BRPI0719058A2 - Compostos, composições farmacêuticas contendo os mesmos e métodos de uso para os mesmos - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOS- TOS, COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS CONTENDO OS MESMOS E MÉTODOS DE USO PARA OS MESMOS".

Antecedentes da Invenção Sintase de ácido araxo

Ácidos graxos têm três papéis primários na fisiológica das célu- las. Primeiro, eles são blocos de construção de membranas biológicas. Se- gundo, derivados de ácido graxo servem como hormônios e mensageiros intracelulares. Terceiro e de importância particular para a presente invenção, ácidos graxos são moléculas combustíveis que podem ser armazenadas em tecido adiposo como triacilgliceróis, os quais também são conhecidos como gorduras neutras.

Existem quatro enzimas primárias envolvidas na via sintética de ácido graxo, sintase de ácido graxo (FAS), carboxilase de acetil CoA (ACC)1 enzima málica e citrato de liase. A principal enzima, FAS, catalisa a conden- sação NADPH-dependente dos precursores malonil-CoA e acetil CoA para produzir ácidos graxos. NADPH é um agente de redução que, em geral, ser- ve como o doador de elétrons essencial em dois pontos no ciclo de reação de FAS. As outras três enzimas (isto é, ACC, enzima málica e citrato de lia- se) produzem os precursores necessários. Outras enzimas, por exemplo, as enzimas que produzem NADPH, também estão envolvidas na síntese de ácido graxo.

FAS tem uma Comissão de Enzima (E.C.) N9 2.3.1.85 e também é conhecida como sintase de ácido graxo, Iigase de ácido graxo, bem como seu nome sistemático, C-aciltransferase de acil-CoA:malonil-CoA (decarboxi- lação, redução de oxoacila- e enoíla- e hidrólise de tioéster). Existem sete enzimas distintas - ou domínios catalíticos - envolvidos na síntese catalisada por FAS de ácidos graxos: transacilase de acetila, transacilase de malonila, sintetase de beta-cetoacila (enzima de condensação), reductase de beta- cetoacila, de-hidrase de beta-hidróxiacila, reductase de enoíla e tioesterase (Wakil, S. J., Biochemistry, 28: 4523-4530,1989). Todas essas sete enzimas juntas formam a FAS. • 10

15

20

Embora a síntese catalisada por FAS de ácidos graxos seja simi- lar em organismos inferiores e em organismos superiores, tais como seres humanos por exemplo, existem algumas diferenças importantes. Em bacté- rias, as sete reações enzimáticas são realizadas por sete polipeptídeos dis- tintos que são não-associados. Essa é classificada como FAS do Tipo II. Em contraste, a reação enzimática em micobactérias, Ievedos e seres humanos é realizada através de polipeptídeos multifuncionais. Por exemplo, Ievedos têm um complexo composto de dois polipeptídeos distintos, enquanto que em micobactéria e seres humanos, todas as sete reações enzimáticas são realizadas por um único polipeptídeo. Essas são classificadas como FAS do Tipo I.

Inibidores de FAS

Foi mostrado que vários compostos inibem a síntese de ácido graxo (FAS). Inibidores de FAS podem ser identificados pela capacidade de um composto de inibir a atividade enzimática da FAS purificada. A atividade da FAS pode ser ensaiada medindo a incorporação de precursor radiorrotu- Iado (isto é, acetil CoA ou malonil-CoA) em ácidos graxos ou espectrofoto- metricamente, medindo a oxidação de NADPH (Dils et al., Methods Enzy- mol., 35: 74-83).

A Tabela 1, apresentada abaixo, lista vários inibidores de FAS.

Tabela 1 Inibidores reDresentativos das enzimas da via sintética de ácido araxo Inibidores de síntese de ácido araxo 1,3-dibromopropanona Cerulenina Reagente de Ellman (ácido 5,5'- Fenilcerulenina ditiobis(2-nitrobenzóico), DTNB Melarsoprol Nicotinato de 4-(4'- Iodoacetato clorobenzilóxi)benzila (KCD-232) Óxido de fenilarsina Ácido 4-(4'-clorobenzilóxi)benzóico Pentostam (MII) Melitina 2-(5-(4-clorofenil)pentil)oxirano-2- Tiolactomicina carboxilato (POCA) e seu derivado de CoA Anidrido etóxifórmico Inibidores de citrato de Iiase (-)hidroxicitrato S-carbóximetil-CoA radicicol

Inibidores de cartjoxilase de alquinil CoA Setoxidim

Haloxyfop e seu éster CoA Diclofop e seu éster CoA Clethodim Alloxydim T rifop

Ácido clofíbrico

2,4-D-mecopropdalapon 2-alquil glutarato

2-tetradecanilglutarato (TDG) ácido 2-octilglutárico 3',5'-monofosfato cíclico de N6,02- dibutiril adenosina 3',5'-monofosfato cíclico de N2,02- dibutiril adenosina derivado de CoA de ácido 5- (tetradecilóxi)-2-furóico (TOFA) 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-dioxina

Inibidores da enzima málica Fosfato de dinucleotídeo de 3- aminopiridina adenina periodato- oxidada

Ácido 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzóico)

p-hidróximercuribenzoato

N-etilmaleimida

Tiol ésteres de oxalila, tal como S-

oxalilglutationa

Gossypol

fenilglioxal

2,3-butanodiona

bromopiruvato

Pregnenolona

Ácido 9-decenil-1-pentenodioico Ácido decanil-2-pentenodioico Ácido decanil-1-pentenodioico (S)-ibuprofenil-CoA (R)-ibuprofenil-CoA fluazifop e seu éster CoA Clofop

Ácido 5-(tetradeciclóxi)-2-furoico Ácido beta.beta'- tetrametilhexadecanodióico T ralcoxidim

Ácido hexadecanodioico beta,beta prime-metil-substituído, monotioés- ter ou livre (MEDICA 16) Alfa-ciano-4-hidróxicinamato S-(4-bromo-2,3-dioxobutil)-CoA p-hidróximercuribenzoato (PHMB) 3',5'-monofosfato cíclico de N6,02- dibutiril adenosina

Das quatro enzimas na via sintética de ácido graxo, a FAS é o alvo preferido para inibição porque ela atua apenas dentro da via de ácidos graxos, enquanto que as outras três enzimas estão implicadas em outras funções celulares. Portanto, é mais provável que inibição de uma das outras três enzimas afete células normais. Das sete etapas enzimáticas realizadas pela FAS, a etapa catalisada pela enzima de condensação (isto é, sintetase de beta-cetoacila) e a reductase de enoíla têm sido os candidatos mais co- 5 muns para inibidores que reduzem ou param a síntese de ácido graxo. A enzima de condensação do complexo FAS é bem caracterizada em termos de estrutura e função. O sítio ativo da enzima de condensação contém um tiol de cisteína crítico, o qual é o alvo de reagentes antilipidêmicos tal como, por exemplo, o inibidor cerulenina.

Inibidores preferidos da enzima de condensação incluem uma

ampla faixa de compostos químicos, incluindo agentes de alquilação, oxidan- tes e reagentes capazes de sofrer troca de dissulfeto. A bolsa de ligação da enzima prefere E1E dienos de cadeia longa.

A princípio, um reagente contendo o dieno da cadeia lateral e um grupo o qual exibe reatividade com ânions de tiolato poderia ser um bom inibidor da enzima de condensação. A cerulenina [(2S, 3R)-2,3-epóxi-4-oxo- 7,10 dodecadienoil amida] é um exemplo:

A

.NH2

O O

A cerulenina liga-se covalentemente ao grupo tiol de cisteína crítico no sítio ativo da enzima de condensação de sintase de ácido graxo, 20 inativando essa etapa enzimática chave (Funabashi et al., J. Biochem., 105: 751-755, 1989). Embora tenha sido notado que a cerulenina possui outras atividades, essas ocorrem em micro-organismos os quais podem não ser modelos relevantes de células humanas (por exemplo, inibição de síntese de colesterol em fungos, Omura (1976), Bacteriol. Rev., 40: 681-697; ou síntese 25 de RNA diminuída em vírus, Perez et al. (1991), FEBS, 280: 129-133), ocor- rem em concentrações de fármaco substancialmente maior (inibição de pro- tease de HIV viral a 5 mg/ml, Moelling et al. (1990), FEBS, 261: 373-377) ou pode ser o resultado direto da inibição de síntese de ácido graxo endógena (inibição de processamento de antígeno em linfócitos B e macrófagos, Falo et al. (1987), J. Immunol., 139: 3918-3923). Alguns dados sugerem que a cerulenina não iniba especificamente a miristoilação de proteínas (Simon et al., J. Biol. Chem., 267: 3922-3931, 1992).

Vários outros inibidores de FAS são divulgados na Patente U.S.

5 Nq 5.614.551, a descrição da qual é aqui incorporada por referência. São incluídos inibidores de sintase de ácido graxo, citrato de liase, carboxilase de acetil CoA e enzima málica.

Tomoda et al. (Tomoda et al., Biochim. Biophys. Act 921: 595- 598, 1987; Omura et al., J. Antibiotics 39: 1211-1218, 1986) descrevem a Triacsina C (algumas vezes denominada WS-1228A), um inibidor de sinteta- se de acil-CoA que ocorre naturalmente, o qual é um produto de Streptomy- ces sp. SK-1894. A estrutura química da Triacsina C é 1-hidróxi-3-(E,£,E- 2',4,,7'-undecatrienilidina) triazeno. A Triacsina C causa inibição de 50% da sintetase de acil-CoA em fígado de rato a 8,7 μΜ; um composto relacionado, Triacsina A, inibe a sintetase de acil-CoA através de um mecanismo o qual é competitivo com ácidos graxos de cadeia longa. Inibição de sintetase de acil- CoA é tóxica para células de animais. Tomoda et al. (Tomoda et al., J. Biol. Chem. 266: 4214-4219, 1991) ensinam que a Triacsina C causa inibição de crescimento em células Raji a 1,0 μΜ e também foi mostrado que inibe o crescimento de células Vero e Hela. Tomoda et al. ainda ensinam que a sin- tetase de acil-CoA é essencial em células de animais e que inibição da en- zima tem efeitos letais.

