BRPI0817337A2 - clonagem e aplicação de um gene ghd7 pleiotrópico que controla rendimento de grãos, caracteres do ciclo vegetativo e altura de planta de arroz - Google Patents
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Abstract
CLONAGEM E APLICAÇÃO DE UM GENE GHD7 PLEIOTRÓPICO QUE CONTROLA RENDIMENTO DE GRÃOS, CARACTERES DO CICLO VEGETATIVO E ALTURA DE PLANTA DE ARROZ
A presente invenção refere-se à clonagem e aplicação de um gene Ghd7 pleiotrópico que controla rendimento de grãos, caracteres do ciclo vegetativo e altura de planta de arroz. O gene tem a sequência de nucleotídeo conforme mostrada em SEQ ID NO: 1. A sequência do presente gene foi 3.917 bp de comprimento, contém dois éxons e codifica 257 aminoácidos. A sequência de cDNA do gene foi conforme mostrada em SEQ ID NO: 1. O presente gene codifica uma proteína tendo o domínio de CCT de CO proteína e tendo a sequência de aminoácido conforme mostrada em SEQ ID NO: 1. Plantas transgênicas de arroz para gene GHD7 foram obtidas usando-se tecnologia de transgene. As plantas transgênicas todas exibem rendimento marcadamente aumentado, grande número de espiguetas por panícula, caracteres do ciclo vegetativo retardada e altura de planta elevada conforme comparados a seus respectivos controles (plantas receptoras tipo selvagem). As mudanças de traço foram muito consistentes com os fenótipos dos genótipos originais de linhas isogênicas quase GHD7 de Zhenshan 97. A presente invenção também refere-se aos métodos para clonagem de gene, para geração de linhas quase isogênicas e para manipulação de transgene, assim como à aplicação de gene pleiotrópico GHD7 em pesquisa de geração de arroz e evolução de planta.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CLONAGEM E APLICAÇÃO DE UM GENE GHD7 PLEIOTRÓPICO QUE CONTROLA E RENDIMENTO DE GRÃOS, CARACTERES DO CICLO VEGETATIVO E ALTURA DE PLANTA DE ARROZ". f 5 Campo Técnico A presente invenção refere-se ao campo de engenharia genética de planta.
Particularmente, a presente invenção refere-se a clonagem e a uso de um gene pleiotrópico Ghd7 que controla rendimento de grãos, caracteres do ciclo vegetativo e altura de planta de arroz. oe 10 Antecedentes da Invenção O rendimento de grão de arroz é um dos mais importantes últi- mos traços na produção de arroz.
Ele é um traço compósito de número de grãos por panícula, número de alças efetivas e peso por milhares de grãos.
O número de grãos por panícula é dependente do número de espiguetas por “15 —panículae taxa de assentamento de semente.
Pesquisa extensiva tem mos- À trado que o número de espiguetas por panícula determina o rendimento do arroz a uma maior extensão devido a sua hereditariedade relativamente grande e maior contribuição para rendimento e, portanto, muita atenção tem sido prestada para este traço.
Os caracteres do ciclo vegetativo são traços biológicos importantes que determina diretamente a eco adaptação e adap- oe tação de estação de variedades de arroz.
E a altura de planta está proxi- mamente relacionada ao rendimento biológico e o índice de coleta e influen- cia a estabilidade de rendimento.
Portanto, a elucidação da base genética e mecanismo molecular de número de grãos por panícula, os caracteres do ciclo vegetativo e a altura de planta podem facilitar a modificação de alto ren- dimento e a estabilidade de rendimento do arroz.
Os caracteres do ciclo vegetativo estão sob a regulação de ge- nes nutricionais básicos e genes de sensibilidade a foto período (Tanisaka et al.
Jon J Breeding, 1997, 442: 657-668; Tsai, Rice genet Newslett, 1985, 2:77-78).A distribuição de variedades de arroz e diferenciação de arroz in- dica e arroz japonica são também acreditados estarem associados com a evolução de genes de caracteres do ciclo vegetativo.
Portanto, a revelação das bases genéticas de caracteres do ciclo vegetativo pode emprestar vestí- gio à pesquisa na evolução do arroz e proporcionar orientação teórica na - seleção de geração de variedades de arroz de ecotipos diferentes.
Conforme demonstrado por ambos meios genéticos clássicos e meios genéticos mo- h 5 leculares, os caracteres do ciclo vegetativo são controlados por vários locais de traço qualitativos e muitos locais de traço quantitativos (QTLs). Entre os QTLs, uma QLT de caracteres do ciclo vegetativo na região C1023-R1440 perto do centrômero do cromossomo de arroz 7 (este QTL foi denominado como Ghd7 na presente invenção) foi detectado em populações de arroz oe 10 diferentes tal como população do cruzamento Indica-Japonica (Li et a/., 2003, Theor.
Appl.
Genet. 108: 141-153), população de cruzamento Indica-Indica (Xing et al., 2002, Theor.
Appl.
Genet. 105:248-257), população de cruza- mento Japonica-Japonica (Lin et a/., 2003, Breeding Sci. 53: 51-59) e popu- lação cultivada selvagem (Thomson et a/., 2003, Theor.
Appl.
Genet. 107: “15 479-4093), mas seu efeito genético difere grandemente entre populações di- . ferentes.
Nosso laboratório, usando Zhenshan 97/Minghui 63 derivou F2:3 e população de linha inata recombinante, também detectou caracteres do ciclo vegetativo de controle de QTL na região Ghd7 muitas vezes, que explanou até cerca de 25% de variação de caracteres do ciclo vegetativo total (Xing et al/,2001, Acta.
Bot.
Sin. 43:721-726; Yu et a/., 2002, Theor.
Appl.
Genet. 104: oe 619-625). Estes resultados mostraram que gene Ghd7 pode ser estavel- mente expresso sob antecedente genéticos diferentes e em ambientes dife- rentes.
As pesquisas genéticas de muitos anos sugerem que a altura da planta seja também controlada por vários locais de traço qualitativos e muitos QTLs.
Um QTL que influencia a altura da planta e é afetado pelo ambiente foi também encontrado presente n região de Ghd7 em populações diferentes (Li et al., 1996, Genetics, 145: 453-465; Li et a/., 2003, Theor.
Appl.
Genet. 108: 141-153; Li et al., 2006, The New Phyto. 170: 185-193; Xiao et al., 1996, Theor App! Genet, 92: 230-244). Também, um QTL que influencia traço de rendimento de grão foi detectado nesta região em algumas populações (Brondani et a/., 2002, Theor App! Genet, 104: 1192-1203; Li et a/., 1996, Genetics). Nós cultivamos o Zhenshan 97/Minghui 63 F2, RIL e populações de "Yongjiu F2" na mesma estação de anos diferentes na mesma locação, e verificamos que este QTL foi capaz de controlar os caracteres do ciclo ve- - getativo, a altura da planta, o número de espiguetas por panícula e rendi- mento nas populações de gerações diferentes derivadas da mesma combi- ' 5 nação(Yuetal. 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:9226-9231; Xing et al. 2001, Acta. Bot. Sin. 43:721-726; Yu et al., 2002, Theor. Appl. Genet. 104:619-625; Xing et a/l., 2002, Theor. Appl. Genet. 105:248-257; Hua et al., 2002, Genetics 162:1885-1895). Isto não tem sido reportado por outros gru- pos de pesquisa. Ghd7 influencia o número de espiguetas por panícula, os oe 10 caracteres do ciclo vegetativo e a altura da planta ao mesmo tempo. O alelo Minghui 63 aumentou os valores de fenótipo destes três traços. Portanto, existe grande potencial e perspective de Ghd7 na modificação de rendimento de arroz e adaptação de variedade. Mapeamento preciso e clonagem de Ghd7 pode proporcionar uma nova fonte de gene para a geração de rendi- “15 mento altodo arroz.
E É quase impossível mapear precisamente os locais de traço quantitativos usando população de mapeamento primária, porque em tal população muitos QTLs que influenciam o mesmo traço são isolados. A in- terferência entre os QTLs e a influência de fatores ambientais limitam gran- demente a precisão de mapeamento de QTL. Em adição, para uma região oe rica em QTL, é muito difícil julgar se ela é um QTL pleiotrópico ou muitos QTLs menores que desempenham um papel (Yano et al., 1997, Plant Mole- cular Biology 35:145-153). Portanto, populações de mapeamento avançadas devem ser construídas de modo a mapear precisamente QTL. Uma prática comum é construção de linhas quase isogênicas do QTL alvo para eliminar muita da diferença antecedente fora do local de QTL-alvo, de modo que o local exiba hereditariedade de Mendelian típica, isto é, conversão de traços quantitativos a traços qualitativos. Estas aproximações têm desempenhado um papel importante no mapeamento preciso e pesquisa de clonagem de gene de muitos QTLs. Fan et al. mapearam GS3 a um região de 7,9 kb e clonagem baseada em mapa conduzida de GS3 usando esta aproximação (Fan et a/., 2006, Theo App! Genet 112: 1164-1171). Devido a restrição de tamanho da população ou a inibição de recombinação que ocorre frequen- temente na região perto do centrômero, às vezes a resolução de mapea- - mento de gene é insuficiente para localizar o gene-alvo, e isto traz problema para clonagem baseada em mapa.
