BRPI0811799B1

BRPI0811799B1 - reagente para análise de leucócitos imaturos, kit de reagentes para análise de leucócitos imaturos e método para classificar leucócitos

Info

Publication number: BRPI0811799B1
Application number: BRPI0811799-3A
Authority: BR
Inventors: Yukiko Kataoka; Tomohiro Tsuji; Shinichiro Oguni; Ayumu Yoshida; Masaki Abe
Original assignee: Sysmex Corporation
Priority date: 2007-06-25
Filing date: 2008-06-25
Publication date: 2021-02-23
Also published as: PL2166353T3; EP2166353A1; BRPI0811799B8; EP2166353B1; RU2010102038A; JPWO2009001868A1; JP4981907B2; CN101680879B; KR101331332B1; WO2009001868A1; RU2435164C2; MX2009012997A; BRPI0811799A2; US20100184061A1; HUE040270T2; BRPI0811799C1; ES2684695T3; US8455209B2; EP2166353A4; CN101680879A

Abstract

reagente para análise de leucócitos imaturos, kit de reagentes para análise de leucócitos imaturos e método para classificar leucócitos. a presente invenção provê um reagente para análise de leucócitos imaturos compreendendo: um tensoativo que possa danificar as membranas celulares de eritrócitos e leucócitos maduros, um agente solubilizante que possa encolher as células sanguíneas danificadas, e um corante para manchar ácido nucléico, sendo que o reagente tem uma pressão osmótica não mais baixa que 10 mosm/kg e mais baixa que 150 mosm/kg.

Description

Campo da invenção

[001] A presente invenção refere-se a um reagente e kit de reagentes para classificar e contar leucócitos em uma amostra biológica.

Antecedentes da invenção

[002] Células sanguíneas são produzidas na medula óssea, diferenciadas células maduras e de células imaturas e migradas ao sangue periférico. No indivíduo saudável, leucócitos imaturos não aparecem no sangue periférico. Entretanto, em alguns casos, leucócitos imaturos aparecem no sangue periférico de pacientes sofrendo de leucemia, matástase de câncer na medula óssea, mieloma múltiplo, infecção severa ou assemelhados. Daí é muito importante classificar e medir leucócitos maduros e imaturos em amostras biológicas de maneira a diagnosticar estas doenças. Um reagente divulgado no pedido de patente japonês não examinado noHei 10(1998)-206423 é conhecido como um reagente para medir leucócitos imaturos. Este reagente é misturado com uma amostra biológica para formar uma amostra de medição, a amostra de medição obtida é introduzida em um citômetro de fluxo e leucócitos maduros e imaturos são classificados e respectivamente contados com base na informação ótica obtida aplicando luz contra um comprimento de onda específico. Ademais, leucócitos imaturos poderão ser adicionalmente classificados em mieloblastos, granulócitos imaturos e assemelhados e poderão ser medidos respectivamente.

Sumário da invenção Problemas a serem solucionados pela invenção

[003] Na análise de células usando o reagente convencional, quando as células sanguíneas tiverem que ser medidas com o citômetro de fluxo, por exemplo, a região de sinal dos detritos de eritrócitos lisados (fantasmas de eritrócitos) e a região de sinal de mieloblastos parcialmente se sobrepõem, em alguns casos. Nas análises usando tal reagente, mesmo quando uma amostra de sangue não contendo nenhum mieloblasto é analisada, o sinal de detritos de eritrócitos é incorretamente reconhecido como o sinal de mieloblastos de maneira tal que não era possível obter uma análise precisa das células sanguíneas. Por exemplo, o sangue periférico dos pacientes sofrendo das doenças específicas tais como mieloma múltiplo, câncer do duto biliar, peritonite, diabetes, nefrite gromerular, pleurisia ou assemelhados não contém mieloblastos. Entretanto, quando células sanguíneas são analisadas no sangue periférico tomado de tais pacientes usando o reagente convencional, houve alguns casos onde um sinal detectado na região onde os mieloblastos são detectados no diagrama de dispersão. A razão para tanto é considerada como sendo que os eritrócitos na amostra de tais pacientes específicos não lisados corretamente, diferentemente dos eritrócitos na amostra do indivíduo saudável ou pacientes com doenças diferentes daquelas descritas acima. Existe uma possibilidade de diagnóstico e tratamento falsos se a quantidade de mieloblastos detectada no sangue periférico for mais alta que a sua quantidade efetiva. Conforme usado aqui, “fantasma de eritrócito” significa eritrócitos que perderam sua hemoglobina como resultado da reação da amostra de sangue e um reagente para análise de sangue, mas não encolheu suficientemente.

[004] Daí, é um propósito da presente invenção prover um reagente que torne possível classificar e contar leucócitos imaturos mais precisamente mesmo quando amostras de sangue dos pacientes com tais doenças específicas conforme descritas acima forem analisadas.

Meios para resolver os problemas

[005] Os presentes inventores realizaram estudos intensivos para resolver o problema acima e descobriram que os problemas acima poderão ser resolvidos reduzindo a pressão osmótica do reagente para análise de leucócitos imaturos a um nível mais baixo que aquele que tem sido usado convencionalmente.

[006] Foi considerado que o reagente convencional para análise de leucócitos imaturos é adequado para ter uma pressão osmótica semelhante àquela de leucócitos imaturos e leucócitos maduros de maneira a evitar a lise dessas células sanguíneas na ocasião da medição.

[007] Entretanto, descobriu-se agora que a precisão da análise das amostras biológicas dos pacientes sofrendo das doenças específicas tais como mieloma múltiplo, câncer do duto biliar, peritonite, diabetes, nefrite gromerular, pleurisia ou assemelhados é melhorada quando um reagente de análise tendo pressão osmótica surpreendentemente baixa comparada com o conhecimento comum é usado. Por exemplo, usando o reagente de análise tendo baixa pressão osmótica, mieloblastos e eritrócitos lisados poderiam ser mais claramente discriminados. Ademais, foi agora descoberto, surpreendentemente, que o reagente de análise da presente invenção torna possível distinguir leucócitos imaturos de leucócitos maduros tão claramente quanto leucócitos imaturos de leucócitos maduros tão claramente quanto o reagente convencional tendo altas pressões osmóticas, mesmo para amostras biológicas de pacientes sofrendo de doenças outras que não as doenças específicas acima. Por exemplo, descobriu- se que fantasmas de eritrócitos poderão ser evitados de aparecer usando o reagente de análise da presente invenção.

