BRPI0821599B1

BRPI0821599B1 - FILTRATION METHODS OF A LIQUID PROTEIN MIXTURE

Info

Publication number: BRPI0821599B1
Application number: BRPI0821599-5A
Authority: BR
Inventors: Nebojsa Nikolic; Michaela Frey; Wolfgang Grabmayer; Thomas Jancik; Matthias Fried; Klaus Tschetschkowitsch; Barbara Riegler; Alma Kasapovic
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Company Limited
Priority date: 2007-12-28
Filing date: 2008-12-22
Publication date: 2025-01-14

Abstract

METODO DE FILTRAQAO DE UMA MISTURA LIQUIDA DE PROTEINA. Um metodo e descrito para filtrar uma proteina em uma mistura liquida em uma maneira que nao danifique substancialmente ou de outra forma limite a recuperagao da proteina no filtrado de filtragao. O metodo geralmente inclui passar uma mistura liquido contendo uma proteina (por exemplo, uma mistura vWF aquosa) atraves de um filtro embora aplique uma contrapressao ao filtrado da mistura liquida para reduzir e controlar precisamente o diferencial de pressao atraves do filtro. O metodo descrito tem uma vantagem que vazoes de filtragao altas podem ser alcangadas em diferenciais de pressao relativamente baixas, em contraste a altos diferenciais de pressao, que realmente reduzem a vazao de filtragao de misturas liquidas de proteina. Adicionalmente, o metodo pode recuperar substancialmente toda a proteina que esta inicialmente presente na mistura liquida.METHOD OF FILTRATING A LIQUID PROTEIN MIXTURE. A method is described for filtering a protein in a liquid mixture in a manner that does not substantially damage or otherwise limit the recovery of the protein in the filtration filtrate. The method generally includes passing a liquid mixture containing a protein (e.g., an aqueous VWF mixture) through a filter while applying a back pressure to the filtrate of the liquid mixture to reduce and precisely control the pressure differential across the filter. The method described has an advantage that high filtration flow rates can be achieved at relatively low pressure differentials, in contrast to high pressure differentials, which actually reduce the filtration flow rate of liquid protein mixtures. Additionally, the method can recover substantially all of the protein that is initially present in the liquid mixture.

Description

CROSS REFERENCE TO RELACIQNADQS REQUESTS

[001] O beneflcio sob a U.S.C. § 119(e) de Pedido de Patente Provisorio US de N° de serie 61/017.418 depositado em 28 de dezembro, 2007, a descrisao da qual e incorporada aqui por referenda, e aqui reivindicada.[001] The benefit under U.S.C. § 119(e) of U.S. Provisional Patent Application Serial No. 61/017,418 filed December 28, 2007, the disclosure of which is incorporated herein by reference, is claimed herein.

FUNDAMENTS Description Field

[002] A descrisao se relaciona geralmente a metodos de flltra?ao para a purifica?ao de protelnas. Mais particularmente, a descrisao se relaciona a flltra?ao esteril a baixo cisalhamento, e contrapressao de proteinas suscetiveis a danos por forsas de cisalhamento (por exemplo, proteinas sensiveis ao cisalhamento, proteinas de cascata da coagula?ao sanguinea), por exemplo, quando sendo transportadas em um fluido.[002] The description generally relates to filtration methods for the purification of proteins. More particularly, the description relates to low-shear sterile filtration, and backpressure of proteins susceptible to damage by shear forces (e.g., shear-sensitive proteins, blood coagulation cascade proteins), for example, when being transported in a fluid.

Brief Description of Related Technology

[003] Misturas de proteinas purificadas podem ser administradas a pacientes para uma variedade de usos terapeuticos. Uma mistura de proteinas purificadas preparada para infusao em pacientes deve ser esterilizada antes do uso. Um processo de esteriliza?ao adequado para algumas proteinas inclui filtra?ao em membrana de uma mistura de proteinas purificadas. A membrana filtro pode ser dimensionada para reter (i.e., remover da mistura de proteinas) particulados, microrganismos, e alguns virus, enquanto que as proteinas sao capazes de passar atraves da membrana.[003] Purified protein mixtures can be administered to patients for a variety of therapeutic uses. A purified protein mixture prepared for infusion into patients must be sterilized prior to use. A suitable sterilization process for some proteins includes membrane filtration of a purified protein mixture. The filter membrane can be sized to retain (i.e., remove from the protein mixture) particulates, microorganisms, and some viruses, while the proteins are able to pass through the membrane.

[004] Contudo, algumas proteinas nao sao eficientemente recuperadas como proteinas purificadas, esterilizadas usando-se metodos convencionais tais como filtra?ao em membrana. Este efeito e mais pronunciado quando se tenta filtrar proteinas que sao sensiveis ao cisalhamento e/ou parte da cascata da coagula?ao sanguinea. Um exemplo de tal proteina e o fator von Willebrand (vWF), o qual circula no plasma complexado com fator VII e assiste na regulagem da atividade biologica de coagula?ao sangulnea. Especificamente, as protelnas vWF sao senslveis a forsas de cisalhamento induzidas pelo gradiente de velocidade de um meio fluido carreador, em particular quando as proteinas vWF passam atraves ou proximo a uma membrana filtro (i.e., onde restrisoes ao escoamento e caminhos tortuosos de escoamento na vizinhansa dos poros da membrana filtro resultam em gradientes de velocidade particularmente grandes). Assim, quando unidades de filtra?ao sao operadas a pressoes suficientes para idealmente gerar taxas de fluxo de processo desejaveis, maiores taxas de fluxo (e o aumento das forsas de cisalhamento induzidas que acompanham) tendem a reduzir o rendimento do processo,, por exemplo, pelo dano ou destrui?ao das proteinas, e/ou pela redu?ao da taxa de filtra?ao ao longo do tempo.[004] However, some proteins are not efficiently recovered as purified, sterilized proteins using conventional methods such as membrane filtration. This effect is most pronounced when attempting to filter proteins that are shear sensitive and/or part of the blood coagulation cascade. An example of such a protein is von Willebrand factor (vWF), which circulates in plasma complexed with factor VII and assists in regulating the biological activity of blood coagulation. Specifically, vWF proteins are sensitive to shear forces induced by the velocity gradient of a carrier fluid medium, particularly when vWF proteins pass through or near a filter membrane (i.e., where flow restrictions and tortuous flow paths in the vicinity of the filter membrane pores result in particularly large velocity gradients). Thus, when filtration units are operated at pressures sufficient to ideally generate desirable process flow rates, higher flow rates (and the accompanying increased induced shear forces) tend to reduce process throughput, e.g., by damaging or destroying proteins, and/or by reducing the filtration rate over time.

[005] Conformemente, seria desejavel desenvolver um metodo de filtrar uma mistura de vWF purificada de uma maneira que nao danifique substancialmente as proteinas vWF, ainda o tal metodo ainda permita um alto rendimento de processo (i.e., taxa de filtra?ao) ao longo do tempo. Adicionalmente, seria desejavel desenvolver um metodo de filtra?ao geralmente aplicavel a qualquer proteina, tal que a proteina em geral possa ser filtrada (por exemplo, esterilmente filtrada) a uma taxa eficiente sem incorrencia de dano substancial/perda da proteina.[005] Accordingly, it would be desirable to develop a method of filtering a purified vWF mixture in a manner that does not substantially damage the vWF proteins, yet such a method still allows for a high process throughput (i.e., filtration rate) over time. Additionally, it would be desirable to develop a filtration method generally applicable to any protein, such that the protein in general can be filtered (e.g., sterile filtered) at an efficient rate without incurring substantial damage/loss of the protein.

SUMMARY

[006] O metodo descrito e util para filtrar uma proteina em uma mistura liquida tanto em batelada quanto de uma maneira continua que nao danifique substancialmente ou caso contrario limite a recupera?ao da proteina no filtrado da filtra?ao. O metodo geralmente aplica uma contrapressao ao filtrado para precisamente reduzir e controlar o diferencial de pressao atraves de um filtro. O metodo descrito tern a vantagem de que taxas de fluxo de filtra?ao relativamente altas podem ser alcansadas a diferenciais de pressao relativamente baixos, em contraste a altos diferenciais de pressao os quais na realidade reduzem a vazao de flltra?ao de misturas liquidas de proteinas. Ainda, o metodo pode recuperar substancialmente toda a proteina que estiver inicialmente presente na mistura liquida.[006] The method described is useful for filtering a protein in a liquid mixture either in a batch or continuous manner that does not substantially damage or otherwise limit the recovery of the protein in the filtration filtrate. The method generally applies a back pressure to the filtrate to precisely reduce and control the pressure differential across a filter. The method described has the advantage that relatively high filtration flow rates can be achieved at relatively low pressure differentials, in contrast to high pressure differentials which actually reduce the filtration throughput of liquid protein mixtures. Further, the method can recover substantially all of the protein that is initially present in the liquid mixture.