Foi mostrado na Patente U.S. N9 5.981.575 descrição a qual é incorporada aqui por referência que uma família de compostos (alfa- 25 metileno-beta-carbóxi-gama-butiro Iactonas gama-substituídas) inibe a sínte- se de ácido graxo, inibe o crescimento de células tumorais e induzem à per- da de peso. Os compostos descritos na Patente '575 têm várias vantagens com relação ao produto natural cerulenina para aplicações terapêuticas: [1] eles não contêm o grupo epóxido altamente reativo da cerulenina; [2] eles 30 são estáveis e solúveis em solução aquosa; [3] eles podem ser produzidos através de uma reação sintética em duas etapas e, assim, facilmente produ- zidos em grandes quantidades; e [4] eles são facilmente tritiados à alta ativi- dade específica para análises bioquímica e farmacológica. A síntese dessa família de compostos, os quais são inibidores de ácido graxo, é descrita na Patente '575, assim como seu uso como um meio para tratar células tumo- rais expressando FAS e seu uso como um meio para reduzir o peso corpo- 5 ral. A Patente '575 também descreve o uso de quaisquer inibidores de sinta- se de ácido graxo para reduzir sistematicamente a massa de adipócitos (número ou tamanho de células adiposas) como um meio de reduzir o peso corporal.

Os sítios primários para síntese de ácido graxo em camundon- 10 gos e seres humanos são o fígado (veja Roncari, Can. J. Biochem., 52: 221- 230, 1974; Triscari et al., 1985, Metabolism, 34: 580-7; Barakat et al., 1991, Metabolism, 40: 280-5), glândulas mamárias em lactação (veja Thompson et al., Pediatr. Res., 19: 139-143, 1985) e tecido adiposo (Goldrick et al., 1974, Clin. Sei. Mol. Med., 46: 469-79).

Inibidores da síntese de ácido araxo como aaentes antimicrobianos

A cerulenina foi originalmente isolada como um antibiótico anti- fúngico potencial do caldo de cultura de Cephalosporium caerulens. Estrutu- ralmente, a cerulenina foi caracterizada como amida de ácido (2R,3S)-epóxi- 4-oxo-7,10-trans,trans-dodecanoico. Foi mostrado que seu mecanismo de ação é a inibição, através de ligação irreversível, de sintase de beta-cetoaril- ACP, a enzima de condensação requerida para a biossíntese de ácidos gra- xos. A cerulenina foi classificada como um antifúngico, primariamente contra Candida e Saccharomyces sp. Além disso, alguma atividade in vitro foi mos- trada contra algumas bactérias, actinomicetes e micobactérias, embora ne- nhuma atividade tenha sido encontrada contra Mycobacterium tuberculosis. A atividade dos inibidores da síntese de ácido graxo e a cerulenina em parti- cular não foi avaliada contra protozoários, tal como Toxoplasma gondii ou outros patógenos eucarióticos infecciosos, tais como Pneumoeystis earinii, Giardia lamblia, Plasmodium sp., Triehomonas vaginalis, Cryptosporidium, Trypanosoma, Leishmania e Schistosoma.

Doenças infecciosas as quais são particularmente suscetíveis ao tratamento são doenças as quais causam lesões em superfícies externa- mente acessíveis do animal infectado. Superfícies externamente acessíveis incluem todas as superfícies que podem ser atingidas através de meios não- invasivos (sem cortar ou perfurar a pele), incluindo a superfície da pele em si, membranas mucosas, tais como aquelas que cobrem as superfícies na- 5 sal, oral, gatrointestinal ou urogenital e superfícies pulmonares, tais como os sacos alveolares. Doenças suscetíveis incluem: (1) micoses ou alergias cu- tâneas, especialmente se causadas por Microsporum, Trichophyton, Epi- dermophyton ou Mucocutoneous candidiasis; (2) queratite micótica, especi- almente se causada por Aspergillus, Fusarium ou Candida; (3) queratite a- 10 mébica, especialmente se causada por Acanthamoeba; (4) doença gatroin- testinal, especialmente se causada por Giardia iambiia, Entamoeba, Cryp- tosporidium, Microsporidium ou Candida (mais comumente em animais imu- nocomprometidos); (5) infecção urogenital, especialmente se causada por Candida aibicans ou Trichomonas vaginalis; e (6) doença pulmonar, especi- 15 almente se causada por Myeobaeterium tubereuiosis, Aspergillus ou Pneu- moeystis earinii. Organismos infecciosos que são suscetíveis ao tratamento com inibidores da síntese de ácido graxo incluem Myeobaeterium tubereulo- sis, especialmente cepas resistentes a múltiplos fármacos e protozoários, tal como Toxoplasma.

Qualquer composto que inibe a síntese de ácido graxo pode ser

usado para inibir o crescimento de células microbianas. Contudo, compostos administrados a um paciente devem não ser igualmente tóxicos para o paci- ente e as células microbianas-alvo. Consequentemente, é benéfico selecio- nar inibidores que afetam apenas ou predominantemente as células microbi- anas-alvo.

Célula microbianas eucariotas as quais são dependentes de seu ácido graxo endogenamente sintetizado expressarão FAS do Tipo I. Isso é mostrado pelo fato de que inibidores de FAS são inibitórios de crescimento e pelo fato de que ácidos graxos exogenamente adicionados podem proteger 30 células normais do paciente, mas não essas células microbianas contra ini- bidores de FAS. Portanto, agentes os quais impedem a síntese de ácidos graxos pela célula podem ser usados para tratar infecções. Em eucariotas, ácidos graxos são sintetizados pela FAS do Tipo I usando os substratos ace- til CoA, malonil-CoA e NADPH. Assim, outras enzimas as quais podem ali- mentar substratos nessa via pode também afetar a taxa de síntese de ácido graxo e, assim, ser importantes em micróbios que dependem do ácido graxo 5 endogenamente sintetizado. Inibição da expressão ou atividade de qualquer uma dessas enzimas afetará o crescimento das células microbianas que são dependentes do ácido graxo endogenamente sintetizado.

O produto da FAS do Tipo I difere em vários organismos. Por exemplo, no fungo S. cerevisiae, os produtos são predominantemente palmi- 10 tato e estearato esterificado em coenzima-A. Em Mycobacterium smegmatis, os produtos são ésteres CoA de ácido graxo saturado oscilando, quanto ao comprimento, de 16 a 24 carbonos. Esses Iipfdios são frequentemente ainda processados para preencher a necessidade das células por vários compo- nentes lipídicos.

Pode-se esperar que a inibição de etapas chave no processa-

mento ou utilização de ácidos graxos a jusante iniba a função celular, quer a célula dependa de ácido graxo endógeno ou utilize o ácido graxo fornecido externamente à célula e, assim, inibidores dessas etapas a jusante podem não ser suficientemente seletivos para células microbianas que dependem 20 de ácido graxo endógeno. Contudo, descobriu-se que a administração de um inibidor de síntese de ácido graxo do Tipo I a tais micróbios os torna mais sensíveis à inibição por inibidores de processamento e/ou utilização de ácido graxo a jusante. Em virtude dessa sinergia, a administração de um inibidor da síntese de ácido graxo em combinação com um ou mais inibidores de 25 etapas a jusante na biossíntese e/ou utilização de lipídio afetará seletiva- mente células microbianas que dependem do ácido graxo endogenamente sintetizado. Combinações preferidas incluem um inibidor de FAS e carboxi- Iase de acetil CoA ou FAS e um inibidor de MAS.

Quando foi determinado que um mamífero está infectado com células de um organismo o qual expressa FAS do Tipo I ou se FAS é encon- trada em um fluido biológico de um paciente, o mamífero ou paciente pode ser tratado através de administração de um inibidor da síntese de ácido gra- xo (Patente Ne 5.614.551).

0 uso de inibidores de FAS para inibir o crescimento de células cancerígenas é descrito na Patente U.S. Nq 5.759.837, a descrição da qual é aqui incorporada por referência. Esse pedido não descreve ou divulga qual- quer um dos compostos descritos aqui.

Uma classe de compostos os quais podem atuar como inibidores de FAS é divulgada no WO 2004/005277, a descrição da qual é aqui incor- porada por referência. Esse pedido não descreve ou divulga qualquer um dos compostos reivindicados aqui.

Sumário da Invenção

Uma nova classe de compostos foi descoberta, a qual tem uma variedade de propriedades terapeuticamente valiosas, por exemplo, inibição de FAS e propriedades anticâncer e antimicrobiana.

É um objetivo da presente invenção proporcionar um método de indução de perda de peso em animais e seres humanos através de adminis- tração de uma composição farmacêutica compreendendo um diluente far- macêutico e um composto de fórmula I.

É um outro objetivo da invenção proporcionar um método de ini- bição de atividade de sintase de ácido graxo em seres humanos ou animais através de administração de uma composição farmacêutica compreendendo um diluente farmacêutico e um composto de fórmula I.

É um outro objetivo da presente invenção proporcionar um mé- todo de prevenção do crescimento de células cancerígenas em animais e seres humanos através de administração de uma composição farmacêutica compreendendo um diluente farmacêutico e um composto de fórmula I.

É ainda um outro objetivo da presente invenção proporcionar um método de prevenção do crescimento de células cancerígenas em animais e seres humanos através de administração de uma composição farmacêutica compreendendo um diluente farmacêutico e um composto de fórmula I.

É um outro objetivo da presente invenção proporcionar um mé-

todo de inibição do crescimento de células microbianas invasivas através de administração de uma composição farmacêutica compreendendo um diluen- te farmacêutico e um composto de fórmula I.

Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1 mostra esquemas sintéticos para fabricação dos com- postos e intermediários pertinentes à invenção.

A figura 2 mostra um esquema sintético para fabricação de um

composto sob a invenção.

Descrição Detalhada da Invenção

Os compostos da invenção podem ser preparados através de meios convencionais. A síntese de uma série dos compostos é descrita nos exemplos. Os compostos podem ser úteis para o tratamento de obesidade, câncer ou infecções microbianamente baseadas.

