BRPI0711967A2 - ensaio de biomarcador de espectrometria de massa - Google Patents

Abstract

ENSAIO DE BIOMARCADOR DE ESPECTROMETRIA DE MASSA. A presente invenção refere-se a um método para determinar a presença de um ou mais biomarcadores de polipeptídeo em uma amostra, compreendendo as etapas de: (a) submeter a amostra a uma análise espectrométrica de massa (MS) e gravação do índice do tempo de retenção e da massa correspondente para cada sinal detectado; (b) correlacionar a massa correspondente a cada sinal a uma base de dados de referência das massas de biomarcador para formar uma correlação entre cada sinal e um biomarcador de referência, e descartar aqueles sinais cujas massas não se correlacionam a uma massa do biomarcador de referência; (c) armazenar aqueles sinais cujas massas se correlacionam com um biomarcador de referência; (d) confirmar a correlação entre cada sinal armazenado e um biomarcador de referência ao combinar o espectro de MS de cada sinal com o espectro de MS do biomarcador de referência na base de dados usando uma medida de similaridade, para definir um conjunto de sinais de correlação positivos; (d) medir a intensidade de cada sinal de correlação positivo e a classificação de sua intensidade absoluto ou a sua intensidade de sinal relativo usando uma função de discriminação; (e) aplicar um limite aos valores de classificação obtidos a partir da função de discriminação para determinar a presença ou ausência do biomarcador.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ENSAIO DE BIOMARCADOR DE ESPECTROMETRIA DE MASSA"

A presente invenção refere-se a um ensaio para biomarcadores. Em particular, a invenção descreve um ensaio multíplex capaz de automati- camente rastrear a presença de biomarcadores em amostras por espectro- metria de massa.

Vários marcadores biológicos, conhecidos como biomarcadores, têm sido identificados e estudados através da aplicação de bioquímica e bio- logia molecular para estados clínicos e toxicológicos. Os biomarcadores po- dem ser descobertos tanto em tecidos quanto em biofluidos, onde o sangue é o biofluido mais comum usado em estudos de biomarcadores.

Os biomarcadores podem ter um poder preditivo, e como tal po- dem ser usados para predizer ou detectar a presença, nível, tipo ou estágio de condições ou doenças particulares (incluindo a presença ou nível de mi- crorganismos ou toxinas em particular), a susceptibilidade (incluindo a sus- ceptibilidade genética) para condições ou doenças em particular, ou a res- posta a tratamentos particulares (incluindo tratamentos com fármacos). A- credita-se que os biomarcadores vão desempenhar um papel cada vez mais importante no futuro da descoberta e desenvolvimento de fármacos, melho- rando a eficiência da pesquisa e dos programas de desenvolvimento. Os biomarcadores podem ser usados como agentes de diagnóstico, monitores de progresso da doença, monitores de tratamento e pregnosticador do resul- tado clínico. Por exemplo, vários projetos de pesquisa de biomarcadores estão tentando identificar marcadores de cânceres específicos e de doenças cardiovasculares e imunológicas específicas.

Proteínas intactas podem ser ensaiadas de diversas maneiras utilizando tecnologias baseadas em gel como também de separação da fase líquida. A eletroforese de gel bidimensional é usada com misturas de proteí- nas solubilisadas em que as proteínas são separadas com base na carga e no tamanho. As proteínas são transformadas de tal modo que ambas as formas isoméricas, como também as modificações pós-traducionais, são transformadas. A quantificação das proteínas é feita por técnicas de colora- ção, em que ambas as técnicas de pré- e pós coloração podem ser aplica- das. A marcação metabólica também permite que a faixa linear seja estendi- da até 5 ordens de magnitude, oferecendo sensibilidades dentro da faixa fentomolar. A identificação da proteína é realizada a partir de pontos de gel excisados. As proteínas são fragmentadas após degradação e modificação química. As misturas de peptídeos resultantes são extraídas de amostra de gel isolada e subseqüentemente identificadas por espctrometria de massa.

A HPLC (Cromatografia Líquida de Alto Desempenho) multidi- mensional pode ser usada como uma boa alternativa para separar proteínas ou peptídeos. A mistura de proteína ou peptídeo é passada por uma suces- são de fases ou dimensões estacionárias cromatográficas que dá uma po- tência de transformação mais alta. A HPLC é flexível para muitas aborda- gens experimentais, e várias fases estacionárias e móveis podem ser sele- cionadas por sua adequabilidade em transformar classes de proteína ou peptídeo específicas de interesse, e por compatibilidade umas com as outras e com os métodos de espectrometria de massa a jusante de deteção e iden- tificação. A Cromatografia Líquida de Alto Desempenho é atualmente a me- lhor metodologia para separações de solutos que também permitem a ope- ração automatizada com um alto grau de reprodutibilidade. As configurações em linha desses tipos de plataformas de separação de multimecanismos são comumente aplicadas dentro dos estudos proteômicos.

A espctrometria de massa (MS) é também um elemento essen- cial do campo de proteômicos. De fato, a MS é a principal ferramenta usada para estudar e caracterizar proteínas purificadas nesse campo. O link de interface em proteômicos e MS, exibindo centenas ou milhares de proteínas, é feito pela tecnlogia de gel em que a alta resolução pode ser alcançada em um gel único. Os pesquisadores estão utilizando com sucesso o poder de MS para por de lado os géis bidimensionais que originalmente deram aos proteômicos o seu impulso.

A aplicação e o desenvolvimento da espctrometria de massa (MS) para identificar proteínas ou peptídeos separados, através de técnicas de separação de fase líquida e/ou técnicas de separação com base em gel, levaram a um avanço tecnológico significativo em análise de expressão de proteína e peptídeo. Há dois métodos principais para a caracterização de espectrometria de massa de proteínas e peptídeos: ionização de desabsor- ção a laser assistida pela matriz (MALDI) e ionização de electrospray (ESI).

Usando várias abordagens, as fontes de íons de MALDI e ESI podem ser combinadas com tempo-de- vôo (TOF) ou outros tipos de analizadores es- pectrométricos de massa para determinar a massa ou a seqüência de peptí- deos.

Em MALDI, os peptídeos são co-cristalizados com a matriz, e pulsados com lasers. Esse tratamento vaporiza e ioniza os peptídeos. Os pesos moleculares (massas) dos peptídeos carregados são depois determi- nados em um analizador de TOF. Nesse dispositvo, um campo elétrico ace- lera as moléculas carregadas em direção a um detector, e as diferenças em duração de tempo que os peptídeos ionizados gastam para alcançar o de- tector (o tempo-de-vôo deles) revelam os pesos moleculares dos peptídeos; peptídeos menores alcançam o detector mais rapidamente. Esse método gera perfis de massa de misturas de peptídeos - isto é, perfis dos pesos e quantidades moleculares dos peptídeos na mistura. Esses perfis podem de- pois ser usados para identificar proteínas conhecidas a partir de bancos de dados de seqüência de proteínas.

Fazendo uma interface de ESI-MS com a cromatografia líquida (LC/MS/MS), os peptídeos que são depurados a partir da coluna LC- são introduzidos na fonte de íon do espectrometro de massa. Uma voltagem é aplicada para uma agulha muito fina. A agulha depois atomiza gotículas no analizador espectrométrico de massa, onde as gotículas evaporam e os íons de peptídeos são liberados correspondendo a uma variedade de estados de carga que são fragmentados e a partir dos quais a seqüência pode ser de- terminada. Em LC/MS/MS, os pesquisadores usam dispositivos de LC mi- crocapilares para inicialmente separar peptídeos.

A espctrometria de massa (MS) é uma técnica analítica valiosa porque ela mede uma propriedade intrínseca de uma biomolécula, sua mas- sa, com sensibilidade muito alta. A MS pode portanto ser usada para medir uma ampla variedade de tipos de moléculas (proteínas, peptídeos, ou quais- quer outras biomoléculas) e uma ampla faixa de materiais de tipos/biológicos de amostras. A preparação da amostra correta é conhecida como sendo crucial para a geração do sinal de MS e resolução e sensibilidade de espec- tra. A preparação da amostra é dessa maneira uma área crucial para a exe- qüibilidade e sensibilidade da análise.