[007] Mais especificamente, a descrisao fomece um metodo de filtra?ao de uma mistura liquida de proteinas. De acordo com uma modalidade, o metodo inclui o fomecimento de uma mistura liquida a uma primeira pressao Pi e passagem da mistura liquida atraves de um filtro para formar um filtrado a uma segunda pressao P2, e aplica?ao de uma contrapressao ao filtrado tal que um diferencial de pressao P1-P2 nao seja de mais de cerca de 30 kPa (300 mbar). Em outra modalidade, o metodo inclui os passos de fomecimento de uma mistura liquida a uma primeira pressao Pi, e passagem da mistura liquida atraves de um filtro para formar um filtrado a uma segunda pressao P2, e aplica?ao de uma contrapressao ao filtrado suficiente para produzir uma vazao media do filtrado de pelo menos cerca de 300 g/min.m2de area superficial de filtro. A mistura liquida inclui um liquido carreador, uma proteina a uma primeira concentra?ao Ci relativo ao liquido carreador, e um contaminante disperso. O filtrado inclui o liquido carreador e a proteina a uma segunda concentra?ao C2 relativo ao liquido carreador. O filtro e dimensionado para remover pelo menos uma porsao do contaminante disperso da mistura liquida.[007] More specifically, the disclosure provides a method of filtering a liquid mixture of proteins. According to one embodiment, the method includes supplying a liquid mixture at a first pressure P1 and passing the liquid mixture through a filter to form a filtrate at a second pressure P2, and applying a back pressure to the filtrate such that a pressure differential P1-P2 is not more than about 30 kPa (300 mbar). In another embodiment, the method includes the steps of supplying a liquid mixture at a first pressure P1, and passing the liquid mixture through a filter to form a filtrate at a second pressure P2, and applying a back pressure to the filtrate sufficient to produce an average flow rate of the filtrate of at least about 300 g/min.m2 of filter surface area. The liquid mixture includes a carrier liquid, a protein at a first concentration Ci relative to the carrier liquid, and a dispersed contaminant. The filtrate includes the carrier liquid and the protein at a second concentration C2 relative to the carrier liquid. The filter is sized to remove at least a portion of the dispersed contaminant from the liquid mixture.

[008] Em ainda outra modalidade, o metodo e capaz de filtrar uma mistura de proteina aquosa, e inclui os passos de fomecimento de uma mistura aquosa a uma primeira pressao Pi, passagem da mistura aquosa atraves de um filtro de membrana porosa para formar um filtrado a uma segunda pressao P2, e aplica?ao de uma contrapressao ao filtrado tal que um diferencial de pressao P1-P2 nao seja de mais de cerca de 9 kPa (90 mbar). A mistura aquosa inclui agua e vWF a uma primeira concentra?ao Ci relativo a agua. O filtrado inclui agua e vWF a uma segunda concentra?ao C2 relativo a agua. O filtro de membrana porosa inclui poros dimensionados de cerca de 0,1 pm a cerca de 0,5 pm.[008] In yet another embodiment, the method is capable of filtering an aqueous protein mixture, and includes the steps of supplying an aqueous mixture to a first pressure P1, passing the aqueous mixture through a porous membrane filter to form a filtrate at a second pressure P2, and applying a back pressure to the filtrate such that a pressure differential P1-P2 is not more than about 9 kPa (90 mbar). The aqueous mixture includes water and vWF at a first concentration Ci relative to water. The filtrate includes water and vWF at a second concentration C2 relative to water. The porous membrane filter includes pores sized from about 0.1 μm to about 0.5 μm.

[009] Em qualquer das modalidades acima, a protelna epreferencialmente uma protelna senslvel ao cisalhamento e/ou uma protelna da cascata de coagula?ao sangulnea. Ainda, a protelna e preferencialmente recuperada no flltrado tal que uma razao de recupera?ao C2/C1 seja de pelo menos cerca de 0,95, mais preferencialmente de pelo menos cerca de 0,99. Adicionalmente, o diferencial de pressao P1-P2 e preferencialmente de nao mais que cerca de 9 kPa (90 mbar) e a primeira pressao Pi e preferencialmente de pelo menos cerca de 20 kPa (200 mbar) manometricos. Modalidades de preferencia dos metodos acima incluem aquelas nas quais o llquido carreador e agua, e/ou o contaminante disperso inclui microrganismos. A protelna pode incluir o Fator de von Willebrand, o Fator VIII, o Fator XIII, e misturas dos mesmos. O filtro preferencialmente inclui um filtro de membrana porosa tendo poros dimensionados de cerca de 0,1 pm a cerca de 0,5 pm, mais preferencialmente dimensionados de 0,2 pm a cerca de 0,22 pm. Preferencialmente, o produto flltrado esta substancialmente livre do contaminante disperso.[009] In any of the above embodiments, the protein is preferably a shear-sensitive protein and/or a protein of the blood coagulation cascade. Further, the protein is preferably recovered in the filtrate such that a recovery ratio C2/C1 is at least about 0.95, more preferably at least about 0.99. Additionally, the pressure differential P1-P2 is preferably no more than about 9 kPa (90 mbar) and the first pressure Pi is preferably at least about 20 kPa (200 mbar) gauge. Preferred embodiments of the above methods include those in which the carrier liquid is water, and/or the dispersed contaminant includes microorganisms. The protein may include von Willebrand Factor, Factor VIII, Factor XIII, and mixtures thereof. The filter preferably includes a porous membrane filter having pore sizes of from about 0.1 μm to about 0.5 μm, more preferably sized from 0.2 μm to about 0.22 μm. Preferably, the filtered product is substantially free of the dispersed contaminant.

[0010] A filtra?ao de uma protelna sob a aplica?ao de umacontrapressao permite a recupera?ao da protelna em altas concentrates relativas, altas taxas de fluxo de flltrado relativas, e taxas de fluxo de flltrado substancialmente constantes que nao sao do contrario atingiveis na ausencia de contrapressao. Isto esta em contraste com a teoria geral de aplica?ao de filtros com rela?ao a vazao de flltrado, a qual preve que uma vazao de flltrado aumenta com o crescente diferencial de pressao atraves do filtro (i.e., na ausencia de contrapressao).[0010] Filtration of a protein under the application of a back pressure allows recovery of the protein at high relative concentrations, high relative filtrate flow rates, and substantially constant filtrate flow rates that are not otherwise achievable in the absence of back pressure. This is in contrast to general filter application theory with respect to filtrate flow rate, which predicts that filtrate flow rate increases with increasing pressure differential across the filter (i.e., in the absence of back pressure).

[0011] Outros aspectos e vantagens serao aparentes aqudes comhabilidade ordinaria na tecnica a partir de uma revisao da seguinte descrisaodetalhada, tomada em conjunto com o desenho. Enquanto as composi?oes, filmes, e pacotes descritos aqui sao suscetiveis a modalidades de varias formas, a descrito a seguir inclui modalidades especificas com o entendimento de que a descr^ao e ilustrativa, e nao se destina a limitar a invensao as modalidades especificas descritas aqui.[0011] Other aspects and advantages will be apparent to those of ordinary skill in the art from a review of the following detailed description, taken in conjunction with the drawing. While the compositions, films, and packages described herein are susceptible to embodiments of various forms, the following description includes specific embodiments with the understanding that the description is illustrative, and is not intended to limit the invention to the specific embodiments described herein.

BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWING

[0012] Duas figuras de desenho estao anexadas a este documento parafacilitar o entendimento da descr^ao.[0012] Two drawing figures are attached to this document to facilitate understanding of the description.

[0013] A Figura 1 e uma vista da se?ao da se?ao cruzada de um filtrode cartucho simetrico ao eixo para uso na filtra?ao de proteinas com contrapressao.[0013] Figure 1 is a cross-sectional view of an axis-symmetric cartridge filter for use in backpressure filtration of proteins.

[0014] A Figura 2 e uma compara?ao dos dados de taxa de filtra?aoobtidos usando-se um metodo de filtra?ao convencional e um metodo de filtra?ao com contrapressao.[0014] Figure 2 is a comparison of filtration rate data obtained using a conventional filtration method and a backpressure filtration method.

DETAILED DESCRIPTION

[0015] O metodo descrito aqui e geralmente aplicavel a purifica?aopor filtra?ao de uma proteina em uma mistura liquida de uma maneira que nao danifique substancialmente ou do contrario limita a recupera?ao da proteina durante a filtra?ao. Em adi?ao a proteina, a mistura liquida tambem inclui um liquido carreador e um contaminante disperso. O liquido carreador e o meio de suspensao para a proteina e nao e geralmente limitado. Um liquido carreador de preferencia e a agua. Similarmente, o contaminante disperso nao e particularmente limitado e pode incluir qualquer material solido disperso que seja um componente indesejavel do filtrado de proteina filtrado, purificado. No caso de uma opera?ao de filtra?ao esteril, o contaminante disperso geralmente inclui qualquer um de uma variedade de microrganismos (i.e., bacterias) que possa estar presente na mistura liquida.[0015] The method described herein is generally applicable to the filtration purification of a protein in a liquid mixture in a manner that does not substantially damage or otherwise limit the recovery of the protein during filtration. In addition to the protein, the liquid mixture also includes a carrier liquid and a dispersed contaminant. The carrier liquid is the suspension medium for the protein and is generally not limited. A preferred carrier liquid is water. Similarly, the dispersed contaminant is not particularly limited and may include any dispersed solid material that is an undesirable component of the purified, filtered protein filtrate. In the case of a sterile filtration operation, the dispersed contaminant generally includes any of a variety of microorganisms (i.e., bacteria) that may be present in the liquid mixture.

