BRPI0803481A2 - process of obtaining xylitol from xylose by enzymatic bioconversion in membrane reactor - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
A presente invenção refere-se ao método de obtenção de xilitol a partir da bioconversão multienzimática da xilose com utilização de enzimas, por exemplo, xilose redutase (XR) e glicose 6-fosfato desidrogenase (G6PDH) em um reator com membrana de ultrafiltração. Adicionalmente, o presente pedido ainda provê os usos do xilitol resultante do dito processo em indústrias alimentícia, odontológica e farmacêutica.The present invention relates to the method of obtaining xylitol from multienzyme bioconversion of xylose using enzymes, for example xylose reductase (XR) and glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) in an ultrafiltration membrane reactor. Additionally, the present application further provides the uses of xylitol resulting from said process in the food, dental and pharmaceutical industries.
Description
"PROCESSO DE OBTENÇÃO DE XILITOL A PARTIR DA itii^JSEATRAVÉS DE BIOCONVERSÃO ENZIMÁTICA EM REATOR COMMEMBRANA""XYLITOL OBTAINING PROCESS FROM ITII ^ JSEATURE BY ENZYMATIC BIOCONVERSION IN COMMEMBRANE REACTOR"
Campo da InvençãoField of the Invention
A presente invenção refere-se ao método de obtenção dexilitol a partir da bioconversão multienzimática da xilose com utilizaçãode enzimas, por exemplo, xilose redutase (XR) e glicose 6-fosfatodesidrogenase (G6PDH) em um reator com membrana de ultrafiltração.Adicionalmente, o presente pedido ainda prove os usos do xilitolresultante do dito processo em indústrias alimentícia, odontológica efarmacêutica.The present invention relates to the method of obtaining dexylitol from multienzyme xylose bioconversion using enzymes, for example xylose reductase (XR) and glucose 6-phosphatodehydrogenase (G6PDH) in an ultrafiltration membrane reactor. The application also proves the uses of xylitol resulting from this process in the food, dental and pharmaceutical industries.
Antecedentes da InvençãoBackground of the Invention
As bioconversões são reações químicas catalisadas porenzimas, células ou organelas celulares e executadas em meio com altaou baixa atividade de água, vêm apresentando interesse crescente nasíntese orgânica.Bioconversions are chemical reactions catalyzed by enzymes, cells or cell organelles and performed in medium with high or low water activity, have shown increasing interest in organic synthesis.
O sucesso da biocatálise se deve ao fato da transformaçãopoder ser rigorosamente controlada e conduzida de modo contínuo sobcondições brandas de pH e temperatura, favorecendo a manipulação desubstâncias sensíveis a condições extremas de processo. Associam-se,também, a alta seletividade (do ponto de vista químico, daregiosseletividade e enantiosseletividade), a formação de efluentesmenos tóxicos e facilmente tratáveis e a possibilidade de se executaremreações simultâneas. A disponibilidade de biocatalisadores temaumentado em decorrência dos avanços da biotecnologia (novastécnicas de cultivo celular, isolamento e manipulação genética:cruzamentos, mutações, DNA recombinante, hibridoma), resultando emaumento do número de aplicações em processos industriais, porexemplo, a conversão da insulina suína em humana, a produção deaspartame, acrilamida e penicilinas semi-sintéticas.The success of biocatalysis is due to the fact that the transformation can be strictly controlled and continuously conducted under mild pH and temperature conditions, favoring the handling of sensitive substances to extreme process conditions. They are also associated with high selectivity (chemically, darioselectivity and enantioselectivity), the formation of toxic and easily treatable effluents and the possibility of performing simultaneous reactions. The availability of biocatalysts has increased due to advances in biotechnology (new cell culture techniques, isolation and genetic manipulation: crosses, mutations, recombinant DNA, hybridoma), resulting in an increase in the number of applications in industrial processes, for example, the conversion of swine insulin into production of deaspartame, acrylamide and semi-synthetic penicillins.
Outro aspecto é a competição vantajosa da biocatálise,quando possível de ser aplicada, frente aos processos tradicionais deextração (fortemente dependente da disponibilidade da matéria-prima ebaixo rendimento em produto final), fermentação (só é econômica,quando se operam grandes volumes) e de síntese química (maispoluente, maior consumo de energia, menos enantiosseletiva).Another aspect is the advantageous competition of biocatalysis, when applicable, when compared to traditional extraction processes (strongly dependent on the availability of the raw material and low yield in the final product), fermentation (only economical when operating large volumes) and chemical synthesis (more polluting, higher energy consumption, less enantioselective).
A eficiência da biocatálise depende do binômiobiocatalisador/biorreator.The efficiency of biocatalysis depends on the binomial catalyst / bioreactor.
Os biorreatores são equipamentos nos quais os agentes denatureza biológica (células, enzimas, organelas celulares ou anticorpos)são utilizados para transformar um dado substrato em produto. Emtermos operacionais o biorreator pode ser do tipo descontínuo oucontínuo.Bioreactors are equipment in which biological agents (cells, enzymes, cell organelles or antibodies) are used to transform a given substrate into a product. In operational terms the bioreactor can be of the batch or continuous type.
O biorreator descontínuo, no qual o tempo de residência éigual para reagentes, produtos e catalisador, é preferido nos casos emque o biocatalisador é barato, não requer co-fator ou possui meia-vidacurta. Apesar de ser o tipo mais simples para operar e modelar tem oinconveniente de dificultar ou até mesmo impossibilitar a recuperaçãodo biocatalisador no final do processo. No caso do biocatalisador sersolúvel, uma enzima, por exemplo, dever-se-ia adaptar na linha desaída uma unidade de ultrafiltração, a qual permitiria recuperá-lo ereciclá-lo no processo. Por outro lado, se o biocatalisador é suscetível àinibição por substrato, passa a ser recomendável o emprego do processodescontínuo-alimentado, porque ao se adicionar o substratopaulatinamente ter-se-ia a possibilidade de manter sua concentraçãoabaixo do limite inibitório.The batch bioreactor, in which the residence time is equal for reagents, products and catalyst, is preferred in cases where the biocatalyst is inexpensive, does not require cofactor or has half life. Despite being the simplest type to operate and model, it has the drawback of making it difficult or even impossible to recover the biocatalyst at the end of the process. In the case of the soluble biocatalyst, an enzyme, for example, would have to fit an ultrafiltration unit onto the output line, which would allow it to be recovered and recycled in the process. On the other hand, if the biocatalyst is susceptible to substrate inhibition, the use of the continuous-fed process is recommended, because by adding the substrate, one would have the possibility of maintaining its concentration below the inhibitory limit.
O biorreator contínuo surgiu como uma extensão aplicativada técnica de imobilização de biocatalisadores, introduzida efetivamenteno início da década de setenta. Com o biocatalisador ligado por métodofísico ou químico em matrizes inertes e insolúveis foi possível operarbiorreatores contínuos com diferentes configurações, a saber, colunascom o material imobilizado empacotado (reator de fluxo pistonado) oumantido suspenso em meio líquido através da alimentação da soluçãosubstrato sob pressão gerada por bomba peristáltica (reator de leitofluidizado).The continuous bioreactor emerged as an extension applied biocatalyst immobilization technique, introduced effectively in the early seventies. With the biocatalyst bound by the physical or chemical method in inert and insoluble matrices it was possible to operate continuous bioreactors with different configurations, namely columns with the immobilized packed material (piston flow reactor) or suspended in liquid medium by feeding the pump-generated substrate under pressure solution. peristaltic (leitofluidized reactor).
Uma variante para manter o biocatalisador imobilizado emsuspensão é o biorreator de tanque continuamente agitado (CSTR), cujaconfiguração básica seria a de um reator descontínuo, ao qual seadaptou um sistema contínuo de introdução e de retirada de material.Os biorreatores dos tipos leito fluidizado e tanque continuamenteagitado não possuem problemas relacionados ao estabelecimento degradientes radiais ou axiais de pH, temperatura e concentrações desubstrato e produto.A variant for keeping the biocatalyst immobilized in its suspension is the continuously stirred tank bioreactor (CSTR), whose basic configuration would be that of a batch reactor, which has been adapted to a continuous material introduction and withdrawal system. Fluid bed and tank bioreactors continuously agitated have no problems related to the establishment of radial or axial degradants of pH, temperature and undubstrate and product concentrations.
Em geral, o biorreator tipo tanque continuamente agitadoacaba sendo a primeira escolha para o desenvolvimento de um novoprocesso, porque possui grande flexibilidade operacional (por exemplo,pode-se trabalhar com um amplo intervalo de velocidades de agitação) ede utilização (não é desenhado para um processo em particular,podendo, inclusive, ser usado na configuração descontínua).In general, the continuously agitated tank bioreactor was the first choice for the development of a new process because it has great operational flexibility (for example, it can work with a wide range of stirring speeds) and use (not designed for a particular process and may even be used in the batch configuration).