[008] Dependendo dos espécimes, existem alguns casos onde o sinal de mieloblastos e o sinal de basófilos se sobrepõem mesmo quando um reagente de baixa pressão osmótica é usado. Daí, existia uma possibilidade de que os mieloblastos fossem identificados no sangue periférico do indivíduo saudável, apesar de que mieloblastos não existem no mesmo para conduzir a um resultado falso. Este problema adicional de os sinais dos mieloblastos e dos basófilos se sobreporem poderia ser reduzido reduzindo as concentrações de um tensoativo e um agente solubilizante no reagente para análise de leucócitos imaturos até um nível mais baixo que aquele que tem sido considerado convencionalmente. Consequentemente, torna-se possível distinguir mais claramente basófilos de mieloblastos mesmo em amostras de sangue altas quantidades de basófilos usando o reagente da presente invenção. Ademais, a redução das concentrações de um tensoativo e um agente solubilizante permite a classificação de leucócitos maduros em pelo menos três espécies sob condição de baixa pressão osmótica.

[009] Um aspecto da presente invenção é um reagente para análise de leucócitos imaturos compreendendo:

[010] um tensoativo que possa danificar membranas celulares de eritrócitos e leucócitos maduros,

[011] um agente solubilizante que possa encolher as células sanguíneas danificadas e

[012] um corante para manchar o ácido nucléico, sendo que o reagente tem uma pressão osmótica de não mais baixa que 10 mOsm/kg e mais baixa que 150 mOsm/kg.

[013] Um outro aspecto da presente invenção é um kit para a análise de leucócitos imaturos compreendendo:

[014] um primeiro reagente que compreende um tensoativo que possa danificar membranas celulares de eritrócitos e leucócitos maduros e um agente solubilizante que possa encolher as células sanguíneas danificadas e que tenham uma pressão osmótica não mais baixa que 10 mOsm/kg e mais baixa que 150 mOsm/kg, e

[015] um segundo reagente que compreenda um corante para manchar ácido nucléico.

[016] Um aspecto adicional da presente invenção é um método para classificar leucócitos imaturos compreendendo as etapas de:

[017] misturar uma amostra biológica possivelmente contendo leucócitos imaturos com um reagente para análise de leucócitos imaturos compreendendo um tensoativo que possa danificar membranas celulares de eritrócitos e leucócitos maduros, um agente solubilizante que possa encolher as células sanguíneas danificadas e um corante para manchar ácido nucléico, e tendo uma pressão osmótica não mais baixa que 10 mOsm/kg e mais baixa que 150 mOsm/kg, e

[018] medir pelo menos uma luz dispersa e pelo menos uma fluorescência dos leucócitos imaturos tratados na etapa anterior para classificar leucócitos imaturos baseado nas intensidades da luz dispersa e na fluorescência.

Efeito da invenção

[019] o reagente e kit de reagentes para análise de leucócitos imaturos da presente invenção permite uma classificação e contagem mais precisas de leucócitos imaturos e leucócitos maduros comparativamente com o reagente convencional, mesmo quando amostras biológicas de pacientes sofrendo de doenças específicas tais como mieloma múltiplo, câncer do duto biliar, peritonite, diabetes, nefrite gromerular, pleurisia ou assemelhados são analisados.

Breve descrição dos desenhos

[020] A seguir, a invenção será descrita com relação aos desenhos em anexo, nos quais:

[021] A figura 1 é uma representação esquemática mostrando um exemplo de um citômetro de fluxo que pode ser usado para análises de leucócitos imaturos usando o reagente ou kit de reagentes da presente invenção;

[022] A figura 2 representa um diagrama de dispersãoobtido no exemplo 1;

[023] A figura; 3 representa um diagrama de dispersãoobtido no exemplo 2

[024]A figura; 4 representa um diagrama de dispersão obtido no exemplo 3

[025]A figura; 5 representa um diagrama de dispersão obtido no exemplo 4

[026]A figura; 6 representa um diagrama de dispersão obtido no exemplo 5

[027]A figura; 7 representa um diagrama de dispersão obtido no exemplo 6

[028]A figura ; 8 representa um diagrama de dispersão obtido no exemplo 7

[029] A figura 9 representa um diagrama de dispersãoobtido no exemplo 8;

[030] A figura 10 representa um diagrama de dispersãoobtido no exemplo 9; e

[031] A figura 11 representa um diagrama de dispersãoobtido no exemplo 10.

Descrição dos numerais de referência

[032] 6 — Bocal

[033] 21 — Fonte de luz

[034] 22 Lente do colimador

[035] 23 Célula de fluxo

[036] 24 Lente condensadora

[037] 25 Placa ponteada

[038] 26 Detector de luz frontalmente dispersa

[039] 27 Lente condensadora

[040] 28 Espelho dicróico

[041] 28’ Filtro

[042] 29 Detector de luz lateralmente dispersa

[043] 30 Placa ponteada

[044] 31 Detector de fluorescência lateral

[045] 32, 33 e 34 Amplificadores

[046] 35 Parte analisadora

Melhor maneira de realizar a invenção

[047] O reagente para análise de leucócitos imaturos da presente concretização (daqui por diante referido como “o reagente”) torna possível classificar leucócitos contidos em uma amostra biológica em leucócitos maduros e imaturos e contá-los respectivamente. Ele também torna possível classificar os leucócitos maduros em três espécies tais como linfócitos, monócitos, granulócitos, basófilos e assemelhados e para respectivamente contá-los. Ademais, o presente reagente também torna possível ainda classificar leucócitos imaturos em granulócitos e mieloblastos e, respectivamente, contá-los precisamente.

[048] O termo “leucócitos imaturos” conforme usado aqui refere-se a leucócitos imaturos que existem usualmente na medula óssea e não ocorrem no sangue periférico do indivíduo saudável. Leucócitos imaturos incluem, por exemplo, mieloblastos, promielócitos, mielócitos, metamielócitos, e assemelhados. Em alguns casos, promielócitos, mielócitos e metamielócitos são coletivamente chamados de “granulócitos imaturos”. Mieloblastos incluem células precursoras hematopoiéticas leucocíticas tais como células tronco da série dos mielóides (CFU-GEMN), células formadoras de colônias de neutrófilos-macrófagos (CFU-GM), células formadoras de colônias de eosinófilos (CFY-EOS) e assemelhadas.

[049] A amostra biológica a ser analisada com o reagente da presente concretização não está limitada, contanto que ela compreenda leucócitos e inclua, por exemplo, sangue, uréia, aspirado de medula óssea, uma amostra tomada em aférese e assemelhados.

