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BRPI0620803B1 - anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo anti-her-3, seu processo de preparação, composição farmacêutica e kit compreendendo o mesmo, molécula de ácido nucléico codificando o referido anticorpo, vetor compreendendo o mesmo, microrganismo transgênico, bem como método para diagnosticar uma doença associada a her-3 - Google Patents

anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo anti-her-3, seu processo de preparação, composição farmacêutica e kit compreendendo o mesmo, molécula de ácido nucléico codificando o referido anticorpo, vetor compreendendo o mesmo, microrganismo transgênico, bem como método para diagnosticar uma doença associada a her-3 Download PDF

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BRPI0620803B1
BRPI0620803B1 BRPI0620803-7A BRPI0620803A BRPI0620803B1 BR PI0620803 B1 BRPI0620803 B1 BR PI0620803B1 BR PI0620803 A BRPI0620803 A BR PI0620803A BR PI0620803 B1 BRPI0620803 B1 BR PI0620803B1
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BR
Brazil
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antibody
antibodies
cancer
cells
human
Prior art date
Application number
BRPI0620803-7A
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English (en)
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Mike Rothe
Martin Treder
Susanne Hartmann
Dan Freeman
Bob Radinsky
Eric Borges
Original Assignee
Amgen Inc
Daiichi Sankyo Europe Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=38110697&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=BRPI0620803(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Amgen Inc, Daiichi Sankyo Europe Gmbh filed Critical Amgen Inc
Publication of BRPI0620803A2 publication Critical patent/BRPI0620803A2/pt
Publication of BRPI0620803B1 publication Critical patent/BRPI0620803B1/pt
Publication of BRPI0620803B8 publication Critical patent/BRPI0620803B8/pt

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Abstract

ANTICORPOS DIRIGIDOS PARA O HER-3 E SEUS USOS. A presente invenção refere-se às proteínas de ligação que se ligam ao HER-3 e aos polinucleotídeos que as codificam. Os vetores de expressão e as células hospedeiras que os compreendem para a produção da proteína de ligação da invenção são também proporcionados. Além disso, a invenção proporciona composições e métodos para diagnosticar e tratar doenças associadas com a transdução de sinal mediada pelo HER-3 e/ou seu ligante heregulina.

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 1. Campo da Invenção
[001] A presente invenção refere-se às proteínas de ligação, incluindo os anticorpos e os seus fragmentos de ligação, que se ligam ao HER-3 e aos polinucleotídeos que as codificam. Os vetores de expressão e as células hospedeiras que os compreendem para a produção da proteína de ligação da invenção são também proporcionados. Além disso, a invenção proporciona composições e métodos para diagnosticar e tratar doenças associadas com a transdução de sinal mediada pelo HER-3 e/ou seu ligante heregulina.
2. Antecedentes da Tecnologia
[002] O receptor do fator do crescimento epidérmico humano 3 (HER-3, também conhecido como ErbB3) é uma tirosina cinase protéica receptora e pertence à subfamília das tirosina cinases protéicas receptoras do receptor do fator do crescimento epidérmico (EGFR), que também inclui o HER-1 (também conhecido como EGFR), o HER2, e o HER-4 (Plowman e outros., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87 (1990), 4905-4909; Kraus e outros., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (1989), 9193-9197; e Kraus e outros., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (1993), 2900-2904). Como o receptor do fator do crescimento epidérmico prototípico, o receptor de transmembrana HER-3 consiste em um domínio de ligação ao ligante extracelular (ECD), um domínio de dimerização dentro do ECD, um domínio de transmembrana, um domínio de tirosina cinase (TKD) protéica intracelular e um domínio de fosforilação C-terminal.
[003] O ligante Heregulina (HRG) se liga ao domínio extracelular do HER-3 e ativa a via de sinalização mediada por receptor por promoção da dimerização com outros membros da família do receptor do fator do crescimento epidérmico humano (HER) e da transfosforilação de seu domínio intracelular. A formação de dímero entre os membros da família do HER expande o potencial de sinalização do HER-3 e é um meio não somente para a diversificação do sinal, como também para a amplificação do sinal. Por exemplo, o heterodímero HER-2/HER-3 induz um dos sinais mitogênicos mais importantes entre os membros da família do HER.
[004] O HER-3 foi verificado ser superexpresso em diversos tipos de câncer, tais como os cânceres de mama, gastrointestinais e pancreáticos. De modo interessante, foi mostrada uma correlação entre a expressão de HER-2/HER-3 e a progressão a partir de um estágio não invasivo até um invasivo (Alimandi e outros., Oncogene 10,1813-1821; deFazio e outros., Cancer 87, 487-498; Naidu e outros., Br. J. Cancer 78, 1385-1390). Desse modo, agentes que interfiram com a sinalização mediada pelo HER-3 são desejáveis. Os anticorpos para o HER-3 de murino ou quiméricos foram descritos, tais como nos US5968511, US5480968 e WO03013602.
[005] Um anticorpo monoclonal humanizado contra HER-2, Herceptin®, foi mostrado recentemente interferir com a sinalização mediada pelo HER-2 e é terapeuticamente efetivo em seres humanos (Fendly e outros., Hybridoma 6, 359-370; Hudziak e outros., Mol. Cell. Biol. 9, 1165-1172; Stebbing e outros., Cancer Treat. Rev. 26, 287290). A Herceptin® foi mostrada atuar através de dois mecanismos diferentes, isto é, a absorção das células efetoras do sistema imune, bem como um efeito indutor da apoptose, citotóxico, direto.
[006] Entretanto, somente os pacientes com HER-2 altamente amplificado respondem significativamente à terapia com Herceptin®, assim limitando o número de pacientes adequados para a terapia. Além disso, o desenvolvimento da resistência a fármacos ou uma alteração na expressão ou sequência de epítopos do HER-2 sobre as células de tumor pode até tornar estes pacientes abordáveis não reativos com o anticorpo e, portanto, anulando os seus benefícios terapêuticos. Portanto, são necessários mais fármacos para as terapias à base de alvos que abordem mais membros da família do HER, tais como o HER-3.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS DOS DESENHOS
[007] A figura 1 mostra o grau de expressão do HER-3 em um painel de linhagens celulares de cânceres humanos e demonstra que o HER-3 é expresso em uma variedade de cânceres humanos.
[008] A figura 2 mostra os resultados da análise por FACS do anticorpo para HER-3 que se liga às células RatI estavelmente expressando os diferentes membros da família do HER ou somente ao vetor vazio.
[009] A figura 3 mostra os locais de competição pela ligação dos anticorpos, mapeados para os domínios do HER3.
[0010] A figura 4 mostra os resultados da análise da afinidade do anticorpo por FACS Scatchard indireta, efetuada com os anticorpos anti-HER-3 da invenção. A análise indica que os anticorpos anti-HER-3 da invenção possuem altas afinidades e fortes constantes de ligação pelo HER-3 expresso sobre a superfície da célula.
[0011] A figura 5 mostra a endocitose acelerada do HER-3, induzida pelos anticorpos anti-HER-3 da invenção.
[0012] As figuras 6 a-e mostram os resultados de um ensaio de competição com ligante efetuado com os anticorpos anti-HER-3 da invenção. Os resultados demonstram que os anticorpos da invenção especificamente reduzem a ligação de [125I]-α-HRG/ [125I]-β-HRG às células que expressam o HER-3 endógeno.
[0013] A figura 7a mostra os resultados de um ELISA da fosfotirosina HER-3 efetuado com os anticorpos anti-HER-3 da invenção. Os anticorpos de acordo com a presente invenção foram capazes de inibir a ativação do HER-3 mediada pela β-HRG, conforme indicada por fosforilação da tirosina receptora aumentada. Além disso, a figura 7b mostra os resultados representativos deste experimento com anticorpo titulado.
[0014] A figura 8 mostra o resultado de um ELISA de MAP-Cinase p42/p44 efetuado com os anticorpos anti-HER-3 da invenção. Os anticorpos de acordo com a presente invenção foram capazes de reduzir a ativação de MAP-Cinase p42/p44 mediada pela β-HRG, conforme indicada pela fosforilação aumentada de MAP-Cinase.
[0015] A figura 9 mostra o resultado de um ELISA de fosfo-AKT efetuado com os anticorpos anti-HER-3 da invenção. Os anticorpos de acordo com a presente invenção foram capazes de reduzir a ativação da AKT mediada pela β-HRG, conforme indicada por fosforilação de AKT.
[0016] A figura 10 mostra a inibição da proliferação das células MCF7 pelos anticorpos anti-HER-3 humanos da invenção. Os anticorpos de acordo com a presente invenção inibem o crescimento celular induzido pela HRG nas células de câncer humanas.
[0017] A figura 11 mostra a transmigração das células MCF7 inibida pelos anticorpos anti-HER-3 humanos da invenção.
[0018] As figuras 12a-i mostram a inibição do crescimento celular independente de ancoragem pelos anticorpos para HER-3 humanos da invenção.
[0019] A figura 13 mostra a inibição do crescimento de xenoenxertos de células de câncer de mama humanas T47D por um anticorpo anti-HER-3 humano da invenção.
[0020] A figura 14 mostra a redução das células de câncer do pâncreas humanas BxPC3 em camundongos, após a administração dos anticorpos anti Her3 (U1-59 e U1-53) ou anti EGFR (Erbitux).
[0021] A figura 15 mostra a redução do crescimento de xenoenxertos de células de câncer do pâncreas humanas BxPC3 por um anticorpo anti-HER-3 humano da invenção e em combinação com os anticorpos anti EGFR (Erbitux).
[0022] A figura 16 demonstra que os anticorpos da invenção retardam o crescimento de células de melanoma humanas (HT144) em camundongos nu/nu.
[0023] A figura 17 mostra a redução do crescimento no xenoenxerto de células de carcinoma do cólon humanas HT-29 pelos anticorpos para HER-3 humanos da invenção (U1-53, U1-59 e U1-7).
[0024] A figura 18 mostra a redução do crescimento no xenoenxerto de células de câncer de pulmão humanas Calu-3 pelos anticorpos anti-HER-3 humanos da invenção (U1-59, U1-53 e U1-7).
[0025] A figura 19 mostra a redução do crescimento no xenoenxerto de células de câncer do pâncreas humanas BxPC-3 pelos anticorpos anti-HER-3 humanos da invenção (U1-7, U1-59 e U1-53).
[0026] A figura 20 demonstra que um anticorpo da invenção (U159. causa a supressão do HER-3 em xenoenxertos de câncer do pâncreas humano BxPC3.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0027] Um primeiro aspecto da presente invenção refere-se a uma proteína de ligação isolada que se liga ao HER-3.
[0028] Em uma modalidade da presente invenção, uma proteína de ligação isolada da invenção compreende uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada compreendendo pelo menos uma das CDRs selecionadas a partir do grupo que consiste em: (a) CDRH1s, conforme mostradas nas SEQ ID NOs: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 e 230, (b) CDRH2's, conforme mostradas nas SEQ ID NOs: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 e 230, e (c) CDRH3's, conforme mostradas nas SEQ ID NOs: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 e 230, e/ou uma sequência de aminoácidos da cadeia leve compreendendo pelo menos uma das CDRs selecionadas a partir do grupo que consiste em: (d) CDRL1s, conforme mostradas nas SEQ ID NOs: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 e 232, (e) CDRL2's, conforme mostradas nas SEQ ID NOs: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 e 232, e (f) CDRL3's, conforme mostradas nas SEQ ID NOs: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 e 232.
[0029] Em uma outra modalidade da presente invenção, uma proteína de ligação isolada da invenção compreende uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada, selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 e 230,
[0030] e/ou uma sequência de aminoácidos da cadeia leve, selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 e 232.
[0031] Em mais uma outra modalidade da presente invenção, uma proteína de ligação isolada da invenção compreende uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos da cadeia leve, conforme mostradas nas SEQ ID NOs: 2 e 4, 6 e 8, 10 e 12, 14 e 16, 18 e 20, 22 e 24, 26 e 28, 30 e 32, 36 e 38, 42 e 44, 46 e 48, 50 e 52, 54 e 56, 60 e 58, 62 e 64, 66 e 68, 70 e 72, 74 e 76, 78 e 82, 80 e 82, 84 e 86, 88 e 90, 92 e 94, 96 e 98, 100 e 102, 104 e 106, 108 e 110, 112 e 114, 116 e 118, 122 e 124, 126 e 128, 130 e 132, 134 e 136, 138 e 140, 142 e 144, 146 e 148, 150 e 152, 154 e 156, 158 e 160, 162 e 164, 166 e 168, 170 e 172, 174 e 176, 178 e 180, 182 e 184, 186 e 188, 190 e 192, 194 e 196, 198 e 200, 202 e 204, 206 e 208, 210 e 212, 214 e 216, 218 e 220, 222 e 224, 226 e 228, 230 e 232, ou uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada, conforme mostrada nas SEQ ID NOs: 34, 40, 60, 62 ou 120, ou uma sequência de aminoácidos da cadeia leve, conforme mostrada nas SEQ ID NOs: 58 ou 64.
[0032] De acordo com a presente invenção, uma proteína de ligação isolada que é capaz de ligar-se ao HER-3 interage com pelo menos um epítopo na parte extracelular de HER-3. Os epítopos estão preferivelmente localizados no domínio L1 (aa 19-184), que é o domínio amino terminal, nos domínios S1 (aa 185-327) e S2 (aa 500632), que são os dois domínios ricos em Cisteína, ou no domínio L2 (328-499), que é flanqueado pelos dois domínios ricos em Cisteína. Os epítopos podem também estar localizados em combinações de domínios, tal como, porém não limitado a um epítopo compreendido pelas partes de L1 e S1. É adicionalmente preferida uma proteína de ligação isolada que se liga a uma estrutura tridimensional formada pelos resíduos de aminoácidos 1-160, 161-358, 359-575, 1-358 e/ou 359-604 do HER-3 maduro, particularmente do HER-3 humano maduro.
[0033] De preferência, uma proteína de ligação isolada da invenção é uma proteína de andaime tendo uma atividade de ligação similar a um anticorpo ou um anticorpo, por exemplo, um anticorpo anti-HER-3. Em particular, o anticorpo anti-HER-3 é selecionado a partir do grupo que consiste em anticorpo U1-1, anticorpo U1-2, anticorpo U1-3, anticorpo U1-4, anticorpo U1-5, anticorpo U1-6, anticorpo U1-7, anticorpo U1-8, anticorpo U1-9, anticorpo U1-10, anticorpo U1-11, anticorpo U1-12, anticorpo U1-13, anticorpo U1-14, anticorpo U1-15, anticorpo U1-16, anticorpo U1-17, anticorpo U1-18, anticorpo U1-19, anticorpo U1-20, anticorpo U1-21, anticorpo U1-22, anticorpo U1-23, anticorpo U1-24, anticorpo U1-25, anticorpo U1-26, anticorpo U1-27, anticorpo U1-28, anticorpo U1-29, anticorpo U1-30, anticorpo U1-31, anticorpo U1-32, anticorpo U1-33, anticorpo U1-34, anticorpo U1-35, anticorpo U1-39, anticorpo U1-43, anticorpo U1-47, anticorpo U1-36, anticorpo U1-40, anticorpo U1-44, anticorpo U1-48, anticorpo U1-37, anticorpo U1-41, anticorpo U1-45, anticorpo U1-49, anticorpo U1-38, anticorpo U1-42, anticorpo U1-46, anticorpo U1-50, anticorpo U1-51, anticorpo U1-52, anticorpo U1-53, anticorpo U1-55.1, anticorpo U1-55, anticorpo U1-57.1, anticorpo U1-57, anticorpo U1-58, anticorpo U1-59, anticorpo U1-61.1, anticorpo U1-61, anticorpo U1-62 ou um anticorpo tendo pelo menos uma cadeia pesada ou leve de um dos ditos anticorpos. São especialmente preferidos os anticorpos U149 (SEQ ID NO: 42/44), U1-53 (SEQ ID NO: 54/56) e U1-59 (SEQ ID NO: 70/72) ou um anticorpo tendo pelo menos uma cadeia pesada ou leve de um dos ditos anticorpos.
[0034] Além disso, as modalidades adicionais da presente invenção proporcionam uma proteína de ligação isolada, acoplada a um grupo de marcação ou grupo efetor. De preferência, tal proteína de ligação é útil para o tratamento de doenças hiperproliferativas, particularmente as doenças oncológicas, tais como o câncer de mama, o câncer gastrointestinal, o câncer pancreático, o câncer da próstata, o câncer ovariano, o câncer do estômago, o câncer endometrial, o câncer da glândula salivar, o câncer do pulmão, o câncer do rim, o câncer do cólon, o câncer colorretal, o câncer da tireóide, o câncer da bexiga, o glioma, o melanoma, o câncer do testículo, o sarcoma de tecido mole, o câncer da cabeça e do pescoço, ou outros cânceres que expressam ou superexpressam o HER3, e a formação de metástases do tumor.
[0035] Os outros aspectos da presente invenção relacionam-se a uma molécula de ácido nucléico isolada que codifica uma proteína de ligação da invenção, um vetor tendo uma molécula de ácido nucléico codificando a proteína de ligação da invenção, e uma célula hospedeira, por exemplo, uma célula CHO, uma célula de mieloma NS/0, transformada com tal molécula de ácido nucléico ou vetor.
[0036] Um aspecto adicional da presente invenção refere-se a um método para produzir uma proteína de ligação da invenção, por preparação da dita proteína de ligação a partir de uma célula hospedeira que secreta a proteína de ligação. De preferência, a proteína de ligação da invenção é preparada a partir de uma linhagem celular de hibridoma que secreta uma proteína de ligação ou uma célula CHO ou outro tipo de célula transformada com uma molécula de ácido nucléico que codifica uma proteína de ligação da invenção.
[0037] Um outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para produzir uma proteína de ligação da invenção, por preparação da dita proteína de ligação a partir de um tecido, produto ou secreção de um animal, planta ou fungo transgênico para uma molécula de ácido nucléico ou moléculas de ácidos nucléicos codificando a proteína de ligação da invenção. De preferência, uma proteína de ligação da invenção é preparada a partir do tecido, produto ou secreção de um animal transgênico, tal como a vaca, a ovelha, o coelho, a galinha ou outra espécie mamífera ou aviária, uma planta transgênica, tal como o milho, o tabaco ou outra planta, ou um fungo transgênico, tal como o Aspergillus, o Pichia ou outra espécie fúngica.
[0038] Um outro aspecto da presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo, como um agente ativo, pelo menos uma proteína de ligação da invenção em mistura com veículos, diluentes e/ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis. Em uma outra modalidade preferida da presente invenção, a composição farmacêutica da invenção adicionalmente contém pelo menos um outro agente ativo, por exemplo, pelo menos um agente antineoplástico. Ainda um outro aspecto da presente invenção referese ao uso de pelo menos uma proteína de ligação da invenção, e opcionalmente pelo menos um outro agente ativo, por exemplo, pelo menos um agente antineoplástico, em mistura com veículos, diluentes e/ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis, para a preparação de uma composição farmacêutica. A composição farmacêutica é adequada para diagnosticar, prevenir ou tratar uma doença hiperproliferativa, particularmente uma doença oncológica, tal como o câncer de mama, o câncer gastrointestinal, o câncer do pâncreas, o câncer da próstata, o câncer ovariano, o câncer do estômago, o câncer endometrial, o câncer da glândula salivar, o câncer do pulmão, o câncer do rim, o câncer do cólon, o câncer colorretal, o câncer da tireóide, o câncer da bexiga, o glioma, o melanoma ou outros cânceres que expressam ou superexpressam o HER-3, e a formação de metástases do tumor.
[0039] Ademais, a presente invenção refere-se em um aspecto adicional a um método para diagnosticar doenças ou condições associadas com a expressão de HER-3, compreendendo o contato de uma amostra com pelo menos uma proteína de ligação da invenção, e a detecção da presença do HER-3. As doenças ou condições preferidas incluem as doenças hiperproliferativas mencionadas acima.
[0040] Ainda um outro aspecto da presente invenção é um método para prevenir ou tratar doenças ou condições associadas com a expressão de HER-3 em um paciente que necessita dele, compreendendo administrar ao paciente uma quantidade eficaz de pelo menos uma proteína de ligação da invenção e opcionalmente pelo menos um outro agente ativo, por exemplo, pelo menos um agente neoplástico. De preferência, o paciente é um paciente mamífero, mais preferivelmente um paciente humano. As doenças ou as condições preferidas, associadas com a expressão de HER-3, são as doenças hiperproliferativas mencionadas acima.
[0041] Um aspecto adicional da presente invenção refere-se a um kit para a diagnose, a prevenção ou o tratamento de doenças ou condições associadas com a expressão de HER-3, compreendendo pelo menos uma proteína de ligação, e/ou a molécula de ácido nucléico e/ou o vetor da invenção. Opcionalmente, o kit da invenção pode adicionalmente compreender pelo menos um outro agente ativo, por exemplo, pelo menos um agente antineoplástico. De preferência, as doenças ou as condições associadas com a expressão de HER-3 são as doenças hiperproliferativas mencionadas acima. DESCRIÇÃO DETALHADA
[0042] Um primeiro aspecto da presente invenção refere-se a uma proteína de ligação isolada que se liga ao HER-3.
[0043] Em uma modalidade da presente invenção, a proteína de ligação isolada da invenção compreende uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada compreendendo pelo menos uma das CDRs selecionadas a partir do grupo que consiste em: (a) CDRH1s, conforme mostradas nas SEQ ID NOs: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 e 230, (b) CDRH2's, conforme mostradas nas SEQ ID NOs: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 e 230, e (c) CDRH3's, conforme mostradas nas SEQ ID NOs: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 e 230, e/ou uma sequência de aminoácidos da cadeia leve compreendendo pelo menos uma das CDRs selecionadas a partir do grupo que consiste em: (d) CDRL1s, conforme mostradas nas SEQ ID NOs: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 e 232, (e) CDRL2's, conforme mostradas nas SEQ ID NOs: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 e 232, e (f) CDRL3's, conforme mostradas nas SEQ ID NOs: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 e 232.
[0044] Em uma outra modalidade da presente invenção, a proteína de ligação isolada da invenção compreende uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada, selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 e 230, e/ou uma sequência de aminoácidos da cadeia leve, selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 e 232.
