iniciar buscas para encontrar HSPs mais longos que os contém. Os acertos de palavra são expandidos em ambas as direções ao longo de cada sequência para que o escore de alinhamento cumulativo possa ser aumentado. O escore cumulativo é calculado usando, para sequências nucleotídicas, os parâmetros M (escore de recompensa de um par de resíduos compatíveis; sempre > 0) e N (escore de penalidade para resíduos incompatíveis; sempre < 0). Para sequências de aminoácidos, uma matriz de escore é usada para calcular o escore cumulativo. A extensão dos acertos de palavra em cada direção é parada quando: o escore de alinhamento cumulativo declina pela quantidade X de seu valor alcançado máximo; o escore cumulativo vai a zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduo de escore negativo; ou a extremidade de qualquer sequência é alcançada. Os parâmetros de algoritmo BLAST W, T e X determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências nucleotídicas) usa como pré-configuração um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) ou 10, M=5, N =-4 e uma comparação de ambas as fitas. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como pré-configuração um comprimento de palavra de 3, e expectativa (E) de 10, e a matriz de escore BLOSUM62 (vide Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989) os alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N = -4, e uma comparação de ambas as fitas.

[059] O algoritmo BLAST também realiza uma análise estatísticade similaridade entre duas sequências (vide, por exemplo, Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993). Uma medida de similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a probabilidade de soma menor (P (N)), que fornece uma indicação da probabilidade pela qual uma combinação entre duas sequências nucleotídicas ou de aminoácidos ocorreria por acaso. Por exemplo, um ácido nucleico é considerado similar a uma sequência de referência se a probabilidade de soma menor em uma comparação do teste de ácido nucleico à referência de ácido nucleico for menor que aproximadamente 0,2, mais preferencialmente menor que aproximadamente 0,01, e ainda mais preferencialmente menos de aproximadamente 0,001.

[060] A identidade percentual entre duas sequências de aminoá-cidos também pode ser determinada usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988) que foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), usando uma tabela de resíduo de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de lacuna de 12 e uma penalidade de lacuna de 4. Além disso, a identidade percentual entre duas sequências de aminoácidos pode ser determinada usando o algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970) que foi incorporado no programa GAP no pacote de programa GCG (disponível em www.gcg.com), usando uma matriz Blosum 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de lacuna de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6.

[061] Além da porcentagem de identidade de sequência observada acima, outra indicação que duas sequências de ácidos nucleicos ou polipeptídicas são substancialmente idênticas consiste em que o poli- peptídeo codificado pelo primeiro ácido nucleico é imunologicamente interreativo com os anticorpos originados contra o polipeptídeo codificado pelo segundo ácido nucleico, como descrito abaixo. Dessa forma, um polipeptídeo é tipicamente substancialmente idêntico a um segundo polipeptídeo, por exemplo, onde os dois peptídeos se diferenciam somente por substituições conservativas. Outra indicação que duas sequências de ácidos nucleicos são substancialmente idênticas consiste em que as duas moléculas ou seus complementos hibridizam entre si sob condições estringentes, como descrito abaixo. Ainda outra indicação que duas sequências de ácidos nucleicos são substancialmente idênticas consiste em que os mesmos iniciadores podem ser usados para amplificar a sequência.

[062] O termo "anticorpo isolado" refere-se a um anticorpo que ésubstancialmente livre de outros anticorpos que têm especificidades antigênicas diferentes (por exemplo, um anticorpo isolado que especi-ficamente se liga à C5 é substancialmente livre de anticorpos que es-pecificamente se ligam a antígenos além de C5). Um anticorpo isolado que especificamente se liga à C5 pode, entretanto, ter interreatividade a outros antígenos. Além disso, um anticorpo isolado pode estar substancialmente livre de outro material celular e/ou produtos químicos.

[063] O termo "isotipo" refere-se à classe de anticorpo (porexemplo, IgM, IgE, IgG, tal como IgG1 ou IgG4) que é fornecida por genes de região constante da cadeia longa. O isotipo também inclui versões modificadas de uma destas classes, onde modificações tenham sido feitas para alterar a função de Fc, por exemplo, para aumentar ou reduzir funções efetoras ou de ligação a receptores Fc.

[064] O termo "Kassoc" ou "Ka", como usado neste pedido, édestinado a referir-se à taxa de associação de uma interação particular anticorpo-antígeno, ao passo que o termo "Kdis" ou "Kd", como usado neste pedido, é destinado a referir-se à taxa de dissociação de uma interação particular anticorpo-antígeno. O termo "KD", como usado neste pedido, é destinado a referir-se à constante de dissociação, que é obtida da razão de Kd para Ka (isto é, Kd/Ka) e é expressa como uma concentração molar (M). Os valores de KD de anticorpos podem ser determinados usando métodos bem estabelecidos na técnica. Um método para determinar o KD de um anticorpo é usando ressonância de plásmons de superfície, ou usando um sistema biosensor, tal como um sistema Biacore®.

[065] Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal" como usados neste pedido referem-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular única. Uma composição de anticorpo monoclonal exibe uma especificidade de ligação e afinidade únicas por um epítopo particular.

[066] O termo "ácido nucleico" é usado neste pedido intercambi-avelmente com o termo "polinucleotídeo" e refere-se a desoxirribonu- cleotídeos ou ribonucleotídeos e polímeros dos mesmo em forma de fita única ou dupla. O termo engloba ácidos nucleicos contendo análogos nucleotídicos conhecidos ou resíduos de cadeia principal ou ligações modificadas, que são sintéticos, de ocorrência natural, e ocorrência não natural, que têm propriedades de ligação similares ao ácido nucleico de referência, e que são metabolizados de uma maneira similar aos nucleotídeos de referência. Exemplos de tais análogos incluem, sem limitação, fosforotioatos, fosforamidatos, metilfosfonatos, metilfos- fonatos quirais, 2-O-metil ribonucleotídeos, ácidos peptídeo-nucleicos (PNAs).

[067] A menos que de outra maneira indicado, uma sequênciaparticular de ácido nucleico também engloba implicitamente variantes conservativamente modificadas da mesma (por exemplo, substituições de códon degeneradas) e sequências complementares, bem como a sequência explicitamente indicada. Especificamente, como detalhado abaixo, as substituições de códon degeneradas podem ser alcançadas gerando sequências nas quais a terceira posição de um ou mais có- dons selecionados (ou todos) é substituída por resíduos de base variada e/ou desoxinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985; e Rossolini et al., Mol. Cell Probes 8:91-98, 1994).

[068] O termo "operacionalmente ligado" refere-se a uma relaçãofuncional entre dois ou mais segmentos polinucleotídicos (por exemplo, DNA). Tipicamente, refere-se à relação funcional de uma sequência de regulação transcricional para uma sequência transcrita. Por exemplo, uma sequência promotora ou potencializadora é operacionalmente ligada a uma sequência de codificação se estimular ou modular a transcrição da sequência de codificação em uma célula hospedeira ou outro sistema de expressão apropriado. Geralmente, sequências de regulação transcricional promotoras que são operacionalmente ligadas a uma sequência transcrita são fisicamente contíguas com a sequência transcrita, isto é, são cis atuantes. Entretanto, algumas sequências de regulação transcricional, tais como potencializadoras, não têm que ser fisicamente contíguas ou localizadas em proximidade das sequências de codificação cuja transcrição aumenta.

[069] Como usado neste pedido, o termo "otimizado" significaque uma sequência nucleotídica foi alterada para codificar uma sequência de aminoácidos usando códons que são preferenciais na célula ou organismo de produção, geralmente uma célula eucariótica, por exemplo, uma célula de Pichia, uma célula de Ovário de Hamster chinês (CHO) ou uma célula humana. A sequência nucleotídica otimizada é engendrada para conservar completamente ou tanto quanto possível a sequência de aminoácidos originalmente codificada pela sequência nucleotídica inicial, que também é conhecida como a sequência "parental". As sequências otimizadas neste pedido foram engendradas para terem códons que são preferenciais em células mamíferas. Entre- tanto, a expressão otimizada destas sequências em outras células eu- carióticas ou células procarióticas também é prevista neste pedido. As sequências de aminoácidos codificadas por sequências nucleotídicas otimizadas também são referidas como otimizadas.

[070] Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são usados intercam-biavelmente neste pedido para referir-se a um polímero de resíduos de aminoácido. Os termos aplicam-se a polímeros de aminoácido nos quais um ou mais resíduos de aminoácidos são um mimético químico artificial de um aminoácido natural correspondente, bem como a polímeros de aminoácido natural e polímero de aminoácido não natural. A menos que de outra maneira indicado, uma sequência polipeptídica particular também engloba implicitamente variantes conservativamente modificadas da mesma.

[071] O termo "anticorpo humano recombinante", como usadoneste pedido, inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico ou transcromossômico de genes de imunoglobulina humana ou um hibridoma preparado a partir destes, anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo humano, por exemplo, a partir de um transfectoma, anticorpos isolados de uma biblioteca de anticorpo humano recombinante, combinatória, e anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolva o splicing (processamento) de todos ou uma porção de um gene de imunoglobulina humana, sequências de outras sequências de DNA. Tais anticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis nas quais a região conservada e as regiões CDR são derivadas de sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Em certas modalidades, entretanto, tais anticorpos humanos recombinantes podem ser submetidos à mutagênese in vitro (ou, quando um animal transgênico de sequências de Ig humana é usado, mutagênese somática in vivo) e dessa forma as sequências de amino- ácidos de regiões de VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, enquanto derivadas e relacionadas a sequências de VH e VL de linhagem germinativa humana, podem não existir naturalmente dentro do repertório de linhagem germinativa de anticorpo humano in vivo.

[072] O termo "célula hospedeira recombinante" (ou simplesmente "célula hospedeira") refere-se a uma célula na qual um vetor de expressão recombinante foi introduzido. Deve ser entendido que tais termos são destinados a referirem-se não somente à célula objeto particular, mas à progênie de tal célula. Como certas modificações podem ocorrer em gerações sucessivas devido à mutação ou devido a influências ambientais, tal progênie pode não ser, de fato, idêntica à célula parental, mas ainda está incluída dentro do escopo do termo "célula hospedeira" como usado neste pedido.

[073] O termo "indivíduo" inclui animais humanos e não humanos. Animais não humanos incluem todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, tais como primatas não humanos, ovelhas, cão, vaca, frangos, animais anfíbios e répteis. Exceto quando observado, os termos "paciente" ou "indivíduo" são usados neste pedido intercambiavelmente.

[074] O termo "tratamento" inclui a administração de composições ou anticorpos para prevenir ou retardar o início dos sintomas, complicações ou indícios bioquímicos de uma doença (por exemplo, AMD), aliviando os sintomas ou detendo ou inibindo o desenvolvimento adicional da doença, condição ou desordem. O tratamento pode ser profilático (para prevenir ou retardar o início da doença, ou prevenir a manifestação de sintomas clínicos ou subclínicos da mesma) ou de supressão ou alívio terapêutico de sintomas após manifestação da do- ença.

[075] O termo "vetor" é destinado a referir-se a uma molécula depolinucleotídeo capaz de transportar outro polinucleotídeo ao qual foi ligado. Um tipo do vetor é um "plasmídeo", que se refere a uma alça de DNA de fita dupla circular na qual segmentos adicionais de DNA podem ser ligados. Outro tipo do vetor é um vetor viral, em que segmentos adicionais de DNA podem ser ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem de replicação bacteriana e vetores mamíferos episso- mais). Outros vetores (por exemplo, vetores mamíferos não episso- mais) podem estar integrados no genoma de uma célula hospedeira por introdução na célula hospedeira, e por meio disso são replicados junto com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de dirigir a expressão de genes aos quais são operacionalmente ligados. Tais vetores são referidos neste pedido como "vetores de expressão recombinante" (ou simplesmente, "vetores de expressão"). Em geral, os vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante estão muitas vezes na forma de plasmídeos. No presente relatório descritivo, "plasmídeo" e "vetor" podem ser usados inter- cambiavelmente já que plasmídeo é a forma mais comumente usada de vetor. Entretanto, a invenção é destinada a incluir outras formas de vetores de expressão, tais como vetores virais (por exemplo, retrovírus de replicação defeituosa, adenovírus e vírus adenoassociados), que servem a funções equivalentes.4. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[076] A Figura 1 mostra alinhamentos de região variável de anticorpos selecionados com suas sequências de linhagem germinativa humanas mais estritamente relacionadas.A Figura 2 mostra um ensaio hemolítico no qual C5 humana é titulada no soro depletado de C5 humana para determinar a atividade de C5. A Figura 3 mostra a titulação do soro de cinomolgus no soro depletado de C5 humana para determinar a concentração ótima de C5 de cinomolgus para o ensaio hemolítico da via alternativa.

[077] A Figura 4 mostra exemplos de ensaios hemolíticos da viaclássica com soro humano 20%.

[078] A Figura 5 mostra exemplo de ensaios hemolíticos da viaalternativa com C5 humana purificada 100 pM adicionada ao soro de- pletado de C5 humana.

[079] A Figura 6 mostra exemplos de ensaios hemolíticos da viaalternativa com soro de cinomolgus 0,025% adicionado ao soro deple- tado de C5 humana.

[080] A Figura 7 mostra exemplos de ensaios hemolíticos da viaclássica (soro humano 20%) com Fabs maduros em comparação com seus respectivos parentais.

[081] A Figura 8 mostra exemplos de ensaios hemolíticos da viaclássica (soro de cinomolgus 5%) com Fabs maduros.

[082] A Figura 9 mostra afinidade de caracterização de Fab maduro no ensaio hemolítico da via alternativa usando C5 humana 100 pM adicionada ao soro depletado de C5 humana 20%.

[083] A Figura 10 mostra afinidade de caracterização de Fab maduro no ensaio hemolítico da via alternativa usando soro humano 20%.

[084] A Figura 11 mostra afinidade de caracterização de Fab maduro no ensaio hemolítico da via alternativa usando C5 de cinomolgus 100 pM adicionada ao soro depletado de C5 humana 20%.

[085] A Figura 12 mostra a caracterização de IgGs em linhagemgerminativa no ensaio hemolítico da via clássica usando soro humano 20%.

[086] A Figura 13 mostra a caracterização de IgGs em linhagemgerminativa no ensaio hemolítico da via clássica usando soro de cino- molgus de 5%.

[087] A Figura 14 mostra a caracterização de IgGs em linhagemgerminativa no ensaio hemolítico da via alternativa, C5 humana 100 pM.

[088] A Figura 15 mostra a caracterização de IgGs finais em linhagem germinativa no ensaio hemolítico da via alternativa e ELISA para geração de C5a usando soro humano 20%.

[089] A Figura 16 mostra afinidade de caracterização de Fab maduro no ELISA de C5a usando o sobrenadante de ensaios hemolíticos de soro humano 20%.

[090] A Figura 17 mostra a especificidade de solução por ELISAsobre C3, C4, C5 humana e C5 de cinomolgus do anticorpo teste 7091 e seus derivados.

[091] A Figura 18 mostra ensaios de estabilidade sérica (ligaçãoà C5 humana na presença do soro 50%) com Fabs.

[092] A Figura 19 mostra a ligação ao epítopo de alguns Fabscom afinidade melhorada.

[093] A Figura 20 mostra um ELISA da ligação de anticorpo à C5quimérica camundongo-humano ou C5 humana para determinar liga- dores de cadeia alfa contra cadeia beta. C5 foi apresentada por 5G1.1 para determinar a competição com 5G1.1.

[094] A Figura 21 mostra ELISA para teste de ligantes de cadeiaalfa contra cadeia beta com captura de 5G1.1.

[095] A Figura 22 mostra resultados do ensaio hemolítico parateste de ligadores de cadeia alfa contra cadeia beta.

[096] A Figura 23 mostra proteólise de termolisina de Fabs parentais a 37°C (0, 30, 60 e 90 minutos).

[097] A Figura 24 mostra proteólise de termolisina de Fabs parentais a 55°C (0, 30, 60 e 90 minutos).

[098] A Figura 25 mostra sensibilidade de termolisina de Fabs maduros a 37°C.

[099] A Figura 26 mostra sensibilidade de termolisina de Fabsmaduros a 55°C.

[0100] A Figura 27 mostra exemplos de inibição por Fab da via alternativa no ensaio de deposição MAC.5. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0101] A presente invenção fornece anticorpos que especificamente se ligam à proteína C5 do complemento (por exemplo, C5 humana, C5 de cinomolgus), composições farmacêuticas, métodos de produção e métodos de uso de tais anticorpos e composições.5.1. Anticorpos para C5

[0102] A presente invenção fornece anticorpos que especificamente se ligam à C5 (por exemplo, C5 humana, C5 de cinomolgus). Em algumas modalidades, a presente invenção fornece anticorpos que especificamente se ligam tanto à C5 humana como de cinomolgus. Os anticorpos da invenção incluem, mas não são limitados aos anticorpos monoclonais humanos, isolados como descrito nos Exemplos (vide Seção 6 abaixo).

[0103] A presente invenção fornece anticorpos que especificamente se ligam a uma proteína C5 (por exemplo, C5 humana e/ou de ci- nomolgus), os ditos anticorpos compreendendo um domínio VH tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7, 23, 39, 51, 67, 79, 96, 108, 114, 121, 137, 151, 165, 179, 187, 201, 210, 218, 227, 241, 253, 257, 273, 277 ou 281. A presente invenção também fornece anticorpos que especificamente se ligam a uma proteína C5 (por exemplo, C5 humana e/ou de cinomolgus), os ditos anticorpos compreendendo uma CDR de VH tendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDRs de VH listadas na Tabela 1, infra. Em particular, a invenção fornece anticorpos que especificamente se ligam a uma proteína C5 (por exemplo, C5 humana e/ou de cinomolgus), os ditos anti- corpos compreendendo (ou alternativamente, consistindo em) uma, duas, três, quatro, cinco ou mais CDRs de VH que têm uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDRs de VH listadas na Tabela 1, infra.

[0104] A presente invenção fornece anticorpos que especificamente se ligam a uma proteína C5 (por exemplo, C5 humana e/ou de ci- nomolgus), os ditos anticorpos compreendendo um domínio VL tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, 24, 40, 52, 68, 80, 90, 102, 122, 138, 152, 166, 180, 188, 202, 211, 219, 228, 242, 261, 265, 269, 285 ou 289. A presente invenção também fornece anticorpos que especificamente se ligam a uma proteína C5 (por exemplo, C5 humana e/ou de cinomolgus), os ditos anticorpos compreendendo uma CDR de VL tendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDRs de VL listadas na Tabela 1, infra. Em particular, a invenção fornece anticorpos que especificamente se ligam a uma proteína C5 (por exemplo, C5 humana e/ou de cinomolgus), os ditos anticorpos compreendendo (ou alternativamente, consistindo de) uma, duas, três ou mais CDRs de VL tendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDRs de VL listadas na Tabela 1, infra.

[0105] Outros anticorpos da invenção incluem aminoácidos queforam mutados, tendo ainda identidade de pelo menos 60, 70, 80, 90 ou 95 por cento nas regiões CDR com as regiões CDR representadas nas sequências descritas na Tabela 1. Em algumas modalidades, incluem sequências de aminoácidos mutantes em que não mais do que 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos foram mutados nas regiões CDR quando comparadas às regiões CDR representadas na sequência descrita na Tabela 1.

[0106] A presente invenção também fornece sequências de ácidosnucleicos que codificam VH, VL, cadeia longa de extensão completa, e a cadeia curta de extensão completa dos anticorpos que especifica- mente se ligam a uma proteína C5 (por exemplo, C5 humana e/ou de cinomolgus). Tais sequências de ácidos nucleicos podem ser otimizadas para a expressão em células mamíferas (por exemplo, a Tabela 1 mostra as sequências de ácidos nucleicos otimizadas da cadeia longa e a cadeia curta de anticorpos 8109, 8110, 8111, 8113, 8114, 8112, 8125, 8126, 8127, 8128, 8129, 8130, 8131, 8132 e 8091).

[0107] Outros anticorpos da invenção incluem aqueles onde osaminoácidos ou os ácidos nucleicos que codificam os aminoácidos foram mutados, tendo ainda identidade de pelo menos 60, 70, 80, 90 ou 95 por cento às sequências descritas na Tabela 1. Em algumas modalidades, inclui sequências de aminoácidos mutantes em que não mais do que 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos foram mutados nas regiões variáveis quando comparadas às regiões variáveis representadas na sequência descrita na Tabela 1, conservando substancialmente a mesma atividade terapêutica.

[0108] Uma vez que cada um destes anticorpos pode ligar-se aC5, VH, VL, sequências de cadeia curta de extensão completa e de cadeia longa de extensão completa (sequências de aminoácidos e sequências nucleotídicas que codificam as sequências de aminoácidos) podem ser "misturadas e combinadas" para criar outros anticorpos de ligação à C5 da invenção. Tais anticorpos de ligação à C5 "variados e combinados" podem ser testados usando os ensaios de ligação conhecidos na técnica (por exemplo, ELISAs, e outros ensaios descritos na seção de Exemplo). Quando estas cadeias são misturadas e combinadas, uma sequência de VH de um pareamento particular VH/VL deve ser substituída por uma sequência de VH estruturalmente similar. Do mesmo modo, uma sequência de cadeia longa de extensão completa a partir de um pareamento particular de uma cadeia longa de extensão completa/cadeia curta de extensão completa deve ser substituída por uma sequência de cadeia longa de extensão completa estruturalmente similar. Do mesmo modo, uma sequência de VL de um pare- amento particular VH/VL deve ser substituída por uma sequência de VL estruturalmente similar. Do mesmo modo uma sequência de cadeia curta de extensão completa a partir de um pareamento particular de cadeia longa de extensão completa/cadeia curta de extensão completa deve ser substituída por uma sequência de cadeia curta de extensão completa estruturalmente similar. Consequentemente, em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo monoclonal isolado ou região de ligação a antígeno do mesmo tendo: uma região variável de cadeia longa compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 7, 23, 39, 51, 67, 79, 96, 108, 114, 121, 137, 151, 165, 179, 187, 201, 210, 218, 227, 241, 253, 257, 273, 277 e 281; e uma região variável de cadeia curta compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consis- tindo nas SEQ ID NOs: 8, 24, 40, 52, 68, 80, 90, 102, 122, 138, 152, 166, 180, 188, 202, 211, 219, 228, 242, 261, 265, 269, 285 e 289; em que o anticorpo especificamente se liga à C5 (por exemplo, C5 humana e/ou de cinomolgus).

[0109] Em outro aspecto, a invenção fornece (i) um anticorpo monoclonal isolado tendo: uma cadeia longa de extensão completa com-preendendo uma sequência de aminoácidos que foi otimizada para a expressão na célula de um mamífero selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 9, 25, 41, 53, 69, 81, 97, 109, 115, 123, 139, 153, 167, 181, 189, 203, 212, 220, 229, 243, 249, 254, 258, 274, 278 e 282; e uma cadeia curta de extensão completa compreendendo uma sequência de aminoácidos que foi otimizada para a expressão na célula de um mamífero selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 10, 26, 42, 54, 70, 82, 91, 103, 124, 140, 154, 168, 182, 190, 204, 213, 221, 230, 244, 251, 262, 266, 270, 286 e 290; ou (ii) uma proteína funcional compreendendo uma porção de ligação a antí- geno da mesma.

[0110] Em outro aspecto, a presente invenção fornece anticorposde ligação à C5 que compreendem às CDR1s, CDR2s e CDR3s de cadeia longa e cadeia curta como descritas na Tabela 1, ou combinações das mesmas. As sequências de aminoácidos das CDR1s de VH dos anticorpos são mostradas nas SEQ ID NOs: 1, 17, 33, 61, 131, 145, 159, 173, 195 e 235. As sequências de aminoácidos das CDR2s de VH dos anticorpos e são mostradas nas SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 49, 62, 77, 95, 107, 113, 119, 132, 146, 160, 174, 196, 226 e 236. As sequências de aminoácidos das CDR3s de VH dos anticorpos são mostradas nas SEQ ID NOs: 3, 19, 35, 63, 133, 147, 161, 175, 197 e 237. As sequências de aminoácidos das CDR1s de VL dos anticorpos são mostradas nas SEQ ID NOs: 4, 20, 36, 64, 134, 148, 162, 176, 198 e 238. As sequências de aminoácidos das CDR2s de VL dos anticorpos são mostradas nas SEQ ID NOs: 5, 21, 37, 65, 135, 149, 163, 177, 199 e 239. As sequências de aminoácidos das CDR3s de VL dos anticorpos são mostradas nas SEQ ID NOs: 6, 22, 38, 50, 66, 78, 89, 101, 120, 136, 150, 164, 178, 200, 209 e 240. As regiões CDR são delineadas usando o sistema Kabat (Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication N. 91-3242).

[0111] Considerando que cada um destes anticorpos pode se ligara C5 e que a especificidade de ligação a antígeno é fornecida principalmente pelas regiões CDR1, 2 e 3, as sequências de CDR1, 2 e 3 de VH e sequências de CDR1, 2 e 3 de VL podem ser "misturadas e combinadas" (isto é, as CDRs de anticorpos diferentes podem ser misturadas e combinadas, embora cada anticorpo deva conter uma CDR1, 2 e 3 de VH e uma CDR1, 2 e 3 de VL para criar outra ligação à moléculas de ligação à C5 da invenção. Tais anticorpos de ligação à C5 "variados e combinados" podem ser testados usando os ensaios de ligação conhecidos na técnica e aqueles descritos nos Exemplos (por exemplo, ELISAs). Quando as sequências de CDR de VH são misturadas e combinadas, a sequência de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma sequência particular de VH devem ser substituídas por uma sequên- cia(s) de CDR estruturalmente similar. Do mesmo modo, quando as sequências de CDR de VL são misturadas e combinadas, a sequência CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma sequência particular de VL devem ser substituídas por uma sequência(s) de CDR estruturalmente similar. Será prontamente evidente para o técnico no assunto que novas sequências de VH e de VL podem ser criadas pela substituição de uma ou mais sequências de região CDR de VH e/ou VL por sequências estruturalmente similares das sequências de CDR mostradas neste pedido para os anticorpos monoclonais da presente invenção.

[0112] Consequentemente, a presente invenção fornece um anti- corpo monoclonal isolado ou região de ligação a antígeno do mesmo compreendendo uma região variável de cadeia longa CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 1, 17, 33, 61, 131, 145, 159, 173, 195 e 235; uma região variável de cadeia longa CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 49, 62, 77, 95, 107, 113, 119, 132, 146, 160, 174, 196, 226 e 236; uma região variável de cadeia longa CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 3, 19, 35, 63, 133, 147, 161, 175, 197 e 237; uma região variável de cadeia curta CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 4, 20, 36, 64, 134, 148, 162, 176, 198 e 238; uma região variável de cadeia curta CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 5, 21, 37, 65, 135, 149, 163, 177, 199 e 239; e uma região variável de cadeia curta CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 6, 22, 38, 50, 66, 78, 89, 101, 120, 136, 150, 164, 178, 200, 209 e 240; em que o anticorpo especificamente se liga à C5.

[0113] Em uma modalidade específica, um anticorpo que especificamente se liga à C5 compreendendo uma região variável de cadeia longa CDR1 da SEQ ID NO:1; uma região variável de cadeia longa CDR2 da SEQ ID NO: 2; uma região variável de cadeia longa CDR3 da SEQ ID NO: 3; uma região variável de cadeia curta CDR1 da SEQ ID NO: 4; uma região variável de cadeia curta CDR2 da SEQ ID NO: 5; e uma região variável de cadeia curta CDR3 da SEQ ID NO: 6. Em outra modalidade específica, um anticorpo que especificamente se liga à C5 compreendendo uma região variável de cadeia longa CDR1 da SEQ ID NO: 17; uma região variável de cadeia longa CDR2 da SEQ ID NO: 18; uma região variável de cadeia longa CDR3 da SEQ ID NO: 19; uma região variável de cadeia curta CDR1 da SEQ ID NO: 20; uma região variável de cadeia curta CDR2 da SEQ ID NO: 21; e uma região variável de cadeia curta CDR3 da SEQ ID NO: 22.

[0114] Em outra modalidade específica, um anticorpo que especificamente se liga à C5 compreendendo uma região variável de cadeia longa CDR1 da SEQ ID NO: 33; uma região variável de cadeia longa CDR2 da SEQ ID NO: 34; uma região variável de cadeia longa CDR3 de SEQ ID NO: 35; uma região variável de cadeia curta CDR1 da SEQ ID NO: 36; uma região variável de cadeia curta CDR2 da SEQ ID NO: 37; e uma região variável de cadeia curta CDR3 da SEQ ID NO: 38. Em outra modalidade específica, um anticorpo que especificamente se liga à C5 compreendendo uma região variável de cadeia longa CDR1 da SEQ ID NO: 17; uma região variável de cadeia longa CDR2 da SEQ ID NO: 49; uma região variável de cadeia longa CDR3 da SEQ ID NO: 19; uma região variável de cadeia curta CDR1 da SEQ ID NO: 20; uma região variável de cadeia curta CDR2 da SEQ ID NO: 21; e uma região variável de cadeia curta CDR3 da SEQ ID NO: 50.

[0115] Em outra modalidade específica, um anticorpo que especificamente se liga à C5 compreendendo uma região variável de cadeia longa CDR1 da SEQ ID NO: 61; uma região variável de cadeia longa CDR2 da SEQ ID NO: 62; uma região variável de cadeia longa CDR3 da SEQ ID NO: 63; uma região variável de cadeia curta CDR1 da SEQ ID NO: 64; uma região variável de cadeia curta CDR2 de SEQ ID NO: 65; e uma região variável de cadeia curta CDR3 da SEQ ID NO: 66. Em outra modalidade específica, um anticorpo que especificamente se liga à C5 compreendendo uma região variável de cadeia longa CDR1 da SEQ ID NO: 61; uma região variável de cadeia longa CDR2 da SEQ ID NO: 77; uma região variável de cadeia longa CDR3 da SEQ ID NO: 63; uma região variável de cadeia curta CDR1 da SEQ ID NO: 64; uma região variável de cadeia curta CDR2 da SEQ ID NO: 65; e uma região variável de cadeia curta CDR3 da SEQ ID NO: 78.

[0116] Em outra modalidade específica, um anticorpo que especificamente se liga à C5 compreendendo uma região variável de cadeia longa CDR1 da SEQ ID NO: 61; uma região variável de cadeia longa CDR2 da SEQ ID NO: 77; uma região variável de cadeia longa CDR3 da SEQ ID NO: 63; uma região variável de cadeia curta CDR1 da SEQ ID NO: 64; uma região variável de cadeia curta CDR2 da SEQ ID NO: 65; e uma região variável de cadeia curta CDR3 da SEQ ID NO: 89. Em outra modalidade específica, um anticorpo que especificamente se liga à C5 compreendendo uma região variável de cadeia longa CDR1 da SEQ ID NO: 61; uma região variável de cadeia longa CDR2 da SEQ ID NO: 62; uma região variável de cadeia longa CDR3 da SEQ ID NO: 63; uma região variável de cadeia curta CDR1 da SEQ ID NO: 64; uma região variável de cadeia curta CDR2 da SEQ ID NO: 65; e uma região variável de cadeia curta CDR3 da SEQ ID NO: 89.