[050] O reagente da presente concretização compreende o tensoativo que irá danificar membranas celulares de eritrócitos e leucócitos maduros, o agente solubilizante que poderá encolher as células sanguíneas e o corante para manchar ácido nucléico e tem uma pressão osmótica não mais baixa que 10 mOsm/kg e mais baixa que 150 mOsm/kg.

[051] Misturando a amostra biológica e o reagente, membranas celulares de células sanguíneas de células sanguíneas contidas na amostra são danificadas pela ação do tensoativo e o agente solubilizante. O tensoativo tende a danificar as membranas celulares de eritrócitos e leucócitos maduros, enquanto que membros celulares de leucócitos imaturos são resistentes a serem danificados. As células sanguíneas danificadas tais como eritrócitos e leucócitos maduros encolhem pela ação do agente solubilizante. Por outro lado, uma vez que membranas celulares de leucócitos imaturos são difíceis de serem danificadas, estas células são menos encolhidas pelo agente solubilizante que eritrócitos e leucócitos maduros.

[052] Dentre as células sanguíneas danificadas, os núcleos de leucócitos tendem a ser intensamente manchados pela ação do corante para manchar ácido nucléico. Consequentemente, leucócitos imaturos, leucócitos maduros e eritrócitos poderão ser respectivamente discriminados.

[053] A pressão osmótica do reagente não é mais baixa que 10 mOsm/kg e é mais baixa que 150 mOPsm/kg, preferivelmente de 10 a 10 mOsm/kg, e mais preferivelmente 10 a 60 mOsm/kg. Tal pressão osmótica pode ser obtida misturando os componentes descritos a seguir, ou ajustando adequadamente a concentração do agente tamponador. Entretanto, também é possível ajustar a pressão adicionando sacarídeos, amino ácidos, cloreto de sódio e assemelhados, caso desejado.

[054] Os sacarídeos poderão compreender monossacarídeos tais como glicose, frutose e assemelhados; polissacarídeos, tais como arabinose e assemelhados; e álcoois de açúcares, tais como xilitol, sorbitol, manitol, ribitol e assemelhados, sem limitação a estes.

[055] Quando xilitol for usado, por exemplo, ele deverá ser usado em uma quantidade de 0 a 10 g/L, mais preferivelmente 4 a 8 g/L no reagente.

[056] Os amino ácidos poderão incluir valina, prolina, glicina, alanina, e assemelhados. É preferido usar um ou ambos dentre glicina e alanina.

[057] Quando a glicina for usada, por exemplo, ela poderá ser usada em uma quantidade de 0 a 10 g/L, mais preferivelmente de 2 a 6 g/L no reagente.

[058] O tensoativo que poderá danificar membranas celulares ou eritrócitos e leucócitos maduros é preferivelmente um tensoativo não iônico e é mais preferivelmente um tensoativo não iônico de polioxietileno. O tensoativo não iônico de polioxietileno é mais preferivelmente um tendo a seguinte fórmula (I): R1R2-(CH2CH2O)N-H (I) (onde R1representa um grupo alquila, alquenila ou alquinila C9-25; R2 representa -O-, -COO- ou

e n é um número inteiro de 10 a 40).

[059] O tensoativo representado pela fórmula (I) acima poderá incluir polioxietileno(15)oleil éter, polioxietileno(29) oleil éter, polioxietileno(20) estearil éter, polioxietileno(15)cetil éter, polioxietileno(20)cetil éter, e assemelhados. O tensoativo poderá ser de uma ou mais espécies.

[060] A concentração do tensoativo no reagente poderá ser selecionada apropriadamente de acordo com o tipo do tensoativo. Quando o tensoativo for o polioxietileno oleil éter, a concentração deste no reagente será preferivelmente de 500 a 15.000 ppm, mais preferivelmente de 750 a 10.000 ppm, e ainda mais preferivelmente de 1.000 a 2.500 ppm.

[061] Em uma concretização mais preferida da invenção, a concentração do tensoativo é ajustada em uma faixa relativamente baixa, tal como de 1.000 a 10.000 ppm, por exemplo. Em tal faixa de concentração, os danos às membranas celulares de um dos leucócitos maduros, basófilos é menor que no caso onde o reagente tendo concentração relativamente alta do tensoativo é usado, podendo, portanto, ser evitado que os basófilos sejam danificados e componentes celulares dos basófilos sejam liberados para fora das células. Consequentemente, basófilos são facilmente manchados pela ação do corante para manchar ácido nucléico. Por outro lado, membranas celulares de um dos leucócitos imaturos, mieloblastos, não são danificadas conforme acima sendo, portanto, difíceis de serem manchadas. Consequentemente, basófilos e mieloblastos são mais eficientemente discriminados.

[062] Quando tensoativos múltiplos são usados, a razão de mistura desses tensoativos poderá ser apropriadamente selecionada de acordo com um valor de hidroxila dos tensoativos. Por exemplo, quando polioxietileno(15)oleil éter tendo o valor de hidroxila de 64,8 e polioxietileno(20)oleil éter forem usados, a razão de mistura será preferivelmente de 1:9.

[063] O agente solubilizante acima poderá incluir, por exemplo, derivados de sarcosina, derivados de ácido cólico, metilglucanamidas e assemelhados. Um ou mais selecionados dentre estes poderão ser usados.

[064] Derivados de sarcosina incluem os derivados de sarcosina tendo a seguinte fórmula estrutural e sais destes. Especificamente, N-lauroilsarcosinato de sódio, lauroil metil β-alanina sódica, lauroilsarcosina e assemelhados são mencionados. Derivados de ácido cólico incluem derivados de ácido cólico tendo a seguinte fórmula estrutural e sais destes. Especificamente CHAPS (3-[(3-colamidopropil)dimetilamônio]-1-propanossulfonato), CHAPSO (3-[(3-colamidopropil)dimetilamônio]-2-hidroxi-1-propanossulfonato) e assemelhados são mencionados. MEGA8 (octanoil-N-metilglucanamida), MEGA9 (nonanoil-N-metilglucanamida), MEGA10 (decanoil-N-metilglucanamida) e assemelhados.

[065] Os derivados de sarcosina têm a seguinte fórmula estrutural:

onde R1 é um grupo alquila C10-22; e n é 1 a 5. Os derivados de ácido cólico têm a seguinte fórmula estrutural:

onde R1 é um átomo de hidrogênio ou um grupo hidróxi.

[066] As metilglucanamidas têm a seguinte fórmula estrutural:

onde n é de 5 a 7.

