BRPI0611936A2

BRPI0611936A2 - protease, uso de uma protease, composição farmacêutica, e, método para o tratamento de doença

Info

Publication number: BRPI0611936A2
Application number: BRPI0611936-0A
Authority: BR
Inventors: Allan Svendsen; Claus Crone Fuglsang; Peter Colin Gregory
Original assignee: Solvay Pharm Gmbh; Novozymes As
Priority date: 2005-06-24
Filing date: 2006-06-16
Publication date: 2011-02-22
Also published as: WO2006136160A2; IL187510A0; KR20080017039A; RU2008102738A; WO2006136160A3; MX2007015474A; US20100135978A1; CA2612806A1; NO20080438L; US20080317726A1; RU2420578C2; JP2008546395A; NZ563777A; EP1896058A2; US20110110910A1; AU2006261443A1

Abstract

PROTEASE, USO DE UMA PROTEASE, COMPOSIçãO FARMACêUTICA, E, MéTODO PARA O TRATAMENTO DE DOENçA. O uso farmacêutico de proteases relacionadas com os aminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 2, a serina protease derivada de Bacilius licheniform is, que também é designado subtilisina Carlsberg, opcionalmente em combinação com uma lipase e/ou uma amilase. Os exemplos de indicações médicas são: Tratamento de distúrbios digestivos, insuficiência exócrina pancreática (PEI), pancreatite, fibrose cística, diabete tipo I e/ou diabete tipo II.

Description

"PROTEASE, USO DE UMA PROTEASE, COMPOSIÇÃOFARMACÊUTICA, E, MÉTODO PARA Ò TRATAMENTO DE DOENÇA"

Campo Técnico

A presente invenção diz respeito ao uso farmacêutico deproteases relacionadas com uma serina protease derivada de Bacilluslicheniformis (aminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 2), opcionalmente emcombinação com uma lipase e/ou uma amilase. Os exemplos de indicaçõesmédicas são: Tratamento de distúrbios digestivos, insuficiência exócrinapancreática (PEI), pancreatite, fibrose cística, diabete tipo I e/ou diabete tipo II.

Fundamentos da Técnica

Diversos medicamentos comerciais na forma de suplementosde enzima pancreática são conhecidos para o tratamento de insuficiênciaexócrina pancreática. Os ingredientes ativos destes produtos são enzimasdigestivas, principalmente amilase, lipase e protease, que são normalmenteproduzidas no pâncreas e excretadas na parte superior do intestino delgado (oduodeno). As enzimas usadas em tais medicamentos derivam de pâncreasbovino ou suíno, entretanto também existem produtos no mercado comenzimas microbianas, por exemplo, o produto Nortase® que contém umalipase de Rhizopus oryzae, uma protease de Aspergillus oryzae, e uma amilasede Aspergillus oryzae.

A US 5614189 (EP 600868) descreve o uso de, i.a., uma lipasederivada de Humicola lanuginosa na terapia de reposição de enzimapancreática, por exemplo no tratamento de pacientes que sofrem de fibrosecística. Esta lipase é de Humieola lanuginosa DSM 4109 e tem a seqüência deaminoácido dos aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 14.

A WO 00/54799 descreve o uso de misturas de enzimafisiologicamente aceitáveis tendo atividade lipolítica, proteolítica e amiolíticano tratamento da diabete melito tipo I e II.A WO 02/060474 descreve o uso de uma lipase concentradade Rhizopus delemar, uma protease neutra de Aspergillus melleus, e umaamilase de Aspergillus oryzae no tratamento da má digestão.

A WO 01/62280 descreve o uso de um certo cristal de lipasenão fungica reticulada com um agente de reticulação multifuncional, umaprotease e uma amilase, em que o cristal de lipase é ativo em uma faixa de pHde cerca de 2,0 a 9,0, para tratar ou prevenir um distúrbios gastrintestinais emum mamífero. Uma lipase preferida é de Pseudomonas, as amilases preferidassão de Bacillus ou Aspergillus, as proteases preferidas são bromelaína,papaína ou ficina.

A EP 0828509 descreve o uso de certas amilases estáveis emácido, opcionalmente em combinação com certas lipases e/ou proteasesestáveis em ácido, no tratamento de insuficiência pancreática exócrina. Umaamilase preferida é de Aspergillus niger e as lipases preferidas são deRhizopus arrhizus ou Rhizopus javanicus.

A WO 91/00345 descreve várias serina subtilisina proteases evariantes melhoradas destas, para o uso em composições de detergente.

A WO 2005/115445 (publicada depois das datas de prioridadedo presente pedido) descreve o uso farmacêutico de proteases relacionadascom uma protease derivada de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 (esta proteasetendo a seqüência de aminoácido de aminoácidos 1-188 da SEQ ID NO: 1nesta referência), opcionalmente em combinação com uma lipase e/ou umaamilase. As indicações médicas são as mesmas como na presente invenção.

A WO 02/077187 divulga variantes de uma subtilisina deBacillus amyloliquefaeiens tendo um epítopo de célula T alterado e váriosusos destes. As composições farmacêuticas são reivindicadas.

A WO 01/12795 divulga o uso farmacêutico de composiçõesde enzima proteolítica. As proteases preferidas são de Aspergillus oryzae,Aspergillus niger, Aspergillus sojae, Aspergillus flavus, Aspergillus awamoriou Bacillus subtilis.

A WO 2004/078773 divulga como manter proteases tais comosubtilisina proteases em um estado inativo que pode ser ativado na demandaatravés de um sinal externo. Entre outros usos o uso de pró-subtilisina emformulações de limpeza de ferimento é divulgado e como fazer com que asubtilisina ativa seja formada. Uma enzima de protease preferida é a ProD-subtilisina ou ProD-subtilisina carregada (Yabuta et al., J. Biol. Chem. 278:15246-51,2003).

A US 2002/0081703 divulga um método para reduzir aalergenicidade de proteínas não humanas, em que um epítopo é identificado esubstituído com uma região análoga dentro de uma subtilisina humana. Ascomposições farmacêuticas que compreendem uma subtilisina humana sãoreivindicadas.

Existe uma necessidade na técnica quanto a enzimasalternativas, preferivelmente melhoradas para uso farmacêutico, em particularpara as indicações médicas mencionadas acima.

Sumário da invenção

A presente invenção fornece enzimas alternativas,preferivelmente melhoradas para uso farmacêutico, em particular para otratamento de distúrbios digestivos, insuficiência exócrina pancreática (PEI),pancreatite, fibrose cística, diabete tipo I e/ou diabete tipo II. As novasenzimas são proteases, amilases e lipases. Preferivelmente, as enzimas para ouso de acordo com a invenção têm uma eficácia melhorada in vivo e/ou invitro; um perfil de estabilidade ao pH melhorada; um perfil de atividade aopH melhorada; são estáveis contra a degradação pelas proteases; são estáveisna presença de sais biliares; e/ou têm uma alergenicidade reduzida.

A presente invenção diz respeito a uma protease de pelomenos 50% de identidade com os aminoácidos 1 a 274 da SEQ ID NO: 2,para o uso como um medicamento, opcionalmente em combinação com umalipase e/ou uma amilase.

A invenção também diz respeito ao uso de tais proteases para afabricação de um medicamento para o tratamento de distúrbios digestivos,PEI, pancreatite (aguda e/ou crônica), fibrose cística, diabete tipo I e/oudiabete tipo Π, estes usos opcionalmente compreendendo ainda o uso de umalipase e/ou uma amilase.

A invenção além disso diz respeito a uma composiçãofarmacêutica que compreende tais proteases, junto com pelo menos ummaterial auxiliar farmaceuticamente aceitável, opcionalmente incluindo umalipase e/ou uma amilase.

A invenção também diz respeito a um método para otratamento de distúrbios digestivos, PEI, pancreatite (aguda e/ou crônica),fibrose cística, diabete tipo I e/ou diabete tipo II, pela administração de umaquantidade terapeuticamente eficaz de tais proteases, opcionalmente juntascom uma lipase e/ou uma amilase.

Descrição Detalhada da invenção

Enzimas

A presente invenção diz respeito ao uso farmacêutico deproteases tendo pelo menos 50% de identidade à protease de aminoácidos dela 274 da SEQ ID NO: 2, uma serina protease derivada de Bacilluslicheniformis, que também é designada subtilisina Carlsberg. A invençãotambém diz respeito ao uso de tais proteases para a fabricação de ummedicamento para o tratamento de distúrbios digestivos, PEI, pancreatite,fibrose cística, diabete tipo I e/ou diabete tipo II. A invenção além disso dizrespeito a uma composição farmacêutica que compreende tais proteases, juntocom pelo menos um material auxiliar farmaceuticamente aceitável, assimcomo a um método para o tratamento das doenças mencionadas acima, pelaadministração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de tais proteases.

No que segue, a protease para o uso nas composições, métodose usos da invenção é aludido como a "protease da invenção."

Em formas de realização preferidas, a protease da invençãotem um grau de identidade com os aminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 2de pelo menos 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% ou pelomenos 60%. Em outras formas de realização preferidas, a protease dainvenção tem um grau de identidade com os aminoácidos de 1 a 274 da SEQID NO: 2 de pelo menos 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%ou pelo menos 70%. Ainda em outras formas de realização preferidas, aprotease da invenção tem um grau de identidade com os aminoácidos de 1 a274 da SEQ ID NO: 2 de pelo menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%,78%, 79% ou pelo menos 80%. Em formas de realização adicionaispreferidas, a protease da invenção tem um grau de identidade com osaminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 2 de pelo menos 81%, 82%, 83%,84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% ou pelo menos 90%. Em formas derealização mais preferidas, a protease da invenção tem um grau de identidadecom os aminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 2 de pelo menos 91%, 92%,93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou pelo menos 99%.

O termo "protease" é aqui definido como uma enzima quehidrolisa ligações peptídicas. O mesmo inclui qualquer enzima pertencente aogrupo de enzima EC 3.4 (incluindo cada uma das treze subclasses destes,estas enzimas sendo a seguir aludida como "pertencente ao grupo EC 3.4.-.-"). O número EC refere-se à Nomenclatura de Enzima 1992 da NC-IUBMB,Academic Press, San Diego, Califórnia, incluindo os suplementos 1 a 5publicados na Eur. J. Biochem. 1994, 223, 1-5; Eur. J. Biochem. 1995, 232, 1-6; Eur. J. Biochem. 1996, 237, 1-5; Eur. J. Biochem. 1997, 250, 1-6; e Eur. J.Biochem. 1999, 264, 610-650; respectivamente. A nomenclatura éregularmente suplementada e atualizadas; ver por exemplo, a World WideWeb em http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzima/index.html.

As proteases são classificadas com base no seu mecanismocatalítico nos seguintes grupos: as serina proteases (S), cisteína proteases (C),aspártico proteases (A), metalo proteases (M) e desconhecidas ou como aindanão classificadas, proteases (U), ver Handbook of Proteolytic Enzymes, A. J.Barrett, N. D. Rawlings, J. F. Woessner (eds), Academic Press (1998), (noque segue aludida como "o handbooAj'), em particular a parte de introduçãogeral.

Em uma outra forma de realização, a protease da invenção éuma serina protease. O termo serina protease refere-se às serina peptidases eseus clãs como definido no handbook, ver em particular os capítulos 1-175.Uma serina protease é uma peptidase em que o mecanismo catalítico dependedo grupo hidroxila de um resíduo de serina que atua como o nucleófilo queataca a ligação peptídica.

Ainda em uma outra forma de realização, a protease dainvenção é uma subtilisina e/ou derivada da família da subtilisina. Os termossubtilisina ou família de subtilisina incluem todo o Clã das SB serinaproteases, em particular a Família S8 destes (o Clã SB é dado no Capítulo 93do handbook). Para determinar se uma dada protease é uma subtilisina ou não,referência é feita ao handbook e os princípios aí indicados. Tal determinaçãopode ser realizada para todos os tipos de proteases, sejam proteases queocorram naturalmente ou do tipo selvagem; ou proteases geneticamenteengendrada ou sintéticas. Em uma forma de realização particular, a ordem datríade catalítica na protease da invenção é Asp-His-Ser. Em uma outra formade realização particular, a estrutura terciária da protease da invenção incluitanto hélices alfa e folhas beta. O clã SB inclui endopeptidases eexopeptidases. Ainda em uma outra forma de realização particular a proteaseda invenção é uma endopeptidase. As endopeptidases mostram atividade nossubstratos de peptídeos bloqueados no terminal NeC que são relevantes paraa especificidade da protease em questão.

Em uma forma de realização particular, a protease da invençãonão é ProD-subtilisina ou ProD-subtilisina carregada (Yabuta et al., J. Biol.Chem. 278: 15246-51, 2003). Em uma outra forma de realização particular aprotease da invenção não é uma subtilisina de Bacillus subtilis do tiposelvagem e/ou não é derivada de Bacillus subtilis.

Conseqüentemente, em um primeiro aspecto, a protease dainvenção é selecionada do grupo que consiste de: (a) proteases pertencentesao grupo de enzima EC 3.4.-.-; (b) serina proteases; (c) subtilisina proteasesde peptidase Clã SB; e (d) subtilisina proteases da Família S8.

Em um segundo aspecto, a protease da invenção é derivada deum microorganismo, por exemplo de um fungo ou de uma bactéria. Osexemplos de bactérias são cepas de Bacillus, tais como cepas de Bacillusalkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus clausii,Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus,Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus mesentericus, Bacillusnatto, Bacillus pumilus, Bacillus sp., Bacillus stearothermophilus, Bacillussubtilis, Bacillus subtilis var natto ou Bacillus thuringiensis; em particularcepas de Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus clausii, Bacillus lentus, Bacilluslicheniformis, Bacillus mesentericus, Bacillus natto, Bacillus pumilus,Bacillus sp., Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis ou Bacillus subtilisvar natto·, preferivelmente uma cepa de Bacillus licheniformis. Nestecontexto, o termo "derivada de" inclui enzimas obteníveis ou obtida, de cepasdo tipo selvagem; assim como, preferivelmente, variantes destas tendo pelomenos uma substituição, inserção e/ou deleção de pelo menos um resíduo deaminoácido. O termo variante também inclui shujflants, híbridos, enzimasquiméricas e enzimas de consenso. As variantes podem ter sido produzidaspor qualquer método conhecido na técnica, tais como mutagênese direcionadaao sítio, mutagênese aleatória, processos de derivação de consenso (EP897985) e embaralhamento de gene (WO 95/22625, WO 96/00343), etc.

Os seguintes são exemplos de proteases da invenção derivadasde cepas de Bacillus e relacionadas com a protease dos aminoácidos de 1 a274 da SEQ ID NO: 2: Swissprot subtbacli acesso n° P00780 (derivada deBacillus lieheniformis, aminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 5); Swissprotsubn_bacna acesso η2 P35835 (derivada de Bacillus natto, aminoácidos de 1 a275 da SEQ ID NO: 6); Swissprot subt_bacpu acesso η2 P07518 (derivada deBacillus pumilus, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ED NO: 7); Swissprotsubt_bacsu acesso η2 P04189 (derivada de Bacillus subtilis, aminoácidos de 1a 275 da SEQ ID NO: 8); Swissprot subt_bacst acesso n2 P29142 (derivada deBacillus stearothermophilus, aminoácidos 1275 da SEQ ID NO: 9); Swissprotsubt_bacam acesso η2 P00782 (derivada de Bacillus amyloliquefaeiens,aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 10); Swissprot subs_bacle acesso n2P29600 (derivada de Bacillus lentus, aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO:11); Swissprot elya baccs acesso η2 P41362 (derivada de Bacillus elausii,aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 12); e Swissprot elya_bacya acessoη2 P20724 (derivada de Bacillus sp., aminoácidos de 1 a 268 da SEQ ID NO:13); assim como variantes destes, como definido acima.

Os exemplos particulares adicionais de proteases da invençãosão as proteases contidas nos seguintes produtos comerciais: Purafect MA,Purafect, Purafect Ox (variante M222S), Purafect Prime (Y217L), Properase(S87N + SlOlG + V104N), FN3 (N76D + S103A + V1041), FN4 (S101G +S103A + V1041 + GÍ59D + A232V + Q236H + Q245R + N248D + N252K)- todos preferivelmente variantes da parte madura da SEQ ID NO: 10 ecomercialmente disponível da Genencor/Danisco; Blap (a parte madura daSEQ ID NO: 11 com S99D + S101 R + S103A + V1041 + G160S), BLAPR(Blap com S3T + V4I + V199M + V2051 + L217D) e BLAP X (Blap comS3T + V41 + V2051) - todos de Henkel/Kemira; e KAP (A230V + S256G +S259N) de Kao.

Em um terceiro aspecto, a protease da invenção é ou pode serobservada como, uma variante da protease da SEQ ID NO: 2, isto é, a mesmacompreende pelo menos uma substituição, deleção e/ou inserção de um oumais aminoácidos dos aminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 2.Preferivelmente, as mudanças de aminoácido são de uma natureza menor, quesão substituições ou inserções de aminoácido conservativas que não afetamsignificantemente a dobra e/ou atividade da proteína; deleções pequenas;extensões de terminal amino ou carboxila pequenas, tais como um resíduo demetionina de terminal amino; um peptídeo ligador pequeno; ou uma extensãopequena que facilite a purificação pela mudança da carga líquida ou umaoutra função, tal como um trato de poli-histidina, um epítopo antigênico ouum domínio de ligação. Neste contexto, o termo "pequeno"independentemente designa vários até 25 resíduos de aminoácido. Em formasde realização preferidas, o termo "pequeno" independentemente designa até24, 23, 22, 21 ou até 20 resíduos de aminoácido. Em formas de realizaçãoadicionais preferidas, o termo "pequeno" independentemente designa até 19,18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 ou até 10 resíduos de aminoácido. Em outrasformas de realização preferidas, o termo "pequeno" independentementedesigna até 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou até 1 resíduo de aminoácido. Em formas derealização alternativas, o termo "pequeno" independentemente designa até 40,39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27 ou até 26 resíduos deaminoácido.

Os exemplos de substituições conservativas estão dentro dogrupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidosácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (serina,treonina, glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina,isoleucina, valina e alanina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofanoe tirosina) e aminoácidos pequenos (glicina, alanina, prolina, serina, treonina,cisteína e metionina).

Na alternativa, exemplos de substituições conservativas estãodentro do grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina),aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares(glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina evalina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina) eaminoácidos pequenos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). Assubstituições de aminoácido que no geral não alteram a atividade específicasão conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, Em, The Proteins, Academic Press, Nova Iorque. As mudançasque ocorrem mais habitualmente são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser,Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Vai, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg,Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Vai, Ala/Glu e Asp/Gly.