[0045] Em mais uma outra modalidade da presente invenção, a proteína de ligação isolada da invenção compreende uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos da cadeia leve, conforme mostradas nas SEQ ID NOs: 2 e 4, 6 e 8, 10 e 12, 14 e 16, 18 e 20, 22 e 24, 26 e 28, 30 e 32, 36 e 38, 42 e 44, 46 e 48, 50 e 52, 54 e 56, 60 e 58, 62 e 64, 66 e 68, 70 e 72, 74 e 76, 78 e 82, 80 e 82, 84 e 86, 88 e 90, 92 e 94, 96 e 98, 100 e 102, 104 e 106, 108 e 110, 112 e 114, 116 e 118, 122 e 124, 126 e 128, 130 e 132, 134 e 136, 138 e 140, 142 e 144, 146 e 148, 150 e 152, 154 e 156, 158 e 160, 162 e 164, 166 e 168, 170 e 172, 174 e 176, 178 e 180, 182 e 184, 186 e 188, 190 e 192, 194 e 196, 198 e 200, 202 e 204, 206 e 208, 210 e 212, 214 e 216, 218 e 220, 222 e 224, 226 e 228, 230 e 232, ou uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada, conforme mostrada nas SEQ ID NOs: 34, 40, 60, 62 ou 120, ou uma sequência de aminoácidos da cadeia leve, conforme mostrada nas SEQ ID NOs: 58 ou 64.
[0046] De acordo com a presente invenção, é para ser entendido que a sequência de aminoácidos da proteína de ligação da invenção não está limitada aos vinte aminoácidos convencionais (Ver Immunology A Synthesis (2a Edição, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), que é incorporado neste documento por referência). Por exemplo, os aminoácidos podem incluir os estereoisômeros (por exemplo, os D-aminoácidos) dos vinte aminoácidos convencionais, os aminoácidos não naturais, tais como os aminoácidos α-,α-dissubstituidos, os N-alquil aminoácidos, o ácido láctico, e outros aminoácidos não convencionais. Os exemplos dos aminoácidos não convencionais que podem também ser componentes adequados para a proteína de ligação da invenção incluem: 4-hidroxiprolina, y-carboxiglutamato, ε-N,N,N-trimetil lisina, ε-N-acetil lisina, Ofosfosserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metil histidina, 5hidroxilisina, α-N-metilarginina, e outros aminoácidos e iminoácidos similares, por exemplo, a 4-hidroxiprolina.
[0047] Além disso, de acordo com a presente invenção, as pequenas variações nas sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs: 1-232 são contempladas como estando incluídas pela presente invenção, desde que as variações na sequência de aminoácidos mantenham pelo menos 75 %, mais preferivelmente pelo menos 80 %, 90 %, 95 %, e mais preferivelmente 99% das sequências mostradas nas SEQ ID NOs: 1-232. As variações podem ocorrer dentro das regiões de armação (isto é, fora das CDRs), dentro das CDRs, ou dentro das regiões de armação e das CDRs. As variações preferidas nas sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs: 1-232, isto é, as remoções, as inserções e/ou as substituições de pelo menos um aminoácido, ocorrem próximas aos limites dos domínios funcionais. Os domínios estruturais e funcionais podem ser identificados por comparação dos dados das sequências de nucleotídeos e/ou de aminoácidos com as bases de dados de sequências públicas ou confidenciais. Os métodos de comparação computadorizados podem ser usados para identificar os motivos das sequências ou os domínios de conformação da proteína preditos que ocorrem em outras proteínas de ligação de estrutura e/ou função conhecidas. Os métodos para identificar as sequências de proteínas que se duplicam em uma estrutura tridimensional conhecida são conhecidos. Ver, por exemplo, Bowie e outros., Science 253, 164 (1991); Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman e Company, Nova Iorque (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden e J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nova York, N.Y. (1991)); e Thornton e outros., Nature 354, 105 (1991), que são todos incorporados neste documento por referência. Assim, aqueles de habilidade na técnica podem reconhecer os motivos de sequências e as conformações estruturais que podem ser usados para definir os domínios estruturais e funcionais de acordo com a invenção.
[0048] As variações especialmente preferidas nas sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs: 1-174 e 1-232 são aquelas que resultam em uma suscetibilidade reduzida à proteólise ou à oxidação, alteram os padrões de glicosilação ou alteram as afinidades de ligação ou conferem ou modificam outras propriedades físicoquímicas ou funcionais da proteína de ligação. Em particular, as substituições de aminoácidos conservativas são contempladas. As substituições conservativas são aquelas que ocorrem dentro de uma família de aminoácidos que são relacionados em suas cadeias laterais. As famílias de aminoácidos preferidas são as seguintes: família ácida = aspartato, glutamato; família básica = lisina, arginina, histidina; família apolar = alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; e família polar não carregada = glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. As famílias mais preferidas são: família hidróxi-alifática = serina e treonina; família contendo amida = asparagina e glutamina; família alifática = alanina, valina, leucina e isoleucina; e família aromática = fenilalanina, triptofano, e tirosina. Por exemplo, é razoável esperar que uma substituição isolada de uma leucina com uma isoleucina ou valina, um aspartato com um glutamato, uma treonina com uma serina, ou uma substituição similar de um aminoácido com um aminoácido estruturalmente relacionado não terá um efeito principal sobre a ligação ou as propriedades da proteína de ligação resultante, especialmente se a substituição não envolver um aminoácido dentro de um sítio de armação. Entretanto, todas as outras substituições de aminoácidos possíveis são também incluídas pela presente invenção. Se uma alteração de aminoácido resulta em uma proteína de ligação funcional, isto é, em uma proteína de ligação que se liga ao HER-3 e reduz a transdução de sinal dos membros da família de HER, pode prontamente ser determinado testando a atividade específica da proteína de ligação resultante em ELISA ou FACS quanto à ligação ao HER-3 ou ensaio funcional in vitro ou in vivo.
[0049] De acordo com a presente invenção, a proteína de ligação da invenção interage com pelo menos um epítopo na parte extracelular de HER. Os epítopos estão preferivelmente localizados no domínio L1 (aa 19-184), que é o domínio amino terminal, nos domínios S1 (aa 185-327) e S2 (aa 500-632), que são os dois domínios ricos em Cisteína, no domínio L2 (328-499), que é flanqueado pelos dois domínios ricos em Cisteína, ou em uma combinação de domínios do HER-3. Os epítopos podem também estar localizados em combinações de domínios, tal como, porém não limitado a um epítopo compreendido pelas partes de L1 e S1. Além disso, a proteína de ligação da invenção é adicionalmente caracterizada pelo fato de que a sua ligação ao HER-3 reduz a transdução de sinal mediada pelo HER3. De acordo com a presente invenção, uma redução da transdução de sinal mediada pelo HER-3 pode, por exemplo, ser causada por uma infra-regulação do HER-3, resultando em um desaparecimento pelo menos parcial das moléculas de HER-3 da superfície celular ou por uma estabilização do HER-3 sobre a superfície celular em uma forma substancialmente inativa, isto é, uma forma que exibe uma transdução de sinal menor, comparada à forma não estabilizada. Alternativamente, uma redução da transdução de sinal mediada pelo HER-3 pode também ser causada influenciando, por exemplo, diminuindo ou inibindo, a ligação de um ligante ou um outro membro da família do HER ao HER-3, de GRB2 ao HER-2 ou de GRB2 ao SHC, por inibição da fosforilação da tirosina receptora, da fosforilação da AKT, da fosforilação da tirosina PYK2 ou da fosforilação da ERK2, ou por diminuição da invasão do tumor. Alternativamente, uma redução da transdução de sinal mediada pelo HER-3 pode também ser causada por influência, diminuição ou inibição, da formação de dímeros contendo HER-3 com outros membros da família do HER. Um exemplo entre outros pode ser a diminuição ou a inibição da formação do complexo protéico de HER3-EGFR.
[0050] De preferência, a proteína de ligação da invenção é uma proteína de andaime tendo uma atividade de ligação similar a um anticorpo ou um anticorpo, isto é, um anticorpo anti-HER-3.
[0051] Dentro do contexto da presente invenção, o termo "proteína de andaime", como usado neste documento, significa um polipeptídeo ou proteína com as áreas de superfície expostas, nas quais as inserções, as substituições ou as remoções de aminoácidos são altamente toleráveis. Os exemplos de proteínas de andaime que podem ser usadas de acordo com a presente invenção são a proteína A de Staphylococcus aureus, a proteína de ligação de bilina de Pieris brassicae ou outras lipocalinas, as proteínas de repetição de anquirina, e a fibronectina humana (revisto em Binz e Plückthun, Curr Opin Biotechnol, 16, 459-69). A engenharia de uma proteína de andaime pode ser considerada como o enxerto ou a integração de uma função de afinidade sobre a, ou na, armação estrutural de uma proteína estavelmente duplicada. A função de afinidade significa uma afinidade de ligação a uma proteína de acordo com a presente invenção. Um andaime pode ser estruturalmente separável das sequências de aminoácidos que conferem especificidade de ligação. Em geral, as proteínas que parecem adequadas para o desenvolvimento de tais reagentes de afinidades artificiais podem ser obtidas por técnicas de engenharia de proteínas racionais, ou mais comumente, combinatórias, tais como a bateia ("panning") contra o HER-3, a proteína purificada ou a proteína mostrada sobre a superfície da célula, por agentes de ligação em uma biblioteca de andaime artificial mostrada in vitro, habilidades que são conhecidas na técnica (Skerra, J. Mol. Recog., 2000; Binz e Plückthun, 2005). Além disso, uma proteína de andaime tendo uma atividade de ligação similar a um anticorpo pode ser derivada de um polipeptídeo aceptor contendo o domínio de andaime, que pode ser enxertado com os domínios de ligação de um polipeptídeo doador para conferir a especificidade de ligação ao polipeptídeo doador sobre o domínio de andaime contendo o polipeptídeo aceptor. Os ditos domínios de ligação inseridos podem ser, por exemplo, a região determinante de complementaridade (CDR) de um anticorpo, em particular um anticorpo anti-HER-3. A inserção pode ser efetuada por diversos métodos conhecidos para aqueles versados na técnica, incluindo, por exemplo, a síntese de polipeptídeos, a síntese de ácidos nucléicos de um aminoácido de codificação, bem como por diversas formas de métodos recombinantes, bastante conhecidas para aqueles versados na técnica.
[0052] Além disso, o termo "anticorpo" ou "anticorpo anti-HER-3", conforme usado neste documento, significa um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo recombinante, um anticorpo humanizado (Jones e outros., Nature 321 (1986), 522-525; Riechmann e outros., Nature 332 (1988), 323-329; e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 (1992), 593-596), um anticorpo quimérico (Morrison e outros., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81 (1984), 6851-6855), um anticorpo multiespecífico (por exemplo, um anticorpo biespecífico) formado a partir de pelo menos dois anticorpos, ou um fragmento de anticorpo dele. O termo "fragmento de anticorpo" compreende qualquer porção dos anticorpos antes mencionados, preferivelmente as suas regiões de ligação a antígenos ou variáveis. Os exemplos de fragmentos de anticorpos incluem os fragmentos Fab, os fragmentos Fab', os fragmentos F(ab')2, os fragmentos Fv, os diacorpos (Hollinger e outros., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (1993), 6444-6448), as moléculas de anticorpos de cadeias individuais (Plückthun em: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113, Rosenburg e Moore, EDS, Springer Verlag, N.Y. (1994), 269-315) e outros fragmentos, desde que eles exibam a capacidade desejada de ligação ao HER-3.
[0053] Além disso, o termo "anticorpo" ou "anticorpo anti-HER-3", conforme usado aqui, pode incluir as moléculas similares a anticorpos que contêm subdomínios engenheirados de anticorpos ou variantes de anticorpos de ocorrência natural. Estas moléculas similares a anticorpos podem ser anticorpos de domínios individuais, tais como os domínios somente VH ou somente VL, derivados de fontes naturais, tais como os camelídeos (Muyldermans e outros., Reviews in Molecular Biotechnology 74, 277-302), ou através da exposição in vitro de bibliotecas de seres humanos, camelídeos ou outras espécies (Holt e outros., Trends Biotechnol., 21, 484-90).
[0054] De acordo com a presente invenção, o "fragmento Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um sítio completo de reconhecimento e de ligação a um antígeno. Esta região consiste em um dímero de um domínio variável de uma cadeia pesada e uma leve em associação não covalente, firme. É nesta configuração que três CDRs de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação a antígeno sobre a superfície do dímero VH-VL. Coletivamente, as seis CDRs conferem especificidade de ligação a antígeno para o anticorpo. Entretanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo somente três CDRs específicas para um antígeno) tem a capacidade de reconhecer e ligar o antígeno, embora normalmente em uma menor afinidade do que o sítio de ligação inteiro. O "fragmento Fab" também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. O "fragmento Fab" difere do "fragmento Fab'" pela adição de alguns resíduos na extremidade de carbóxi do domínio CH1 da cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas da região de articulação do anticorpo. O "fragmento F(ab')2" originalmente é produzido como um par de "fragmentos Fab'", os quais têm cisteínas de articulação entre eles. Os métodos de preparar tais fragmentos de anticorpos, tais como a digestão com papaína ou pepsina, são conhecidos para aqueles versados na técnica.
[0055] Em uma modalidade preferida da presente invenção, o anticorpo anti-HER-3 da invenção é do tipo IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM, preferivelmente do tipo IgG ou IgM, incluindo, porém não limitado ao tipo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM1 e IgM2. Nas modalidades mais preferidas, o anticorpo é do tipo IgG1, IgG2 ou IgG4.
[0056] Em uma outra modalidade preferida da presente invenção, o anticorpo anti-HER-3 da invenção é um anticorpo anti-HER-3 dirigido contra o domínio extracelular (ECD) do HER-3.
[0057] Em certos aspectos, por exemplo, em conexão com a geração de anticorpos como candidatos terapêuticos contra o HER-3, pode ser desejável que o anticorpo anti-HER-3 da invenção seja capaz de fixar o complemento e participar na citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Existem diversos isótipos de anticorpos que são capazes disto, incluindo, sem limitações, os que seguem: IgM de murino, IgG2a de murino, IgG2b de murino, IgG3 de murino, IgM humana, IgG1 humana, IgG3 humana, e IgA humana. Será apreciado que os anticorpos que são gerados não necessitam inicialmente possuir tal isótipo, porém, preferivelmente, o anticorpo, conforme gerado, pode possuir qualquer isótipo e o anticorpo pode ser trocado de isótipo por fixação dos genes ou do cDNA da região V molecularmente clonado aos genes ou cDNAs da região constante molecularmente clonados, em vetores de expressão apropriados, usando práticas convencionais biológicas moleculares, que são bastante conhecidas na técnica, e então expressão dos anticorpos em células hospedeiras, usando práticas conhecidas na técnica. O anticorpo trocado de isótipo pode também possuir uma região Fc que tenha sido molecularmente engenheirada para possuir CDC superior sobre as variantes de ocorrência natural (Idusogie e outros., J Immunol., 166, 2571-2575) e expressa de modo recombinante em células hospedeiras, usando práticas conhecidas na técnica. Tais práticas incluem o uso de técnicas recombinantes diretas (ver, por exemplo, a Patente U.S. No 4.816.397), técnicas de fusão de célulacélula (ver, por exemplo, as Patentes U.S. Nos 5.916.771 e 6.207.418), entre outras. Na técnica de fusão de célula-célula, um mieloma ou outra linhagem celular, tal como CHO, é preparada, que possui uma cadeia pesada com qualquer isótipo desejado e um outro mieloma ou outra linhagem celular, tal como CHO, é preparada, que possui a cadeia leve. Tais células podem, após isso, ser fundidas e uma linhagem celular expressando um anticorpo intacto pode ser isolada. Como forma de exemplo, um anticorpo anti-HER-3 de IgG4 humano, que possui a ligação desejada ao antígeno HER-3, poderia ser prontamente trocado de isótipo para gerar um isótipo de IgM humana, IgG1 humana ou IgG3 humana, ao mesmo tempo possuindo a mesma região variável (que define a especificidade do anticorpo e algo de sua afinidade). Tal molécula poderia então ser capaz de fixar o complemento e participar na CDC.
[0058] Além disso, pode também ser desejável para o anticorpo anti-HER-3 da invenção ser capaz de ligar-se aos receptores de Fc sobre as células efetoras, tais como os monócitos e as células exterminadoras naturais (NK), e participar na citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Existem diversos isótipos de anticorpos que são capazes disto, incluindo, sem limitações, os que seguem: IgG2a de murino, IgG2b de murino, IgG3 de murino, IgG1 humana e IgG3 humana. Será apreciado que os anticorpos que são gerados não necessitam inicialmente possuir tal isótipo, porém, preferivelmente, o anticorpo, conforme gerado, pode possuir qualquer isótipo e o anticorpo pode ser trocado de isótipo por fixação dos genes ou do cDNA da região V molecularmente clonado aos genes ou cDNAs da região constante molecularmente clonados, em vetores de expressão apropriados, usando práticas convencionais biológicas moleculares, que são bastante conhecidas na técnica, e então expressão dos anticorpos em células hospedeiras, usando práticas conhecidas na técnica. O anticorpo trocado de isótipo pode também possuir uma região Fc que tenha sido molecularmente engenheirada para possuir ADCC superior sobre as variantes de ocorrência natural (Shields e outros. J biol Chem., 276, 6591-6604) e expressa de modo recombinante em células hospedeiras usando práticas conhecidas na técnica. Tais práticas incluem o uso de técnicas recombinantes diretas (ver, por exemplo, a Patente U.S. No 4.816.397), técnicas de fusão de célula-célula (ver, por exemplo, as Patentes U.S. Nos 5.916.771 e 6.207.418), entre outras. Na técnica de fusão de célula-célula, um mieloma ou outra linhagem celular, tal como CHO, é preparada, que possui uma cadeia pesada com qualquer isótipo desejado, e um outro mieloma ou outra linhagem celular, tal como CHO, é preparada, que possui a cadeia leve. Tais células podem, após isso, ser fundidas e uma linhagem celular expressando um anticorpo intacto pode ser isolada. Como forma de exemplo, um anticorpo anti-HER-3 de IgG4 humano, que possui a ligação desejada ao antígeno HER-3, poderia ser prontamente trocado de isótipo para gerar um isótipo de IgG1 humana ou IgG3 humana, ao mesmo tempo possuindo a mesma região variável (que define a especificidade do anticorpo e algo de sua afinidade). Tal molécula poderia então ser capaz de ligar-se ao FcyR sobre as células efetoras e participar na ADCC.
[0059] Além disso, de acordo com a presente invenção, aprecia-se que o anticorpo anti-HER-3 da invenção é um anticorpo totalmente humano ou humanizado. Os anticorpos humanos evitam certos dos problemas associados com os anticorpos xenogênicos, por exemplo, os anticorpos que possuem regiões variáveis e/ou constantes de murinos ou ratos. A presença de proteínas xenogênicas derivadas, tais como as proteínas derivadas de murinos ou ratos, pode resultar na geração de uma resposta imune contra o anticorpo por um paciente, subseqüentemente levando à rápida depuração dos anticorpos, à perda de utilidade terapêutica através da neutralização do anticorpo e/ou a reações alérgicas graves, que podem até causar morte.
[0060] De preferência, o anticorpo anti-HER-3 selecionado a partir do grupo que consiste em anticorpo anticorpo anticorpo anticorpo anticorpo anticorpo U1-23, anticorpo anticorpo U1-27, anticorpo anticorpo U1-31, anticorpo anticorpo U1-35, anticorpo anticorpo U1-39, anticorpo anticorpo U1-43, anticorpo anticorpo U1-47, anticorpo anticorpo U1-51, anticorpo U1-52, anticorpo U1-53, anticorpo U1-55.1, U1-3, anticorpo U1-7, anticorpo U1-11, anticorpo U1-15, anticorpo U1-19, anticorpo U1-4, anticorpo U1-8, anticorpo U1-12, anticorpo U1-16, anticorpo U1-20, anticorpo U1-24, anticorpo U1-28, anticorpo U1-32, anticorpo U1-36, anticorpo U1-40, anticorpo U1-44, anticorpo U1-48, anticorpo U1-5, U1-9, U1-13, U1-17, U1-21, U1-25, U1-29, U1-33, U1-37, U1-41, U1-45, U1-49, da invenção é anticorpo anticorpo anticorpo anticorpo anticorpo anticorpo anticorpo anticorpo anticorpo anticorpo anticorpo anticorpo anticorpo U1-2, U1-6, U1-10, U1-14, U1-18, U1-22, U1-26, U1-30, U1-34, U1-38, U1-42, U1-46, U1-50, anticorpo U1-55, anticorpo U1-57.1, anticorpo U1-57, anticorpo U1-58, anticorpo U1-59, anticorpo U1-61.1, anticorpo U1-61, anticorpo U1-62.
[0061] Em uma modalidade preferida da presente invenção, uma proteína de ligação da invenção é acoplada a um grupo de marcação. Tal proteína de ligação é particularmente adequada para aplicações diagnósticas. Conforme usado neste documento, o termo "grupo de marcação" refere-se a um marcador detectável, por exemplo, um aminoácido radiomarcado ou porção de biotinila que possa ser detectada pela avidina marcada (por exemplo, a estreptavidina ligada a um marcador fluorescente ou atividade enzimática que possa ser detectada por métodos ópticos ou colorimétricos). Diversos métodos para marcar os polipeptídeos e as glicoproteínas, tais como os anticorpos, são conhecidos na técnica e podem ser usados na realização da presente invenção. Os exemplos de grupos de marcação adequados incluem, porém não estão limitados aos que seguem: radioisótopos ou radionuclídeos (por exemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), grupos fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, substâncias fosforescentes de lantanídeos), grupos enzimáticos (por exemplo, peroxidase da rábano silvestre, βgalactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), grupos quimioluminescentes, grupos de biotinila, ou epítopos de polipeptídeos predeterminados, reconhecidos por um relator secundário (por exemplo, as sequências de pares de leucina zipper, os sítios de ligação para os anticorpos secundários, os domínios de ligação a metais, as marcas de epítopos). Em certos aspectos, pode ser desejável que os grupos de marcação estejam unidos por braços espaçadores de diversos comprimentos, para reduzir o impedimento estérico potencial.