[0117] Em outra modalidade específica, um anticorpo que especificamente se liga à C5 compreendendo uma região variável de cadeia longa CDR1 de SEQ ID NO: 61; uma região variável de cadeia longa CDR2 de SEQ ID NO: 95; uma região variável de cadeia longa CDR3 de SEQ ID NO: 63; uma região variável de cadeia curta CDR1 de SEQ ID NO: 64; uma região variável de cadeia curta CDR2 de SEQ ID NO: 65; e uma região variável de cadeia curta CDR3 de SEQ ID NO: 89. Em outra modalidade específica, um anticorpo que especificamente se liga à C5 compreendendo uma região variável de cadeia longa CDR1 de SEQ ID NO: 17; uma região variável de cadeia longa CDR2 de SEQ ID NO: 49; uma região variável de cadeia longa CDR3 de SEQ ID NO: 19; uma região variável de cadeia curta CDR1 de SEQ ID NO: 20; uma região variável de cadeia curta CDR2 de SEQ ID NO: 21; e uma região variável de cadeia curta CDR3 de SEQ ID NO: 101.

[0118] Em outra modalidade específica, um anticorpo que especificamente se liga à C5 compreendendo uma região variável de cadeia longa CDR1 da SEQ ID NO: 17; uma região variável de cadeia longa CDR2 da SEQ ID NO: 107; uma região variável de cadeia longa CDR3 da SEQ ID NO: 19; uma região variável de cadeia curta CDR1 da SEQ ID NO: 20; uma região variável de cadeia curta CDR2 da SEQ ID NO: 21; e uma região variável de cadeia curta CDR3 da SEQ ID NO: 22. Em outra modalidade específica, um anticorpo que especificamente se liga à C5 compreendendo uma região variável de cadeia longa CDR1 da SEQ ID NO: 17; uma região variável de cadeia longa CDR2 da SEQ ID NO: 107; uma região variável de cadeia longa CDR3 da SEQ ID NO: 19; uma região variável de cadeia curta CDR1 da SEQ ID NO: 20; uma região variável de cadeia curta CDR2 da SEQ ID NO: 21; e uma região variável de cadeia curta CDR3 da SEQ ID NO: 101.

[0119] Em outra modalidade específica, um anticorpo que especificamente se liga à C5 compreendendo uma região variável de cadeia longa CDR1 da SEQ ID NO: 17; uma região variável de cadeia longa CDR2 da SEQ ID NO: 113; uma região variável de cadeia longa CDR3 da SEQ ID NO: 19; uma região variável de cadeia curta CDR1 da SEQ ID NO: 20; uma região variável de cadeia curta CDR2 da SEQ ID NO: 21; e uma região variável de cadeia curta CDR3 da SEQ ID NO: 22. Em outra modalidade específica, um anticorpo que especificamente se liga à C5 compreendendo uma região variável de cadeia longa CDR1 da SEQ ID NO: 17; uma região variável de cadeia longa CDR2 da SEQ ID NO: 113; uma região variável de cadeia longa CDR3 da SEQ ID NO: 19; uma região variável de cadeia curta CDR1 da SEQ ID NO: 20; uma região variável de cadeia curta CDR2 da SEQ ID NO: 21; e uma região variável de cadeia curta CDR3 da SEQ ID NO: 101.

[0120] Em outra modalidade específica, um anticorpo que especificamente se liga à C5 compreendendo uma região variável de cadeia longa CDR1 da SEQ ID NO: 1; uma região variável de cadeia longa CDR2 da SEQ ID NO: 119; uma região variável de cadeia longa CDR3 da SEQ ID NO: 3; uma região variável de cadeia curta CDR1 da SEQ ID NO: 4; uma região variável de cadeia curta CDR2 da SEQ ID NO: 5; e uma região variável de cadeia curta CDR3 da SEQ ID NO: 120. Em outra modalidade específica, um anticorpo que especificamente se liga à C5 compreendendo uma região variável de cadeia longa CDR1 da SEQ ID NO: 131; uma região variável de cadeia longa CDR2 da SEQ ID NO: 132; uma região variável de cadeia longa CDR3 da SEQ ID NO: 133; uma região variável de cadeia curta CDR1 da SEQ ID NO: 134; uma região variável de cadeia curta CDR2 da SEQ ID NO: 135; e uma região variável de cadeia curta CDR3 da SEQ ID NO: 136.

[0121] Em outra modalidade específica, um anticorpo que especificamente se liga à C5 compreendendo uma região variável de cadeia longa CDR1 da SEQ ID NO: 145; uma região variável de cadeia longa CDR2 da SEQ ID NO: 146; uma região variável de cadeia longa CDR3 da SEQ ID NO: 147; uma região variável de cadeia curta CDR1 da SEQ ID NO: 148; uma região variável de cadeia curta CDR2 da SEQ ID NO: 149; e uma região variável de cadeia curta CDR3 da SEQ ID NO: 150. Em outra modalidade específica, um anticorpo que especificamente se liga à C5 compreendendo uma região variável de cadeia longa CDR1 da SEQ ID NO: 159; uma região variável de cadeia longa CDR2 da SEQ ID NO: 160; uma região variável de cadeia longa CDR3 da SEQ ID NO: 161; uma região variável de cadeia curta CDR1 da SEQ ID NO: 162; uma região variável de cadeia curta CDR2 da SEQ ID NO: 163; e uma região variável de cadeia curta CDR3 da SEQ ID NO: 164.

[0122] Em outra modalidade específica, um anticorpo que especificamente se liga à C5 compreendendo uma região variável de cadeia longa CDR1 da SEQ ID NO: 173; uma região variável de cadeia longa CDR2 da SEQ ID NO: 174; uma região variável de cadeia longa CDR3 da SEQ ID NO: 175; uma região variável de cadeia curta CDR1 da SEQ ID NO: 176; uma região variável de cadeia curta CDR2 da SEQ ID NO: 177; e uma região variável de cadeia curta CDR3 da SEQ ID NO: 178. Em outra modalidade específica, um anticorpo que especificamente se liga à C5 compreendendo uma região variável de cadeia longa CDR1 da SEQ ID NO: 195; uma região variável de cadeia longa CDR2 da SEQ ID NO: 196; uma região variável de cadeia longa CDR3 da SEQ ID NO: 197; uma região variável de cadeia curta CDR1 da SEQ ID NO: 198; uma região variável de cadeia curta CDR2 da SEQ ID NO: 199; e uma região variável de cadeia curta CDR3 da SEQ ID NO: 200.

[0123] Em outra modalidade específica, um anticorpo que especificamente se liga à C5 compreendendo uma região variável de cadeia longa CDR1 da SEQ ID NO: 61; uma região variável de cadeia longa CDR2 da SEQ ID NO: 77; uma região variável de cadeia longa CDR3 da SEQ ID NO: 63; uma região variável de cadeia curta CDR1 da SEQ ID NO: 64; uma região variável de cadeia curta CDR2 da SEQ ID NO: 65; e uma região variável de cadeia curta CDR3 da SEQ ID NO: 209. Em outra modalidade específica, um anticorpo que especificamente se liga à C5 compreendendo uma região variável de cadeia longa CDR1 da SEQ ID NO: 17; uma região variável de cadeia longa CDR2 da SEQ ID NO: 49; uma região variável de cadeia longa CDR3 da SEQ ID NO: 19; uma região variável de cadeia curta CDR1 da SEQ ID NO: 20; uma região variável de cadeia curta CDR2 da SEQ ID NO: 21; e uma região variável de cadeia curta CDR3 da SEQ ID NO: 22.

[0124] Em outra modalidade específica, um anticorpo que especificamente se liga à C5 compreendendo uma região variável de cadeia longa CDR1 da SEQ ID NO: 33; uma região variável de cadeia longa CDR2 da SEQ ID NO: 226; uma região variável de cadeia longa CDR3 da SEQ ID NO: 35; uma região variável de cadeia curta CDR1 da SEQ ID NO: 36; uma região variável de cadeia curta CDR2 da SEQ ID NO: 37; e uma região variável de cadeia curta CDR3 da SEQ ID NO: 38. Em outra modalidade específica, um anticorpo que especificamente se liga à C5 compreendendo uma região variável de cadeia longa CDR1 da SEQ ID NO: 235; uma região variável de cadeia longa CDR2 da SEQ ID NO: 236; uma região variável de cadeia longa CDR3 da SEQ ID NO: 237; uma região variável de cadeia curta CDR1 da SEQ ID NO: 238; uma região variável de cadeia curta CDR2 da SEQ ID NO: 239; e uma região variável de cadeia curta CDR3 da SEQ ID NO: 240.

[0125] Em outra modalidade específica, um anticorpo que especificamente se liga à C5 compreendendo uma região variável de cadeia longa CDR1 da SEQ ID NO: 1; uma região variável de cadeia longa CDR2 da SEQ ID NO: 119; uma região variável de cadeia longa CDR3 da SEQ ID NO: 3; uma região variável de cadeia curta CDR1 da SEQ ID NO: 4; uma região variável de cadeia curta CDR2 da SEQ ID NO: 5; e uma região variável de cadeia curta CDR3 da SEQ ID NO: 6. Em outra modalidade específica, um anticorpo que especificamente se liga à C5 compreendendo uma região variável de cadeia longa CDR1 da SEQ ID NO: 1; uma região variável de cadeia longa CDR2 da SEQ ID NO: 2; uma região variável de cadeia longa CDR3 da SEQ ID NO: 3; uma região variável de cadeia curta CDR1 da SEQ ID NO: 4; uma região variável de cadeia curta CDR2 da SEQ ID NO: 5; e uma região variável de cadeia curta CDR3 da SEQ ID NO: 120.

[0126] Em outra modalidade específica, um anticorpo que especificamente se liga à C5 compreendendo uma região variável de cadeia longa CDR1 da SEQ ID NO: 61; uma região variável de cadeia longa CDR2 da SEQ ID NO: 62; uma região variável de cadeia longa CDR3 da SEQ ID NO: 63; uma região variável de cadeia curta CDR1 da SEQ ID NO: 64; uma região variável de cadeia curta CDR2 da SEQ ID NO: 65; e uma região variável de cadeia curta CDR3 da SEQ ID NO: 209. Em outra modalidade específica, um anticorpo que especificamente se liga à C5 compreendendo uma região variável de cadeia longa CDR1 da SEQ ID NO: 61; uma região variável de cadeia longa CDR2 da SEQ ID NO: 95; uma região variável de cadeia longa CDR3 da SEQ ID NO: 63; uma região variável de cadeia curta CDR1 da SEQ ID NO: 64; uma região variável de cadeia curta CDR2 da SEQ ID NO: 65; e uma região variável de cadeia curta CDR3 da SEQ ID NO: 209.

[0127] Em outra modalidade específica, um anticorpo que especificamente se liga à C5 compreendendo uma região variável de cadeia longa CDR1 da SEQ ID NO: 61; uma região variável de cadeia longa CDR2 da SEQ ID NO: 77; uma região variável de cadeia longa CDR3 da SEQ ID NO: 63; uma região variável de cadeia curta CDR1 da SEQ ID NO: 64; uma região variável de cadeia curta CDR2 da SEQ ID NO: 65; e uma região variável de cadeia curta CDR3 da SEQ ID NO: 66. Em outra modalidade específica, um anticorpo que especificamente se liga à C5 compreendendo uma região variável de cadeia longa CDR1 da SEQ ID NO: 61; uma região variável de cadeia longa CDR2 da SEQ ID NO: 77; uma região variável de cadeia longa CDR3 da SEQ ID NO: 63; uma região variável de cadeia curta CDR1 da SEQ ID NO: 64; uma região variável de cadeia curta CDR2 da SEQ ID NO: 65; e uma região variável de cadeia curta CDR3 da SEQ ID NO: 78.

[0128] Em outra modalidade específica, um anticorpo que especificamente se liga à C5 compreendendo uma região variável de cadeia longa CDR1 da SEQ ID NO: 61; uma região variável de cadeia longa CDR2 da SEQ ID NO: 77; uma região variável de cadeia longa CDR3 da SEQ ID NO: 63; uma região variável de cadeia curta CDR1 da SEQ ID NO: 64; uma região variável de cadeia curta CDR2 da SEQ ID NO: 65; e uma região variável de cadeia curta CDR3 da SEQ ID NO: 89. Em outra modalidade específica, um anticorpo que especificamente se liga à C5 compreendendo uma região variável de cadeia longa CDR1 da SEQ ID NO: 17; uma região variável de cadeia longa CDR2 da SEQ ID NO: 107; uma região variável de cadeia longa CDR3 da SEQ ID NO: 19; uma região variável de cadeia curta CDR1 da SEQ ID NO: 20; uma região variável de cadeia curta CDR2 da SEQ ID NO: 21; e uma região variável de cadeia curta CDR3 da SEQ ID NO: 22.

[0129] Em certas modalidades, um anticorpo que especificamentese liga à C5 é um anticorpo que é descrito na Tabela 1.

[0130] Como usado neste pedido, um anticorpo humano compreende regiões variáveis de cadeia longa ou leve ou cadeias longas ou leves de extensão completa que são "o produto de" ou "derivadas de" uma sequência particular de linhagem germinativa se as regiões variáveis ou cadeias de extensão completa do anticorpo forem obtidas de um sistema que usa genes de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Tais sistemas incluem imunização de um camundongo trans- gênico carregando genes de imunoglobulina humana com o antígeno de interesse ou rastreamento de uma biblioteca gênica de imunoglobu- lina humana exposta em fago com o antígeno de interesse. Um anticorpo humano que é "o produto de" ou "derivado de" uma sequência de imunoglobulina de linhagem germinativa humana pode ser identificado como tal por comparação da sequência de aminoácidos do anti-corpo humano às sequências de aminoácidos de imunoglobulinas de linhagem germinativa humana e seleção da sequência de imunoglobu- lina de linhagem germinativa humana que é muito próxima em sequência (isto é, a maior % de identidade) à sequência do anticorpo humano. Um anticorpo humano que é "o produto de" ou "derivado de" uma sequência particular de imunoglobulina de linhagem germinativa humana pode conter diferenças de aminoácido quando comparada com a sequência de linhagem germinativa, devido a, por exemplo, mutações somáticas de ocorrência natural ou introdução intencional de mutações sítio-dirigidas. Entretanto, nas regiões conservadas de VH ou VL, um anticorpo humano selecionado tipicamente é pelo menos 90% idêntico na sequência de aminoácidos a uma sequência de ami- noácidos codificada por um gene de imunoglobulina de linhagem ger- minativa humana e contém resíduos de aminoácido que identificam o anticorpo humano como sendo humano quando comparado às sequências de aminoácidos de imunoglobulina de linhagem germinativa de outras espécies (por exemplo, sequências de linhagem germinativa murina). Em certos casos, um anticorpo humano pode ser pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, ou pelo menos 95%, ou até pelo menos 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntico na sequência de aminoácidos à sequência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina de linhagem germinativa. Tipicamente, um anticorpo humano recombinante exibirá não mais do que 10 diferenças de aminoácidos na sequência de ami- noácidos codificada pelo gene de imunoglobulina de linhagem germi- nativa humana nas regiões conservadas de VH ou de VL. Em certos casos, o anticorpo humano pode expor não mais do que 5, ou até não mais do que 4, 3, 2, ou 1 diferenças de aminoácidos na sequência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina de linhagem germinativa.

Anticorpos homólogos

[0131] Ainda em outra modalidade, a presente invenção forneceum anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo com-preendendo sequências de aminoácidos que são homólogas às sequências descritas na Tabela 1, e o dito anticorpo liga-se a uma proteína C5 (por exemplo, C5 humana e/ou de cinomolgus), e conserva as propriedades funcionais desejadas daqueles anticorpos descritos na Tabela 1.

[0132] Por exemplo, a invenção fornece um anticorpo monoclonalisolado (ou um fragmento de ligação a antígeno funcional do mesmo) compreendendo uma região variável de cadeia longa e uma região variável de cadeia curta, em que a região variável de cadeia longa compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% idêntica a uma sequência de amino- ácidos selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 7, 23, 39, 51, 67, 79, 96, 108, 114, 121, 137, 151, 165, 179, 187, 201, 210, 218, 227, 241, 253, 257, 273, 277 ou 281; a região variável de cadeia curta compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 8, 24, 40, 52, 68, 80, 90, 102, 122, 138, 152, 166, 180, 188, 202, 211, 219, 228, 242, 261, 265, 269, 285 ou 289; o anticorpo especificamente se liga à C5 (por exemplo, C5 humana e/ou de cino- molgus), e o anticorpo pode inibir a lise de célula vermelha sanguínea em um ensaio hemolítico. Em um exemplo específico, tais anticorpos têm um valor de IC50 em um ensaio hemolítico de 20 a 200 pM usando soro depletado de C5 humana que é reconstituído com C5 humana 100 pM.

[0133] Em outras modalidades, as sequências de aminoácidos deVH e/ou VL podem ser 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas às sequências apresentadas na Tabela 1. Em outras modalidades, as sequências de aminoácidos de VH e/ou VL podem ser idênticas exceto uma substituição de aminoácido em não mais do que 1, 2, 3, 4 ou 5 posições de aminoácido. Um anticorpo que tem regiões de VH e VL tendo alta identidade (isto é, 80% ou maior) às regiões de VH e VL daqueles descritos na Tabela 1 pode ser obtido por mutagênese (por exemplo, mutagênese sítio-dirigida ou mediada por PCR) de moléculas de ácidos nucleicos que codificam as SEQ ID NOs: 7, 23, 39, 51, 67, 79, 96, 108, 114, 121, 137, 151, 165, 179, 187, 201, 210, 218, 227, 241, 253, 257, 273, 277 ou 281; e 8, 24, 40, 52, 68, 80, 90, 102, 122, 138, 152, 166, 180, 188, 202, 211, 219, 228, 242, 261, 265, 269, 285 ou 289 respectivamente, seguida pelo teste do anticorpo alterado codificado de função conservada usando os ensaios funcionais descritos neste pedido.

[0134] Em outras modalidades, as sequências de aminoácidos decadeia longa de extensão completa e/ou de cadeia curta de extensão completa podem ser 50% 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticos às sequências apresentadas na Tabela 1. Um anticorpo que tem uma cadeia longa de extensão completa e cadeia curta de extensão completa tendo alta identidade (isto é, 80% ou maior) às cadeias longas de extensão completa de qualquer uma das SEQ ID NOs: 9, 25, 41, 53, 69, 81, 97, 109, 115, 123, 139, 153, 167, 181, 189, 203, 212, 220, 229, 243, 249, 254, 258, 274, 278 e 282, e cadeias curtas de extensão completa de qualquer uma das SEQ ID NOs 10, 26, 42, 54, 70, 82, 91, 103, 124, 140, 154, 168, 182, 190, 204, 213, 221, 230, 244, 251, 262, 266, 270, 286 e 290 respectivamente, podem ser obtidas por mutagênese (por exemplo, mutagênese sítio-dirigida ou mediada por PCR) de moléculas de ácidos nucleicos que codificam tais polipeptídeos respectivamente, seguida pelo teste do anticorpo alterado codificado de função conservada usando os ensaios funcionais descritos neste pedido.

[0135] Em outras modalidades, as sequências nucleotídicas decadeia longa de extensão completa e/ou cadeia curta de extensão completa podem ser 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas às sequências apresentadas acima.

[0136] Em outras modalidades, as sequências nucleotídicas deregiões variáveis de cadeia longa e/ou cadeia curta podem ser 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas às sequências apresentadas acima.

[0137] Como usado neste pedido, a identidade percentual entre duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (isto é, a % de identidade igual ao número de posições idênticas/número total de posições x 100), considerando o número de lacunas, e o comprimento de cada lacuna, que precisa ser introduzida para alinhamento ótimo das duas sequências. A comparação de sequências e determinação da identidade percentual entre duas sequências podem ser realizadas usando um algoritmo matemático, como descrito nos exemplos não restritivos abaixo.

[0138] Adicionalmente ou alternativamente, as sequências proteicas da presente invenção podem ser ainda usadas como "uma sequência de questionamento" para realizar uma busca contra bancos de dados públicos, por exemplo, para identificar sequências relacionadas. Por exemplo, tais buscas podem ser realizadas usando o programa BLAST (versão 2.0) de Altschul, et al., 1990 J.Mol. Biol. 215:403-10.Anticorpos com Modificações Conservativas

[0139] Em certas modalidades, um anticorpo da invenção tem umaregião variável de cadeia longa compreendendo sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 e uma região variável de cadeia curta compreendendo sequências de CDR1, CDR2 e CDR3, em que uma ou mais destas sequências de CDR especificaram sequências de aminoácidos baseadas nos anticorpos descritos neste pedido ou modificações conservativas dos mesmos, e em que os anticorpos conservam as propriedades funcionais desejadas dos anticorpos de ligação à C5 da invenção. Consequentemente, a invenção fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou fragmento funcional de ligação a antígeno do mesmo, consistindo de uma região variável de cadeia longa compreendendo sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 e uma região variável de cadeia curta compreendendo sequências de CDR1, CDR2 e CDR3, em que: as sequências de aminoácidos de CDR1 da região variável de cadeia longa são selecionadas a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 1, 17, 33, 61, 131, 145, 159, 173, 195 e 235, e modificações conservativas das mesmas; as sequências de aminoácidos de CDR2 da região variável de cadeia longa são selecionadas a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 49, 62, 77, 95, 107, 113, 119, 132, 146, 160, 174, 196, 226 e 236, e modificações conservativas das mesmas; as sequências de aminoácidos de CDR3 da região variável de cadeia longa são selecionadas a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 3, 19, 35, 63, 133, 147, 161, 175, 197 e 237, e modificações conserva- tivas das mesmas; as sequências de aminoácidos de CDR1 das regiões variáveis de cadeia curta são selecionadas a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 4, 20, 36, 64, 134, 148, 162, 176, 198 e 238, e modificações conservativas das mesmas; as sequências de aminoá- cidos de CDR2 das regiões variáveis de cadeia curta são selecionadas a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 5, 21, 37, 65, 135, 149, 163, 177, 199 e 239, e modificações conservativas das mesmas; as sequências de aminoácidos de CDR3 das regiões variáveis de cadeia curta são selecionadas a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 6, 22, 38, 50, 66, 78, 89, 101, 120, 136, 150, 164, 178, 200, 209 e 240, e modificações conservativas das mesmas; o anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo que especificamente se liga à C5, e inibe a lise de célula vermelha sanguínea em um ensaio hemolítico como descrito neste pedido.

[0140] Em outras modalidades, um anticorpo da invenção otimizado para a expressão em uma célula mamífera tem uma sequência de cadeia longa de extensão completa e uma sequência de cadeia curta de extensão completa, em que uma ou mais destas sequências especificaram sequências de aminoácidos baseadas nos anticorpos descritos neste pedido ou modificações conservativas dos mesmos, e em que os anticorpos conservam as propriedades funcionais desejadas dos anticorpos de ligação à C5 da invenção. Consequentemente, a invenção fornece um anticorpo monoclonal isolado otimizado para a expressão em uma célula mamífera consistindo em uma cadeia longa de extensão completa e uma cadeia curta de extensão completa em que: a cadeia longa de extensão completa tem sequências de aminoá- cidos selecionadas do grupo das SEQ ID NOs:: 9, 25, 41, 53, 69, 81, 97, 109, 115, 123, 139, 153, 167, 181, 189, 203, 212, 220, 229, 243, 249, 254, 258, 274, 278 e 282, e modificações conservativas das mesmas; e a cadeia curta de extensão completa tem sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo das SEQ ID NOs: 10, 26, 42, 54, 70, 82, 91, 103, 124, 140, 154, 168, 182, 190, 204, 213, 221, 230, 244, 251, 262, 266, 270, 286 e 290, e modificações conservativas das mesmas; o anticorpo especificamente liga-se à C5 (por exemplo, C5 humana e/ou de cinomolgus); e o anticorpo inibe a lise de célula vermelha sanguínea em um ensaio hemolítico como descrito neste pedido. Em uma modalidade específica, tais anticorpos têm um valor de IC50 em um ensaio hemolítico de 20 a 200 pM usando soro deple- tado de C5 humana que é reconstituído com C5 humana 100 pM.

Anticorpos Que se Ligam ao Mesmo Epítopo

[0141] A presente invenção fornece anticorpos que se ligam aomesmo epítopo como fazem os anticorpos de ligação à C5 descritos na Tabela 1. Anticorpos adicionais, por isso, podem ser identificados com base em sua capacidade de competição cruzada (por exemplo, inibir competitivamente a ligação, de uma maneira estatisticamente significante) com outros anticorpos da invenção em ensaios de ligação à C5. A capacidade de um anticorpo teste de inibir a ligação de anticorpos da presente invenção a uma proteína C5 (por exemplo, C5 humana e/ou de cinomolgus) demonstra que o anticorpo teste pode competir com aquele anticorpo por ligação à C5; tal anticorpo, de acordo com a teoria não limitante, pode se ligar ao mesmo ou um epí- topo relacionado (por exemplo, um similar estruturalmente ou espaci- almente próximo) na proteína C5 como o anticorpo com o qual compete. Em certa modalidade, o anticorpo que se liga ao mesmo epítopo em C5 que os anticorpos da presente invenção é um anticorpo monoclonal humano. Tais anticorpos monoclonais humanos podem ser preparados e isolados como descrito neste pedido.

nticorpos Engendrados e Modificados

[0142] Um anticorpo da invenção pode ainda ser preparado usando um anticorpo tendo uma ou mais das de sequências de VH e/ou VL mostradas neste pedido como material inicial para engendrar um anticorpo modificado, anticorpo modificado o qual pode ter propriedades do anticorpo inicial alteradas. Um anticorpo pode ser engenheirado pela modificação de um ou mais resíduos dentro de uma ou ambas regiões variáveis (isto é, VH e/ou VL), por exemplo, dentro de uma ou mais regiões CDR e/ou dentro de uma ou mais regiões conservadas. Adicionalmente ou alternativamente, um anticorpo pode ser engenhei- rado pela modificação de resíduos dentro da região(ões) constante(s), por exemplo, para alterar a função(ões) efetora(s) do anticorpo.

[0143] Um tipo de engenharia de região variável que pode ser realizada é o enxerto de CDR. Anticorpos interagem com antígenos alvo predominantemente por resíduos de aminoácido que estão localizados nas seis regiões de determinação de complementaridade de cadeia longa e leve (CDRs). Por essa razão, as sequências de aminoácidos dentro das CDRs são mais diversas entre anticorpos individuais do que sequências de fora das CDRs. Como as sequências de CDR são responsáveis pela maioria das interações anticorpo-antígeno, é possível expressar anticorpos recombinantes que mimetizam as propriedades de anticorpos específicos de ocorrência natural pela construção de vetores de expressão que incluem sequências de CDR do anticorpo específico de ocorrência natural enxertado nas sequências de região conservada de um anticorpo diferente com propriedades diferentes (vide, por exemplo, Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323-327; Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522-525; Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad., U.S.A. 86:10029-10033; Patente U.S. No. 5.225.539 por Winter e Patentes Americanas Nos. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 por Queen et al.)

[0144] Consequentemente, outra modalidade da invenção pertence a um anticorpo monoclonal isolado, ou fragmento de ligação a antí- geno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia longa compreendendo sequências de CDR1 tendo uma sequência de ami- noácidos selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 1, 17, 33, 61, 131, 145, 159, 173, 195 e 235; sequências de CDR2 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 49, 62, 77, 95, 107, 113, 119, 132, 146, 160, 174, 196, 226 e 236; sequências de CDR3 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 3, 19, 35, 63, 133, 147, 161, 175, 197 e 237, respectivamente; e uma região variável de cadeia curta tendo sequências de CDR1 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 4, 20, 36, 64, 134, 148, 162, 176, 198 e 238; sequências de CDR2 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 5, 21, 37, 65, 135, 149, 163, 177, 199 e 239; e sequências de CDR3 consistindo de uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 6, 22, 38, 50, 66, 78, 89, 101, 120, 136, 150, 164, 178, 200, 209 e 240, respectivamente. Dessa forma, tais anticorpos contêm sequências de CDR de VH e VL dos anticorpos monoclo- nais, podem ainda conter sequências de região conservada diferentes destes anticorpos.

[0145] Tais sequências de região conservada podem ser obtidasde bancos de dados de DNA públicos ou referências publicadas que incluem sequências gênicas de anticorpo de linhagem germinativa. Por exemplo, sequências de DNA de linhagem germinativa para genes de região variável de cadeia longa e leve humana podem ser achadas no banco de dados de sequência de linhagem germinativa humana "VBa- se" (disponíveis na Internet em www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), bem como em Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication N. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al., 1992 J. P. Biol. 227:776-798; e Cox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836; os conteúdos de cada um dos quais são expressamente incorporados neste pedido por referência.

[0146] Um exemplo de sequências de região conservada para usonos anticorpos da invenção são aquelas que são estruturalmente similares às sequências de região conservada usadas por anticorpos selecionados da invenção, por exemplo, sequências consenso e/ou sequências de região conservada usadas por anticorpos monoclonais da invenção. As sequências CDR1, 2 e 3 de VH e as sequências de CDR1, 2 e 3 de VL, podem ser enxertadas em regiões conservadas que têm sequência idêntica àquela encontrada no gene de imunoglobulina de linhagem germinativa de que a sequência de região conservada deriva, ou as sequências de CDR podem ser enxertadas nas regiões conservadas que contêm uma ou mais mutações quando comparadas às sequências de linhagem germinativa. Por exemplo, foi encontrado que em certos exemplos é benéfico mutar resíduos dentro das regiões conservadas para manter ou aumentar a capacidade de ligação do anticorpo ao antígeno (vide, por exemplo, Patentes Americanas Nos 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 por Queen e al).

[0147] Outro tipo de modificação de região variável é a mutaçãode resíduos de aminoácido dentro de regiões CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de VH e/ou VL para melhorar por meio disso uma ou mais proprieda- des de ligação (por exemplo, afinidade) do anticorpo de interesse, conhecido como "maturação por afinidade". Mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese mediada por PCR podem ser realizadas para introduzir mutação(ões) e o efeito sobre a ligação do anticorpo, ou outra propriedade funcional de interesse, podem ser avaliadas por ensaios in vitro ou in vivo como descrito neste pedido e fornecido nos Exemplos. Modificações conservativas (como discutido acima) podem ser introduzidas. As mutações podem ser substituições, adições ou deleções de amino- ácidos. Além disso, tipicamente não mais do que um, dois, três, quatro ou cinco resíduos dentro de uma região CDR são alterados.