Desse modo, uma aproximação de clo- ' 5 nagem de gene candidato é uma estratégia relativamente boa.
Todos os genes na região de mapeamento são analisados; baseados nas caracterís- ticas e funções relevantes do domínio de gene clonado e por comparação das funções conhecidas de genes conhecidos e perfis de genes prognosti- cados, genes estruturalmente e funcionalmente relevantes são selecionados oe 10 como os genes candidatos para verificação funcional.
Esta estratégia de gene candidato proporciona uma nova aproximação para a separação e a clonagem de gene Ghad7. Um gene Ghd7 que controla rendimento de grão, caracteres do ciclo vegetativo e altura da planta em arroz foi isolado e clonado através da “15 aproximação de clonagem de gene candidato na presente invenção, para h proporcionar uma nova fonte de gene para geração de arroz em termos de rendimento e, de variedade para emprestar prestígio à pesquisa na evolução de colheitas.
Sumário da Invenção Um objetivo da presente invenção é isolar e clonar do arroz um oe gene pleiotrópico que controla concorrentemente o rendimento de grão, ca- racteres do ciclo vegetativo e altura da planta em arroz usando aproximação de clonagem de gene candidato, para superar os problemas da técnica ante- rior.
A presente invenção também se refere a aplicação deste gene na ge- raçãode arroz para aumentar grandemente o rendimento do arroz.
Este gene foi designado como Ghd7 pelos presentes requerentes.
A presente invenção foi realizada conforme segue.
A partir da população de linha inata recombinante derivada da combinação de Zhenshan 97 (uma variedade de arroz publicamente conhecida e usada) e Minghui 63 (uma variedade de arroz publicamente conhecida e usada), os requerentes selecionaram uma planta compreendendo gene Ghd7 e tendo um antece- dente genético 70% idêntico àquele de Zhenshan 97. A planta selecionada foi usada para conduzir cruzamento posterior com Zhenshan 97 para duas ge- rações seguidas de procriação consanguínea para construir linhas isogênicas s perto de Ghd7. A análise da população de linhas perto de isogênicas revelou que o gene tinha um grande efeito nos caracteres do ciclo vegetativo, no E 5 número de espiguetas por panícula e na altura da planta (tabela 2). Um teste de progenia mostrou que o gene exibiu uma proporção de segregação de Mendelian (tabela 2). Usando a grande população de linhas perto de isogê- nicas, Ghd7 foi precisamente mapeado a uma região de cromossomo de 0,4 CM, cerca de 2.300 kb (figura 3). O prognóstico dos genes na região conduziu oe 10 a descoberta de um gene com domínio de CCT.
Clones positivos compre- endendo Ghd7 foram classificados a partir da biblioteca de BAC de Minghui 63, e foram subclonados para obter um fragmento genômico de 8.175 como gene candidato para Ghd7 que foi submetido a verificação de transgene.
O gene foi introduzido em Mudanjiang 8 e Hejiang 19 (ambos são variedades “15 de arroz publicamente conhecidas e usadas) e as plantas individuais trans- BR gênicas todas exibiram aumento marcado no rendimento e no número de espiguetas por panícula, no retardo marcado de caracteres do ciclo vegeta- tivo e na altura da planta mais alta (conforme mostrado na tabela 4). O CDONA de comprimento total de Ghd7, 1.014 bp de comprimento, foi isolado usando amplificação rápida de método de extremidades de cDNA (RACE) (Frohman o et al., 1988, Proc Natl Acad Sci USA,1988,85: 8998-9002). A comparação de sequência de genoma e sequência de CDNA de comprimento total revelou que o gene Ghd7 compreende dois éxons e codifica um total de 257 amino- ácidos.
A análise de expressão de gene mostrou que o gene é expresso em todos os tecidos com baixo nível de expressão em todos os estágios de crescimento.
O teste da reação de ciclo leve mostrou que a quantidade de expressão de Ghd7 é elevada e os caracteres do ciclo vegetativo são retar- dados sob condições de dias longos conforme comparado a condição de dia curto.
O alelo de Zhenshan 97 estava ausente.
Para variedades de alça grandes, isto é, Minghui 63, H94 (de Shanghai Agrobiological Gene Centre), 93-11 (variedade indica média de geração por Agricultural Science Research Institute em Lixia River Area, Jiangsu Province) e Teging (uma variedade de arroz de alto rendimento amplamente estendida no anos de 1980), duas va- riedades de alça pequena, isto é, Mudanjiang 8 e Hejiang 19, e duas varie- - dades com tamanho de alça intermediário, isto é, Zhonghua 11 (uma varie- dade comercial de Crops Research Institute da Chinese Academy of Agricul- f 5 tural Sciences) e Nipponbare (uma variedade de arroz publicamente conhe- cida e usada cujo sequenciamento total de genoma foi completado) foi se- quenciado e comparado. O sequenciamento dos alelos destas oito plantas revelou que, na região de sequência de 5,5 kb compreendendo o promotor e gene total, o primeiro éxon em quatro variedades de alça grandes tinha uma o 10 variação comum comparada com duas variedades de alça pequenas, isto é, GAG que codifica ácido glutâmico é mutacionada para o códon de parada (TGA).
A presente invenção tem as seguintes vantagens:
1. A presente invenção clonou um gene pleiotrópico que influen- “15 cia concorrentemente rendimento de grão, caracteres do ciclo vegetativo e E altura da planta de arroz pela primeira vez. Portanto, a presente invenção proporciona uma nova fonte de gene para a geração de variedades de alto rendimento e variedades capazes de se adaptar a ecotipos diferentes e es- tações, e também proporciona sequência de gene para a clonagem de genes relevantes em outras colheitas usando um método de gene homólogo.
o 2. O gene clonado na presente invenção pode também propor- cionar evidência para pesquisa na reação leve e evolução molecular de co- lheitas de cereal, tal como arroz (Oryza sativa) e colheita dicotiledônea tal como colza de semente de óleo (Brassica napus).
Breve Descrição dos Desenhos SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequência é sequência genômica Ghd7 isolada e clonada na presente invenção (que inclui a sequência de codificação de gene Ghd7). A figura 1 é o esquema de tecnologia total da presente invenção. Figura 2: A distribuição de frequência de rendimento de grão, número de espiguetas por panícula, os caracteres do ciclo vegetativo e a altura da planta na população aleatória de BC3F2. A figura 2a mostra a dis-
tribuição de frequência de caracteres do ciclo vegetativo; figura 2b mostra a distribuição de frequência de altura da planta e a figura 2c mostra a distribu- D ição de frequência de número de espiguetas por panícula. As barras cinza, preta e branca nas figuras representam genótipo de Zhenshan 97, genótipo 1 5 heterozigoto e genótipo de Minghui 63 em local de Ghd7. Estes três genóti- pos de Ghd7 foram inferidos através de teste de progenia.
Figura 3. Mapeamento de Ghd7 no mapa de ligação genética, a unidade genética estando em cM. A figura 3a é um gráfico que mostra ma- peamento de uma população de linha inata recombinante; a figura 3b é um oe 10 gráfico que mostra mapeamento usando população pequena de BC3F>2; e a figura 3c é um gráfico que mostra mapeamento preciso usando uma planta individual extremamente recessiva. Os numerais na esquerda do cromos- somo representa a distância física entre dois marcadores, e numerais nos colchetes seguindo os marcadores na direita representam o tempo de re- “15 combinação do gene com o respectivo marcador.
À A figura 4 é o fluxograma de construção das linhas quase isogê- nicas da presente invenção. Zhenshan 97 foi usado como a origem fêmea no cruzamento posterior.
A figura 5 mostra os fenótipos das linhas isogênicas e plantas individuais transgênicas da presente invenção. A figura 5a mostra plantas das oe linhas quase isogênicas, que são, a partir da esquerda para a direita, Zhen- shan 97, Zhenshan 97- Zhenshan 97 Ghd7, Zhenshan 97-híbrido Ghd7, Zhenshan 97-Minghui 63 Ghd7, Minghui 63, respectivamente. A figura 5b mostra as alças de arroz, que são, da esquerda para a direita, genótipos de Zhenshan 97- Zhenshan 97 Ghd7, Zhenshan 97-híbrido Ghd7, Zhenshan 97-Minghui 63 Ghd7 respectivamente. A figura 5c mostra Ghd7 de plantas transgênicas, no qual a esquerda representa a planta negativa de Hejiang 19 e a direita representa a planta positiva. A figura 5d mostra as alças de arroz das plantas transgênicas, no qual a esquerda representa a alça de arroz da planta negativade Hejiang 19 e a direita representa a alça de arroz da planta positiva.