No contexto dos biorreatores contínuos, o biorreator commembrana (BM), pode ser configurado de dois modos distintos, talcomo, um reator continuamente agitado (CSTR) ao qual se acopla umamembrana ou um recipiente cilíndrico desprovido de sistema deagitação contendo grande número de membranas de filtração tangencialdo tipo fibra oca dispostas em um arranjo tipo feixe. Este último tipo deBM é conhecido pelo nome "hollow-fiber reactor" (HFR).In the context of continuous bioreactors, the commemorative bioreactor (BM) can be configured in two distinct ways, such as a continuously stirred reactor (CSTR) to which a membrane or a stirring-free cylindrical vessel containing a large number of filtration membranes is coupled. hollow fiber type tangentials arranged in a beam type arrangement. This latter type of BM is known by the name "hollow-fiber reactor" (HFR).
Segundo GIORNO e DRIOLI, (GIORNO, L., & DRIOLI, E.(2000). Biocatalytic membrane reactors: Applications and perspectives.Trends in Biotechnology, 18(8), 339-349) em um biorreator commembrana, que não o HFR, o arranjo biocatalisador/membrana podeser de dois tipos. Em um deles o biocatalisador não está ligado àmembrana, a qual, neste caso, atua como uma unidade de separação,impedindo o escape do biocatalisador no permeado. No outro tipo, obiocatalisador encontra-se unido à membrana, a qual atua tanto comosítio de catalise quanto como unidade de separação. Quando não háinteração entre o biocatalisador e a membrana, têm-se as situações emque a membrana está em um módulo acoplado em série ao biorreator(caso de um CSTR típico), sendo o biocatalisador impelido e removidocontinuamente de sua superfície (caso em que o biocatalisador éreciclado ao CSTR) ou o biocatalisador é confinado dentro do módulocom a membrana (caso em que não há reciclo do biocatalisador).According to GIORNO and DRIOLI, (GIORNO, L., & DRIOLI, E. (2000). Biocatalytic membrane reactors: Applications and perspectives.Trends in Biotechnology, 18 (8), 339-349) in a commemorative bioreactor other than HFR , the biocatalyst / membrane arrangement can be of two types. In one of them the biocatalyst is not bound to the membrane, which in this case acts as a separation unit, preventing the escape of the biocatalyst in the permeate. In the other type, the catalyst is attached to the membrane, which acts as both catalyst catalyst and separation unit. When there is no interaction between the biocatalyst and the membrane, there are situations where the membrane is in a module coupled in series with the bioreactor (case of a typical CSTR), and the biocatalyst is propelled and continuously removed from its surface (in which case the biocatalyst is recycled to the CSTR) or the biocatalyst is confined within the membrane module (in which case there is no recycling of the biocatalyst).
Existe, ainda, o arranjo em que o CSTR tem umamembrana como integrante de sua base (nesta configuração o sistemafunciona como CSTR e módulo de separação simultaneamente, sem anecessidade de reciclo). Quando existe união entre o biocatalisador e amembrana, pode-se ter o biocatalisador aprisionado na membrana,depositado na forma de gel sobre a superfície da membrana ou ligadoatravés de interação química (adsorção, ligação iônica ou ligaçãocovalente). Para este caso, pode-se, também, dispor de um únicosistema CSTR/módulo de separação.There is also the arrangement in which the CSTR has a membrane as part of its base (in this configuration the system works as CSTR and separation module simultaneously, without the need for recycling). When there is a union between the biocatalyst and the membrane, one may have the biocatalyst trapped in the membrane, deposited as a gel on the membrane surface or bonded through chemical interaction (adsorption, ionic bonding or covalent bonding). For this case, you can also have a single CSTR system / separation module.
Os biorreatores com membrana aparecem como alternativaviável aos reatores tradicionais de enzimas imobilizadas (leito fixo,CSTR-Tradicional, leito fluidizado), já que o biocatalisador não precisaestar necessariamente ligado a um suporte insolúvel. Neste últimoaspecto, diferencia-se do reator agitado tradicional (CSTR-TRAD),embora mantenha todos os atributos favoráveis deste tipo de reatorcontínuo. Lembra-se que o BM, em princípio, permite integrar em umaúnica etapa a conversão catalítica, a separação /concentração doproduto e a recuperação do biocatalisador. Estes aspectos podempromover significativa produtividade e redução de custos por ocasião daampliação de escala. O BM apresenta as seguintes vantagens: catalisehomogênea, ausência de limitações difusionais, estéricas econformacionais, alta atividade por unidade de volume, possibilidade dese trabalhar em condições assépticas, produtividade constantegarantida pela constância da dosagem da enzima e possibilidade de usode sistemas multienzimáticos.Membrane bioreactors appear as a viable alternative to traditional immobilized enzyme reactors (fixed bed, CSTR-Traditional, fluidized bed), as the biocatalyst need not necessarily be attached to an insoluble support. In this last aspect, it differs from the traditional stirred reactor (CSTR-TRAD), although it maintains all the favorable attributes of this type of continuous reactor. It is recalled that the BM, in principle, allows to integrate in one step the catalytic conversion, the separation / concentration of the product and the recovery of the biocatalyst. These aspects can promote significant productivity and cost savings when scaling up. The BM has the following advantages: catalytic homogeneity, absence of diffusional limitations, steric and conformational, high activity per unit volume, possibility of working under aseptic conditions, constant productivity guaranteed by the constant dosage of the enzyme and the possibility of using multienzyme systems.
Os primeiros estudos sobre os biorreatores com membranativeram início em 1970, resumindo-se na tentativa de hidrolisar o amidoà glicose, usando a-amilase retida em um sistema de filtraçãoconvencional. O principal problema observado relacionou-se àconcentração de polarização da membrana, acarretando diminuição dofluxo ao longo do tempo e perda da enzima. O BM só começou a setornar viável após os avanços ocorridos na tecnologia de membranas, asquais passaram a ser produzidas com espessura adequada, diâmetro eformato dos poros uniformes (microfiltração: 0,1 - 0,5(j.; ultrafiltração:0,001(i - 0,l[i; nanofiltração: menor que 2 nm), além das característicasquímicas definidas das mesmas (hidrofílicas, hidrofóbicas, neutras oucarregadas), as quais resultam da natureza dos materiais empregados,a saber, polímeros orgânicos (por exemplo, polisulfonas, celulose,acetato de celulose, politetrafluoretileno) e inorgânicos (representadosbasicamente pelas cerâmicas porosas).The first studies on membrane reactive bioreactors began in 1970, summarizing in an attempt to hydrolyze starch to glucose using retained α-amylase in a conventional filtration system. The main problem observed was related to membrane polarization concentration, resulting in decreased flow over time and loss of enzyme. BM only became viable after advances in membrane technology, which were produced with adequate thickness, uniform pore diameter and shape (microfiltration: 0.1 - 0.5 (j.; Ultrafiltration: 0.001 (i - 0.1 nanofiltration: less than 2 nm), in addition to their defined chemical characteristics (hydrophilic, hydrophobic, neutral or charged), which result from the nature of the materials employed, namely organic polymers (eg polysulfones, cellulose , cellulose acetate, polytetrafluoroethylene) and inorganic (basically represented by porous ceramics).
O BM configurado como CSTR é o mais usado, podendo-seidentificar estudos recentes preconizando sua aplicação na obtenção deciclodextrinas, frutoligossacarídeos, catecol, proteólise da caseína, dahemoglobina e síntese de ésteres.BM configured as CSTR is the most used, and recent studies can be identified recommending its application in obtaining decyclodextrins, fructoligosaccharides, catechol, casein proteolysis, dahemoglobin and ester synthesis.
Ainda, de acordo com GIORNO e DRIOLI, (GIORNO, L., &DRIOLI, E. (2000). Biocatalytic membrane reactors: Applications andperspectives. Trends in Biotechnology, 18(8), 339-349) identificou-se ouso do BM nos setores agro-alimentar (na hidrólise da pectina porpectinase em sucos de fruta, em enologia, na remoção da lactose dosoro e/ou leite integral e modificação de óleos e gorduras), químico-farmacêutico (dentre outros, citam-se a título de exemplos, asconversões do ácido fumárico e L-aspãrtico, respectivamente, em ácidoL-aspártico e L-alanina, a obtenção do ibuprofeno a partir de seu ciano-éster e a obtenção de oligonucleotídeos a partir de DNA) e biomédico(órgãos artificiais para uso extra-corpóreo).Also, according to GIORNO and DRIOLI, (GIORNO, L., & DRIOLI, E. (2000). Biocatalytic membrane reactors: Applications andperspectives. Trends in Biotechnology, 18 (8), 339-349) identified BM use in agri-food sectors (in the hydrolysis of pectin porpectinase in fruit juices, in oenology, in the removal of lactose from whey and / or whole milk and in the modification of oils and fats), chemist-pharmaceutical (among others, are cited as examples , conversions of fumaric acid and L-aspartic acid respectively into L-aspartic acid and L-alanine, obtaining ibuprofen from its cyano ester and obtaining oligonucleotides from DNA) and biomedical (artificial organs for extra use) -corporeal).