[0062] Alternativamente, uma proteína de ligação da invenção pode ser acoplada a um grupo efetor em uma outra modalidade preferida da invenção. Tal proteína de ligação é especialmente adequada para aplicações terapêuticas. Conforme usado neste documento, o termo "grupo efetor" refere-se a um grupo citotóxico, tal como um radioisótopo ou radionuclídeo, uma toxina, um grupo terapêutico ou outro grupo efetor conhecido na técnica. Os exemplos para os grupos efetores adequados são os radioisótopos ou os radionuclídeos (por exemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), a caliqueamicina, os análogos de dolastatina, tais como as auristatinas, e os agentes quimioterapêuticos, tais como a geldanamicina e os derivados de maitansina, incluindo o DM1. Em certos aspectos, pode ser desejável que os grupos efetores estejam unidos por braços espaçadores de diversos comprimentos, para reduzir o impedimento estérico potencial.
[0063] Um segundo aspecto da presente invenção refere-se a um processo para preparar uma proteína de ligação isolada da invenção, compreendendo a etapa de preparar a proteína de ligação a partir de uma célula hospedeira que secreta a proteína de ligação. As células hospedeiras, que podem ser usadas de acordo com a presente invenção, são hibridomas; células eucarióticas, tais como as células de mamíferos, por exemplo, as células de hamster, coelhos, ratos, porcos, camundongos ou outros animais, as células de plantas, as células fúngicas, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, as células procarióticas, tais como E. coli; e outras células usadas na técnica para a produção de proteínas de ligação. Diversos métodos para preparar e isolar as proteínas de ligação, tais como as proteínas de andaime ou os anticorpos, a partir de células hospedeiras são conhecidos na técnica e podem ser usados na realização da presente invenção. Além disso, os métodos para preparar os fragmentos de proteínas de ligação, por exemplo, os fragmentos das proteínas de andaime ou os fragmentos dos anticorpos, tais como a digestão com papaína ou pepsina, as técnicas de clonagem modernas, as técnicas para a preparação de moléculas de anticorpos de cadeias individuais (Plückthun em: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113, Rosenburg e Moore, EDS, Springer Verlag, N.Y. (1994), 269-315) e diacorpos (Hollinger e outros., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (1993), 6444-6448), são conhecidos também para aqueles versados na técnica e podem ser usados na efetuação da presente invenção.
[0064] Em uma modalidade preferida da presente invenção, uma proteína de ligação da invenção é preparada a partir de um hibridoma que secreta a proteína de ligação. Ver, por exemplo, Kohler e outros., Nature 256 (1975), 495.
[0065] Em uma modalidade preferida adicional da presente invenção, uma proteína de ligação da invenção é preparada de modo recombinante por otimização e/ou amplificação da expressão da proteína de ligação em uma célula hospedeira e isolamento da proteína de ligação a partir da dita célula hospedeira. Para esta finalidade, as células hospedeiras são transformadas ou transfectadas com DNA que codifica uma proteína de ligação ou um vetor contendo DNA que codifica a proteína de ligação e cultivadas sob condições apropriadas para produzir a proteína de ligação da invenção. Ver, por exemplo, a Patente U.S. No 4.816.567. As células hospedeiras preferidas podem ser as células CHO, as células de mieloma NS/0, as células de rins embriônicas humanas 293, E. coli e Saccharomyces cerevisiae.
[0066] Com relação às proteínas de ligação que são anticorpos, estes anticorpos podem ser preparados a partir de animais geneticamente engenheirados para preparar anticorpos inteiramente humanos ou a partir de uma biblioteca de exposição de anticorpos feitas em bacteriófago, levedura, ribossomo ou E. coli. Ver, por exemplo, Clackson e outros., Nature 352 (1991), 624-628, Marks e outros., J. Mol. Biol. 222 (1991), 581-597, Feldhaus e Siegel J Immunol Methods. 290, 69-80, Groves e Osbourn, Expert Opin Biol Ther., 5, 125-135 e Jostock e Dubel, Comb Chem High Throughput Screen. 8, 127-133.
[0067] Os anticorpos humanos evitam alguns dos problemas associados com os anticorpos que possuem regiões variáveis e/ou constantes de murinos ou ratos. A presença de tais proteínas derivadas de murinos ou ratos pode resultar na rápida depuração dos anticorpos ou pode resultar na geração de uma resposta imune contra o anticorpo, por um paciente. Para evitar a utilização de anticorpos derivados de murinos ou ratos, os ânticos inteiramente humanos podem ser gerados através da introdução de locais de anticorpos humanos funcionais em um rodente, outro mamífero ou animal, de modo que o rodente, o outro mamífero ou o animal produza anticorpos inteiramente humanos.
[0068] Um método para gerar anticorpos inteiramente humanos é através do uso das cepas XENOMOUSE® de camundongos que tenham sido engenheiradas para conter fragmentos de configurações de linhas germinativas de tamanhos 245 kb e 190 kb do local da cadeia pesada humana e no local da cadeia leve capa. As outras cepas XenoMouse de camundongos contêm fragmentos de configurações de linhas germinativas de tamanhos 980 kb e 800 kb do local da cadeia pesada humana e do local da cadeia leve capa. Ainda as outras cepas XenoMouse de camundongos contêm fragmentos de configurações de linhas germinativas de tamanhos 980 kb e 800 kb do local da cadeia pesada humana e do local da cadeia leve capa mais um local da cadeia leve lambda humana completa configurada com linha germinativa de tamanho 740 kb. Ver Mendez e outros. Nature Genetics 15:146-156 (1997) e Green e Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998). As cepas XENOMOUSE® estão disponíveis de Abgenix, Inc. (Fremont, CA).
[0069] A produção dos camundongos XENOMOUSE® é adicionalmente discutida e descrita nos Pedidos de Patentes U.S. Nos de Série 07/466,008, depositado em 12 de janeiro de 1990, 07/610,515, depositado em 8 de novembro de 1990, 07/919,297, depositado em 24 de julho de 1992, 07/922,649, depositado em 30 de julho de 1992, 08/031,801, depositado em 15 de março de 1993, 08/112,848, depositado em 27 de agosto de 1993, 08/234,145, depositado em 28 de abril de 1994, 08/376,279, depositado em 20 de janeiro de 1995, 08/430, 938, 27 de abril de 1995, 08/464,584, depositado em 5 de junho de 1995, 08/464,582, depositado em 5 de junho de 1995, 08/463,191, depositado em 5 de junho de 1995, 08/462,837, depositado em 5 de junho de 1995, 08/486,853, depositado em 5 de junho de 1995, 08/486,857, depositado em 5 de junho de 1995, 08/486,859, depositado em 5 de junho de 1995, 08/462,513, depositado em 5 de junho de 1995, 08/724,752, depositado em 2 de outubro de 1996, e 08/759,620, depositado em 3 de dezembro de 1996, na Publicação de Patente U.S. 2003/0217373, depositada em 20 de novembro de 2002, e nas Patentes U.S. Nos 6.833.268, 6.162.963, 6.150.584, 6.114.598, 6.075.181, e 5.939.598 e nas Patentes Japonesas Nos 3 068 180 B2, 3 068 506 B2, e 3 068 507 B2. Ver também a Patente Européia No EP 0 463 151 B1, concessão publicada em 12 de junho de 1996, o Pedido de Patente Internacional No WO 94/02602, publicado em 3 de fevereiro de 1994, o Pedido de Patente Internacional No WO 96/34096, publicado em 31 de outubro de 1996, o WO 98/24893, publicado em 11 de junho de 1998, o WO 00/76310, publicado em 21 de dezembro de 2000. As descrições de cada uma das patentes, pedidos, e referências acima citados são, pelo presente, incorporadas por referência em sua totalidade.
[0070] Em uma abordagem alternativa, outros, incluindo a GenPharm International, Inc., utilizaram uma abordagem de "minilocal". Na abordagem de minilocal, um local de Ig exógeno é copiado através da inclusão de pedaços (genes individuais) do local de Ig. Assim, um ou mais genes de VH, um ou mais genes de DH, um ou mais genes de JH, uma região constante mu, e uma segunda região constante (preferivelmente uma região constante gama) são formados em uma construção para a inserção em um animal. Esta abordagem é descrita na Patente U.S. No 5.545.807 para Surani e outros. e nas Patentes U.S. Nos 5.545.806, 5.625.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016, 5.770.429, 5.789.650, 5.814.318, 5.877.397, 5.874.299, e 6.255.458, cada uma para Lonberg e Kay, nas Patentes U.S. Nos 5.591.669 e 6.023.010 para Krimpenfort e Berns, nas Patentes U.S. Nos 5.612.205, 5.721.367, e 5.789.215 para Berns e outros., e na Patente U.S. No 5.643.763 para Choi e Dunn, e nos Pedidos de Patentes U.S. Internacionais da GenPharm International Nos de Série 07/574,748, depositado em 29 de agosto de 1990, 07/575,962, depositado em 31 de agosto de 1990, 07/810,279, depositado em 17 de dezembro de 1991, 07/853,408, depositado em 18 de março de 1992, 07/904,068, depositado em 23 de junho de 1992, 07/990,860, depositado em 16 de dezembro de 1992, 08/053,131, depositado em 26 de abril de 1993, 08/096,762, depositado em 22 de julho de 1993, 08/155,301, depositado em 18 de novembro de 1993, 08/161,739, depositado em 3 de dezembro de 1993, 08/165,699, depositado em 10 de dezembro de 1993, 08/209,741, depositado em 9 de março de 1994, cujas descrições são, pelo presente, incorporadas por referência. Ver também a Patente Européia No 0 546 073 B1, os Pedidos de Patentes Internacionais Nos WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, e WO 98/24884 e a Patente U.S. No 5.981.175, cujas descrições são, pelo presente, incorporadas por referência em sua totalidade. Ver adicionalmente Taylor e outros., 1992, Chen e outros., 1993, Tuaillon e outros., 1993, Choi e outros., 1993, Lonberg e outros., (1994), Taylor e outros., (1994), e Tuaillon e outros., (1995), Fishwild e outros., (1996), cujas descrições são, pelo presente, incorporadas por referência em sua totalidade.
[0071] Kirin também demonstrou a geração de anticorpos humanos a partir de camundongos nos quais, através de fusão de microcélulas, foram introduzidos pedaços grandes de cromossomos, ou cromossomos inteiros. Ver os Pedidos de Patentes Europeus Nos 773 288 e 843 961, cujas descrições são, pelo presente, incorporadas por referência. Adicionalmente, foram gerados os camundongos KM®, que são o resultado da hibridização dos camundongos Tc de Kirin com os camundongos de minilocais (Humab) de Medarex. Estes camundongos possuem o transcromossomo de HC dos camundongos de Kirin e o transgene de cadeia capa dos camundongos de Medarex (Ishida e outros., Cloning Stem Cells, (2002) 4:91-102).
[0072] Os anticorpos humanos podem também ser derivados por métodos in vitro. Os exemplos adequados incluem, porém não estão limitados à, exposição em fagos (como comercializado por Cambridge Antibody Technology, Morphosys, Dyax, Biosite/Medarex, Xoma, Symphogen, Alexion (anteriormente Proliferon), Affimed), exposição em ribossomos (como comercializado por Cambridge Antibody Technology), exposição em leveduras, e similares.
[0073] Os anticorpos, como descritos neste documento, foram preparados através da utilização da tecnologia XENOMOUSE®, conforme descrita abaixo. Tais camundongos, então, são capazes de produzir moléculas e anticorpos de imunoglobulinas humanos e são deficientes na produção de moléculas e anticorpos de imunoglobulinas de murinos. As tecnologias utilizadas para obter os mesmos são divulgadas nas patentes, nos pedidos, e nas referências divulgados na seção de fundamentos aqui contida. Em particular, entretanto, uma modalidade preferida da produção transgênica de camundongos e anticorpos a partir deles é divulgada no Pedido de Patente U.S. No de Série 08/759,620, depositado em 3 de dezembro de 1996, e nos Pedidos de Patentes Internacionais Nos WO 98/24893, publicado em 11 de junho de 1998 e WO 00/76310, publicado em 21 de dezembro de 2000, cujas descrições são, pelo presente, incorporadas por referência. Ver também Mendez e outros. Nature Genetics 15:146-156 (1997), cuja descrição é, pelo presente, incorporada por referência.
[0074] Através do uso de tal tecnologia, produziram-se anticorpos monoclonais inteiramente humanos para uma variedade de antígenos. Essencialmente, as linhagens de camundongos XENOMOUSE® são imunizadas com um antígeno de interesse (por exemplo, o HER-3), as células linfáticas (tais como as células B) são recuperadas dos camundongos que expressaram os anticorpos, e as linhagens celulares recuperadas são fundidas com uma linhagem celular do tipo mielóide para preparar as linhagens celulares de hibridomas imortais. Estas linhagens celulares de hibridomas são examinadas e selecionadas para identificar as linhagens celulares de hibridomas que produziram anticorpos específicos para o antígeno de interesse. Proporcionam-se neste documento métodos para a produção de múltiplas linhagens celulares de hibridomas que produzem anticorpos específicos para HER-3. Ademais, proporciona-se neste documento a caracterização dos anticorpos produzidos por tais linhagens celulares, incluindo as análises das sequências de nucleotídeos e aminoácidos das cadeias pesadas e leves de tais anticorpos.
[0075] Em geral, os anticorpos produzidos pelos hibridomas fundidos eram cadeias pesadas da IgG1 humanas com cadeias leves capa inteiramente humanas. Os anticorpos descritos neste documento possuem cadeias pesadas da IgG4 humanas, bem como cadeias pesadas da IgG1. Os anticorpos podem também ser de outros isótipos humanos, incluindo IgG2 ou IgG3. Os anticorpos possuíam altas afinidades, tipicamente possuindo uma KD de cerca de 10-6 até cerca de 10-13 M ou abaixo, quando medidas por técnicas de fase sólida e à base de células.
[0076] Um outro aspecto da presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucléico isolada que codifica uma proteína de ligação da invenção. Dentro do contexto da presente invenção, o termo "molécula de ácido nucléico isolada", conforme usado neste documento, significa um polinucleotídeo de origem genômica, de cDNA, ou sintética, ou alguma combinação disto, que, em virtude de sua origem, a "molécula de ácido nucléico isolada" (1) não está associada com todo ou uma porção de um polinucleotídeo no qual o "polinucleotídeo isolado" é encontrado na natureza, (2) está operavelmente ligada a um polinucleotídeo ao qual não está ligada na natureza, ou (3) não ocorre na natureza como parte de uma sequência maior. Ademais, o termo "molécula de ácido nucléico", como referido neste documento, significa uma forma polimérica de nucleotídeos de pelo menos 10 bases de comprimento, ribonucleotídeos ou desoxinucleotídeos ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo, tal como os nucleotídeos com grupos de açúcar modificados ou substituídos e similares. O termo também inclui as formas de fitas simples ou duplas de DNA.
[0077] Em uma modalidade da presente invenção, uma molécula de ácido nucléico da invenção está operavelmente ligada a uma sequência de controle. O termo "sequência de controle", conforme usado neste documento, refere-se às sequências de polinucleotídeos que são necessárias para efetuar a expressão e o processamento das sequências de codificação às quais elas estão ligadas. A natureza de tais sequências de controle difere, dependendo do organismo hospedeiro. Nos procariotos, tais sequências de controle geralmente incluem promotores, sítios de ligação ribossômicos, e sequências de terminação da transcrição. Nos eucariotos, geralmente, tais sequências de controle incluem os promotores e as sequências de terminação da transcrição. De acordo com a presente invenção, o termo "sequência de controle" é pretendido incluir, em um mínimo, todos os componentes cuja presença seja essencial para a expressão e o processamento, e pode também incluir componentes adicionais cuja presença seja vantajosa, por exemplo, as sequências líderes e as sequências de pares de fusão. Ademais, o termo "operavelmente ligada", conforme usado neste documento, refere-se às posições dos componentes assim descritos que estão em uma relação que os permite funcionar em sua maneira pretendida. Além disso, de acordo com a presente invenção, uma sequência de controle da expressão operavelmente ligada a uma sequência de codificação está ligada em um modo tal que a expressão da sequência de codificação é atingida sob condições compatíveis com a sequência de controle da expressão.
[0078] Um aspecto adicional da presente invenção é um vetor compreendendo uma molécula de ácido nucléico que codifica uma proteína de ligação da invenção. A molécula de ácido nucléico pode estar operavelmente ligada a uma sequência de controle. Além disso, o vetor pode adicionalmente conter uma origem de replicação ou um gene marcador de seleção. Os exemplos de vetores que podem ser usados de acordo com a presente invenção são, por exemplo, os plasmídios, os cosmídios, os fagos, os vírus, etc.
[0079] Um outro aspecto da presente invenção refere-se a uma célula hospedeira transformada com uma molécula de ácido nucléico ou vetor da invenção. A transformação poderia ser feita por qualquer método conhecido para a introdução de polinucleotídeos em uma célula hospedeira, incluindo, por exemplo, o acondicionamento do polinucleotídeo em um vírus (ou em um vetor viral) e a transdução de uma célula hospedeira com o vírus (ou vetor) ou por procedimentos de transfecção conhecidos na técnica, conforme exemplificados pelas Patentes U.S. Nos 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461, e 4.959.455, cujas patentes são, pelo presente, incorporadas neste documento por referência. Particularmente, os métodos para introduzir polinucleotídeos heterólogos em células mamíferas são bastante conhecidos na técnica e incluem a transfecção mediada por dextrana, a precipitação com fosfato de cálcio, a transfecção mediada por polibreno, a fusão de protoplasto, a eletroporação, a encapsulação do(s) polinucleotídeo(s) em lipossomos, e a microinjeção direta do DNA nos núcleos. Os exemplos de células hospedeiras que podem ser usadas de acordo com a presente invenção são as células eucarióticas de hibridomas, tais como as células de mamíferos, por exemplo, as células de hamster, coelhos, ratos, porcos, camundongos ou outros animais; as células de plantas e as células fúngicas, por exemplo, milho, tabaco, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris; as células procarióticas, tais como E. coli; e outras células usadas na técnica para a produção de anticorpos. Especialmente, as linhagens celulares mamíferas disponíveis como hospedeiros para a expressão são bastante conhecidas na técnica e incluem muitas linhagens celulares imortalizadas disponíveis da American Type Culture Collection (ATCC) ("Coleta de Cultura do Tipo Americano"), incluindo, porém não limitado às células do ovário de hamster chinês (CHO), células HeLa, células do rim de hamster bebê (BHK), células dos rins de macacos (COS), células de carcinoma hepatocelular (por exemplo, Hep G2), e diversas outras linhagens celulares.
[0080] Mais um outro aspecto da presente invenção é uma composição farmacêutica compreendendo, como um agente ativo, pelo menos uma proteína de ligação da invenção e veículos, diluentes e/ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis. O termo "composição farmacêutica", conforme usado neste documento, refere-se a um composto ou composição química capaz de induzir um efeito terapêutico desejado quando adequadamente administrada a um paciente (The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms, Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985), incorporado neste documento por referência). De acordo com a presente invenção, a potência da composição farmacêutica da invenção é baseada na ligação da pelo menos uma proteína de ligação ao HER-3. De preferência, esta ligação resulta em uma redução da transdução de sinal mediada pelo HER-3.
[0081] Além disso, o termo "veículos", quando usado neste documento, inclui os veículos, os excipientes, ou os estabilizantes que sejam não tóxicos para a célula ou o mamífero que está sendo exposto a eles, nas dosagens e concentrações empregadas. Frequentemente, o veículo fisiologicamente aceitável é uma solução tamponada de pH aquosa ou um lipossomo (uma pequena vesícula composta de diversos tipos de lipídios, fosfolipídios e/ou tensoativos, que é útil para a distribuição de um fármaco para um mamífero). Os exemplos de veículos fisiologicamente aceitáveis incluem os tampões, tais como o fosfato, o citrato, e outros ácidos orgânicos; os antioxidantes, incluindo o ácido ascórbico; os polipeptídeos de baixos pesos moleculares (menos do que cerca de 10 resíduos); as proteínas, tais como a soro albumina, a gelatina, ou as imunoglobulinas; os polímeros hidrofílicos, tais como a polivinilpirrolidona; os aminoácidos, tais como a glicina, a glutamina, a asparagina, a arginina ou a lisina; os monossacarídeos, os dissacarídeos, e outros carboidratos, incluindo a glicose, a manose ou as dextrinas; os agentes quelantes, tais como o EDTA; os álcoois de açúcares, tais como o manitol ou o sorbitol; os contra-íons formadores de sais, tais como o sódio; e/ou os tensoativos não-iônicos, tais como o TWEEN®, o polietileno glicol (PEG), e os PLURONICS®.
[0082] Em uma modalidade da presente invenção, a pelo menos uma proteína de ligação da invenção contida na composição farmacêutica é acoplada a um efetor, tal como a caliqueamicina, a Auristatina-PE, um radioisótopo ou um agente quimioterapêutico tóxico, tal como a geldanamicina e a maitansina. Em particular, estes conjugados da proteína de ligação são úteis no alvejamento de células, por exemplo, as células de câncer, que expressam o HER-3 para a eliminação.
[0083] Além disso, a ligação das proteínas de ligação da invenção aos radioisótopos, por exemplo, proporciona vantagens para os tratamentos de tumores. Ao contrário da quimioterapia e de outras formas de tratamento do câncer, a radio-imunoterapia ou a administração de uma combinação de radioisótopo-proteína de ligação alveja diretamente as células de câncer, com dano mínimo ao tecido saudável, normal, circundante. Com este "remédio mágico", o paciente pode ser tratado com quantidades muito menores de radioisótopos do que as outras formas de tratamento disponíveis hoje. Os radioisótopos preferidos incluem o ítrio90 (90Y), o índio111 (111In), o 131I, o 99mTc, a radioprata-111, a radioprata-199, e o Bismuto213. A ligação dos radioisótopos às proteínas de ligação da invenção pode, por exemplo, ser efetuada com quelatos bifuncionais convencionais. Visto que a prata é monovalente, para a ligação da radioprata-111 e da radioprata199, podem ser usados os ligadores à base de enxofre (Hazra e outros., Cell Biophys. 24-25, 1-7 (1994)). A ligação dos radioisótopos de prata pode envolver a redução da imunoglobulina com o ácido ascórbico. Além disso, o tiuxetano é um quelante ligador de MX-DTPA unido ao ibritumomab para formar o ibritumomab tiuxetano (Zevalin) (Witzig, T.E, Cancer Chemother. Pharmacol. 48 Supl 1, 91-5 (2001). O ibritumomab tiuxetano pode reagir com os radioisotipos, tais como o índio111 (111In) ou o 90Y, para formar o 111In-ibritumomab tiuxetano e o 90Y-ibritumomab tiuxetano, respectivamente.