[0016] O metodo descrito e particularmente preferencialmenteaplicado a filtrasao de proteinas que forem sensiveis ao cisalhamento, parte da cascata da coagula?ao sanguinea humana, ou ambos (i.e., algumas proteinas adequadas,, por exemplo, vWF, podem ser classificadas como proteinas ambas sensiveis ao cisalhamento e da cascata da coagula?ao sanguinea).[0016] The method described is particularly preferably applied to the filtration of proteins that are shear-sensitive, part of the human blood coagulation cascade, or both (i.e., some suitable proteins, e.g. vWF, may be classified as both shear-sensitive and blood coagulation cascade proteins).

[0017] Proteinas sensiveis ao cisalhamento que sao adequadas paraa puriflca?ao usando o metodo de flltra?ao em contrapressao descrito incluem aquelas que sao suscetiveis a danos, destrui?ao, perda de atividade, e/ou uma redu?ao na taxa de flltra?ao quando transportadas como uma suspensao em um liquido carreador que e caracterizado por signiflcantes floras cisalhantes (i.e., gradientes de velocidade relativamente altos). Em geral, uma proteina sensivel ao cisalhamento e uma proteina a qual exibe uma proporcionalidade inversa entre a taxa de flltra?ao e cisalhamento aplicado (ou pressao aplicada) acima de um cisalhamento critico aplicado (ou pressao aplicada). O cisalhamento critico aplicado (ou pressao aplicada) no qual uma transi?ao entre uma rela?ao diretamente proporcional para taxa de flltra?ao e cisalhamento aplicado (ou pressao aplicada) e uma rela?ao inversamente proporcional (i.e., uma transi?ao ocorrendo quando a taxa de flltra?ao estiver em um maximo) pode ser diferente para varias proteinas sensiveis ao cisalhamento. Por exemplo, cisalhamento critico aplicado pode ser pelo menos de cerca de 2000 s"1 (ou de pelo menos cerca de 4000 s"1) e nao mais que cerca de 8000 s"1 (ou nao mais que cerca de 12000 s"1). Contudo, espera-se que o comportamento qualitative para diferentes proteinas sensiveis a cisalhamento seja similar. Uma proteina sensivel a cisalhamento inclui vWF, embora o metodo descrito nao seja particularmente limitado a isso. Enquanto o vWF existe em plasma em uma serie de formas oligomericas/polimericas tendo pesos moleculares que vao desde cerca de 1.000 kDa (quilodalton) a cerca de 20.000 kDa baseado em dimeros de 520 kDa, o metodo descrito nao estanecessariamente limitado a uma faixa particular de peso molecular.[0017] Shear-sensitive proteins that are suitable for purification using the described backpressure filtration method include those that are susceptible to damage, destruction, loss of activity, and/or a reduction in filtration rate when transported as a suspension in a carrier liquid that is characterized by significant shear rates (i.e., relatively high velocity gradients). In general, a shear-sensitive protein is a protein which exhibits an inverse proportionality between filtration rate and applied shear (or applied pressure) above a critical applied shear (or applied pressure). The critical applied shear (or applied pressure) at which a transition occurs between a directly proportional relationship for filtration rate and applied shear (or applied pressure) and an inversely proportional relationship (i.e., a transition occurring when the filtration rate is at a maximum) may be different for various shear-sensitive proteins. For example, the critical applied shear may be at least about 2000 s"1 (or at least about 4000 s"1) and no more than about 8000 s"1 (or no more than about 12000 s"1). However, the qualitative behavior for different shear-sensitive proteins is expected to be similar. One such shear-sensitive protein includes vWF, although the method described is not particularly limited to it. While vWF exists in plasma in a number of oligomeric/polymeric forms having molecular weights ranging from about 1,000 kDa (kilodalton) to about 20,000 kDa based on 520 kDa dimers, the method described is not necessarily limited to a particular molecular weight range.

[0018] O metodo descrito tambem e geralmente aplicavel napurificasao de proteinas na cascata de coagula?ao sanguinea humana (i.e., fatores de coagula?ao). Por exemplo, os Fatores de coagula?ao II (peso molecular de cerca de 37 kDa), VII ( cerca de 50 kDa), VIII: C (cerca de 260 kDa), IX (cerca de 55 kDa a cerca de 70 kDa), X (cerca de 100 kDa), XIII (cerca de 350 kDa), vWF (discutido acima), e combinasoes disso, algumas das quais tambem sao sensiveis ao cisalhamento, podem ser eflcientemente filtradas e recuperadas usando-se contrapressao.[0018] The described method is also generally applicable to the purification of proteins in the human blood coagulation cascade (i.e., coagulation factors). For example, coagulation factors II (molecular weight about 37 kDa), VII (about 50 kDa), VIII:C (about 260 kDa), IX (about 55 kDa to about 70 kDa), X (about 100 kDa), XIII (about 350 kDa), vWF (discussed above), and combinations thereof, some of which are also shear sensitive, can be efficiently filtered and recovered using back pressure.

[0019] Algumas proteinas purificadas de preferencia particularmenteincluem proteinas unicas tais como os Fatores XIII ou vWF e combinasoes de multi-proteinas tais como um Fator complexo VIII:C/vWF. Uma mistura de proteinas de preferencia que nao e particularmente sensivel ao cisalhamento, mas a qual e ainda favoravelmente filtrada usando-se contrapressao, e a mistura FEIBA VH (“factor eight inhibitor bypassing activity (vapor heated)”, disponivel pela Baxter, Deerfield, IL) que pode ser usada para controlar o sangramento espontaneo e/ou tratar pacientes de hemofilia A/B. A mistura FEIBA VH inclui os Fatores II, IX e X (principalmente nao ativados), Fator VII (principalmente ativado), e Fator VIII:C (cerca de 1 a 6 unidades/ml). A mistura FEIBA VH se beneficia do uso da contrapressao em que a mistura de proteina pode ser filtrada a taxas de filtra?ao relativamente altas com pequena ou nenhuma perda na atividade da proteina quando a contrapressao e aplicada.[0019] Some particularly preferred purified proteins include single proteins such as Factors XIII or vWF and multi-protein combinations such as a Factor VIII:C/vWF complex. A preferred protein mixture that is not particularly shear sensitive, but which is still favorably filtered using back pressure, is the FEIBA VH (“factor eight inhibitor bypassing activity (vapor heated)” mixture, available from Baxter, Deerfield, IL) which can be used to control spontaneous bleeding and/or treat hemophilia A/B patients. The FEIBA VH mixture includes Factors II, IX, and X (mostly unactivated), Factor VII (mostly activated), and Factor VIII:C (about 1 to 6 units/ml). The FEIBA VH blend benefits from the use of back pressure in that the protein blend can be filtered at relatively high filtration rates with little or no loss in protein activity when back pressure is applied.

[0020] A mistura liquida contendo a proteina e o contaminantedisperso e entao purificada pela passagem da mistura liquida atraves de um filtro. Os filtros adequados para uso de acordo com o metodo descrito nao estao particularmente limitados e podem incluir filtros de superflcie,, por exemplo, filtros sem saida (i.e., no qual o fluido a ser filtrado perpendicularmente se aproxima da superflcie do filtro) e filtros de fluxo cruzado (i.e., no qual o fluido a ser filtrado viaja paralelamente a superflcie dofiltro). Vide, por exemplo, Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, vol. 10, pag. 788-853 (“Filtration”) (4- ed., 1993). Os filtros tambem nao sao particularmente limitados com rela?ao a seu tamanho de classifica?ao (i.e., o tamanho acima do qual o material disperso e retido no filtro e o tamanho abaixo do qual o material disperso passa para o filtrado). Uma vez que o tamanho de classifica?ao de um filtro e selecionado para uma aplica?ao particular (i.e., material disperso a ser retido vs. material disperso a passar para o filtrado), o filtro deveria ser operado considerando-se a quantidade de cisalhamento gerada pelo liquido carreador escoando atraves do filtro relativo a sensibilidade ao cisalhamento da proteina em particular sendo filtrada.[0020] The liquid mixture containing the protein and the dispersed contaminant is then purified by passing the liquid mixture through a filter. Filters suitable for use in accordance with the described method are not particularly limited and may include surface filters, e.g., dead-end filters (i.e., in which the fluid to be filtered approaches the filter surface perpendicularly) and cross-flow filters (i.e., in which the fluid to be filtered travels parallel to the filter surface). See, e.g., Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, vol. 10, pp. 788-853 (“Filtration”) (4th ed., 1993). Filters are also not particularly limited with respect to their size rating (i.e., the size above which dispersed material is retained on the filter and the size below which dispersed material passes into the filtrate). Once the size rating of a filter is selected for a particular application (i.e., dispersed material to be retained vs. dispersed material to pass into the filtrate), the filter should be operated with consideration of the amount of shear generated by the carrier liquid flowing through the filter relative to the shear sensitivity of the particular protein being filtered.