As proteínas são biomacromoléculas que são difíceis de separar por técnicas de separação cromatográfica de fase líquida, devido à transfe- rência de massa desfavorável dentro das partículas do material de coluna cromatográfica, a fase estacionária. Entretanto, as proteínas podem se transformar em formas de unidades menores (peptídeo ou polipeptídeo) por quebrar a ligação de peptídeo que junta dois aminoácidos adjacentes. Isso pode ser realizado pela clivagem enzimática por proteases, proteínas que são capazes de interagir e dissolver ligações de peptídeos em outras proteí- nas. A tripsina é a protease mais comumente usada, usada em estudos de análise de expressão de proteína. Após a degradação enzimática, uma mis- tura complexa de peptídeos resultante será separada e fracionada por cro- matografia capilar. Todos os peptídeos que são a soma das proteínas fra- gentadas na amostra não serão transformados nesse estágio. Os peptídeos que tiverem sido gerados a partir da proteína correspondente não serão se- parados como uma unidade na etapa de fracionamento cromatográfico, mas em vez disso serão separados junto com os peptídeos resultantes de todas as outras proteínas da amostra. Os altos peptídeos de depuração separados e transformados do capilar, serão fraciondos mais comumente com base na carga e hidrofobicidade. Os peptídeos separados são introduzidos em linha a partir da parte cromatográfica da plataforma no espectrometro de massa, dessa maneira evitando possíveis contaminações. Os peptídeos são depois determinados por massa (m/z), a fim de capturar todos os peptídeos presen- tes em uma dada janela de tempo. Em seguida, diversas massas de peptí- deo são selecionadas para seqüenciar (MS/MS), com base em sua abun- dância em dada janela de tempo. Isso é realizado através de uma nova inter- face de amostragem de íon, por meio da ionização de um sistema de espec- trometro de massa de separar íon de ionização por electrospray. A interface usa quadrupolos lineares como guias de íons e separadores de íons para aumentar o desempenho do filtro. íons de separação nos quadrupolos linea- res demonstraram melhorar o ciclo obrigatório do sistema. A excitação dipo- lar de íons separados em um quadrupolo linear é usada para ejetar íons in- desejáveis.

Depois da primeira aparição de uma instrumentação bem- sucedida em 1990, a espectrometria de massa de íon separada com ioniza- ção por electrospray (ESI) tornou-se uma ferramenta usada amplamente para análise de investigação. Electrospray é uma fonte suave que pode ioni- zar analisados importantes tais como peptídeos, e proteínas. íons altamente carregados produzidos em ESI podem estender a faixa de analisadores de massa. Os espectômetros de massa de separação têm capacidades favorá- veis tais como capacidade de MS de série flexível (MS n.... ). Nesse proces- so de ionização, o íon precursor é ativado por aceleração em um separador de íon linear seletivo de massa, sob condições pelas quais alguns dos íons formados de fragmentos são instáveis dentro do separador. Após um atraso de tempo, os parâmetros de estabilidade do separador de íons são mudados para permitir a captura de fragmentos que eram anteirormente instáveis. O resultado é um espectro de íon do produto que tem origem a partir dos íons de precursor com uma distribuição de energia interna modificada. É possível acompanhar a evolução da distribuição de energia interna do precursor por muitos milisegundos, após a admitância dos íons de precursor em uma se- paração de íon linear. O espectro de íon do produto de fragmentação de tempo demorado tipicamente exibe produtos de fragmentação seqüencial reduzida levando aos espectros que são mais facilmente interpretados. Di- versos parâmetros experimentais importantes para a fragmentação de tem- po· demorado têm sido identificados e são discutidos. A técnica tem aplica- ções para ambos, íons de precursor pequenos e peptídeos carregados mul- tiplicados.

A Espctrometria de massa em série (MS/MS) está no âmago das mais modernas investigações espectrométricas de massa de misturas com- plexas. A fragmentação envolve a ativação de um íon precursor através de colisões com um gás alvo e pode produzir fragmentos carregados e neutros. A natureza dos íons de fragmentos, como também suas intensidades, é mui- tas vezes indicadora da estrutura do íon precursor e dessa maneira pode render informações úteis para a identificação de analisados desconhecidos, como também prover uma técnica de rastreamento útil para diferentes clas- ses de analisados. A ativação através de colisões múltiplas prolonga a ativa- ção do tempo e permite que energias mais altas sejam depositadas nos íons precursores. Pressões de gás de colisão mais altas também implicam taxas de relaxamento mais altas.

Enquanto que a combinação da separação de proteína por elec- troforese de gel D2 e análise por espctrometria de massa têm sido conside- radas como sendo úteis para a análise de biomarcador, sistemas multíplex capazes de analisar diversos biomarcadores estão atualmente no estágio experimental.

Muitas doenças têm sido apresentadas como estando associa- das a um padrão complexo de biomarcadores, que podem ser diagnóstico para a doença ou indicativo da resposta ao tratamento do fármaco por um paciente. Esses padrões muitas vezes envolvem diversos biomarcadores, requerendo análises simultâneas múltiplas. Existe uma necessidade, dessa maneira, de um sistema capaz de ensaiar diversos biomarcadores simulta- neamente. Idealmente, o sistema poderia ser automatizado.

Sumário da Invenção

A invenção provê um ensaio para biomarcadores em uma amos- tra biológica que é automatizada e acurada. O ensaio conta com a espctro- metria de massa para identificar biomarcadores, e é referido aqui a seguir como ensaio de biomarcador de espctrometria de massa (MSBA).

A invenção provê um método para determinar a presença de um ou mais biomarcadores de polipeptídeos preferivelmente em amostra de tes- te de ser humano, que pode incluir amostras de teste de não-humanos, que está tipicamente confinada em um volume de um biofluido contendo proteí- nas de ocorrência natural dentro de uma quantidade de tecido, sangue, ou outros espécimes clinicamente obtidos.

O método preferivelmente compreende as etapas a seguir:

(a) submeter a amostra a uma análise espectrométrica de massa (MS) e registrar o índice do tempo de retenção e massa correspondente pa- ra cada sinal detectado;

(b) correlacionar, a massa que corresponde a cada sinal, a um banco de dados de referência mantendo um conjunto master de massas de biomarcador de uma doença ou alteração biológica conhecidas, para formar uma correlação entre cada sinal de amostra de teste e um biomarcador do conjunto mestre de biomarcadores dentro do banco de dados de referência, e descartar aqueles sinais de teste cujas massas não são correlatas a uma massa de biomarcador de referência no conjunto de dados-mestre;

(c) armazenar esses sinais de amostras de teste cujas massas são correlacionadas com um biomarcador de referência nos dados-mestre;

(d) confirmar a correlação entre cada sinal armazenado e um biomarcador de referência, igualando o espectro de MS de cada sinal com o espectro de MS do biomarcador de referência no banco de dados, usando uma medida de similaridade para definir um conjunto de sinais positivamente correlacionados;

(d) medir a intensidade de cada sinal de teste armazenado posi- tivamente correlacionado o sinal e a classificando sua intensidade de sinal absoluta, ou sua intensidade de sinal relativa, usando uma função de discri- minação;

(e) aplicar um limite para anotar os valores obtidos a partir da função de discriminação para determinar a presença ou ausência do biomar- cador.

Preferivelmente, o método da invenção usa o conjunto de dados- mestre na fase de rastreamento da amostra de teste.

Vantajosamente, o método filtra e rstreia a massa e as identida- des de seqüências de conjuntos de dados que são baseadas em cada uma das propriedades únicas de carga, massa, espectros de seqüências associ- ados com certas seqüências de proteínas identificadas no conjunto de da- dos-mestre.

Em um primeiro aspecto, dessa maneira, a invenção provê um método para determinar a presença de um ou mais biomarcadores de poli- peptídeos em uma amostra, compreendendo as etapas de:

(a) submeter a amostra a uma análise espectrométrica de massa (MS) e registrar o índice do tempo de retenção e a massa correspondente para cada sinal detectado;

(b) correlacionar a massa correspondente a cada sinal para um banco de dados de referência de massas de biomarcador para formar uma correlação entre cada sinal e um biomarcador de referência, e descartar a- queles sinais cujas massas não se correlacionam a uma massa de biomar- cador de referência;

(c) armazenar aqueles sinais cujas massas se correlacionam com o biomarcador de referência;

(d) confirmar a correlação entre cada sinal armazenado e um biomarcador de referência, combinando o espectro de MS de cada sinal com o espectro de MS do biomarcador de referência no banco de dados, usando uma medida de similaridade para definir um conjunto de sinais positivamente correlacionados;

(d) medir a intensidade de cada sinal correlacionando positiva- mente o sinal de teste e classificando sua intensidade de sinal absoluta ou sua intensidade de sinal relativa, usando uma função de discriminação;

(e) aplicar um princípio para anotar os valores obtidos a partir das função de discriminação para determinar a presença ou ausência do biomarcador.