As variantes preferidas de qualquer uma das partes da proteasemadura das SEQ ID NOs: 5 a 13, tais como, por exemplo, aminoácidos de 1 a268 da SEQ ID NO: 13, compreendem pelo menos uma substituição, deleçãoe/ou inserção de um ou mais aminoácidos (quando comparada com a enzimaprecursora ou ancestral, a enzima tal como, por exemplo, os aminoácidos de 1a 268 da SEQ ID NO: 13), como explicado acima para as variantes deaminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 2. Mais preferivelmente estasvariantes são com substituições de aminoácido conservativas ou inserções,pequenas deleções, pequenos ligadores ou com pequenas extensões, comotambém explicado em detalhes acima para as variantes de aminoácidos de 1 a274 da SEQ ID NO: 2. Um exemplo específico de uma variante de proteaseda invenção é a variante 99aE da SEQ ID NO: 11 (ver Exemplo 4).

Em um quarto aspecto, a protease da invenção tem umaseqüência de aminoácido que difere em não mais do que 25, 24, 23, 22, 21,20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 ou não mais do que 11 aminoácidos dosaminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 2; ou, a mesma difere dosaminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 2 em não mais do que 10, 9, 8, 7, 6,5, 4, 3, 2 ou em não mais do que 1 aminoácido. Em formas de realizaçãoalternativas, a protease da invenção tem uma seqüência de aminoácido quedifere em não mais do que 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27ou não mais do que 26 aminoácidos dos aminoácidos de 1 a 274 da SEQ IDNO: 2.

As variantes preferidas de qualquer uma das partes da proteasemadura das SEQ ID NOs: 5 a 13, tais como, por exemplo, os aminoácidos de1 a 275 da SEQ ID NO: 7, têm uma seqüência de aminoácido que difere emnão mais do que 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 ou nãomais do que 11 aminoácidos das partes maduras de qualquer uma das SEQ IDNOs: 5 a 13, tais como, por exemplo, os aminoácidos de 1 a 275 da SEQ IDNO: 7; ou, a mesma difere das partes maduras de qualquer uma das SEQ IDNOs: 5 a 13, tais como, por exemplo, os aminoácidos de 1 a 275 da SEQ IDNO: 7, em não mais do que 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou em não mais do que 1aminoácido.

Em um quinto aspecto, a protease da invenção é uma variantealélica da SEQ ID NO: 2 (preferivelmente uma variante alélica da partemadura desta), uma variante alélica de qualquer uma das SEQ ID NOs. 5 a 13(preferivelmente uma variante alélica de qualquer uma das partes madurasdestas) ou um fragmento de qualquer uma destas que tenha atividade deprotease. O termo variante alélica denota qualquer uma de duas ou mais dasformas alternativas de um gene que ocupa os mesmos locais cromossômicos.

A variação alélica surge naturalmente através da mutação e pode resultar empolimorfismo dentro das populações. As mutações de gene podem sersilenciosas (nenhuma mudança no polipeptídeo codificado) ou podemcodificar polipeptídeos tendo seqüências de aminoácido alteradas. Umavariante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por umavariante alélica de um gene. O termo fragmento é aqui definido como umpolipeptídeo tendo um ou mais aminoácidos deletados do terminal amino e/oucarboxila dos aminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 2, ou, do terminalamino e/ou carboxila de qualquer uma das SEQ ID NOs: 5 a 13,preferivelmente das partes maduras destes. Preferivelmente, um pequenonúmero de aminoácidos foi deletado, pequeno sendo definido como explicadoacima. Mais preferivelmente, um fragmento contém pelo menos 244, 245,246, 247, 248, 249 ou pelo menos 250 resíduos de aminoácido. O maispreferivelmente, um fragmento contém pelo menos 251, 252, 253, 254, 255,256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270,271, 272 ou pelo menos 273 resíduos de aminoácido.

Em resumo, uma forma de realização da presente invenção dizrespeito a uma protease para uso farmacêutico, em que a) a proteasecompreende uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo que consistedos aminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 2, aminoácidos de 1 a 274 daSEQ ID NO: 5, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 6, aminoácidos de 1a 275 da SEQ ID NO: 7, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 8,aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 9, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ IDNO: 10, aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 11, aminoácidos de 1 a 269da SEQ ID NO: 12 e aminoácidos de 1 a 268 da SEQ ID NO: 13; e/ou b) aprotease é uma variante de uma seqüência de aminoácido selecionada dogrupo que consiste dos aminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 2,aminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 5, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ IDNO: 6, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 7, aminoácidos de 1 a 275 daSEQ ID NO: 8, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 9, aminoácidos de 1a 275 da SEQ ID NO: 10, aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 11,aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 12 e aminoácidos de 1 a 268 da SEQID NO: 13, em que a variante difere da respectiva seqüência de aminoácidoem não mais do que vinte e cinco aminoácidos e em que: (i) a variantecompreende pelo menos uma substituição, deleção e/ou inserção de um oumais aminoácidos quando comparada com a respectiva seqüência deaminoácido; e/ou (ii) a variante compreende pelo menos uma deleção pequenaquando comparada com a respectiva seqüência de aminoácido; e/ou (iii) avariante compreende pelo menos uma pequena Extensão de terminal N ou Cquando comparada com a respectiva seqüência de aminoácido; e/ou c) aprotease é uma variante alélica de uma protease tendo os aminoácidosselecionados do grupo que consiste dos aminoácidos de 1 a 274 da SEQ IDNO: 2, aminoácidos de I a 274 da SEQ ID NO: 5, aminoácidos de 1 a 275 daSEQ ID NO: 6, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 7, aminoácidos de 1a 275 da SEQ ID NO: 8, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 9,aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 10, aminoácidos de 1 a 269 da SEQID NO: 11, aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 12 e aminoácidos de 1 a268 da SEQ ID NO: 13; e/ou d) a protease é um fragmento de uma proteasetendo os aminoácidos selecionados do grupo que consiste dos aminoácidos de1 a 274 da SEQ ID NO: 2, aminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 5,aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 6, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ IDNO: 7, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 8, aminoácidos de 1 a 275 daSEQ ID NO: 9, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 10, aminoácidos de 1a 269 da SEQ ID NO: 11, aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 12 eaminoácidos de 1 a 268 da SEQ ID NO: 13.

Em particular, a presente invenção diz respeito a uma proteasepara uso farmacêutico, em que a protease tem uma seqüência de aminoácidoselecionada do grupo que consiste dos aminoácidos de 1 a 274 da SEQ IDNO: 2, aminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 5, aminoácidos de 1 a 275 daSEQ ID NO: 6, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 7, aminoácidos de 1a 275 da SEQ ID NO: 8, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 9,aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 10, aminoácidos de 1 a 269 da SEQID NO: 11, aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 12 e aminoácidos de 1 a268 da SEQ ID NO: 13.

Em uma outra forma de realização particular, a protease dainvenção pode ser usada em combinação com uma protease adicional. Osexemplos de proteases adicionais são as proteases de mamífero e as proteasesmicrobianas. Uma protease de mamífero preferida é o extrato de pâncreas, porexemplo, de suíno ou boi, tal como pancreatina. A pancreatina pode ser usadana forma de um produto não revestido (bruto) ou na forma de um produtoformulado (revestimento entérico (para fornecer resistência contra ácidogástrico) ou não funcionalmente revestido (revestido, mas não para fornecerresistência contra ácido gástrico)). A pancreatina potencialmente compreendeainda outros constituintes ativos enzimáticos como a lipase pancreática, BSSL(Lipase estimulada pelo sal biliar) e/ou amilase pancreática. As proteasesmicrobianas preferidas derivam de cepas baterianas ou fungicas, por exemplode uma cepa de Aspergillus, tal como Aspergillus oryzae ou Aspergillusmelleus, em particular o produto Prozyme 6® (protease alcalina neutra EC3.4.21.63) que é comercialmente disponível da Amano Pharmaceuticals,Japão.

Opcionalmente, a protease da invenção é usada emcombinação com uma lipase, com ou sem e amilase, como explicado maisabaixo.

No presente contexto, uma lipase significa uma hidrolase deéster carboxílico EC 3.1.1.-, que inclui atividades tais como EC 3.1.1.3triacilglicerol lipase, EC 3.1.1.4 fosfolipase Al, EC 3.1.1.5 lisofosfolipase,EC 3.1.1.26 galactolipase, EC 3.1.1.32 fosfolipase Al, EC 3.1.1.73 feruloilesterase. Em uma forma de realização particular, a lipase é uma triacilglicerollipase EC 3.1.1.3.

Em formas de realização particulares, a lipase é uma lipase demamífero, por exemplo extrato de pâncreas de suíno ou boi, tal comopancreatina. A pancreatina pode ser usada na forma de um produto nãorevestido (bruto) ou na forma de um produto formulado (revestimentoentérico ou não funcionalmente revestido, como definido acima). Apancreatina potencialmente compreende ainda outros constituintesenzimáticos ativos como protease pancreática, BSSL (Lipase estimulada pelosal biliar) e/ou amilase pancreática. A lipase também pode ser uma lipasemicrobiana, por exemplo derivada de cepas baterianas ou fungicas, tais comoBaeillus, Pseudomonas, Aspergillus ou Rhizopus. A lipase em particular podeser derivada de uma cepa de Rhizopus, tais como Rhizopus javanicus,Rhizopus oryzae ou Rhizopus delemar, por exemplo o produto Lipase DAmano 2000® (também designado Lipase D2®) que é comercialmentedisponível da Amano Pharmaceuticals, Japão.

Em outras formas de realização particulares, a lipase é umalipase microbiana recombinantemente produzida, por exemplo derivada deum fungo tal como Humicola ou Rhizomucor, de uma levedura tal comoCandida ou de uma bactéria tal como Pseudomonas. Em uma forma derealização preferida, a lipase é derivada de uma cepa de Humieola lanuginosaou Rhizomueor miehei.

A lipase de Humieola lanuginosa (sinônimo Thermomyeeslanuginosus) (SEQ ID NO: 14) está descrita na EP 305216 e as variantes delipase particulares estão descritas, por exemplo, na WO 92/05249, WO92/19726, WO 94/25577, WO 95/22615, WO 97/04079, WO 97/07202, WO99/42566, WO 00/32758, WO 00/60063, WO 01/83770, WO 02/055679 eWO 02/066622. Uma variante de lipase de Humieola lanuginosa preferida éuma lipase que compreende os aminoácidos de 1 a 269 ou de 2 a 269, da SEQID NO: 15, tais como os seguintes: (i) aminoácidos +1 a +269 da SEQ IDNO: 15, (ii) aminoácidos -5 a +269 da SEQ ID NO: 15, (iii) aminoácidos -4 a+269 da SEQ ID NO: 15; (iv) aminoácidos -3 a +269 da SEQ ID NO: 15; (v)aminoácidos -2 a +269 da SEQ ID NO: 15; (vi) aminoácidos -Ia +269 daSEQ ID NO: 15, (vii) aminoácidos +2 a +269 da SEQ ID NO: 15, assim como(viii) qualquer mistura de duas ou mais das lipases de (i) a (vii) - assim comovariantes destas. Em uma forma de realização particular, a lipase éselecionada das lipases de (i), (ii) e qualquer mistura de (i) e (ii). As misturaspreferidas de (i) e (ii) compreendem pelo menos 5%, preferivelmente pelomenos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou pelo menos95% da lipase (i), as porcentagens sendo determinadas pelo seqüenciamentode terminal N usando o método de Edman, como descrito no Exemplo 5 dopedido PCT que reivindica prioridade do pedido de patente DK 2005 00929).

Outras misturas preferidas são: (a) composições que compreendem de 35 a75%, preferivelmente de 40 a 70%, mais preferivelmente de 45 a 65% dalipase (ii); (b) composições que compreendem de 20 a 60%, preferivelmentede 25 a 55%, mais preferivelmente de 30 a 50%, o mais preferivelmente de 35a 47% da lipase (i); (c) composições que compreendem até 30%,preferivelmente até 25%, mais preferivelmente até 20%, o maispreferivelmente até 16% da lipase (vii); e (d) qualquer combinação de (a), (b)e/ou (c), tal como uma composição que compreende de 45 a 65% da lipase(ii), de 35 a 47% da lipase (i) e até 16% da lipase (vii).

As lipases das SEQ ID NOs: 14 e 15, por exemplo, podem serpreparadas como descrito na patente US n° 5.869.438 (a SEQ ID NO: 1 napatente US aludida é uma seqüência de DNA que codifica a lipase da SEQ IDNO: 14). A lipase da SEQ ID NO: 15, por exemplo, pode ser preparada pelaexpressão recombinante em uma célula hospedeira adequada de umaseqüência de DNA que é uma modificação da SEQ ID NO:l da patente US, amodificação refletindo as diferenças de aminoácido entre as SEQ ID NOs: 14e 15 aqui. Tais modificações podem ser feitas pela mutagênese direcionada aosítio, como é conhecido na técnica.

Ainda outros exemplos de lipases fungicas são a cutinase deHumicola insolens que é descrita na EP 785994 e a fosfolipase de Fusariumoxysporum que é descrita na EP 869167. Os exemplos de lipases de levedurasão as lipases A e B de Candida antarctica das quais a lipase A é descrita naEP 652945 e a lipase B é descrita, por exemplo, por Uppenberg et al emStructure, 2 (1994), 293. Um exemplo de uma lipase bacteriana é a lipasederivada de Pseudomonas cepacia, que é descrita na EP 214761.Em uma forma de realização preferida, a lipase é pelo menos70% idêntica à lipase da SEQ ID NO: 15, preferivelmente os aminoácidos de1 a 269 desta. Em formas de realização adicionais preferidas, o grau deidentidade com a SEQ ID NO: 15, preferivelmente os aminoácidos de 1 a 269desta, é pelo menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%,81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%,94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou pelo menos 99%. Em formas de realizaçãoalternativas, o grau de identidade com a SEQ ID NO: 15, preferivelmente osaminoácidos de 1 a 269 desta, é pelo menos cerca de 50%, 51%, 52%, 53%,54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%,67%, 68% ou pelo menos 69%.

Ainda em uma outra forma de realização preferida, a lipase,como a lipase de mamífero pancreática, é uma lipase específica da posição1,3.

Opcionalmente, a protease da invenção, com ou sem umalipase como descrito acima, é usada em combinação com uma amilase.

No presente contexto, uma amilase é uma enzima que catalisaa endo-hidrólise de amido e outros oligo- e polissacarídeos lineares eramificados. A parte da amilose de amido é rica em ligações 1,4-alfa-glicosídicas, enquanto que a parte de amilopectina é mais ramificadacontendo não apenas 1,4-alfa mas também ligações 1,6-alfa-glicosídicas. Emuma forma de realização particular, a amilase é uma enzima pertencente aogrupo EC 3.2.1.1.

Em formas de realização particulares, a amilase é uma amilasede mamífero, por exemplo extrato de pâncreas de suíno ou boi, tais comopancreatina. A pancreatina pode ser usada na forma de um produto nãorevestido (bruto) ou na forma de um produto formulado (revestimentoentérico ou não funcionalmente revestido, como definido acima). Apancreatina potencialmente compreende ainda outros constituintes ativosenzimáticos como protease pancreática, BSSL e/ou lipase pancreática. Aamilase também pode ser uma amilase microbiana, por exemplo derivada decepas baterianas ou fungicas, tais como Bacillus, Pseudomonasi Aspergillusou Rhizopus.

A amilase em particular pode ser derivada de uma cepa deAspergillus, tal como Aspergillus niger, Aspergillus oryzae ou Aspergillusmelleus, por exemplo cada um dos produtos Amilase Al™ derivado deAspergillus oryzae que é comercialmente disponível da AmanoPharmaceuticals, Japão ou Amilase EC® derivada de Aspergillus melleus queé comercialmente disponível da Extract-Chemie, Alemanha.

Outros exemplos de amilases fungicas são a amilase deAspergillus niger (SWISSPROT P56271), que também é descrita no Exemplo3 da WO 89/01969 e a amilase de Aspergillus oryzae. Os exemplos devariantes da amilase de Aspergillus oryzae são descritos na WO 01/34784.

A alfa-amilase derivada de Bacillus licheniformis é umexemplo de uma alfa-amilase bacteriana. Esta amilase é, por exemplo,descrita na WO 99/19467, junto com outras alfa-amilases bacterianashomólogas derivadas, por exemplo, de Bacillus amiloliquefaciens e Bacillusstearothermophilus, assim como variantes destas. Os exemplos de variantesde amilase adicionais são aqueles descritos na patente US n° 4.933.279; EP722490 e EP 904360.

As amilases preferidas são uma amilase que compreende osaminoácidos de 1 a 481 da SEQ ID NO: 16 (tais como os aminoácidos de 1 a481, 1 a 484 ou 1 a 486 desta), os aminoácidos de 1 a 481 da SEQ ID NO: 17e/ou os aminoácidos de 1 a 483 da SEQ ID NO: 18. Em uma forma derealização preferida, a amilase é pelo menos 70% idêntica a cada um de (i)aminoácidos de 1 a 481 da SEQ ID NO: 16, (ii) aminoácidos de 1 a 481 daSEQ ID NO: 17 e/ou (iii) aminoácidos de 1 a 483 da SEQ ID NO: 18. Asamilases das SEQ ID NOs: 16 a 18, por exemplo, podem ser preparadas comodescrito no pedido DK co-pendente n° 2005 00931 intitulado "Amylases forPharmaceutical Uses" e depositado em 24 de junho de 2005 pela SolvayPharmaceuticals GmbH e Novozymes A/S.

Em formas de realização adicionais preferidas de cada um de(i), (ii) ou (iii), os graus de identidade com as respectivas partes da SEQ IDNO: 16, 17 ou 18 é de pelo menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%,78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%,91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou pelo menos 99%. Em formasde realização alternativas, o grau de identidade com as respectivas partes daSEQ ID NO: 16, 17 ou 18 é de pelo menos cerca de 50%, 51%, 52%, 53%,54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%,67%, 68% ou pelo menos 69%.