A versatilidade do BM se reflete no grande número deprocessos desenvolvidos até agora, para a obtenção dos mais variadosprodutos, tais como: hidrolisados de caseína e de hemoglobina,ciclodextrinas, frutooligossacarídeos, catecol e ésteres. Inclusive os BMestão sendo preconizados para uso no tratamento da água.O BM configurado desta maneira foi descrito na patenteamericana US 4.304.858, de propriedade da Degussa AG/GBF, visandoo seu uso industrial em processo contínuo para a produção de L-aminoácidos (metionina e valina), estando a aminoacilase retida emuma membrana de ultrafiltração.The versatility of BM is reflected in the large number of processes developed so far, to obtain the most varied products, such as casein and hemoglobin hydrolysates, cyclodextrins, fructooligosaccharides, catechol and esters. Even BM are being recommended for use in water treatment. The BM configured in this manner has been described in US Patent 4,304,858, owned by Degussa AG / GBF, for its continuous industrial use in the production of L-amino acids (methionine). and valine), the aminoacylase being retained in an ultrafiltration membrane.
O BM configurado como HFR mostrou-se útil no caso de seusar células íntegras (de origem animal ou microbiano) comobiocatalisadores. O HFR, atualmente, está sendo preconizado notratamento de águas residuais, usando o lodo ativado comobiocatalisador" ou, ainda, como simples sistema de microfiltração, bemcomo de ultrafiltração para a sanitização da água e quando combinadocom o tratamento biológico prévio da biomassa, a conjunção deste como uso da membrana mostrou-se muito mais eficiente.The HFR-configured BM proved to be useful in the case of its intact cells (animal or microbial origin) as microbiocatalysts. HFR is currently being advocated for wastewater treatment, using the biocatalyst-activated sludge "or even as a simple microfiltration system, as well as ultrafiltration for water sanitization and when combined with prior biological treatment of biomass, the conjunction of this as use of the membrane proved much more efficient.
Embora o transporte através da membrana possa se dar pordifusão (a separação se baseia, apenas, no gradiente de concentraçãoestabelecido entre as duas faces da membrana) ou por convecção(resultante do estabelecimento de um gradiente de pressão outemperatura através da membrana), os BM's mais usados, querequerem fluxos elevados, valem-se deste mecanismo de transporte.Although transport across the membrane may be by diffusion (separation is based only on the concentration gradient established between the two membrane faces) or by convection (resulting from the establishment of a temperature-pressure gradient across the membrane), used, wanting high flows, use this transport mechanism.
A direção do fluxo introduzido no BM e a travessia do fluidoatravés da membrana podem ser paralelos, ambos perpendiculares àsuperfície da membrana, ou perpendiculares entre si (o fluidoalimentado tangencia a superfície da membrana e a travessia se dáperpendicularmente à superfície da mesma). Este último padrão deoperação do BM é o mais indicado para evitar o fenômeno dapolarização da membrana. Caso se faça o reciclo do efluente, aeficiência do BM é, ainda, mais aumentada. Atualmente o custo dasmembranas não afeta substancialmente o custo global do reator,porque são bastante estáveis e podem ser regeneradas várias vezes. Porisso, ao invés de minimizar a área da membrana para um determinadofluxo, prefere-se fornecer área de membrana suficiente para otimizar otempo de operação de um BM.The direction of flow introduced into the BM and the fluid crossing through the membrane may be parallel, both perpendicular to the membrane surface, or perpendicular to each other (the fluid fed tangent to the membrane surface and the crossing is perpendicular to the membrane surface). This last pattern of BM operation is best indicated to avoid the phenomenon of membrane polarization. If the effluent is recycled, the BM's efficiency is even higher. Currently the cost of membranes does not substantially affect the overall cost of the reactor because they are very stable and can be regenerated several times. Therefore, rather than minimizing the membrane area for a given flow, it is preferred to provide sufficient membrane area to optimize the operating time of a BM.
Apesar da retenção de enzimas por membranas e aimobilização em suportes sólidos serem consideradas duas técnicasdistintas de retenção do biocatalisador, a linha divisória entre elas nãoé nítida, sobretudo quando se imagina a membrana como umasuperfície de imobilização, sendo o BM, neste caso, considerado comoum tipo especial de reator para enzimas imobilizadas.Although membrane retention of enzymes and mobilization on solid supports are considered two distinct techniques of biocatalyst retention, the dividing line between them is unclear, especially when imagining the membrane as an immobilization surface, in which case BM is considered as a type. special reactor for immobilized enzymes.
Finalmente, os biorreatores de membrana podem serutilizados em escala de laboratório para monitoramento contínuo daatividade de enzimas, avaliando-se a desativação por pH ou pelatemperatura em condições operacionais. Pode ser útil, também, naidentificação de mecanismos de inibição enzimática. Em escalaindustrial para recuperação e reutilização de biocatalisadores solúveis,na facilidade de separação dos produtos e como técnica de reator deenzimas imobilizadas com elevada área superficial.Finally, membrane bioreactors can be used on a laboratory scale for continuous monitoring of enzyme activity by assessing pH or temperature deactivation under operating conditions. It may also be useful in identifying enzymatic inhibition mechanisms. Industrial scale for the recovery and reuse of soluble biocatalysts, ease of separation of products and as a reactor technique immobilized enzymes with high surface area.
A xilose redutase (XR) de Cândida guilliermondii é umaaldo-ceto redutase com massa molar de 36 kDa, formada por umacadeia peptídica, requer o co-fator NADPH, pi 5,7, pHótimo 7,2, estávelem 5,5 < pH < 7,5, estável até 45°C, Km (xilose) 6,4xlO-2mM e Km(NADPH) 9,5xl0"3m. Apesar de estar sendo amplamente estudadarecentemente, inclusive com sua estrutura já estabelecida, ainda não éencontrada no comércio, devendo, por isso, ser obtida em laboratórioatravés do cultivo descontínuo da Cândida guilliermondii. Nesta linha,KITPREECHAVANICH e seus colaboradores (KITPREECHAVANICH, V.,HAYASHI, M., NISHIO, N., NAGAI, S. (1984). Conversion of D-xyloseinto xylitol by xylose reductase from Cândida pelliculosa coupled withthe oxireductase system of methanogen strain Hu. BiotechnologyLetters, 6(10), 651-656) reportou a produção de xilitol a partir de XR deCândida pelliculosa (usando células ou extrato livre de células) acopladoa um sistema de óxido-redução de Methanobacterium sp (NADP —>NADPH, sendo o H2 o doador de elétrons), usando uma proporção co-fator reduzido/xilose de 1/30 e NIDETZKY e seus colaboradores(NIDETZKY, B., NEUHAUSER, W., HALTRICH, D., KULBE, K.D. (1996).Continuous enzymatic production with simultaneous coenzymeregeneration in a charged membrane reactor. Biotechnology &Bioengineering, 52, 387-396) utilizou em reator descontínuo o sistemaacoplado xilose redutase/NADH//glicose desidrogenase/NAD, obtendo96% de conversão. Executando a reação de modo contínuo em reatorcom membrana, obtiveram produtividade de 80g de xilitol/L.dia, sem anecessidade de repor o co-fator por um período de 150 dias. Estesresultados depõem a favor da exploração de outros arranjos paraexecutar a bioconversão xilose/xilitol, como o uso de reator commembrana uni-modular (BMU), co-fator imobilizado e diferentesenzimas auxiliares.Candida guilliermondii xylose reductase (XR) is a 36 kDa molar mass aldo-keto reductase, formed by a peptide chain, requires the NADPH cofactor, pi 5.7, optimal pH 7.2, stable at 5.5 <pH < 7.5, stable up to 45 ° C, Km (xylose) 6.4x10-2mM and Km (NADPH) 9.5x10 "3m. Despite being widely studied, including its already established structure, it is not yet found in trade, therefore, it should be obtained in the laboratory through the discontinuous cultivation of Candida guilliermondii.In this line, KITPREECHAVANICH and his collaborators (KITPREECHAVANICH, V., HAYASHI, M., NISHIO, N., NAGAI, S. (1984). -xyloseinto xylitol by xylose reductase from Candida pelliculosa coupled with the oxireductase system of methanogen strain Hu. BiotechnologyLetters, 6 (10), 651-656) reported the production of xylitol from coupled pelliculous XR (using cells or cell free extract) oxide-reduction system of Methanobacterium sp ( NADP -> NADPH, where H2 is the electron donor), using a reduced cofactor / xylose ratio of 1/30 and NIDETZKY and his collaborators (NIDETZKY, B., NEUHAUSER, W., HALTRICH, D., KULBE, KD (1996) .Continuous enzymatic production with simultaneous coenzymeregeneration in a charged membrane reactor. Biotechnology & Bioengineering, 52, 387-396) used in a batch reactor the coupled xylose reductase / NADH // glucose dehydrogenase / NAD coupled system, obtaining 96% conversion. Running the reaction continuously in a membrane reactor yielded 80g of xylitol / L.day, with no need to replace the cofactor for a period of 150 days. These results favor the exploration of other arrangements to perform xylose / xylitol bioconversion, such as the use of uni-modular membrane reactor (BMU), immobilized cofactor and different auxiliary enzymes.