[0148] Consequentemente, em outra modalidade, a invenção fornece anticorpos monoclonais de ligação à C5 isolados, ou fragmento de ligação a antígeno dos mesmos, consistindo em uma região variável de cadeia longa tendo: uma região VH de CDR1 consistindo de uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo tendo SEQ ID NOs: 1, 17, 33, 61, 131, 145, 159, 173, 195 e 235 ou uma sequência de aminoácidos tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos quando comparada às SEQ ID NOs: 1, 17, 33, 61, 131, 145, 159, 173, 195 e 235; uma região de VH de CDR2 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 49, 62, 77, 95, 107, 113, 119, 132, 146, 160, 174, 196, 226 e 236, ou uma sequência de aminoácidos tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos quando comparada às SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 49, 62, 77, 95, 107, 113, 119, 132, 146, 160, 174, 196, 226 e 236; uma região de VH de CDR3 tendo uma sequência de ami- noácidos selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 3, 19, 35, 63, 133, 147, 161, 175, 197 e 237, ou uma sequência de aminoácidos tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, de- leções ou adições de aminoácidos quando comparada às SEQ ID NOs: 3, 19, 35, 63, 133, 147, 161, 175, 197 e 237; uma região de VL de CDR1 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 4, 20, 36, 64, 134, 148, 162, 176, 198 e 238, ou uma sequência de aminoácidos tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoáci- dos quando comparada às SEQ ID NOs: 4, 20, 36, 64, 134, 148, 162, 176, 198 e 238; uma região de VL de CDR2 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 5, 21, 37, 65, 135, 149, 163, 177, 199 e 239, ou uma sequência de aminoácidos tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos quando comparada às SEQ ID NOs: 5, 21, 37, 65, 135, 149, 163, 177, 199 e 239; e uma região de VL de CDR3 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 6, 22, 38, 50, 66, 78, 89, 101, 120, 136, 150, 164, 178, 200, 209 e 240, ou uma sequência de amino- ácidos tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos quando comparada às SEQ ID NOs: 6, 22, 38, 50, 66, 78, 89, 101, 120, 136, 150, 164, 178, 200, 209 e 240.Enxerto de Domínios de Ligação a Antígeno em Regiões Conservadas ou Proteínas Estruturais Alternativas

[0149] Uma larga variedade de regiões conservadas de anticorpo /imunoglobulina ou proteínas estruturais pode ser empregada contanto que o polipeptídeo resultante inclua pelo menos uma região de ligação que se liga especificamente à C5. Tais regiões conservadas ou proteínas estruturais incluem 5 idiotipos principais de imunoglobulinas humanas, ou fragmentos das mesmas, e incluem imunoglobulinas de outras espécies animais, preferencialmente tendo aspectos humanizados. Anticorpos de cadeia longa única, tais como aqueles identificados em camelídeos têm interesse particular neste sentido. Regiões conservadas, proteínas estruturais e novos fragmentos continuam sendo verificados e desenvolvidos pelos versados na técnica.

[0150] Em um aspecto, a invenção pertence à geração dos anticorpos com base em não-imunoglobulina usando proteínas estruturais não-imunoglobulina nas quais as CDRs da invenção podem ser enxertadas. Regiões conservadas não-imunoglobulina e proteínas estruturais conhecidas ou futuras podem ser empregadas, enquanto compreendem uma região de ligação específica à proteína-alvo C5 (por exemplo, C5 humana e/ou de cinomolgus). Regiões conservadas não- imunoglobulina ou proteínas estruturais conhecidas incluem, mas não são limitadas a, fibronectina (Compound Therapeutics, Inc, Waltham, MA), anquirina (Molecular Partners AG, Zurich, Suíça), anticorpos de domínio (Domantis, Ltd., Cambridge, MA, e Ablynx nv, Zwijnaarde, Bélgica), lipocalina (Pieris Proteolab AG, Freising, Alemanha), pequenos imunofarmacêuticos modulares (Trubion Pharmaceuticals Inc, Seattle, WA), maxicorpos (Avidia, Inc. Mountain View, CA), Proteína A (Affibody AG, Suécia), e afilina (gama-cristalina ou ubiquitina) (Scil Proteins GmbH, Halle, Alemanha).

[0151] As proteínas estruturais de fibronectina são baseadas nodomínio de fibronectina tipo III (por exemplo, o décimo módulo de fi- bronectina tipo III (domínio 10 Fn3)). O domínio de fibronectina tipo III tem 7 ou 8 fitas beta que são distribuídas entre duas folhas beta, que se enovelam para formar o núcleo da proteína, e contendo alças adicionais (análogas a CDRs) que unem as fitas beta entre si e são expostas a solventes. Há pelo menos três tais alças em cada borda do sanduíche de folha beta, onde a borda é o limite da proteína perpendicular à direção das fitas beta (vide US 6.818.418). Estas proteínas estruturais com base em fibronectina não são uma imunoglobulina, embora todas as alças estejam estritamente relacionadas àquelas do fragmen-to de anticorpo funcional menor, a região variável da cadeia longa, que compreende a unidade de reconhecimento de antígeno inteira em IgG de camelo e lhama. Por causa desta estrutura, o anticorpo não- imunoglobulina mimetiza as propriedades de ligação ao antígeno que são similares em natureza e afinidade àquelas de anticorpos. Estas proteínas estruturais podem ser usadas em uma estratégia de rando- mização de alça e mistura in vitro que é similar ao processo de maturação por afinidade de anticorpos in vivo. Estas moléculas com base em fibronectina podem ser usadas como proteínas estruturais onde as regiões de alça da molécula podem ser substituídas por CDRs da invenção usando técnicas de clonagem padrão.

[0152] A tecnologia de anquirina é baseada na utilização de proteínas com módulos repetidos derivados de anquirina como proteínas estruturais para carregar regiões variáveis que podem ser usadas para ligação a diferentes alvos. O módulo de repetição de anquirina é um polipeptídeo de 33 aminoácidos consistindo de duas a-hélices antipa- ralelas e uma ligação entre folhas β. A ligação das regiões variáveis é na maior parte otimizada pelo uso de exibição de ribossomo.

[0153] Avímeros são derivados da proteína contendo domínio Anatural, tal como LRP-1. Estes domínios são usados pela natureza de interações proteína-proteína e em ser humano mais de 250 proteínas são estruturalmente baseadas em domínios A. Avímeros consistem em diversos monômeros de "domínio A" diferentes (2 a 10) ligados através de ligantes de aminoácido. Avímeros podem ser criados de tal modo que podem se ligar ao antígeno alvo usando a metodologia descrita em, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente U.S. Nos 20040175756; 20050053973; 20050048512; e 20060008844.

[0154] Ligantes de afinidade Affibody são proteínas pequenas,simples compostas de um pacote de três hélices com base na proteína estrutural de um dos domínios de IgG de ligação à Proteína A. Proteína A é uma proteína de superfície da bactéria Staphylococcus aureus. Este domínio de proteína estrutural consiste em 58 aminoácidos, 13 dos quais são randomizados para gerar bibliotecas de affibody com um grande número de variantes de ligante (Vide, por exemplo, US 5.831.012). Moléculas de Affibody mimetizam anticorpos, têm um peso molecular de 6 kDa, comparadas ao peso molecular de anticorpos, que é de 150 kDa. Apesar de seu pequeno tamanho, o sítio de ligação de moléculas affibody é similar àquele de um anticorpo.

[0155] Anticalinas são produtos desenvolvidos pela companhiaPieris ProteoLab AG. São derivadas de lipocalinas, um grupo comum de pequenas e robustas proteínas que normalmente estão envolvidas no transporte fisiológico ou armazenamento de compostos quimicamente sensíveis ou insolúveis. Várias lipocalinas naturais ocorrem em tecidos ou líquidos do corpo humano. A arquitetura proteica lembra imunoglobulinas, com alças hipervariáveis sobre uma região conservada rígida. Entretanto, em contraste com anticorpos ou seus fragmentos recombinantes, lipocalinas são compostas de uma cadeia polipep- tídica única com 160 a 180 resíduos de aminoácido, sendo então marginalmente maiores do que um domínio único de imunoglobulina. O conjunto de quatro alças, que compõe a bolsa de ligação, mostra plasticidade estrutural pronunciada e tolera uma variedade de cadeias laterais. O sítio de ligação pode ser dessa forma reformado em um processo proprietário a fim de reconhecer moléculas alvo prescritas de forma diferente com alta afinidade e especificidade. Uma proteína da família de lipocalina, a proteína de ligação à bilina (BBP) de Pieris Brassicae foi usada para desenvolver anticalinas por mutagenização do conjunto de quatro alças. Um exemplo de um pedido de patente que descreve anticalinas está na Publicação de PCT No WO 199916873.

[0156] Moléculas de afilina são pequenas proteínas não-imunoglobulina que são desenhadas para afinidades específicas em direção a proteínas e pequenas moléculas. Novas moléculas de afilina podem ser muito rapidamente selecionadas de duas bibliotecas, cada uma das quais é baseada em uma proteína estrutural humana derivada diferente. Moléculas de afilina não mostram nenhuma homologia estrutural a proteínas imunoglobulina. Atualmente, duas proteínas estruturais de afilina são empregadas, uma das quais é gama cristalina, uma proteína estrutural humana de lente ocular e a outra são proteínas da superfamília "ubiquitina". Ambas proteínas estruturais humanas são muito pequenas, mostram alta estabilidade de temperatura já que são quase resistentes a modificações de pH e agentes desnaturantes. Esta alta estabilidade é principalmente devida à estrutura de folha beta estendida das proteínas. Exemplos de proteínas gama cristalinas derivadas são descritos no WO200104144 e exemplos de proteínas "similares a ubiquitina" são descritos no WO2004106368.

[0157] Miméticos de epítopo proteico (PEM) são moléculas de tamanho médio, cíclicas, similares a um peptídeo (PM 1 a 2kDa) mimeti- zando o grampo-beta das estruturas secundárias das proteínas, a estrutura secundária principal envolvida em interações proteína-proteína.

[0158] Em algumas modalidades, os Fabs são convertidos no formato IgG1 silenciosa pela modificação da região Fc. Por exemplo, os anticorpos 6525-7910 na Tabela 1 podem ser convertidos no formato de IgG1 silenciosa pela substituição do "X" nas sequências de amino- ácidos da cadeia longa por:CDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV- DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS-TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- KGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN- VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 293)e substituição do "X" na sequência de aminoácidos da cadeia curta por: CS se a cadeia curta for lambda, ou C se a cadeia curta for capa. Como usado neste pedido, uma "IgG1 silenciosa" é uma sequência Fc de IgG1 na qual a sequência de aminoácidos foi alterada para reduzir as funções efetoras mediadas por Fc (por exemplo, ADCC e/ou CDC). Tal anticorpo terá tipicamente reduzido a ligação a receptores Fc e/ou C1q.

[0159] Em algumas outras modalidades, os Fabs são convertidosno formato de IgG2. Por exemplo, os anticorpos 6525-7910 na Tabela 1 podem ser convertidos no formato de IgG2 pela substituição da sequência constanteASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL- TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT- KVDKKVEPKSX (SEQ ID NO: 294)com a sequência constante da cadeia longa de IgG2:ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL- TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNT- KVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNST- FRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPRE- PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN- VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 295)e substituição do "X" na sequência de aminoácidos da cadeia curta por CS se a cadeia curta for lambda, ou C se a cadeia curta for capa.Anticorpos humanos ou humanizados

[0160] A presente invenção fornece anticorpos totalmente humanos que especificamente se ligam a uma proteína C5 (por exemplo, C5 de ser humano e/ou de cinomolgus). Comparados aos anticorpos quiméricos ou humanizados, os anticorpos de ligação à C5 de ser humano da invenção reduziram ainda a antigenicidade sob administração a indivíduos humanos.

[0161] Os anticorpos de ligação à C5 de ser humano podem sergerados usando métodos que são conhecidos na técnica. Por exemplo, a tecnologia de humanização usada para conversão de anticorpos não humanos em anticorpos humanos engenheirados. A Publicação de Patente U.S. No. 20050008625 descreve um método in vivo para substituir uma região variável de anticorpo não humano por uma região variável humana em um anticorpo mantendo as mesmas ou fornecendo características de ligação melhores em relação àquelas do anticorpo não humano. O método depende da substituição direcionada de epítopo de regiões variáveis de um anticorpo de referência não humano por um anticorpo totalmente humano. O anticorpo humano resultante é geralmente não estruturalmente relacionado ao anticorpo não humano de referência, mas liga-se ao mesmo epítopo no mesmo antíge- no que o anticorpo de referência. Resumidamente, a abordagem de substituição de complementaridade direcionada pelo epítopo serial é permitida pela configuração de uma competição em células entre "um competidor" e uma biblioteca de diversos híbridos do anticorpo de referência ("anticorpos de teste") para ligação às limitadas quantidades do antígeno na presença de um sistema repórter que responde à ligação do anticorpo de teste ao antígeno. O competidor pode ser o anticorpo de referência ou derivado do mesmo, tal como um fragmento Fv de cadeia única. O competidor também pode ser um ligante natural ou artificial do antígeno que se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência. As únicas exigências do competidor consistem em que ele se ligue ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência, e que com-pita com o anticorpo de referência pela ligação ao antígeno. Os anticorpos de teste têm uma região V de ligação a antígeno em comum com o anticorpo de referência não humano, e outra região V selecionada randomicamente de uma fonte diversa, tal como uma biblioteca de repertório de anticorpos humanos. A região V comum do anticorpo de referência serve como um guia, posicionando os anticorpos de teste sobre o mesmo epítopo no antígeno, e na mesma orientação, de forma que a seleção seja influenciada em direção à fidelidade de ligação a antígeno mais alta no anticorpo de referência.

[0162] Muitos tipos de sistema repórter podem ser usados paradetectar interações desejadas entre anticorpos de teste e antígeno. Por exemplo, fragmentos repórteres de complemento podem ser ligados ao antígeno e anticorpo de teste, respectivamente, para que a ativação do repórter pela complementação de fragmento somente ocorra quando o anticorpo de teste se ligue ao antígeno. Quando as fusões de fragmento de anticorpo- e antígeno repórter de teste são coexpres- sos com um competidor, ativação do repórter torna-se dependente da capacidade do anticorpo de teste de competir com o competidor, que é proporcional à afinidade do anticorpo de teste pelo antígeno. Outros sistemas repórter que podem ser usados incluem o reativador de um sistema de reativação de repórter autoinibido (RAIR) como revelado no Pedido de Patente U.S. No. de Série 10/208.730 (Publicação No.20030198971), ou sistema de ativação competitivo descrito no Pedido de Patente U.S. No. de Série 10/076.845 (Publicação N.20030157579).

[0163] Com o sistema de substituição de complementaridade guiado por epítopo serial, seleção é feita para identificar células expressas em um anticorpo de teste único junto com o competidor, antígeno e componentes repórteres. Nestas células, cada anticorpo de teste compete um a um com o competidor por ligação a uma quantidade restritiva de antígeno. A atividade do repórter é proporcional à quantidade de antígeno ligado ao anticorpo de teste, que por sua vez é proporcional à afinidade do anticorpo de teste ao antígeno e à estabilidade do anticorpo de teste. Anticorpos de teste são inicialmente selecionados com base em sua atividade em relação àquela do anticorpo de referência quando expresso como o anticorpo de teste. O resultado do primeiro ciclo de seleção é o grupo de anticorpos "híbridos", cada um dos quais é compreendido da mesma região V não humana do anticorpo de referência e uma região V humana da biblioteca, e cada um do quais se liga ao mesmo epítopo no antígeno que o anticorpo de referência. Um ou mais anticorpos híbridos selecionados no primeiro ciclo terá uma afinidade pelo antígeno comparável ou maior que aquela do anticorpo de referência.

[0164] Na segunda etapa de substituição da região V, as regiões Vhumanas selecionadas na primeira etapa são usadas como guia para a seleção de substituições humanas da região V do anticorpo de referência não humano restante com uma biblioteca diversa de regiões V humanas cognatas. Os anticorpos híbridos selecionados na primeira etapa também podem ser usados como concorrentes da segunda etapa de seleção. O resultado da segunda etapa de seleção é um conjunto de anticorpos totalmente humanos que se diferenciam estruturalmente do anticorpo de referência, mas que competem com o anticorpo de referência por ligação ao mesmo antígeno. Alguns anticorpos humanos selecionados ligam-se ao mesmo epítopo no mesmo antígeno que o anticorpo de referência. Entre estes anticorpos humanos selecionados, um ou mais se ligam ao mesmo epítopo com uma afinidade que é comparável ou maior que aquela do anticorpo de referência.

[0165] Usando um dos anticorpos de ligação à C5 de camundongoou quimérico descritos acima como o anticorpo de referência, este método pode ser prontamente empregado para gerar anticorpos humanos que se ligam à C5 de ser humano com a mesma especificidade de ligação e a mesma, ou melhor, afinidade de ligação. Além disso, tais anticorpos de ligação à C5 de ser humano também podem ser comercialmente obtidos de companhias que habitualmente produzem anticorpos humanos, por exemplo, KaloBios, Inc (Mountain View, CA). Anticorpos camelídeos

[0166] Proteínas de anticorpo obtidas de membros da família docamelo e dromedário (Camelus bactrianus e Camelus dromaderius) incluindo membros do novo mundo, tais como espécies de lhama (Lama paccos, Lama glama e Lama vicugna) têm sido caracterizadas com relação a tamanho, complexidade estrutural e antigenicidade para indivíduos humanos. Certos anticorpos IgG desta família de mamíferos como encontrados na natureza sem cadeias curtas, e são dessa forma estruturalmente distintos da estrutura de quatro cadeias quaternárias típicas tendo duas cadeias longas e duas curtas, dos anticorpos de outros animais. Vide PCT/EP93/02214 (WO 94/04678 publicado em 3 de março de 1994).

[0167] Uma região do anticorpo camelídeo que é o pequeno domínio variável único identificado como VHH pode ser obtida por engenharia genética para produzir uma pequena proteína que tem alta afinidade por um alvo, resultando em uma proteína de baixo peso molecular derivada do anticorpo conhecida como um "nanocorpo camelídeo". Vide Patente U.S. número 5.759.808 emitida em 2 de junho de 1998; vide também Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261; Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger, M. et al. 2003 Bioconjugate Chem 14: 440-448; Cortez-Retamozo, V. et al. 2002 Int J Cancer 89: 456-62; e Lauwereys, M. et al. 1998 EMBO J 17: 3512-3520. Bibliotecas engenheiradas de anticorpos camelídeos e fragmentos de anticorpo estão comercialmente disponíveis, por exemplo, em Ablynx, Gante, Bélgica. Como outros anticorpos de origem não humana, uma sequência de aminoácidos de um anticorpo camelídeo pode ser recombinantemente alterada para obtenção de uma sequência que mais estritamente se pareça com uma sequência humana, isto é, o nanocorpo pode ser "humanizado". Dessa forma a baixa antigeni- cidade natural de anticorpos camelídeos para seres humanos pode ser ainda reduzida.

[0168] O nanocorpo camelídeo tem um peso molecular aproximadamente um décimo daquele de uma molécula de IgG humana, e a proteína tem um diâmetro físico de somente alguns nanômetros. Uma consequência do pequeno tamanho é a capacidade de nanocorpos camelídeos de se ligar a sítios antigênicos que são funcionalmente invisíveis para proteínas de anticorpo maiores, isto é, nanocorpos camelídeos são úteis como reagentes que detectam antígenos que são de outra maneira crípticos usando técnicas imunológicas clássicas, e como possíveis agentes terapêuticos. Dessa forma, outra consequência do pequeno tamanho é que um nanocorpo camelídeo pode inibir em consequência da ligação a um sítio específico em uma ranhura ou fissura estreita de uma proteína-alvo, e por isso pode servir em uma ca-pacidade que mais estritamente se parece com a função de um fárma- co clássico de baixo peso molecular do que aquela de um anticorpo clássico.

[0169] O baixo peso molecular e o tamanho compacto resultamainda em nanocorpos camelídeos que são extremamente termoestá- veis, estáveis ao pH extremo e à digestão proteolítica, e pobremente antigênico. Outra consequência é que os nanocorpos camelídeos prontamente se movem do sistema circulatório para o interior de tecidos, e até cruzam a barreira hematoencefálica e podem tratar desordens que afetam o tecido nervoso. Nanocorpos podem ainda facilitar o transporte de fármaco através da barreira hematoencefálica. Vide Pedido de Patente U.S. 20040161738 publicado em 19 de agosto de 2004. Estas características combinadas com baixa antigenicidade para humanos indicam grande potencial terapêutico. Além disso, estas moléculas podem ser totalmente expressas em células procarióticas, tais como E. coli e são expressas como proteínas de fusão com bacterió- fago e são funcionais.

[0170] Consequentemente, uma característica da presente invenção é um anticorpo camelídeo ou nanocorpo que tem alta afinidade à C5. Em certas modalidades neste pedido, o anticorpo camelídeo ou nanocorpo é naturalmente produzido no animal camelídeo, isto é, é produzido pela imunização camelídea com C5 ou um fragmento peptí- dico da mesma, usando técnicas descritas neste pedido para outros anticorpos. Alternativamente, o nanocorpo camelídeo de ligação à C5 é engenheirado, isto é, produzido pela seleção, por exemplo, de uma biblioteca de fago expondo proteínas de nanocorpo camelídeo muta- genizado apropriadamente usando procedimentos de separação com C5 como um alvo como descrito nos exemplos neste pedido. Nano- corpos engenheirados podem ser ainda construídos por engenharia genética para ter meia-vida em um indivíduo recipiente de 45 minutos a duas semanas. Em uma modalidade específica, o anticorpo camelí-deo ou nanocorpo é obtido pelo enxerto das sequências de CDRs da cadeia longa ou curta dos anticorpos humanos da invenção no nano- corpo ou sequências de estrutura de anticorpo de domínio único, como descrito, por exemplo, em PCT/EP93/02214.Moléculas Biespecíficas e Anticorpos Multivalentes

[0171] Em outro aspecto, a presente invenção caracteriza moléculas biespecíficas ou multiespecíficas compreendendo um anticorpo de ligação à C5, ou fragmento do mesmo, da invenção. Um anticorpo da invenção, ou regiões de ligação a antígeno do mesmo, pode ser derivado ou ligado à outra molécula funcional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína (por exemplo, outro anticorpo ou ligante de um receptor) para gerar uma molécula biespecífica que se liga a pelo menos dois sítios de ligação ou moléculas alvo diferentes. O anticorpo da invenção pode ser de fato derivado ou ligado a mais de uma molécula funcional para gerar moléculas multiespecíficas que se ligam a mais de dois sítios de ligação e/ou moléculas alvo diferentes; tais moléculas multies- pecíficas também são destinadas a ser englobadas pelo termo "molécula biespecífica" como usado neste pedido. Para criar uma molécula biespecífica da invenção, um anticorpo da invenção pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, por acoplamento químico, fusão genética, ligação não covalente ou de outra maneira) a uma ou outras moléculas de ligação, tais como outro anticorpo, fragmento de anticorpo, peptídeo ou mimético de ligação, tal que resulte em uma molécula bi- específica.

[0172] Consequentemente, a presente invenção inclui moléculasbiespecíficas compreendendo pelo menos uma primeira especificidade de ligação à C5 e uma segunda especificidade de ligação a um segundo epítopo-alvo. Por exemplo, o segundo epítopo-alvo é outro epí- topo de C5 diferente do primeiro epítopo-alvo.

[0173] Adicionalmente, para a invenção na qual a molécula bies-pecífica é multiespecífica, a molécula pode incluir ainda uma terceira especificidade de ligação, além do primeiro e do segundo epítopos- alvo.

[0174] Em uma modalidade, as moléculas biespecíficas da invenção compreendem como uma especificidade de ligação pelo menos um anticorpo, ou fragmento de anticorpo do mesmo, incluindo, por exemplo, um Fab, Fab', F(ab')2, Fv, ou Fv de cadeia única. O anticorpo também pode ser um dímero de cadeia curta ou cadeia longa, ou qualquer fragmento mínimo do mesmo, tal como um Fv ou um constru- to de cadeia única como descrito em Ladner et al. Patente U.S. No. 4.946.778.

[0175] Diacorpos são moléculas bivalentes, biespecíficas nasquais domínios de VH e VL são expressos em uma cadeia polipeptídi- ca única, unida por um ligante que é demasiado curto para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia. O par de domínios de VH e VL com domínios complementares de outra cadeia, por meio disso cria dois sítios de ligação a antígeno (vide, por exemplo, Holliger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak et al., 1994 Structure 2:1121-1123). Diacorpos podem ser produzidos expressando duas cadeias polipeptídicas com qualquer estrutura VHA- VLB e VHB-VLA (configuração VH-VL), ou VLA-VHB e VLB-VHA (configuração VL-VH) dentro da mesma célula. A maioria deles pode ser expressa na forma solúvel em bactérias. Diacorpos de cadeia única (scDb) são produzidos pela ligação de duas cadeias polipeptídicas formadoras de diacorpo com o ligante de aproximadamente 15 resíduos de aminoácido (vide Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45 (3-4):128-30; Wu et al. 1996 Immunotechnology, 2 (1):21-36). scDb pode ser expresso em bactérias em forma monoméri- ca solúvel ativa (vide Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Im- munother., 45 (34): 128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36; Pluckthun and Pack, 1997 Immunotechnology, 3 (2): 83-105; Ridgway et al., 1996 Protein Eng., 9 (7):617-21). Um diacorpo pode ser fusionado a Fc para gerar "um di-diacorpo" (vide Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279 (4):2856-65).

[0176] Outros anticorpos que podem ser empregados nas moléculas biespecíficas da invenção são anticorpos monoclonais murinos, quiméricos e humanizados.

[0177] As moléculas biespecíficas da presente invenção podemser preparadas pela conjugação das especificidades de ligação constituintes, usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, cada especificidade de ligação da molécula biespecífica pode ser gerada separadamente e então conjugada entre si. Quando as especificidades de ligação são proteínas ou peptídeos, uma variedade de agentes de acoplamento ou interligação pode ser usada para conjugação covalente. Exemplos de agentes de interligação incluem proteína A, carbodii- mida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis (ácido 2- nitrobenzoico) (DTNB), o-fenilenodimaleimido (oPDM), propionato de n-succinimidil-3- (2-piridilditio) (SPDP), e sulfossuccinimidil 4-(N- maleimidometil) ciclo-hexano-l-carboxilato de sulfossuccinimidila (sul- fo-SMCC) (vide por exemplo, Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med.160:1686; Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Outros métodos incluem aqueles descritos em Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78,118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83), e Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375). Agentes de conjugação são SATA e sulfo-SMCC, ambos disponíveis em Pierce Chemical Co (Rockford, IL).

[0178] Quando as especificidades de ligação são anticorpos, podem ser conjugados pela ligação sulfidrila das regiões de dobradiça do C-terminal de duas cadeias longas. Em uma modalidade particular, a região de dobradiça é modificada para conter um número ímpar de resíduos sulfidrila, por exemplo, um, antes da conjugação.

[0179] Alternativamente, ambas as especificidades de ligação podem ser codificadas no mesmo vetor quando expressas e montadas na mesma célula hospedeira. Este método é particularmente útil onde a molécula biespecífica é um mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 ou ligante x proteína de fusão Fab. Uma molécula biespecífica da invenção pode ser uma molécula de cadeia única compreendendo um anticorpo de cadeia única e um determinante de ligação, ou uma molécula biespecífica de cadeia única compreendendo dois determinantes de ligação. Moléculas biespecíficas podem compreender pelo menos duas moléculas de cadeia única. Métodos para preparação de moléculas biespecíficas são descritos, por exemplo, na Patente U.S. No. 5.260.203; Patente U.S. No. 5.455.030; Patente U.S. No. 4.881.175; Patente U.S. No. 5.132.405; Patente U.S. No. 5.091.513; Patente U.S. No. 5.476.786; Patente U.S. No. 5.013.653; Patente U.S. No. 5.258.498; e Patente U.S. No. 5.482.858.

[0180] Ligação das moléculas biespecíficas aos seus alvos específicos pode ser confirmada por, por exemplo, ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), radioimunoensaio (REA), análise por FACS, bioensaio (por exemplo, inibição de crescimento), ou ensaio de Western Blot. Cada um destes ensaios geralmente detecta a presença de complexos de anticorpo proteico de interesse particular pelo emprego de um reagente marcado (por exemplo, um anticorpo) específico para o complexo de interesse.

[0181] Em outro aspecto, a presente invenção fornece compostosmultivalentes que compreendem pelo menos duas porções de ligação a antígeno idênticas ou diferentes dos anticorpos de ligação de invenção à C5. As porções de ligação ao antígeno podem ser ligadas em conjunto através de fusão proteica ou ligação covalente ou não covalente. Alternativamente, métodos de ligação foram descritos para as moléculas biespecíficas. Compostos tetravalentes podem ser obtidos, por exemplo, por interligação dos anticorpos da invenção com um anticorpo que se liga às regiões constantes dos anticorpos da invenção, por exemplo, região de dobradiça ou Fc.

[0182] Domínio de trimerização é descrito, por exemplo, na patente EP Borean 1 012 280B1. Módulos de pentamerização são descritos, por exemplo, em PCT/EP97/05897.

Anticorpos com Meia-vida Estendida

[0183] A presente invenção fornece anticorpos que especificamente se ligam à proteína C5 tendo uma meia-vida estendida in vivo.

[0184] Muitos fatores podem afetar a meia-vida de uma proteína invivo. Por exemplo, filtração renal, metabolismo hepático, degradação por enzimas proteolíticas (proteases) e respostas imunogênicas (por exemplo, neutralização proteica por anticorpos e absorção por macrófa- gos e células dendríticas). Uma variedade de estratégias pode ser usada para estender a meia-vida dos anticorpos da presente invenção. Por exemplo, por ligação química a polietilenoglicol (PEG), reCODE PEG, estrutura de anticorpo, ácido polissiálico (PSA), hidroxietil amido (HES), ligantes de ligação à albumina e escudos de carboidrato; por fusão genética à ligação de proteínas a proteínas do soro, tais como albumina, IgG, FcRn, e transferência; por acoplamento (geneticamente ou quimicamente) a outras porções de ligação que se ligam a proteínas séricas, tais como nanocorpos, Fabs, DARPins, avímeros, affibodies e anticali- nas; por fusão genética a rPEG, albumina, domínio de albumina, proteínas de ligação à albumina e Fc; ou pela incorporação em nanoveículos, formulações de liberação lenta ou dispositivos médicos.

[0185] Para prolongar a circulação sérica de anticorpos in vivo,moléculas de polímero inerte, tais como PEG de alto peso molecular podem ser ligadas aos anticorpos ou a um fragmento dos mesmos com ou sem um ligante multifuncional por conjugação específica ao sítio do PEG ao N- ou C-terminal dos anticorpos ou através de grupos epsilon-amino presentes em resíduos lisina. Para peguilar um anticorpo, o anticorpo ou fragmento do mesmo tipicamente é reagido com polietilenoglicol (PEG), tal como um éster reativo ou derivado de aldeído de PEG, sob condições nas quais um ou mais grupos PEG ficam ligados ao anticorpo ou ao fragmento de anticorpo. A peguilação pode ser realizada por uma reação de acilação ou uma reação de alquilação com uma molécula de PEG reativa (ou um polímero solúvel em água reativo análogo). Como usado neste pedido, o termo "polietilenoglicol" é destinado a englobar qualquer uma das formas de PEG que têm sido usadas para derivar outras proteínas, tal como mono (C1-C10) alcóxi- ou arilóxi-polietilenoglicol ou maleimido polietilenoglicol. Em certas modalidades, o anticorpo a ser peguilado é um anticorpo aglicosilado. Derivatização de polímero linear ou ramificado que resulta em perda mínima da atividade biológica será usada. O grau de conjugação pode ser estritamente monitorado por SDS-PAGE e espectrometria de mas sa para assegurar a conjugação apropriada de moléculas de PEG aos anticorpos. PEG não reagido pode ser separado de conjugados anti- corpo-PEG por cromatografia por exclusão de tamanho ou por troca iônica. Anticorpos derivados de PEG podem ser testados para atividade de ligação bem como para eficácia in vivo usando métodos bem conhecidos por aqueles versados na técnica, por exemplo, por imuno- ensaios descritos neste pedido. Métodos para pegilação de proteínas são conhecidos na técnica e podem ser aplicados aos anticorpos da invenção. Vide, por exemplo, EP 0 154316 por Nishimura et al. e EP 0 401384 por Ishikawa et al.