Para os propósitos da presente invenção, as combinações particularmente preferidas de enzimas são as seguintes: (i) A protease dosaminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 2 em combinação com uma lipaseque compreende os aminoácidos de 1 a 269 ou de 2 a 269, da SEQ ID NO:15; (ii) a protease dos aminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 2 emcombinação com uma amilase que compreende os aminoácidos de 1 a 481 daSEQ ID NO: 16 (tais como os aminoácidos de 1 a 481, 1 a 484 ou 1 a 486desta); (iii) a protease dos aminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 2 emcombinação com a amilase tendo os aminoácidos de 1 a 481 da SEQ ID NO:17; (iv) a protease dos aminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 2 emcombinação com a amilase tendo os aminoácidos de 1 a 483 da SEQ ID NO:18; (v) a protease dos aminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 2 emcombinação com uma amilase que compreende os aminoácidos de 1 a 481 daSEQ ID NO: 16 (tais como os aminoácidos de 1 a 481, 1 a 484 ou 1 a 486desta) e uma lipase que compreende os aminoácidos de 1 a 269 ou de 2 a 269,da SEQ ID NO: 15; (vi) a protease dos aminoácidos de 1 a 274 da SEQ IDNO: 2 em combinação com a amilase tendo os aminoácidos de 1 a 481 daSEQ ID NO: 17 e uma lipase que compreende os aminoácidos de 1 a 269 oude 2 a 269, da SEQ ID NO: 15; e (vii) a protease dos aminoácidos de 1 a 274da SEQ ID NO: 2 em combinação com a amilase tendo os aminoácidos de 1 a483 da SEQ ID NO: 18 e uma lipase que compreende os aminoácidos de 1 a269 ou de 2 a 269, da SEQ ID NO: 15.

Conseqüentemente, uma forma de realização da presenteinvenção diz respeito a uma protease em combinação com uma lipase e/ouuma amilase para uso farmacêutico, em que (i) a protease é uma proteasecomo aqui definida; (ii) a lipase compreende os aminoácidos de 2 a 269 daSEQ ID NO: 15; e (iii) a amilase é uma amilase selecionada do grupo queconsiste de: a) uma amilase que compreende os aminoácidos de 1 a 481 daSEQ ID NO: 16, b) uma amilase tendo os aminoácidos de 1 a 481 da SEQ IDNO: 17 e c) uma amilase tendo os aminoácidos de 1 a 483 da SEQ ID NO: 18.

Em particular, a presente invenção diz respeito a uma proteaseem combinação com uma lipase e/ou uma amilase para uso farmacêutico, emque (i) a protease compreende ou preferivelmente é ou tem, os aminoácidosde 1 a 274 da SEQ ID NO: 2; (ii) a lipase compreende os aminoácidos de 2 a269 da SEQ ID NO: 15; e (iii) a amilase é uma amilase selecionada do grupoque consiste de: a) uma amilase que compreende os aminoácidos de 1 a 481da SEQ ID NO: 16, b) uma amilase tendo os aminoácidos de 1 a 481 da SEQID NO: 17 e c) uma amilase tendo os aminoácidos de 1 a 483 da SEQ ID NO: 18.

Outras combinações preferidas de enzimas são as seguintes: (i)Uma protease tendo pelo menos 50% de identidade com os aminoácidos de 1a 274 da SEQ ID NO: 2 em combinação com uma lipase tendo pelo menos50% de identidade com os aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 15; (ii)uma protease tendo pelo menos 50% de identidade com os aminoácidos de 1 a274 da SEQ ID NO: 2 em combinação com uma amilase tendo pelo menos50% de identidade com os aminoácidos de 1 a 481 da SEQ ID NO: 16; (iii)uma protease tendo pelo menos 50% de identidade com os aminoácidos de 1 a274 da SEQ ID NO: 2 em combinação com uma amilase tendo pelo menos50% de identidade com os aminoácidos de 1 a 481 da SEQ ID NO: 17; (iv)uma protease tendo pelo menos 50% de identidade com os aminoácidos de 1 a274 da SEQ ID NO: 2 em combinação com uma amilase tendo pelo menos50% de identidade com os aminoácidos de 1 a 483 da SEQ ID NO: 18; (v)uma protease tendo pelo menos 50% de identidade com os aminoácidos de 1 a274 da SEQ ID NO: 2 em combinação com uma amilase tendo pelo menos50% de identidade com os aminoácidos de 1 a 481 da SEQ ID NO: 16 e umalipase tendo pelo menos 50% de identidade com os aminoácidos de 1 a 269 daSEQ ID NO: 15; (vi) uma protease tendo 50% de identidade com osaminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 2 em combinação com uma amilasetendo pelo menos 50% de identidade com os aminoácidos de 1 a 481 da SEQID NO: 17 e uma lipase tendo pelo menos 50% de identidade com osaminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 15; e (vii) uma protease tendo pelomenos 50% de identidade com os aminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 2em combinação com uma amilase tendo pelo menos 50% de identidade comos aminoácidos de 1 a 483 da SEQ ID NO: 18 e uma lipase tendo pelo menos50% de identidade com os aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 15. Emformas de realização preferidas de (i) a (vii), cada grau de identidade é,independentemente, pelo menos 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%,58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%,71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%,84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%,97%, 98% ou pelo menos 99%.

Conseqüentemente, uma forma de realização da presenteinvenção diz respeito a uma protease em combinação com uma lipase e/ouuma amilase para uso farmacêutico, em que (i) a protease é selecionada dogrupo de a) uma protease tendo pelo menos 50% de identidade com osaminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 2; b) uma protease que compreendeuma seqüência de aminoácido selecionada do grupo que consiste dosaminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 2, aminoácidos de 1 a 274 da SEQ IDNO: 5, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 6, aminoácidos de 1 a 275 daSEQ ID NO: 7, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 8, aminoácidos de 1a 275 da SEQ ID NO: 9, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 10,aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 11, aminoácidos de 1 a 269 da SEQID NO: 12 e aminoácidos de 1 a 268 da SEQ ID NO: 13; c) uma proteasesendo uma variante de uma seqüência de aminoácido selecionada do grupoque consiste dos aminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 2, aminoácidos de 1a 274 da SEQ ID NO: 5, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 6,aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 7, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ IDNO: 8, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 9, aminoácidos de 1 a 275 daSEQ ID NO: 10, aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 11, aminoácidos de1 a 269 da SEQ ID NO: 12 e aminoácidos de 1 a 268 da SEQ ID NO: 13, emque a variante difere da respectiva seqüência de aminoácido em não mais doque vinte e cinco aminoácidos e em que: (i) a variante compreende pelomenos uma substituição, deleção e/ou inserção de um ou mais aminoácidosquando comparada com a respectiva seqüência de aminoácido; e/ou (ii) avariante compreende pelo menos uma deleção pequena quando comparadacom a respectiva seqüência de aminoácido; e/ou (iii) a variante compreendepelo menos uma pequena extensão de terminal N ou C quando comparadacom a respectiva seqüência de aminoácido; d) uma protease sendo umavariante alélica de uma protease tendo os aminoácidos selecionados do grupoque consiste dos aminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 2, aminoácidos de 1a 274 da SEQ ID NO: 5, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 6,aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 7, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ IDNO: 8, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 9, aminoácidos de 1 a 275 daSEQ ID NO: 10, aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 11, aminoácidos de1 a 269 da SEQ ID NO: 12 e aminoácidos de 1 a 268 da SEQ ID NO: 13; e)uma protease sendo um fragmento de uma protease tendo os aminoácidosselecionados do grupo que consiste dos aminoácidos de 1 a 274 da SEQ IDNO: 2, aminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 5, aminoácidos de 1 a 275 daSEQ ID NO: 6, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 7, aminoácidos de 1a 275 da SEQ ID NO: 8, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 9,aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 10, aminoácidos de 1 a 269 da SEQID NO: 11, aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ED NO: 12 e aminoácidos de 1 a268 da SEQ ID NO: 13; e f) uma protease tendo uma seqüência deaminoácido selecionada do grupo que consiste dos aminoácidos de 1 a 274 daSEQ ID NO: 2, aminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 5, aminoácidos de 1a 275 da SEQ ID NO: 6, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 7,aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 8, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ IDNO: 9, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 10, aminoácidos de 1 a 269da SEQ ID NO: 11, aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 12 eaminoácidos de 1 a 268 da SEQID NO: 13; (ii) a lipase tem pelo menos 70%de identidade com uma lipase tendo os aminoácidos de 1 a 269 da SEQ IDNO: 15; e (iii) a amilase tem pelo menos 70% de identidade com uma amilaseselecionada do grupo que consiste de: a) uma amilase tendo os aminoácidosde 1 a 481 da SEQ LD NO: 16, b) uma amilase tendo os aminoácidos de 1 a481 da SEQ ID NO: 17 e c) uma amilase tendo os aminoácidos de 1 a 483 daSEQ ID NO: 18.

No geral, as enzimas de protease, lipase e amilase (daqui emdiante "a(s) enzima(s)," a saber as enzimas da invenção) podem ser enzimasnaturais ou do tipo selvagem (obtidas de animais, em particular mamíferos,por exemplo enzimas humanas ou de suíno; de plantas ou demicroorganismos), mas também quaisquer mutantes, variantes, fragmentosetc. destas que exibam a atividade enzimática desejada, assim como enzimassintéticas, tais como enzimas misturadas, híbridas ou enzimas quiméricas eenzimas de consenso.

Em uma forma de realização específica, a(s) enzima(s) sãovariantes alergênicas baixas, planejadas para invocar uma respostaimunológica reduzida quando expostas aos animais, incluindo o ser humano.

O termo resposta imunológica deve ser entendida como qualquer reação pelosistema imune de um animal exposto à(s) enzima(s). Um tipo de respostaimunológica é uma resposta alérgica que leva aos níveis aumentados de IgEno animal exposto. As variantes alergênicas baixas podem ser preparadasusando técnicas conhecidas no ramo. Por exemplo a(s) enzima(s) pode(m) serconjugada(s) com porções que protegem as partes poliméricas ou epítoposda(s) enzima(s) envolvida(s) em um resposta imunológica. A conjugação compolímeros pode envolver ligação química in vitro de polímero com a(s)enzima(s), por exemplo como descrito na WO 96/17929, WO 98/30682, WO98/35026 e/ou WO 99/00489. A conjugação pode além disso oualternativamente a isto envolver a ligação in vivo de polímeros à(s) enzima(s).Tal conjugação pode ser obtida pelo engenheiramento genético da seqüênciade nucleotídeo que codifica a(s) enzima(s), inserção das seqüências deconsenso que codificam sítios de glicosilação adicionais na(s) enzima(s) eexpressão da(s) enzima(s) em um hospedeiro capaz de glicosilar a(s)enzima(s), ver por exemplo a WO 00/26354. Um outro modo de fornecervariantes alergênicas baixas é o engenheiramento genético da seqüência denucleotídeo que codifica a(s) enzima(s) de modo a fazer com que as enzimasse auto-oligomerizem, no sentido de que os monômeros de enzima possamproteger os epítopos de outros monômeros de enzima e diminuindo destemodo a antigenicidade dos oligômeros. Tais produtos e a sua preparação édescrita por exemplo na WO 96/16177. Os epítopos envolvidos em umaresposta imunológica podem ser identificados por vários métodos tais como ométodo da demonstração de fago descritos na WO 00/26230 e WO 01/83559ou o método aleatório descrito na EP 561907. Uma vez que um epítopo tenhasido identificado, a sua seqüência de aminoácido pode ser alterada paraproduzir propriedades imunológicas alteradas da(s) enzima(s) pelas técnicasde manipulação de gene conhecidas tais como a mutagênese direcionada aosítio (ver por exemplo a WO 00/26230, WO 00/26354 e/ou WO 00/22103)e/ou a conjugação de um polímero pode ser feita em proximidade suficienteao epítopo para o polímero proteger o epítopo.

Em formas de realização particulares, a(s) enzima(s) são (i)estáveis no pH 2 a 8, preferivelmente também no pH 3 a 7, maispreferivelmente no pH 4 a 6; (ii) ativo no pH 4 a 9, preferivelmente 4 a 8; (iii)estáveis contra a degradação pela pepsina e outras proteases digestivas (taiscomo as proteases pancreáticas, isto é, principalmente tripsina equimiotripsina); e/ou (iv) estáveis e/ou ativos na presença de sais biliares.

Preferivelmente, a protease da invenção é estável ao ácido, oque significa que a enzima de protease pura permanece ativo mesmo depoisda exposição continuada a um ambiente ácido. Preferivelmente, a atividaderemanescente é um fator 1,1, 1,2, 1,3, 1,5, 1,6, 1,8, 2,0, 2,5 e 3,0 mais alto doque a atividade remanescente de uma protease comparável já conhecida parapropósitos farmacêuticos.

Em outras formas de realização particulares, a estabilidade aoácido significa que a atividade de protease da enzima de protease pura, emuma diluição que corresponde a A280 = 1,0 e seguindo incubação por 2 horasa 37°C a seguir de tampão (100 mM de ácido succínico, 100 mM de HEPES,100 mM de CHES, 100 mM de CABS, 1 mM de CaCl2, 150 mM de KCl,0,01% de Triton® X-100, pH 3,5) é de pelo menos 40% (ou pelo menos 45,50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou pelo menos 97%) da atividade dereferência, como medido usando o ensaio descrito no Exemplo 2C da WO01/58276 (substrato: SucAAPF-pNA, pH 9,0, 25°C). O termo atividade dereferência refere-se à atividade de protease das mesmas protease, a seguir daincubação na forma pura, em uma diluição que corresponde a A280 = 1,0, por2 horas a 5°C a seguir tampão (100 mM de ácido succínico, 100 mM deHEPES, 100 mM de CHES, 100 mM de CABS, 1 mM de CaCl2, 150 mM deKCl, 0,01% de Triton® X-100, pH 9,0) em que a atividade é determinadacomo descrito acima. O termo A280 = 1,0 significa concentração (diluição)tal da dita protease pura que dê origem a uma absorção de 1,0 a 280 nm emuma cubeta de 1 cm de trajetória em relação a um branco de tampão. O termoprotease pura refere-se a uma amostra com uma razão de A280/A260 acimaou igual a 1,70 (ver o Exemplo 2E da WO 01/58276) e que por uma varredurade um gel de SDS-PAGE tingido com Coomassie é medido para ter pelomenos 95% de sua intensidade de varredura na faixa que corresponde à ditaprotease (ver o Exemplo 2A da WO 01/58276).

O termo "em combinação com" refere-se ao uso combinado deacordo com a invenção da protease, lipase e/ou amilase. O uso combinadopode ser simultâneo, sobreposto ou seqüencial, estes três termos sendo nogeral interpretado considerando-se a prescrição feita pelo médico.

O termo "simultâneo" refere-se às circunstâncias sob as quaisas enzimas são ativas ao mesmo tempo, por exemplo quando eles sãoadministrados ao mesmo tempo como um ou mais produtos farmacêuticosseparados ou se eles são administrados em uma e na mesma composiçãofarmacêutica.

O termo "seqüencial" refere-se a tais casos onde uma e/ouduas das enzimas estão atuando primeiro e a segunda e/ou terceira enzimasubseqüentemente. Uma ação seqüencial pode ser obtida pela administraçãodas enzimas em questão como formulações farmacêuticas separadas comintervalos desejados ou como uma composição farmacêutica em que asenzimas em questão são diferentemente formuladas (compartimentalizadas),por exemplo com uma vista para a obtenção de um tempo de liberaçãosubseqüente, fornecendo uma estabilidade de produto melhorada ou paraotimizar a dosagem da enzima.O termo "sobreposto" refere-se a tais casos onde os períodosde atividade da enzima não são nem completamente simultâneos nemcompletamente seqüenciais, isto é existe um certo período em que as enzimassão ambas ou todas, ativas.

O termo "um", por exemplo quando usada no contexto da(s)enzima(s) da invenção, significa pelo menos um. Em formas de realizaçãoparticulares, "um" significa "um ou mais," ou "pelo menos um", que maisuma vez significa um, dois, três, quatro, cinco, etc.

A relacionabilidade entre duas seqüências de aminoácido édescrita pelo parâmetro "identidade".

Para os propósitos da presente invenção, o alinhamento deduas seqüências de aminoácido é determinado usando-se o programa deNeedle do pacote EMBOSS (http://emboss.org) versão 2.8.0. O programa deNeedle implementa o algoritmo de alinhamento global descrito emNeedleman, S. B. e Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453. A matrizde substituição usada é BLOSUM62, penalidade de abertura de intervalo é 10e a penalidade de extensão de intervalo é 0,5.

O grau de identidade entre uma seqüência de aminoácido dapresente invenção ("seqüência da invenção"; por exemplo aminoácidos de 1 a274 da SEQ ID NO: 2) e uma seqüência de aminoácido diferente ("seqüênciaestranha"; por exemplo aminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 1 da WO2005/115445) é calculada como o número de emparelhamentos exatos em umalinhamento das duas seqüências, dividido pelo comprimento da "seqüênciada invenção" ou o comprimento da "seqüência estranha", seja qual for a maiscurta. O resultado é expressado na identidade percentual.

Um emparelhamento exato ocorre quando a "seqüência dainvenção" e a "seqüência estranha" têm resíduos de aminoácido idênticos nasmesmas posições da sobreposição (no exemplo de alinhamento abaixo isto érepresentado por "I"). O comprimento de uma seqüência é o número deresíduos de aminoácido na seqüência (por exemplo o comprimento da SEQID NO: 2 é 274).

No exemplo de alinhamento, puramente hipotético, abaixo, asobreposição é a seqüência de aminoácido "HTWGER-NL" da Seqüência 1;

ou a seqüência de aminoácido "HGWGEDANL" da Seqüência 2. No exemploum intervalo é indicado por um "-".

Exemplo de alinhamento hipotético:

<formula>formula see original document page 29</formula>

Conseqüentemente, a porcentagem de identidade da Seqüência1 para a Seqüência 2 é 6/12 = 0,5, que corresponde a 50%.

Em uma forma de realização particular, a porcentagem deidentidade de uma seqüência de aminoácido de um polipeptídeo com ou aos,aminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 2 é determinada por i) alinhando asduas seqüências de aminoácido usando o programa Needle, com a matriz desubstituição BLOSUM62, uma penalidade de abertura de intervalo de 10 euma penalidade de extensão de intervalo de 0,5; ii) contar o número deemparelhamentos exatos no alinhamento; iii) dividir o número deemparelhamentos exatos pelo comprimento da mais curta das duas seqüênciasde aminoácido e iv) converter o resultado da divisão de iii) em porcentagem.

