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BRPI0717505B1 - Conjugado de peptídeo e formulação farmacêutica - Google Patents

Conjugado de peptídeo e formulação farmacêutica Download PDF

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BRPI0717505B1
BRPI0717505B1 BRPI0717505-1A BRPI0717505A BRPI0717505B1 BR PI0717505 B1 BRPI0717505 B1 BR PI0717505B1 BR PI0717505 A BRPI0717505 A BR PI0717505A BR PI0717505 B1 BRPI0717505 B1 BR PI0717505B1
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BR
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peptide
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confidential
glycosyl
peg
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Application number
BRPI0717505-1A
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Inventor
Xiao Zeng
Shawn DeFrees
Original Assignee
Novo Nordisk A/S
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Publication date
Application filed by Novo Nordisk A/S filed Critical Novo Nordisk A/S
Publication of BRPI0717505A2 publication Critical patent/BRPI0717505A2/pt
Publication of BRPI0717505B1 publication Critical patent/BRPI0717505B1/pt
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Abstract

conjugado de peptídeo e formulação farmacêutica a presente invenção fornece conjugados entre peptídeos e porções de peg através de ligantes de glicerol.

Description

CONJUGADO DE PEPTÍDEO E FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA Referência cruzada a pedidos relacionados
O presente pedido reivindica prioridade para Pedido de Patente Provisório U.S. No. 60/828.208, depositado em 4 de outubro de 2006, que é aqui incorporado em sua totalidade por referência para todos objetivos.
Sumário da invenção
Em uma modalidade de exemplo, moléculas glicopeguiladas da invenção são produzidas pela formação mediada por enzima de um conjugado entre um peptídeo glicosilado ou não glicosilado e uma porção sacaril enzimaticamente transferivel que inclui um grupo de modificação, como um grupo de modificação polimérico como poli(etileno glicol), em sua estrutura. Em uma modalidade de exemplo, o peptídeo é um membro selecionado de proteínas morfogênicas do osso (por exemplo, BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15), neurotrofinas (por exemplo, NT-3, NT-4, NT-5), fatores de diferenciação do crescimento (por exemplo, GDF-5) , fator neurotrófico derivado de linhagem de células (GDNF), fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), fator de crescimento de nervos (NGF), protease de fator de von Willebrand (vWF), Fator VII, Fator Vila, Fator VIII, Fator IX, Fator X, Fator XI, Fator VIII de domínio B deletado, proteína de fusão de vWFFator VIII que tem Fator VIII de comprimento total, proteína de fusão de vWF-Fator VIII que tem Fator VIII de domínio B deletado, eritropoietina (EPO), fator estimulante de colônia de granulócitos (G-CSF), Fator estimulante de colônia de granulócitos-macrófagos (GM-CSF)interferon alfa,
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2/239 interferon beta, interferon gama, ocl-antitripsina (ATT, ou inibidor de a-1 protease), glicocerebrosidase, Ativador de plasminogênio de tipo tecidual (TPA), Interleucina-2 (IL2), uroquinase, DNase humana, insulina, Proteína de superfície de Hepatite B (HbsAg) , hormônio do crescimento humano, proteína de fusão de região Fc de Receptor de TNFIgG (Enbrel™) , anticorpo monoclonal anti-HER2 (Herceptin™) , anticorpo monoclonal para Proteína F de Virus sincicial respiratório (Synagis™) , anticorpo monoclonal para TNF-α (Remicade™) , anticorpo monoclonal para glicoproteina Ilb/IIIa (Reopro™) , anticorpo monoclonal para CD20 (Rituxan™) , anti-trombina III (AT III), gonadotrofina coriônica humana (hCG), alfagalactosidase (Fabrazyme™), alfa-iduronidase (Aldurazyme™) , hormônio foliculo-estimulante, betaglicosidase, anticorpo monoclonal anti-TNF-alfa (MLB 5075), peptideo-1 semelhante a glucagon (GLP-1), peptideo-2 semelhante a glucagon (GLP-2), beta-glicosidase, alfagalactosidase A e fator de crescimento de fibroblastos. 0 grupo de modificação polimérico é anexado à porção sacaril (ou seja, através de um grupo único formado pela reação de dois grupos reativos) ou através de uma porção de ligante, por exemplo, alquil substituído ou não substituído, heteroalquil substituído ou não substituído etc.
Portanto, em um aspecto, a presente invenção fornece um conjugado entre uma porção PEG, por exemplo, PEG e um peptídeo que tem uma atividade ín vivo similar ou de outro modo análoga ao peptídeo terapêutico reconhecido na técnica. No conjugado da invenção, a porção PEG é covalentemente ligada ao peptídeo por meio de um grupo de
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Confidencial ligação de glicosil intacto. Exemplos de grupos de ligação de glicosil intactos incluem porções de ácido siálico que são derivatizadas com PEG.
O grupo de modificação polimérico pode ser anexado em qualquer posição de uma porção glicosil em um peptideo. Além disso, o grupo de modificação polimérico pode ser ligado a um resíduo de glicosil em qualquer posição na seqüência de aminoácidos de um peptideo de tipo selvagem ou mutante.
Em uma modalidade de exemplo, a invenção fornece um peptideo que é conjugado através de um grupo de ligação de glicosil a um grupo de modificação polimérico. Exemplos de conjugados de peptideo incluem um grupo de ligação de glicosil que tem uma fórmula selecionada de:
][
R’
R'
R'
O.
Nas Fórmulas I, Ia, II ou Ila, R2 é H, CH2OR7, COOR7, 000“ ou OR7, em que R7 representa H, alquil substituído ou não substituído ou heteroalquil substituído ou não substituído. Os símbolos R3, R4, R5, R6 e R6' independentemente compreendem H, alquil substituído ou não substituído, OR8, NHC(O)R9 e uma porção sacaril. O índice d
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4/239 é 0 ou 1. R8 e R9 são independentemente selecionados de H, alquil substituído ou não substituído, heteroalquil substituído ou não substituído, ácido siálico. Pelo menos um de R3, R4, R5, R6 ou R6' inclui o grupo de modificação polimérico, por exemplo, PEG. Em uma modalidade de exemplo, R6 e R6' , juntos com o carbono ao qual eles são anexados são componentes da cadeia lateral de uma porção sialil. Em uma modalidade de exemplo adicional, essa cadeia lateral é funcionalizada com o grupo de modificação polimérico.
Em uma modalidade de exemplo, o grupo de modificação polimérico é ligado ao grupo de ligação de glicosil, geralmente através de um heteroátomo no núcelo do glicosil (por exemplo, N, O), através de um ligante, L, como mostrado abaixo:
(R1).—L-R1 é o grupo de modificação polimérico e L é selecionado de uma ligação e um grupo de ligação. O índice w representa um número inteiro selecionado de 1-6, preferivelmente 1-3 e mais preferivelmente 1-2. Exemplos de grupos de ligação incluem porções de alquil substituído ou não substituído, heteroalquil substituído ou não substituído e ácido siálico. Um exemplo de componente do ligante é uma porção acil. Um outro exemplo de grupo de ligação é um resíduo de aminoácido (por exemplo, cisteína, serina, lisina, e oligopeptídeos curtos, por exemplo, LysLys, Lys-Lys-Lys, Cys-Lys, Ser-Lys, etc.).
Quando L é uma ligação, ela é formada por reação de um grupo funcional reativo em um precursor de R1 e um grupo funcional reativo de reatividade complementar em um
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5/239 precursor do grupo de ligação de glicosil. Quando L é um grupo de ligação de ordem não zero, L pode estar no lugar da porção glicosil antes da reação com o precursor de R1. Alternativamente, os precursores de R1 e L podem ser incorporados em um cassete pré-formado que é subseqüentemente anexado à porção de glicosil. Como aqui apresentado, a seleção e preparação de precursores com grupos funcionais reativos adequados estão dentro da capacidade daqueles habilitados na técnica. Além disso, a ligação dos precursores prossegue por química que é bem compreendida na técnica.
Em uma modalidade de exemplo L é um grupo de ligação que é formado a partir de um aminoácido, ou peptídeo pequeno (por exemplo, 1-4 resíduos de aminoácido) gerando um açúcar modificado em que a porção de modificação polimérica é anexada através de um ligante de alquil substituído. Exemplos de ligantes incluem glicina, lisina, serina e cisteína. Análogos de aminoácido, como aqui definido, são também de utilidade como componentes de ligantes. O aminoácido pode ser modificado com um componente adicional de um ligante, por exemplo, alquil, heteroalquil, covalentemente anexado através de uma ligação de acil, por exemplo, uma amida ou uretano formado através de uma porção amina do resíduo de aminoácido.
Em uma modalidade de exemplo, o grupo de ligação de glicosil tem uma estrutura de acordo com Fórmulas I ou Ia e R5 inclui o grupo de modificação polimérico. Em outra modalidade de exemplo, R5 inclui o grupo de modificação polimérico e um ligante, L, unindo o grupo de modificação polimérico ao núcleo de glicosil. L pode ser uma estrutura
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6/239 linear ou ramificada. De modo similar, o grupo de modificação polimérico pode ser ramificado ou linear.
O grupo de modificação polimérico compreende duas ou mais unidades de repetição que podem ser hidrossolúveis ou essencialmente insolúveis em água. Exemplos de polímeros hidrossolúveis de uso nos compostos da invenção incluem PEG, por exemplo, m-PEG, PPG, por exemplo, m-PPG, ácido polissiálico, poliglutamato, poliaspartato, polilisina, polietilenoneimina, polímeros biodegradáveis (por exemplo, polilactídeo, poliglicerídeo), e PEG funcionalizado, por exemplo, PEG terminal-funcionalizado.
O núcleo de glicosil dos grupos de ligação de glicosil de uso nos conjugados de peptídeo é selecionado de furanoses e piranoses naturais e não naturais. Os sacarídeos não naturais incluem opcionalmente uma porção hidroxil e/ou amina alquilada ou acilada, por exemplo, éteres, ésteres e substituintes de amida no anel. Outros sacarídeos não naturais incluem um H, hidroxil, éter, éster ou substituinte de amida em uma posição no anel em que tal substituinte ao está presente no sacarídeo natural. Alternativamente, o carboidrato é desprovido de um substituinte que pode ser encontrado no carboidrato do qual seu nome é derivado, por exemplo, desoxi açúcares. Ainda outros exemplos de açúcares não naturais incluem carboidratos oxidados (por exemplo, ácido -ônicos e — urônicos) e reduzidos (alcoóis de açúcar). A porção de açúcar pode ser um mono, oligo- ou poli-sacarídeo.
Exemplos de açúcares naturais de uso como componentes de grupos de ligação de glicosil na presente invenção incluem glicose, glicosamina, galactose, galactosamina,
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7/239 fucose, manose, manosamina, xilanose ribose, N-acetil glicose, N-acetil glicosamina, N-acetil galactose, N-acetil galactosamina, e ácido siálico.
Em uma modalidade a presente invenção fornece um conjugado de peptídeo compreende a porção:
que
Figure BRPI0717505B1_D0001
em que D é um membro selecionado de -OH e R1-L-HN-; G é um membro selecionado de H e Rí-L- e -C(O) (Ci-Ce) alquil; R1 é uma porção que compreende um resíduo de poli(etileno glicol) de cadeia linear ou ramificada ; e L é um ligante, por exemplo, uma ligação (de ordem zero), alquil substituído ou não substituído e heteroalquil substituído ou não substituído. Em modalidades de exemplo, quando D é OH, G é R1-L-, e quando G é -C (O) (Ci-C6) alquil, D é R1-LNH- .
Em outro aspecto, a invenção fornece um conjugado de peptídeo que compreende um grupo de ligação de glicosil, em que o grupo de ligação de glicosil é anexado a um resíduo de aminoácido do referido peptídeo, e em que o referido grupo de ligação de glicosil compreende um grupo de ligação de sialil que tem a fórmula que é um membro selecionado de:
Figure BRPI0717505B1_D0002
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Confidencial
8/239 em que (ΟΟΗ,ΟΗΛα’
Figure BRPI0717505B1_D0003
r16_X2
X5—C S
R17— X4 são grupos de modificação
R2 é um membro selecionado de H,
CH2OR7, COOR7, COO- e OR7. R7 é um membro selecionado de H, alquil substituído ou não substituído and heteroalquil substituído ou não substituído. R3 e R4 são membros independentemente selecionados de H, alquil substituído ou não substituído, OR8, e NHC(O)R9. R8 e R9 são independentemente selecionados de H, alquil substituído ou não substituído, heteroalquil substituído ou não substituído e sialil. La é um ligante selecionado de uma ligação, alquil substituído ou não substituído and heteroalquil substituído ou não substituído. X5, R16 e R17 são independentemente selecionados de grupo não reativo e porções poliméricas (por exemplo óxido de poli(alquileno), por exemplo, PEG) . Grupos não reativos incluem grupos que são considerados como sendo essencialmente não reativos, neutros e/ou estáveis em pH fisiológico, por exemplo, H, alquil substituído ou não substituído, heteroalquil substituído ou não substituído e outros. Um exemplo de porção polimérica inclui as estruturas ramificadas
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Confidencial
9/239 apresentadas na Fórmula IIIa e seus exemplares, abaixo. Uma pessoa habilitada na técnica perceberá que a porção PEG nessas fórmulas pode ser substituída com outros polímeros.
Exemplos de polímeros incli de poli(alquileno). X2 e independentemente selecioi poliméricas R16 e R17 a C. selecionado de 1 a 15.
Em outra modalidade de polimérico tem a estrutura fórmula:
(OCH2CH2)nA1 CAW (CA5As)j
A2(CH2CH2O)ni--A7 (CAaA9)k
CA10A11 em que os índices m independentemente seleciona A5, A6, A7, A8, A9, A10 e A11 iem aqueles da família de óxido X4 são fragmentos de ligação lados que unem as porções O índice j é um número inteiro exemplo, o grupo de modificação de acordo com a seguinte (Hla) e n são números inteiros os de 0 a 5.000. A1, A2, A3, A4, são membros independentemente selecionados de H, alquil substituído ou não substituído, heteroalquil substituído ou não substituído, cicloalquil substituído ou não substituído, heterocicloalquil substituído ou não substituído, aril substituído ou não substituído, heteroaril substituído ou não substituído, NA12A13, OA12 e -SiA12A13. A12 e A13 são membros independentemente selecionados de alquil substituído ou não substituído, heteroalquil substituído ou não substituído, cicloalquil substituído ou não substituído,
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Confidencial
10/239 heterocicloalquil substituído ou não substituído, aril substituído ou não substituído, e heteroaril substituído ou não substituído.
Em uma modalidade de exemplo, o grupo de modificação polimérico tem uma estrutura que inclui a porção de acordo com as seguintes fórmulas:
(OCH2CH2)nA1 {OCH2CH2)nA1
Figure BRPI0717505B1_D0004
A2(CH2CH2O)m gh2
Ή
Figure BRPI0717505B1_D0005
Em outra modalidade de exemplo de acordo com a fórmula acima , o grupo de modificação polimérico tem uma estrutura de acordo com a seguinte fórmula:
Em inteiros de
4.000,
3.000,
Figure BRPI0717505B1_D0006
uma modalidade de independentemente exemplo, m selecionados
5.000, preferivelmente de cerca de de são números cerca de 1 mais preferivelmente de cerca de 200 a cerca ainda mais preferivelmente de cerca de 300 a de 2.000 e ainda mais preferivelmente de cerca de cerca de 1.000. Em uma modalidade de exemplo, m números inteiros independentemente selecionados de a cerca de 500. Em uma modalidade de exemplo, m de de
400 a são cerca de e n são
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11/239 números inteiros independentemente selecionados de cerca de 1 a cerca de 70, cerca de 70 a cerca de 150, cerca de 150 a cerca de 250, cerca de 250 a cerca de 375 e cerca de 375 a cerca de 500. Em uma modalidade de exemplo, men são números inteiros independentemente selecionados de cerca de a cerca de 35, cerca de 45 a cerca de 65, cerca de 95 a cerca de 130, cerca de 210 a cerca de 240, cerca de 310 a
cerca de 370 e cerca de 420 a cerca de 480 . Em uma
modalidade de exemplo, m e n são números inteiros
selecionados de cerca de 15 a cerca de 30 . Em uma
modalidade de exemplo, m e n são números inteiros
selecionados de cerca de 50 a cerca de 65. Em uma
modalidade de exemplo, m e n são números inteiros
selecionados de cerca de 100 a cerca de 130 . Em uma
modalidade de exemplo, m e n são números inteiros
selecionados de cerca de 210 a cerca de 240 . Em uma
modalidade de exemplo, m e n são números inteiros
selecionados de cerca de 310 a cerca de 370 . Em uma
modalidade de exemplo, m e n são números inteiros
selecionados de cerca de 430 a cerca de 470 . Em uma
modalidade de exemplo
A1 e A2 são membros selecionados de
-OH e -OCH3.
Exemplos de grupos acordo com essa modalidade
Figure BRPI0717505B1_D0007
de modificação poliméricos de incluem a porção
Figure BRPI0717505B1_D0008
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A invenção fornece um conjugado de peptídeo que compreende um grupo de ligação de glicosil, em que o grupo de ligação de glicosil é anexado a um resíduo de aminoácido do peptídeo, e em que o grupo de ligação de glicosil compreende um grupo de ligação de sialil que tem a fórmula:
Figure BRPI0717505B1_D0009
em que
Figure BRPI0717505B1_D0010
é um grupo de modificação. O índice s é um número inteiro selecionado de 1 a 20. O índice f é um número inteiro selecionado de 1 a 2.500. Q é um membro selecionado de H e Ci-Ce alquil substituído ou não substituído.
Em uma modalidade de exemplo, a invenção fornece um açúcar modificado que tem a seguinte fórmula:
Figure BRPI0717505B1_D0011
nh2 em que R1 é a porção polimérica; L é selecionado de uma ligação e um grupo de ligação; R2 é um membro selecionado de H, CH2OR7, COOR7 e OR7; R7 é um membro selecionado de H,
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13/239 alquil substituído ou não substituído e heteroalquil substituído ou não substituído; R3 e R4 são membros independentemente selecionados de H, alquil substituído ou não substituído, OR8 e NHC(O)R9; e R8 e R9 são independentemente selecionados de H, alquil substituído ou não substituído, heteroalquil substituído ou não substituído, ácido siálico e ácido polissiálico. O índice w representa um número inteiro selecionado de 1-6, preferivelmente 1-3 e mais preferivelmente 1-2. Exemplos de grupos de ligação incluem porções de alquil substituído ou não substituído, heteroalquil substituído ou não substituído e ácido siálico. Um exemplo de componente do ligante é uma porção acil.
A presente invenção fornece métodos de formação de conjugados de peptídeos. Os métodos incluem o contato de um peptídeo com um doador de açúcar modificado que porta um grupo de modificação covalentemente ligado a um açúcar. A porção de açúcar modificado é transferida do donor para um aminoácido ou resíduo de glicosil do peptídeo pela ação de uma enzima. Enzimas representativas incluem, sem limitação, glicosiltransferases, por exemplo, sialiltransferases. O método inclui o contato do peptídeo com: a) um doeador de açúcar modificado; e b) uma enzima capaz de transferir uma porção de açúcar modificado do doador de açúcar modificado para um aminoácido ou resíduo de glicosil do peptídeo, sob condições adequadas para transferir uma porção de açúcar modificado do doador para um aminoácido ou resíduo de glicosil do peptídeo, assim sintetizando o referido conjugado de peptídeo.
Em uma modalidade preferida, antes da etapa a) , o
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14/239 peptídeo faz contato com uma sialidase, assim removendo pelo menos uma porção do ácido siálico no peptídeo.
Em outra modalidade preferida, o peptídeo faz contato com uma sialidase, uma glicosiltransferase e um doador de açúcar modificado. Nessa modalidade preferida, o peptídeo está em contato com a sialidase, glicosiltransferase e doador de açúcar modificado essencialmente de modo simultâneo, não importando a ordem de adição dos vários componentes. A reação é realizada sob condições adequadas para que a sialidase remova um resíduo de ácido siálico do peptídeo; e a glicosiltransferase transfira uma porção de açúcar modificado do doador de açúcar modificado a um aminoácido ou resíduo de glicosil do peptídeo.
Em outra modalidade preferida, a dessialilação e conjugação são realizadas no mesmo frasco, e o peptídeo dessialilado é preferivelmente não purificado antes da etapa de conjugação. Em outra modalidade de exemplo, o método também compreende uma etapa de capping que envolve sialilação do conjugado de peptídeo. Essa etapa é realizada no mesmo frasco de reação que contém a sialidase, sialiltransferase e doador de açúcar modificado sem purificação anterior.
Em outra modalidade preferida, a dessialilação do peptídeo é realizada, e o peptídeo assialo é purificado. O peptídeo assialo purificado é então submetido a condições de reação de conjugação. Em outra modalidade de exemplo, o método também compreende uma etapa de capping que envolve a sialilação do conjugado de peptídeo. Essa etapa é realizada no mesmo frasco de reação que contém a sialidase, sialiltransferase e doador de açúcar modificado sem
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15/239 purificação anterior.
Em outra modalidade de exemplo, a etapa de capping, sialilação do conjugado de peptideo, é realizada no mesmo frasco de reação que contém a sialidase, sialiltransferase e doador de açúcar modificado sem purificação anterior.
Em uma modalidade de exemplo, o contato é por um tempo de menos que 20 horas, preferivelmente menos que 16 horas, mais preferivelmente menos que 12 horas, ainda mais preferivelmente menos que 8 horas, e ainda mais preferivelmente menos que 4 horas.
Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece uma mistura de reação de conjugado de peptideo. A mistura de reação compreende: a) uma sialidase; b) uma enzima que é um membro selecionado de glicosiltransferase, exoglicosidase e endoglicosidase; c) um açúcar modificado; e d) um peptideo.
Em outra modalidade de exemplo, a proporção da sialidase ao peptideo é selecionada de 0,1 U/L:2 mg/mL a 10 U/L:l mg/mL, preferivelmente 0,5 U/L:2 mg/mL, mais preferivelmente 1,0 U/L:2 mg/mL, ainda mais preferivelmente 10 U/L:2 mg/mL, ainda mais preferivelmente 0,1 U/L:l mg/mL, mais preferivelmente 0,5 U/L:l mg/mL, ainda mais preferivelmente 1,0 U/L:l mg/mL, e ainda mais preferivelmente 10 U/L:l mg/mL.
Em uma modalidade de exemplo, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% ou 80% do referido conjugado de peptideo inclui no máximo duas porções PEG. As porções PEG podem ser adicionadas em um processo de one-pot, ou elas podem ser adicionadas depois de o assialo ser purificado.
Em outra modalidade de exemplo, pelo menos 10%, 20%,
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30%, 40%, 50%, 60%, 70% ou 80% do conjugado de peptídeo inclui no máximo uma porção PEG. A porção PEG pode ser adicionada em um processo de one-pot, ou ela podem ser adicionada depois de o peptídeo assialo ser purificado.
Em uma modalidade de exemplo adicional, o método também compreende capping, ou adição de ácido siálico ao conjugado de peptídeo. Em outra modalidade de exemplo, sialidase é adicionada, seguida por um retardo de 30 minutos, 1 hora, 1,5 hora, ou 2 horas, seguido pela adição da glicosiltransferase, exoglicosidase, ou endoglicosidase.
Em outra modalidade de exemplo, sialidase é adicionada, seguida por um retardo de 30 minutos, 1 hora, 1,5 hora, ou 2 horas, seguido pela adição da glicosiltransfase, exoglicosidase, ou endoglicosidase. Outros objetos e vantagens da invenção serão aparentes para aqueles habilitados na técnica a partir da descrição detalhada que se segue.
Em outra modalidade de exemplo, o método inclui: (a) o contato de um peptídeo que compreende um grupo glicosil selecionado de:
£----Gal N Ac S Gal’ (Sia)a
S e em que a é um número inteiro de 0 a 10, com um açúcar modificado que tem a fórmula:
Figure BRPI0717505B1_D0012
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17/239 e uma transferase adequadas que transfere o grupo de ligação de glicosil para um membro selecionado de GalNAc, Gal e Sia do referido grupo glicosil, sob condições adequadas para a referida transferência. Um exemplo de açúcar modificado é CMP-ácido siálico modificado, através de uma porção de ligante, com um polímero, por exemplo, uma porção de poli(etileno glicol) de cadeia linear ou ramificada. Os radicais na fórmula acima são substancialmente a mesma identidade que aqueles encontrados na fórmula idêntica acima.
O peptídeo pode ser adquirido de essencialmente qualquer fonte, no entanto, em uma modalidade, antes de ser modificado como acima discutido, o peptídeo é expresso em um hospedeiro adequado. Células de mamífero (por exemplo, BHK, CHO), de bactérias (por exemplo, E. coli) e de inseto (por exemplo, Sf 9) são exemplos de sistemas de expressão que fornecem um peptídeo de uso nas composições e métodos aqui apresentados.
Outros objetos e vantagens da invenção serão aparentes para aqueles habilitados na técnica a partir da descrição detalhada que se segue.
Descrição dos desenhos
FIG. 1 ilustra a preparação de CMP-ácido siálicoGlicerol PEG 40 kD.
FIG. 2 ilustra condições de reação para a preparação de CMP-ácido siálico-Glicerol PEG 40 kD.
FIG. 3 ilustra um processo de purificação para CMPácido siálico-Glicerol PEG 40 kD.
FIG. 4 ilustra um processo de purificação que envolve Q-Sepharose para CMP-ácido siálico-Glicerol PEG 40 kD.
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FIG. 5 é um espectro de 1H RMN de CMP-ácido siálicoGlicerol PEG 40 kD.
FIG. 6 é uma tabela que fornece Exemplos de sialiltransferases de uso na formação de glicoconjugados da invenção, por exemplo, para peptídeos glicoPEGuilados com um ácido siálico modificado.
FIG. 7 é uma tabela do peptídeo ao qual um ou mais grupos de ligação de glicosil podem ser anexados para fornecer o conjugados de peptídeo da invenção.
Descrição detalhada da invenção e das modalidades preferidas
Abreviações
PEG, poli(etilenoglicol); PPG, poli(propilenoglicol); Ara, arabinosil; Fm, fructosil; Fuc, fucosil; Gal, galactosil; GalNAc, N-acetilgalactosaminil; Glc, glucosil; GlcNAc, N-acetilglicosaminil; Man, manosil; ManAc, manosaminil acetato; Xil, xilosil; NeuAc, sialil ou Nacetilneuraminil; Sia, sialil ou N-acetilneuraminil; e derivados e análogos desses.
Definições
A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui usados geralmente têm o mesmo significado como comumente compreendido por pessoa de habilidade comum na técnica à qual essa invenção pertence. Geralmente, a nomenclatura aqui usada e os procedimentos laboratoriais em cultura de células, genética molecular, química orgânica e química de ácido nucléico e hibridização são aqueles bem conhecidos e comumente empregados na técnica. Técnicas padrão são usadas para síntese de ácido nucléico e de peptídeo. As técnicas e procedimentos são
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19/239 geralmente realizados de acordo com métodos convencionais na técnica e várias referências gerais (veja, geralmente, Sambrook e cols. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2a ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., que é aqui incorporado por referência), que são fornecidas por todo esse documento. A nomenclatura aqui usada e os procedimentos laboratoriais em química analítica, e síntese orgânica descritos abaixo são aqueles bem conhecidos e comumente empregados na técnica. Técnicas padrão, ou modificações dessas, são usadas para síntese química e análise química.
Todos os oligossacarídeos aqui descritos são descritos com o nome ou abreviação para o sacarídeo não redutor (ou seja, Gal), seguido pela configuração da ligação glicosídica (a ou β), a ligação do anel (1 ou 2), a posição do anel do sacarídeo redutor envolvido na ligação (2, 3, 4, 6 ou 8) , e então o nome ou abreviação do sacarídeo redutor (ou seja, GlcNAc). Cada sacarídeo é preferivelmente uma piranose. Para uma revisão de nomenclatura padrão de glicobiologia, veja, Essentials of Glycobiology Varki e cols, eds. CSHL Press (1999).
Oligossacarídeos são considerados como tendo uma extremidade redutora e uma extremidade não redutora, seja ou não o sacarídeo na extremidade redutora de fato um açúcar redutor. De acordo com a nomenclatura aceita, oligossacarídeos são aqui mostrados com a extremidade não redutora na esquerda e a extremidade redutora na direita.
O termo ácido siálico ou sialil refere-se a qualquer membro de uma família de açúcares carboxilatos de nove carbonos. O membro mais comum da família de ácido
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20/239 siálico é ácido N-acetil neuraminico (ácido 2-ceto-5acetamido-3,5-didesoxi-D-glicero-D-galactononulopiranos-lônico (freqüentemente abreviado como Neu5Ac, NeuAc, ou NANA) . Um segundo membro da família é ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc ou NeuGc), em que o grupo N-acetil de NeuAc é hidroxilado. Um terceiro membro da família de ácido siálico é ácido 2-ceto-3-desoxi-nonulosônico (KDN) (Nadano e cols. (1986) J. Biol. Chem. 261: 11.550-11.557; Kanamori e cols., J. Biol. Chem. 265:21.811-21.819 (1990)). Também são incluídos ácidos siálicos 9-substituídos como 9-O-Ci-Ce acil Neu5Ac como 9-O-lactil-Neu5Ac ou 9-O-acetil-Neu5Ac, 9desoxi-9-flúor-Neu5Ac e 9-azido-9-desoxi-Neu5Ac. Para revisão da família de ácido siálico, veja, por exemplo, Varki, Glicobiology 2: 25-40 (1992); Sialic Acids:
Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, Ed. (Springer- Verlag, New York (1992)) . A síntese e uso de compostos de ácido siálico em um procedimento de sialilação é revelada no pedido internacional WO 92/16640, publicado em 1 de outubro de 1992.
Peptídeo refere-se a um polímero em que os monômeros são aminoácidos e são unidos através de ligações de amida, alternativamente referido como um polipeptídeo. Adicionalmente, aminoácidos não naturais, por exemplo, βalanina, fenilglicina e homoarginina são também incluídos. Aminoácidos que não são codificados por gene também podem ser usados na presente invenção. Além disso, aminoácidos que foram modificados para incluir grupos reativos, sítios de glicosilação, polímeros, porções terapêuticas, biomoléculas e outros também podem ser usados na invenção. Todos os aminoácidos usados na presente invenção podem ser
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21/239 o D- ou L-isômero. O L-isômero é geralmente preferido. Além disso, outros peptidomiméticos são também úteis nos peptídeos glicosilados e não glicosilados. Também são incluídos peptídeos que são incompletamente glicosilados por um sistema que expressa o peptídeo. Para uma revisão geral, veja, Spatola, A. F., em CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS, PEPTIDES AND PROTEINS, B. Weinstein, eds. , Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983) . Uma listagem de alguns dos peptídeos da invenção é fornecida na FIG. 7.
O termo conjugado de peptídeo, refere-se a espécies da invenção em que um peptídeo é conjugadod com um açúcar modificado como aqui apresentado.
O termo aminoácido refere-se a aminoácidos de ocorrência natural e sintéticos, bem como a análogos de aminoácido e miméticos de aminoácido que funcionam em uma maneira similar aos aminoácidos de ocorrência natural. Aminoácidos de ocorrência natural são aqueles codificados pelo código genético, bem como aqueles aminoácidos que são posteriormente modificados, por exemplo, hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato, e O-fosfoserina. Análogos de aminoácido refere-se a compostos que têm a mesma estrutura química básica que um aminoácido de ocorrência natural, ou seja, um oc carbono que é ligado a um hidrogênio, um grupo carboxil, um grupo amino, e um grupo R, por exemplo, homosserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfônio. Tais análogos têm grupos R modificados (por exemplo, norleucina) ou esqueletos de peptídeo modificados, mas retêm a mesma estrutura química básica que um aminoácido de ocorrência natural. Miméticos de aminoácidos referem-se a compostos
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22/239 químicos que têm uma estrutura que é diferente da estrutura química geral de um aminoácido, mas que funcionam em uma maneira similar a um aminoácido de ocorrência natural.
Como aqui usado, o termo açúcar modificado, ou resíduo de açúcar modificado, refere-se a um carboidrato de ocorrência natural ou não natural que é enzimaticamente adicionado em um aminoácido ou um resíduo de glicosil de um peptídeo em um processo da invenção. O açúcar modificado é selecionado de substratos de enzima que incluem, sem limitação, nucleotídeos de açúcar (mono-, di-, e trifosfatos), açúcares ativados (por exemplo, haletos de glicosil, mesilatos de glicosil) e açúcares que não são ativados nem nucleotídeos. O açúcar modificado é covalentemente funcionalizado com um grupo de modificação. Grupos de modificação úteis incluem, sem limitação, porções de PEG, porções terapêuticas, porções diagnosticas, biomoléculas e outros. O grupo de modificação é preferivelmente um carboidrato de ocorrência não natural, ou não modificado. O lócus de funcionalização com o grupo de modificação é selecionado de modo que ele não impeça o açúcar modificado de ser adicionado enzimaticamente a um peptídeo.
Como aqui usado, o termo porção polimérica refere-se a um polímero hidrossolúvel ou insolúvel em água. O termo hidrossolúvel refere-se a porções que têm algum grau detectável de solubilidade em água. Métodos para detectar e/ou quantificar a solubilidade em água são bem conhecidos na técnica. Exemplos de polímeros hidrossolúveis incluem peptídeos, sacarídeos, poli(éteres), poli(aminas), ácidos poli(carboxílicos) e outros. Peptídeos podem ter seqüências
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23/239 mistas compostas de um aminoácido único, por exemplo, poli(lisina). Um exemplos de polisacarídeo é ácido poli(siálico). Um Exemplo de poli(éter) é poli(etileno glicol). Poli(etileno imina) é um exemplo de poliamina, e ácido poli(acrílico) é um ácido poli(carboxílico) representativo. Polímeros hidrossolúveis preferidos são essencialmente não fluorescentes, ou emitem uma quantidade mínima de fluorescência que os tornam inadequados para uso como um marcador fluorescente em um ensaio. Polímeros que não são açúcares de ocorrência natural podem ser usados. Em adição, o uso de um açúcar de ocorrência natural que é modificado por ligação covalente de uma outra entidade (por exemplo, poli(etileno glicol), poli(propileno glicol), poli(aspartato), biomolécula, porção terapêutica, porção diagnostica etc.) é também contemplado. O termo polímero hidrossolúvel também engloba espécies como sacarídeos (por exemplo, dextrano, amilose, ácido hialourônico, ácido poli(siálico), heparanos, heparinas etc.); poli (aminoácidos), por exemplo, ácido poli(glutâmico); ácidos nucleicos; polímeros sintéticos (por exemplo, ácido poli(acrílico), poli(éteres), por exemplo, poli(etileno glicol); peptídeos, proteínas e outros. Polímeros insolúveis em água representativos incluem, sem limitação, polifosfazinas, alcoóis poli(vinílicos), poliamidas, policarbonatos, polialquilenos, poliacrilamidas, polialquileno glicóis, óxidos de polialquileno, polialquileno tereftalatos, polivinil éteres, polivinil ésteres, polivinil haletos, polivinilpirrolidona, poliglicolídeos, polissiloxanos, poliuretanos, poli(metil metacrilato), poli(etil metacrilato), poli(butil
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24/239 metacrilato), poli(isobutil metacrilato), poli(hexil metacrilato), poli(isodecil metacrilato), poli(lauril metacrilato), poli(fenil metacrilato), poli(metil acrilato), poli(isopropil acrilato), poli(isobutil acrilato), poli(octadecil acrilato) polietileno, polipropileno, poli(etileno glicol), óxido de poli(etileno), poli (etileno tereftalato), acetato de poli(vinila) , cloreto de polivinila, poliestireno, polivinil pirrolidona, plurônicos e polivinilfenol e copolímeros desses. Em adição, o uso de um açúcar de ocorrência natural que é modificado por ligação covalente de uma outra entidade (por exemplo, poli(etileno glicol), poli(propileno glicol), poli(aspartato), biomolécula, porção terapêutica, porção diagnostica etc.) é também contemplado. Exemplos adicionais de polímeros hidrossolúveis e insolúveis em água são descritos no pedido.
O esqueleto do polímero do polímero hidrossolúvel pode ser poli(etileno glicol) (ou seja PEG). No entanto, deve-se entender que outros polímeros relacionados são também adequados para uso na prática dessa invenção e que o uso do termo PEG ou poli (etileno glicol) é deve ser inclusivo e não exclusivo nesse caso. O termo PEG inclui poli(etileno glicol) em qualquer uma de suas formas, incluindo alcoxi PEG, PEG difuncional, PEG de multibraços, PEG em grafo, PEG ramificado, PEG pendente (ou seja PEG ou polímeros relacionados que têm um ou mais grupos funcionais pendentes ao esqueleto do polímero), ou PEG com ligações degradáveis nele.
O polímero pode ser linear ou ramificado. Polímeros
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25/239 ramificados são geralmente conhecidos na técnica. Tipicamente, um polímero ramificado tem uma porção de núcleo de ramo central e uma pluralidade de cadeias de polímero linear ou ramificado ligadas ao núcleo do ramo central. PEG é comumente usado em formas ramificadas que podem ser preparadas por adição de óxido de etileno a vários polióis, como glicerol, pentaeritritol e sorbitol. A porção de ramo central também pode ser derivada de vários aminoácidos, como lisina. O poli(etileno glicol) ramificado pode ser representado em forma geral como R(-PEG-OH)m em que R representa a porção de núcleo, como glicerol ou pentaeritritol, e m representa o número de braços. Moléculas de PEG de múltiplos braços, como aquelas descritas na Pat. U.S. No. 5.932.462, que é aqui incorporada em sua totalidade por referência, também podem ser usadas como o esqueleto do polímero. Em uma modalidade de exemplo, o polímero ramificado é em si anexado a uma porção de ramificação (por exemplo, cisteína, serina, lisina, e oligômeros de lisina).
Vários outros polímeros são também adequados para a invenção. Esqueletos de polímero que são não peptídicos e hidrossolúveis, em cerca de 2 a cerca de 300 lócus para anexação, são particularmente úteis na invenção. Exemplos de polímeros adequados incluem, sem limitação, outros poli(alquileno glicóis), como polipropileno glicol) (PPG), copolímeros de etileno glicol e propileno glicol e outros, poli(oxietilated poliol), álcool poli(olefínico), poli(vinilpirrolidona), poli(hidroxipropilmetacrilamida), ácido poli(α-hidroxi), álcool poli(vinilico), polifosfazeno, polioxazolina, poli(N-acriloilmorfolino),
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26/239 como descrito na Pat. U.S. No. 5.629.384, que é aqui incorporada em sua totalidade por referência, e copolímeros, terpolímeros, e misturas desses. Embora o peso molecular de cada cadeia do esqueleto do polímero possa variar, ele está tipicamente na faixa de cerca de 100 Da a cerca de 100.000 Da, freqüentemente de cerca de 6.000 Da a cerca de 80.000 Da.
A área sob a curva ou AUC, como aqui usado no contexto de administração de um medicamento de peptídeo a um paciente, é definida como a área total sob a curva que descreve a concentração de medicamento em circulação sistêmica no paciente como uma função do tempo de zero ao infinito.