[0186] Outras tecnologias de peguilação modificadas incluem tecnologia de engenharia ortogonal quimicamente dirigida de reconstituição (reCODE PEG), que incorpora cadeias laterais quimicamente especificadas em proteínas biossintéticas através de um sistema reconstituído que inclui tRNA e tRNA sintetase. Esta tecnologia permite a incorporação de mais de 30 novos aminoácidos em proteínas biossinté- ticas em células de E.coli, curtadura e mamíferas. O tRNA incorpora um aminoácido não nativo onde um códon âmbar é posicionado, convertendo o códon âmbar em um códon stop àqueles sinais de incorporação do aminoácido quimicamente especificado.

[0187] Tecnologia de peguilação recombinante (rPEG) tambémpode ser usada para a extensão de meia-vida sérica. Esta tecnologia envolve a fusão geneticamente da cauda proteica não estruturada de 300 a 600 aminoácidos a uma proteína farmacêutica existente. Como o peso molecular evidente de uma cadeia proteica quando não estruturada é aproximadamente 15 vezes maior que seu peso molecular real, a meia-vida sérica da proteína é muito aumentada. Em contraste com a PEGuilação tradicional, que requer conjugação química e repurifica- ção, o processo de fabricação é muito simplificado e o produto é homogêneo.

[0188] Polissialilação é outra tecnologia, que usa o polímero natural de ácido polissiálico (PSA) para prolongar a vida ativa e melhorar a estabilidade de peptídeos e proteínas terapêuticos. PSA é um polímero de ácido siálico (um açúcar). Quando usado em distribuição de proteína e fármaco peptídico terapêutico, ácido polissiálico fornece um microambiente protetor na conjugação. Isto aumenta a vida ativa da proteína terapêutica na circulação e o impede de ser reconhecido pelo sistema imune. O polímero de PSA é naturalmente encontrado no corpo humano. Foi adotado por certas bactérias que o desenvolveram ao longo de milhões de anos para recobrir suas paredes. Estas bactérias naturalmente polissialiladas foram então capazes, em virtude do mimetismo molecular, de evitar o sistema de defesa do corpo. PSA, tecnologia definitiva de invisibilidade da natureza, pode ser facilmente produzido a partir de tais bactérias em grandes quantidades e com características físicas predeterminadas. PSA bacteriano é completamente não imunogênico, mesmo quando acoplado a proteínas, já que é quimicamente idêntico ao PSA no corpo humano.

[0189] Outra tecnologia inclui o uso de derivados de hidroxietilamido ("HES") ligados a anticorpos. HES é um polímero natural modificado derivado do amido de milho ceroso e pode ser metabolizado pelas enzimas do corpo. Soluções de HES são normalmente administradas para substituir o volume de sangue deficiente e melhorar as propriedades reológicas do sangue. Hesilação de um anticorpo permite o prolongamento da meia-vida de circulação pelo aumento da estabilidade da molécula, bem como redução da depuração renal, resultando em uma atividade biológica aumentada. Variando parâmetros diferentes, tais como o peso molecular de HES, uma larga faixa de conjugados anticorpo HES pode ser construída.

[0190] Anticorpos tendo uma meia-vida aumentada in vivo tambémpodem ser gerados pela introdução de uma ou mais modificações de aminoácido (isto é, substituições, inserções ou deleções) em um domínio constante de IgG, ou fragmento de ligação a FcRn do mesmo (preferencialmente um Fc ou fragmento de domínio de Fc de dobradiça). Vide, por exemplo, Publicação Internacional No. WO 98/23289; Publicação Internacional No. WO 97/34631; e Patente U.S. No. 6.277.375.

[0191] Além disso, os anticorpos podem ser conjugados à albumina a fim de produzir o anticorpo ou fragmento de anticorpo in vivo mais estável ou tendo uma meia-vida mais longa in vivo. Técnicas são bem conhecidas na técnica, ver, por exemplo, Publicação Internacional Nos. WO 93/15199, WO 93/15200 e WO 01/77137; e Patente Europeia No. EP 413.622.

[0192] As estratégias para aumento da meia-vida são especialmente úteis em nanocorpos, ligantes baseados em fibronectina e outros anticorpos ou proteínas para os quais meia-vida aumentada in vivo é desejada.

Conjugados de Anticorpo

[0193] A presente invenção fornece anticorpos ou fragmentos dosmesmos que especificamente se ligam a uma proteína C5 recombi- nantemente fusionada ou quimicamente conjugada (tanto incluindo conjugações covalentes como não covalentes) a uma proteína ou poli- peptídeo heterólogo (ou fragmento do mesmo, preferencialmente a um polipeptídeo de pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90 ou pelo menos 100 aminoácidos) para gerar proteínas de fusão. Em particular, a invenção fornece proteínas de fusão que compreendem um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo descrito neste pedido (por exemplo, um fragmento Fab, fragmento de Fd, fragmento de Fv, fragmento de F(ab)2, um domínio de VH, uma CDR de VH, um domínio de VL ou uma CDR de VL) e uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo heterólogos. Métodos para fusão ou conjugação de proteínas, polipeptídeos, ou peptídeos a um anticorpo ou um fragmento de anticorpo são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Patentes U.S.s Nos. 5.336.603, 5.622.929, 5.359.046, 5.349.053,5.447.851, e 5.112.946; Patente Europeia Nos. EP 307.434 e EP 367.166; Publicação Internacional Nos. WO 96/04388 e WO 91/06570; Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539; Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600; e Vil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337 - 11341.

[0194] Proteínas de fusão adicionais podem ser geradas pelastécnicas de rearranjo de gene, rearranjo de motivo, rearranjo de éxon e/ou rearranjo de códon (coletivamente referido como "rearranjo de DNA"). Rearranjo de DNA pode ser empregado para alterar as atividades de anticorpos da invenção ou fragmentos dos mesmos (por exemplo, anticorpos ou fragmentos dos mesmos com afinidades maiores e taxas de dissociação menores). Vide, geralmente, Patentes U.S.s Nos. 5.605.793, 5.811.238, 5.830.721, 5.834.252, e 5.837.458; Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16 (2):76-82; Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:26576; e Lorenzo e Blasco, 1998, Biotechniques 24 (2):308-313 (cada uma destas patentes e publicações é por meio deste incorporada por referência em sua totalidade). Anticorpos ou fragmentos dos mesmos, ou anticorpos codificados ou fragmentos dos mesmos, podem ser alterados sendo submetidos à mutagênese randômica por PCR propensa a erros, inserção de nucleotídeo randômico ou outros métodos antes da recombinação. Um polinucleotídeo que codifica um anticorpo ou fragmento do mesmo que especificamente se liga a uma proteína C5 pode ser recombinado com um ou mais componentes, motivos, seções, partes, domínios, fragmentos, etc. de uma ou mais moléculas heterólogas.

[0195] Além disso, os anticorpos ou fragmentos dos mesmos podem ser fusionados a sequências marcadoras, tais como um peptídeo para facilitar purificação. Em modalidades preferenciais, a sequência marcadora de aminoácidos é um peptídeo hexa-histidina, tal como a marcação fornecida em um vetor pQE (QIAGEN, Inc, 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre outros, muitos dos quais estão comercialmente disponíveis. Como descrito em Gentz et al., 1989,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824, por exemplo, hexa-histidina fornece purificação adequada da proteína de fusão. Outras marcações peptídicas úteis para purificação incluem, mas não são limitadas a, a marcação de hemaglutinina ("HA"), que corresponde a um epítopo derivado da proteína hemaglutinina de influenza (Wilson et al., 1984, Cell 37:767), e a marcação "flag".

[0196] Em outras modalidades, anticorpos da presente invençãoou fragmentos dos mesmos conjugados a um agente diagnóstico ou detectável. Tais anticorpos podem ser úteis para o monitoramento ou prognóstico de início, desenvolvimento, progressão e/ou severidade de uma doença ou distúrbio como parte de um procedimento de teste clínico, tal como determinação da eficácia de uma terapia particular. Tal diagnóstico e detecção podem ser realizados pelo acoplamento do anticorpo a substâncias detectáveis incluindo, mas não limitadas a, várias enzimas, tais como, mas não limitadas a, peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, beta-galactosidase ou acetilcolinesterase; grupos prostéticos, tais como, mas não limitados a, estreptavidina- biotina e avidina/biotina; materiais fluorescentes, tais como, mas não limitados a, umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansila ou fico- eritrina; materiais luminescentes, tais como, mas não limitados a, lumi-nol; materiais bioluminescentes, tal como mas não limitados a, luciferase, luciferina e aequorina; materiais radioativos, tais como, mas não limitados a, iodo (131I, 125I, 123I, e 121I,), carbono (14C), enxofre (35S), trítio (3H), índio (115In, 113In, 112In e 111In,), tecnécio (99Tc), tálio (201Ti), gálio (68Ga, 67Ga), paládio (103Pd), molibdênio (99Mo), xenônio (133Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn e 117Tin; e metais emissores de pósitron usando várias tomografias de emissão de pósitron, e íons metálicos paramagnéticos não radioativos.

[0197] A presente invenção engloba ainda usos de anticorpos oufragmentos dos mesmos conjugados a uma porção terapêutica. Um anticorpo ou fragmento do mesmo pode ser conjugado a uma porção terapêutica, tal como uma citotoxina, por exemplo, um agente citostáti- co ou citocida, um agente terapêutico ou um íon metálico radioativo, por exemplo, alfa-emissores. Uma citotoxina ou agente citotóxico incluem qualquer agente que seja prejudicial para células.

[0198] Além disso, um anticorpo ou fragmento do mesmo pode serconjugado a uma porção terapêutica ou porção de fármaco que modifica uma dada resposta biológica. Porções terapêuticas ou porções de fármaco não devem ser interpretadas como limitadas a agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a porção de fármaco pode ser uma proteína, peptídeo, ou polipeptídeo que possui uma atividade biológica desejada. Tais proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina, tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, toxina colérica ou toxina diftérica; uma proteína, tal como fator de necrose tumoral, interferon-α, interferon-β, fator de crescimento do nervo, fator derivado de crescimento plaquetário, ativador de plasminogênio teci- dual, um agente apoptótico, um agente antiangiogênico; ou, um modificador de resposta biológica tal como, por exemplo, uma linfocina.

[0199] Além disso, um anticorpo pode ser conjugado a porçõesterapêuticas, tais como um íon metálico radioativo, tais como alfa- emissores, tais como 213Bi ou quelantes macrocíclicos úteis para conjugar íons radiometálicos, incluindo, mas não limitados a, 131In, 131LU, 131Y, 131Ho, 131Sm, a polipeptídeos. Em certas modalidades, o quelante macrocíclico é ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclododecano- N,N,N,N-tetra-acético (DOTA) que pode ser ligado ao anticorpo através de uma molécula ligantea. Tais moléculas liganteas são comu- mente conhecidas na técnica e descritas em Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4 (10):2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10 (4):553-7; e Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26 (8):943-50, cada um incorporado por referência em suas totalidades.

[0200] Técnicas para conjugação de porções terapêuticas a anticorpos são bem conhecidas, vide, por exemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", em Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", em Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", em Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", em Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985) e Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58.

[0201] Anticorpos também podem ser ligados a suportes sólidos,que são particularmente úteis para imunoensaios ou purificação do antígeno-alvo. Tais suportes sólidos incluem, mas não são limitados a, vidro, celulose, poliacrilamida, náilon, poliestireno, cloreto de polivinila ou polipropileno.

5.2. Métodos de Produção de Anticorpos da Invenção 5.2.1. Ácidos Nucleicos que Codificam os Anticorpos

[0202] A invenção fornece moléculas de ácidos nucleicos substancialmente purificadas que codificam polipeptídeos compreendendo segmentos ou domínios das cadeias de anticorpo de ligação à C5 descritas acima. Alguns ácidos nucleicos da invenção compreendem a sequência nucleotídica que codifica a região variável de cadeia longa mostrada na SEQ ID NO: 7, 23, 39, 51, 67, 79, 96, 108, 114, 121, 137, 151, 165, 179, 187, 201, 210, 218, 227, 241, 253, 257, 273, 277 ou 281, e/ou sequência nucleotídica que codifica a região variável de cadeia curta mostrada em SEQ ID NO: 8, 24, 40, 52, 68, 80, 90, 102, 122, 138, 152, 166, 180, 188, 202, 211, 219, 228, 242, 261, 265, 269, 285 ou 289. Em uma modalidade específica, as moléculas de ácidos nucleicos são aquelas identificadas na Tabela 1. Outras moléculas de ácidos nucleicos da invenção compreendem sequências nucleotídicas que são substancialmente idênticas (por exemplo, pelo menos 65, 80%, 95%, ou 99%) às sequências nucleotídicas daquelas identificados na Tabela 1. Quando expressos a partir de vetores de expressão apropriados, os polipeptídeos codificados por estes polinucleotídeos são capazes de exibir capacidade de ligação ao antígeno C5.

[0203] Também fornecidos na invenção são polinucleotídeos quecodificam pelo menos uma região CDR e normalmente as três regiões CDR da cadeia longa ou curta do anticorpo de ligação à C5 apresentado acima. Outros polinucleotídeos codificam toda ou substancialmente toda a sequência de região variável da cadeia longa e/ou cadeia curta do anticorpo de ligação à C5 apresentado acima. Por causa da degeneração do código, uma variedade de sequências de ácidos nucleicos codificará cada uma das sequências de aminoácidos da imunoglobulina.

[0204] As moléculas de ácidos nucleicos da invenção podem codificar tanto uma região variável como uma região constante do anticor- po. Algumas sequências de ácidos nucleicos da invenção compreendem nucleotídeos que codificam uma sequência de região variável de cadeia longa madura que é substancialmente idêntica (por exemplo, pelo menos 80%, 90% ou 99%) à sequência de região variável de cadeia longa madura apresentada na SEQ ID NO: 7, 23, 39, 51, 67, 79, 96, 108, 114, 121, 137, 151, 165, 179, 187, 201, 210, 218, 227, 241, 253, 257, 273, 277 ou 281. Outras sequências de ácidos nucleicos compreendendo nucleotídeos que codificam uma sequência de região variável de cadeia curta madura que são substancialmente idênticas (por exemplo, pelo menos 80%, 90% ou 99%) à sequência de região variável de cadeia curta madura apresentada na SEQ ID NO: 8, 24, 40, 52, 68, 80, 90, 102, 122, 138, 152, 166, 180, 188, 202, 211, 219, 228, 242, 261, 265, 269, 285 ou 289.

[0205] As sequências polinucleotídicas podem ser produzidas porsíntese de novo de DNA em fase sólida ou por mutagênese por PCR de uma sequência existente (por exemplo, sequências como descritas nos Exemplos abaixo) que codifica um anticorpo de ligação à C5 ou seu fragmento de ligação. Síntese química direta de ácidos nucleicos pode ser realizada por métodos conhecidos na técnica, tais como o método fosfotriéster de Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90; o método fosfodiéster de Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979; o método dietilfosforamidita de Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981; e o método de suporte sólido da Patente U.S. No. 4.458.066. A introdução de mutações em uma sequência polinucleotídica por PCR pode ser realizada como descrito em, por exemplo, PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991; e Eckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991.

[0206] Também fornecidos na invenção são vetores de expressãoe células hospedeiras para produzir os anticorpos de ligação à C5 descritos acima. Vários vetores de expressão podem ser empregados para expressar os polinucleotídeos que codificam as cadeias de anticorpo de ligação à C5 ou fragmentos de ligação. Tanto vetores de expressão virais como não virais podem ser usados para produzir os anticorpos em uma célula hospedeira mamífera. Vetores e sistemas não virais incluem plasmídeos, vetores epissomais, tipicamente com um cassete de expressão para expressar uma proteína ou RNA, e cromossomos artificiais humanos (ver, por exemplo, Harrington et al., Nat Genet 15:345, 1997). Por exemplo, vetores não virais úteis para a expressão dos polinucleotídeos e polipeptídeos de ligação à C5 em células mamíferas (por exemplo, humanas) incluem pThioHis A, B & C, pcDNA3.1/His, pEBVHis A, B & C, (Invitrogen, San Diego, CA), vetores MPSV, e outros numerosos vetores conhecidos na técnica para expressão de outras proteínas. Vetores virais úteis incluem vetores baseados em retrovírus, adenovírus, vírus adeno-associado, vírus de herpes, vetores baseados em SV40, vírus de papiloma, vírus de HBP Epstein Barr, vetores de vírus de vacínia e vírus da Floresta de Semliki (SFV). Ver, Brent et al., supra; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995; e Rosenfeld et al., Cell 68:143, 1992.

[0207] A escolha do vetor de expressão depende das células hospedeiras desejadas nas quais o vetor deve ser expresso. Tipicamente, os vetores de expressão contêm um promotor e outras sequências reguladoras (por exemplo, potencializadores) que são operacionalmente ligados aos polinucleotídeos que codificam uma cadeia de anticorpo de ligação à C5 ou fragmento. Em algumas modalidades, um promotor induzível é empregado para impedir a expressão de sequências inseridas exceto nas condições de indução. Promotores induzíveis incluem, por exemplo, arabinose, lacZ, promotor de metalotioneína ou um promotor de choque térmico. Culturas de organismos transformados podem ser expandidas sob condições não indutoras sem influenciar a população para codificar sequências cujos produtos de expressão são mais bem tolerados pelas células hospedeiras. Além de promotores, outros elementos reguladores também podem ser necessários ou desejados para a expressão eficiente de uma cadeia de anticorpo de ligação à C5 ou fragmento. Estes elementos tipicamente incluem um códon de iniciação ATG e sítio de ligação a ribossomo adjacente ou outras sequências. Além disso, a eficiência da expressão pode ser aumentada pela inclusão de potencializadores apropriados para o sistema celular em uso (vide, por exemplo, Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994; e Bittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987). Por exemplo, o potencializador SV40 ou o potencializador CMV podem ser usados para aumentar a expressão em células hospedeiras mamíferas.

[0208] Os vetores de expressão também podem fornecer uma posição de sequência sinal de secreção para formar uma proteína de fusão com polipeptídeos codificados por sequências de anticorpo de ligação à C5 inseridas. Mas, muitas vezes, as sequências de anticorpo de ligação à C5 inseridas são ligadas a algumas sequências sinal antes da inclusão no vetor. Vetores a serem usados para receber sequências que codificam domínios variáveis de cadeia curta e longa de anticorpo de ligação à C5 às vezes também codificam regiões constantes ou partes das mesmas. Tais vetores permitem a expressão das regiões variáveis como proteínas de fusão com as regiões constantes que por meio disso levam à produção de anticorpos intactos ou fragmentos dos mesmos. Tipicamente, tais regiões constantes são humanas.

[0209] As células hospedeiras para abrigo e expressão das cadeias de anticorpo de ligação à C5 podem ser procarióticas ou eucarióti- cas. E. coli é um hospedeiro procariótico útil para clonagem e expres- são dos polinucleotídeos da presente invenção. Outros hospedeiros microbianos adequados para uso incluem bacilos, tais como Bacillus subtilis, e outros enterobacteriaceae, tais como Salmonella, Serratia, e várias espécies de Pseudomonas. Nestes hospedeiros procarióticos, pode-se também construir vetores de expressão, que tipicamente contêm sequências de controle de expressão compatíveis com a célula hospedeira (por exemplo, uma origem de replicação). Além disso, qualquer um de uma variedade de promotores bem conhecidos estará presente, tal como o sistema de promotor de lactose, um sistema promotor de triptofano (trp), um sistema promotor de beta-lactamase ou um sistema promotor de fago lambda. Os promotores tipicamente controlam expressão, opcionalmente com uma sequência operadora, e têm sequências de sítio de ligação a ribossomo e similares, para início e término da transcrição e tradução. Outros micróbios, tais como cur- tadura, também podem ser empregados para expressar polipeptídeos de ligação à C5 da invenção. Células de inseto em combinação com vetores baculovirais também podem ser usadas.

[0210] Em algumas modalidades preferenciais, células hospedeiras mamíferas são usadas para expressar e produzir os polipeptídeos de ligação à C5 da presente invenção. Por exemplo, podem ser uma linhagem celular de hibridoma expressando genes de imunoglobulina endógena (por exemplo, o clone hibridoma de mieloma 1D6. de C9 como descrito nos Exemplos) ou uma linhagem celular mamífera carregando um vetor de expressão exógeno (por exemplo, as células de mieloma SP2/0 exemplificadas abaixo). Estes incluem qualquer célula animal ou humana normal mortal ou normal ou anormal imortal. Por exemplo, diversas linhagens de célula hospedeira adequadas capazes de secretar imunoglobulinas intactas foram desenvolvidas incluindo as linhagens de células CHO, várias linhagens de células COS, células HeLa, linhagens celulares de mieloma, células B transformadas e hi- bridomas. O uso da cultura de célula de tecido mamífero para expressar polipeptídeos é discutido geralmente em, por exemplo, Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987. Vetores de expressão de células hospedeiras mamíferas podem incluir sequências controle de expressão, tais como uma origem de replicação, um promotor e um potencializador (ver, por exemplo, Queen, et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986), e sítios de informação sobre processamento necessário, tais como sítios de ligação a ribossomo, sítios de junção de RNA, sítios de poliadenilação e sequências de terminação transcricional. Estes vetores de expressão normalmente contêm promotores derivados de genes mamíferos ou de vírus de mamíferos. Promotores adequados podem ser constitutivos, tipo celular- específicos, estágio-específicos e/ou moduláveis ou reguláveis. Pro-motores úteis incluem, mas não são limitados ao promotor de meta- lotioneína, promotor tardio principal de adenovirus constitutivo, promotor MMTV induzível por dexametasona, promotor SV40, promotor MRP polIII, promotor MPSV constitutivo, promotor CMV induzível por tetra- ciclina (tal como o promotor CMV imediato-precoce humano), promotor CMV constitutivo, e combinações potencializadoras por promotor conhecidas na técnica.

[0211] Métodos para introdução de vetores de expressão contendoas sequências polinucleotídicas de interesse variam dependendo do tipo de hospedeiro celular. Por exemplo, transfecção por cloreto de cálcio é comumente utilizada para células procarióticas, ao passo que o tratamento por fosfato de cálcio ou eletroporação pode ser usado para outros hospedeiros celulares. (Vide, em geral, Sambrook, et al., supra). Outros métodos incluem, por exemplo, eletroporação, tratamento por fosfato de cálcio, transformação mediada por lipossoma, injeção e microinjeção, métodos balísticos, virossomas, imunoliposso- mas, conjugados policátion:ácidos nucleicos, DNA nu, vírions artifici- ais, fusão à proteína estrutural do vírus de herpes VP22 (Elliot e O'Hare, Cell 88:223, 1997), absorção aumentada por agente de DNA e transdução ex vivo. Para produção de longa duração, de alto rendimento de proteínas recombinantes, expressão estável muitas vezes será desejada. Por exemplo, linhagens celulares que estavelmente expressam cadeias de anticorpo de ligação à C5 ou fragmentos de ligação podem ser preparadas usando os vetores de expressão da invenção contendo origens de replicação virais ou elementos de expressão endógenos e um gene marcador selecionável. Após introdução do vetor, pode permitir-se que células cresçam por 1 a 2 dias em meios enriquecidos antes que sejam trocados para meios seletivos. O objetivo do marcador selecionável é conferir resistência à seleção, e sua presença permite o crescimento de células que com sucesso expressam as sequências introduzidas em meios seletivos. Células resistentes estavelmente transfectadas podem ser proliferadas usando técnicas de cultura tecidual apropriadas para o tipo celular.

5.2.2. Geração de anticorpos monoclonais da invenção

[0212] Anticorpos monoclonais (mAbs) podem ser produzidos poruma variedade de técnicas, incluindo metodologia de anticorpo monoclonal convencional, por exemplo, a técnica de hibridização celular somática padrão de Kohler e Milstein, 1975 Nature 256: 495. Muitas técnicas para produção do anticorpo monoclonal podem ser empregadas, por exemplo, transformação viral ou oncogênica de linfócitos B.

[0213] Um sistema animal para preparação de hibridomas é o sistema murino. A produção de hibridoma no camundongo é um procedimento bem estabelecido. Protocolos de imunização e técnicas para isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são conhecidos na técnica. Parceiros de fusão (por exemplo, células de mieloma murino) e procedimentos de fusão também são conhecidos.

[0214] Anticorpos quiméricos ou humanizados da presente inven- ção podem ser preparados com base na sequência de um anticorpo monoclonal murino preparado como descrito acima. DNA que codifica as imunoglobulinas de cadeia longa e curta pode ser obtido do hibri- doma murino de interesse e engenheirado para conter sequências de imunoglobulina não murinas (por exemplo, humanas) usando técnicas de biologia molecular padrão. Por exemplo, para criar um anticorpo quimérico, as regiões variáveis murinas podem ser ligadas a regiões constantes humanas usando métodos conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Patente U.S. No. 4.816.567 por Cabilly et al.). Para criar um anticorpo humanizado, as regiões CDR murinas podem ser inseridas em estrutura humana usando métodos conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Patente U.S. No. 5225539 por Winter, e Patentes U.S. Nos. 5530101; 5585089; 5693762 e 6180370 por Queen et al.

[0215] Em certa modalidade, os anticorpos da invenção são anticorpos monoclonais humanos. Tais anticorpos monoclonais humanos dirigidos contra C5 podem ser gerados usando camundongos transgê- nicos ou transcromossômicos que carregam partes do sistema imune humano ao invés do sistema de camundongo. Estes camundongos transgênicos ou transcromossômicos incluem camundongos referidos neste pedido como camundongos HuMAb e camundongos KM, respectivamente, e são coletivamente referidos neste pedido como "camundongos de Ig humana."

[0216] O camundongo HuMAb® (Medarex, Inc) contém minilocigênicos de imunoglobulina humana que codificam sequências de imu- noglobulina de cadeia não rearranjada longa (μ e Y) e curta K humana, em conjunto com mutações direcionadas que inativam os loci endógenos da cadeia μ e k (ver, por exemplo, Lonberg, et al., 1994 Nature 368 (6474): 856-859). Consequentemente, os camundongos exibem expressão reduzida da IgM de camundongo ou k, e em resposta à imunização, os transgenes de cadeia humana longa e curta introduzi- dos sofrem troca de classe e mutação somática para gerar IgGK monoclonal humana de alta afinidade (Lonberg, N. et al., 1994 supra; revisto em Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immu-nol.13: 65-93, e Harding, F. and Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546). A preparação e o uso de camundongos HuMAb, e modificações genômicas carregadas por tais camundongos, são ainda descritos em Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:62876295; Chen, J. et at., 1993 International Immunology 5: 647-656; Tuail- lon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724; Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591; and Fishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851, os conteúdos de todos os quais são por meio deste especificamente incorporados por referência em sua totalidade. Vide ainda, Patentes U.S. Nos. 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016;5.814.318; 5.874.299; e 5.770.429; todas por Lonberg e Kay; Patente U.S. No. 5.545.807 por Surani et al.; Publicação PCT Nos. WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 e WO 99/45962, todos por Lonberg e Kay; e Publicação PCT No. WO 01/14424 por Korman et al.

[0217] Em outra modalidade, os anticorpos humanos da invençãopodem ser originados usando um camundongo que carrega sequências de imunoglobulina humanas em transgenes e transcromossomos, tais como um camundongo que transporta um transgene de cadeia longa humana e um transcromossomo de cadeia curta humana. Tais camundongos, referidos neste pedido como "camundongos KM", são descritos em detalhes na Publicação PCT WO 02/43478 por Ishida et al.

[0218] Além disso, sistemas animais transgênicos alternativos que expressam genes de imunoglobulina humana estão disponíveis na técnica e podem ser usados para originar anticorpos de ligação à C5 da invenção. Por exemplo, um sistema transgênico alternativo referido como Xenomouse (Abgenix, Inc) pode ser usado. Tais camundongos são descritos em, por exemplo, Patentes U.S.s Nos. 5.939.598; 6.075.181; 6.114.598; 6, 150.584 e 6.162.963 por Kucherlapati et al.

[0219] Além disso, sistemas animais transcromossômicos alternativos expressando genes de imunoglobulina humanas estão disponíveis na técnica e podem ser usados para originar anticorpos de ligação à C5 da invenção. Por exemplo, os camundongos carregando tanto um transcromossomo de cadeia longa humana como um transcromos- somo de cadeia curta humana, referidos como "camundongos TC" podem ser usados; tais camundongos são descritos em Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727. Além disso, vacas transportando transcromossomos de cadeia longa e curta humana foram descritas na técnica (Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20:889-894) e podem ser usadas para originar anticorpos de ligação à C5 da invenção.

[0220] Anticorpos monoclonais humanos da invenção também podem ser preparados usando métodos de exposição de fago para ras- treamento de bibliotecas de genes de imunoglobulina humana. Tais métodos de exposição de fago para isolamento de anticorpos humanos são estabelecidos na técnica ou descritos nos exemplos abaixo. Vide por exemplo: Patentes U.S. Nos. 5.223.409; 5.403.484; e5.571.698 por Ladner et al.; Patentes U.S. Nos. 5.427.908 e 5.580.717 por Dower et al.; Patentes U.S. Nos. 5.969.108 e 6.172.197 por McCafferty et al; e Patentes U.S. Nos. 5.885.793; 6.521.404;6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 e 6.593.081 por Griffiths et al.

[0221] Os anticorpos monoclonais humanos da invenção tambémpodem ser preparados usando camundongos SCID nos quais as célu- las imunes humanas foram reconstituídas tal que uma resposta de anticorpo humana possa ser gerada na imunização. Tais camundongos são descritos em, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 5.476.996 e 5.698.767 por Wilson et al.

5.2.3. Estrutura ou Engenharia de Fc

[0222] Anticorpos engenheirados da invenção incluem aqueles nosquais modificações foram feitas em resíduos de estrutura dentro de VH e/ou VL, por exemplo, para melhorar as propriedades do anticorpo. Tipicamente tais modificações de estrutura são feitas para reduzir a imunogenicidade do anticorpo. Por exemplo, uma abordagem é "re- tromutação" de um ou mais resíduos de estrutura da sequência de linhagem germinativa correspondente. Mais especificamente, um anticorpo que sofreu mutação somática pode conter resíduos de estrutura que se diferenciam da sequência de linhagem germinativa da qual o anticorpo é derivado. Tais resíduos podem ser identificados por comparação das sequências de estrutura de anticorpo com as sequências de linhagem germinativa das quais o anticorpo é derivado. Para retornar as sequências de região de estrutura à sua configuração de linhagem germinativa, as mutações somáticas podem ser "retromutadas" à sequência de linhagem germinativa por, por exemplo, mutagênese sí- tio-dirigida. Tais anticorpos "retromutados" também são destinados a serem englobados pela invenção.

[0223] Outro tipo de modificação de estrutura envolve a mutaçãode um ou mais resíduos dentro da região de estrutura, ou até dentro de uma ou mais regiões CDR, para remover a epítopo de célula T para reduzir por meio disso a imunogenicidade potencial do anticorpo. Esta abordagem também é referida como "desimunização" e é descrita em detalhes adicionais na Publicação de Patente U.S. No. 20030153043 por Carr et al.

[0224] Além disso ou alternativas para modificações feitas dentro da estrutura ou regiões CDR, os anticorpos da invenção podem ser engenheirados para incluir modificações dentro da região Fc, tipicamente alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo, tais como meia-vida sérica, fixação de complemento, ligação de receptor de Fc e/ou citotoxicidade celular dependente de antígeno. Além disso, um anticorpo da invenção pode ser quimicamente modificado (por exemplo, uma ou mais porções químicas podem ser ligadas ao anticorpo) ou ser modificado para alterar sua glicosilação, novamente alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo. Cada uma destas modalidades é descrita em detalhes adicionais abaixo. A numeração de resíduos na região Fc é aquela do índice EU de Kabat.