[067] A concentração do agente solubilizante no reagente poderá apropriadamente ser selecionada de acordo com o tipo de agente solubilizante sendo usado. Quando o derivado de sarcosina for usado como agente solubilizante, a concentração do agente solubilizante no reagente é preferivelmente de 50 a 3.000 ppm, mais preferivelmente de 100 a 4000 ppm. Quando o derivado de ácido cólico for usado, ela é preferivelmente de 50 a 10.000 ppm, mais preferivelmente de 50 a 1.300 ppm. Quando a metilglucanamida for usada, é preferivelmente de 500 a 8.000 ppm, mais preferivelmente de 500 a 1.100 ppm.

[068] Ademais, n-octil β-glicosideo, monocaprato de sacarose, N-formilmetilleucilalanina e assemelhados poderão ser usados como agente solubilizante. Quando estes forem usados, a concentração destes no reagente é preferivelmente de 5 a 50.000 ppm, mais preferivelmente de 5 a 6.600 ppm. Um ou mais agentes solubilizantes poderão ser usados isoladamente ou em combinação.

[069] Em uma concretização mais preferida da presente invenção, devido à concentração relativamente baixa do agente solubilizante, os danos à membrana celular de um dos leucócitos maduros, basófilos, é suprimido ao contrário do caso onde o reagente tendo uma concentração relativamente alta do agente solubilizante é usado, podendo, portanto, ser evitado que os basófilos sejam danificados e os componentes celulares dos basófilos sejam liberados para fora das células. Consequentemente, os basófilos são facilmente manchados pela ação do corante para manchar ácido nucléico semelhantemente a leucócitos maduros. Por outro lado, membranas celulares de um dos leucócitos imaturos, mieloblastos, não são danificados conforme acima sendo portanto difíceis de manchar. Consequentemente, basófilos e mieloblastos são mais facilmente discriminados.

[070] O corante acima para manchar ácido nucléico não está limitado contanto que ele seja capaz de manchar ácido nucléico, e é preferivelmente um corante fluorescente. Usando um tal corante, eritrócitos não tendo ácido nucleio quase não são manchados, enquanto que leucócitos tendo ácido nucléico são manchados intensamente. Com base na diferença de intensidade do manchamento, eritrócitos e leucócitos poderão ser discriminados. Ademais, leucócitos maduros cuja membrana celular seja danificada de maneira tal que o corante possa permear são manchados intensamente pelo corante, enquanto que leucócitos imaturos predominantemente indenes são de difícil manchamento. Com base na diferença de intensidade do manchamento, leucócitos maduros e leucócitos imaturos poderão ser discriminados entre os leucócitos.

[071] Os corantes para manchar ácido nucléico são apropriadamente selecionados de acordo com a luz a ser aplicada na análise. Por exemplo, os corantes tendo as seguintes fórmulas estruturais são preferivelmente usados. (1) um corante tendo a seguinte fórmula (II);

onde R1 e R2 são um grupo alquila inferior; n é 1 ou 2; X- é um ânion; e Z é um átomo de enxofre, um átomo de oxigênio, ou um átomo de carbono que seja substituído com um grupo alquila inferior.

[072] O grupo alquila inferior com relação a R1 e R2 da fórmula (II) acima refere-se a um grupo alquila C1-6 linear ou ramificado. Ele inclui, por exemplo, grupos metila, etila, propila, butila, isobutila, sec-butila, ter-butila, pentila e hexila, dentre os quais o grupo metila é preferido.

[073] O grupo alquila inferior com relação a Z inclui os mesmos grupos que acima. Z é preferivelmente um átomo de enxofre. O ânion com relação a X- inclui íons halogênio (íon fluoreto, cloreto, brometo ou iodeto), íons haleto de boro (BF4-, BCl4-, BBr4-, etc.), íons compostos de fósforo, íons ácidos de halogeno-oxigênio, íons ácido fluorsulfúrico, íons sulfato de metila, e íons compostos de tetrafenil boro que tenham um grupo halogênio ou halogerno-alquila como substituinte no anel aromático. Dentre estes, o íon iodeto é preferido.

[074] Os seguintes corantes são adequados para uso como corante para manchar ácido nucléico tendo a fórmula (II) acima: Corante A:

(2) um corante tendo a seguinte fórmula (III):

onde R1 e R2 são um grupo alquila inferior; n é 1 ou 2; e X- é um ânion.

[075] Os mesmos poderão ser mencionados para o grupo alquila de R1 e R2 e o ânion de X- na fórmula (III) acima que aqueles descritos para a fórmula (II) acima.

[076] O seguinte corante é adequado como o corante para manchar ácido nucléico tendo a fórmula (III). Corante B:

(3) um corante tendo a seguinte fórmula (IV):

onde R1 e um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila inferior; R2 e R3 são um átomo de hidrogênio, um grupo alquila inferior ou um grupo alcóxi inferior; R4 é um átomo de hdrogênio, um grupo acila ou um grupo alquila inferior; R5 é um átomo de hidrogênio, ou um grupo alquila inferior opcionalmente substituído; Z é uma átomo de enxofre, um átomo de oxigênio, ou um átomo de carbono que seja substituído por um grupo alquila inferior; n é 1 ou 2; e X- é um ânion.

[077] O mesmo grupo alquila inferior daquele descrito para a fórmula (II) acima poderá ser mencionado para o R1 da fórmula (IV) acima.

[078] O mesmo que o acima poderá ser mencionado para o grupo alquila inferior de R2 e R3. O grupo alcóxi inferior significa um grupo alcóxi C1-6 e inclui grupos metóxi, etóxi, e propóxi, dentre os quais os grupos metóxi e etóxi são preferidos. R2 e R3 são preferivelmente átomos de hidrogênio.

[079] Na fórmula (IV) acima, o grupo acila de R4 é preferivelmente um grupo acila derivado de um ácido carboxílico alifático e inclui, por exemplo, acetila, propionila e assemelhados, dentre os quais um grupo acetila é preferido. Os grupos alquila inferiores estão mencionados.

[080] O mesmo poderá ser mencionado para o grupo alquila inferior de R5. O grupo alquila inferior opcionalmente substituído significa um grupo alquila inferior que poderá ser substituído com um a três grupos hidróxi, átomos de halogênio (flúor, cloro, bromo ou iodo) e assemelhados e é preferivelmente um grupo metila ou etila substituído com um grupo hidróxi.

[081] O mesmo que o acima poderá ser mencionado para o grupo alquila inferior de Z. Z é preferivelmente um átomo de enxofre.

[082] O ânion de X- é preferivelmente um íon brometo ou BF4-.