O termo meia-vida ou Tl/2, como aqui usado no contexto de administração de um medicamento de peptídeo a um paciente, é definido como o tempo necessário para que a concentração plasmática de um medicamento em um paciente seja reduzida à metade. Há mais de uma meia-vida associada com o medicamento de peptídeo dependendo dos mecanismos de clearance múltiplos, redistribuição, e outros mecanismos bem conhecidos na técnica. Comumente, alfa e beta meiasvidas são definidas de modo que a fase alfa é associada com redistribuição, e a fase beta é associada com clearance. No entanto, com medicamentos de proteína que são, na maior parte do tempo, confinados à corrente sangüínea, pode haver pelo menos duas meias-vidas de clearance. Para alguns peptídeos glicosilados, clearance rápido de fase beta pode ser mediado por meio de receptores em macrófagos, ou células endoteliais que reconhecem galactose terminal, Nacetilgalactosamina, N-acetilglicosamina, manose, ou
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27/239 fucose. Clearance mais lento de fase beta pode ocorrer por meio de filtração glomerular renal para moléculas com um raio efetivo < 2 nm (aproximadamente 68 kD) e/ou retenção especifica ou não especifica e metabolismo em tecidos. GlicoPEGuilação pode cobrir açúcares terminais (por exemplo, galactose ou N-acetilgalactosamina) e assim bloquear o clearance rápido de fase alfa por meio de receptores que reconhecem esses açúcares. Ele também conferir um maior raio efetivo e assim diminuir o volume de distribuição e captação de tecido, assim prolongando a fase beta. Portanto, o impacto preciso da glicoPEGuilação sobre as meias-vidas de fase alfa e fase beta pode variar dependendo do tamanho, estado de glicosilação, e de outros parâmetros, como é bem conhecido na técnica. Uma explicação adicional de meia-vida é encontrada em Pharmaceutical Biotechnology (1997, DEA Crommelin and RD Sindelar, eds. , Harwood Publishers, Amsterdam, pp 101 — 120).
O termo glicoconjugação, como aqui usado, refere-se à conjugação enzimaticamente mediada de uma espécie de açúcar modificado a um aminoácido ou resíduo de glicosil de um polipeptídeo, por exemplo, um peptideo G-CSF da presente invenção. Um subgênero de glicoconjugação é glicoPEGuilação, em que o grupo de modificação do açúcar modificado é poli(etileno glicol), e derivado de alquil (por exemplo, m-PEG) ou derivado reativo (por exemplo, H2NPEG, HOOC-PEG) desses.
Os termos grande escala e escala industrial são usados de modo intercambiável e referem-se a um ciclo de reação que produz pelo menos cerca de 250 mg, preferivelmente pelo menos cerca de 500 mg, e mais
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28/239 preferivelmente pelo menos cerca de 1 grama de glicoconjugado no fim de um ciclo de reação único.
O termo, grupo de ligação de glicosil, como aqui usado refere-se a um resíduo de glicosil ao qual um grupo de modificação (por exemplo, porção PEG, porção terapêutica, biomolécula) é covalentemente anexado; o grupo de ligação de glicosil une o grupo de modificação ao restante do conjugado. Nos métodos da invenção, o grupo de ligação de glicosil torna-se covalentemente ligado a um peptídeo glicosilado ou não glicosilado, assim ligando o agente a um aminoácido e/ou resíduo de glicosil no peptídeo. Um grupo de ligação de glicosil é geralmente derivado de um açúcar modificado pela anexação enzimática do açúcar modificado a um aminoácido e/ou resíduo de glicosil do peptídeo. O grupo de ligação de glicosil pode ser uma estrutura derivada de sacarídeo que é degradada durante a formação do cassete grupo de modificação-açúcar modificado (por exemplo, oxidação^-f ormação de base de Schiff^-redução) , ou o grupo de ligação de glicosil pode estar intacto. Um grupo de ligação de glicosil intacto refere-se a um grupo de ligação que é derivado de uma porção de glicosil em que o monômero de sacarídeo que liga o grupo de modificação e o restante do conjugado não é degradado, por exemplo, oxidado, por exemplo, por sódio metaperiodato. Grupos de ligação de glicosil intactos da invenção podem ser derivados de um oligossacarídeo de ocorrência natural por adição de unidades de glicosil ou remoção de uma ou mais unidades de glicosil de uma estrutura de sacarídeo parente.
O termo, grupo de modificação não glicosídico, como
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29/239 aqui usado, refere-se a grupos de modificação que não incluem um açúcar de ocorrência natural ligado diretamente ao grupo de ligação de glicosil.
O termo porção de direcionamento como aqui usado, refere-se a espécies que se localizarão seletivamente em um tecido ou região particular do corpo. A localização é mediada por reconhecimento específico de determinantes moleculares, tamanho molecular do agente de direcionamento ou conjugado, interações iônicas, interações hidrofóbicas e outros. Outros mecanismos de direcionamento de um agente a um tecido ou região em particular são conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Exemplos de porções de direcionamento incluem anticorpos, fragmentos de anticorpo, transferrina, HS-glicoproteína, fatores de coagulação, proteínas séricas, β-glicoproteína, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO e outros.
Como aqui usado, porção terapêutica significa qualquer agente útil para terapia incluindo, sem limitação, antibióticos, agentes antiinflamatórios, medicamentos antitumor, citotoxinas, e agentes radioativos. Porção terapêutica inclui pró-fármacos de agentes bioativos, construções em que mais de uma porção terapêutica é ligada a um veículo, por exemplo, agentes multivalentes. Porção terapêutica também inclui proteínas e construções que incluem proteínas. Exemplos de proteínas incluem, sem limitação, Fator Estimulante de Colônia de Granulócitos (GCSF), Fator Estimulante de Colônia de Granulócitos Macrófagos (GMCSF), Interferon (por exemplo, Interferon-a, -β, -γ), Interleucina (por exemplo, Interleucina II), proteínas séricas (por exemplo, Fatores VII, Vila, VIII,
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IX, e X) , Gonadotrofina coriônica humana (HCG), Hormônio foilculo-estimulante (FSH) e hormônio Luteinizante ing (LH) e proteínas de fusão de anticorpo (por exemplo Receptor de Fator de Necrose Tumoral ((TNFR)/ proteína de fusão de domínio Fc)).
Como aqui usado, veículo farmaceuticamente aceitável inclui qualquer material, que quando combinado com o conjugado retém a atividade do conjugados e é não reativo com o sistema imune do indivíduo. Exemplos incluem, sem limitação, qualquer um dos veículos farmacêuticos padrão 1 como solução salina tamponada por fosfato, água, emulsões como emulsão óleo em água, e vários tipos de agentes umectantes. Outros veículos também podem incluir soluções estéreis, comprimidos que incluem comprimidos revestidos e cápsulas. Tipicamente tais veículos contêm excipientes como amido, leite, açúcar, certos tipos de argila, gelatina, ácido esteárico ou sais desse, estearato de magnésio ou cálcio, talco, gorduras ou óleos vegetais, gomas, glicóis, ou outros excipientes conhecidos. Tais veículos também podem incluir aditivos de sabor e cor ou outros ingredientes. Composições que compreendem tais veículos são formuladas por métodos convencionais bem conhecidos.
Como aqui usado, administração, significa administração oral, administração como um supositório, contato tópico, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intralesional, intranasal ou administração subcutânea, ou o implante de um dispositivo de liberação lenta, por exemplo, uma bomba mini-osmótica, ao indivíduo. A administração é por qualquer via incluindo parenteral, e transmucosa (por exemplo, oral, nasal, vaginal, retal, ou
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31/239 transdérmica). A administração parenteral inclui, por exemplo, intravenosa, intramuscular, intra-arteriolar, intradérmica, subcutânea, intraperitoneal, intraventricular, e intracraniana. Além disso, quando a injeção é para tratar um tumor, por exemplo, induzir apoptose, a administração pode ser diretamente ao tumor e/ou em tecidos que circundam o tumor. Outros modos de liberação incluem, sem limitação, o uso de formulações lipossomais, infusão intravenosa, emplastros transdérmicos etc.
O termo melhoria ou melhorar refere-se a qualquer indício de sucesso no tratamento de uma patologia ou condição, incluindo qualquer parâmetro objetivo ou subjetivo como redução, remissão ou diminuição dos sintomas ou uma melhoria no bem estar físico ou mental do paciente. A melhoria de sintomas pode ser baseada em parâmetros objetivos ou subjetivos; incluindo os resultados de um exame físico e/ou uma avaliação psiquiátrica.
O termo terapia refere-se a tratar ou tratamento de uma doença ou condição que inclui prevenir a ocorrência da doença ou condição em um animal que pode estar predisposto à doença mas que ainda não experimenta ou exibe os sintomas da doença (tratamento profiláticos) , inibição da doença (retardo ou interrupção de seu desenvolvimento) ,
alívio dos sintomas ou efeitos colaterais da doença
(incluindo tratamento paliativo), e alívio da doença
(causando re gressão da doença).
0 termo quantidade eficaz ou uma quantidade eficaz
para ou uma quantidade terapeuticamente eficaz ou qualquer termo gramaticalmente equivalente significa a
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32/239 quantidade que, quando administrada a um animal para o tratamento de uma doença, é suficiente para efetuar o tratamento para aquela doença.
O termo isolado refere-se a um material que é substancialmente ou essencialmente livre de componentes, que são usados para produzir o material. Para conjugados de peptideo da invenção, o termo isolado refere-se a material que é substancialmente ou essencialmente livre de componentes que normalmente acompanham o material na mistura usada para preparar o conjugado de peptideo. Isolado e puro são usados de modo intercambiável. Tipicamente, conjugados de peptideo isolados da invenção têm um nível de pureza preferivelmente expresso como uma faixa. A extremidade inferior da faixa de pureza para os conjugados de peptideo é cerca de 60%, cerca de 70% ou cerca de 80% e a extremidade superior da faixa de pureza é cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90% ou mais que cerca de 90%.
Quando os conjugados de peptideo são mais que cerca de 90% puros, suas purezas são também preferivelmente expressas como uma faixa. A extremidade inferior da faixa de pureza é cerca de 90%, cerca de 92%, cerca de 94%, cerca de 96% ou cerca de 98%. A extremidade superior da faixa de pureza é cerca de 92%, cerca de 94%, cerca de 96%, cerca de 98% ou cerca de 100% de pureza.
A pureza é determinada por qualquer método reconhecidos na técnica de análise (por exemplo, intensidade de banda em um gel corado por prata, eletroforese em gel de poliacrilamida, HPLC, ou um meio similar).
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Essencialmente cada membro da população, como aqui usado, descreve uma característica da população de conjugados de peptídeo da invenção em que uma percentagem selecionada dos açúcares modificados adicionados a um peptídeo são adicionados a sítios aceitadores múltiplos, idênticos no peptídeo. Essencialmente cada membro da população refere-se à homogeneidade dos sítios no peptídeo conjugado a um açúcar modificado e refere-se a conjugados da invenção, que são pelo menos cerca de 80%, preferivelmente pelo menos cerca de 90% e mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% homogêneos.
Homogeneidade, refere-se à consistência estrutural por toda a população de porções aceitadores às quais os açúcares modificados são conjugados. Assim, em um conjugado de peptídeo da invenção em que cada porção de açúcar modificado é conjugada a um sítio aceitador que tem a mesma estrutura que o sítio aceitador ao qual cada açúcar modificado é conjugado, o conjugado de peptídeo é dito como sendo cerca de 100% homogêneo. A homogeneidade é tipicamente expressa como uma faixa. A extremidade inferior da faixa de homogeneidade para o conjugados de peptídeo é cerca de 60%, cerca de 70% ou cerca de 80% e a extremidade superior da faixa de pureza é cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90% ou mais que cerca de 90%.
Quando os conjugados de peptídeo são mais ou igual a a cerca de 90% homogêneos, sua homogeneidade é também preferivelmente expressa como um faixa. A extremidade inferior da faixa de homogeneidade é cerca de 90%, cerca de 92%, cerca de 94%, cerca de 96% ou cerca de 98%. A extremidade superior da faixa de pureza é cerca de 92%,
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34/239 cerca de 94%, cerca de 96%, cerca de 98% ou cerca de 100% de homogeneidade. A pureza dos conjugados de peptídeo é tipicamente determinada por um ou mais métodos conhecidos por aqueles de habilidade na técnica, por exemplo, cromatografia líquidas-espectrometria de massa (LC-MS), espectrometria de vôo de massa de desabsorção de laser
assistido por matriz (MALDITOF) , eletroforese capilar, e
outros.
Glicoforma substancialmente uniforme ou um padrão
de glicosilação substancialmente uniforme, quando em
referência a uma espécie de glicopeptídeo, refere-se à percentagem de porções aceitadoras que são glicosiladas pela glicosiltransferase de interesse (por exemplo, fucosiltransferase) . Por exemplo, no caso de uma al,2 fucosiltransferase, existe um padrão de fucosilação substancialmente uniforme se substancialmente todo (como abaixo definido) o Gaipi,4-GlcNAc-R e análogos sialilados desse são fucosilados em um conjugado de peptídeo da invenção. Nas estruturas fucosiladas aqui apresentadas, a ligação Fuc-GlcNAc é geralmente al,6 ou al,3, com al,6 geralmente preferida. Será entendido por pessoa habilitada na técnica, que o material de iniciação contém porções aceitadoras glicosiladas (por exemplo, porções Gaipi,4GlcNAc-R fucosiladas). Portanto, o percentual de glicosilação calculado incluirá porções aceitadoras que são glicosiladas pelos métodos da invenção, bem como porções aceitadoras já glicosiladas no material de iniciação.
O termo substancialmente nas definições acima de substancialmente uniforme geralmente significa que pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos
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35/239 cerca de 80%, ou mais preferivelmente pelo menos cerca de 90%, e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% das porções aceitadoras para uma glicosiltransferase particular são glicosiladas.
Quando grupos substituintes são especificados por suas fórmulas químicas convencionais, escritos da esquerda para a direita, eles englobam igualmente os substituintes quimicamente idênticos, que podem resultar da escrita da estrutura da direita para a esquerda, por exemplo, -CH2Otambém deve referir-se a —OCH2-.
O termo alquil, em si ou como parte de outro substituinte significa, a menos que determinado de outra forma, uma cadeia linear ou ramificada, ou radical de hidrocarboneto cíclico, ou combinação desses, que pode ser totalmente saturado, mono- ou poliinsaturado e pode incluir radicais di- e multivalentes, que têm o número de átomos de carbono designado (ou seja C1-C10 significa um a dez carbonos). Exemplos de radicais de hidrocarboneto saturado incluem, sem limitação, grupos como metil, etil, n-propil, isopropil, n-butil, t-butil, isobutil, sec-butil, ciclohexil, (ciclohexil)metil, ciclopropilmetil, homólogos e isômeros de, por exemplo, n-pentil, n-hexil, n-heptil, noctil, e outros. Um grupo alquil insaturado é um que tem uma ou mais ligações duplas ou ligações triplas. Exemplos de grupos alquil insaturados incluem, sem limitação, vinil,
2- propenil, crotil, 2-isopentenil, 2-(butadienil), 2,4pentadienil, 3-(1,4-pentadienil), etinil, 1- e 3-propinil,
3- butinil, e os homólogos e isômeros superiores. O termo alquil, a menos que notado de outra forma, também deve incluir aqueles derivados de alquil definidos em maiores
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36/239 detalhes abaixo, como heteroalquil. Grupos alquil que são limitados a grupos de hidrocarboneto são denominados homoalquil.
O termo alquileno em si ou como parte de outro substituinte significa um radical divalente derivado de um alcano, como exemplificado, nas não limitado, por — CH2CH2CH2CH2-, e também inclui aqueles grupos descritos abaixo como heteroalquileno. Tipicamente, um grupo alquil (ou alquileno) terá de 1 a 24 átomos de carbono, com aqueles grupos que têm 10 ou menos átomos de carbono sendo preferidos na presente invenção. Um alquil inferior ou alquileno inferior é um grupo alquil ou alquileno de cadeia mais curta, geralmente tendo oito ou menos átomos de carbono.
Os termos alcoxi, alquilamino e alquiltio (ou tioalcoxi) são usados em seu sentido convencional, e referem-se àqueles grupos alquil anexados ao restante da molécula por meio de um átomo de oxigênio, um grupo amino, ou um átomo de enxofre, respectivamente.
O termo heteroalquil, em si ou em combinação com outro termo, significa, a menos que determinado de outra forma, uma cadeia linear ou ramificada estável, ou radical de hidrocarboneto cíclico, ou combinações desses, que consiste no número determinado de átomos de carbono e pelo menos um heteroátomo selecionado do grupo que consiste em O, N, Si e S, e em que os átomos de nitrogênio e enxofre podem ser opcionalmente oxidados e o heteroátomo de nitrogênio pode ser opcionalmente quaternizado. Os heteroátomos O, N e S e Si podem ser colocados em qualquer posição interior do grupo heteroalquil ou na posição em que
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37/239 o grupo alquil é anexado ao restante da molécula. Exemplos incluem, sem limitação, -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NHCH3, -CH2CH2-N (CH3) -ch3, -ch2-s-ch2-ch3, -CH2-CH2,-S (O)-ch3, -ch2-ch2S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3, e -CH=CHN(CH3)-CH3. Até dois heteroátomos podem ser consecutivos, como, por exemplo, -CH2-NH-OCH3 e —CH2-O-Si (CH3) 3. De modo similar, o termo heteroalquileno em si ou como parte de outro substituinte significa um radical divalente derivado de heteroalquil, como exemplificado, mas não limitado por, -CH2-CH2-S-CH2-CH2- e -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-. Para grupos heteroalquileno, os heteroátomos também podem ocupar cada um ou ambos terminais da cdeia (por exemplo, alquilenooxi, alquilenodioxi, alquilenoamino, alquilenodiamino, e outros). Ainda adicionalmente, para grupos de ligação de alquileno e heteroalquileno, nenhuma orientação do grupo de ligação está indicada pela direção em que a fórmula do grupo de ligação é escrita. Por exemplo, a fórmula C(O)2R'- representa tanto -C(O)2R'- quanto -R'C(O)2-.
Os termos cicloalquil e heterocicloalquil, por si ou em combinação com outros termos, representam, a menos que determinado de outra forma, versões cíclicas de alquil e heteroalquil, respectivamente. Adicionalmente, para heterocicloalquil, um heteroátomo pode ocupar a posição em que o heterociclo é anexado ao restante da molécula. Exemplos de cicloalquil incluem, sem limitação, ciclopentil, ciclohexil, 1-ciclohexenil, 3- ciclohexenil, cicloheptil, e outros. Exemplos de heterocicloalquil incluem, sem limitação, 1-(1,2,5,6-tetrahidropiridil) , 1piperidinil, 2-piperidinil, 3-piperidinil, 4-morfolinil, 3morfolinil, tetrahidrofuran-2-il, tetrahidrofuran-3-il,
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38/239 tetrahidrotien-2-il, tetrahidrotien-3-il, 1 -piperazinil, 2-piperazinil, e outros.
Os termos halo ou halogênio, por si ou como parte de outro substituinte, significa, a menos que determinado de outra forma, um átomo de flúor, cloro, bromo, ou iodo. Adicionalmente, termos como haloalquil, devem incluir monohaloalquil e polihaloalquil. Por exemplo, o termo halo (C1-C4) alquil deve incluir, mas não é limitado a, trifluormetil, 2,2,2-trifluoretil, 4-clorobutil, 3bromopropil, e outros.
O termo aril significa, a menos que determinado de outra forma, um substituinte poliinsaturado, aromático que pode ser de anel único ou de múltiplos anéis (preferivelmente de 1 a 3 anéis), que são fundidos ou ligados covalentemente. O termo heteroaril refere-se a grupos aril (ou anéis) que contêm de um a quatro heteroátomos selecionado de N, O, e S, em que os átomos de nitrogênio e enxofre são opcionalmente oxidados, e os átomos de nitrogênio são opcionalmente quaternizados. Um grupo heteroaril pode ser anexado ao restante da molécula através de um heteroátomo. Exemplos não limitantes de grupos aril e heteroaril incluem fenil, 1-naftil, 2-naftil,
4-bifenil, 1-pirrolil, 2-pirrolil, 3-pirrolil, 3-pirazolil,
2- imidazolil, 4-imidazolil, pirazinil, 2-oxazolil, 4oxazolil, 2-fenil-4-oxazolil, 5-oxazolil, 3-isoxazolil, 4isoxazolil, 5-isoxazolil, 2-tiazolil, 4-tiazolil, 5tiazolil, 2-furil, 3-furil, 2-tienil, 3-tienil, 2-piridil,
3- piridil, 4-piridil, 2-pirimidil, 4-pirimidil, 5benzotiazolil, purinil, 2-benzimidazolil, 5-indolil, 1 isoquinolil, 5-isoquinolil, 2-quinoxalinil, 5-quinoxalinil,
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3-quinolil, tetrazolil, benzo[b]furanil, benzo [b]tienil, 2,3-dihidrobenzo[1,4]dioxin-6-il, benzo[1,3]dioxol-5-il e 6-quinolil. Substituintes para cada um dos sistemas de anel de aril e heteroaril acima são selecionados do grupo de substituintes aceitáveis como descrito abaixo.
Resumidamente, o termo aril quando usado em combinação com outros termos (por exemplo, ariloxi, ariltioxi, arilalquil) inclui anéis aril e heteroaril como acima definido. Portanto, o termo arilalquil deve incluir aqueles radicais em que um grupo aril é anexado a um grupo alquil (por exemplo, benzil, fenetil, piridilmetil e outros) incluindo aqueles grupos alquil em que um átomo de carbono (por exemplo, um grupo metileno) foi substituído, por exemplo, por um átomo de oxigênio (por exemplo, fenoximetil, 2-piridiloximetil, 3-(1-naftiloxi)propil, e outros).
Cada um dos termos acima (por exemplo, alquil, heteroalquil, aril e heteroaril) deve incluir formas tanto substituídas quanto não substituídas do radical indicado. Substituintes preferidos para cada tipo de radical são fornecidos abaixo.
Substituintes para os radicais alquil e heteroalquil (incluindo aqueles grupos freqüentemente referidos como alquileno, alcenil, heteroalquileno, heteroalcenil, alcinil, cicloalquil, heterocicloalquil, cicloalcenil, e heterocicloalcenil) são genericamente referidos como substituintes de grupo alquil, e eles podem ser um ou mais de vários grupos selecionados de, mas não limitados a: -OR', =0, =NR', =N-OR', -NR'R, -SR', -halogênio,
SiR'RR', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R' , -CONR'R,
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0C(0)NR'R, -NRC(0)R', -NR'-C(O)NRR', - NRC(O) 2R' , -NRC (NR'RR') =NR'', -NR-C(NR'R)=NR', -S(O)R', -S(O)2R', S(O)2NR'R, -NRSO2R', -CN e —NO2 em um número que varia de zero a (2m'+l), em que m' é o número total de átomos de carbono em tal radical. R', R, R' e R'' referem-se preferivelmente independentemente a hidrogênio, heteroalquil substituído ou não substituído, aril substituído ou não substituído, por exemplo, aril substituído com 1-3 halogênios, alquil substituído ou não substituído, grupos alcoxi ou tioalcoxi, ou grupos arilalquil. Quando um composto da invenção inclui mais de um grupo R, por exemplo, cada um dos grupos R é independentemente selecionado como são cada grupo R' , R, R' e R'’ quando mais de um desses grupos está presente. Quando R' e R são anexados ao mesmo átomo de nitrogênio, eles podem ser combinados com o átomo de nitrogênio para formar um anel de 5, 6 ou 7 membros. Por exemplo, -NR'R deve incluir, mas não é limitado a, 1-pirrolidinil e 4morfolinil. A partir da discussão acima de substituintes, a pessoa habilitada na técnica compreenderá que o termo alquil deve incluir grupos que incluem átomos de carbono ligados a grupos outros que não grupos hidrogênio, como haloalquil (por exemplo, -CF2 e —CH2CF3) e acil (por exemplo, -C(O)CH3, -C(O)CF3, -C (O) CH2OCH3, e outros).
Similar aos substituintes descritos para o radical alquil, substituintes para os grupos aril e heteroaril são genericamente referidos como substituintes de grupo aril. Os substituintes são selecionados de, por exemplo:
halogênio, -OR', =0, =NR', =N-OR', -NR'R, -SR', halogênio, -SiR'RR', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R' , -CONR'R,
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-QC(0)NR'R, - NRC(0)R', -NR'-C(O)NRR', -NRC(O)2R', NR-C (NR' RR) =NR, -NR-C (NR' R) =NR', -S(O)R', -S (O) 2R', S(O)2NR'R, -NRSO2R', -CN e -NO2, -R' , -N3, -CH(Ph)2, fluor (C1-C4) alcoxi, e flúor (C1-C4) alquil, em um número que varia de zero ao número total de valências abertas no sistema de anel aromático; e quando R' , R, R' e R' são preferivelmente independentemente selecionados de hidrogênio, alquil substituído ou não substituído, heteroalquil substituído ou não substituído, aril substituído ou não substituído e heteroaril substituído ou não substituído. Quando um composto da invenção inclui mais de um grupo R, por exemplo, cada um dos grupos R é independentemente selecionado como são cada grupo R' , R, R' e R' quando mais de um desses grupos está presente. Nos esquemas que se seguem, o símbolo X representa R como acima descrito.
Dois dos substituintes em átomos adjacentes do anel aril ou heteroaril podem ser opcionalmente substituídos com um substituinte de fórmula —T-C (O) - (CRR') U-U-, em que T e U são independentemente —NR-, -Q-, -CRR'- ou uma ligação única, e u é um número inteiro de 0 a 3. Alternativamente, dois dos substituintes em átomos adjacentes do anel aril ou heteroaril podem ser opcionalmente substituídos com um substituinte de fórmula —A-(CH2) ,-B-, em que A e B são independentemente -CRR'-, -Q-, -NR-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2NR'- ou uma ligação única, erê um número inteiro de 1 a 4. Uma das ligações únicas do novo anel assim formado pode ser opcionalmente substituída por uma ligação dupla. Alternativamente, dois dos substituintes em átomos adjacentes do anel aril ou heteroaril podem ser
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42/239 opcionalmente substituídos com um substituinte de fórmula — (CRR') z-X-(CRR') d~, em que zed são independentemente números inteiros de 0 a 3, e X é -O-, -NR'-, -S-, -S(O)-, S(O)2-, ou — S(O)2NR'-. Os substituintes R, R' , R e R' são preferivelmente independentemente selecionados de hidrogênio ou (Ci-Ce)alquil substituído ou não substituído.
Como aqui usado, o termo heteroátomo deve incluir oxigênio (O), nitrogênio (N), enxofre (S) e silício (Si).
Como aqui usado, peptídeo de Fator VII refere-se aos peptídeos de Fator VII e Fator Vila. Os termos geralmente referem-se a variantes e mutantes desses peptídeos, incluindo mutantes de adição, deleção, substituição e de proteína de fusão. Quando Fator VII e Fator Vila são usados, o so deve ser ilustrativo de duas espécies do gênero peptídeo de Fator VII.
A invenção deve incluir sais dos compostos da invenção que são preparados com ácido ou bases relativamente não tóxicos, dependendo dos substituintes particulares encontrados nos compostos descritos nessa. Quando os compostos da presente invenção contêm funcionalidades relativamente ácidas, sais de adição básica podem ser obtidos por contato da forma neutra de tais compostos com uma quantidade suficiente da base desejada, pura ou em um solvente inerte adequado. Exemplos de sais de adição básica incluem sais de sódio, potássio, lítio, cálcio, amônio, amino orgânico, ou de magnésio, ou um sal similar. Quando os compostos da presente invenção contêm funcionalidades relativamente básicas, sais de adição ácida podem ser obtidos por contato da forma neutra de tais compostos com uma quantidade suficiente do ácido desejado, puro ou em um
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43/239 solvente inerte adequado. Exemplos de sais de adição ácida incluem auqeles derivados de ácidos inorgânicos como ácidos clorídrico, hidrobrômico, nítrico, carbônico, monohidrogencarbônico, fosfórico, monohidrogenfosfórico, dihidrogenfosfórico, sulfúrico, monohidrogensulfúrico, hidriódico, ou de fósforo e outros, bem como os sais derivados de ácidos orgânicos relativamente não tóxicos como acético, propiônico, isobutírico, maleico, malônico, benzóico, succínico, subérico, fumárico, lático, mandélico, ftálico, benzenossulfônico, ptolilsulfônico, cítrico, tartárico, metanossulfônico, e outros. Também são incluídos sais de aminoácidos como arginato e outros, e sais de ácidos orgânicos como ácidos glicurônico ou galactunôrico e outros (veja, por exemplo, Berge e cols., Pharmaceutical Salts, Journal of Pharmaceutical Science 66: 1-19 (1977)). Certos compostos específicos da presente invenção contêm funcionalidades básicas e ácidas que permitem que os compostos sejam convertidos em sais de adição básica ou ácida.
As formas neutras dos compostos são preferivelmente regeneradas por contato do sal com uma base ou ácido e isolação dos compostos parentes de maneira convencional. A forma parente do composto difere das várias formas de sal em certas propriedades físicas, como solubilidade em solventes polares.
Contra-íon de sal, como aqui usado, refere-se a ions positivamente carregados que se associam com um composto da invenção quando uma de suas porções é negativamente carregada (por exemplo COO-). Exemplos de contra-íons de sal incluem H+, HaO+, amônio, potássio, cálcio, lítio,
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44/239 magnésio e sódio.
Como aqui usado, o termo CMP-SA-PEG é uma molécula de citidina monofosfato que é conjugada a um ácido siálico que compreende uma porção de polietileno glicol. Se um comprimento da cadeia de polietileno glicol não é especificado, então qualquer comprimento de cadeia de PEG é possível (por exemplo 1 kD, 2 kD, 5 kD, 10 kD, 20 kD, 30 kD, 4 0 kD) . Um exemplo de CMP-SA-PEG é o composto 5 no Esquema 1.
I. Introdução
Para melhorar a eficácia de peptídeos recombinantes usados para objetivos terapêuticos, a presente invenção fornece conjugados de peptídeos glicosilado e não glicosilado com um grupo de modificação. Os grupos de modificação podem ser selecionados de grupos de modificação poliméricos como, por exemplo, PEG (m-PEG), PPG (m-PPG) etc., porções terapêuticas, porções diagnosticas, porções de direcionamento e outros. A modificação do peptídeo, por exemplo, com um grupo de modificação polimérico hidrossolúvel pode melhorar a estabilidade e tempo de retenção dos peptídeos recombinantes na circulação do paciente, e/ou reduzir a antigenicidade dos peptídeos recombinantes.
O conjugados de peptídeo da invenção pode ser formado pela anexação enzimática de um açúcar modificado ao peptídeo glicosilado ou não glicosilado. Um sítio de glicosilação e/ou um grupo glicosil modificado fornece um lócus para conjugação de um açúcar modificado que porta um grupo de modificação ao peptídeo, por exemplo, por glicoconjugação.
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Os métodos da invenção também tornam possível montar conjugados de peptídeo e glicoconjugados de peptídeo que têm um padrão de derivatização substancialmente homogêneo. As enzimas usadas na invenção são geralmente seletivas para um resíduo de aminoácido particular, combinação de resíduos de aminoácidos, particular resíduos de glicosil, ou combinações de resíduo de glicosil do peptídeo. Os métodos são também práticos para a produção em larga escala de conjugados de peptídeo. Portanto, os métodos da invenção fornecem um meio prático para a preparação em larga escala de conjugados de peptídeo que têm padrões de derivatização uniformes pré-selecionados. Os métodos são particularmente bem adequados para a modificação de peptídeos terapêuticos, que incluem, sem limitação, glicopeptídeos que são incompletamente glicosilados durante a produção em células de cultura de células (por exemplo, células de mamífero, células de inseto, células de planta, células fúngicas, células de levedura, ou células procarióticas) ou plantas ou animais transgênicos.
A presente invenção também fornece conjugados de peptídeos glicosilados e não glicosilados com meia-vida terapêutica aumentada devido, por exemplo, à taxa de clearance reduzida, ou taxa reduzida de captação pelo sistema imune ou reticuloendotelial (RES). Além disso, os métodos da invenção fornecem um meio para mascarar determinantes antigênicos em peptídeos, assim reduzindo ou eliminando uma resposta imune do hospedeiro contra o peptídeo. Anexação seletiva de agentes de direcionamento também pode ser usada para direcionar um peptídeo a um receptor de superfície de tecido ou célula particular que é
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46/239 específico para o agente de direcionamento particular.
A determinação de condições ótimas para a preparação de conjugados de peptideo com polímeros hidrossolúveis, por exemplo, envolve a otimização de numerosos parâmetros, que são dependentes da identidade do peptideo e do polímero hidrossolúvel. Por exemplo, quando o polímero é poli (etileno glicol), por exemplo, um poli(etileno glicol) ramificado, um equilíbrio é preferivelmente estabelecido entre a quantidade de polímero utilizada na reação e a viscosidade da mistura de reação atribuível à presença do polímero: se o polímero é muito concentrado, a mistura de reação torna-se viscosa, retardando a taxa de transferência de massa e reação.
Além disso, embora seja intuitivamente aparente a adição de um excesso de enzima, os presentes inventores reconheceram que, quando a enzima está presente em grande excesso, a enzima em excesso torna-se um contaminante cuja remoção requer etapas extra de purificação e material e aumentos desnecessários do custo do produto final.
Além disso, é geralmente desejado a produção de um peptideo com um nível controlado de modificação. Em alguns casos, é desejável adicionar um açúcar modificado preferencialmente. Em outros casos, é desejável adicionar dois açúcares modificados preferencialmente. Assim, as condições de reação são preferivelmente controladas para influenciar o grau de conjugação dos grupos de modificação ao peptideo.
A presente invenção fornece condições sob as quais o rendimento de um peptideo, tendo o nível desejado de conjugação, é maximizado. As condições nos exemplos de
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47/239 modalidades da invenção também reconhecem o consumo dos vários reagentes e os materiais e tempo necessários para purificar o produto: as condições de reação aqui apresentadas são otimizadas para fornecer excelentes rendimentos do produto desejado, enquanto minimizam o desperdício de reagentes caros.
II. As composições de matéria/conjugados de peptídeo
Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece um conjugado entre um açúcar modificado e um peptídeo. A presente invenção também fornece um conjugado entre um grupo de modificação e um peptídeo. Um conjugado de peptídeo pode ter uma de várias formas. Em uma modalidade de exemplo, um conjugado de peptídeo pode compreender um peptídeo e um grupo de modificação ligado a um aminoácido do peptídeo através de um grupo de ligação de glicosil. Em outra modalidade de exemplo, um conjugado de peptídeo pode compreender um peptídeo e um grupo de modificação ligado a um resíduo de glicosil do peptídeo através de um grupo de ligação de glicosil. Em um outro exemplo de modalidade, o conjugado de peptídeo pode compreender um peptídeo e um grupo de ligação de glicosil que é ligado a um carboidrato de glicopeptídeo e diretamente a um resíduo de aminoácido do esqueleto do peptídeo. Ainda em outro exemplo de modalidade, um conjugado de peptídeo pode compreender um peptídeo e um grupo de modificação ligado diretamente a um resíduo de aminoácido do peptídeo. Nessa modalidade preferida, o conjugado de peptídeo pode não compreender um grupo glicosil. Em qualquer dessas modalidades, o peptídeo pode ou não ser glicosilado.
Os conjugados da invenção corresponderão tipicamente à
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Figure BRPI0717505B1_D0013
em que os símbolos a, b, c, d e s representam um número inteiro positivo, diferente de zero; e t é 0 ou um número inteiro positivo. O agente, ou grupo de modificação, pode ser um agente terapêutico, um agente bioativo, um rótulo detectável, um grupo de modificação polimérico como um polímero hidrossolúvel (por exemplo, PEG, m-PEG, PPG, e m-PPG) ou outros. O agente, ou grupo de modificação, pode ser um peptídeo, por exemplo, enzima, anticorpo, antígeno etc. O ligante pode ser qualquer umd e uma grande variedade de grupos de ligação, infra. Alternativamente, o ligante pode ser uma ligação única ou um ligante de ordem zero.
II. A. Peptídeo
O peptídeo no conjugado de peptídeo é um membro selecionado do peptídeo na FIG. 7. Nesses casos, o peptídeo no conjugado de peptídeo é um membro selecionado de proteínas morfogênicas do osso (por exemplo, BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15), neurotrofinas (por exemplo, NT-3, NT-4, NT-5), fatores de diferenciação do crescimento (por exemplo, GDF-5) , fator neurotrófico derivado de linhagem de células da glia (GDNF), fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), fator de crescimento de nervos (NGF), fator de von Willebrand (vWF) protease, Fator VII, Fator Vila, Fator VIII, Fator IX,
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Fator X, Fator XI, Fator VIII de domínio B deletado, proteína de fusão de vWF-Fator VIII que tem Fator VIII de comprimento total, proteína de fusão de vWF-Fator VIII que tem Fator VIII de domínio B deletado, eritropoietina (EPO), fator estimulante de colônia de granulócitos (G-CSF), Fator estimulante de colônia de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), interferon alfa, interferon beta, interferon gama, ociantitripsina (ATT, ou inibidor de a-1 protease, glicocerebrosidase, ativador de plasminogênio de tipo tecidual (TPA) , Interleucina-2 (IL-2), uroquinase, DNase humana, insulina, Proteína de superfície de Hepatite B (HbsAg), hormônio do crescimento humano, proteína de fusão de receptor de TNF-região Fc de IgG (Enbrel™) , anticorpo monoclonal anti-HER2 (Herceptin™) , anticorpo monoclonal para Proteína F de Vírus Sincicial Respiratório (Synagis™) , anticorpo monoclonal para TNF-α (Remicade™) , anticorpo monoclonal para glicoproteína Ilb/IIIa (Reopro™) , anticorpo monoclonal para CD20 (Rituxan™) , anti-trombina III (AT III), gonadotrofina coriônica humana (hCG), alfa-galactosidase (Fabrazyme™), alfa-iduronidase (Aldurazyme™) , hormônio folículo-estimulante, betaglicosidase, anticorpo monoclonal anti-TNF-alfa, peptídeo-1 semelhante a glucagon (GLP-1), peptídeo-2 semelhante a glucagon (GLP-2), beta-glicosidase, alfa-galactosidase A, e fato de crescimento de fibroblastos. Em certas modalidades, o peptídeo no conjugado de peptídeo é Fator VIII. Em outras modalidades, o peptídeo no conjugado de peptídeo é interferon alfa.
Em uma modalidade de exemplo, o grupo de modificação polimérico tem uma estrutura que inclui uma porção de
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50/239 acordo com as seguintes fórmulas:
(och^ch^a1
Em inteiros de
H
A^CHjCHjOJ
Figure BRPI0717505B1_D0014
H (OCHsCHihA1 a2(CH2CH2O)
CH:
Figure BRPI0717505B1_D0015
Figure BRPI0717505B1_D0016
uma modalidade de exemplo, m independentemente selecionados
5.000, preferivelmente de cerca de de mais preferivelmente de cerca de 200 são
100 a to 2 0 números de 1 de de ainda mais preferivelmente de cerca de 300 de 2000 e ainda mais preferivelmente de cerca de
400 a cerca de 1.000.