[0225] Em uma modalidade, a região de dobradiça de CH1 é modificada tal que o número de resíduos cisteína na região de dobradiça seja alterado, por exemplo, aumentado ou diminuído. Esta abordagem é ainda descrita na Patente U.S. No. 5.677.425 por Bodmer et al. O número de resíduos de cisteína na região de dobradiça de CH1 é alterado, por exemplo, para facilitar a reunião das cadeias curtas e longas ou aumentar ou reduzir a estabilidade do anticorpo.

[0226] Em outra modalidade, a região de dobradiça Fc de um anticorpo é mutada para reduzir a meia-vida biológica do anticorpo. Mais especificamente, uma ou mais mutações de aminoácido são introduzidas na região de interface de domínio CH2-CH3 do fragmento de Fc- dobradiça tal que o anticorpo tenha prejudicado a ligação de proteína A de Staphylococcyl (SpA) em relação à ligação de SpA de domínio de Fc-dobradiça nativa. Esta abordagem é descrita em detalhes adicionais na Patente U.S. No. 6.165.745 por Ward et al.

[0227] Em outra modalidade, o anticorpo é modificado para aumentar sua meia-vida biológica. Várias abordagens são possíveis. Por exemplo, uma ou mais das seguintes mutações podem ser introduzidas: T252L, T254S, T256F, como descrito na Patente U.S. No. 6.277.375 por Ward. Alternativamente, para aumentar a meia-vida biológica, o anticorpo pode ser alterado dentro da região CH1 ou CL para conter um epítopo de ligação a receptor de salvamento tomado de duas alças de um domínio CH2 de uma região Fc de uma IgG, como descrito nas Patentes U.S. Nos. 5.869.046 e 6.121.022 por Presta et al.

[0228] Ainda em outras modalidades, a região Fc é alterada pelasubstituição de pelo menos um resíduo de aminoácido por um resíduo de aminoácido diferente para alterar as funções efetoras do anticorpo. Por exemplo, um ou mais aminoácidos podem ser substituídos por um resíduo de aminoácido diferente tal que o anticorpo tenha uma afinidade alterada por um ligante efetor, mas conserve a capacidade de ligação ao antígeno do anticorpo parental. O ligante efetor ao qual a afinidade é alterada pode ser, por exemplo, um receptor Fc ou componente C1 do complemento. Esta abordagem é descrita em detalhes adicionais nas Patentes U.S. Nos. 5.624.821 e 5.648.260, ambas por Winter et al.

[0229] Em outra modalidade, um ou mais aminoácidos selecionados de resíduos de aminoácido podem ser substituídos por um resíduo de aminoácido diferente tal que o anticorpo tenha ligação de C1q alterada e/ou tenha reduzida ou não tenha citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Esta abordagem é descrita em detalhes adicionais nas Patentes U.S. Nos. 6.194.551 por Idusogie et al.

[0230] Em outra modalidade, um ou mais resíduos de aminoácidosão alterados para alterar por meio disso a capacidade do anticorpo de fixar-se ao complemento. Esta abordagem é descrita ainda na Publicação PCT WO 94/29351 por Bodmer et al.

[0231] Ainda em outra modalidade, a região Fc é modificada paraaumentar a capacidade do anticorpo de mediar a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e/ou aumentar a afinidade do anticorpo por um receptor de FCY pela modificação de um ou mais amino- ácidos. Esta abordagem é descrita ainda na Publicação PCT WO 00/42072 por Presta. Além disso, os sítios de ligação em IgG1 humana a FCYRI, FcyRII, FCYRIII e FcRn foram mapeados e variantes com ligação melhorada foram descritas (vide Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604).

[0232] Ainda em outra modalidade, a glicosilação de um anticorpoé modificada. Por exemplo, um anticorpo aglicosilado pode ser produzido (isto é, anticorpo sem glicosilação). Glicosilação pode ser alterada, por exemplo, para aumentar a afinidade do anticorpo pelo "antíge- no'. Tais modificações de carboidrato podem ser realizadas, por exemplo, pela alteração de um ou mais sítios de glicosilação dentro da sequência de anticorpo. Por exemplo, uma ou mais substituições de aminoácido podem ser feitas o que resulta na eliminação de um ou mais sítios de glicosilação da estrutura da região variável para eliminar por meio disso a glicosilação naquele sítio. Tal aglicosilação pode aumentar a afinidade do anticorpo pelo antígeno. Tal abordagem é des-crita em detalhes adicionais nas Patentes U.S. Nos. 5.714.350 e 6.350.861 por Co et al.

[0233] Adicionalmente ou alternativamente, um anticorpo que podeser feito tem um tipo alterado de glicosilação, tal como um anticorpo hipofucosilado tendo quantidades reduzidas dos resíduos fucosila ou um anticorpo tendo estruturas GlcNac de bissegmentação aumentada. Tais padrões de glicosilação alterados foram demonstrados aumentar a capacidade de ADCC dos anticorpos. Tais modificações de carboidrato podem ser realizadas, por exemplo, pela expressão do anticorpo em uma célula hospedeira com o maquinário de glicosilação alterado. Células com maquinário de glicosilação alterado foram descritas na técnica e podem ser usadas como células hospedeiras nas quais expressar anticorpos recombinantes da invenção para produzir por meio disso um anticorpo com glicosilação alterada. Por exemplo, EP 1.176.195 por Hang et al. descreve uma linhagem celular com um gene FUT8 funcionalmente alterado, que codifica uma fucosil transferase, tal que os anticorpos expressos em tal linhagem celular exibem hipofucosilação. Publicação PCT WO 03/035835 por Presta descreve uma variante de linhagem de célula CHO, células Lecl3, com capacidade reduzida de ligação de fucose a carboidratos ligados a Asn (297), também resultando em hipofucosilação de anticorpos expressos naquela célula hospedeira (vide também Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740). Publicação PCT WO 99/54342 por Umana et al. descreve linhagens celulares engenheiradas para expressar gli- cosil transferases modificadoras de glicoproteína (por exemplo, beta (1,4)-N acetilglucosaminiltransferase III (GnTIII)) tal que os anticorpos expressos nas linhagens celulares engenheirada exibam estruturas GlcNac de bissegmentação aumentadas que resultam em atividade de ADCC aumentada dos anticorpos (ver também Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180).

5.2.4. Métodos de Anticorpos Alterados por Engenharia

[0234] Como discutido acima, os anticorpos de ligação à C5 tendosequências de VH e VL ou sequências de cadeia longa e curta de extensão completa mostrados neste pedido podem ser usados para criar novos anticorpos de ligação à C5 pela modificação das sequências de cadeia longa e/ou cadeia curta de extensão completa, de sequências VH e/ou VL, ou da(s) região(ões) constante(s) ligada(s) a estas. Dessa forma, em outro aspecto da invenção, as características estruturais de um anticorpo de ligação à C5 da invenção são usadas para criar anticorpos de ligação à C5 estruturalmente relacionados que conservam pelo menos uma propriedade funcional dos anticorpos da invenção, tal como ligação à C5 de ser humano e também inibição de uma ou mais propriedades funcionais de C5 (por exemplo, inibir lise de célula vermelha sanguínea em um ensaio hemolítico).

[0235] Por exemplo, uma ou mais regiões CDR dos anticorpos dapresente invenção, ou mutações das mesmas, podem ser recombinan- temente combinadas com regiões conservadas conhecidas e/ou outras CDRs para criar anticorpos de ligação à C5 da invenção adicionais, engenheirados recombinantemente, como discutido acima. Outros tipos de modificações incluem aquelas descritas na seção anterior. O material de partida do método de engenharia é uma ou mais das sequências de VH e/ou VL fornecidas neste pedido, ou uma ou mais regiões CDR das mesmas. Para criar o anticorpo engenheirado, não é necessário preparar de fato (isto é, expresso como uma proteína) um anticorpo tendo uma ou mais das sequências de VH e/ou VL fornecidas neste pedido, ou uma ou mais regiões CDR das mesmas. Prefe-rencialmente, a informação contida na(s) sequência(s) é usada como material de partida para criar sequência(s) de "segunda geração" derivada da sequência(s) original e em seguida a(s) sequência(s) de "segunda geração" é preparada e expressa como uma proteína.

[0236] Consequentemente, em outra modalidade, a invenção fornece um método para preparação de um anticorpo de ligação à C5 consistindo em: uma sequência de anticorpo de região variável de cadeia longa tendo uma sequência de CDR1 selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 1, 17, 33, 61, 131, 145, 159, 173, 195 e 235, uma sequência de CDR2 selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 49, 62, 77, 95, 107, 113, 119, 132, 146, 160, 174, 196, 226 e 236, e/ou uma sequência de CDR3 selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 3, 19, 35, 63, 133, 147, 161, 175, 197 e 237; e uma sequência de anticorpo de região variável de cadeia curta tendo uma sequência de CDR1 selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 4, 20, 36, 64, 134, 148, 162, 176, 198 e 238, uma sequência de CDR2 selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 5, 21, 37, 65, 135, 149, 163, 177, 199 e 239, e/ou uma sequência de CDR3 selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 6, 22, 38, 50, 66, 78, 89, 101, 120, 136, 150, 164, 178, 200, 209 e 240; alterar pelo menos um resíduo de aminoácido dentro da sequência de anticorpo de região variável de cadeia longa e/ou sequência de anticorpo de região variável de cadeia curta para criar pelo menos uma sequência de anticorpo alterada; e expressar a sequência de anticorpo alterada como uma proteína.

[0237] Consequentemente, em outra modalidade, a invenção fornece um método para preparação de um anticorpo de ligação à C5 otimizado para a expressão em uma célula mamífera consistindo em: uma sequência de extensão completa de anticorpo de cadeia longa tendo uma sequência selecionada a partir do grupo das SEQ ID NOs: 9, 25, 41, 53, 69, 81, 97, 109, 115, 123, 139, 153, 167, 181, 189, 203, 212, 220, 229, 243, 249, 254, 258, 274, 278 e 282; e uma sequência de anticorpo de cadeia curta de extensão completa tendo uma sequência selecionada a partir do grupo de 10, 26, 42, 54, 70, 82, 91, 103, 124, 140, 154, 168, 182, 190, 204, 213, 221, 230, 244, 251, 262, 266, 270, 286 e 290; alterar pelo menos um resíduo de aminoácido dentro da sequência de anticorpo de extensão completa de cadeia longa e/ou a sequência de anticorpo de extensão completa de cadeia curta para criar pelo menos uma sequência de anticorpo alterada; e expressar a sequência de anticorpo alterada como uma proteína.

[0238] A sequência de anticorpo alterada também pode ser preparada pelo rastreamento de bibliotecas de anticorpo tendo sequências de CDR3 fixadas ou determinantes de ligação essenciais mínimas como descrito em US20050255552 e diversidade em sequências de CDR1 e CDR2. O rastreamento pode ser realizado de acordo com qualquer tecnologia de rastreamento apropriada para rastreamento de anticorpos de bibliotecas de anticorpo, tais como tecnologia de exposição de fago.

[0239] Técnicas de biologia molecular padrão podem ser usadaspara preparar e expressar a sequência de anticorpo alterada. O anticorpo codificado pela(s) sequência(s) de anticorpo alterada é aquele que conserva uma, algumas ou todas as propriedades funcionais dos anticorpos de ligação à C5 descritos neste pedido, propriedades funcionais as quais incluem, mas não são limitadas a, ligação específica a C5 de ser humano e/ou de cinomolgus; e o anticorpo inibe lise de célula vermelha sanguínea em um ensaio hemolítico.

[0240] As propriedades funcionais dos anticorpos alterados podemser avaliadas usando ensaios-padrão disponíveis na técnica e/ou descritos neste pedido, tais como aqueles apresentados nos Exemplos (por exemplo, ELISAs).

[0241] Em certas modalidades dos métodos de anticorpos de engenharia da invenção, mutações podem ser introduzidas randomica- mente ou seletivamente ao longo de toda ou parte de uma sequência de codificação de anticorpo de ligação à C5 e os anticorpos de ligação à C5 modificados resultantes podem ser rastreados para a atividade de ligação e/ou outras propriedades funcionais como descrito neste pedido. Os métodos mutacionais foram descritos na técnica. Por exemplo, a Publicação PCT WO 02/092780 por Short descreve métodos para criar e rastrear mutações de anticorpo usando mutagênese de saturação, reunião de ligação sintética, ou uma combinação dos mesmos. Alternativamente, a Publicação PCT WO 03/074679 por Lazar et al. descreve métodos de uso de métodos de rastreamento com-putacionais para otimizar propriedades fisioquímicas de anticorpos.

5.3. Caraterização dos Anticorpos da Invenção

[0242] Os anticorpos da invenção podem ser caracterizados porvários ensaios funcionais. Por exemplo, eles podem ser caracterizados pela sua capacidade de inibir a lise de célula vermelha sanguínea em ensaios hemolíticos, sua afinidade por uma proteína C5 (por exemplo, C5 de ser humano e/ou de cinomolgus), o a ligação ao epítopo, sua resistência à proteólise, e sua capacidade de bloquear a cascata de complemento, por exemplo, sua capacidade de inibir a formação de MAC.

[0243] Vários métodos podem ser usados para medir a presençade moléculas da via de complemento e ativação do sistema de complemento (vide, por exemplo, Patente U.S. No. 6.087.120; e Newell et al., J Lab Clin Med, 100:437-44, 1982). Por exemplo, a atividade de complemento pode ser monitorada por (i) medida da inibição da lise mediada por complemento de células vermelhas sanguíneas (hemóli- se); (ii) medida da capacidade de inibir a clivagem de C3 ou C5; e (iii) medida da inibição da hemólise pela via alternativa.

[0244] As duas técnicas mais comumente usadas são ensaioshemolíticos (ver, por exemplo, Baatrup et al., Ann Rheum Dis, 51:8927, 1992) e ensaios imunológicos (ver, por exemplo, Auda et al., Rheumatol Int, 10:185-9, 1990). As técnicas hemolíticas medem a capacidade funcional da sequência inteira - ambas via clássica ou alternativa. Técnicas imunológicas medem a concentração proteica de um componente de complemento específico ou produto clivado. Outros ensaios que podem ser empregados para detectar ativação de complemento ou atividades de medida de componentes do complemento nos métodos da presente invenção incluem, por exemplo, ensaio de proliferação de célula T (Chain et al., J Immunol Methods, 99:221-8, 1987), e ensaio de hipersensibilidade do tipo retardada (DTH) (Forstrom et al., 1983, Nature 303:627-629; Halliday et al., 1982, em Assessment of Immune Status by the Leukocyte Adherence Inhibition Test, Academic, New York pp 1-26; Koppi et al., 1982, Cell. Immunol. 66:394-406; e Patente U.S. No. 5.843.449).

[0245] Em técnicas hemolíticas, todos os componentes do complemento devem estar presentes e ser funcionais. Por isso, técnicas hemolíticas podem rastrear tanto integridade funcional como deficiências do sistema de complemento (ver, por exemplo, Dijk et al., J Immunol Methods 36: 29-39, 1980; Minh et al., Clin Lab. Haematol. 5:23-34 1983; e Tanaka et al., J Immunol 86: 161-170, 1986). Para medir a capacidade funcional da via clássica, células vermelhas sanguíneas de ovelha cobertas com hemolisina (IgG de coelho para células vermelhas sanguíneas de ovelha) ou células vermelhas sanguíneas de frango que são sensibilizadas com anticorpos antifrango de coelho são usadas como células-alvo (células sensibilizadas). Esses complexos Ag-Ab ativam a via clássica e resultam na lise das células alvo quando os componentes estão funcionais e presentes na concentração adequada. Para determinar a capacidade funcional da via alternativa, células vermelhas sanguíneas de coelho são usadas como célula-alvo (ver, por exemplo, Patente U.S. No. 6.087.120).

[0246] Para testar a capacidade de um anticorpo inibir a formaçãode MAC (complexo de ataque da membrana), um ensaio de deposição de MAC pode ser realizado. Resumidamente, zimosan pode ser usado para ativar a via alternativa e IgM pode ser usada para ativar a via clássica. Fabs são pré-incubados com soro humano e adicionados a placas cobertas com zimosan ou IgM. A porcentagem de inibição da deposição de MAC pode ser calculada para cada amostra em relação à base (soro humano tratado com EDTA) e controle positivo (soro humano).

[0247] A capacidade de um anticorpo ligar-se à C5 pode ser detectada pela marcação do anticorpo de interesse diretamente, ou o anticorpo pode ser não marcado e a ligação detectada indiretamente usando vários formatos de ensaio sanduíche conhecidos na técnica.

[0248] Em algumas modalidades, os anticorpos de ligação à C5 dainvenção bloqueiam ou competem com a ligação de um anticorpo de ligação à C5 de referência a um polipeptídeo C5. Estes podem ser an- ticorpos de ligação à C5 totalmente humanos descritos acima. Também podem ser outros anticorpos de camundongo de ligação à C5 quiméricos ou humanizados que se ligam ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência. A capacidade de bloquear ou competir com a ligação do anticorpo de referência indica que um anticorpo de ligação à C5 no teste liga-se ao mesmo epítopo ou similar àquele definido pelo anticorpo de referência, ou a um epítopo que é suficientemente proximal ao epítopo ligado pelo anticorpo de ligação à C5 de referência. Tais anticorpos especialmente provavelmente compartilharão as propriedades vantajosas identificadas para o anticorpo de referência. A capacidade de bloquear ou competir com o anticorpo de referência pode ser determinada, por exemplo, por um ensaio de ligação de competição. Com um ensaio de ligação de competição, o anticorpo sob teste é examinado sobre a capacidade de inibir a ligação específica do anticorpo de referência a um antígeno comum, tal como um poli- peptídeo C5. Um anticorpo de teste compete com o anticorpo de referência pela ligação específica ao antígeno se um excesso do anticorpo de teste substancialmente inibir a ligação do anticorpo de referência. Inibição substancial significa que o anticorpo de teste reduz a ligação específica do anticorpo de referência normalmente em pelo menos 10%, 25%, 50%, 75% ou 90%.

[0249] Há diversos ensaios de ligação de competição conhecidosque podem ser usados para avaliar a competição de um anticorpo de ligação à C5 com o anticorpo de ligação à C5 de referência para ligação a uma proteína C5. Estes incluem, por exemplo, radioimunoensaio direto ou indireto em fase sólida (RIA), imunoensaio de enzima direto ou indireto em fase sólida (EIA), ensaio de competição de sanduíche (vide Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242-253, 1983); EIA de biotina-avidina direta em fase sólida (vide Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619, 1986); ensaio marcado direto em fase sólida, ensaio de sanduíche de marcação direta em fase sólida (vide Harlow & Lane, supra); RIA de marcação direta de fase sólida usando marcação de I125 (vide Morel et al., Molec. Immunol. 25:7-15, 1988); EIA de biotina- avidina direta em fase sólida (Cheung et al., Virology 176:546-552, 1990); e RIA marcado direto (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77-82, 1990). Tipicamente, tal ensaio envolve o uso do antígeno purificado ligado a uma superfície sólida ou células carregando qualquer destes, um anticorpo de teste de ligação à C5 não marcado e um anticorpo de referência marcado. Inibição competitiva é medida pela determinação da quantidade de marcação ligada à superfície sólida ou células na presença do anticorpo de teste. Normalmente o anticorpo de teste está presente em excesso. Anticorpos identificados pelo ensaio de competição (anticorpos de competição) incluem ligação de anticorpos ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência e ligação de anticorpos a um epítopo adjacente suficientemente próximo ao epítopo ligado pelo anticorpo de referência com ocorrência de impedimento estérico.

[0250] Para determinar se anticorpos monoclonais de ligação à C5selecionados se ligam a epítopos únicos, cada anticorpo pode ser bio- tinilado usando reagentes comercialmente disponíveis (por exemplo, reagentes de Pierce, Rockford, IL). Estudos de competição usando anticorpos monoclonais não marcados e anticorpos monoclonais bioti- nilados podem ser realizados usando um ELISA com placas cobertas de polipeptídeo C5. Ligação de MAb biotinilado pode ser detectada com uma sonda de estreptavidina-fosfatase alcalina. Para determinar o isotipo de um anticorpo de ligação à C5 purificado, ELISAs de isotipo podem ser realizados. Por exemplo, poços de placas de microtítulo podem ser cobertos com 1 μg/mL de IgG anti-humana por uma noite a 4°C. Após bloqueio com BSA a 1%, as placas são reagidas com 1 μg/mL ou menos do anticorpo de ligação à C5 monoclonal ou controles isotípicos purificados, à temperatura ambiente por uma a duas horas. Os poços então podem ser reagidos com IgG1 humana ou com sondas conjugadas à fosfatase alcalina para IgM humana. As placas então são desenvolvidas e analisadas para que o isotipo do anticorpo purificado possa ser determinado.

[0251] Para demonstrar ligação de anticorpos monoclonais de ligação à C5 a células vivas expressando um polipeptídeo C5, citome- tria de fluxo pode ser usada. Resumidamente, linhagens celulares expressando C5 (cultivadas sob condições de crescimento padrão) podem ser misturadas com várias concentrações de um anticorpo de ligação à C5 em PBS contendo BSA 0,1% e soro fetal de bezerro 10%, e incubadas a 37°C por 1 hora. Após lavagem, as células são reagidas com anticorpo IgG anti-humano marcado com Fluoresceína sob as mesmas condições que a marcação do anticorpo primário. As amostras podem ser analisadas pelo instrumento FACScan usando propriedades de tamanho e complexidade em células únicas. Um ensaio alternativo usando microscopia de fluorescência pode ser usado (além de ou ao invés de) ensaio de citometria de fluxo. Células podem ser marcadas exatamente como descrito acima e examinadas por micros- copia de fluorescência. Este método permite a visualização de células individuais, mas pode ter sensibilidade diminuída dependendo da densidade do antígeno.

[0252] Os anticorpos de ligação à C5 da invenção podem ser ainda testados para reatividade com um polipeptídeo C5 ou fragmento antigênico por Western blotting. Resumidamente, os polipeptídeos C5 purificados ou proteínas de fusão, ou extratos celulares de células expressando C5 podem ser preparados e submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio. Após eletroforese, os antígenos separados são transferidos para membranas de nitrocelulo- se, bloqueados com soro fetal de bezerro 10%, e marcados com os anticorpos monoclonais a serem testados. Ligação de IgG Humana pode ser detectada usando IgG antifosfatase alcalina humana e desenvolvida com tabletes de substrato BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO).

[0253] Exemplos de ensaios funcionais também são descritos naseção do Exemplo abaixo.

5.4. Usos Profiláticos e Terapêuticos

[0254] A presente invenção fornece métodos de tratamento deuma doença ou distúrbio associado à atividade de complemento aumentada pela administração a um indivíduo em necessidade dos mesmos de uma quantidade eficaz dos anticorpos da invenção. Em uma modalidade específica, a presente invenção fornece um método de tratamento para degeneração macular relacionada à idade (AMD) pela administração a um indivíduo em necessidade do mesmo de uma quantidade eficaz dos anticorpos da invenção.

[0255] Os anticorpos da invenção podem ser usados, inter alia,para impedir a progressão de AMD seca para AMD úmida, reduzir e/ou impedir a progressão da atrofia geográfica, e melhorar a visão perdida devido à progressão de AMD seca. Também podem ser usados em combinação com terapias anti-VEGF para o tratamento de pacientes de AMD úmida.

[0256] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece métodos de tratamento de uma doença ou de um distúrbio relacionado a complemento pela administração a um indivíduo em necessidade dos mesmos de uma quantidade eficaz dos anticorpos da invenção. Exemplos de doenças ou distúrbios relacionados a complemento conhecidos incluem: distúrbios neurológicos, esclerose múltipla, derrame, Síndrome de Guillain-Barre, injúria cerebral traumática, doença de Parkinson, distúrbios de ativação de complemento inapropriada ou indesejável, complicações de hemodiálise, rejeição de aloenxerto hipe- raguda, rejeição de xenoenxerto, toxicidade induzida por interleucina-2 durante terapia com IL-2, distúrbios inflamatórios, inflamação de doenças autoimunes, doença de Crohn, síndrome de aflição respiratória adulta, injúria térmica incluindo queimaduras ou ulceração, condições de reperfusão pós-isquêmicas, infarto do miocárdico, angioplastia de balão, síndrome pós-bombeamento em desvio cardiopulmonar ou desvio renal, hemodiálise, isquemia renal, reperfusão mesentérica de artéria após reconstrução acrótica, doença infecciosa ou sepse, distúrbios do complexo imune e doenças autoimunes, artrite reumatoide, lúpus sistêmico eritematoso (SLE), nefrite de SLE, nefrite proliferativa, anemia hemolítica e miastenia gravis. Além disso, outras doenças relacionadas ao complemento conhecidas são doenças e distúrbios de pulmão, tais como dispneia, hemoptise, ARDS, asma, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), enfisema, embolias pulmonares e infartos, pneumonia, doenças de pó fibrogênico, pós inertes e minerais (por exemplo, silício, pó de carvão, berílio e asbesto), fibrose pulmonar, doenças de pó orgânico, injúria química (devido a gases e produtos químicos irritantes, por exemplo, cloro, fosgênio, dióxido de enxofre, sulfito de hidrogênio, dióxido de nitrogênio, amônia e ácido clorídrico), injúria por fumo, injúria térmica (por exemplo, queimadura, congelamento), asma, alergia, broncoconstrição, pneumonite de hipersensibi- lidade, doenças parasíticas, Síndrome de Goodpasture, vasculite pulmonar e inflamação associada ao complexo imune.

[0257] Em uma modalidade específica, a presente invenção fornece métodos de tratamento de uma doença ou de um distúrbio relacionado a complemento pela administração a um indivíduo em necessidade dos mesmos de uma quantidade eficaz dos anticorpos da invenção, em que a dita doença ou distúrbio são asma, artrite (por exemplo, artrite reumatoide), doença cardíaca autoimune, esclerose múltipla, doença intestinal inflamatória, injúrias de reperfusão de isquemia, Sín- drome de Barraquer-Simons, hemodiálise, lúpus sistêmico, lúpus eri- tematoso, psoríase, esclerose múltipla, transplante, doenças do sistema nervoso central, tais como doença de Alzheimer e outras condições neurogenerativas, aHUS, glomerulonefrite, penfigoide bolhoso ou MPGN II.

[0258] Em uma modalidade específica, a presente invenção fornece métodos de tratamento de glomerulonefrite pela administração a um indivíduo em necessidade dos mesmos de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um anticorpo da presente invenção. Sintomas da glomerulonefrite incluem, mas não limitados a, pro- teinúria; taxa de filtração glomerular reduzida (GFR); modificações de eletrólito sérico incluindo azotemia (uremia, nitrogênio ureia sangue em excesso - BUN) e retenção de sal, levando a retenção de água que resulta em hipertensão e edema; hematúria e sedimento urinário anormal incluindo aspectos de células vermelhas; hipoalbuminemia; hiperlipidemia; e lipidúria. Em uma modalidade específica, a presente invenção fornece métodos de tratamento de hemoglobinúria paroxísti- ca noturna (PNH) pela administração a um indivíduo em necessidade dos mesmos de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um anticorpo da presente invenção.

[0259] Em uma modalidade específica, a presente invenção fornece métodos de redução da disfunção dos sistemas imune e hemostáti- co associada à circulação extracorpórea pela administração a um indivíduo em necessidade dos mesmos de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um anticorpo da presente invenção. Os anticorpos da presente invenção podem ser usados em qualquer procedimento que envolva a circulação do sangue do paciente a partir de um vaso sanguíneo do paciente, por um canal, e retorno a um vaso sanguíneo do paciente, o canal tendo uma superfície luminosa compreendendo um material capaz de causar pelo menos uma ativação de complemento, ativação de plaqueta, ativação de leucócito ou adesão plaqueta-leucócito. Tais procedimentos incluem, mas não são limitados a, todas as formas de ECC, bem como procedimentos envolvendo a introdução de um órgão, tecido ou vaso artificial ou estranho no circuito sanguíneo de um paciente.

[0260] Aos indivíduos a serem tratados com agentes terapêuticosda presente invenção também podem ser administrados outros agentes terapêuticos com métodos conhecidos de tratamento de condições associadas à degeneração macular, tais como tratamentos com antibióticos como descrito na Patente U.S. No. 6.218.368. Em outros tratamentos, agentes imunossupressores, tais como ciclosporina, são agentes capazes de suprimir respostas imunes. Estes agentes incluem fármacos citotóxicos, corticosteroides, fármacos anti-inflamatórios não esteroidais (NSAIDs), imunossupressores de linfócito T específico, e anticorpos ou fragmentos dos mesmos (vide Physician's Desk Reference, 53rd edition, Medical Economics Company Inc, Montvale, N.J. (1999). Tratamento imunossupressor é tipicamente continuado em intervalos por um período de uma semana, um mês, três meses, seis meses ou um ano. Em alguns pacientes, o tratamento é administrado por toda a vida de um paciente.

[0261] Quando os agentes terapêuticos da presente invenção sãoadministrados em conjunto com outro agente, os dois podem ser ad-ministrados sequencialmente em ordem ou simultaneamente. Em alguns aspectos, um anticorpo da presente invenção é administrado a um indivíduo que também está recebendo terapia com um segundo agente (por exemplo, verteporfina). Em outros aspectos, a molécula de ligação é administrada em conjunto com tratamentos cirúrgicos.

[0262] Agentes adequados para tratamento de combinação comanticorpos de ligação à C5 incluem agentes conhecidos na técnica que são capazes de modular as atividades de componentes do comple- mento (vide, por exemplo, Patente U.S. No. 5.808.109). Foi relatado que outros agentes diminuem a atividade mediada por complemento. Tais agentes incluem: aminoácidos (Takada, Y. et al. Immunology 1978, 34, 509); ésteres de fosfonato (Becker, L. Biochem. Biophy. Acta 1967, 147, 289); substâncias polianiônicas (Conrow, R. B. et al. J. Med. Chem. 1980, 23, 242); fluoretos de sulfonila (Hansch, C.; Yoshimoto, M. J. Med. Chem. 1974, 17, 1160, e referências citadas nestes); polinucleotídeos (DeClercq, P. F. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1975, 67, 255); ácidos pimáricos (Glovsky, M. M. et al. J. Immunol. 1969, 102, 1); porfinas (Lapidus, M. and Tomasco, J. Immu- nopharmacol. 1981, 3, 137); vários anti-inflamatórios (Burge, J. J. et al. J. Immunol. 1978, 120, 1625); fenóis (Muller-Eberhard, H. J. 1978, em Molecular Basis of Biological Degradative Processes, Berlim, R. D. et al., eds. Academic Press, New York, p. 65); e benzamidinas (Vogt, W. et al Immunology 1979, 36, 138). Alguns destes agentes funcionam pela inibição geral de proteases e esterases. Outros não são específicos para alguma etapa particular intermediária na via de complemento, mas, preferencialmente inibem mais de uma etapa da ativação de complemento. Exemplos dos últimos compostos incluem as benzami- dinas, que bloqueiam a utilização de C1, C4 e C5 (ver, por exemplo, Vogt et al. Immunol. 1979, 36, 138).

