BRPI0711137A2 - métodos e reagentes para detecção de suscetibilidade à doença enxerto versus hospedeiro ou mortalidade transplante-relacionada - Google Patents

Abstract

MéTODOS E REAGENTES PARA DETECçãO DE SUSCETIBILIDADE à DOENçA ENXERTO VERSUS HOSPEDEIRO OU MORTALIDADE TRANSPLANTE-RELACIONADA A presente invenção proporciona métodos para determinação da probabilidade e/ou gravidade de GvHD e da probabilidade da ocorrência de mortalidade transplante-relacionada.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS EREAGENTES PARA DETECÇÃO DE SUSCETIBILIDADE À DOENÇA EN-XERTO VERSUS HOSPEDEIRO OU MORTALIDADE TRANSPLANTE-RELACIONADA"

ESTABELECIMENTO COM RELAÇÃO À PESQUISA OU DESENVOLVI-MENTO FEDERALMENTE CUSTEADO

Nenhum fundo do governo foi usado para fazer a presente invenção.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Doença enxerto versus hospedeiro (GVHD) ocorre no contextode transplante. Em GVHD, células T doadoras rejeitam os tecidos e órgãosdo recipiente montando um ataque contra o corpo do recipiente. Um hospe-deiro de outras doenças envolvem desregulação do sistema imune do hos-pedeiro. Algumas são melhor tratadas com produtos farmacêuticos, algumascom produtos biológicos, outras com tratamentos tal como fotoferese extra-corporal e ainda outras têm opções de tratamento muito limitadas.

Foi mostrado que fotoferese extracorporal (ECP) é uma terapiaeficaz em determinadas doenças mediadas por células T. No caso de G-VHD, fotoferese tem sido usada como um tratamento em associação compomadas tópicas de triamcinolona, antifúngicos, antivirais, antibióticos, imu-noglobulinas e metotrexato. ECP também tem sido usada com agentes imu-nossupressores, tais como micofenolato mofetil, tacrolimus, prednisona, ci-closporina, hidroxicloroquina, esteróides, FK-506 e talidomida para cGVHD ecGVHD resistente. Para transplante de órgãos sólidos, ECP tem sido usadaem conjunto com agentes imunossupressores para reduzir o número de epi-sódios de rejeição aguda a aloenxerto associada a aloenxertos renais etransplantes cardíacos. Por exemplo, ECP tem sido usada com OKT3 e/ouos agentes imunossupressores ciclofosfamida, azatioprina e ciclosporinapara reverter rejeição aguda a aloenxerto renal. ECP também tem sido usa-da com ciclofosfamida, irradiação fracionada do corpo todo e etoposídeopara transplante de medula alogenéico para leucemia mielóide aguda, leu-cemia linfoblástica aguda, leucemia mielóide crônica, Iinfoma não Hodgkinou anemia aplástica grave.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Várias estratégias experimentais identificaram biomarcadoresfarmacodinâmicos para ECP. Análise citométrica de fluxo de amostras depaciente em experimentos de pGvHD indica que a abundância relativa dedeterminados subconjuntos de células dendríticas é previsível da propensãode desenvolver GvHD e também reflete o impacto de ECP sobre esse pro-cesso.

A correlação dos dados citométricos de fluxo com dados centraisde laboratório levou a biomarcadores candidatos adicionais que se correla-cionam com a proporção de DC e, portanto, eliminam a necessidade de es-tudos citométricos de fluxo. A presente invenção proporciona um conjunto demarcadores que são prontamente medidos e, quando analisados juntos, for-necem uma medida estatisticamente robusta de ação de ECP e progressãoda doença.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 mostra o experimento clínico e design de estudo.

A Figura 2 mostra fenotipificação citométrica de PBMC.

A Figura 3 mostra que perfis de DC prevêem GvHD grave. Sub-conjuntos de DC variam com o grau de GvHD. Mapa térmico da abundânciade DC o qual, junto com a plotagem de CD11c+/CD11cDC mostrada em (B)demonstram a diferença na expressão relativa desses subtipos de DC empacientes que depois sofreram GvHD. (C) e (D) mostram os resultados deanálise por regressão logística de marcadores na superfície celular. Aqui, aROC reflete a utilidade do marcador para discriminação entre populações deGvHD grave e de grau 0 ou 1. Um melhor teste tem uma ROC mais próximode 1, no pior teste a ROC é de 0,5.

A Figura 4 mostra que perfis de DC prevêem TRM.

A Figura 5 mostra modelamento com diferentes biomarcadores emostra que o melhor indicador de TRM encontrado no estudo é um modeloincluindo células CD11c+ DC e NK.

A Figura 6 mostra A) modelos prevendo GvHD. Com 59 resulta-dos, apenas contagens de monócitos - (ROC = 0,66) e neutrófilos (ROC =0,69) se aproximaram do poder previsível de subconjuntos de DC para G-vHD. B) Modelos que prevêem TRM. Combinações de valores de laboratórioe dados demográficos de pacientes proporcionaram modelos com poderprevisível acentuado para TRM. Os resultados são mostrados independen-temente (esquerda abaixo) e quando modelados em combinação (curva deROC à direita abaixo). A curva de ROC para o modelo incluía albumina, pro-porção de BUN/creatinina, compatibilidade do doador e relação de compati-bilidade e interação com albumina. C) Marcadores de superfície celular cor-relacionados e valores de laboratório. Valores de marcador de superfíciecelular foram comparados com resultados de laboratório usando correlaçãode Pearson para identificar alterações em perfis celulares e ensaios citomé-tricos.

DESCRIÇÃO DETALHA DA INVENÇÃO

Todas as referências citadas na presente Descrição são incorpo-radas na presente especificação em sua totalidade. Os termos "indivíduo" ou"paciente" são usados permutavelmente e se referem a um animal, de prefe-rência um mamífero e, mais preferivelmente, um ser humano.

Uma "população de células" geralmente inclui um tipo de célulaencontrado no sangue. O termo pode incluir um ou mais tipos de célulassangüíneas, especificamente células sangüíneas vermelhas, plaquetas ecélulas sangüíneas brancas. Uma população de células pode compreendersubconjuntos de células sangüíneas brancas, por exemplo, células T, célulasdendríticas, células B, etc. Em uma modalidade, uma população de célulaspode compreender uma mistura ou reservatório de tipos células. Alternati-vamente, uma população de células pode compreender um tipo substanci-almente purificado de células, por exemplo, células T ou células dendríticas.

"Procedimento de ECP" ou "ECP" se refere à fotoferese extra-corporal, também conhecida como fototerapia extracorporal. Ele é um trata-mento de uma população de células que foi submetida à luz UVA e um com-posto fotoativável. De preferência, a população de células é de um órgão outecido; mais preferivelmente, a população de células é de uma porção dosangue; e, mais preferivelmente, a população de células é um envoltório dacamada leucocitária. ECP é, algumas vezes, usada para se referir a um pro-cesso no qual uma população de células foi submetida a um procedimentode indução de apoptose com luz UVA na presença de um agente de ligaçãocruzada a DNA, tai como psoraleno (de preferência, 8-MOP).

Na modalidade mais preferida da invenção, ECP é usada parainduzir à apoptose. Isso envolve um composto fotoativável adicionado a umapopulação de células ex vivo. O composto fotossensível pode ser adminis-trado a uma população de células compreendendo células sangüíneas apóssua extração do indivíduo, recipiente ou doador, conforme possa ser o caso,e antes de ou contemporaneamente com exposição à luz ultravioleta. Ocomposto fotossensível pode ser administrado a uma população de célulascompreendendo sangue íntegro ou uma fração do mesmo, contanto que ascélulas sangüíneas ou componentes sangüíneos alvo recebam o compostofotossensível. Em outra modalidade, uma porção do sangue do indivíduo,sangue do recipiente ou sangue do doador primeiro deverá ser processadausando métodos conhecidos para remover substancialmente os eritrócitos eo composto fotoativo pode, então, ser administrado à população de célulasresultante compreendendo a fração de leucócitos enriquecida.