Na alternativa, o grau de identidade entre duas seqüências deaminoácido pode ser determinado pelo programa "α/zgw" que é umalinhamento de Needleman-Wunsch (isto é, um alinhamento global). Asseqüências são alinhadas pelo programa, usando a matriz de contagem depadrão BLOSUM50. A penalidade para o primeiro resíduo de um intervalo é12 e para os outros resíduos de um intervalo as penalidades são 2. Oalgoritmo de Needleman-Wunsch é descrito em Needleman, S. B. e Wunsch,C. D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453 e o programa alignpor Myers e W. Miller em "Optimal Alignments in Linear Space" CABIOS(computer applications in the biosciences) (1988) 4: 11-17. iiAlign" é parte dopacote FASTA versão v20u6 (ver W. R. Pearson e D. J. Lipman (1988),"Improved Tools for Biological Seqüence Analysis", PNAS 85: 2444-2448 eW. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Seqüence Comparison withFASTP e FASTA," Methods in Enzymology 183: 63-98).

O grau de identidade entre uma amostra ou teste, a seqüênciade qualquer uma da(s) enzima(s) da invenção e uma seqüência especificadapode ser determinado como segue: As duas seqüências são alinhadas usando oprograma "align." O número de emparelhamentos perfeitos("Emparelhamentos perfeitos N") no alinhamento é determinado (umemparelhamento perfeito significa o mesmo resíduo de aminoácido na mesmaposição do alinhamento). O comprimento comum das duas seqüênciasalinhadas também é determinado, a saber o número total dos aminoácidos noalinhamento (a sobreposição), incluindo os intervalos de arrasto e carregadorcriado pelo alinhamento, se algum ("sobreposição Ν"). O grau de identidade écalculado como a razão entre "Emparelhamentos perfeitos N" e "sobreposiçãoN" (para a conversão de identidade percentual, multiplicar por 100).

O grau de identidade entre a seqüência de amostra ou de testee uma seqüência especificada também pode ser determinado como segue: Asseqüências são alinhadas usando o programa "align." O número deemparelhamentos perfeitos ("Emparelhamentos perfeitos N") no alinhamentoé determinado (um emparelhamento perfeito significa o mesmo resíduo deaminoácido na mesma posição do alinhamento). O comprimento da seqüênciade amostra (o número de resíduos de aminoácido) é determinado ("amostraΝ"). O grau de identidade é calculado como a razão entre "Emparelhamentosperfeitos N" e "amostra N" (para a conversão da, identidade percentual,multiplicar por 100).

O grau de identidade entre a seqüência de amostra ou teste euma seqüência especificada também pode ser determinada como segue: Asseqüências são alinhadas usando o programa "align." O número deemparelhamentos perfeitos ("Emparelhamentos perfeitos N") no alinhamentoé determinado (um emparelhamento perfeito significa o mesmo resíduo deaminoácido na mesma posição do alinhamento). O comprimento da seqüênciaespecificada (o número de resíduos de aminoácido) é determinado("especificado Ν"). O grau de identidade é calculado como a razão entre"Emparelhamentos perfeitos N" e "especificado N" (para a conversão deidentidade percentual, multiplicar por 100).

Preferivelmente5 a sobreposição é de pelo menos 20% daseqüência especificada ("sobreposição N" como definido acima, dividido pelonúmero dos aminoácidos na seqüência especificada ("especificado N") emultiplicado por 100), mais preferivelmente pelo menos 25%, 30%, 35%,40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou pelo menos95%. Isto significa que pelo menos 20% (preferivelmente 25 a 95%) dosaminoácidos da seqüência especificada encontram-se incluídos nasobreposição, quando a seqüência de amostra é alinhada com a seqüênciaespecificada.

Na alternativa, a sobreposição é de pelo menos 20% daseqüência especificada ("sobreposição N" como definido acima, dividido pela"amostra N" como definido acima e multiplicado por 100), maispreferivelmente pelo menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%,65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou pelo menos 95%. Isto significa que pelomenos 20% (preferivelmente 25 a 95%) dos aminoácidos da seqüência deamostra encontram-se incluídos na sobreposição, quando alinhados contra aseqüência especificada.

A atividade da(s) enzima(s) da invenção pode ser medidausando qualquer ensaio adequado. No geral, o pH do ensaio e a temperaturado ensaio podem ser adaptados à enzima em questão. Os exemplos de valoresde pH do ensaio são pH 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12. Os exemplos detemperaturas do ensaio são 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90 ou95°C. os valores de pH preferidos e as temperaturas estão na faixa fisiológica,tais como valores de pH de 4, 5, 6, 7 ou 8 e temperaturas de 30, 35, 37 ou 40°C.

Por exemplo, a atividade de protease pode ser medida usandoqualquer ensaio, em que um substrato é utilizado, que inclui ligaçõespeptídicas relevantes para a especificidade da protease em questão. Osexemplos de ensaios de enzima adequados são incluídos na parteexperimental, ver o Exemplo 2 em particular. Outros exemplos são os ensaiosda Ph. Eur. quanto à atividade de lipase e amilase

Medicamento

No presente contexto, o termo "medicamento" significa umcomposto ou mistura de compostos, que trata, previne e/ou alivia os sintomasda doença; preferivelmente que trata e/ou alivia os sintomas da doença. Omedicamento pode ser prescrito por um médico ou pode ser um produtovendido sem receita.

As composições farmacêuticas

A isolação, purificação e concentração da(s) enzima(s) dainvenção podem ser realizadas por meios convencionais. Por exemplo, elespodem ser recuperados a partir de um caldo de fermentação pelosprocedimentos convencionais incluindo, mas não limitado a, centrifugação,filtração, extração, secagem por pulverização, evaporação ou precipitação eainda purificados por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnicaincluindo, mas não limitado à, cromatografia (por exemplo, troca iônica,afinidade, hidrofóbica, cromatofocalização e exclusão de tamanho),procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focalização eletroforéticapreparativa), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação com sulfatode amônio), SDS-PAGE ou extração (ver, por exemplo, Protein Purification,J.-C. Janson e Lars Ryden, editores, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989).

A preparação de uma protease pura da invenção é descrita noExemplo 1 aqui. Neste exemplo, o gene que codifica a chamada componenteC protease (SEQ ID NO: 4, codificado pela SEQ ID NO: 3) foi deletado dacepa produtora do Bacillus licheniformis pela mutagênese direcionada aosítio, como é conhecido na técnica. Um outro método para a deleção destegene pode ser, por exemplo, a mutação clássica como descrita, por exemplo,na patente US n° 4.266.031, preferivelmente combinada com os métodos detriagem de alto rendimento do estado da técnica.

No Exemplo 1, a célula que expressa a protease da SEQ IDNO: 2 é derivada de uma cepa do tipo selvagem do Bacillus licheniformis, asaber a cepa ATCC 14580, que está publicamente disponível da AmericanType Culture Collection, ATCC. Pode ser preferível inserir uma ou maiscópias adicionais de um gene que codifica uma protease da invenção, porexemplo um gene que codifica os aminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 2,nesta célula. Isto pode ser feito, por exemplo, como descrito na WO02/00907, usando, por exemplo, um promotor divulgado na WO 99/43835.

Em uma forma de realização particular, preparações sólidas oulíquidas concentradas de cada uma das enzimas são preparadasseparadamente. Estes concentrados, pelo menos em parte, podem serseparadamente formulados, como explicado em mais detalhes abaixo.

Em uma outra forma de realização particular, a(s) enzima(s)é/são incorporada(s) nas composições farmacêuticas da invenção na forma deconcentrados sólidos. A(s) enzima(s) pode(m) ser levada(s) ao estado sólidopor vários métodos como é conhecido na técnica. Por exemplo, o estadosólido pode ser cristalino, onde as moléculas de enzima são dispostos em umaforma altamente ordenada ou um precipitado, onde as moléculas de enzimasão dispostas em uma forma menos ordenada ou desordenada.

A cristalização, por exemplo, pode ser realizada em um pHpróximo ao pi da(s) enzima(s) e em baixa condutividade, por exemplo 10mS/cm ou menos, como descrito na EP 691982.

Vários métodos de precipitação são conhecidos na técnica,incluindo a precipitação com sais, tais como sulfato de amônio e/ou sulfato desódio; com solventes orgânicos, tais como etanol e/ou isopropanol; ou compolímeros, tais como PEG (Poli Etileno Glicol). Na alternativa, a(s) enzima(s)podem ser precipitadas a partir de uma solução pela remoção do solvente(tipicamente água) pelos vários métodos conhecidos na técnica, por exemploliofilização, evaporação (por exemplo na pressão reduzida) e/ou secagem porpulverização.

Em uma outra forma de realização particular, o concentradosólido da(s) enzima(s) tem um teor de proteína de enzima ativa de pelo menos50% (p/p) por referência ao teor de proteína total do concentrado sólido.Ainda em outras formas de realização particulares, o teor de proteína deenzima ativa, em relação ao teor de proteína total do concentrado sólido é depelo menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ou pelo menos 95% (p/p). O teor deproteína pode ser medido como é conhecido na técnica, por exemplo pelavarredura densitométrica de géis de SDS-PAGE tingido com coomassie,usando-se um kit comercial, tal como o Ensaio de Proteína ESL, ordem n°1767003, que é comercialmente disponível da Roche ou com base no métododescrito no Exemplo 8 da WO 01/58276.

Preferivelmente, a proteína de enzima da protease constituipelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85,90, 92, 94, 95, 96 ou pelo menos 97% do espectro de proteína do concentradode protease sólida para o uso de acordo com a invenção, como medido pelavarredura densitométrica de um gel de SDS-PAGE tingido com coomassie.

Uma composição farmacêutica da invenção compreende a(s)enzima(s), preferivelmente na forma de preparações de enzima concentradas,mais preferivelmente concentrados sólidos, junto com pelo menos ummaterial auxiliar ou subsidiário farmaceuticamente aceitável, tal como (i) pelomenos um carregador e/ou excipiente; ou (ii) pelo menos um carregador,excipiente, diluente e/ou adjuvante. Os exemplos não limitantes de outrosingredientes opcional,, todos farmaceuticamente aceitáveis, sãodesintegradores, lubrificantes, agentes de tamponamento, agentes umectantes,conservantes, agentes flavorizantes, solventes, agentes de solubilização,agentes de suspensão, emulsificadores, estabilizadores, propelentes eveículos.

No geral, dependendo i.a. da indicação médica em questão, acomposição da invenção pode ser planejada para todas as maneiras deadministração conhecidas na técnica, preferivelmente incluindo aadministração enteral (através do canal alimentar). Assim, a composição podeestar nas formas sólida, semi-sólida, líquida ou gasosa, tais como tabletes,cápsulas, pós, grânulos, microesferas, ungüentos, cremes, espumas, soluções,supositório, injeções, inalantes, géis, microesferas, loções e aerossóis. Omédico saberá selecionar a via mais adequada de administração enaturalmente evitar as vias de administração potencialmente nocivas ou deoutro modo desvantajosa.

Os seguintes métodos e materiais auxiliares são portantotambém meramente exemplares e não são de nenhum modo limitantes.

Para as preparações sólidas orais. a(s) enzima(s) pode(m) serusada(s) sozinha(s) ou em combinação com aditivos apropriados para fabricarpelotas, micropelotas, tabletes, microtabletes, pós, grânulos ou cápsulas, porexemplo, com carregadores convencionais, tais como lactose, manitol, amidode milho ou amido de batata; com excipientes ou aglutinantes, tais comocelulose cristalina ou microcristalina, derivados de celulose, acácia, amido demilho ou gelatinas; com desintegradores, tais como amido de milho, amido debatata ou carboximetilcelulose sódica; com lubrificantes, tais como cera decarnaúba, cera branca, goma laca, sílica coloidal isenta de água, polietilenoglicol (PEGs, também conhecidos sob o termo macrogol) de 1500 a 20000,em particular PEG 4000, PEG 6000, PEG 8000, povidona, talco, mono-oleínaou estearato de magnésio; e se desejado, com diluentes, adjuvantes, agente detamponamento, agentes umidificadores, conservantes tais como metil-para-hidroxibenzoato (E218), agentes de coloração tais como dióxido de titânio(El71) e agentes flavorizantes tais como sacarose, sacarina, óleo de laranja,óleo de limão e vanilina. As preparações orais são exemplos de preparaçõespreferidas para o tratamento da indicação médica de PEI.

A(s) enzima(s), muito no geral, também podem ser formuladasem preparações orais líquidas, dissolvendo-as, colocando-as em suspensão ouemulsificando-as em um solvente aquoso tal como água ou em solventes nãoaquosos tais como vegetais ou outros óleos similares, glicerídeos de ácidoalifático sintéticos, ésteres de ácidos alifáticos superiores, propileno glicol,polietileno glicol tais como PEG 4000 ou álcoois inferiores tais como álcooisC1-C4 lineares ou ramificados, por exemplo 2-propanol; e se desejado, commateriais ou aditivos subsidiários convencionais tais como solubilizadores,adjuvantes, diluentes, agentes isotônicos, agentes de suspensão, agentesemulsificadores, estabilizantes e conservantes.

Além disso, a(s) enzima(s) no geral podem ser fabricadas emsupositório, para a administração retal misturando-se com uma variedade debases tais como bases emulsificantes ou bases solúveis em água. Osupositório pode incluir veículos tais como manteiga de cacau, carboceras epolietileno glicóis, que fundem na temperatura corporal, embora sejamsolidificadas na temperatura ambiente.

O uso de lipossomas. como um veículo de liberação é umoutro método de interesse geral possível. Os lipídeos podem ser qualquercombinação útil de lipídeos que formem lipossoma conhecidos, incluindolipídeos catiônicos ou zuiteriônicos, tais como fosfatidilcolina. O lipídeoremanescente normalmente será um lipídeo neutro ou ácido, tal comocolesterol, fosfatidil serina, fosfatidil glicerol e outros. Para preparar oslipossomas, o procedimento descrito por Kato et al. (1991) J. Biol. Chem.266:3361 pode ser usado.

As formas de dosagem unitária para a administração oral ouretal tais como xaropes, elixires, pós e suspensões podem ser fornecidas emque cada unidade de dosagem, por exemplo, o que cabe em uma colher dechá, o que cabe em uma colher de sopa, cápsula, tablete ou supositório,contém uma quantidade pré determinada da(s) enzima(s). Similarmente, asformas de dosagem unitárias para injeção podem compreender a(s) enzima(s)em uma composição como uma solução em água estéril, solução salina estérilou um outro carregador farmaceuticamente aceitável.

O termo "forma de dosagem unitária", como aqui usado,refere-se a unidades fisicamente separadas adequadas como dosagensunitárias para pacientes humanos e animal, cada unidade contendo umaquantidade pré determinada de enzima(s) em uma quantidade suficiente paraproduzir o efeito desejado.

Em uma forma de realização particular, a composiçãofarmacêutica da invenção é para a administração enteral, preferivelmente oral.

Em outras formas de realização particulares, a composição oralé (i) uma composição líquida contendo cristais da(s) enzima(s); (ii) umasuspensão líquida de sedimentos de enzima(s) (altamente) purificada(s); (iii)um gel contendo a(s) enzima(s) na forma sólida ou solubilizada; (iv) umasuspensão líquida de enzima(s) imobilizada(s) ou de enzimas adsorvidas naspartículas e outros; ou (v) uma composição sólida na forma de pó, pelotas,grânulos ou microesferas contendo a(s) enzima(s), se desejado na forma detabletes, cápsulas ou coisa parecida, que são opcionalmente revestidas, porexemplo com um revestimento estável ao ácido.

Em uma outra forma de realização particular da composição,a(s) enzima(s) são compartimentalizadas, a saber separadas umas das outras,por exemplo por meio de revestimentos separados.

Ainda em uma outra forma de realização particular dacomposição, a protease é separada de outros componentes enzimáticos dacomposição, tais como a lipase e/ou a amilase.

A dosagem da(s) enzima(s) variarão amplamente, dependendoda(s) enzima(s) específica(s) a ser(em) administrada(s), da freqüência deadministração, da maneira de administração, da gravidade dos sintomas e dasuscetibilidade do paciente aos efeitos colaterais e outros. Algumas dasenzimas específicas podem ser mais potentes do que outras.

Os exemplos de preparações orais sólidas da(s) enzima(s) dainvenção compreendem: (i) uma protease da invenção que compreende umaseqüência de aminoácido que tem pelo menos 50% de identidade com osaminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 2; (ii) uma lipase tendo pelo menos70% de identidade com uma lipase tendo os aminoácidos de 1 a 269 da SEQID NO: 15: e (iii) uma amilase tendo pelo menos 70% de identidade com umaamilase selecionada do grupo que consiste de a) uma amilase tendo osaminoácidos de 1 a 481 da SEQ ID NO: 16, b) uma amilase tendo osaminoácidos de 1 a 481 da SEQ ID NO: 17 e c) uma amilase tendo osaminoácidos de 1 a 483 da SEQ ID NO: 18; em que preferivelmente asdosagens clínicas diárias previstas das enzimas de (i), (ii) e (iii) são comosegue (todas em mg de proteína de enzima por kg de peso corporal (pc)): paraa protease de (i): 0,005 a 500, 0,01 a 250, 0,05 a 100 ou 0,1 a 50 mg/kg de pc;para a lipase de (ii): 0,01 a 1000, 0,05 a 500, 0,1 a 250 ou 0,5 a 100 mg/kg depc; para a amilase de (iii): 0,001 a 250, 0,005 a 100, 0,01 a 50 ou 0,05 a 10mg/kg de pc.

Um exemplo preferido de preparações orais sólidas da(s)enzima(s) da invenção compreende: (i) uma protease que compreende,preferivelmente tendo, os aminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 2; (ii) umalipase que compreende os aminoácidos de 2 a 269 da SEQ ID NO: 15 e/ou(iii) uma amilase que compreende os aminoácidos de 1 a 481 da SEQ ID NO:16.

Os exemplos de dosagens clínicas diárias previstas dasenzimas de (i), (ii) e (iii) são como segue (todas em mg de proteína de enzimapor kg de peso corporal (pc)): para a protease de (i): 0,05 a 100, 0,1 a 50 ou0,5 a 25 mg/kg de pc; para a lipase de (ii): 0,1 a 250, 0,5 a 100 ou 1 a 50mg/kg de pc; para a amilase de (iii): 0,01 a 50, 0,05 a 10 ou 0,1 a 5 mg/kg de pc.

As ligações de amida (peptídeo), assim como os terminaisamino e carbóxi, podem ser modificados para maior estabilidade sobre aadministração oral. Por exemplo, o terminal carbóxi pode ser amidado.