[0084] Além disso, uma proteína de ligação da invenção, particularmente quando usada para tratar o câncer, pode ser conjugada com fármacos quimioterapêuticos tóxicos, tais como a caliqueamicina (Hamann e outros., Bioconjug. Chem. 13(1), 40-6 (2002), a geldanamicina (Mandler e outros., J. Natl. Cancer Inst., 92(19), 1549-51 (2000)) e a maitansina, por exemplo, o fármaco maitansinóide, DM1 (Liu e outros., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:8618-8623 (1996)). Podem ser empregados com esta tecnologia diferentes ligadores que liberam os fármacos sob condições ácidas ou redutoras ou na exposição a proteases específicas. De acordo com a presente invenção, uma proteína de ligação da invenção pode ser conjugada conforme descrito na técnica.
[0085] A auristatina-PE, por exemplo, é um agente antimicrotúbulo que é uma modificação estrutural do constituinte de peptídeo de molusco sem concha, marinho, dolastatina 10. A auristatina-PE tanto tem atividade antitumor quanto atividade vascular antitumor (Otani e outros., Jpn. J. Cancer Res. 91(8), 837-44 (2000)). Por exemplo, a auristatina-PE inibe o crescimento da célula e induz a interrupção do ciclo celular e a apoptose nas linhagens celulares de câncer pancreático (Li e outros., Int. J. Mol. Med. 3(6), 647-53 (1999)). Desse modo, para marcar ar especificamente a atividade antitumor e as atividades vasculares antitumor da auristatina-PE aos tumores particulares, a auristatina-PE pode ser conjugada à proteína de ligação da invenção.
[0086] Em uma modalidade da presente invenção, a composição farmacêutica compreende pelo menos um agente ativo adicional. Os exemplos para os agentes ativos adicionais, os quais podem ser usados de acordo com a presente invenção, são os anticorpos ou os inibidores de baixos pesos moleculares de outras cinase protéicas receptoras, tais como o EGFR, o HER-2, o HER-4, o IGFR-1, ou o cmet, os ligantes de receptores, tais como o fator endotelial vascular (VEGF), os agentes citotóxicos, tais como a doxorrubicina, a cisplatina ou a carboplatina, as citocinas ou os agentes antineoplásticos. Muitos agentes antineoplásticos são atualmente conhecidos na técnica. Em uma modalidade, o agente antineoplástico é selecionado a partir do grupo de proteínas terapêuticas, incluindo, porém não limitadas aos, anticorpos ou proteínas imunomoduladoras. Em uma outra modalidade, o agente antineoplástico é selecionado a partir do grupo de inibidores de pequenas moléculas ou agentes quimioterapêuticos consistindo em inibidores mitóticos, inibidores das cinases, agentes alquilantes, antimetabólitos, antibióticos que se intercalam, inibidores do fator do crescimento, inibidores do ciclo celular, enzimas, inibidores das topoisomerases, inibidores da histona desacetilase, agentes antisobrevivência, modificadores da resposta biológica, anti-hormônios, por exemplo, antiandrógenos, e agentes antiangiogênse. Quando o agente antineoplástico for a radiação, o tratamento pode ser obtido com uma fonte interna (braquiterapia BT) ou externa (terapia externa de radiação de feixes: EBRT).
[0087] A composição farmacêutica da presente invenção é especialmente adequada para a diagnose, a prevenção ou o tratamento de uma doença hiperproliferativa. A doença hiperproliferativa pode estar, por exemplo, associada com a transdução aumentada de sinal da família do HER. Particularmente, a doença pode estar associada com a fosforilação aumentada do HER-3 e/ou a formação de complexo aumentada entre o HER-3 e os outros membros da família do HER e/ou a atividade aumentada da PI3 cinase e/ou a atividade da cinase terminal c-jun e/ou a atividade da AKT aumentadas e/ou a atividade da ERK2 e/ou a atividade da PYK2 aumentadas. De preferência, a doença hiperproliferativa é selecionada a partir do grupo que consiste em câncer de mama, câncer gastrointestinal, câncer pancreático, câncer da próstata, câncer ovariano, câncer do estômago, câncer endometrial, câncer da glândula salivar, câncer do pulmão, câncer do rim, câncer do cólon, câncer colorretal, câncer da tireóide, câncer da bexiga, glioma, melanoma, ou outros cânceres que expressam ou superexpressam o HER-3, e na formação de metástases do tumor.
[0088] De acordo com a presente invenção, o termo "prevenção ou tratamento", quando usado neste documento, refere-se tanto ao tratamento terapêutico quanto às medidas profiláticas ou preventivas, onde o paciente que necessita é para prevenir ou desacelerar (diminuir) a condição ou o distúrbio patológico alvejado. Aqueles que necessitam de prevenção ou tratamento incluem aqueles já com o distúrbio, bem como aqueles propensos a terem o distúrbio ou aqueles em que o distúrbio é para ser prevenido. O paciente que necessita de prevenção ou tratamento é um paciente mamífero, isto é, qualquer animal classificado como um mamífero, incluindo os seres humanos, os animais domésticos e de fazendas, e os animais de zoológicos, de esportes, ou de estimação, tais como os cães, os gatos, o gado, os cavalos, as ovelhas, os porcos, as cabras, os coelhos, etc. De preferência, o paciente que necessita de tratamento é um paciente humano.
[0089] De acordo com a presente invenção, a composição farmacêutica da invenção pode ser formulada por mistura do(s) agente(s) ativo(s) com veículos, diluentes e/ou adjuvantes fisiologicamente aceitáveis, e opcionalmente outros agentes que sejam normalmente incorporados nas formulações para proporcionar a transferência, a distribuição, a tolerância, e similares, aperfeiçoadas. A composição farmacêutica da invenção pode ser formulada, por exemplo, na forma de formulações liofilizadas, soluções aquosas, dispersões ou preparações sólidas, tais como comprimidos, drágeas ou cápsulas. Uma multiplicidade de formulações apropriadas pode ser encontrada no formulário conhecido para todos os químico-farmacêuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences (18a ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1990)), particularmente o Capítulo 87, por Block, Lawrence, nele. Estas formulações incluem, por exemplo, os pós, as pastas, os ungüentos, as geléias, as ceras, os óleos, os lipídios, as vesículas contendo lipídios (catiônicos ou aniônicos) (tais como a Lipofectin®), os conjugados de DNA, as pastas de absorção anidras, as emulsões de óleo em água e de água em óleo, as emulsões carbowax (polietileno glicóis de diversos pesos moleculares), os géis semi-sólidos, e as misturas semi-sólidas contendo carbowax. Quaisquer das misturas precedentes podem ser apropriadas nos tratamentos e nas terapias de acordo com a presente invenção, desde que o agente ativo na formulação não seja inativado pela formulação e a formulação seja fisiologicamente compatível e tolerável com a via de administração. Ver também Baldrick P., “Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance.”, Regul. Toxicol. Pharmacol. 32(2), 210-218 (2000); Wang W., “Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.”, Int. J. Pharm. 203(1-2), 1-60 (2000); Charman W.N., “Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts.”, J. Pharm. Sci. 89(8), 967-978 (2000); Powell e outros., “Compendium of excipients for parenteral formulations”, PDA J. Pharm. Sci. Technol. 52, 238-311 (1998); e as citações neles quanto a uma informação adicional relacionada a formulações, excipientes e veículos, bastante conhecidos para os químico-farmacêuticos.
[0090] Um outro aspecto da presente invenção refere-se ao uso de pelo menos uma proteína de ligação isolada da invenção, e opcionalmente pelo menos um outro agente ativo, por exemplo, pelo menos um agente antineoplástico conforme descrito acima, em mistura com veículos, diluentes e/ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis, para a manufatura de uma composição farmacêutica para a diagnose, a prevenção ou o tratamento de uma doença hiperproliferativa. De preferência, a composição farmacêutica é uma composição farmacêutica conforme descrita acima e a doença hiperproliferativa é uma doença hiperproliferativa conforme mencionada acima.
[0091] Ainda um outro aspecto da presente invenção está envolvido com um método para diagnosticar doenças ou condições associadas com a expressão do HER-3, compreendendo contatar uma amostra com uma proteína de ligação da invenção, e detectar a presença do HER-3 na amostra. A amostra pode ser uma célula que mostre a expressão do HER-3, tal como uma célula de tumor, uma amostra de sangue ou uma outra amostra adequada. Em uma modalidade preferida da presente invenção, as doenças ou as condições associadas com a expressão do HER-3 são as doenças hiperproliferativas definidas acima.
[0092] De acordo com a presente invenção, o método pode, por exemplo, ser usado para a detecção do antígeno HER-3 em uma célula, para a determinação da concentração do antígeno HER-3 em pacientes que sofrem de uma doença hiperproliferativa conforme mencionada acima ou para o estadiamento da dita doença hiperproliferativa em um paciente. Para o estadiamento da progressão de uma doença hiperproliferativa em um paciente sob estudo, ou para a caracterização da resposta do paciente a um curso da terapia, uma amostra de sangue pode, por exemplo, ser retirada do paciente e a concentração do antígeno HER-3 presente na amostra é determinada. A concentração assim obtida é usada para identificar em qual faixa de concentrações incide o valor. A faixa assim identificada correlacionase com um estágio de progressão ou um estágio de terapia identificado nas diversas populações dos pacientes diagnosticados, desse modo proporcionando um estágio no paciente sob estudo. Uma biopsia do tecido com a doença, por exemplo, o câncer, obtido do paciente pode também ser usada para avaliar a quantidade de antígeno HER-3 presente. A quantidade de antígeno HER-3 presente no tecido com a doença pode ser avaliada pela imuno-histoquímica, ELISA ou arranjos de anticorpos usando os anticorpos para HER3 da invenção. Os outros parâmetros de interesse diagnóstico são o estado de dimerização, bem como os pares de dimerização da proteína HER3 e o estado de ativação dela e seus pares. Os métodos analíticos com proteínas para determinar aqueles parâmetros são bastante conhecidos na técnica e são, entre outros, as técnicas de transferência western blot e imunoprecipitação, as análises por FACS, a reticulação química, a transferência de energia ressonante por bioluminescência (BRET), a transferência de energia ressonante por fluorescência (FRET) e similares (por exemplo, Price e outros., Methods in Molecular Biology, 218: 255-268 (2002) ou a tecnologia de eTag (WO0503707, WO04091384, WO04011900).
[0093] Além disso, a presente invenção refere-se, em um outro aspecto, a um método para prevenir ou tratar doenças ou condições associadas com a expressão do HER-3 em um paciente, compreendendo administrar a um paciente que está necessitado dele uma quantidade eficaz de pelo menos uma proteína de ligação da invenção. De preferência, as doenças ou as condições associadas com a expressão do HER-3 são as doenças hiperproliferativas definidas acima. O paciente que está necessitado de prevenção ou tratamento é um paciente mamífero, isto é, qualquer animal classificado como um mamífero, incluindo os seres humanos, os animais domésticos e de fazendas, e os animais de zoológicos, esportes, ou de estimação, tais como os cães, os gatos, o gado, os cavalos, as ovelhas, os porcos, as cabras, os coelhos, etc. De preferência, o paciente que está necessitado é um paciente humano.
[0094] Em uma modalidade preferida da presente invenção, o método para prevenir ou tratar uma doença hiperproliferativa em um paciente que está necessitado dele compreende administrar ao paciente uma quantidade eficaz de pelo menos uma proteína de ligação da invenção e adicionalmente pelo menos um outro agente ativo, por exemplo, pelo menos um agente antineoplástico conforme mencionado acima. De preferência, o método é para inibir o crescimento, a migração ou a invasão anormal de células.
[0095] Além dos modos clássicos de administração das substâncias terapêuticas de proteínas de ligação potenciais, por exemplo, via as formulações acima mencionadas, as modalidades de administração recentemente desenvolvidas podem também ser úteis de acordo com a presente invenção. Por exemplo, descreveu-se a administração local de anticorpo monoclonal marcado com 131I para o tratamento de tumores primários do cérebro, após a ressecção cirúrgica. Adicionalmente, a injeção intracerebral estereotática direta de anticorpos monoclonais e de seus fragmentos está também sendo estudada clínica e pré-clinicamente. A perfusão hiperosmolar intracarótida é uma estratégia experimental de marcar a malignidade primária do cérebro com anticorpos monoclonais humanos conjugados com fármacos.
[0096] Dependendo do tipo e da gravidade da condição a ser tratada, aproximadamente 1 μg/kg a 15 mg/kg da pelo menos uma proteína de ligação da invenção podem ser administrados a um paciente que necessita dela, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas ou por infusão contínua. Uma dosagem diária típica poderia variar de cerca de 1 μg/kg a cerca de 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas durante diversos dias ou mais tempo, dependendo da condição a ser tratada, o tratamento é continuado até ocorrer uma supressão desejada dos sintomas da doença.
[0097] A dose do pelo menos um agente antineoplástico administrado depende de uma variedade de fatores. Estes são, por exemplo, a natureza do agente, o tipo de tumor ou a rota de administração. Deve ser enfatizado que a presente invenção não está limitada a qualquer dose.
[0098] Finalmente, a presente invenção refere-se, em um aspecto adicional, a um kit para a diagnose, a prevenção ou o tratamento de doenças hiperproliferativas associadas com a transdução de sinal mediada pelo HER-3, compreendendo a pelo menos uma proteína de ligação e/ou a molécula de ácido nucléico e/ou o vetor da invenção. Além disso, o kit da invenção pode compreender adicionalmente pelo menos um outro agente ativo, por exemplo, pelo menos um outro agente antineoplástico conforme mencionado acima.
[0099] Ademais, a presente invenção será explicada pelos Exemplos a seguir e pelas figuras dos desenhos que acompanham. Exemplos
[00100] Os exemplos a seguir, incluindo os experimentos conduzidos e os resultados atingidos, são proporcionados para propósitos ilustrativos somente e não são para serem interpretados como limitativos sobre a presente invenção. EXEMPLO 1: preparação do antígeno HER-3 e da linhagem celular
[00101] No presente estudo, as proteínas HER-3 recombinantes foram preparadas. O cDNA do domínio extracelular de HER-3 (ECD) foi clonado por reação em cadeia por polimerase (PCR) a partir de pcDNA3-HER-3 (vetor de expressão com HER-3 humano de tamanho completo, C.Wallasch e outros., EMBO J. 14, 4267-4275) com iniciadores baseados na sequência de HER-3 (No de Acesso do Genebank NM_001982).
[00102] Os iniciadores usados para a amplificação do HER-3 foram como a seguir: Iniciador dianteiro: 5’-CGGGATCCATGTCCTAGCCTAGGGGC-3’ (SEQ ID NO: 233) Iniciador reverso: 5’GCTCTAGATTAATGATGATGATGATGATGTTGTCCTAAA CAGTCTTG-3' (SEQ ID NO: 234)
[00103] O produto da PCR foi digerido com BamH1 e XbaI e ligado no pcDNA3 (Invitrogen) digerido com BamH1 e XbaI. Os plasmídios foram transfectados nas células HEK293 usando um método de CaPO4. Proteína de fusão de HER-3-HIS foi purificada a partir de meio condicionado coletado, via cromatografia por afinidade de Ni-NTA.
[00104] As células Ratl HER-3 foram geradas por transferência de gene retroviral. Resumidamente, as células GP+E 86 (3x105) foram semeadas sobre um disco de cultura de 60 mm e transfectadas com 2 μg/ml de vetor pIXSN ou cDNA de pIXSN-HER-3 (C. Wallasch, Tese de PhD, Max-Planck Insitute of Biochemistry, Martinsried, Alemanha), usando o método de fosfato de cálcio. Após 24 h, o meio foi substituído por meio novo e as células GP+E 86 foram incubadas por 4-8 h. As células Rat1 subconfluentes (2x105 células por placa de 6 cm) foram então incubadas com os sobrenadantes das células GP+E 86, liberando pLXSN ou pLXSN-HER-3 de alto título, vírus p (>1 X 106 G418 c.f.u./ml; m.o.i. de 10) por 4-12 h, na presença de Polibreno (4 mg/ml; Aldrich). Após trocar o meio, a seleção das células Ratl com G418 foi iniciada. Normalmente, os clones estáveis eram coletados após seleção por 21 dias.
EXEMPLO 2: expressão de HER-3 em linhagens de células de câncer humanas
[00105] As tirosina cinase receptoras, como por exemplo, o HER-3, desempenham uma função crucial na iniciação e na progressão das doenças hiperproliferativas, tal como a transição de crescimento celular hiperplástico benigno para um carcinoma maligno. Visto que a expressão de HER-3 varia entre as células de tumor e o tecido normal, uma análise da expressão de HER-3 é um fator crítico para a identificação de subgrupos de pacientes que se beneficiariam do tratamento com as proteínas de ligação da invenção. Assim, a expressão de HER-3 foi quantificada em um painel de linhagens de células de câncer humanas para esclarecer a função do HER-3 na formação de câncer humano. As linhagens de células de câncer foram desenvolvidas conforme recomendado pela ATCC. Em detalhe, 105 células foram colhidas com EDTA a 10 mM em PBS, lavadas uma vez com tampão de FACS (PBS, 3 % de FCS, 0,4 % de azida) e semeadas sobre uma placa de fundo redondo de 96 cavidades. As células foram giradas por 3 min a 1000 rpm para remover o sobrenadante e então suspensas novamente com o anticorpo para aHER-3 2D1D12 (WO03013602) (3 μg/ml). As suspensões de células foram incubadas sobre gelo por 1 h, lavadas duas vezes com tampão de FACS e suspensas novamente com o anticorpo secundário (100 μl/cavidade) anti-PE humano em burro (Jackson) diluído 1:50 em tampão de FACS. As suspensões de células foram incubadas sobre gelo e no escuro por 30 min, lavadas duas vezes com tampão de FACS e analisadas (FACS, Beckman Coulter). A figura 1 mostra os resultados representativos da análise e demonstra que o HER-3 é expresso em uma variedade de cânceres humanos.
EXEMPLO 3: Imunização e título
[00106] A proteína do ECD do HER-3, que foi preparada conforme descrito no Exemplo 1, e as células C32 (Melanoma humano; ATCC #CRL-1585) foram usadas como um antígeno. Os anticorpos monoclonais contra HER-3 foram desenvolvidos imunizando seqüencialmente os camundongos XenoMouse® (cepas XenoMouse®: XMG1 e XMG4, Abgenix, Inc. Fremont, CA). Os animais XenoMouse® foram imunizados via a rota das patas para todas as injeções. O volume total de cada injeção foi 50 μl por camundongo, 25 μl por pata.
[00107] Para o grupo no 1 (10 camundongos XMG1), a imunização inicial foi com 10 μg de proteína do ECD do HER-3 misturada 1:1 (v/v) com TITERMAX GOLD® (Sigma, Oakville, ON) por camundongo. Os cinco reforços subseqüentes foram feitos com 10 μg da proteína do ECD do HER-3 misturada 1:1 (v/v) com 100 μg de gel de alúmen (Sigma, Oakville, ON) em D-PBS sem pirogênio. O sexto reforço consistia em 10 μg de proteína do ECD do HER-3 misturada 1:1 (v/v) com TITERMAX GOLD®. A sétima injeção consistia em 10 μg de proteína do ECD do HER-3 misturada 1:1 v/v com 100 μg de gel de alúmen. O reforço final foi feito com 10 μg de proteína do ECD do HER-3 em DPBS sem pirogênio, sem adjuvante. Os camundongos XenoMouse® foram imunizados nos dias 0, 4, 7, 11, 15, 20, 24, e 29 para este protocolo e as fusões foram efetuadas no dia 33. As duas sangrias foram feitas através do procedimento de Sangria Retrorbital no dia 13, após o quarto reforço, no dia 19, após o sexto reforço. Não havia nenhum grupo no 2.
[00108] Para o Grupo no 3 (10 camundongos XMG1) e o Grupo no 4 (10 camundongos XMG4), a primeira injeção foi com 107 células C32 em PBS da Dulbecco (DPBS) sem pirogênio, misturadas 1:1 (v/v) com TITERMAX GOLD®, por camundongo. Os quatro reforços seguintes foram com 107 células C32 em DPBS sem pirogênio, misturadas com 25 μg de Adju-Phos e 10 μg de CpG, por camundongo. O sexto reforço foi com 107 células C32 em DPBS sem pirogênio, misturadas 1:1 (v/v) com TITERMAX GOLD®, por camundongo. O sétimo, o oitavo, o nono reforços foram com 107 células C32 em DPBS sem pirogênio, misturadas com 25 μg de Adju-Phos e 10 μg de CpG, por camundongo. Do décimo até o décimo quarto reforço foram 5 μg de proteína do ECD do HER-3 em DPBS sem pirogênio, misturados com 25 μg de AdjuPhos e 10 μg de CpG, por camundongo. Um reforço final consistia em 5 μg de proteína do ECD do HER-3 em DPBS sem pirogênio, sem adjuvante. Ambos os Grupos no 3 e no 4, os camundongos XenoMouse® foram imunizados nos dias 0, 3, 7, 11, 14, 17, 21, 24, 28, 33, 35, 38, 42 e 45 para este protocolo e as fusões foram efetuadas no dia 49. As três sangrias foram feitas através do procedimento de Sangria Retrorbital no dia 12, após o quarto reforço, no dia 19, após o sexto reforço, e no dia 40, após o décimo segundo reforço. Seleção dos animais para a coleta por título
[00109] Para o grupo no 1, os títulos de anticorpo anti-HER-3 no soro a partir dos camundongos XenoMouse® imunizados foram determinados por ELISA contra a proteína do ECD do HER-3. O título específico de cada animal XenoMouse® foi determinado a partir da densidade óptica a 650 nm e é mostrado na Tabela 1 abaixo. O valor do título é a recíproca da maior diluição dos soros com uma leitura da DO duas vezes aquela da base. Portanto, quanto maior o número, maior foi a resposta imune humoral ao ECD do HER-3.