Afigura 6 é o diagrama estrutural de vetor binário PCAMBIA1301.
A figura 7 é o diagrama estrutural do gene Ghd7 clonado na pre- sente invenção. As caixas pretas representam éxons, e as caixas com linhas " inclinadas representam 5' e 3' UTR. "ATG" e "TGA" são translação de códon de partida e códon de parada, respectivamente. A diferença em uma base 1 5 entrea variedade de alça grande e a variedade de alça pequena está locali- zada no primeiro éxon de gene Ghd7, que uma mutação de ácido glutâmico (GAG) na variedade de alça pequena para o códon de parada (TGA) na va- riedade de alça grande. O intervalo sublinhado é o domínio conservado de cer.
oe 10 Descrição Detalhada da Invenção De acordo com o esquema de tecnologia na figura 1, uma planta compreendendo Minghui 63 Ghd7 alelo e tendo um antecedente genético mais similar àquele de Zhenshan 97, isto é, linha inata Nº 50 RIL50, foi sele- cionada a partir de população de linha inata recombinante derivada de com- “15 —binaçãode Zhenshan 97 e Minghui 63 (Vide Xing Yongzhong et a/., Mapping ; and Separation of Plant Height Gene and Heading Date in Rice, Journal of Integrative Plant Biology, 2001, 43(7):721-726). A planta selecionada foi u- sada para conduzir cruzamento posterior com Zhenshan 97 (conforme a o- rigem recorrente) para três gerações seguidas por procriação consanguínea para construir linhas quase isogênicas do gene Ghd7. Ghd7 foi mapeado e oe seu efeito genético analisado usando uma população aleatória compreen- dendo 190 plantas individuais de BC3F2. Análise adicional de 1.082 plantas individuais de partes superiores extremamente anteriores, talo curto e alça pequena de 8.400 plantas individuais usando marcadores de SSR comuns na região-alvo finalmente mapeiam Ghd7 para uma região entre C39 e RM3859, os dois marcadores tendo uma distância genética de 0,4 CM, mas uma dis- tância física até 2.300 kb. Análise de sequência usando Nipponbare, cujo genoma tinha sido completamente sequenciado, e 93-11 (uma geração de variedade de indica de arroz média pelo Agricultural Science Research Insti- tuteem Lixia River Area, Jiangsu Province) resultou no prognóstico que e- xiste na região um gene com domínio de CCT e o gene foi determinado para ser o gene candidato para Ghd7. Um fragmento de sequência de 8.1725 bp compreendendo gene Ghd7 foi isolado a partir da biblioteca de BAC de Minghui 63 e o fragmento foi ligado no vetor de plasmídeo binário pcCAMBI- F A1301 (um plasmídeo publicamente reportado e usado da Austrália). Sobre expressão e transformação de sentido do vetor nas plantas receptoras Hejing í 5 19, Mudanjiang8 e Zhenshan 97 resultou em plantas individuais transgênicas que exibiram as mudanças de traço esperadas, isto é, rendimento marca- damente aumentado, tamanho de alça ampliado, caracteres do ciclo vegeta- tivo retardados e altura da planta elevada.
Estes fenótipos são extremamente similares àqueles dos dois genótipos homozigotos de linhas quase isogêni- o 10 casde Ghd7, demonstrando que este gene candidato é justo Ghd7 que está ausente em Zhenshan 97. Iniciadores foram designados baseados na se- quência de Ghd7 e a sequência e sequência de CDNA de comprimento total de Ghd7, 1.014 bp de comprimento, foi isolada usando tecnologia de RACE.
O alinhamento de sequência da sequência de 5,5 kb compreendendo o pro- “15. motore gene total revelaram que o primeiro éxon das quatro variedades de . alça grandes (como o estágio de crescimento em Wuhan, China foi longo, a altura da planta foi mais alta e a alça de arroz foi maior) tinha uma variação comum comparada com as duas variedades de alça pequenas, isto é, GAG que codifica ácido glutâmico é substituído com o códon de parada (TGA). O tratamento das plantas individuais transgênicas negativas e positivas junto oe com as linhas quase isogênicas dos dois genótipos homozigotos sob condi- ções de dia longo revela as seguintes descobertas: a expressão de Ghd7 sob condição de dia longo foi aumentada conforme comparada a condição de dia curto; Plantas de genótipo homozigoto de Minghui 63 exibem caracteres do ciclo vegetativo marcadamente retardada, uma altura da planta elevada e tamanho de alça ampliado e rendimento aumentado sob condição de dia longo.
Contudo, sob condição de dia curto, os fenótipos dos genótipos dife-
rem insignificantemente e foram similares àquele de Zhenshan 97. Os seguintes exemplos descrevem adicionalmente a presente invenção.
Eles ilustram os métodos para separação e clonagem de gene Ghd7 e transformação genética, bem como os métodos para a detecção da diferença de sequência entre alelos de Ghd7 por alinhamento de sequência,
e a expressão de gene Ghd7 sob condições de dia longo e dia curto. Base- ado na seguinte descrição e exemplos, aqueles versados na técnica podem B determinar as características essenciais da presente invenção e são capazes de produzir várias mudanças e modificações à presente invenção para apli- 1 5 cálaem diferentes usos e condições sem fugir do conceito e escopo da presente invenção. Exemplo 1: Construções de Linhas Quase Isogênicas de Ghd7
1. Cruzamento posterior e Seleção Conforme mostrado na Figura3a, baseado no resultado de ma- oe 10 peamento de QTL da população de linha inata recombinante derivada de Zhenshan 97 e de Minghui 63 e em conjunto com genótipo marcador, a linha inata RILSO compreendendo o alelo Ghd7 de Minghui 63 e tendo um ante- cedente genético 70% idêntico àquele de Zhenshan 97 foi selecionado como a origem fêmea para conduzir cruzamento posterior com Zhenshan 97 três “15 vezes em sucessão, seguido por procriação consanguínea uma vez para h obter BC3F> (figura 4). As gerações de BC1F, e BC2F,; foram somente sub- metidas a seleção positive para Ghd7, isto é, uma planta individual com a região alvo tendo o genótipo heterozigoto Zhenshan 97/Minghui 63 foi sele- cionada para a próxima etapa de cruzamento posterior. A geração de BC3F,, em adição a seleção positiva, foi submetida a escaneamento do antecedente oe genético for a da região-alvo, de modo que plantas individuais com um an- tecedente genético mais próximo àquele de Zhenshan 97 fossem selecio- nadas para os experimentos subsequentes. Pela referência a mapas de li- gação genética de arroz publicados (Temnykh et. al., 2000, Theor. Appl. Genet. 100:697-712; Temnykh et. al., 2001, Genome Res. 11:1441-1452), 150 pares de marcadores de SSR mostrando polimorfismo entre as origens e constantemente distribuídos em 12 cromossomos de arroz foram seleciona- dos para a classificação de antecedente genético. Uma planta individual com um antecedente genético mais próximo àquele de Zhenshan 97 (BC3F1) foi finalmente selecionada, cujos marcadores RM5451 e RM445 (vide a Gra- mene website) mostrou um genótipo de heterozigoto Zhenshan 97/Minghui 63, enquanto somente 7% (10 pares) dos 150 pares dos marcadores de SSR mostraram um genótipo de Zhenshan 97/Minghui 63 heterozigotos, e o res- tante mostrou um genótipo de Zhenshan 97/Minghui 63 homozigoto. As pro- - genias de referida planta individual (BC3F2> e BC3F3) foram usadas no ma- peamento preciso subsequente e clonagem de genes. f 5 2.MétododeSSR O protocolo de PCR padrão para Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3º ed., (traduzido por Jin Dongyan et a/.), Sci- ence Press, 2002. O PCR usou um system de reação de 20 ul que compre- ende 20-50 ng de gabarito de DNA, Tris-HC! a 10 mM, KCI a 50 MM, 0,1% de oe 10 Triton X-100, MgClza 1,8 MM, dNTP a 0,1 mM, 0,2 UM de iniciadores (para iniciadores para RM282 e RM16 referidos acima, refere-se a Gramene web- site) e 1 U Taq de DNA polimerase. As condições para PCR foram: predena- turação a 94ºC por 4 min; 94ºC 1 min, 55ºC 1 min, 72ºC 1 min, 34 ciclos; alongamento a 72ºC por 10 min. Produtos de PCR foram isolados em 6% de “15 gel de poliacrilamida e, em seguida, manchado com prata (Bassam et al, Fr 1991, Anal Biochem 196 80-83). Exemplo 2: Mapeamento e avaliação de efeito de Ghd7 na população aleatória
1. Medição de fenótipo "Caracteres do ciclo vegetativo" conforme aqui usado refere-se oe ao número de dias a partir do dia de semeadura ao dia quando uma planta individual desenvolve sua primeira alça, isto é, caracteres do ciclo vegetativo de uma planta individual. "Altura da planta", conforme aqui usado, refere-se a altura a partir da superfície do campo ao topo da alça mais alta de uma planta individual, isto é, altura da planta de uma planta individual. "Número de es- piguetas por panícula" conforme aqui usado, refere-se ao quociente do nú- mero total de grãos (incluindo o número de grãos preenchidos e o número de grãos não-preenchidos) de uma planta individual dividido pelo número de alças efetivas da planta. "Rendimento", conforme aqui usado, refere-se a massa de grãos preenchidos de uma planta individual após secagem natural dos grãos, isto é, rendimento de grãos. De entre a população de BC3F> derivada de uma planta individual de BC3F,, 190 plantas individuais foram aleatoriamente selecionadas para formar uma população aleatória.