Uma modalidade da invenção são compostos tendo a seguinte fórmula geral:

O

1

em que:

R1 = H, C1-C20 alquila, cicloalquila, alquenila, arila, arilalquila ou

alquilarila, cianometila, -OCH3, -OC(O)CH3Ou -OC(O)CF3;

R2 = -OCH2C(O)NHNH-R5, onde R5 é:

(a) fenila opcionalmente substituída por um ou mais de halogê- nio, CrC8 alquila opcionalmente substituída por halogênio, -OH, -OR6, onde

20 R6 é CrCe alquila opcionalmente substituída por halogênio; ou

(b) 2-, 3- ou 4-piridila opcionalmente substituída por halogênio, - OH, -OR61 onde R6 é CrC8 alquila opcionalmente substituída por halogênio; ou

(c) um heterociclo selecionado do grupo consistindo em imidazo- 25 Ia1 tiazola, benzimidazola, benzoxazola, benztiazola, tetrazola, triazola e a-

minotiazola; ou (d) -C(O)R71 onde R7 é uma CrC2O alquila, cicloalquila, alquenila, arila, arilalquila ou alquilarila ou um heterociclo selecionado do grupo consis- tindo em piridila, imidazola, tiazola, benzimidazola, benzoxazola, benztiazola, tetrazola, triazola e aminotiazola; e 5 R3 e R4, os mesmos ou diferentes um do outro, são CrC20 alqui-

la, cicloalquila, alquenila, arila, arilalquila ou alquilarila;

contanto que, quando R1 é -H, -OCH3 ou -OC(O)CF3 e R3 é - (CH2)7CH3, então, R2 não é -OCH2C(O)NHNH-R5, onde R5 é -p-C6H4CI, -

Deve ser entendido que, quando aplicável, a forma cetotautomé-

rica dos compostos precedentes também está incluída na fórmula I.

Em uma modalidade preferida, R1 é H.

Em outra modalidade preferida, R5 é C1-C10 alquila, cicloalquila, alquenila, arila, arilalquila ou alquilarila.

Em outra modalidade preferida, R3 é -H ou -CH3.

Em outra modalidade preferida, R4 é n-C6-C8 alquila.

Em outra modalidade preferida, R6 é C1-C10 alquila.

Outra modalidade da presente invenção é uma composição far- macêutica compreendendo um diluente farmacêutico e um composto de 20 fórmula I.

As composições da presente invenção podem ser apresentadas para administração a seres humanos e outros animais em formas de dosa- gem unitária, tais como comprimidos, cápsulas, pílulas, pós, grânulos, solu- ções ou suspensões parenterais estéreis, soluções ou suspensões orais, 25 emulsões óleo em água e água em óleo contendo quantidades adequadas do composto, supositórios e em suspensões ou soluções fluidas. Conforme usado no presente relatório descritivo, os termos "diluente farmacêutico" e "veículo farmacêutico" têm o mesmo significado. Para administração oral, formas de dosagem unitária sólidas ou fluidas podem ser preparadas. Para o 30 preparo de composições sólidas, tais como comprimidos, o composto pode ser misturado com ingredientes convencionais, tais como talco, estearato de magnésio, fosfato de dicálcio, silicato de alumínio magnésio, sulfato de cál- cio, amido, lactose, acácia, metilcelulose e materiais funcionalmente simila- res como diluentes ou veículos farmacêuticos.

5 Cápsulas são preparadas através de mistura do composto com

um diluente farmacêutico inerte e enchimento da mistura em uma cápsula de gelatina dura de tamanho apropriado. Cápsulas de gelatina moles são pre- paradas através de encapsulação, em uma máquina, de uma pasta do com- posto com um óleo vegetal aceitável, petrolato líquido leve ou outro óleo i- nerte.

Formas de dosagem unitária fluidas para administração oral, tais como xaropes, elixires e suspensões, podem ser preparadas. As formas po- dem ser dissolvidas em um veículo aquoso junto com açúcar ou outro ado- çante, agentes de flavorização aromáticos e conservantes para formar um 15 xarope. Suspensões podem ser preparadas com um veículo aquoso com o auxílio de um agente de suspensão, tal como acácia, tragacanto, metilcelu- lose e similares.

Para administração parenteral, formas de dosagem unitária flui- das podem ser preparadas utilizando o composto e um veículo estéril. No 20 preparo de soluções, o composto pode ser dissolvido em água para injeção e esterilizado em filtro antes de enchimento em um frasco ou ampola ade- quada e vedação. Adjuvantes, tais como um anestésico local, conservante e agentes de tamponamento, podem ser dissolvidos no veículo. A composição pode ser congelada após enchimento em um frasco e a água removida sob 25 vácuo. O pó Iiofilizado pode, então, ser colocado no frasco e reconstituído antes de uso.

As indicações terapêuticas clínicas consideradas para os com- postos da invenção incluem: (1) infecções em virtude de mícro-organismos invasivos, tais como estafilococos e enterococos; (2) cânceres originários em 30 muitos tecidos cujas células superexpressam sintase de ácido graxo e (3) obesidade em virtude da ingestão de calorias em excesso. A dose e duração de terapia dependerão de uma variedade de fatores, incluindo (1) a idade, peso corporal e função de órgãos do paciente (por exemplo, função hepática e renal); (2) a natureza e extensão do processo doentio a ser tratado, bem como qualquer comorbidade significativa existente e concomitantes medica- ções que estão sendo tomadas e (3) parâmetros relacionados a fármaco, tais como a via de administração, a frequência e duração de dosagem ne- cessária para realizar uma cura e o índice terapêutico do fármaco. Em geral, a dose será escolhida para obter níveis no soro de 1 ng/ml a 100 ng/ml, com o objetivo de atingir concentrações eficazes no sítio-alvo de aproximadamen- te 1 μς/ml a 10 μg/ml.

Exemplos

tizados conforme descrito abaixo. A atividade biológica de determinados compostos foi classificada como se segue. Os compostos foram testados com relação a pelo menos um dos seguintes: [1] inibição de FAS humana purificada, [2] inibição de atividade de síntese de ácido graxo em células in- teiras e [3] citotoxicidade contra células de câncer de mama humano MCF-7 cultivadas, conhecidas por possuírem altos níveis de FAS e atividade de sín- tese de ácido graxo, usando os ensaios com violeta cristal e XTT. Compos- tos selecionados com baixos níveis de citotoxicidade foram, então, testados com relação à perda de peso em camundongos Balb/C. Determinados com- postos também foram testados com relação à atividade contra bactérias gram-positivas e/ou negativas.

Síntese química de Compostos

Síntese de derivados de TLM trazendo hidrazidas de ácido O-acético

(212 mL) esfriado para -40 0C foram adicionados piridina (recentemente des- tilada de CaH2, 3,28 mL, 40,6 mmols) e anidrido tríflico (6,41 mL, 38,1 mmols) e a solução foi deixada agitar durante 20 minutos a -40 °C. Então, a

A invenção será ilustrada, mas não limitada, aos exemplos a se-

guir.

Uma série de compostos de acordo com a invenção foram sinte-

Triflato de octila (1). A octanol (4,6 g, 35,3 mmols) em CH2CI2 mistura de reação foi lentamente deixada aquecer para a temperatura ambi- ente durante 3 h. O sólido branco foi, então, filtrado através de Celite, a qual foi lavada com pentano (2 x 70 mL). A maioria dos solventes foram evapora- dos, deixando aproximadamente 5-10 mL de solvente e um precipitado 5 branco presente. Pentano quente (70 mL) foi adicionado e essa mistura foi filtrada para remover quaisquer sais de piridina restantes. O filtrado foi no- vamente evaporado para proporcionar um óleo laranja claro 1 (quantitativo através de TLC, rf = 0,64, EtOAc/Hex a 10%), o qual foi usado imediatamen- te.

X I

fH OMe tfy» (2,52%)

''XQjH S

Md

2,2,4-Trimetil-[1,3]oxatiolan-5-ona (2). A ácido tioláctico (14,0 g,

132,0 mmols) esfriado para 0 0C foi adicionado 2-metóxipropeno (50,5 mL, 528 mmols) gota a gota usando um funil de adição. A solução foi deixada aquecer para a temperatura ambiente, então, aquecida até refluxo durante 48 h. Após esfriar para a temperatura ambiente, Et2O (200 mL) foi adiciona- 15 do e essa mistura foi extraída com Na2CO3 (1N, 3 x 150 mL) e lavada com salmoura (2 x 100 mL). Os orgânicos combinados foram secos (MgSO4), filtrados e evaporados para proporcionar um óleo amarelo bruto, o qual foi destilado (pressão do aspirador de H2O, 25-35 torr) a 80-95 0C a fim de pro- porcionar 2 puro (9,9 g, 52%). 1H RMN (300 MHz, CDCI3) δ 1,56 (d, J = 6,9 20 Hz, 3 H), 1,72 (s, 3 H), 1,74 (s, 3 H), 4,10 (q,J = 6,9 Hz, 1 H), 13C RMN (75 MHz, CDCI3) δ 17,9, 30,8, 31,4, 42,5, 86,2, 175,0.

í ^UHMOStW,,48 «C Iftw

Λ-* TKXCH^CtMU

z *** €*.72%)

2,2,4-Trimetil-4-octil-[1,3]-oxatiolan-5-ona (3). A uma mistura de LiHMDS (31,7 mL, 31,7 mmols, 1 M em THF) em THF (47 mL) a -78 0C foi adicionado 2 (4,3 g, 29,4 mmols) em THF (47 mL) gota a gota através de 25 uma cânula e a solução amarela resultante agitada durante 30 min a -78 °C. Então, triflato de octila 1 (9,0 g, 35 mmols) em pentano (8 mL) foi adicionado lentamente em temperatura ambiente via uma cânula à solução do enolato a -78 °C. Após agitação a -78 0C durante 2 h, HCI a 1 N (200 mL) foi adiciona- do e a solução foi extraída com Et2O (3 x 75 mL). Os orgânicos combinados foram secos (MgS04), filtrados e evaporados. Cromatografia instantânea (EtOAc/hexanos a 2%) proporcionou 3 puro (5,45 g, 72%). 1H RMN (300 5 MHz, CDCI3, δ 0,86 (bs, 3 H), 1,25 (m, 10 H), 1,63 (s, 3 H), 1,73 (s, 3 H), 1,80 (s, 3 H), 1,5-1,81 (m, 4 H); 13C RMN (75 MHz, CDCI3) δ 14,0, 22,6, 25,5,

29,0, 29,1, 29,3, 29,4, 31,8, 32,5, 33,5, 41,4, 58,1, 84,7, 177,7.