A enzima glicose-6-fosfato desidrogenase, G6PDH, (D-glicose-6-fosfato: NADP-oxidorredutase) é encontrada em célulasanimais, vegetais e microorganismos, podendo se destacar a leveduraSaccharomyces cereuisiae. A enzima é a primeira do processo oxidativoda via pentose-fosfato convertendo a glicose-6-fosfato a 6-fosfoglicono-ô-lactona, sendo classificada bioquimicamente como oxidorredutase.A G6PDH é de grande importância para a sobrevida dascélulas, uma vez que é responsável pela manutenção de um níveladequado da coenzima reduzida NADPH e participa da regulação dociclo das pentoses. A necessidade celular por G6PDH está relacionadaao fornecimento de NADPH e ribose-5-fosfato. O NADPH é usado embiossínteses redutoras, enquanto que a ribose-5-fosfato é usada nasíntese de DNA e RNA.The enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH, (D-glucose-6-phosphate: NADP-oxidoreductase) is found in animal cells, plants and microorganisms, especially Saccharomyces cereuisiae. The enzyme is the first in the oxidative process of the pentose-phosphate pathway converting glucose-6-phosphate to 6-phosphoglycono-β-lactone and is biochemically classified as oxidoreductase. G6PDH is of great importance for cell survival as it is responsible for maintaining an adequate level of reduced NADPH coenzyme and participating in the regulation of pentoses. The cellular need for G6PDH is related to the supply of NADPH and ribose-5-phosphate. NADPH is used for reducing embryosynthesis, while ribose-5-phosphate is used for DNA and RNA synthesis.
Na maioria dos microrganismos, a G6PDH apresenta umasubunidade com massa molar de 50-60 kDa, correspondendoaproximadamente a 500 aminoácidos. Esta enzima aparecenormalmente na forma de dímeros ou tetrâmeros, sendo que asG6PDHs provenientes de Leuconostoc mesenteroid.es e Saccharomycescerevisiae são dímeros. O pH ótimo de atividade da enzima é 7,8 e oponto isoelétrico é 4,6. A enzima nativa pura é estável durante muitassemanas tanto a 0°C como a 20°C. Pode, ainda ser mantida por muitashoras a 40°C, sem apreciável perda de atividade.In most microorganisms, G6PDH has a 50-60 kDa molar mass subunit, corresponding to approximately 500 amino acids. This enzyme appears usually in the form of dimers or tetramers, with asG6PDHs from Leuconostoc mesenteroids and Saccharomycescerevisiae being dimers. The optimal pH of enzyme activity is 7.8 and the isoelectric point is 4.6. The pure native enzyme is stable for many weeks at both 0 ° C and 20 ° C. It can still be kept for many hours at 40 ° C without appreciable loss of activity.
O mercado da enzima G6PDH movimentou 7 milhões dedólares no mercado mundial de kits, no ano de 1995, e foi a quartaenzima mais comercializada para esse fim. Esses kits podem serutilizados para medidas de teores de glicose, frutose, manose, ATP e deatividade enzimática de hexoquinase e creatino-quinase. Usando aG6PDH, é possível determinar glicose na presença de outros sacarídeos,como a frutose. Além disso, a G6PDH pode ser empregada para adeterminação de glicose em sistema de reator em fluxo contínuo, pois oNADPH formado pela reação enzimática pode ser facilmente detectadoespectrofotometricamente ou fluorimetricamente.Essa enzima pode ainda detectar baixíssimos níveis deestreptavidina e biotina por ensaios de bioluminescência em reações dehibridização de DNA, sem perda da atividade enzimática. Comobiossensor, a G6PDH pode monitorar rapidamente a concentração deG6P (glicose-6-fosfato) no sangue com menor custo e consumo de tempodo que os métodos tradicionais como cromatografia e espectroscopia.The G6PDH enzyme market moved 7 million dollars in the world kit market in 1995 and was the fourth most traded enzyme for this purpose. These kits can be used to measure glucose, fructose, mannose, ATP, and hexokinase and creatine kinase enzyme reactivity. Using aG6PDH, it is possible to determine glucose in the presence of other saccharides, such as fructose. In addition, G6PDH can be employed for glucose determination in a continuous-flow reactor system, as the NADPH formed by the enzymatic reaction can be easily detected spectrophotometrically or fluorimetrically. This enzyme can further detect very low levels of depteptavidin and biotin by bioluminescence assays in hybridization reactions. DNA without loss of enzymatic activity. As a microbiosensor, G6PDH can quickly monitor blood G6P (glucose-6-phosphate) concentrations at lower cost and time consumption than traditional methods such as chromatography and spectroscopy.
Esse monitoramento é importante porque ele pode refletir diretamente aatividade relativa da G6PDH na via metabólica e tem sido utilizado porpossibilitar o controle de G6PDH em eritrócitos humanos e em célulasde fígado de ratos.This monitoring is important because it can directly reflect the relative activity of G6PDH in the metabolic pathway and has been used to enable control of G6PDH in human erythrocytes and rat liver cells.
O xilitol é um poliol de massa molecular 125,15 g/mol(C5H12O5), índice de dulçor semelhante ao da sacarose, PF 92-96°C, PE216°C, hidrossolúvel (169g/100g H20 a 20°C), pH 5,0-7,0 (solução 5%p/v), densidade l,03g/mL (solução 10% p/v), viscosidade 1,23 cP(solução a 10% p/v), calor de dissolução -34,8 cal/g, valor calórico 4Kcal/g e estável nas condições usuais de processamento de alimentos.Xylitol is a polyol of molecular weight 125.15 g / mol (C5H12O5), sucrose-like sweetness index, mp 92-96 ° C, PE216 ° C, water soluble (169g / 100g H20 at 20 ° C), pH 5.0-7.0 (5% w / v solution), density 1.03g / mL (10% w / v solution), viscosity 1.23 cP (10% w / v solution), heat of dissolution - 34.8 cal / g, caloric value 4Kcal / g and stable under usual food processing conditions.
O xilitol é utilizado como componente de formulaçõesalimentícias, odontológicas e farmacêuticas. Em alimentos é usadocomo adoçante em produtos dietéticos (indicados para diabéticos,porque o metabolismo do xilitol independe da ação da insulina) e emconfeitos (balas "Smints®", chiclete "Trident®", por exemplo); emodontologia na formulação de cremes dentais pelas suas propriedadesnão cariogênica (os microrganismos bucais não o metabolizam), efeitorefrescante ao paladar (devido ao calor de dissolução ser endotérmico) epossível auxiliar na remineralização de lesões dentárias iniciais; emmedicamentos como coadjuvante (adoçante e/ou excipiente) deformulações.O xilitol ocorre naturalmente em pequenas quantidades emcertos frutos e vegetais, sendo sua extração a partir destas fonteseconomicamente inviável.Xylitol is used as a component of food, dental and pharmaceutical formulations. In foods it is used as a sweetener in diet products (indicated for diabetics, because xylitol metabolism is independent of insulin action) and in confectionery ("Smints®" candies, "Trident®" gum, for example); dentistry in the formulation of toothpastes for their non-cariogenic properties (oral microorganisms do not metabolize it), a cooling effect on the taste (due to the heat of dissolution being endothermic) and can assist in the remineralization of initial dental lesions; In drugs such as adjuvant (sweetener and / or excipient) deformulations. Xylitol occurs naturally in small quantities in certain fruits and vegetables, and its extraction from these sources economically unfeasible.
A xilose com alto grau de pureza, obtida pela hidrólise dahemicelulose de madeiras e purificação do hidrolisado por colunas detroca iônica e fracionamento cromatográfico, é convertida em xilitolatravés do processo de hidrogenação catalítica (pressão de 50 atm,temperatura entre 80-140°C e níquel como catalisador). Após ahidrogenação, o catalisador é removido empregando sucessivamente afiltração e a passagem por colunas de troca iônica. O efluente éconcentrado, passado em colunas contendo resinas catiônicas e no finalo xilitol é recuperado por cristalização fracionada. A principaldesvantagem desta via é o custo do xilitol obtido, já que é fortementeinfluenciado pela necessidade de se empregar xilose com alto grau depureza (não pode estar contaminada com galactose, arabinose emanose, açúcares normalmente presentes nos hidrolisados de madeira),a fim de otimizar o rendimento da hidrogenação catalítica. Além disso,durante a hidrogenação uma fração do xilitol pode ser convertida emxilulose, resultando na diminuição do rendimento da reação e devendoser removida para não contaminar o produto final. O tratamento dosresíduos resultantes é outro ponto a ser considerado.High purity xylose, obtained by hydrolysis of wood hemicellulose and purification of hydrolyzate by ionic column and chromatographic fractionation, is converted to xylitol through the catalytic hydrogenation process (pressure of 50 atm, temperature between 80-140 ° C and nickel). as a catalyst). After hydrogenation, the catalyst is removed by successively employing filtration and passage through ion exchange columns. The effluent is concentrated, passed on columns containing cationic resins and at the end xylitol is recovered by fractional crystallization. The main disadvantage of this pathway is the cost of the xylitol obtained, as it is strongly influenced by the need to use high purity xylose (cannot be contaminated with galactose, arabinose emanose, sugars normally present in wood hydrolysates) in order to optimize catalytic hydrogenation yield. In addition, during hydrogenation a fraction of xylitol can be converted to xylulose resulting in decreased reaction yield and should be removed to avoid contaminating the final product. The treatment of the resulting waste is another point to consider.
Uma outra via para a produção de xilitol é a conversãomicrobiológica da xilose, utilizando-se diferentes espécies de leveduras,dentre as quais a Cândida guilliermondii.Another pathway for xylitol production is the microbiological conversion of xylose using different yeast species, including Candida guilliermondii.