[0021] Um meio de filtra?ao de preferencia e uma membrana porosa,a qual esta geralmente disponivel em varios tamanhos (i.e., area superficial do filtro, por exemplo, que vai de cerca de 0,001 m2 a cerca de 5 m2) e configura5oes (por exemplo, discos de filtro, cartuchos de filtro). A membrana porosa pode ser formada de materials tais como nitrato de celulose, acetato de celulose, polimeros vinilicos, poliamidas, fluorocarbonetos, e polietersulfonas. A membrana porosa inclui poros geralmente tendo um tamanho altamente uniforme que e selecionada dependendo do tamanho do contaminante disperso a ser removido da mistura liquida. Por exemplo, em operates de filtra?ao esteril destinadas a remover microrganismos (enquanto permitindo que a proteina passe atraves da membrana do filtro para o filtrado), os poros preferencialmente tern o tamanho em uma faixa de cerca de 0,1 pm a cerca de 0,5 pm, ou de cerca de 0,15 pm a cerca de 0,25pm„ por exemplo, de cerca de 0,2 pm a cerca de 0,22 pm. Filtros de membrana porosa adequados podem tambem incluir ambos um filtro de 0,2 pm/0,22 pm e um pre-filtro grosseiro (por exemplo, de cerca de 0,45 pm) para melhorar o rendimento e limitar acumulo de torta na superflcie de 0,2 pm/0,22 pm do filtro. Exemplos de filtros de membrana porosa comerciais adequados para filtrado esteril de misturas liquidas com proteinas incluem uma membrana SARTOBRAN P 0,2 pm de acetato de celulose (incluindo ambos poros de filtrado de 0,2 pm e uma membrana pre-filtro tendo poros de fHtra?ao de 0,45 pm; disponlvel pela Sartorius AG, Gottingen, Alemanha) e uma membrana SUPOR EKV 0,2 pm de polietersulfona (disponlvel pela Pall Corporation, East Hills, NY).[0021] A preferred filtration medium is a porous membrane, which is generally available in a variety of sizes (i.e., filter surface area, for example, ranging from about 0.001 m2 to about 5 m2) and configurations (e.g., filter discs, filter cartridges). The porous membrane may be formed of materials such as cellulose nitrate, cellulose acetate, vinyl polymers, polyamides, fluorocarbons, and polyethersulfones. The porous membrane includes pores generally having a highly uniform size that is selected depending on the size of the dispersed contaminant to be removed from the liquid mixture. For example, in sterile filtration operations intended to remove microorganisms (while allowing protein to pass through the filter membrane into the filtrate), the pores preferably have a size in a range of from about 0.1 μm to about 0.5 μm, or from about 0.15 μm to about 0.25 μm, e.g., from about 0.2 μm to about 0.22 μm. Suitable porous membrane filters may also include both a 0.2 μm/0.22 μm filter and a coarse prefilter (e.g., about 0.45 μm) to improve throughput and limit cake accumulation on the 0.2 μm/0.22 μm surface of the filter. Examples of commercial porous membrane filters suitable for sterile filtration of protein liquid mixtures include a SARTOBRAN P 0.2 μm cellulose acetate membrane (including both 0.2 μm filtrate pores and a prefilter membrane having 0.45 μm filtration pores; available from Sartorius AG, Gottingen, Germany) and a SUPOR EKV 0.2 μm polyethersulfone membrane (available from Pall Corporation, East Hills, NY).

[0022] A Figura 1 ilustra o escoamento da mistura liquida atraves deum aparelho de filtro 100„ por exemplo, um filtro de cartucho tendo uma membrana porosa. Como ilustrado, a mistura liquida entra no aparelho de filtro 100 selado via entrada 110 para uma camara de entrada 120. O fluido na camara de entrada 120 e pressurizado, tendo uma primeira pressao Pi que esta geralmente acima da pressao ambiente (i.e., cerca de 100 kPa (1 bar) absoluto). A primeira pressao Pi na camara de entrada 120 conduz o liquido carreador e a proteina na mistura liquida atraves de uma membrana porosa de filtro 130. O material passando atraves da membrana do filtro 130 forma um filtrado incluindo ambos o liquido carreador e a proteina em uma camara de filtrado 140. O fluido na camara de filtrado 140 e tambem pressurizado, tendo uma segunda pressao P2 que e menor que a primeira pressao Pi, mas a qual esta geralmente acima da pressao ambiente. O filtrado purificado entao sai do aparelho de filtro 100 via saida 150. A vazao atraves da saida 150 (e a segunda pressao P2) e regulada via regulador de contrapressao 160.[0022] Figure 1 illustrates the flow of liquid mixture through a filter apparatus 100, for example, a cartridge filter having a porous membrane. As illustrated, the liquid mixture enters the sealed filter apparatus 100 via inlet 110 to an inlet chamber 120. The fluid in the inlet chamber 120 is pressurized, having a first pressure Pi that is generally above ambient pressure (i.e., about 100 kPa (1 bar) absolute). The first pressure P i in inlet chamber 120 drives the carrier liquid and the protein in the liquid mixture through a porous filter membrane 130. The material passing through the filter membrane 130 forms a filtrate including both the carrier liquid and the protein in a filtrate chamber 140. The fluid in the filtrate chamber 140 is also pressurized, having a second pressure P 2 that is less than the first pressure P , but which is generally above ambient pressure. The purified filtrate then exits the filter apparatus 100 via outlet 150. The flow rate through outlet 150 (and the second pressure P 2 ) is regulated via backpressure regulator 160.

[0023] Os poros da membrana de filtro 130 sao dimensionados pararemover pelo menos uma porsao de contaminantes dispersos contidos na mistura liquida, retendo os contaminantes dispersos removidos no lado de entrada da membrana de filtro 130 (i.e., na camara de entrada 120). Preferencialmente, a membrana de filtro 130 e dimensionada para remover substancialmente todos os contaminantes dispersos inicialmente contidos pela mistura liquida na entrada; assim, o filtrado esta substancialmente livre (ou livre) dos contaminantes dispersos. Especificamente, o filtrado nao deveria conter os contaminantes dispersos em uma quantidade que adversamente afetaria o uso do filtrado e mistura purificada de protelna como uma composi?ao terapeutica. Por exemplo, quando os contaminantes dispersos incluem microrganismos, a membrana de filtro 130 deveria ser capaz de remover pelo menos cerca de 107 unidades formadoras de colonia por cm2 de area de filtro.[0023] The pores of the filter membrane 130 are sized to remove at least a portion of the dispersed contaminants contained in the liquid mixture, retaining the removed dispersed contaminants on the inlet side of the filter membrane 130 (i.e., in the inlet chamber 120). Preferably, the filter membrane 130 is sized to remove substantially all of the dispersed contaminants initially contained by the liquid mixture at the inlet; thus, the filtrate is substantially free (or free) of the dispersed contaminants. Specifically, the filtrate should not contain the dispersed contaminants in an amount that would adversely affect the use of the filtrate and purified protein mixture as a therapeutic composition. For example, when the dispersed contaminants include microorganisms, the filter membrane 130 should be capable of removing at least about 107 colony forming units per cm2 of filter area.