[083] Os seguintes corantes são adequados como corantes para manchar ácido nucléico tendo a fórmula (IV) acima. Corante C:

(4) um corante tendo a fórmula (V)

onde X1 e X2 são independentemente Cl ou I. (5) um corante tendo a fórmula (VI) (NK-3975):

(6) um corante tendo a fórmula (VII) (NK-1570):

(7) um corante tendo a fórmula (VIII) (NK-1049):

(8) um corante tendo a fórmula (IX) (NK-98):

(9) um corante tendo a fórmula (X) (NK-141):

(10) iodeto de propídio ou brometo de etídio. (11) heterodímero de etídio-acridina, etídio diazida, homodímero de etídio-1, homodímero de etídio-2, etídio monoazida, tetraiodeto de trimetileno bis[[3-[[4-[[(3- metilbenzotiazól-3-io)-2-il]metileno]-1,4-dihidroquinoli-n]- 1-ila]propil]dimetilamínio (TOTO-1), diiodeto de 4[(3- metilbenzotiazol-2(3H)-ilideno)metil]-1-[3-(trimetilami- nio)propil]quinolínio (TO-PRO-1), tetraiodeto de N,N,N’,N’- tetrametil-N,N’-bis[3-[4-[3-[(3-metilbenzotiazol-3-io)-2- ila]-2-propenilideno]1,4-dihidroquinoli-1-il]propil]1,3- propanodiamínio (TOTO-3), oudiiodeto de 2-[3-[[1-[3-(trimetilamínio)propil]1,4- dihidroquinolin-4-ilideno]-1-propenil]3-metilbenzotiazól-3-io (TO-PRO-3).

[084] A concentração do corante acima é preferivelmente de 0,01 a 500 ppm, e mais preferivelmente de 0,1 a 200 ppm no reagente. O corante acima poderá ser individualmente ou dois ou mais corantes poderão ser combinados.

[085] O pH do reagente de acordo com a presente concretização é preferivelmente de 5,0 a 9,0, mais preferivelmente de 6,5 a 7,5, e ainda mais preferivelmente de 6,8 a 7,3. O pH do reagente poderá ser ajustado com um agente tamponador. O agente tamponador usado poderá ser, por exemplo, um tampão de Gooder tal como HEPES ou MOPS (ácido 3- morfolinopropanossulfônico), MOPSO (ácido 2-hidroxi-3- morfolinopropanossulfônico) ou BES (ácido (2-[bis(2- hidroximetil)amino]etanossulfônico, solução salina tamponada com fosfato, e assemelhados. Um agente de ajuste de pH tal como hidróxido de sódio também poderá ser usado.

[086] O reagente da presente concretização poderá ser obtido dissolvendo o tensoativo, agente solubilizante, corante para manchar ácido nucléico e componentes(s) opcional(is) acima, em um meio apropriado com as concentrações descritas acima. O meio apropriado não é limitado, contanto que ele possa dissolver os componentes acima, e inclui água, álcool, etileno glicol, sulfóxido de dimetila (DMSO), uma mistura destes e assemelhados.

[087] O tensoativo, agente solubilizante e corante para manchar ácido nucléico acima poderão ser usados como um único reagente a ser misturado com a amostra biológica para a análise de leucócitos imaturos. Alternativamente, um kit de reagentes contendo um primeiro reagente compreendendo o tensoativo e o agente solubilizante e um segundo reagente compreendendo o corante para manchar ácido nucléico poderá ser usado para a análise de leucócitos imaturos.

[088] Daí, a presente invenção também provê um kit de reagentes para a análise de leucócitos imaturos compreendendo um primeiro reagente que compreende um tensoativo que poderá danificar membranas de células de eritrócitos e leucócitos maduros e um agente solubilizante que poderá encolher as células danificadas e que tem uma pressão osmótica não mais baixa que 10 mOsm/kg e mais baixa que 150 mOsm/kg, e um segundo reagente que compreende um corante para manchar ácido nucleico.

[089] As concentrações do tensoativo e do agente solubilizante no primeiro reagente acima poderão ser tais que as concentrações destes descritas acima para o reagente para análise de leucócitos imaturos possam ser obtidas quando o primeiro reagente for misturado com o segundo reagente. A pressão osmótica do primeiro reagente poderá ser ajustada à faixa desejada dissolvendo o tensoativo e o agente solubilizante no meio apropriado descrito acima e ajustando apropriadamente a quantidade de agente tamponador, caso desejado. Os sacarídeos, amino ácidos e assemelhados acima poderão ser usados para o ajuste. A concentração do corante para manchar ácido nucléico no segundo reagente poderá ser tal que a sua concentração conforme descrita acima para o reagente para análise de leucócitos imaturos possa ser obtida quando o segundo reagente for misturado com o primeiro reagente. É preferível que o segundo reagente seja aquele no qual o corante para manchar ácido nucléico seja dissolvido em um solvente orgânico tal como etileno glicol porque a estabilidade de armazenamento do corante poderá ser melhorada.

[090] O reagente e o kit de reagentes poderão ser usados para a análise de leucócitos imaturos preparando uma amostra de medição misturando o(s) reagente(s) com uma amostra biológica e submetendo a amostra de medição a um citômetro de fluxo. A razão de mistura (em volume) da amostra biológica e o reagente ou a soma do primeiro e segundo reagentes do kit de reagentes é preferivelmente de 1:10 a 1:1.000.

[091] No kit de reagentes, a razão de mistura (em volume) do primeiro e segundo reagentes é de 1.000:1 a 10:1.

[092] Quando o kit de reagentes for usado, a ordem de adição para mistura do respectivo do kit de reagentes e a amostra biológica não é especificamente limitada. Preferivelmente, o primeiro reagente e o segundo reagente são misturados e então a amostra biológica é adicionada.

[093] A condição de misturação do reagente ou dos reagentes do kit de reagentes e a amostra biológica poderá ser apropriadamente selecionada de acordo com o(s) reagente(s). Por exemplo, a temperatura e o tempo de reação poderão ser selecionados de 20 a 40°C e 3 a 30 segundos, respectivamente. Quando a temperatura de reação for alta, o tempo de reação poderá ser mais curto; quando a temperatura de reação for baixa, o tempo de reação poderá ser mais longo.

[094] Quando um citômetro de fluxo for usado para a análise, luz poderá ser aplicada às células sanguíneas na amostra de medição fluindo através de uma célula de fluxo para obter informação ótica tal como luz dispersa, fluorescência, e assemelhados. As espécies e o número de células sanguíneas poderão ser medidos com base na informação.

[095] Especificamente, a análise acima poderá ser realizada usando o citômetro de fluxo mostrado na figura 1. A seguir, uma medição de mieloblastos será descrita como exemplo das presentes concretizações.