O processo fermentativo comparado ao da hidrogenaçãocatalítica tem a vantagem de não exigir xilose com alto grau de pureza.A levedura consegue metabolizar a xilose presente em hidrolisadoshemicelulósicos obtidos de diferentes fontes, inclusive de resíduosagroindustriais, tais como, bagaço de cana, palha de arroz e cavacos deeucalipto.The fermentative process compared to catalytic hydrogenation has the advantage that it does not require high purity xylose. Yeast can metabolize xylose present in hemicellulosic hydrolysates obtained from different sources, including agroindustrial residues such as sugarcane bagasse, rice straw and chips. Ducalyptus.
Outros aspectos atraentes da via microbiológica são asmenores gerações de resíduos agressivos ao meio ambiente, a plenadisponibilidade do substrato, condições operacionais mais brandas,menor consumo de energia no processo como um todo (o gasto maior deenergia ocorre na preparação do hidrolisado), menos etapas depurificação ("downstream") até o produto final (separação das células docaldo fermentado, concentração do caldo e cristalização do xilitol) e apresença de outros açúcares no hidrolisado não impedem a conversãoxilose/xilitol, inclusive alguns deles servem até de substrato para alevedura (por exemplo, a arabinose).Other attractive aspects of the microbiological pathway are fewer generations of environmentally aggressive waste, full substrate availability, milder operating conditions, lower energy consumption in the process as a whole (higher energy expenditure occurs in hydrolyzate preparation), fewer purification steps (downstream) to the final product (separation of fermented candy cells, broth concentration and xylitol crystallization) and the presence of other sugars in the hydrolyzate do not prevent conversion to xylose / xylitol, including some even as substrate for yeast (eg , arabinose).
A fermentação da xilose (presente no hidrolisadohemicelulósico) pela Cândida guilliermondii requer o controle de váriosparâmetros de processo, a saber, concentração inicial de xilose, pH,temperatura e suprimento de oxigênio. Nos hidrolisados provenientes deresíduos agrícolas encontram-se várias substâncias (glicose, fenóis,ácido acético, furfural, hidroximetilfurfural e arabinose, principalmente)que podem influir no crescimento e na produção de xilitol pela levedura.The fermentation of xylose (present in the hemicellulosic hydrolyzate) by Candida guilliermondii requires the control of several process parameters, namely initial xylose concentration, pH, temperature and oxygen supply. In hydrolysates from agricultural waste there are various substances (glucose, phenols, acetic acid, furfural, hydroxymethylfurfural and arabinose mainly) that can influence the growth and production of xylitol by yeast.
Porém, a maior parte dos contaminantes voláteis é removida pelaconcentração a vácuo do hidrolisado e a quantidade de ácido acéticomantida em nível não inibitório para o crescimento.However, most volatile contaminants are removed by vacuum concentration of the hydrolyzate and the amount of aceticomantide acid at non-inhibitory level for growth.
Em Cândida guilliermondii a xilose é isomerizada a xiluloseatravés das reações de redução e oxidação catalisadas pela açãoseqüencial da xilose redutase (enzima NAD(P)H-dependente) e da xilitoldesidrogenase (enzima NAD(P)-dependente), sendo o xilitol ummetabólito intermediário deste processo. Por conseguinte, para se tersucesso no aumento da formação de xilitol pela levedura, deve-sefavorecer a etapa redutora (xilose-->xilitol) frente à etapa oxidativa(xilitol —> xilulose). Isto só pode ser conseguido ou através de condiçõesde cultivo bem equilibradas ou pelo uso de levedura mutante (incapazde produzir a xilitol desidrogenase, sendo, portanto, xilulosedependente).In Candida guilliermondii xylose is isomerized to xylulosea through the reduction and oxidation reactions catalyzed by the sequential action of xylose reductase (NAD (P) H-dependent enzyme) and xylitoldeshydrogenase (NAD (P) -dependent enzyme), with xylitol of this intermediate metabolite. process. Therefore, in order to succeed in increasing xylitol formation by yeast, the reducing step (xylose -> xylitol) should be favored over the oxidative step (xylitol -> xylulose). This can only be achieved either by well-balanced cultivation conditions or by the use of mutant yeast (unable to produce xylitol dehydrogenase, and therefore xylulosedependent).
Até o momento, os esforços para otimizar a formação dexilitol por via microbiológica têm se concentrado no aperfeiçoamentodas condições de cultivo, sobretudo, em termos do fornecimento deoxigênio, que no caso da Cândida guilliermondii deve ser fornecido emquantidade controlada (0,6 wm). A influência do oxigênio nabioconversão xilose /xilitol está na dependência do estado óxido-redutivoda célula, representado, ao menos em parte, pelo balanço entre asconcentrações intracelulares de NADH e NAD e de NADPH e NADP (esteafetando diretamente a atividade da xilose redutase intracelular).So far, efforts to optimize microbial dexylitol formation have focused on improving cultivation conditions, especially in terms of oxygen supply, which in the case of Candida guilliermondii must be supplied in a controlled quantity (0.6 wm). The influence of oxygen on xylose / xylitol nabioconversion is dependent on the oxide-reductive state of the cell, represented at least in part by the balance between intracellular NADH and NADP and NADPH and NADP concentrations (directly affecting intracellular xylose reductase activity).
Exatamente a dificuldade em se controlar o metabolismo dalevedura, visando à formação otimizada do xilitol, muito dependente dosmecanismos de indução e repressão catabólica exercidos pelas oses,constitui-se no fator limitante da aplicação generalizada da viamicrobiológica. Apesar da ampla literatura existente sobre esta via deprodução de xilitol (cultivos descontínuo, descontínuo-alimentado econtínuo, executados em fermentadores com as mais diferentesconfigurações), ainda, a síntese química com todas as desvantagensapontadas é o processo preferido para a produção industrial desteproduto.Se por ura lado há dificuldades para a produção de xilitol,por outro a obtenção de biomassa não é problemática. Sendo a xiloseredutase uma enzima constitutiva, e, por conseguinte, a quantidadeformada ser função da biomassa produzida, então existe a possibilidadede extraí-la das células e utilizá-la em reator adequado para realizar abioconversão direta da xilose em xilitol.Exactly the difficulty in controlling the metabolism of yeast, aiming at the optimized formation of xylitol, very dependent on the mechanisms of induction and catabolic repression exerted by the oses, constitutes the limiting factor of the widespread application of viamicrobiological. Despite the extensive literature on this pathway of xylitol production (discontinuous, discontinuous-fed and continuous cultivation performed in fermenters with the most different configurations), chemical synthesis with all the disadvantages noted is still the preferred process for the industrial production of this product. On the one hand there are difficulties for xylitol production, on the other hand obtaining biomass is not problematic. Since xylosereductase is a constitutive enzyme, and therefore the amount formed is a function of the biomass produced, then it is possible to extract it from cells and use it in a suitable reactor to perform direct abioconversion of xylose to xylitol.
A bioconversão da xilose em xilitol em uma única etapacatalisada pela xilose redutase (XR) constitui-se em alternativa viávelpara as vias química e microbiológica. Esta perspectiva fundamenta-seno fato de poder ser conduzida sob condições operacionais brandas,não gerar resíduos poluentes e não apresentar os inconvenientes dalevedura, a saber, usar o xilitol como metabólito intermediário nasreações intracelulares, limitações na transferência de massa (osubstrato e o produto devem atravessar membranas) e susceptibilidadeaos contaminantes existentes no hidrolisado de resíduos vegetais,sobretudo o ácido acético.Bioconversion of xylose to xylitol in a single step catalyzed by xylose reductase (XR) is a viable alternative for the chemical and microbiological pathways. This perspective is based on the fact that it can be conducted under mild operating conditions, does not generate polluting residues and does not present the drawbacks of yeast, such as using xylitol as an intermediate metabolite in intracellular reactions, limitations in mass transfer (the substrate and the product must pass through). membranes) and susceptibility to contaminants in plant hydrolyzate, especially acetic acid.
No entanto, a XR de Cândida guilliermondii exige o NADPHcomo co-fator na redução da xilose a xilitol, o qual deve ser regeneradodurante a catalise, tanto para sustentar a reação (a formação de 1 molde xilitol requer 1 mol de NADPH) quanto evitar a sua perda, já que éum reagente de custo elevado. Quando se usa a levedura, a regeneraçãodo co-fator é garantida pelo metabolismo celular, mas no caso daenzima livre seu reciclo passa a ser um ponto crítico do processo. Paratanto, procura-se acoplar à reação que o oxida uma capaz de reduzi-lo.However, Candida guilliermondii XR requires NADPH as a cofactor in reducing xylose to xylitol, which must be regenerated during catalysis to either sustain the reaction (formation of 1 xylitol mold requires 1 mol of NADPH) and avoid loss as it is a high cost reagent. When yeast is used, cofactor regeneration is guaranteed by cellular metabolism, but in the case of free enzyme its recycling becomes a critical point in the process. Therefore, we seek to engage the reaction that oxidizes one capable of reducing it.