[0263] Agentes adicionais conhecidos na técnica que podem inibira atividade de componentes do complemento incluem K-76, um meta- bólito fúngico de Stachybotrys (Corey et al., J. Amer. Chem. Soc. 104: 5551, 1982). Ambos K-76 e K-76 COOH foram mostrados inibir ocomplemento principalmente na etapa de C5 (Hong et al., J. Immunol. 122: 2418, 1979; Miyazaki et al., Microbiol. Immunol. 24: 1091, 1980), e prevenir a geração de um fator quimiotático do complemento humano normal (Bumpers et al., Lab. Clinc. Med. 102: 421, 1983). Em altas concentrações de K-76 ou K-76 COOH, um pouco de inibição das rea- ções de C2, C3, C6, C7, e C9 com seus respectivos intermediários precedentes é exibida. Também foi relatado que K-76 ou K-76 COOH inibe o sistema inativador de C3b do complemento (Hong et al., J. Immunol. 127: 104-108, 1981). Outros agentes adequados para praticar métodos da presente invenção incluem griseofulvina (Weinberg, em Principles of Medicinal Chemistry, 2nd Ed., Foye, W. O. ed., Lea & Febiger, Philadelphia, Pa, p. 813, 1981), isopanarina (Djura et al.,Aust. J. Chem.36: 1057, 1983), e metabólitos de Siphonodictyon coral- li-phagum (Sullivan et al., Tetrahedron 37: 979, 1981).

[0264] Um regime de terapia de combinação pode ser aditivo oupode produzir resultados sinergísticos (por exemplo, reduções da atividade da via de complemento mais do que esperadas para o uso combinado dos dois agentes). Em algumas modalidades, a presente invenção fornece uma terapia de combinação para prevenção e/ou tratamento de AMD ou outra doença relacionada ao complemento como descrito acima com um anticorpo de ligação à C5 da invenção e um anti-angiogênico, tal como agente anti-VEGF.

5.5. Usos Diagnósticos

[0265] Em um aspecto, a invenção engloba ensaios diagnósticospara determinação da expressão proteica e/ou de ácido nucleico de C5 bem como a função da proteína C5, no contexto de uma amostra biológica (por exemplo, sangue, soro, células, tecido) ou do indivíduo que sofre com uma doença ou um distúrbio, ou está em risco de desenvolver um distúrbio associado a AMD.

[0266] Ensaios diagnósticos, tais como ensaios competitivos dependem da capacidade de um análogo marcado (o "rastreador") competir com o analito da amostra de teste por um número limitado de sítios de ligação em um parceiro de ligação comum. O parceiro de ligação geralmente é insolubilizado antes ou após competição e então o rastreador e o analito ligados ao parceiro de ligação são separados do rastreador e analito não ligados. Esta separação é realizada por decantação (onde o parceiro de ligação foi pré-insolubilizado) ou por centrifugação (onde o parceiro de ligação foi precipitado após reação competitiva). A quantidade do analito de amostra de teste é inversamente proporcional à quantidade do rastreador ligado como medido pela quantidade da substância marcadora. Curvas dose-resposta com quantidades conhecidas do analito são preparadas e comparadas aos resultados do teste a fim de determinar quantitativamente a quantidade presente de analito na amostra de teste. Estes ensaios são chamados sistemas ELISA quando enzimas são usadas como marcadores detec- táveis. Em um ensaio desta forma, a ligação competitiva entre anticor-pos e anticorpos de ligação à C5 resulta na proteína C5 ligada, prefe-rencialmente os epítopos C5 da invenção, sendo uma medida de anticorpos na amostra sérica, ainda mais particularmente, neutralizando anticorpos na amostra sérica.

[0267] Uma vantagem significante do ensaio consiste em que amedida de neutralização de anticorpos é feita diretamente (isto é, aqueles que interferem na ligação de proteína C5, especificamente, epítopos). Tal ensaio, particularmente na forma de um teste ELISA tem aplicações consideráveis no ambiente clínico e no rastreamento de sangue de rotina.

[0268] Técnicas imunológicas empregam anticorpos policlonais oumonoclonais contra os epítopos diferentes de vários componentes do complemento (por exemplo, C3, C4, C5) para detectar, por exemplo, os produtos de clivagem de componentes do complemento (ver, por exemplo, Hugli et al., Immunoassays Clinical Laboratory Techniques 443-460, 1980; Gorski et al., J Immunol Meth 47: 61-73, 1981; Linder et al., J Immunol Meth 47: 49-59, 1981; e Burger et al., J Immunol 141: 553-558, 1988). Ligação do anticorpo com o produto de divisão na competição com uma concentração conhecida do produto de divisão marcado então pode ser medida. Vários ensaios, tais como radioimu- noensaios, ELISA's, e ensaios de difusão radiais estão disponíveis para detectar produtos de clivagem de complemento.

[0269] Técnicas imunológicas fornecem alta sensibilidade para detectar a ativação de complemento, uma vez que permitem a medida da formação de produto de clivagem no sangue de um indivíduo de teste e indivíduos de controle com ou sem distúrbios relacionados à degeneração macular. Consequentemente, em alguns métodos da presente invenção, o diagnóstico de um distúrbio associado a distúrbios oculares é obtido pela medida da ativação de complemento anormal pela quantificação dos produtos de clivagem solúveis de componentes do complemento no plasma sanguíneo de um indivíduo de teste. As medidas podem ser realizadas como descrito, por exemplo, em Chenoweth et al., N Engl J Med 304: 497-502, 1981; e Bhakdi et al., Biochim Biophys Acta 737: 343-372, 1983. Preferencialmente, somente a ativação de complemento formado in vivo é medida. Isto pode ser realizado pela coleta de uma amostra biológica do indivíduo (por exemplo, Soro) em meio contendo inibidores do sistema de complemento, e posteriormente medindo ativação de complemento (por exemplo, quantificação dos produtos de clivagem) na amostra.

[0270] No diagnóstico clínico ou monitoramento de pacientes comdistúrbios associados a doenças ou distúrbios oculares, a detecção de proteínas de complemento em comparação com os níveis em uma amostra biológica correspondente de um indivíduo normal é indicativa de um paciente com distúrbios associados à degeneração macular.

[0271] Diagnóstico ou imagem in vivo é descrito emUS2006/0067935. Resumidamente, estes métodos geralmente compreendem administração ou introdução em um paciente de uma quantidade diagnosticamente eficaz de uma molécula de ligação à C5 que é operacionalmente ligada a um marcador ou marcação que é detec- tável por métodos não invasivos. O conjugado anticorpo-marcador é deixado por tempo suficiente para localizar e se ligar a proteínas do complemento dentro do olho. O paciente então é exposto a um dispositivo de detecção para identificar o marcador detectável, dessa maneira formando uma imagem da posição das moléculas de ligação à C5 no olho de um paciente. A presença de C5 que se liga ao anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo é detectada pela determinação se um marcador do anticorpo liga-se a um componente do olho. Detecção de um nível aumentado em proteínas de complemento selecionadas ou uma combinação da proteína em comparação com um indivíduo normal sem doença AMD é indicativa de uma predisposição e/ou início de distúrbios associados à degeneração macular. Estes aspectos da invenção também são preferenciais para uso em métodos de visualização ocular e combinados com diagnóstico angiogênico e métodos de tratamento.

[0272] A invenção também pertence ao campo da medicina predi-tiva, na qual ensaios diagnósticos, ensaios prognósticos, farmacoge- nômicos e testes clínicos de monitoramento são usados para fins prognósticos (preditivos) por meio disso para tratar profilaticamente um indivíduo.

[0273] A invenção também fornece ensaios prognósticos (ou predi-tivos) para determinar se um indivíduo está em risco de desenvolver um distúrbio associado à desregulação da atividade da via de complemento. Por exemplo, mutações em um gene C5 podem ser analisadas em uma amostra biológica. Tais ensaios podem ser usados para fins prognósticos ou preditivos por meio disso tratar profilaticamente um indivíduo antes do início de um distúrbio caracterizado ou associado à proteína C5, expressão ou atividade de ácido nucleico.

[0274] Outro aspecto da invenção fornece métodos para determinação da expressão de ácido nucleico C5 ou da atividade de proteína C5 em um indivíduo para selecionar por meio disso agentes terapêuticos ou profiláticos apropriados para aquele indivíduo (referido neste pedido como "farmacogenômicos"). Farmacogenômicos permitem a seleção de agentes (por exemplo, fármacos) para o tratamento terapêutico ou profilático de um indivíduo com base no genótipo do indivíduo (por exemplo, o genótipo do indivíduo examinado para determinar a capacidade do indivíduo de responder a um agente particular).

[0275] Ainda outro aspecto da invenção pertence ao monitoramento da influência de agentes (por exemplo, fármacos) de acordo com a expressão ou atividade da proteína C5 em testes clínicos.

5.6. Composições Farmacêuticas

[0276] A invenção fornece composições farmacêuticas compreendendo os anticorpos de ligação à C5 (fragmentos intactos ou de ligação) formuladas em conjunto com veículo farmaceuticamente aceitável. As composições podem conter adicionalmente um ou mais agentes terapêuticos que são adequados para tratamento ou prevenção de uma doença associada ao complemento (por exemplo, AMD). Veículos farmacêuticos aumentam ou estabilizam a composição, ou facilitam a preparação da composição. Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes anti- bacterianos e antifúngicos, isotônicos e agentes de retardo de absorção e similares que são fisiologicamente compatíveis.

[0277] Uma composição farmacêutica da presente invenção podeser administrada por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. A via e/ou o modo de administração variam dependendo dos resultados desejados. É preferencial que a administração seja intravenosa, intramuscular, intraperitonial, ou subcutânea, ou administrada próxima ao sítio-alvo. Em uma modalidade específica, anticorpos da invenção são formulados para que possam ser administrados intravitrealmente no olho. Veículo farmaceuticamente aceitável deve ser adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, espinhal ou epidérmica (por exemplo, por injeção ou infusão). Dependendo da via da administração, o composto ativo, isto é, o anticorpo, molécula biespecífica e multiespecífica, pode ser coberto com um material para proteger o composto da ação de ácidos e outras condições naturais que podem inativar o composto.

[0278] A composição deve ser estéril e fluida. Fluidez apropriadapode ser mantida, por exemplo, pelo uso de revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário em caso da dispersão e pelo uso de tensoativos. Em muitos casos, é preferencial incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tais como manitol ou sorbitol e cloreto de sódio na composição. Absorção de longa duração das composições injetáveis pode ser ocasionada pela inclusão na composição um agente de retardo de absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio ou gelatina.

[0279] Composições farmacêuticas da invenção podem ser preparadas conforme métodos bem conhecidos e praticados rotineiramente na técnica. Vide, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co, 20th ed., 2000; e Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc, New York, 1978. Composições farmacêuticas são preferencialmente produzidas sob condições GMP. Tipicamente, uma dose terapeuticamente eficaz ou dose eficaz do anticorpo de ligação à C5 são empregadas nas composições farmacêuticas da invenção. Os anticorpos de ligação à C5 são formulados em formas de dosagem far- maceuticamente aceitáveis por métodos convencionais conhecidos por aqueles versados na técnica. Regimes de dosagem são ajustados para fornecer a resposta ótima desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, um bolus único pode ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parenterais na forma de dosagem unitária para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. Forma de dosagem unitária como usada neste pedido refere-se a unidades fisicamente discretas ajustadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada do composto ativo calculado para produzir o efeito terapêutico desejado em parceria com veículo farmacêutico necessário.

[0280] Níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados para obter uma quantidade do ingrediente ativo que é eficaz para alcançar a resposta terapêutica desejada de um paciente, composição e modo de administração particular, sem ser tóxico ao paciente. O nível de dosagem selecionado depende de uma variedade de fatores far- macocinéticos incluindo a atividade das composições particulares da presente invenção empregada, ou o éster, sal ou amida das mesmas, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto particular sendo empregados, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições particulares empregadas, a idade, sexo, peso, condição, saúde geral e história médica prévia do paciente sendo tratado e fatores similares.

[0281] Um médico ou veterinário pode iniciar doses dos anticorposda invenção empregadas na composição farmacêutica em níveis mais baixos do que aqueles necessários para alcançar o efeito terapêutico desejado e gradualmente aumentar a dosagem até que o efeito desejado seja alcançado. Em geral, doses eficazes das composições da presente invenção, para o tratamento de um distúrbio inflamatório alérgico descrito neste pedido variam dependendo de muitos fatores diferentes, incluindo meios de administração, sítio-alvo, estado fisiológico do paciente, se o paciente é um ser humano ou um animal, outras medicações administradas, e se o tratamento é profilático ou terapêutico. Dosagens de tratamento têm que ser tituladas para otimizar a segurança e a eficácia. Para administração sistêmica com um anticorpo, a dosagem varia de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg, e mais normalmente 0,01 a 15 mg/kg, do peso corporal do hospedeiro. Um regime de tratamento exemplar implica administração sistêmica uma vez a cada duas semanas ou uma vez por mês ou uma vez a cada 3 a 6 meses. Para administração intravitreal com um anticorpo, a dosagem varia de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 10 mg. Um regime de tratamento exemplar implica a administração sistêmica uma vez a cada duas semanas ou uma vez por mês ou uma vez a cada 3 a 6 meses.

[0282] Anticorpo é normalmente administrado em múltiplas ocasiões. Intervalos entre dosagens únicas podem ser semanalmente, mensalmente ou anualmente. Intervalos também podem ser irregulares como indicado pela medida dos níveis sanguíneos do anticorpo de ligação à C5 no paciente. Em alguns métodos de administração sistêmica, a dosagem é ajustada para alcançar uma concentração plasmá- tica de anticorpo de 1 a 1000 μg/mL e em alguns métodos de 25 a 500 μg/mL. Alternativamente, o anticorpo pode ser administrado como uma formulação de liberação sustentada, caso em que a administração menos frequente é necessária. Dosagem e frequência variam dependendo da meia-vida do anticorpo no paciente. Em geral, anticorpos humanizados mostram meia-vida mais longa do que aquela de anticorpos quiméricos e anticorpos não humanos. A dosagem e a frequência de administração podem variar dependendo se o tratamento é profilático ou terapêutico. Em aplicações profiláticas, uma dosagem relativamente baixa é administrada em intervalos relativamente raros ao longo de um período de tempo extenso. Alguns pacientes continuam recebendo o tratamento pelo resto de suas vidas. Em aplicações terapêuticas, uma dosagem relativamente alta em intervalos relativamente curtos é às vezes necessária até que a progressão da doença seja reduzida ou terminada, e preferencialmente até que o paciente mostre melhoria parcial ou completa de sintomas da doença. Após isso, ao paciente pode ser administrado um regime profilático.

6. EXEMPLOS

[0283] Os seguintes exemplos são fornecidos para ilustrar a invenção, mas não limitar seu escopo. Outras variantes da invenção serão prontamente evidentes para um técnico no assunto e são englobadas pelas reivindicações adicionadas.Exemplo 1: Geração de C5 de cinomolgus e C5 de ser humano1. Geração de C5 de cinomolgus

[0284] C5 de cinomolgus foi purificada com sucesso do soro decinomolgus por cromatografia por afinidade usando IgG1 hu MOR07086. C5 de cinomolgus foi qualitativamente testada por SDS- PAGE, Western blot, espectrometria de massa e ensaios hemolíticos. Foi mostrado que a qualidade da C5 de cinomolgus purificada era alta por SDS-PAGE e Western blot. A ausência da contaminação de C3 foi confirmada por SDS e Western blot. Além disso, a identidade do cino- molgus à sequência de C5 foi determinada pela análise espectrométri- ca de massa e a atividade de C5 de cinomolgus purificada foi testada em ensaios hemolíticos. Em ensaios hemolíticos, a nova preparação foi equipotente à C5 de ser humano (por exemplo, Amostra 6, que foi usada em separação de maturação por afinidade, atividade de complemento reconstituída do soro depletado de C5 de ser humano 20% com atividade similar à C5 de ser humano purificada).2. Controle de Qualidade de Proteínas C5 Biotiniladas e Não Biotinila- das de Ser humano e Cinomolgus

[0285] Bioatividade de C5 de ser humano purificada foi caracterizada e confirmada pela atividade hemolítica da via alternativa. C5 foi inserida no soro humano depletado de C5 em concentrações variadas para obter uma EC50. Valores de EC50 variando entre 0,02 e 0,1nM foram considerados aceitáveis.

[0286] Antes do uso, bioatividade de cada lote de proteína C5 deser humano purificada foi testada no ensaio hemolítico. O mesmo controle de qualidade foi feito para a C5 de cinomolgus após purificação do soro de cinomolgus. Após biotinilação da C5 de ser humano e de cinomolgus, a bioatividade do material também foi testada em ensaios hemolíticos, a fim de analisar se houve uma perda da atividade causada por biotinilação.Exemplo 2: Geração de anticorpos específicos para C5 a partir da Biblioteca HuCAL GOLD®

[0287] Anticorpos para C5 foram gerados por seleção de clonestendo altas afinidades de ligação, usando como fonte de proteínas variantes de anticorpo uma biblioteca de exposição de fago comercialmente disponível, biblioteca de HuCAL GOLD® MorphoSys.

[0288] A biblioteca HuCAL GOLD® é uma biblioteca de Fab(Knappik et al., 2000) na qual as seis CDRs são diversificadas por mutação apropriada, e que emprega a tecnologia CysDisplay® para ligar o Fab à superfície do fago (WO01/05950, Lohning et al., 2001).3. Seleção por separação de anticorpos específicos para C5 a partir da biblioteca

[0289] Para a seleção de anticorpos contra C5, duas estratégiasde separação diferentes foram aplicadas. Seis agrupamentos diferentes foram individualmente submetidos a três ciclos de: (a) uma separação em fase sólida onde os antígenos (C5 de ser humano e de cino- molgus) foram diretamente cobertos em placas de microtítulo de 96 poços Maxisorp (Nunc, Wiesbaden, Alemanha); ou (b) uma solução de separação com C5 de ser humano biotinilada e de cinomolgus onde o complexo fago-antígeno foi capturado por contas magnéticas com Es- treptavidina (Dynabeads M 280; Dynal) para cada agrupamento de separação.

[0290] A biblioteca HuCAL GOLD® foi amplificada em meio 2xYTcontendo cloranfenicol a 34 μg/mL e glicose a 1% (2xYT-CG). Após infecção com fago auxiliar VCSM13 em uma OD600nm de 0,5 (30 min a 37°C sem agitação; 30 min a 37°C agitação a 250 rpm), células foram centrifugadas (4120 g; 5 min; 4°C), ressuspensas em 2xYT / clo- ranfenicol a 34 μg/mL / canamicina a 50 μg/mL / IPTG a 0,25mM e cultivadas por uma noite a 22°C. O fago foi precipitado por PEG a partir do sobrenadante, ressuspenso em PBS / glicerol 20% e armazenado a -80°C. Amplificação de fago entre dois ciclos de separação foi conduzida como se segue: células de E. coli TG1 em fase mid-log foram infectadas com fago eluído e plaqueadas em ágar LB suplementado com 1% de glicose e 34 μg/mL de cloranfenicol (placas LB-CG). Após incubação por uma noite a 30°C, as colônias TG1 foram raspadas das placas de ágar e usadas para inocular 2xYT-CG até que uma OD600nm de 0,5 fosse alcançada. O fago auxiliar VCSM13 foi adicionado para infecção como descrito acima.

[0291] Tomados em conjunto 354 clones derivados de todas asestratégias de separação foram sequenciados, resultando em 64 clones únicos com o perfil desejado: ligação à C5 de ser humano e de cinomolgus e nenhuma ligação aos contra-alvos C3 e C4.

[0292] 45 clones derivados da separação em fase sólida e 19 clones de separação em solução foram selecionados para expressão e purificação proteica. Quatro Fabs a partir de separação em fase sólida (MOR06525, MOR06756, MOR06757 e MOR06763) e 6 Fabs a partir de separação em solução (MOR07086, MOR07087, MOR07091,MOR07092, MOR07093 e MOR07094) introduzidos em maturação por afinidade.Separação em Fase Sólida Contra C5 em Proteína Diretamente Coberta

[0293] A primeira variante de separação foi separação em fasesólida alternando C5 de ser humano (primeiro e terceiro ciclo de seleção) e C5 de cinomolgus (o segundo ciclo de seleção).

[0294] Três poços de uma placa Maxisorp (F96 Nunc-Immunoplate) foram cobertos com 200 μL de C5 50nM cada um por uma noite a 4°C. Os poços cobertos foram lavados 2x com 400 μL de PBS e bloqueados com 350 μL de MPBS 5% por 2h a TA em um agitador de placa de microtítulo. Para cada separação, aproximadamente 1013 anticorpos do fago HuCAL GOLD® foram bloqueados com volume igual de PBST/leite em pó 5% por 2h à temperatura ambiente. Os poços cobertos foram lavados 2x com 400 μL de PBS após procedimento de bloqueio. 200 μL de anticorpos do fago HuCAL GOLD® pré- bloqueados foram adicionados a cada poço coberto e incubados por 2h a TA em um agitador. A lavagem foi realizada pela adição de cinco vezes 350 μL de PBS/Tween 0,05%, seguida pela lavagem outras cinco vezes com PBS. Para algumas condições de separação um procedimento mais estringente de lavagem foi aplicado.

[0295] Eluição do fago da placa foi realizada com 200 μL de DTT20 mM em Tris 10 mM/HCl pH8 por poço por 10 min. O eluato de fago DTT foi adicionado a 15mL de E.coli TG1, que foram cultivados a uma OD600 de 0,6 a 0,8 a 37°C em meio 2YT e incubados em tubos plásticos de 50mL por 45 minutos a 37°C sem agitação para infecção de fago. Após centrifugação por 5 min a 4120 x g, os precipitados bacteri- anos foram ressuspensos em 600 μL de meio 2xYT, plaqueados em placas de ágar 3xYT-CG e incubados por uma noite a 37°C. Colônias foram raspadas das placas e os fagos foram resgatados e amplificados como descrito acima.

[0296] O segundo e o terceiro ciclos de separação em fase sólidaforam realizados de acordo com o protocolo da primeira etapa. Na segunda etapa de seleção para algumas condições de separação, a produção da primeira etapa foi usada para seleções em C5 de cinomolgus a fim de enriquecer para anticorpos inter-reativos de cinomolgus.

[0297] Para algumas condições de lavagem de separação, estrin-gência foi aumentada e concentração de antígeno foi reduzida em três etapas de seleção a fim de gerar anticorpos de alta afinidade.

[0298] A biblioteca de fagemídeo HuCAL GOLD® foi usada paraselecionar fragmentos de anticorpo Fab específico contra C5 de ser humano. A primeira estratégia era uma separação em fase sólida na proteína C5 de ser humano coberta diretamente (separação com procedimento descrito acima).

[0299] Após a 3a etapa de separação, os agrupamentos de fagoenriquecidos foram subclonados do vetor de biblioteca pMORPH® 23 (permitindo exposição de anticorpo eficiente na superfície de fago) no vetor de expressão pMORPH® x9_Fab_MH que medeia a expressão periplasmática de Fabs solúveis. Clones únicos foram escolhidos e Fabs solúveis foram expressos destes clones únicos.

[0300] No total, 6624 clones foram analisados no rastreamentoprimário que foi realizado pela ligação dos Fabs diretamente dos lisa- dos bacterianos à C5 de ser humano imobilizada em placas de microtí- tulo Maxisorp. 1660 acertos foram obtidos do rastreamento primário em C5 de ser humano com sinais > 5 vezes acima do fundo. 384 acertos foram ainda analisados em um rastreamento secundário para confirmar ligação à C5 de ser humano e rastrear para ligação aos contra- alvos C3 e C4 humanas.

[0301] Muitos acertos primários podem ser confirmados em C5 deser humano e não mostraram inter-reatividade para C3 e C4 humanas, mas somente 6 Fabs tinham fraca interreatividade à C5 de cinomolgus.

[0302] Como uma primeira consequência, novas separações emfase sólida foram realizadas alternando em C5 de ser humano e de cinomolgus. Em paralelo, controles de qualidade da batelada de C5 de cinomolgus purificada revelaram uma alta quantidade de C3 de cino- molgus dentro da batelada de C5 de cinomolgus. Considerando estes resultados, um novo método para rastrear anticorpos interreativos de cinomolgus foi aplicado. C5 de cinomolgus foi capturado do soro de cinomolgus usando um anticorpo policlonal de ligação à C5 (ver Exemplo 3, seção 3). Usando este método, os acertos primários iniciais foram rastreados novamente na C5 de cinomolgus e 56 clones foram confirmados para ligação à C5 de cinomolgus.

[0303] Para separações em fase sólida alternadas, a 1a saída daetapa das 12 separações em fase sólida humana mais bem sucedida foi usada para seleções na C5 de cinomolgus (batelada proteica contaminada com C3 de cinomolgus; não conhecida durante separações). 376 clones foram confirmados em um rastreamento secundário para ligação à C5 de ser humano e 361 clones para ligação à C5 de cino- molgus capturados do soro de cinomolgus.Separação em Solução em Proteína C5 Biotinilada

[0304] A segunda variante de separação foi separação em soluçãocontra C5 de ser humano biologicamente ativa biotinilada (em ensaios hemolíticos) e C5 de cinomolgus biotinilada.

[0305] Para esta separação, 200 μL de contas magnéticas de Es-treptavidina (Dynabeads M 280; Dynal) foram lavadas uma vez com PBS e bloqueadas com Chemiblocker por 2h a TA. 300 μL de fago diluído em PBS foram bloqueados também com Chemiblocker por 12h a TA em um rotor. Os fagos bloqueados foram duas vezes pré- adsorvidos contra 50 μL de contas magnéticas de Estreptavidina bloqueadas por 30 minutos. O sobrenadante de fago foi transferido para um novo tubo de reação bloqueado de 2mL e C5 biotinilada humana foi adicionada e incubada por 1h a TA em um rotor. 100 μL de contas magnéticas de Estreptavidina bloqueadas foram adicionados a cada agrupamento de separação e incubados por 10 minutos em um rotor. As contas foram coletadas com um separador de partículas (Dynal MPC-E) por aproxim. 2,5 minutos e a solução foi removida cuidadosamente.

[0306] As contas então foram lavadas 7x em PBS/Tween 0,05 %usando um rotor, seguido por lavagem outras três vezes com PBS. Eluição do fago das Dynabeads foi realizada pela adição de 200 μL de DTT 20 mM em Tris/HCl a 10 mM pH 8 a cada tubo e incubação por 10 min. Dynabeads foram removidas pelo separador de partículas magnéticas e o sobrenadante foi adicionado a 15mL de uma cultura de E.coli TG-1 cultivada a OD600nm de 0,6 a 0,8. As contas então foram lavadas uma vez com 200 μL de PBS e em conjunto com fagos adicionalmente removidos, PBS foi adicionado a 15mL de cultura de E.coli TG-1. Para infecção de fago, a cultura foi incubada em tubos plásticos de 50mL por 45 minutos a 37°C sem agitação. Após centrifugação por 5 minutos a 4120 x g, os precipitados bacterianos foram ressuspensos cada um em 600 μL de meio 2xYT, plaqueados em placas de ágar 3xYT-CG e incubados por uma noite a 37 °C. As colônias foram raspadas das placas e os fagos foram resgatados e amplificados como descrito acima. As segunda e terceira etapas da seleção foram realizadas de um modo idêntico à primeira etapa da seleção.

[0307] Uma estratégia de separação adicional foi separação emsolução usando C5 de ser humano e alternando C5 de ser humano e de cinomolgus (lote proteico contaminado com C3 de cinomolgus, não conhecido durante as separações). Por isso, as proteínas foram bioti- niladas e a bio-funcionalidade conservada após o procedimento de biotinilação ser confirmada em bioensaios hemolíticos.

[0308] O complexo fago-antígeno foi capturado em contas magné- ticas de Estreptavidina através da porção biotina do antígeno. Após lavagem, somente fago ligado específico foi eluído (procedimento de separação descrito acima).

[0309] O primeiro rastreamento foi feito em proteínas diretamentecobertas (ver Exemplo 3, seção 1) e somente 80 clones podem ser confirmados em C5 de ser humano. Devido a durante as separações o antígeno ter sido mantido em solução, um novo método de rastrea- mento foi desenvolvido. Em uma solução de ELISA, os Fabs foram incubados com o antígeno biotinilado em uma placa NeutrAvidin. Usando este procedimento de rastreamento em solução, uma quantidade significativamente mais alta de clones específicos de C5 de ser humano e de cinomolgus pode ser selecionada. Estes resultados confirmaram que muitos Fabs derivados de separações em solução reconhecem C5 somente em solução ou quando capturado (por exemplo, através de um anticorpo de ligação à C5 policlonal).4. Subclonagem e Expressão de Fragmentos de Fab Selecionados

[0310] Para facilitar expressão rápida de Fabs solúveis, os insertosque codificam Fab dos fagos de HuCAL GOLD® selecionados foram subclonados através de XbaI e EcoRI no vetor de expressão de E. coli pMORPH® x9_MH. Fragmentos Fab carregam uma marcação Myc C- terminal e como uma segunda marcação C-terminal, a marcação His 6x (Chen et al., Gene 139:73-75 (1994)). Após transformação dos plasmídeos de expressão em células de E. coli TG1 F, clones únicos resistentes a cloranfenicol foram escolhidos nos poços de uma placa de microtítulo preenchida de 384 poços estéreis com 60 μL de meio 2xYT-CG e cultivados por uma noite a 30°C. 5 μL de cada cultura de E.coli TG-1 por uma noite foram transferidos para uma placa de micro- título preenchida com 96 poços frescos, estéreis de 40 μL de meio 2xYT suplementado com cloranfenicol 34 μg/mL por poço. As placas de microtítulo foram incubadas a 30°C agitando a 400 rpm em um agi- tador de microplaca até que as culturas estivessem curtamente turvas (~2 a 4 h) com uma OD600nm de ~0,5. A estas placas de expressão, 10 μL de meio 2xYT suplementado com cloranfenicol 34 μg/mL e IPTG 3 mM (isopropil-e-D-thiogalactopiranosídeo) foram adicionados por poço (concentração final IPTG 0,5 mM). As placas de microtítulo foram seladas com uma fita permeável a gás, e incubadas por uma noite a 30°C agitando a 400 rpm. A cada poço das placas de expressão, 15 μL tampão BEL foram adicionados contendo lisozima 2,5 mg/mL, EDTA a 4 mM e Benzonase a 10U/μl e incubados por 1h a 22°C em um agitador de placa de microtítulo (400 rpm) seguido por uma etapa de congelamento opcional por pelo menos 2h a -80°C. Os extratos de BEL foram usados para análise de ligação por ELISA ou rastreamento de Fab SET após maturação por afinidade.

[0311] Expressão de fragmentos Fab codificados por pMORPH®x9_Fab_MH em células TG-1 foi realizada em culturas de frasco de agitador usando 750mL de meio 2xYT suplementado com cloranfenicol a 34 μg/mL. Culturas foram agitadas a 30°C até que a OD600nm alcançasse 0,5. A expressão foi induzida pela adição de IPTG a 0,75 mM por 20h a 30°C. Células foram rompidas usando lisozima e fragmentos Fab isolados por cromatografia Ni-NTA (Qiagen, Hilden, Alemanha). Troca de tampão por PBS de Dulbecco 1 x (pH 7,2) foi realizada usando colunas PD10. Amostras foram filtradas esterilmente (0,2 μm, Millipore). Pureza de amostras foi determinada no estado desnaturado, reduzido por SDS-PAGE (Géis de Critério a 15%, BioRad) e no estado nativo por cromatografia por exclusão de tamanho (HP-SEC). Concentrações proteicas foram determinadas por espectrofotometria em UV (Krebs et al., J. Immunol. Methods 254:67-84 (2001)).