JL (CHACH, '•^552'

2. AcCt1NEt* CH2Cl, AeS CH,

M· (j, 72%) ^ ^ (<« 54%)

Etil éster de ácido 2-Acetil-sulfanil-2-metil-decanoico (4). A 3 (5,33 g, 20,6 mmols) em EtOH (anidro, 14,6 mL) foi adicionado NaOEt (2,1 M, 12,7 mL, 26,9 mmols) [recentemente preparado a partir de metal Na (1,24 g, 54 mmols) em EtOH (24 mL)] e a solução foi deixada agitar em temperatu- ra ambiente. Após 30 min, a solução foi entornada em NH4CI(Sat)/HCI a 1 N (100 mL, 3:2) e extraída com Et2O (3 x 75 mL). Os orgânicos combinados foram, então, lavados totalmente com H2O, secos (MgSO4), filtrados, evapo- rados e redissolvidos em CH2CI2 (129 mL). A essa solução pré-esfriada (0 °C) foi adicionado Et3 (4,3 mL, 30,9 mmols) e cloreto de acetila (3,2 mL, 41,2 mmols). Após 40 min a 0 °C, NH4CI(Sat) (200 mL) foi adicionado e a solução foi extraída com CH2CI2 (3 x 70 mL). Os orgânicos combinados foram secos (MgSO4), filtrados e evaporados. Cromatografia instantânea (EtOAc/hexanos a 5%) proporcionou 4 puro (3,1 g, 54%). 1H RMN (300 MHz, CDCI3) δ 0.87 (t, J = 6,9 Hz, 3 H), 1,22-1,27 (m, 15 H), 1,61 (s, 3 H), 1,75-1,84 (m, 2 H), 2,26 (s, 3 H), 4,18 (q, J = 7,1 Hz, 2 H); 13C RMN (75 MHz, CDCI3) δ 13,9, 14,1, 22,6, 23,4, 24,4, 29,1, 29,2, 29,6, 30,3, 31,8, 38,3, 55,8, 61,5, 173,1, 195,8. IR (NaCI) 3430, 1868, 1693, 1644 cm'1; Anal. (Ci5H28O3S) C, 62,5; H, 9,78; Encontrado: C, 62,6; H, 9,83.

o

S w-u. u hmds/thf A

a^sCH5 -7ΒΚ H3C(H^^OH

{4,54%) (5,46%)

4-Hidróxi-5-metil-5-octil-5-H-tiofen-2-ona (5). A 4 (3,11 g, 10,8 mmols) em THF (155 mL) a -78 0C foi adicionado LiHMDS (13,4 mL, 13,4 mmols, 1,0 M em THF) e a solução foi deixada aquecer lentamente durante um período de 2 h para -5 0C e, então, mantida a -5 0C durante mais 20 min. A solução foi, então, entornada em HCI a 1N (200 mL) e extraída com Et2O 5 (3 x 100 mL). Os orgânicos combinados foram secos (MgSO4), filtrados e evaporados. Cromatografia instantânea (EtOAc a 20%/CH3C02H a 2%/ He- xanos) proporcionou 5 (1,2 g, 46%). 1H RMN (300 MHz1 CDCI3) (ceto- tautômero) δ 0,86 (t, J =6,7 Hz1 3 H), 1,19-1,24 (m, 10 H), 1,48-1,53 (m, 2 H), 1,65 (s, 3 H), 1,77-1,85 (m, 1 H), 1,94-2,01 (m, 1 H), 3,36 (s, 2 H); 1H 10 RMN (300 MHz, MeOD) (tautômero enol) δ 0,87-0,89 (m, 3 H), 1,29 (m, 10 H), 3,29 (s, 3 H), 1,81-1,87 (m, 2 H); 13C RMN (75 MHz, MeOD) (tautômero de enol) δ 14,7, 23,8, 26,4, 27,1, 30,5, 30,6, 30,8, 33,2, 39,8, 61,3, 103,1 (m),

189,8, 197,8. IR (NaCI) 3422, 1593 cm'1; Anal. (Ci3H22O2S), C, 64,4; H, 9,15; Encontrado: C, 64,3; H, 9,10.

NaHtMF

* »° * °

<5,4«%) * (T, 82%)

Éster terc-butíl de ácido 5-Metil-5-octil-2-oxo-tiofen-4-ilóxi)-

acético (7). A 5 (1,4 g, 5,8 mmols) em DMF (23 mL) esfriado para -40 0C foi adicionado NaH (326 mg, 8,15 mmols, 60% em óleo mineral) e a solução foi deixada aquecer e agitar a 0 0C durante 30 min. Bromoacetato de t-butila 6 (1,29 mL, 8,73 mmols) foi, então, adicionado diretamente e a mistura foi dei- 20 xada aquecer e agitar durante 3 h em temperatura ambiente. NH4CI(sat/HCI a 1 N (6:1, 100 mL) foi adicionado e a solução foi extraída com Et2O (3 x 70 mL). Os orgânicos combinados foram lavados com H2O, secos (MgSO4), filtrados e evaporados, cromatografia instantânea (EtOAc/hexanos a 15%) proporcionou 7 puro (1,7 g, 82%). 1H RMN (300 MHz, CDCI3) δ 0,86 (t, J = 25 6,9 Hz, 3 H), 1,24 (s, 12 H), 1,49 (s, 9 H), 1,68 (s, 3 H), 1,83-1,86 (m, 2 H), 4,43 (s, 2 H), 5,19 (s, 1 H); 13C RMN (75 MHz, CDCI3) δ 14,0, 22,6, 25,2, 26,3, 28,1, 29,2, 29,3, 29,5, 31,8, 38,9, 59,7, 68,5, 83,4, 102,1, 165,2, 185,5, 193,4. Anal. (Ci9H32O4S) C, 64,0; H, 9,05; Encontrado: C, 64,1, H, 9,08. f TFAlCH1Clj

χ) Ij

hah^'Vo-^rotey ^TOnrwi

(7,82%) 0 {8,77%) °

Ácido 5-Metil-5-octil-2-oxo-tiofen-4-ilóxi)-acético (8). A 7 (1,7 g, 4,7 mmols) dissolvido em CH2CI2 (32 mL) foi adicionado ácido trifluoroacéti- co (TFA) (9,1 mL) e a solução foi agitada em temperatura ambiente durante 4-5 h. Os solventes foram evaporados e o material bruto foi cromatografado 5 (EtOAc a 40%/CH3CO2H a 2%/hexanos) para proporcionar 8 puro (1,1, 77%). 1H RMN (300 MHz, CDCI3) δ 0,86 (t, J = 6,9 Hz, 3 H), 1,24 (s, 11 H), 1,47-1,48 (m, 1 H), 1,68 (s, 3 H), 1,84-1,88 (m, 2 H), 4,62 (s, 2 H), 5,31 (s, 1 H); 13C RMN (75 MHz, CDCI3) δ 14,1, 22,6, 25,1, 26,1, 29,2, 29,3, 29,5, 31,8,

38,9, 60,1, 67,7, 102,4, 169,8, 185,8, 195,4. IR (NaCI) 3442, 1645 cm'1; Anal.

(Ci5H24O4S) C, 59,9; H, 8,05; Encontrado: C, 60,0; H, 8,09.

EfXiCHiCk

I ^ H

HiiWiCb'

Hi LJ Π Ttt fl ^

(*.77%) 0 í»* 779fcJ

N'-(4-clorofenil)-hidrazida de ácido (5-Metil-5-octil-2-oxo-tiofen-4- ilóxi)-acético (9). A uma solução gelada (0 °C) de 8 (1,1 g, 3,67 mmols) em CH2CI2 (17,3 mL) foram adicionados cloridrato de 1-[3-(dimetilamino)propil]-

3-etilcarbodi-imida (EDC) (1,4 g, 7,3 mmols), cloridrato de 4- clorofenilhidrazina (854 mg, 4,77 mmols), NEt3 (0,51 mL, 3,67 mmols) e DMAP (67 mg, 0,55 mmols). Essa mistura foi agitada a 0 0C durante 30 min, então, aquecida para a temperatura ambiente e agitada durante 12 h. A so- lução foi entornada em NH4Clsat:HCI (IN) (4:1, 100 ml) e extraída com CH2CI2 (3 x 30 ml). Os orgânicos combinados foram secos (MgSO4), filtrados e eva- porados para proporcionar 9 bruto. Cromatografia instantânea [EtOAc/Hex a 30% (remove os subprodutos) - então, EtOAc/Hex a 35% (500 mL)- EtO- Ac/Hex a 40% (300 mL)] proporcionou 9 puro (1,2 g, 77%). 1H RMN (300 MHz, CDCI3) δ 0,86 (t, J = 6 Hz, 3 H), 1,24 (m, 11 H), 1,46-1,54 (m, 1 H), 1,71 (s, 3 H), 1,82-1,90 (m, 2 H), 4,57 (s, 2 H), 5,39 (s, 1 H), 6,75 (d, J = 8,8 Hz, 2 H), 7,18 (d, J = 8,8 Hz, 2 H), 7,38 (s, 1 H), 8,09 (s, 1 H); 13C RMN (100 MHz1 CDCI3) δ 14,1, 22,6, 25,3, 26,1, 29,2, 29,3, 29,5, 31,8, 38,8, 59,7, 69,7,

103,2, 114,7, 126,4, 145,8, 129,2, 165,9, 184,3, 193,5. IR (NaCI) 2957, 1695, 1658, 1609 cm'1.