A patente espanhola ES 2.275.437 refere-se a um processode purificação de xilitol em meios fermentados (obtenção microbiológica)obtidos pela bioconversão de hidrolisados de massa vegetal.A patente européia EP 527.758 prove no uso da tecnologiade DNA-recombinante, em linhagens de leveduras, no processo deconversão de xilose em xilitol.Spanish patent ES 2,275,437 refers to a process of xylitol purification in fermented media (microbiological production) obtained by bioconversion of vegetable mass hydrolysates. European patent EP 527,758 provides for the use of recombinant DNA technology in yeast strains. , in the process of converting xylose to xylitol.
A patente européia EP 432.015 descreve um processo deseparação da xilose a partir de materiais lignocelulósicos por processoquímico e físico-químico combinados.European patent EP 432,015 describes a process for the removal of xylose from lignocellulosic materials by combined chemical and physicochemical processes.
A patente americana US 1.273.498 reivindica um processode fabricação de xilose e xilitol a partir de material hemicelulósico livrede lignina através da conversão de polissacarídeos em monossacarídeosatravés em processos fermantativos.U.S. Patent 1,273,498 claims a process for the manufacture of xylose and xylitol from lignin-free hemicellulosic material by converting polysaccharides to monosaccharides through fermantative processes.
O pedido de patente americano US 2005/0148055 trata deum método biotecnológico de produção de xilitol utilizandomicroorganismos capazes de metabolizar xilose em xilitol através daoxidação NADH por enzimas.US Patent Application US 2005/0148055 deals with a biotechnological method of xylitol production using microorganisms capable of metabolizing xylose to xylitol through NADH enzyme oxidation.
A patente americana US 5.081.026 refere-se a um métodode produção de xilitol a partir de materiais contendo xilose e/ou xilanoatravés de processo fermentativos.US 5,081,026 relates to a method of producing xylitol from xylose and / or xylan-containing materials through fermentative processes.
O pedido de patente americano US 2007/0072280 trata daconversão xilose/xilitol por processo fermentativo, utilizandomicrorganismos "engenheirados", como a Eschericchia coli.US patent application US 2007/0072280 deals with xylose / xylitol conversion by fermentative process using "engineered" microorganisms such as Eschericchia coli.
Diante de todo o exposto, a Depositante, de formainesperada, apresenta um processo de obtenção de xilitol por viamultienzimática que é um processo alternativo e inovador às viasquímicas e fermentativas presentes no estado da técnica.Given all of the above, the depositor, unexpectedly, presents a process of obtaining xylitol by multi-enzymatic pathway that is an alternative and innovative process to the chemical and fermentative pathways present in the state of the art.
Descrição das FigurasDescription of the Figures
A figura 1 mostra o gráfico da bioconversão da xilose emxilitol empregando ambas as enzimas no biorreator com membrana(membrana de ultrafiltração - corte molecular de 500Da ou 30kDa),sendo que ▲ [xilose] alimentada, mg/ml e ■ [xilose] consumida, mg/ml.Figure 1 shows the bioconversion graph of xylose emxylitol using both enzymes in the membrane bioreactor (ultrafiltration membrane - molecular cut of 500Da or 30kDa), with ▲ [xylose] fed, mg / ml and ■ [xylose] consumed, mg / ml.
A figura 2 representa o fluxograma para a bioconversão daxilose (1-substrato; 2-bomba pistonada/peristáltica; 3 - retentor debolhas; 4- pressurizador; 5-filtro estéril; 6-reator com membrana comagitador magnético; 7-coletor).Figure 2 represents the flowchart for the daxylose bioconversion (1-substrate; 2-piston / peristaltic pump; 3-leaf retainer; 4-pressurizer; 5-sterile filter; 6-reactor with magnetic comagitator membrane; 7-collector).
Descrição da InvençãoDescription of the Invention
A presente invenção refere-se ao método de obtenção dexilitol a partir da bioconversão multienzimática da xilose com utilizaçãode enzimas, por exemplo, xilose redutase (XR) e glicose 6-fosfatodesidrogenase (G6PDH) em um reator com membrana de ultrafiltração.Adicionalmente, o presente pedido ainda prove os usos do xilitolresultante do dito processo em indústrias alimentícia, odontológica efarmacêutica.The present invention relates to the method of obtaining dexylitol from multienzyme xylose bioconversion using enzymes, for example xylose reductase (XR) and glucose 6-phosphatodehydrogenase (G6PDH) in an ultrafiltration membrane reactor. The application also proves the uses of xylitol resulting from this process in the food, dental and pharmaceutical industries.
Considerando que as enzimas, devido às suas propriedadesinerentes, permitem a obtenção de alta percentagem de conversão emcondições brandas, o presente pedido tem como objetivo descrever aaplicação seqüencial e conjunta do sistema xilose redutase/glicose 6-fosfato desidrogenase sobre a xilose, utilizando-se reator commembrana (RM) operado de modo contínuo e em regime permanente.Considering that enzymes, due to their inherent properties, allow high conversion rates to be achieved in mild conditions, the present application aims to describe the sequential and joint application of the xylose reductase / glucose 6-phosphate dehydrogenase system on xylose using reactor. membrane (RM) operated continuously and permanently.
Em uma primeira realização o presente pedido prove ummétodo de obtenção de xilitol a partir da xilose através de processosdescontínuos e/ou contínuos.In a first embodiment the present application provides a method of obtaining xylitol from xylose by continuous and / or continuous processes.
Nos processos descontínuos e/ou contínuos de obtenção doxilitol, apresentados a seguir, utiliza-se o bioreator com membrana uni-modular (BMU) com membrana de corte molecular de 100-500 Da e/oude 10-30 kDa. O sistema é mantido pressurizado, a temperatura écontrolada pela circulação de água na jaqueta de revestimento, sendo aalimentação feita com bomba adequada (peristáltica e/ou pistonada). Afaixa de vazão específica de alimentação, definida como a razão entre avazão volumétrica de alimentação e o volume do reator, varia entre 0,1a 1 h-i.In the discontinuous and / or continuous processes of obtaining doxylitol, presented below, the uni-modular membrane bioreactor (BMU) with 100-500 Da and / or 10-30 kDa molecular cut-off membrane is used. The system is kept pressurized, the temperature is controlled by the circulation of water in the jacket, and the feed is made with a suitable pump (peristaltic and / or piston). Specific feed flow rate, defined as the ratio between volumetric feed volume and reactor volume, ranges from 0.1 to 1 h-i.
A obtenção de xilitol da presente invenção, no processodescontínuo, realiza-se pelo (a) emprego de uma solução aquosa(tampão fosfato ou tampão Tris-HCl - pH 4,5-8,5), (b) adição do co-fator(NADP e/ou NADPH) solúvel e/ou imobilizado, em quantidades quevariam de 0,1-100 mM, (c) adição das enzimas solúveis xilose redutase(1,0x10-3-1,OxlO5 -U/mL) e G6PDH (1-500 - U/mL), (d) incorporaçãodos substratos, xilose nas concentrações de 0,1-5,0:1000 m/v e D-glicose 6-fosfato em concentrações de 1-100:10000 m/v e (e) agitaçãoconstante de 50 a 500 rotação por minuto por 1 a lOh à temperatura de20a50°C.Xylitol of the present invention is obtained in the continuous process by (a) employing an aqueous solution (phosphate buffer or Tris-HCl buffer - pH 4.5-8.5), (b) adding the cofactor (NADP and / or NADPH) soluble and / or immobilized in amounts which would be 0.1-100 mM, (c) addition of soluble enzymes xylose reductase (1.0x10-3-1, Ox105 -U / mL) and G6PDH (1-500 - U / mL), (d) substrate incorporation, xylose at concentrations of 0.1-5.0: 1000 m / v and D-glucose 6-phosphate at concentrations of 1-100: 10000 m / v ( e) constant stirring at 50 to 500 rotation per minute for 1 to 10h at a temperature of 20 to 50 ° C.
Por outro lado, a obtenção do xilitol através do processocontínuo se dá pelas etapas de (a) emprego de solução aquosa (pH 4,5-8,5), (b) adição do co-fator (NADP e/ou NADPH) solúvel ou imobilizado,em quantidades que variam de 0,1 a lOOmM, (c) adição das enzimassolúveis xilose redutase (1,0x10-3-1,0x105 - U/mL) e G6PDH (1-500 -U/mL), (d) alimentação com a solução de substratos, xilose nasconcentrações de 0,1-5,0:1000 m/v e D-glicose 6-fosfato emconcentrações de 1-10:10000 m/v e (e) agitação constante de 50 a 500rotação por minuto por pelo menos 12 a 720hs à temperatura de 20 a50°C.On the other hand, xylitol is obtained by continuous process through the steps of (a) use of aqueous solution (pH 4.5-8.5), (b) addition of soluble cofactor (NADP and / or NADPH) or immobilized in amounts ranging from 0.1 to 100mM, (c) addition of the soluble enzymes xylose reductase (1.0x10-3-1.0x105 - U / mL) and G6PDH (1-500 -U / mL), ( d) substrate solution feed, xylose at concentrations of 0.1-5.0: 1000 m / v and D-glucose 6-phosphate at concentrations of 1-10: 10000 m / v (e) constant agitation at 50 to 500rpm. minute for at least 12 to 720 hours at a temperature of 20 to 50 ° C.