[0312] No nível de Fab, as taxas de expressão globais e a porcentagem de fração monomérica em SEC (Cromatografia por Exclusão de Tamanho) variaram de aceitáveis a boas para a maioria dos fragmen- tos de anticorpo identificados. 64 Fabs parentais foram expressos e 61 Fabs podem ser purificados. 60 Fabs maduros por afinidade foram purificados na escala de mg. A maioria dos Fabs foi de bons expressores e não tinham nenhuma tendência à agregação.Exemplo 3: Identificação de anticorpos específicos para C5 da Biblioteca de HuCAL GOLD®

[0313] Abaixo, quatro diferentes métodos de Ensaio Imunoabsor-vente Ligado à Enzima (ELISA) descrevem o rastreamento de anticorpos de ligação à C5 (como lisados de BEL bacteriana ou Fabs purificado) em antígenos específicos e contra-antígenos.5. Rastreamento em proteína Diretamente Coberta

[0314] Placas de 384 poços Maxisorp (Nunc, Rochester, NY, USA)foram cobertas com 20 μL por poço de antígeno 2,5 μg/mL (C5 de ser humano e contra-proteínas C3 e C4 humanas) em PBS, pH 7,4 por uma noite a 4°C. Em paralelo, placas foram cobertas com 20 μL por poço de IgG anti-humana de ovelha 5 μg/mL, fragmento Fd específico (The Binding Site, Birmingham, UK), diluído em PBS, pH 7,4 para verificar o nível de expressão Fab.

[0315] As placas foram bloqueadas com PBS/Tween 20 (PBST)0,05% contendo leite em pó a 5% por 12h a TA. Após lavagem dos poços com PBST, extratos de BEL, Fabs purificados HuCAL GOLD® ou Fabs controle diluídos em PBS foram adicionados e incubados por 1 h a TA. Para detectar ligação de Fab, anticorpo anti-HIS6 acoplado à peroxidase foi aplicado (Roche).

[0316] Para detecção de substrato fluorogênico POD-conjugado,QuantaBlu (Pierce) foi usado de acordo com instruções do fabricante. Entre todas as etapas de incubação, os poços das placas de microtítu- lo foram lavados três vezes e cinco vezes com PBST após a incubação final com o anticorpo secundário. Fluorescência foi medida em um leitor de placa Tecan GENios Pro. 6. Rastreamento em Solução com Proteínas Biotiniladas

[0317] O método ELISA descrito abaixo foi usado para rastrearFabs HuCAL GOLD® após separação em solução usando proteínas de complemento biotiniladas.

[0318] Placas NeutrAvidin foram bloqueadas com Chemiblocker 1x(Chemicon) diluído em PBS por uma noite a 4°C. Estas placas foram usadas para rastrear a ligação a C5 de ser humano e aos contra-alvos C3 e C4. Em paralelo, placas de 384 poços Maxisorp (Nunc, Rochester, NY, USA) foram cobertas com 20 μL por poço de IgG anti-humano de ovelha 5 μg/mL, fragmento Fd específico (The Binding Site, Birmingham, UK), diluído em PBS, pH 7,4. Estas placas foram usadas para verificar níveis de expressão Fab e ligação de biotina não específica. No dia seguinte, placas Maxisorp cobertas foram lavadas 2x com PBST e bloqueadas com BSA 3% em TBS por 12h a TA. Extratos de BEL periplasmática contendo Fabs ou Fabs HuCAL GOLD® purificados foram adicionados tanto a NeutrAvidin bloqueada como placas Maxi- sorp.

[0319] Posteriormente, 20 μL por poço de C5 de ser humano bioti-nilada (para detectar a ligação específica) e em paralelo, C3 e C4 humanas biotiniladas (para detectar ligação não desejada) foram adicionados a poços das placas NeutrAvidin. Antígenos biotinilados foram incubados com Fabs HuCAL GOLD® por 12h a TA. Antígeno não relacionado biotinilado Transferrina então foi adicionado às placas Maxi- sorp para verificar Fabs de ligação à biotina (neste caso os fragmentos HuCAL®-Fab foram anteriormente capturados através do anticorpo an- ti-Fd).

[0320] Após anticorpos secundários serem aplicados para detecção: fragmento F(ab')2 Estreptavidina-AP conjugada à fosfatase alcalina (AP) AffiniPure, de cabra anti-humano, foi adicionado às placas de expressão Maxisorp; anticorpo de camundongo conjugado à Peroxida- se anti-HIS6, Roche, foi adicionado às placas NeutrAvidin e Estrepta- vidina-Fosfatase alcalina, ZYMED, foi adicionada às placas Maxisorp com a Transferrina biotinilada.

[0321] Para a detecção de conjugados a AP, substrato fluorogêni-co AttoPhos (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha) e para detecção de conjugados POD, substrato fluorogênico QuantaBlu (Pierce) foram usados de acordo com as instruções do fabricante. Fluorescência foi medida em um leitor de placa Tecan GENios Pro.

[0322] Usando este método, foi possível rastrear Fabs anti-C5 deser humano que reconhecem C5 de ser humano em solução e excluir a ligação de anticorpos à porção biotina dos antígenos alvo.7. Determinação de interreatividade à C5 de cinomolgus

[0323] Um anticorpo policlonal de ligação à C5 (US Biological Ca-tNoC7850-24) foi usado para capturar a C5 de cinomolgus do soro de cinomolgus.

[0324] Placas de 384 poços Maxisorp foram cobertas com 20μL/po^o de ligação à C5 policlonal 5 μg/mL em PBS e incubadas por uma noite a 4°C. No dia seguinte as placas foram lavadas 3x com PBST e bloqueadas com 100 μL/po^o de diluente (BSA a 4%/ Tween 20 a 0,1%/Triton-X 100 a 0,1%/PBS) por 2 horas a TA. O soro de cinomolgus foi diluído 1:20 no diluente (BSA 4%/ Tween 20 a 0,1%/Triton-X 100 a 0,1%/PBS) (~aprox. concentração de C5 de cinomolgus 4 μg/mL) e 20 μl/po^o foram adicionados às placas Maxisorp lavadas 2x com PBST. Após 1h, incubação a TA, as placas foram lavadas 3x com PBST e lisa- dos de BEL contendo fragmentos de Fab ou Fabs purificados foram adicionados e incubados por 1h a TA. As placas foram lavadas novamente e anticorpo de detecção anti-HIS6-POD (Roche No1965085), foi adicionado. Substrato POD, BM Blue, solúvel, (Roche Applied Science) foi adicionado e a reação foi parada com H2SO41M. Absorvância foi lida em 450 nm usando dispositivo Leitor BMG. Exemplo 4: Maturação por Afinidade1. Construção de Bibliotecas de Maturação por Afinidade de Fabs Se-lecionados de Ligação à C5

[0325] Para aumentar afinidade e atividade biológica de fragmentos de anticorpo selecionados, regiões L-CDR3 e H-CDR2 foram otimizadas em paralelo pela mutagênese de cassete usando mutagênese direcionada a trinucleotídeo (ver, por exemplo, Virnekas et al., Nucleic Acids Res. 22:5600-5607 (1994)), enquanto regiões de estrutura foram mantidas constantes. Antes da clonagem para maturação por afinidade, todos os fragmentos Fab parentais foram transferidos do vetor de expressão correspondente (pMORPH® x9_MH) para dentro do vetor CysDisplayTM pMORPH®25 através de XbaI/EcoRI. pMORPH®25 foi criado do vetor de monitor de HuCAL GOLD® pMORPH®23 pela remoção de um sítio BssHII interferindo na biblioteca de clonagem para otimização de H-CDR2. Para otimização de L-CDR3 de Fabs parentais, L-CDR3, estrutura 4 e região constante das cadeias curtas (405 bp) dos ligantes foram removidas por BpiI/SphI e substituídas por um repertório de L-CDR3s diversificadas em conjunto com a estrutura 4 e o domínio constante.

[0326] 10 Fabs parentais de ligação à C5 foram divididos em 7agrupamentos de acordo com critérios de seleção diferentes e somente Fabs com a mesma estrutura foram unidos: (1) MOR07086; (2) MOR06525 + 6756 (mesma estrutura); (3) MOR06757; (4) MOR06763; (5) MOR07087; (6) MOR07091 + 7092 (mesma estrutura); (7)MOR07093 + 7094 (mesma estrutura).

[0327] Aproximadamente 1,5 μg do fragmento de vetor Fab únicoe do agrupamento de Fab foram ligados com um excesso molar de 3 a 5 vezes do fragmento de inserção que carrega as L-CDR3s diversificadas. Em um segundo conjunto de biblioteca, a H-CDR2 (XhoI/BssHII) foi diversificada enquanto as regiões de estrutura de co- nexão forem mantidas constantes. A fim de monitorar a eficiência de clonagem, a H-CDR2 parental foi substituída por um modelo antes que o cassete de H-CDR2 diversificada fosse clonado.

[0328] Misturas de ligação das bibliotecas diferentes foram eletro-poradas em células de E.coli TOP10 F' (Invitrogen) produzindo de 2x107 a 2x108 colônias independentes. As bibliotecas foram amplificadas. Para controle de qualidade, vários clones únicos por biblioteca foram randomicamente escolhidos e sequenciados usando iniciadores CFR84 (VL) e OCAL_Seq_Hp (VH).

[0329] Como descrito acima, sete subgrupamentos de maturaçãoforam gerados e mantidos separados durante o processo de seleção subsequente.

[0330] 14 bibliotecas de maturação de afinidade diferentes (umabiblioteca de LCDR3 e uma de HCDR3 de cada líder ou agrupamento) foram geradas por procedimentos de clonagem padrão e transformação dos clones diversificados em células eletrocompetentes de E. coli TOP10F' (Invitrogen). Tamanhos de biblioteca eram bons, estando na faixa de 2x107 a 5x108. Sequenciamento de clones randomicamente escolhidos mostrou uma diversidade de 100%. Sem ligantes parentais, mas os derivados de todos os respectivos ligantes de entrada parentais foram encontrados. Finalmente fagos das 14 bibliotecas foram preparados separadamente.Tabela 2. Sumário de bibliotecas de maturação

2. Preparação de Anticorpo- Fagos para Maturação por Afinidade

[0331] As bibliotecas de maturação HuCAL® foram amplificadasem meio 2xYT contendo cloranfenicol 34 μg/mL e glicose 1% (2xYT- CG). Após infecção com fago auxiliar VCSM13 em uma OD600nm de 0,5 (30 min a 37°C sem agitação; 30 min a 37°C agitação a 250 rpm), células foram centrifugadas (4120 x g; 5 min; 4°C), ressuspensas em 2xYT/cloranfenicol 34 μg/mL/canamicina 50 μg/mL/IPTG 0,25mM e cultivadas por uma noite a 22°C. Fagos foram precipitados por PEG duas vezes do sobrenadante, ressuspensas em PBS e usadas para separações por maturação descritas abaixo.3. Separação por Maturação em Solução Padrão em Proteína C5 Bio- tinilada

[0332] Aproximadamente 1012 fagos resgatados das bibliotecas dematuração de afinidade geradas, como descrito acima, foram submetidos à separação realizada sob condições muito estringentes para selecionar Fabs específicos à C5 de afinidade melhorada.

[0333] Separações em solução usando os respectivos agrupamentos de fago foram realizadas usando C5 de ser humano biotinilada ou alternando proteínas de C5 de ser humano e de cinomolgus biotinila- das. A fim de aumentar a estringência de separação e selecionar para taxas de dissociação melhoradas, concentração de antígeno foi reduzida e períodos de lavagem prolongados foram aplicados (condições de lavagem são listadas na Tabela 3). Tabela 3. Condições de lavagem aumentadas dentro das etapas de seleção de separação de maturação em solução

[0334] Fago pré-bloqueado (mistura 1:2 com Chemiblocker 2x incubada por 1h a TA) foi incubado com baixa concentração da proteína C5 biotinilada por 12h à TA. A estratégia de separação é similar a uma separação em solução padrão descrita acima. O complexo fago- antígeno foi capturado através da porção biotina de C5 por contas magnéticas em Estreptavidina pré-bloqueadas por 30 minutos à TA. Contas então foram lavadas mais estritamente comparadas a separações normais. Eluição e amplificação de fago foram realizadas como descrito acima.

[0335] A segunda e a terceira etapas da seleção foram realizadasde um modo idêntico à primeira etapa, mas em condições de lavagem de estringência mais alta e concentrações de antígeno mais baixas. Para cada líder de anticorpo ou agrupamento várias separações diferentes foram realizadas. Para cada estratégia de separação, condições de estringência diferentes foram aplicadas. Estratégias de separação são sumarizadas na Tabela 4. Tabela 4. Visão geral da separação por maturação em solução 1783 e 1784 em C5 de ser humano biotinilada e C5 de cinomolgus biotini-lada

[0336] Após separações por maturação, os agrupamentos de fa-gemídeo enriquecidos foram subclonados em vetor de expressão pMORPH® x9_MH.4. Intercombinação de VL Otimizada (L-CDR3) com VH Otimizada (H- CDR2)

[0337] Para melhora adicional de afinidade e potência, cadeias longas e curtas de anticorpos maduros independentemente otimizados, de-rivados do mesmo clone parental, foram combinadas (ver, por exemplo, Rauchenberger et al., J. Biol. Chem. 278:38194-38205 (2003); Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999); e Schier et al., J. Mol. Biol. 263:551567 (1996)). Este procedimento, chamado interclonagem, foi aplicado a ligantes derivando dos mesmos clones parentais.5. Rastreamento de Afinidade e Resultado de Separação por Maturação

[0338] Um total de 2640 clones derivados de todas as separaçõesfoi rastreado como lisados bacterianos para afinidades melhoradas em C5 de ser humano. Afinidades preliminares foram estimadas pela titulação de equilíbrio de solução (SET). Com base em suas afinidades estimadas, clones derivados de cada agrupamento de Fab ou Fab parentais foram sequenciados. A Tabela 5 mostra o número de clones sequenciados e o número de sequências únicas obtidas de cada condição de separação.Tabela 5. Visão geral dos clones de afinidade melhorada selecionados para análise de sequência

6. Análise de Sequência e Seleção de Fabs Otimizados por Afinidade para Produção Proteica

[0339] Uma diversidade muito boa foi mantida pela recuperaçãode todos os derivados dos 10 Fabs parentais. As sequências nucleotí- dicas das regiões variáveis de cadeia longa (VH) para 188 clones me-lhorados de HCDR2 e de cadeia curta (VL) para 150 clones melhorados de LCDR3 foram determinadas. Sequências de 87 HCDR2 únicas e de 52 LCDR3 únicas foram selecionadas para uma análise detalhada de diversidade de sequência dentro das CDRs amadurecidas. Fabs contendo sítios de glicosilações possíveis nas CDRs foram omitidos a partir de caracterizações adicionais.

[0340] A análise de sequência de VH e VL e dados de afinidademostraram que os 10 Fabs parentais produziram sucessores melhorados por afinidade. Fabs Parentais MOR06525, MOR06757,MOR06763, MOR07087 e MOR07094 produziram somente clones me-lhorados de HCDR2 e parentais MOR06756 e MOR07093 produziram somente clones melhorados de LCDR3. MOR07086, MOR07091 eMOR07092 tinham clones maduros tanto de VH como de VL. Esta última permitiu interclonagem de cadeias maduras de VH e VL. De todos os dados, 60 clones com melhor afinidade e diversidade mais alta nas CDRs maduras foram selecionados para expressão de Fab. Aminoáci- dos de VH e VL selecionados, bem como sequências nucleotídicas, são listados na Tabela 1.Exemplo 5: Conversão de IgG1. Conversão em Formato de IgG2 Humana

[0341] A fim de expressar imunoglobulina de extensão completa(Ig), fragmentos de domínio variável das cadeias longa (VH) e curta (VL) foram subclonados de vetores de expressão pMORPH® x9_MH Fab em série de vetor pMORPH® 2_h_Ig de IgG2 humana. Enzimas de restrição MfeI e BlpI foram usadas para subclonagem do fragmento de domínio VH em pMORPH® 2_h_IgG2. Subclonagem do fragmento de domínio VL em pMORPH® 2_h_Ig K foi realizada através de sítios EcoRV e BsiWI, ao passo que subclonagem em pMORPH® 2_h_IgÀ2 foi feito usando EcoRV e HpaI.

[0342] Todos os dez Fabs parentais (MOR06525, 6756, 6757,6763, 7086, 7087, MOR07091, 7092, 7093 e 7094) foram convertidos em IgG2 humana. As IgGs também foram expressas.2. Conversão em Formato de IgG1AA Humana

[0343] A fim de expressar a imunoglobulina de extensão completa,os fragmentos de domínio variável de Fab das cadeias longa (VH) e curta (VL) foram subclonados dos vetores de expressão de Fab em vetores de expressão de IgG1. Enzimas de restrição MfeI e BlpI foram usados para subclonagem do fragmento de domínio de VH em pMORPH® 2_h_IgG1AA, no qual as leucinas nas posições 234 e 235 foram mutadas a alaninas para anular ligação de FCRY e atenuar funções efetoras. As enzimas de restrições EcoRV e HpaI foram usadas para subclone do fragmento de domínio VL em pMORPH® 2_h_IgÀ2.

[0344] Os seguintes Fabs maduros com perfil desejado foram sub-clonados em formato de IgG1AA humana: MOR07832, 7834, 7872, 7876, 7829, 7871, 7865, 7873, 7830, 7878, 7910. Interclonagem o nível de IgG foi alcançado pela transfecção de células com combinações de construtos de cadeia curta e longa. Por exemplo, MOR08114 foi o produto da cadeia longa em linhagem germinativa de MOR07829 e a cadeia curta em linhagem germinativa de MOR07871. A Tabela 6 resume as IgGs em linhagem germinativa interclonadas mais relevantes. Tabela 6. Visão geral das IgGs em linhagem germinativa interclonadas mais relevantes

3. Expressão Transiente e Purificação de IgG Humana

[0345] Células HKB11 e HEK293 eucarióticas foram transfectadascom uma proporção equimolar de DNA de vetor de expressão de cadeia longa e curta de IgG. O sobrenadante de cultura celular foi coletado em 3 ou 7 dias pós-transfecção e submetido à cromatografia por afinidade de proteína A padrão (rProteinA FF ou MabSelect SURE, GE Healthcare). Quando não indicado ao contrário, a troca de tampão foi realizada com PBS de Dulbecco 1x (pH 7,2, Invitrogen) e as amostras foram esterilmente filtradas (0,2 μm). A pureza de IgG foi analisada em condições desnaturantes, redutoras e não redutoras em SDS-PAGE ou usando Agilent BioAnalyzer e no estado nativo por HP-SEC.Exemplo 6: Modificação em linhagem germinativa (Germlining)

[0346] Construtos de IgG foram modificados em linhagem germi-nativa através de mutagênese sítio-dirigida usando QuickChange® Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene). O DI N-terminal de MOR08111 VÀ2 foi modificado para ES para combinar com sequência de linhagem germinativa humana bem como evitar um terminal Q (N- terminal Q pode formar piroglutamina). O DI N-terminal de MOR08110 VÀ3, MOR08113 VÀ3, e MOR08114 VÀ3 foi inserido em linhagem ger- minativa para SY, a sequência ainda mais comumente encontrada em genes À3 humanos. QVQ N-terminal de MOR08111 VH2 foi modificado em linhagem germinativa para EVT para combinar com um gene À2 e evitar o terminal Q. Q N-terminal em MOR08109 VH5, MOR08110 VH5, MOR08113 VH5 e MOR08114 VH5 também foi mutado para E.

[0347] Sequências de estrutura de MOR08109 VÀ3 foram sintetizadas para combinar com o gene À3j humano e clonado no vetor de expressão usando NheI e sítios de restrição HpaI. Os alinhamentos de sequência dos domínios de variável de anticorpos com suas respectivas sequências de linhagem germinativa humana relacionadas muito próximas são mostrados na Figura 1.Exemplo 7: Determinação de Afinidade1. Determinação de Kon/Koff e KD de anticorpos anti-C5 de ser humano usando Ressonância de plásmons de superfície (Biacore)

[0348] Foi determinado que os anticorpos anti-Fab usados paraimobilizar Fabs no chip Biacore influenciavam diferentemente na afinidade de ligação de cada Fab de C5 de ser humano, dessa forma fazendo a comparação do Fabs entre si difícil. Análise de Biacore foi realizada em anticorpos IgG.

[0349] Um chip CM4 foi coberto com 50 μg/mL anticorpo anti- Fchumano de cabra (500-2000 RU) em tampão acetato 10 mM, pH 4,5, usando química de acoplamento de amina de EDC-NHS padrão. Cada IgG anti-C5 de ser humano foi capturada no chip no tampão HBS-EP em taxa de fluxo constante de 10 μL/min por um tempo de contato levando a uma densidade de ligante de aproximadamente 20 RU. Após capturar IgG anti-C5 hu, concentrações diferentes de C5 de ser humano ou de cinomolgus, na faixa entre 0,156nM a 2,5nM, foram injetadas. Cada ciclo foi completado com duas etapas de regeneração com ácido fosfórico. Todas as condições de corrida foram realizadas a 25°C em tampão HBS-EP 1x. Os sinais resultantes foram ajustados por referência dupla, subtraindo os valores de índice de refração de célula de fluxo de referência e a etapa de ligação sem analito. Dados foram coletados em 10 Hz e analisados usando Programa de Avaliação Biacore T100 Versão 1.1 (GE). Este programa usa um método de análise de ajuste global para determinação de constantes de taxa e afinidade de cada interação.

[0350] A especificidade dos anticorpos foi medida. Preferencialmente, os valores de Kon e Koff para ligação à C5 de ser humano e de cinomolgus são como se segue: Kon > 1 x 105, Koff < 1 x 10-4). Estas medidas foram realizadas em Biacore para IgGs modificadas em li-nhagem germinativa e os dados resultantes são listados na Tabela 7.Tabela 7. Valores de KD, Kon e Koff de IgGs modificadas em linhagem germinativa determinados por Biacore

2. Determinação de Afinidades Picomolares Usando Titulação de Equi-líbrio de Solução (SET) para Fabs Purificados ou Fabs de Lisados Bacterianos (Meso Scale Discovery (MSD))

[0351] Para determinação de KD por titulação de equilíbrio de solução (SET), frações monoméricas (conteúdo de monômero de pelo menos 90%, analisado por SEC analítico; Superdex75, Amersham Phar- macia) da proteína Fab foram usadas. Determinação de afinidade em solução foi basicamente realizada como descrito na literatura (Friguet et al., J. Immunol Methods 77:305-319 (1985)). A fim de melhorar a sensibilidade e a exatidão do método SET, foi transferido de ELISA clássico para a tecnologia baseada em ECL (Haenel et al., Anal Bio- chem 339:182-184 (2005).

[0352] 1mg/mL de anticorpos específicos para fragmento (Fab)2 decabra-anti-humano (Dianova) foi marcado com ECL Sulfo-TAGTM NHS-éster (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, Maryland, USA) de acordo com as instruções do fabricante. Experimentos foram realizados em placas de microtítulo de polipropileno e PBS pH 7,4 com BSA 0,5% e Tween 20 0,02% como tampão de ensaio. Antígeno não marcado foi diluído seriamente 2n, começando com uma concentração pelo menos 10 vezes maior do que o KD. Poços sem antígeno foram usados para determinar valores de Bmax; poços sem antígeno nem Fab foram usados para determinar o fundo. Após adição, por exemplo, de Fab 10pM (concentração final em volume final de 60 μL), a mistura foi incubada durante a noite a TA. A concentração de Fab aplicada foi similar ou abaixo do KD esperado.

[0353] Placas de Estreptavidina MSD foram cobertas com C5 deser humano biotinilada 0,2 μg/mL (30 μL/poço) e bloqueadas com BSA 5% em PBS. Posteriormente as amostras equilibradas foram transferidas para aquelas placas (30 μL por poço) e incubadas por 20 minutos. Após lavagem, 30 μl/poço de ECL Sulfo-tag marcado de detecção de anticorpo ((Fab)2 anti-humano de cabra) em uma diluição final 1:1500 foram adicionados à placa MSD e incubados por 30 min em um agitador Eppendorf (700 rpm).

[0354] Após lavagem e adição de Tampão MSD Read T 30 μl/poçocom tensoativo, sinais eletroquimioluminescentes foram detectados usando um Sector Imager 6000 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, Maryland, USA).

[0355] Dados foram avaliados com o programa XLfit (IDBS) aplicando modelos de ajuste personalizado. Para avaliação de dados, isto é, determinação de KD de moléculas Fab, o seguinte modelo próprio foi usado (modelo de Abraham et al 16, modificado de acordo com et al., 200515): y=Bmax-(Bmax/(2*cFab)*(x +cFab+KD-sqrt((x+cFab+KD)*(x+cFab+KD)-4*x*cFab))); cFab: concentração de Fab aplicada; x: concentração de antígeno solúvel total aplicada (sítios de ligação); sqrt: raiz quadrada. Usando as condições de ensaio descritas acima, afinidades (monoméricas) para Fabs de ligação à C5 otimizados por afinidade foram determinadas em solução.Fabs Parentais

[0356] A fim de caracterizar ainda os anticorpos de ligação à C5,afinidade de Fabs parentais à C5 de ser humano foi determinada. Como o foco de caracterização estava na eficácia em ensaios hemolíti- cos, medidas de afinidade foram feitas somente para os Fabs mais relevantes. Para uma determinação confiável de afinidades monovalentes somente lotes de Fab foram usados para medidas que mostraram fração monomérica > 90% em uma cromatografia por exclusão de tamanho qualitativa.

[0357] Afinidades de 10 Fabs parentais que introduziram maturação por afinidade são resumidas na Tabela 8. Afinidades variaram de 72 pM a 3,7 nM.Tabela 8. Afinidades de 10 Fabs parentais determinadas em SET

(n=1)Fabs Maduros

[0358] Afinidades monovalentes de Fabs purificados para C5 deser humano foram medidas em SET. Afinidades estavam na faixa pM baixa e as melhores afinidades foram obtidas para derivados de MOR07086, 7091, 7092 e 7093. Posteriormente, medidas de afinidade destes derivados para C5 de cinomolgus mostraram afinidades na faixa de pM de média a baixa.

[0359] O processo de maturação de afinidade foi muito bem sucedido resultando em um repertório de ligantes com afinidade acentua- damente melhorada. A Tabela 9 resume afinidades à C5 de ser humano e de cinomolgus dos melhores ligantes melhorados. Certos Fabs tem KD para C5 de ser humano < 30pM e para C5 de cinomolgus < 150pM.Tabela 9. Visão geral de afinidades para C5 de ser humano e de ci-nomolgus de Fabs melhorados de melhor afinidade

3. Determinação de KD de moléculas de IgG usando Titulação de Equilíbrio de Solução (SET)

[0360] Afinidades das IgGs modificadas em linhagem germinativa(formato de IgG1AA humana) por C5 de ser humano e de cinomolgus foram determinadas em SET como descrito abaixo. Conjuntos de dados similares entre duas medidas independentes mostraram afinidades mais altas das IgGs líderes para C5 de ser humano do que IgG 5G1.1 de referência (ver Patente U.S. No. 6.355.245). IgGs finais tinham afinidades à C5 de ser humano variando de 1 a 14 pM e afinidades à C5 de cinomolgus variando de 3 a 29pM.Tabela 10. Determinação de valores de KD para as IgGs líderes finais (formato de IgGIAA humana) em SET

[0361] Para determinação de KD por titulação de equilíbrio de solução (SET), frações monoméricas da proteína IgG foram usadas (con-teúdo de monômero de pelo menos 90%, analisado por SEC MALS analítico; Tosoh TSKgel G3000SWXL, Wyatt Treos miniDAWN). De-terminação de afinidade em solução foi basicamente realizada como descrito na literatura (Friguet et al., J. Immunol Methods 77:305-319 (1985)). A fim de melhorar a sensibilidade e acurácia do método SET, foi transferido de ELISA clássico para tecnologia baseada em ECL (Haenel et al., Anal Biochem 339:182-184 (2005)).

[0362] 1mg/mL de anticorpos específicos para fragmento (Fab)2 decabra anti-humano (Dianova) foi marcado com ECL Sulfo-TAGTM NHS-éster (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, Maryland, USA) de acordo com as instruções do fabricante. Os experimentos foram realizados em placas de microtítulo de polipropileno e PBS pH 7,4 com BSA a 0,5% e Tween 20 a 0,02% como tampão de ensaio. O antígeno não marcado foi diluído em série 2n ou 1,75n, respectivamente, começando com uma concentração pelo menos 10 vezes mais alta do que o KD. Poços sem antígeno foram usados para determinar valores de Bmax; poços não contendo antígeno nem IgG foram usados para de- terminar o fundo. Após adição, por exemplo, de IgG a 10pM (concen-tração final em volume final de 60 μL), a mistura foi incubada por uma noite a TA. A concentração de IgG aplicada foi similar ou abaixo do KD esperado.

[0363] Placas de MSD Estreptavidina foram cobertas com C5 deser humano biotinilada 0,2 μg/mL (30 μL/poço) e bloqueadas com BSA 5% em PBS. Posteriormente as amostras equilibradas foram transferidas para aquelas placas (30 μL por poço) e incubadas por 20 min. Após lavagem, 30 μl/poço de anticorpo de detecção marcado com marcação de ECL Sulfo ((Fab)2 de cabra anti-humano) em uma diluição final 1:1500 foram adicionados à placa MSD e incubados por 30 min em um agitador Eppendorf (700 rpm).

[0364] Sinais eletroquimioluminescentes foram detectados apóslavagem e adição de 30 μL/poço de Tampão MSD Read T com ten- soativo usando um Sector Imager 6000 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, Maryland, USA).

[0365] Dados foram avaliados com o programa XLfit (IDBS) aplicando modelos de ajuste personalizado. Para avaliação de dados, isto é, determinação de KD de moléculas de IgG o seguinte modelo de ajuste de IgG foi usado (modificado de acordo com Piehler et al., 199717): y=Bmax/(cIgG/2)*(cIgG/2-((x+cIgG+KD)/2-((x+cIgG+KD)A2/4- x*cIgGA0,5)A2/(2*IgG)); cIgG = concentração aplicada de IgG, molécula completa (sítios de não ligação); x = concentração de antígeno solúvel total aplicada (sítios de ligação); sqrt: raiz quadrada.Exemplo 8: Caracterização por Ensaios Hemolíticos

[0366] O ensaio hemolítico é um ensaio funcional básico que testapara ativação de complemento e foi usado para avaliar a capacidade de mAbs anti-C5 de ser humanos e moléculas de Fab para bloquear a lise de células vermelhas sanguíneas (RBCs) por vias de complemento (ver, por exemplo, Evans et al., Mol. Immunol 32: 1183-1195 (1995); Thomas et al., Mol Immunol 33:1389-1401 (1996); Rinder et al., J Clin Invest 96:1564-1572 (1995)). Resumidamente, para ensaios da via clássica, células vermelhas sanguíneas sensibilizadas são usadas como alvos da lise por proteínas de complemento presentes no soro. Este ensaio é de interesse para a caracterização e rastreamento da alta afinidade de mAbs anti-C5 de seres humanos.1. Via Clássica

[0367] A quantidade desejada de células vermelhas sanguíneasde frango foi lavada quatro vezes com tampão de gelatina fria veronal (GVB++) e ressuspensa a 5x107 células/mL. Para sensibilizar as células, IgG anti-chRBC de coelho foi adicionada à suspensão celular de RBC a uma concentração final de IgG 1μg/mL. Após incubação por 15 minutos em gelo, as chRBCs sensibilizadas foram centrifugadas, lavadas duas vezes com GVB++ e diluídas a 8,33x107 células/mL.