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[00110] Para os grupos no 3 e no 4, os títulos de anticorpo anti-HER- 3 no soro a partir dos camundongos XenoMouse® imunizados foram determinados por FACS, usando as células Rat1/HER-3 (linhagem celular positiva para antígeno) e as células Rat1/pLSXN (linhagem celular negativa para antígeno). Os dados são apresentados como a intensidade fluorescente por média geométrica (MédiaGeo) da coloração celular do anti-HER-3 em célula por diluições em série das amostras de soro. TABELA 2
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EXEMPLO 4: Recuperação dos linfócitos, isolamentos das Células B, fusões e geração de hibridomas
[00111] Os camundongos imunizados foram sacrificados e os linfonodos foram coletados e reunidos a partir de cada grupo. As células linfóides foram dissociadas por moagem em DMEM, para liberar as células dos tecidos, e as células foram suspensas em DMEM. As células foram contadas, e 0,9 ml de DMEM por 100 milhões de linfócitos foi adicionado ao precipitado celular para suspender novamente as células, de modo suave, porém completamente. Usando 100 μl de glóbulos magnéticos CD90+ por 100 milhões de células, as células foram marcadas por incubação das células com os glóbulos magnéticos a 4 °C, por 15 min. A suspensão celular marcada magneticamente contendo até 108 células positivas (ou até 2x109 células totais) foi carregada para uma coluna LS+ e a coluna lavada com DMEM. O efluente total foi coletado como a fração negativa para CD90 (a maior parte destas células era esperada ser células B).
[00112] A fusão foi efetuada misturando-se as células B enriquecidas, lavadas, do acima mencionado, e as células de mieloma não secretórias P3X63Ag8.653, adquiridas da ATCC (No do Cat. CRL 1580) (Kearney e outros., J. Immunol. 123, 1979, 1548-1550), em uma razão de 1:1. A mistura celular foi suavemente precipitada por centrifugação a 800 g. Após a remoção completa do sobrenadante, as células foram tratadas com 2 a 4 ml de solução de pronase (CalBiochem. No do Cat. 53702; 0,5 mg/ml em PBS) por não mais do que 2 min. Então, 3 a 5 ml de FBS foram adicionados para interromper a atividade da enzima e a suspensão foi ajustada para um volume total de 40 ml, usando solução de eletrofusão celular, ECFS (sacarose a 0,3 M, Sigma, No do Cat. S7903, acetato de magnésio a 0,1 mM, Sigma, No do Cat. M2545, acetato de cálcio a 0,1 mM, Sigma, No do Cat. C4705). O sobrenadante foi removido após centrifugação e as células foram suspensas novamente em 40 ml de ECFS. Esta etapa de lavagem foi repetida e as células de novo foram suspensas em ECFS até uma concentração de 2x106 células/ml.
[00113] A eletrofusão celular foi efetuada usando um gerador de fusão, modelo ECM2001, Genetronic, Inc., San Diego, CA. A dimensão da câmara de fusão usada foi 2,0 ml, usando os seguintes ajustes de instrumento: Condição de alinhamento: voltagem: 50 V, tempo: 50 s; rompimento de membrana em: voltagem: 3000 V, tempo: 30 μs; tempo de retenção após a fusão: 3 s.
[00114] Após a ECF, as suspensões celulares foram cuidadosamente removidas da câmara de fusão, sob condições estéreis, e transferidas para um tubo estéril contendo o mesmo volume de Meio de Cultura de Hibridoma (DMEM (JRH Biosciences), 15 % de FBS (Hyclone), suplementado com L-glutamina, pen/estrep, OPI (oxaloacetato, piruvato, insulina bovina) (todos da Sigma) e IL-6 (Boehringer Mannheim). As células foram incubadas por 15 a 30 min, a 37 °C, e então centrifugadas a 400 g, por cinco min. As células foram suavemente suspensas novamente em um pequeno volume de Meio de Seleção de Hibridoma (Meio de Cultura de Hibridoma suplementado com 0,5x de HA (Sigma, No do Cat. A9666)), e o volume foi ajustado apropriadamente com mais Meio de Seleção de Hibridoma, com base em uma preparação final de 5x106 células totais por placa de 96 cavidades e 200 μl por cavidade. As células foram suavemente misturadas e pipetadas para as placas de 96 cavidades e deixadas desenvolverem-se. No dia 7 ou 10, metade do meio foi removido, e as células foram realimentadas com Meio de Seleção de Hibridoma. EXEMPLO 5: Seleção de anticorpos candidatos por ELISA
[00115] Após 14 dias de cultura, a triagem primária dos sobrenadantes de hibridomas a partir do grupo no 1 (os camundongos no grupo um foram divididos arbitrariamente em fusão no 1 e no 2) quanto aos anticorpos específicos para HER-3 foi efetuada por ELISA, usando ECD do HER-3 marcado com his, purificado, e exame por contador contra uma proteína marcada com his irrelevante, por ELISA, usando anti-hulgGFc-HRP em cabra (Caltag Inc., No do Cat. H10507, a concentração de uso foi uma diluição de 1:2000), para detectar a ligação da IgG humana ao ECD do HER-3 imobilizado sobre as placas de ELISA. Os sobrenadantes da cultura antiga, a partir dos cavidades de crescimento das células de hibridomas positivas, com base na triagem primária, foram removidos e as células de hibridomas positivas para HER-3 foram suspensas com meio de cultura de hibridoma novo e foram transferidas para placas de 24 cavidades. Após 2 dias na cultura, estes sobrenadantes estavam prontos para uma triagem de confirmação secundária. Na triagem de confirmação secundária quanto aos anticorpos de IgGk inteiramente humanos, específicos para HER-3, os positivos na primeira triagem foram examinados por ELISA com dois grupos de anticorpos investigadores: anti-huIgGFcHRP em cabra (Caltag Inc., No do Cat. H10507, a concentração de uso foi uma diluição de 1:2000), para a detecção da cadeia gama humana, e anti-hIg capa-HRP em cabra (Southern Biotechnology, No do Cat. 2060-05), para a detecção da cadeia leve capa humana. Havia 91 anticorpos monoclonais específicos para IgG/capa HER-3 inteiramente humanos que foram gerados a partir do grupo no 1.
EXEMPLO 6: Seleção de anticorpos candidatos por FMAT/FACS
[00116] Após 14 dias de cultura, os sobrenadantes de hibridomas dos grupos no 3 e no 4 (fusões no 3 e no 4) foram examinados quanto aos anticorpos monoclonais específicos para HER-3 por FMAT. Na triagem primária, os sobrenadantes de hibridomas em diluição final de 1:10 foram incubados com as células Rat1-Her3 expressando o HER-3 humano e 400 ng/ml de anticorpo F(ab')2 anti-IgG humana específico para Fc, em Cabra conjugado a Cy5 (Jackson ImmunoResearch, No do Cat. 109-176-098), na temperatura ambiente, por 6 h. A ligação do complexo de anticorpos e anticorpos de detecção às células foi medida por FMAT (Applied Biosystems). A ligação não específica dos anticorpos às células foi determinada por sua ligação às células Rat1 parentais. Um total de 420 hibridomas produzindo anticorpos específicos para HER-3 foi selecionado a partir da triagem primária da fusão no 3. Os sobrenadantes destas culturas expandidas foram testados novamente usando o mesmo protocolo de FMAT e 262 deles foram confirmados ligarem-se a células que expressam o HER-3 especificamente. Um total de 193 hibridomas produzindo anticorpos específicos para HER-3 foi selecionado a partir da triagem primária da fusão no 4. Os sobrenadantes destas culturas expandidas foram testados por FACS e 138 deles foram confirmados ligarem-se a células que expressam o HER-3 especificamente. No ensaio de confirmação por FACS, as células Rat1-Xher3 e as células Rat1 parentais (como controle negativo) foram incubadas com os sobrenadantes de hibridomas em diluição de 1:2, por 1 h, a 40C, em PBS contendo 2 % de FBS. Após a lavagem com PBS, a ligação dos anticorpos às células foi detectada por 2,5 μg/ml de anticorpo F(ab')2 anti-IgG humana específico para Fc, em Cabra conjugado a Cy5 (JIR no 109-176-098) e 5 μg/ml de anticorpo F(ab')2 anti-humano específico para capa em Cabra conjugado a PE (SB no 2063-09). Após a remoção dos anticorpos não ligados por lavagem com PBS, as células foram fixadas por cytofix (BD no 51-2090KZ) em diluição de 1:4 e analisadas por FACSCalibur.
EXEMPLO 7: Seleção de hibridomas para a clonagem
[00117] Os anticorpos dos grupos 1 e 2 foram selecionados para a clonagem de hibridomas com base na especificidade por HER-3 sobre HER1 (EGFR), HER-2 e HER-4, em ELISA, usando domínios extracelulares recombinantes purificados, disponíveis, por exemplo, de R&D Biosystems, e análise à base de FACS das linhagens de células de tumores humanas que expressam diferentes membros da família do HER, e um aumento > 5 vezes na intensidade fluorescente média na coloração de FACS para as células positivas para HER-3 sobre a base. Com base nestes critérios, um total de 23 linhagens de hibridomas foi selecionado para a clonagem por preparação em placas de células de diluição limitativa.
[00118] Os anticorpos dos grupos 3 e 4 foram selecionados para a clonagem de hibridomas com base na especificidade por HER-3 sobre HER-1 (EGFR), HER-2 e HER-4, mais três outros critérios. O primeiro critério foi uma triagem por ELISA quanto aos anticorpos com os epítopos contidos dentro do domínio L2 de HER-3 (ver o Exemplo "Análise Estrutural dos Anticorpos Anti-HER-3", na invenção).
[00119] O segundo critério foi a neutralização da ligação da heregulina-alfa biotinilada às células que expressam o HER-3, em um ensaio à base de FACS. As células SKBR-3 foram coletadas, lavadas em meio de cultura, precipitadas via centrifugação e suspensas novamente em meio de cultura. As células suspensas novamente foram divididas em alíquotas para as placas de 96 cavidades. As placas foram centrifugadas para precipitar as células. Os anticorpos de teste nos sobrenadantes de hibridomas de esgotamento foram adicionados a 25 μl/cavidade e incubados por 1 h sobre gelo, para permitir a ligação dos anticorpos. Cinqüenta μl de uma solução de heregulina-alfa a 10 nM (R&D Biosystems, Minneapolis, MN) foram adicionados a cada cavidade para uma concentração final de 5 nM e incubados sobre gelo por 1,5 h. As células foram lavadas em 150 μl de PBS, precipitadas por centrifugação e o sobrenadante removido. As células foram suspensas novamente em 50 μl de anticorpo policlonal anti-HRG-alfa em cabra, a 10 μg/ml, e incubadas por 45 min sobre gelo. As células foram lavadas em 200 μl de PBS, precipitadas por centrifugação e o sobrenadante removido. Cinqüenta μl de uma solução de anticorpo policlonal anticabra marcado com Cy5 em coelho, a 5 μg/ml, mais 7AAD, a 10 μg/ml, foram adicionados e incubados sobre gelo por 15 min. As células foram lavadas em 200 μl de PBS, precipitadas por centrifugação e o sobrenadante removido. As células foram suspensas novamente em 100 μl de tampão de FACS e lidas no FACS. Os anticorpos para HER-3 de teste que reduziram a ligação da heregulina-alfa foram aqueles que tiveram a menor intensidade de fluorescência. Como controles positivos, usaram-se diluições em série de 1:5 a partir de 10.000 ng/ml até 16 ng/ml de um mAb para HER-3 de camundongo (105.5) ou do mAb para HER-3 de IgG1 humana, U149. Os controles negativos eram heregulina-alfa sozinha, as células sozinhas, o anticorpo policlonal anti-heregulina-alfa em cabra sozinho e o anticorpo policlonal anticabra marcado com Cy5 em coelho sozinho.
[00120] O terceiro critério foi a classificação relativa quanto à afinidade e/ou a maior intensidade de fluorescência média relativa em FACS usando linhagens celulares que expressam o HER-3. A classificação relativa quanto à afinidade foi efetuada por normalização das concentrações de anticorpos específicos para HER-3 e representação contra dados a partir de ELISA com antígeno limitado, como se segue.
[00121] Normalização das concentrações de anticorpos específicos para os antígenos usando ELISA com alto teor de antígeno
[00122] Usando um método ELISA, os sobrenadantes para a concentração de anticorpo específico para antígeno foram normalizados. Usando dois anticorpos de IgG1 humana anti-HER-3 a partir do grupo 1, de concentração conhecida, titulados em paralelo, gerou-se uma curva padrão e comparou-se a quantidade de anticorpo específico para antígeno nos sobrenadantes de hibridomas de teste a partir dos grupos 3 e 4 ao padrão. Neste modo, estimou-se a concentração de anticorpo de IgG para HER3 em cada cultura de hibridoma.
[00123] As placas de neutravidina foram preparadas revestindo a neutravidina a 8 μg/ml em IXPBS/0,05% de azida sódica sobre placas de ligação de meio Costar 3368, a 50 ul/cavidade, com incubação durante a noite, a 4° C. No dia seguinte, as placas foram bloqueadas com 1XPBS/1% de leite desnatado. O ECD do HER-3 marcado com his fotobiotinilado, a 500 ng/ml, em 1XPBS/1% de leite desnatado, foi ligado às placas de neutravidina por incubação por 1 hora, na temperatura ambiente. O sobrenadante de hibridomas, diluído em série a 1:2,5 a partir de uma diluição de partida de 1:31 até uma diluição final de 1:7568, em 1XPBS/1% de leite desnatado/0,05% de azida, foi adicionado a 50 μl/cavidade, e então incubado por 20 horas na temperatura ambiente. As diluições em série foram usadas para assegurar a obtenção de leituras de DO para cada incógnita na faixa linear do ensaio. A seguir, um anticorpo de detecção secundário, o anti Fc HRP de IgG humana em cabra, a 400 ng/ml, em 1XPBS/1% de leite desnatado, foi adicionado a 50 ul/cavidade. Após 1 hora na temperatura ambiente, as placas foram novamente lavadas 5 vezes com água e 50 μL de substrato TMB de um componente foram adicionados a cada cavidade. A reação foi interrompida, após 30 minutos, pela adição de 50 μl de ácido clorídrico a 1M a cada cavidade e as placas foram lidas em comprimento de ondas de 450 nm. Uma curva padrão foi gerada a partir dos dois mAbs para HER-3 de IgG1 do grupo 1, diluídos em série a 1:2 a partir de 1000 ng/ml até 0,06 ng/ml e avaliados em ELISA usando o protocolo acima descrito. Para cada incógnita, as leituras de DO na faixa linear do ensaio foram usadas para estimar a concentração de IgG para HER-3 humano em cada amostra.
[00124] A análise por antígeno limitado é um método que classifica por afinidade os anticorpos específicos para antígenos preparados em sobrenadantes de culturas de células B em relação a todos os outros anticorpos específicos para antígenos. Na presença de uma cobertura muito baixa de antígeno, somente os anticorpos de maior afinidade devem ser capazes de ligarem-se até qualquer nível detectável, no equilíbrio. (Ver, por exemplo, a Publicação PCT WO/03048730A2, intitulada "IDENTIFICATION OF HIGH AFFINITY MOLECULES BY LIMITED DILUTION SCREENING", publicada em 12 de junho de 2003). Neste caso, dois mAbs do grupo 1, ambos de concentração conhecida e KD conhecido, foram usados como referências no ensaio.
[00125] As placas de neutravidina foram preparadas revestindo a neutravidina a 8 μg/ml em IXPBS/0,05% de azida sódica sobre placas de ligação de meio Costar 3368, a 50 ul/cavidade, com incubação durante a noite, a 4° C. No dia seguinte, as placas foram bloqueadas com 1XPBS/1% de leite desnatado. O ECD do HER-3 marcado com his fotobiotinilado (50 μl/cavidade) foi ligado às placas de neutravidina de 96 cavidades em cinco concentrações: 125, 62,5, 31,2, 15,6, e 7,8 ng/ml em 1XPBS/1% de leite desnatado, por 1 hora, na temperatura ambiente. Cada placa foi lavada 5 vezes com água. os sobrenadantes de hibridomas diluídos a 1:31 em 1XPBS/1% de leite desnatado/0,05% de azida, foram adicionados a 50 ul/cavidade. Após 20 horas de incubação, na temperatura ambiente, sobre um agitador, as placas foram novamente lavadas 5 vezes com dH2O. A seguir, um anticorpo de detecção secundário, o anti Fc HRP (Peroxidase da Raiz Forte) de IgG humana em cabra, a 400 ng/ml, em 1XPBS/1% de leite desnatado, foi adicionado a 50 μl/cavidade. Após 1 hora na temperatura ambiente, as placas foram novamente lavadas 5 vezes com dH2O e 50 μL de substrato TMB de um componente foram adicionados a cada cavidade. A reação foi interrompida, após 30 minutos, pela adição de 50 μL de ácido clorídrico a 1M a cada cavidade e as placas foram lidas em comprimento de ondas de 450 nm. As leituras de DO a partir de uma concentração de antígeno que produziu valores de DO na faixa linear foram usadas na análise dos dados.
[00126] A representação dos dados de alto teor de antígeno, que estima comparativamente a concentração de anticorpo específica (ver acima quanto aos detalhes), versus a DO do antígeno limitado ilustrou os anticorpos de afinidades relativamente maiores, por exemplo, aqueles que ligaram tinham DO maior no ensaio de antígeno limitado, ao mesmo tempo tendo quantidades menores de anticorpo para HER3 de IgG no sobrenadante.
[00127] Os hibridomas dos grupos 3 e 4 para os 33 anticorpos de melhor atuação nestes grupos de ensaios foram promovidos para a clonagem por preparação em placas de hibridomas de diluição limitativa.
[00128] Alternativamente, a análise por FACS da expressão do HER3 das células RatI/pLXSN e RatI/HER-3 mostrou resultados similares (nenhuma reatividade cruzada com os epítopos de ratos endógenos) (figura 2).
[00129] Em detalhe, 1x105 células foram coletadas com EDTA a 10 mM em PBS, lavadas uma vez com tampão de FACS (PBS, 3 % de FCS, 0,4 % de azida) e semeadas sobre uma placa de fundo redondo de 96 cavidades. As células foram giradas por 3 min a 1000 rpm para remover o sobrenadante e então suspensas novamente com os anticorpos para a família do HER específicos (3 μg/ml). As suspensões de células foram incubadas sobre gelo por 45 min, lavadas duas vezes com tampão de FACS e suspensas novamente com o anticorpo secundário (100 μl/cavidade) anti-PE humano em burro (Jackson Immunoresearch, PA) diluído 1:50 em tampão de FACS. As suspensões de células foram incubadas sobre gelo e no escuro por 30 min, lavadas duas vezes com tampão de FACS e analisadas (FACS, Beckman Coulter).
EXEMPLO 8: Análise estrutural dos anticorpos anti-HER-3 da invenção
[00130] Na discussão a seguir, proporciona-se uma informação estrutural relacionada aos anticorpos preparados de acordo com a invenção. Para analisar as estruturas dos anticorpos produzidos de acordo com a presente invenção, os genes que codificam os fragmentos de cadeias pesadas e leves foram amplificados do hibridoma particular. O seqüenciamento foi efetuado como se segue:
[00131] os transcritos de VH e VL foram amplificados a partir dos clones de hibridomas individuais em placa de 96 cavidades, usando transcritase reversa reação em cadeia por polimerase (RT-PCR). O poli(A)+-mRNA foi isolado de aproximadamente 2x105 células de hibridomas usando o kit Fast-Track (Invitrogen). Quatro reações de PCR foram efetuadas para cada hibridoma: duas para a cadeia leve (capa (K)), e duas para a cadeia pesada gama (y). O kit de PCR na temperatura ambiente de Uma Etapa da QIAGEN foi usado para a amplificação (Qiagen, No do Catálogo 210212). Nas reações de PCR na temperatura ambiente acopladas, os cDNAs foram sintetizados com mistura de enzimas na temperatura ambiente (Omniscript e Sensiscript) usando iniciador específico para sequência sem sentido correspondido à C-k, ou a um consenso das regiões CH1 dos genes de Cy. A transcrição reversa foi efetuada a 50 °C por 1 h, seguida por amplificação por PCR do cDNA pela DNA Polimerase HotStarTaq para alta especificidade e sensibilidade. Cada reação de PCR usou uma mistura de iniciadores com sentido em 5'; as sequências de iniciadores foram baseadas nas sequências líderes de VH e VK disponíveis no endereço de página eletrônica da rede de Vbase (http://vbase.mrccpe.cam.ac.uk/).
[00132] As reações de PCR foram efetuadas a 94 °C por 15 min, início a quente inicial seguido 40 ciclos de 94 °C por 30 s (desnaturação), 60 °C por 30 s (anelamento) e 72 °C por 1 min (alongamento).
[00133] Os produtos da PCR foram purificados e seqüenciados diretamente usando os iniciadores dianteiro e reverso da PCR, usando o Kit de reação pronta por seqüenciamento de ciclo terminador ABI PRISM BigDye (Perkin Elmer). Ambas as fitas foram seqüenciadas usando os kits de seqüenciamento de terminador de corante Prims e uma máquina de seqüenciamento ABI 377.
Análise da Sequência
[00134] As análises das sequências de cDNA de pesada V e capa V humano dos anticorpos para HER3 foram efetuadas alinhando as sequências do HER-3 com as sequências de pesada V e capa V da linha germinativa humana usando o software doméstico Abgenix (5AS). O software identificou o uso do gene V, do gene D e do gene J, bem como as inserções de nucleotídeos nas junções de recombinação e mutações somáticas. As sequências de aminoácidos foram também geradas em sílico para identificar as mutações somáticas. Puderam ser obtidos resultados similares com o software de análise de sequência comercialmente disponível e a informação publicamente disponível sobre a sequência dos genes V, D, e J humanos, por exemplo, Vbase (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/). Clonagem molecular do mAb U1-59
[00135] O RNA total foi extraído do cavidade de cultura de tecido contendo múltiplas linhagens de hibridomas, incluindo a linhagem de hibridoma que secreta o anticorpo U1-59. Uma região variável da cadeia pesada foi amplificada usando os iniciadores específicos para a família de VH líder em 5', com o iniciadores 3'-C-gama. Uma banda principal foi amplificada usando um iniciador de VH4, nenhuma outra banda estava visível. O fragmento de VH4-34 gama foi clonado no vetor de expressão de pCDNA em quadro com um gene da região constante gama 1 humano.