Procedimento Geral A:

A uma solução gelada (0 °C) de 8 (0,05 mmols, 1,0 equiv.) em

CH2CI2 (1,0 mL) foram adicionados cloridrato de 1-[3-(dimetilamino)propil]-3- etilcarbodiimida (EDC) (0,1 mmol, 2,0 equiv.), derivado de hidrazina (0,065 mmols, 1,3 equiv.) e DMAP (0,0075 mmols, 0,15 equiv.) e trietilamina (1,0 equiv.) se o sal de cloridrato foi usado na reação. A mistura foi agitada a 0

0C durante 30 min, então, aquecida para a temperatura ambiente e agitada durante 12 h. A mistura de reação foi transferida para uma coluna de gel de sílica empacotada com CH2CI2. Cromatografia instantânea (éter/CH2C12 a 20) proporcionou o produto puro.

tX

N'-fenilhidrazida de ácido (5-Metil-5-octil-2-oxo-tiofen-4-ilóxi)- 15 acético (10). A 8 (15,0 mg, 0,05 mmols) e fenilhidrazina (6,4 μί, 0,065 mmols), seguindo o procedimento geral A, composto 10 foi obtido (15,0 mg, 77%) como um óleo (proporção cisitrans - 27\72>). 1H RMN (400 MHz, CDCI3) δ 0,80 (t, J = 8,0 Hz, 3 H), 1,10-1,24 (m, 11 H), 1,41-1,51 (m, 1 H), 1,66 (s, 3 H), 1,78-1,84 (m, 2H), 4,50 (s, 2 H), 5,33 (s, 1 H), 6,75 (dd, J = 1,2, 20 8,0 Hz, 2 H), 6,90 (dd, J = 8,0, 16,0 Hz, 1 H), 7,20 (dd, J = 8,0, 16,0 Hz, 2 H), 8,03 (s, 1 H); picos representativos para compostos cis: 1,62 (s, 3 H), 4,75 (s, 2H), 5,13 (s, 1 H); 13C RMN (100 MHz, CDCI3) δ 14,1,22,6,

25,4,26,3,29,2, 29,3,29,5, 31,8, 39,0, 59,4, 0,0, 103,5, 113,6, 122,0, 129,4,

147,0, 165,6, 183,9, 193,0.

11 N'-(3-metilfenil)-hidrazida de ácido (5-Metil-5-octil-2-oxo-tiofen-4- ilóxi)-acético (11). A 8 (15,0 mg, 0,05 mmols) e cloridrato de 1-(3- metilfenil)hidrazina (10,2 mg, 0,065 mmols), seguindo o procedimento geral A, composto 11 foi obtido (7,0 mg, 35%) como um óleo (proporção cisitrans - 5 29:71). 1H RMN (400 MHz1 CDCI3) δ 0,87 (t, J = 8,0 Hz, 3 H), 1,19-1,29 (m,

11 H), 1,51-1,57 (m, 1 H), 1,74 (s, 3 H), 1,85-1,91 (m, 2 H), 2,30 (s, 3 H), 4,59 (s, 2 H), 5,14 (s, 1 H), 6,62-6,65 (m, 2 H), 6,77 (d, J = 8,0 Hz, 1 H), 7,07- 7,19 (m, 1 H), 7,93 (s, 1 H); picos representativos para o composto c/s: 1,69 (s, 3 H), 2,33 (s, 3 H), 4,82 (s, 2 H), 5,23 (s, 1 H); 13C RMN (100 MHz, CD- 10 Cl3) δ 14,1, 21,5, 22,6, 25,0, 26,4, 29,2, 29,4, 29,6, 31,8, 38,5, 59,0, 70,0,

103,0, 110,5, 114,0, 122,5, 129,0, 139,0, 147,0, 165,0, 184,0, 193,0.

íugcr

HiCiHjChyT O f H

O ”

12

N‘-(4-trifluorometilfenil)-hidrazida de ácido (5-Metil-5-octil-2-oxo- tiofen-4-ilóxi)-acético (12). A 8 (15,0 mg, 0,05 mmols) e cloridrato de 1-[4- (trifluorometil)-fenil]hidrazina (14,0 mg, 0,065 mmols), seguindo o procedi- 15 mento geral A, composto 12 foi obtido (12,0 mg, 53%) como um óleo (pro- porção cis.trans - 17:83). 1H RMN (400 MHz, CDCI3) δ 0,80 (t, J = 8,0 Hz, 3 H), 1,10-1,25 (m, 11 H), 1,45-1,51 (m, 1 H), 1,68 (s, 3 H), 1,78-1,85 (m, 2 H),

4,56 (s, 2 H), 5,36 (s, 1 H), 6,29 (s, 1 H), 6,81 ((d, J = 8,0 Hz, 2 H), 7,43 (d, J = 8,0 Hz, 2 H), 7,94 (s, 1H); picos representativos para o composto c/s: 1,62

20 (s, 3 H), 4,74 (s, 2 H), 5,18 (s, 1 H).

o

H3C<H2Ch

N'-(4-metóxifenil)-hidrazida de ácido (5-Metil-5-octil-2-oxo-tiofen-

4-ilóxi)-acético (13). A 8 (15,0 mg, 0,05 mmols) e cloridrato de 1-(4- metóxifenil)hidrazina (11,3 mg, 0,065 mmols), seguindo o procedimento ge- ral A, composto 13 foi obtido (7,0 mg, 33%) como um óleo (proporção cisitrans -25:75). 1HRMN (400 MHz, CDCI3) δ 0,80 (t, J = 8,0 Hz, 3 Η), 1,08- 1,24 (m, 11 Η), 1,41 -1,51 (m, 1 Η), 1,66 (s, 3 Η), 1,80-1,84 (m, 2Η), 3,69 (s, 3 Η), 4,50 (s, 2 Η), 5,33 (s, 1 Η), 6,76 (s, 4 Η), 7,90 (s, 1H); picos representati- vos para ο composto cis: 1,63 (s, 3 H), 3,71 (s, 3H), 4,76 (s, 2 H), 5,15 (s, 1 5 H); 13C RMN (75 MHz, CDCI3) δ 14,1, 22,6, 25,4, 26,4, 29,2, 29,4, 29,5, 31,8, 39,0, 55,6, 69,4, 69,9, 103,5, 114,3, 114,7, 139,7, 155,3, 165,5, 183,8,

192,9.

Λ

14

N'-(2,4-diclorofenil)-hidrazida de ácido (5-Metil-5-octil-2-oxo- tiofen-4-ilóxi)-acético (14). A 8 (19,0 mg, 0,063 mmols) e cloridrato de 1-(2,4- 10 diclorofenil)hidrazina (17,5 mg, 0,082 mmols), seguindo o procedimento ge- ral A, composto 14 foi obtido (17,0 mg, 59%) como um sólido (proporção cis.trans - 20:80). 1H RMN (400 MHz, CDCI3) δ 0,86 (t, J = 7,2 Hz, 3 H), 1,15-

1,31 (m, 11 H), 1,42-1,51 (m, 1 H), 1,72 (s, 3 H), 1,82-1,90 (m, 2 H), 4,77 (s, 2 H), 5,41 (s, 1 H), 6,38 (s, 1 H), 6,76 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 7,14 (dd, J = 2,0, 15 8,4 Hz, 1 H), 7,32 (d, J = 2,0 Hz, 1 H), 8,11 (s, 1H); picos representativos para o composto cis: 1,65 (s, 3 H), 4,75 (s, 2 H), 5,20 (s, 1 H); 13C RMN (100 MHz, CDCI3) δ 14,1, 22,6, 25,4, 26,3, 29,2, 29,4, 29,5, 31,8, 39,0, 59,5,

69,8, 103,5, 114,4, 120,5, 126,5, 127,8, 129,4, 141,9, 165,5, 183,9, 193,0.

α

HiCCHíCrT 0Td O

15

N'-(3,4-diclorofenil)-hidrazida de ácido (5-Metil-5-octil-2-oxo-

20 tiofen-4-ilóxi)-acético (15). A 8 (19,0 mg, 0,063 mmols) e cloridrato de 1-(3,4- diclorofenil)hidrazina (17,5 mg, 0,082 mmols), seguindo o procedimento ge- ral A, composto 15 foi obtido (12,0 mg, 42%) como um semissólido (propor- ção cisitrans - 17:83). 1H RMN (400 MHz, CDCI3) δ 0,80 (t, J = 6,8 Hz, 3 H), 1,09-1,23 (m, 11 H), 1,36-1,53 (m, 1 H), 1,67 (s, 3 H), 1,77-1,84 (m, 2 H), 25 4,54 (s, 2 H), 5,35 (s, 1 H), 6,21 (s, 1 H), 6,60 (dd, J = 2,4, 8,8 Hz1 1 H), 6,84 (d, J = 2,4 Hz, 1 Η), 7,21 (d, J = 8,8 Hz, 1 Η), 8,0 (s, 1H); picos representati-

vos para o composto cis: 1,65 (s, 3 H), 4,73 (s, 2 H), 5,18 (s, 1 H); 13C RMN

16

N'-[2-cloro-5-(trifluorometil)fenil]-hidrazida de ácido (5-Metil-5- octil-2-oxo-tiofen-4-ilóxi)-acético (16). A 8 (15,0 mg, 0,05 mmols) e cloridrato de 1-[2-cloro-5-(trifluorometil)fenil]hidrazina (13,6 mg, 0,065 mmols), seguin- do o procedimento geral A, composto 16 foi obtido (10,4 mg, 42%) como um óleo (proporção cisitrans - 14:86). 1H RMN (300 MHz1 CDCI3) δ 0,80 (t, J = 6,6 Hz, 3 H), 1,06-1,24 (m, 11 H), 1,41 -1,50 (m, 1 H), 1,67 (s, 3 H), 1,76-1,89 (m, 2 H), 4,58 (s, 2 H), 5,37 (s, 1 H), 6,53 (d, J= 3,3 Hz, 1 H), 6,98 (d, J = 1,5 Hz, 1 H), 7,07 (dd, J= 1,8, 8,4 Hz, 1 H), 7,37 (d, J = 8,1 Hz, 1 H), 8,03 (s, 1H); picos representativos para o composto cis: 1,60 (s, 3 H), 4,77 (s, 2 H), 5,28 (s, 1 H).