[0368] Placas de fundo redondo de 96 poços foram usadas para oensaio hemolítico. Anticorpos foram diluídos em tampão GVB++ e adi-cionados aos poços (ao calcular a concentração necessária da ligação à C5 Abs, foi considerado que a amostra será diluída duas vezes quando o soro é adicionado). 50 μL de soro humano 40% (diluído em GVB++) foi adicionado a diluições de anticorpo de 50 μL, resultando em uma concentração de ensaio sérico final de 20%.

[0369] O controle e os poços em branco foram preparados comodescrito aqui: poços controle: i) controle de lise 0% ^ 100μl de GVB++, ii) controle de lise 100% ^ 100μl de NP-40 0,1%, iii) controle sérico 20% ^ 100μl de soro 20% (controle de Ab 0%). Poços em branco: i) branco sérico 20% ^ 100μl de soro 20%, ii) branco GVB++ ^ 100μl de GVB++, iii) branco de NP-40 ^ 100μl de NP-40 0,1%.

[0370] 2,5x106 (30 μL) chRBCs sensibilizadas/poço foram adicionados a toda amostra e poços de controle. Aos poços em branco, PBS foi adicionado em vez de células. Placa de ensaio foi incubada 30 min a 37°C, centrifugada (2.000 rpm, 5 min) e 85μl de sobrenadante foram transferidos para uma nova placa de 96 poços, de fundo chato. A nova placa foi centrifugada (2.000 rpm, 3 min) para livrar-se de qualquer bolha. Liberação de hemoglobina foi medida pela leitura de absorvância em 415nm. Porcentagem de hemólise foi calculada com respeito ao controle e poços em branco usando os seguintes algoritmos de cálculo:

[0371] Usando este procedimento, anticorpos anti-C5 de ser humano que foram capazes de inibir lise de célula vermelha sanguínea podem ser identificados. Para rastrear por interreatividade à C5 de ci- nomolgus, a via clássica foi realizada usando soro de cinomolgus 5%.2. Via Alternativa

[0372] Ensaios hemolíticos submetidos à via alternativa foram feitos de um modo similar a ensaios hemolíticos da via clássica. Na via alternativa, as células de RBCs de coelho foram usadas e não houve necessidade de sensibilizar as células. As RBCs de coelho são diferentes de RBCs de frango em que são sensíveis à lise causada pela via de alternativa de complemento.

[0373] O tampão de trabalho foi GVB++ suplementado com EGTA10 mM e Mg++ 5 mM, uma vez que a C5 convertase da via alternativa é dependente de Mg++ e a C5 convertase da via clássica é dependente de Ca++.

[0374] Ensaios hemolíticos da via alternativa foram corridos com: i)soro humano a 20%, ii) C5 de ser humano a 100pM adicionada a soro depletado de C5 de ser humano a 20%, iii) soro de cinomolgus a 0,025% adicionado a soro depletado de C5 de ser humano a 20%, iv) C5 de cinomolgus a 100pM adicionada a soro depletado de C5 de ser humano a 20%, v) soro de cinomolgus a 10%. Estas configurações foram usadas para rastrear por anticorpos com alta afinidade a proteínas C5 de ser humano e de cinomolgus que foram capazes de inibir muito efetivamente a lise de célula vermelha sanguínea induzida pela via de complemento alternativa.3. Ensaios Hemolíticos com Fabs Parentais

[0375] Ensaios hemolíticos foram usados como um ensaio biofun-cional básico para avaliar a capacidade de mAbs anti-C5 de ser humano de bloquear a lise mediada por complemento de células vermelhas sanguíneas. C5 convertase cliva C5 em peptídeo C5a e fragmento C5b, que é posteriormente incorporado no complexo de ataque à membrana (MAC), que leva à lise celular. C5 convertase da via clássica, formada por um complexo C3bC4bC2a tem uma estrutura diferente do que a C5 convertase da via alternativa que é formada por um complexo C3bC3bBb. Anticorpos gerados HuCAL GOLD® devem ser inibitórios tanto na via clássica como na alternativa, mas com foco na via alternativa porque principalmente a via alternativa (genes relacionados a fator H, fator B e fator H) está implicada em AMD.

[0376] Os ensaios de via clássica e alternativa foram realizadoscom soro humano a 20% (C5 ~80nM). Para aumentar sensibilidade de ensaios da via alternativa, novos formatos de ensaio foram desenvol-vidos. C5 de ser humano purificada 10 a 100pM ou soro de cinomol- gus a 0,025% (C5 de cinomolgus ~100pM) foram adicionados ao soro depletado de C5 de ser humano (mas contendo todos os outros com-ponentes séricos e de complemento).

[0377] A Figura 2 mostra que hemólise considerável pode ser observada entre C5 de ser humano purificada de 10 e 100 pM adicionada ao soro depletado de C5 de ser humano. Soro de cinomolgus foi adici- onado ao soro depletado de C5 de ser humano para teste de interrea- tividade. A FIG. 3 mostra que 0,025% do soro de cinomolgus (C5 ~100pM) adicionado ao soro depletado de C5 de ser humano restauram a atividade hemolítica.Via Clássica

[0378] A primeira seleção de Fab foi feita na via clássica (sorohumano a 20%). Aproximadamente a metade de 61 Fabs parentais purificados foi fraca para inibidores fortes da via clássica. Os valores de IC50 dos melhores Fabs inibitórios foram entre 35 e 900nM.

[0379] Ensaios foram feitos mostrando resultados congruentes(como mostrados na Figura 4). % de hemólise foi calculada com relação ao controle e poços brancos. Inibição de Fab da lise celular foi comparada com uma lise máxima causada por soro humano a 20% (=100%). Um Fab humano irrelevante (ligante de lisozima de ovo branco de galinha MOR03207) foi usado como controle negativo e anticorpo monoclonal IgG de anti-C5 de ser humano (Quidel) como controle positivo. A Figura 4 mostra um exemplo com os melhores Fabs inibitórios.Via Alternativa

[0380] Fabs que mostram atividade inibitória na via clássica foramainda avaliados na via alternativa. Ensaios hemolíticos foram dirigidos com C5 de ser humano purificada a 100pM ou soro de cinomolgus 0,025% adicionados ao soro depletado de C5 de ser humano. Valores de IC50 para os ensaios alternativos humanos foram entre 0,1 e 90 nM (exemplos de ensaios com Fabs mais relevantes são mostrados na Figura 5).

[0381] O controle positivo da via clássica (anticorpo anti-C5 de serhumano, Quidel) não foi inibitório na via alternativa. Por isso, um fator de anticorpo anticomplemento P (Quidel) foi usado como controle positivo. Como mostrado na Figura 5, MOR07086 tinha melhor atividade inibitória e dados de NVS revelaram uma melhor potência do que para o anticorpo de referência 5G1.1.

[0382] Para testar a interreatividade de cinomolgus, ensaios hemo-líticos da via alternativa foram realizados com soro de cinomolgus a 0,025% adicionado ao soro depletado de C5 de ser humano. Uma comparação com 5G1.1 não foi possível, uma vez que 5G1.1 não re-conhece C5 de cinomolgus. O anticorpo anti-Fator P foi usado como controle positivo. Os resultados de ensaios revelaram valores de IC50 entre 0,1 e 400 nM para os melhores Fabs inibitórios. Novamente, MOR07086 mostrou melhor potência (mostrado na Figura 6).

[0383] Uma atividade inibitória consistente dos Fabs foi notadatanto na via clássica como na alternativa. A Tabela 11 abaixo resume os resultados de ensaios hemolíticos dos 22 Fabs mais relevantes. Para ter uma comparação confiável entre experimentos diferentes, a lise causada pelo soro humano a 20% foi normalizada a 100%.Tabela 11. Sumário de ensaios hemolíticos com os Fabs mais relevantes

*não puro como M** como pMx9_FS H4. Ensaios Hemolíticos com Fabs MadurosVia Clássica (1) Via Clássica Usando Soro humano a 20%

[0384] Fabs maduros foram testados na via clássica com soro humano a 20%. Derivados de MOR07086, 7091, 7092 e 7093 mostraram a potência mais alta (valores de IC50 na faixa de baixo nM). Descendentes de MOR07091, 7092 e 7093 mostraram potência fortemente melhorada. A Figura 7 mostra exemplos de ensaios hemolíticos com derivados de MOR07086, 7091, 7092 e 7093.(2) Via Clássica Usando Soro de Cinomolgus a 5%

[0385] Ensaios da via de complemento também foram corridos napresença do soro de cinomolgus 5% a fim de teste de interreatividade. Derivados de MOR07086, 7091, 7092 e 7093 podem inibir muito efeti-vamente a lise de célula vermelha sanguínea. O controle negativo, MOR03207 (Fab antilisozima), não tinha impacto na via de complemento. Resultados destes ensaios são mostrados na Figura 8.Via Alternativa(1) Via Alternativa usando C5 de ser humano a 100 pM

[0386] Fabs maduros foram testados no ensaio hemolítico da viaalternativa com C5 de ser humano 100 pM. Alguns derivados de MOR06525, 6757, 6763 e 7087 mostraram melhora de potência com-parada com seu parentais. Fabs derivados de mOR07086-, 7091-, 7092-, 7093-, e 7094 mostrou potência mais alta (valores de IC50 na faixa de nM baixa). Descendentes de MOR07091, 7092, 7093, e 7094 mostraram potência altamente melhorada, muitos dos quais são mais potentes do que o anticorpo de referência 5G1.1. A Figura 9 mostra os exemplos de resultados de ensaio hemolítico para os Fabs maduros por afinidade e 5G1.1.(2) Via Alternativa Usando Soro humano a 20%

[0387] Fabs maduros foram testados no ensaio hemolítico da viaalternativa com soro humano a 20%. Fabs derivados de MOR07086, 7091, 7092 e 7093 mostraram melhor atividade inibitória. Muitos destes Fabs tinham melhor atividade inibitória do que 5G1.1. A Figura 10 mostra exemplos de resultados de ensaio hemolítico para os Fabs maduros por afinidade e anticorpo de referência 5G1.1.(3) Via Alternativa usando C5 de cinomolgus a 100 pM

[0388] Fabs maduros foram testados na via alternativa usando ensaio hemolítico de C5 de cinomolgus a 100 pM adicionado ao soro de- pletado de C5 de ser humano a 20%. Fabs derivados de MOR07091, 7092 e 7093 mostraram melhor atividade inibitória; 5G1.1 não interreage com C5 de cinomolgus. A Figura 11 mostra exemplos de resultados de ensaio hemolítico para os Fabs maduros por afinidade.5. Ensaios Hemolíticos com IgGs Modificadas em linhagem germinati- va (Formato de IgG1AA Humana) Via Clássica(1) Via Clássica Usando Soro humano a 20%

[0389] Ensaios de via clássica usando soro humano a 20% foramcorridos em MOR. Valores de IC50 da hu IgGAA modificada em linhagem germinativa final - MOR08109, 8110, 8113, 8114 - foram melhores ou similares à IgG referência 5G1.1 (vide Figura 12).(2) Via Clássica Usando Soro de Cinomolgus a 5%

[0390] Um comparação a 5G1.1 na via clássica usando soro decinomolgus a 5% não foi aplicável, uma vez que este anticorpo de re-ferência não reconhece C5 de cinomolgus. As IgGs modificadas em linhagem germinativa finais pode inibir completamente a lise das células vermelhas sanguíneas induzidas por soro de cinomolgus exceto MOR08111. Dados são mostrados na Figura 13.Via Alternativa(1) Via Alternativa usando C5 de ser humano a 100 pM

[0391] As IgGs modificadas em linhagem germinativa foram testadas na via alternativa usando ensaio hemolítico de C5 de ser humano 100pM. Todos os anticorpos mostraram atividade inibitória potente com valores de IC50 entre 28 e 128pM (com exceção de MOR08111, vide Figura 14), todos foram iguais ou melhores do que 5G1.1. A Figura 14 mostra exemplos de resultados de ensaio hemolítico de IgGs.(2) Via Alternativa Usando Soro humano a 20% e ELISA de Geração de C5a

[0392] As IgGs modificadas em linhagem germinativa também foram testadas no ensaio hemolítico da via alternativa com soro humano a 20%. A maioria dos anticorpos testados alcança inibição completa com valores de IC50 mais baixos do que 80nM. O anticorpo de referência 5G1.1 não inibe totalmente hemólise neste ensaio. A Figura 15 mostra exemplos de resultados de ensaio hemolítico de IgGs. Inibição da geração de C5a pelas IgGs finais foi similar a 5G1.1 (valores de IC50 na faixa de baixo nM).(3) Via Alternativa Usando C5 de cinomolgus a 100 pM

[0393] Ensaios hemolíticos da via alternativa no soro depletado deC5 de ser humano a 20% foram reconstituídos com C5 de cinomolgus 100 pM. Potência dos candidatos finais em linhagem germinativa contra C5 de cinomolgus foi dentro de de 5 vezes daquele para C5 de ser humano (valores de IC50 na faixa de baixo pM).(4) Via Alternativa Usando Soro de Cinomolgus a 10%

[0394] Em ensaios hemolíticos da via alternativa usando soro decinomolgus 10% ([C5] ~ 40 nM) a potência dos candidatos em linhagem germinativa foi similar à potência no soro humano (o critério de êxito era ter uma potência não mais do que de 5 vezes mais fraca do que para o ensaio de funcional usando C5 de ser humano).Exemplo 9: Geração de ELISA de C5a

[0395] ELISA C5a-des-Arg foi desenvolvido para medir geração deC5a durante hemólise para confirmar que os anticorpos que foram ini-bitórios no ensaio hemolítico também inibiram clivagem de C5 em C5a e C5b.

[0396] Uma placa Maxisorp foi coberta com 100 μl/poço anti-C5a-des-Arg humana de camundongo (US Biologics) em 1μg/mL no tampão de revestimento (bicarbonato pH 9,5 a 9,8) e foi incubada por uma noite a 4°C. Após lavagem 3x com PBST, a placa foi bloqueada com 300μl de diluente/poço (Synblock, AbD Serotec) por 2 horas à temperatura ambiente. Após aspiração da solução de bloqueio, 100 μl de amostras ou padrões diluídos com diluente foram incubados por 1 hora à temperatura ambiente. Os padrões foram preparados como se segue: a partida estava no padrão a 20ng/mL (rC5a-des-Arg) e diluições seriais 1:4 foram preparadas para uma curva de 7 pontos. Amostras de ensaios hemolíticos foram diluídas 1:5 no diluente (sobrenadantes de ensaio hemolítico devem ser armazenados a -80°C até ser usado em C5a ELISA). Na metade, placa foi lavada 3x com PBST. 100μl/poço de anticorpo de detecção 0,4μg/mL (biotina - anti-c5a humana de cabra, R&D Systems) diluídos no diluente foram adicionados e após incubação por 1 hora à temperatura ambiente, 100μl/poço de Strep-HRP (poli-estreptavidina HRP) diluídos 1:5000 no diluente HRP (diluente poli-HRP) foram adicionados por 30 minutos. Após lavagem 4x com PBST, 100μl/poço de Substrato TMB (solução de substrato Ultra TMB) foram adicionados por 5 a 10 minutos. A reação foi parada com solução de parada 50μl/poço (H2SO4 2N). A absorvância foi lida (A450-A570) e dados foram analisados usando SoftMax Pro.

[0397] Fabs maduros foram testados para geração de C5a durantehemólise para confirmar que a atividade inibitória foi devido a bloqueio de clivagem de C5 em C5a e C5b. Os sobrenadantes de ensaios he- molíticos em soro humano a 20% foram usados para quantificar a for-mação de C5a.

[0398] Todos os Fabs testados ocasionam níveis de C5a diminuídos à linha de base. A Figura 16 mostra exemplos de resultados ELISA de C5a.Exemplo 10: Especificidade de ELISA em C3, C4, C5 de ser humanos e C5 de cinomolgus

[0399] Todos os Fabs purificados foram analisados em uma solução de ELISA (método descrito acima) para ligação a C3, C4 e C5 de ser humanos. Fabs foram incubados com antígeno biotinilado em uma placa Neutravidin e detectados através de marcação de histidina.

[0400] Ligação melhorada foi vista para quase todos Fabs maduros comparados com seu respectivo parental. Nenhuma ligação aos contra-alvos C4 e C3 humanas foi detectada até Fab 100nM. Estes resultados impactam nos critérios de sucesso para especificidade: li-gação à C5 de ser humano e de cinomolgus e nenhuma ligação a pro-teínas de complemento C3 e C4 humanas. Exemplos de derivados de Fab parental MOR07091 são mostrados na Figura 17.Exemplo 11: Ensaios de Estabilidade sérica

[0401] Atividade de ligação conservada a C5 de ser humano emum ensaio de ligação no soro humano a 50% de anticorpos de ligação à C5 foi determinada como descrito abaixo.

[0402] Anticorpos (formato Fab) foram incubados até 8h a 37°Ccom soro depletado de C5 de ser humano a 100% ou com PBST/BSA a 0,5 % (controle positivo). Poços de uma placa de polipropileno bloqueada foram usados para incubação para assegurar nenhuma ligação dos anticorpos à superfície ao longo do tempo de incubação extenso. Amostras foram coletadas em pontos de tempo diferentes e armazenadas a -20°C.

[0403] Amostras foram testadas em uma solução de ELISA emplacas NeutrAvidin para verificar a capacidade de ligação à C5 de ser humano. Às placas NeutrAvidin, que foram bloqueadas por uma noite com ChemiBlocker-PBST 1x, 20 μL de diluições seriais das amostras coletadas diferentes foram adicionados. A primeira diluição das amostras foi 1:2 (concentração de soro final 50%), seguida por etapas de diluições 1:3. Após 1h de incubação, a placa foi lavada 3x com PBST e 20 μl de C5 de ser humano biotinilada foi aplicada a uma concentração de 2,5 μg/mL. Após 1h, a placa foi lavada novamente 5x com PBST (Tween 0,05%) e o anticorpo de detecção anti-HIS6-POD para Fabs foi adicionado.

[0404] Fluorescência do substrato (Quanta Blue ou AttoPhos) foimedida após 5 a 10 min e conservou atividade de ligação que foi cal-culada comparada com o respectivo sinal máximo (anticorpo incubado com PBST/BSA 0,5%).

[0405] Um dos critérios "necessários" para os anticorpos de ligação à C5 que é para conservar 75 a 80% da atividade de ligação no soro humano i) em um ensaio funcional no soro 10% e ii) em um en- saio de ligação no soro a 50%. Como os ensaios hemolíticos foram corridos na presença do soro a 20% foi somente necessário mostrar ligação conservada em um ensaio de ligação no soro a 50%.

[0406] Por isso, Fabs finais maduros foram incubados com sorodepletado de C5 de ser humano a 100% a 37°C por 8h. Amostras foram coletadas em pontos de tempo diferentes e testadas para ligação a C5 de ser humano em uma solução de ELISA. Fab + amostras de soro usadas para ELISA foram diluídas a uma concentração sérica 50% + Fab 10nM.

[0407] A Figura 18 ilustra os resultados dos anticorpos finais deligação à C5 final no formato Fab. 70 a 93% da atividade de ligação foram conservados após um tempo de incubação de 8 horas a 37°C em soro 50% comparada com incubação em PBS.Exemplo 12: Caracterização por Epítopo Binning

[0408] Este procedimento foi usado para agrupar Fabs anti-C5 deser humano em ligação bin de epítopo diferente ao mesmo ou um epí- topo de sobreposição da proteína C5.

[0409] Competição de cada anticorpo anti-C5 de ser humano bioti-nilada com cada anticorpo anti-C5 de ser humano não marcado em excesso de 100 vezes foi testada em um ELISA (modo de captura). Foi comparado com o sinal mais alto de cada anticorpo (Fab biotinila- do sem competição).

[0410] C5 de ser humano foi capturada através uma IgG anti-C5de ser humano policlonal (US Biological), que foi coberta anteriormente por uma noite a 4°C em uma placa de 384 poços Maxisorp preta. No dia seguinte, a placa foi lavada duas vezes com PBST e bloqueada por 2h com BSA 3%-PBST. Após lavagem 3x com PBST, 20 μL de C5 de ser humano foram adicionados e incubados 2h à TA. A placa foi lavada 3x com PBST antes de adicionar os Fabs.

[0411] 20 μl de Fab não marcado (200 μg/mL ou 400 μg/mL) (ex- cesso de 100 vezes) foram adicionados aos poços de uma placa Ma- xisorp e posteriormente 20ng/mL ou 40ng/mL de Fab biotinilado. Os Fabs biotinilados e não marcados foram incubados por 1h a TA. A placa foi lavada 3x com PBST e Strep-AP Zymax, ZYMED, Código: 438322, Lote: 50799648 foi adicionada para detecção da ligação de Fab biotinilado através de C5 nas placas. Substrato AttoPhos (Roche) foi adicionado às placas e Fluorescência foi lida após 5 a 10min.Fabs Parentais

[0412] C5 foi capturada (através de um anticorpo policlonal) eFabY não marcado foi aplicado em excesso a FabX biotinilado. Ligação de FabX biotinilado à C5 de ser humano foi detectada. Seis grupos de Fabs podem ser definidos: Grupo 1: MOR06952, 6961; Grupo 2: MOR06525, 6756, 6757, 6763; Grupo 3: MOR07087; Grupo 4: MOR06764, 6776, 7081; Grupo 5: MOR07089; Grupo 6: MOR07082, 7083, 7084, 7086, 7088, 7090, 7091, 7092, 7093, 7095.

[0413] Os Fabs também foram divididos em diferentes grupos deligação a epítopo usando um método diferente: FabX foi imobilizado, então FabY pré-incubado com C5 biotinilada foi adicionado. Os seguintes grupos de Fabs podem ser definidos: Grupo 1: MOR06952, 6961; Grupo 2: MOR06525,6757, 7083; Grupo 3: MOR07087; Grupo 4: MOR06763; Grupo 5: MOR07081; Grupo 6: MOR07082, 7083, 7084,7086, 7088, 7091, 7092, 7093 (7089 compete com 7084). A conclusão foi tirada que usando dois métodos diferentes, resultados similares podem ser obtidos.Fabs Maduros

[0414] A fim de completar a competição de caracterização de Fabbiotinilado com Fab não marcado (aplicado em excesso de 100 vezes) foi medido na solução de ELISA. Resultados foram comparados com o sinal mais alto (Fab biotinilado sem competição).

[0415] Como mostrado na Figura 19, Fabs biotinilados competem com Fabs não marcados idênticos e todos os Fabs competem por ligação ao mesmo ou epítopo de sobreposição. Estes resultados correlacionam-se com dados de ligação a epítopo dos Fabs parentais.Exemplo 13: Rastreamento de Ligantes de Cadeia C5 Alfa versus Beta e Ensaios de Competição

[0416] Dois experimentos de ELISA e ensaios hemolíticos foramrealizados para testar se um Fab era ligante de uma cadeia alfa ou beta como descrito abaixo.

[0417] No primeiro experimento, Fab foi coberto em uma placa eC5 purificada ou sobrenadante da preparação de C5 quimérica (cadeia alfa humana, beta de camundongo) foram adicionados. Como uma etapa seguinte, 5G1.1 foi aplicada e a detecção foi feita através de uma IgG anti-humana.

[0418] Em um segundo experimento, 5G1.1 foi coberta em umaplaca, C5 purificada ou sobrenadante da preparação de C5 quimérica (cadeia alfa humana, beta de camundongo) foram adicionados, então Fab, que foi detectado com um anticorpo anti-Myc.

[0419] IgG 5G1.1 de referência reconhece a cadeia alfa e foi usada para determinar se Fabs gerados do MorphSys competem com 5G1.1 para ligação. No sobrenadante de ensaios hemolíticos a partir da preparação de C5 quimérica foi adicionado ao soro depletado de C5 de ser humano e Fabs foram testados para inibição de hemólise. Fabs Parentais

[0420] A Figura 20 mostra os resultados de um experimento deELISA onde os Fabs foram cobertos em uma placa, C5 ou sobrena- dante de uma preparação de C5 quimérica (cadeia alfa humana e cadeia beta de camundongo) foram adicionados, em seguida 5G1.1. A Figura 21 mostra os resultados de um experimento de ELISA onde C5 purificada e sobrenadante da C5 quimérica foram capturados através de 5G1.1.

[0421] MOR06525, 6756, 6763 foram ligantes de cadeia beta (ligam-se à C5 mas não à C5 quimérica). A maioria dos Fabs MOR070XX (derivados das separações em solução) são ligantes de cadeia alfa (ligam-se à C5 e C5 quimérica). MOR06952 e 6961 competem com 5G1.1 portanto são negativos tanto para C5 como para C5 quimérica e, dessa forma, são os ligantes de cadeia alfa mais prováveis como 5G1.1. MOR06757 comporta-se como MOR06952 e 6961, isto é, provavelmente é um ligante de cadeia alfa. Entretanto, MOR06757 não inibe hemólise do sobrenadante de C5 quimérica inserido no soro depletado de C5, enquanto todos os outros ligantes de cadeia alfa fazem (vide Figura 22).

[0422] No sobrenadante de ensaio hemolítico de C5 prep quimérica foi adicionado soro depletado de C5 de ser humano e Fabs foram testados para inibição de hemólise. MOR06525, 6756, 6757 e 6763 não inibiram hemólise com C5 quimérica e dessa forma, pode ser li- gantes de cadeia beta. MOR06952, 6961, 7081, 7082, 7083, 7084, 7086, 7087, 7088, 7089, 7090, 7091, 7092, 7093, 7094, 7095 inibiram hemólise e dessa forma pode ser ligantes de cadeia alfa.Exemplo 14: Resistência à Proteólise

[0423] Para investigar a rigidez estrutural de Fabs, resistência deFabs à proteólise por termolisina foi realizada (termolisina protease bacteriana, Calbiochem). Fab foi incubado com termolisina (Fab:termolisina = 3:1 (p/p), volume de reação de 8 μL) a 37°C ou a 55°C (atividade de termolisina é ótima a 55°C). A reação foi parada pela adição de 4 μL de EDTA 0,5 M e 4 μL de tampão de amostra LDS 4x (Invitrogen) e as amostras paradas foram corridas em SDS-PAGE 4 a 12% em condição não redutora. Proteólise de Fabs foi analisada pelo monitoramento do desaparecimento de bandas Fab que foram visu-alizadas pela marcação de Coomassie.Fabs Parentais

[0424] Fabs parentais foram testados para resistência à proteólisede termolisina a 37°C e 55°C. Fab de um anticorpo IL-1β humanizado foi usado como controle. Os Fabs mais testados foram resistentes à degradação por termólise a 37°C até 90 min. Para diferenciar ainda a rigidez estrutural de Fabs, proteólise foi realizada em temperatura mais alta de 55°C. Muitos dos Fabs testados foram rapidamente degradados a 55°C (>90% de Fab foi degradado dentro de 30 min), enquanto alguns Fabs foram ainda resistentes à proteólise após 90 min (por exemplo, 7094). Foi sugerido que Fabs resistentes tivessem uma estrutura mais rígida tal que pudessem mostrar melhores propriedades farmacocinéticas in vivo. Resultados destes experimentos são mostrados na Figura 23 e na Figura 24.Fabs Maduros

[0425] Fabs com a potência mais alta em ensaios hemolíticos foram testados para sensibilidade à termolisina a 37°C e 55°C. Na Figura 25 e na Figura 26, experimentos com derivados de MOR07086, 7091, 7092 e 7093 são mostrados.

[0426] Os resultados destes testes revelaram que os derivados deparentals MOR07091, 7092 e 7093 foram menos sensíveis à proteólise, enquanto os derivados MOR07086 foram mais sensíveis à proteólise.Exemplo 15: Ensaio de Deposição de MAC

[0427] Como a cascata de complemento terminal acaba com aformação do MAC, inibição da formação de MAC foi uma sugestão adicional da capacidade do anticorpo de bloquear a cascata de com-plemento. O racional era ter uma organização adicional independente de células e comportamento celular.

[0428] Zymosan (Sigma), que é um carboidrato insolúvel da parede celular da curtadura, usada especialmente no imunoensaio da via alternativa, foi coberto para ativar a Via Alternativa e IgM (Sigma) foi coberta para ativar a Via Clássica para determinação da deposição de MAC (complexo de ataque à membrana). Fabs foram pré-incubados com soro humano (6% para AP, 2% para CP) e adicionados à placa. Porcentagem (%) de inibição da deposição de MAC foi calculada para cada amostra em relação à linha de base (soro humano tratado com EDTA) e controle positivo (soro humano), e usado para gerar a curva de IC50 com XLFit.Fabs Parentais

[0429] Fabs Parentais foram usados em concentrações diferentese a inibição máxima (se aplicável também a valores de IC50) foi de-terminada (exemplo mostrado na Figura 27). A maioria dos Fabs inibiu completamente o bloqueio de indicação de deposição de MAC de cli-vagem de C5. Potência e classificação de Fabs foram similares aos dados de ensaios hemolíticos.

Claims

1. Anticorpo monoclonal isolado de proteína C5 humana, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende(i) uma CDR1 de cadeia pesada apresentando a sequência de SEQ ID NO: 1; uma CDR2 de cadeia pesada apresentando a sequência de SEQ ID NO: 2; e uma sequência de CDR3 de cadeia pesada apresentando a sequência de SEQ ID NO: 3; e(ii) uma CDR1 de cadeia leve apresentando a sequência de SEQ ID NO: 4; uma CDR2 de cadeia leve apresentando a sequência de SEQ ID NO: 5; e uma sequência de CDR3 de cadeia leve apresentando a sequência de SEQ ID NO: 6, em que o referido anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga à proteína C5 humana com um KD de 10-10M ou menos conforme medido por ressonância plasmônica de superfície.

2. Anticorpo monoclonal isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável da cadeia pesada apresentando a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; e uma região variável de cadeia leve apresentando a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

3. Anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia pesada apresentando a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; e uma cadeia leve apresentando a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

4. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que inibe a via alternativa do complemento, com uma IC50 de 20-200 pM como medido por ensaio hemolítico in vitro quando se utiliza soro depletado de C5 humano que é reconstituído com 100 pM de C5 humano.

5. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo é um anticorpo humano ou quimérico.

6. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo é um isotipo IgG.

7. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e um veículo far- maceuticamente aceitável.

8. Ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6,em que a sequência de nucleotídeos que codifica o polipep- tídeo compreendendo uma região variável da cadeia pesada tem a se-quência de SEQ ID NO: 11, e a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo que compreende uma região variável da cadeia leve tem a sequência de SEQ ID NO: 12; ouem que a sequência de nucleotídeos que codifica o polipep- tídeo compreendendo uma cadeia pesada tem a sequência de SEQ ID NO: 13 ou 15, e a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptí- deo que compreende uma cadeia leve tem a sequência de SEQ ID NO: 14 ou 16.

9. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico como definido na reivindicação 8.

10. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento.

11. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que é para preparação de um medicamento para tratamento de de-generação macular relacionada à idade, asma, artrite, doença cardíaca autoimune, esclerose múltipla, doença inflamatória intestinal, lesões de isquemia-reperfusão, Síndrome de Barraquer-Simons, lúpus sistêmico, lúpus eritematoso, psoríase, esclerose múltipla, doença de Alzheimer, glomerulonefrite, hemoglobinúria paroxística noturna (HPN) ou MPGN II.

12. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, ou composição farma-cêutica, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que é para preparação de um medicamento para redução da disfunção dos sistemas imunológico e hemostático associado à circulação extracorpó- rea pela administração de anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou a composição farmacêutica em um indivíduo em necessi-dade do mesmo.