O método da invenção permite que os usuários analisem, simul- taneamente, centenas ou milhares de biomarcadores em uma amostra. O método conta com um banco de dados de biomarcadores, que mostraram estar associados com a doença, que compreende dados de massa e espec- trais para cada um dos biomarcadores e permite que os ditos biomarcadores sejam indentificados precisamente pelo software MSBA, em uma dada a- mostra. Investigando os peptídeos presentes em uma amostra e eliminando as seqüências indesejáveis com base no índice do tempo de retenção, que se correlaciona com o tempo de chegada do peptídeo no detector de MS1 acima de 30.000 seqüências podem ser analisadas em minutos, e determi- nados biomarcadores identificados com alta confiança. O método é automa- tizável, a produtividade operacional alta e operável por técnicos relativamen- te não-experientes.

A amostra pode ser submetida à análise de MS sem procedi- mentos de separação anteriores. Em tal modalidade, a amostra é preferivel- mente analisada por infusão direta usando princípios de nano- electrospray estático, análise de injeção de fluxo e injeção de fluxo com enriquecimento da amostra.

Vantajosamente, a amostra é processada antes da análise de MS, preferivelmente para separar os componentes da amostra antes de car- regá-los na MS. Por exemplo, o processamento da amostra compreende separação da amostra por cromatografia líquida de pressão alta de fase úni- ca ou multi-fases (HPLC).

O próprio sistema de MS é preferivelmente ionização por elec- trospray (ESI) MS, ionização de desabsorção a laser assistida pela matriz - tempo de vôo de (MALDI-TOF) MS ou ionização de desabsorção a laser de superfície aumentada - tempo de vôo de (SELDI-TOF) MS.

O método de acordo com a invenção é vantajosamente automa- tizado e realizado sob controle de computador. A identificação de biomarca- dores em uma amostra é feita por comparação com os dados de referência para os ditos biomarcadores; preferivelmente, massa de referência e dados espectrais de MS para uma pluralidade de biomarcadores são armazenados em um computador.

Espectros de MS de referência para um biomarcador definido são preferivelmente espectros proporcionais obtidos dos dados reais e me- didos obtidos por um cálculo de agregação.

O método da invenção pode ser implementado de duas manei- ras; usando padrões internos para prover uma referência para a intensidade de sinal quantificada, e sem tais padrões. Dessa maneira, em uma modali- dade, um ou mais padrões internos são adicionados para a amostra antes da análise por MS. Preferivelmente, os padrões internos são rotulados.

Em tal implementação da invenção, a intensidade de sinal abso- luta para cada sinal de biomarcador é classificada pela medida da intensida- de de sinal do biomarcador e comparando-a à intensidade de sinal de um ou mais padrões internos conhecidos.

Em uma implementação alternativa, a amostra é processada sem a adição de padrões internos. Em tal modalidade, a intensidade de sinal relativa é classificada pela medida da relação entre as intensidades de sinal do biomarcador individual em um paciente, e a intensidade de sinal de refe- rência para um grupo de pacientes.

O biomarcador pode ser descrito como "uma característica que é objetivamente medida e avaliada como um indicador de processos biológi- cos normais, processos patogênicos ou respostas farmacológicas a uma intervenção terapêutica". Um biomarcador é qualquer indicador identificável e mensurável associado a uma condição ou doença em particular, em que existe uma correlação entre a presença ou nível do biomarcador e algum aspecto da condição ou doença (incluindo a presença de, o nível ou nível de mudança de, o tipo de, o estágio de, a susceptibilidade para a condição ou doença, ou a responsividade a um fármaco usado para tratar a condição ou doença). A correlação pode ser qualitativa, quantitativa, ou ambas, qualitati- va e quantitativa. Tipicamente, um biomarcador é um composto, fragmento de composto ou grupo de compostos. Tais compostos podem ser quaisquer compostos encontrados ou produzidos por um organismo, incluindo proteí- nas (e peptídeos), ácidos nucléicos e outros compostos.

A amostra pode ser qualquer substância biológica de interesse, mas é vantajosamente um tecido biológico e preferivelmente um fluido bioló- gico tal como sangue ou plasma.

O método da invenção conta com a correlação de sinais de MS observados com massas de referência e espectros de MS de biomarcadores conhecidos. Os dados de referência são preferivelmente armazenados em um servidor de computador, que permite o procedimento inteiro ser realizado sob o controle do computador.

Os sinais são correlacionados aos padrões de referência por comparação, por exemplo usando funções computacionais como descrito aqui a seguir. Preferivelmente, os sinais são caracterizados como "positivo" ou "negativo", de acordo com se um nível de limite de similaridade é alcançado; sinais que são negativos e não alcançam o nível de limite de similaridade são descar- tados no processo de MSBA, enquanto que os sinais que são positivos são combinados com biomarcadores e resultam em um diagnóstico da presença dos ditos biomarcadores em uma amostra biológica.

A intensidade de sinal é medida com referência a padrões de controle conhecidos adicionados à amostra biológica, ou por comparação com uma intensidade de referência calculada através de um grupo de paci- entes, dependendo da implementação do ensaio de MSBA.

No caso de implementação com padrões, a classificação de MSBA dos sinais do biomarcador é calculada pela relação entre o sinal de biomarcador presente na amostra e o padrão interno adicionado à amostra. Todos os biomarcadores em um ensaio múltiplo serão analisados da mesma maneira resultando em um fator de classificação de MSBA final.

A fim de ter quantificação absoluta integrada à metodologia de MSBA, o uso de padrões calibradores internos é preferido. Tais padrões são, por exemplo, isotopo rotulado, fazendo a leitura do ensaio altamente acura- da em termos de seqüência de proteínas, como também vantajosos em ter- mos de quantificação absoluta. Seqüências de calibragem integradas dentro do rastreamento de MSBA permitirão a mensuração de níveis de biomarca- dor de proteína absoluta no sangue, ou em qualquer outra amostra clínica.

Um novo método é provido, composto de múltiplas etapas liga- das, para detectar e quantificar os biomarcadores de seqüências de proteí- nas com uma leitora multíplex em que os níveis de expressão de, mas não restritos a, 2-100 biomarcadores podem ser mapeados em uma única leitura da memória de MSBA. O sistema de MSBA é desenvolvido em uma plata- forma de fase líquida que pode manipular o mapeamento de diagnóstico de linha única, ou uma configuração de fluxo múltiplo com processamento de amostras paralelo simultâneo, dessa maneira aumentando a capacidade e a produtividade operacional do sistema. O modo de detecção do método de MSB é a identificação acurada da massa e a determinação da seqüência, e subseqüente quantificação por espctrometria de massa.

Essa metodologia pode ser aplicada a qualquer tipo de amostra biológica que está em, ou pode ser transformada em, uma forma líquida. A metodologia de MSBA pode também processar amostras de quaisquer tipos de processos celular ou de biotecnologia em que, por exemplo, os perfis ci- néticos são medidos durante o tempo. Essa análise de horas extraordiárias é realizada por introdução subseqüente da amostra na plataforma de MSBA automaticamente além do tempo. A capacidade de análise inteira de fazer o perfil de diagnóstico de MSBA é inteiramente controlada por computador incluindo a avaliação de sinal de massa, a análise da seqüencia, a quantifi- cação multíplex colocando em peso a discriminação e finalmente o diagnós- tico de MSBA SCORE (CLASSIFICAÇÃO DE MSBA). Todas as etapas in- termediárias dentro do ciclo de MSBA que seguem nessa plataforma são avaliadas por algoritmos dedicados que fazem a tomada de decisão acurada a partir da quantidade maciça de dados gerados em cada ciclo de análise de MSBA de qualquer amostra biológica dada.

O método de MSBA resulta na identificação de peptídeos espe- cíficos, como também variantes dos mesmos modificadas bioquimicamente, presentes como entidades separadas, ou presentes dentro de misturas complexas de proteínas e peptídeos. Cada peptídeo pode ser definido por uma seqüência específica de aminoácidos, que pode ser seletivamente iden- tificada ou por sua massa precisa, ou suas propriedades de ligação de imu- noafinidade únicas para um dado reagente imunológico.

O método permite a identificação de identidades de proteína es- tatisticamente significativas e versões modificadas das mesmas. Além do mais, é possível medir as quantidades relativas de cada biomarcador na amostra, mesmo sem o uso de padrões internos. Alternativamente, quantifi- cações absolutas podem ser feitas de cada biomarcador separadamente em qualquer amostra biológica dada, pelo uso de padrões internos, em que es- ses padrões internos (por exemplo, n=l-20) são as seqüências de proteína dos biomarcadores. Esses padrões internos podem depois ser feitos como seqüências de aminoácidos frios, ou como seqüências de aminoácidos rotu- lados de isótopos. Os padrões têm seqüências idênticas aos biomarcadores selecionados, com a possível exceção da marcação.