Cada planta individual na população de - Zhenshan 97, população de Minghui 63 e a população aleatória foi avaliada para seu caracteres do ciclo vegetativo, sua altura da planta, seu número de f 5 espiguetas por panícula e rendimento.
Os resultados mostraram que todos os traços eram significantemente diferentes entre as duas origens (tabela 1). Na população aleatória, o número de espiguetas por panícula mostrou uma dis- tribuição descontinua e tomados 110-120 grãos como a linha de divisão, a população pode ser dividida em dois tipos, isto é, tipo alça grande e tipo alça oe 10 pequena (tabela 1 e figura 2c). Os caracteres do ciclo vegetativo, a altura da planta e o rendimento todos mostraram uma distribuição bimodal contínua (figura 2a, 2b e 2c). Além disso, o rendimento mostrou uma correlação mais significantemente positiva com altura da planta, caracteres do ciclo vegetativo e número de espiguetas por panícula, isto é, plantas de alto rendimento ti- “15 nhamuma altura da planta mais alta, um dia mais tarde de caracteres do ciclo vegetativo e um número maior de espiguetas por panícula conforme compa- rado a plantas de baixo rendimento.
Para simplicidade de descrição, na presente invenção, o tipo tendo um grande número de espiguetas por paní- cula é referido como o tipo de alça grande, e o tipo tendo um número menor de espiguetas por panícula é referido com tipo de alça pequeno. oe Tabela 1. Valores dos fenótipos nas duas origens e nos tipos de alça grande e pequeno na população aleatória Traços Origens (média + SD) Tipo de alça grande Tipo de alça pequeno Zhen- — Minghui MédiatSD Faixa — Mé Faixa shang97 63 diatSD Rendi- 196+1,6 — 29,9+21 25,7+4,0 16,5-39,4 10,5-25,3 17,512,8 mento de uma planta individual (9) Número 1092+64 1486+95 1748+27,7 1219-2167 90,2+11,3 74,9-109,2 de espi- guetas por pa nícula
Continuação... Traços Origens (média + SD) Tipo de alça grande Tipo de alça pequeno Zhrer — Minghui MédiatlSD Faixa —. Mé Faixa E shang97 63 dia+SD Caracte- —60,4:1,3 892+15 —81,9+7,3 71,3-92,4 60,7+1,8 — 59,1-62,7 res do à ciclo ve- getativo (dia) Altura da 79,421 107,4:2,5 109,3+869 98,1-129,3 80,0:5,6 — 70,1-91,7 planta (em)
2. Mapeamento de QTL e avaliação de efeito de Ghd7 oe Vinte e um marcadores de SSR foram selecionados a partir da região de QTL entre C1023-R1440 (figura 3a), e nove marcadores de PCR e um marcador de RFLP foram obtidos que mostraram polimorfismo entre Zhenshan 97 e Minghui 63. A população aleatória de linhas quase isogênicas E: foi analisada para genótipo de marcador. Mapmaker/Exp 3.0 software (Lin- coln et. al. 1992, Whitehead Institute Technical Report, Whitehead Institute, E Cambridge, Massachusetts, EUA) foi usado para construir um mapa de |i- gação local para a região de Ghd7 (figura 3b). Rendimento, número de es- piguetas por panícula, caracteres do ciclo vegetativo e altura da planta de plantas individuais na população aleatória foram mapeados por QTL usando método de mapeamento de região Mapmaker/QTL 1.1, com um valor LOD de oe 3.0 como o limite para detecção de QTL. Os resultados na tabela 2 mostra- ram que um QTL encontrado na região de RM3859 a C39 tinha efeitos no rendimento, no número de espiguetas por panícula, nos caracteres do ciclo vegetativo e na altura da planta de plantas individuais, e contaram 43,2%, 74,2%, 91,8% e 88,9% da variação fenotípica para estes traços, respecti- vamente. O genótipo de Minghui 63 contribuiu para o aumento no rendimento, no número de espiguetas por panícula, nos caracteres do ciclo vegetativo e na altura da planta de plantas individuais. O QTL exibiu um efeito dominante parcial em vários traços diferentes. Isto indicou que alelos superiores podem ser direcionados através de seleção auxiliada por marcador para modificar variedades de arroz. Além disso, o genótipo homozigoto dominante é o ge- —nótiporelativamente ideal.
Tabela 2. Efeitos do QTL na região de RM3859 a C39 no rendimento, número de espiguetas por panícula, caracteres do ciclo vegetativo e altura da planta ' Traços LOD A Dº D/A R? (%)º Rendimento (grama) 22,3 4,4 2,7*** 0,61 43,2 . Número de espiguetas 56,1 59,8 28,3** — 047 74,2 por panícula Caracteres do ciclo 1029 12,3 4,0* 0,33 291,8 vegetativo (dia) Altura da planta (cm) 76,7 18,8 12,3* 0,65 88,9 oe ? Efeito aditivo de alelo de Minghui 63; º Efeito de dominância de alelo Min- ghui 63; *, ** e *** referem-se a nível de significância a P <0,01, 0,001 e 0,0001 (t-teste);*Percentagem de variância de fenótipo total explanada pelo QTL.
4. Teste de progenia á Cada planta individual na referida população aleatória foi culti- : vada em 20 famílias (geração BC3F3) para teste de progenia. Foi verificado que, entreas 190 plantas, 45 plantas tinham progenias que mostraram fenó- tipos de alça pequena, caracteres do ciclo vegetativo anterior, haste curta e baixo rendimento, 43 plantas tinham progenias que mostraram fenótipos de alça grande, caracteres do ciclo vegetativo posterior, haste comprida e alto oe rendimento, e as restantes 102 plantas tinham progenias que exibem se- gregação nos quatro traços-alvo. Teste de Chi-quadrado mostraram que es- tes três grupos de plantas seguiram a proporção de segregação de 1:2:1 para um fator de Mendelian simples (X? = 1,07, P > 0,05), indicando que nesta população de BC3F>2, os quatro traços foram controlados por um gene maior, e que o alelo de alça grande era dominante sobre o alelo de alça pequeno. Desde que estes três grupos conforme exibido pelas progenias correspon- didas para os três genótipos das plantas individuais de BC3F2 no local de Ghd7: genótipo homozigoto de Minghui 63 (alça grande), genótipo homozi- goto de Zhenshan 97 (alça pequena) e genótipo heterozigoto (segregação de alça grande e alça pequena), portanto, Ghd7 como um marcador foi direta- mentemapeado a uma região de 0,4 cM entre marcador de SSR RM3859 e marcador RFLP C39, e Ghd7 foi cosegregado com RM5436 (figura 3c). Exemplo 3: Mapeamento preciso de Ghd7 e determinação de gene can- " didato
1. Classificação de plantas individuais recombinantes e mapeamento preciso E 5 deGhd7 De modo a estreitar adicionalmente a região compreendendo Ghd7, de entre as 8.400 plantas de BC3F> derivadas de uma planta individual de BC3F1, 1.082 plantas individuais encabeçam os anteriores e mostrando hastes curtas e alças pequenas foram selecionadas e usadas para a classi- oe 10 ficação de plantas individuais recombinantes. Na base de mapeamento de população pequena aleatória, 5 marcadores SSR e 1 marcador RFLP (figura 3b) na região 8 CM compreendendo Ghd7 foram selecionados para classificar estas 1.082 plantas individuais. Primeiramente, 1.082 plantas individuais foram classificadas com “15 marcadores SSR RM5431 e RM445 para dar 66 e 94 plantas individuais re- . combinantes (160 no total) respectivamente. Em seguida, estas 160 plantas individuais recombinantes foram analisadas usando-se os seguintes quatro marcadores: RM3859, RM5436, RM5499, C39 e RM7110. Foi verificado que existem 8 plantas individuais recombinantes no qual elas estavam na região entreRM3859 e C39, e respectivamente, 4 plantas individuais recombinantes oe na região entre RM3859 e Ghd7 e na região entre C39 e Ghd7. E RM5436 e RMB5499 foram ambos cosegregados com Ghd7 (figura 3c). Portanto, Ghd7 foi finalmente mapeado para a região entre RM3859 e C39. Esta região cor- respondia ao escopo físico de cerca de 2.300 kb na sequência de genoma —Nipponbare e foicosegregado com a região 920 kb (figura 3c).