Em uma modalidade alternativa, o composto fotoativável podeser administrado in vivo. O composto fotossensível, quando administrado auma população de células compreendendo o sangue do indivíduo, sanguedo recipiente ou o sangue do doador, conforme possa ser o caso, in vivopode ser administrado oralmente, mas também pode ser administrado intra-venosamente e/ou através de outras vias de administração convencionais. Adosagem oral do composto fotossensível pode estar na faixa de cerca de 0,3a cerca de 0,7 mg/kg, mais especificamente cerca de 0,6 mg/kg. Quandoadministrado oralmente, o composto fotossensível pode ser administradopelo menos cerca de uma hora antes do tratamento de fotoferese e não maisdo que cerca de três horas antes do tratamento de fotoferese.

Compostos foto-ativáveis para uso de acordo com a presenteinvenção incluem, mas não estão limitados a, compostos conhecidos comopsoralenos (ou furocumarinas), bem como derivados de psoraleno, tais co-mo aqueles descritos, por exemplo, na Pat. U.S. No. 4.321.919 e Pat. U.S.No. 5.399.719. Compostos preferidos incluem 8-metoxipsoraleno; 4,5'8-trimetilpsoraleno; 5-metoxipsoraleno; 4-metilpsoraleno; 4,4-dimetilpsoraleno; 4-5'-dimetilpsoraleno; 4,-aminometil-4,5',8-trimetilpsoraleno; 4'-hidroximetil-4,5',8-trimetilpsoraleno; 4',8-metoxipsoraleno; e um 4'-(omega-amino-2-oxa)alquil-4,5'8-trimetilpsoraleno incluindo, mas não limitado a, 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno. Em uma modalidade, o composto fotossen-sível que pode ser usado compreende o derivado de psoraleno amotosalen (S-59) (Cerus, Corp., Concord, Calif.). Em outra modalidade, o compostofotossensível compreende 8-metoxipsoraleno (8 MOP).

A população de células à qual o composto fotoativável foi adicio-nado é tratada com uma luz de um comprimento de onda que ativa o com-posto fotoativável. A etapa de tratamento que ativa o composto fotoativável é, de preferência, realizada usando luz ultravioleta com comprimento de on-da longo (UVA), por exemplo, em um comprimento de onda dentro da faixade 320 a 400 nm. A exposição à luz ultravioleta durante o tratamento de foto-ferese é, de preferência, administrado durante uma extensão de tempo sufi-ciente para distribuir cerca de 1 -2 J/cm2 à população de células.

Aparelhos de fotoferese extracorporal úteis nos métodos de a-cordo com a invenção incluem aqueles fabricados pela Therakos, Inc., (Ex-ton, Pa.) sob a marca UVAR™. Uma descrição de tal aparelho é encontradana Pat. U.S. No. 4,683,889. O sistema UVAR™ usa um sistema de trata-mento e consiste em três fases, incluindo: 1) a coleta de uma fração da ca- mada leucocitária (enriquecida em leucócitos), 2) irradiação da fração dacamada leucocitária coletada e 3) re-infusão das células sangüíneas brancastratadas. A fase de coleta tem seis ciclos de etapas de extração de sangue,centrifugação e re-infusão. Durante cada ciclo, sangue íntegro é centrifugadoe separado em um vaso de ferese. A partir dessa separação, plasma (o vo- lume, em cada ciclo, é determinado pelo operador do instrumento UVAR™)e 40 ml de camada leucocitária são guardados em cada ciclo de coleta. Ascélulas vermelhas e todo o plasma adicional são reinfundidos ao pacienteantes de início do próximo ciclo de coleta. Finalmente, um total de 240 ml decamada leucocitária e 300 ml de plasma são separados e guardados parairradiação por UVA.

A irradiação do sangue enriquecido em leucócitos dentro do cir-cuito de irradiação começa durante a coleta de camada leucocitária do pri-meiro ciclo de coleta. O plasma e camada leucocitária coletados são mistu-rados com 200 ml de solução salina normal heparinizada e 200 mg de UVA-DEX™ (8-metoxipsoralina solúvel em água). Essa mistura flui em uma ca-mada de 1,4 mm de espessura através da Câmara de Fotoativação PHO-TOCEPTOR™, a qual é inserida entre dois grupos de lâmpadas de UVAPHOTOSETTE™. Lâmpadas de UVA PHOTOSETTE™ irradiam ambos oslados dessa câmara PHOTOCEPTOR™ UVA-transparente, permitindo umaexposição de 180 minutos à luz ultravioleta A, proporcionando uma exposi-ção média por linfócito de 1-2 J/cm2. O preparado de camada leucocitáriafinal contém uma estimativa de 20% a 25% do componente de células mo-nonucleares de sangue periférico total e tem um hematócrito de 2,5% a 7%.Após o período de fotoativação, o volume é reinfundido ao paciente duranteum período de 30 a 45 minutos. O pedido de patente U.S. No. de Ser.09/480.893 (incorporado aqui por referência) descreve outro sistema parauso em administração de ECP. As Pats. U.S. Nos. 5.951.509; 5.985.914;5.984.887, 4.464.166; 4.428.744; 4.398.906; 4.321.919; Publicações PCTNos. WO 97/36634; e WO 97/36581 também contêm descrição de dispositi-vos e métodos úteis a esse respeito.

Outro sistema que pode ser útil nos métodos da presente inven-ção é descrito no pedido de patente U.S. No. de Ser. 09/556.832. Esse sis-tema inclui um aparelho pelo qual o volume líquido de fluido coletado ou re-movido de um indivíduo pode ser reduzido durante ECP. A quantidade eficazde energia luminosa que é distribuída a uma população de células pode serdeterminada usando os métodos e sistemas descritos na Pat. U.S. No.6.219.584.

Uma variedade de outros métodos para indução de apoptose emuma população de células são bem conhecidos e podem ser adotados parauso na presente invenção. Um de tais tratamentos compreende sujeição deuma população de células à radiação ionizante (raios gama, raios x, etc.)e/ou radiação eletromagnética não ionizante, incluindo luz ultravioleta, aque-cimento, resfriamento, privação de soro, privação de fator de crescimento,acidificação, diluição, alcalinização, alteração da resistência iônica, privaçãode soro, irradiação ou uma combinação dos mesmos. Alternativamente, a-poptose pode ser induzida através de sujeição de uma população de célulasa ultra-som.

Ainda outro método de indução de apoptose compreende a apli-cação extracorporal de estresse oxidativo a uma população de células. Issopode ser obtido através de tratamento da população de células, em suspen-são, com agentes de oxidação química, tais como peróxido de hidrogênio,outros peróxidos e hidroperóxidos, ozônio, permanganatos, periodatos esemelhantes. Agentes de oxidação biologicamente aceitáveis podem serusados para reduzir problemas potenciais associados a resíduos e contami-nações da população de células apoptose-induzida assim formada.

No preparo da população de células apoptose-induzida, cuidadodeve ser tomado para não aplicar níveis excessivos de estresse oxidativo,radiação, tratamento com fármaco, etc. porque, de outro modo, pode haverum risco significativo de causar necrose de pelo menos algumas das célulassob tratamento. Necrose faz com que a membrana celular se rompa e a libe-ração de conteúdos celulares freqüentemente com resultados biologicamen-te prejudiciais, particularmente eventos inflamatórios, de modo que a pre-sença de células necróticas e seus componentes, junto com a população decélulas compreendendo células apoptóticas é melhor evitada. Níveis apro-priados de tratamento da população de células para induzir à apoptose e otipo de tratamento escolhido para induzir à apoptose são prontamente de-termináveis por aqueles versados na técnica.

Um processo de acordo com a presente invenção envolve a cul-tura de células do indivíduo ou uma linhagem de célula de mamífero compa-tível. As células cultivadas podem, então, ser tratadas extracorporalmentepara induzir à apoptose e criar uma população de células da mesma. O tra-tamento extracorporal pode ser selecionado do grupo consistindo em anti-corpos, agentes quimioterapêuticos, radiação, fotoferese extracorporal, ultra-som, proteínas e agentes de oxidação. As células, suspensas no plasma doindivíduo ou outro meio de suspensão adequado, tal como solução salina ouum meio de cultura de células de mamífero equilibrado podem, então, seradministradas ao paciente.

