BRPI0900815A2 - método para isolamento de exossomos a partir de soluções biológicas utilizando nanopartìculas de óxido de ferro - Google Patents
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Abstract
MéTODO PARA ISOLAMENTO DE EXOSSOMOS A PARTIR DE SOLUçõES BIOLóGICAS UTILIZANDO NANOPARTìCULAS DE óXIDO DE FERRO.Esta patente descreve um método para o isolamento de exossomos provenientes de plaquetas utilizando nanopartículas superparamagnéticas de óxido de ferro (Fe3O4), através de um mecanismo de atração de cargas baseado no potencial Zeta pré- determinado dos exossomos; o método consiste na utilização das nanopartículas de óxido de ferro previamente sintetizadas com carga positiva pré-determinada que se ligam aos exossomos carregados negativamente, contidos na amostra biológica; durante a incubação, as nanopartículas magnéticas catiónicas são absorvidas para à superfície da membrana dos exossomos por meio das interações eletrostáticas; a exposição do material a um campo magnético permite a separação dos exossomos que se ligaram às nanopartículas; o sucesso da técnica é confirmado pela caracterização dos exossomos por citometria de fluxo; o método mostrou ser adequado para tal finalidade, uma vez que permite que exossomos sejam isolados e purificados e não foram observadas alterações nas características morfológicas e estruturais originais dos exossomos.
Description
"MÉTODO PARA ISOLAMENTO DE EXOSSOMOS A PARTIR DESOLUÇÕES BIOLÓGICAS UTILIZANDO NANOPARTÍCULAS DEÓXIDO DE FERRO".
CAMPO DE APLICAÇÃO
Trata a presente patente de invenção de ummétodo para o isolamento de exossomos provenientes de plaquetasutilizando nanopartículas superparamagnéticas de magnetita (Fe3O4),através de um mecanismo de atração de cargas baseado no potencialZeta pré-determinado dos exossomos.
FUNDAMENTOS DA TÉCNICA
Exossomo é um tipo de micropartículaproduzida por diversos tipos celulares normais e tumorais (linfócitos,plaquetas, células dendríticas, neurônios, mastócitos, células intestinais,macrófagos, entre outras) com ampla função sinalizadora. Possuiaproximadamente 100 nm de diâmetro, é composto de uma duplacamada lipídica associada a proteínas de membrana, contendointernamente proteínas, ácidos nucléicos e lípides., Estudos recentesmostram ampla capacidade de induzir resposta imune mais eficiente,assim como promover imunotolerância. Essas propriedades fizeram comque se propusessem o preparo de vacinas anti-tumorais baseadas emexossomos de células previamente sensibilizadas. Mais recentemente,exossomos mostraram-se capazes de promover angiogênese, apoptosede células vasculares, disfunção de células cardíacas e de transmitirinclusive informações genéticas entre células. Por fim, acredita-setambém, que sejam via de transmissão de doenças priônicas emicobacterianas.
A despeito da evidente importância dosexossomos, sua separação e isolamento de soluções biológicas, com apreservação de sua integridade estrutural e funcional para estudo eutilização representa um problema. O isolamento convencional deexossomos é trabalhoso, demorado e não garante a preservaçãoestrutural das partículas. Partindo-se da solução biológica original,centrifugações seriadas são realizadas, que garantem a precipitação decélulas, debris e partículas por sua densidade relativa e tamanho.
Num protocolo padrão, para obtenção deexossomos a partir de uma solução celular, submtete-se a solução acentrifugação de: IOOOg durante 15 minutos para retirada das células egrandes debris; segue-se então a 40G 18,OOOg durante 30 minutos pararetirada de partículas subcelulares maiores, corpos apoptóticos eorganelas indesejadas; em seguida, o sobrenadante da fraçãomicrovesicular é filtrado seqüencialmente através de membranas denáilon de Ιμίτι, 500nm e 220nm e, então, novamente centrifugado a 4°Ca 100,OOOg durante 90 minutos para obtenção do "pellet" deexossomos. O pellet pode ser então ressuspendido para sua utilização.
Todos os resultados da presente invenção foramobtidos a partir de exossomos provenientes de plaquetas. Estudosprévios mostram que na situação clínica de sepse, exossomos deplaquetas podem estar associados à disfunção vascular e cardíaca.