2. Determinação do gene candidato A distância genética 0,4 cM da região compreendendo Ghd7 correspondia a uma distância física de 2.300 kb, que indicou a presença de inibição severa de recombinante na região-alvo. Isto foi associado com a região perto do centrômero onde o gene se localiza. Ghd7 foi cosegregado com a região de 920 kb, que indicou que clonagem baseada em mapa foi incapaz de estreitar adicionalmente a região de gene. Portanto, o gene can-
didato foi determinado pelo uso da aproximação de gene candidato. Todos os genes possíveis foram prognosticados baseados na sequência de região de - 2.300 kb correspondente de Nipponbare. Foi verificado que existem mais do que 450 genes na região, entre a qual um gene tinha domínio conservado de " 5 CCT(CONSTANS (CO), CO-LIKE e TIMING OF CAB1 (TOC1)) e foi repor- tado para ser associado com o seguinte período de Arabidopsis e arroz, portanto, foi priorizado como o gene candidato para Ghd7. Exemplo 5: Teste de Complementação Transgênica para Ghd7 Baseado na sequência de gene candidato prognosticada, três o 10 pares de iniciadores de PCR conforme mostrado na tabela 3 foram desig- nados para classificar a reunião de DNA de biblioteca de BAC de Minghui 63, e clones contendo o gene candidato foram selecionados. Os clones positivos foram excisados usando-se endonucleases BamHI e EcoR! de restrição subclonados para obter um fragmento de 8.175 bp que contém uma sequên- “15 ciade 2.261 kb à montante do local de iniciação de transcrição e uma se- É quência de 3.255 kb à jusante do local de terminação de transcrição.
Este fragmento foi ligado no vetor binário pCAMBIA1301 e plan- tas de arroz transgênicas foram obtidas usando-se método transgene. Mais especificamente, as plantas de arroz transgênicas foram obtidas conforme segue: oe O Minghui 63 BAC 60F11 selecionado foi excisado usando-se endonucleases BamHI e EcoRiI de restrição, e um fragmento cerca de 8 kb de comprimento foi isolado em 0,8% de agarose. Este fragmento foi ligado no vetor binário PCAMBIA1301 (o diagrama do vetor é mostrado na figura 6) e entãoclones positivos foram classificados usando-se os iniciadores conforme mostrado na tabela 3. O clone obtido foi sequenciado usando-se iniciadores conforme mostrado na tabela 3 para confirmar que o fragmento onde o gene reside foi ligado no vetor. O plasmídeo clonado correto assim obtido foi in- troduzido nas variedades de arroz de Zhonghua Hejiang 19 e Mudanjiang 8 usando-se um sistema de transformação genético de arroz mediado por A- grobacterium. Uma planta transgênica foi obtida através de pré-cultivo, in- festação, cocultivo, classificação do calo com resistência à higromicin, dife-
renciação, enraizamento, estabelecimento de muda e transplante.
O sistema de transformação genética de arroz (subespécie de arroz japônica) mediado . por Agrobacterium foi otimizado na base de método reportado por Hiei, et al. (Vide "Efficient transformation of rice, Oryza sativa L., mediated by Agrobac- f 5 teriume sequence analysis of the boundaries of the T-DNA", 1994, Plant Journal 6:271-282). O meio e seu método de preparação e as etapas principais da transformação genética da presente invenção foram conforme segue: (1) Abreviações de Reagentes e Soluções oe 10 As abreviações de fito-hormônios usados no meio de cultura da presente invenção foram conforme segue: 6-BA (6-benzilaminopurina); CN (Carbenicilin), KT (Kinetin); NAA (Naftaleno ácido acético); IAA (Indo- le-3-ácido acético); 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético); AS (Acetosringo- na); CH (Hidrolisato de Caseina Enzimática); HN (Higromycin B); DMSO “15 (Sulfóxido de Dimetila)) Nomax (solução de N6 macroelementos); N6mix . (solução de N6 microelementos); MSmax (solução de MS macroelementos); MSmix (solução de MS microelementos) (2) Fórmulas de Soluções Primárias 1) Preparação de solução-mãe de N6 macroelementos (preparada como 10X concentrado): oe KNO;3 28,39 KH2PO, 4,09 (NH4)2SO, 4,639 MgSO, *7H20 1,859 CaCl; *2H20 1,688 g : Estes compostos foram dissolvidos em sucessão e em seguida o volume foi trazido a 1000 m! com água destilada à temperatura ambiente. 2) Preparação de solução-mãe N6 microelementos (preparada como 10X concentrado): KI 0,08 g H3BO; 0,169 MnNSO,244H20 0,44 g
ZNSO4º7H20 0,159 Estes compostos foram dissolvidos e em seguida o volume foi trazido a 1000 À ml com água destilada à temperatura ambiente. 3) Preparação de estoque de alimentação de sal férrico (Fe2EDTA) (preparado como 10X concentrado): 3,73 g de Na2EDTA-2H,O e 2,78 g de FeSO,4º2H2O foram dis- solvidos, misturados e trazidos a 1000 ml! com água destilada.
A solução re- sultante foi mantida em banho de água a 70ºC por 2 horas e armazenada a 4ºC para uso. oe 4) Preparação de solução de estoque de vitaminas (preparada como 10X concentrado): Ácido nicotínico 0,19 Vitamina B1 (Tiamina HCI) 0,19 - Vitamina B6 (Piridoxina HCI) 0,19 Glicina 0,29 É Inositol 10g Água destilada foi adicionada para trazer o volume a 1000 ml e a solução resultante foi armazenada a 4ºC para uso. 5) Preparação de solução-mãe MS macroelementos (solu- e ção-mãe MSmax) (preparada como 10X concentrado): NHaNO;3 16,59 KNO;3 19,0g KH2PO, 1,79 MgSO,. 3,79 CaCl, 4,49 Estes compostos foram dissolvidos à temperatura ambiente e em seguida o volume foi trazido a 1000 ml! com água destilada. 6) Preparação de solução-mãe MS microelementos (Solu- ção-mãe MSmix) (preparada como 10X concentrado): MnNSO,44H20 2,239
ZNnSO,4"7HO0 0,86 g H3BO;3 0,629 ã KI 0,083 g : Na2MoO,4"2H,0 0,025 g CuSO4-5H20 0,0025 g CoCl-6H20 0,0025 g Estes compostos foram dissolvidos à temperatura ambiente e em seguida o volume foi trazido a 1000 ml com água destilada. 7) Prepara- CS ção de solução de estoque de 2,4-D (1 mg/ml): 100 mg de 2,4-D foram pesados e dissolvidos em 1 ml! de hidróxido de po- tássioa1Npor5 minutos, em seguida 10 ml de água destilada foi adicio- nado para dissolução completa.
A solução resultante foi trazida a 100 ml e armazenada à temperatura ambiente.
E 8) Preparação de solução de estoque 6-BA (1 mg/ml): E 100 mg de 6-BA foram pesados e dissolvidos em 1 ml! de hidró- xidode potássio a 1 N por 5 minutos, em seguida 10 ml de água destilada foi adicionada para dissolução completa.
A solução resultante foi trazida a 100 ml e armazenada à temperatura ambiente. 9) Preparação de solução de estoque de NAA (1 mg/ml): oe 100 mg de NAA foram pesados e dissolvidos em 1 ml de hidró- xidode potássio a 1 N por 5 minutos, em seguida 10 ml de água destilada foi adicionado para dissolução completa.
A solução resultante foi trazida a 100 ml e armazenada a 4ºC para uso. 10) Preparação de solução de estoque de IAA (1 mg/ml): 100 mg de IAA foram pesados e dissolvidos em 1 ml de hidróxido de potássio a1N por5 minutos, em seguida 10 ml de água destilada foi adi- cionado para dissolução completa.
A solução resultante foi trazida a 100 ml e armazenada a 4ºC para uso. 11) Preparação de solução de estoque de glicose (0,5 g/ml): 125 g de glicose foram pesados e dissolvidos com água destilada.