Em uma modalidade de exemplo, m são números inteiros independentemente selecionados de cerca de a cerca de 500. Em uma modalidade de exemplo, men são números inteiros independentemente selecionados de cerca de 1 a cerca de 70, cerca de 70 a cerca de 150, cerca de 150 a cerca de 250, cerca de 250 a cerca de 375 e cerca de 375 a cerca de 500. Em uma modalidade de exemplo, men são números inteiros independentemente selecionados de cerca de a cerca de 35, cerca de 45 a cerca de 65, cerca de 95 a cerca de 130, cerca de 210 a cerca de 240, cerca de 310 a cerca de 370 e cerca de 420 a cerca de 480. Em uma
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modalidade de exemplo, m e n são números inteiros
selecionados de cerca de 15 a cerca de 30. Em uma
modalidade de exemplo, m e n são números inteiros
selecionados de cerca de 50 a cerca de 65. Em uma
modalidade de exemplo, m e n são números inteiros
selecionados de cerca de 100 a cerca de 130. Em uma
modalidade de exemplo, m e n são números inteiros
selecionados de cerca de 210 a cerca de 240. Em uma
modalidade de exemplo, m e n são números inteiros
selecionados de cerca de 310 a cerca de 370. Em uma
modalidade de exemplo, m e n são números inteiros
selecionados de cerca de 430 a cerca de 470. Em uma
modalidade de exemplo
A1 e A2 são membros selecionados de
-OH e -OCH3.
Exemplos de grupos de modificação poliméricos de acordo com essa modalidade incluem a porção:
Em uma modificação
CHsOÍCHjjCH.OV M (OCHaCH2)nOCH3
Figure BRPI0717505B1_D0017
modalidade de é um polímero aqueles acima mostrados concentração de sialidase
U/L de mistura de reação.
Figure BRPI0717505B1_D0018
exemplo, em hidrossolúvel é geralmente que o grupo de ramificado, como preferível que a seja cerca de 1,5 a cerca de 2,5
Mais preferivelmente a quantidade de sialidase é cerca de 2
U/L.
Em outra modalidade de exemplo, cerca de 5 a cerca de
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52/239 gramas de substrato de peptídeo faz contato com as quantidades de sialidase acima apresentadas.
O açúcar modificado está presente na mistura de reação em uma quantidade de cerca de 1 grama a cerca de 6 gramas, preferivelmente de cerca de 3 gramas a cerca de 4 gramas. É geralmente preferível manter a concentração de um açúcar modificado que tem uma porção de modificação de polímero hidrossolúvel ramificado, por exemplo, a porção acima mostrada, em menos que cerca de 0,5 mM.
Em certas modalidades, o grupo de modificação é um óxido de poli(alquileno) ramificado, por exemplo, poli(etileno glicol), que tem um peso molecular de cerca de 20 kD a cerca de 60 kD, mais preferivelmente, de cerca de 30 kD a cerca de 50 kD, e ainda mais preferivelmente cerca de 40 kD. Em outras modalidades, o grupo de modificação é um óxido de poli(alquileno) ramificado, por exemplo, poli (etileno glicol), que tem um peso molecular de pelo menos cerca de 80 kD, preferivelmente pelo menos cerca de 100 kD, mais preferivelmente pelo menos cerca de 120 kD, pelo menos cerca de 140 kD ou pelo menos cerca de 160 kD. Ainda em outra modalidade, o óxido de poli(alquileno) ramificado, por exemplo, poli(etileno glicol) é de pelo menos cerca de 200 kD, como de pelo menos cerca de 80 kD a pelo menos cerca de 200 kD, incluindo pelo menos cerca de 160 kD e pelo menos cerca de 180 kD. Como aqueles habilitados perceberão, o peso molecular dos polímeros é freqüentemente polidisperso, assim, a frase cerca de no contexto de peso molecular preferivelmente engloba uma escala de valores em torno do número determinado. Por exemplo, um grupo de modificação preferido que tem um peso
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53/239 molecular de cerca de 40 kD é um que tem um peso molecular de cerca de 35 kD a cerca de 45 kD. Aqueles habilitados perceberão que a confiança em estruturas de PEG ramificado acima apresentadas é simplesmente para clareza de ilustração, o PEG pode ser substituído por substancialmente qualquer porção polimérica, incluindo, sem limitação aquelas espécies apresentadas na definição de porção polimérica encontrada nessa.
Com relação à concentração de glicosiltransferase, em uma modalidade atualmente preferida, com o uso do grupo de modificação acima apresentado, a proporção de glicosiltransferase para peptídeo é de cerca de 40 μρ/πιΐι de transferase a cerca de 200 μΜ de peptídeo.
II. B. Açúcar modificado
Em uma modalidade de exemplo, os peptídeos da invenção, como Fator VIII, interferon alfa, e os peptídeos listados na FIG. 7, reagem com um açúcar modificado, assim formando um conjugado de peptídeo. um açúcar modificado compreende uma porção doadora de açúcar bem como uma porção de transferência de açúcar. A porção doadora de açúcar é qualquer porção do açúcar modificado que será anexada ao peptídeo, através de uma porção de glicosil ou porção de aminoácido, como um conjugado da invenção. A porção doadora de açúcar inclui aqueles átomos que são quimicamente alterados durante sua conversão do açúcar modificado ao grupo de ligação de glicosil do conjugado de peptídeo. A porção de transferência de açúcar é qualquer porção do açúcar modificado que não será anexada ao peptídeo como um conjugado da invenção. Por exemplo, um açúcar modificado da invenção é o nucleotídeo de açúcar
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PEGuilado, PEG-ácido siálico CMP. Para PEG-ácido siálico CMP, a porção doadora de açúcar, ou porção doadora de PEGsialil, compreende PEG-ácido siálico enquanto a porção de transferência de açúcar, ou porção de transferência de sialil, compreende CMP.
Em açúcares modificados de uso na invenção, a porção sacaril é preferivelmente um sacarídeo, um desoxisacarídeo, um amino-sacarídeo, ou um N-acil sacarídeo. O termo sacarídeo e seus equivalentes, sacaril, açúcar, e glicosil referem-se a monômeros, dímeros, oligômeros e polímeros. A porção de açúcar é também funcionalizada com um grupo de modificação. O grupo de modificação é conjugado à porção sacaril, tipicamente, através de conjugação com uma amina, sulfidril ou hidroxil, por exemplo, hidroxil primário, porção no açúcar. Em uma modalidade de exemplo, o grupo de modificação é anexado através de uma porção amina no açúcar, por exemplo, através de uma amida, um uretano ou uma uréia que é formada através da reação da amina com um derivado reativo do grupo de modificação.
Qualquer porção sacaril pode ser utilizada como a porção doadora de açúcar do açúcar modificado. A porção sacaril pode ser um açúcar conhecido, como manose, galactose ou glicose, ou uma espécie que tem a estereoquímica de um açúcar conhecido. As fórmulas gerais desses açúcares modificados são:
Figure BRPI0717505B1_D0019
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Outras porções sacaril que são úteis na formação das composições da invenção incluem, sem limitação fucose e ácido siálico, bem como açúcares de amino como glicosamina, galactosamina, manosamina, o análogo de 5-amina de ácido siálico e outros. A porção sacaril pode ser a estrutura encontrada na natureza ou ela pode ser modificada para fornecer um sítio para conjugação do grupo de modificação. Por exemplo, em uma modalidade, o açúcar modificado fornece um derivado de ácido siálico em que a porção 9-hidroxi é substituída com uma amina. A amina é facilmente derivatizada com um análogo ativado de um grupo de modificação selecionado.
Exemplos de açúcares modificados de uso na invenção são descritos no Pedido de Patente PCT No. PCT/US05/002522, que é aqui incorporado por referência.
Em uma modalidade de exemplo adicional, a invenção utiliza açúcares modificados em que a posição 6-hidroxil é convertida à porção de amina correspondente, que porta um cassete de ligante-grupo de modificação como aqueles acima apresentados. Exemplos de grupos glicosil que podem ser usados como o núcleo desses açúcares modificados incluem Glu, Gal, GalNAc, Glc, GlcNAc, Fuc, Xyl, Man, e outros. Um açúcar modificado representativo de acordo com essa modalidade tem a fórmula:
Figure BRPI0717505B1_D0020
em que R11-R14 são membros independentemente
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56/239 selecionados de H, OH, C(O)CH3, NH, e NHC(O)CH3. R10 é uma ligação a um outro resíduo de glicosil (-O-glicosil) ou a um aminoácido do peptídeo Fator VII/Fator Vila (-NH-( Fator VII/Fator Vila)). R14 é ORI, NHR1 ou NH-L-R1. R1 e NH-L-R1 são como acima descrito.
II. C. Grupos de ligação de glicosil
Em uma modalidade de exemplo, a invenção fornece um conjugado de peptídeo formado entre um açúcar modificado da invenção e um peptídeo. Em outra modalidade de exemplo, quando o grupo de modificação no açúcar modificado inclui a porção:
(OCH2CH2)nA1 ca3a4 (CA5A6)j
--A7 (CAaA9)k CA1°A11 Ia—| e o peptídeo no conjugado de peptídeo é um membro selecionado dos peptídeos na FIG. 7. Ainda em outra modalidade de exemplos, o peptídeo no conjugado de peptídeo é um membro selecionado de proteínas morfogênicas do osso (por exemplo, BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP14, BMP-15), neurotrofinas (por exemplo, NT-3, NT-4, NT-5), fatores de diferenciação do crescimento (por exemplo, GDF5) , fator neurotrófico derivado de linhagem de células (GDNF), fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), fator de crescimento de nervos (NGF), fator de von Willebrand (vWF) protease, Fator VII, Fator Vila, Fator
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VIII, Fator IX, Fator X, Fator XI, Fator VIII de domínio B deletado, proteína de fusão de vWF-Fator VIII que tem Fator VIII de comprimento total, proteína de fusão de vWF-Fator VIII tendo Fator VIII de domínio B deletado, eritropoietina (EPO), fator estimulante de colônia de granulócitos (GCSF) , Fator estimulante de colônia de granulócitosmacrófagos (GM-CSF), interferon alfa, interferon beta, interferon gama, al-antitripsina (ATT, ou inibidor de a-1 protease), glicocerebrosidase, Ativador de plasminogênio de tipo tecidual (TPA), Interleucina-2 (IL-2), uroquinase, DNase humana, insulina, Proteína de superfície de Hepatite B (HbsAg), hormônio do crescimento humano, proteína de fusão de receptor de TNF-região Fc de IgG (Enbrel™) , anticorpo monoclonal anti-HER2 (Herceptin™) , anticorpo monoclonal para Proteína F de Vírus Sincicial Respiratório (Synagis™) , anticorpo monoclonal para TNF-α (Remicade™) , anticorpo monoclonal para glicoproteína Ilb/IIIa (Reopro™) , anticorpo monoclonal para CD20 (Rituxan™) , anti-trombina III (AT III), gonadotrofina coriônica humana (hCG), alfa-galactosidase (Fabrazyme™), alfa-iduronidase (Aldurazyme™) , hormônio folículo-estimulante, betaglicosidase, anticorpo monoclonal anti-TNF-alfa, peptídeo-1 semelhante a glucagon (GLP-1), peptídeo-2 semelhante a glucagon (GLP-2), beta-glicosidase, alfa-galactosidase A, e fato de crescimento de fibroblastos. Em certas modalidades o peptídeo é Fator VIII ou interferon alfa. Nessa modalidade preferida, o porção doadora de açúcar (como a porção sacaril e o grupo de modificação) do açúcar modificado torna-se um grupo de ligação de glicosil. O grupo de ligação de glicosil pode referir-se
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58/239 alternativamente à porção de glicosil que é interposta entre o peptídeo e o grupo de modificação.
Em uma modalidade de exemplo, o grupo de modificação polimérico inclui uma porção que tem a estrutura de acordo com as seguintes fórmulas:
Figure BRPI0717505B1_D0021
(OCH^GHiJnA1
A2(CH2CH2O)
Figure BRPI0717505B1_D0022
Em uma modalidade de exemplo, grupo de modificação no açúcar modificado inclui a porção:
Figure BRPI0717505B1_D0023
Em uma modalidade de exemplo, A1 e A2 são membros selecionados de -OH and —OCHa.
Exemplos de grupos de modificação poliméricos de acordo com essa modalidade incluem a porção:
(OCHjCH^JnOCHa
CH3O(CH2CH2O)r
Figure BRPI0717505B1_D0024
Figure BRPI0717505B1_D0025
aqueles de habilidade na
Como será percebido por técnica, as porções PEG em cada uma das estruturas acima
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59/239 mostradas podem ser substituídas por qualquer outra porção polimérica, incluindo, sem limitação, aquelas espécies aqui definidas como porções poliméricas.
Devido à versatilidade dos métodos disponíveis para adição e/ou modificação de resíduos de glicosil em um peptideo, os grupos de ligação de glicosil pode ter substancialmente qualquer estrutura. Na discussão que se segue, a invenção é ilustrada em referência ao uso de derivados selecionados de furanose e piranose. Aqueles habilitados na técnica reconhecerão que o foco da discussão é para clareza de ilustração e que as estruturas e composições apresentadas são geralmente aplicáveis por todos os gêneros de grupos de ligação de glicosil e açúcares modificados. O grupo de ligação de glicosil pode compreender virtualmente qualquer mono- ou oligossacarídeo. Os grupos de ligação de glicosil podem ser anexados a um aminoácido através da cadeia lateral ou através do esqueleto do peptideo. Alternativamente os grupos de ligação de glicosil pode ser anexado ao peptideo através de uma porção sacaril. Essa porção sacaril pode ser a porção de uma estrutura de glicano ligada em O ou ligada em N no peptideo.
Em uma modalidade de exemplo, a invenção fornece um conjugado de peptideo que compreende um grupo de ligação de glicosil intacto que tem a fórmula que é selecionada de:
II
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Figure BRPI0717505B1_D0026
Figure BRPI0717505B1_D0027
Nas Fórmulas I e Ia R2 é H, CH2OR7, COOR7 ou OR7, em que R7 representa H, alquil substituído ou não substituído ou heteroalquil substituído ou não substituído. Quando COOR7 é um ácido carboxílico ou carboxilato, ambas formas são representadas oeka designação da estrutura única COO- ou COOH. Nas Fórmulas I, Ia, II ou Ila, os símbolos R3, R4, R5, r6 e r6' representam independentemente H, alquil substituído ou não substituído, OR8, NHC(O)R9. O índice d é 0 ou 1. R8 e R9 são independentemente selecionados de H, alquil substituído ou não substituído, heteroalquil substituído ou não substituído, ácido siálico ou ácido polissiálico. Pelo menos um de R3, R4, R5, R6 e R6' inclui um grupo de modificação. Esse grupo de modificação pode ser uma porção de modificação polimérica por exemplo, PEG, ligada através de uma ligação ou um grupo de ligação. Em uma modalidade de exemplo, R6 e R6', junto com o carbono ao qual eles são anexados são componentes da cadeia lateral de piruvil de ácido siálico. Em uma modalidade de exemplo adicional, a cadeia lateral de piruvil é funcionalizada com o grupo de modificação polimérico. Em outros exemplos de modalidade, R6 e R6', junto com o carbono ao qual eles são anexados são componentes da cadeia lateral de ácido siálico e o grupo de modificação polimérico é um componente de R5.
Em uma modalidade de exemplo, a invenção utiliza um grupo de ligação de glicosil que tem a fórmula:
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Figure BRPI0717505B1_D0028
em que J é a porção de glicosil, L é uma ligação ou um ligante e R1 é um grupo de modificação, por exemplo, um grupo de modificação polimérico. Exemplos de ligações são aquelas que são formadas entre uma porção NH2 na porção de glicosil e um grupo de reatividade complementar no grupo de modificação. Por exemplo, quando R1 inclui uma porção de ácido carboxílico, essa porção pode ser ativada e ligada com a porção NH2 on o resíduo de glicosil gerando uma ligação que tem a estrutura NHCÍOJR1. J é preferivelmente uma porção de glicosil que é intacto, não tendo sido degradada por exposição a condições que clivam a estrutura de piranose ou furanose, por exemplo, condições oxidativas, por exemplo, periodato de sódio.
Exemplos de ligantes incluem porções alquil e heteroalquil. Os ligantes incluem grupos de ligação, por exemplo, grupos de ligação com base em acil, por exemplo, C(O)NH-, -OC(O)NH- e outros. Os grupos de ligação são ligações formadas entre componentes das espécies da invenção, por exemplo, entre a porção de glicosil e o ligante (L) , ou entre o ligante e o grupo de modificação (R' ) . Outros Exemplos de grupos de ligação são éteres, tioéteres e aminas. Por exemplo, em uma modalidade, o ligante é um resíduo de aminoácido, como um resíduo de glicina. A porção de ácido carboxílico da glicina é convertida à amida correspondente por reação com uma amina no resíduo de glicosil, e a amina da glicina é convertida à amida correspondente ou uretano por reação com um ácido carboxílico ativado ou carbonato do grupo de modificação.
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Uma espécie de exemplo de NH-L-R1 tem a fórmula:
NH{C (O) (CH2) aNH}s{C (O) (CH2) b (OCH2CH2) cO (CH2) dNHJtR1, em que os indices set são independentemente 0 ou 1. Os índices a, b e d são independentemente números inteiros de 0 a 20, e c é um número inteiro de 1 a 2.500. Outros ligantes similares são baseados em espécies em que uma porção -NH é substituída por outro grupo, por exemplo, -S, -O ou —CH2. como aqueles habilitados perceberão uma ou mais das porções entre chaves que correspondem aos indices set podem ser substituídas com uma porção de alquil ou heteroalquil substituído ou não substituído.
Mais particularmente, a invenção utiliza compostos em que NH-L-R' é:
XI HC(O)(CH?);1NHC(O )(CH? WOCH?CH2)lO(CH AiN HR1, NHQOXCH^btOCHiCHíLOCCH^N HR1, N HC (O)O(CHI)b(OCH2CH2)£.O(CHI)dN HR1, NI I(CIhXNIIC(OXCHzMOCI 12CILUXCIh)dNIIR1, NIIC(O)(CIhXNIIR1,
NH (CH2) aNHR1, e NHR1. Nessas fórmulas, os índices a, b e d são independentemente selecionados dos números inteiros de 0 a 20, preferivelmente de 1 a 5. O índice c é um número inteiro de 1 a cerca de 2.500.
Em uma modalidade de exemplo, c é selecionado de modo que a porção PEG é aproximadamente 1 kD, 5 kD, 10, kD, 15 kD, 20 kD, 25 kD, 30 kD, 35 kD, 40 kD ou 45 kD.
Para objetivos de conveniência, os grupos de ligação de glicosil no restante dessa seção serão baseados em uma porção sialil. No entanto, uma pessoa habilitada na técnica reconhecerá que outra porção de glicosil, como manosil, galactosil, glucosil, ou fucosil, pode ser usada no lugar da porção sialil.
Em uma modalidade de exemplo, o grupo de ligação de
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63/239 glicosil é um grupo de ligação de glicosil intacto, em que a porção de glicosil ou porções que formam o grupo de ligação não são degradadas por processos químicos (por exemplo, metaperiodato de sódio) ou enzimáticos (por exemplo, oxidase). Conjugados selecionados da invenção incluem um grupo de modificação que é anexado à porção amina de um amino-sacarídeo, por exemplo, manosamina, glicosamina, galactosamina, ácido siálico etc. Exemplos de cassetes de grupo de modificação-grupo de ligação de glicosil intacto de acordo com esse motivo são baseados em uma estrutura de ácido siálico, como aquelas que têm as fórmulas:
Figure BRPI0717505B1_D0029
Figure BRPI0717505B1_D0030
Nas fórmulas acima, R1 e L são como acima descrito.
Detalhes adicionais sobre a estrutura de exemplo de grupos
R1 são fornecidos abaixo.
Ainda em uma modalidade de exemplo adicional, o conjugado é formado entre um peptídeo e um açúcar modificado em que o grupo de modificação é anexado através de um ligante na posição 6-carbono do açúcar modificado. Portanto, grupos de ligação de glicosil ilustrativos de acordo com essa modalidade têm a formula:
Figure BRPI0717505B1_D0031
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64/239 em que the radicais são como acima discutido. Grupos de ligação de glicosil incluem, sem imitação, glicose, glicosamina, N-acetil-glicosamina, galactose, galactosamina, N-acetilgalactosamina, manose, manosamina, N-acetil-manosamina, e outros.
Em uma modalidade, a presente invenção fornece um conjugado de peptideo que compreende o grupo de ligação de glicosil a seguir:
Figure BRPI0717505B1_D0032
em que D é um membro selecionado de -OH e R1-L-HN-; G é um membro selecionado de H e R1-L- e -C(O) (Ci-Ce) alquil;
R1 é uma porção que compreende um resíduo de poli(etileno glicol) de cadeia linear ou ramificada ; e L é um ligante, por exemplo, uma ligação (de ordem zero), alquil substituído ou não substituído e heteroalquil substituído ou não substituído. Em modalidades de exemplo, quando D é OH, G é R1-L-, e quando G é -C(O) (Ci-C6) alquil, D é Ri-LNH- .
Em uma modalidade, a presente invenção fornece um conjugado de peptideo que compreende o seguinte grupo de ligação de glicosil:
Figure BRPI0717505B1_D0033
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D é um membro selecionado de -OH e R1-L-HN-; G é um membro selecionado de Ri-L- e -C(O) (Ci-Ce) alquil-R1; R1 é uma porção que compreende um membro selecionado de um resíduo de poli(etileno glicol) de cadeia linear e resíduo de poli(etileno glicol) ramificado; e M é um membro selecionado de H, um contra-íon de sal e uma carga negativa única; L é um ligante que é um membro selecionado de uma ligação, alquil substituído ou não substituído e heteroalquil substituído ou não substituído. Em uma modalidade de exemplo, quando D é OH, G é R1-L-. Em outra modalidade de exemplo, quando G é — C(O) (Ci-Ce) alquil, D é R1-L-NH-.
Em qualquer um dos compostos da invenção, um grupo COOH pode ser alternativamente COOM, em que M é um membro selecionado de H, uma carga negativa, e um contra-íon de sal
A invenção fornece um conjugado de peptídeo que inclui um grupo de ligação de glicosil que tem a fórmula:
Figure BRPI0717505B1_D0034
em que D e G são como acima descritos.
Em outras modalidades o grupo de ligação de glicosil tem a fórmula:
Figure BRPI0717505B1_D0035
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66/239 em que D e G são como acima descrito e o índice t
Ainda em outra modalidade de exemplo o grupo de ligação de glicosil tem a fórmula:
Figure BRPI0717505B1_D0036
em que D e G são como acima descrito e o índice t
Ainda em outra modalidade, o grupo de ligação de glicosil tem a fórmula:
Figure BRPI0717505B1_D0037
acima descrito em que D e G são como e o índice representa um número inteiro de 1 a 10; e
Em outra modalidade de exemplo conj ugado de peptideo compreende uma porção glicosil selecionada das fórmulas:
{OCH^CH^A1 CAW
OH
OH
OH
R1’-Xí
R17 — X4
Figure BRPI0717505B1_D0038
R3
Fr
R2
OAÍ(CH?GH5Q), (CAsA8)(
--AT
OH
OH
OH
CA10 A11 (CAW)k
Figure BRPI0717505B1_D0039
R4
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Figure BRPI0717505B1_D0040
Figure BRPI0717505B1_D0041
Figure BRPI0717505B1_D0042
(OGHjCH^A1 ca3a* (CAsAe)j
Aa(CHsCH2O)m--A7 (CAaA\
CA10 A11 l„
Figure BRPI0717505B1_D0043
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Figure BRPI0717505B1_D0044
Figure BRPI0717505B1_D0045
Figure BRPI0717505B1_D0046
Figure BRPI0717505B1_D0047
(OCH^CHjJnOCHj
Figure BRPI0717505B1_D0048
Figure BRPI0717505B1_D0049
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69/239 (qaW)]
A£(CH2CH2OU
OH
Figure BRPI0717505B1_D0050
Figure BRPI0717505B1_D0051
Figure BRPI0717505B1_D0052
Figure BRPI0717505B1_D0053
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Figure BRPI0717505B1_D0054
Figure BRPI0717505B1_D0055
Figure BRPI0717505B1_D0056
Figure BRPI0717505B1_D0057
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Figure BRPI0717505B1_D0058
(OCH2CH3)PA'
CAaA4 (CAW), OH
Az(CHj,CHsOU
Figure BRPI0717505B1_D0059
R1
Figure BRPI0717505B1_D0060
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Figure BRPI0717505B1_D0061
Figure BRPI0717505B1_D0062
Figure BRPI0717505B1_D0063
Figure BRPI0717505B1_D0064
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Figure BRPI0717505B1_D0065
Figure BRPI0717505B1_D0066
(OCHjCHsJçjA1
Figure BRPI0717505B1_D0067
Figure BRPI0717505B1_D0068
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Figure BRPI0717505B1_D0069
Figure BRPI0717505B1_D0070
(ÜCHjCHAA'
Figure BRPI0717505B1_D0071
Figure BRPI0717505B1_D0072
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Figure BRPI0717505B1_D0073
Figure BRPI0717505B1_D0074
A^CHjCHaOU
Figure BRPI0717505B1_D0075
R4
Figure BRPI0717505B1_D0076
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Figure BRPI0717505B1_D0077
(OCH2CH2)nOCHa
Figure BRPI0717505B1_D0078
Figure BRPI0717505B1_D0079
(OCHoCHAA1
Figure BRPI0717505B1_D0080
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Figure BRPI0717505B1_D0081
Figure BRPI0717505B1_D0082
(OGHjCH^A1
CA3A4 0H
A^CH.CHjOJh,
--A7 (CAW)k
CA^A1'
La-----
Figure BRPI0717505B1_D0083
Figure BRPI0717505B1_D0084
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Figure BRPI0717505B1_D0085
Figure BRPI0717505B1_D0086
Figure BRPI0717505B1_D0087
A^CHjCHjOk
Figure BRPI0717505B1_D0088
Figure BRPI0717505B1_D0089
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Figure BRPI0717505B1_D0090
(OCHnCHjWXHij
Figure BRPI0717505B1_D0091
em que o índice a e o ligante La são como acima discutido. O índice p é um número inteiro de 1 a 10. Os índices tea são independentemente selecionados de 0 ou 1. Cada um desses grupos pode ser incluído como componentes das estruturas de sacarídeo mono-, bi, tri e tetraantenário acima apresentadas. AA é um resíduo de aminoácido do peptideo. Uma pessoa habilitada na técnica perceberá que a porção PEG nessas fórmulas pode ser substituída com outros grupo não reativo e porções poliméricas. Exemplos de polímeros incluem aqueles da família de óxido de poli(alquileno). Grupos não reativos incluem grupos que são considerados como sendo essencialmente não reativos, neutros e/ou estáveis em pH fisiológico, por exemplo, H, alquil substituído ou não substituído, heteroalquil substituído ou não substituído e outros. Um exemplo de porção polimérica inclui as estruturas ramificadas apresentadas na Fórmula Ilia e seus exemplares.
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Em uma modalidade de exemplo, a porção PEG tem um peso molecular de cerca de 20 kD. Em outra modalidade de exemplo, a porção PEG tem um peso molecular de cerca de 5 kD. Em outra modalidade de exemplo, a porção PEG tem um peso molecular de cerca de 10 kD. Em outra modalidade de exemplo, a porção PEG tem um peso molecular de cerca de 40 kD. Em outras modalidades, o grupo de modificação é um óxido de poli(alquileno) ramificado, por exemplo, poli (etileno glicol), que tem um peso molecular de pelo menos cerca de 80 kD, preferivelmente pelo menos cerca de 100 kD, mais preferivelmente pelo menos cerca de 120 kD, pelo menos cerca de 140 kD ou pelo menos cerca de 160 kD. Ainda em outra modalidade, o óxido de poli(alquileno) ramificado, por exemplo, poli(etileno glicol) é pelo menos cerca de 200 kD, como de pelo menos cerca de 80 kD a pelo menos cerca de 200 kD, incluindo pelo menos cerca de 160 kD e pelo menos cerca de 180 kD. Em uma modalidade de exemplo,
o polímero ramificado é em si anexado a uma porção de
ramificação (por exemplo , cisteína, serina, lisina, e
oligômeros de lisina).
Em uma modalidade de exemplo, o grupo de ligação de
glicosil é uma porção de SA-PEG-10 kD ramificado com base em um resíduo de cisteína, e um ou dois desses grupos de ligação de glicosil são covalentemente ligados ao peptídeo. Em outra modalidade de exemplo, o grupo de ligação de glicosil é uma porção de SA-PEG-10 kD ramificado com base em um resíduo de lisina, e um ou dois desses grupos de ligação de glicosil são covalentemente ligados ao peptídeo. Em uma modalidade de exemplo, o grupo de ligação de glicosil é uma porção de SA-PEG-10 kD ramificado com base
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81/239 em um resíduo de cisteína, e um ou dois desses grupos de ligação de glicosil são covalentemente ligados ao peptídeo. Em uma modalidade de exemplo, o grupo de ligação de glicosil é uma porção de SA-PEG-10 kD ramificado com base em um resíduo de lisina, e um ou dois desses grupos de ligação de glicosil são covalentemente ligados ao peptídeo. Em uma modalidade de exemplo, o grupo de ligação de glicosil é uma porção de SA-PEG-5 kD ramificado com base em um resíduo de cisteína, e um, dois ou três desses grupos de ligação de glicosil são covalentemente ligados ao peptídeo. Em uma modalidade de exemplo, o grupo de ligação de glicosil é uma porção de SA-PEG-5 kD ramificado com base em um resíduo de lisina, e um, dois ou três desses grupos de ligação de glicosil são covalentemente ligados ao peptídeo. Em uma modalidade de exemplo, o grupo de ligação de glicosil é uma porção de SA-PEG-40 kD ramificado com base em um resíduo de cisteína, e um ou dois desses grupos de ligação de glicosil são covalentemente ligados ao peptídeo. Em uma modalidade de exemplo, o grupo de ligação de glicosil é uma porção de SA-PEG-40 kD ramificado com base em um resíduo de lisina, e um ou dois desses grupos de ligação de glicosil são covalentemente ligados ao peptídeo.
Em outra modalidade de exemplo, o conjugado de peptídeo compreende uma porção de glicosil selecionada das fórmulas:
Figure BRPI0717505B1_D0092
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R5
R4R2
Figure BRPI0717505B1_D0093
í; e R5 em que pelo menos um de R2, R3, R4, R5 ou R6 tem uma estrutura que é um membro selecionado de
Figure BRPI0717505B1_D0094
(CA5A6)j
A2(CH2CH2O)m (CA8A9)k em que as variáveis são como acima descrito, aqueles habilitados perceberão que a confiança em estruturas de PEG ramificado acima apresentadas é simplesmente para clareza de ilustração, o PEG pode ser substituído por substancialmente qualquer porção polimérica, incluindo, sem limitação aquelas espécies apresentadas na definição de porção polimérica aqui encontrada.
Em uma modalidade de exemplo, pelo menos um de R2, R3, R4, R5 ou R6 tem uma estrutura de acordo com a seguinte fórmula:
Figure BRPI0717505B1_D0095
Figure BRPI0717505B1_D0096
H
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Em uma modalidade de exemplo, A1 e A2 são selecionados de -OH e -OCH3.
Exemplos de grupos de modificação poliméricos de acordo com essa modalidade incluem:
CH3O(CH,CH2O)m
Figure BRPI0717505B1_D0097
Figure BRPI0717505B1_D0098
Em uma modalidade de exemplo, apenas um de R2, R3, R4,
R5 ou R6 tem uma estrutura que inclui os grupos de modificação acima descritos.
Em outra modalidade de exemplo, o conjugado de peptídeo compreende uma porção de glicosil selecionada das fórmulas:
OH
Figure BRPI0717505B1_D0099
Figure BRPI0717505B1_D0100
?
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Figure BRPI0717505B1_D0101
em que R2, R3, R4, R5 ou R6 são como acima descrito.
Em outra modalidade de exemplo, o conjugado de peptídeo compreende uma porção de glicosil selecionada das fórmulas:
Figure BRPI0717505B1_D0102
Figure BRPI0717505B1_D0103
em que L-(R2)W é um membro selecionado de
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R1B-X2 x5—c
R17—X4 (OCHiCH^A1 ca3a4
I 5 6 (CA5As)j
A2(CHzCH;,O)m--A7 (CA8A9)k c/A’a11 t.
em que as variáveis são como acima descrito.
Em uma modalidade de exemplo, L-(R2)W tem uma estrutura de acordo com a seguinte fórmula:
Figure BRPI0717505B1_D0104
Em uma modalidade de exemplo, A1 e A2 são selecionados de -OH e -OCH3.
Exemplos de grupos de modificação poliméricos de acordo com essa modalidade incluem:
Figure BRPI0717505B1_D0105
Figure BRPI0717505B1_D0106
Em uma modalidade de exemplo, men são números
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86/239 inteiros independentemente selecionados de cerca de 1 a cerca de 1.000. Em uma modalidade de exemplo, men são números inteiros independentemente selecionados de cerca de 1 a cerca de 500. Em uma modalidade de exemplo, men são números inteiros independentemente selecionados de cerca de 1 a cerca de 70, cerca de 70 a cerca de 150, cerca de 150 a cerca de 250, cerca de 250 a cerca de 375 e cerca de 375 a cerca de 500. Em uma modalidade de exemplo, men são números inteiros independentemente selecionados de cerca de 10 a cerca de 35, cerca de 45 a cerca de 65, cerca de 95 a
cerca de 130 , cerca de 210 a cerca de 2 4 0, cerca de 310 a
cerca de 370 e cerca de 420 a cerca de 480. Em uma
modalidade de exemplo, m e n são números inteiros
selecionados de cerca de 15 a cerca de 30. Em uma
modalidade de exemplo, m e n são números inteiros
selecionados de cerca de 50 a cerca de 65. Em uma
modalidade de exemplo, m e n são números inteiros
selecionados de cerca de 100 a cerca de 130. Em uma
modalidade de exemplo, m e n são números inteiros
selecionados de cerca de 210 a cerca de 240. Em uma
modalidade de exemplo, m e n são números inteiros
selecionados de cerca de 310 a cerca de 370. Em uma
modalidade de exemplo, m e n são números inteiros
selecionados de cerca de 430 a cerca de 470.
Em outra modalidade de exemplo, o conjugado de peptídeo compreende uma porção de glicosil selecionada das fórmulas:
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Figure BRPI0717505B1_D0107
O
Figure BRPI0717505B1_D0108
(R1)„-L-NH em que as variáveis são como acima descrito.
Em outra modalidade de exemplo, espécies de acordo com essa modalidade incluem:
Figure BRPI0717505B1_D0109
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Confidencial
Figure BRPI0717505B1_D0110
Figure BRPI0717505B1_D0111
Figure BRPI0717505B1_D0112
em que as variáveis são as acima discutidas.
Em uma modalidade de exemplo, um conjugado de peptídeo glicopeguilado da invenção é selecionado das fórmulas apresentadas abaixo:
‘'V' tFuç), Man—{GlcNAc-Galt-R1*'
I i i
AA— G IlN Al---GlcNAc--M an jJv Míin
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89/239
Man
AA — GlcNAc GlcNAc — Man
Man--- (GlcNAc — Galjp-R15' (FUC),
Μ3Π--(GlcNAc—Gal)F —R’&
AA —GlcNAc — GltzN Ac--Man
Man--- (GlcNAc—Gal^—R14' (GlcNAc-Gal^-R’1' (Fuc>
Man---(GlcNAc — Ga l)p—Rli_
AA— G IcNAç·— GlcNAc—Man
Man---(GlcNAc—Gal^-R15' (FucX
Man---(GlcNAc—Ga^—R16'
AA—GlcNAc—GlcNAc—Man
Man--- (GlcNAc—Galjp—R15·' (GlcNAc-Ga>)p-R15'
[GlcNAc—Gal^—R15- (Fucfc
Man---(GlcNAc—Gal^—R15'
AA— GlcNAc — GlcNAc—Man
Man--- (GlcNAc— Gal^—R1Í' {GlcNAc— GalJjj—R15' em que as variáveis são como acima descrito.
Nas fórmulas acima, o índice t é um número inteiro e 0 a 1 e o índice p é um número inteiro de 1 a 10. O símbolo
R15' representa H, OH (por exemplo
Gal-OH), uma porção sialil um grupo de ligação de sialil (ou seja, grupo de ligação de sialil-grupo de modificação polimérico (Sia-LR1) , ou uma porção sialil à qual é ligada uma porção de sialil modificada por polímero (por exemplo, Sia-Sia-L-R1) uma porção galactosil, um grupo de ligação de galactosil (ou seja, grupo de ligação de galactosil
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90/239 grupo de modificação polimérico (Gal-L-R1) , ou uma porção de sialil à qual é ligada uma porção de galactosil modificada por polímero (por exemplo, Sia-Gal-L-R1) (SiaGalp) ) , uma porção galactosaminil, um grupo de ligação de galactosaminil (ou seja, grupo de ligação de galactosaminil -grupo de modificação polimérico (GalNAc-L-R1) , ou uma porção sialil à qual é ligada uma porção galactosaminil modificada por polímero (por exemplo, Sia-GalNAc-L-R1) (Sia-GalNAcp) ) , uma porção glicosil, um grupo de ligação de glicosil (ou seja, grupo de ligação de glicosil -grupo de modificação polimérico (Glc-L-R1) , ou uma porção sialil à qual é ligada uma porção glicosil modificada 'por polímero (por exemplo, Sia-Glc-L-R1) (Sia-GlcP) ) , uma porção glicosaminil, um grupo de ligação de glicosaminil (ou seja, grupo de ligação de glicosaminil -grupo de modificação polimérico (GlcNAc-L-R1) , ou uma porção sialil à qual é ligada uma porção glicosaminil modificada por polímero (por exemplo, Sia-GlcNAc-L-R1) (Sia-GlcNAcp) ) , uma porção manosil, um grupo de ligação de manosil (ou seja, grupo de ligação de manosil -grupo de modificação polimérico (Man-L-R1) , ou uma porção sialil à qual é ligada uma porção manosil modificada por polímero (por exemplo, Sia-Man-L-R1) (Sia-Manp) ) , uma porção fucosil, um grupo de ligação de fucosil (ou seja, grupo de ligação de fucosil -grupo de modificação polimérico (Fuc-L-R1), ou uma porção sialil à qual é ligada uma porção fucosil modificada por polímero (por exemplo, Sia-Fuc-L-R1) (Sia-Fucp) ) . Exemplos de porções sacaril modificadas por polímero têm a estrutura de acordo com Fórmulas I, Ia, II ou Ila. Um exemplo de conjugado de peptídeo da invenção incluirá pelo
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91/239 menos um glicano que tem um R15' que inclui a estrutura de acordo com Fórmulas I, Ia, II e lia. O oxigênio, com a Valencia aberta, de Fórmulas I, Ia, II ou lia é preferivelmente anexado através de uma ligação glicosídica a um carbono de uma porção Gal ou GalNAc. Em uma modalidade de exemplo adicional, o oxigênio é anexado ao carbono na posição 3 de um resíduo de galactose. Em um exemplos de modalidade, o ácido siálico modificado é ligado a2,3- ao resíduo de galactose. Em outra modalidade de exemplo, o ácido siálico é ligado a2,6-ao resíduo de galactose.
Em uma modalidade de exemplo, o grupo de ligação de sialil é uma porção sialil à qual é ligada uma porção sialil modificada por polímero (por exemplo, Sia-Sia-L-R1) (Sia-Siap) . Aqui, o grupo de ligação de glicosil é ligado a uma porção galactosil através de uma porção sialil:
-----Ga I-----3 ia-----5 ia-----L-----R1
Um exemplo de espécie de acordo com esse motivo é preparado por conjugação de Sia-L-R1 a um ácido siálico terminal de um glicano usando uma enzima que forma ligações Sia-Sia, por exemplo, CST-II, ST8Sia-II, ST8Sia-III e ST8Sia-IV.