Métodos para a detecção e quantificação de apoptose são úteispara determinação da presença e nível de apoptose no preparado a ser ad-ministrado ao indivíduo na presente invenção. O número de células apoptóti-cas em uma população de células requerido para obter o benefício clínicodesejado em um indivíduo pode variar, dependendo da fonte de células, dacondição do indivíduo, da idade e peso do indivíduo e outros fatores relevan-tes, os quais são prontamente determináveis através de métodos bem co-nhecidos. De preferência, o número de células apoptóticas que são adminis-tradas a um paciente é de 0,1 a 50 bilhões, mais preferivelmente 1 a 10 e,ainda mais preferivelmente, 2,5 a 7,5 bilhões.

Em uma modalidade, células que sofrem apoptose podem seridentificadas por um "laddering" característico de DNA observado quando deeletroforese em gel de agarose, resultante da clivagem de DNA em uma sé-rie de fragmentos. Em outra modalidade, a expressão na superfície de fosfa-tidil serina sobre células pode ser usada para identificar e/ou quantificar umapopulação de células apoptose-induzida. Medição de alterações no potencialda membrana mitocondrial, que refletem alterações na permeabilidade damembrana mitocondrial, é outro método reconhecido de identificação deuma população de células. Uma série de outros métodos de identificação decélulas que sofreram apoptose e de uma população de células, muitos u-sando anticorpos monoclonais contra marcadores específicos para uma po-pulação de células, foram também descritos na literatura específica.

Rejeição aguda a transplante de órgãos sólidos ocorre em 30%a 60% dos pacientes após transplante de pulmão e, em um grau menor, comfígado, coração, rim, etc. em virtude do sucesso de agentes imunossupres-sores. A reação imune a linfócito (célula)-mediada contra antígenos detransplante é o principal mecanismo de rejeição aguda. Uma rejeição crônicaou retardada causa destruição do enxerto em meses a anos após transplan-te e é caracterizada por destruição vascular que leva à necrose do tecidotransplantado. Essa rejeição não é atualmente suprimida, até grande ponto,pelos regimes padrões e, assim, a necessidade de tolerância imune maissustentável é uma necessidade não reunida significativa.

Deterioração tardia do enxerto ocorre ocasionalmente e essetipo crônico de rejeição freqüentemente progride insidiosamente, a despeitode terapia imunossupressora aumentada. O quadro patológico difere daque-le de rejeição aguda. O endotélio arterial está primariamente envolvido, comproliferação extensiva que pode gradualmente obstruir o lúmen do vaso, re-sultando em isquemia e fibrose do enxerto.

Imunossupressores são atualmente usados amplamente paracontrolar a reação de rejeição e são primariamente responsáveis pelo su-cesso do transplante. Contudo, esses fármacos suprimem todas as reaçõesimunológicas, assim, tornando a infecção devastadora que leva à causa demorte em recipientes de transplante.

O tratamento imunossupressor existente pode diferir no caso dediferentes tipos de transplantes. Aloenxertos de fígado são menos agressi-vãmente rejeitados do que outros aloenxertos de órgãos. Por exemplo, rejei-ção hiperaguda a um transplante de fígado não ocorre invariavelmente empacientes que foram pré-sensibilizados a antígenos de HLA ou incompatibili-dades ABO. Terapia imunossupressora típica em adultos envolve o uso deciclosporina, usualmente fornecida IV a 4 a 6 mg/kg/dia, começando no mo-mento de transplante e, então, 8 a 14 mg/kg/dia p.o. quando alimentação étolerada. As doses são ajustadas para menos se disfunção renal ocorre e osníveis no sangue são usados como medidas aproximadas de dosagem ade-quada.

Em transplante de coração, regimes imunossupressores são si-milares àqueles para transplante de rim ou fígado. Contudo, em transplantesde pulmão e coração-pulmão, rejeição aguda ocorre em >80% dos pacien-tes, mas pode ser gerenciada com sucesso. Os pacientes são tratados comcorticosteróides, fornecidos rapidamente IV em alta dosagem, ATG ouOKT3. ALG ou OKT3 profilático também é freqüentemente fornecido duranteas primeiras duas semanas pós-transplante. Transplante de pâncreas é úni-co dentre os transplantes de órgãos vascularizados: ao invés de ser usadopara saivar uma vida, ele tente estabilizar ou prevenir as complicações de-vastadoras sobre o órgão alvo de diabetes do tipo I. Em virtude do fato de orecipiente trocar os riscos da injeção de insulina pelos riscos de imunossu-pressão, o transplante de pâncreas geralmente tem sido limitado a pacientesque já precisam receber fármacos imunossupressores (isto é, diabéticoscom insuficiência renal que estão recebendo um transplante de rim).

Pacientes com leucemia mielóide ou linfoblástica aguda podemse beneficiar de transplante de medula óssea (BMT). BMT pediátrica tem seexpandido em virtude de seu potencial para cura de crianças com doençasgenéticas (por exemplo, talassemia, anemia de células falsiformes, imunode-ficiências, erros congênitos de metabolismo). Outra opção para BMT étransplante autólogo (remoção da própria medula do paciente quando umaremissão completa tenha sido induzida, seguido por tratamento ablativo dopaciente com a esperança de destruição de qualquer tumor residual e resga-te da própria medula óssea do paciente). Uma vez que um auto-enxerto éusado, nenhuma outra imunossupressão é necessária que não a quimiote-rapia em alta dose a curto prazo usada para erradicação de tumor e ablaçãoda medula óssea; problemas pós-transplante com GVHD são mínimos.

A taxa de rejeição é <5% em transplantes de pacientes com leu-cemia a partir de doadores HLA-idênticos. Para pacientes com múltiplastransfusões com anemia aplástica, a taxa de rejeição também tem sido signi-ficativamente diminuída em virtude de imunossupressão aumentada duranteindução de transplante. Todavia, complicações podem surgir, incluindo rejei-ção pelo hospedeiro do enxerto de medula, GVHD aguda e infecções. Com-plicações tardias incluem GVHD crônica, imunodeficiência prolongada e re-corrência da doença.

Os métodos da presente invenção também podem ser usadosem cirurgia de implante, por exemplo, com cirurgia de implante comumenterealizada em cirurgia plástica cosmética ou não-cosmética. Tais implantespodem incluir dental, enxerto de gordura, por exemplo, nas bochechas, lá-bios e nádegas, implantes faciais, incluindo aqueles do nariz, bochecha, tes-ta, queixo e crânio, implantes na nádega, implantes de mama, etc. Outrosimplantes incluem, mas não estão limitados a, anel corneal, cortical, orbital,coclear, muscular (todos os músculos, incluindo peitoral, gluteal, abdominal,panturrilha, soleus, bíceps, tríceps), articulação aloplástica e reposição ós-sea, raiz vertebral, implante de células-tronco ou fetais.

O desenvolvimento hematopoiético de células dendríticas (DC),células apresentando antígeno (APCs) potentes, é distinto e pode seguir di-versas vias precursoras, algumas intimamente relacionadas a monócitos.DCs podem ser derivadas de um precursor linfóide. Thomas e outros (1993)J. !mmunol. 150: 821 834. Assim como no sangue, podem existir três sub-conjuntos distintos de DCs presentes no timo: 1) DCs CD4+ CD11c- plas-macitóides; 2) DCs CD4+ CD11 c+; e 3) DCs de interdigitação.

A geração de grandes números de DCs para uso clínico poten-cial foi recentemente realizada através da cultura in vitro de progenitorescom citocinas. Várias estratégias têm sido adotadas para introduzir antíge-nos em células dendríticas, de modo que elas sejam mais eficazmente apre-sentadas a células T no contexto de co-estimulação. Também, foi mostradoque células dendríticas podem influenciar a resposta de células T ao antíge-no para acompanhar uma via humoral ou sistêmica.