A solução resultante foi trazida a 250 ml, esterilizada e armazenada a 4ºC para uso. 12) Preparação de solução de estoque de AS: " 0,392g de AS foram pesados e dissolvidos com 10 ml! de DMSO.
A solução resultante foi dispensada em tubos de centrífuga de 1,5 ml e armazenada a 4ºCparauso. 13) Preparação de solução de estoque de hidróxido de potássio a 1N: 5,6 g de hidróxido de potássio foram pesados e dissolvidos com água destilada.
A solução resultante foi trazida a 100 ml e armazenada à oe 10 temperatura ambiente para uso. (3) Fórmulas de Meio de Cultura para Transformação Genética de Arroz 1) Indução de Meio de Cultura: : Solução-mãe N6max (usar o 10X concentrado preparado, o Don! mesmo abaixo) f Solução-mãe N6mix (usar o 100X concentrado preparado, o O mesmo abaixo) Solução de estoque de Fe?*EDTA (usar o 100X concentrado im! preparado, o mesmo abaixo) Solução de estoque de vitaminas (usar o 100X concentrado o preparado, o mesmo abaixo) om Solução de estoque de 2,4-D(usar a solução de estoque pre- 2,5m parada conforme descrito acima) Prolina 0,3g cH 0,69 Sacarose 309g Phytage! 39 Água destilada foi adicionada a um volume de 900 ml, e o valor dopHfoiajustado a 5,9 com hidróxido de potássio a 1 N.
A mistura resultante foi fervida e trazida a 1000 ml.
O meio resultante foi dispensado em frascos Erlenmeyer de 50 ml (25 ml/frasco), e os frascos foram vedados e esterili-
zados usando-se métodos convencionais (por exemplo, esterilizados a 121ºC por 25 minutos.
O método de esterilização para o seguinte meio foi o mesmo : conforme aquele deste meio). 2) Meio de Cultura Secundário: ' Solução-mãe DN6max (10X) 100 ml Solução-mãe N6mix (100X) 10ml Solução de estoque de Fe?*EDTA (100X) 10m Solução de estoque de vitaminas (100X) 10ml Solução de estoque de 2,4-D 2.0ml o Prolina 0,59 cH 0.69 Sacarose 309 ; Phytagel 39 Água destilada foi adicionada a um volume de 900 ml, e o valor í do pH foi ajustado a 5,9 com hidróxido de potássio a 1 N.
A mistura resultante foi fervida e trazida a 1000 ml.
O meio resultante foi dispensado em frascos Erlenmeyer de 59 ml (25 ml/frasco), e os fracos foram vedados e esteriliza- dos conforme acima. 3)Meiode Pré-cultura: oe Solução-mãe N6max (10X) 12,5ml Solução-mãe N6mix (100X) 1,25 ml Solução de estoque de Fe?*EDTA (100X) 2,5ml Solução de estoque de vitaminas (100X) 2,5ml Solução de estoque 2,4-D 0,75 ml cH 0,159 Sacarose 59 Agarose 1,759 Água destilada foi adicionada a um volume de 250 ml, e o valor do pH foi ajustado a 5,6 com hidróxido de potássio a 1N.
O meio resultante foi vedado e esterilizado conforme acima.
Antes de uso, o meio foi aquecido para dissolver e 5 ml de solu- ção de estoque de glicose e 250 ul de solução de estoque de AS foram adi- - cionados.
O meio resultante foi dispensado nos pratos de cultura (25 mi/prato). h 5 d4)Meiode Cocultura: Solução-mãe N6max (10X) 12,5ml Solução-mãe N6mix (100X) 1,25 ml Solução de estoque de Fe?*EDTA (100X) 2,5 ml Solução de estoque de vitaminas (100X) 2,5ml o Solução de estoque de 2,4-D 0,75 ml cH 0,29 Sacarose 59 Pó agar 1,759 É Água destilada foi adicionada a um volume de 250 ml, e o valor " do pH foi ajustado a 5,6 com hidróxido de potássio a 1 N.
O meio resultante foi vedado e esterilizado conforme acima.
Ante do uso, o meio foi aquecido para dissolver e 5 ml de solução de estoque de glicose e 250 ul de solução de estoque de AS foram adicio- nados.
O meio resultante foi dispensado nos pratos de cultura (25 ml/prato). o 5) Meio de Suspensão: Solução-mãe N6max (10X) sm Solução-mãe N6mix (100X) 0,5 ml Solução de estoque de Fe?"EDTA(100X) 0,5 ml Solução de estoque de vitaminas (100X) 1ml Solução de estoque de 2,4-D 0,2m! cH 0,08 g Sacarose 29 Água destilada foi adicionada a um volume de 100 ml, e o valor do pH foi ajustado a 5,4. O meio resultante foi dispensado em dois frascos Erlenmeyer de 100 ml e os frascos foram vedados e esterilizados conforme acima.
Antes do uso, 1 m! de solução de estoque de glicose estéril e 100 . ul de solução de estoque de AS foram adicionados. 6) Meio Seletivo: i Solução-mãe N6max (10X) 25 ml Solução-mãe N6mix (100X) 25m Solução de estoque de Fe?* EDTA(100X) *2,5ml Solução de estoque de vitaminas (100X) 2,5ml Solução de estoque de 2,4-D 0,625 ml o cH 0,159 Sucrose 7,59 Pó agar 1,759 Água destilada foi adicionada a um volume de 250 ml, e o valor Í do pH foi ajustado a 6,0. O meio resultante foi vedado e esterilizado conforme - acima.
Ante do uso, o meio foi dissolvido e 250 ul de HN (50 mg/ml) e 4004! de CN (250 mg/ml) foram adicionados.
O meio resultante foi dispen- sado nos pratos de cultura (25 ml/prato). (Nota: para o primeiro meio seletivo, a concentração de ampicilina é 400 mg/L, e para o segundo meio seletivo oe mais tarde, a concentração de ampíicilina é 250 mg/L). 7) Meio de Pré-diferenciação: Solução-mãe N6max (10X) 25 ml Solução-mãe N6mix (100X) 2,5 ml Solução de estoque de Fe? EDTA(100X) 2,5ml Solução de estoque de vitaminas (100X) 2,5ml Solução de estoque de 6-BA 0,5 ml Solução de estoque de KT 0,5 ml Solução de estoque de NAA 50 ul Solução de estoque de IAA 50 ul cH 0,159
Sacarose 7,59 Pó agar 1,759 Í Água destilada foi adicionada a um volume de 250 ml, e o valor do pH foi ajustado a 5,9 com hidróxido de potássio a 1 N. O meio resultante ; foi vedado e esterilizado conforme acima. Ante do uso, o meio foi dissolvido e 250 ul! de HN (50 mg/ml) e 250ul de CN (250 mg/ml) foram adicionados. O meio resultante foi dispen- sado nos pratos de cultura (25 ml/prato). 8) Meio de Diferenciação: oe Solução-mãe N6max (10X) 100 ml! Solução-mãe N6mix (100X) 10ml Solução de estoque de Fe?** EDTA (100X) 10oml Solução de estoque de vitaminas (100X) 10ml fÊ Solução de estoque de 6-BA 2ml " Solução de estoque de KT 2ml Solução de estoque de NAA 0,2ml Solução de estoque de IAA o0,2ml cH 19 Sacarose 30g o Phytagel 39 Água destilada foi adicionada a um volume de 900 ml, e o valor do pH foi ajustado a 6,0 com hidróxido de potássio a 1 N.
A mistura resultante foi fervida e trazida a 1000 ml. O meio re- sultante foi dispensado em frascos Erlenmeyer de 50 mil (50 ml/frasco), e os frascos foram vedados e esterilizados conforme acima.
9) Meio de Enraizamento: Solução-mãe de MSmax (10X) 50 ml Solução-mãe de MSmix (100X) 5 ml Solução de estoque de Fe?* EDTA (100X) 5 ml Solução de estoque de vitaminas (100X) 5 ml
Sacarose 209 Phytagel 39 á Água destilada foi adicionada a um volume de 900 ml, e o valor do pH foi ajustado a 5,8 com hidróxido de potássio a 1 N. i A mistura resultante foi fervida e trazida a 1000 ml. O meio re- sultante foi dispensado em tubos de enraizamento (25 mi/tubo), e os tubos foram vedados e esterilizados conforme acima. (4) Etapas de Transformação Genética Mediada por Agrobacterium
3.1 Indução de Calo ) (1) Sementes de arroz maduras de Hejiang 19 e Mudanjiang 8 foram descascadas, e, em seguida, foram sucessivamente tratadas com 70% de álcoolpor1 minuto e desinfetadas na superfície com 0,15% de HgCl2 por minutos; : (2) As sementes foram lavadas com água esterilizada por 4-5 vezes; f (3) As sementes foram postas no meio de indução; 15 (4) O mio semeado foi colocado no escuro por 4 semanas em cultura a 25+1ºC.