Em meio ao processo de obtenção de xilitol, do presentepedido, a regeneração do NADPH consumido pela XR é realizada pelautilização da glicose 6-fosfato desidrogenase (G6PDH) como enzimaauxiliar. As razões para a escolha da G6PDH são seu amplo uso comoreagente analítico, atividade catalítica de fácil medição, apresentar altaatividade em pH 7 a 8 (mesma faixa que a requerida pela XR), requerero NADP como co-fator, não ser inibida pela xilose e xilitol e serfacilmente obtida.Amid the process of obtaining xylitol from the present application, the regeneration of NADPH consumed by XR is accomplished by the use of glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) as auxiliary enzyme. The reasons for choosing G6PDH are its wide use as analytical agent, easy-to-measure catalytic activity, high activity at pH 7 to 8 (same range as required by XR), requiring NADP as a cofactor, not being inhibited by xylose and xylitol is easily obtained.
A regeneração demonstrada no presente pedido resulta nabioconversão NADPH/XR//G6PDH/NADP em reator com membranauni-modular (BMU). Alternativamente as enzimas podem ser utilizadasna forma solúvel, desde que a membrana tenha corte molecular máximode 30 kDa (massas molares da XR e G6PDH da ordem de 36-40 kDa e100-120 kDa, respectivamente). O não desprendimento do co-fator dossuportes permite o uso da membrana de ultrafiltração de 30 kDa.The regeneration demonstrated in this application results in NADPH / XR // G6PDH / NADP nabioconversion in a single-membrane membrane reactor (BMU). Alternatively the enzymes may be used in soluble form as long as the membrane has a maximum molecular cross-section of 30 kDa (XR and G6PDH molar masses on the order of 36-40 kDa and 100-120 kDa, respectively). The non detachment of the carrier cofactor allows the use of the 30 kDa ultrafiltration membrane.
A regeneração é enfrentada pelo uso combinado dasenzimas XR e G6PDH, enquanto que a retenção do co-fator é realizadapor imobilização (ligação do NADPH a um suporte inerte) ou pelo uso demembrana com corte molecular máximo de 500 Da (sendo a massamolar do NADPH de 760 Da).Regeneration is faced by the combined use of the XR and G6PDH enzymes, while cofactor retention is accomplished by immobilization (binding of NADPH to an inert support) or by the use of a maximum molecular weight cutoff of 500 Da (NADPH massamolar of 760 Da).
Em particular, a presente invenção pleiteia a bioconversãoda xilose em xilitol através da ação conjunta da XR e G6PDH comregeneração simultânea do NADPH em reator com membrana uni-modular utilizando as enzimas na forma solúvel e o co-fator na formasolúvel e/ou imobilizada em resina trocadora de ânions (copolímero depoli(estireno-divinilbenzeno)).In particular, the present invention advocates xylose xylose bioconversion by the joint action of XR and G6PDH with simultaneous regeneration of NADPH into uni-modular membrane reactor using soluble and / or resin-immobilized cofactor enzymes anion exchanger (depoli copolymer (styrene divinylbenzene)).
ExemploO processo de obtenção de xilitol a partir de xilose, de formageral, se dá pelo preparo de seus substratos para posterior inserção aobioreator através das seguintes etapas:Example The process for obtaining xylitol from xylose, from formageral, is by preparing its substrates for later insertion into the upper reactor through the following steps:
Obtenção de BiomassaBiomass Obtainment
A Cândida guilliermondii FTI 20037 foi cultivada porprocesso descontínuo durante 24h em meio contendo 50 g/L de xilose,2,0 g/L de (NH4)2S04, 0,01 g/L de CaCl2.2H20 e 20 g/L de solução deextrato de farelo de arroz. A seguir, as células foram separadas porcentrifugação (2000xg; 15 min). Após lavagem com água destilada ecentrifugada, as células foram recolhidas para posterior rompimento.Candida guilliermondii FTI 20037 was cultivated by batch for 24h in medium containing 50 g / l xylose, 2.0 g / l (NH4) 2 SO4, 0.01 g / l CaCl2.2H20 and 20 g / l solution of rice bran extract. Next, the cells were separated by centrifugation (2000xg; 15 min). After washing with distilled water and centrifuged, the cells were harvested for further disruption.
Rompimento das Células (Ultrassom ou por Pérolas de Vidro)Cell Disruption (Ultrasound or Glass Pearls)
Por ultrassom, as células foram ressuspendidas em tampãofosfato de potássio (5mM, pH 7,0), adicionado de lmL de uma soluçãode inibidores de protease (2mM de ácido aminocapróico, lOmM de (3-mercaptoetanol, lmM fenil-metil-sulfonil-fluoride e 0,2mM de EDTA) ede 3,30mL de tampão fosfato (0,1M; pH7,2), em um tubo cônico embanho refrigerado, foi rompida por ultra-som (Vibra Cell lOOW-Sonics &Materials), usando-se pulsos de ls com intervalos de ls por um períodode 45 minutos à freqüência de 20kHz. Os fragmentos celulares foramremovidos por centrifugação (6700g; 10 min), recolhendo-se o extrato aser usado como fonte de xilose redutase.By ultrasound, the cells were resuspended in potassium phosphate buffer (5mM, pH 7.0), added with 1mL of a protease inhibitor solution (2mM aminocaproic acid, 10mM (3-mercaptoethanol, 1mM phenylmethylsulfonyl fluoride). and 0.2mM EDTA) and 3.30mL phosphate buffer (0.1M; pH7.2) in a chilled conical chilled tube were ultrasonically ruptured (Vibra Cell 10-Sonics & Materials) using pulses of ls with ls intervals for a period of 45 minutes at a frequency of 20kHz. Cell fragments were removed by centrifugation (6700g; 10 min), collecting the extract to be used as a source of xylose reductase.
Já com uso de pérolas de vidro, as células foramressuspendidas em tampão fosfato de potássio (5mM, pH 4,5-8,5),adicionado de lmL de uma solução de inibidores de protease (2mM deácido aminocapróico, lOmM de P-mercaptoetanol, lmM fenil-metil-sulfonil-fluoride e 0,2mM de EDTA). O rompimento foi feito em um tubocônico contendo 3 mL de suspensão de células e de 3 mL de pérolas devidro. Através de um auxílio de vórtice, o tubo cônico foi agitadodurante 60 segundos seguidos de 30 segundos no banho de gelo. Esteciclo foi repetido durante 7 vezes. Os fragmentos celulares foramremovidos por centrifugação (6700g; 20min), recolhendo-se o extrato aser usado como fonte de XR.Already using glass beads, the cells were resuspended in potassium phosphate buffer (5mM, pH 4.5-8.5), added with 1mL of a protease inhibitor solution (2mM aminocaproic acid, 10mM P-mercaptoethanol, 1mM phenyl methyl sulfonyl fluoride and 0.2mM EDTA). The disruption was made in a tuboconic containing 3 mL of cell suspension and 3 mL of glass beads. Through a vortex aid, the conical tube was shaken for 60 seconds followed by 30 seconds in the ice bath. This cycle was repeated for 7 times. Cell fragments were removed by centrifugation (6700g; 20min), collecting the extract to be used as a source of XR.
Purificação Parcial da Xilose RedutasePartial Purification of Xylose Reductase
O extrato foi passado através de uma membrana deultrafiltração com membrana de 30 kDa (7000 rpm/20min),recolhendo-se o filtrado contendo a XR.The extract was passed through a 30 kDa membrane defiltration membrane (7000 rpm / 20min), collecting the filtrate containing the XR.
IMOBILIZAÇÃO DO CO-FATORCO-FACTOR IMOBILIZATION
Em 25 mL de água deionizada, tampão fosfato ou tampãoTris-HCl (pH 7,2 ou 7,4) foi adicionada a quantidade de resinatrocadora de ânions (5, 10 ou 25mg), deixando-se a suspensão por 24ha 32°C sob agitação (100 rpm). A seguir, adicionou-se o co-fator (NADPou NADPH; 100 |umol), deixando-se a mistura a 100 rpm e 32°C por umtempo (1, 2 ou 4 horas). O sistema imobilizado foi separado porcentrifugação (4000g; 30min) e a quantidade de co-fator não ligadamedida no sobrenadante.In 25 mL of deionized water, phosphate buffer or Tris-HCl buffer (pH 7.2 or 7.4) was added the amount of anion resorption agent (5, 10 or 25 mg), and the suspension was left for 24 h at 32 ° C. stirring (100 rpm). Then the cofactor (NADP or NADPH; 100 µmol) was added, leaving the mixture at 100 rpm and 32 ° C for one time (1, 2 or 4 hours). The immobilized system was separated by centrifugation (4000g; 30min) and the amount of unbound cofactor measured in the supernatant.