DCs são APCs que são essenciais para início de respostas imu-nes primárias e o desenvolvimento de tolerância. DCs expressam MHC, ne-cessário para estimulação de populações de células T naive. O desenvolvi-mento hematopoiético de DCs é distinto e pode seguir diversas vias precurso-ras, algumas das quais estão intimamente relacionadas a monócitos. Veja, porexemplo, Avigan (1999) Blood Rev. 13: 51-64. Diferentes subconjuntos de DCstêm vias de desenvolvimento distintas. O conceito emergente é que um sub-conjunto de DC tem funções regulatórias que podem contribuir para a induçãode tolerância a auto-antígenos. Austyn (1998) Curr. Opin. Hematol. 5: 3-15.

Estudos sobre DCs em sangue foram atrasados pela escassezde células e a falta relativa de marcadores na superfície celular DC-específicos. Métodos para isolamento de DC são baseados em alteração namaturação após um curto período de cultura, tal como a aquisição de baixadensidade flutuante ou a expressão de antígenos de ativação/maturação deDC (CD83, CMRF-44 e CMRF-56). Young e outros (1988) Cell Immunol.111: 167; e Van Voorhis e outros (1982) J. Exp. Med. 155: 1172.

O isolamento de DCs do sangue contava anteriormente comuma multiplicidade de critérios imunofenotípicos, tais como a ausência deum painel de antígenos linhagem de leucócito (lin)-específicos (por exemplo,CD3, CD14, CD19 e CD56) e a presença de HLA-DR, CD4 ou CD33. Roma-ni e outros (1996) J. Immunol. Met. 196: 137 151.

A partir de análises de DCs isoladas de sangue não cultivado, setornou evidente que DCs sangüíneas não são uma população de célulashomogênea, mas uma mistura de pelo menos duas populações. Thomas eoutros (1994). A primeira sub-população de DCs sangüíneas são DCsCD123bnght CD11c", as quais possuem uma morfologia de plasmacitóide epotente função estimulatória de células Τ. A segunda sub-população de DCssangüíneas é CD123dim CD11cbri9ht, as quais são de aparência monocitóide,expressam CD45RO e se desenvolvem espontaneamente em DCs madurastípicas, mesmo quando cultivadas sem quaisquer citocinas exógenas. DCsCD123bnght CD11c" plãsmacitóides mostram algumas características, tal co-mo a expressão da receptor de pré-células T de cadeia α, o que indica queelas podem se originar de precursores linfóides. Bruno e outros (1997) J.Exp. Med. 185: 875 884. DCs CD123dim CD1 Icbright mostram todos os crité-rios de DCs mielóides. DCs semelhantes à DCs CD123bright CD11c" plasma-citóides foram detectadas em áreas ricas em células T de tecido linfóide eforam, inicialmente, designadas erroneamente como células T plasmacitói-des ou monócitos plasmacitóides em virtude de sua morfologia e fenotipo.Grouard e outros (1997) J. Exp. Med. 185: 1101-111.

Agora, foi descoberto um subconjunto de DCs e um método deanálise do mesmo como um método de detecção de suscetibilidade à G-VHD, progressão e tratamento de GVHD e como um biomarcador para ECP.A prevenção de GvHD e conseqüências clínicas (pelo menosparcialmente como um resultado de ECP) são refletidas na proporção deCD11c+ para CD11c- em sangue periférico e sua alteração após ECP.

Conforme demonstrado por sua identificação em um experimentoclínico, esse biomarcador pode ser medido confiavelmente com pouca sofisti-cação requerida pelo médico, além de flebotomia. Todavia, medição citométri-ca de fluxo é uma técnica sofisticada e requer mais perícia técnica do que édesejável na maioria das aplicações. Os conjuntos de dados ricos derivadosde experimentos de pGvHD têm criado várias oportunidades para identificarbiomarcadores adicionais que se correlacionam com a presença desse sub-conjunto de DCs e que são mais prontamente medidos (veja abaixo).

Um biomarcador é qualquer indício do nível de expressão de umgene marcador indicado, O indício pode ser direto ou indireto e medir a su-per- ou sub-expressão do gene dados os parâmetros fisiológicos e em com-paração com um controle interno, tecido normal ou outro carcinoma. Biomar-cadores incluem, sem limitação, ácidos nucléicos (super- e sub-expressão edireto ou indireto). Uso de ácidos nucléicos como biomarcadores pode incluirqualquer método conhecido na técnica incluindo, sem limitação, medição deamplificação de DNA, RNA, micro RNA, perda de heterozigosidade (LOH),polimorfismos de um único nucleotídeo (SNPs, Brookes (1999)), DNA mi-crossatélite, hipo- ou hiper-metilação de DNA. Uso de proteínas como bio-marcadores inclui qualquer método conhecido na técnica incluindo, sem limi-tação, medição da quantidade, ativação, modificações, tais como glicosila-ção, fosforilação, ADP-ribosilação, ubiquitinação, etc. ou imunohistoquímica(IHC). Outros biomarcadores incluem, formação de imagem , contagem decélulas e marcadores de apoptose.

Um ácido nucléico marcador corresponde à seqüência designa-da por uma SEQ ID NO quando ela contém essa seqüência. Um segmentoou fragmento de gene corresponde à seqüência de tal gene quando ele con-tém uma porção da seqüência em questão ou seu complemento suficientepara distinguir a mesma como sendo a seqüência do gene. Um produto daexpressão de gene corresponde a tal seqüência quando seu RNA, mRNA,miRNA ou cDNA se hibridiza à composição tendo tal seqüência (por exem-plo, uma sonda) ou, no caso de um peptídeo ou proteína, ele é codificadapor tal mRNA. Um segmento ou fragmento de um produto de expressão degene corresponde à seqüência de tal gene ou produto da expressão de genequando ela contém uma porção do produto de expressão de gene em ques-tão ou seu complemento suficiente para distinguir a mesma como sendo aseqüência do gene ou produto de expressão do gene.

Os métodos da invenção, composições, artigos e kits descritos ereivindicados no presente relatório descritivo incluem um ou mais genesmarcadores. "Marcador" ou "gene marcador" é usado por todo o presenterelatório descritivo para se referir a genes e produtos de expressão de geneque correspondem a qualquer gene, a super- ou sub-expressão do qual estáassociada a uma probabilidade da ocorrência de GvHD ou TRM.

A presente invenção ainda proporciona microarranjos ou lascasde gene para realização dos métodos descritos aqui.

A presente invenção ainda proporciona portfolios diagnósti-cos/prognósticos contendo reagentes adequados para medição de biomar-cadores, tais como seqüências de ácido nucléico isoladas, seus complemen-tos ou porções das mesmas de uma combinação de genes conforme descri-to aqui, onde a combinação é suficiente para medir ou caracterizar a expres-são de gene em uma amostra biológica.

Qualquer método descrito na presente invenção pode ainda in-cluir medição de expressão de pelo menos um gene constitutivamente ex-presso na amostra.

A invenção ainda proporciona um método para fornecer orienta-ção de terapia através de determinação da probabilidade de GvHD ou TRMde acordo com os métodos descritos aqui e identificação do tratamento a-propriado para os mesmos.

A invenção ainda proporciona um método para fornecer umprognóstico para determinação da probabilidade de GvHD ou TRM de acor-do com os métodos descritos aqui e identificação do prognóstico correspon-dente para os mesmos.A invenção ainda proporciona um método para descobrir bio-marcadores compreendendo determinação do nível de expressão de umgene marcador, medição de um biomarcador para o gene marcador a fim dedeterminar a expressão do mesmo, análise da expressão do gene marcadorde acordo com os métodos descritos aqui e determinação se o gene marca-dor é eficazmente específico para GvHD ou TRM.

A invenção ainda proporciona kits, artigos, microarranjos ou las-cas de gene, portfolios diagnósticos/prognósticos para conduzir os ensaiosdescritos aqui e relatórios de pacientes para reportar os resultados obtidosatravés dos presentes métodos.