17

N'-(2-benzotiazola)-hidrazida de ácido (5-Metil-5-octil-2-oxo- tiofen-4-ilóxi)-acético (17). A 8 (22,0 mg, 0,07 mmols) e 2- hidrazinobenzotriazola (14,6 mg, 0,09 mmols), seguindo o procedimento ge- ral A, composto 17 foi obtido (14,0 mg, 45%) como um sólido (único isôme- ro). 1H RMN (400 MHz, CDCI3) δ 0,88 (t, J = 6,4 Hz, 3 H), 1,26-1,83 (m, 11 H), 1,52 (m, 1 H), 1,75 (s, 3 H), 1,86-1,99 (m, 2 H), 4,86 (s, 2 H), 5,22 (s, 2 H), 5,32 (s, 1 H), 7,36 (t, J = 7,2 Hz1 1 H), 7,48 (t, J = 7,2 Hz1 1 H), 7,81 (d, J = 8,0 Hz, 1 H), 7,85 (d, J = 8,0 Hz, 1 H); m.p. 151-152°C.

(75 MHz, CDCI3) δ 14,1, 22,6, 25,4, 26,3, 29,2, 29,4, 29,5, 31,8, 39,0, 59,5, 69,8, 103,5, 113,2, 115,2, 124,8, 130,9, 133,2, 146,7, 165,9, 184,0, 193,2. HjqHsCh O

18

N'-[6-metil-4-(trifluorometil)-2-piridil]-hicJrazida de ácido (5-Metil-

5-octil-2-oxo-tiofen-4-ilóxi)-acético (18). A 8 (15,0 mg, 0,05 mmols) e 1-[6- metil-4-(trifluorometil)-2-piridil]hidrazina (12,5 mg, 0,065 mmols), seguindo o procedimento geral A, composto 18 foi obtido (12,5 mg, 53%) como um óleo (proporção cis:trans - 10:90). 1H RMN (300 MHz, CDCI3) δ 0,79 (t, J = 8,4 Hz, 3 H), 1,10-1,29 (m, 11 H), 1,44-1,52 (m, 1 H), 1,70 (s, 3 H), 1,82-1,89 (m, 2 H), 2,41 (s, 3 H), 4,57 (s, 2 H), 5,37 (s, 1 H), 6,59 (s, 1 H), 6,81 (s, 1H),

7,31 (bs, 1 H), 8,70 (bs, 1 H); picos representativos para o composto cis: 1,62 (s, 3 H), 4,74 (s, 2 H), 5,29 (s, 1H).

19

N'-(2-clorofenil)-hidrazida de ácido (5-Metil-5-octil-2-oxo-tiofen-4- ilóxi)-acético (19). A 8 (98,0 mg, 0,33 mmols) e cloridrato de 2- clorofenilhidrazina (77,0 mg, 0,43 mmols), seguindo o procedimento geral A, composto 19 foi obtido (91,0 mg, 60%). 1H RMN (300 MHz1 CDCI3) δ 0,85 (t, J = 7,0 Hz, 3 H), 1,23 (m, 11 H), 1,48-1,51 (m, 1 H), 1,69 (s, 3 H), 1,81-1,89 (m, 2 H), 4,56 (s, 2 H), 5,37 (s, 1 H), 6,49-6,51 (m, IH), 6,84-6,94 (m, 2H), 7,12-7,35 (m, 2 H), 8,31 (d, J = 3,1 Hz, 1 H). 13C RMN (100 MHz, CDCI3) δ

14,0, 22,5, 25,3, 26,2, 29,2, 29,3, 29,5, 31,7, 38,9, 59,5, 69,7, 103,3, 113,5,

119,8, 122,0, 122,7, 129,6, 142,9, 165,5, 184,1, 193,3.

O

O

20

N'-(4-piridil)-hidrazida de ácido (5-Metil-5-octil-2-oxo-tiofen-4- ilóxi)-acético (20). A 8 (100,0 mg, 0,33 mmols) e hidrazina isonicotínica (59,0 mg, 0,42 mmols), seguindo o procedimento geral A, composto 20 foi obtido (118,0 mg, 86%) após cromatografia instantânea (MeOH/CHCh a 5%). 1H RMN (300 MHz, CDCI3) δ 0,85 (t, J = 7,0 Hz, 3 H), 1,23 (m, 11 H), 1,44-1,45 (m, 1 H), 1,68 (s, 3 H), 1,82-1,88 (m, 2 H), 4,69 (s, 2 H), 5,42 (s, 1 H), 7,64 (d, J = 5,3 Hz, 2 H), 8,67 (m, 2H). 13C RMN (100 MHz1 CDCI3) δ 14,0, 22,5, 253, 26,2, 29,2, 29,3, 29,5, 31,7, 38,9, 59,5, 69,7, 103,3, 113,5, 119,8, 122,0, 122,7, 129,6, 142,9, 165,5, 184,1, 193,3.

M

'JJ-

21

N'-(4-clorofenil)-hidrazida de ácido 5-Metil-5-hexil-2-oxo-tiofen-4- ilóxi)-acético (21). Esse composto foi preparado de acordo com o esquema 10 mostrado na figura 2. A 26 (83,0 mg, 0,29 mmols) e cloridrato de 4- clorofenilhidrazina (68,0 mg, 0,38 mmols), seguindo o procedimento geral A, composto 21 foi obtido (34,0 mg, 30%). 1H RMN (300 MHz1 CDCI3) δ 0,86 (m, 3 H), 1,26 (m, 7 H), 1,45-1,50 (m, 1 H), 1,71 (s, 3 H), 1,85-1,90 (m, 2 H),

4,57 (s, 2 H), 5,39 (s, 1 H), 6,74 (d, J =8,8 Hz, 2 H), 7,20 (d, J = 8,8 Hz, 2 H), 7,59 (s, 1 H), 8,21 (s, IH).

Métodos Biológicos e Bioquímicos

Purificação de FAS de células de câncer de mama humano ZR-75-1

FAS humana foi purificada de células de câncer de mama hu- mano ZR-75-1 cultivadas obtidas da American Type Culture Collection. O 20 procedimento, adaptado de Lion et al., 1981 e Kuhajda et al., 1994, utiliza Iise hipotônica, precipitações sucessivas com polietileno glicol (PEG) e cro- matografia de troca de ânions. Células ZR-75-1 são cultivadas a 37 0C com 5% de C02 em meio de cultura RPMI com 10% de soro bovino fetal, penici- lina e estreptomicina.

Dez frascos T150 de células confluentes são submetidos à Iise

com 1,5 ml de tampão de Iise (Tris-HCI a 20 mM, pH de 7,5, EDTA a 1 mM, fluoreto de fenilmetanossulfonila a 0,1 mM (PMSF), Igepal a 0,1% CA-630) e homogeneizados sobre gelo durante 20 recalques. O Iisato é centrifugado em um rotor JA-20 (Beckman) a 20.000 rpm durante 30 minutos a 4 0C e o sobrenadante é levado para 42 ml com tampão de lise. Uma solução de PEG 8000 a 50% em tampão de Iise é adicionada lentamente ao sobrena- dante até uma concentração final de 7,5%. Após agitação durante 60 minu- tos a 4 °C, a solução é centrifugada em um rotor JA-20 (Beckman) a 15.000 rpm durante 30 minutos a 4 0C. PEG 8000 sólido é, então, adicionado ao sobrenadante até uma concentração final de 15%. Após a agitação e centri- fugação serem repetidas conforme acima, o pélete é resuspenso durante a noite a 4 0C em 10 ml de Tampão A (K2HPO4 a 20 mM, pH de 7,4). Após filtração a 0,45 μΜ, a solução de proteína é aplicada a uma coluna de troca de ânions Mono Q 5/5 (Pharmacia). A coluna é lavada durante 15 minutos com tampão A a 1 ml/minuto e o material ligado é eluído com um gradiente linear de 60 ml durante 60 minutos em KCI a 1 M. FAS (MW~ 270 kD) elui, tipicamente, em KCI a 0,25 M em três frações de 0,5 ml identificadas usando SDS-PAGE a 4-15% com coloração com Coomassie G250 (Bio-Rad). A concentração de proteína FAS é determinada usando o Coomassie Plus Protein Assay Reagent (Pierce) de acordo com as especificações do fabri- cante usando BSA como um padrão. Esse procedimento resulta em prepa- rados de FAS substancialmente puros (>95%), conforme julgado através de géis corados com Coomassie.

Medição de Atividade Enzimática de FAS e Determinação da IC^n dos Com- postos

A atividade de FAS é medida através de monitoramento da oxi- dação dependente de malonil-CoA de NADPH espectrofotometricamente em 25 uma OD340 em lâminas com 96 cavidades (Dils et al. e Arslanian et al., 1975). Cada cavidade contém 2 μg de FAS purificada, K2HPO4 a 100 mM, pH de 6,5, ditiotreitol a 1 mM (Sigma) e β-NADPH a 187,5 μΜ (Sigma). Solu- ções de estoque de inibidores são preparadas em DMSO a 2,1 e 0,5 mg/ml, resultando em concentrações finais de 20, 10 e 5 μg/ml quando 1 μΙ de esto- 30 que é adicionado por cavidade. Para cada experimento, cerulenina (Sigma) é passada como um controle positivo junto com controles de DMSO, inibido- res e placebos (sem enzima FAS), todos em duplicata. O ensaio é realizado sobre um Espectrofotômetro Molecular De- vices SpectraMax Plus. As lâminas contendo FAS, tampões, inibidores e controles são colocadas no espectrofotômetro aquecido para 37°C. Usando o protocolo cinético, as cavidades são purgadas em cavidades duplas con- tendo 100 μΙ de K2HPO4 a 100 μΜ, pH de 6,5 e a lâmina é lida em uma OD340 em intervalos de 10 seg durante 5 minutos para medir qualquer oxida- ção independente de malonil-CoA de NADPH. A lâmina é removida do es- pectrofotômetro e malonil-CoA (67,4 μΜ, concentração final por cavidade) e alquinil-CoA (61,8 uM, concentração final por cavidade) são adicionadas a cada cavidade, exceto os placebos. A lâmina é lida novamente conforme acima com o protocolo cinético para medir a oxidação de NADPH dependen- te de malonil-CoA. A diferença entre a Δ OD340 para oxidação de NADPH dependente de malonil-CoA e não dependente de malonil-CoA é a atividade de FAS específica. Em virtude da pureza do preparado de FAS, a oxidação e NADPH não dependente de malonil-CoA é negligenciável.