O método combina diversas etapas chave que resultam em pro- cessamento, separação, isolamento, e identificação específicos das seqüên- cias de proteínas únicas presentes em uma amostra de material biológico. O método pode ser aplicado a amostras clínicas de seres humanos. O método pode também ser aplicado a amostras derivadas de animais não-humanos.

Proveu-se um método de multietapas para identificar a identida- de de seqüências de proteínas únicas apresentadas por exemplo como uni- dades de massa atômica de entidades de uma amostra biológica, que tem provado ter uma alteração quantitativa em um dado grupo de biomarcador multíplex, o tamanho do qual pode variar por exemplo entre 2-100, de uma dada amostra.

Nós, além do mais, provemos um método para determinar ou confirmar que os biomarcadores, em qualquer amostra biológica específica, tem o desvio quantitativo múltiplo de um conjunto de biomarcadores de se- qüências de proteínas que é predeterminado em amostra clínica, celular, ou de qualquer outro tipo. Essa alteração quantitativa é finalmente calculada pelo algoritmos de MSBA para gerar um MSBA SCORE que será a leitura do diagnóstico.

Adicionalmente, similaridades estatisticamente significativas po- dem ser detectadas e registradas como identidades de seqüências de prote- ínas únicas, ou identidades de peptídeos múltiplos. Determinar estatistica- mente similaridades significativas envolve usar bancos de dados de seqüên- cias de proteína e gene publicamente disponíveis, como também algoritmos desenvolvidos especificamente para atender as demandas da metodologia de MSBA.

A integração de etapas do processo para identificação de bio- marcador é vantajosa. O processo integrado conta com os princípios a se- guir: 1) alta qualidade do material clínico biomédico, 2) processamento de amostra reproduzível e de alta velocidade com separações das fases líqui- das subseqüentes, 3) determinação quantitativa e qualitativa acurada de um conjunto múltiplo de biomarcadores e 4) algoritmos que vão controlar a ge- ração de dados e calcular e permitir o isolamento dos biomarcadores em um grupo de seqüência de proteína múltiplo, um por um. Breve Descrição das Figuras

Figura 1 mostra uma ilustração esquemática do princípio de MSBA.

A Figura 2 ilustra com mais detalhes os procedimentos de mani- pulação de dados envolvidos em MSBA.

A Figura 3 mostra um espectro de massa de uma amostra de sangue de um paciente com doença pulmonar. Biomarcadores múltiplos são identificados na amostra.

A Figura 4 mostra um exemplo de comentário de biomarcador feito a partir do ensaio múltiplo, apresentado pelo espectro de MS em que o biomarcador foi reconhecido pelo software de MSBA, e o acompanhamento do espectro de MS/MS que representa o biomarcador de C- VLFPYGGCQGNGNK resultante.

A Figura 5 mostra um exemplo de avaliar a previsibilidade de um modelo de MSBA com 11 sinais de biomarcadores nos dados de amostra de 19 pacientes, como descrito no Exemplo 2. 10 casos e 9 controles foram usados como se fossem amostras cegas. A classificação de MSBA para ca- da sujeito foi calculada usando Eq.5. Nesse exemplo, sujeitos cuja classific- cação de MSBA foi igual ou superior a 1, foram diagnosticados como casos (círculos vermelhos). Sob outros aspectos, o indivíduo foi considerado como sendo um controle (círculos azuis). A exatidão do prognóstico foi de 100%.

A Figura 6 mostra os resultados de autodiscriminação usando um modelo de MSBA com 10 sinais sobre os dados de amostra de 96 paci- entes, como descrito no Exemplo 3. Cada ponto representa um paciente, e o eixo vertical representa a classificação discriminatória (z), calculada usando Eq. 6. Se essa classificação tivesse sido >0, seria interpretada como um ca- so da doença (círculos vermelhos). Sob outros aspectos, o indivíduo foi con- siderado como sendo um controle (círculos azuis). A exatidão da previsão foi 83,3%.

Descrição Detalhada da Invenção

Biomarcadores

A definição do FDA de biomarcador é "uma característica que é objetivamente medida e avaliada como um indicator de processos biológicos normais, processos patogênicos, ou respostas farmacológicas para uma in- tervenção terapêutica".

Como usado aqui a seguir, o termo "biomarcador" refere-se a um polipeptídeo que pode ser usado para monitorar a presença ou o pro- gresso de uma doença, consistente com a definição do FDA acima.

Biomarcadores podem ser usados como agentes de diagnóstico, monitores da progressão da doença, monitores de tratamento e previsores de resultado clínico. Por exemplo, vários projetos de pesquisa de biomarca- dores estão tentando identificar marcadores de cânceres específicos, e de doenças cardiovasculares e imunológicas específicas.

Algumas dessas proteínas associadas a doenças podem ser identificadas como novos alvos de fármacos, e algumas podem ser úteis como biomarcadores do progresso da doença. Tais biomarcadores podem ser usados para melhorar o desenvolvimento clínico de um fármaco novo ou para desenvolver novos diagnósticos para a doença em particular.

Proteínas associadas a doenças são conhecidas na técnica, e seu uso como biomarcadores para a doença está estabelecido. Tais biomar- cadores podem ser monitorados por meio da presente invenção. Novas pro- teínas associadas à doenças, entretanto, podem ser identificadas. A detec- ção de proteínas associadas a doenças pode ser realizada, por exemplo, pelo método a seguir. Amostras de proteína são tiradas de pacientes únicos ou de grupos de pacientes. Essas amostras podem ser células, tecidos, ou fluidos biológicos que são processados para extrair e enriquecer os constitu- intes de proteína e/ou peptídeo. Tipicamente o processo acarreta a divisão na fase de solução, mas podem também incluir o estabelecimento de com- ponentes de proteína e/ou ligados a matrizes de sólidos. Após a separação e análise (proteômicas, peptidonômicas), impressões digitais de expressão são produzidas para ambos os indivíduos doentes e saudáveis por medição qualitativa e quantitativa. Essas impressões digitais podem ser usadas como idetificadores únicos para distinguir indivíduos e/ou estabelecer e/ou acom- panhar certos processos naturais ou de doença. Esses protótipos de impres- sões digitais são estabelecidos para cada amostra/indivíduo individual e são registrados como valores numéricos em um banco de dados de computador. As impressões digitais são depois analisadas usando ferramentas de bioin- formática para identificar e selecionar as proteínas ou peptídeos que estão presentes nas impressões digitais do protótipo, e cuja expressão pode ou não pode estar presente de maneira diferente nas amostras derivadas das amostras de sujeitos saudáveis e doentes. Essas proteínas/peptídeos são depois adicionalmente caracterizadas e perfis detalhados são produzidos, que identificam as propriedades físicas características das proteínas ou pep- tídeos. Quer seja uma proteína/peptídeo singular ou grupos de proteí- nas/peptídeos, podem ser determinados para ser significativamente associ- ados com certos processos naturais ou doentios.

Espctrometria de massa

A Espctrometria de massa é o método de escolha para as análi- ses de proteínas e peptídeos. A pesquisa com o biomarcador moderno des- coberto emprega dois princípios principais de espctrometria de massa: MALDI-TOF (tempo de vôo de ionização de desabsorção a laser assistida pela matriz) espctrometria de massa em que as proteínas são analisadas em um estado cristalino, e ESI (ionização por electrospray) espectrometria de massa em que as proteínas são analisadas em estado líquido. Adicional- mente, uma aplicação de chip de superfície aumentada de MALDI, chamada ionização de desabsorção a laser de superfície aumentada (SELDI), tem sido usada ampalmente em estudos de descoberta de biomarcador. Vide, por exemplo, Petricoin et al., Lancet, 16, 572-577, 2002; Alexe et al, Proteo- mics. 2004, 4766-4783; and Liotta et al., Endocr Relat Câncer. 2004 Dec;ll(4):585-7. A tecnologia de desabsorção/ionização a laser de superfície au- mentada (SELDI)-TOF-MS usa superfícies cromatográficas acopladas à lâ- mina alvo de ensaio. O material ligado à proteína nas lâminas é depois dire- tamente analisado por MALDI-MS. Peptídeos e proteínas de ensaio de SELDI predominantemente na faixa de massa molecular baixa. Essa tecno- logia é aplicável a peptídeos e proteínas de maior à média abundância em que um esquema de purificação de antemão apropriada não está integrada.

A tecnologia de SELDI leva principalmente ao padrão a partir do qual a se- qüência pode ser realizada usando identificação de MALDI-TOF-TOF de peptídeos.