As formas de realização particulares das composiçõesfarmacêuticas da invenção, adequadas para o tratamento de distúrbiosdigestivos, PEI, pancreatite, fibrose cística, diabete tipo I e/ou diabete tipo II,podem ser preparadas pela incorporação da(s) enzima(s) da invenção empelotas. As pelotas no geral podem compreender de 10 a 90% (p/p, emrelação ao peso seco das pelotas resultantes) de um polímero orgânicofisiologicamente aceitável, de 10 a 90% (p/p, em relação ao peso seco daspelotas resultantes) de celulose ou um derivado de celulose e de 80 a 20%(p/p, em relação ao peso seco das pelotas resultantes) da(s) enzima(s), aquantidade total de polímero orgânico, celulose ou derivado de celulose eenzima(s) perfazendo até 100% em cada caso.

O polímero orgânico fisiologicamente aceitável pode serselecionado do grupo que consiste de polietileno glicol 1500, polietilenoglicol 2000, polietileno glicol 3000, polietileno glicol 4000, polietileno glicol6000, polietileno glicol 8000, polietileno glicol 10000, polietileno glicol20000, hidroxipropil metilcelulose, polioxietileno, copolímeros depolioxietileno-polioxipropileno e misturas dos ditos polímeros orgânicos. Opolietileno glicol 4000 é preferido como polímero orgânico fisiologicamenteaceitável.

A celulose ou um derivado de celulose por exemplo pode serselecionado de celulose, acetato de celulose, éster de ácido graxo de celulose,nitratos de celulose, éter de celulose, carboximetil celulose, etil celulose,hidroxietil celulose, hidroxipropil celulose, metil celulose, metil etilcelulose emetil-hidroxipropil celulose. A celulose, em particular celulosemicrocristalina é preferida como celulose ou derivado de celulose.

As pelotas resultantes podem ser revestidas com umrevestimento entérico adequado, outros revestimentos não funcionais ou serusadas diretamente sem tal revestimento. Além disso, as pelotas resultantespodem ser enchidas em cápsulas como cápsulas de gelatina dura ou cápsulasisentas de gelatina de um tamanho adequado para terapia de um distúrbio oudoença como descrito em mais detalhes acima. Em uma forma de realizaçãoda invenção, as pelotas produzidas a partir de tipos de enzima diferentes, emparticular da lipase, protease e/ou amilase podem ser enchidas nas ditascápsulas. Durante o enchimento das cápsulas com os tipos de enzimadiferentes, a dosagem dos tipos de enzima únicos (a saber lipase, protease ouamilase) pode ser adaptada para as necessidades específicas de um certogrupo de indicação ou um certo subgrupo de paciente pela adição de umaquantidade especificada de qualquer uma de lipase, protease e/ou amilase àscápsulas, isto é, as cápsulas podem ser produzidas de modo que variem emsuas razões específicas de lipase:protease:amilase.

As composições farmacêuticas preferidas da lipase dainvenção são descritas na WO 2005/092370, em particular as formulações quecompreendem os excipientes preferidos mencionados nesta. Em uma forma derealização particularmente preferida, a composição farmacêutica compreendeuma mistura de macrogolglicerídeo de mono-, di- e tri-acilglicerídeos epolietileno glicol (PEG) mono- e di-ésteres de ácidos carboxílicos C6-C22 etambém possivelmente pequenas proporções de glicerol e polietileno glicollivre.

O polietileno glicol (PEG) contido nas misturas demacrogolglicerídeo é preferivelmente PEG que tem em média de 6 a nomáximo 40 unidades de óxido de etileno por molécula ou um peso moleculardentre 200 e 2000.

Um outro aspecto da invenção fornece a composiçãofarmacêutica da(s) enzima(s) da invenção compreendendo um sistema queconsiste de tensoativo, co-tensoativo e fase lipofílica, o sistema tendo umvalor HLB (Equilíbrio Hidrofílico-Lipofílico) maior do que ou igual a 10 eum ponto de fusão maior do que ou igual a 30°C. Em uma forma derealização preferida o sistema tem um valor HLB de 10 a 16, preferivelmentede 12 a 15 e tem um ponto de fusão dentre 30 e 600°C, preferivelmente entree 500°C. Em particular, o sistema caracterizado pelo valor HLB e ponto defusão é uma mistura de mono-, di- e triacilgilcerídeos e mono- e diésteres depolietileno glicol (PEG) com ácidos carboxílicos alifáticos com 8 a 20,preferivelmente de 8 a 18, átomos de carbono, por meio do qual o polietilenoglicol preferivelmente tem de cerca de 6 a cerca de 32 unidades de óxido deetileno por molécula e o sistema opcionalmente contém glicerina livre e/oupolietileno glicol livre. O valor HLB de um tal sistema é preferivelmenteregulado pelo comprimento da cadeia do PEG. O ponto de fusão de um talsistema é regulado pelo comprimento da cadeia dos ácidos graxos, ocomprimento da cadeia do PEG e o grau de saturação das cadeias de ácidograxo e por este motivo o óleo de partida para a preparação da mistura demacrogolglicerídeo.

"Ácidos carboxílicos C8-C18 alifáticos" designa misturas emque o ácido caprílico (C8), ácido cáprico (CIO), ácido láurico (Cl2), ácidomirístico (Cl4), ácido palmítico (Cl6) e ácido esteárico (Cl8) são contidosem uma proporção significante e variável, se estes ácidos são saturados e osácidos carboxílicos C8-C18 insaturados correspondentes. As proporçõesdestes ácidos graxos podem variar de acordo com os óleos de partida.

Uma tal mistura de mono-, di- e triacilgilcerídeos e mono- ediésteres de polietileno glicol (PEG) com ácidos carboxílicos alifáticos com 8a 18 átomos de carbono por exemplo podem ser obtidos por uma reação entreum polietileno glicol com um peso molecular dentre 200 e 1500 e um óleo departida, o óleo de partida consistindo de uma mistura de triglicerídeo comácidos graxos que são selecionados do grupo contendo ácido caprílico, ácidocáprico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácidooléico e ácido linolênico, individualmente ou como uma mistura.

Opcionalmente, o produto de uma tal reação também pode conter pequenasproporções de glicerina e polietileno glicol livre.

Tais misturas são comercialmente disponíveis por exemplo sobo nome comercial Gelucire®. Uma forma de realização vantajosa da invençãofornece que, dos produtos conhecidos sob o nome comercial Gelucire®, emparticular "Gelucire® 50/13" e/ou "Gelucire® 44/14" representam misturasadequadas para o uso nas preparações farmacêuticas de acordo com ainvenção.

Gelucire® 50/13 é uma mistura com mono-, di- etriacilglicerídeos e mono- e diésteres de polietileno glicol, com ácidopalmítico (C16) e ácido esteárico (C18) de 40% a 50% e de 48% a 58%,respectivamente perfazendo a proporção maior dos ácidos graxos ligados. Aproporção de ácido caprílico (C8) e ácido cáprico (CIO) é menor do que 3%em cada caso e a proporção de ácido láurico (Cl2) e ácido mirístico (Cl4) emcada caso é menor do que 5%.

Gelucire® 44/14 é uma mistura com mono-, di- etriacilglicerídeos e mono- e diésteres de polietileno glicol, as respectivasproporções de ácido palmítico (Cl6) sendo de 4 a 25%, ácido esteárico (Cl8)de 5 a 35%, ácido caprílico (C8) menor do que 15%, ácido cáprico (CIO)menor do que 12%, ácido láurico (C12) de 30 a 50% e ácido mirístico (C14)de 5 a 25%. Gelucire® 44/14, por exemplo, pode ser preparado por umareação de alcoólise/esterificação usando óleo de dendê e polietileno glicol 1500.

Uma forma de realização preferida da presente invençãofornece uma composição farmacêutica da(s) enzima(s) da invenção quecompreende(m) um sistema contendo uma mistura de mono-, di- e triacil-glicerídeos e polietileno glicol mono- e diésteres de ácidos carboxílicos C8-Cl8 alifáticos e também possivelmente pequenas proporções de glicerina epolietileno glicol livre, o sistema tendo um ponto de fusão entre 40°C e 55°Ce um valor HLB na faixa entre 12 e 15. Mais preferido, o sistema tem umponto de fusão entre 44°C e 50°C e um valor HLB na faixa de 13 a 14.

Alternativamente, o sistema tem um ponto de fusão em torno de 44°C e umvalor HLB de 14 ou o sistema tem um ponto de fusão em torno de 50°C e umvalor HLB de 13.

Métodos de Tratamento

A protease da invenção, opcionalmente em combinação comuma lipase e/ou uma amilase (a(s) enzima(s) da invenção), é útil notratamento terapêutico e/ou profilático de várias doenças ou distúrbios emanimais. O termo "animal" inclui todos os animais e em particular sereshumanos. Os exemplos de animais são não ruminantes e ruminantes, taiscomo ovelha, cabra e gado, por exemplo gado de corte e vacas. Em umaforma de realização particular, o animal é um animal não ruminante. Osanimais não ruminantes incluem animais mono-gástricos, por exemplo cavalo,porco (incluindo, mas não limitado a, porquinhos, porcos em crescimento eporcas); aves domésticas tais como perus, patos e galinhas (incluindo mas nãolimitado a frangos, poedeiras); bezerros jovens; animais de estimação taiscomo gato e cachorro; e peixe (incluindo mas não limitado a salmão, truta,tilápia, peixe gato e carpas; e crustáceos (incluindo mas não limitado acamarões e pitus). Em uma forma de realização particular o animal é ummamífero, mais em particular um ser humano.

Por exemplo, a(s) enzima(s) são úteis no tratamento dedistúrbios digestivos como má digestão ou dispepsia que são freqüentementecausadas por uma produção deficiente e/ou secreção no trato gastrintestinal deenzimas digestivas normalmente secretadas, i.a., do estômago e do pâncreas.

Além disso, a(s) enzima(s) são particularmente úteis notratamento de PEI. PEI pode ser verificado usando, i.a., o teste de Borgstrom(JOP. J Pancreas (Online) 2002; 3(5): 116-125) e esta pode ser causada pelasdoenças e condições tais como câncer pancreático, cirurgia pancreática e/ougástrica, por exemplo ressecção total ou parcial do pâncreas, gastrectomia,cirurgia de desvio pós gastrintestinal (por exemplo gastroenterostomia deBillroth II); pancreatite crônica; Síndrome de Shwachman Diamond;obstrução dutal do pâncreas ou do duto biliar comum (por exemplo deneoplasmo); e/ou fibrose cística (uma doença herdada em que um mucoespesso bloqueia os dutos do pâncreas). A(s) enzima(s) também pode(m) serútil(eis) no tratamento de pancreatite aguda.

O efeito da(s) enzima(s) sobre os distúrbios digestivos podeser medido como no geral descrito na EP 0600868, em que o Exemplo 2descreve um teste de digestibilidade in vitro para medir o teste de estabilidadeda lipase sob condições gástricas e o Exemplo 3 um teste de digestibilidade invitro para a atividade da lipase na presença de sais biliares. Os testescorrespondentes podem ser ajustados quanto a protease e amilase. Também aWO 02/060474 divulga testes adequados, por exemplo (1) um teste in vitropara medir a digestão lipídica em uma alimentação de teste de suíno e (2) umteste in vivo com suíno com pâncreas insuficiente em que a digestibilidade dagordura, proteína e amido é medida.

Em uma forma de realização particular, o efeito da protease dainvenção é medido usando o teste de triagem in vivo quanto a eficácia daprotease do Exemplo 3.Como um outro exemplo, a(s) enzima(s) são útil(eis) notratamento da diabete melito tipo I e/ou tipo II, em particular para otratamento adjuvante em uma terapia na diabete de distúrbios digestivos queusualmente acompanham esta doença, com uma vista para diminuircomplicações posteriores.

O efeito sobre a diabete melito da(s) enzima(s) pode serdeterminado por um ou mais dos métodos descritos na WO 00/54799, porexemplo controlando-se o nível de hemoglobina glicosilada, o nível daglicose do sangue, ataque hipoglicêmico, a situação de vitaminas solúveis emgordura como vitaminas A, D e E, a dosagem diária requerida de insulina, oíndice de peso corporal e períodos hiper glicêmicos.

Em uma forma de realização particular, a protease da invençãonão é para o uso como um agente de remoção de corpos estranhos e tecidomorto de feridas e/ou não para o uso na cicatrização de ferimento.

A invenção aqui descrita e reivindicada não deve ser limitadano escopo pelas formas de realização específicas aqui divulgadas, visto queestas formas de realização são intencionadas como ilustrações de diversosaspectos da invenção. Quaisquer formas de realização equivalentes sãointencionadas a estar dentro do escopo desta invenção. De fato, váriasmodificações da invenção além daquelas aqui mostradas e descritas tornar-se-ão evidentes àqueles habilitados na técnica da descrição precedente. Taismodificações também são intencionadas a cair dentro do escopo dasreivindicações anexas. No caso de conflito, a presente divulgação incluindo asdefinições controlarão.

Várias referências são aqui citadas, as divulgações das quaissão incorporadas por referência em suas totalidades.

Exemplos

Exemplo 1: Preparação de protease de Bacillus licheniformis purificada

Uma preparação pura da protease de Bacillus licheniformis dosaminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 1 foi preparada como segue:Materiais e Métodos:

Caldo TY: triptona 20 g/l, extrato de levedura 5 g/l,FeCl2.4H20 7 mg/l, MnCl2.4H20 1 mg/l, MgSO4JH2O 15 mg/l, pH 7,3.

Caldo PS-I: Sacarose 100 g, farinha de soja 40 g,Na2HPO4.12H20 (Merck 6579) 10 g, CaCO3 5 g, Pluronic PE 6100 (BASF)0,1 ml, água de torneira até 1000 ml.

Fermentação:

Uma cepa derivada de Bacillus licheniformis ATCC 14580pela deleção do gene (SEQ ID NO: 3) que codifica uma outra protease, foipropagada durante a noite a 37°C em meio ágar TY (caldo TY solidificadocom 2% de ágar) e inoculado em frascos agitados contendo 100 ml de caldoPS-1. Os frascos agitados foram incubados a 37°C por 90 horas com umavelocidade de agitação de 225 rpm.

Purificação:

o caldo de fermentação foi floculado e as células foramseparadas do líquido contendo enzima pela centrifugação. A eletroforese emgel de SDS poliacrilamida do sobrenadante revelou uma faixa forte de umpeso molecular relativo de aproximadamente 31 kDa que corresponde àprotease desejada. A presença de uma atividade de protease forte nosobrenadante também foi confirmada pela presença de zonas de depuraçãograndes em placas de ágar com 1% de leite desnatado, pH 7 e 9. Como umaetapa seguinte, o líquido da centrífuga foi filtrado para remover os sólidos emsuspensão remanescentes e depois concentrados pela ultrafiltração usandomembranas apropriadas isto é, com um valor de corte abaixo do tamanho daprotease. Finalmente o concentrado foi filtrado em germe.

100 ml do concentrado líquido filtrado em germe foi diluídoIOx em 100 mM de H3BO3, 10 mM de ácido succínico/NaOH, 2 mM deCaCl2, pH 7,0. O pH da solução de protease resultante foi 7,0. 120 ml destesforam aplicados a uma coluna de 100 ml de bacitracin-agarose (UpFrontChromatography, catálogo n2 600-0100) equilibrada em 100 mM de H3BO3,10 mM de ácido succínico/NaOH, 2 mM de CaCl2, pH 7,0. Depois umlavagem completa da coluna com o tampão de equilíbrio, a coluna foi eluídaescalonadamente com 100 mM de H3BO3, 10 mM de ácido succínico/NaOH,2 mM de CaCl2, 1 M de NaCl, pH 7,0, 25% (v/v) de isopropanol. A etapa deBacitracina-sílica foi repetida 7 vezes (8 vezes no total). Todos os eluídosforam combinados (420 ml) e os eluídos foram diluídos para 15 L com águadesmineralizada. O pH da protease diluída foi ajustado ao pH 6,0 com 20% deCH3COOH e aplicado a uma coluna FF de SP-sefarose de 400 ml equilibradaem 50 mM de H3BO3, 5 mM de ácido succínico/NaOH, 1 mM de CaCl2, pH6,0. A coluna foi lavada cuidadosamente com o tampão de equilíbrio e acoluna foi eluída com um gradiente linear de NaCl (0 a 0,5 M) em 3 volumesde coluna. O pico da protease eluído (200 ml) foi transferido para 20 mM deHEPES/NaOH, 100 mM de NaCl, 1 mM de CaCl2, pH 7,0 pela troca detampão em uma coluna G25 sephadex de 1,4 L (HEPES é o ácido 4-(2-hidroxietil)-l-piperazinoetanossulfônico). A protease trocada em tampão (340ml) foi filtrada em uma unidade de filtração de 0,22 μ (tal como Corning,catálogo n-431097).

Exemplo 2: Ensaios de Enzima

Ensaio de Suc-AAPF-pNA de ProteaseSubstrato: Suc-AAPF-pNA (Sigma® S-7388).

Ensaio tampão: 100 mM de ácido succínico, 100 mM deHEPES (Sigma H-3375), 100 mM de CHES (Sigma C-2885), 100 mM deCABS (Sigma C-5580), 1 mM de CaCl2, 150 mM de KCl, 0,01% de Triton®X-100 ajustado ao pH 9,0 com HCl ou NaOH.

Temperatura de Ensaio: 25°C.

300 μΐ de amostra de protease diluída foram misturados com1,5 ml do tampão de ensaio e a reação de atividade foi iniciada pela adição de1,5 ml de substrato de pNA (50 mg dissolvidos em 1,0 ml de DMSO e aindadiluída 45x com 0,01% de Triton® X-100) e, depois de misturar, o aumentoem A405 foi monitorado por um espectrofotômetro como uma medição daatividade de protease. As amostras de protease foram diluídas antes damedição da atividade de modo a garantir que todas as medições de atividadecaiam dentro da parte linear da curva de resposta de dose para o ensaio.

Ensaio FIP Protease

A atividade de protease também pode ser determinada usandoum ensaio de FIP (Federation Internationale Pharmaceutique), 1 unidade FIP=1 unidade Ph. Eur. (European Pharmacopoeia). Este ensaio é descrito, juntocom outros ensaios FIP na: Federation Internationale Pharmaceutique,Scientific Section: International Commission para a padronização de enzimasfarmacêuticas, a) "Pharmaceutical Enzymes," Editores: R. Ruyssen e A.Lauwers, E. Story Scientia, Ghent, Bélgica (1978), b) EuropeanPharmacopoeia. Ver também Deemester et al in Lauwers A, Scharpó S (eds):Pharmaceutical Enzymes, Nova Iorque, Mareei Dekker, 1997, p. 343-385.