Descobriu-se que a mera presença ou ausência de seqüênciasde ácido nucléico particulares em uma amostra tecidual raramente tem valordiagnóstico ou prognóstico. Informação sobre a expressão de várias proteí-nas, peptídeos ou mRNA, por outro lado, vem sendo crescentemente consi-derada como importante. A mera presença de seqüências de ácido nucléicotendo o potencial de expressar proteínas, peptídeos ou mRNA (tais seqüên-cias referidas como "genes") dentro do genoma em si não é determinante seuma proteína, peptídeo ou mRNA é expresso em uma determinada célula.Se um determinado gene capaz ou não de expressar proteínas, peptídeosou mRNA assim o faz e em que extensão tal expressão ocorre, se ocorre, édeterminado por uma variedade de fatores complexos. A despeito de dificul-dades na compreensão e avaliação desses fatores, ensaio da expressão degene pode fornecer informação útil sobre a ocorrência de eventos importan-tes, tais como GvHD ou TRM, e outros fenômenos clinicamente relevantes.Indicações relativas do grau até o qual os genes são ativos ou inativos po-dem ser encontradas em perfis de expressão de gene.

Métodos preferidos para estabelecer perfis de expressão de ge-ne incluem determinação da quantidade de RNA que é produzido por umgene que pode codificar uma proteína ou peptídeo. Isso é realizado atravésde PCR com transcriptase reversa (RT-PCR), RT-PCR competitiva, RT-PCRem tempo real, RT-PCR com visualização diferencial, análise de NorthernBlot e outros testes relacionados. Embora seja possível conduzir essas téc-nicas usando reações de PCR individuais, é melhor amplificar DNA comple-mentar (cDNA) ou RNA complementar (cRNA) produzido a partir de mRNA eanalisá-lo via microarranjo. Uma série de diferentes configurações de arran-jos e métodos para sua produção são conhecidos por aqueles versados natécnica e são descritos, por exemplo, 5445934; 5532128; 5556752;5242974; 5384261; 5405783; 5412087; 5424186; 5429807; 5436327;5472672; 5527681; 5529756; 5545531; 5554501; 5561071; 5571639;5593839; 5599695; 5624711; 5658734; e 5700637.

Tecnologias de microarranjo permitem a medição do nível demiRNA ou mRNA em estado uniforme de milhares de genes simultaneamen-te, proporcionando uma ferramenta poderosa para a identificação de efeitos,tais como o início ou modulação de GvHD. Duas tecnologias de microarranjoestão atualmente em amplo uso, arranjos de cDNA e oligonucleotídeo. Em-bora existam diferenças na construção dessas lascas, essencialmente todaa análise de dados a jusante e rendimento são os mesmos. O produto des-sas análises são, tipicamente, medições da intensidade do sinal recebido deuma sonda rotulada usada para detectar uma seqüência de cDNA a partir daamostra que se hibridiza a uma seqüência de ácido nucléico em um localconhecido sobre o microarranjo. Tipicamente, a intensidade do sinal é pro-porcional à quantidade de cDNA e, assim, mRNA ou miRNA, expresso nascélulas da amostra. Um grande número de tais técnicas está disponível eútil. Métodos preferidos podem ser encontrados em 6271002; 6218122;6218114; 6004755; e Keene e outros (2006) RIP-Chip: the isolation and i-dentification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleo-protein complexes from cell extracts Nature Protocols 1: 302-307.

Análise dos níveis de expressão é conduzida comparando taisintensidades de sinal. Isso é feito melhor através de geração de uma matrizde proporção das intensidades de expressão de genes em uma amostra deteste versus aquela em uma amostra de controle. Por exemplo, as intensi-dades de expressão de gene de um tecido doente podem ser comparadascom as intensidades de expressão geradas de tecido normal do mesmo tipo.Uma proporção dessas intensidades de expressão indica a alteração na ex-pressão de gene entre amostras de teste e de controle.

A seleção pode ser baseada em testes estatísticos que produ-zem listas graduadas relacionadas à evidência de significância para expres-são diferencial de cada gene entre fatores relacionados à GvHD ou TRM.

Exemplos de tais testes incluem ANOVA e Kruskal-Wallis. As classificaçõespodem ser usadas como pesos em um modelo projetado para interpretar asoma de tais pesos, até um corte, como a preponderância de evidência afavor de uma classe com relação à outra. Evidência anterior, conforme des-crito na literatura, também pode ser usada para ajustar os pesos.

Perfis de expressão de gene podem ser visualizados em umasérie de formas. A mais comum é dispor intensidades de fluorescência brutaou matriz de proporção em um dendograma gráfico onde as colunas indicamamostras de teste e as fileiras indicam genes. Os dados são dispostos demodo que genes que têm perfis de expressão similares estejam próximosuns dos outros. A proporção de expressão para cada gene é visualizadacomo uma cor. Por exemplo, uma expressão de menos de um (sub-regulação) aparece na porção azul do espectro, enquanto que uma propor-ção maior do que um (super-regulação) aparece na porção vermelha do es-pectro. Programas de software de computador comercialmente disponíveisestão disponíveis para visualizar tais dados, incluindo "GeneSpring" (SiliconGenetics, Inc.) e "Discovery" e "Infer" (Partek, Inc.).

No caso de medição de níveis de proteína para determinar ex-pressão de gene, qualquer método conhecido na técnica é adequado, con-tanto que ele resulte em especificidade e sensibilidade adequadas. Por e-xemplo, os níveis de proteína podem ser medidos através de ligação a umanticorpo ou fragmento de anticorpo específico para a proteína e medição daquantidade de proteína anticorpo-ligada. Anticorpos podem ser rotuladosatravés de reagentes radioativos, fluorescentes ou outros detectáveis parafacilitar a detecção. Métodos de detecção incluem, sem limitação, ensaioimunoabsorvente enzima-ligado (ELISA) e técnicas de imunoblot.

Os perfis de expressão de gene da presente invenção podemtambém ser usados em conjunto com outros métodos diagnósticos não ge-néticos úteis em diagnóstico, prognóstico ou monitoramento de tratamento.Por exemplo, em algumas circunstâncias, é benéfico combinar o poder diag-nóstico dos métodos baseados em expressão de gene descritos acima comdados de marcadores convencionais, tais como marcadores de proteína nosoro. Em tal método, sangue é periodicamente coletado de um paciente e,então, submetido a um imunoensaio enzimático para marcadores no soro, talcomo albumina. Quando a concentração do marcador sugere a probabilida-de de GvHD ou TRM, uma fonte de amostra passível de análise de expres-são de gene é tomada. Essa abordagem pode ser particularmente útil quan-do testagem adicional produz resultados ambíguos.

Kits feitos de acordo com a invenção incluem ensaios formatadospara determinação da expressão de biomarcador. Esses podem incluir todosou alguns materiais necessários para conduzir os ensaios, tais como reagen-tes e instruções e um meio através do qual biomarcadores são ensaiados. Os artigos da presente invenção incluem representações da ex-pressão de biomarcador úteis para o tratamento, diagnóstico, prognóstico e,de outro modo, avaliação de doenças. Essas representações de perfil sãoreduzidas para um meio que pode ser automaticamente lido por uma máqui-na, tal como meios legíveis em computador (magnéticos, ópticos e seme-lhantes). Os artigos podem também incluir instruções para avaliação dosperfis de expressão de gene em tais meios. Por exemplo, os artigos podemcompreender um CD ROM tendo instruções de computador para compara-ção de perfis de expressão de gene dos portfolios de genes descritos acima.Os artigos também podem ter perfis de expressão de gene digitalmente re-gistrados nos mesmos, de modo que eles podem ser comparados com da-dos de expressão de gene de amostras de um paciente. Alternativamente,os perfis podem ser registrados em um formato representacional diferente.Um registro gráfico é um de tais formatos. Algoritmos de agrupamento, taiscomo aqueles incorporados nos softwares "DISCOVERY" e "INFER" da Par-tek, Inc. mencionados acima podem auxiliar melhor na visualização de taisdados.

Diferentes tipos de artigos de fabricação de acordo com a inven-ção são meios ou ensaios formatados usados para revelar perfis de expres-são de gene. Esses podem compreender, por exemplo, microarranjos nosquais complementos de seqüência ou sondas são afixadas a uma matriz àqual as seqüências indicativas de genes de interesse se combinam, criandouma determinante legível de sua presença. Alternativamente, artigos de a-cordo com a invenção podem ser feitos em kits de reagentes para conduzirhíbridização, amplificação e geração de sinal indicativa do nível de expres-são dos genes de interesse para prever GvHD ou TRM.