As plataformas de separação por multimecanismo permitem a separação de peptídeo de resolução alta configurada em linha com espctro- metria de massa de ionização de electrospray, ou "off-line" com princípios de ionização tais como espctrometria de massa de ionização de desabsorção a laser assistida pela matriz. Vide, por exemplo, Aebersold,R. & Goodlett.D.R. Chem. Rev. 2001, 101, 269-295; Mann, et al., Amu. Rev. Biochem, 2001. 70, 437-473; Wolters.et al. Anal. Chem. 73, 5683-5690 (2001); e Washbum,et al., Nat. Biotechnol. 19, 242-247 (2001).

A Espctrometria de massa (MS) é também um elemento essen- ciai no campo proteômico. De fato, a MS é a principal ferramenta usada para estudar e caracterizar estrutura e seqüência de proteínas dentro desse cam- po. Vide Aebersold, R. & Mann, M. Espctrometria de massa -based proteo- mics. Nature 422, 198-207 (2003); Steen, H. and M. Mann (2004). Nat Rev Mol Cell Biol 5(9): 699- 711; and Olsen, J. V. and M. Mann (2004) Proc Natl Acad Sci U S A 101 (37): 13417-22.

Os pesquisadores estão utilizando com sucesso o poder da MS para por de lado os géis bidimensionais que originalmente deram aos prote- ômicos seu impulso. Usando ESI e cromatografia líquida (LC)/MS/MS, uma voltagem é aplicada para uma agulha muito fina que contém uma mistura de peptídeo, gerando seqüências de peptídeos, depuradas da coluna de LC-. A agulha depois pulveriza gotículas em uma analizador espectrométrico de massa em que as gotículas evaporam e os íons de peptídeo são liberados. Em LC/MS/MS, os pesquisdores usam dispositivos de LC microcapilares para inicialmente separar os peptídeos.

A Espctrometria de massa (MS) é um técnica analítica valiosa porque mede uma propriedade intrínseca de uma biomolécula, sua massa, com sensibilidade muito alta. A MS pode dessa maneira ser usada para me- dir uma ampla faixa de tipos de moléculas (proteínas, peptídeos, ou quais- quer outras biomoléculas), uma ampla faixa de amostras de tipos/materiais biológicos.

A preparação correta da amostra pode influenciar a geração de sinal e resolução do espetro e sensibilidade da MS. Sistemas de separação de alta resolução, tais como Cromatografia Líquida (LC) de alta pressão di- mensional única e Cromatografia Líquida (LC/LC) multidimensional podem fazer interface diretamente com a Espctrometria de massa. Essa interface permite rápida aquisição automatizada e coleta de grandes conjuntos de da- dos que representam ambas, quantificação como também informações de seqüências, dentro do espectro de massa gerado. Essa tecnologia de prote- ômicos "shotgun" é conhecida como MudPIT (Tecnologia de Identificação de Proteína Multidimensional). Vide Eng et al., J Am Soc Mass Spectrom 1994, 5: 976-989; Link et al., Nat Biotechnol. 1999 Jul;17(7):676-82; Washburn et al., Nat Biotechnol. 2001 Mar;19(3):242-7; Lin et al., American Geno- mic/Proteomic Technology, 2001 1(1): 38- 46; and Tabb et al., J. Proteome Res. 2002 1:21-26.

Na abordagem de proteômicos "shotgun", os peptídeos gerados por proteína específica digerindo enzimas, tais como tripsina e outras endo-, e exopeptidases/proteinases são analisadas em vez de proteínas intactas. Essa fragmentação oferece vantagens definidas devido ao fato de que mesmo as proteínas muito grandes, com características físicas e químicas variáveis, tais como proteínas muito hidrofóbicas, ou muito básicas, podem ser analisadas. Tais classes de proteínas podem ao contrário ser difíceis de manipular. Essas proteínas vão dar origem à misturas resultantes de peptí- deos de tamanho e número suficientes que permitem comentário e identifi- cação acuradas da proteína. Entretanto, uma vez que diversos peptídeos são gerados a partir de cada proteína respectiva, aumenta a complexidade da mistura a ser analisada. Conseqüentemente, considerável instrumento de tempo e potência de computação são necessários para a abordagem de "shotgun". Contudo, a riqueza de informações de expressão de proteína é extensa, e gerada em um assentamento totalmente automatizado com iden- tificação de proteína em tempo real simultânea.

A fim de poder manipular as amostras de paciente diferentes que apresentam vários graus de doença, métodos diferentes podem ser a- plicados para ajudar e alinhar os cromatogramas e espectros de massa re- sultantes da cromatografia líquida. Essa normalização pode ser realizada através de uma abordagem de software por meio da qual a geração de sinal total, feita do experimento inteiro, é usada e comparada àquela das diversas amostras do paciente analisadas. Os valores médios e as propriedade em comum de todos os sinais serão alinhados para permitir quantificações dife- renciadas.

Em uma segunda abordagem, uma quantidade predeterminada de peptídeo padrão é adicionada à amostra. Essa adição será feita antes e depois, ou, antes e depois da digestão das amostras. Os padrões usados serão as seqüências do biomarcador atual sintetizadas como seqüências marcadas de isótopos, ou sem rotulação de isótopo, e em pico (spiked) com as amostras.

O uso de tecnologias de marcação dentro do campo de Proteô- micos para estudos de regulagem de proteína clínica quantitativa é altamen- te comum. Várias técnicas de marcação têm sido desenvolvidas e aplicadas utilizando uma variedade de químicas de ligação. Entre as marcas mais co- mumente usadas dentro do campo de proteômicos estão os rótulos ICAT e ITRAQ. Vide Parker et al., Mol. Cell. Proteomics, 625-659, 3, 2004; Ross et al., Cell. Proteomics, 3, 1153-1169, 2004; and DeSouza et al., J. Proteome Res., 2005, 4, 377- 386.

Separação de amostras

A HPLC (Cromatografia Líquida de Alto Desempenho) única-, ou multidimensional será usada com a alternativa preferida para separar proteí- nas ou peptídeos. A mistura de proteína ou peptídeo é passada por uma su- cessão de fases ou dimensões estacionárias cromatográficas que dá uma potência de resolução mais alta. A HPLC é adaptável para muitas aborda- gens experimentais, e várias fases estacionárias e móveis podem ser sele- cionadas para sua aplicabilidade em resolução de classes de proteínas ou peptídeos específicas de interesse, e para a compatibilidade de umas com as outras com os métodos espectométricos de massa a jusante de detecção e identificação. A HPLC é usada para separar amostras clínicas que foram digeridas por uma enzima proteolítica em que os produtos da enzima cor- respondente, as misturas de peptídeos, são geradas. Os procedimentos de preparação da amostra são aplicados às amostras de proteína tais como sangue, tecido, ou qualquer outro tipo de biofluido. Vide, por exemplo, Schul- te et al., Expert Rev. Diagn., 5(2), 2005, 145-157; Chertov et al., Expert Rev. Diagn., 5(2), 2005, 139-145; Adkins etal., Mol. Cell. Proteomics, 1 (12), 2002 947-955; Pieper et al., Proteomics. 2003 Jul;3(7): 1345-64; and Anderson, N. L. & Anderson, N. G. Mol. Cell Proteom.2002 1, 845-867.

A mistura de peptídeos correspondente é passada através de uma sucessão de fases ou dimensões estacionárias cromatográficas que dá uma potência de resolução alta. A HPLC é flexível para muitas abordagens experimentais; no ajuste da presente invenção é feita uma otimização que especificamente elimina a fração de alta abundância de proteínas expressas em amostras de sangue de ser humano, dessa maneira o enriquecimento é feito de proteínas na região de média- e baixa abundância. A separação de peptídeos e proteínas é baseada na seqüência de peptídeos, nos grupos funcionais da seqüência de peptídeos, como também nas propriedades físi- cas.

Princípios de Operação de MSBA

Antes de expor amostras para MSBA, uma etapa de manipula- ção e preparação da amostra é requerida na maioria dos casos. O objetivo de introduzir essa etapa anterior à metodologia de MSBA é para eliminar agentes de interferência e componentes de matriz, desse modo facilitando uma melhor detectabilidade total que resulta em um aumento do comentário, como também de sensibilidade total. Entretanto, em certas modalidades a preparação da amostra pode ser dispensada, particularmente se o biomar- cador é maior em abundância e a amostra é de baixa complexidade. Aque- les versados na técnica serão capazes de determinar se uma etapa de pre- paração é essencial.

A plataforma de MSBA pode ser operada em diversas maneiras diferentes, predominantemente determinadas pela natureza da amostra e sua complexidade.

As seqüências de proteínas de biomarcador são determinadas qualitativamente e quantitativamente na amostra do paciente através de aná- lise múltipla. Ambos os princípios de MSBA Marcados e não-marcados po- dem ser aplicados, empregando configurações de ensaio de MSBA de acor- do com dois princípios possíveis: o princípio de adição de padrão interno e o princípio de padrão não-interno.