[00136] Uma região variável da cadeia pesada de IgM foi amplificada usando iniciadores específicos para a família de VH em 5' com o iniciador da região constante mu em 3'. Uma banda principal foi amplificada usando o iniciador de VH2, nenhuma outra banda estava visível. O fragmento de mu de VH2-5 foi clonado no vetor de expressão de pCDNA em quadro com um gene da região constante mu humano. As cadeias capa V foram amplificadas e seqüenciadas. Quatro produtos de RT-PCR de cadeias capa foram identificados. Os produtos foram seqüenciados e, após a análise de sequência via tradução em sílico, somente três deles tinham quadros de leitura abertos. Estas três cadeias capa funcionais foram clonadas do cavidade de hibridoma U159 oligoclonal, identificadas com base no uso do gene de capa V como (1) VK1 A3-JK2, (2) VK1 A20-JK3 e (3) B3-JK1. Todas as capa V foram clonadas no vetor de expressão de pCDNA em quadro com um gene da região constante da cadeia leve capa humano.
Transfecções:
[00137] Cada cadeia pesada foi transfectada com cada uma das cadeias capa em transfecções transientes para um total de 6 pares de cadeias pesadas/cadeias leves capa. A transfecção da cadeia gama com a cadeia capa de A20 deu uma expressão do anticorpo insatisfatória, enquanto que nenhum anticorpo foi secretado ou detectado quando a cadeia capa de A20 foi co-transfectada com a cadeia mu. Um total de três sups de IgF e dois sups de IgM estava disponível para o ensaio de ligação ao HER-3.
Figure img0006
[00138] A atividade de ligação às linhagens celulares HER-3+ foi detectada em FACS com o mAb de IgG1 consistindo na VH4-34 e na cadeia capa de B3. Nenhuma outra combinação de VH/V K deu sinal de fluorescência acima da base em FACS usando as linhagens celulares HER-3+.
Competição pela ligação dos anticorpos anti-HER-3
[00139] A ligação competitiva diversificada do anticorpo foi efetuada conforme publicada em Jia e outros. J Immunol Methods. 288, 91-98 (2004), para avaliar os grupos de anticorpos para HER-3 que competiam pela ligação ao HER-3. Os anticorpos para HER-3 testados a partir do grupo 1 agruparam-se em 5 locais com base na competição pela ligação.
Figure img0007
Caracterização dos epítopos dos anticorpos anti-HER-3
[00140] Os epítopos dos anticorpos anti-HER-3 humanos da invenção foram caracterizados. Primeiramente, uma análise por transferência de ponto ("dot blot") da proteína de ECD purificada, marcada com HER-3-His, desnaturada, reduzida, mostrou ausência de ligação pelos anticorpos anti-HER-3 testados (U1-59, U1-61, U1-41, U1-46, U1-53, U1-43, U1-44, U1-47, U1-52, U1-40, U1-49), demonstrando que todos tinham epítopos sensíveis à redução das ligações de dissulfeto, sugerindo que todos tinham epítopos descontínuos. A seguir, os anticorpos foram mapeados para definir os domínios na molécula de HER-3 por engenharia de diversas moléculas quiméricas de HER-3 de seres humanos-ratos, com base na divisão do domínio extracelular do HER-3 em quatro domínios: 1) L1 (D1): o domínio de ligação ao ligante secundário, 2) S1 (D2): o primeiro domínio rico em cisteína, 3) L2 (D3): o domínio de ligação ao ligante principal, e 4) S2 (D4): o domínio rico em cisteína sec.
[00141] O domínio extracelular (ECD) do cDNA do HER-3 Humano foi amplificado a partir das células RAT1-HER-3. O cDNA do HER-3 de rato foi amplificado por RT-PCR a partir do RNA do fígado do rato e confirmado por seqüenciamento. Os cDNAs que expressam o ECD do Her3 humano e de rato foram clonados em vetores de expressão de mamíferos como proteínas de fusão de V5-His. Os domínios a partir do ECD do HER-3 humano foram trocados no andaime proporcionado pelo ECD do HER-3 do rato por utilização dos sítios de restrição internos Mfe1, BstX1 e DraIII. Por este meio, diversas proteínas de fusão quiméricas de ECD do HER-3 HIS de ratos/humanas (aminoácidos 1-160, 161-358, 359-575, 1-358, 359-604) foram construídas e expressas via transfecção transiente de células HEK 293T. A expressão das construções foi confirmada usando um anticorpo policlonal de rato contra o HER-3 humano. Os anticorpos monoclonais humanos foram testados em ELISA quanto à ligação aos ECDs quiméricos secretados.
[00142] Dois dos anticorpos humanos, incluindo o anticorpo U1-59, reagiram cruzado com o HER-3 do rato. Para determinar os domínios de ligação, estes mAbs foram testados contra uma forma truncada do HER3 consistindo em proteína marcada com L1-S1-V5his, purificada a partir do sobrenadante de células HEK 293T transfectadas com um DNA de plasmídio que codifica a expressão dos domínios extracelulares L1-S1 do HER3. O mAb U1-59 ligou-se à proteína de L1-S1 em ELISA, indicando que o seu epítopo está em L1-S1. O mAb 2.5.1 não se ligou à proteína de L1-S1, indicando que o seu epítopo está em L2-S2. O mapeamento adicional do anticorpo U1-59 foi efetuado usando espectroscopia de massa com SELDI e por tempo de vôo com os digestos proteolíticos sobre chips dos complexos de mAb-ECD do HER-3. Mapeamento dos epítopos de U1-59 usando SELDI
[00143] O mapeamento adicional do anticorpo U1-59 foi efetuado usando a espectroscopia de massa com SELDI e por tempo de vôo com os digestos proteolíticos sobre chips dos complexos de mAb-ECD do HER-3. Proteína A foi ligada covalentemente a uma arranjo de chip de proteína PS20 e usada para capturar o mAb U1-59. Então, o complexo do chip de proteína PS20 e o anticorpo monoclonal foi incubado com antígeno purificado HER-3-His. A seguir, o complexo de anticorpo-antígeno foi digerido com alta concentração de Asp-N. O chip foi lavado, resultando na retenção de somente o peptídeo HER-3 ligado ao anticorpo sobre o chip. O epítopo foi determinado por SELDI e identificado por massa do fragmento. O fragmento 6814 D identificado corresponde a dois peptídeos esperados possíveis, gerados a partir de um digesto parcial de ECD de HER-3-his. Ambos os peptídeos de sobreposição mapeiam para o domínio S1. Por união dos resultados de SELDI com a ligação a uma construção de remoção de HER-3, o epítopo foi mapeado para os resíduos 251 a 325.
[00144] A localização dos domínios de ligação na parte extracelular do HER-3 que são reconhecidos pelos mAbs anti-HER-3 humanos da invenção é resumida na Tabela 4. Os resultados do mapeamento dos domínios dos epítopos estavam consistentes com os resultados dos locais de competição pela ligação dos anticorpos, com os anticorpos que competiam cruzado um com outro pela ligação ao HER-3 também mapeando para os mesmos domínios sobre HER-3 (figura 3). TABELA 4
Figure img0008
XR = reativo cruzado
EXEMPLO 9: Determinação das classes canônicas dos anticorpos
[00145] Chothia e outros. descreveram a estrutura do anticorpo em termos de "classes canônicas" para as regiões hipervariáveis de cada cadeia de imunoglobulina (J. Mol. Biol., 20 de agosto de 1987, 196(4):901-17). As estruturas atômicas dos fragmentos Fab e de VL de uma variedade de imunoglobulinas foram analisadas, para determinar a relação entre as suas sequências de aminoácidos e as estruturas tridimensionais de seus sítios de ligação a antígenos. Chothia e outros. verificaram que existiam relativamente poucos resíduos que, através de seu acondicionamento, ligação de hidrogênio ou da capacidade de assumir conformações incomuns fi, psi ou ômega, eram principalmente responsáveis pelas conformações das cadeias principais das regiões hipervariáveis. Estes resíduos foram verificados ocorrer em sítios dentro das regiões hipervariáveis e na estrutura de folha β conservada. Pelo exame das sequências de imunoglobulinas tendo estrutura desconhecida, Chothia e outros. mostram que muitas imunoglobulinas têm regiões hipervariáveis que são similares no tamanho a uma das estruturas conhecidas e adicionalmente continham resíduos idênticos nos sítios responsáveis pela conformação observada.
[00146] Esta descoberta implicou que estas regiões hipervariáveis têm conformações semelhantes àquelas nas estruturas conhecidas. Para cinco das regiões hipervariáveis, o repertório de conformações parecia estar limitado a um número relativamente pequeno de classes estruturais distintas. Estas conformações de cadeias principais que ocorrem comumente das regiões hipervariáveis foram chamadas "estruturas canônicas". Um trabalho adicional de Chothia e outros. (Nature, 21-28 de dez. de 1989, 342 (6252):877-83) e de outros (Martin, e outros. J. Mol. Biol., 15 de nov. de 1996, 263(5):800-15) confirmou que há um pequeno repertório de conformações de cadeias principais para pelo menos cinco das seis regiões hipervariáveis dos anticorpos.
[00147] As CDRs de cada anticorpo descrito acima foram analisadas para determinar a sua classe canônica. Conforme é conhecido, as classes canônicas somente foram determinadas para a CDR1 e a CDR2 da cadeia pesada do anticorpo, juntamente com a CDR1, a CDR2 e a CDR3 da cadeia leve do anticorpo. As tabelas abaixo resumem os resultados da análise. O dado de classe canônica está na forma de HCDR1-HCDR2-LCDR1-LCDR2-LCDR3, onde "HCDR" refere-se à CDR da cadeia pesada e "LCDR" refere-se à CDR da cadeia leve. Assim, por exemplo, uma classe canônica de 1-3-2-1-5 refere-se a um anticorpo que tem uma HCDR1 que incide na classe canônica 1, uma HCDR2 que incide na classe canônica 3, uma LCDR1 que incide na classe canônica 2, uma LCDR2 que incide na classe canônica 1, e uma LCDR3 que incide na classe canônica 5.
[00148] As determinações foram feitas para uma classe canônica particular, onde havia 70 % ou mais de identidade dos aminoácidos no anticorpo, com os aminoácidos definidos para cada classe canônica. Os aminoácidos definidos para cada anticorpo podem ser encontrados, por exemplo, nos artigos de Chothia e outros. referidos acima. A Tabela 5 e a Tabela 6 descrevem os dados da classe canônica para cada um dos anticorpos para HER-3. Onde houver menos do que 70 % de identidade, a determinação da classe canônica é marcada com um asterisco ("*") para indicar que foi feita a melhor estimativa da classe canônica adequada, com base no comprimento de cada CDR e na totalidade dos dados. Onde não houver nenhuma classe canônica correspondente com o mesmo comprimento da CDR, a determinação da classe canônica é marcada com uma letra s e um número, tal como "s18", significando que a CDR é de tamanho 18. Onde não houver nenhum dado de sequência disponível para uma das cadeias pesada ou leve, a classe canônica é marcada com "Z". TABELA 5
Figure img0009
[00149] A Tabela 7 é uma aná ise do número de anticorpos por classe. O número de anticorpos tendo a classe canônica particular designada na coluna da esquerda é mostrado na coluna da direita. Os quatro mAbs não tendo o dado de sequência para uma cadeia e, assim, tendo "Z" na determinação canônica não estão incluídos nesta contagem.
[00150] A estrutura mais comumente vista é 3-1-2-1-1: Vinte e um dos quarenta e um mAbs tendo as sequências de cadeias tanto pesadas quanto leves tinham esta combinação. TABELA 6
Figure img0010
EXEMPLO 10: Determinação da afinidade do anticorpo
[00151] As medições das afinidades dos anticorpos anti-HER-3 da invenção foram efetuadas por análise indireta de FACS Scatchard. Portanto, 105 células de interesse ou células SK-Br 3 foram coletadas com EDTA a 10 mM em PBS, lavadas uma vez com tampão de FACS (PBS, 3 % de FCS, 0,4 % de azida) e semeadas sobre uma placa de fundo redondo de 96 cavidades. As células foram giradas por 3 min a 1000 rpm para remover o sobrenadante e então suspensas novamente com o anticorpo para a-HER-3 (3 μg/ml) ou com as diluições de anticorpos (100 μl/cavidade), começando com 20 μg/ml de anticorpo monoclonal humano em tampão de FACS, diluído em etapas de diluição de 1:2. As suspensões de células foram incubadas sobre gelo por 1 h, lavadas duas vezes com tampão de FACS e suspensas novamente com o anticorpo secundário (100 μl/cavidade) anti-PE humano em burro (Jackson) diluído 1:50 em tampão de FACS. As suspensões de células foram incubadas sobre gelo e no escuro por 30 min, lavadas duas vezes com tampão de FACS e analisadas (FACS, Beckman Coulter). De acordo com a análise de FACS Scatchard, a média da fluorescência foi calculada para cada medição. A coloração de base (= sem o anticorpo principal) foi subtraída de cada média da fluorescência. Gerou-se o gráfico de Scatchard com o valor de x = média da fluorescência e o valor de y = média da fluorescência/concentração de mAb (nM). A KD foi representada como o valor absoluto de 1/m da equação linear. A figura 4 mostra uma análise cinética usando o anticorpo U1-59 da invenção. Na tabela 8 a seguir, proporcionam-se as medições das afinidades para certos anticorpos da invenção selecionados neste modo. TABELA 7
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EXEMPLO 11: Os anticorpos antiHER-3 da invenção induzem a endocitose do receptor HER-3
[00152] O HER-3 foi identificado como um fator que pode influenciar o início e a progressão das doenças hiperproliferativas através da atuação como um guardião importante da sinalização celular mediada pela família do HER. Assim, se o HER-3 for depurado efetivamente da superfície/membrana da célula por internalização do receptor, a sinalização da célula e, portanto, a transformação e/ou a manutenção das células na malignidade podem ser diminuídas ou suprimidas no final.
[00153] Para investigar se os anticorpos anti-HER-3 da invenção são capazes de induzir a endocitose acelerada do HER-3, comparouse a quantidade relativa de moléculas de HER-3 sobre a superfície celular, após incubação por 0,5 e 4 h das células, com os anticorpos antiHER-3 da invenção. 3x105 células foram semeadas em meio de crescimento normal, em placa de 24 cavidades, e deixadas desenvolver durante a noite. As células foram pré-incubadas com 10 μg/ml de mAbs anti-HER-3 em meio de crescimento normal pelos tempos indicados, a 37 °C. As células foram removidas com EDTA a 10 mM e incubadas com 10 μg/ml de mAbs anti-HER em tampão de lavagem (PBS, 3 % de FCS, 0,04 % de azida), por 45 min, a 4 °C. As células foram lavadas duas vezes com tampão de lavagem, incubadas com anticorpo secundário anti-PE em burro (Jackson) diluído a 1:100, por 45 min, a 4 °C, lavadas duas vezes com tampão de lavagem e analisadas por FACS (BeckmanCoulter, EXPO).
[00154] Os dados mostrados na figura 5 demonstram que o tratamento das células com os anticorpos anti-HER-3 resulta na internalização do receptor. Os dados são mostrados como % de internalização e referem-se à redução da intensidade de fluorescência média de amostras tratadas com anti-HER3 em relação a amostras tratadas com controle.
EXEMPLO 12: Inibição da ligação do ligante às células de câncer humanas SKBr3 pelos anticorpos anti-HER-3 humanos da invenção
[00155] Os experimentos de competição com os radioligantes foram efetuados para quantificar a capacidade dos anticorpos anti-HER-3 da invenção de inibir a ligação do ligante ao HER-3, em um ensaio a base de células. Portanto, o ensaio de ligação ao receptor HER-3 foi efetuado com 4x105 células SK-BR-3, que foram incubadas com concentrações variadas de anticorpos, por 30 min, sobre gelo. As [I125]-aHRG/ [125I]-β-HRG foram adicionadas a cada cavidade e a incubação foi continuada por 2 h, sobre gelo. As placas foram lavadas cinco vezes, secadas ao ar e contadas em um contador de cintilação. As figuras 6a-e mostram os resultados destes experimentos efetuados com os anticorpos anti-HER-3 representativos da invenção e demonstram que os anticorpos da invenção são capazes de reduzir especificamente a ligação de [125I]-α-HRG/ [125I]-β-HRG às células que expressam o HER-3 endógeno.
EXEMPLO 13: Inibição da fosforilação de HER-3 induzida por ligante pelos anticorpos anti-HER-3 humanos da invenção
[00156] Os experimentos de ELISA foram efetuados para investigar se os anticorpos da invenção são capazes de bloquear a ativação do HER-3 mediada pelo ligante β-HRG. A ativação do HER-3 mediada pelo ligante foi detectada pela fosforilação aumentada da tirosina receptora.
[00157] Dia 1: 1 x a placa de 96 cavidades foi revestida com 20 μg/ml de Colágeno I em ácido acético a 0,1 M por 4 h, a 37 °C. 2,5x105 células foram semeadas em meio de crescimento normal.
[00158] Dia 2: As células foram subalimentadas em 100 μl de meio sem soro por 24 h.
[00159] Dia 3: As células foram pré-incubadas com 10 μg/ml de mAbs anti-HER-3 por 1 h, a 37 °C, e então tratadas com 30 ng/ml de β-HRG-dominio do EGF (R&D Systems), por 10 min. O meio foi removido e as células foram fixadas com solução a 4 % de formaldeído em PBS, por 1 h, na temperatura ambiente. A solução de formaldeído foi removida e as células foram lavadas com tampão de lavagem (PBS/0,1 % de Tween 20). As células foram finalizadas com 1 % de H2O2, 0,1 % de NaN3 em tampão de lavagem e incubadas por 20 min, na temperatura ambiente, então bloqueadas com NET-GELANTINE por 5 h, a 4 °C. O anticorpo primário fosfo-HER-3 (Tyr1289) (coelho policlonal; Cell signaling no 4791; 1:300) foi adicionado, durante a noite, a 4 °C.
[00160] Dia 4: A placa foi lavada 3x com tampão de lavagem, então incubada com anti-POD de coelho diluído a 1:3000 em PBS 0,5 % de BSA foi adicionado a cada cavidade e incubado por 1,5 h na temperatura ambiente. A placa foi lavada 3x com tampão de lavagem e uma vez com PBS. A tetrametilbenzidina (TMB, Calbiochem) foi adicionada e monitorada a 650 nm. A reação foi interrompida por adição de 100 μl de HCl a 250 nM e a absorbância foi lida a 450 nm com um comprimento de ondas de referência de 650 nm, usando uma leitora de placa Vmax (Thermo Lab Systems).
[00161] A figura 7a mostra os resultados representativos deste experimento, demonstrando que os anticorpos anti-HER-3 da invenção foram capazes de reduzir a ativação do HER-3 mediada pelo ligante, conforme indicado pela fosforilação da tirosina receptora diminuída. Os dados são mostrados como porcentagem de redução pelos anticorpos terapêuticos em relação a um anticorpo de controle.
[00162] Para testar a potência do mAb U1-53 em inibir a ativação do HER-3 induzida pelo ligante, as células MCF-7 foram subalimentadas por 24 h, incubadas com o mAb U1-53 por 1 h, a 37 °C, e estimuladas com HRG-β a 10 nM por 10 min. Os lisados foram transferidos para as placas de ELISA de 1B4 (mAb anti-HER-3 de camundongo) e a fosforilação do HER-3 foi analisada com o anticorpo 4G10. Conforme mostrado na figura 7b, a fosforilação do HER-3 foi quase completamente inibida, em um modo dependente da dose, com uma IC50 de 0,14 nM.
EXEMPLO 14: Inibição da fosforilação de MAP-Cinase p42/p44 induzida por ligante pelos anticorpos anti-HER-3 humanos da invenção
[00163] A seguir, os experimentos de ELISA foram efetuados para investigar se os anticorpos da invenção são capazes de bloquear a ativação de MAP-Cinase p42/p44 mediada pelo ligante β-HRG. A ativação do HER-3 mediada pelo ligante foi detectada pela fosforilação aumentada de proteínas (Thr202/Tyr204).
[00164] Dia 1: 1 x a placa de 96 cavidades foi revestida com 20 μg/ml de Colágeno I em ácido acético a 0,1 M por 4 h, a 37 °C. 3x105 células foram semeadas em meio de crescimento normal.
[00165] Dia 2: As células foram subalimentadas em 100 μl de meio sem soro por 24 h.
[00166] Dia 3: As células foram pré-incubadas com 5 μg/ml de mAbs anti-HER-3 por 1 h, a 37 °C, e então tratadas com 20 ng/ml de β-HRG-dominio do EGF (R&D Systems), por 10 min. O meio foi removido e as células foram fixadas com solução a 4 % de formaldeído em PBS, por 1 h, na temperatura ambiente. A solução de formaldeído foi removida e as células foram lavadas com tampão de lavagem (PBS/0,1 % de Tween 20). As células foram finalizadas com 1 % de H2O2, 0,1 % de NaN3 em tampão de lavagem e incubadas por 20 min, na temperatura ambiente, então bloqueadas com PBS/0,5 % de BSA por 5 h, a 4 °C. O anticorpo primário fosfo-MAP Cinase p44/p42 (Thr202/Tyr204) (coelho policlonal; Cell signaling no 9101; 1:300) foi adicionado, durante a noite, a 4 °C.
[00167] Dia 4: A placa foi lavada 3x com tampão de lavagem, então incubada com anti-HRP de coelho diluído a 1:5000 em PBS 0,5 % de BSA foi adicionado a cada cavidade e incubado por 1,5 h na temperatura ambiente. A placa foi lavada 3x com tampão de lavagem e uma vez com PBS. A tetrametilbenzidina (TMB, Calbiochem) foi adicionada e monitorada a 650 nm. A reação foi interrompida por adição de 100 μl de HCl a 250 nM e a absorbância foi lida a 450 nm com um comprimento de ondas de referência de 650 nm, usando uma leitora de placa Vmax (Thermo Lab Systems).