Os exemplos a seguir são fornecidos para ilustrar, mas não Iimi-tar, a invenção reivindicada. Todas as referências citadas aqui são aqui in-corporadas por referência.

Exemplo 1

I. Candidato 1 a Biomarcador: subconjuntos de células dendríticas de san-gue periférico: (biomarcador previsível de doença, mecanismo de ação debiomarcador (MOA), biomarcador de eficácia de tratamento)

Análise citométrica de fluxo de amostras de sub-estudo de umexperimento de prevenção de GvHD mostrou uma diferença estatisticamentesignificativa na proporção de células dendríticas CD11c+ e CD11c- (célulasmononucleares lin-/HLADR+, expressas como uma fração de células mono-nucleares) no sangue periférico de pacientes que sofreram GvHD de graudois, três ou quatro comparado com pacientes que desenvolveram nenhumaou apenas GvHD branda ("sem GvHD", grau zero ou um). Os resultados sãomostrados nas Tabelas 1 e 2. A Figura 1 esboça o experimento e a Figura 2mostra fenotipificação citométrica de PBMC.

Tabela 1

<table>table see original document page 20</column></row><table>Fio examinado, sangue de um subconjunto de 32 pacientes tra-tados com ECP para identificar marcadores na superfície celular de sangueperiférico que poderiam prever GvHD e TRM. Amostras foram extraídas i-mediatamente antes de ECP (na linha de base) e imediatamente após ECP,mas antes de condicionamento mieloablativo, então, avaliadas através decitometria de fluxo. Dados de citometria foram agrupados e modelados paraavaliar sua precisão prognostica sozinhos ou em combinação com valoresclínicos de laboratório. Regressão logística mostrou que marcadores parasubconjuntos de DC específicos presentes antes de mieloablação eram osmelhores indicadores dos resultados. A probabilidade de GvHD de grau II-IV(aGvHD) aumenta quando células mielóides lin- HLA-DR+ CD11c+de linhade base compõem uma proporção menor de células Lin- HLA-DR+ em circu-lação com uma precisão prognostica, refletida na área sob a curva de recep-tor-operador (ROC) de 0,83. O melhor modelo prognóstico para TRM foi umamenor abundância absoluta de DCs plasmacitóides lin- HLA-DR+ CD123+em circulação na linha de base (ROC = 0,86). Nenhum poder prognósticoadicional surge com relação a aGvHD ou TRM após inclusão de valores delaboratório. Contudo, modelos que combinam determinados resultados clíni-cos de laboratório e fatores demográficos também prevêem esses resultadosclínicos e oferecem uma possível alternativa a ensaios citométricos comple-xos. O melhor de tais modelos incluía medições de linha de base da propor-ção de BUN/creatinina, albumina no soro e os dados de compatibilida-de/relação do doador do enxerto e do recipiente (ROC = 0,82, n = 59) paraTRM, enquanto que as contagens de neutrófilos de linha de base eram maisprognósticas de aGvHD (ROC = 0,69, n = 60). Em suma, foram identificadosbiomarcadores, incluindo subconjuntos de DCs do hospedeiro, testes clíni-cos prontamente medidos e fatores demográficos que, pelo menos em paci-entes que receberam ECP, estão presentes antes de condicionamento epodem prever resultados.

Quando contagens de células DC absolutas são considerados,se torna evidente que a contribuição relativa de DCs CD11 c+ e CD11 c- pa-ra uma determinada população de células de sangue periférico pode ser umindicador do eventual desenvolvimento de GvHD nesse paciente. Especifi-camente, a proporção de células DC CD11c+ para CD11c- em uma determi-nada amostra do paciente de desvio daquela de um paciente que não de-senvolve subseqüentemente GvHD grave (grau 2 a 4) para tão baixo quanto 0,006 em pacientes que desenvolvem depois GvHD grave.

Padrões nos dados ilustram a rigorosidade desse biomarcador.Embora as contagens absolutas mostradas abaixo sejam pequenas em umabase por microlitro, os resultados são reproduzíveis em termos de contagemabsoluta e proporção quando considerando contagens das populações CD123+/- relacionadas. Essa comparação mostra uma duplicação conside-rável nas contagens absolutas de marcador (-) e uma forte relação entre po-pulações CD123- e CD11c-. Na verdade, as populações Lin-/HLA-DR+/CD11C- e Lin-/HLA-DR+/CD123- são altamente correlacionadas emamostras pré- e pós-ECP (coeficientes de correlação de Pearson r = 0,95 e 0,985, respectivamente), sugerindo que essas medições podem representara mesma população de células. Além disso, essas contagens absolutas es-tão em concordância com contagens de DC previamente reportadas em po-pulações normais e com GvHD. Essa pesquisa é única pelo fato de que elaexamina populações CD11c- e CD123-, enquanto que a maioria dos estudos examina as populações antígeno-positivas mais maduras de DC. Assim, foiidentificada uma nova população de DCs relacionadas a um resultado clíni-co.

Tabela 2

Valores absolutos de DC pré-ECP

Grau HLA- HLA- HLA- HLA- HLA- WBSde DR+/CD123+ DR+/CD123- DR+/CD11 DR+/CD11 lin abs.GvHD c+ c- 0 7 15 10 12 670 33000 5 12 9 8 401 24000 1 8 3 6 383 12000 2 15 9 8 947 32000 4 11 6 8 847 58000 3 4 3 4 252 35000 3 6 5 4 462 1600Grau HLA- HLA- HLA- HLA- HLA- WBSde DR+/CD123+ DR+/CD123- DR+/CD11 DR+/CD11 lin abs.GvHD C+ C- 0 5 19 16 6 1290 23000 0 2 1 1 597 30000 5 5 3 7 578 53000 3 17 15 5 672 47001 5 18 9 14 984 46001 4 8 6 6 585 38001 5 7 5 7 942 27001 1 103 44 59 1643 83002 7 19 11 15 332 22002 4 34 13 25 492 60002 31 27 7 50 1085 27002 2 15 2 14 2845 109002 1 6 5 2 1502 35002 0 267 7 260 1288 37002 3 11 4 9 832 33003 0 2 1 1 1140 37003 1 4 1 3 499 52003 2 7 3 5 779 41003 1 487 3 485 1705 35003 163 25 4 187 2415 115004 0 2 0 2 274 119004 1 29 5 23 611 86004 0 4 3 1 281 23004 2 24 3 23 422 15004 1 9 3 8 352 4000

Uma plotagem da proporção de DCs Cd11c+ para CD11c- ver-sus o grau de GvHD revela uma correlação entre a proporção e a eventualgravidade de GvHD em um paciente (Figura 3). As Figuras 4-6 mostram per-fis de DC prognósticos de TRM.

Outros padrões incluem uma propensão para que essa propor-ção se desvie para positivo após tratamento com ECP e para os pacientescom uma proporção pré-BMT mais próxima de um tendo menor mortalidade(2 mortes em 0-1 vs. Cinco no grupo 2-4). Nem a variabilidade da medição,nem a relação do doador para o recipiente parecem se correlacionar com ograu de GvHD1 sugerindo ainda que características recipiente-específicasacionam a propensão à GvHD.

Proporções de DC1/DC2 e a proporção relativa de DCs imaturasforam propostas como indicadores prognósticos de progressão de doença eresultados de tratamento em numerosas condições relevantes, incluindosíndrome de Sezary1 transplante de órgãos sólidos e de medula óssea, inclu-indo GvHD, tumores sólidos, dermatite atópica, doença inflamatória do intes-tino e infecção viral sistêmica.

O número de DCs antígeno-negativas se correlaciona bem compopulações de células B ativadas. O número de DCs CD11c- e, provavel-mente, o número de CD123-, se correlaciona com CD19+/CD27+ eCD19+/CD40+ (r = 0,91 e 0,8, respectivamente) e menos com a contagemde células CD19+/CD20+B totais (r = 0,64) através de todos os participantesdo sub-estudo. Esses dados mostram que o número absoluto de DCsCD11c-/CD123- em circulação reflete o grau de ativação de células B, umaconsideração relevante em GvHD.