Este ensaio foi usado para determinar a atividade de protease na pancreatina.Para determinar a atividade FIP de proteases microbianas, a etapa de ativaçãopela adição da enterocinase foi omitida.

Princípio: A caseína do substrato é hidrolisado pela proteaseno pH 7,5 e em uma temperatura de 35°C. A reação é interrompida pelaadição de ácido tricloroacético e a caseína não degradada é separada porfiltração. A quantidade de peptídeos que permanecem em solução édeterminada pela espectrofotometria a 275 nm.

Definição da atividade: A atividade de protease é determinadacomo a quantidade de peptídeos não precipitado por uma solução a 5,0%(p/vol, isto é, 5,0 g/100 ml) de ácido tricloroacético, pela referência a um póde referência do pâncreas (padrão de referência da protease) de conhecidosFIP atividade.Materiais e métodos:

Solução de Caseína:

1,25 g de caseína (matéria seca), por exemplo Calbiochem n2218680, é colocada em suspensão em água até que uma solução praticamenteclara é obtida. O pH é ajustado a 8,0 e a solução é diluída com água a umvolume final de 100 ml. Aqui e a seguir, água significa água desionizada.

Tampão de Borato pH 7,5:

2,5 g de cloreto de sódio, 2,85 g tetraborato de dissódio e 10,5g de ácido bórico são dissolvidos em 900 ml de água, o pH é ajustado ao pH7,5 +/- 0,1 e diluído a 1000 ml com água.

Papel de Filtro:

Filtros dobrados com um diâmetro de 125 mm, por exemploSchleicher & Schuell na 15741A O teste de papel de filtro: Filtro de 5 ml de5,0% de ácido tricloroacético através do filtro. A absorção a 275 nm dofiltrado deve ser menor do que 0,04, usando solução de ácido tricloroacéticonão filtrado como um branco.

Padrão de referência de protease:

A protease (pâncreas) comercialmente disponível daInternational Commission on Pharmaceutical Enzymes, Centre for Standards,Harelbekestraat 72, B-9000 Ghent, Bélgica. O padrão tem uma atividaderotulada (A) em FlP/unidades Ph. Eur./g. Pesar acuradamente uma quantidadeque corresponda a aprox. 130 unidades de protease-FIP/Ph.Eur.. Adicionaruma ponta de espátula de areia do mar, umidificada com umas poucas gotasde cloreto de cálcio 0,02 M (pH 6,0 a 6,2) e triturado o todo com uma varetade vidro de extremidade plana. Diluir com aprox. 90 ml da mesma solução decloreto de cálcio gelado e agitar a suspensão por 15 a 30 minutos em umbanho de gelo. O pH é ajustado a 6,1 e o volume é ajustado a 100 ml com amesma solução de cloreto de cálcio. 5,0 ml desta suspensão é diluída comtampão de borato pH 7,5 a 100 ml. Para o teste de atividade, 1,0, 2,0 e 3,0 mldesta solução são usados como referência (no que segue designados S1, S2 eS3, S para Padrão).

Suspensão de Teste:

Preparar uma suspensão da amostra como descrito acima parao padrão de referência de protease, usando uma quantidade equivalente deamostra a aprox. 260 unidades FIP/Ph.Eur.. O pH é ajustado a 6,1 e água éadicionada a 100 ml. 5,0 ml desta solução é misturada com 5 ml de solução decloreto de cálcio. 5 ml desta diluição é ainda diluído a 100 ml com tampão deborato. Usar 2,0 ml desta solução para o ensaio (no que segue a amostra édesignada Un, amostra de atividade desconhecida, número n).

Procedimento de Ensaio (teste de atividade):

O ensaio é realizado para as três suspensões de referência (S1,S2, S3) e para a suspensão de amostra (Un), Todas em triplicata. Um brancopor amostra é suficiente (designada Slb, S2b, S3b e Unb, respectivamente).

Um cego (B) é preparado sem amostra/padrão como compensação líquidapara o espectrofotômetro. O tampão de borato é adicionado aos tubos comosegue: Cego (B) 3,0 ml; amostra (Un) 1,0 ml; padrões (SI, S2 e S3) 2,0, 1,0 e0 ml, respectivamente. O padrão de referência de protease é adicionado a SI,S2 e S3 como segue: 1,0, 2,0 e 3,0 ml, respectivamente. A suspensão de testeé adicionada aos tubos de amostra como segue (Un): 2,0 ml. 5 ml de ácidotricloroacético são adicionados a todos os cegos (Slb, S2b, S3b, Unb e B)seguido pela mistura imediata. Todos os tubos são tampados com uma tampade vidro e colocados juntos com a solução de substrato em um banho de águaem temperatura constante (35 +/- 0,5°C). Quando o equilíbrio de temperaturaé atingido, no tempo zero, 2,0 ml de solução de caseína é adicionado aostubos SI, S2, S3 e Un, seguido pela mistura imediata. Exatamente 30 minutosdepois, 5,0 ml de ácido tricloroacético são adicionados a cada um dos tubosSI, S2, S3 e Un, seguido pela mistura imediata. Os tubos são retirados dobanho de água e deixado repousar na temperatura ambiente por 20 minutospara completar a precipitação das proteínas. O conteúdo de cada tubo éfiltrado duas vezes através do mesmo filtro e a absorção dos filtrados émedida a 275 nm usando o filtrado do tubo B como líquido de compensação.A atividade da amostra (Un) em unidades FIP é calculada em relação àatividade rotulada conhecida (A) dos padrões (SI, S2, S3). Os valores deabsorção menos os respectivos cegos (por exemplo a absorção de Sl menos aabsorção de Sl b) deve residir no intervalo de 0,15 a 0,60.

Ensaio de AU Protease

Hemoglobulina desnaturada (0,65% (p/p) em tampão de 6,7mM de KH2PO4ZNaOH contendo uréia, pH 7,50) é degradada a 250C por 10minutos pela protease e a hemoglobina não degradada é precipitada comácido tricloroacético (TCA) e removida pela filtração. Os produtos dadegradação da hemoglobulina solúveis em TCA no filtrado são determinadoscom reagente de fenol de Folin & Ciocalteu (1 volume de Reagente de Fenolde Folin-Ciocalteu Merck 9001.0500 para 2 volumes de águadesmineralizada), que dá uma cor azul com diversos aminoácidos (sendomedido a 750 nm). A unidade de atividade (AU) é medida e definida pelareferência a um padrão. O substrato de hemoglobina desnaturado pode serpreparado como segue: 1154 g de uréia (Harnstoff, Merck 8487) é dissolvidoem 1000 ml de água desmineralizada, 240,3 g de NaOH são adicionados edepois, lentamente, 63,45 g de hemoglobina (Merck 4300) são adicionados,seguido por 315,6 g de KH2PO4 e água desmineralizada até 3260 g. O pH éajustado a 7,63. Mais detalhes e um padrão de Alcalase adequado estãodisponíveis sob solicitação da Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880Bagsvaerd, Dinamarca (ensaio n2 EB-SM-0349.01).

Ensaio pNP de Lipase

Substrato: Valerato de para-Nitro-Fenila (pNP)

Ensaio pH: 7,7

Temperatura do ensaio: 40°CTempo de reação: 25 min

O produto digerido com cor amarela tem uma absorbânciacaracterística a 405 nm. A sua quantidade é determinada pelaespectrofotometria. Uma unidade de lipase é a quantidade de enzima quelibera 1 micromol de ácido butírico titulável por minuto sob as condições deensaio dadas. Uma descrição de ensaio mais detalhada, AF95/6-GB, estádisponível sob solicitação da Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880Bagsvaerd, Dinamarca.

Ensaio LU de Lipase

Neste ensaio, a degradação catalisada pela lipase de 0,16 M detributirin (tributirato de glicerol, Merck 1.01958,000) no pH 7,00 e 30°C (+/-1°C) é seguida pela titulação estacionária do pH do ácido butírico liberadocom 0,025 M de hidróxido de sódio desgaseificado, isento de CO2 (Hidróxidode sódio titrisol, Merck 9956). O consumo do titulante é registrado como umafunção do tempo.

O substrato é emulsificado com um emulsificador de gomaarábica a 0,6% p/v (20,0 g de Goma Arábica, 89,5 g de NaCl, 2,05 g deKH2PO4, adicionar água até 1,5 L, deixar até completamente dissolvido,adicionar 2700 ml de glicerol, ajustar o pH para 4,5. 90 ml de tributirin sãomisturados com 300 ml de emulsificador de goma arábica e 1410 ml de águadesmineralizada e homogeneizados por 3 minutos usando por exemplo umemulsificador de Silverson L4RT a 7000 rpm e depois ajustado ao pH 4,75).

As amostras de Lipase são diluídas primeiro em tampão de glicina a 0,1 M pH10.8, em seguida em água desmineralizada, com objetivo de um nível deatividade de 1,5 a 4,0 LU/ml. 15 ml da solução de substrato emulsificado sãovertidos no vaso de titulação. 1,0 ml de solução de amostra é adicionado e opH é mantido a 7,0 durante a titulação. A quantidade de titulante adicionadapor minuto para manter um pH constante é medida. O cálculo da atividadeestá fundamentado na inclinação média da faixa linear da curva de titulação.Um padrão de atividade conhecida pode ser usado como uma checagem denível.

1 LU (unidade de lipase) é a quantidade de enzima que libera 1micro mol de ácido butírico titulável por minuto sob as condições de ensaiodadas acima. 1 kLU (quilo Unidade de lipase) = 1000 LU.

Uma descrição do ensaio mais detalhada, EB-SM-0095,02,está disponível sob solicitação da Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Dinamarca.

Ensaio em pH estacionário de Lipase

Este ensaio está fundamentado na liberação catalisada pelalipase de ácidos graxos de uma emulsão de óleo de oliva na presença de 0,65mM de sais biliares. O Substrato é emulsificado com goma arábica comoemulsificador (175 g de óleo de oliva emulsificado com 630 ml de solução degoma arábica (474,6 g de goma arábica, 64 g de cloreto de cálcio em 4000 mlde água) por 15 min em um misturador; depois de esfriar até a temperaturaambiente, o pH é ajustado ao pH 6.8 a 7,0 usando NaOH 4 M).

Para a determinação, 19 ml da emulsão e 10 ml de solução desais biliares (492 mg de sais biliares são dissolvidos em água e enchidos até500 ml) são misturados no vaso de reação e aquecidos de 36,9°C a 37,5°C. Areação é iniciada pela adição de 1,0 ml de solução de enzima. O ácidoliberado é titulado automaticamente no pH 7,0 pela adição de hidróxido desódio 0,1 M para um total de 5 min. A atividade é calculada a partir dainclinação da curva de titulação entre o I0 e o 5o minutos. Para a calibração,um padrão é medido em três níveis diferentes de atividade.

Amilase

Substrato: Tabletes Phadebas (Pharmacia Diagnostics;polímero de amido reticulado, insolúvel, de cor azul, que são misturados comalbumina sérica bovina e uma substância tampão e fabricado em tabletes)Temperatura do ensaio: 37°CEnsaio pH: 4,3 (ou 7,0, se desejado)

Tempo de reação: 20 min

Depois da suspensão em água o amido é hidrolisado pela alfa-amilase, dando fragmentos azuis solúveis. A absorbância da solução azulresultante, medido a 620 nm, é uma função da atividade de alfa-amilase. UmaUnidade de alfa-Amilase Fúngica (1 FAU) é a quantidade de enzima quedecompõem 5,26 g de amido (Merck, Amilum solubile Erg. B. 6, Lote9947275) por hora nas condições de ensaio padrão. Uma descrição do ensaiomais detalhada, APTSMYQI-3207, está disponível sob solicitação daNovozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Dinamarca.

Exemplo 3: Teste de tiragem in vivo da protease de Bacillus licheniformis

A protease de Bacillus licheniformis purificado do Exemplo 1foi testado em miniporcos Gottingen fêmeas (Ellegaard) com pancreatinacomo um sinal de medida. A insuficiência exócrina pancreática (PEI) foiinduzida nos miniporcos pela ligação do duto pancreático e eles tambémforam adaptados com uma cânula reentrante íleo-cecal, todos sob anestesiacom halotano e em um peso de cerca de 25 kg, como descrito em Tabeling etai., J. 1999, Studies on nutrient digestibilities (pre-caecal and total) inpancreatic duct-ligated pigs and the effects of enzyme substitution, J. Anim.Physiol. A. Anim. Nutr. 82: 251-263 (daqui em diante aludida como"Tabeling 1999"); e em Gregory et al., J. 1999. Growth and digestion inpancreatic duct ligated pigs, Effect of enzyme supplementation in "Biology ofthe Pancreas in Growing Animais" (SG Pierzynowski & R. Zabielski eds),Elsevier Science BV, Amsterdam, pp 381-393 (daqui em diante aludida como"Gregory et al 1999"). Um período de pelo menos 4 semanas foi deixado paraa recuperação da cirurgia, antes que os estudos fossem começados. Antes queo estudo começasse, a situação da PEI de cada porco foi confirmada porintermédio do teste de quimiotripsina das fezes (comercialmente disponívelda Immundiagnostik AG, Wiesenstrasse 4, D-64625 Bensheim, Alemanha,com catálogo N2 K 6990).

Durante os estudos, os porcos foram alojados em gaiolas demetabolismo modificadas em um ciclo de luz-escuro de 12:12 horas e deixadolivre acesso a água e alimentados duas refeições/dia. Para avaliar a eficácia daprotease, os porcos foram alimentados com uma refeição de teste de 250 gmisturados com 1 litro de água, 0,625 g de Cr2O3 (marcador de óxidocrômico) e nas quantidades diferentes de protease (0, 1000, 2500, 6000 FIP Uprotease/refeição (unidades FIP da protease, ver o Exemplo 2)) forammisturados imediatamente antes da alimentação. A refeição de teste conteve21,4% de proteína, 51,9% de amido, 2,6% de gordura e teve a seguintecomposição (g/100 g de matéria seca): Farinha de peixe 3,5, farinha de carnede aves 10,2, farinha de trigo 29,5, arroz descascado 14, amido de batata 11,amido de milho 14, caseína 5,9, pó de celulose 4,3, vitaminas, minerais eelementos traço 7,6 (como para a exigência nutricional para porcos, ver porexemplo a Tabela A da WO 01 /5 8276).

O quimo curado foi coletado em gelo por um total de 8 horasdepois do primeiro aparecimento do marcador de refeição no íleo (quimoverde) e armazenado a -20°C antes da análise. Pelo menos um dia de lavagemfoi deixado entre as determinações separadas.

Em resumo, as amostras congeladas foram secadas porcongelamento e analisadas quanto a matéria seca (DM) e proteína bruta. ADM foi estimada pelo peso depois da secagem por congelamento seguido pelaincubação de 8 horas a 1030C. A proteína bruta foi calculada como nitrogênio(N) multiplicado por um fator de 6,25, isto é, Proteína bruta (g/kg) = N (g/kg)χ 6,25 como estabelecido em Animal Nutrition, 4a edição, Capítulo 13 (Eds.P. McDonald, R. A. Edwards e J. F. D. Greenhalgh, Longman Scientific eTechnical, 1988, ISBN 0-582-40903-9). O teor de nitrogênio foi determinadopelo método de Kjeldahl (Naumann e Bassler, 1993, Die chemischeUntersuchung von Futtermitteln. 3a edição VDLUFA-Verlag, Darmstadt,Alemanha (VDLUFA = Verband Deutscher LandwirtschaftlicherUntersuchungs- and Forschungsanstalten).

O cálculo da digestibilidade da proteína pré-cecal aparente foifeita de acordo com a fórmula:

<formula>formula see original document page 56</formula>

em que Cr2Os e a proteína foram expressados como g/100 g de matéria seca.A quantidade de Cr2Os pode ser determinada pelos métodos conhecidos natécnica, preferivelmente pela oxidação para cromato e a medição da extinçãoa 365 nm, como descrito por Petry e Rapp em Zeitung kw Tierphysiologie(1970), vol. 27, p. 181-189. Os resultados deste estudo são representados naTabela 1.

Tabela 1: Influência da suplementação de enzima na digestibilidade deproteína aparente

<table>table see original document page 56</column></row><table>

Os valores são média ± SD

A partir dos resultados na Tabela 1 é evidente que a proteaseda SEQ ID NO: 2 de acordo com a invenção atua com a mesma atividadecomo as preparações de pancreatina conhecidas. A protease da invençãocausou uma melhora forte e dependente da dose sobre a digestibilidade daproteína, já mostrando uma melhora altamente eficiente na dosagem maisbaixa testada.

Exemplo 4: Teste in vitro de proteases

Várias proteases foram testadas in vitro quanto a capacidadedo ar para degradar a proteína sob condições que simulam a digestão.

Proteases

As seguintes subtilisina proteases da invenção foram testadas:

A protease de Bacillus licheniformis dos aminoácidos de 1 a 274 da SEQ IDNO: 1; a protease de Bacillus amiloliquefaeiens dos aminoácidos de 1 a 275da SEQ ID NO: 10 e a protease da variante 99aÉ do Bacillus lentus dosaminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 11 (um E (Glu) sendo inserido depoisdo resíduo de aminoácido n° 99, S (Ser), nos aminoácidos de 1 a 269 da SEQID NO: 11). Estas proteases todas têm uma identidade percentual com osaminoácidos de 1 a 274 da SEQID NO: 1 acima de 50%.

Para comparação, algumas subtilisina proteases fora dainvenção também foram incluídas, a saber de Bacillus halmapalus NCIB12513 (descrita na WO 88/01293 e também na WO 98/012005 (SEQ ID NO:42, Bacillus sp. JP170)) e de Bacillus sp. NCIMB 40339 (descrita na WO92/017577 como Bacillus sp. TY145). Estas proteases todas têm umaidentidade percentual com os aminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 1abaixo de 50%. Além disso, a protease que não de subtilisina de Nocardiopsisdescrita na WO 2005/115445 (aminoácidos de 1 a 188 da SEQ ID NO: 1nesta) foi incluída para comparação. Esta protease também tem identidadeabaixo de 50% com os aminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 1. Finalmente,a pancreatina foi incluída como um controle positivo.