Em outra modalidade de exemplo, os glicanos nos conjugados de peptídeo têm a fórmula que é selecionada do grupo:
[FucJ, Man
I I I
AA— GlcNAc —GlcNAc—Man jJv Man---GlcNAc—Gal---R1Í !
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92/239 ''y'* (Fuc\ Man—GlcNAc— GalR
AA— GlcNAc —GlcNAc— Man
I
Mín (FucJt Man---GlcNAc—GalR
I iI
AA—GlcNAc—GlcNAc—Man;
,/ΰν Man---GlcNAc—GalR e combinações desses
Em cada uma das fórmulas acima, R15' é como acima discutido. Além disso, um exemplo de conjugado de peptídeo da invenção incluirá pelo menos um glicano com uma porção R15 que tem a estrutura de acordo com Fórmulas I, Ia, II ou Ila.
Em outra modalidade de exemplo, o grupo de ligação de glicosil compreende pelo menos um grupo de ligação de glicosil que tem a fórmula:
(GlcNAc---Gal)p---R15 ; e (GlcNAc---Gal)p---Sia----R16 em que R15 é o referido grupo de ligação de sialil; e o índice p é um número inteiro selecionado de 1 a 10.
Em uma modalidade de exemplo, a porção de ligação de glicosil tem a fórmula:
Figure BRPI0717505B1_D0113
o em que b é um número inteiro de 0 a 1. O índice s representa um número inteiro de 1 a 10; e o índice f representa um número inteiro de 1 a 2.500.
Em uma modalidade de exemplo, o grupo de modificação polimérico é PEG. Em outra modalidade de exemplo, a porção
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PEG tem um peso molecular de cerca de 20 kD. Em outra modalidade de exemplo, a porção PEG tem um peso molecular de cerca de 5 kD. Em outra modalidade de exemplo, a porção PEG tem um peso molecular de cerca de 10 kD. Em outra modalidade de exemplo, a porção PEG tem um peso molecular de cerca de 40 kD. Em outras modalidades, o grupo de modificação é um óxido de poli(alquileno) ramificado, por exemplo, poli(etileno glicol), que tem um peso molecular de pelo menos cerca de 80 kD, preferivelmente pelo menos cerca de 100 kD, mais preferivelmente pelo menos cerca de 120 kD, pelo menos cerca de 140 kD ou pelo menos cerca de 160 kD. Ainda em outra modalidade, o óxido de poli(alquileno) ramificado, por exemplo, poli(etileno glicol) tem pelo menos cerca de 200 kD, como de pelo menos cerca de 80 kD a pelo menos cerca de 200 kD, incluindo pelo menos cerca de 160 kD e pelo menos cerca de 180 kD.
Em uma modalidade de exemplo, o grupo de ligação de glicosil é uma porção de SA-PEG-10 kD linear, e um ou dois desses grupos de ligação de glicosil são covalentemente ligados ao peptideo. Em outra modalidade de exemplo, o grupo de ligação de glicosil é uma porção SA-PEG-20 kD linear, e um ou dois desses grupos de ligação de glicosil são covalentemente ligados ao peptideo. Em uma modalidade de exemplo, o grupo de ligação de glicosil é uma porção SAPEG-5 kD linear, e um, dois ou três desses grupos de ligação de glicosil são covalentemente ligados ao peptideo. Em uma modalidade de exemplo, o grupo de ligação de glicosil é uma porção SA-PEG-40 kD linear, e um ou dois desses grupos de ligação de glicosil são covalentemente ligados ao peptideo.
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Em outra modalidade de exemplo, o grupo de ligação de glicosil é um grupo de ligação de sialil que tem a fórmula:
Figure BRPI0717505B1_D0114
Em outra modalidade de exemplo, Q é um membro selecionado de H e CH3. Em outra modalidade de exemplo, em que o referido grupo de ligação de glicosil tem a fórmula:
(GlcNAc---Gal)p--(GlcNAc---Gal)p---Sia
R15 em que R15 é o referido grupo de ligação de sialil; e o índice p é um número inteiro selecionado de 1 a 10. Em uma modalidade de exemplo, o grupo de ligação de glicosil compreende a fórmula:
Figure BRPI0717505B1_D0115
OH
OH
O em que o índice b é um número inteiro selecionado de 0 e 1. Em uma modalidade de exemplo, o índice s é 1; e o índice f é um número inteiro selecionado de cerca de 200 a cerca de 300.
II. D. Grupos de modificação
O conjugados de peptídeo da invenção compreende um grupo de modificação. Esse grupo pode ser covalentemente ligado a um peptídeo através de um aminoácido ou um grupo de ligação de glicosil. Em outra modalidade de exemplo,
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95/239 quando o grupo de modificação inclui a porção:
(OCH2CH2)nA1 CAW (CA5A6)j
Az(CH2CH2O)rn--A7 (CAW)h CA10A11 I s La—ξ e o peptideo no conjugado de peptideo é um membro selecionado dos peptídeos na FIG. 7. Em outra modalidade de exemplo, o peptideo no conjugado de peptideo é um membro selecionado das proteínas morfogênicas do osso (por exemplo, BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14, BMP15), neurotrofinas (por exemplo, NT-3, NT-4, NT-5), fatores de diferenciação do crescimento (por exemplo, GDF-5), fator neurotrófico derivado de linhagem de células (GDNF), fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), fator de crescimento de nervos (NGF), fator de von Willebrand (vWF) protease, Fator VII, Fator Vila, Fator VIII, Fator IX, Fator X, Fator XI, Fator VIII de domínio B deletado, proteína de fusão de vWF-Fator VIII que tem Fator VIII de comprimento total, proteína de fusão de vWF-Fator VIII tendo Fator VIII de domínio B deletado, eritropoietina (EPO), fator estimulante de colônia de granulócitos (GCSF) , Fator estimulante de colônia de granulócitosmacrófagos (GM-CSF), interferon alfa, interferon beta, interferon gama, al-antitripsina (ATT, ou inibidor de a-1 protease), glicocerebrosidase, Ativador de plasminogênio de tipo tecidual (TPA), Interleucina-2 (IL-2), uroquinase,
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DNase humana, insulina, Proteína de superfície de Hepatite
B (HbsAg) hormônio do crescimento humano, proteína de fusão de receptor de TNF-região Fc de IgG (Enbrel™) anticorpo monoclonal anti-HER2 (Herceptin™) , anticorpo monoclonal para Proteína F de Vírus Sincicial Respiratório (Synagis™) anticorpo monoclonal para TNF-α (Remicade™) anticorpo monoclonal para glicoproteína
Ilb/IIIa (Reopro™) anticorpo monoclonal para CD20 (Rituxan™) anti-trombina III (AT III) gonadotrofina coriônica humana (hCG), alfa-galactosidase (Fabrazyme™), alfa-iduronidase (Aldurazyme™) hormônio folículo-estimulante betaglicosidase, anticorpo monoclonal anti-TNF-alfa, peptídeo-1 semelhante a glucagon (GLP-1), peptídeo-2 semelhante a glucagon (GLP-2), beta-glicosidase, alfa-galactosidase A, e fato de crescimento de fibroblastos.
Grupos de modificação podem englobar uma variedade de estruturas que incluem porções de direcionamento, porções terapêuticas biomoléculas. Adicionalmente grupos de modificação incluem grupos de modificação poliméricos, que são polímeros que podem alterar uma propriedade do peptídeo como sua biodisponibilidade ou sua meia-vida no corpo.
Em uma modalidade de exemplo o grupo de modificação polimérico tem uma estrutura que inclui uma porção de acordo com as seguintes fórmulas:
(OCH.CH^A1
Figure BRPI0717505B1_D0116
Figure BRPI0717505B1_D0117
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Em outra modalidade de exemplo de acordo com a fórmula acima, o grupo de modificação polimérico inclui uma porção de acordo com a seguinte fórmula:
M (OCH2CH,>nA1
A2(CH2CHZO)
Figure BRPI0717505B1_D0118
Em uma modalidade de exemplo, A1 e A2 são membros selecionados de -OH and —OCH3.
Exemplos de grupos de modificação poliméricos de acordo com essa modalidade incluem a porção:
Figure BRPI0717505B1_D0119
Para objetivos de
CH^CH.CH.QU
Figure BRPI0717505B1_D0120
grupos de modificação no de modificação insolúveis em restante dessa seção será baseado em grupos poliméricos como polímeros hidrossolúveis e água, no entanto, uma pessoa habilitada na técnica reconhecerá que outros grupos de modificação, como porções de direcionamento, porções terapêuticas e biomoléculas, podem ser usados no lugar dos grupos de modificação poliméricos. Em adição, aqueles habilitados perceberão que a confiança em estruturas de PEG ramificado acima apresentadas é simplesmente para clareza de
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98/239 ilustração, o PEG pode ser substituída por substancialmente qualquer porção polimérica, incluindo, sem limitação àquelas espécies apresentadas na definição de porção polimérica aqui encontrada.
II. D. i. Ligantes dos grupos de modificação
Os ligantes do grupo de modificação servem para anexar o grupo de modificação (ou seja, grupos de modificação poliméricos, porções de direcionamento, porções terapêuticas e biomoléculas) ao peptídeo. Em uma modalidade de exemplo, o grupo de modificação polimérico é ligado a um grupo de ligação de glicosil, geralmente através de um heteroátomo, por exemplo, nitrogênio, no núcleo através de um ligante, L, como mostrado abaixo:
(R1)*—L-R1 é uma porção polimérica e L é selecionado de uma ligação e um grupo de ligação. O índice w representa um número inteiro selecionado de 1-6, preferivelmente 1-3 e mais preferivelmente 1-2. Exemplos de grupos de ligação incluem porções de alquil substituído ou não substituído, heteroalquil substituído ou não substituído e ácido siálico. Um exemplo de componente do ligante é uma porção acil.
Um composto de exemplo de acordo com a invenção tem uma estrutura de acordo com as Fórmulas I, Ia, II ou lia acima, em que pelo menos um de R2, R3, R4, R5, R6 ou R6' tem a fórmula:
Figure BRPI0717505B1_D0121
Em outro exemplo de acordo com essa modalidade pelo
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99/239 menos um de R2, R3, R4, R5, R6 ou R6' tem a fórmula:
|---ΝΗϋ(Ο)(0Η2)κ—NHC(O) R1 em que s é um número inteiro de 0 a 20 e R1 é uma porção de modificação polimérica linear.
Em uma modalidade de exemplo, a construção de grupo de modificação polimérico-ligante é uma estrutura ramificada que inclui duas ou mais cadeias poliméricas anexadas à porção central. Nessa modalidade preferida, a construção tem a fórmula:
(R1L·-----l-----1 em que R1 e L são como acima discutidos e w' é um número inteiro de 2 a 6, preferivelmente de 2 a 4 e mais preferivelmente de 2 a 3.
Quando L é uma ligação, ele é formado entre um grupo
funcional reativ' o em um precursor de R1 e um grupo
funcional reativo de reatividade complementar no núcleo do
sacaril. Quando L é um ligante de ordem não zero, um
precursor de L pode estar no lugar em uma porção de
glicosil antes da reação com o precursor de R1.
Alternativamente, os precursores de R1 e L podem ser
incorporados em um cassete pré-formado que é subseqüentemente anexado a uma porção de glicosil. Como apresentado nessa, a seleção e preparação de precursores com grupos funcionais reativos adequados estão dentro da capacidade daqueles habilitados na técnica. Além disso, a ligação de precursores prossegue por química que é bem compreendida na técnica.
Em uma modalidade de exemplo, L é um grupo de ligação
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100/239 que é formado a partir de um aminoácido, ou peptideo pequeno (por exemplo, 1-4 resíduos de aminoácido) gerando um açúcar modificado em que o grupo de modificação polimérico é anexado através de um ligante de alquil substituído. Exemplos de ligantes incluem glicina, lisina, serina e cisteína. A porção PEG pode ser anexada à porção de amina do ligante através de uma ligação de amida ou uretano. O PEG é ligado aos átomos de enxofre ou oxigênio de cisteína e serina através de ligações de tioéter ou éter, respectivamente.
Em uma modalidade de exemplo, R5 inclui o grupo de modificação polimérico. Em outra modalidade de exemplo, R5 inclui o grupo de modificação polimérico e um ligante, L, que une o grupo de modificação ao restante da molécula. Como acima discutido, L pode ser uma estrutura linear ou ramificada. De modo similar, o grupo de modificação polimérico pode ser ramificado ou linear.
II. D. ii. Polímeros hidrossolúveis
Vários polímeros hidrossolúveis são conhecidos por aqueles habilitados na técnica e são úteis na prática da presente invenção. O termo polímero hidrossolúvel engloba espécies como sacarídeos (por exemplo, dextrano, amilose, ácido hialurônico, ácido poli(siálico) , heparanos, heparinas etc.); poli (aminoácidos) , por exemplo, ácido poli(aspártico) e ácido poli(glutâmico); ácidos nucleicos; polímeros sintéticos (por exemplo, ácido poli(acrílico), poli (éteres), por exemplo, poli(etileno glicol); peptídeos, proteínas e outros. A presente invenção pode ser praticada com qualquer polímero hidrossolúvel com a única limitação sendo que o polímero deve incluir um ponto em que o
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101/239 restante do conjugado possa ser anexado.
Métodos para ativação de polímeros também podem ser encontrados em WO 94/17039, Pat. U.S. No. 5.324.844, WO 94/18247, WO 94/04193, Pat. U.S. No. 5.219.564, Pat. U.S. No. 5.122.614, WO 90/13540, Pat. U.S. No. 5.281.698, e mais WO 93/15189, e para a conjugação entre polímeros ativados e peptídeos, por exemplo, Fator de coagulação VIII (WO 94/15625), hemoglobina (WO 94/09027), molécula que porta oxigênio (Pat. U.S. No. 4.412.989), ribonuclease e superóxido dismutase (Veronese e cols., App. Bíochem. Biotech. 11: 141-45 (1985)).
Exemplos de polímeros hidrossolúveis são aqueles em que uma proporção substancial das moléculas do polímero em uma amostra do polímero são de aproximadamente o mesmo peso molecular; uma vez que polímeros são homodispersos.
A presente invenção é também ilustrada por referência a um conjugado de poli(etileno glicol). Várias revisões e monografias sobre a funcionalização e conjugação de PEG são disponíveis. Veja, por exemplo, Harris, Macromol. Chem. Phys. C25: 325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987); Wong e cols., Enzyme Microb. Technol. 14: 866-874 (1992); Delgado e cols., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995); and Bhadra, e cols., Pharmazie, 57:5-29 (2002) . Vias para a preparação de moléculas reativas de PEG e formação de conjugados que usam as moléculas reativas são conhecidas na técnica. Por exemplo, Patente U.S. No. 5.672.662 revela um conjugado a hidrossolúvel e isolável de um éster ativo de um ácido de polímero selecionado de óxidos de poli(alquileno) , polióis
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102/239 poli(oxietilados) , alcoóis poli(olefínicos) , e poli(acrilomorfolino) lineares ou ramificados.
A Patente U.S. No. 6.376.604 apresenta um método para a preparação de éster de 1-benzotriazolilcarbonato hidrossolúvel de um polímero hidrossolúvel e não peptídico por reação de um hidroxil terminal do polímero com di(lbenzotriazoil)carbonato em um solvente orgânico. O éster ativo é usado para formar conjugados com um agente biologicamente ativo como uma proteína ou peptídeo.
WO 99/45964 descreve um conjugado que compreende um agente biologicamente ativo e um polímero hidrossolúvel ativado que compreende um esqueleto de polímero que tem pelo menos um terminal ligado ao esqueleto do polímero através de uma ligação estável, em que pelo menos um terminal compreende uma porção de ramificação que tem grupos reativos proximais ligados à porção de ramificação, em que o agente biologicamente ativo é ligado a pelo menos um dos grupos reativos proximais. Outros poli(etileno glicóis) ramificados são descritos em WO 96/21469, Patente U.S. No. 5.932.462 descreve um conjugado formado com uma molécula de PEG ramificado que inclui um terminal ramificado que inclui grupos funcionais reativos. Os grupos livres reativos são disponíveis para reagir com uma espécie biologicamente ativa, como uma proteína ou peptídeo, formando conjugados entre o poli(etileno glicol) e a espécie biologicamente ativa. A Patente U.S. No. 5.446.090 descreve um ligante de PEG bifuncional e seu uso na formação de conjugados que têm um peptídeo em cada um dos terminais de ligante de PEG.
Conjugados que incluem ligações degradáveis de PEG são
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descritos em WO 99/34833; e WO 99/14259, bem como na
Patente U.S. No. 6.348.558. Tais ligações degradáveis são
aplicáveis na presente invenção.
Os métodos reconhecidos na técnica de ativação de
polímero acima apresentados são de uso no contexto da
presente invenção na formação dos polímeros ramificados aqui apresentados e também para a conjugação desses polímeros ramificados a outras espécies, por exemplo, açúcares, nucleotídeos de açúcar e outros.
Um exemplo de polímero hidrossolúvel é poli(etileno glicol), por exemplo, metoxi poli(etileno glicol). O poli(etileno glicol) usado na presente invenção não é restrito a qualquer forma particular ou faixa de peso molecular. Para moléculas de poli(etileno glicol) não ramificado o peso molecular é preferivelmente entre 500 e 100.000. Um peso molecular de 2.000-60.000 é preferivelmente usado e preferivelmente de cerca de 5.000 a cerca de 40.000.
II. D. iii. Polímeros hidrossolúveis ramificados
Em outra modalidade a porção de modificação polimérica é uma estrutura de PEG ramificado que tem mais de uma porção de PEG linear ou ramificado anexada. Exemplos de PEGs ramificados são descritos na Pat. U.S. No. 5.932.462; Pat. U.S. No. 5.342.940; Pat. U.S. No. 5.643.575; Pat. U.S. No. 5.919.455; Pat. U.S. No. 6.113.906; Pat. U.S. No. 5.183.660; WO 02/09766; Kodera Y., Bioconjugate Chemistry 5: 283-288 (1994); e Yamasaki e cols., Agric. Biol. Chem., 52: 2.125-2.127, 1998.
Porções de modificação de polímero representativas incluem estruturas que são baseadas em aminoácidos que
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104/239 contêm cadeia lateral, por exemplo, serina, cisteína, lisina, e peptídeos pequenos, por exemplo, lys-lys. Em algumas modalidades, a porção de modificação polimérica é uma porção de PEG ramificado que é baseada em um oligopeptídeo, como um peptídeo tri-lisina. Exemplos de aminoácidos adequados para uso incluem lisina, cisteína, e serina. Em tais modalidades, cada subunidade polimérica anexada à estrutura do peptídeo pode ser uma porção de PEG linear ou uma porção de PEG ramificada. Por exemplo, a trilisina pode ser mono-, di-, tri-, ou tetra-PEG-ilada com porções de PEG linear, porções de PEG ramificadas, ou uma combinação de porções de PEG linear e ramificada. Exemplos de estruturas ramificadas incluem as seguintes porções:
Figure BRPI0717505B1_D0122
Figure BRPI0717505B1_D0123
Figure BRPI0717505B1_D0124
NHClOJCH/WOCHaCHíJfOCHi
Figure BRPI0717505B1_D0125
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Figure BRPI0717505B1_D0126
Figure BRPI0717505B1_D0127
Figure BRPI0717505B1_D0128
1---(CHjCHíOkCH,
NHCtOJCHhCHaOCI-ti
Figure BRPI0717505B1_D0129
O
Figure BRPI0717505B1_D0130
S---(CHaCHsOKCHj
NHCpjCHa
Aqueles habilitados perceberão que a amina livre mas estruturas de di-lisina também podem ser peguiladas através de uma ligação de amida ou uretano com uma porção de PEG linear ou uma porção de PEG ramificada.
Será percebido por uma pessoa habilitada na técnica que em adição às estruturas lineares de PEG acima mostradas, os polímeros ramificados exemplificados na seção prévia também podem ser anexados a uma porção de ramificação (por exemplo, cisteína, serina, lisina, e oligômeros de lisina) no lugar de uma ou mais das estruturas de PEG linear. Além disso, aqueles habilitados perceberão que a confiança nas estruturas de PEG acima apresentadas é simplesmente para clareza de ilustração, o
PEG pode ser substituído por substancialmente qualquer porção polimérica, que inclui, sem limitação, aquelas espécies apresentadas na definição de porção polimérica aqui encontrada.
PEG de qualquer peso molecular, por exemplo, 1 kD, 2 kD, 5 kD, 10 kD, 15 kD, 20 kD, 25 kD, 30 kD, 35 kD, 40 kD e 45 kD é de uso na presente invenção. PEG de um peso
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106/239 molecular maior também pode ser usado na presente invenção, incluindo até cerca de 200 kD, como pelo menos cerca de 180 kD, cerca de 160 kD, cerca de 140 kD, cerca de 120 kD, cerca de 100 kD, cerca de 90 kD, cerca de 80 kD, e cerca de 70 kD. Em certas modalidades o peso molecular de PEG é cerca de 80 kD. Em outras modalidades, o peso molecular de PEG é pelo menos cerca de 200 kD, pelo menos cerca de 180 kD, pelo menos cerca de 160 kD, ou pelo menos cerca de 140 kD.
Cada porção PEG da porção de modificação polimérica ramificada pode ter um peso molecular como acima definido ou o peso molecular total de todas as porções PEG da porção de modificação polimérica pode ser como acima definido. Por exemplo, em certas modalidades cada porção PEG da porção de modificação polimérica ramificada pode ser cerca de 80 kD ou o peso molecular total de todas as porções PEG da porção de modificação polimérica pode ser cerca de 80 kD. Do mesmo modo, em certas modalidades cada porção PEG da porção de modificação polimérica ramificada pode ser cerca de 200 kD ou o peso molecular total de todas as porções PEG da porção de modificação polimérica pode ser cerca de 200 kD.
Exemplos de espécies de acordo com essa modalidade têm as fórmulas:
o
HO'
NHC (ÜJOCHjCHXOCHjCHjJsÜCHj
HN.
NHC(O)OC H lCH2(OCHíCH2 JfOCHj
IHC (OJOCHiCHiiOCHjCHilfOCHa
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107/239
Figure BRPI0717505B1_D0131
em que os índices e, f and f' são números inteiros independentemente selecionados de 1 a 2.500; e os índices q, q' e q são números inteiros independentemente selecionados de 1 a 20.
Como será aparente para aqueles habilitados, os polímeros ramificados de uso na invenção incluem variações nos temas acima apresentados. Por exemplo o conjugado dilisina-PEG acima mostrado pode incluir três subunidades poliméricas, a terceira ligada à α-amina mostrada como não modificada na estrutura acima. De modo similar, o uso de uma tri-lisina funcionalizada com três ou quatro subunidades poliméricas rotuladas com uma porção de modificação polimérica em uma maneira desejada está dentro do escopo da invenção.
Como aqui discutido, o PEG de uso nos conjugados da invenção podem ser lineares ou ramificados. Um exemplo de precursor de uso para formar o PEG ramificado que contém conjugados de peptideo de acordo com essa modalidade da invenção tem a fórmula:
R16-X2 x5-c—X3'
R17-x4 any
Um outro exemplo de precursor de uso para formar o PEG ramificado que contém conjugados de peptideo de acordo com
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108/239 essa modalidade da invenção tem a fórmula:
(OCH2GH2)nA1
CA3A4
A2(GH2GH2O)m (CA5A6)j
--A7 (CAW)k
CA’°A” ([Uai
As espécies de polímero ramificado de acordo com essa fórmula são essencialmente polímeros hidrossolúveis puros. X3' é uma porção que inclui um grupo funcional reativo ionizável (por exemplo, OH, COOH, H2PO4, HSO3, HPOa, e sais desses etc.) ou outro grupo funcional reativo, por exemplo, infra. C é carbono. X5, R16 e R17 são independentemente selecionados de grupos não reativos e porções poliméricas (por exemplo óxido de poli(alquileno), por exemplo, PEG) . Grupos não reativos incluem grupos que são considerados como sendo essencialmente não reativos, neutros e/ou estáveis em pH fisiológico, por exemplo, H, alquil substituído ou não substituído, heteroalquil substituído ou não substituído e outros. Um exemplo de porção polimérica inclui as estruturas ramificadas apresentadas na Fórmula Ilia e seus exemplares. Uma pessoa habilitada na técnica perceberá que a porção PEG nessas fórmulas pode ser substituída com outros polímeros. Exemplos de polímeros incluem aqueles da família de óxido de poli(alquileno) (por exemplo, H, alquil não substituído, heteroalquil não substituído) e braços poliméricos (por exemplo, PEG) . X2 e
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X4 são fragmentos de ligação que são preferivelmente essencialmente não reativos sob condições fisiológicas, que pode ser as mesmas ou diferentes. Um exemplo de ligante não inclui porções aromáticas nem de éster. Alternativamente, essas ligações podem incluir uma ou mais porções que são desenhadas para se degradar sob condições fisiologicamente relevantes, por exemplo, ésteres, dissulfetos etc. X2 e X4 unem braços poliméricos R16 e R17 a C. Quando X3' reage com um grupo funcional reativo de reatividade complementar em um ligante, açúcar ou cassete ligante-açúcar, X3' é convertido a um componente de fragmento de ligação de X3.
Exemplos de fragmentos de ligação para X2, X3 e X4 são independentemente selecionados e incluem S, SC(O)NH, HNC(O)S, SC (O) O, O, NH, NHC(O), (O) CNH e NHC(O)O, e OC(O)NH, CH2S, CH2O , CH2CH2O, CH2CH2S, (CH2)oQ, (CH2)oS ou (CH2)oY'-PEG em que, Y' é S, NH, NHC(O), C(O)NH, NHC(O)O, OC(O)NH, ou O e o é um número inteiro de 1 a 50. Em uma modalidade de exemplo, os fragmentos de ligação X2 e X4 são fragmentos de ligação diferentes.
Em uma modalidade de exemplo, o precursor (Fórmula III), ou um derivado ativado desse, reage com, e assim se liga a um açúcar, um açúcar ativado ou um nucleotídeo de açúcar através de uma reação entre X3' e um grupo de reatividade complementar na porção de açúcar, por exemplo, uma amina. Alternativamente, X3' reage com um grupo funcional reativo em um precursor para ligante, L. Um ou mais de R2, R3, R4, R5, R6 ou R6' de Fórmulas I, Ia, II ou lia podem incluir a porção de modificação polimérica ramificada, ou essa porção ligada através de L.
Em uma modalidade de exemplo, o grupo de modificação
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110/239 polimérico tem uma estrutura que inclui uma porção de acordo com as seguintes fórmulas:
(OCHzCH^nA1
Figure BRPI0717505B1_D0132
Figure BRPI0717505B1_D0133
Em outra modalidade de exemplo de acordo com a fórmula acima, o polímero ramificado tem uma estrutura de acordo com a seguinte fórmula:
Figure BRPI0717505B1_D0134
Em uma modalidade de exemplo, A1 e A2 são selecionados de -OH e -OCH3.
Exemplos de grupos de modificação poliméricos de acordo com essa modalidade incluem a porção:
CH3O{CH,CH2O)m
Figure BRPI0717505B1_D0135
CH3O(CH2CH2OU-
Figure BRPI0717505B1_D0136
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Figure BRPI0717505B1_D0137
Em uma modalidade de exemplo, a porção:
É o braço do ligante, L. Nessa modalidade preferida, um exemplo de ligante é derivado de um aminoácido natural ou não natural, análogo de aminoácido ou mimético de aminoácido, ou um peptídeo pequeno formado a partir de uma ou mais de tais espécies. Por exemplo, certos polímeros ramificados encontrados nos compostos da invenção têm a fórmula:
O
Figure BRPI0717505B1_D0138
Figure BRPI0717505B1_D0139
Xa é um fragmento de ligação que é formado pela reação de um grupo funcional reativo, por exemplo, X3', em um precursor da porção de modificação polimérica ramificada e um grupo funcional reativo na porção de açúcar, ou um precursor para um ligante. Por exemplo, quando X3' é um ácido carboxílico, ele pode ser ativado e ligado diretamente a um grupo amina pendente a partir de um aminosacarídeo (por exemplo, Sia, GalNH2, GICNH2, ManNH2 etc.), formando Xa que é uma amida. Exemplos adicionais de grupos funcionais reativos e precursores ativados são descritos abaixo. O índice c representa um número inteiro de 1 a 10. Os outros símbolos têm a mesma identidade que aqueles acima discutidos.
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Em outra modalidade de exemplo, Xa é uma porção de ligação formada com outro ligante:
-----Xa---L1----X6--em que Xb é um segundo fragmento de ligação e é independentemente selecionado daqueles grupos apresentados para Xa, e , similar a L, L1 é uma ligação, alquil substituído ou não substituído ou heteroalquil substituído ou não substituído.
Exemplos de espécies para Xa e Xb incluem S, SC(O)NH, HNC(O)S, SC (O) O, O, NH, NHC(O), C(O)NH e NHC(O)O, e OC(O)NH.
Em outra modalidade de exemplo, X4 é uma ligação de peptídeo a R17, que é um aminoácido, di-peptídeo (por exemplo,, Lys-Lys) ou tri-peptídeo (por exemplo, Lys-LysLys) em que a porção alfa-amina (ies) e/ou heteroátomo(s) de cadeia lateral são modificados com a porção de modificação polimérica.
Em uma modalidade de exemplo adicional, os conjugados de peptídeo da invenção incluem uma porção, por exemplo, uma porção R15 que tem a fórmula que é selecionada de:
Figure BRPI0717505B1_D0140
Figure BRPI0717505B1_D0141
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113/239 (OCHjCH^A1
Figure BRPI0717505B1_D0142
(OCHjCH2)rA1
Figure BRPI0717505B1_D0143
AÍ(CH2CH2O}I
CH,
Figure BRPI0717505B1_D0144
Rs
Figure BRPI0717505B1_D0145
R3
R4
Vb
Figure BRPI0717505B1_D0146
(R6
A2(CH2CH2OU
Figure BRPI0717505B1_D0147
R4
Figure BRPI0717505B1_D0148
Figure BRPI0717505B1_D0149
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114/239
A^CHjCHjO)
Figure BRPI0717505B1_D0150
em que a identidade dos radicais representados pelos vários símbolos é a mesma que a discutida acima. La é ligação ou um ligante como acima discutido para L e L1 exemplo, porção alquil substituído ou não substituído heteroalquil substituído ou não substituído. Em modalidade de exemplo ácido siálico que é modificação polimérica uma por ou uma
La é uma porção funcionalizado como mostrado.
da cadeia lateral de com uma
Exemplos porção de de porções
La incluem cadeias de alquil substituído ou não substituído que incluem um ou mais OH ou
Ainda em outra modalidade de exemplo a invenção fornece conjugados de peptídeo que têm uma porção, por exemplo, uma porção fórmula:
R15 com
Figure BRPI0717505B1_D0151
VIΠ
Figure BRPI0717505B1_D0152
IX
A identidade dos radicais representados pelos vários símbolos é a mesma que a discutida acima.
Como aqueles habilitados perceberão, o braço de ligante nas
Fórmulas
VIII e IX é igualmente aplicável a outros açúcares modificados aqui apresentados. Em exemplos de modalidade
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115/239 as espécies de Fórmulas VIII e IX são as porções R15 anexadas às estruturas de glicano aqui apresentadas.
Ainda em outra modalidade de exemplo, o conjugado de peptídeo inclui uma porção R15 com uma fórmula que é um membro selecionado de:
Figure BRPI0717505B1_D0153
R em que as identidades dos radicais são como acima discutido.
Um exemplo de espécie para
La (CH2) jC (O) NH (CH2) hC (O) NH-, em que os índices são números inteiros independentemente selecionados de
Um exemplo adicional de espécies é —C(O)NH-. Os índices são números inteiros independentemente selecionados de 0 a 5.000. A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10 e A11, são membros independentemente selecionados de H, alquil substituído ou não substituído, heteroalquil substituído ou não substituído, cicloalquil substituído ou não substituído, heterocicloalquil substituído ou não substituído, aril substituído ou não substituído, heteroaril substituído ou não substituído, -NA12A13, -CA12 e -SiA12A13. A12 e A13 são membros independentemente
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116/239 selecionados de alquil substituído ou não substituído, heteroalquil substituído ou não substituído, cicloalquil substituído ou não substituído, heterocicloalquil substituído ou não substituído, aril substituído ou não substituído, e heteroaril substituído ou não substituído.
As modalidades da invenção acima apresentadas são também exemplificadas por referência a espécies em que o polímero é um polímero hidrossolúvel, particularmente poli(etileno glicol) (PEG), por exemplo, metoxi-poli(etileno glicol). Aqueles habilitados perceberão que o foco nas seções que se seguem é para clareza de ilustração e os vários motivos apresentados que usam PEG como um exemplo de polímero são igualmente aplicáveis a espécies em que um polímero diferente de PEG é utilizado.
Em uma modalidade de exemplo, a porção R15 tem a fórmula que é um membro selecionado de o grupo:
HOOC
Figure BRPI0717505B1_D0154
CH(OH)CH[OH>CH;CiH
Oil
Figure BRPI0717505B1_D0155
S--(CHLCH;OKCH:
NHCÍOJCHjCHjjOCH.CH.jQCH,
HOOC
Figure BRPI0717505B1_D0156
NHGiOJiCH^NH
OH
CH(OH)CH(OH)CHj0«
O
Figure BRPI0717505B1_D0157
S—-[CH:CH.O),CH: nhC(O;ch,ch,och,ch,:i,och:, hooc
Figure BRPI0717505B1_D0158
NHCfOjCHj
OH
Figure BRPI0717505B1_D0159
s—(OhlChlo^chHOOC
Figure BRPI0717505B1_D0160
O
Figure BRPI0717505B1_D0161
NHC^OJCHj
OH
ΟΗιΟΗΪΟΗίΟΗίΟΗ^ΗίΟΗ,Ι/ΛΟίΟΪΟίΟΗΑΛΟΟΚ^Ι,ΟίΟΚ^ιΝΗ
Figure BRPI0717505B1_D0162
S---(CH.CI I.OJ.CH,
NHCCOX^jOyOCHiCHjlOCH,
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Em cada uma das estruturas acima, o fragmento de ligante —NH(CH2)a- pode estar presente ou ausente.
Em outras modalidades de exemplo, o conjugado de peptideo inclui uma porção R15 selecionada do grupo:
Em cada uma das fórmulas acima, os índices e e f são independentemente selecionadas dos números inteiros de 1 a
2.500. Em modalidades de exemplo adicionais, e e f são selecionados para fornecer uma porção PEG que é de cerca de 1 kD, 2 kD, 5 kD, 10 kD, 15 kD, 20 kD, 25 kD, 30 kD, 35 kD, 40 kD e 45 kD. PEG de maior peso molecular também pode ser usado na presente invenção, incluindo de até cerca de 200 kD, como pelo menos cerca de 180 kD, cerca de 160 kD, cerca de 140 kD, cerca de 120 kD, cerca de 100 kD, cerca de 90 kD, cerca de 80 kD, e cerca de 70 kD. Em certas modalidades o peso molecular de PEG é cerca de 80 kD. Em outras modalidades, o peso molecular de PEG é pelo menos cerca de 200 kD, pelo menos cerca de 180 kD, pelo menos cerca de 160 10 kD, ou pelo menos cerca de 140 kD. O símbolo Q
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118/239 representa alquil substituído ou não substituído (por exemplo, Ci-Ce alquil, por exemplo, metil), heteroalquil substituído ou não substituído ou H.
Outros polímeros ramificados têm estruturas com base em peptídeos di-lisina (Lys-Lys), por exemplo:
Figure BRPI0717505B1_D0163
N HC( O )G H2GH 2 (OC H^QH^OQ
NH
NH,
Figure BRPI0717505B1_D0164
N H C (O )C H2CH2(OCH 2CH 2)fOQ
O
Figure BRPI0717505B1_D0165
N H C( O )OCH 2CH 2(OC H2C H^OQ
NH
NH
Figure BRPI0717505B1_D0166
NHC (O)OC H7CH7(OCH gCH^-OQ
O
O
Figure BRPI0717505B1_D0167
N HC(O)CH2CH 2(OC H2C H2)cOQ
N HC(O)CH 2CH 2(OC H2C H2)fQQ
N H C (O )C H2C H^OCHiCHjJf OQ
NH
Figure BRPI0717505B1_D0168
O
N HC(O)OCH2C H2(OC H2CH 2)aOQ
NH
NHC(O)OCH2CH2(OCH7CH2)fOQ
N HC(O PCH^CHí (OC H2C H j μ OQ
Figure BRPI0717505B1_D0169
O e peptídeos de tri-lisina (Lys-Lys-Lys), por exemplo:
O
Figure BRPI0717505B1_D0170
N HC( O)OCH2CH2(OC H 2CH2 )θθα
NH
Figure BRPI0717505B1_D0171
NHG(O)O C H 2GH2(OC H2CH 2 )fOQ
NHC( O )DC H sCHJ DG H2C H 2 QQ
NH
N H C (O )OC H2C Η2(ΟΟΗ2ΟΗ2> OQ O 9'
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119/239
O
Figure BRPI0717505B1_D0172
N HC(O )C H2C H z(O CH2CH ^QQ
N HC(O )CH2C H2(OCH2CH2 Q
NH
NHC(OK:H2CH2(CX;H2CH2)fOQ
O 4'
N H C{0 )C H 2CH2(OCH2C H 2 > Ό Q
Em cada uma das figures acima, os índices e, f, f' e f representam números inteiros independentemente selecionados de 1 a 2.500. Os índices q, q' e q representam números inteiros independentemente selecionados de 1 a 20. deve ser percebido por uma pessoa habilitada na técnica que além das estruturas de PEG linear mostradas acima, os polímeros ramificados exemplificados nas seções prévias também podem ser anexados a uma porção de ramificação (por exemplo, lisina, e oligômeros de lisina) no lugar de uma ou mais das estruturas de PEG linear.
Em outra modalidade de exemplo, o grupo de modificação:
R16—X2 x5—c r17-x4 tem a fórmula que é um membro selecionado de:
o
Figure BRPI0717505B1_D0173
NHC(0)CH2CH2(OCH2CH2):OQ
Figure BRPI0717505B1_D0174
N HG(O j OCH2 CH 2(OCH2CH z)fOQ
Figure BRPI0717505B1_D0175
NHC(0)CH3CH?(OCH?CH?)|OQ o
Figure BRPI0717505B1_D0176
N HC(O) OCH2CH 2(OCH2CH2)fOQ
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120/239 em que Q é um membro selecionado de H e Ci-Ce alquil substituído ou não substituído. Os índices e e f são números inteiros independentemente selecionados de 1 a
2.500, e o índice q é um número inteiro selecionado de 0 a 20 .
Em outra modalidade de exemplo, o grupo de modificação:
R16- X3
Figure BRPI0717505B1_D0177
R17—X4 tem a fórmula que é um membro selecionado de:
Figure BRPI0717505B1_D0178
N HC( O)OCH2CH2(CX3H^C H2ÇOQ q
nh2
NH
Figure BRPI0717505B1_D0179
N HC(O)CCH2CH2COCH2CH2)rOQ
O
O
Ã^/Ã^^^NHCtQ)CH2CH2(CCH2CH2)eOQ
N HCÍOJGH^C H2(OCH2CH2)fOQ
NHtXO>2H2CH2(OCH2CH2)rOQ
NH
Figure BRPI0717505B1_D0180
Figure BRPI0717505B1_D0181
, N HC(O)OC H2CHJ OCH2C H2 pÜQ
NHCOOC H2CH2(OCH2CH2)1OQ
NHC(O)OCH2CH2(OCH2CH2>QQ
NH
Figure BRPI0717505B1_D0182
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121/239 em que Q é um membro selecionado de H e Ci-Ce alquil substituído ou não substituído. Os índices e, f e f' são números inteiros independentemente selecionados de 1 a
2.500, e q e q' são números inteiros independentemente selecionados de 1 a 20.