[0024] A primeira pressao Pi da mistura liquida de entrada pode seraplicada por qualquer fonte adequada, por exemplo, gravidade, um gas comprimido (por exemplo, ar comprimido), ou uma bomba (por exemplo, uma bomba de baixo cisalhamento). Preferencialmente, a primeira pressao Pi e de pelo menos cerca de 20 kPa (200 mbar) manometrica, ou em uma faixa de cerca de 20 kPa (200 mbar) manometrica a cerca de 100 kPa (1.000 mbar) manometrica (i.e., cerca de 100 kPa (1 bar) manometrica), por exemplo, de cerca de 30 kPa (300 mbar) manometrica. A contrapressao (ou pressao contraria) tambem pode ser aplicada por qualquer fonte adequada, por exemplo, uma valvula convencional (ilustrada na Figura 1 como o regulador de contrapressao 160), para obter a segunda pressao P2 da do filtrado de saida. Adicionalmente, a contrapressao pode tambem ser aplicada por uma restr^ao, obstru?ao, etc. ao fluxo ao longo do comprimento da passagem de saida 150. Como um resultado da primeira e segunda pressoes Pi e P2, a contrapressao aplicada gera um diferencial (positivo) de pressao Pi-P2 para conduzir o liquido carreador e a proteina atraves do filtro e para o filtrado. O diferencial de pressao e baixo, com diferenciais de pressao maximos adequados dependendo de uma variedade de fatores, por exemplo, a proteina em particular sendo filtrada e o filtro em particular sendo usado. Em particular, o diferencial de pressao e preferencialmente de nao mais que cerca de 30 kPa (300 mbar), 20 kPa (200 mbar), 15 kPa (150 mbar), ou 12 lcPa (120 mbar), mais preferencialmente de nao mais que cerca de 9 kPa (90 mbar) ou 5 kPa (50 mbar), ate mais preferencialmente de nao mais que cerca de 2 lcPa (20 mbar) ou 1 kPa (10 mbar), por exemplo, de nao mais que 0,5 kPa (5 mbar) ou nao mais que cerca de 0,3 kPa (3 mbar).[0024] The first pressure Pi of the inlet liquid mixture may be applied by any suitable source, e.g., gravity, a compressed gas (e.g., compressed air), or a pump (e.g., a low-shear pump). Preferably, the first pressure Pi is at least about 20 kPa (200 mbar) gauge, or in a range of about 20 kPa (200 mbar) gauge to about 100 kPa (1,000 mbar) gauge (i.e., about 100 kPa (1 bar) gauge), e.g., about 30 kPa (300 mbar) gauge. Back pressure (or counter pressure) may also be applied by any suitable source, e.g., a conventional valve (illustrated in Figure 1 as back pressure regulator 160), to obtain the second pressure P2 of the outlet filtrate. Additionally, back pressure may also be applied by a restriction, obstruction, etc. to the flow along the length of the outlet passage 150. As a result of the first and second pressures P1 and P2, the applied back pressure generates a (positive) pressure differential P2 to drive the carrier liquid and protein through the filter and into the filtrate. The pressure differential is low, with suitable maximum pressure differentials depending on a variety of factors, e.g., the particular protein being filtered and the particular filter being used. In particular, the pressure differential is preferably not more than about 30 kPa (300 mbar), 20 kPa (200 mbar), 15 kPa (150 mbar), or 12 lcPa (120 mbar), more preferably not more than about 9 kPa (90 mbar) or 5 kPa (50 mbar), even more preferably not more than about 2 lcPa (20 mbar) or 1 kPa (10 mbar), for example not more than 0.5 kPa (5 mbar) or not more than about 0.3 kPa (3 mbar).

[0025] Em tais diferenciais de pressao, a vazao atraves do flltro ebaixa o suficiente para gerar um ambiente de baixo cisalhamento que nao danifica, destroi, ou reduz substancialmente a atividade da proteina. O ambiente de baixo cisalhamento ainda nao limita substancialmente o rendimento do processo de filtra?ao.[0025] At such pressure differentials, the flow rate through the filter is low enough to generate a low shear environment that does not damage, destroy, or substantially reduce the activity of the protein. The low shear environment still does not substantially limit the throughput of the filtration process.

[0026] Especificamente, foi observado que uma baixa pressaodiferencial pode ser usada para obter ambos uma vazao relativamente alta e substancialmente constante. Em particular, uma baixa pressao diferencial pode ser aplicada para obter uma vazao de filtra?ao media de pelo menos cerca de 300 g/min.m2, por exemplo, de cerca de 300 g/min.m2 a cerca de 1000 g/min.m2 ou cerca de 400 g/min.m2 a cerca de 800 g/min.m2, onde as unidades sao massa de filtrado (i.e., gramas de liquido carreador e proteina combinados) obtidos por tempo unitario (i.e., minutos) e normalizado por unidade de area superficial do filtro (i.e., m2). A baixa pressao diferencial resultando da aplica?ao de contrapressao pode tambem gerar uma taxa de filtra?ao substancialmente constante, em particular apos a realiza?ao de um transiente de partida, assim melhorando a capacidade liquida de um filtro. Em contraste a taxa de filtra?ao observada a uma baixa pressao diferencial (e em contraste com a teoria geral de filtra?ao, a qual descreve que a taxa de filtra?ao e proporcional a pressao diferencial atraves do filtro), uma pressao diferencial mais alta (por exemplo, acima de cerca de 10 kPa (100 mbar)) tende a diminuir a taxa de filtra?ao. Assim, os metodos convencionais de filtra?ao, os quais aplicam pressoes diferenciais de pelo menos cerca de 10 kPa (100 mbar) a cerca de pelo menos 30 kPa (300 mbar), sao incapazes de atingir taxas de fluxo de filtra?ao medias observadas no metodo descrito.[0026] Specifically, it has been observed that a low differential pressure can be used to obtain both a relatively high and substantially constant flow rate. In particular, a low differential pressure can be applied to obtain a mean filtration flow rate of at least about 300 g/min.m2, e.g., from about 300 g/min.m2 to about 1000 g/min.m2 or about 400 g/min.m2 to about 800 g/min.m2, where the units are mass of filtrate (i.e., grams of carrier liquid and protein combined) obtained per unit time (i.e., minutes) and normalized per unit surface area of the filter (i.e., m2). The low differential pressure resulting from the application of backpressure can also produce a substantially constant filtration rate, particularly after a start-up transient has occurred, thereby improving the net capacity of a filter. In contrast to the filtration rate observed at a low differential pressure (and in contrast to general filtration theory, which states that the filtration rate is proportional to the differential pressure across the filter), a higher differential pressure (e.g., above about 10 kPa (100 mbar)) tends to decrease the filtration rate. Thus, conventional filtration methods, which apply differential pressures of at least about 10 kPa (100 mbar) to at least about 30 kPa (300 mbar), are unable to achieve the average filtration flow rates observed in the method described.

[0027] Ainda, foi observado que uma baixa pressao diferencial podeser usada para obter uma lata recupera?ao de proteina. Especificamente,substancialmente toda a protelna que esta inicialmente presente na mistura llquida e preferencialmente recuperada no flltrado. Por exemplo, quando uma primeira concentra?ao Ci representa a concentra?ao da protelna relativo ao llquido carreador na mistura liquida inicial, e uma segunda concentra?ao C2 representa a concentra?ao da protelna relativo ao liquido carreador no flltrado final, entao uma razao de recupera?ao C2/C1 do metodo de filtra?ao descrito e preferencialmente pelo menos de cerca de 0,95, e mais preferencialmente pelo menos de cerca de 0,99.[0027] Further, it has been observed that a low differential pressure can be used to achieve high protein recovery. Specifically, substantially all of the protein that is initially present in the liquid mixture is preferably recovered in the filtrate. For example, when a first concentration Ci represents the protein concentration relative to the carrier liquid in the initial liquid mixture, and a second concentration C2 represents the protein concentration relative to the carrier liquid in the final filtrate, then a recovery ratio C2/C1 of the described filtration method is preferably at least about 0.95, and more preferably at least about 0.99.

[0028] O metodo de filtra?ao com contrapressao descrito e utilquando aplicado a protelnas porque o metodo fomece controle preciso da vazao de filtra?ao. Fontes de pressao que podem ser usadas para conduzir a mistura llquida atraves do filtro geralmente fomecem uma pressao excessiva que resulta em altas taxas de cisalhamento, as quais, por sua vez, levam ao entupimento do filtro e danifica?ao da protelna. E geralmente dificil, se nao imposslvel, regular uma unica fonte de pressao relativa a pressao ambiente tal que a pressao diferencial resultante e ambos baixa o suficiente e suficientemente constante para resultar em uma vazao media atraves do filtro que seja suficientemente baixa para evitar danifica?ao da protelna e substancialmente constante. Pela aplica?ao de contrapressao ao lado do flltrado do fluido de processo, contudo, uma fonte de pressao relativamente alta (i.e., a primeira pressao Pi) pode ser precisamente contrabalanceada (i.e., com a segunda pressao P2) para obter um diferencial de pressao baixo e substancialmente constante (i.e., P2-P2).[0028] The backpressure filtration method described is useful when applied to proteins because the method provides precise control of the filtration flow rate. Pressure sources that may be used to drive the liquid mixture through the filter generally provide excessive pressure that results in high shear rates, which in turn lead to filter clogging and protein damage. It is generally difficult, if not impossible, to regulate a single pressure source relative to ambient pressure such that the resulting differential pressure is both low enough and sufficiently constant to result in an average flow rate through the filter that is low enough to avoid protein damage and is substantially constant. By applying backpressure to the filtrate side of the process fluid, however, a relatively high pressure source (i.e., the first pressure Pi) can be precisely counterbalanced (i.e., with the second pressure P2) to obtain a low and substantially constant pressure differential (i.e., P2-P2).

Examples

[0029] Os seguintes exemplos sao fomecidos para ilustra?ao e nao saodestinados a limitar o escopo da invensao.[0029] The following examples are provided for illustration and are not intended to limit the scope of the invention.