A IC50 para os compostos contra a FAS é determinada através de plotagem da Δ OD340 para cada concentração de inibidor testada, reali- zando regressão linear e computando a linha de melhor adaptação, valores r2 e intervalos de confiança de 95%. A concentração de composto que pro- 20 porciona inibição de 50% da FAS é a IC50. Gráficos da Δ OD340 versus o tempo são plotados pelo software SOFTmax PRO (Molecular Devices) para cada concentração de composto. Computação de regressão linear, linha de melhor adaptação, r2 e intervalos de confiança de 95% é calculada usando o Prism Versão 3.0 (Graph Pad Software).

Ensaio de crescimento de célula com violeta cristal

O ensaio com violeta cristal mede o crescimento celular, mas não a citotoxicidade. Esse ensaio emprega coloração com violeta cristal de células fixadas em lâminas com 96 cavidades com subsequente solubiliza- ção e medição da OD490 sobre um espectrofotômetro. A OD490 corresponde 30 a um crescimento celular por tempo unitário medido. As células são tratadas com os compostos de interesse ou controles de veículo e a IC50 para cada composto é computada. Para medir a citotoxicidade de compostos específicos contra cé- lulas cancerígenas, 5 x 104 células de câncer de mama humano MCF-7, ob- tidas da American Type Culture Collection são colocadas por cavidade em lâminas com 24 cavidades em meio DMEM com soro fetal bovino a 10%, 5 penicilina e estreptomicina. Após cultura durante a noite a 37°C e 5% de CO2, os compostos a serem testados, dissolvidos em DMSO, são adiciona- dos às cavidades em um volume de 1 μΙ nas seguintes concentrações: 50, 40, 30, 20 e 10 μς/ιηΙ em triplicata. Concentrações adicionais são testadas se requerido. 1 μΙ de DMSO é adicionado às cavidades em triplicata como 0 10 controle de veículo. C75 é passado a 10 e 5 μςΛτιΙ em triplicata como contro- les positivos.

Após 72 horas de incubação, as células são coradas com 0,5 ml de corante Violeta Cristal (0,5% em metanol a 25%) em cada cavidade. Após 10 minutos, as cavidades são enxaguadas, secas ao ar e, então, solubiliza- 15 das com 0,5 ml de dodecil sulfato de sódio a 10% com agitação durante 2 horas. Após transferência de 100 μΙ de cada cavidade para uma lâmina com 96 cavidades, as lâminas são lidas em uma OD490 sobre um Espectrofotô- metro Molecular Devices SpectraMax Plus. Os valores médios de OD490 são computados usando 0 software SOFTmax Pro (Molecular Devices) e os va- 20 Iores de IC50 são determinados através de análise por regressão linear u- sando o Prism versão 3.02 (Graph Pad Software, San Diego).

Ensaio de citotoxicidade XTT

O ensaio XTT é uma alternativa não radioativa para o ensaio de citotoxicidade por liberação de [51Cr]. XTT é um sal de tetrazólio que é redu- zido a um corante de formazano apenas por células viáveis, metabolicamen- te ativas. A redução de XTT é medida espectrofotometricamente como OD490

- OD650-

Para medir a citotoxicidade de compostos específicos contra cé- lulas cancerígenas, 9 x 103 células de câncer de mama humano MCF-7, ob- tidas da American Type Culture Collection, são colocadas em lâminas com 96 cavidades em meio DMEM com soro fetal bovino a 10%, soro, insulina, penicilina e estreptomicina. Após cultura durante a noite a 37°C e 5% de CO2, os compostos a serem testados, dissolvidos em DMSO1 são adiciona- dos às cavidades em um volume de 1 μΙ nas seguintes concentrações: 80, 40, 20, 10, 5, 2,5, 1,25 e 0,625 μg/ml em triplicata. Concentrações adicionais são testadas se requerido. 1 μΙ de DMSO é adicionado à cavidades em tripli- 5 cata como o controle de veículo. C75 é passado a 40, 20, 10, 15, 12,5, 10 e 5 μg/ml em triplicata como controles positivos.

Após 72 horas de incubação, as células são incubadas durante 4 horas com o reagente XTT conforme as instruções do fabricante (Cell Proli- feration Kit Il (XTT) Roche). As lâminas são lidas em uma OD490 e OD650 so- 10 bre um Espectrofotômetro Molecular Devices SpectraMax. Três cavidades contendo o reagente XTT sem células servem como 0 placebo de lâmina. Os dados de XTT são reportados como as médias de OD490 - OD6so e o erro padrão da média é computado usando o software SOFTmax Pro (Molecular Dynamics).

A IC50 para os compostos é definida como a concentração de

fármaco que leva a uma redução de 50% na OD490 - OD65O comparado com os controles. A OD49O - OD65O é computada pelo software SOFTmax PRO (Molecular Devices) para cada concentração de composto. A IC50 é calcula- da através de regressão linear, plotando a atividade de FAS como percentu- 20 al do controle versus concentrações de fármaco. Regressão linear, linha de melhor adaptação, r2 e intervalos de confiança de 95% são determinados usando o Prism Versão 3.0 (Graph Pad Software).

Medição de incorporação de r14C1acetato em lipídíos totais e determinação de IC^n de compostos Esse ensaio mede a incorporação de [14C]acetato em lipídios

totais e é uma medida da atividade na via de síntese de ácido graxo ín vitro. Ele é utilizado para medir a inibição de síntese de ácido graxo in vitro .

Células de câncer de mama humano MCF-7 cultivadas conforme acima são colocadas a 5 x 104 células por cavidade em lâminas com 24 ca- vidades. Após incubação durante a noite, os compostos a serem testados, solubilizados em DMSO, são adicionados a 5, 10 e 20 μg/ml em triplicata, com menores concentrações testadas se necessário. DMSO é adicionado à cavidades em triplicata para controle de veículo. C75 é passado a 5 e 10 μς/ιτιΙ em triplicata como controles positivos. Após 4 horas de incubação, 0,25 μΟϊ de [14Cjacetato (volume de 10 μΙ) são adicionados a cada cavidade.

Após 2 horas de incubação adicional, o meio é aspirado das ca- vidades e 800 μΙ de clorofórmio:metanol (2:1) e 700 μΙ de MgCI2 a 4 mM são adicionados a cada cavidade. Os conteúdos de cada cavidade são transferi- dos para tubos de Eppendorf de 1,5 e centrifugados em velocidade total du- rante 2 minutos em uma Eppendorf Microcentrifuge 5415D de alta velocida- de. Após remoção da camada aquosa (superior), mais 700 μΙ de clorofór- mio.metanol (2:1) e 500 μΙ de MgCI2 a 4 mM são adicionados a cada tubo e, então, centrifugados durante 1 minutos conforme acima. A camada aquosa é removida com uma pipeta de Pasteur e descartada. Mais 400 μΙ de clorofór- mio:metanol (2:1) e 200 μΙ de MgCI2 a 4 mM são adicionados a cada tubo, então, centrifugados e a camada aquosa é descartada. A fase inferior (orgâ- nica) é transferida para um frasco de cintilação e seca a 40 0C sob gás N2. Uma vez seca, 3 ml de cintilante (APB N-NBC5104) são adicionados e os frascos são contados com relação ao 14C. O Contador de Cintilação Beck- man calcula os valores médios de cpm para triplicatas.

A IC5O para os compostos é definida como a concentração de 20 fármaco que leva a uma redução de 50% na incorporação de [14CJacetato em lipídios comparado a controles. Essa é determinada através de plotagem do cpm médio para cada concentração de inibidor testada, realizando re- gressão linear e computando a linha de melhor adaptação, valores r2 e inter- valos de confiança de 95%. Os valores médios de cpm são computados pelo 25 Contador de Cintilação Beckman (Modelo LS6500) para cada concentração de composto. Computação de regressão linear, linha de melhor adaptação, r2 e intervalos de confiança de 95% é calculada usando o Prism Versão 3.0 (Graph Pad Software).

Testaaem de perda de peso para novos inibidores de FAS Camundongos Balb/C (Jackson Labs) são utilizados para a tes-

tagem inicial de perda de peso. Os animais são alojados em salas com tem- peratura ambiente e ciclo de dia/noite de 12 horas e alimentados com ração para camundongo e água ad lib. Três camundongos são utilizados para cada composto testado com controles de veículo em triplicata por experimento. Para os experimentos, os camundongos são alojados separadamente para cada composto testado, três camundongos por gaiola. Compostos são diluí- 5 dos em DMSO a 10 mg/ml e os camundongos são injetados intraperitoneal- mente com 60 mg/kg em aproximadamente 100 μΙ de DMSO ou com veículo apenas. Os camundongos são observados e pesados diariamente; os pesos médios e erros padrões são computados com o Excel (Microsoft). O experi- mento continua até que os animais tratados atinjam seus pesos pré- 10 tratamento.

Propriedades Antimicrobianas

Um ensaio de microdiluição de caldo é usado para avaliar a ati- vidade antimicrobiana dos compostos. Os compostos são testados em uma diluição serial de duas vezes e a concentração que inibe o crescimento visí-

vel (OD6OO a 10% do controle) é definida como a MIC. Micro-organismos testados incluem Staphylococcus aureus (ATCC N5 29213), Enterococcus faeealis (ATCC N9 29212), Pseudomonas aeruginosa (ATCC Ng 27853) e Escheriehia eoli (ATCC N9 25922). O ensaio é realizado em dois meios de crescimento, Caldo de MuelIer Hinton e Caldo de Tripticase de Soja.