3.2 Subcultura de Calo O calo embriogênico relativamente compacto e seco amarelo oe claro foi selecionado, posto no meio de cultura secundário, e cultivado no escuro por2 semanas a 25+1ºC.
3.3 Pré-cultura O calo embriônico compacto e relativamente seco foi selecionado, posto no meio de pré-cultura, e cultivado no escuro por 2 semanas a 25+1ºC.
3.4 Cultura de Agrobacterium (1) Agrobacterium EHA1OS (uma cepa de Agrobacterium publi- camente usada comercialmente disponível de Cambia Co.) foi pré-cultivada no meio de cultura LA com seleção de resistência correspondente (para a preparação de meio de cultura de LA, vide Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3º ed., (traduzido por Jin Dongyan et al.), Science Press, 2002, Beijing) a 28ºC por 2 dias;
(2) O Agrobacterium foi transferido para o meio de suspensão e cultivado n mesa de sacudimento a 28ºC por 2-3 horas. : 3.5 Infestação de Agrobacterium (1) O calo pré-cultivado foi transferido em uma garrafa esterili- ' 5 zada; (2) A suspensão de Agrobacterium foi ajustada para ODçoo 0,8-1,0; (3) O calo foi imerso na suspensão de Agrobacterium por 30 minutos; oe 10 (4) O calo foi transferido em um papel de filtro esterilizado e seco, e, em seguida, posto no meio de co-cultura por 3 dias de cultura a 19-20ºC.
3.6 Lavagem e Cultura Seletiva de Calo (1) O calo foi lavado com água esterilizada até nenhum Agro- bacterium ser observado; (2) O calo foi imerso em água esterilizada contendo 400 mg/L de . carbenicillin (CN) por 30 minutos; (3) O calo foi transferido em um papel de filtro esterilizado e seco; (4) O calo foi transferido no meio seletivo e seletivamente culti- vado por 2-3 vezes, 2 semanas por cada vez.
3.7 Diferenciação oe (1) O calo resistente obtido foi transferido para o meio de pré-diferenciação, e cultivado no escuro por 5-7 semanas; (2) O calo obtido a partir da cultura de pré-diferenciação foi transferido para o meio de diferenciação e cultivado a 26ºC sob luz. 48 Enraizamento (1) As raízes do calo gerada durante diferenciação foram corta- das; (2) O calo foi em seguida transferido para o meio de enraiza- mento, e cultivado a 26ºC sob luz por 2-3 semanas. 49Transplante O meio residual nas raízes do calo foi lavado, e as mudas com boas raízes foram transferidas para a estufa. A estufa foi mantida umedecida nos primeiros poucos dias. Transformação das variedades Japonica de Hejiang 19 e Mu- " danjiang 8 produziram a geração TO de plantas individuais transgênicas das duas variedades de recipiente. As plantas individuais transgênicas todas mostram as mudanças de fenótipo esperadas, isto é, diferenças de fenótipo similares àquelas de linhas quase isogênicas (figura 5a e figura Sb) e valores de fenótipo marcadamente mais altos no número de espiguetas por panícula, caracteres do ciclo vegetativo e altura da planta conforme comparado a con- troles (figura 5c e figura 5d). A geração T1 exibiu mudanças de traço similares oe 10 (tabela 4)e mostrou a proporção de segregação de um gene simples, indi- cando que estas plantas individuais transgênicas continham uma cópia sim- ples de gene Ghd7 (tabela 5) e que este gene pode ser usado para modificar variedades de arroz através de transformação genética. Tabela 3 Iniciadores da presente invenção usados na separação de gene “15 Ghd7 Nome do Iniciador de direto Iniciador reverso Tama- Tempe- Uso T iniciador — (5-3) (5-3) nho do ratura de produto — recozi- bp mento E e ea eae bao aaa Sae eee) Cexut-2? — gcaaggggatgtctaaanga — waatititgaccetogeatto — 950 55 classifi- cação de clone oe BAC Cexu7-B catacggatccageetetet ttgcaatgatgcgtaticac — 950 55 Classifi- cação de clone
BAC Ce- 950 55 Clasifi- atttgtgccatgagagagea ccccaaatatetitaeceact xu13-14 EIBODANSADAÇSS cação de clone
BAC cDNA caactigccctetetictictio — gateagteatatatagttagte — 1014 50 Separa- total ção de cDNA de compri- mento total
Tabela 4 Fenótipos das plantas individuais T transformadas com gene Ghd7 na presente invenção . Genótipo Número de Dias de se- Altura da Número de plantas in- meadura para planta(cm) espiguetas na á dividuais florescimento panícula — prin- examinadas cipal Mudanjiang 8 10 53,0+1,4 67,9+1,1 69,3+4,3 Mudanjiang 8 (+) 28 130,9+1,5 106,8+0,9 — 123,4+3,8 Mudanjiang 8(-) — 11 59,8+1,2 71,6+1,3 65,0+3,1 oe P=0,000000 P=0,000000 P=0,000000 Hejiang 19 10 52,8+0,7 60,7+0,7 53,3+3,9 Hejiang 19 (+) 25 104,341,7 101,341,2 — 161,7+8,3 Hejiang 19 (-) 10 50,8+1,5 60,7+0,7 55,54+2,1 i P=0,000000 P=0,000000 P=0,000000 : Nota: (+) e (-) suportam plantas individuais transgênicas positivas e negativas; os valores P representam os valores de probabilidade de diferenças nos traços entre plantas individuais de geração T1 positivas e negativas pelo teste t.
Tabela 5 Teste de proporção de segregação da geração T transgênica para oe Ghd7 Recipiente Número de plan" — Número de plan- valor de tas individuais tas individuais Chi-quadrado com duração com duração (3:1) posterior, alça posterior, alça grande e haste pequena e haste alta curta Moudanjian 8 36 111 0,0072 Hejiang 19 25 10 0,085 Exemplo 6: Estrutura de gene e prognóstico de função de Ghd7 (1) Análise de estrutura de gene de Ghd7 Após identificação da função do gene candidato usando plantas individuais transgênicas, o gene Ghd7 foi determinado para se localizar na região de 8.175 bp. Baseado na sequência de Ghd7, iniciadores 3º RACE E (GTCATATTGTGGGAGCACGT) e 5' RACE (ACCATCTCCTTGGGCATCGA) foram designados. Sequências 5- e 3'-terminal foram obtidas usando-se tecnologiade5' e3 RACE e cDNA de comprimento total foi, portanto, isolado. Um cDNA longo de 1.014 bp foi obtido, cuja sequência de nucleotídeo foi conforme mostrada em SEQ ID NO: 2. A sequência de cDNA do gene Ghd7 clonado da presente invenção se equipara bem com a região de 1.469 bp a
3.884 nesta região de 8.175 bp. Comparando-se a sequência do CDNA de e 10 comprimento total com a sequência genômica de 8.175 bp de Minghui 63, a estrutura de gene Ghd7 foi obtida conforme segue: gene Ghd7 foi 2.659 bp de comprimento a partir do códon de partida de transcrição para o códon de terminação, compreendendo 2 éxons e 1 íntron; o éxon de partida foi 444 bp de comprimento, o segundo éxon foi 327 bp de comprimento, e o íntron foi “15 1.647 bpde comprimento (figura 6). Portanto, a estrutura de leitura aberta de . gene Ghd7 foi 771 bp de comprimento e codifica 257 aminoácidos. A se- quência de gene Ghd7 foi conforme mostrada em SEQ ID NO: 1. (2) Prognóstico de função de Ghd7 A estrutura de proteína compreendendo 277 aminoácidos codifi- cada por gene Ghd7 foi submetida a pesquisa por BLASTp. Foi verificado oe que a região a partir da 189º aminoácido para o 233º aminoácido compre- ende um gene tendo identidade significante com o domínio de CCT conser- vado da proteina de CO em Arabidopsis (74%, 26-09) (Putterill et a/. 1995) e também tendo alta homologia a muitas proteínas associadas com a regula- ção de florescimento de planta, tal como controle de tempo de florescimento durante período de luz (Putterill et a/. 1995, Yano et al. 2000, Turner et al. 2005), florescimento de primavera de trigo (Yan et a/. 2004), relógio biológico (Strayer et al. 2000; Salome et al. 2006) e sinal de luz (Kaczorowski e Quail 2003). Contudo, Ghd7 não tem proteína de garra de zinco de caixa B, por- tanto, Ghd7 é um novo membro na família de gene tendo domínio de CCT. Exemplo 7: Determinação de variação de pares bases entre alelos de Ghd7 por alinhamento de sequência
1. Sequenciamento Quatro variedades de alça grande (Minghui 63, Teging, 93-11 e : HR5), duas variedades de alça pequena (Mudanjiang 8 e Hejiang 19) e duas variedades com fenótipos intermediários (Zhonghua 11 e Nipponbare) foram í 5 sequenciadas na região-alvo.