Em outra modalidade de exemplo, o polímero ramificado tem uma estrutura que inclui uma porção de acordo com a seguinte fórmula:
(OCH2CH2)i1A1 caW (CA5A6)j t2(CH2CH2O)rn--A7 (CAW)h
CA1DAn
Figure BRPI0717505B1_D0183
em que os indices men são números inteiros independentemente selecionados de 0 a 5.000. A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10 e A11, são membros independentemente selecionados de H, alquil substituído ou não substituído, heteroalquil substituído ou não substituído, cicloalquil substituído ou não substituído, heterocicloalquil substituído ou não substituído, aril substituído ou não substituído, heteroaril substituído ou não substituído, NA12A13, -OA12 e -SiA12A13. A12 e A13 são membros independentemente selecionados de alquil substituído ou não substituído, heteroalquil substituído ou não substituído, cicloalquil substituído ou não substituído, heterocicloalquil substituído ou não substituído, aril substituído ou não substituído, e heteroaril substituído ou não substituído.
Fórmula Ilia é um subconjunto de Fórmula III. As
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122/239 estruturas descritas pela Fórmula IIIa são também englobadas pela Fórmula
Em uma modalidade de exemplo, o grupo de modificação polimérico tem uma estrutura que inclui uma porção de acordo com as seguintes fórmulas:
(OCH2CH2)nA1
A2(CH2CH2O)
Figure BRPI0717505B1_D0184
Figure BRPI0717505B1_D0185
Em outra modalidade de exemplo de acordo com a fórmula acima, o polímero ramificado tem uma estrutura que inclui uma porção de acordo com a seguinte fórmula:
A2(CH3CH2O)·
Figure BRPI0717505B1_D0186
H
Em uma modalidade de exemplo, A1 e A2 são membros independentemente selecionados de -OH e —OCHa.
Exemplos de grupos de modificação poliméricos de acordo com essa modalidade incluem a porção:
CH30(CH2CH2Q),
Figure BRPI0717505B1_D0187
Figure BRPI0717505B1_D0188
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123/239 em que as variáveis são como acima descrito.
Em uma modalidade ilustrativa, o açúcar modificado é ácido siálico e compostos de açúcar modificado selecionados de uso ma invenção têm a fórmulas:
Figure BRPI0717505B1_D0189
OH
Figure BRPI0717505B1_D0190
OH
IIOOC
HfOHJCHlOHJCHjOH
HO
Figure BRPI0717505B1_D0191
NHIÍ1
OH
Os índices a, b e d são números inteiros de 0 a 20. O índice c é um número inteiro de 1 a
2.500. As estruturas acima apresentadas podem ser componentes de R15.
Em outra modalidade ilustrativa, uma porção hidroxil primária do açúcar é funcionalizada com o grupo de modificação. Por exemplo, o 9-hidroxil de ácido siálico pode ser convertido à amina correspondente e funcionalizada para fornecer um composto de acordo com a invenção. Fórmulas de acordo com essa modalidade incluem:
H(d l)CH(aH)CHLNHC|a)(CHiJJMHC|O)|CHi]i1[aCH£CHi]L?OtCHJyMHR·
I IO DC
Figure BRPI0717505B1_D0192
NHCÍOICH,
OH
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Figure BRPI0717505B1_D0193
Cl I ηο'Ί I ^NHCfOlCH,
Figure BRPI0717505B1_D0194
OH
As estruturas acima apresentadas podem ser componentes de R15.
Embora a presente invenção seja exemplificada nas seções anteriores por referência a PEG, como aqueles habilitados perceberão, um arranjo de porções de modificação poliméricas é de uso nos compostos e métodos aqui apresentados.
Em modalidades selecionadas, R1 ou L-R1 é um PEG ramificado, por exemplo, uma das espécies acima apresentadas. Em uma modalidade de exemplo, a estrutura de PEG ramificado é baseada em um peptídeo de cisteína. Açúcares modificados ilustrativos de acordo com essa
modalidade incluem:
HCtOC .0^ u:moi ιχ;η(οι i)ci ι2αιι
f ΚΓ
N NHC(O)|CH, WOC HaGH2l,.O(CH2 ηρ —·ΐθΗ,οι^>ίθΗ.,
UH NMCtOJXfoHiCHiíOCH.CHAOCH.,
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Figure BRPI0717505B1_D0195
Figure BRPI0717505B1_D0196
zCH((Ji i)t;i i(OnjCH^OH O 'NI C(O)tC^X,NI I <c;l i^OfcCH,
N HCtOJX'CH, LH/OCH.CH ; JlOCHj
t) .OKCJHjCHtOHjChaNHlCHiKNH
NHCtOjK^CHijCH^OCHfCHjlOCl-l) LNHC(O)CHS
t)
CHIOH JCHfOHJCH. NH(C H^NHClCWfC HsMOCHjCHzkCHCHzJjNH --(CHLCl Ι,ΟΐίΗ,
N HC([J]XICHsCtV(<JCH:CH! Jt !LH.; NIIG(O)CH;
em que X4 é uma ligação ou 0. Em cada uma das estruturas acima, o ligante de alquilamina -(CH2)aNH- pode 15 estar presente ou ausente. As estruturas acima apresentadas podem ser componentes de R15/R15' .
Como aqui discutido, o polímero-ácido siálico modificado de uso na invenção também podem ser estruturas lineares. Portanto, a invenção fornece conjugados que 20 incluem uma porção de ácido siálico derivada da estrutura como:
Figure BRPI0717505B1_D0197
Exemplos de açúcares modificados são modificados com polímeros hidrossolúveis ou insolúveis em água. Exemplos de polímero útil são também exemplificados abaixo.
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Em outra modalidade de exemplo, o peptídeo é derivada de células de inseto, remodeladas por adição de GlcNAc e Gal ao núcleo de manose e glicopeguilado com o uso de um ácido que siálico que tem uma porção de PEG linear, gerando um peptídeo que compreende pelo menos uma porção que tem a fórmula:
oh
Figure BRPI0717505B1_D0198
em que o índice t é um número inteiro de 0 a 1; o índice s representa um número inteiro de 1 a 10; e o índice f representa um número inteiro de 1 a 2.500.
Em uma modalidade, a presente invenção fornece um conjugado de peptídeo que compreende o grupo de ligação de glicosil a seguir:
Figure BRPI0717505B1_D0199
D é um membro selecionado de -OH and R1-L-HN-; G é um membro selecionado de R1-L- e -C(O) (Ci-Ce) alquil-R1; R1 é uma porção que compreende um membro selecionado de um resíduo de poli(etileno glicol) de cadeia linear e resíduo de poli(etileno glicol) ramificado; e M é um membro selecionado de H, um contra-íon de sal e uma carga negativa única; L é um ligante que é um membro selecionado de uma ligação, alquil substituído ou não substituído e heteroalquil substituído ou não substituído. Em uma
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127/239 modalidade de exemplo quando D é OH, G é Η2-Η-. Em outra modalidade de exemplo quando G é -C(O) (Ci-Ce) alquil, D é
R1-L-NH-.
Em uma modalidade de exemplo, L-R1 tem a fórmula:
em que
Em uma
R1—HN
Figure BRPI0717505B1_D0200
a é um número inteiro selecionado modalidade de exemplo, R1 tem uma de 0 a 20.
estrutura que inclui uma porção selecionada de:
Figure BRPI0717505B1_D0201
□
Figure BRPI0717505B1_D0202
O---(CHaCH2O)eCH;
N H G(O)GHSGH ((O G HaC HJjOCHj □
Figure BRPI0717505B1_D0203
O--(CH.GHíOKGHs
N HC( D)OC HjC H ,(O C H i/CHjhOCH,;
em que e, f, m e n são números inteiros independentemente selecionados de 1 a 2.500; e q é um número inteiro selecionado de 0 a 20.
Em uma modalidade de exemplo, R1 tem uma estrutura que é um membro selecionado de:
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Figure BRPI0717505B1_D0204
Figure BRPI0717505B1_D0205
Figure BRPI0717505B1_D0206
Figure BRPI0717505B1_D0207
f f' que em são números inteiros independentemente selecionados de números inteiros independentemente a 2.500; e q selecionados de e q' são a 20.
Em outra modalidade de exemplo, R1 tem uma estrutura que é um membro selecionado de:
Figure BRPI0717505B1_D0208
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Figure BRPI0717505B1_D0209
Figure BRPI0717505B1_D0210
Figure BRPI0717505B1_D0211
em que e, f e f' são números inteiros independentemente selecionados de 1 a 2.500; e q e q' são números inteiros independentemente selecionados de 1 a 20.
Em outra modalidade de exemplo, R1 tem uma estrutura que é um membro selecionado de:
g(O)ch2ch2(och2ch2)0och3 ;
e
C(0 )OCH2 Ch2(0Ch2C h 2 )|OCH 3 em que e e f são números inteiros independentemente selecionados de 1 a 2.500.
Em outra modalidade de exemplo, o ligante de glicosil tem a fórmula:
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Figure BRPI0717505B1_D0212
em que as variáveis são como acima descrito.
Em outra modalidade de exemplo, o conjugado de peptídeo compreende pelo menos um dos referidos ligantes de glicosil de acordo com a fórmula selecionada de:
Figure BRPI0717505B1_D0213
Figure BRPI0717505B1_D0214
ÜH em que D e G são como acima descrito, AA é um resíduo de aminoácido do referido conjugado de peptídeo e t é um número inteiro selecionado de 0 e 1.
Em outra modalidade de exemplo, o conjugado de peptídeo compreende pelo menos um dos referidos ligantes de glicosil em que cada um dos referidos ligantes de glicosil tem uma estrutura que é um membro independentemente selecionado das seguintes fórmulas:
Figure BRPI0717505B1_D0215
Man— GlcNAc — GlcNAc--AA
Figure BRPI0717505B1_D0216
OH
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Figure BRPI0717505B1_D0217
Figure BRPI0717505B1_D0218
Figure BRPI0717505B1_D0219
em que D e G são como acima descrito, AA é um resíduo de aminoácido do referido conjugado de peptídeo e t é um número inteiro selecionado de 0 e 1.
Em outra modalidade de exemplo, o conjugado de peptídeo compreende pelo menos um dos referidos ligantes de
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132/239 glicosil de acordo com uma fórmula selecionada de:
Figure BRPI0717505B1_D0220
Figure BRPI0717505B1_D0221
Figure BRPI0717505B1_D0222
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Figure BRPI0717505B1_D0223
Figure BRPI0717505B1_D0224
Figure BRPI0717505B1_D0225
Figure BRPI0717505B1_D0226
Figure BRPI0717505B1_D0227
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134/239 em que D e G são como acima descrito, AA é um resíduo de aminoácido do referido conjugado de peptídeo e t é um número inteiro selecionado de 0 e 1. Em uma modalidade de exemplo, um membro selecionado de 0 e 2 das porções sialil que não compreendem G são ausentes. Em uma modalidade de exemplo, um membro selecionado de 1 e 2 das porções sialil que não compreendem G são ausentes.
Em outra modalidade de exemplo, o conjugado de peptídeo compreende pelo menos um dos referidos ligantes de glicosil de acordo com a fórmula selecionada de:
Figure BRPI0717505B1_D0228
Figure BRPI0717505B1_D0229
OH
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Figure BRPI0717505B1_D0230
Figure BRPI0717505B1_D0231
Figure BRPI0717505B1_D0232
Figure BRPI0717505B1_D0233
Figure BRPI0717505B1_D0234
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Figure BRPI0717505B1_D0235
em que D e G são como acima descrito, AA é um resíduo de aminoácido do referido conjugado de peptídeo e t é um número inteiro selecionado de 0 e 1. Em uma modalidade de exemplo, um membro selecionado de 0 e 2 das porções sialil que não compreendem G são ausentes. Em uma modalidade de exemplo, um membro selecionado de 1 e 2 das porções sialil que não compreendem G são ausentes.
Em outra modalidade de exemplo, o conjugado de peptídeo compreende pelo menos um ligante de glicosil de acordo com a fórmula selecionada de:
Figure BRPI0717505B1_D0236
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Figure BRPI0717505B1_D0237
Figure BRPI0717505B1_D0238
Figure BRPI0717505B1_D0239
Man— GlcNAc— G IcWte—ΛΑ
Figure BRPI0717505B1_D0240
Figure BRPI0717505B1_D0241
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138/239 em que D e G são como acima descrito, AA é um resíduo de aminoácido do referido conjugado de peptídeo e t é um número inteiro selecionado de 0 e 1. Em uma modalidade de exemplo, um membro selecionado de 0 e 2 das porções sialil que não compreendem G são ausentes. Em um exemplo de modalidade, um membro selecionado de 1 e 2 das porções sialil que não compreendem G são ausentes.
Em outra modalidade de exemplo, a invenção fornece um peptídeo que é produzido em um hospedeiro adequado. A invenção também fornece métodos de expressão desse peptídeo. Em outra modalidade de exemplo, o hospedeiro é um sistema de expressão de mamífero.
Em outra modalidade de exemplo, a invenção fornece um método de tratamento de uma condição em um indivíduo em necessidade desse, a referida condição caracterizada por potência de coagulação comprometida no referido indivíduo, o referido método compreende a etapa de administração ao indivíduo de uma quantidade do conjugado de peptídeo da invenção, eficaz para melhorar a referida condição no referido indivíduo. Em outra modalidade de exemplo, o método compreende a administração ao referido mamífero de uma quantidade do conjugado de peptídeo produzido de acordo com os métodos aqui descritos.
Em outro aspecto, a invenção fornece um método de confecção de um conjugado de peptídeo que compreende um ligante de glicosil aqui descrito. O método compreende (a) contato de um peptídeo que compreende a porção de glicosil:
Gal
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Com um açúcar de nucleotídeo PEGuilado aqui descrito e uma enzima que transfere o açúcar PEGuilado para Gal da referida porção de glicosil, sob condições adequadas para a referida transferência.
Em outra modalidade de exemplo, a porção:
R16-X2
X5—C--La—
R17—X4 tem a fórmula que é um membro selecionado de:
CHjOÍCHíGHíO^,·
Figure BRPI0717505B1_D0242
Figure BRPI0717505B1_D0243
O
Figure BRPI0717505B1_D0244
Figure BRPI0717505B1_D0245
NHC(0)OCH2CH2(OCH2CH2)fOCH3.
Figure BRPI0717505B1_D0246
O--(CH2CH2O)---CHS;
NHC(O)CH2CH2(0CH2CH2)OCH3 .
o
---N
H
Figure BRPI0717505B1_D0247
q Ό—(CHjCHyO)— CHj
N HC( O)OCH2CH2 (OCH2CH2 >OCH3 em que e, f, m e n são números inteiros independentemente selecionados de 1 a 2.500; e q é um número inteiro selecionado de 0 a 20.
Em outra modalidade de exemplo, a porção:
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R16—X2
X5—C--La—>
I 5
R17—X4 tem a fórmula que é um membro selecionado de:
o
Figure BRPI0717505B1_D0248
N H C(O JCHjCHriO CH 3 C Hs),0 C H j o
Figure BRPI0717505B1_D0249
NH
NHj
Figure BRPI0717505B1_D0250
NHC(O)CH2CH2(OCH2CHz),OCHj o
o
Figure BRPI0717505B1_D0251
NHC(O)CH2CH2(OCHíCHrie0CHs
NH
N HC( O)CH2C H2(O C Hj CH2>OCH3
N H C (O)C H2G HaíOCHiCHiJt QCH j e
Figure BRPI0717505B1_D0252
O
Figure BRPI0717505B1_D0253
NMC(O)OCH 2CH2(OCHíCHz)eOCH3
NH
N HC(O)0CH5 C HrfO C H:CHZ )|0CH3
N HC( OJOCHjCHgÜ CH 3 C )rOCH3
Figure BRPI0717505B1_D0254
O em que e, f e são números inteiros independentemente selecionados de 1
2.500; e q e q' são números inteiros independentemente selecionados de 1 a
Em outra modalidade de exemplo, o ligante de glicosil compreende a fórmula:
Figure BRPI0717505B1_D0255
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Em outra modalidade de exemplo, o conjugado de peptideo compreende pelo menos um ligante de glicosil que tem a fórmula:
1Ajv' (Fuc)L Man—GlcNAc—Gal·—R1S
AA—GlcNAc—GlcNAc—Man
Man
(Fuc)l Man
AA—GlcNAc—GlcNAc—Man
I 1 xkr Man---GlcNAc—Gal’—R15 (Fuc)t Man---GlcNAc—Gal---R15
AA—GlcNAc—GlcNAc—Man
-GlcNAc—Gal·--RlS
- (GlcNAc- Galfe-R15 (GlcNAc- Galjp-R15
- (GlcNAc-Gal)p—R15 (Fuc)t
Man·
Man
AA—GlcNAc—GlcNAc—Man-Man
GlcNAc—Gal).,—R
Man---(GlcNAc—Gal)p—R1s
jw1 (Fuc)t
AA—GlcNAc—GlcNAc—Man--(GlcNAc-Gal)3-R1j wv |
Man--- (GlcNAc—GalJ^—R15 (GlcNAc—Gal^—R15 em que AA é um resíduo de aminoácido do referido peptideo; t é um número inteiro selecionado de 0 e 1; e R15 é a porção de sialil modificada.
Em outra modalidade de exemplo, o método compreende,
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antes da etapa (a): (b) expressão do peptídeo em um
hospedeiro adequado.
II. D. iv. Polímeros insolúveis em água
Em outra modalidade, análoga àquelas acima discutidas, os açúcares modificados incluem um polímero insolúvel em água, em vez de um polímero hidrossolúvel. Os conjugados da invenção também podem incluir um ou mais polímeros insolúveis em água. Essa modalidade da invenção é ilustrada pelo uso do conjugado como um veículo com o qual há a liberação de um peptídeo terapêutico em uma maneira controlada. Sistemas de liberação de medicamento polimérico são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Dunn e cols., Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991. Aqueles habilitados na técnica perceberão que substancialmente qualquer sistema de liberação de medicamento conhecido é aplicável aos conjugados da presente invenção.
Os motivos acima para R1, L-R1, R15, R15' e outros radicais são igualmente aplicáveis a polímeros insolúveis em água, que podem ser incorporados nas estruturas lineares e ramificadas sem limitação com a utilização de química prontamente acessível para aqueles de habilidade na técnica.
Polímeros insolúveis em água representativos incluem, sem limitação, polifosfazinas, alcoóis poli(vinílicos), poliamidas, policarbonatos, polialquilenos, poliacrilamidas, polialquileno glicóis, polialquileno óxidos, polialquileno tereftalatos, polivinil éteres, polivinil ésteres, polivinil haletos, polivinilpirrolidona,
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143/239 poliglicolideos, polissiloxanos, poliuretanos, poli(metil metacrilato), poli(etil metacrilato), poli(butil metacrilato), poli(isobutil metacrilato), poli(hexil metacrilato), poli(isodecil metacrilato), poli(lauril metacrilato), poli(fenil metacrilato), poli(metil acrilato), poli(isopropil acrilato), poli(isobutil acrilato), poli(octadecil acrilato) polietileno, polipropileno, poli(etileno glicol), poli(etileno óxido), poli (etileno tereftalato), poli(vinil acetato), cloreto de polivinila, poliestireno, polivinil pirrolidona, plurônicos e polivinilfenol e copolímeros dessses.
Polímeros naturais sinteticamente modificados de uso em conjugados da invenção incluem, sem limitação, alquil celuloses, hidroxialquil celuloses, éteres de celulose, ésteres de celulose, e nitroceluloses. Membros particularmente preferidos das amplas classes de polímeros naturais sinteticamente modificados incluem, sem limitação, metil celulose, etil celulose, hidroxipropil celulose, hidroxipropil metil celulose, hidroxibutil metil celulose, acetato de celulose, propionato de celulose, acetato butirato de celulose, acetato ftalato de celulose, carboximetil celulose, triacetate de celulose, sal de sódio de sulfato de celulose, e polímeros de ésteres acrílicos e metacrílicos e ácido algínico.
Esses e outros polímeros discutidos nessa podem ser prontamente obtidos a partir de fontes comerciais como Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO.), Polisciences (Warrenton, PA.), Aldrich (Milwaukee, WI.), Fluka (Ronkonkoma, NY), e BioRad (Richmond, CA) , ou sintetizados a partir de monômeros obtidos a partir desses fornecedores
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144/239 com o uso de técnicas padrão.
Polímeros biodegradáveis representativos de uso nos conjugados da invenção incluem, sem limitação, polilactides, poliglicolídeos e copolímeros desses, poli(etileno tereftalato), ácido poli(butírico), ácido poli(valérico), poli(lactide-cocaprolactona), poli(lactideco-glicolídeo), polianidridos, poliortoésteres, misturas e copolímeros desses. De uso particular são composições que formam géis, como aquelas que incluem colágeno, plurônicos e outros.
Os polímeros de uso na invenção incluem polímeros híbridos que incluem materiais insolúveis em água que têm em pelo menos uma porção de sua estrutura, uma molécula bio-reabsorvível. Um exemplo de tal polímero é um que inclui um copolímero insolúvel em água, que uma região bioreabsorvível, uma região hidrofílica e uma pluralidade de grupos funcionais entrecruzáveis por cadeia de polímero.
Para objetivos da presente invenção, materiais insolúveis em água incluem materiais que são substancialmente insolúveis em água ou ambientes que contêm água. Portanto, embora certas regiões ou segmentos do copolímero possam ser hidrofílicas ou mesmo hidrossolúveis, a molécula do polímero, como um todo, não se dissolve em água.
Para objetivos da presente invenção, o termo molécula bio-reabsorvível inclui uma região que é capaz de ser metabolizada ou quebrada e reabsorvida e/ou eliminada através de vias excretoras normais pelo corpo. Tais metabólitos ou produtos da quebra são preferivelmente substancialmente não tóxicos para o corpo.
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A região bio-reabsorvível pode ser hidrofóbica ou hidrofílica, desde que a composição do copolímero como um todo não seja transformada em hidrossolúvel. Assim, a região bio-reabsorvível é selecionada com base na preferência de que o polímero, como um todo, permanece insolúvel em água. Portanto, as propriedades relativas, ou seja, os tipos de grupos funcionais contidos, e as proporções relativas da região bio-reabsorvível, e a região hidrofílica são selecionados para assegurar que composições bio-reabsorvíveis úteis permaneçam insolúveis em água.
Exemplos de polímeros reabsorvíveis incluem, por exemplo, copolímeros em bloco reabsorvíveis sinteticamente produzidos de ácido poli(α-hidroxi- carboxílico) /poli(oxialquileno, (veja, Cohn e cols., Patente U.S. No. 4.826.945). Esses copolímeros não são entrecruzados e são hidrossolúveis de modo que o corpo pode excretar as composições de copolímero em bloco degrado. Veja, Younes e cols., J Biomed. Mater. Res. 21: 1.301-1.316 (1987); e Cohn e cols., J Biomed. Mater. Res. 22: 993-1.009 (1988).
Polímeros reabsorvíveis atualmente preferidos incluem um ou mais componentes selecionados de poli (ésteres), ácidos poli(hidroxi), poli(lactonas), poli(amidas), poli(éster amidas), poli (aminoácidos), poli(anidridros), poli(ortoésteres), poli (carbonates), poli(fosfazinas), poli(fosfoésteres), poli(tioésteres), polissacarídeos e misturas desses. Ainda mais preferivelmente, o polímero bio-reabsorvível inclui um componente de ácido poli(hidroxi). Dos ácidos poli(hidroxi), ácido polilático, ácido poliglicólico, ácido policapróico, ácido polibutírico, ácido polivalérico e copolímeros e misturas
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146/239 desses são preferidos.
Além da formação de fragmentos que são absorvidos ín vivo (bio-reabsorvíveis), revestimentos poliméricos preferidos para uso nos métodos da invenção também podem formar um fragmento excretável e/ou metabolizável.
Copolímeros de ordem superior também podem ser usados na presente invenção. Por exemplo, Casey e cols., Patente U.S. No. 4.438.253, emitida em 20 de março de 1984, revela copolímeros em tri-bloco produzidos a partir da transesterificação de ácido poli(glicólico) e um poli(alquileno glicol) de extremidade hidroxil. Tais composições são reveladas para uso como suturas de monofilamento reabsorvíveis. A flexibilidade de tais composições é controlada pela incorporação de um ortocarbonato aromático, como tetra-p-tolil ortocarbonato na estrutura do copolímero.
Outros polímeros com base em ácido lático e/ou glicólico também podem ser utilizados. Por exemplo, Spinu, Patente U.S. No. 5.202.413, emitida em 13 de abril de 1993, revela copolímeros em multi-bloco biodegradable que têm blocos em ordem seqüencial de polilactide e/ou poliglicolídeo produzidos por polimerização de abertura de anel do lactide e/ou glicolídeo em um diol oligomérico ou um resíduo de diamina seguido por extensão de cadeia com um composto di-funcional, como, um diisocianato, diacilcloreto ou diclorossilano.
Regiões bio-reabsorvíveis de revestimentos úteis na presente invenção podem ser designadas para serem hidroliticamente e/ou enzimaticamente cliváveis. Para objetivos da presente invenção, hidroliticamente clivável
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147/239 refere-se à suscetibilidade do copolímero, especialmente a região bio-reabsorvível, à hidrólise em água ou um ambiente que contém água. De modo similar, enzimaticamente clivável como aqui usado refere-se à susceptibilidade do copolímero, especialmente a região bio-reabsorvível, à divagem por enzimas endógena ou exógena.
Quando colocada no corpo, a região hidrofílica pode ser processada em fragmentos excretáveis e/ou metabolizáveis. Portanto, a região hidrofílica pode incluir, por exemplo, poliéteres, polialquileno óxidos, polióis, poli(vinil pirrolidina), álcool poli(vinílico) , poli(alquil oxazolinas), polissacarídeos, carboidratos, peptídeos, proteínas e copolímeros e misturas desses. Além disso, a região hidrofílica também pode ser, por exemplo, a óxido de poli(alquileno). Tais óxidos de poli(alquileno) podem incluir, por exemplo, óxido de poli(etileno), óxido de poli(propileno) e misturas e copolímeros desses.
Polímeros que são componentes de hidrogéis são também úteis na presente invenção. Hidrogéis são materiais poliméricos que são capazes de absorver quantidades relativamente grandes de água. Exemplos de compostos que formam hidrogel incluem, sem limitação, ácidos poliacrílicos, sódio carboximetilcelulose, álcool polivinílico, polivinil pirrolidina, gelatina, carragenana e outros polissacarídeos, ácido hidroxietilenometacrílico (HEMA), bem como derivados desses, e outros. Podem ser produzidos hidrogéis que são estáveis, biodegradáveis e bio-reabsorvíveis. Além disso, composições de hidrogel podem incluir subunidades que exibem uma ou mais dessas propriedades.
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Composições bio-compatíveis de hidrogel cujas integridades podem ser controladas através de entrecruzamento são conhecidas e são atualmente preferidas para uso nos métodos da invenção. Por exemplo, Hubbell e cols., Patente U.S. Nos. 5.410.016, emitida em 25 de abril de 1995 e 5.529.914, emitida em 25 de junho de 1996, revelam sistemas hidrossolúveis, que são copolímeros em bloco entrecruzados que têm um segmento em bloco central hidrossolúvel entre duas extensões hidroliticamente instáveis. Tais copolímeros são também end-capped com funcionalidades de acrilato fotopolimerizável. Quando entrecruzados, esses sistemas tornam-se hidrogéis. O bloco central hidrossolúvel de tais copolímeros pode incluir poli(etileno glicol); enquanto as extensões hidroliticamente instáveis podem ser um ácido poli(ahidroxi), como ácido poliglicólico ou ácido polilático. Veja, Sawhney e cols., Macromolecules 26: 581-587 (1993) .
Em outra modalidade preferida, o gel é um gel termoreversível. Géis termo-reversíveis que incluem componentes como plurônicos, colágeno, gelatina, ácido hialurônico, polissacarídeos, poliuretano hidrogel, poliuretano-uréia hidrogel e combinações desses são atualmente preferidos.
Ainda em outros exemplos de modalidade, o conjugado da invenção inclui um componente de um lipossomo. Lipossomos podem ser preparados de acordo com métodos conhecidos por aqueles habilitados na técnica, por exemplo, como descrito em Eppstein e cols., Patente U.S. No. 4.522.811. Por exemplo, formulações em lipossomo podem ser preparadas por dissolução de lipídeos adequados (como estearoil fosfatidil etanolamina, estearoil fosfatidil colina, aracadoil
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149/239 fosfatidil colina, e colesterol) em um solvente inorgânico que é então evaporado, deixando para trás uma fina película de lipídeo seco na superfície do recipiente. Uma solução aquosa do composto ativo ou seu sal farmaceuticamente aceitável é então introduzida no recipiente. O recipiente é então agitado à mão para liberar material lipídico das laterais do recipiente e para to dispersar agregados lipídicos, assim formando a suspensão lipossômica.
As micropartícuias acima citadas e métodos de preparação das micropartícuias são oferecidos por via de exemplo e eles não devem definir o escopo das micropartícuias de uso na presente invenção. Será aparente para aqueles habilitados na técnica que um arranjo de micropartícuias, fabricadas por diferentes métodos, é de uso na presente invenção.
Os formatos estruturais acima discutidos no contexto dos polímeros hidrossolúveis, de cadeia linear e ramificada são geralmente aplicáveis com relação a polímeros insolúveis em água também. Portanto, por exemplo, os núcleos de ramificação de cisteína, serina, dilisina, e trilisina podem ser funcionalizados com duas porções de polímero insolúvel em água. Os métodos usados para produzir essas espécies são geralmente intimamente análogos àqueles usados para produzir os polímeros hidrossolúveis.
II. D. v. Métodos de produção de grupos de modificação poliméricos
Os grupos de modificação poliméricos podem ser ativados por reação com uma porção glicosil ou sacaril ou uma porção de aminoácido. Exemplos de estruturas de espécies ativadas (por exemplo, carbonates e ésteres
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150/239 ativos) incluem:
Figure BRPI0717505B1_D0256
Figure BRPI0717505B1_D0257
H
CHjOÍOCHjCHJnO
Figure BRPI0717505B1_D0258
Figure BRPI0717505B1_D0259
(OCHíCHjJnA1
CA,
A2(CH2CH2O)m
Figure BRPI0717505B1_D0260
ch2
O
Figure BRPI0717505B1_D0261
(OCHjCHhLA1 d 2
Figure BRPI0717505B1_D0262
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151/239 (OCH2CH2)nA’ f—H
Figure BRPI0717505B1_D0263
Na figura acima, q é um membro selecionado de 1-40. outros grupos de ativação, ou de partida, adequados para ativação de PEGs lineares e ramificados de uso na preparação dos compostos aqui apresentados incluem, sem limitação as espécies:
Figure BRPI0717505B1_D0264
moléculas de PEG que são ativadas com essas e outras espécies e métodos de fazer os PEGs ativados são apresentadas em WO 04/083259.
Aqueles habilitados na técnica perceberão que um ou mais dos braços de m-PEG do polímero ramificados acima mostrado podem ser substituídos por uma porção PEG com um terminal diferente, por exemplo, OH, COOH, NH2, C2-C10alquil etc. Além disso, as estruturas acima são prontamente modificadas por inserção de ligantes de alquil (ou remoção
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152/239 de átomos de carbono) entre o átomo de α-carbono e o grupo funcional da cadeia lateral do aminoácido. Assim, derivados homo e homólogos superiores, bem como homólogos inferiores estão dentro do escopo de núcleos para PEGs ramificados de uso na presente invenção.
As espécies de PEG ramificado aqui apresentadas são facilmente preparadas por métodos como aquele apresentado
Figure BRPI0717505B1_D0265
em que Xd é O ou S e r é um número inteiro de 1 a 5. Os índices e e f são números inteiros independentemente selecionados de 1 a 2.500. Em uma modalidade de exemplo, um ou ambos desses índices são selecionados de modo que o polímero tem cerca de 5 kD, 10 kD, 15 kD, 20 kD, 25 kD, 30 kD, 35 kD, ou 40 kD de peso molecular. PEG de um maior peso molecular também pode ser usado na presente invenção, incluindo até cerca de 200 kD, como pelo menos cerca de 180 kD, cerca de 160 kD, cerca de 140 kD, cerca de 120 kD, cerca de 100 kD, cerca de 90 kD, cerca de 80 kD, e cerca de 70 kD. Em certas modalidades o peso molecular de PEG é cerca de 80 kD. Em outras modalidades, o peso molecular de PEG é pelo menos cerca de 200 kD, pelo menos cerca de 180 kD, pelo menos cerca de 160 kD, ou pelo menos cerca de 140 kD.
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Portanto, de acordo com esse esquema, um aminoácido natural ou não natural faz contato com um derivado ativado de m-PEG, no caso do tosilato, formando 1 por alquilação do heteroátomo de cadeia lateral Xd. O aminoácido m-PEG monofuncionalizado é submetido a condições de N-acilação com um derivado reativo de m-PEG, assim montando um m-PEG ramificado 2. Como uma pessoa habilitada perceberá, o grupo de partida de tosilato pode ser substituído com qualquer grupo de partida adequado, por exemplo, halogênio, mesilato, triflato etc. De modo similar, o carbonato reativo utilizados para acilar a amina pode ser substituído com um éster ativo, por exemplo, N-hidroxissuccinimida etc., ou o ácido pode ser ativado in situ com o uso de um agente de desidratação como diciclohexilcarbodiimida, carbonildiimidazol etc.
Em outros exemplos de modalidades, a porção de uréia é substituída por um grupo como amida.
II. E. Composições de matéria de conjugado de peptídeo homodi sperso
Além de fornecer conjugados de peptídeo que são formados através de um grupo de ligação de glicosil quimicamente ou enzimaticamente adicionado, a presente invenção fornece composições de matéria que compreendem conjugados de peptídeo que são altamente homogenos em seus padrões de substituição. Com o uso dos métodos da invenção, é possível formar conjugados de peptídeo em que uma proporção substancial dos grupos de ligação de glicosil e porções glicosil por uma população de conjugados de peptídeo é anexada a um aminoácido estruturalmente idêntico ou resíduo de glicosil. Portanto, em um segundo aspecto, a
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154/239 invenção fornece um conjugado de peptídeo que tem uma população de porções de polímero hidrossolúvel, que são covalentemente ligadas ao peptídeo através de um grupo de ligação de glicosil, por exemplo, um grupo de ligação de glicosil intacto. Em um exemplo de conjugado de peptídeo da invenção, essencialmente cada membro da população de polímero hidrossolúvel é ligado por meio do grupo de ligação de glicosil a um resíduo de glicosil do peptídeo, e cada resíduo de glicosil do peptídeo ao qual o grupo de ligação de glicosil é anexado tem a mesma estrutura.
A presente invenção também fornece conjugados análogos àqueles descritos acima em que o peptídeo é conjugado a um grupo de modificação, por exemplo, porção terapêutica, porção diagnostica, porção de direcionamento, porção de toxina ou outras por meio de um grupo de ligação de glicosil. Cada um dos grupos de modificação acima citados d pode ser uma molécula pequena, polímero natural (por exemplo, polipeptídeo) ou polímero sintético. Quando o grupo de modificação é anexado a um ácido siálico, é geralmente preferível que o grupo de modificação seja substancialmente não fluorescente.
Em uma modalidade de exemplo, o peptídeo da invenção inclui pelo menos um sítio de glicosilação ligado em O ou ligado em N, que é glicosilado com um açúcar modificado que inclui um grupo de modificação polimérico, por exemplo, uma porção PEG. Em uma modalidade de exemplo, o PEG é covalentemente ligado ao peptídeo por meio de um grupo de ligação de glicosil intacto, ou por meio de um ligante não glicosil, por exemplo, alquil substituído ou não substituído, heteroalquil substituído ou não substituído. O
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155/239 grupo de ligação de glicosil é covalentemente ligado a um resíduo de aminoácido ou um resíduo de glicosil do peptídeo. Alternativamente, o grupo de ligação de glicosil é anexado a uma ou mais unidades de glicosil de um glicopeptídeo. A invenção também fornece conjugados em que um grupo de ligação de glicosil é anexado a um resíduo de aminoácido e a um resíduo de glicosil.
Os glicanos nos peptídeos da invenção geralmente correspondem àqueles encontrados em um peptídeo que é produzido por células de mamífero (BHK, CHO) ou células de inseto (por exemplo, Sf-9), após remodelagem de acordo com os métodos aqui apresentados. Por exemplo, peptídeo derivado de inseto que é expresso com um núcleo de trimanosil faz contato subseqüentemente com um doador de GlcNAc e uma GlcNAc transferase e um doador de Gal e uma Gal transferase. A anexação de GlcNAc e Gal ao núcleo de tri-manosil é realizada em duas etapas ou em etapa única. Um ácido siálico modificado é adicionado a pelo menos um ramo de uma porção de glicosil como aqui discutido. Aquelas porções Gal que não são funcionalizadas com o ácido siálico modificado são opcionalmente capped por reação com um doador de ácido siálico na presença de uma sialil transferase.
Em uma modalidade de exemplo, pelo menos 60% das porções Gal terminais em uma população de peptídeos são capped com ácido siálico, preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente, pelo menos 80%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90% e ainda mais preferivelmente pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% são capped com ácido siálico.
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II. F. Açúcares de núcleotideo
Em outro aspecto da invenção, a invenção também fornece nucleotideos de açúcar. Exemplos de espécies de acordo com essa modalidade incluem:
Figure BRPI0717505B1_D0266
HO OH
Figure BRPI0717505B1_D0267
Figure BRPI0717505B1_D0268
HO OH
Figure BRPI0717505B1_D0269
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Figure BRPI0717505B1_D0270
em que y é um número inteiro selecionado de 0 a 2 e pelo menos um de R2, R3, R4, R5 ou R6 tem uma estrutura que é um membro selecionado de R16_X2
X5—C r17-x4
Figure BRPI0717505B1_D0271
(OCH^CH2)nA1
CA3A4 (CA5A%
A2(CH2CH2O)rn--A7 (CAeA9)k
CA10A11 H >
\ >
em que as variáveis são como acima descrito.
Em uma modalidade de exemplo, pelo menos um de R2, R3,
R4, R5 ou R6 tem uma estrutura de acordo com a seguinte fórmula:
Figure BRPI0717505B1_D0272
Em uma modalidade de exemplo, A1 e A2 são selecionados de -OH e -OCH3.
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Exemplos de grupos de modificação poliméricos de acordo com essa modalidade incluem a porção:
Figure BRPI0717505B1_D0273
Em uma modalidade de
Figure BRPI0717505B1_D0274
de
R2, R3 exemplo, apenas um
R4
R5 ou R6 tem uma estrutura que inclui os grupos de modificação acima descritos.
Em outra modalidade de exemplo espécies de acordo com essa modalidade incluem:
Figure BRPI0717505B1_D0275
Figure BRPI0717505B1_D0276
θ Vrldlna
HO OH
Figure BRPI0717505B1_D0277
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Figure BRPI0717505B1_D0278
Figure BRPI0717505B1_D0279
Figure BRPI0717505B1_D0280
HO OH
Figure BRPI0717505B1_D0281
em que as variáveis são como acima descrito.