Examples 1-8

[0030] Uma mistura llquida aquosa da protelna senslvel aocisalhamento, da cascata da coagula?ao sangulnea vWF foi filtradaesterilmente para se determinar o efeito da pressao (e contrapressao) e outras variaveis de processo (por exemplo, tamanho e tipo de filtro) na eficacia da filtrado, por exemplo, baseado na atividade recuperada de vWF no flltrado, a vazao media do filtrado, e a habilidade aumentar a escala do processo.[0030] An aqueous liquid mixture of the shear-sensitive blood coagulation cascade protein vWF was sterile filtered to determine the effect of pressure (and back pressure) and other process variables (e.g., filter size and type) on filtration efficiency, e.g., based on recovered vWF activity in the filtrate, average filtrate flow rate, and the ability to scale up the process.

[0031] Uma mistura liquida de vWF recombinante (“rVWF:Rco”)tendo uma atividade de 125 IU/ml e concentra?ao de 1159 pg/ml (ensaio do acido bicinconinico (“BCA”)) foi preparada para uso em cada um dos seguintes Exemplos 1-8. Sais de baixo peso molecular foram adicionados para ajustar o pH e osmolaridade da mistura para valores de 7,3 e cerca de 400 mOsmol/1 (miliosmol/litro), respectivamente. Porque os Exemplos 1-8 foram destinados isolar os efeitos dinamicos do fluido (por exemplo, cisalhamento) na proteina na vizinhansa de um filtro, nenhum outro contaminante ou material disperso (por exemplo, bacterias, outros microrganismos, ou outras proteinas) foi adicionado a mistura. Os componentes da mistura liquida aquosa estao resumidos na Tabela 1.Tabela 1 - Composigao da Mistura Liquida para os Exemplos 1-8 [0031] A liquid mixture of recombinant VWF (“rVWF:Rco”) having an activity of 125 IU/mL and concentration of 1159 pg/mL (bicinchoninic acid (“BCA”) assay) was prepared for use in each of the following Examples 1-8. Low molecular weight salts were added to adjust the pH and osmolarity of the mixture to values of 7.3 and approximately 400 mOsmol/L (milliosmol/liter), respectively. Because Examples 1-8 were intended to isolate the dynamic effects of fluid (e.g., shear) on protein in the vicinity of a filter, no other contaminants or dispersed material (e.g., bacteria, other microorganisms, or other proteins) were added to the mixture. The components of the aqueous liquid mixture are summarized in Table 1. Table 1 - Composition of Liquid Mixture for Examples 1-8

[0032] A mistura liquida aquosa foi entao testada da seguintemaneira. Um volume de teste de pelo menos cerca de 500 ml da mistura foi adicionado a um vaso pressao-resistente de a?o inoxidavel. A saida do vaso foi conectada a entrada de um filtro esteril (esterilizado a vapor) com uma primeira se?ao de tubula?ao de silicone. Uma segunda se?ao de tubula?ao de silicone com um comprimento de cerca de 10 cm foi anexada a saida da carca?a do filtro esteril. O efluente filtrado do filtro esteril foi coletado em um bequer posicionado sobre uma balan£a para monitorar a taxa de filtra?ao. A balan$a foi interfaceada com um computador para registrar a intervalos determinados a total quantidade de filtrado coletado como uma fun?ao do tempo.[0032] The aqueous liquid mixture was then tested in the following manner. A test volume of at least about 500 ml of the mixture was added to a stainless steel pressure-resistant vessel. The outlet of the vessel was connected to the inlet of a sterile filter (steam sterilized) with a first section of silicone tubing. A second section of silicone tubing with a length of about 10 cm was attached to the outlet of the sterile filter housing. The filtered effluent from the sterile filter was collected in a beaker positioned on a balance to monitor the filtration rate. The balance was interfaced with a computer to record at set intervals the total amount of filtrate collected as a function of time.

[0033] Nos exemplos 1-7, urn filtro SARTOBRAN P 0.2 pm demembrana de acetato de celulose (incluindo um pre-filtro de 0,45 pm) foi usado. No Exemplo 8, um filtro SUPOR EKV 0.2 pm de membrana de polietersulfona foi usado. O Exemplos 1-3 usaram filtros de membrana em disco, enquanto os Exemplos 4-8 usaram filtros de membrana em cartucho. A area superficial de filtro de cada filtro e fomecida na Tabela 2.[0033] In Examples 1-7, a SARTOBRAN P 0.2 μm cellulose acetate membrane filter (including a 0.45 μm pre-filter) was used. In Example 8, a SUPOR EKV 0.2 μm polyethersulfone membrane filter was used. Examples 1-3 used disc membrane filters, while Examples 4-8 used cartridge membrane filters. The filter surface area of each filter is given in Table 2.

[0034] Para cada um dos Exemplos 1-8, o volume de teste da misturaliquida aquosa foi filtrado a pressao constante. No Exemplo 1, a mistura liquida aquosa entrando no filtro esteril teve uma pressao aplicada de cerca de 10 kPa (100 mbar) manometrica (i.e., cerca de 110 kPa (1,1 bar) absoluto), baseado na altura da coluna de fluido alimentando o filtro esteril do vaso de a?o inoxidavel. Nos Exemplos 2-8, ar comprimido limpo foi usado para fomecer a pressao da mistura liquida aquosa entrando no filtro esteril, cuja pressao variou de 15 kPa a 30 kPa (150 mbar a 300 mbar), como indicado na Tabela 2. Nos Exemplos 1-4, a filtra?ao com contrapressao nao foi realizada (i.e., o tubo de saida do filtro esteril estava aberto a atmosfera enquanto o filtrado fluia para o bequer coletor); assim, o diferencial de pressao conduzindo a filtra?ao foi essencialmente a pressao da mistura liquida aquosa entrando no filtro esteril. Para os Exemplos 5-8, a contrapressao foi aplicada ao filtrado anexando-se e apertando uma bra?adeira ao tubo de saida do filtro esteril. O diferencial de pressao para os Exemplos 5-8 (indicado na Tabela 2) foi estimado baseado na vazao de filtra?ao media medida durante a filtra?ao e as caracteristicas da vazao de queda de pressao conhecidas dos filtros comerciais usados.[0034] For each of Examples 1-8, the test volume of the aqueous liquid mixture was filtered at constant pressure. In Example 1, the aqueous liquid mixture entering the sterile filter had an applied pressure of about 10 kPa (100 mbar) gauge (i.e., about 110 kPa (1.1 bar) absolute), based on the height of the fluid column feeding the sterile filter from the stainless steel vessel. In Examples 2-8, clean compressed air was used to pressure the aqueous liquid mixture entering the sterile filter, which pressure ranged from 15 kPa to 30 kPa (150 mbar to 300 mbar), as indicated in Table 2. In Examples 1-4, backpressure filtration was not performed (i.e., the sterile filter outlet tube was open to the atmosphere while the filtrate flowed to the collection beaker); thus, the pressure differential driving the filtration was essentially the pressure of the aqueous liquid mixture entering the sterile filter. For Examples 5-8, backpressure was applied to the filtrate by attaching and tightening a clamp to the sterile filter outlet tube. The pressure differential for Examples 5-8 (shown in Table 2) was estimated based on the average filtration flow rate measured during the filtration and the known pressure drop flow characteristics of the commercial filters used.

[0035] Geralmente, em cada exemplo, a mistura foi filtradaimediatamente apos o volume teste da mistura liquida aquosa ser preparado. Contudo, no Exemplo 5, a mistura foi filtrada apos um atraso de oito horaspara examinar qualquer efeito potencial de estocagem do metodo descrito.[0035] Generally, in each example, the mixture was filtered immediately after the test volume of the aqueous liquid mixture was prepared. However, in Example 5, the mixture was filtered after an eight hour delay to examine any potential storage effects of the described method.