[00168] A figura 8 mostra os resultados representativos deste experimento. Os anticorpos da invenção foram capazes de reduzir a ativação de MAP-Cinase p42/p44 mediada pelo ligante, conforme indicado pela fosforilação diminuída. Os dados são mostrados como a porcentagem de redução pelos anticorpos terapêuticos em relação a um anticorpo de controle.
EXEMPLO 15: Inibição da fosforilação de fosfo-AKT induzida pela β HRG pelos anticorpos anti-HER-3 humanos da invenção
[00169] No experimento de ELISA a seguir nós investigamos se os anticorpos anti-HER-3 da invenção são capazes de bloquear a ativação da AKT-Cinase mediada pela β-HRG. A ativação da AKT mediada pelo ligante foi detectada pela fosforilação da proteína (Ser473) aumentada.
[00170] Dia 1: 1 x a placa de 96 cavidades foi revestida com 20 μg/ml de Colágeno I em ácido acético a 0,1 M por 4 h, a 37 °C. 3x105 células foram semeadas em meio de crescimento normal.
[00171] Dia 2: As células foram subalimentadas em 100 μl de meio sem soro por 24 h.
[00172] Dia 3: As células foram pré-incubadas com 5 μg/ml de mAbs anti-HER-3 por 1 h, a 37 °C, e então tratadas com 20 ng/ml de β-HRG-dominio do EGF (R&D Systems), por 10 min. O meio foi removido e as células foram fixadas com solução a 4 % de formaldeído em PBS, por 1 h, na temperatura ambiente. A solução de formaldeído foi removida e as células foram lavadas com tampão de lavagem (PBS/0,1 % de Tween 20). As células foram finalizadas com 1 % de H2O2, 0,1 % de NaN3 em tampão de lavagem e incubadas por 20 min, na temperatura ambiente, então bloqueadas com PBS/0,5 % de BSA por 5 h, a 4 °C. O anticorpo primário fosfo-Akt (Ser473) (coelho policlonal; Cell signaling no 9217; 1:1000) foi adicionado, durante a noite, a 4 °C.
[00173] Dia 4: A placa foi lavada 3x com tampão de lavagem, então incubada com anti-HRP de coelho diluído a 1:5000 em PBS 0,5 % de BSA foi adicionado a cada cavidade e incubado por 1,5 h na temperatura ambiente. A placa foi lavada 3x com tampão de lavagem e uma vez com PBS. A tetrametilbenzidina (TMB, Calbiochem) foi adicionada e monitorada a 650 nm. A reação foi interrompida por adição de 100 μl de HCl a 250 nM e a absorbância foi lida a 450 nm com um comprimento de ondas de referência de 650 nm, usando uma leitora de placa Vmax (Thermo Lab Systems).
[00174] A figura 9 mostra os resultados representativos deste experimento. Os anticorpos anti-HER-3 da invenção foram capazes de reduzir a ativação de AKT mediada pela β-HRG ligante, conforme indicado pela fosforilação diminuída. Os dados são mostrados como a porcentagem de redução pelos anticorpos terapêuticos em relação a um anticorpo de controle.
EXEMPLO 16: Inibição da proliferação mediada por α-HRG/β-HRG das células MCF7 pelos anticorpos anti-HER-3 humanos da invenção
[00175] Foram conduzidos experimentos in vitro para determinar a capacidade dos anticorpos da invenção de inibir a proliferação de célu- las estimulada pela HRG. 2000 células MCF7 foram semeadas em meio contendo FCS, sobre placas de 96 cavidades, durante a noite. As células foram pré-incubadas em quadruplicata com anticorpo diluído em meio com 0,5 % de FCS, por 1 h, a 37 °C. As células foram estimuladas com 30 ng/ml de a-HRG ou 20 ng/ml de β-HRG (R&D Systems) por adição do ligante diretamente à solução de anticorpo e foram deixadas desenvolver por 72 h. O AlamarBlue® (BIOSOURCE) foi adicionado e incubado a 37 °C, no escuro. A absorbância foi medida a 590 nm a cada 30 min. Os dados foram coletados 90 min após a adição do alamar blue. Os resultados, conforme indicados na figura 10, mostram que os anticorpos representativos da invenção inibem o crescimento celular induzido pela HRG nas células de câncer humanas. Os dados são mostrados como a porcentagem de redução pelos anticorpos terapêuticos em relação a um anticorpo de controle.
EXEMPLO 17: Inibição da migração das células MCF7 induzida pela β-HRG pelos anticorpos anti-HER-3 humanos da invenção
[00176] Os experimentos de transmigração foram efetuados para investigar se os anticorpos da invenção bloqueiam a migração celular. As células MCF7 subalimentadas de soro foram pré-incubadas por adição da quantidade indicada de anticorpo à suspensão celular e incubação de ambos por 45 min, a 37 °C. 500 μl de suspensão celular (50.000 células) foram então colocados na câmara de topo de transcavidades revestidos com colágeno I (BD Falcon, poros de 8 μm). 750 μl de meio (MEM, aminoácidos, piruvato de Na, Pen.-Estrep., 0,1 % de BSA, sem soro bezerro fetal) sozinho ou contendo os ligantes β-HRGdomínio do EGF (R&D Systems) foram usados na câmara de fundo. As células foram deixadas migrar por 8 h, a 37 °C, e foram coloridas com DAPI.
[00177] Os núcleos coloridos foram contados manualmente; a porcentagem de inibição foi expressa como a inibição em relação a um anticorpo de controle.
[00178] A figura 11 mostra o resultado do experimento demonstrando que os anticorpos anti-HER-3 representativos da invenção reduzem a migração celular induzida pela HRG. EXEMPLO 18: Ensaio de formação de colônias (ensaio em ágar mole) i.Os ensaios em ágar mole foram conduzidos para investigar a capacidade dos anticorpos anti-HER-3 da invenção de inibir o crescimento celular independente de ancoragem. O ensaio de formação de colônias em ágar mole é um ensaio in vitro padrão para testar para células transformadas, visto que somente tais células transformadas podem crescer em ágar mole.
[00179] 750 a 2000 células (dependendo da linhagem celular) foram pré-incubadas com os anticorpos indicados, a 10 μg/ml, em meio IMDM (Gibco), por 30 min, e suspensas novamente em 0,4 % de ágar nobre da Difco. A suspensão celular foi preparada sobre 0,75 % de agarose contendo 20 % de FCS, em quadruplicata, em uma placa de 96 cavidades. As colônias foram deixadas se formarem por 14 dias e foram então coloridas com 50 μl de MTT (0,5 mg/ml em PBS), durante a noite. As figuras 12a-i mostram os resultados destes experimentos efetuados com três anticorpos representativos da invenção. Estes resultados demonstram que os anticorpos anti-HER-3 da invenção reduzem o crescimento celular independente de ancoragem das células de câncer de mama MDA-MB361 e NCI-ADR (figura 12a,b), das células de câncer gástrico MKN-28 (figura 12c), de melanoma HT144 (figura 12d), das células de carcinoma do ovário Skov3 (figura 12e), das células de câncer da próstata PPC-1 (figura 12f), das células de câncer do pâncreas BX-PC3 (figura 12g), das células de carcinoma epidermóides A431 (figura 12h) e das células de carcinoma do pulmão (figura 12i). As colônias foram contadas com um sistema de câmera Scanalyzer HTS (Lemnatec, Wuerselen).
EXEMPLO 19: Os anticorpos anti-HER-3 humanos inibem o crescimento de carcinoma de mama humano em camundongos nus
[00180] A eficácia antitumor dos anticorpos terapêuticos é freqüentemente avaliada em estudos de tumores de xenoenxertos humanos. Nestes estudos, os tumores crescem como xenoenxertos em camundongos imunocomprometidos e a eficácia terapêutica é medida pelo grau de inibição do crescimento do tumor. Para determinar se os anticorpos anti-HER-3 da invenção interferem com o crescimento de tumor de células de câncer de mama humanas em camundongos nus, 5x106 células T47D foram implantadas em camundongos nus/nus NMRI fêmeos. Os tumores eram subcutâneos, desenvolvidos sobre o dorso do animal. Os tratamentos começaram quando os tumores atingiram um volume médio de 20 mm3; oito dias após a implantação. Antes do primeiro tratamento, os camundongos foram aleatorizados e os testes estatísticos efetuados para assegurar a uniformidade nos volumes de tumores de partida (média, desvio médio e padrão) através dos grupos de tratamento. O tratamento começou com uma dose de carga de 50 mg/kg, seguida por injeções de 25 mg/kg uma vez por semana por injeção intraperitoneal. Um braço de controle recebeu a doxorrubicina (grau farmacêutico). Todos os animais foram suplementados com 0,5 mg/kg/semana de estrogênio injetado i.p.
[00181] Os detalhes dos grupos de tratamento são dados abaixo.
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* tratamento com doxorrubina conforme descrito por Boven e outros., Cancer Research, 1992.
[00182] Os dados para o volume médio do tumor (figura 13) demonstraram que a administração de um anticorpo anti-HER-3 da invenção resultou na redução do crescimento do tumor.
EXEMPLO 20: Os anticorpos anti-HER-3 humanos inibem o crescimento de tumor pancreático humano em camundongos SCID
[00183] Para testar o potencial terapêutico dos anticorpos antiHER3 em outros tipos de tumores sólidos, os anticorpos anti-HER-3, U1-53 e U1-59, foram testados em camundongos com tumores estabelecidos, derivados da linhagem de células de tumores pancreáticos humanos BxPC3. Como controles, incluíram-se os grupos de camundongos tratados com o controle veículo, a PBS, ou o anticorpo terapêutico estabelecido, Erbitux. 5x106 células BxPC3 foram inoculadas subcutaneamente sem Matrigel em camundongos CB17 SCID. Os camundongos contendo os tumores estabelecidos, com um volume médio de 140 mm2, receberam 50 mg/kg de U1-53, U1-59, Erbitux ou o volume equivalente de PBS, via injeção intraperitoneal. Após isso, os camundongos receberam injeções de 25 mg/kg uma vez por semana, pela duração do estudo.
[00184] Os resultados para este experimento são mostrados na figura 14. O U1-53 e o U1-59 reduziram o crescimento dos tumores pancreáticos humanos em um modo citostático. Notavelmente, neste experimento, o U1-53 e o U1-59 eram mais efetivos do que o anticorpo que objetiva o EGFR, Erbitux, no retardo do crescimento do tumor. Estes dados demonstraram a eficácia terapêutica dos anticorpos antiHER-3 da invenção em comparação com um agente terapêutico de referência.
EXEMPLO 21: A combinação dos anticorpos anti-HER-3 humanos com os anticorpos anti-EGFR aumenta a atividade antitumor
[00185] A monoterapia das doenças hiperproliferativas com os anticorpos alvejados é freqüentemente dificultada por problemas tais como, por um lado, o desenvolvimento de resistência a fármacos, e por outro lado, uma alteração na antigenicidade. Por exemplo, a perda de antigenicidade após tratamento prolongado pode tornar as células de tumor insensíveis aos anticorpos terapêuticos, visto que estas células de tumor que não expressam ou perderam o antígeno alvo têm uma vantagem de crescimento seletivo. Estes problemas poderiam ser evitados por utilização dos anticorpos da invenção em combinação com um anticorpo terapêutico que marque um receptor diferente sobre as células de tumor, ou um outro agente antineoplástico. A intervenção nas múltiplas vias de sinalização ou mesmo nas vias relacionadas, porém em etapas de intervenção múltiplas, poderia também proporcionar benefício terapêutico. Estas modalidades de tratamento combinadas são prováveis de serem mais eficazes, porque elas combinam dois agentes anticâncer, cada um operando via um mecanismo de ação diferente.
[00186] Para demonstrar a viabilidade dos anticorpos anti-HER-3 da invenção, U1-53 e U1-59, como agentes de combinação adequados, comparam-se as administrações monoterapêuticas de U1-53 ou U1-59 com aquelas nas quais o U1-53 ou o U1-59 foi combinado com o anticorpo específico anti-EGR, Erbitux. 5x106 células BxPC3 foram inoculadas subcutaneamente com Matrigel em camundongos CB17 SCID. Após os volumes dos tumores terem atingido 200 mm3, os camundongos foram aleatorizados em grupos de tratamento individuais. Efetuaram-se administrações intraperitoneais semanais de U1-53, U1-59 e Erbitux, como agentes individuais ou combinações de quaisquer dos dois anticorpos anti-HER3 com o Erbitux ou como um coquetel de dois anticorpos anti HER-3. Todos os anticorpos foram dosados em doses de cargas individuais de 50 mg/kg/semana, seguidas por injeções semanais de 25 mg/kg por seis semanas. Os braços de controle receberam administrações bi-semanais de Gencitabina (120 mg/kg), injeções de IgG humana reunida semanalmente ou de veículo semanalmente (PBS). Os regimes são detalhados abaixo. Gr. N Composto Dose de carga (mg/kg) Dose semanal (mg/kg) Rota Programa
Figure img0014
[00187] Os resultad os para este experimento são mostrados na figura 15. Os anticorpos U1-53 e U1-59, quando administrados como agentes individuais, retardaram o crescimento dos tumores pancreáticos humanos até a mesma proporção que a Gencitabina, que é freqüentemente usada como uma quimioterapia anticâncer pancreático padrão. A co-administração de Erbitux com U1-53 e U1-59 resultou em uma redução significativamente maior do crescimento do tumor do que observado com a administração de quaisquer agentes individuais de U1-53, U1-59 ou Erbitux. Assim, uma resposta terapêutica benéfica pode ser obtida por combinação dos anticorpos anti-HER-3 da invenção com anticorpos adequados que alvejam antígenos de tumores separados.
[00188] Em resumo, os anticorpos anti-HER-3 da invenção têm eficácia terapêutica potente contra os tumores humanos in vivo. Eles podem ser efetivamente combinados com outras substâncias terapêuticas antineoplásticas para a atividade antitumor aumentada.
EXEMPLO 22: Os anticorpos anti-HER-3 humanos inibem o crescimento de tumores de melanoma humanos em camundongos nu/nu
[00189] Os membros da família de receptores erbB, incluindo o Her3, são anormalmente expressos em uma grande variedade de cânceres epiteliais e eles desempenham funções importantes no crescimento e na sobrevivência de muitos destes tumores sólidos. Estes tumores incluem os melanomas, os cânceres de células escamosas da cabeça e do pescoço, os cânceres de pulmão de células não pequenas e os cânceres da próstata, glioma, gástricos, de mama, colorretais, pancreáticos, ovarianos. Para verificar que os anticorpos anti-Her3 da invenção não estão restritos em sua atividade anticâncer aos tipos de tumores individuais, por exemplo, os cânceres pancreáticos (ver o Exemplo 21), porém podem ser usados como substâncias terapêuticas contra muitos tumores dependentes de HER-3, nós testamos o U1-53 e o U1-59 em estudos de xenoenxertos adicionais. Um exemplo é mostrado na figura 16. 5 x 105 células de melanoma humanas, HT144, foram injetadas subcutaneamente em camundongos CB17 SCID, seguidas por injeção intraperitoneal subseqüente imediata de 50 mg/kg de U1-53 e U1-59, pelo volume equivalente de PBS ou Dacarbacina (DITC) a 200 mg/kg. Após isso, os camundongos receberam 25 mg/kg de U1-53 ou U1-59 uma vez por semana, enquanto a DITC era dada uma vez a cada duas semanas, a 200 mg/kg.
[00190] Os volumes dos tumores médios a partir de cada grupo de tratamento são mostrados na Figura 16. A administração dos anticorpos da invenção resultou na redução do crescimento dos melanomas humanos, quando comparados aos tumores que tinham sido tratados com o controle veículo. Estes resultados demonstram que os anticorpos da invenção não estão restritos em seu potencial terapêutico e alvejam uma ampla variedade de cânceres que expressam o HER-3.
EXEMPLO 23: Os anticorpos anti-HER-3 humanos inibem o crescimento dos xenoenxertos de carcinoma do cólon em camundongos
[00191] As células de carcinoma do cólon humano HT-29 foram suspensas em meio com razão de 2:1 de Matrigel para uma concentração final de 10 x 106 células/ml. 0,2 ml da suspensão de células foi injetado s.c. no flanco direito de camundongos nu/nu CD1, de 4-5 semanas de idade. Um total de 95 camundongos foi usado.
[00192] Os camundongos foram aleatoriamente designados para os grupos de controle e de tratamento. O tratamento começou no mesmo dia. A duração do tratamento foi 29 dias. Ao término do estudo, três tumores por grupo foram coletados 3 horas após a administração do tratamento. Os tumores foram congelados rápidos e mantidos a -80 °C.
[00193] O seguinte protocolo de tratamento foi realizado:
[00194] Grupo de controle: 25 mg/kg de IgG humana não específica, duas vezes por semana, intraperitoneal.
[00195] Grupo de tratamento: anticorpo U1-53, 25 mg/kg, duas vezes por semana, intraperitoneal
[00196] Grupo de tratamento: anticorpo U1-7, 25 mg/kg, duas vezes por semana, intraperitoneal
[00197] Grupo de tratamento: anticorpo U1-59, 25 mg/kg, duas vezes por semana, intraperitoneal
[00198] Grupo de tratamento 5-FU: 5-fluorouracil, 50 mg/kg, 9d x 5, intraperitoneal
[00199] Os volumes dos tumores médios de cada grupo são mostrados na figura 17. A administração dos anticorpos da invenção resultou na redução do crescimento dos tumores de carcinoma do cólon HT-29, quando comparados aos tumores que tinham sido tratados com a IgG1 humana não específica.
EXEMPLO 24: Os anticorpos anti-HER-3 humanos inibem o crescimento do câncer de pulmão em camundongos
[00200] As células de câncer do pulmão de células não pequenas humanas Calu-3 foram suspensas em meio com razão de 1:1 de Matrigel até uma concentração final de 5 x 106 células/ml. 0,05 ml da suspensão de células foi injetado s.c. no flanco direito de camundongos CB17 scid fêmeos, de 9 semanas de idade. Um total de 60 camundongos foi usado.
[00201] Os camundongos foram aleatoriamente selecionados para os grupos de controle e de tratamento. O tratamento começou no mesmo dia. A duração do tratamento foi 32 dias.
[00202] O seguinte protocolo de tratamento foi realizado:
[00203] Grupo de veículo de PBS
[00204] Grupo de controle hG: IgG humana não específica: 25 mg/kg, duas vezes por semana, intraperitoneal
[00205] Grupo de tratamento anticorpo U1-53, 25 mg/kg, duas vezes por semana, intraperitoneal
[00206] Grupo de tratamento anticorpo U1-7, 25 mg/kg, duas vezes por semana, intraperitoneal
[00207] Grupo de tratamento anticorpo U1-59, 25 mg/kg, duas vezes por semana, intraperitoneal
[00208] Os volumes dos tumores médios de cada grupo de controle e de tratamento são mostrados na figura 18. A administração dos anticorpos da invenção resultou na redução do crescimento dos xenoenxertos de câncer do pulmão não pequenos, quando comparados aos tumores que tinham sido tratados com o controle veículo de PBS ou a IgG humana não específica.
EXEMPLO 25: Os anticorpos anti-HER-3 humanos inibem o crescimento do tumor pancreático humano em camundongos Balb/C
[00209] As células de tumores pancreáticos humanos BxPC3 foram suspensas em meio com uma razão a 2:1 de Matrigel até uma concentração final de 5 x 106 células por ml. 0,2 ml da suspensão celular foi injetado s.c. no flanco direito de camundongos BalbC nu/nu fêmeos, de 5-7 semanas de idade. Um total de 100 camundongos foi usado.
[00210] Os camundongos foram aleatoriamente distribuídos para grupos de controle e de tratamento. O tratamento começou no mesmo dia. A duração do tratamento foi 27 dias.
[00211] O seguinte protocolo de tratamento foi realizado:
[00212] Grupo de controle de hIgG: IgG2 humana não específica, 25 mg/kg, duas vezes por semana, intraperitoneal
[00213] Grupo de tratamento anticorpo U1-53, 25 mg/kg, duas vezes por semana, intraperitoneal
[00214] Grupo de tratamento anticorpo U1-7, 25 mg/kg, duas vezes por semana, intraperitoneal
[00215] Grupo de tratamento anticorpo U1-59, 25 mg/kg, semanalmente, intraperitoneal
[00216] Grupo de tratamento de Gemzar, gencitabina, 80 mg/kg, semanalmente, intraperitoneal
[00217] Os volumes dos tumores médios de cada grupo de controle e de tratamento são mostrados na figura 19. A administração dos anticorpos da invenção resultou na redução do crescimento dos tumores pancreáticos humanos, quando comparados aos tumores que tinham sido tratados com a IgG humana não específica ou com Gemzar.
[00218] A inibição do HER-3 nos tumores pancreáticos humanos pôde também ser mostrada em um experimento farmacodinâmico. Os xenoenxertos de tumores BxPC3 foram desenvolvidos conforme descrito acima. 3 camundongos foram tratados com 500 μg de um anticorpo de controle de IgG1 e 3 camundongos foram tratados com 500 μg do anticorpo anti-HER-3 U1-59. Os camundongos foram tratados no dia 1 e no dia 4 e então sacrificados no dia 5 para medir a inibição dependente de anticorpo da fosforilação de HER-3 (pHER-3).
[00219] Os tumores foram homogeneizados em um tampão de RIPA padrão com inibidores das proteases. 50 μg de lisado claro foram separados sobre um gel de 4-20 % de Tris-glicina, transferidos para uma membrana de nitrocelulose e bloqueados em 3 % de soro albumina bovina (BSA). A imunotransferência foi efetuada usando um anticorpo antiHER-3 (anticorpo 21D3, tecnologia de Cell Signaling). Um anticorpo antiactina (AB a-2066, Sigma) foi usado como um controle.
[00220] A expressão foi detectada por quimioluminescência aumentada (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). As imagens foram capturadas com o Sistema de Imageamento Versadoc 5000 (BioRad, Hercules, CA).
[00221] Os resultados são mostrados na figura 20. Após a administração do anticorpo anti-HER-3 U1-59, a fosforilação de HER-3 não mais era detectável. Assim, os anticorpos da invenção são capazes de reduzir significativamente a ativação do HER-3 em células de tumores pancreáticos humanos.