Metodologia Geral

Após a preparação da amostra, esta é injetada na plataforma de MSBA. Em seguida, as operações a seguir são empreendidas;

Etapa IA

Primeiramente, o biomarcador de sinais de MS necessita ser identificado dentro da amostra.

Uma lista predefinida de massas de lista de Biomarcador +/- 1 Dálton que correlacionam-se com o índice de tempo de retenção e massa correspondente do respectivo biomarcador, é rastreada na amostra de bio- fluido. O índice de tempo de retenção relativa obtido na maioria dos ensaios de MSBA é definido em minutos e tem uma variabilidade de cerca de +/- 2%, embora essa cifra possa variar.

Essas etapas são executadas pela combinação espectral de massa em tempo real para o repositório de espectros de referência de MS- BA, como ilustrado na Figura 1.

Em seguida, é feita uma comparação das massas nos espectros de MS-com as massas da lista de referência de Biomarcadores, até cerca de +/-1 Dálton. Etapa IB

Quando a massa candidata ao biomarcador é identificada como aquela de um biomarcador que tem um espectro de MS combinando dentro da lista de referência, dentro de +/-1 Da1 a informação a esse respeito é sal- va no servidor de MSBA-. No caso em que a massa está incorreta, o rastre- amento de MSBA não salva arquivos espectrais para o servidor.

Essas operações são executadas por um compartilhar de arqui- vo e um mecanimso de comunicação inter-processos (tais como a comuni- cação do tipo cliente-servidor).

Etapa 2A

Quando a identidade da massa nos espectros de MS- é identifi- cada, a identificação da massa e a análise de identidade de seqüências é iniciada.

A etapa de combinação de padrão dentro do software MSBA identificará uma certa medida de similaridade, por exemplo a correlação de co-seno. Usando a medida de similaridade, a seqüência correta de proteínas é confirmada. Essa confirmação é feita por combinação espectral. A combi- nação espectral é executada por comparação dos espectros da amostra e os espectros de referência no banco de dados de MSBA. Para uma identidade positiva nessa etapa um fator de correlação de co-seno de 0,8 ou maior é requerida a fim de confirmar a seqüência de proteína acurada.

Valores de produtividade operacional equivalentes para medidas de similaridade alternativa estarão evidentes para aqueles versados na téc- nica.

A comparação e avaliação espectral de referência é realizada na maneira a seguir.

O espectro de MS/MS é representado como um lista de dubletos (m,v) em que m representa a relação de massa- para -carga, e ν significa o valor da intensidade de sinal de íon. Por m começando o intervalo de nib, (mi, = largura atual do bin) o espectro de MS/MS podem também ser ex- pressos por um vetor ν = [-y,.,.,-y }, em que seu comprimento («) é igual ao número de bins, e o valor de cada elemento é a soma de intensidade de to- dos os sinais dentro de cada bin. Esse é um perfil de representação de um espectro de MS/MS.

A correlação de Co-seno (S) de 2 espectros de MS/MS diferen- tes (Vt' V2) Pocle ser calculada como uma correlação de co-seno de acordo

com eq 1;

<formula>formula see original document page 24</formula>

O valor de S varia de O a 1. 0. Um valor de 0 significa que dois vetores são completamente independentes; no caso de um vetor de S com o valor=l, isso significa que a direção dos vetores é o mesmo.

Note que os dois vetores dos espectros de MS/MS devem ter o mesmo início, isto é, se o início de m de um vetor é 500-501, 501-502,... 1999-2000, então o outro espectro deve ser iniciado (binned) da mesma ma- neira. Conseqüentemente, o comprimento dos dois vetores deve ser o mes- mo.

A fim de julgar se os sinais de MS medidas são o biomarcador correto ou não, a porção de MS/MS dos sinais medidos é extraída e compa- rada com o espectro de referência de MS/MS da amostra usando por exem- plo a correlação co-seno descrita acima.

O valor da correlação de co-seno S é igual ou maior do que um valor de ponto inicial predefinido, por exemplo 0,8, depois os sinais medidos são julgados para ser derivados do biomarcador reputado no conjunto de referência.

A seção a seguir descreve como construir os espectros de refe- rência que são obtidos como um espectro específico de grupo de muitos pa- cientes individuais.

Para cada biomarcador candidato, uma vez que tal biomarcador é estabelecido, diversos espectros de MS/MS devem ser coletados para construir um mapa de espectro de MS/MS de referência. Esse é um espectro produzido em média a partir dos conjuntos de dados reais e medidos e é obtido por um cálculo aglomerado. Um exemplo da construção de tal espectro de referência é como a seguir:

(1) Coleta de espectros de MS/MS múltiplos para o biomarcador alvejado. Esses espectros de MS/MS devem ser confirmados como sendo derivados do biomarcador-alvo por MASCOT, SEQUEST ou outros progra- mas com um dado nível de confiança.

(2) É realizada a investigação da similaridade de cada espectro de MS/MS coletado com a semelhança mecionada acima. Isso é realizado por um cálculo do aglomerado usando a medida de similaridade. O cálculo do aglomerado é realizado até um ponto em que a medida de similaridade diminui até o valor do ponto inicial predefinido. Em seguida a esses cálculos de aglomerado, uma lista do sumário de todos os ions da seqüência de pro- teína restante dentro dos espectros de MS/MS é gerada. A etapa seguinte é a remoção dos íons da seqüencia restante na lista do sumário do cálculo de aglomerado.

(3) Usando o espectro de MS/MS do sumário estabelecido e qualificado a partir do aglomerado, é possível calcular a média aritmética para cada elemento do vetor do espectro. O vetor avaliado pode agora ser usado como espectro de referência de MS/MS.

(4) Durante o processo de aglomerado, é possível alcançar um resultado que gera mais do que uma referência do grupo de pacientes.

a) Nesse caso, existe mais de um aglomerado que contém uma diferença no mapa de perfil espectral de MS/MS. Os conjunto de critérios nessas situações é que esses grupos necessitam ter identificação de bio- marcador-alvo confiável. É depois possível gerar e fazer uso de mais de um espectro de referência para um alvo. Tais casos aparecem se houver íons de fragmento de MS/MS que são diferentes nos grupos mas correlatos a mesma proteína comentada.

b) É também possível chegar a situações com os dados de aná- lise de aglomerado em que existe uma diferença no mapa do perfil do bio- marcador. Isso significaria que podem ser estabelecidos diversos grupos de indivíduos a partir da coorte de pacientes, por exemplo, fenótipos diferentes. Nesses casos, o padrão múltiplo comparativo será um fenótipo específico. Entretanto, existirão também possibilidades do biomarcador se sobrepor en- tre os fenótipos.

Esses algoritmos de confirmação serão aplicados como usados em tempo real dentro das operações de rastreamento de alta produtividade operacional da plataforma de MSBA exemplificada abaixo.

Etapa 2B

O espectrometro de massa (por exemplo o Finnigan LTQ), uma vez que uma massa de biomarcador positiva tenha sido identificada, ficará nesse alvo de massa a fim de fazer rastreamentos repetidos do sinal de íon do biomarcador. O número de escaneamentos dependerá da combinação de classificações geradas para cada seqüência de proteína particular, mas será alinhada à identidade positiva do biomarcador. A janela de rastreamento se- rá determinada automaticamente pelo software de MSBA.

O critério para uma correlação positiva deverá ser maior ou igual a 0,8 em uma medida de similaridade de correlação de co-seno.

A próxima etapa que se sucede será fazer uma identidade esta- tisticamente significativa da seqüência de proteínas, utilizando instrumentos de pesquisa comerciais tais como MASCOT ou SEQUEST ou qualquer outro instrumento com banco de dados de proteínas, para confirmar que ela é a identidade do biomarcador correta.

O sitema MSBA irá somente armazenar e arquivar aqueles si- nais e arquivos de dados que estão dentro da área de massa e seqüência dos biomarcadores. Todos os outros dados gerados a partir do ensaio não são transferidos para o banco de dados de MSBA.

Etapa 3

Cálculo da leitura de ensaio de biomarcador múltiplo

O cálculo da leitura de ensaio de biomarcador múltiplo é realiza- do pela aplicação do algoritmo de MSBA que consiste de uma função de discriminação que calculará a classificação do diagnóstico de MSBA.

Uma função de discriminação é definida como uma função de X1,...,Xn , em que xi- representa uma intensidade de sinal absoluta ou rela- tiva de η do biomarcador /':th. A potência de uma função de discriminação deve ser um valor positivo ou negativo, de acordo com o resultado do diag- nóstico. Por exemplo, se o diagnóstico é positivo, o valor da potência da fun- ção de discriminação deve ser positivo e vice-versa.