[0036] A Tabela 2 resume os parametros de teste para cada um dosExemplos 1-8.Tabela 2 - Parametros do Teste de Filtragao para os Exemplos 1-8 [0036] Table 2 summarizes the test parameters for each of Examples 1-8. Table 2 - Filtration Test Parameters for Examples 1-8

[0037] Os resultados dos testes de filtrapao sao resumidos na Tabela 3.Na Tabela 3, a “quantidade de filtrado” representa a massa de filtrado (i.e., incluindo a agua e qualquer vWF recuperado) obtida durante o teste individual. Para os Exemplos 1-4, o teste de filtrapao foi realizado ate que o filtro ficasse entupido e quantidades substanciais de filtrado nao pudessem mais ser obtidas. Para os Exemplos 5-8, o teste de filtra?ao foi realizado ate que varias centenas de gramas de filtrado fossem obtidas, e o teste foi terminado enquanto o filtro estava desentupido e ainda capaz de outra filtra?ao. A entrada “capacidade do filtro” na Tabela 3 representa a quantidade de filtrado normalizada por area unitaria de superficie de filtro. O “>” para os Exemplos 5-8 indica que a capacidade do filtro e uma estimativa mais baixa do que a capacidade de fato, na medida em que o filtro nao ficou entupido durante o teste. A entrada de “vazao media” na Tabela 3 representa a quantidade de filtrado calculada ao longo do curso do teste e normalizada por area unitaria de superficie de filtro.Tabela 3 - Resultados das Filtrates para os Exemplos 1-8 [0037] The results of the filtration tests are summarized in Table 3. In Table 3, the “quantity of filtrate” represents the mass of filtrate (i.e., including water and any recovered vWF) obtained during the individual test. For Examples 1-4, the filtration test was run until the filter became clogged and substantial amounts of filtrate could no longer be obtained. For Examples 5-8, the filtration test was run until several hundred grams of filtrate were obtained, and the test was terminated while the filter was unclogged and still capable of further filtration. The “filter capacity” entry in Table 3 represents the amount of filtrate normalized per unit area of filter surface. The “>” for Examples 5-8 indicates that the filter capacity is a lower estimate than the actual capacity, since the filter did not become clogged during the test. The “average flow rate” entry in Table 3 represents the amount of filtrate averaged over the course of the test and normalized per unit area of filter surface.Table 3 - Filtration Results for Examples 1-8

[0038] Da Tabela 3, e aparente que a filtra?ao a contrapressao deproteinas significantemente aumenta a capacidade de filtra?ao e vazao. Aspressoes uniformes moderadamente baixas aplicadas que vao desde 10 kPa a 30 kPa (100 mbar a 300 mbar) para o vWF e os flltros utilizados (onde os cartuchos de flltro utilizados podem resistir a pressoes maximas que vao desde cerca de 200 kPa (2 bar) a cerca de 550 kPa (5,5 bar)), os Exemplos 1-4 indicam que a capacidade do filtro e baixa e rapidamente decresce com aumento da pressao. Em contraste, quando uma contrapressao e aplicada ao filtrado para reduzir o diferencial de pressao, os Exemplos 5-8 exibem capacidades de filtra?ao e taxas de fluxo substancialmente maiores. Este comportamento observado e inesperado, na medida em que os filtros sao geralmente caracterizados por uma proporcionalidade direta entre a vazao de filtra?ao e diferencial de pressao: [0038] From Table 3, it is apparent that backpressure filtration of proteins significantly increases filtration capacity and flow rates. At moderately low uniform pressures applied ranging from 10 kPa to 30 kPa (100 mbar to 300 mbar) to the vWF and filters used (where the filter cartridges used can withstand maximum pressures ranging from about 200 kPa (2 bar) to about 550 kPa (5.5 bar)), Examples 1-4 indicate that the filter capacity is low and rapidly decreases with increasing pressure. In contrast, when a backpressure is applied to the filtrate to reduce the pressure differential, Examples 5-8 exhibit substantially higher filtration capacities and flow rates. This observed behavior is unexpected, as filters are generally characterized by a direct proportionality between filtration flow rate and pressure differential:

[0039] Na Equa?ao (1), Q e a vazao de filtra?ao (volume oumassa por tempo unitario), A e a area superficial do filtro, Ap e o diferencial de pressao atraves do filtro, pea viscosidade do fluido sendo filtrado, e R e uma resistencia empirica do meio de filtro. A similaridade entre os resultados dos Exemplos 5-8 ainda indica que os beneficios da filtra?ao a contrapressao podem ser obtidos usando-se meios de filtro e/ou tamanhos de filtros variaveis.[0039] In Equation (1), Q is the filtration flow rate (volume or mass per unit time), A is the surface area of the filter, Ap is the pressure differential across the filter, p is the viscosity of the fluid being filtered, and R is an empirical resistance of the filter media. The similarity between the results of Examples 5-8 further indicates that the benefits of backpressure filtration can be obtained by using varying filter media and/or filter sizes.

[0040] Os dados dependentes do tempo (i.e., filtrado coletadocomo uma funsao do tempo) para os Exemplos 4 e 6 sao mostrados na Figura 2. Da Figura 2, e aparente que o diferencial de pressao mais alto para o Exemplo 4 resulta em uma taxa de filtra?ao relativamente alta ao longo dos primeiros 10-15 minutos do teste de filtra?ao. Contudo, o diferencial de pressao mais alto no Exemplo 4 tambem resulta em um entupimento mais rapido do filtro. Em contraste, o uso da contrapressao no Exemplo 6 abaixa o diferencial de pressao e a taxa inicial de filtra?ao. Especificamente, apos o periodo transiente inicial de cerca de 10 minutos a cerca de 15 minutos, o baixo diferencial de pressao cria um ambiente de flltra?ao de baixo cisalhamento que previne o filtro de ficar entupido pelo vWF, desse modo aumentando a capacidade do filtro e a vazao de filtra?ao ao longo da vida do filtro, e ainda resultando em uma vazao de filtra?ao que e substancialmente constante.[0040] The time-dependent data (i.e., filtrate collected as a function of time) for Examples 4 and 6 are shown in Figure 2. From Figure 2, it is apparent that the higher pressure differential for Example 4 results in a relatively high filtration rate over the first 10-15 minutes of the filtration test. However, the higher pressure differential in Example 4 also results in more rapid filter clogging. In contrast, the use of backpressure in Example 6 lowers the pressure differential and the initial filtration rate. Specifically, after the initial transient period of about 10 minutes to about 15 minutes, the low pressure differential creates a low-shear filtration environment that prevents the filter from becoming clogged by VWF, thereby increasing filter capacity and filtration throughput over the life of the filter, and still resulting in a filtration throughput that is substantially constant.

[0041] Como resumido na Tabela 4, o filtrado de cada um dos Exemplos1-3 e 5 pode tambem ser analisado para medir o nivel de vWF recombinante no filtrado para determinar se o processo de filtrapao adversamente afetou a concentrapao do vWF recombinante presente na mistura liquida aquosa inicial. Na ausencia de contrapressao, os Exemplos 1-3 indicam que diferenciais de pressao uniformes moderadamente baixos podem danificar ou destruir proteinas durante a filtrapao, com ate cerca de metade do vWF recombinante sendo perdido durante a filtrapao a diferenciais de pressao de 20 kPa (200 mbar) e 30 kPa (300 mbar). Essa perda na filtra?ao e evitada pelo uso de contrapressao, como mostrado no Exemplo 5, onde nenhuma redu?ao mensuravel na concentra?ao de rVWF:Rco ocorreu e apenas um decrescimo de 4% no conteudo de proteina medido (BCA) ocorreu. Assim, substancialmente toda a proteina que esta inicialmente presente na mistura liquida aquosa pode ser recuperada no filtrado.Tabela 4 - Recupera^ao de vWF no Filtrado [0041] As summarized in Table 4, the filtrate from each of Examples 1-3 and 5 may also be analyzed to measure the level of recombinant vWF in the filtrate to determine whether the filtration process adversely affected the concentration of recombinant vWF present in the initial aqueous liquid mixture. In the absence of backpressure, Examples 1-3 indicate that moderately low uniform pressure differentials can damage or destroy proteins during filtration, with up to about half of the recombinant vWF being lost during filtration at pressure differentials of 20 kPa (200 mbar) and 30 kPa (300 mbar). This filtration loss is avoided by the use of back pressure, as shown in Example 5, where no measurable reduction in the rVWF:Rco concentration occurred and only a 4% decrease in the measured protein content (BCA) occurred. Thus, substantially all of the protein that is initially present in the aqueous liquid mixture can be recovered in the filtrate. Table 4 - Recovery of vWF in Filtrate

Examples 9-20

[0042] Solu?oes aquosas contendo o Fator VIII foram testadas emfiltros SARTOBRAN®, com um pre-filtro SARTOCLEAN, para determinar o efeito da contrapressao na eficacia da filtrapao, por exemplo, baseado na area superficial de filtro necessaria. Nos Exemplos 9-13, a filtra?ao com contrapressao nao foi realizada; a pressao inicial aplicada foi de 10 kPa (100 mbar) a 50 kPa (500 mbar). Nos Exemplos 14-16, o diferencial de pressao foi de 20 kPa (200 mbar), e nos Exemplos 17-20, o diferencial de pressao foi reduzido a menos de 15 kPa (150 mbar). A area superficial de cada filtro foi de 1,2 m2. A Tabela 5 contem a atividade do Fator VIII antes e depois da filtra?ao e rendimento para cada experimento.Tabela 5 - Recuperapao de FVIII no Filtrado [0042] Aqueous solutions containing Factor VIII were tested in SARTOBRAN® filters with a SARTOCLEAN prefilter to determine the effect of back pressure on filtration efficiency, i.e. based on the filter surface area required. In Examples 9-13, back pressure filtration was not performed; the initial pressure applied was 10 kPa (100 mbar) to 50 kPa (500 mbar). In Examples 14-16, the pressure differential was 20 kPa (200 mbar), and in Examples 17-20, the pressure differential was reduced to less than 15 kPa (150 mbar). The surface area of each filter was 1.2 m2. Table 5 contains the Factor VIII activity before and after filtration and yield for each experiment.Table 5 - Recovery of FVIII in the Filtrate

[0043] Os dados precedentes demonstram que bem menos area defiltro e necessaria quando a filtrasao a contrapressao e empregada para a mesma quantidade de substantia ativa. A filtrado a contrapressao estabiliza a filtrado, e quando a pressao diferencial e otimizada, o rendimento de atividade medio e melhorado.[0043] The foregoing data demonstrate that much less filter area is required when backpressure filtration is employed for the same amount of active substance. Backpressure filtration stabilizes the filtrate, and when the differential pressure is optimized, the average activity yield is improved.