As proteases foram todas dosadas de modo idêntico em umabase em proteína de enzima, a saber 72, 36, 18 e 9 mg de Proteína de Enzima(EP) por refeição de 250 g. A quantidade de proteína de enzima da proteasefoi calculada com base nos valores A280 e a seqüência de aminoácidos(composições de aminoácido) usando os princípios esboçados em S. C. Gill &Ρ. H. von Hippel, Analytical Biochemistry 182, 319-326, (1989).

Materiais e Métodos

Sais biliares (isto é, taurocolato de sódio BRP, lote 2, da Ph.Eur ou FIP, também comercialmente disponível por exemplo da LGCpromochem, 500 g/mol), Pepsina (Merck, VL 317492 437 (1.07192)),Pancreatina (da Solvay Pharmaceuticals). Dieta de Protease: 51,9% de amido,21,3% de proteína e 2,6% de gorduras/lipídeos.Modelo In Vitro

A dieta de protease foi dissolvida em HCl 0,1 M a umaconcentração de 0,2 g de dieta/ml. O pH foi ajustado para atingir o pH 3,0(simulando condições gástricas). 100 μΐ de pasta fluida de dieta, 20 μΐ depepsina (concentração final de 70 mg/L em água desmineralizada (Milli-Q) e30 μΐ de protease (ou Milli-Q no controle sem enzima) foram adicionados acada reservatório em uma placa de microtítulo (MTP). Estes foram incubadospor 1 hora a 37°C, 700 rpm. No final de 1 hora de incubação, o pH foi medidoa 3,4. Para elevar o pH a 6,0 (simulando as condições intestinais), 25 μΐ de umtampão de pH 5/9 misto (0,8 M de MES, 0,8 M de imidazol, 0,8 M de Na-acetato, pH 5,0 ou pH 9,0; 40% de tampão pH 5 e 60% de tampão pH 9)foram adicionados a cada reservatório. Adicionalmente, 25 μΐ de sais biliares(concentração final de 5 mM) foram adicionados e estes foram incubados 2horas a 37°C, 700 rpm. Depois da incubação in vitro, as MTP's foramcentrifugadas a 2700 rpm (1500g), 4°C por 10 min e os sobrenadantes foramcoletados para outras investigações.

Determinação de grupos amino livre (OPA)

Os sobrenadantes das digestões in vitro foram analisadas peladeterminação dos grupos amino livres pela reação com OPA (O-ftaldialdeído). O procedimento da determinação OPA foi como segue; 20 μΐde sobrenadante diluído in vitro foi transferido para nova MTP e adicionados200 μΐ de reagente OPA (80 mg de OPA são dissolvidos em 2 ml de etanol a96%; 3,81 g de tetraborato de di-sódio decaidratado, 1 ml de SDS a 10%, 88mg de DTT e a solução de OPA-etanol é feita até 100 ml com água Milli-Q).

A absorbância foi medida a 340 nm. Uma série de padrão de serina (0,5mg/ml a 0,0078 mg/ml) foi incluída nas determinações.

A Tabela 2 abaixo mostra os resultados como mM de gruposamino hidrolisados. Os resultados são valores médios de determinações emduplicata e o desvio padrão (s.d.) também é indicado. Apenas os resultadoscom 72 mg de proteína de enzima por refeição são mostrados, visto que nesteteste os resultados com as dosagens de enzima mais baixas não permitem adiscriminação apropriada entre as enzimas.

Tabela 2

<table>table see original document page 59</column></row><table>

Os resultados da Tabela 2 mostram que as proteases dainvenção (SEQ 1, SEQ 10) executam muito bem neste modelo in vitro. Estenão é o caso para as proteases JP170 e TY145 que não são parte da presenteinvenção. De fato, desconsiderando a Nocardiopsis protease que é um tipomuito diferente de protease e não incluída na presente invenção, parece haveruma correlação entre as identidades percentuais com a SEQ ID NO: 1 dainvenção e o desempenho neste modelo (quanto mais alta a% de identidade,melhor o desempenho).

Em um experimento separado, realizado como descrito acima,nós testamos o desempenho in vitro da variante de protease de Bacillus lentusda invenção (variante da SEQ 11), incluindo também aqui para comparação aprotease de Nocardiopsis. Os resultados de dose-resposta são mostrados naTabela 3 abaixo.

Tabela 3

<table>table see original document page 59</column></row><table>

Primeiramente, estes resultados mostram uma boa relação dedose-resposta. Em segundo lugar, deve ser mencionado que também aprotease da invenção (variante SEQ 11) executa muito bem, em particular nadosagem de 72 mg de EP/refeição. A variante SEQ 11 parece ainda ajustar-sebem na correlação entre identidade percentual para a SEQ ID NO: 1 e odesempenho aludido acima (em relação à Nocardiopsis protease, que foiincluída em ambos os experimentos).

Exemplo 5: Composições de protease farmacêutica

(A) Pelotas de Alta Concentração

Um concentrado líquido filtrado contra germes da protease dosaminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 1 foi preparado como descrito noExemplo 1 e secado por pulverização. O teor de proteína de protease medidodo pó de protease secado por pulverização foi de 58,5%. 1125 g de proteaseseca por pulverização na forma de pó foi pré-misturada seca junto comcelulose microcristalina (450 g) e polietileno glicol 4000 (Macrogol® 4000;675 g) em um misturador comercialmente disponível. Álcool isopropílico(460 g; 100%) foi adicionado e a massa úmida resultante foi continuada sercuidadosamente misturada na temperatura ambiente. A massa homogeneizadafoi depois extrudada em uma extrusora comercialmente disponível que foiadaptada com uma matriz perfurada tendo um diâmetro de furo de 0.8 mmpara formar pelotas cilíndricas. A temperatura do cabeçote não excedeu 50°Cdurante a extrusão. O extrudado produzido foi de pelotas arredondadas aesféricas com um esferonizador comercialmente disponível pela adição daquantidade necessária de álcool isopropílico 100% (54,5 g). As pelotas foramsecadas em uma temperatura de produto de aproximadamente 40°C em umsecador a vácuo comercialmente disponível (da Voetsch). A temperatura doproduto não excedeu 45°C. As pelotas secas foram depois separadas usando-se uma máquina de peneiramento mecânico com peneiras de 0,7 e 1,4 mm. Asfrações de peneira de 0,7 mm e de 1,4 mm foram coletadas e enchidas emporções de 200 mg de pelotas cada uma em cápsulas de tamanho 2. Aconcentração da protease das pelotas secas resultantes foi deaproximadamente 29,3% (p/p).(B) Pelotas de Concentração mais Baixa

Similar ao exemplo (A) fornecido acima, as pelotas com umteor mais baixo de protease como substância medicamentosa foramproduzidas com um tamanho de lote de 2250 g usando 562,5 g de proteasesecada por pulverização na forma de pó (com um teor de proteína de proteasemedido de 58,5%), celulose microcristalina (1125 g), polietileno glicol 4000(562,5 g), álcool isopropílico para umedecimento (700 g) e álcool isopropílicopara arredondamento (61,2 g). A concentração da protease das pelotas secasresultantes foi de aproximadamente 14,6% (p/p).

As pelotas resultantes dos exemplos (A) e (B) foram testadasquanto a atividade proteolítica pela aplicação dos método FIP às proteases apartir de pó de pâncreas com a modificação de que a etapa de ativação foiomitida. Nenhuma perda na atividade proteolítica foi encontrada nas pelotasem cada caso em relação ao material de protease em pó de partida.

As pelotas resultantes dos exemplos (A) e (B) foram depoistestadas quanto a desintegração de acordo com a Pharm. Eur. 2.9.1. (Seção"Disintegration of tablets and capsules") (solução de teste: água - 500 ml, 37°C).

A desintegração das pelotas do exemplo (A) foi completadadentro de 3 min. A desintegração das pelotas do exemplo (B) foi completadadentro de 11 min.

Exemplo 6: Composições farmacêuticas de protease e amilase

As pelotas de concentração alta contendo amilase e proteaseforam preparadas como segue:

Um concentrado líquido foi preparado como descrito na DK2005 00931 (um ultrafiltrado filtrado contra germes) da amilase tendo osaminoácidos de 1 a 486 da SEQ ID NO: 16. O concentrado líquido foi secadopor pulverização. O teor de proteína de amilase medido do pó de amilasesecado por pulverização foi de 37%. A amilase secada por pulverização naforma de pó (398,5 g) foi pré-misturada seca junto com pó de protease secadopor pulverização preparado como descrito no Exemplo 5 (746,5 g; tendo umteor de proteína de protease medido de 58,5%), celulose microcristalina (458g) e polietileno glicol 4000 (Macrogol® 4000; 687 g) em um misturadorcomercialmente disponível. Álcool isopropílico 100% (460 g) foi adicionadoe a massa úmida resultante foi continuada até estar completamente misturadana temperatura ambiente. A massa homogeneizada foi depois extrudada emuma extrusora comercialmente disponível que foi adaptada com uma matrizperfurada tendo um diâmetro de furo de 0,8 mm para formar pelotascilíndricas. A temperatura do cabeçote não excedeu 50°C durante a extrusão.

O extrudado produzido foi de pelotas arredondadas a esféricas com umesferonizador comercialmente disponível pela adição da quantidadenecessária de álcool isopropílico 100% (58 g). As pelotas foram secadasusando uma temperatura de abastecimento de aproximadamente 40°C em umsecador a vácuo comercialmente disponível (da Voetsch). A temperatura doproduto não excedeu 45°C. As pelotas secadas foram depois separadasusando-se uma máquina de peneiramento mecânico com peneiras de 0,7 e 1,4mm. As frações de peneira de 0,7 mm e 1,4 mm foram coletadas e podem serenchidas em porções de 200 mg cada uma em cápsulas de tamanho 2. Aconcentração de protease das pelotas secas resultantes foi deaproximadamente 19,1% (p/p) e a concentração de amilase das pelotas secasresultantes foi de aproximadamente 6,4% (p/p).

As pelotas resultantes foram testadas quanto às atividadesproteolíticas e amilolíticas de acordo com os métodos como esboçado acima.Nenhuma perda na atividade proteolítica ou amilolítica foi encontrada naspelotas em cada caso em relação aos materiais de protease ou amilase em póde partida, respectivamente.

Exemplo 7: Estabilidade e eficácia in vivo de lipase na presença deproteaseA estabilidade e eficácia de uma variante de lipase deHumicola lanuginosa da SEQ ID NO: 15 na presença de uma protease dainvenção (a protease tendo os aminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 1)foram testados como segue:

A lipase purificada foi testada em um teste in vivo como nogeral descrito no Exemplo 2 do pedido PCT que reivindica prioridade dopedido DK n° 2005 00929, exceto que a dosagem foi de acordo com asunidades de lipase estimadas no ensaio de FIP pancreático também descritonesta referência. Os valores de digestibilidade (coeficiente de absorção degordura; CFA) foram estimados como também descrito no pedido de patentealudido.

A lipase foi testada sozinha e em combinação com a protease,em várias combinações de dosagem. A atividade de protease foi determinadausando-se o ensaio de FIP pancreático (ver referência no Exemplo 1).

Os resultados são mostrados na Tabela 4 abaixo, dado comovalores de CFA médio (%) e com indicação do desvio padrão (sd).

Tabela 4

<table>table see original document page 63</column></row><table>

Para cada uma das duas dosagens de lipase aqui testadas nãohouve nenhuma diferença significante entre os resultados sem e com protease,nas duas dosagens diferentes. Portanto pode ser concluído que a protease nãoteve nenhum efeito adverso sobre a lipase in vivo.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Novozymes A/S

Solvay Pharmaceuticals GmbH<120> Proteases para uso farmacêutico<130> 10794.204-W0<160> 18

<170> PatentIn versão 3.3<210> 1<211> 1140<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis<220>

<221> sig_peptideo<222> (1)..(87)<220><221> CDS<222> (1)..(1137)<220>

<221> misc_estrutura<222> (88)..(315)<223> Proregion<220>

<221> mat_peptideo<222> (316)..(1134)<400> 1

atg atg agg aaa aag agt ttt tgg ctt ggg atg ctg acg gcc ttc atg 48

Met Met Arg Lys Lys Ser Phe Trp Leu Gly Met Leu Thr Ala Phe Met-105 -100 -95 -90

ctc gtg ttc acg atg gca ttc age gat tcc gct tet gct gct caa ccg 96

Leu Val Phe Thr Met Ala Phe Ser Asp Ser Ala Ser Ala Ala Gln Pro

-85 -80 -75

gcg aaa aat gtt gaa aag gat tat att gtc gga ttt aag tca gga gtg 144

Ala Lys Asn Val Glu Lys Asp Tyr Ile Val Gly Phe Lys Ser Gly Val

-70 -65 -60

aaa acc gca tet gtc aaa aag gac ate ate aaa gag age ggc gga aaa 192

Lys Thr Ala Ser Val Lys Lys Asp Ile Ile Lys Glu Ser Gly Gly Lys

-55 -50 -45

gtg gac aag cag ttt aga ate ate aac gcg gca aaa gcg aag cta gac 240

Val Asp Lys Gln Phe Arg Ile Ile Asn Ala Ala Lys Ala Lys Leu Asp

-40 -35 -30

aaa gaa gcg ctt aag gaa gtc aaa aat gat ccg gat gtc gct tat gtg 288

Lys Glu Ala Leu Lys Glu Val Lys Asn Asp Pro Asp Val Ala Tyr Val-25 -20 -15 -10

gaa gag gat cat gtg gcc cat gcc ttg gcg caa acc gtt cct tac ggc 336

Glu Glu Asp His Val Ala His Ala Leu Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly

-5 -11 5

att cct ctc att aaa gcg gac aaa gtg cag gct caa ggc ttt aag gga 384

Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val Gln Ala Gln Gly Phe Lys Gly

10 15 20

gcg aat gta aaa gta gcc gtc ctg gat aca gga ate caa gct tet cat 432

Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Ile Gln Ala Ser His

25 30 35

ccg gac ttg aac gta gtc ggc gga gca age ttt gtg gct ggc gaa gct 480

Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala40 45 50 55

tat aac acc gac ggc aac gga cac ggc aca cat gtt gcc ggt aca gta 528

Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val

60 65 70

gct gcg ctt gac aat aca acg ggt gta tta ggc gtt gcg cca age gta 576

Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Val75 80 85tcc ttg tac gcg gtt aaa gta ctg aat tca age gga age gga tca tacSer Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn Ser Ser Gly Ser Gly Ser Tyr

90 95 100

age ggc att gta age gga ate gag tgg gcg aca aca aac ggc atg gatSer Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp

105 110 115

gtt ate aat atg age ctt ggg gga gea tca ggc tcg aca gcg atg aaaVal Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys120 125 130 135

cag gea gtc gac aat gea tat gea aga ggg gtt gtc gtt gta gct geaGln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg Gly Val Val Val Val Ala Ala

140 145 150

gea ggg aac age gga tet tca gga aac acg aat aca att ggc tat cctAla Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Asn Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro

155 160 165

gcg aaa tac gat tet gtc ate gct gtt ggt gcg gta gac tet aac ageAla Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser

170 175 180

aac aga gct tca ttt tcc age gtc gga gea gag ctt gaa gtc atg gctAsn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Ala Glu Leu Glu Val Met Ala

185

190

195

cct ggc gea ggc gtg tac age act tac cca acg aac act tat gea acaPro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr Pro Thr Asn Thr Tyr Ala Thr

200

205

210

215

ttg aac gga acg tca atg gct tet cct cat gta gcg gga gea gea gctLeu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala

220

225

230

ttg ate ttg tca aaa cat ccg aac ctt tca gct tca caa gtc cgc aacLeu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn

235 240 245

cgt etc tcc age acg gcg act tat ttg gga age tcc ttc tac tat gggArg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly

250 255 260

aaa ggt ctg ate aat gtc gaa gct gcc gct caa taaLys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala Ala Gln

265 270

<210> 2<211> 379<212> PRT

<213> Bacillus licheniformis<400> 2

Leu Val Phe Thr Met Ala Phe Ser Asp Ser Ala Ser Ala Ala Gln Pro

-85 -80 -75

Ala Lys Asn Val Glu Lys Asp Tyr Ile Val Gly Phe Lys Ser Gly Val

-70 -65 -60

Lys Thr Ala Ser Val Lys Lys Asp Ile Ile Lys Glu Ser Gly Gly Lys

-55 -50 -45

Val Asp Lys Gln Phe Arg Ile Ile Asn Ala Ala Lys Ala Lys Leu Asp

-40 -35 -30

Lys Glu Ala Leu Lys Glu Val Lys Asn Asp Pro Asp Val Ala Tyr Val-25 -20 -15 -10

Glu Glu Asp His Val Ala His Ala Leu Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly

-5 -11 5

Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val Gln Ala Gln Gly Phe Lys Gly

10 15 20

Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Ile Gln Ala Ser His

25 30 35

Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala40 45 50 55

Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val60 65 70

624

672

720

768

816

864

912

960

1008

1056

1104

1140Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Val

75 80 85

Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn Ser Ser Gly Ser GlySer Tyr

90 95 100

Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp

105 110 115

Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys120 125 130 135

Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg Gly Val Val Val Val Ala Ala

140 145 150

Ala Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Asn Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro

155 160 165

Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser

170 175 180

Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Ala Glu Leu Glu Val Met Ala

185 190 195

Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr Pro Thr Asn Thr Tyr Ala Thr200 205 210 215

Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala

220 225 230

Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn

235 240 245

Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly

250 255 260

Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala Ala Gln

265 270

<210> 3<211> 948<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis<220><221> CDS<222> (1)..(948)<220>

<221> sig_peptídeo<222> (1)..(93)<220>

<221> misc_estrutura<222> (94)..(282)<223> Pro-peptideo<220>

<221> mat_peptídeo<222> (283)..(948)<400> 3

ttg gtt agt aaa aag agt gtt aaa cga ggt ttg ate aca ggt ctc att 48

Leu Val Ser Lys Lys Ser Val Lys Arg Gly Leu Ile Thr Gly Leu Ile

-90 -85 -80

ggt att tet att tat tet tta ggt atg cac ccg gcc caa gcc gcg cca 96

Gly Ile Ser Ile Tyr Ser Leu Gly Met His Pro Ala Gln Ala Ala Pro

-75 -70 -65

tcg cct cat act cct gtt tca age gat cct tca tac aaa gcg gaa aca 144

Ser Pro His Thr Pro Val Ser Ser Asp Pro Ser Tyr Lys Ala Glu Thr

-60 -55 -50

tcg gtt act tat gac cca cac att aag age gat caa tac ggc ttg tat 192

Ser Val Thr Tyr Asp Pro His Ile Lys Ser Asp Gln Tyr Gly Leu Tyr

-45 -40 -35

tca aaa gcg ttt aca ggc acc ggc aaa gtg aat gaa aca aag gaa aaa 240

Ser Lys Ala Phe Thr Gly Thr Gly Lys Val Asn Glu Thr Lys Glu Lys-30 -25 -20 -15

gcg gaa aaa aag tca ccc gcc aaa gct cct tac age att aaa tcg gtg 288

Ala Glu Lys Lys Ser Pro Ala Lys Ala Pro Tyr Ser Ile Lys Ser Val

-10 -5 -1 1

att ggt tet gat gat cgg aca agg gtc acc aac aca acc gea tat ccg 336Ile Gly Ser Asp Asp Arg Thr Arg Val Thr Asn Thr Thr Ala Tyr Pro