Por exemplo, em Eq 2, a função de discriminação usada é esboçada:

<formula>formula see original document page 27</formula>

em que, η é o número de biomarcadores múltiplos usados para o diagnósti- co, Xi é a intensidade de sinal absoluta ou relativa do biomarcador i:th bio- marcador, e Xtotai é a intensidade de sinal total da medição de MS.

Existe também um fator de peso incluído nos algoritmos do software MSBA.

Um vetor {α1,...,αη,αθ] é um vetor de peso que determina a direção do vetor normal de um hiperplano separador que divide o espaço de intensidade de sinal n-dimensional em dois: diagnóstico positivo e diagnósti- co negativo. Um exemplo do procedimento para determinar o vetor de peso é descrito depois, entretanto vários tipos de algoritmos, por exemplo, Sup- port Vector Machine, Artificial Neural Network, e outros podem ser usados para determinar o vetor de peso.

Outro exemplo de uma função de discriminação está incluído nos algoritmos de MSBA e são definidos como a seguir:

<formula>formula see original document page 27</formula>

A função fp e fn é uma função arbitrária que dá uma medida de similaridade ou distância entre um conjunto de biomarcadores medidos em um paciente para ser diagnosticado e conjuntos de sinais de biomarcadores de referência no servidor de MSBA. fp denota a função de similaridade ou diferença das referências positivas de diagnósticos, e fn denota aquelas de diagnósticos negativas.

α e β são coeficientes que podem ser usados para desigualmen- te pesar as métricas de diagnóstico-positivo e diagnóstico-negativo. Se a função fp e fn dão uma medida de similaridade, então a a- mostra de um paciente será diagnosticada como positiva quando a equação 3 gerar um valor positivo. Se as funções dão medidas de distância, o valor positivo da eqn3 significa o diagnóstico negativo.

Um exemplo de tal função é a distância Euclideana, em que y, é a intensidade de sinal de biomarcador i:th em um paciente a ser diagnosti- cado,

<formula>formula see original document page 28</formula>

e X, é a intensidade de sinal de biomarcador i:th do conjunto de referência.

Outro exemplo é um erro-padrão do valor previsto na regressão:

<formula>formula see original document page 28</formula>

em que η é ο número de sinais de biomarcador, x, é a intensidde de sinal de z:th medida de uma amostra de um paciente, e y, é o valor previsto de cada χ, usando uma linha de regressão linear que foi calculada pelo menor qua- drado adaptado entre os x,'s medidos e os sinais de referência.

O esquema inteiro do software, incluindo os algoritmos que con- trolam cada etapa específica dentro do processo, é delineado na Figura 2.

Etapa 4

Anotação e quantificação de Biomarcador A plataforma de ensaio de MSBA se baseia em um: A) princípio de separação

B) princípio de não-separação

No caso do princípio de não separação somos capazes de fazer comentários e quantificações de biomarcador por: (a) análise de MS Direta

i) infusão direta de amostra biológica usando princípios de nano- electrospray estático. Agulhas de nanospray descartáveis são usadas, onde cada agu- lha de nanoelectrospray será somente exposta para uma amostra biológica, dessa maneira contornando a sobrecarga da amostra e efeitos de memória.

(ii) modo de análise de injeção de fluxo em que a amostra é inje- tada como um tampão. O volume da amostra escolhida dentro do plugue é diretamente relacionado à intensidade de sinal da respectiva seqüência do biomarcador. É também possível para biomarcadores de pouca abundância usar grandes (diversos ml) volumes de injeção de amostra, dessa maneira alcançando uma saturação (estado firme) da eficiência do sinal de íon do espectrometro de massa.

(iii) injeção de fluxo com enriquecimento da amostra por análise de MS- utilizando uma coluna de enriquecimento de extração da fase sólida cromatográfica. Essa etapa permite a limpeza total simultânea, através da eliminação de componentes da matriz dentro da amostra, e enriquecimento do traço de biomarcadores. A vantagem dessa abordagem é que é possível analisar biomarcadores a partir das origens da amostra com alta complexi- dade, por exemplo extratos de tecido.

Adicionalmente, no modo de enriquecimento da amostra (iii), somos capazes de gerar fatores de amplificação de sinal variando mas não restritos a 2-500. Adicionalmente, essa abordagem vai melhorar a detectabi- Iidade de biomarcadores expressa a níveis baixos, mas também a exatidão da anotação da seqüência de proteínas.

B) Na análise de separação, a cromatografia líquida (LC) inte- grada à identificação do biomarcador conta com a alta potência de resolução de LC que pode ser operada em um modo de coluna único (vide a Figura x), ou em um modo de multicolunas utilizando comutação de coluna onde as amostras são analisadas em um modo seqüencial, dessa maneira melho- rando a produtividade operacional da amostra.

Programação de MSBA

Aqui está um exemplo de código da parte do núcleo para calcu- lar um peso de vetor (ou um modelo) e para predizer diagnóstico usando algoritmo de Support Vector Machine. O código está escrito em Linguagem R-. Um modelo (modelo) será construído a partir do conjunto de dados de treinamento ("train"), e depois será utilizado para gerar uma predição (pred) para um dado conjunto de dados de teste (teste). Os conjuntos de dados "train" e "test" são estruturas de dados contendo números plurais de pontos de dados, que consistem em um objeto Diag contendo resultados de diag- nósticos (valor categórico: "Positivo" ou "Negativo". Os valores são vazios para o caso de pred), e um vetor contendo intensidade de sinal para cada biomarcador e uma intensidade de sinal total. A programação de MSBA con- tará com os dados gerados a partir da seqüência de proteínas realizada nos dois grupos de pacientes de onde os biomarcadores tiverem sido gerados.

A programação dentro do software MSBA é realizada da seguin- te maneira;

library(el071) model <- svm( Diag data = train ) ## a equação acima pode calcular o modelo, mas ela pode ser muito simples para refletir a eqn 2.

## vetores de suporte selecionados são: model$SV ## e vetores de peso são: modeIScoefs pred <- predict( modelo, teste)

Exemplos

Os exemplos a seguir são ilustrações de um estudo de câncer de pulmão que foi realizado ao traçar um perfil da proteína por LC-MS em amostras de sangue humano. Dois grupos de paciente foram analisados, o grupo de câncer de CASO e o de CONTROLE com diferenças de expressão de proteína diferencial analisadas.

Exemplo 1

Detalhes Experimentais

Aproximadamente 6 ml do sangue de cada paciente foram colhi- dos para um tubo de ensaio contendo sal de sódio de heparina e foram bem misturados 2 a 3 vezes. A seguir, foi submetido à centrifugação a 2,000 χ g por 10 min a 4°C. Três ml de plasma foram obtidos a partir de um sobrena- dante. A amostra foi armazenada congelada a -80°C. Em seguida, as proteí- nas foram extraídas do plasma e foram submetidas à digestão tríptica após depleção da albumina e IgG do plasma humano abundante. Alíquotas da amostra de plasma fracionada foram a seguir analisadas por LC-MS, e colo- cadas em seqüência por MS/MS, como previamente descrito [W006100446].

O Gráfico de MSBA

O gráfico de sumário do biomarcador multíplex apresenta os da- dos da expressão multíplex dos biomarcadores do paciente dentro do estudo de câncer do pulmão.

A leitura ("read-out") do diagnóstico do biomarcador multíplex 10 gerado a partir da metodologia de MSBA ilustra cada um e todos os biomar- cadores separadamente (vide a Figura 3). A diferença quantitativa, isto é, a diferença na mudança de vezes que já é conhecida e armazenada dentro da base de dados do MSBA (vide a Figura 1) é usada junto com as diferenças qualitativas para avaliar os biomarcadores. Os dados do biomarcador gera- dos a partir do estudo do câncer de pulmão identificam corretamente todos estes pacientes como positivos a partir da leitura de MSBA multíplex diag- nóstico.

Descobriu-se que a classificação de todos estes 10 pacientes encontra-se na faixa de 0,80 a 1,0.

A figura 4 mostra um exemplo de anotação de biomarcador feita a partir do ensaio multíplex, apresentado pelo espectro de MS onde o bio- marcador foi reconhecido pelo software de MSBA1 e pelo acompanhamento do espectro de MS/MS (vide a figura 4) que representa o biomarcador de CVLFPYGGCQGNGNK resultante. A combinação de MSBA, usando os es- pectros de biomarcador de referência na base de dados de MSBA aplicando a correlação de co-seno, mostra que o fator da correlação de co-seno é i- gual, ou maior do que 0,8.