[096] Um amostra para medição é descarregada de um bocal 6 através de uma porção de orifício de uma célula de fluxo 23. Células sanguíneas na amostra passam através da porção de orifício segundo uma linha. Luz emitida por uma fonte de luz 21 é aplicada através de uma lente colimadora 22 às células sanguíneas fluindo através da célula de fluxo 23. A luz lateralmente dispersa e a luz frontalmente dispersa são geradas aplicando luz às células sanguíneas. A luz lateralmente dispersa é introduzida em um detector de luz lateralmente dispersa (tubo fotomultiplicador) 29 através de uma lente condensadora 27 e um espelho dicróico 28. A fluorescência lateral é introduzida em um detector de fluorescência lateral (tubo fotomultiplicador) 31 através de uma lente condensadora 27, o espelho dicróico 28, um filtro 28’ e uma placa ponteada 30. A luz frontalmente dispersa é introduzida em um detector de luz frontalmente dispersa (fotodiodo) 26 através de uma lente condensadora 24 e uma placa ponteada 25.

[097] O sinal de luz frontalmente dispersa, o sinal de luz lateralmente dispersa e o sinal de fluorescência lateral gerados pelo detector de luz frontalmente dispersa 26, o detector de luz lateralmente dispersa 29 e o detector de fluorescência 31, respectivamente, são amplificados pelos amplificadores 32, 33 e 34, respectivamente, e introduzidos em uma parte analisadora 35.

[098] A parte analisadora 35 calcula as intensidades da luz frontalmente dispersa, da luz lateralmente dispersa, e da fluorescência, respectivamente, a partir do sinal de luz frontalmente dispersa, do sinal de luz lateralmente dispersa e do sinal de fluorescência lateral. A parte analisadora 35 gera um primeiro mapa de distribuição bidimensional tendo dois eixos geométricos da intensidade de luz frontalmente dispersa e da intensidade de fluorescência e identifica uma região onde todos os leucócitos da amostra aparecem (região de leucócitos totais) no mapa de distribuição bidimensional.

[099] Ademais, a parte analisadora 35 gera um segundo mapa de distribuição bidimensional tendo dois eixos geométricos da intensidade de luz lateralmente dispersa e da intensidade de fluorescência das células aparecendo na região total de leucócito. Neste mapa de distribuição bidimensional, são estabelecidas uma região onde aparecem leucócitos maduros (região de leucócitos maduros), uma região onde linfócitos aparecem (região de linfócitos), uma região onde monócitos aparecem (região de monócitos) e uma região onde granulócitos aparecem (região de granulócitos). Ademais, são identificadas uma região onde mieloblastos aparecem (região de mieloblasto 1) e uma região onde granulócitos imaturos aparecem (região de granulócitos imaturos).

[100] Então, um terceiro mapa de distribuição bidimensional é gerado tendo dois eixos geométricos da intensidade de luz lateralmente dispersa e da intensidade de luz frontalmente dispersa, e uma região onde mieloblastos aparecem (região de mieloblasto 2) neste mapa de distribuição bidimensional são identificados. O número de mieloblastos contidos na amostra é calculado como o número de células aparecendo na região de mieloblasto 1 e a região de mieloblasto 2, e o número de granulócitos imaturos contidos na amostra é calculado como o número de células aparecendo na região de granulócitos imaturos. Incidentalmente, devido ao fato de os mieloblastos terem um tamanho grande e terem um único núcleo, eles geram uma forte intensidade de luz frontalmente dispersa e uma fraca intensidade de luz lateralmente dispersa. Ademais, eles geram uma baixa intensidade de fluorescência porque eles quase não são manchados, conforme descrito acima.

[101] A presente invenção adicionalmente provê um método para analisar leucócitos imaturos compreendendo misturar o presente reagente para análise ou os reagentes do kit de reagentes para análise com a amostra biológica.

[102] Na concretização preferida do método da presente invenção, a concentração do tensoativo no reagente ou mistura de reagentes do primeiro e segundo reagentes to kit para análise é preferivelmente de 500 a 15.000 ppm, mais preferivelmente de 750 a 10.000 ppm e ainda mais preferivelmente de 1.000 a 2.500 ppm.

[103] Em outras concretizações preferidas do método da presente invenção, quando o derivado de sarcosina ou o sal deste for usado como agente solubilizante, a concentração do agente solubilizante no reagente ou mistura de reagentes do primeiro e segundo reagentes do kit de reagentes será de 100 a 400 ppm; quando o derivado do ácido cólico for usado, será de 50 a 1.300 ppm; e quando a metilglucanamida for usada, será de 500 a 1.100 ppm.

[104] De acordo com estas concretizações preferidas, basófilos e mieloblastos na amostra biológica poderão ser mais claramente discriminados.

Exemplos

[105] A presente invenção será explicada em maior detalhe pelos exemplos a seguir.

(Exemplo 1)

[106] Um primeiro reagente e um segundo reagente tendo a seguinte composição foram preparados. Primeiro reagente Polioxietileno(20)oleil éter (Nikko Chemicals) 2000 ppm N-lauroilsarcosinato de sódio (produto comercial) 125 ppm MOPOSO (produto comercial) 10 mM Água purificada 1 L

[107] Os componentes acima foram misturados e o pH foi ajustado em 7,0 com NaOH. A pressão osmótica e a condutividade elétrica do primeiro reagente eram de 20 mOsm/kg e 0,78 mS/cm, respectivamente. Segundo reagente Corante para ácido nucléico 50 ppm Etileno glicol 1 L

[108] O corante foi dissolvido em etileno glicol para preparar o segundo reagente. Como corante para manchar ácido nucléico, o corante C descrito acima foi usado.

[109] O primeiro reagente (980 μ L), 20 μ L do segundoreagente e 20 μ L de uma amostra de sangue coletado de um doador saudável (razão de basófilos sendo de 2,1%, não contendo nenhum basófilo) foram misturados e reagidos a 35°C durante 19 segundos para preparar uma amostra de medição. A amostra de medição obtida foi submetida ao citômetro de fluxo mostrado na figura 1 e foram medidas a intensidade de luz lateralmente dispersa, a intensidade de luz frontalmente dispersa e intensidade de fluorescência. A fonte de luz usada foi um laser semicondutor vermelho.