Os produtos que cobrem o 8.175 bp foram amplificados usando 3 pares de iniciadores de PCR e os produtos foram sequenciados usando 15 iniciadores (Tabela 6). A amplificação de PCR foi efetuada a partir do genoma destas variedades usando LA-Taq de alta fide- lidade (TakaRa Co., Japão). Em seguida, os produtos de PCR foram ligados oe 10 novetor pGEM-T usando kit pGEM-T Vector System (Promega Co., EUA) de acordo com a especificação do fabricante e foram transformados em E. coli DH10B (Invitrogen Co., EUA). Clones positivos foram obtidos por classifica- ção azul/branca e sequenciamento foi efetuado de ambas extremidades de cada subclone usando iniciadores universais T7-R e SP6-F (Shanghai San- “15 — gonBiological Engineering Technology e Services Co., Ltd., China) e Big Dye . Kit (Perkin Elmer Co., USA). Sequências contigs foram montadas usando-se software SEQUENCHER 4.1 (Gene Codes Corporation, USA). Tabela 6 Iniciadores auto-designados usados para alinhamento de sequência da presente invenção Nome do Iniciador direto Iniciador — re- Tama- Tempe- Uso iniciador (5-3) verso nho do ratura oe (5-3) produ- de | re- to cozi- oro E CDNAtotal — caactigccctetettcticito — gateagtcatatatagtiagig — 2659 50 Amplificação de compri- mento total CEXU1-2 Bcaagegeatgtetaancga — wnnutigacgtoggatto — DIO 55 Amplificação de região promotora CEXU3-4 tigcogaagaactggamcto — tigecganganctggancto — 950 55 Amplificação de região promtora
Continuação... Nome do Iniciador direto Iniciadorre- — Tama- “Tempe- Uso iniciador NOS nho do ratura . (5-3) produ- de re- (5-3) to* cozi- - mento XUECE- ttatccgttcatgtogateg . accgancicgamangcacac Iniciador de XUS5-6 sequencia- mento — in- terno - Iniciador de XUECE- catacggatccagectetet Ttgcantgatgogtaticas E eauonoa XU7-8 E o mento — in- terno CEXU3374 tagaacigcaaggagatgca Iniciador de sequencia- mento — in- terno É Cexue800 ctettettectettetectte Iniciador de sequencia- mento — in- terno CEXU4147 gloatatigteggagencet — wgancegencagangriagt — 1870 50 Amplificação de região 3-externa cexu4933 caaapttccacglatectet Iniciador de oe sequenci- mento — in- terno CEXU6105 glogetgetgccaatiatga Iniciador de sequenci- mento — in- terno - if ão CE atttgtgccatgagagagca — ccccaaatatetiteccact 950 S5 at XU13-14 3 externa * Os tamanhos de produtos de PCR foram determinados de acordo com a sequência de Nipponbare e eles devem variar dependendo das variedades.
2. Alinhamento de sequência
O alinhamento de sequência na região-alvo foi realizado entre quatro variedades de alça grande (Minghui 63, HR5, Teging e 93-11) e duas " variedades de alça pequena (Hejiang 19 e Mudanjiang 8). A informação de sequência de região de Ghd7 de 93-11 vem de contig AAAAO2021502.1 É 5 (informação disponível na NCBI website). O alinhamento de sequência foi realizado no software Vector NTI9 (InforMaxTM Co., EUA). A análise de se- quência verificou que variedades de alça grande todas tinham uma mutação de parada no 53º aminoácido no primeiro éxon (vide figura 7). É provável que esta mutação de parada anterior seja a mutação-chave que afeta a função do oe 10 gene.
Exemplo 7: Resposta de Ghd7 a regulação de período de luz Linhas de gene isogênicas de Ghd7 com antecedentes de Zhenshan 95 foram submetidas a tratamento de dia longo e de dia curto.
Foi verificado que, sob tratamento de dia longo, as plantas individuais de alelos “15 de Ghd7de Minghui63 tinham caracteres do ciclo vegetativo marcadamente . posteriores, altura da planta mais alta, número grande de espiguetas por pa- nícula e rendimento mais alto comparado com o alelotipo Zhenshan 94 (tipo deficiente de Ghd7). Contudo, sob tratamento de dia curto, não existe dife- rença entre os dois genotipos de linhas quase isogênicas (tabela 7). Sob condições de dia longo e dia curto, Minghui 63 e Zhenshan 97 (MM) foram oe extremamente significantemente diferentes nos três traços; enquanto Zhen- shan 97 e Zhenshan 97 (ZZ) foram significantemente diferentes em número de espiguetas por panícula e não foram significantemente diferentes em al- tura da planta e caracteres do ciclo vegetativo.
Obviamente, Ghd7 retardou oscaracteres do ciclo vegetativo sob condição de dia longo.
Tabela 7 Fenótipos de dois genotipos homozigotos de Ghd7 de linhas quase isogênicas sob condições de dia longo e dia curto Traços Trata- Zhenshan 97 Zhenshan 97Minghui 63 Zhenshan 97 mento (ZZ) (MM) Caracteres — Dia longo 62,5+1,1 63,8+1,0 90,3+1,9 90,8+2,2 do ciclo ve-Dia curto 63,1+1,3 64,8+2,2 75,3+1,8 68,1+2,7 getativo (Dia) Diferença -0,6 -1,0 15,0** 22,7”
Altura daDia longo 78,2+2,3 74,34+3,6 102,4+2,7 105,3+5,1 planta (cm) Dia curto 75,3 71,33,1 86,7+2,1 80,5+4,1 - Diferença 2,9 3,0 15,7** 24,8" Número — deDia longo 88,7+4,4 86,7+5,3 155,4+7,8 152,6t5,7 espiguetas — Dia curto 80,4+5,3 78,5+5,0 96,1+4,8 84,9+7,0 por panícula Diferença 8,3* 8,2* 59,3** 67,7* Zhenshan 97 (ZZ) e Zhenshan 97 (MM) representam linhas quase isogênicas com antecedente de Zhenshan 97, respectivamente; * e ** representa dife- rença significante a nível de 5% e 1%, respectivamente. o o
Claims (10)
1. Planta transformada compreendendo uma construção de DNA E: recombinante compreendendo um promotor funcional em uma célula de planta posicionada para proporcionar expressão de um polinucleotídeo tendo q 5 uma sequência com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% de identidade para a região de codificação da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:1, ou para um fragmento funcionalmente ativo da mesma.
2. Planta transformada compreendendo uma construção de DNA recombinante compreendendo um promotor funcional em uma célula de e 10 planta posicionada para proporcionar expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptíeo pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% idêntico à sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO:1.
3. Planta transformada, de acordo com a reivindicação 2, em que referida sequência de polipeptídeo compreende um domínio de CCT.
4. Planta transformada, de acordo com a reivindicação 1, 2, ou 3, i em que referida planta é uma colheita de planta.
5. Planta transformada, de acordo com a reivindicação 1, 2, ou 3, em que a referida planta transgênica tem um traço alterado conforme comparado a uma planta não-transformada ou a uma planta tipo selvagem.
6. Planta transformada, de acordo com a reivindicação 5, em que oe referido traço alterado é selecionado a partir do grupo consistindo em: caracteres do ciclo vegetativo retardados, altura de planta aumentada, número aumentado de espiguetas por panícula e rendimento aumentado.
7. Planta transformada, de acordo com a reivindicação 6, em que areferida planta é uma planta de colheita.
8. Método de produção de uma célula de planta transformada tendo um traço alterado, em que o referido método compreende transformar uma célula de planta com uma construção recombinante compreendendo um promotor funcional em uma célula de planta posicionada para proporcionar expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo útil para retardo da caracteres do ciclo vegetativo, aumento da altura de planta, aumento do número de espiguetas por panícula e aumento do rendimento,
em que o referido polinucleotíideo tem uma sequência com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% de identidade para a região de & codificação da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:1 ou para um fragmento funcionalmente ativo da mesma.
9. Método de produção de uma planta transformada tendo um traço alterado, em que o referido método compreende transformar uma planta com uma construção recombinante compreendendo um promotor funcional em uma célula de planta posicionada para proporcionar expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo útil para retardo de o 10 caracteres do ciclo vegetativo, aumento da altura de planta, aumento do número de espiguetas por panícula e aumento do rendimento, em que o referido polipeptídeo é pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% idêntico à sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO:2.
10. Método, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, em que a “15 referida planta transformada é uma planta de colheita. o
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