A tabela 1 apresenta os detalhes da geração dos dados de MS- BA, onde as massas predefinidas dos biomarcadores regulados são analisadas. Tabela 1

<table>table see original document page 32</column></row><table> <table>table see original document page 33</column></row><table>

Exemplo 2

Um outro exemplo descrito como a seguir é derivado de uma doença de pulmão do estudo de CASO - CONTROLE que foi realizado ao traçar um perfil da proteína por LC-MS ema amostras de sangue humano. Dois grupos de paciente foram analisados, o grupo de doença de pulmão de CASO e o de CONTROLE com análise de expressão de proteína diferencial. Detalhes Experimentais

Os procedimentos de coleta de amostra de plasma e preparação foram os mesmos como no exemplo acima descrito.

Construção e Avaliação do Modelo de MSBA

Os dados de amostra de 46 pacientes consistindo em 10 casos e 36 controles foram usados para construir os modelos de MSBA. Foram construídos 5 modelos de MSBA diferentes contendo 14, 8, 26, 8, e 11 si- nais, respectivamente. Após a combinação dos 5 modelos, revelou-se que o (5o) modelo de MSBA final tinha capacidade de discriminação dominante. Assim, apenas o 5o modelo foi usado na etapa seguinte. As informações de LC-MS (tempo de retenção (min)/valor de MS (m/z)) dos 11 sinais do modelo final foram como a seguir: 11.6/485.2, 12.5/608.1, 18.3/547.0, 20.2/681.3, 21.1/575.1, 21.3/531.5, 25.5/561.6, 23.1/514.5, 32.5/682.2, 44.0/985.2, 48.7/945.8.

A fim de avaliar a capacidade de predição do modelo, tentou-se predizer o CASO/CONTROLE usando 10 casos e 9 controles como se eles fossem amostras cegas. De acordo com o procedimento de diagnose de MSBA descrito acima (também ilustrado na figura 2), os sinais de biomarca- dor multíplex 11 foram identificados para cada amostra de teste, e a quantifi- cação de cada sinal de pico foi realizada. A partir da quantidade de todos os sinais multíplex 11, a classificação de MSBA para cada indivíduo foi calcula- da usando a fórmula acima descrita (Eq. 5). Neste exemplo, os indivíduos cuja classificação de MSBA era igual ou maior do que 1 foram diagnostica- dos como casos (Tabela 2, diagnose de MSBA). Conseqüentemente, pode- ria se predizer todas as amostras corretamente, isto é, a capacidade de dis- criminação era de 100% (vide a figura 5).

Exemplo 3

O exemplo a seguir foi também derivado do estudo do CASO- CONTROLE da doença de pulmão realizado ao traçar o perfil da proteína por LC-MS em amostras de sangue humano com dois grupos de paciente (CASO e CONTROLE. Neste exemplo, um outro conjunto de biomarcadores multíplex foi usado para construir um modelo de MSBA, com um conjunto de dados do diferente de um tamanho ainda maior.

Detalhes Experimentais

Os procedimentos da coleta de amostra de plasma e preparação foram os mesmos do exemplo descrito acima.

Construção e Avaliação do Modelo de MSBA

Os dados de amostra de 96 pacientes consistindo em 21 casos e 75 controles foram usados como um conjunto de dados de treinamento. À medida que o número de amostras crescia, a variabilidade da amostra não aumentava. Assim, primeiramente aplicou-se o teste Smirnov para remover os pontos de divergência ("outlier"). Conseqüentemente, 5 amostras que continham pontos de divergência foram também removidas do conjunto de análise. Usando o resultado do teste t, construiu-se um modelo MSBA inicial contendo 100 sinais de biomarcador candidatos.

A seguir, ao aplicar recursivamente a análise discriminante para remover o sinal mínimo contribuído do modelo de discriminação, finalmente obteve-se um modelo de MSBA com 10 sinais. Vide a tabela 3 para a lista- gem de 10 sinais marcadores multíplex.

Neste exemplo, para calcular a classificação discriminante (z), foi usada uma outra função de classificação apresentada como a equação a seguir:

<formula>formula see original document page 35</formula>

(χ,: intensidade do sinal, a,& C: coeficientes descritos na Tabela 3)

Se o valor da classificação for positivo, ele é interpretado como CASO, senão CONTROLE.

A fim de avaliar a capacidade de predição do modelo, tentou-se predizer CASO/CONTROLE usando o mesmo conjunto de dados ( 21 casos + 75 controles, 96 no total). De acordo com o procedimento de diagnose de MSBA descrito acima (também ilustrado na figura 2), os sinais de biomarca- dor multíplex 10 foram identificados para cada amostra, e a quantificação de cada sinal de pico foi realizada. A partir da quantidade de todos os sinais multíplex 10, a classificação de MSBA para cada indivíduo foi calculada u- sando a fórmula descrita acima (Eq.6). Neste exemplo, os indivíduos cuja classificação de MSBA era igual ou maior do que 0 foram diagnosticados como casos. A tabela 4 e a figura 6 mostram os resultados de auto- discriminação. Na figura 6, cada ponto representa um paciente, e o eixo ver- tical representa a classificação discriminante (z). Neste exemplo, e a sensibi- lidade era de 85,7%, e a especificidade era de 82,7%, e a precisão de predi- ção era de 83,3%.

Tabela 2

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Tabela 3

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Tabela 4

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Claims (17)

1. Método para a determinação da presença de um ou mais bi- omarcadores de polipeptídeo em uma amostra, compreendendo as etapas de: (a) submeter a amostra a uma análise espectrométrica de massa (MS) e a gravação do índice do tempo de retenção e a massa corresponden- te para cada sinal detectado; (b) correlacionar a massa correspondente a cada sinal a uma base de dados de referência de massas de biomarcador para formar uma correlação entre cada sinal e um biomarcador de referência, e descartar a- queles sinais cujas massas não se correlacionam a uma massa de biomar- cador de referência; (c) armazenar aqueles sinais cujas massas se correlacionam a um biomarcador de referência; (d) confirmar a correlação entre cada sinal armazenado e um biomarcador de referência ao combinar o espectro de MS de cada sinal com o espectro de MS do biomarcador de referência na base de dados usando uma medida de similaridade, para definir um conjunto de sinais de correla- ção positiva; (d) medir a intensidade de cada sinal de correlação positiva e classificar sua intensidade de sinal absoluto ou sua intensidade de sinal rela- tivo usando uma função de discriminação; (e) aplicar um limite aos valores de classificação obtidos a partir da função de discriminação para determinar a presença ou ausência do bio- marcador.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a amostra de teste é submetida à análise de MS sem procedimentos de separação an- teriores.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que a amostra de teste é analisada por infusão direta usando os princípios da nanoeletro- pulverização estática, da análise por injeção de fluxo ou da injeção de fluxo com enriquecimento da amostra.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a amostra de teste é processada antes da análise de MS.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que o proces- samento da amostra compreende a separação da amostra por cromatografia líquida de alta pressão de múltiplas fases ou de fase única (HPLC).

6. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a MS é a MS de ionização por eletropulverização (ESI), MS por ioniza- ção de dessorção a laser auxiliada por matriz - tempo de vôo (MALDI- TOF) ou ionização de dessorção a laser intensificada na superfície - tempo de vôo (SELDI-TOF).

7. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a massa de referência e os dados espectrais de MS para uma pluralida- de de biomarcadores são armazenados na forma de papel ou eletrônica.

8. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que os espectros de MS de referência para um biomarcador definido são a média dos espectros atuais e dos dados medidos obtidos por um cálculo de agrupamento.

9. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que um ou mais padrões internos dos peptídeos de referência são adiciona- dos à amostra antes da análise por MS.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que os padrões internos são marcados com um marcador ("tag") molecular.

11. Método de acordo com a reivindicação 9, em que os padrões internos são marcados e incluídos no conjunto de dados principal.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, em que a intensi- dade de sinal absoluta é classificada pela medição da intensidade de sinal do biomarcador e a comparação da mesma com a intensidade de sinal de um ou mais padrões internos conhecidos.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -9, em que a amostra é processada sem a adição de padrões internos.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que a intensi- dade de sinal relativo é classificada pela medição da razão entre as intensi- dades de sinal do biomarcador individual em um paciente e a intensidade de sinal de referência para um grupo de paciente.

15. Método de acordo com a reivindicação 13, que é completa- mente automatizado.

16. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a função de discriminação para calcular a classificação da intensidade de sinal de MS opcionalmente incluí o uso de quaisquer variáveis clínicas tais como os re- sultados de exame clínico e/ou e da fenotipificação da observação clínica e/ou gravações médicas.

17. Método diagnóstico para determinar a presença de uma do- ença que compreende a comparação dos biomarcadores de seqüência de proteína de uma amostra de teste com biomarcadores de referência, em que os biomarcadores de referência compreendem os peptídeos identificados na Tabela 1.