Em outra modalidade de exemplo, espécies de acordo com essa modalidade incluem:
Figure BRPI0717505B1_D0282
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160/239
Figure BRPI0717505B1_D0283
HO OH
Figure BRPI0717505B1_D0284
Figure BRPI0717505B1_D0285
HO OH
Figure BRPI0717505B1_D0286
Figure BRPI0717505B1_D0287
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161/239 em que L-ÍR1)» é um membro selecionado de (OCH2CH2)nA1 ca3a4 (CA5AB)j
A2(CH2CH2O)rri--A7
R16—X2
Figure BRPI0717505B1_D0288
R1?-X4 (CAsA9)k
Figure BRPI0717505B1_D0289
em que as variáveis são como acima descrito.
Em uma modalidade de exemplo, L-ÍR1)» tem uma estrutura de acordo com a seguinte formula:
Az(CH2CH2Oj
Figure BRPI0717505B1_D0290
Em uma modalidade de exemplo, A1 e A2 são selecionados de -OH e -OCH3.
Exemplos de grupos de modificação poliméricos de acordo com essa modalidade incluem a porção:
Figure BRPI0717505B1_D0291
Figure BRPI0717505B1_D0292
Em uma modalidade de exemplo, men são números inteiros independentemente selecionados de cerca de 1 a
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162/239 cerca de 1.000. Em uma modalidade de exemplo, men são números inteiros independentemente selecionados de cerca de 1 a cerca de 500. Em uma modalidade de exemplo, men são números inteiros independentemente selecionados de cerca de 1 a cerca de 70, cerca de 70 a cerca de 150, cerca de 150 a cerca de 250, cerca de 250 a cerca de 375 e cerca de 375 a cerca de 500. Em uma modalidade de exemplo, men são números inteiros independentemente selecionados de cerca de a cerca de 35, cerca de 45 a cerca de 65, cerca de 95 a cerca de 130, cerca de 210 cerca de 370 e cerca de modalidade de exemplo,m selecionados de cerca de modalidade de exemplo,m selecionados de cerca de modalidade de exemplo,m selecionados de cerca de modalidade de exemplo,m selecionados de cerca de modalidade de exemplo,m selecionados de cerca de modalidade de exemplo,m selecionados de cerca de 430 a cerca de 240, cerca de 310 a
420 a cerca de 480. Em uma e n são números inteiros a cerca de 30. Em uma e n são números inteiros a cerca de 65. Em uma e n são números inteiros
100 a cerca de 130. Em uma e n são números inteiros
210 a cerca de 240. Em uma e n são números inteiros
310 a cerca de 37 0. Em uma e n são números inteiros a cerca de 470.
Em outra modalidade de exemplo, espécies de acordo com essa modalidade incluem:
Figure BRPI0717505B1_D0293
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163/239
Figure BRPI0717505B1_D0294
Urldlna
HO OH
Figure BRPI0717505B1_D0295
HO OH
Figure BRPI0717505B1_D0296
Figure BRPI0717505B1_D0297
HO OH
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164/239
Figure BRPI0717505B1_D0298
em que as variáveis são como acima descrito.
Em outra modalidade de exemplo, espécies de acordo com essa modalidade incluem:
Figure BRPI0717505B1_D0299
Figure BRPI0717505B1_D0300
HO OH
Figure BRPI0717505B1_D0301
Figure BRPI0717505B1_D0302
HO OH
Uridina
Figure BRPI0717505B1_D0303
Figure BRPI0717505B1_D0304
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165/239
Figure BRPI0717505B1_D0305
HO OH
Figure BRPI0717505B1_D0306
em que as variáveis são como acima descrito.
Em outra modalidade de exemplo, os açúcares de nucleotideo têm a fórmula que é um membro selecionado de:
Figure BRPI0717505B1_D0307
Figure BRPI0717505B1_D0308
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166/239 (OCH^CH;)^· CAJA'
Figure BRPI0717505B1_D0309
em que as variáveis são como acima descrito.
Um exemplo de açúcar de nucleotídeo de acordo com essa modalidade tem a estrutura:
Figure BRPI0717505B1_D0310
Um exemplo de açúcar de nucleotídeo de acordo com essa modalidade tem a estrutura:
(OCHíCHfhOCHs
Figure BRPI0717505B1_D0311
Em outra modalidade de exemplo, o açúcar de
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167/239 nucleotídeo é baseado na seguinte fórmula:
Figure BRPI0717505B1_D0312
em que os grupos R, e L, representam porções como acima discutido. O índice y é 0, 1 ou 2. Em uma modalidade de exemplo, L é uma ligação entre NH e R1. A base é uma base de ácido nucleico.
Em uma modalidade de exemplo, L-R1 é um membro selecionado de
A2(CH2CH2O)m
R16—X2
X5—C '
R17—X4 (OCH2CH2)nA1 CA3A4 (CA5A6)j
--A7 (CA8A9)k
CA10A11
Figure BRPI0717505B1_D0313
em que as variáveis são como acima descrito.
Em uma modalidade de exemplo, L-R1 tem uma estrutura de acordo com a seguinte fórmula:
Figure BRPI0717505B1_D0314
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Em uma modalidade de exemplo, A1 e A2 são selecionados
de -OH e -OCH3.
III. Os métodos
Além dos conjugados acima discutidos, a presente
invenção fornece métodos para a preparação desses e de
outros conjugados. Além disso, a invenção fornece métodos de prevenção, cura ou melhoria de um estado de doença por administração de um conjugado da invenção a um indivíduo em risco de desenvolver a doença ou um indivíduo que tem a doença.
Em modalidades de exemplo, o conjugado é formado entre uma porção de modificação polimérica e um peptídeo glicosilado ou não glicosilado. O polímero é conjugado ao peptídeo por meio de um grupo de ligação de glicosil, que é interposto, e covalentemente ligado ao peptídeo (ou resíduo de glicosil) e ao grupo de modificação (por exemplo, polímero hidrossolúvel). O método inclui o contato do peptídeo com uma mistura que contém um açúcar modificado e uma enzima, por exemplo, uma glicosiltransferase que conjuga o açúcar modificado ao substrato. A reação é conduzida sob condições adequadas para formar uma ligação covalente entre o açúcar modificado e o peptídeo. A porção de açúcar do açúcar modificado é preferivelmente selecionada de açúcares de nucleotídeo. O método de síntese de um conjugado de peptídeo, que compreende a combinação de a) sialidase; b) uma enzima capaz de catalisar a transferência de um grupo de ligação de glicosil como uma glicosiltransferase, exoglicosidase ou endoglicosidase; c) açúcar modificado; d) peptídeo, assim sintetizando o conjugado de peptídeo. A reação é conduzida sob condições
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169/239 adequadas para formar uma ligação covalente entre o açúcar modificado e o peptideo. A porção de açúcar do açúcar modificado é preferivelmente selecionada de açúcares de nucleotideo.
Em uma modalidade de exemplo, o açúcar modificado, como aqueles acima apresentados, é ativado como os açúcares de nucleotideo correspondentes. Exemplos de nucleotideos de açúcar que são usados na presente invenção em sua forma modificada incluem mono, di ou trifosfatos de nucleotideo ou análogos desses. Em uma modalidade preferida, o nucleotideo de açúcar modificado é selecionado de UDPglicosídeo, CMP-glicosideo, ou GDP-glicosideo. Ainda mais preferivelmente, a porção de nucleotideo de açúcar do nucleotideo de açúcar modificado é selecionada de UDPgalactose, UDP-galactosamina, UDP-glicose, UDP-glicosamina, GDP-manose, GDP-fucose, CMP-ácido siálico, ou CMP-NeuAc. Em uma modalidade de exemplo, o fosfato de nucleotideo é anexado a C-l.
A invenção também fornece o uso de nucleotideos de açúcar modificados com L-R1 na posição de carbono 6. Exemplos de espécies de acordo com essa modalidade incluem:
Figure BRPI0717505B1_D0315
em que os grupos R, e L, representam as porções como acima discutido. O índice y é 0, 1 ou 2. Em uma modalidade de exemplo, L é uma ligação entre NH e R1. a
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170/239 base é uma base de ácido nucleico.
Exemplos de açúcares de nucleotídeo de uso na invenção são descritos nessa. Em outra modalidade de exemplo, açúcares de nucleotídeo de uso na invenção são aqueles em que o carbono na posição 6 é modificado incluindo espécies que têm a estereoquímica de GDP manose, por exemplo:
Figure BRPI0717505B1_D0316
Figure BRPI0717505B1_D0317
em que X5 é uma ligação ou O e as variáveis restantes são como acima descrito. O índice i representa 0 ou 1. O índice a representa um número inteiro de 1 a 20. Os índices e e f representam independentemente números inteiros de 1 a 2.500. Q, como acima discutido, é H ou Ci-Ce alquil substituído ou não substituído. Como aqueles habilitados perceberão, o derivado de serina, em que S é substituído com O também está dentro desse motivo geral.
Ainda em uma outra modalidade de exemplo, a invenção
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171/239 fornece um conjugado em que o açúcar modificado é baseado na estereoquimica de UDP galactose. Um exemplo de açúcar de nucleotideo de uso nessa invenção tem a estrutura:
Figure BRPI0717505B1_D0318
Figure BRPI0717505B1_D0319
são as como em que acima descrito.
Em outra modalidade de exemplo o açúcar de nucleotideo baseado na estereoquimica de glicose.
Exemplos de espécies de acordo com essa modalidade têm as fórmulas:
Figure BRPI0717505B1_D0320
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Figure BRPI0717505B1_D0321
em que as variáveis são como acima descrito.
Portanto, em uma modalidade ilustrativa em que a porção de glicosil é ácido siálico, o método da invenção utiliza compostos que têm as fórmulas:
Figure BRPI0717505B1_D0322
em que L-R1 é como acima discutido, e L1-R1 representa um ligante ligado ao grupo de modificação. Como com L, exemplos de espécies de ligante de acordo com L1 incluem uma ligação, porções alquil ou heteroalquil.
Além disso, como acima discutido, a presente invenção fornece o uso de açúcares de nucleotídeo que são modificados com um polímero hidrossolúvel, que é de cadeia linear ou ramificada. Por exemplo, compostos que têm a fórmula mostrada abaixo são de uso para preparar conjugados dentro do escopo da presente invenção:
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Figure BRPI0717505B1_D0323
e
Figure BRPI0717505B1_D0324
em que X4 é O ou uma ligação.
Em geral, a porção de açúcar ou cassete porção de açúcar-ligante ou o PEG ou os grupos de cassete PEGligante são ligados através do uso de grupos reativos, que são tipicamente transformados pelo processo de ligação em um novo grupo funcional orgânico ou espécies não reativas. O grupo funcional reativo do açúcar, é localizado em qualquer posição na porção de açúcar. Grupos reativos e classes de reações úteis na prática da presente invenção são geralmente aqueles que são bem conhecidos na técnica de química de bioconjugado. Classes de reações atualmente favorecidas disponíveis com porções reativas de açúcar são aquelas que prosseguem sob condições relativamente brandas. Essas incluem, sem limitação, substituições nucleof1licas (por exemplo, reações de aminas e alcoóis com acil haletos, ésteres ativos), substituições eletrofílicas (por exemplo, reações de enamina) e adições a ligações múltiplas carbonocarbono e carbono-heteroátomo (por exemplo, reação de Michael, adição de Diels-Alder). Essa e outras reações úteis são discutidas, por exemplo, em March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY, 3a Ed., John Wiley & Sons, New York,
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1985; Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, San Diego, 1996; e Feeney e cols., MODIFICATION OF PROTEINS; Advances in Chemistry Series, Vol. 198, American Chemical Society, Washington, D.C., 1982.
Grupos funcionais reativos úteis pendentes de um núcleo de açúcar ou grupo de modificação incluem, sem limitação:
(a) grupos carboxil e vários derivados desses que incluem, sem limitação, ésteres de N-hidroxissuccinimida, ésteres de N-hidroxibenztriazol, haletos de ácido, acil imidazol, tioésteres, ésteres de p-nitrofenil, alquil, alcenil, alcinil e ésteres aromáticos;
(b) grupos hidroxil, que podem ser convertidos, por exemplo, a ésteres, éteres, aldeidos etc.
(c) grupos haloalquil, em que o haleto pode ser posteriormente deslocado com um grupo nucleofilico como, por exemplo, uma amina, um ânion de carboxilato, ânion de tiol, carbênion, ou um ion de alcóxido, assim resultando na anexação covalente de um novo grupo no grupo funcional do átomo de halogênio;
(d) grupos dienofilo, que são capazes de participar em reações de Diels-Alder como, por exemplo, grupos maleimido;
(e) grupos aldeido ou cetona, de modo que subseqüente derivatização é possível por meio de formação de derivados de carbonil como, por exemplo, iminas, hidrazonas, semicarbazonas ou oximas, ou por meio de tais mecanismos como adição de Grignard ou adição de alquilítio;
(f) grupos sulfonil haleto para subseqüente reação com aminas, por exemplo, para formar sulfonamidas;
(g) grupos tiol, que podem ser, por exemplo,
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175/239 convertidos a dissulfetos ou reagir com acil haletos;
(h) grupos amina ou sulfidril, que podem ser, por exemplo, acilados, alquilados ou oxidados;
(1) alcenos, que podem, por exemplo, passar por cicloadições, acilação, adição de Michael etc; e (j) epóxidos, que podem reagir com, por exemplo, aminas e compostos hidroxil.
Os grupos funcionais reativos podem ser escolhidos de modo que eles não participem, ou interfiram com as reações necessárias para montar o núcleo de açúcar reativo ou grupo de modificação. Alternativamente, um grupo funcional reativo pode ser protegido de participar na reação pela presença de um grupo de proteção. Aqueles habilitados na técnica compreendem como proteger um grupo funcional particular de modo que ele não interfira com um conjunto escolhido de condições de reação. Para exemplos de grupos de proteção úteis, veja, por exemplo, Greene e cols., PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, John Wiley & Sons, New York, 1991.
Na discussão que se segue, inúmeros exemplos específicos de açúcares modificados que são úteis na prática da presente invenção são apresentados. Nos exemplos de modalidades, um derivado de ácido siálico é utilizado como o núcleo de açúcar ao qual o grupo de modificação é anexado. O foco da discussão sobre derivados de ácido siálico é para clareza de ilustração apenas e não deve limitar o escopo da invenção. Aqueles habilitados na técnica perceberão que várias outras porções de açúcar podem ser ativadas e derivatizadas em uma maneira análoga àquela apresentada com o uso de ácido siálico como um
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176/239 exemplo. Por exemplo, numerosos métodos são disponíveis para modificação de galactose, glicose, Nacetilgalactosamina e fucose para nomear alguns substratos de açúcar, que são prontamente modificados por métodos reconhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Elhalabi e cols., Curr. Med. Chem. 6: 93 (1999); e Schafer e cols., J. Org. Chem. 65: 24 (2000)).
Em uma modalidade de exemplo, o açúcar modificado é baseado em 6-amino-N-acetil-porção de glicosil.
No esquema acima, o índice n representa um número inteiro de 1 a 2.500. Em uma modalidade de exemplo, esse índice é selecionado de modo que o polímero tem cerca de 10 kD, 15 kD ou 20 kD de peso molecular. O símbolo A representa um grupo de ativação, por exemplo, um halo, um componente de um éster ativado (por exemplo, um éster de Nhidroxissuccinimida), um componente de um carbonato (por exemplo, p-nitrofenil carbonato) e outros. Aqueles habilitados na técnica perceberão que outros açúcares de nucleotídeo de PEG-amida são facilmente preparados por esses e métodos análogos.
O peptídeo é tipicamente sintetizado de novo, ou recombinantemente expresso em uma célula procariótica (por exemplo, célula bacteriana, como E. coll) ou em uma célula eucariótica como uma célula de mamífero, levedura, inseto, de fungo ou planta. O peptídeo pode ser uma proteína de comprimento total ou um fragmento. Além disso, o peptídeo pode ser um peptídeo de tipo selvagem ou mutado. Em uma modalidade de exemplo, o peptídeo inclui uma mutação que adiciona um ou mais sítios de glicosilação ligados em O ou N à seqüenciado peptídeo.
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O método da invenção também fornece modificação de peptideos incompletamente glicosilados que são produzidos recombinantemente. Várias glicoproteinas produzidas recombinantemente são incompletamente glicosiladas, expondo resíduos de carboidrato que podem ter propriedades indesejadas, por exemplo, imunogenicidade, reconhecimento pelo RES. O emprego de um açúcar modificado em um método da invenção, o peptídeo pode ser simultaneamente glicosilado e derivatizado, por exemplo, com um polímero hidrossolúvel, agente terapêutico ou outros. A porção de açúcar do açúcar modificado pode ser o resíduo que pode ser conjugado adequadamente ao aceitador em um peptídeo totalmente glicosilado, ou uma outra porção de açúcar com propriedades desej áveis.
Aqueles habilitados perceberão que a invenção pode ser praticada com o uso de substancialmente qualquer peptídeo ou glicopeptídeo de qualquer fonte. Exemplos de peptideos com os quais a invenção pode ser praticada são apresentados em WO 03/031464, e nas referências aqui apresentadas.
Peptideos modificados pelos métodos da invenção podem ser sintéticos ou peptideos de tipo selvagem ou eles podem ser peptideos mutados, produzidos por métodos conhecidos na técnica, como mutagênese direcionada a sítio. Glicosilação de peptideos é tipicamente ligada em N ou ligada em O. Um exemplo de ligação em N é a anexação do açúcar modificado à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As seqüências de tripeptídeo asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, em que X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as seqüências de reconhecimento para anexação enzimática de uma porção de carboidrato à cadeia lateral de asparagina.
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Portanto, a presença de uma dessas seqüências de tripeptídeo em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação potencial. Glicosilação ligada em 0 refere-se à anexação de um açúcar (por exemplo, Nacetilgalactosamina, galactose, manose, GlcNAc, glicose, fucose ou xilose) à cadeia lateral hidroxi de um hidroxiaminoácido, preferivelmente serina ou treonina, embora aminoácidos não usuais ou não naturais, por exemplo, 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina também possam ser usados.
Além disso, em adição a peptídeos, os métodos da presente invenção podem ser praticados com outras estruturas biológicas (por exemplo, glicolipídeos, lipídeos, esfingóides, ceramidas, células inteiras, e outros, contendo um sítio de glicosilação) .
A adição de sítios de glicosilação a um peptídeo ou outra estrutura é convenientemente realizada por alteração da seqüência de aminoácidos de forma que ela contenha um ou mais sítios de glicosilação. A adição também pode ser feita pela incorporação de uma ou mais espécies que apresentam um grupo -OH, preferivelmente resíduos de serina ou treonina, dentro da seqüência de peptídeos (para sítios de glicosilação ligados em O) . A adição pode ser feita por mutação ou por síntese química completa do peptídeo. A seqüência de aminoácidos do peptídeo é preferivelmente alterada através de mudanças no nível de DNA, particularmente por mutação do DNA que codifica o peptídeo em bases pré-selecionadas de forma que são gerados códons que se traduzirão nos aminoácidos desejados. A mutação(s) de DNA é preferivelmente feita com o uso de métodos
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Em uma modalidade exemplar, o sítio de glicosilação é adicionado por embaralhamento de polinucleotídeos. Polinucleotídeos que codificam um peptideo candidato podem ser modulados com protocolos de embaralhamento de DNA. Embaralhamento de DNA é um processo de recombinação recursiva e mutação, realizado por fragmentação aleatória de um conjunto de genes relacionados, seguido por remontagem dos fragmentos por um processo semelhante à reação de cadeia de polimerase. Veja, por exemplo, Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:10747-10751 (1994); Stemmer, Nature 370:389-391 (1994); e Patente U.S. Nos. 5.605.793, 5.837.458, 5.830.721 e 5.811.238.
Peptídeos de exemplo com os quais a invenção pode ser praticada, métodos de adição ou remoção de sítios de glicosilação, e adição ou remoção de estruturas ou subestruturas de glicosil são descritos em detalhes em W003/031464 e relatados em pedidos U.S. e PCT.
A presente invenção também toma vantagem da adição (ou remoção) de um ou mais resíduos glicosil selecionados ao peptideo, após o que, um açúcar modificado é conjugado a pelo menos um dos resíduos de glicosil selecionados do peptideo. A presente modalidade é útil, por exemplo, quando é desejado conjugar o açúcar modificado a um resíduo de glicosil selecionado que tanto não está presente em um peptideo ou não está presente em uma quantidade desejada. Assim, antes do acoplamento de um açúcar modificado a um peptideo, o resíduo de glicosil selecionado é conjugado em relação ao peptideo por acoplamento enzimático ou químico. Em outra modalidade, o padrão de glicosilação de um
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180/239 peptídeo é alterado antes da conjugação do açúcar modificado por remoção de um resíduo de carboidrato do peptídeo. Vide, por exemplo, WO 98/31826.
A adição ou remoção de quaisquer porções de carboidrato presentes no glicopeptídeo é realizada tanto química quanto enzimaticamente. Um exemplo de desglicosilação química é preferivelmente alcançado por exposição da variante do peptídeo ao composto de ácido trifluormetanossulfônico ou um composto equivalente. Esse tratamento resulta na divagem da maior parte ou todos os açúcares, exceto o açúcar de ligação (N-acetilglicosamina ou N-acetilgalactosamina) , embora deixando o peptídeo intacto. A desglicosilação química é descrita por Hakimuddin e outros, 1987, Arch. Bíochem. Bíophys. 259:52 e por Edge e outros, 1981, Anal. Bíochem. 118:131. A divagem enzimática das porções de carboidrato nas variantes dos peptídeos pode ser obtida por uso de várias endo e exoglicosidases conforme descrito por Thotakura e outros, Meth. Enzymol. 138:350 (1987) .
Em uma modalidade de exemplo, o peptídeo é essencialmente completamente dessialilado com neuraminidase antes da realização de etapas de glicoconjugação ou remodelagem no peptídeo. Após a glicoconjugação ou remodelagem, o peptídeo é opcionalmente re-sialilado com o uso de uma sialiltransferase. Em uma modalidade de exemplo, a re-sialilação ocorre essencialmente em cada (por exemplo, >80%, preferivelmente maior que 85%, maior que 90%, preferivelmente maior que 95% e mais preferivelmente maior que 96%, 97%, 98% ou 99%) aceitador de sacaril terminal em uma população de aceitadores de sialil. Em uma modalidade
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181/239 preferida, o sacarideo tem um padrão de sialilação substancialmente uniforme (ou seja, padrão de glicosilação substancialmente uniforme).
A adição química de porções de glicosil é realizada por qualquer processo reconhecido na técnica. A adição enzimática de porções de açúcar é preferivelmente obtida usando uma modificação dos métodos estabelecidos aqui, substituindo unidades de glicosil nativas para os açúcares modificados usados na invenção. Outros métodos de adição de porções de açúcar são revelados na Patente U.S. número 5.876.980, 6.030.815, 5.728.554 e 5.922.577.
Pontos de anexação exemplares para resíduo de glicosil selecionado incluem, porém não estão limitados a: (a) sítios de consenso para glicosilação em N e sítios para glicosilação ligada em O; (b) porções de glicosil terminal que são aceitadoras para uma glicosiltransferase; (c) arginina, asparagina e histidina; (d) grupos carboxila livre; (e) grupos sulfidril livre, tais como aqueles de cisteína; (f) grupos hidroxila livres tais como aqueles de serina, treonina ou hidroxiprolina; (g) resíduos aromáticos tais como aqueles de fenilalanina, tirosina ou triptofano; ou (h) o grupo amida de glutamina. Métodos exemplares de uso na presente invenção são descritos no WO 87/05330 publicado em 11 de setembro de 1987 e em Aplin and Wriston, CRC Grit. Rev. Biochem., páginas 259-306 (1981).
Em uma modalidade, a invenção fornece um método para ligação de dois ou mais peptídeos através de um grupo de ligação. O grupo de ligação é de qualquer estrutura útil e pode ser selecionado de cadeia linear e estruturas de cadeia ramificada. Preferivelmente, cada término do
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182/239 ligante, que é anexado a um peptídeo, inclui um açúcar modificado (isto é, um grupo de ligação de glicosil intacto nascente).
Em um método exemplar da invenção, dois peptídeos são ligados em conjunto através de uma porção ligante que inclui uma polimérica (por exemplo, um ligante PEG) . A construção conforma-se na estrutura geral estabelecida no quadro acima. Conforme descrito aqui, a construção da invenção inclui dois grupos de ligação glicosil intactos (isto é, s + t = 1) . O foco em um ligante PEG que inclui dois grupos glicosil é para fins de clareza e não deve ser interpretado como limitando a identidade dos braços de ligante de uso nesta modalidade da invenção.
Assim, uma porção PEG é funcionalizada em um primeiro término com uma primeira unidade glicosil e em um segundo término, com uma segunda unidade glicosil. As primeira e segunda unidades glicosil são preferivelmente substratos para transferases diferentes, permitindo anexação ortogonal dos primeiro e segundo peptídeos às primeira e segunda unidades glicosil, respectivamente. Na prática, o ligante (glicosil)2-PEG-(glicosil)2 faz contato com o primeiro peptídeo e uma primeira transferase para a qual a primeira unidade glicosil é um substrato, desta forma constituindo o (peptídeo)2-(glicosil)2-PEG-(glicosil)2. A primeira transferase e/ou peptídeo não reagido é então opcionalmente removida da mistura de reação. O segundo peptídeo e a segunda transferase para a qual a segunda unidade de glicosil é um substrato são adicionados ao conjugado de (peptídeo)2-(glicosil)2-PEG-(glicosil)2 constituindo (peptídeo)1-(glicosil)1-PEG-(glicosil)2-(peptídeo)2. Os
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183/239 habilitados na técnica apreciarão que o processo ressaltado acima é também aplicável para formação de conjugados entre mais do que dois peptídeos, por exemplo, o uso de um PEG ramificado, dendrímero, poli(aminoácido), polissacarídeo ou semelhante.
Em uma modalidade de exemplo, o peptídeo que é modificado por um método da invenção é um glicopeptídeo que é produzido em células de mamífero (por exemplo, células CHO) ou em um animal transgênico e portanto, contêm cadeias de oligossacarídeo ligadas em N e/ou ligadas em O, que são incompletamente sialiladas. As cadeias do oligossacarídeo do glicopeptídeo desprovido de um ácido siálico e que contêm um resíduo de galactose terminal podem ser PEGuiladas, PPGuiladas ou modificadas com um ácido siálico modificado.
No Esquema 1, o amino glicosídeo 1 é tratado com o éster ativo de um derivado de aminoácido protegido (por exemplo, glicina), convertendo o resíduo de amina açúcar no aduto de amida de aminoácido protegido correspondente. O aduto é tratado com uma aldolase para formar a-hidroxi carboxilato 2. O composto 2 é convertido no derivado CMP correspondente por ação de sintetase CMP-SA, seguido por hidrogenação catalítica do derivado de CMP para produzir o composto 3. A amina introduzida através da formação do aduto de glicina é utilizada como um local de anexação PEG por reação do composto 3 com um PEG ativado ou o derivado de PPG (por exemplo, PEG-C(O)NHS, PEG-OC(O)O-p-nitrofenil), produzindo espécies como 4 ou 5, respectivamente
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Esquema 1
HO
HO
Figure BRPI0717505B1_D0325
1. Z-Glicina-NHS HO
2. NeuAc Aldolase, piruvato HO ZN
H
OH ° HO. PEG-c
HO OH
O II o—P-o I Λ·
0' νΎνη~οη Η O
-oj' f°
Ó-‘Na \_/ Vo'‘Na HO OH O
CMP-SA-5-NHCOCH2NH—PEG
OH
Figure BRPI0717505B1_D0326
O'*Na
O
TNH o
O
PEG-Ü-NHS
Figure BRPI0717505B1_D0327
1. CMP-SA sintetase, CTP
2. Hypd/C
Figure BRPI0717505B1_D0328
NH2
Figure BRPI0717505B1_D0329
HO
HO h2n'~ynh O 0 l '1 ^N'
O—P-o-'VzOj ©•-Na \7 O’*Na HO OH
O
C(O)O-pNPC
CMP-SA-5-NHCOCH2NH2
CMP-SA-5-NHCOCH2NH—C(O)O-PEG
Em uma modalidade de exemplo, um açúcar modificado pode ser ligado a um sítio de ligação de 0-glicano em um peptídeo. As glicosiltransferases que podem ser usadas para produzir esse conjugado de peptídeo incluem: para Ser56 (Glc-(Xyl)n-Gal-SA-PEG — uma galactosiltransferase e sialiltransferase; para Ser56 —Glc-(Xyl)n-Xyl-PEG — uma xilosiltransferase; e para Ser60-Fuc-GlcNAc-(Gal)n-(SA)mPEG — uma GlcNAc transferase.
III. A. Conjugação de Açúcares Modificados em Peptideos
Os açúcares modificados com PEG são conjugados a um peptídeo glicosilado ou não glicosilado usando uma enzima adequada para mediar a conjugação. Preferivelmente, as concentrações de açúcar(es) doador(es) modificado(s), enzima(s) e peptídeo(s) aceitador(es) são selecionadas, de modo que, a glicosilação prossegue até o aceitador ser consumido. As considerações discutidas abaixo, embora
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185/239 apresentadas no contexto de uma sialiltransferase são geralmente aplicáveis a outras reações de glicosiltransferase. Uma lista de sialiltransferases preferidas para uso na invenção é fornecida na FIG. 6.
Vários métodos de uso de glicosiltransferases para sintetizar estruturas de oligossacarídeo desejadas são conhecidos e são geralmente aplicáveis à presente invenção. Métodos de exemplo são descritos, por exemplo, no WO 96/32491, Ito e outros, Pure Appl. Chem. 65: 753 (1993), e Patente U.S. números 5.352.670, 5.374,541 e 5.545.553, Pat. U.S. de domínio público Nos. 6.399.336, e 6.440.703, e Pedidos PCT publicados de domínio público, WO 03/031464, WO 04/033651, WO 04/099231, que são aqui incorporados por referência.
A presente invenção é praticada usando uma glicosiltransferase simples ou uma combinação de glicosiltransferases. Por exemplo, pode-se usar uma combinação de sialiltransferase e uma galactosiltransferase. Naquelas modalidades que usam mais de uma enzima, as enzimas e substratos são preferivelmente combinados em uma mistura de reação inicial ou as enzimas e reagentes para a segunda reação enzimática são adicionados ao meio de reação, uma vez que a primeira reação enzimática está completa ou quase completa. Por condução de duas reações enzimáticas em seqüência em um recipiente simples, os rendimentos totais são aperfeiçoados em relação aos procedimentos nos quais uma espécie intermediária é isolada. Além disto, a limpeza e descarte de solventes extras e subprodutos é reduzida.
Em uma modalidade preferida, cada uma das primeira e
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186/239 segunda enzimas é uma glicosiltransferase. Em outra modalidade preferida, uma enzima é uma endoglicosidase. Em uma modalidade preferida adicional, mais de duas enzimas são usadas para montar a glicoproteína modificada da invenção. As enzimas são usadas para alterar uma estrutura de sacarídeo no peptideo em qualquer ponto antes ou após a adição do açúcar modificado ao peptideo.
Em uma outra modalidade, o método faz uso de uma ou mais exo ou endoglicosidase. A glicosidase é tipicamente um mutante, que é transformado por engenharia para formar ligações de glicosil ao invés de romper as mesmas. A glicanase mutante inclui, tipicamente, uma substituição de um resíduo de aminoácido para um resíduo de aminoácido ácido de sítio ativo. Por exemplo, quando a endoglicanase é endo-H, os resíduos de sítio ativo substituídos tipicamente serão Asp na posição 130, Glu na posição 132 ou uma combinação desses. Os aminoácidos são geralmente substituídos por serina, alanina, asparagina ou glutamina.
A enzima mutante catalisa a reação, geralmente por uma etapa de síntese que é análoga à reação inversa da etapa de hidrólise de endoglicanase. Nestas modalidades, a molécula doadora de glicosil (por exemplo uma estrutura oligo ou monossacarídea desejada) contém um grupo de partida e a reação se processa com a adição da molécula doadora a um resíduo de GlcNAc na proteína. Por exemplo, o grupo de partida pode ser um halogênio, tal como flúor. Em outras modalidades, o grupo de partida é uma porção Asn ou Asnpeptídeo. Ainda em modalidades adicionais, o resíduo de GlcNAc na molécula doadora de glicosil é modificado. Por exemplo, o resíduo de GlcNAc pode compreender uma porção
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1,2-oxazolina.
Em uma modalidade preferida, cada uma das enzimas utilizada para produzir um conjugado da invenção está presente em uma quantidade catalítica. A quantidade catalítica de uma enzima específica varia de acordo com a concentração daquele substrato da enzima, bem como as condições de reação tais como, temperatura, tempo e valor de pH. Meios para determinar a quantidade catalítica para uma dada enzima sob concentrações de substrato préselecionadas e condições de reação são bem conhecidas dos habilitados na técnica.
A temperatura na qual um processo descrito acima é realizado pode variar de imediatamente acima do congelamento à temperatura na qual a maior parte da enzima sensível desnatura. As faixas de temperatura preferidas são de cerca de 0°C a cerca de 55°C e, mais preferivelmente, cerca de 20°C a cerca de 37°C. Em outra modalidade exemplar, um ou mais componentes do presente método são conduzidos em uma temperatura elevada usando uma enzima termofílica.
A mistura de reação é mantida por um período de tempo suficiente para que o aceitador seja glicosilado, dessa forma formando o conjugado desejado. Algum conjugado pode freqüentemente ser detectado após algumas horas, com quantidades recuperáveis geralmente sendo obtidas dentro de 24 horas ou menos. Os habilitados na técnica entenderão que a taxa de reação é dependente de vários fatores variáveis (por exemplo, concentração de enzima, concentração de doador, concentração de aceitador, temperatura, volume do solvente) que são otimizados para um sistema selecionado
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A presente invenção também provê a produção em escala industrial de peptídeos modificados. Como aqui usado, uma escala industrial geralmente produz pelo menos 1 grama de conjugado finalizado, purificado.
Na discussão que se segue a invenção é exemplificada pela conjugação de porções de ácido siálico modificadas a um peptídeo glicosilado. O ácido siálico modificado de exemplo é rotulado com PEG. O foco da discussão que se segue no uso do ácido siálico modificado por PEG e peptídeos glicosilados é quanto a clareza de ilustração e não se destina a implicar no fato de que a invenção esteja limitada à conjugação desses dois parceiros. Uma pessoa habilitada entenderá que a discussão é geralmente aplicável às adições de porções de glicosil modificadas que não ácido siálico. Além disso, a discussão é igualmente aplicável à modificação de uma unidade de glicosil com agentes que não PEG incluindo outras porções de PEG, porções terapêuticas e biomoléculas.
Uma abordagem enzimática pode ser usada para a introdução seletiva de carboidratos Peguilados ou PPGuilados em um peptídeo ou glicopeptídeo. O método utiliza açúcares modificados contendo PEG, PPG ou um grupo funcional reativo mascarado e é combinado com a glicosiltransferase ou glicosintase apropriada. Selecionando-se a glicosiltransferase que tornará a ligação carboidrato desejada e com a utilização do açúcar modificado como o substrato doador, PEG ou PPG podem ser introduzidos diretamente no esqueleto do peptídeo, nos resíduos de açúcar existentes de um glicopeptídeo ou em resíduos de açúcar que foram adicionados a um peptídeo.
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Em uma modalidade de exemplo, um aceitador para a sialiltransferase está presente no peptídeo a ser modificado tanto como uma estrutura de ocorrência naturalmente quanto uma colocada lá recombinante, enzimática ou quimicamente. Aceitadores apropriados incluem, por exemplo, aceitadores de galactosil tais como Gaipi,4GlcNAc, Gaipi,4GalNAc, Gaipi,3GalNAc, lacto-Ntetraose, Gaipi,3GlcNAc, Gaipi,3Ara, Gaipi,6GlcNAc, Gal31,4Glc (lactose) e outros aceitadores conhecidos dos habilitados na técnica (vide, por exemplo, Paulson e outros, J. Biol. Chem. 253:5617-5624 (1978)). Exemplos de sialiltransferases são aqui apresentados.
Em uma modalidade, um aceitador para a sialiltransferase está presente no glicopeptídeo a ser modificado por síntese in vivo do glicopeptídeo. Tais glicopeptídeos podem ser sialilados usando os métodos reivindicados sem posterior modificação do padrão de glicosilação do glicopeptídeo. Alternativamente, os métodos da invenção podem ser usados para sialilar um peptídeo que não inclui um aceitador adequado; um primeiro modifica o peptídeo para incluir um aceitador por métodos conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Em uma modalidade de exemplo, um resíduo GalNAc é adicionado pela ação de uma GalNAc transferase.
Em uma modalidade exemplar, o aceitador de galactosil é montado por anexação de um resíduo de galactose a um aceitador apropriado ligado ao peptídeo, por exemplo um GlcNAc. O método inclui incubação do peptídeo a ser modificado com uma mistura de reação que contém uma quantidade apropriada de uma galactosiltransferase (por
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190/239 exemplo, gaipi,3 ou gaipi,4) e um doador de galactosil adequado (por exemplo, UDP-galactose). A reação é deixada para processar substancialmente até terminar ou alternativamente, a reação é terminada quando uma quantidade pré-selecionada do resíduo de galactose é adicionada. Outros processos de montagem de um aceitador de sacarídeo selecionado ficarão aparentes aos habilitados na técnica.
Ainda em outra modalidade, os oligossacarídeos ligados ao glicopeptídeo são primeiro aparados, tanto no total quanto em parte, para expor tanto um aceitador para a sialiltransferase quanto uma porção à qual um ou mais resíduos adequados podem ser adicionados para obter um aceitador adequado. Enzimas, tais como, glicosiltransferases e endoglicosidades (vide, por exemplo, Patente U.S. número 5.716.812) são úteis para reações de anexação e aparamento. Em uma outra modalidade desse método, as porções de ácido siálico do peptídeo são essencialmente completamente removidas (por exemplo, pelo menos 90, pelo menos 95 ou pelo menos 99%), expondo um aceitador para um ácido siálico modificado.
Na discussão que se segue, o método da invenção é exemplificado pelo uso de açúcares modificados possuindo uma porção de PEG anexada aos mesmos. O foco da discussão é para clareza da ilustração. Os habilitados na técnica apreciarão que a discussão é igualmente relevante para aquelas modalidades nas quais o açúcar modificado porta uma porção terapêutica, biomolécula ou outras.
Em uma modalidade exemplar da invenção em que um resíduo de carboidrato é aparado antes da adição do
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191/239 açúcar modificado, alta manose é retro-aparada para a estrutura biantenária de primeira geração. Um açúcar modificado que sustenta PEG é conjugado a um ou mais dos resíduos de açúcar expostos pelo retro-aparamento. Em um exemplo, uma porção de PEG é adicionada via uma porção de GlcNAc conjugada à porção de PEG. A GlcNAc modificada é anexada a um ou ambos dos resíduos de manose terminais da estrutura biantenária. Alternativamente, uma glcNAc não modificada pode ser adicionada a um ou ambos terminar das espécies ramificadas.
Em outra modalidade exemplar, um uma porção de PEG é adicionada a um ou ambos dos resíduos de manose terminal da estrutura biantenária através de um açúcar modificado possuindo um resíduo de galactose, que é conjugado ao resíduo de GlcNAc adicionado aos resíduos de manose terminal. Alternativamente, uma Gal não modificada pode ser adicionada a um ou ambos resíduos de GlcNAc terminal.