Esses exossomos expressam em abundância CD63 (tetraspanina), eexpõem fracamente anexina V em sua superfície.
Para melhor entender o princípio do método deisolamento de exossomos a partir de nanopartículas de óxido ferroutilizados na presente invenção, é necessária uma pequena explanaçãosobre o "potencial Zeta".
Quase todos os materiais macroscópicos ouparticulados em contato com um líquido adquirem uma carga elétricaem sua superfície. Essa carga pode aparecer a partir da dissociação deíons na superfície da partícula, da adsorção diferencial de íons dasolução na superfície da partícula, entre outras. A carga líquida nasuperfície da partícula afeta a distribuição de íons na sua vizinhança,aumentando a concentração de contraíons junto à superfície. Assim,forma-se uma dupla camada elétrica na interface da partícula com olíquido.
Essa dupla camada divide-se em duas regiões:uma região interna que inclui íons fortemente ligados à superfície e umaregião externa onde a distribuição dos íons é determinada peloequilíbrio entre forças eletrostáticas e movimento térmico. Dessa forma,o potencial nessa região decai com o aumento da distância da superfícieaté, a uma distância suficientemente grande, atingir o potencial dasolução. Esse potencial é convencionado como potencial zero.
Em um campo elétrico, cada partícula e os íonsmais fortemente ligados à mesma se movem como uma unidade, e opotencial no plano de interface entre essa unidade e o meio circundanteé chamado potencial Zeta. Portanto o potencial Zeta é um indicador útildessa carga podendo ser usado para prever e controlar a estabilidadede suspensões ou emulsões coloidais. Quanto maior o potencial Zetamais provável que a suspensão seja estável, pois as partículascarregadas se repelem umas às outras e essa força supera a tendêncianatural à agregação.
O potencial Zeta não pode ser medidodiretamente. Assim usa-se algum tipo de medida indireta, a partir daqual se calcula o potencial zeta. A técnica mais usada e mais aceita éatravés da mobilidade eletroforética, introduz-se uma suspensãocoloidal diluída em uma cuba com dois eletrodos e aplica-se umpotencial elétrico à suspensão. As partículas com carga elétrica líquidamover-se-ão na direção do eletrodo de carga contrária. O quociente davelocidade de deslocamento pelo campo elétrico chama-se mobilidadeeletroforética, expressa em m2/V.s . Esse valor entra numa equação (asmais usadas são as aproximações de Smoluchowski ou a de Debye) paracalcular o potencial Zeta.
BREVE DESCRIÇÃO DO OBJETO
Analisando o atual estado da técnica, orequerente desenvolveu um método para o isolamento de exossomosprovenientes de plaquetas utilizando nanopartículassuperparamagnéticas de magnetita (Fe3O4), através de um mecanismode atração de cargas baseado no potencial Zeta pré-determinado dosexossomos.
O método consiste, basicamente, na utilizaçãodas nanopartículas de óxido de ferro previamente sintetizadas comcarga positiva pré-determinada que se ligam aos exossomos carregadosnegativamente, contidos na amostra biológica, por força de atraçãoelétrica; a exposição do material a um campo magnético permite aseparação dos exossomos que se ligaram às nanopartículas; o sucessoda técnica é confirmado pela caracterização dos exossomos porcitometria de fluxo.
O método mostrou ser adequado para talfinalidade, uma vez que permite que exossomos sejam isolados epurificados e não foram observadas alterações nas característicasmorfológicas e estruturais originais dos exossomos.
DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A complementar a presente descrição de modoa obter melhor esclarecimento dos detalhes da invenção é feita umadescrição detalhada do presente método, a qual é acompanhada dasfiguras que constam as análises que evidenciam o sucesso do novométodo.Figura 1 - Fluxograma que mostra o novométodo para isolamento de exossomos a partir de soluções biológicasutilizando nanopartículas de óxido de ferro.
Figura 2 - Esquema do princípio defuncionamento do Potencial zeta.
Figura 3 - Gráfico mostrando as diferençasentre os potenciais Zeta obtidos das medições feitas em micropartículasdecorrentes de degradação plaquetária (PBS) e da exposição à trombina(5UI/ml) - sobrenadante 1- versus exossomos obtidos pela exposição deplaquetas ao LPS (lOOng/ml) - sobrenadante 2 - . Resultado de 4experimentos independentes.