Exemplo 2

II. Candidatos 2 e 3 a biomarcadores, GGT no soro e LDH (biomarcadorespara prognóstico de doença, MOA, eficácia de tratamento)

Usando a proporção CD11c+/CD11c-, dados de um laboratóriocentral foram examinados para correlações da proporção de subconjunto deDC e gravidade de GvHD. Duas novas correlações emergiram a partir deamostras pré-transplante, GGT e LDH elevados no soro. Elevação nessesmarcadores, junto com contagens de plaquetas significativamente diminuí-das, permitem a discriminação de indivíduos que depois sofreram de GvHDde grau alto daqueles com GvHD de grau zero e um em amostras de linhade base e pós-ECP.

Dado sua derivação a partir de proporção de CD11c, esses mar-cadores de laboratório central vão de encontro a todos os critérios descritospara o marcador citométrico de fluxo, mas têm a vantagem adicional de se-rem prontamente medidos e interpretados. GGT é amplamente usado comoum marcador para dano hepático em cirrose e outros distúrbios hepáticos eLDH é, tipicamente, considerado uma medida de lise celular. Dado que es-ses marcadores estão elevados em pacientes pré-transplante e parecem secorrelacionar com um fator de risco previamente identificado para GvHD(baixa contagem de plaquetas), eles podem proporcionar uma vantagemadicional com relação à medição citométrica de fluxo descrita acima.

Capacidade diagnostica de GvHD:

Essas observações representam o primeiro marcador ou conjun-to de marcadores prognósticos para o início e gravidade de GvHD aguda.Um laboratório qualificado pode realizar prontamente citometria de fluxo comquantificação absoluta ou relativa de subconjuntos de DC para prever o iní-cio de doença. Alternativamente, o uso de contagens de monócitos e neutró-filos em combinação com outros marcadores de suscetibilidade pode intensi-ficar o prognóstico e orientar terapia após transplante de medula óssea.O uso desses subconjuntos de células prognósticas em combi-nação com outros diagnósticos pode permitir a identificação de analitos co-variáveis (isto é, constituintes do plasma ou soro ou outros marcadores bio-lógicos) que são prognósticos ou aumentam o poder prognóstico de subcon-juntos de DC. Essa observação e subseqüente diagnóstico também são re-levantes e são aplicáveis, em geral, para todos os pacientes que receberamtransplantes de medula óssea.

Exemplo 3

Análise por regressão logística é usada para identificar pacientesde alto risco (morte por transplante e GvHD de Grau II-IV) aos quais foi for-necida ECP, usando marcador de linha de base, variáveis de laboratório edemográficas para prever o resultado. Informação demográfica foi coletadade 62 subconjuntos, 13 indivíduos tiveram uma morte relacionada a trans-plante e 22 indivíduos tiveram GvHD aguda de grau III/IV. GvHD aguda degrau III/IV estava ausente em um indivíduo, esse indivíduo não estava nossubconjunto de marcador. O número de indivíduos com valores de laborató-rio varia em virtude de dados que faltam. O subconjunto de pacientes comvalores de marcador coletados tinha um número total de 23 pacientes, 9 in-divíduos tiveram uma morte relacionada a transplante e 15 indivíduos tive-ram GvHD aguda de grau lll/IV.

Valores de marcador η = 32

O subconjunto de pacientes com valores de marcador de linhade base foi avaliado para determinar se qualquer um dos valores de marca-dor contribua para o prognóstico de cada um dos resultados (morte pelotransplante e GvHD de Grau ll-IV). As variáveis fornecidas nas Tabelas 3 e 4são os melhores indicadores dentre todas as variáveis de marcador coleta-das. Os valores de marcador foram colocados no modelo como variáveiscontínuas.

Tabela 3

Resultado: MORTE PELO TRANSPLANTE

<table>table see original document page 26</column></row><table>

*p-valor de qui-quadrado de Wald para coeficiente do modelo.

ROC = Área sob a curva de receptor-operador (sensibilidade vs. 1-especificidade)

() indica a proporção de chances inversa.

Tabela 4

Resultado: GvHD de grau II-IV

<table>table see original document page 26</column></row><table>*p-valor de qui-quadrado de Wald para coeficiente do modelo.

ROC = Área sob a curva de receptor-operador (sensibilidade vs. 1-especificidade)

() indica a proporção de chances inversa._

Nesse subconjunto de pacientes, o melhor indicador de morteem virtude de transplante é uma diminuição em HLAmDRsCDI23cs. O me-lhor indicador de GvHD de Grau II-IV é uma diminuição emp_HLAmDRsCD11cs.

Valores de laboratório e demográficos N = 62

Todos os pacientes que receberam ECP foram analisados paradeterminar se qualquer um dos valores de laboratório ou valores demográfi-cos de linha de base contribuíam para o prognóstico de cada um dos resul-tados. Modelos foram selecionados como o "melhor" modelo baseado nonível de significância determinado pela diferença no modelo saturado e novalor de probabilidade -2 Iog dos modelos básicos. Os resultados do "me-lhor" modelo são apresentados nas Tabelas 5-10.

O melhor modelo para prever morte por transplante continha asvariáveis L_BUN_CREATININA_PROPORÇÃO, L_ALBUMINA_G_DL_ eNão compatível vs. compatível.Tabela 5

<table>table see original document page 27</column></row><table>

O melhor modelo para prognóstico de GvHD de Grau II-IV con-tém apenas a variável L_NEUTRÓFILO_.Tabela 6

<table>table see original document page 28</column></row><table>

*AUC = 0,69, η = 60 (estava faltando o resultado de um indivíduo para GvHDde grau II-IN/)

**p-valor de qui-quadrado de Wald._

Resultados: valores de laboratório e linha de base

As tabelas precedentes foram extraídas dos seguintes dados.Tabelas 7 e 8

<table>table see original document page 28</column></row><table>Resultados: valores de laboratório e linha de baseTabelas 9 e 10

<table>table see original document page 29</column></row><table>Resultados: GVHD de grau 2-4

<table>table see original document page 30</column></row><table>

Nota: dados de GvHD faltando em um indivíduo

Exemplo 4

Transplante de medula é um tratamento geralmente aceito parapacientes sofrendo de leucemia ou outras anomalias genéticas que amea-çam a vida. Infelizmente, 20-50% dos recipientes de transplante de células-tronco hematopoiéticas alogeneicas sucumbem à doença enxerto versushospedeiro, a qual é um ataque mediado por células T do doador sobre ostecidos do recipiente. Atualmente, prevenção de GvHD conta grandementecom imunossupressão global (CSA, etc.) dirigida contra células T. depleçãode células T da população do doador diminui significativamente as reaçõesde enxerto versus hospedeiro, mas compromete, adicionalmente, o enxerto,inibe a erradicação de células malignas no recipiente e compromete a re-constituição de imunidade ao doador (torna o recipiente suscetível a recor-rência de leucemia).

Em virtude de seus efeitos imunomodulatórios, foi mostrado queECP proporciona proteção benéfica (salva vidas) em várias doenças autoi-munes e inflamatórias, incluindo Iinfoma de células T cutâneas, escleroder-ma, artrite reumatóide, rejeição a transplante, GvHD aguda e crônica. Acre-dita-se que pré-tratamento de pacientes com BMT com ECP funciona atra-vés de modulação do compartimento de células que apresentam antígeno.Mais especificamente, células dendríticas (DCs) no enxerto e no recipientepodem ser responsáveis pela estimulação de rejeição ao transplante de BMalogenéico. Maturação de DCs é uma etapa importante para a estimulaçãode rejeição ao transplante. Para avaliar se ECP tem um efeito imunomodula-tório sobre as células imunes (células T, células NK e DCs), esse sub-estudofoi conduzido para monitorar alterações fenotípicas no compartimento decélulas imunes. Amostras de sangue são coletadas de cada paciente antesde e subseqüentemente à fotoferese, mas antes de irradiação do corpo todo(TBI). Uma terceira amostra de sangue é coletada por ano após recebimentodo transplante.

Objetivo do estudo

Estudar o efeito imunomodulatório de ECP com UVADEX® so-bre o compartimento de células dendríticas e células T no sangue periféricode pacientes que receberam regime de condicionamento mieloablativo pa-drão historicamente comparado com o regime de condicionamento mieloa-blativo padrão apenas sobre a incidência de GvHD aguda e crônica em pa-cientes que sofreram BMT alogenéico de irmãos ou não relacionado outransplante de células-tronco de sangue periférico (PBSCT) para tratamentode malignidades hematológicas.