[110] Com base na intensidade de luz frontalmente dispersa e a intensidade de fluorescência obtidas, foi gerado um primeiro mapa de distribuição bidimensional (diagrama de dispersão) tendo dois eixos geométricos da intensidade de luz frontalmente dispersa e intensidade de fluorescência. De acordo com este primeiro mapa de distribuição bidimensional, foi identificada a região de leucócitos total. O número de células aparecendo na região de leucócitos total foi calculado como o número de leucócitos contidos na amostra. A figura 2(1) mostra o diagrama de dispersão obtido. Para as células aparecendo na região de leucócitos total identificada, um segundo mapa de distribuição bidimensional (diagrama de dispersão) tendo dois eixos geométricos de intensidade de luz lateralmente dispersa e a intensidade de luz frontalmente dispersa foi gerada. No segundo e terceiro mapas e distribuição bidimensionais, as regiões de mieloblasto 1 e 2 foram estabelecidas. As figuras 3 (2) e (3) mostram os diagramas de dispersão obtidos. O número de células aparecendo nas regiões de mieloblasto 1 e 2 foi calculado como o número de mieleoblastos contidos na amostra. A figura 2 (4) mostra o diagrama de dispersão obtido.

[111] Conforme pode ser visto das figuras 2 (1) a (4), nenhum sinal é detectado no diagrama de dispersão em uma região onde aparece o sinal potencial de mieloblastos, porque nenhum mieloblasto é contido na amostra de sangue do doador saudável. Não aparece nenhum sinal de eritrócitos lisados. Ademais, basófilos não aparecem na região de mieloblasto porque eles são tão intensamente manchados quanto outros leucócitos maduros.

[112] A razão de mieloblastos para leucócitos totais (razão de mieloblastos = número de mieloblastos/número total de leucócitos x 100) foi calculada como sendo de 0%. A razão visualmente confirmada de mieloblastos também foi de 0%.

(Exemplo 2)

[113] Um primeiro reagente tendo a seguinte composição foi preparado. Primeiro reagente Polioxietileno(20)oleil éter (Nikko Chemicals) 1500 ppm N-lauroilsarcosinato de sódio (produto comercial) 225 ppm MOPOSO (produto comercial) 10 mM Água purificada 1 L

[114] Os componentes acima foram misturados e o pH foi ajustado em 7,25 com NaOH. A pressão osmótica e a condutividade elétrica do primeiro reagente eram de 20 mOsm/kg e 0,78 mS/cm, respectivamente.

[115] A amostra de sangue do doador saudável foi analisada conforme descrito no exemplo 1 exceto que o primeiro reagente acima foi usado ao invés do primeiro reagente usado no exemplo 1.

[116] As figuras 3 (1) a (4) mostram os diagramas dedispersão obtidos.

[117] Conforme pode ser visto das figuras 3 (1) a (4),nenhum sinal é detectado no diagrama de dispersão em uma região onde o sinal potencial de mieloblastos aparece, uma vez que nenhum mieloblasto está contido na amostra de sangue do doador saudável. Não apareceu nenhum sinal de eritrócitos lisados. Ademais, basófilos não aparecem na região de mieloblasto porque eles estão tão intensamente manchados quanto outros leucócitos maduros.

[118] A razão de mieloblastos para leucócitos totais (razão de mieloblastos = número de mieloblastos/número total de leucócitos x 100) foi calculada como sendo de 0%. A razão visualmente confirmada de mieloblastos também foi de 0%.

(Exemplo 3)

[119] A análise foi realizada conforme descrito no exemplo 1 exceto que ao invés da amostra de sangue de um doador saudável, uma amostra de sangue contendo mieloblastos de um paciente com leucemia mielóide aguda foi usada, e a intensidade de luz frontalmente dispersa, a intensidade de luz frontalmente dispersa e a intensidade de fluorescência foram obtidas.

[120] As figuras 4 (1) a (4) mostram os diagramas dedispersão obtidos.

[121] Baseado nos diagramas de dispersão das figuras 4 (10 a (4), a razão de mieloblastos totais para leucócitos totais foi de 1,2%. A razão visualmente confirmada de mieloblastos da mesma amostra de sangue foi de 4%.

(Exemplos 4 a 9)

[122] Um primeiro reagente e um segundo reagente tendo a seguinte composição foram preparados. Tabela 1

[123] O primeiro reagente (980 μ L), 20 μ L do segundo reagente e 20 μ L de qualquer uma adesão seguintes amostras de sangue foram misturados e reagidos a 35°C durante 13 segundo (17,5 segundos para os exemplos 4 e 11) para preparar amostras de medição. Diagramas de dispersão foram obtidos conforme descrito nos exemplos 1 a 3.

[124] Como amostra de sangue, foi usada uma amostra de sangue de um paciente com leucemia contendo mieloblastos (daqui por diante referida como “amostra de mieloblasto”) ou uma amostra de sangue de paciente com mieloma múltiplo não contendo mieloblastos (eritrócitos foram incorretamente lisados)(daqui por diante referida como “amostra de hemólise incorreta”).

[125] As figuras 5 a 11 mostram os diagramas de dispersão obtidos. Na respectiva figura das figuras 5 a 11, (A) mostra um diagrama de dispersão quando a amostra de mieloblasto foi usada como amostra de sangue e (B) mostra um diagrama de dispersão quando a amostra de hemólise incorreta foi usada como a amostra de sangue. Normalmente, os mieloblastos são detectados na região “BL” dos diagramas de dispersão.

[126] O eixo x e o eixo y dos diagramas de dispersão das figuras 5 a 11 mostram a intensidade da luz lateralmente dispersa e a intensidade de fluorescência, respectivamente. “Ly”, “Mo”, “Gran” e “IG” representam as seções nas quais linfócitos, monócitos, granulócitos e granulócitos imaturos aparecem, respectivamente.

[127] Com base nesses diagramas de dispersão, as razões de mieloblastos para leucócitos totais foram calculadas e descritos como “região BL” nas figuras 6 a 11.

[128] Os resultados das figuras 5 a 11 mostram que quando a análise foi realizada usando o(s) reagente(s) da presente invenção, mieloblastos foram detectados da amostra de mieloblasto e a razão de mieloblastos foi muito baixa na amostra de hemólise incorreta. Ademais, fantasmas de eritrócitos, que são detectados quando reagentes convencionais são usados, quase não foram detectados na análise da amostra de hemólise incorreta. Daí, fica demonstrado que usando o(s) presente(s) reagente(s), poderão ser obtidos resultados de análise precisos uma vez que mieloblastos não são incorretamente detectados, mesmo quando amostras de hemólise incorreta forem analisadas. Ademais, a região de mieloblasto e a região de fantasma de eritrócito não se sobrepuseram no diagrama de dispersão onde fantasmas de eritrócitos foram detectados (dados não mostrados). A saber, é mostrado que usando o(s) presente(s) reagente(s), os mieloblastos poderão ser claramente distinguidos dos fantasmas de eritrócitos e leucócitos imaturos poderão ser claramente medidos, mesmo em amostras de sangue tais como aquelas de pacientes com mieloma múltiplo, uma vez que fantasmas de eritrócitos não aparecem na região de mieloblastos nos diagramas de dispersão.