Figura 4 - Dot-plots mostrando a obtenção dossinais fluorescentes correspondentes, na primeira situação, detecçãoapenas das nanopartículas ferrosas em tampão PBS com os anticorpos,mostrando a ausência de fluorescência significativa (artefato); e, nasegunda situação, a detecção da amostra propriamente dita, jádescontado o "background" encontrado na primeira situação.
Figura 5 - Gráficos mostrando claramente adetecção diferencial por citometria de fluxo da expressão dosmarcadores de superfície de exossomos, CD63, CD3 e CD9 e baixaexpressão de anexina V e HLA-DR, quando comparada com asmicropartículas obtidas por degradação de plaquetas. Em ambas assituações, partículas foram capturadas por nanopartículas ferrosas.
DESCRIÇÃO DETALHADA DO OBJETO
Com referências aos desenhos, a presenteinvenção se refere a um "MÉTODO PARA ISOLAMENTO DE EXOSSOMOSA PARTIR DE SOLUÇÕES BIOLÓGICAS UTILIZANDO NANOPARTÍCULASDE ÓXIDO DE FERRO", sendo que, mais particularmente, o método parao isolamento de exossomos provenientes de plaquetas utilizandonanopartículas superparamagnéticas de magnetita (Fe3O4) é realizadoatravés de um mecanismo de atração de cargas baseado no potencialZeta pré-determinado dos exossomos.
O método consiste na utilização dasnanopartículas de óxido de ferro previamente sintetizadas com cargapositiva pré-determinada que se ligam aos exossomos carregadosnegativamente, contidos na amostra biológica, por força de atraçãoelétrica; a exposição do material a um campo magnético permite aseparação dos exossomos que se ligaram às nanopartículas; o sucessoda técnica é confirmado pela caracterização dos exossomos porcitometria de fluxo.
Assim sendo, o método pode ser definido nasseguintes etapas:
(a) Plaquetas foram estimuladas a gerar exossomos típicos e partículascontrole;
(b) Amostras contendo exossomos (sobrenadante 2) e partículas(sobrenadante 1) foram submetidas à medição do potencial Zeta,revelando cargas potenciais bastante negativas, mas diferentes entreelas (-61±21,1) mV para os exossomos versus (-9,2±3) mV parapartículas de degradação plaquetária, média±ep, n=4, p<0,05);
(c) Solução de nanopartículas superparamagnética de óxido de ferro foisintetizada de acordo com a metodologia que consiste basicamente nahidrólise rápida do Fe3+, pela adição de hidróxido de amônio a soluçãoaquosa 0,25 molar de FeCI3.6H20; a diálise do precipitado permite suapeptização levando à formação de suspensão coloidal com partículasextremamente pequenas 200 Â);
(d) A obtenção de partículas nanométricas (50-100 Â) à base de óxidode ferro foram preparadas por meio da hidrólise de soluções alcoólicaspor hidróxido de dietilamônio na presença de um surfactante como ononilfenoletoxilado;
(e) Amostras foram incubadas com as nanopartículas de ferro por 1hora, na proporção de 0,1 ml solução de concentração 200 μ9 deferro/mL para 2 ml de solução contendo exossomos;
(f) Ao final de 1 hora, esse material foi exposto a um campo magnéticoem coluna LS-MidiMACS (MiItenyi) que permitiu a separação dosexossomos que se ligaram as nanopartículas, por eluição com PBS +força mecânica (embolo da própria coluna);(g) Submetido à citometria de fluxo (CMF) é confirmado que foramobtidos exossomos (figura 3) através da alta expressão de CD63 comalguma expressão de CD9 e baixíssima expressão de Anexina V (figura 4).
O novo método aqui demonstrado representasignificativo avanço para a separação dos exossomos, pois permite suaobtenção de maneira significativamente rápida, através de manipulaçãoúnica da solução, sem que seja necessária a centrifugação e filtração esem a formação de pellet, que se contamina de proteínas arrastadasdurante o processo de ultracentrifugação, e que acaba por alterar aultraestrutura das micropartículas. Em contrapartida se adicionamnanopartículas ferrosas no meio. Ainda não está claro se elas apenas seligam à face externa dos exossomos ou se são incorporadas por estes.Tal definição permitirá subseqüente desenvolvimento de método para aseparação do material ferroso.