Design de estudo e tamanho de amostra

Esse sub-estudo multicentro determina os efeitos imunomodula-tórios de ECP com UVADEX® sobre os compartimentos de células dendríti-cas de sangue periférico, células T e células NK em pacientes que recebe-ram ECP1 seguido por um regime de condicionamento mieloablativo de ciclo-fosfamida e TBI imediatamente antes de transplante de medula óssea. Ape-nas pacientes que correspondiam aos critérios de inclusão para experimentode pGvHD e que forneceram consentimento por escrito para esse sub-estudo são incluídos. O tamanho de amostra, portanto, é dependente donúmero de pacientes arrolados no experimento de pGvHD que forneceramconsentimento por escrito.

Aproximadamente 5-6 centros participaram no estudo de pre-venção de GvHD. Aproximadamente 10 pacientes por centro receberamECP para um total de 50-60 pacientes arrolados no estudo de prevenção deGvHD e é esperado que aproximadamente 20-30 pacientes venham a forne-cer consentimento por escrito para participar desse sub-estudo clínico. Ospacientes participaram desse sub-estudo durante 365 dias.Explicação específica de procedimentos de estudoTempo de amostragem

De forma a realizar esse sub-estudo, um total de 3 amostras desangue por paciente é coletado nos seguintes pontos de tempo:

• Amostra PT1: extraída no Dia -21 ao Dia -10 antes de trata-mentos de ECP

• Amostra PT2: extraída no Dia 7 pós-recebimento do transplan-te

• Amostra PT3: extraída no Dia 365 pós-recebimento do trans-plante

Sangue do paciente é coletado em tubos Vacutainer hepariniza-dos rotulados com o número do paciente, número da visita, data e momentoexato de coleta do sangue. As amostras de sangue são transportadas viadistribuição noturna para a Esoterix, Inc. (Tennessee). Leucócitos são sepa-rados do sangue íntegro via gradientes de Ficoll. Células mononucleares sãoreagidas com anticorpos fluorescentemente rotulados específicos para vá-rias linhagens, ativação e marcadores de diferenciação. Os painéis utilizadospara amostras de sangue de imunotipo do paciente incluirão, mas não esta-rão limitados a, anticorpos específicos para células T, células NK e célulasdendríticas. Análise dos níveis de expressão de antígeno é realizada atravésde citometria de fluxo sobre um Becton Dickinson FACScan.

Procedimento Técnico

Em cada ponto de amostragem, uma amostra de 8 ml de sanguefoi coletada de uma veia do antebraço via venipunção em tubos de vidrocontendo heparina sódica. As amostras foram misturadas através de inver-são em temperatura ambiente antes de acondicionamento em recipientes detransporte fornecidos.

Métodos estatísticos

Testagem estatística foi realizada com os dados resultantes paradeterminar se correlações podem ser feitas entre alterações nos fenotiposde DC, células T ou NK e resultados da doença ou tratamento.Exemplo 5

Perfil de expressão de miRNA

DCs foram obtidas conforme descrito acima e miRNA foi obtido eanalisado conforme anteriormente descrito. Keene e outros (2006) RIP-Chip:the isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and protein compo-nents of ribonucleoprotein complexes from cell extracts Nature Protocols 1:302-307. Os resultados obtidos são mostrados na Tabela 11.

Tabela 11

<table>table see original document page 33</column></row><table>Média (Pré- Média (Pós- Média (Pré-ECP)* Média(Pós- ECP)* ECP)* ECP)*ID de Coluna sem gvhd) sem_gvhd) GvHD gvjd grave) Gvhd grave)mo_miR_363_3p 6,60 7,61 8,62 6,28hsa_miR_363 6,69 7,61 8,49 6,14hsa_miR_182 6,49 8,13 8,36 5,03hsa_miR_27a 6,79 5,96 5,34 8,21hsa_miR_145 6,48 5,71 5,01 8,13hsa_miR_140 7,77 5,09 3,96 6,00hsa_miR_130a 3,96 5,22 7,81 5,66ambi_miR_11541 4,77 5,47 6,78 4,50ambi_miR_3998 4,93 4,04 4,96 7,51hsa_miR_143 5,02 3,74 3,91 7,25hsa_miR_489 2,47 2,47 10,60 3,04hsa_miR_101 3,06 4,44 6,50 3,75hsa_miR 151 2,25 4,99 6,06 4,24

Claims (15)

1. Método de previsão do início e/ou gravidade de doença enxer-to versus hospedeiro (GvHD) em um paciente compreendendo as etapas de:a. obtenção de uma amostra contendo células dendríticas (DCs)do paciente;b. medição de biomarcadores associados à CD11c na superfícieda DC; ec. determinação da proporção entre células CD11c+ e CD11c";em que uma proporção de menos de cerca de um é indicativa daocorrência de GvHD.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a amostra éobtida após tratamento do paciente com células apoptóticas autólogas.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que as célulassão obtidas através de tratamento do paciente com fotoforese extracorporal(ECP).

4. Método de previsão do início e/ou gravidade de doença enxer-to versus hospedeiro (GvHD) em um paciente compreendendo as etapas de:a. obtenção de uma amostra de soro do paciente;b. medição de biomarcadores associados à γ-glutamil transfera-se (GGT) e dehidrogenase de Iactato (LDH); ec. determinação se os níveis desses biomarcadores estão ele-vados, em que uma elevação desses biomarcadores antes de transplante éindicativa da ocorrência de GvHD.

5. Método de previsão do início e/ou gravidade de doença enxer-to versus hospedeiro (GvHD) em um paciente compreendendo as etapas de:a. obtenção de uma amostra contendo neutrófilos do paciente;b. medição do número de neutrófilos em um volume conhecido;em que uma redução de neutrófilos antes de transplante é indi-cativa da ocorrência de GvHD.

6. Método para proporcionar orientação de terapia através dedeterminação da probabilidade da ocorrência de GvHD como definido nareivindicação 1, 4 ou 5 e identificação do tratamento apropriado para amesma.

7. Método para proporcionar um prognóstico através de determi-nação da probabilidade de ocorrência de GvHD de acordo com a reivindica-ção 1, 4 ou 5 e identificação do prognóstico correspondente para a mesma.

8. Kit para conduzir um ensaio de acordo com a reivindicação 1,-4 ou 5 compreendendo: reagentes de detecção de biomarcadores.

9. Microarranjo ou lasca de gene para realização do método deacordo com uma das reivindicações 1, 4 ou 5.

10. Método de previsão do início e/ou gravidade de mortalidadetransplante-relacionada (TRM) em um paciente compreendendo as etapasde:a. obtenção de uma amostra contendo células dendríticas (DCs)do paciente;b. medição de biomarcadores associados à superfície de DCsplasmacitóides Iinj HLA-DR e CD123; eem que uma menor abundancia absoluta de DCs plasmacitóides IinHLA-DR+CDI23+ na linha de base é indicativa da ocorrência de TRM.

11. Método de previsão do início e/ou gravidade de mortalidadetransplante-relacionada (TRM) em um paciente compreendendo as etapasde:a. obtenção de uma medição na linha de base de γ-glutamiltransferase e dehidrogenase de Iactato no soro;em que a elevação desses biomarcadores antes de transplanteé indicativa da ocorrência de TRM.

12. Método para proporcionar orientação de terapia através dedeterminação da probabilidade da ocorrência de TRM de acordo com a rei-vindicação 10 ou 11 e identificação do tratamento apropriado para a mesma.

13. Método para proporcionar um prognóstico através de deter-minação da probabilidade da ocorrência de TRM de acordo com a reivindi-cação 10 ou 11 e identificação do prognóstico correspondente para a mes-ma.

14. Kit para conduzir um ensaio de acordo com a reivindicação-10 ou 11 compreendendo: reagentes de detecção de biomarcador.

15. Microarranjo ou lasca de gene para realização do métodocomo definido na reivindicação 10 ou 11.