[129] O presente pedido de patente reivindica as prioridades dos pedidos de patente japoneses nos2007-166609 e 2008-84137 depositados em 25 de junho de 2007 e 27 de março de 2008, respectivamente, e as reivindicações, descritivo, desenhos e resumos dos quais são aqui incorporados por referência.

Claims

1. Reagente para análise de leucócitos imaturos, em sangue periférico, caracterizadopelo fato de compreender: um tensoativo que é um tensoativo não iônico de polioxietileno, um agente solubilizante que é um derivado de sarcosina tendo a seguinte fórmula estrutural ou sais dos mesmos,

sendo que R1 é um grupo alquila C10-22; e n é 1 a 5, e um corante para manchar ácido nucléico, sendo que a concentração do tensoativo no reagente é de 500 a 15.000 ppm e o reagente tem uma pressão osmótica não mais baixa que 10 mOsm/kg e mais baixa que 150 mOsm/kg.

2. Reagente, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o derivado de sarcosina ser N-lauroilsarcosinato de sódio, lauroil metil β-alanina sódica ou lauroilsarcosina.

3. Reagente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizadopelo fato de o tensoativo não iônico de polioxietileno ter a seguinte fórmula (I): R1-R2-(CH2CH2O)N-H (I) (onde R1representa um grupo alquila, alquenila ou alquinila C9-25; R2representa -O-, -COO- ou

e n é um número inteiro de 10 a 40).

4. Reagente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizadopelo fato de o tensoativo não iônico de polioxietileno ser polioxietileno oleil éter.

5. Reagente, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de o polioxietileno oleil éter ter a fórmula (I) sendo que n é de 15 a 20.

6. Reagente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de a concentração do agente solubilizante no reagente ser de 100 a 400 ppm.

7. Reagente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de o corante para manchar ácido nucléico ser pelo menos um corante selecionado do grupo consistindo de: (1) um corante tendo a seguinte fórmula (II);

onde R1 e R2 são um grupo alquila inferior; n é 1 ou 2; X- é um ânion; e Z é um átomo de enxofre, um átomo de oxigênio, ou um átomo de carbono que seja substituído com um grupo alquila inferior; (2) um corante tendo a seguinte fórmula (III):

onde R1 e R2 são um grupo alquila inferior; n é 1 ou 2; e X- é um ânion; (3) um corante tendo a seguinte fórmula (IV):

onde R1 e um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila inferior; R2 e R3 são um átomo de hidrogênio, um grupo alquila inferior ou um grupo alcóxi inferior; R4 é um átomo de hidrogênio, um grupo acila ou um grupo alquila inferior; R5 é um átomo de hidrogênio, ou um grupo alquila inferior opcionalmente substituído; Z é uma átomo de enxofre, um átomo de oxigênio, ou um átomo de carbono que seja substituído por um grupo alquila inferior; n é 1 ou 2; e X- é um ânion; (4) um corante tendo a seguinte fórmula (V):

onde X1 e X2 são independentemente Cl ou I; (5) um corante tendo a seguinte fórmula (VI):

(6) um corante tendo a seguinte fórmula (VII):

(7) um corante tendo a seguinte fórmula (VIII):

(8) um corante tendo a seguinte fórmula (IX)

(9) um corante tendo a seguinte fórmula (X):

(10) iodeto de propídio ou brometo de etídio (11) heterodímero de etídio-acridina, etídio diazida,homodímero de etídio-1, homodímero de etídio-2, etídio monoazida, tetraiodeto de trimetileno bis[[3-[[4-[[(3- metilbenzotiazól-3-io)-2-il]metileno]-1,4-dihidroquinoli-n]- 1-ila]propil]dimetilamínio (TOTO-1), diiodeto de 4[(3- metilbenzotiazol-2(3H)-ilideno)metil]-1-[3-(trimetilami- nio)propil]quinolínio (TO-PRO-1), tetraiodeto de N,N,N’,N’- tetrametil-N,N’-bis[3-[4-[3-[(3-metilbenzotiazol-3-io)-2- ila]-2-propenilideno]1,4-dihidroquinoli-1-il]propil]1,3- propanodiamínio (TOTO-3), ou diiodeto de 2-[3-[[1-[3-(trimetilamínio)propil]1,4- dihidroquinolin-4-ilideno]-1-propenil]3-metilbenzotiazól-3-io (TO-PRO-3).

8. Reagente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ter pH de 5,0 a 9,0.

9. Kit de reagentes para análise de leucócitos imaturos, em sangue periférico, caracterizado pelo fato de compreender: um primeiro reagente que compreende um tensoativo que é um tensoativo não iônico de polioxietileno e um agente solubilizante que é um derivado de sarcosina tendo a seguinte fórmula estrutural ou sais dos mesmos

sendo que R1 é um grupo alquila C10-22; e n é 1 a 5, sendo que a concentração do tensoativo no reagente é de 500 a 15.000 ppm e que tenham uma pressão osmótica não mais baixa que 10 mOsm/kg e mais baixa que 150 mOsm/kg, e um segundo reagente que compreenda um corante para manchar ácido nucléico.

10. Kit de reagentes, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de dito derivado de sarcosina ser N- lauroilsarcosinato de sódio, lauroil metil β-alanina sódica ou lauroilsarcosina.

11. Kit de reagentes, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 ou 10, caracterizado pelo fato de a concentração do agente solubilizante no reagente ser de 100 a 400 ppm.

12. Método para classificar leucócitos, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:misturar sangue periférico possivelmente contendo leucócitos imaturos com um reagente, tal como definido na reivindicação 1, para análise de ácido nucleico de leucócitos imaturos, sendo que a razão da mistura (em volume) do sangue periférico e o reagente ser de 1:10 a 1:1.000, emedir pelo menos uma luz dispersa e pelo menos uma fluorescência dos leucócitos imaturos tratados na etapa anterior para classificar leucócitos imaturos baseado nas diferenças das intensidades da luz dispersa e na fluorescência.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de dito derivado de sarcosina ser N- lauroilsarcosinato de sódio, lauroil metil β-alanina sódica ou lauroilsarcosina.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 ou 13, caracterizado pelo fato de a concentração do agente solubilizante no reagente ser de 100 a 400 ppm.