É certo que quando o presente invento forcolocado em prática poderão ser introduzidas modificações no que serefere a certos detalhes de construção e forma, sem que isso impliqueafastar-se dos princípios fundamentais que estão claramentesubstanciados no quadro reivindicatório, ficando assim estendido que aterminologia empregada teve a finalidade e não de limitação.
Claims (5)
1.) "MÉTODO PARA ISOLAMENTO DE EXOSSOMOS A PARTIR DESOLUÇÕES BIOLÓGICAS UTILIZANDO NANOPARTÍCULAS DEÓXIDO DE FERRO", caracterizado pelo fato do método para oisolamento de exossomos compreender plaquetas utilizandonanopartículas superparamagnéticas de magnetita (Fe3O4) e serrealizado através de um mecanismo de atração de cargas baseado nopotencial Zeta pré-determinado dos exossomos onde as nanopartículasde óxido de ferro, previamente sintetizadas com carga positiva pré-determinada, se ligam aos exossomos carregados negativamente,contidos na amostra biológica, por força de atração elétrica; a exposiçãodo material a um campo magnético permite a separação dos exossomosque se ligaram às nanopartículas.
2.) "MÉTODO PARA ISOLAMENTO DE EXOSSOMOS A PARTIR DESOLUÇÕES BIOLÓGICAS UTILIZANDO NANOPARTÍCULAS DEÓXIDO DE FERRO", de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo método ser definido nas seguintes etapas:(a) Plaquetas foram estimuladas a gerar exossomos típicos e partículascontrole;(b) Amostras contendo exossomos (sobrenadante 2) e partículas(sobrenadante 1) foram submetidas à medição do potencial Zeta,revelando cargas potenciais bastante negativas, mas diferentes entreelas (-61±21,1) mV para os exossomos versus (-9,2±3) mV parapartículas de degradação plaquetária, média±ep, n=4, p<0,05);(c) Solução de nanopartículas superparamagnética de óxido de ferro foisintetizada de acordo com a metodologia que consiste basicamente nahidrólise rápida do Fe3+, pela adição de hidróxido de amônio a soluçãoaquosa 0,25 molar de FeCI3.6H20; a diálise do precipitado permite suapeptização levando à formação de suspensão coloidal com partículasextremamente pequenas 200 Â);(d) A obtenção de partículas nanométricas (50-100 Â) à base de óxidode ferro foram preparadas por meio da hidrólise de soluções alcoólicaspor hidróxido de dietilamônio na presença de um surfactante como ononilfenoletoxilado;(e) Amostras foram incubadas com as nanopartículas de ferro por 1hora, na proporção de 0,1 ml solução de concentração 200 μg deferro/mL para 2 ml de solução contendo exossomos;(f) Ao final de 1 hora, esse material foi exposto a um campo magnéticoem coluna LS-MidiMACS (MiItenyi) que permitiu a separação dosexossomos que se ligaram as nanopartículas, por eluição com PBS +força mecânica (embolo da própria coluna);(g) Submetido à citometria de fluxo (CMF) é confirmado que foramobtidos exossomos através da alta expressão de CD63 com algumaexpressão de CD9 e baixíssima expressão de Anexina V.
3.) "MÉTODO PARA ISOLAMENTO DE EXOSSOMOS A PARTIR DESOLUÇÕES BIOLÓGICAS UTILIZANDO NANOPARTÍCULAS DEÓXIDO DE FERRO", de acordo com as reivindicações 1 e 2,caracterizado pelo fato de o método obter exossomos de soluçõesbiológicas mistas.
4.) "MÉTODO PARA ISOLAMENTO DE EXOSSOMOS A PARTIR DESOLUÇÕES BIOLÓGICAS UTILIZANDO NANOPARTÍCULAS DEÓXIDO DE FERRO", de acordo com as reivindicações I e 2,caracterizado pelo fato de o método obter exossomos íntegros em suaforma.
5.) "MÉTODO PARA ISOLAMENTO DE EXOSSOMOS A PARTIR DESOLUÇÕES BIOLÓGICAS UTILIZANDO NANOPARTÍCULAS DEÓXIDO DE FERRO", de acordo com as reivindicações 1 e 2,caracterizado pelo fato de o método obter exossomos íntegros em seuconteúdo protéico.
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