Uma lâmina de ágar com sangue (Tsoja/sangue de ovelha a 5%)

é inoculada a partir de estoques congelados mantidos em caldo Tsoja con- tendo glicerol a 10% e incubada durante a noite a 37° C. As colônias são suspensas em caldo estéril, de modo que a turvação eqüivale à turvação de um padrão de McFarIand a 0,5 mM. O inóculo é diluído a 1:10 em caldo es- 25 té ri I (Mueller Hinton ou Tripticase de soja) e 195 μΙ são distribuídos por cavi- dade de uma lâmina com 96 cavidades. Os compostos a serem testados, dissolvidos em DMSO, são adicionados às cavidades em um volume de 5 μΙ nas seguintes concentrações: 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,56 e 0,78 μς/ηιΙ em duplicata. Concentrações adicionais são testadas se requerido. 5 μΙ de DM- 30 SO são adicionados à cavidades em duplicada como o controle de veículo. Diluições seriais de compostos de controle positivo, vancomicina (E. faeealis e S. aureus) e tobramicina (E. eoli e P. aeruginosa) são incluídos em cada operação.

Após 24 horas de incubação a 37 °C, as lâminas são lidas em uma OD6Oo sobre um Espectrofotômetro Molecular Devices SpectraMax. Os valores médios de OD6oo são computados usando o software SOFTmax Pro 5 (Molecular Devices) e os valores de MIC são determinados através de análi- se por regressão linear usando o Prism versão 3.02 (Graph Pad Software, San Diego). A MIC é definida como a concentração de composto requerida para produzir uma leitura de OD600 equivalente a 10% da leitura do controle de veículo. • · Resultados da testaaem biológica

O FAS (IC50) 14C (ICsfl) Χπ (ICbo) XTT (IC50) Ò H Neg 12,7 ± 3,7 ug/ml 6,0 ±0,8 ug/ml 14,9 ug/ml (3T3) 237 ± 43 ug/ml 8,8 ug/ml (OV) 7,3 ug/ml (SKBR) Violeta Cr. (IC50) 4,7 ug/ml (H) 9,4 ug/ml (231) 9 i <5 ug/ml 4,5 ug/ml (RKO) 4,3 ug/ml (MRC Perda de Peso 60 mg/kg: 1,4% (dia 2) FAO SC 150 FAO MAX Neg 107% @ 0,195 ug/ml CO FAS (IC50) 14C (IC50) XTT (IC50) Violeta Cr. (IC50) Não-testado 12,0 ug/ml 9,0 ug/ml (M) 21,9 ug/ml (H) I I 10,1 ml (OV) O ” Perda de peso Não-testado π FAO SC 150 FAO Max Neg 116% @ 1,56 ug/ml FAS (IC50) 14C (IC50) XTT(IC50) Violeta Cr. (IC50) Não-testado 11,3 ug/ml 5,7 ug/ml(M) 4,8 ug/ml (H) 12 9,6 ml (OV) Perda de peso 60 mg/kq: 2,7% (dia 2) FAO SC 150 FAO Max Neg 118% a 1,56 uq/ml • · λ H Cf' FAS (IC50) 14C (IC50) Xn(IC50) Violeta Cr. (IC5o) 0 Não-testado 21,3 ug/ml 9,0 ug/ml (M) 12,3 ug/ml (H) 13 18,0 ug/ml (OV) Perda de peso Não-testado FAO SC 150 FAO Max Neg 103% a 0,098 ug/ml O FAS (IC50) wC (IC50) Χπ (IC50) Violeta Cr. (IC50) A·, c'wü o n Não-testado 18,3 ug/ml 6,9 ug/ml (M) 7.3 ug/ml (H) 12.8 ug/ml (OV) Perda de peso Não-testado FAO SC 150 FAO Max Neg 100% a 0,098 ug/ml • · I Xr FAS (ICso) 14C (ICm) Χπ (IC50) Violeta Cr. (ICso) Não-testado 13,3 ug/ml 11,4 ug/ml(M) 8,5 ug/ml (H) 15,2 ug/ml (OV) 15 Perda de peso Não-testado FAO SC 150 FAO Max Neg 100% a 0,395 ug/ml FAS (IC50) 14C (IC50) XTT(IC50) Violeta Cr. (IC50) H5ClHjChA CFí Não-testado 16,5 ug/ml 6,0 ug/ml (M) 5,8 ug/ml (H) O " 16 7,2 ug/ml (OV) Perda de peso 60 mg/kg: 1,7% (dia 3) FAO SC 150 FAO Max Neg 137% @ 6,25 ug/mJ • · O FAS (IC50) 14C (ICsn) XTT (ICfi0) Violeta Cr. (IC50) Não-testado Neg (>80 ug/ml) 74,0 ug/ml (M) 17,8 ug/ml (H) O H 38,7 ml (OV) i7 Perda de peso Não-testado FAO SC 150 FAO Max 4,9 ug/ml 167% @ 6,25 ug/ml FAS (IC50) 14C (ICai) XTT(IC50) Violeta Cr. (IC50) Não-testado 15,4 ug/ml 5,7 ug/ml (M) 5,8 ug/ml (H) n 13,3 ug/ml (OV) Perda de peso 60 mg/kg: 0,6% (dia 2) FAO SC 150 FAO Max 1,6 ug/ml 149% @ 1,56 ug/ml • · O FAS (IC50) mC (ICm) XTT(ICsn) Violeta Cr. (IC50) Neg 39,8 ± 12,7 ug/ml 6,1 ±0,3 ug/ml 7,6 ug/ml 9,4 ug/ml (OV) Perda de peso 60 mg/kg: ± 3,0% (dia V FAO SC 150 FAO MAX Neg 90% @0,125 ug/ml O H f FAS (IC50) 14C (IC50) XTT(IC50) Violeta Cr. (IC50) ^T0 I MJi Neg 17,4 ug/ml 22,5 ± 2,0 ug/ml 18,2 ug/ml 33,0 ± 9,1 ug/ml Perda de peso FAO SC 150 FAO MAX Neg 89% @0,125 ug/ml CO **4

Claims (25)

1. Composto de fórmula: <formula>formula see original document page 39</formula> em que: R1 = H, C1-C20 alquila, cicloalquila, alquenila, arila, arilalquila ou alquilarila, cianometila, -OCH3, -OC(O)CH3 ou -OC(O)CF3; R2 = -OCH2C(O)NHNH-R5, onde R5 é: (a) fenila opcionalmente substituída por um ou mais de halogê- nio, CrC8 alquila opcionalmente substituída por halogênio, -OH, -OR6, onde R6 é CrC8 alquila opcionalmente substituída por halogênio; ou OH, -OR6, onde R6 é CrC8 alquila opcionalmente substituída por halogênio; ou (b) 2-, 3- ou 4-piridila opcionalmente substituída por halogênio, - (c) um heterociclo selecionado do grupo consistindo em imidazo- (d) -C(O)R7, onde R7 é uma CrC20 alquila, cicloalquila, alquenila, Ia, tiazola, benzimidazola, benzoxazola, benztiazola, tetrazola, triazola e a- minotiazola; ou arila, arilalquila ou alquilarila ou um heterociclo selecionado do grupo consis- tindo em piridila, imidazola, tiazola, benzimidazola, benzoxazola, benztiazola, tetrazola, triazola e aminotiazola; e R3 e R4, os mesmos ou diferentes um do outro, são Ci-C2O alqui- la, cicloalquila, alquenila, arila, arilalquila ou alquilarila; contanto que, quando R1 é -H, -OCH3 ou -OC(O)CF3 e R3 é - (CH2)7CH3, então, R2 não é -OCH2C(O)NHNH-R5, onde R5 é -p-C6H4CI, - <formula>formula see original document page 39</formula>

2. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que R1 é H.

3. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que R5 é Cr Cio alquila, cicloalquila, alquenila, arila, arilalquila ou alquilarila.

4. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que R3 é -H ou -CH3.

5. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que R4 é n- C6-C8 alquila.

6. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que o com- posto é selecionado do grupo consistindo em: <formula>formula see original document page 40</formula>

7. Composição farmacêutica compreendendo um diluente far- macêutico e um composto como definido na reivindicação 1.

8. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, em que R1 é H.

9. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, em que R5 é CrCio alquila, cicloalquila, alquenila, arila, arilalquila ou alquila- rila.

10. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, em que R3 é -H ou -CH3.

11. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, em que R4 é n-C6-C8 alquila.

12. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, em que o composto é selecionado do grupo consistindo em: <formula>formula see original document page 41</formula>

13. Método de tratamento de câncer em um animal ou ser hu- mano compreendendo administração de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 7 ao referido indi- víduo.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que o indiví- duo é um ser humano.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, em que o indiví- duo é um animal.

16. Método de acordo com a reivindicação 14, em que a compo- sição farmacêutica compreende um composto selecionado do grupo consis- tindo em: <formula>formula see original document page 41</formula>

17. Método de acordo com a reivindicação 15, em que a compo- sição farmacêutica compreende um composto selecionado do grupo consis- tindo em: <formula>formula see original document page 42</formula>

18. Método de inibição da atividade de sintase de ácido graxo em um animal ou ser humano compreendendo administração de uma quan- tidade eficaz de uma composição farmacêutica como definida na reivindica- ção 7, ao referido indivíduo.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o indiví- duo é um ser humano.

20. Método de acordo com a reivindicação 18 em que o indiví- duo é um animal.

21. Método de inibição do crescimento de células microbianas invasivas em um animal ou ser humano compreendendo administração de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 7, ao referido indivíduo.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, em que o indiví- duo é um ser humano.

23. Método de acordo com a reivindicação 21, em que o indiví- duo é um animal.

24. Método de acordo com a reivindicação 22, em que o com- posto é selecionado do grupo consistindo em: <formula>formula see original document page 43</formula>

25. Método de acordo com a reivindicação 21 em que o compos- to é selecionado do grupo consistindo em: <formula>formula see original document page 43</formula>