BlOCONVERSÃO DA XlLOSE EM XlLITOLXlLOSE BLOCONVERSION IN XlLITOL
Os processos descritos a seguir utilizaram o NADP na formasolúvel e/ou imobilizada, munindo-se, respectivamente, o BMU commembrana de corte molecular de 500 Da ou 30 kDa. O BMU empregadoé da marca BIOENGINEERING® com capacidade operacional de 10 mL,temperatura controlada pela circulação de água na jaqueta derevestimento, tendo acoplados uma bomba peristáltica/pistonada e umsistema de pressurização até 6 bar.Dez mililitros de solução aquosa (pH 7,2) contendo o co-fator solúvel ou imobilizado (e as enzimas solúveis XR (2mL do extratoenzimático) e G6PDH (lOOuL de 272U/mL) foram introduzidos no BMU,sendo, a seguir, alimentado com a solução substrato [D-glicose 6-fosfato (0,5mg/mL) e xilose (lmg/mL) a uma dada vazão especifica de4mL/h (primeiras 24 horas) e 2mL/h (48 horas seguintes)respectivamente. O processo contínuo foi operado por pelo menos 72h,à temperatura ambiente e sob agitação de 100 rpm. Nas amostrascoletadas a cada lh foram feitas as determinações analíticas.The procedures described below used NADP in soluble and / or immobilized form, with respectively the 500 Da or 30 kDa molecular cut-off membrane BMU. The BMU employed is a BIOENGINEERING® brand with an operating capacity of 10 mL, temperature controlled by water circulation in the jacket, having a peristaltic / piston pump and a pressurization system up to 6 bar. Ten milliliters of aqueous solution (pH 7.2) containing the soluble or immobilized cofactor (and the soluble enzymes XR (2mL of the enzyme extract) and G6PDH (100uL of 272U / mL) were introduced into the BMU and then fed with the substrate solution [D-glucose 6-phosphate (0.5mg / mL) and xylose (1mg / mL) at a given specific flow rate of 4mL / h (first 24 hours) and 2mL / h (48 hours thereafter respectively) .The continuous process was operated for at least 72h at room temperature. stirring at 100 rpm The analytical determinations were made every 1h.
Procedimentos AnalíticosAnalytical Procedures
Determinação da Atividade da Xilose RedutaseA atividade da XR foi determinada medindo-se o decréscimoda absorbância a 340nm decorrente da oxidação do NADPH, usando axilose como substrato. Uma unidade de atividade enzimática (Uxr) foidefinida como a quantidade de enzima que catalisa a oxidação de 1 (imolde NADPH por minuto. A atividade específica (UxRe) será expressa em(Uxr)/mg de proteína.Determination of Xylose Reductase Activity XR activity was determined by measuring the decrease in absorbance at 340nm due to NADPH oxidation using axylose as a substrate. One unit of enzyme activity (Uxr) is defined as the amount of enzyme that catalyzes the oxidation of 1 (NADPH immolde per minute. Specific activity (UxRe) will be expressed in (Uxr) / mg protein.
Determinação da Atividade da Glicose 6-Fosfato DesidrogenaseDetermination of Glucose 6-Phosphate Dehydrogenase Activity
A atividade da G6PDH foi determinada medindo-se oaumento da absorbância a 340nm decorrente da redução do NADP,usando D-glicose 6-fosfato como substrato. Uma unidade de atividadeenzimática (Ugõ) foi definida como a quantidade de enzima que catalisaa redução de l|j.mol de NADP por minuto. A atividade específica (UG6e)será expressa em (UGó)/mg de proteína.G6PDH activity was determined by measuring the increase in absorbance at 340nm due to reduction of NADP using D-glucose 6-phosphate as substrate. A unit of enzyme activity (Ug6) was defined as the amount of enzyme that catalyzes the reduction in 1 µmol NADP per minute. Specific activity (UG6e) will be expressed in (UGó) / mg protein.
Determinação do NADPH SolúvelA quantidade de NADPH solúvel na amostra foi determinadapor leitura direta em espectrofotômetro a 340nm, considerando ocoeficiente de extinção molar de 6220 M^.cm-1.Determination of Soluble NADPH The amount of soluble NADPH in the sample was determined by direct spectrophotometer reading at 340nm, considering the molar extinction coefficient of 6220 M ^ .cm-1.
Determinação da Proteína SolúvelDetermination of Soluble Protein
Foi usado o método convencional do reagente azul-brilhante(Coomassie G-250) e a albumina bovina como proteína padrão.The conventional bright blue reagent method (Coomassie G-250) and bovine albumin were used as standard protein.
Determinação das Concentrações de Xilose e XilitolDetermination of Xylose and Xylitol Concentrations
A xilose e o xilitol foram determinados em cromatógrafolíquido de alta eficiência.Xylose and xylitol were determined in high performance chromatograph.
Determinação da Concentração de Açúcares Redutores Totais (ART)Determination of Total Reducing Sugar Concentration (ART)
Os açúcares redutores representados pela xilose e D-glicose6-fosfato em separado ou em mistura foram determinados pelo uso dosreagentes convencionais de Somogyi-Nelson.The reducing sugars represented by xylose and D-glucose6-phosphate separately or in admixture were determined by the use of conventional Somogyi-Nelson reagents.
Eficiência da Imobilização (EU do NADPHImmobilization Efficiency (NADPH EU)
A eficiência da imobilização foi calculada através da relação:EI = 100.[(NADPHad-NADPHsobr)/NADPHad]Immobilization efficiency was calculated by the ratio: EI = 100. [(NADPHad-NADPHsobr) / NADPHad]
onde: (NADPHad) = concentração do co-fator antes da imobilização;(NADPHSobr) = concentração do co-fator no sobrenadante.where: (NADPHad) = cofactor concentration before immobilization (NADPHSobr) = cofactor concentration in the supernatant.
Purificação Parcial da XRXR Partial Purification
O grau de purificação da XR foi expresso pela relação:The degree of purification of XR was expressed by the ratio:
FP = (UxRe)d / (UxRe)aFP = (UxRe) d / (UxRe) a
onde: FP = fator de purificação; (UxRe)d = atividade específica após otratamento e (UxRe)a= atividade específica antes do tratamento.where: FP = purification factor; (UxRe) d = specific activity after treatment and (UxRe) a = specific activity before treatment.
BioconversãoBioconversion
Pela bioconversão realizada em regime descontínuo quercom o NADPH solúvel quer imobilizado, foram estabelecidas asconcentrações das enzimas (XR e G6PDH), substratos (xilose e glicose6-fosfato) e de NADPH que levam à maior conversão.By bioconversion performed in a discontinuous regime with either soluble or immobilized NADPH, the concentrations of the enzymes (XR and G6PDH), substrates (xylose and glucose6-phosphate) and NADPH leading to the highest conversion were established.
Os experimentos de bioconversão descontínua foramacompanhados através da diminuição das concentrações iniciais doART e da xilose e do acúmulo de xilitol no meio reacional ao longo doprocesso. Os dados foram apresentados através de gráficos do tipoconcentração (ART, xilose e xilitol) x tempo de reação.Discontinuous bioconversion experiments were followed by decreasing the initial concentrations of ART and xylose and accumulating xylitol in the reaction medium throughout the process. Data were presented through graphs of tipoconcentration (ART, xylose and xylitol) x reaction time.
A produtividade em xilitol (Pxüí) foi calculada através darelação:The productivity in xylitol (Pxüí) was calculated by the following:
<formula>formula see original document page 25</formula><formula> formula see original document page 25 </formula>
onde (xilitol)f = concentração de xilitol no final do processo; (xilitol)i =concentração de xilitol antes da reação (eventualmente presente no ELCou no extrato de XR parcialmente purificado) e t = tempo total dereação.where (xylitol) f = xylitol concentration at the end of the process; (xylitol) i = concentration of xylitol prior to reaction (possibly present in ELC or in partially purified XR extract) and t = total time to dereal.
Os experimentos de bioconversão contínua foramacompanhados pela determinação da quantidade de ART, xilose e xilitolpresentes no efluente do biorreator ao longo do tempo. No estadoestacionário - constatado através de gráficos concentração (ART, xilosee xilitol) x tempo de processo - foram calculadas a conversão da xilose(X) e a produtividade do processo (Ppc) expressa em (mmol de xilitolformado/h.UxR) através das relações:Continuous bioconversion experiments were accompanied by the determination of the amount of ART, xylose and xylitol present in the bioreactor effluent over time. In the steady state - verified by concentration (ART, xilosee xylitol) x process time graphs - xylose conversion (X) and process productivity (Ppc) expressed as (xylitolformed mmol / h.UxR) were calculated through the ratios :
X (%) = [(XILOSE)cons /(XILOSE)o]xlOO(Ppc) = {[Q x 60 x (XILITOL)] / 1000 x Uxr}X (%) = [(XYLOSE) with / (XYLOSE) o] x100 (Ppc) = {[Q x 60 x (XYLITOL)] / 1000 x Uxr}
onde: (XILOSE)COns = (XILOSE)o - (XILOSE)saída, (XILOSE)o =concentração de xilose na entrada do reator, Q = vazão volumétrica nasaída do reator (mL/h), (XILITOL) = concentração de xilitol na saída doreator e Uxr = atividade da XR no meio reacional.where: (xylose) COns = (xylose) o - (xylose) output, (xylose) o = concentration of xylose at reactor inlet, Q = volumetric flow rate of reactor (mL / h), (xylitol) = xylitol concentration at the reactor outlet and Uxr = XR activity in the reaction medium.
Claims (18)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BRPI0803481 BRPI0803481A2 (en) | 2008-09-19 | 2008-09-19 | process of obtaining xylitol from xylose by enzymatic bioconversion in membrane reactor |
Applications Claiming Priority (1)
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- 2008-09-19 BR BRPI0803481 patent/BRPI0803481A2/en not_active Application Discontinuation
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