EXEMPLO 26: Uso dos anticorpos anti-HER-3 da invenção como um agente diagnóstico
[00222] O mAb anti-HER-3 pode ser usado no diagnóstico de doenças malignas. O HER-3 é expresso sobre células de tumor em um modo muito distinto comparado ao tecido normal e, portanto, uma análise da expressão do HER-3 auxiliaria no diagnóstico primário de tumores malignos, no estadiamento e na graduação dos tumores sólidos, na avaliação de critérios prognósticos para doenças proliferativas e neoplasias e no controle de risco em pacientes com tumores positivos para HER-3.
A. Detecção do antígeno HER-3 em uma amostra
[00223] Um Ensaio Imunológico por Ligação com Enzima (ELISA) para a detecção do antígeno HER-3 em uma amostra é desenvolvido. No ensaio, as cavidades de uma placa de microtítulação, tal como uma placa de microtitulação de 96 cavidades ou uma placa de microtitulação de 384 cavidades, são adsorvidos por diversas h com um primeiro anticorpo monoclonal inteiramente humano dirigido contra o antígeno HER-3. O anticorpo imobilizado serve como um anticorpo de captura para qualquer do antígeno HER-3 que possa estar presente em uma amostra de teste. As cavidades são enxaguados e tratados com um agente bloqueador, tal como a proteína do leite ou a albumina, para impedir a adsorção não específica do analito.
[00224] Subseqüentemente, os cavidades são tratados com uma amostra de teste suspeita de conter o antígeno HER-3, ou com uma solução contendo uma quantidade padrão do antígeno HER-3. Tal amostra é, por exemplo, uma amostra de soro de um paciente suspeito de ter níveis de antígeno HER-3 circulante considerados serem diagnósticos de uma patologia. Após enxaguar a amostra de teste ou o padrão, os cavidades são tratados com um segundo anticorpo antiHER-3 monoclonal inteiramente humano da invenção que está marcado por conjugação com biotina. O anticorpo anti-HER-3 marcado serve como um anticorpo de detecção. Após enxaguar o anticorpo secundário em excesso, as cavidades são tratadas com peroxidase do rábano silvestre (HRP) conjugada com avidina e um substrato cromogênico adequado. A concentração do antígeno HER-3 nas amostras de teste é determinada por comparação com uma curva padrão desenvolvida a partir das amostras padrão.
B. Detecção do antígeno HER3 na Imunoistoquímica (IHC)
[00225] Para determinar o antígeno HER3 em cortes de tecido por IHC, os tecidos incrustados em Parafina são primeiramente desparafinizados em xileno por 2 x 5 min e então hidratados com 100% de Etanol 2 x 3 min, 95% de Etanol 1 min e enxaguados em água destilada. Os epítopos antigênicos mascarados por fixação em formalina e incrustação em parafina são expostos por desmascaramento dos epítopos, digestão enzimática ou saponina. Para o desmascaramento dos epítopos, os cortes de parafinas são aquecidos em um vaporizador, banho de água ou forno de microondas por 20-40 min, em uma solução de restauração de epítopo, como por exemplo, a solução de HCl a 2N (pH 1,0). No caso de uma digestão com enzima, os cortes de tecidos são incubados a 37°C por 10-30 minutos em diferentes soluções de enzimas, tais como proteinase K, tripsina, pronase, pepsina etc.
[00226] Após enxaguar a solução de restauração de epítopo ou a enzima em excesso, os cortes de tecidos são tratados com um tampão bloqueador para impedir as interações não específicas. O anticorpo primário é incubado em diluições apropriadas em tampão de diluição por 1 hora, na temperatura ambiente ou durante a noite. O anticorpo primário em excesso é enxaguado e os cortes são incubados em solução de bloqueio de peroxidase por 10 min, na temperatura ambiente. Após uma outra etapa de lavagem, os cortes de tecidos são incubados com um anticorpo secundário, marcado com um grupo que poderia servir como uma âncora para uma enzima. Os exemplos, portanto, são os anticorpos secundários marcados com biotina que são reconhecidos pela peroxidase da raiz forte acoplada à estreptavidina. A detecção do dito complexo de anticorpo/enzima é atingida por incubação com um substrato cromogênico adequado.
C. Determinação da concentração de antígeno HER-3 no soro de pacientes
[00227] Um ELISA intercalado é desenvolvido para quantificar os níveis de HER-3 no soro humano. Os dois anticorpos anti-HER-3 monoclonais inteiramente humanos usados no ELISA de sanduíche reconheceram diferentes domínios sobre a molécula de HER-3 e não competem pela ligação, por exemplo, ver o Exemplo 8. O ELISA é efetuado como se segue: 50 μl de anticorpo anti-HER-3 de captura em tampão de revestimento (NaHCO3 a 0,1 M, pH 9,6), em uma concentração de 2 μg/ml, foram revestidos sobre placas de ELISA (Fisher). Após incubação a 4 °C durante a noite, as placas são tratadas com 200 μl de tampão de bloqueio (0,5 % de BSA, 0,1 % de Tween 20, 0,01 % de Timerosal em PBS), por 1 h, a 25 °C. As placas foram lavadas (3x) usando 0,05 % de Tween 20 em PBS (tampão de lavagem, WB). Os soros normais ou de pacientes (Clinomics, Bioreclaimation) são diluídos em tampão de bloqueio contendo 50 % de soro humano. As placas são incubadas com amostras de soro durante a noite, a 4 °C, lavadas com WB, e então incubadas com 100 μl/cavidade de anticorpo anti-HER-3 de detecção biotinilado por 1 h, a 25 °C. Após a lavagem, as placas são incubadas com HRP-Estreptavidina por 15 min, lavadas como antes, e então tratadas com 100 μl/cavidade de ofenilenodiamina em H2O2 (solução de desenvolvimento da Sigma) para a geração de cor. A reação é interrompida com 50 μl/cavidade de H2SO4 (2 M) e analisada usando uma leitora de placa de ELISA a 492 nm. A concentração de antígeno HER-3 nas amostras de soro é calculada por comparação com diluições de antígeno HER-3 purificado, usando um programa de adaptação de curva de quatro parâmetros. Estadiamento do câncer em um paciente
[00228] Com base nos resultados apresentados e discutidos nos itens A, B e C, através do uso da presente invenção, é possível o estadiamento de um câncer em um paciente baseado nos níveis de expressão do antígeno HER-3. Para um dado tipo de câncer, as amostras de sangue são retiradas dos pacientes diagnosticados como estando em diversos estágios na progressão da doença, e/ou em diversos pontos no tratamento terapêutico do câncer. A concentração do antígeno HER-3 presente nas amostras de sangue é determinada usando um método que especificamente determina a quantidade do antígeno que está presente. Tal método inclui um método ELISA, tal como o método descrito nos itens A e B. Usando uma população de amostras que proporciona resultados estatisticamente significativos para cada estágio de progressão ou terapia, designa-se uma faixa de concentrações do antígeno HER-3 que pode ser considerada característica de cada estágio.
[00229] Para o estadiamento da progressão do câncer em um paciente sob estudo, ou para a caracterização da resposta do paciente a um curso de terapia, uma amostra de sangue é retirada do paciente e a concentração do antígeno HER-3 presente na amostra é determinada. A concentração assim obtida é usada para identificar em qual faixa de concentrações incide o valor. A faixa assim identificada correlaciona-se com um estágio de progressão ou um estágio de terapia identificado nas diversas populações de pacientes diagnosticados, desse modo proporcionando um estadiamento no paciente sob estudo.
EXEMPLO 27: Usos dos anticorpos anti-HER-3 e dos conjugados de anticorpos da invenção para o tratamento ou a prevenção de doenças hiperproliferativas
[00230] Muitos tumores sólidos são dirigidos pela sinalização mediada pela família do HER e foi demonstrado que o HER-3 é um par crucial através de formação de complexo entre o HER-1, o HER-2 e o HER-4. Portanto, uma redução ou uma eliminação da sinalização mediada pelo HER-3 impactaria todos os outros membros da família do HER e prejudicaria a sinalização celular, resultando em uma janela ampla de intervenções terapêuticas e potencial na terapia de combinação com outros agentes alvejados, substâncias biológicas e agentes citotóxicos. Assim, os anticorpos anti-HER-3 da invenção podem ser usados para o tratamento de certos distúrbios hiperproliferativos ou associados com o HER-3, que são baseados em diversos fatores, como por exemplo, a expressão do HER-3. Os tipos de tumores, como o câncer de mama, o câncer gastrointestinal, o câncer do pâncreas, o câncer da próstata, o câncer ovariano, o câncer de estômago, o câncer endometrial, o câncer da glândula salivar, o câncer de pulmão, o câncer do rim, o câncer do cólon, o câncer colorretal, o câncer da tireóide, o câncer de bexiga, o glioma, o melanoma, outros cânceres que expressam ou superexpressam o HER-3, parecem apresentar indicações preferidas, porém as indicações não estão limitadas àquelas na lista precedente. Além disso, os seguintes grupos de pacientes beneficiar-se-ão do tratamento de mAb anti-HER-3 dirigido: • Pacientes com resistência ao tratamento de mAb antiHER-2 • Pacientes não qualificados para o tratamento com mAb anti-HER-2 • Pacientes com resistência ao mAb anti-HER-1 ou ao inibidor de anti-EGFR de pequena molécula • Pacientes com câncer de pulmão de célula não pequena resistentes ao erlotinib ou gefitinib
[00231] Os anticorpos anti-HER-3 da invenção seriam usados como uma monoterapia ou em combinação com um ou mais agentes em uma assim chamada "terapia de combinação". A dita terapia de combinação pode incluir, porém não está limitada aos, agentes que foram especificados anteriormente na invenção. A terapia de combinação com os anticorpos anti-HER3 e outros agentes pode prolongar a sobrevivência do paciente, o tempo até a progressão do tumor ou a qualidade de vida do paciente. O protocolo e o projeto de administração abordarão a eficácia terapêutica bem como a capacidade de reduzir as doses usuais das terapias padrões, como por exemplo, a quimioterapia e a terapia de radiação. Tratamento dos seres humanos com os anticorpos anti-HER-3 da invenção
[00232] Para determinar os efeitos in vivo do tratamento com o anticorpo anti-HER-3 em pacientes humanos com tumores, tais pacientes humanos são injetados durante certa quantidade de tempo com uma quantidade eficaz do anticorpo anti-HER-3 da invenção. Em tempos periódicos durante o tratamento, os pacientes humanos são monitorados para determinar se os seus tumores progridem, em particular, se os tumores crescem e metastatizam.
[00233] Um paciente com tumor tratado com os anticorpos antiHER-3 da invenção tem um nível menor de crescimento e/ou metástase do tumor, comparado ao nível de crescimento e metástase do tumor em pacientes com tumor tratados com o padrão atual de substâncias terapêuticas para o cuidado. Tratamento com os conjugados de anticorpos anti-HER-3 da invenção
[00234] Para determinar os efeitos in vivo dos conjugados de anticorpos anti-HER-3 da invenção, pacientes humanos ou animais exibindo tumores são injetados, durante certa quantidade de tempo, com uma quantidade eficaz do conjugado de anticorpo anti-HER-3 da invenção. Por exemplo, o conjugado de anticorpo anti-HER-3 administrado é o conjugado de DM1-anticorpo anti-HER-3, um conjugado de auristatina-anticorpo anti-HER-3 ou o conjugado de radioisótopoanticorpo anti-HER-3. Em tempos periódicos durante o tratamento, os pacientes humanos ou os animais são monitorados para determinar se os seus tumores progridem, em particular, se os tumores crescem e metastatizam.
[00235] Um paciente humano ou animal exibindo tumores e sofrendo tratamento com, por exemplo, os conjugados de DM1-anticorpo anti-HER-3 ou de radioisótopo-anticorpo anti-HER-3, tem um nível menor de crescimento e metástase do tumor, quando comparado a um paciente ou animal de controle exibindo tumores e sofrendo tratamento com uma terapia alternativa. Os DM1-anticorpos de controle que podem ser usados em animais incluem os conjugados compreendendo o DM1 ligado aos anticorpos do mesmo isótipo dos anticorpos anti-HER3 da invenção, porém mais especificamente, não tendo a capacidade de ligar-se ao antígeno HER-3 de tumor. Os radioisótopo-anticorpos de controle que podem ser usados em testes com animais incluem os conjugados compreendendo radioisótopo ligado a anticorpos do mesmo isótipo dos anticorpos anti-HER-3 da invenção, porém mais especificamente, não tendo a capacidade de ligar-se ao antígeno HER-3 de tumor. Observação: os conjugados de controle não seriam administrados aos seres humanos.
COMENTÁRIOS GERAIS
[00236] O relatório descritivo escrito precedente é considerado ser suficiente para capacitar alguém versado na técnica de praticar a invenção. A presente invenção não é para ser limitada no escopo pela construção depositada, visto que a modalidade depositada é pretendida como uma ilustração individual de certos objetivos da invenção e quaisquer construtos que sejam funcionalmente equivalentes estão dentro do escopo desta invenção. O depósito de material aqui não constitui uma admissão que a descrição escrita aqui contida é inadequada para capacitar a prática de qualquer objetivo da invenção, incluindo o seu melhor modo, não é para ser interpretado como limitando o escopo das reivindicações às ilustrações específicas que representa.
[00237] A descrição e os Exemplos precedentes detalham certas modalidades preferidas da invenção e descrevem o melhor modo contemplado pelos inventores. Será apreciado, entretanto, que não importa o quanto detalhado o precedente possa aparecer no texto, a invenção pode ser praticada em muitos modos e a invenção não deve ser interpretada de acordo com as reivindicações em anexo e quaisquer seus equivalentes.
[00238] Além disso, a não ser que de outro modo definido, os termos científicos e técnicos usados em conexão com a presente invenção terão os significados que são comumente entendidos por aqueles de habilidade comum na técnica. Ademais, a não ser que de outro modo requerido pelo contexto, os termos singulares incluirão as pluralidades e os termos plurais incluirão o singular. Geralmente, as nomenclaturas utilizadas em conexão com, e as técnicas de, cultura de células e tecidos, biologia molecular, e química e hibridização de oligoou polinucleotídeos descritos neste documento, são aquelas bem conhecidas e comumente usadas na técnica. As técnicas padrão são usadas para DNA recombinante, síntese de oligonucleotídeos, e cultura e transformação de tecido (por exemplo, eletroporação, lipofecção). As reações enzimáticas e as técnicas de purificação são efetuadas de acordo com as especificações do fabricante ou como comumente efetuadas na técnica ou como descritas neste documento. As técnicas e os procedimentos precedentes são geralmente efetuados de acordo com métodos convencionais, bastante conhecidos na técnica, e conforme descritos em diversas referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas por todo o presente relatório descritivo. Ver, por exemplo, Sambrook e outros., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)), que é incorporado neste documento por referência. As nomenclaturas utilizadas em conexão com, e os procedimentos e técnicas de laboratório de, química analítica, química orgânica sintética, e química medicinal e farmacêutica descritas neste documento são aquelas bastante conhecidas e comumente usadas na técnica. As técnicas padrão são usadas para as sínteses químicas, as análises químicas, a preparação farmacêutica, a formulação, e a distribuição, e o tratamento de pacientes.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA
[00239] Todas as referências citadas neste documento, incluindo as patentes, os pedidos de patentes, os documentos, os livros-textos, e similares, incluindo as referências citadas neles, são, pelo presente, incorporadas neste documento por referência em sua totalidade.

Claims (18)

1. Anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo que se liga a HER-3, caracterizado pelo fato de que é selecionado dentre um dos seguintes (1)-(3): (1) um anticorpo ou fragmento de anticorpo compreendendo: uma CDR1 da cadeia pesada representada por GGSFSGYYWS, uma CDR2 da cadeia pesada representada por EINHSGSTNYNPSLKS, uma CDR3 da cadeia pesada representada por DKWTWYFDL, e uma CDR1 da cadeia leve representada por RSSQSVLYSSSNRNYLA, uma CDR2 da cadeia leve representada por WASTRES e uma CDR3 da cadeia leve representada por QQYYSTPRT; 2) um anticorpo ou fragmento de anticorpo compreendendo: uma CDR1 da cadeia pesada representada por GYTFTGYYMH, uma CDR2 da cadeia pesada representada por WINPNIGGTNCAQKFQG, uma CDR3 da cadeia pesada representada por GGRYSSSWSYYYYGMDV, e uma CDR1 da cadeia leve representada por KSSQSLLLSDGGTYLY, uma CDR2 da cadeia leve representada por EVSNRFS e uma CDR3 da cadeia leve representada por MQSMQLPIT; e 3) um anticorpo ou fragmento de anticorpo compreendendo: uma CDR1 da cadeia pesada representada por GFTFSIYSMN, uma CDR2 da cadeia pesada representada por YISSSSSTIYYADSVKG, uma CDR3 da cadeia pesada representada por DRGDFDAFDI, e uma CDR1 da cadeia leve representada por QASQDITNYLN, uma CDR2 da cadeia leve representada por DASNLET e uma CDR3 da cadeia leve representada por QQCENFPIT.
2. Anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada da SEQ ID NO:42 e uma sequência de aminoácidos da cadeia leve da SEQ ID NO:44, (ii) uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada de SEQ ID NO:54 e uma sequência de aminoácidos da cadeia leve de SEQ ID NO:56, ou (iii) uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada de SEQ ID NO:70 e uma sequência de aminoácidos da cadeia leve de SEQ ID NO:72.
3. Anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo monoclonal, um anticorpo recombinante, um anticorpo humanizado, um anticorpo humano, um anticorpo quimérico, um anticorpo multiespecífico, ou um fragmento de anticorpo dos mesmos, em que o fragmento de anticorpo é preferencialmente um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento F(ab')2, um fragmento Fv, um diacorpo, ou uma molécula de anticorpo de cadeia única.
4. Anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é do tipo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4.
5. Anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que está acoplado a um grupo de marcação, o qual é preferencialmente um radioisótopo ou radionuclídeo, um grupo fluorescente, um grupo enzimático, um grupo quimioluminescente, um grupo de biotinila, ou um epítopo de polipeptídeo predeterminado.
6. Anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que está acoplado a um grupo efetor, o qual é preferencialmente um radioisótopo ou radionuclídeo, uma toxina, ou um grupo terapêutico ou quimioterapêutico, em que o grupo terapêutico ou quimioterapêutico é selecionado dentre o grupo que consiste em caliqueamicina, auristatina-PE, geldanamicina, maitansina e seus derivados.
7. Molécula de ácido nucléico isolada, caracterizada pelo fato de que codifica um anticorpo ou fragmento de anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que está operacionalmente ligada a uma sequência controle, em que a molécula de ácido nucleico isolada compreende (i) uma sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia pesada como mostrada na SEQ ID NO: 41 e uma sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia leve como mostrada na SEQ ID NO: 43, (ii) uma sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia pesada como mostrada na SEQ ID NO: 53 e uma sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia leve como mostrada na SEQ ID NO: 55, ou (iii) uma sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia pesada como mostrada na SEQ ID NO: 69 e uma sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia leve como mostrada na SEQ ID NO: 71.
8. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucléico, como definida na reivindicação 7.
9. Microrganismo transgênico, caracterizado pelo fato de que é transformado com o vetor, como definido na reivindicação 8.
10. Processo para preparar o anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de isolar o referido anticorpo ou fragmento de anticorpo de uma célula hospedeira, em que a célula hospedeira é preferencialmente uma célula de mamífero, uma célula de planta, uma célula fúngica, ou uma célula procariótica.
11. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende como um agente ativo pelo menos um anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e um veículo, diluente ou adjuvante farmaceuticamente aceitável.
12. Composição, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que é para uso terapêutico.
13. Composição, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que é para uso diagnóstico.
14. Método in vitro para diagnosticar uma doença associada ao HER-3, particularmente uma doença hiperproliferativa, em que a referida doença hiperproliferativa é selecionada dentre o grupo que consiste em câncer de mama, câncer gastrointestinal, câncer de pâncreas, câncer da próstata, câncer ovariano, câncer de estômago, câncer endometrial, câncer da glândula salivar, câncer de pulmão, câncer de rim, câncer do cólon, câncer colorretal, câncer da tireoide, câncer da bexiga, glioma, melanoma, outros cânceres que expressam ou superexpressam o HER-3, câncer de testículo, sarcoma de tecido mole, câncer de cabeça e pescoço, e formação de metástases do tumor, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende: (a) contatar uma amostra com o anticorpo ou fragmento de anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, sob condições adequadas para permitir a ligação do referido anticorpo ao HER-3; e (b) identificar a ligação do referido anticorpo ao HER-3.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a referida doença hiperproliferativa está associada com a fosforilação aumentada de HER-3, a heterodimerização aumentada de HER-2/HER-3 ou uma atividade aumentada de PI3cinase, cinase terminal c-jun, AKT, ERK2 e/ou PYK2.
16. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
17. Kit, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que compreende um agente terapêutico adicional, em que o agente terapêutico adicional é preferencialmente selecionado dentre um grupo de anticorpos, como Cetuximabe, proteínas imunomoduladoras, inibidores de pequenas moléculas, agentes quimioterapêuticos selecionados dentre o grupo que consiste em inibidores mitóticos, inibidores de quinase, agentes alquilantes, antimetabólitos, antibióticos intercalantes, inibidores do fator de crescimento, inibidores do ciclo celular, enzimas, inibidores da topoisomerase, inibidores da histona desacetilase ou agentes anti-sobrevivência, modificadores da resposta biológica, anti-hormônios e agentes anti-angiogênese.
18. Anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é em combinação com outro agente terapêutico antineoplásico para uso no tratamento de câncer, em que o agente antineoplásico é selecionado dentre o grupo de anticorpos, como Cetuximabe, proteínas imunomoduladoras, inibidores de pequenas moléculas, agentes quimioterapêuticos selecionados dentre o grupo que consiste em inibidores mitóticos, inibidores de cinase, agentes alquilantes, antimetabólitos, antibióticos intercalantes, inibidores de fator de crescimento, inibidores de ciclo celular, enzimas, inibidores de topoisomerase, inibidores de histon desacetilase ou agentes anti-sobrevivência, modificadores de resposta biológica, anti-hormônios e agentes anti-angiogênese.
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