Ainda em outro exemplo, uma porção de PEG é adicionada ao resíduo de Gal usando um ácido siálico modificado como aquele acima discutido.
Em outra modalidade exemplar, uma estrutura de manose superior é retroaparada à manose da qual a estrutura biantenária se ramifica. Em um exemplo, uma porção de PEG é adicionada via uma GlcNAc modificada com o polímero. Alternativamente, uma GlcNAc não modificada é adicionada à manose, seguida por a Gal com uma porção de PEG anexada. Ainda em outra modalidade, resíduos Gal e GlcNAc não modificados são adicionados seqüencialmente à manose, seguido por uma porção de ácido siálico modificada com uma porção de PEG.
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Uma estrutura de manose superior também pode ser retro-aparada ao núcleo de tri-manosil elementar.
Em uma modalidade de exemplo adicional, manose é retro-aparada à GlcNAc à qual a primeira manose é anexada. A GlcNAc é conjugada a um resíduo de Gal que sustenta uma porção de PEG. Alternativamente, uma Gal não modificada é adicionada à GlcNAc, seguida pela adição de um ácido siálico modificado com um açúcar hidrossolúvel. Ainda em um exemplo adicional, a GlcNAc terminal é conjugada com Gal e a GlcNAc é subseqüentemente fucosilada com uma fucose modificada que sustenta uma porção de PEG.
Manose superior também pode ser retro-aparada à primeira GlcNAc anexada à Asn do peptídeo. Em um exemplo, a GlcNAc do resíduo GlcNAc-(Fuc)a é conjugada com a GlcNAc que sustenta um polímero hidrossolúvel. Em um outro exemplo, a GlcNAc do resíduo GlcNAc-(Fuc)a é modificada com Gal, que sustenta um polímero hidrossolúvel. Ainda em uma modalidade adicional, a GlcNAc é modificada com Gal, seguida pela conjugação à Gal d um ácido siálico modificado com uma porção de PEG.
Outras modalidades de exemplo são apresentadas nas Publicações de Pedidos de Patente U.S. de domínio público: 20040132640; 20040063911; 20040137557; Pedidos de Patente U.S. Nos: 10/369.979; 10/410.913; 10/360.770; 10/410.945 e PCT/US02/32263 cada um desses é aqui incorporado por referência.
Os exemplo acima discutidos fornecem ma ilustração do poder dos métodos aqui apresentados. Com o uso dos métodos aqui descritos, é possível retro-aparar e construir um resíduo de carboidrato de substancialmente qualquer
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193/239 estrutura desejada. O açúcar modificado pode ser adicionado ao terminal da porção de carboidrato como apresentado acima, ou ele pode ser intermediário entre o núcleo do peptídeo e o terminal do carboidrato.
Em uma modalidade de exemplo, um ácido siálico existente é removido de um glicopeptídeo com o uso de um sialidase, dessa forma desmascarando todos ou a maior parte dos resíduos de galactosil subjacentes. Alternativamente, um peptídeo ou glicopeptídeo é rotulado com resíduos de galactose, ou um resíduo de oligossacarídeo que termina em uma unidade de galactose. Após a exposição ou adição dos resíduos de galactose, uma sialiltransferase adequada é usada para adicionar um ácido siálico modificado.
Em uma outra modalidade de exemplo, uma enzima que transfere ácido siálico em ácido siálico é utilizada. Esse método pode ser praticado sem tratamento de um glicano sialilado com uma sialidase para expor resíduos de glicano debaixo do ácido siálico. Um exemplo de polímero-ácido siálico modificado é um ácido siálico modificado com poli (etileno glicol) . Outras enzimas de exemplo que adicionam ácido siálico e porções de ácido siálico modificado em glicanos que incluem um resíduo de ácido siálico ou trocam um resíduo de ácido siálico existente em um glicano para essas espécies incluem ST3Gal3, CST-II, ST8Sia-II, ST8Sia-III e ST8Sia-IV.
Em uma abordagem adicional, uma funcionalidade reativa mascarada está presente no ácido siálico. O grupo reativo mascarado é preferivelmente não afetado pelas condições usadas para anexar o ácido siálico modificado ao peptídeo de Fator VII/Fator Vila. Depois da anexação covalente do
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194/239 ácido siálico modificado ao peptídeo, a máscara é removida e o peptídeo é conjugado com um agente como PEG. O agente é conjugado ao peptídeo em uma maneira específica por sua
reação como o grupo reativo não mascarado no resíduo de
açúcar modificado.
Qualquer açúcar modificado pode ser usado com sua
glicosiltransferase apropriada, dependendo dos açúcares
terminais das cadeias laterais de oligossacarídeo do glicopeptídeo. Conforme discutido acima, o açúcar terminal do glicopeptídeo necessário para a introdução da estrutura PEGuilada pode ser introduzido naturalmente durante a expressão ou pode ser produzido após expressão usando a(s) glicosidase(s), glicosiltransferase(s) apropriadas ou mistura de glicosidase(s) e glicosiltransferase(s).
Em uma modalidade de exemplo adicional, UDP-galactosePEG reage com βΐ,4-galactosiltransferase, desse modo transferindo a galactose modificada para a estrutura terminal de N-acetilglicosamina adequada. Os resíduos de GlcNAc terminal no glicopeptídeo podem ser produzidos durante expressão, como pode ocorrer em tais sistemas de expressão como mamífero, inseto, planta ou fungos, mas também podem ser produzidos por tratamento do glicopeptídeo com uma sialidase e/ou glicosidase e/ou glicosiltransferase, como necessário.
Em uma outra modalidade de exemplo, uma GlcNAc transferase, como GNT1-5, é utilizada para transferir PEGuilada-GlcNAc a um resíduo de manose terminal em um glicopeptídeo. Ainda em uma outra modalidade de exemplo, estruturas de glicano ligadas em N e/ou ligada em O são enzimaticamente removidas de um glicopeptídeo para expor um
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195/239 aminoácido ou um resíduo de glicosil terminal que é subseqüentemente conjugado com o açúcar modificado. Por exemplo, uma endoglicanase é usada para remover as estruturas ligadas em N de um glicopeptídeo para expor uma GlcNAc terminal como uma GlcNAc-ligada-Asn no glicopeptídeo. UDP-Gal-PEG e a galactosiltransferase adequada são usados para introduzir a funcionalidade de PEG-galactose na GlcNAc exposta.
Em uma modalidade alternativa, o açúcar modificado é adicionado diretamente ao esqueleto do peptídeo usando uma glicosiltransferase conhecida por transferir resíduos de açúcar para o esqueleto do peptídeo. Glicosiltransferases exemplares úteis na prática da presente invenção incluem, porém não estão limitadas a, GalNAC transferases (GalNAc Tl-14), GlcNAc transferases, fucosiltransferases, glicosiltranferases, xilosiltransferases, manosiltransferases e semelhantes. O uso desta abordagem permite a adição direta de açúcares modificados nos peptídeos que não possuem qualquer carboidrato ou, alternativamente nos glicopeptídeos existentes. Em ambos os casos, a adição de açúcar modificado ocorre em posições específicas no esqueleto de peptídeo, conforme definido pela especificidade do substrato da glicosiltransferase e não em uma maneira aleatória como ocorre durante a modificação de um esqueleto de peptídeo de proteína usando métodos químicos. Um conjunto de agentes pode ser introduzido nas proteínas ou glicopeptídeos que não possuem seqüência de peptídeo de substrato de glicosiltransferase por transformação por engenharia da seqüência de aminoácido adequada na cadeia de polipeptídeo.
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Em cada uma das modalidades exemplares estabelecidas acima, uma ou mais etapas de modificação química ou enzimática adicionais podem ser utilizadas seguindo-se a conjugação do açúcar modificado ao peptídeo. Em uma modalidade exemplar, uma enzima (por exemplo, fucosiltransferase) é usada para anexar uma unidade de glicosil (por exemplo, fucose) ao açúcar modificado terminal anexado ao peptídeo. Em outro exemplo, uma reação enzimática é utilizada para capear sítios aos quais o açúcar modificado falhou em conjugar. Alternativamente, uma reação química é utilizada para alterar a estrutura do açúcar modificado conjugado. Por exemplo, o açúcar modificado conjugado reage com agentes que estabilizam ou desestabilizam sua ligação com o componente de peptídeo ao qual o açúcar modificado é anexado. Em outro exemplo, um componente do açúcar modificado é desprotegido, seguindo-se sua conjugação ao peptídeo. Uma pessoa habilitada perceberá que existe um conjunto de procedimentos enzimáticos e químicos que são úteis nos métodos da invenção em um estágio após o açúcar modificado ser conjugado no peptídeo. Elaboração adicional do conjugado de açúcar-peptídeo modificado encontra-se dentro do escopo da invenção.
Enzimas e condições de reação para a preparação de conjugados da presente invenção são discutidos em detalhes na parente do atual pedido bem como nos pedidos de patente PCT publicados de co-propriedade WO 03/031464, WO 04/033651, WO 04/099231.
Em uma modalidade selecionada, um peptídeo, expresso em células de inseto, é remodelado de modo que glicanos no glicopeptídeo remodelado incluam um resíduo de glicosil
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GlcNAc-Gal. A adição de GlcNAc e Gal pode ocorrer como reações separadas ou como uma reação única em um frasco único. Nesse exemplo, GlcNAc-transferase I e Galtransferase I são usadas. A porção sialil modificada é adicionada com o uso de ST3Gal-III.
Em uma outra modalidade, a adição de GlcNAc, Gal e Sia modificadas também pode ocorrer em um frasco de reação único, usando as enzimas apresentadas acima. Cada uma das etapas de remodelagem enzimática e glicoPEGuilação são realizadas individualmente.
Quando o peptideo é expresso em células de mamífero, diferentes métodos são de uso. Em uma modalidade, o peptideo é conjugado sem necessidade de remodelagem antes da conjugação por contato do peptideo com uma sialiltransferase que transfere o ácido siálico modificado diretamente a um ácido siálico no peptideo formando SiaSia-L-R1, ou troca um ácido siálico no peptideo pelo ácido siálico modificado, formando Sia-L-R1. Uma enzima de exemplo de uso nesse método é CST-II. Outras enzimas que adicionam ácido siálico a ácido siálico são conhecidas por aqueles habilitados na técnica e exemplos de tais enzimas são apresentados nas Figuras anexadas.
Ainda em um outro método de preparação de conjugados da invenção, o peptideo expresso em um sistema de mamífero é dessialilado com o uso de uma sialidase. O resíduo de Gal exposto é sialilado com um ácido siálico modificado com o uso de uma sialiltransferase específica para glicanos ligados em O, gerando um peptideo com glicano ligado em O modificado. O peptideo dessialilado, modificado é opcionalmente parcialmente ou totalmente ressialilado pelo
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198/239 uso de uma sialiltransferase como ST3GalIII.
Em um outro aspecto, A invenção fornece um método de fazer um conjugado de peptídeo PEGuilado da invenção. O método inclui:
o contato de um peptídeo que compreende um grupo glicosil selecionado de:
GaINAc
Gal (Sia)e
Com um doador de PEG-ácido um membro selecionado de siálico que tem a fórmula que é
Figure BRPI0717505B1_D0330
Figure BRPI0717505B1_D0331
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Figure BRPI0717505B1_D0332
em que as variáveis são como acima descrito, e uma enzima que transfere PEG-ácido siálico do referido doador para um membro selecionado de GalNAc, Gal e Sia do referido grupo glicosil, sob condições adequadas para a referida transferência. Um doador de ácido siálico modificado de exemplo é CMP-ácido siálico modificado, através de uma porção ligante, com um polímero, por exemplo, uma porção de poli(etileno glicol) de cadeia linear ou ramificada. Como aqui discutido, o peptídeo é opcionalmente glicosilados= com GalNAc e/ou Gal e/ou Sia (Remodelado) antes da anexação ao açúcar modificado. As etapas de remodelagem podem ocorrer em seqüência no mesmo frasco sem purificação do peptídeo glicosilado entre as etapas. Alternativamente, após uma ou mais etapas de remodelagem, o peptídeo glicosilado pode ser purificado antes de submetê-lo à próxima etapa de glicosilação ou glicoPEGuilação. Em uma modalidade de exemplo, o método também compreende a expressão do peptídeo em um hospedeiro. Em uma modalidade de exemplo, o hospedeiro é uma célula de mamífero ou uma célula de inseto. Em uma outra modalidade de exemplo, a célula de mamífero é um membro selecionado de uma célula
BHK e células CHO e a célula de inseto é uma célula de
Spodoptera frugiperda.
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Como ilustrado nos exemplos e discutido adicionalmente abaixo, a colocação de uma porção aceitadora para o PEGaçúcar é realizada em qualquer número de etapas desejado. Por exemplo, em uma modalidade, a adição de GalNAc ao peptideo pode ser seguida por uma segunda etapa em que o PEG-açúcar é conjugado à GalNAc no mesmo frasco de reação. Alternativamente, essas duas etapas podem ser realizadas em um frasco único aproximadamente simultaneamente.
Em uma modalidade de exemplo, o doador de PEG-ácido siálico tem a fórmula:
Figure BRPI0717505B1_D0333
(OCHjCHjJ.A1
Figure BRPI0717505B1_D0334
Figure BRPI0717505B1_D0335
em que as variáveis são como acima descrito.
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Em outra modalidade de exemplo, o doador de PEG-ácido siálico tem a fórmula:
h£n
Figure BRPI0717505B1_D0336
em que as variáveis são como acima descrito.
Em uma modalidade de exemplo adicional, o peptídeo é expresso em um sistema de expressão adequado antes de ser glicoPEGuilado ou remodelado. Exemplos de sistemas de expressão incluem células Sf-9/baculovírus e de Ovário de Hamster da China (CHO).
Em uma modalidade de exemplo, a invenção fornece um método de fazer um conjugado de peptídeo que compreende um ligante de glicosil que compreende um resíduo de sialil modificado que tem a fórmula:
Figure BRPI0717505B1_D0337
em que D é um membro selecionado de -OH e R1-L-HN-; G é um membro selecionado de R^L e -C(O) (Ci-Ce) alquil-R1; R1 é uma porção que compreende um membro selecionado de um resíduo de poli(etileno glicol) de cadeia linear e resíduo de poli(etileno glicol) ramificado; M é um membro selecionado de H, um metal e uma carga negativa única; L é um ligante que é um membro selecionado de uma ligação, alquil substituído ou não substituído e heteroalquil
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202/239 substituído ou não substituído, de modo que quando D é OH,
G é R1-L-, e quando G é -0(0) (Ci-C6) alquil, D é R1-L-NH o referido método compreendendo: (a) o contato de um peptídeo que compreende a porção glicosil:
Gal^—, com uma porção doadora de
PEG-ácido siálico que tem a fórmula:
Figure BRPI0717505B1_D0338
nh2 em que as variáveis são como acima descrito, e uma enzima que transfere o referido PEG- ácido siálico na Gal da referida porção glicosil, sob condições adequadas para a referida transferência.
Em uma modalidade de exemplo, L-R1 tem a fórmula:
Figure BRPI0717505B1_D0339
em que a é um número inteiro selecionado de 0 a 20.
Em uma outra modalidade de exemplo, R1 tem uma estrutura que é um membro selecionado de:
Figure BRPI0717505B1_D0340
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Figure BRPI0717505B1_D0341
nhc<ox:h,chjoch.ch2)X3ch3
Figure BRPI0717505B1_D0342
NHCIOIOCHjCH/OCHjCHjXOCH,
Figure BRPI0717505B1_D0343
NHClO/XH^CH/OCH/ÍH^OCH,;
O
Figure BRPI0717505B1_D0344
NH C<O)CH,CH^OCH/:H JOCH,
em que e, f, m e n são números inteiros
independentemente selecionados de 1 a 2.500; e q é um
número inteiro selecionado de 0 a 20.
Quantidades de grande escala ou de pequena escala de
conjugado de peptídeo podem ser produzidas pelos métodos aqui descritos. Em uma modalidade de exemplo, a quantidade de peptídeo é um membro selecionado de cerca de 0,5 mg a cerca de 100 kg. Em uma modalidade de exemplo, a quantidade de peptídeo é um membro selecionado de cerca de 0,1 kg a cerca de 1 kg. Em uma modalidade de exemplo, a quantidade de peptídeo é um membro selecionado de cerca de 0,5 kg a cerca de 10 kg. Em uma modalidade de exemplo, a quantidade de peptídeo é um membro selecionado de cerca de 0,5 kg a cerca de 3 kg. Em uma modalidade de exemplo, a quantidade de peptídeo é um membro selecionado de cerca de 0,1 kg a cerca de 5 kg. Em uma modalidade de exemplo, a quantidade de peptídeo é um membro selecionado de cerca de 0,08 kg a cerca de 0,2 kg. Em uma modalidade de exemplo, a quantidade de peptídeo é um membro selecionado de cerca de 0,05 kg a cerca de 0,4 kg. Em uma modalidade de exemplo, a quantidade de peptídeo é um membro selecionado de cerca de 0,1 kg a cerca de 0,7kg. Em uma modalidade de exemplo, a quantidade de peptídeo é um membro selecionado de cerca de 0,3 kg a
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204/239 cerca de 1,75 kg. Em uma modalidade de exemplo, a quantidade de peptídeo é um membro selecionado de cerca de 25 kg a cerca de 65 kg.
A concentração de peptídeo utilizada nas reações aqui descritas é um membro selecionado de cerca de 0,5 a cerca de 10 mg de peptídeo/mL de mistura de reação. Em uma modalidade de exemplo, a concentração do peptídeo é um membro selecionado de cerca de 0,5 a cerca de 1 mg de peptídeo/mL de mistura de reação. Em uma modalidade de exemplo, a concentração de peptídeo é um membro selecionado de cerca de 0,8 a cerca de 3 mg de peptídeo/mL de mistura de reação. Em uma modalidade de exemplo, a concentração do peptídeo é um membro selecionado de cerca de 2 a cerca de 6 mg de peptídeo/mL de mistura de reação. Em uma modalidade de exemplo, a concentração do peptídeo é um membro selecionado de cerca de 4 a cerca de 9 mg peptídeo/mL de mistura de reação. Em uma modalidade de exemplo, a concentração do peptídeo é um membro selecionado de cerca de 1,2 a cerca de 7,8 mg de peptídeo/mL de mistura de reação. Em uma modalidade de exemplo, a concentração do peptídeo é um membro selecionado de cerca de 6 a cerca de 9,5 mg de peptídeo/mL de mistura de reação.
A concentração de açúcar de nucleotídeo PEGuilado que pode ser utilizada nas reações aqui descritas é um membro selecionado de cerca de 0,1 a cerca de 1,0 mM. Fatores que podem aumentar ou diminuir a concentração incluem o tamanho do PEG, tempo de incubação, temperatura, componentes do tampão, bem como o tipo, e concentração, de glicosiltransferase usada. Em uma modalidade de exemplo, a concentração de açúcar de nucleotídeo PEGuilado é um membro
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205/239 selecionado de cerca de 0,1 a cerca de 1,0 mM. Em uma modalidade de exemplo, a concentração de açúcar de nucleotídeo PEGuilado é um membro selecionado de cerca de 0,1 a cerca de 0,5 mM. Em uma modalidade de exemplo, a concentração de açúcar de nucleotídeo PEGuilado é um membro selecionado de cerca de 0,1 a cerca de 0,3 mM. Em uma modalidade de exemplo, a concentração de açúcar de nucleotídeo PEGuilado é um membro selecionado de cerca de 0,2 a cerca de 0,7 mM. Em uma modalidade de exemplo, a concentração de açúcar de nucleotídeo PEGuilado é um membro selecionado de cerca de 0,3 a cerca de 0,5 mM. Em uma modalidade de exemplo, a concentração de açúcar de nucleotídeo PEGuilado é um membro selecionado de cerca de 0,4 a cerca de 1,0 mM. Em uma modalidade de exemplo, a concentração de açúcar de nucleotídeo PEGuilado é um membro selecionado de cerca de 0,5 a cerca de 0,7 mM. Em uma modalidade de exemplo, a concentração de açúcar de nucleotídeo PEGuilado é um membro selecionado de cerca de 0,8 a cerca de 0,95 mM. Em uma modalidade de exemplo, a concentração de açúcar de nucleotídeo PEGuilado é um membro selecionado de cerca de 0,55 a cerca de 1,0 mM.
Os equivalentes molares de de açúcar de nucleotídeo PEGuilado que podem ser utilizados nas reações aqui descritas são baseados no número teórico de açúcares PEGuilados que podem ser adicionados à proteína. O número teórico de açúcares PEGuilados é baseado no número teórico de sítios de sialilação na proteína bem como no peso molecular da proteína quando comparado ao peso molecular e dessa forma moles de açúcar de nucleotídeo PEGuilado. Em uma modalidade de exemplo, os equivalentes molares de
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206/239 açúcar de nucleotídeo PEGuilado é um número inteiro selecionado de 1 a 20. Em uma modalidade de exemplo, os equivalentes molares de açúcar de nucleotídeo PEGuilado é um número inteiro selecionado de 1 a 20. Em uma modalidade de exemplo, os equivalentes molares de açúcar de nucleotídeo PEGuilado é um número inteiro selecionado de 2 a 6. Em uma modalidade de exemplo, os equivalentes molares de açúcar de nucleotídeo PEGuilado é um número inteiro selecionado de 3 a 17. Em uma modalidade de exemplo, os equivalentes molares de açúcar de nucleotídeo PEGuilado é um número inteiro selecionado de 4 a 11. Em uma modalidade de exemplo, os equivalentes molares de açúcar de nucleotídeo PEGuilado é um número inteiro selecionado de 5 a 20. Em uma modalidade de exemplo, os equivalentes molares de açúcar de nucleotídeo PEGuilado é um número inteiro selecionado de 1 a 10. Em uma modalidade de exemplo, os equivalentes molares de açúcar de nucleotídeo PEGuilado é um número inteiro selecionado de 12 a 20. Em uma modalidade de exemplo, os equivalentes molares de açúcar de nucleotídeo PEGuilado é um número inteiro selecionado de 14 a 17. Em uma modalidade de exemplo, os equivalentes molares de açúcar de nucleotídeo PEGuilado é um número inteiro selecionado de 7 a 15. Em uma modalidade de exemplo, os equivalentes molares de açúcar de nucleotídeo PEGuilado é um número inteiro selecionado de 8 a 16.
III. B. Dessialilação e GlicoPEGuilação simultânea
A presente invenção fornece um método one-pot de glicopeguilação. O método de one-pot é distinto de outros processos de exemplo para fazer um conjugado de peptídeo, que emprega uma de-sialilação seqüencial com sialidase,
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207/239 subseqüente purificação do asialo-peptídeo em uma coluna de troca de ânion, então glicoPEGuilação com o uso de CMPácido siálico-PEG e uma glicosiltransferase (como ST3Gal3), exoglicosidase ou uma endoglicosidase. O conjugado de peptídeo é então purificado via troca de ânion seguida por cromatografia de exclusão por tamanho para produzir o conjugado de peptídeo purificado.
O método de one-pot é um método aperfeiçoado para produzir um conjugado de peptídeo. Nesse método, as reações de de-sialilação e glicoPEGuilação são combinadas em uma reação de one-pot que evita a primeira etapa de cromatografia de troca de ânion usada no processo anteriormente descritos para purificar o assialo peptídeo. Essa redução nas etapas do processo produz várias vantagens. Primeiro, o número de etapas de processo necessárias para produzir o conjugado de peptídeo é reduzido, o que também reduz a complexidade de operação do processo, segundo, o tempo do processo para a produção dos conjugados de peptídeo é reduzido, por exemplo, de 4 a 2 dias. Isso reduz as necessidades de material bruto e custos de controle de qualidade associados com controles emprocesso. Terceiro, a invenção utilizes menos sialidase, por exemplo, até 20 vezes menos sialidase, por exemplo, 500 mU/L são necessários para produzir o conjugado de peptídeo em relação ao processo. Essa redução no uso de sialidase reduz significativamente a quantidade de contaminantes, como sialidase, na mistura de reação.
Em uma modalidade de exemplo, um conjugado de peptídeo é preparado pelo seguinte método. Em uma primeira etapa, um peptídeo é combinado com a sialidase, um açúcar modificado
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208/239 da invenção, e uma enzima capaz de catalisar a transferência do grupo de ligação de glicosil do açúcar modificado ao peptideo, portanto preparando o conjugado de peptideo. Qualquer sialidase pode ser usada nesse método. Exemplos de sialidases de uso na invenção podem ser encontrados no banco de dados CAZY (veja, http://afinb cnrs-mrs.fr/CAZY/index.html e www.cazy.org/CAZY). Sialidases de exemplo podem ser adquiridas de qualquer número de fontes (QA-Bio, Calbiochem, Marukin, Prozyme etc.) . Em uma modalidade de exemplo, a sialidase é um membro selecionado de sialidases citoplasmáticas, sialidases lisossômicas, exo-α sialidases, e endosialidases. Em uma outra modalidade de exemplo, a sialidase usada é produzida a partir de bactérias como Clostridium perfringens ou Streptococcus pneumoniae, ou de um vírus como um adenovirus. Em uma modalidade de exemplo, a enzima capaz de catalisar a transferência do grupo de ligação de glicosil do açúcar modificado ao peptideo é um membro selecionado de uma glicosiltransferase, como sialiltransferases e fucosiltransferases, bem como exoglicosidases e endoglicosidases. Em uma modalidade de exemplo, a enzima é uma glicosiltransferase, que é ST3Gal3. Em uma outra modalidade de exemplo, a enzima usada é produzida a partir de bactérias como Escherichia Coli ou um fungo como Aspergillus niger. Em uma outra modalidade de exemplo, a sialidase é adicionada ao peptideo antes da glicosiltransferase por um tempo especificado, permitindo que a reação de sialidase prossiga antes do início da reação de glicoPEGuilação com adição do reagente de PEGácido siálico e a glicosiltransferase. Vários desses
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209/239 exemplos são aqui discutidos. Finalmente, qualquer açúcar modificado aqui descrito pode ser utilizado nessa reação.
Em uma outra modalidade de exemplo, o método também compreende uma etapa de capping. Nessa etapa, ácido siálico não PEGuilado adicional é adicionado à mistura de reação. Em uma modalidade de exemplo, esse ácido siálico é adicionado ao peptídeo ou conjugado de peptídeo portanto evitando adição adicional de PEG-ácido siálico. Em uma outra modalidade de exemplo, esse ácido siálico impede a função da glicosiltransferase na mistura de reação, interrompendo eficazmente a adição de grupos de ligação de glicosil ao peptídeo ou conjugados de peptídeo. Mais importantemente, o ácido siálico que é adicionado à mistura de reação cobre os glicanos não glicoPEGuilados assim fornecendo um conjugado de peptídeo que tem melhor farmacocinética. Em adição, essa sialidase pode ser adicionada diretamente à mistura de reação de glicoPEGuilação quando a extensão da PEGuilação a certas quantidades é desejada sem purificação prévia.
Em uma modalidade de exemplo, depois da etapa de cobertura (capping), menos que cerca de 50% dos sítios de sialilação no peptídeo ou conjugado de peptídeo não compreendem uma porção sialil. Em uma modalidade de exemplo, depois da etapa de cobertura (capping), menos que cerca de 40% dos sítios de sialilação no peptídeo ou conjugado de peptídeo não compreendem uma porção sialil. Em uma modalidade de exemplo, depois da etapa de cobertura (capping), menos que cerca de 30% dos sítios de sialilação no peptídeo ou conjugado de peptídeo não compreendem uma porção sialil. Em uma modalidade de
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210/239 exemplo, depois da etapa de cobertura (capping), menos que cerca de 20% dos sítios de sialilação no peptideo ou conjugado de peptideo não compreendem uma porção sialil. Em uma modalidade de exemplo, depois da etapa de cobertura
(capping), menos que cerca de 10% dos sítios de
sialilação no peptideo ou conjugado de peptideo não
compreendem uma porção sialil. Em uma modalidade de
exemplo, entre cerca de 20% e cerca de 5% dos sítios de
sialilação no peptideo ou conjugado de peptideo não
compreendem uma porção sialil. Em uma modalidade de
exemplo, entre cerca de 25% e cerca de 10% dos sítios de
sialilação no peptideo ou conjugado de peptideo não
compreendem uma porção sialil. Em uma modalidade de
exemplo, depois da etapa de cobertura (capping), essencialmente todos os sítios de sialilação no peptideo ou conjugado de peptideo compreendem uma porção sialil.
III. C. Dessialilação e modificação seletiva de peptideos
Em uma outra modalidade de exemplo, a presente invenção fornece um método para dessialilação de um peptideo. O método preferivelmente fornece um peptideo que é pelo menos cerca de 40%, preferivelmente 45%, preferivelmente cerca de 50%, preferivelmente cerca de 55%, preferivelmente cerca de 60%, preferivelmente cerca de 65%, preferivelmente cerca de 70%, preferivelmente cerca de 75%, preferivelmente cerca de 80%, preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, ainda mais preferivelmente, pelo menos 92%, preferivelmente pelo menos 94%, ainda mais preferivelmente pelo menos 96%, ainda mais preferivelmente pelo menos 98%, e ainda mais preferivelmente 100% dissialilados.
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O método inclui o contato do peptídeo com uma sialidase, preferivelmente por um período de tempo. O período de tempo pré-selecionado é suficiente para dessialilar o peptídeo ao grau desejado. Em uma modalidade preferida, o peptídeo dessialilado é separado da sialidase quando o grau desejado de dessialilação é atingido. Uma reação de dessialilação e ciclo de purificação de exemplo é aqui apresentada.
Aqueles habilitados são capazes de determinar um período de tempo pré-selecionado adequado pelo qual conduzir a reação de dessialilação. Em uma modalidade de exemplo, o período é de menos que 24 horas, preferivelmente menos que 8 horas, mais preferivelmente menos que 6 horas, mais preferivelmente menos que 4 horas, mais preferivelmente menos que 2 horas e ainda mais preferivelmente menos que 1 hora.
Em uma outra modalidade de exemplo, na preparação de conjugado de peptídeo ao final da reação de dessialilação, pelo menos 10% dos membros da população de peptídeos tem apenas um único ácido siálico anexado a ele, preferivelmente pelo menos 20%, mais preferivelmente pelo menos 30%, ainda mais preferivelmente pelo menos 40%, ainda mais preferivelmente pelo menos 50% e mais preferivelmente pelo menos 60%, e ainda mais preferivelmente completamente dessialilado.
Ainda em uma modalidade de exemplo adicional, na preparação ao final da reação de dessialilação, pelo menos 10% dos membros da população dos peptídeos são totalmente dessialilados, preferivelmente pelo menos 20%, mais preferivelmente pelo menos 30%, mais preferivelmente pelo
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212/239 menos 40%, ainda mais preferivelmente pelo menos 50% e ainda mesmo mais preferivelmente pelo menos 60%.
Ainda em uma outra modalidade de exemplo, na preparação de conjugado de peptídeo ao final da reação de dessialilação, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50% ou 60% dos membros da população de peptídeo tem apenas um único ácido siálico, e pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50% ou 60% do peptídeo é totalmente dessialilado.
Em uma modalidade preferida, na preparação ao final da reação de dessialilação, pelo menos 50% da população de peptídeos é totalmente dessialilada e pelo menos 40% dos membros da população de peptídeo sustenta apenas uma única porção de ácido siálico.
Após a dessialilação, o peptídeo é opcionalmente conjugado com um açúcar modificado. Uma exemplo de açúcar modificado inclui uma porção sacaril ligada a uma porção de poli(etileno glicol) ramificado ou linear. A conjugação é catalisada por uma enzima que transfere o açúcar modificado de um doador de açúcar modificado para um aminoácido ou resíduo de glicosil do peptídeo. Um doador de açúcar modificado de exemplo é um CMP-ácido siálico que sustenta uma porção de poli(etileno glicol) ramificado ou linear. Um exemplo de porção de poli(etileno glicol) tem um peso molecular de pelo menos cerca de 2 KDa, mais preferivelmente pelo menos cerca de 5 KDa, mais preferivelmente pelo menos cerca de 10 KDa, preferivelmente pelo menos cerca de 20 KDa, mais preferivelmente pelo menos cerca de 30 KDa, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 40 KDa.
Em uma modalidade de exemplo, a enzima utilizada para
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213/239 transferir a porção do açúcar modificado do doador de açúcar modificado é uma glicosiltransferase, por exemplo, sialiltransferase. Uma sialiltransferase de exemplo de uso nos métodos da invenção é ST3Gal3.
Um método de exemplo da invenção resulta em um peptídeo modificado que sustenta pelo menos um, preferivelmente pelo menos dois, preferivelmente pelo menos três grupos de modificação. Em uma modalidade, o peptídeo produzido sustenta um único grupo de modificação na cadeia leve do peptídeo. Em uma outra modalidade, o método fornece um peptídeo modificado que sustenta um único grupo de modificação na cadeia pesada. Ainda em uma outra modalidade, o método fornece um peptídeo modificado com um único grupo de modificação na cadeia leve e um único grupo de modificação na cadeia pesada.
Em um outro aspecto, a invenção fornece um método de preparação de um peptídeo modificado. O método inclui o contato do peptídeo com um doador de açúcar modificado que sustenta um grupo de modificação e uma enzima capaz de transferir a porção de açúcar modificado do doador de açúcar modificado para um aminoácido ou resíduo de glicosil do peptídeo.
Em uma modalidade de exemplo, o método fornece uma população de peptídeos modificados em que pelo menos 40%, preferivelmente pelo menos 50%, preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 70% e ainda mais preferivelmente pelo menos 80% dos membros da população são mono-conjugados na cadeia leve do peptídeo.
Em uma modalidade de exemplo, o método fornece uma população de peptídeos modificados em que pelo menos 40%,
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214/239 preferivelmente pelo menos 50%, preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 70% e ainda mais preferivelmente pelo menos 80% dos membros da população são di-conjugados na cadeia leve do peptídeo.
Em uma modalidade de exemplo desse aspecto, o método fornece uma população de peptídeos modificados em que não mais que 50%, preferivelmente não mais que 30%, preferivelmente não mais que 20%, mais preferivelmente não mais que 10% dos membros da população são mono-conjugados na cadeia pesada do peptídeo.
Em uma modalidade de exemplo desse aspecto, o método fornece uma população de peptídeos modificados em que não mais que 50%, preferivelmente não mais que 30%, preferivelmente não mais que 20%, mais preferivelmente não mais que 10% dos membros da população são di-conjugados na cadeia pesada do peptídeo.
O peptídeo pode ser submetido à ação de uma sialidase antes da etapa de contato, ou o peptídeo pode ser usado sem dessialilação prévia. Quando o peptídeo faz contato com uma sialidase ele pode ser completamente dessialilado ou apenas parcialmente dessialilado. Em uma modalidade preferida, o peptídeo é pelo menos parcialmente dessialilado antes da etapa de contato. O peptídeo pode ser essencialmente completamente dessialilado (essencialmente assialo) ou apenas parcialmente dessialilado. Em uma modalidade preferida, o peptídeo dessialilado é uma das modalidades dessialiladas acima descritas.
III. D. Alíquotas adicionais de reagentes adicionados na síntese de conjugados de peptídeo
Em uma modalidade de exemplo da síntese dos conjugados
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215/239 de peptídeo aqui descritos, uma ou mais alíquotas adicionais de um componente/reagente da reação são adicionadas à mistura de reação depois de um período de tempo selecionado. Em uma modalidade de exemplo, o conjugado de peptídeo é um conjugado de peptídeo. Em uma outra modalidade de exemplo, um componente/reagente da reação adicionado é um nucleotídeo de açúcar modificado. A introdução de um nucleotídeo de açúcar modificado em uma reação aumentará probabilidade de levar a reação de glicoPEGuilação à finalização. Em uma modalidade de exemplo, o açúcar de nucleotídeo é um CMP-SA-PEG aqui descrito. Em uma modalidade de exemplo, um componente/reagente da reação adicionado é uma sialidase. Em uma modalidade de exemplo, um componente/reagente da reação adicionado é uma glicosiltransferase. Em uma modalidade de exemplo, um componente/reagente da reação adicionado é magnésio. Em uma modalidade de exemplo, a alíquota adicional adicionada representa cerca de 10%, ou 20%, ou 30%, ou 40%, ou 50%, ou 60%, ou 70%, ou 80% ou 90% da quantidade original adicionada no início da reação. Em uma modalidade de exemplo, um componente/reagente da reação é adicionado à reação cerca de 3 horas, ou 6 horas, ou 8 horas, ou 10 horas, ou 12 horas, ou 18 horas, ou 24 horas, ou 30 horas, ou 36 horas depois de seu início.
III. E. Purificação de conjugado de peptídeos
Os produtos produzidos pelos processos acima podem ser usados sem purificação. No entanto, é usualmente preferível recuperar o produto e um ou mais dos intermediários, por exemplo, açúcares de nucleotídeo, espécies de PEG ramificado e linear, açúcares modificados e açúcares de
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216/239 nucleotídeo modificados. Técnicas padrão bem conhecidas para recuperação de peptídeo glicosilado como cromatografia de camada fina ou espessa, cromatografia em coluna, cromatografia de troca iônica, ou filtração de membrana podem ser usadas. É preferível usar filtração de membrana, mais preferivelmente utilizando uma membrana osmótica reversa, ou uma ou mais técnicas cromatográficas em coluna para a recuperação como é discutido posteriormente nessa e na literatura aqui citada. Por exemplo, filtração de membrana em que as membranas têm valor de corte de peso molecular de cerca de 3.000 a cerca de 10.000 pode ser usada para remover proteínas como glicosil transferases. Em certos casos, as diferenças de valor de corte de peso molecular entre a impureza e o produto serão utilizadas para assegurar a purificação do produto. Por exemplo, para purificar o produto peptídeo-SA-PEG-40 kD de CMP-SAPEG-40KD que não reagiu, deve ser escolhido um filtro que permitirá, por exemplo, que peptídeo -SA-PEG40KD permaneça na retenção enquanto permite que CMP-SA-PEG-40KD flua no filtrado. Nanofiltração ou osmose reversa podem ser então usadas para remover sais e/ou purificar os sacarídeos do produto (veja, por exemplo, WO 98/15581). Membranas de nanofiltro são uma classe de membranas de osmose reversa que passam sais monovalentes mas retêm sais polivalentes e solutos não carregados maiores que cerca de 100 a cerca de 2.000 Daltons, dependendo da membrana usada. Portanto, em uma aplicação típica, sacarídeos preparados pelos métodos da presente invenção serão retidos na membrana e sais de contaminação passarão através dela.
Se o peptídeo for produzido intracelularmente, como
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217/239 uma primeira etapa, os resíduos em partículas, quer de células hospedeiras quer fragmentos de lise, são removidos. Após a glicoPEGuilação, o peptídeo PEGuilado é purificado por métodos reconhecidos na técnica, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração; opcionalmente, a proteína pode ser concentrada com um filtro de concentração de proteínas disponível no comércio, seguindo-se da separação da variante de peptídeo de outras impurezas por uma ou mais etapas selecionadas dentre cromatografia por imunoafinidade, fracionamento de coluna de troca de íons (por exemplo, em dietilamino-etila (DEAE) ou em matrizes contendo grupos carboxi-metil ou sulfo-propil) , cromatografia sobre Azul-Sefarose, CM Azul-Sefarose, MONOQ, MONO-S, lentilha-lectina-Sefarose, WGA Sefarose, Con ASefarose, Éter Toyopearl, Butil Toyopearl, Fenil Toyopearl, ou proteína A Sefarose, cromatografia SDS-PAGE, cromatografia sobre sílica, cromato-focalização, HPLC de fase reversa (por exemplo, sílica gel com um grupo alifático anexado), filtração por gel, empregando-se, por exemplo, peneiras moleculares de Sephadex ou cromatografia de exclusão por tamanho, cromatografia em colunas que se ligam seletivamente ao polipeptídeo, e etanol, ou precipitação de sulfato de amônio. A purificação pode ser usada para separar uma cadeia do conjugado de peptídeo de Fator VII/Fator Vila da outra, como também descrito posteriormente nessa seção.