Examples 21-25

[0044] Solu?oes contendo o Fator XIII foram testadas em um filtroPALL® POSIDYNE® N66 de nylon para determinar o efeito da contrapressao na eficacia da filtra?ao, por exemplo, baseado na atividade recuperada e concentra?ao de proteina do Fator XIII no filtrado. A area de filtro foi de 0,82 m2.Nos Exemplos 21-23, a filtra?ao com contrapressao nao foi realizada; a pressao aplicada para estes exemplos foi de 60 kPa (600 mbar). Nos Exemplos 24-26, o diferencial de pressao foi de cerca de 10 kPa (100 mbar). A Tabela 6 contem a concentra?ao e atividade da proteina antes e depois da filtra?ao e rendimento para cada experimento.Tabela 6 - Recuperapao de FXIII no Filtrado [0044] Solutions containing Factor XIII were tested on a PALL® POSIDYNE® N66 nylon filter to determine the effect of back pressure on filtration efficiency, i.e., based on recovered Factor XIII activity and protein concentration in the filtrate. The filter area was 0.82 m2. In Examples 21-23, back pressure filtration was not performed; the applied pressure for these examples was 60 kPa (600 mbar). In Examples 24-26, the pressure differential was approximately 10 kPa (100 mbar). Table 6 contains the protein concentration and activity before and after filtration and throughput for each experiment. Table 6 - Recovery of FXIII in Filtrate

[0045] Como mostrado na Tabela 6, o rendimento da atividade erendimento da protelna sao substancialmente melhorados com o uso de contrapressao durante a filtra?ao.[0045] As shown in Table 6, activity yield and protein yield are substantially improved with the use of back pressure during filtration.

[0046] A descrito precedente e dada para clareza de entendimentoapenas, e nenhuma limita?ao desnecessaria deveria ser entendida dal, como modifica5oes dentro do escopo da invensao podem ser aparentes aqueles com habilidade ordinaria na tecnica.[0046] The foregoing description is given for clarity of understanding only, and no unnecessary limitation should be understood therefrom, as modifications within the scope of the invention may be apparent to those of ordinary skill in the art.

[0047] Por toda a especifica?ao, onde as composi?oes sao descritascomo incluindo componentes ou materials, e contemplado que as composi5oes podem tambem consistir essencialmente de, ou consistir de, qualquer combina?ao dos componentes ou materials recitados, a menos que descrito do contrario.[0047] Throughout the specification, where compositions are described as including components or materials, it is contemplated that the compositions may also consist essentially of, or consist of, any combination of the recited components or materials, unless otherwise described.

[0048] A pratica de um metodo descrito aqui, e passos individualsdisso, podem ser realizados manualmente e/ou com o auxllio de equipamento eletronico. Embora processos tenham sido descritos com referenda a modalidades particulares, uma pessoa com habilidade ordinaria na tecnica prontamente apreciara que outras formas de realizar os atos associados com os metodos podem ser usados. Por exemplo, a ordem de varios dos passos pode ser mudada sem se afastar do escopo ou esplrito do metodo, a menos que descrito do contrario. Em adi?ao, alguns dos passos individuals podem ser combinados, omitidos, ou ainda subdivididos em passos adicionais.[0048] The practice of a method described herein, and individual steps thereof, may be performed manually and/or with the aid of electronic equipment. Although processes have been described with reference to particular embodiments, one of ordinary skill in the art will readily appreciate that other ways of performing the acts associated with the methods may be used. For example, the order of several of the steps may be changed without departing from the scope or spirit of the method, unless otherwise described. In addition, some of the individual steps may be combined, omitted, or further subdivided into additional steps.

Claims

1. A method for filtrating a liquid protein mixture, the method comprising: providing a liquid mixture at a first pressure (Pi), the liquid mixture comprising a carrier liquid, a protein at a first concentration (Ci) relative to the carrier liquid, and a dispersed contaminant; passing the liquid mixture through a filter to form a filtrate at a second pressure (P2), the filtrate comprising the carrier liquid and the protein at a second concentration (C2) relative to the carrier liquid, wherein the filter is sized to remove at least a portion of the dispersed contaminant from the liquid mixture; and, apply a back pressure to the filtrate to ensure that a pressure differential between the first and second pressures (P1-P2) is not more than 9 kPa (90 mbar), where the second pressure P2 is less than the first pressure P1 above ambient pressure, where at least 95% of the protein present in the liquid mixture is recovered in the filtrate, and where the protein is a protein of the blood coagulation cascade.

2. Method according to claim 1, characterized in that at least 99% of the protein present in the liquid mixture is recovered in the filtrate.

3. Method according to claim 1, characterized in that the back pressure is sufficient to produce an average filtrate flow rate of at least 300 g/min.m2 of filter surface area.

4. Method according to claim 1, characterized in that the first pressure (Pi) is at least 20 kPa (200 mbar) gauge.

5. Method according to claim 1, characterized in that the carrier liquid comprises water.

6. Method according to claim 1, characterized in that the protein is selected from the group consisting of von Willebrand factor (vWF), Factor VIII, Factor XIII, and mixtures thereof.

7. Method according to claim 1, characterized in that the dispersed contaminant comprises a microorganism.

8. Method according to claim 1, characterized in that the filtrate is substantially free of dispersed contaminant.

9. Method according to claim 1, characterized in that the filter comprises a porous membrane, the porous membrane comprising pores sized from 0.1 μm to 0.5 μm.

10. Method according to claim 9, characterized in that the pores are sized from 0.2 pm to 0.22 pm.

11. A method of filtering a liquid protein mixture, the method comprising: providing a liquid mixture at a first pressure (Pi), the liquid mixture comprising a carrier liquid, a protein at a first concentration (Ci) relative to the carrier liquid, and a dispersed contaminant; passing the liquid mixture through a filter to form a filtrate at a second pressure (P2), the filtrate comprising a carrier liquid and the protein at a second concentration (C2) relative to the carrier liquid, wherein the filter is sized to remove at least a portion of the dispersed contaminant from the liquid mixture; and, apply a back pressure to the filtrate sufficient to produce an average filtrate flow rate of at least 300 g/min.m2 of filter surface area and/or ensure that a differential pressure between the first and second pressures (PI - P2) is greater than 0 kPa (0 mbar) and not more than 9 kPa (90 mbar), wherein the second pressure P2 is less than the first pressure P2 above ambient pressure, wherein at least 95% of the protein present in the liquid mixture is recovered in the filtrate, and wherein the protein is a protein of the blood coagulation cascade.

12. Method according to claim 11, characterized in that at least 99% of the protein present in the liquid mixture is recovered in the filtrate.

13. Method according to claim 11, characterized in that the carrier liquid comprises water.

14. The method of claim 11, wherein the protein is selected from the group consisting of von Willebrand factor (vWF), Factor VIII, Factor XIII, and mixtures thereof.

15. Method according to claim 11, characterized in that the dispersed contaminant comprises a microorganism.

16. The method of claim 11, wherein the filtrate is substantially free of dispersed contaminant.

17. The method of claim 11, wherein the filter comprises a porous membrane, the porous membrane comprising pores sized from 0.1 μm to 0.5 μm.

18. Method according to claim 17, characterized in that the pores are sized from 0.2 pm to 0.22 pm.

19. A method of filtering an aqueous protein mixture, the method comprising: providing an aqueous mixture at a first pressure (Pi), the aqueous mixture comprising water and von Willebrand factor (vWF) at a first concentration (Ci) relative to water; passing the aqueous mixture through a porous membrane filter to form a filtrate at a second pressure (P2), the filtrate comprising water and vWF at a second concentration (C2) relative to water, wherein the porous membrane filter comprises pores sized from 0.1 μm to 0.5 μm; and, apply a back pressure to the filtrate to ensure that a pressure differential between the first and second pressures (P1-P2) is not more than 9 kPa (90 mbar), where the second pressure P2 is less than the first pressure Pie above ambient pressure, and where at least 95% of the vWF present in the liquid mixture is recovered in the filtrate.

20. Method according to claim 19, characterized in that at least 99% of the vWF present in the liquid mixture is recovered in the filtrate.

21. Method according to claim 19, characterized in that the pores are sized to 0.2 pm or 0.22 pm.

22. The method of claim 19, wherein the aqueous mixture further comprises a population of microorganisms, at least a portion of the population of which is removed from the aqueous mixture by the porous membrane filter.