Os glicopeptídeos modificados produzidos em cultura são geralmente isolados por extração inicial de células, enzimas etc., seguindo-se uma ou mais etapas de concentração, extração de sal, troca de íons aquosos, ou de
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218/239 cromatografia de exclusão por tamanho. Além disso, a glicoproteína modificada pode ser purificada por cromatografia de afinidade. Em seguida pode-se empregar HPLC para as etapas finais de purificação.
Um inibidor de protease pode ser incluído em qualquer uma das etapas acima para inibir a proteólise e podem ser incluídos antibióticos ou conservantes para impedir o crescimento de contaminantes adventícios. Os inibidores de protease usados nas etapas anteriores podem ser inibidores de baixo peso molecular, incluindo antidor, alfa-1antitripsina, anti-trombina, leupeptina, amastatina, quimostatina, banzamidin, bem como outros inibidores de serina de protease (ou seja serpinas). Geralmente, inibidores de serina protease devem ser usados em concentrações que variam de 0,5 — 100 pM, embora quimostatina em cultura de células possa ser usada em concentrações de até 200 pM. Outros serina inibidores de protease incluirão inibidores específicos para a quimiotripsina-like, subtilisina-like, alfa/beta hidrolase, ou os clãs de peptidase de sinal de serina proteases. Além de serina proteases, outros tipos de inibidores de protease também podem ser usados, incluindo inibidores de cisteína protease (1 - 10 pM) e inibidores de aspártico protease (1 -5 pM) , bem como inibidores de protease não específicos como pepstatina (0,1 — 5 pM). Inibidores de protease usados nessa invenção também podem incluir inibidores de protease naturais, como o inibidor de hirustasina isolado de sanguessuga. Em algumas modalidades, inibidores de protease compreenderão peptídeos sintéticos ou anticorpos que são capazes de se ligar com especificidade ao sítio catalítico
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219/239 de protease para estabilizar Fator VII/Fator Vila sem interferir com a reação de glicoPEGuilação.
Em uma outra modalidade, sobrenadantes de sistemas que produzem o glicopeptídeo modificado da invenção são primeiro concentrados empregando-se um filtro de concentração de proteína comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Arnicon ou Millipore Pellicon. Depois da etapa de concentração, o concentrado pode se r aplicado a uma matriz adequada de purificação. Por exemplo, uma matriz de afinidade adequada pode compreender, um ligante para o peptideo, uma molécula de lecitina ou de anticorpo ligada a um suporte adequado. Alternativamente, pode ser empregada uma resina de troca de ânions, por exemplo, uma matriz ou substrato que tenha grupamentos DEAE pendentes. As matrizes adequadas incluem acrilamida, agarose, dextrano, celulose ou outros tipos habitualmente empregados na purificação de proteínas. Alternativamente, pode ser empregada uma etapa de troca de cátions. Os trocadores de cátions adequados incluem diversas matrizes insolúveis que compreendem grupos sulfopropil ou carboximetil. Os grupos sulfopropil são especialmente preferidos.
Outros métodos de uso na purificação incluem cromatografia de exclusão por tamanho (SEC), cromatografia de hidroxiapatita, cromatografia de interação hidrofóbica e cromatografia em azul Sefarose. Esses e outros métodos úteis são ilustrados na Patente Provisória U.S. de coautoria No. (Proceso No. 40853-01-5168-P1, depositada em 6 de maio de 2005).
Uma ou mais etapas de RP-HPLC que empregam meios de
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RP-HPLC hidrófobos, por exemplo, gel de silica tendo grupos metil pendentes ou outros grupos alifáticos, podem ser empregados para purificar ainda mais a composição de conjugado de polipeptídeos. Algumas ou todas as etapas de purificação acima ou todas elas, em diversas combinações, podem também ser empregadas para produzir uma glicoproteína modificada essencialmente homogênea.
O glicopeptídeo modificado da invenção que resulta de uma fermentação em grande escala pode ser purificado por métodos análogos aos descritos por Urdal e cols., J. Chromatog. 296: 171 (1984). Essa referência descreve duas etapas de RP-HPLC em seqüência para a purificação de IL-2 humana recombinante sobre uma coluna de HPLC preparatório. Alternativamente, podem ser utilizadas técnicas tais como cromatografia de afinidade, para a purificação da glicoproteína modificada.
Em uma modalidade de exemplo, a purificação é realizada pelos métodos apresentados na Patente Provisória U.S. de domínio público, No. 60/665.588, depositada em 24 de março de 2005.
De acordo com a presente invenção, peptídeos PEGuilados ou conjugados de peptídeo produzidos via dessialilação seqüencial ou sialilação simultânea podem ser purificados ou resolvidos pelo uso de um gradiente de cloreto de magnésio.
IV. Composições farmacêuticas
Em um outro aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica. A composição farmacêutica inclui um diluente farmaceuticamente aceitável e um conjugado covalente entre uma porção de PEG de ocorrência não natural, porção
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221/239 terapêutica ou biomolécula e um peptídeo glicosilado ou não glicosilado. O polímero, porção terapêutica ou biomolécula é conjugado ao peptídeo via um grupo de ligação de glicosil intacto interposto e ligado de forma covalente ao peptídeo e ao polímero, porção terapêutica ou biomolécula
Composições farmacêuticas da invenção são adequadas para uso em uma variedade de sistemas de liberação de medicamento. Formulações adequadas para uso na presente invenção são encontradas em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, PA, 17a ed. (1985). Para uma breve revisão dos métodos para liberação de medicamento, veja, Langer, Science 249:15271533 (1990).
Em uma modalidade de exemplo, a formulação farmacêutica compreende um peptídeo conjugado e um diluente farmaceuticamente aceitável que é um membro selecionado de cloreto de sódio, dihidrato de cloreto de cálcio, glicilglicina, polissorbato 80, e manitol. Em uma outra modalidade de exemplo, o diluente farmaceuticamente aceitável é cloreto de sódio e glicilglicina. Em uma outra modalidade de exemplo, o diluente farmaceuticamente aceitável é dihidrato de cloreto de cálcio e polissorbato 80. Em uma outra modalidade de exemplo, o diluente farmaceuticamente aceitável é manitol.
As composições farmacêuticas podem ser formuladas para qualquer modo adequado de administração, incluindo, por exemplo, a administração tópica, oral, nasal, intravenosa, intracraniana, intraperitonial, subcutânea ou intramuscular. Para a administração parenteral, tal como por injeção subcutânea, o veículo compreende de
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222/239 preferência, água, solução salina, álcool, uma gordura, uma cera ou um tampão. Para a administração oral, qualquer um dos veículos acima ou um veículo sólido, tal como manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, talco, celulose, glicose, sacarose carbonato de magnésio pode ser empregado. Micro-esferas biodegradáveis (tal como de polilactato poliglicolato) podem também ser empregadas como veículos para as composições farmacêuticas dessa invenção. As micro-esferas biodegradáveis adequadas são reveladas, por exemplo, na Patente U.S. 4.897.268 e 5.075.109.
Habitualmente, as composições farmacêuticas são administradas por via parenteral, por exemplo, por via intravenosa. Assim, a invenção propõe composições para a administração parenteral que compreendem o composto dissolvido ou suspenso em um veículo aceitável, de preferência um veículo aquoso, por exemplo, água, água tamponada, solução salina, PBS e outros. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis como necessário para se aproximar de condições fisiológicas, como ajuste de pH e agentes de tamponamento, agentes de ajuste de tonicidade, agentes umectantes, detergentes e outros.
Essas composições podem ser esterilizadas por técnicas de esterilização convencionais ou podem se esterilizadas por filtração. As soluções aquosas resultantes podem ser acondicionadas para uso conforme estão, ou liofilizadas, sendo o preparado liofilizado combinado com um veículo aquoso estéril antes da administração. O pH dos preparados se encontrará tipicamente entre 3 e 11, sendo mais
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223/239 preferível entre 5 e 9, e o mais preferível de 7 a 8.
Em algumas modalidades, os glicopeptídeos da invenção podem ser incorporados a lipossomos formados de lipídios padrão formadores de vesículas. Vários métodos são disponíveis para a preparação de lipossomos, conforme descrito em Szoka e outros, Ann Rev. Biophys. Bioeng. 9:
467 (1980); Patentes U.S 4.235.871, 4.501.728 e
4.837.0128. 0 direcionamento de lipossomos empregando- -se
uma variedade de agentes de direcionamento (por exemplo,
sialil galactosídeos da invenção) é bem conhecido na
técnica (veja , por exemplo, Patente U.S. 4.957.773 e
4.603.044) .
Métodos padrão para o acoplamento de agentes de
direcionamento a lipossomos podem ser usados. Estes métodos geralmente abrangem a incorporação a lipossomos de componentes lipídios, tais como fosfatidiletanolamina, que podem ser ativados para fixação dos agentes de direcionamento ou compostos lipofílicos derivados tais como glicopeptídeos derivados de lipídeos da invenção.
Os mecanismos de direcionamento geralmente exigem que os agentes de direcionamento estejam posicionados na superfície do lipossomo de um modo tal, que as porções alvo estejam disponíveis para a interação com o alvo, por exemplo, um receptor de superfície celular. Os carboidratos da invenção podem ser ligados a uma molécula de lipídios antes do lipossomo se formar empregando-se métodos conhecidos daqueles habilitados na técnica (por exemplo, alquilação ou acilação do grupo hidroxil presente no carboidrato com um haleto de alquila de cadeia longa ou com um ácido graxo, respectivamente). Alternativamente, o
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224/239 lipossomo pode ser projetado de tal modo que uma porção conectora é primeiro incorporada à membrana no momento da formação da membrana. A porção conectora deve ter uma porção lipofilica, que é firmemente engastada e ancorada na membrana. Ela também deve ter uma porção reativa, que seja disponível quimicamente na superfície aquosa do lipossomo. A porção reativa é selecionada de modo tal, que ela será adequada quimicamente para formar uma ligação química estável com o agente de direcionamento ou carboidrato, que é acrescentado mais tarde. Em alguns casos é possível se ligar diretamente o agente de direcionamento à molécula conectora, mas na maioria dos casos é mais adequado se empregar uma terceira molécula para agir como uma ponte química, ligando desse modo a molécula conectora que se encontra dentro da membrana com o agente de direcionamento ou carboidrato que é estendido, nas três dimensões para fora da superfície da vesícula.
Os compostos preparados por métodos da invenção podem também ter uso como reagentes de diagnóstico. Por exemplo, compostos rotulados, por exemplo, podem ser usados para localizar áreas de inflamação ou metástase tumoral em um paciente sob suspeita de ter uma inflamação. Para tal fim, os compostos podem ser rotulados com 125I, 14C ou trítio.
Métodos preparatórios para espécies de uso na preparação de composições da invenção são geralmente apresentados em várias publicações de patente, por exemplo, US 20040137557; WO 04/083258; e WO 04/033651. Os exemplos a seguir são fornecidos para ilustrar os conjugados, e métodos da presente invenção, mas não devem limitar a invenção reivindicada.
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EXEMPLOS
EXEMPLO 1
Dessialilação de Fator Vila.
Fator Vila que foi expresso em meio livre de soro, Fator Vila que foi produzido em meio contendo soro, mais três mutantes de Fator Vila N145Q, N322Q, e análogo DVQ (V158D/E296V/M298Q).
Na preparação para dessialilação enzimática, Fator Vila foi dialisado em MES, 150 mM NaCl, 5 mM CaC12, 50mM MES, pH 6 de um dia para o outro a 4 °C em tubo de diálise Snakeskin com um MWCO de 10 KDa. Dessialilação de Fator Vila (1 mg/mL) foi realizada com 10 U/L sialidase solúvel de Arthrobacter ureafacíens (Calbiochem) a 32 °C por 18 horas no tampão trocado.
EXEMPLO 2
Sialil-PEGuilação de Fator Vila.
Sialil-PEGuilação (GlicoPEGuilação) foi realizada em assialo-Fator Vila (1 mg/mL) com 100 U/L ST3Gal-III e 200 μΜ CMP-ácido siálico-PEG (40 KDa, 20 KDa, 10 KDa, 5 KDa, e 2 KDa) a 32°C no tampão de dessialilação por 2-6 horas. Depois do tempo de reação adequado ter expirado, a amostra PEGuilada foi imediatamente purificada para minimizar GlicoPEGuilação adicional.
Para cobrir Fator VII/Fator Vila GlicoPEGuilado com amostras cobertas com ácido siálico, a sialidase foi primeiro removida de assialo-Fator Vila por cromatografia de troca aniônica como indicado abaixo. Excesso de CMPácido siálico (5 mM) foi adicionado e incubado a 32°C por 2 horas, cobrindo Fator Vila glicoPEGuilado com ácido siálico. As formas de sialil-PEGuilado de Fator Vila foram
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226/239 analisadas por SDS-PAGE não redutor (géis de Tris-glicina e/ou géis de NuPAGE) e um kit de coloração de azul coloidal, como descrito por Invitrogen.
EXEMPLO 3
Purificação de Fator Vila PEGuilado.
Amostras glicoPEGuiladas de Fator Vila foram purificadas com um método de troca aniônica modificado. Amostras foram manuseadas a 5°C. Imediatamente antes da carga na coluna, 1 g Chelex 100 (BioRad) por 10 mL de solução de Fator Vila foi adicionado à amostra remodelada. Depois de agitação por 10 min, a suspensão foi filtrada em uma membrana de acetato de celulose (0,2 pm) com um sistema de vácuo. A resina quelante retida no filtro foi lavada uma vez com 1-2 mL água por 10 mL. A condutividade do filtrado foi ajustada a 10 mS/cm a 5°C, e ajustada a pH 8,6, se necessário.
Troca aniônica foi realizada a 8-10°C. Uma coluna contendo Q Sepharose FE foi preparada antes da carga por lavagem com 1 M NaOH (10 volumes de coluna) , água (5 volumes de coluna), 2 M NaCl, 50 mM HOAc, pH 3 (10 volumes de coluna), e equilibrando com 175 mM NaCl, 10 mM glicilglicina, pH 8,6 (10 volumes de coluna) . Para cada reação de PEGuilação, 15-20 mg Fator Vila foi carregado a uma coluna XK16 (Amersham Biosciences) com 10 mL Q Sepharose FE (não mais que 2 mg proteína por mL de resina) em uma taxa de fluxo de 100 cm/h. para o PEG de 2 KDa linear, 20 mg de Fator Vila foi carregado em um coluna XK26 (Amersham Biosciences) com 40 mL Q Sepharose FE (0,5 mg proteína ppr mg de resina) em uma taxa de fluxo de 100 cm/h.
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Após a carga, a coluna foi lavada com 175 mM NaCl, 10 mM glicilglicina, pH 8,6 10 volumes de coluna) e 50 mM NaCl, 10 mM glicilglicina, pH 8,6 (2 volumes de coluna) . Eluição foi realizada com um gradiente de etapa de 15 mM CaC12 pelo uso de 50 mM NaCl, 10 mM glicilglicina, 15 mM CaC12, pH 8,6 (5 volumes de coluna) . A coluna foi então lavada com 1 M NaCl, 10 mM glicilglicina, pH 8,6 (5 volumes de coluna). O efluente foi monitorado por absorvência a 280 nrn. Frações (5 mL) foram coletadas durante o fluxo-através e as duas lavagens; frações de 2,5 mL foram coletadas durante as eluições de CaCU e 1M de sal. Frações contendo Fator Vila foram analisadas por SDS-PAGE não redutor (géis de Tris-glicina e/ou géis de NUPAGE) e um kit de coloração de azul coloidal. As frações adequadas com Fator Vila foram reunidas, e o pH foi ajustado a 7,2 com 4 M HC1.
Fator VIIa-SA-PEG-lOKDa foi purificado como descritos acima, exceto pelas seguintes mudanças. EDTA (10 mM) foi adicionada à solução de Fator Vila PEGuilado, o pH foi ajustado a pH 6, e a condutividade foi ajustada a 5mS/cm, a 5°C. Cerca de 20 mg de Fator VIIa-SA-PEG-lOKDa foi carregado a uma coluna XK16 (Amersham Biosciences) com 10 mL Poros de 50 Micron resina HQ (não mais que 2 mg de proteína por mL, resina) em uma taxa de fluxo de 100 cm/h. Após a carga, a coluna foi lavada com 175 mM NaCl, 10 mM histidina pH 6 (10 volumes de coluna) e 50 mM NaCl, 10 mM histidina, pH 6 (2 volumes de coluna). Eluição foi realizada com um gradiente de etapa de 20 mM CaCU em 50 mM NaCl, 10 mM histidina, pH 6 (5 volumes de coluna). A coluna foi então lavada com 1 M NaCl, 10 mM histidina, pH 6 (5 volumes de coluna).
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O eluato da troca aniônica contendo Fator VIIa-SA-PEG lOKDa (25 mL) foi concentrado a 5-7 mL pelo uso de um dispositivo de filtro de centrífuga Amicon Ultra-15 10K, de acordo com as instruções do fabricante (Millipore). Após a concentração, cromatografia de exclusão por tamanho foi realizada. A amostra (5-7 mL) foi carregada na coluna contendo Superdex 200 (HiLoad 16/60, grau prep; Amersham Biosciences) equilibrada em 50 mM NaCl, 10 mM glicilglicina, 15 mM CaC12, pH 7,2 para a maioria das variantes PEGuiladas. Fator VIIa-SA-PEG-10KDa foi separado do assialo-Fator Vila não modificado, em uma taxa de fluxo de 1 mL/min, e a absorvência foi monitorada a 280 nm.
Frações (1 mL) contendo Fator Vila foram coletadas e analisadas por SDS-PAGE não redutor (géis de Tris-glicina e/ou géis de NuPAGE) e um kit de coloração de azul coloidal. Frações contendo a isoforma PEGuilada visada e desprovidas do assialoFator Vila não modificado foram reunidas e concentradas a 1 mg/mL usando um dispositivo de filtro de centrífuga Amicon Ultra-15 10K. A concentração da proteína foi determinada a partir de leituras de absorvência a 280 nm usando um coeficiente de extinção de 1,37 (mg/mL) “1cm_1.
EXEMPLO 4
Determinação de isoformas PEGuiladas por análise de HPLC de fase reversa.
Fator Vila PEGuilado foi analisado por HPLC em uma coluna de fase reversa (Zorbax 300SB-C3, tamanho de partícula 5 nm, 2,1 x 150 mm). Os eluentes foram A) 0,1 TEA em água e B) 0,09 % TEA em acetonitrila. Detecção foi a 214 nm. O gradiente, taxa de fluxo, e temperatura da coluna
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229/239 dependeram do comprimento de PEG (40 KDa, 20 KDa, e 10 KDa PEG: 35-65 %B em 30 min, 0,5 mL/min, 45°C; 10 KDa PEG: 3560 %B em 30 min, 0,5 mL/min, 45°C; 5 KDa: 40-50 %B em 40 min, 0,5 mL/min, 45°C; 2 KDa: 38-43 %B em 67 min, 0,6 mL/min, 55°C) . A identidade de cada pico foi determinada baseado em duas ou mais de quatro diferentes peças de evidência: o tempo de retenção conhecido de Fator Vila nativo, a migração de SDS-PAGE do pico isolado, o espectro de massa MALDI-TOF do pico isolado, e a progresso em ordem do tempo de retenção de cada pico com número crescente de PEG anexado.
EXEMPLO 5
Determinação de sitio de anexação de PEG por HPLC de fase reversa.
Variantes de Fator Vila e Fator Vila PEGuilado foram reduzidas por mistura de amostra (10 μΡ em uma concentração de 1 mg/mL) com tampão de redução (40 μΡ, 50 mM NaCl, 10 mM glicilglicina, 15 mM EDTA, 8 M uréia, 20 mM DTT, pH 8,6) por 15 min em temperatura ambiente. Água (50 gL) foi adicionada e a amostra resfriada a 4°C até ser injetada no HPLC ( < 12 hrs) . A coluna de HPLC, eluentes, e detecção foram como descrito acima para amostras não reduzidas. A taxa de fluxo foi 0,5 mL/min e o gradiente foi 30-55 %B em 90 min, seguido por um breve ciclo de lavagem até 90 %B. A identidade de cada pico foi determinada como descrito no Exemplo 4.
EXEMPLO 6
Ensaio de coagulação de Fator Vila.
Amostras PEGuiladas e padrões foram testados em duplicata, e foram diluídos em 100 mM NaCl, 5 mM CaCÍ2.
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0,1% BSA (peso/vol), 50 mM Tris, pH 7,4. o padrão e amostras foram analisados por uma faixa de 0,1 a 10 ng/mL. Volumes iguais de padrões diluídos e amostras foram misturados com plasma deficiente de Fator Vila (Diagnostica Stago), e estocados em gelo por não mais que 4 horas antes de serem analisados.
Os tempos de coagulação foram medidos com um coagulômetro STart4 (Diagnostica Stago). O coagulômetro mediu o tempo decorrido até que um coágulo in vitro fosse formado, como indicado pela interrupção do leve movimento adiante e para trás de uma bola magnética em uma cuveta de amostra.
Em cada cuveta, uma bola magnética foi depositada, mais 100 μΕ Fator Vila amostra/ plasma deficiente e 100 μΕ de uma solução de cefalina de cérebro de rato diluída (estocada em gelo por não mais que 4 horas). Cada reagente foi adicionado com 5 segundos entre cada cavidade, e a mistura final foi incubada por 300 segundos a 37°C. A solução de cefalina de cérebro de rato diluída (RBC) foi
feita de 2 mL de solução de estoque RBC (1 frasco de
estoque RBC, de Haemachem, mais 10 mL 150mM NaCl) e 4 mL
lOOmM NaCl, 5mM CaCl2, 0,1% BSA (peso/vol), 50mM Tris, pH
7,4.
Em 300 segundos, o ensaio foi iniciado pela adição de 100 μΕ, de uma solução pré-aquecida (37°C) de Fator tecidual solúvel (2pg/mL; aminoácidos 1-209) em lOOmM NaCl. 12,5 mM CaC12, 0,1% BSA (peso/vol), 50mM Tris, pH 7,4. novamente, essa próxima solução foi adicionada com um intervalo de 5 segundos entre amostras.
Os tempos de coagulação dos padrões diluídos foram
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231/239 usados para gerar uma curva padrão (log de tempo de coagulação versus log de concentração de Fator Vila). A regressão linear resultante da curva foi usada para determinar as atividades relativas de coagulação de variantes PEGuiladas. Variantes PEGuiladas de Fator Vila foram comparadas contra um estoque em alíquotas de Fator Vila.
EXEMPLO 7
GlicoPEGuilação de Fator Vila recombinante produzido em células BHK
Esse exemplo apresenta a PEGuilação de Fator Vila recombinante feito em células BHK.
Preparação de Assialo-Fator Vila. Fator Vila recombinante foi produzido em células BHK (células renais de rim de filhote de hamster) . Fator Vila (14,2 mg) foi dissolvido a 1 mg/mL em solução tampão (pH 7,4, 0,05 M Tris, 0,15 M NaCl, 0,001 M CaCl2, 0,05% NaN3) e foi incubado com 300 mU/mL sialidase (Vibrio cholera)-agarose conjugado por 3 dias a 32 °C. Para monitorar a reação uma pequena alíquota da reação foi diluída com o tampão adequado e um gel IEF realizado de acordo com procedimentos de Invitrogen (Figura 157) . A mistura foi centrifugada a 3.500 rpm e o sobrenadante foi coletado. A resina foi lavada três vezes (3 x2 mL) com a solução tampão acima (pH 7,4, , 0,05 M Tris, 0,15 M NaCl, 0,05% NaN2) e as lavagens combinadas foram concentradas em um Centricon-Plus-20. A solução restante teve o tampão trocado com 0,05 M Tris (pH 7,4), 0,15 M NaCl, 0,05% NaN2 a um volume final de 14,4 mL.
Preparação de Fator VIIa-SA-PEG-lKDa e Fator VIIa-SAPEG-lOKDa. A dessialilação de solução de Fator Vila foi
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232/239 dividida em duas amostras iguais de 7,2 mL. A cada amostra foi adicionado CMP-SA-PEG-lKDa (7,4 mg) ou CMP-SA-PEG-lOKDa (7,4 mg). ST3Gal3 (1,58U) foi adicionada a ambos os tubos e as misturas de reação foram incubadas a 32°C por 96 horas. A reação foi monitorada por SDS-PAGE gel usando reagentes e condições descritos por Invitrogen. Quando a reação foi completada, a mistura de reação foi purificada usando uma coluna preparatória Toso Haas TSK-Gel-3000 usando tampão PBS (pH 7,1) e coletando frações baseado em absorção de UV. As frações combinadas contendo o produto foram concentradas a 4°C em filtros de centrífuga Centricon-Plus-20 (Millipore, Bedford, MA) e a solução concentrada reformulada para render 1,97 mg (ensaio de proteína de ácido bicinconinico, ensaio de BCA, Sigma-Aldrich, St. Louis MO) de Fator VIIa-SA-PEG. O produto da reação foi analisado com o uso de SDS-PAGE e análise IEF de acordo com os procedimentos e reagentes supridos por Invitrogen. As amostras foram dialisadas contra água e analisadas por MALDI-TOF.
EXEMPLO 8
Fator VIIa-SA-PEG-10KDa: Método de one pot
Fator Vila (5 mg diluídos no tampão de formulação do produto a uma concentração final de 1 mg/mL), CMP-SA-PEGlOKDa (10 mM, 60 μΕ) e enzima de A. niger ST3Gal3 (33 U/L) e 10 mM histidina, 50 mM NaCl, 20 mM CaCÍ2 foram combinados em um frasco de reação junto com 10 U/L, 1 U/L, 0,5 U/L ou 0,1 U/L de sialidase (CalBiochem) . Os ingredientes foram misturados e incubados a 32°C. O progresso da reação foi medido por análise de alíquotas em intervalos de 30 minutos para as primeiras quatro horas. Uma alíquota foi então
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233/239 removida no ponto de tempo de 20 hora e submetida a SDSPAGE. A extensão da PEGuilação foi determinada por remoção de 1 mL a 1,5, 2,5 e 3,5 horas e purificação da amostra em uma coluna Poros 50HQ.
Para as condições reação contendo 10 U/L de sialidase, nenhuma quantidade apreciável de produto Fator VIIa-SA-PEG foi formada. Para as condições reação contendo 1 U/L de sialidase, cerca de 17,6 % do Fator Vila na mistura de reação foi mono ou diPEGuilado depois de 1,5 hora. Esse aumentou para 29% depois de 2,5 horas, e 40,3% depois de 3,5 horas. Para as condições reação contendo 0,5 U/L de sialidase, cerca de 44,5% do Fator Vila na mistura de reação foi mono ou diPEGuilado depois de 3 horas, e 0,8% foi triPEGuilado ou mais. Depois de 20 horas, 69,4% foi mono ou diPEGuilado, e 18,3% foi triPEGuilado ou mais.
Para as condições reação contendo 0,1 U/L de sialidase, cerca de 29,6% do Fator Vila na mistura de reação foi mono ou diPEGuilado depois de 3 horas. Depois de 20 horas, 71,3% foi mono ou diPEGuilado, e 15,1% foi triPEGuilado ou mais.
EXEMPLO 9
Preparação de Cisteina-PEG2 (2)
HS
Figure BRPI0717505B1_D0345
o
Figure BRPI0717505B1_D0346
ch3cj3.tea
Figure BRPI0717505B1_D0347
Figure BRPI0717505B1_D0348
a. Síntese de Composto 1
Figure BRPI0717505B1_D0349
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Hidróxido de potássio (84,2 mg, 1,5 mmol, como um pó) foi adicionado a uma solução de L-cisteína (93,7mg, 0,75 mmol) em metanol anidro (20 L) sob argônio. A mistura foi agitada em temperatura ambiente por 30 min, e então mPEG-Otosilato de massa molecular 20 kilodalton (Ts; 1,0 g, 0,05 mmol) foi adicionado em várias porções por 2 horas. A mistura foi agitada em temperatura ambiente por 5 dias, e concentrada por evaporação rotatória. O resíduo foi diluído com água (30 mL) , e agitado em temperatura ambiente por 2 horas para destruir qualquer excesso de 20 kilodalton mPEGO-tosilato. A solução foi então neutralizada com ácido acético, o pH ajustado ao pH 5,0 e carregada em uma coluna de cromatografia de fase reversa (C—18 silica). A coluna foi eluída com um gradiente de metanol/água (o produto elui em cerca de 70% metanol), eluição do produto monitorada por dispersão de luz evaporativa, e as frações adequadas coletadas e diluídas com água (500 mL) . Essa solução foi cromatografada (troca iônica, XK 50 Q, BIG Beads, 300 mL, forma de hidróxido; gradiente de água para água/ácido acético -0,75N) e o pH das frações adequadas diminuído para 6,0 com ácido acético. Essa solução foi então capturada em uma coluna de fase reversa (C—18 silica) e eluída com um gradiente de metanol/água como descrito acima. As frações do produto foram reunidas, concentradas, redissolvidas em água e liofilizadas para gerar 453 mg (44%) de um sólido branco (1).
Dados estruturais para 0 composto foram como se segue:
!H- -RMN (500 MHz; D2O) δ 2,83 (t, 2H, O-C-CH2-S), 3, 05 (q,
1H , S-CHH-CHN), 3,18 (q, 1H, (q, 1H, S-CHH-CHN), 3,38 (s,
3H , CHaO) , 3,7 (t, OCS2 CH2O), 3, 95 (q, 1H, CHN). A pureza do
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235/239 produto foi confirmada por SDS PAGE.
b. Síntese de Cisteína-PEG2 (2)
Trietilamina (~0, mL) foi adicionada em gotas a uma solução de composto 1 (440 mg, 22 pmol) dissolvido em
CH2CI2 anidro (30 mL) até a solução esta básica. Uma solução de 20 kilodalton mPEG-O-p-nitrofenil carbonato (660 mg, 33 pmol) e N-hidroxisuccinimida (3,6 mg, 30,8 pmol em CH2CI2 (20 mL) foi adicionada em várias porções por 1 hora em temperatura ambiente. A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente por 24 horas. O solvente foi então removido por evaporação rotatória, o resíduo foi dissolvido em água (100 mL) , e o pH ajustado a 9,5 com 1,0 N NaOH. A solução básica foi agitada em temperatura ambiente por 2 horas e foi então neutralizada com ácido acético \ um pH 7,0. A solução foi então carregada em uma coluna de cromatografia de fase reversa (C-18 silica). A coluna foi eluída com um gradiente de metanol/água (o produto elui em cerca de 70% metanol), eluição do produto monitorada por dispersão de luz evaporativa, e as frações adequadas coletadas e diluídas com água (500 mL) . Essa solução foi cromatografada (troca iônica, XK 50 Q, BIG Beads, 300 mL, forma de hidróxido; gradiente de água para água/ácido acético -0,75N) e o pH das frações adequadas diminuído para 6,0 com ácido acético. Essa solução foi então capturada em uma coluna de fase reversa (C-18 silica) e eluída com um gradiente de metanol/água como descrito acima. As frações do produto foram reunidas, concentradas, redissolvidas em água e liofilizadas para gerar 575 mg (70%) de um sólido branco (2).
Dados estruturais para o composto foram como se segue:
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236/239 1H-RMN (500 MHz; D2O) δ 2,83 (t, 2H, O-C-CHg-S), 2,95 (t, 2H, O-C-CHg-S), 3,12 (q, 1H, S-CHH-CHN), 3,39 (s, 3H CH3O) , 3,71 (t, OCH2CH2O) . A pureza do produto foi confirmada por SDS PAGE.
EXEMPLO 10
Fator VIIa-SA-PEG-40KDa
GlicoPEGuilação de Fator Vila (One Pot com cobertura).
GlicoPEGuilação de Fator Vila foi realizada em uma reação one-pot em que a dessialation e PEGuilação ocorrem simultaneamente, seguida por cobertura com ácido siálico. A reação foi realizada em um frasco de vidro revestido controlado a 32 °C por um banho de água recirculante. Primeiro, o Fator Vila concentrado 0,2 pm-filtrado foi introduzido no frasco e aquecido a 32 °C por mistura com uma barra de agitação por 20 minutos. A solução de sialidase foi feita a partir de pó seco em 10 mM histidina/50 mM NaCl/20 mM CaCU, pH 6,0 em uma concentração de 4.000 U/L. Uma vez que o Fator Vila atinge 32°C, a sialidase foi adicionada ao Fator Vila, e a reação foi misturada por aproximadamente 5 minutos para assegurar uma solução uniforme, depois de um tempo a mistura foi interrompida. A dessialação prosseguiu por 1,0 h a 32°C. Durante a reação de dessialação, CMP-SA-PEG-4OKDa foi dissolvido em lOmM histidina/50mM NaCl/20mM CaCU, tampão em pH 6,0, e a concentração foi determinada por absorvência de UV a 271nm. Depois de CMP-SA-PEG-4OKDa ter sido dissolvido, CMP-SA-PEG40KDa foi adicionado à reação, bem como ST3Gal3, e a reação foi misturada por aproximadamente 15 minutos com uma barra de agitação para assegurar uma solução uniforme. Um volume adicional de 85 mL de tampão foi adicionado para fazer 1,0
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L de reação. A reação prosseguiu sem agitação por 24 horas antes de CMP-SA ser adicionado a uma concentração de 4,3 mM para extinguir a reação e cobrir os resíduos de galactose terminal restantes com ácido siálico. A extinção prosseguiu com mistura por 30 minutos a 32 °C. O volume total da reação foi 1,0 L antes da extinção. Amostras (1 mL) foram feitas em 0, 4,5, 7,5, e 24 horas, extintas com CMP-SA, e analisadas por RP-HPLC e SDS-PAGE.
Purificação de Fator VIIa-SA-PEG-40KDa. Depois da cobertura, a solução foi diluída com 2,0 L de lOmM histidina, pH 6,0 que foi estocada de um dia para o outro a 4°C e a amostra foi filtrada através de um filtro de 0,2 pm Millipak 60. O volume de carga resultante foi 3,1 L. A cromatografia AEX2 foi realizada a 20-25°C (temperatura ambiente) em um sistem Akta Pilot. Após a carga, uma lavagem com 10 volumes de coluna com tampão de equilíbrio foi realizada, e o produto foi eluído da coluna usando um gradiente de volume de coluna 10 de MgC12 que resultou na resolução de espécies de Fator Vila PEGuilado de Fator Vila não PEGuilado. A carga para essa coluna foi intencionalmente mantida baixa, visando < 2 mg Fator VIIa/mL resina. Géis de SDS-PAGE foram adicionados além de análise de RP-HPLC de frações selecionadas e conjuntos de
frações para fazer o conj unto de produto. As frações
reunidas tiveram o pH aj ustado a 6, 0 com IM NaOH e
estocadas na sala fria a 2-8°C de um dia para o outro.
Concentração Final /Diafiltração , filtração asséptica
e alíquotas. As frações reunidas foram filtradas através de um filtro Millipak 20 0,2 pm e estocadas de um dia para o outro a 2-8°C. Para realizar a concentração/diafiltração,
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Confidencial
238/239 uma membrana de celulose regenerada Millipore 0,1 m2 30 KDa foi usada em um sistema ajustado com uma bomba peristáltica e tubos de silicone. O sistema foi montado e aspergido com água, então limpo com 0,lM NaOH por pelo menos 1 hora, e então estocado em 0,lM NaOH até equilíbrio com 10 mM
histidina/ 5 mM CaCl2/100 mM NaCl pH 6, 0 tampão de
diafiltração imediatamente antes do uso. 0 produto foi
concentrado a aproximadamente 400 mL e então diafiltrado em
volume constante com aproximadamente 5 diavolumes de tampão. O produto foi então concentrado a aproximadamente 300 mL e recuperado depois de uma baixa recirculação de pressão por 5 minutos, e as membranas foram enxaguadas com 200 mL de tampão d diafiltração por uma recirculação por 5 minutos. O lavado foi recuperado com produto, e mais 50mL de tampão foi recirculado por mais 5 minutos para um lavado final. O volume resultante foi de aproximadamente 510 mL, e aquele foi filtrado através de um filtro a vácuo de 1L ajustado com uma com membrana de 0,2 pm PES (Millipore). O volume assepticamente filtrado foi então dividido em alíquotas de 25 mL em tubos falcon estéreis de 50mL e congelados a -80°C.
Análise da reação de PEGuilação por HPLC (Exemplo 10)
Tempo de reação de conj ugação Purificação
0 hrs 4,5 hrs 7,5 hrs 24 hrs Depois de Cromatografia
% não PEGuilado 94,7 76,1 6 6,6 51,0 0, 6
% Mono PEGuilado 0, 9 17,9 26,1 39, 1 85, 6
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Confidencial
239/239
% DiPEGuilado 0, 1 0, 9 1,9 5, 1 5, 1
% TriPEGuilado 0, 0 0, 0 0, 0 0,2 0,2
Depois de 24 horas, a distribuição de volume de estado de produto PEG foi: 0,7% não PEGuilado, 85,3% monoPEGuilado, 11,5% di-PEGuilado, e 0,3% tri-PEGuilado. Cromatografia em coluna é a etapa principal no processo que 5 gera a distribuição de produto, amplamente através de remoção de material não PEGuilado de espécies mono- e diPEGuiladas.
Entende-se que os exemplos e modalidades aqui descritos são para objetivos ilustrativos apenas e que 10 várias modificações ou mudanças serão sugeridas em vista desses para pessoas habilitadas na técnica e devem estar incluídas no espírito e alcance desse pedido e escopo das reivindicações em apêndice. Todas publicações, patentes e pedidos de patentes aqui citados são incorporados em suas 15 totalidade por referência para todos os objetivos.

Claims (3)

1. Conjugado de peptideo caracterizado por compreender:
a) um peptídeo que é Fator IX e que é covalentemente ligado a uma porção que é um membro selecionado de:
Figure BRPI0717505B1_C0001
Figure BRPI0717505B1_C0002
Figure BRPI0717505B1_C0003
Figure BRPI0717505B1_C0004
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2/3
Figure BRPI0717505B1_C0005
em que os indices men são números inteiros independentemente selecionados de 100 a 4000; em que R2 é um membro selecionado de H, CH2OR7, COOR7 e OR7; em que R7 é um membro selecionado de H, alquil substituído ou não substituído e heteroalquil substituído ou não substituído;
ou em que referida porção é
Figure BRPI0717505B1_C0006
em que os índices m, n e R2 são conforme definidos acima; e em que R3 e R4 são membros independentemente selecionados de H, alquil substituído ou não substituído, OR8 e NHC(O)R9; em que R8 e R9 são independentemente selecionados de H, alquil substituído ou não substituído, heteroalquil substituído ou não substituído, ácido siálico
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3/3
e ácido polissiálico. 2. Formulação farmacêutica, caracterizada por
compreender um conjugado de peptídeo, conforme definido na reivindicação 1 e um diluente farmaceuticamente aceitável.
BRPI0717505A 2006-10-04 2007-10-04 conjugado de peptídeo e formulação farmacêutica BRPI0717505B8 (pt)

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