5 10 15

tac aga gcg ate gtt cat att tca age age ate ggt tca tgc acc gga 384

Tyr Arg Ala Ile Val His Ile Ser Ser Ser Ile Gly Ser Cys Thr Gly

20 25 30

tgg atg ate ggt ccg aaa acc gtc gea aca gcc gga cac tgc ate tat 432

Trp Met Ile Gly Pro Lys Thr Val Ala Thr Ala Gly His Cys Ile Tyr35 40 45 50

gac aca tca age ggt tca ttt gcc ggt aca gcc act gtt tcg ccg gga 480

Asp Thr Ser Ser Gly Ser Phe Ala Gly Thr Ala Thr Val Ser Pro Gly

55 60 65

cgg aac ggg aca age tat cct tac ggc tca gtt aaa tcg acg cgc tac 528

Arg Asn Gly Thr Ser Tyr Pro Tyr Gly Ser Val Lys Ser Thr Arg Tyr

70 75 80

ttt att ccg tca gga tgg aga age gga aac acc aat tac gat tac gga 576

Phe Ile Pro Ser Gly Trp Arg Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asp Tyr Gly

85 90 95

gea ate gaa cta age gaa ccg ate ggc aat act gtc gga tac ttc gga 624

Ala Ile Glu Leu Ser Glu Pro Ile Gly Asn Thr Val Gly Tyr Phe Gly

100 105 110

tac tcg tac act act tca tca ctt gtt ggg aca act gtt acc ate age 672

Tyr Ser Tyr Thr Thr Ser Ser Leu Val Gly Thr Thr Val Thr Ile Ser115 120 125 130

ggc tac cca ggc gat aaa aca gea ggc aca caa tgg cag cat tca gga 720

Gly Tyr Pro Gly Asp Lys Thr Ala Gly Thr Gln Trp Gln His Ser Gly

135 140 145

ccg att gcc ate tcc gaa acg tat aaa ttg cag tac gea atg gac acg 768

Pro Ile Ala Ile Ser Glu Thr Tyr Lys Leu Gln Tyr Ala Met Asp Thr

150 155 160

tac gga gga caa age ggt tca ccg gta ttc gaa caa age age tcc aga 816

Tyr Gly Gly Gln Ser Gly Ser Pro Val Phe Glu Gln Ser Ser Ser Arg

165 170 175

acg aac tgt age ggt ccg tgc tcg ctt gcc gta cac aca aat gga gta 864

Thr Asn Cys Ser Gly Pro Cys Ser Leu Ala Val His Thr Asn Gly Val

180 185 190

tac ggc ggc tcc tcg tac aac aga ggc acc cgg att aca aaa gag gtg 912

Tyr Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Arg Gly Thr Arg Ile Thr Lys Glu Val195 200 205 210

ttc gac aat ttg acc aac tgg aaa aac age gea caa 948

Phe Asp Asn Leu Thr Asn Trp Lys Asn Ser Ala Gln215 220

<210> 4<211> 316<212> PRT

<213> Bacillus licheniformis<400> 4Leu Val

Gly Ile

Ser Pro

Ser Val-45Ser Lys-30

Ala GluIle Gly

20

Ser Lys Lys -90 Ser Val Lys Arg Gly -85 Leu Ile Thr Gly Leu -80 IleSer Ile -75 Tyr Ser Leu Gly Met -70 His Pro Ala Gln Ala -65 Ala ProHis Thr Pro Val Ser Ser Asp Pro Ser Tyr Lys Ala Glu Thr-60 -55 -50 Thr Tyr Asp Pro His -40 Ile Lys Ser Asp Gln -35 Tyr Gly Leu TyrAla Phe Thr Gly -25 Thr Gly Lys Val Asn -20 Glu Thr Lys Glu Lys -15Lys Lys Ser -10 Pro Ala Lys Ala Pro -5 Tyr Ser Ile Lys -1 Ser 1 ValSer Asp Asp Arg Thr Arg Val Thr Asn Thr Thr Ala Tyr Pro5 10 15 Ala Ile Val His Ile Ser Ser Ser Ile Gly Ser Cys Thr Gly 25 30 Ile Gly Pro Lys Thr Val Ala Thr Ala Gly His Cys Ile Tyr35 40 45 50

Asp Thr Ser Ser Gly 55 Ser Phe Ala Gly Thr 60 Ala Thr Val Ser Pro 65 GlyArg Asn Gly Thr 70 Ser Tyr Pro Tyr Gly 75 Ser Val Lys Ser Thr 80 Arg TyrPhe Ile Pro 85 Ser Gly Trp Arg Ser 90 Gly Asn Thr Asn Tyr 95 Asp Tyr GlyAla Ile 100 Glu Leu Ser Glu Pro 105 Ile Gly Asn Thr Val 110 Gly Tyr Phe GlyTyr Ser Tyr Thr Thr Ser Ser Leu Val Gly Thr Thr Val Thr Ile Ser115 120 125 130Gly Tyr Pro Gly Asp 135 Lys Thr Ala Gly Thr 140 Gln Trp Gln His Ser 145 GlyPro Ile Ala Ile 150 Ser Glu Thr Tyr Lys 155 Leu Gln Tyr Ala Met 160 Asp ThrTyr Gly Gly Gln Ser Gly Ser Pro Val Phe Glu Gln Ser Ser Ser Arg 165 170 175 Thr Asn Cys Ser Gly Pro Cys Ser Leu Ala Val His Thr Asn Gly Val 180 185 190 Tyr Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Arg Gly Thr Arg Ile Thr Lys Glu Val195 200 205 210Phe Asp Asn Leu Thr 215 Asn Trp Lys Asn Ser 220 Ala Gln

<210> 5<211> 37 9<212> PRT

<213> Bacillus Iicheniformis<220>

<221> SINAL<222> (1)..(29)<220>

<221> PROPEP<222> (30)..(105)<220>

<221> mat_peptideo<222> (106)..(379)<400> 5

Met Met Arg Lys Lys Ser Phe Trp Leu Gly Met Leu Thr Ala Phe Met

-105 -100 - 95 —Leu Val Phe Thr Met -85 Ala Phe Ser Asp Ser -80 Ala Ser Ala Ala Gln -75 ProAla Lys Asn Val -70 Glu Lys Asp Tyr Ile -65 Val Gly Phe Lys Ser -60 Gly ValLys Thr Ala -55 Ser Val Lys Lys Asp -50 Ile Ile Lys Glu Ser -45 Gly Gly LysVal Asp -40 Lys Gln Phe Arg Ile -35 Ile Asn Ala Ala Lys -30 Ala Lys Leu AspLys Glu Ala Leu Lys Glu Val Lys Asn Asp Pro Asp Val Ala Tyr Val-25 -20 -15 -10Glu Glu Asp His Val -5 Ala His Ala Leu -1 Ala 1 Gln Thr Val Pro 5 Tyr GlyIle Pro Leu 10 Ile Lys Ala Asp Lys 15 Val Gln Ala Gln Gly 20 Phe Lys GlyAla Asn 25 Val Lys Val Ala Val 30 Leu Asp Thr Gly Ile 35 Gln Ala Ser HisPro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala40 45 50 55Tyr Asn Thr Asp Gly 60 Asn Gly His Gly Thr 65 His Val Ala Gly Thr 70 ValAla Ala Leu Asp 75 Asn Thr Thr Gly Val 80 Leu Gly Val Ala Pro 85 Ser ValSer Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn Ser Ser Gly Ser Gly Thr Tyr 90 95 100Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp

105 110 115

Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys120 125 130 135

Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg Gly Val Val Val Val Ala Ala

140 145 150

Ala Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Asn Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro

155 160 165

Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser

170 175 180

Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Ala Glu Leu Glu Val Met Ala

185 190 195

Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr Pro Thr Ser Thr Tyr Ala Thr200 205 210 215

Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala

220 225 230

Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn

235 240 245

Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly

250 255 260

Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala Ala Gln

265 270

<210> 6<211> 381<212> PRT

<213> Bacillus subtilis var. natto<220>

<221> SINAL<222> (1)..(23)<220>

<221> PROPEP<222> (24)..(106)<220>

<221> mat_peptídeo<222> (107)..(381)<400> 6

Met Arg Ser Lys Lys Leu Trp Ile Ser Leu Leu Phe Ala Leu Thr Leu

-105 -100 -95

Ile Phe Thr Met Ala Phe Ser Asn Met Ser Ala Gln Ala Ala Gly Lys-90 -85 -80 -75

Ser Ser Thr Glu Lys Lys Tyr Ile Val Gly Phe Lys Gln Thr Met Ser

-70 -65 -60

Ala Met Ser Ser Ala Lys Lys Lys Asp Val Ile Ser Glu Lys Gly Gly

-55 -50 -45

Lys Val Gln Lys Gln Phe Lys Tyr Val Asn Ala Ala Ala Ala Thr Leu

-40 -35 -30

Asp Glu Lys Ala Val Lys Glu Leu Lys Lys Asp Pro Ser Val Ala Tyr

-25 -20 -15

Val Glu Glu Asp His Ile Ala His Glu Tyr Ala Gln Ser Val Pro Tyr-10 -5 -11 5

Gly Ile Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu His Ser Gln Gly Tyr Thr

10 15 20

Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp Ser Gly Ile Asp Ser Ser

25 30 35

His Pro Asp Leu Asn Val Arg Gly Gly Ala Ser Phe Val Pro Ser Glu

40 45 50

Thr Asn Pro Tyr Gln Asp Gly Ser Ser His Gly Thr His Val Ala Gly55 60 65 70

Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly Val Ala Pro

75 80 85

Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asp Ser Thr Gly Ser Gly

90 95 100

Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu Trp Ala Ile Ser Asn Asn105 110 115

Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Thr Gly Ser Thr Ala

120 125 130

Leu Lys Thr Val Val Asp Lys Ala Val Ser Ser Gly Ile Val Val Ala135 140 145 150

Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Ser Ser Gly Ser Thr Ser Thr Val Gly

155 160 165

Tyr Pro Ala Lys Tyr Pro Ser Thr Ile Ala Val Gly Ala Val Asn Ser

170 175 180

Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Ser Glu Leu Asp Val

185 190 195

Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr Leu Pro Gly Gly Thr Tyr

200 205 210

Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala215 220 225 230

Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Thr Trp Thr Asn Ala Gln Val

235 240 245

Arg Asp Arg Leu Glu Ser Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Asn Ser Phe Tyr

250 255 260

Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala Ala Ala Gln265 270 275

<210> 7<211> 275<212> PRT

<213> Bacillus pumilus (mesentericus)<220>

<221> mat_peptídeo<222> (1)..(275)<400> 7

Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Ile Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu15 10 15

His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp

20 25 30

Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Asn Val Arg Gly Gly Ala

35 40 45

Ser Phe Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Tyr Gln Asp Gly Ser Ser His

50 55 60

Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly65 70 75 80

Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ser Ala Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu

85 90 95

Asp Ser Thr Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu

100 105 110

Trp Ala Ile Ser Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly

115 120 125

Pro Thr Gly Ser Thr Ala Leu Lys Thr Val Val Asp Lys Ala Val Ser

130 135 140

Ser Gly Ile Val Val Ala Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Ser Ser Gly145 150 155 160

Ser Thr Ser Thr Val Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Pro Ser Thr Ile Ala

165 170 175

Val Gly Ala Val Asn Ser Ala Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Ala

180 185 190

Gly Ser Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr

195 200 205

Leu Pro Gly Gly Thr Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr

210 215 220

Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Thr225 230 235 240

Trp Thr Asn Ala Gln Val Arg Asp Arg Leu Glu Ser Thr Ala Thr Tyr

245 250 255

Leu Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala260 265 270

\Ala Ala Gln275

<210> 8<211> 381<212> PRT

<213> Bacillus subtilis<220>

<221> SINAL<222> (1)..(23)<220>

<221> PROPEP<222> (24)..(106)<220>

<221> mat_peptideo<222> (107)..(381)<400> 8

Met Arg Ser Lys Lys Leu Trp Ile Ser Leu Leu Phe Ala Leu Thr Leu-105 -100 -95

Ile Phe Thr Met Ala Phe Ser Asn Met Ser Val Gln Ala Ala Gly Lys-90 -85 -80 -75Ser Ser Thr Glu Lys -70 Lys Tyr Ile Val Gly -65 Phe Lys Gln Thr Met -60 SerAla Met Ser Ser -55 Ala Lys Lys Lys Asp -50 Val Ile Ser Glu Lys -45 Gly GlyLys Val Gln -40 Lys Gln Phe Lys Tyr -35 Val Asn Ala Ala Ala -30 Ala Thr LeuAsp Glu -25 Lys Ala Val Lys Glu -20 Leu Lys Lys Asp Pro -15 Ser Val Ala TyrVal Glu Glu Asp His Ile Ala His Glu Tyr Ala Gln Ser Val Pro Tyr-10 -5 -1 1 5 Gly Ile Ser Gln 10 Ile Lys Ala Pro Ala 15 Leu His Ser Gln Gly 20 Tyr ThrGly Ser Asn 25 Val Lys Val Ala Val 30 Ile Asp Ser Gly Ile 35 Asp Ser SerHis Pro Asp Leu Asn Val Arg Gly Gly Ala Ser Phe Val Pro Ser Glu

40 45 50

Thr Asn Pro Tyr Gln Asp Gly Ser Ser His Gly Thr His Val Ala Gly55 60 65 70

Thr Ile -Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly Val Ser Pro75 80 85

Ser Ala Ser Leu 90 Tyr Ala Val Lys Val 95 Leu Asp Ser Thr Gly 100 Ser GlyGln Tyr Ser 105 Trp Ile Ile Asn Gly 110 Ile Glu Trp Ala Ile 115 Ser Asn AsnMet Asp 120 Val Ile Asn Met Ser 125 Leu Gly Gly Pro Thr 130 Gly Ser Thr AlaLeu Lys Thr Val Val Asp Lys Ala Val Ser Ser Gly Ile Val Val Ala135 140 145 150Ala Ala Ala Gly Asn 155 Glu Gly Ser Ser Gly 160 Ser Thr Ser Thr Val 165 GlyTyr Pro Ala Lys 170 Tyr Pro Ser Thr Ile 175 Ala Val Gly Ala Val 180 Asn SerSer Asn Gln 185 Arg Ala Ser Phe Ser 190 Ser Ala Gly Ser Glu 195 Leu Asp ValMet Ala 200 Pro Gly Val Ser Ile 205 Gln Ser Thr Leu Pro 210 Gly Gly Thr TyrGly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala215 220 225 230Ala Ala Leu lie. Leu 235 Ser Lys His Pro Thr 240 Trp Thr Asn Ala Gln 245 ValArg Asp Arg Leu 250 Glu Ser Thr Ala Thr 255 Tyr Leu Gly Asn Ser 260 Phe TyrTyr Gly Lys Gly \ Leu Ile Asn Val Gln Ala Ala Ala Gln265 270 275

<210> 9<211> 381<212> PRT

<213> Bacillus stearothermophilus<220>

<221> SINAL<222> (1)..(29)<220>

<221> PROPEP<222> (30)..(106)<220>

<221> mat_peptideo<222> (107)..(381)<400> 9

Met Arg Ser Lys Lys Leu Trp Ile Ser Leu Leu Phe Ala Leu Thr Leu

-105 -100 -95

Ile Phe Thr Met Ala Phe Ser Asn Met Ser Val Gln Ala Ala Gly Lys-90 -85 -80 -75

Ser Ser Thr Glu Lys Lys Tyr Ile Val Gly Phe Lys Gln Thr Met Ser

-70 -65 -60

Ala Met Ser Ser Ala Lys Lys Lys Asp Val Ile Ser Glu Lys Gly Gly

-55 -50 -45

Lys Val Gln Lys Gln Phe Lys Tyr Val Asn Ala Ala Ala Ala Thr Leu

-40 -35 -30

Asp Glu Lys Ala Val Lys Glu Leu Lys Lys Asp Pro Ser Val Ala Tyr

-25 -20 -15

Val Glu Glu Asp His Ile Ala His Glu Tyr Ala Gln Ser Val Pro Tyr-10 -5 -11 5

Gly Ile Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu His Ser Gln Gly Tyr Thr

10 15 20

Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp Ser Gly Ile Asp Ser Ser

25 30 35

His Pro Asp Leu Asn Val Arg Gly Gly Ala Ser Phe Val Pro Ser Glu

40 45 50

Thr Asn Pro Tyr Gln Asp Gly Ser Ser His Gly Thr His Val Ala Gly55 60 65 70

Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly Val Ser Pro

75- 80 85

Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asp Ser Thr Gly Ser Gly

90 95 100

Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu Trp Ala Ile Ser Asn Asn

105 110 115

Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Ser Gly Ser Thr Ala

120 125 130

Leu Lys Thr Val Val Asp Lys Ala Val Ser Ser Gly Ile Val Val Ala135 140 145 150

Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Ser Ser Gly Ser Ser Ser Thr Val Gly

155 160 165

Tyr Pro Ala Lys Tyr Pro Ser Thr Ile Ala Val Gly Ala Val Asn Ser

170 175 180

Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Ala Gly Ser Glu Leu Asp Val

185 190 195

Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr Leu Pro Gly Gly Thr Tyr

200 205 210

Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala215 220 225 230

Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Thr Trp Thr Asn Ala Gln Val

235 . 240 245

Arg Asp Arg Leu Glu Ser Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Asn Ser Phe Tyr

250 255 260

Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala Ala Ala Gln265 270 275

\<210> 10<211> 382<212> PRT

<213> Bacillus amyloliquefaciens<220>

<221> SINAL<222> (1)..(32)<220>

<221> PROPEP<222> (33)..(107)<220>

<221> mat_peptideo<222> (108)..(382)<400> 10

Met Arg Gly Lys Lys Val Trp Ile Ser Leu Leu Phe Ala Leu Ala Leu-105 -100 -95

Ile Phe Thr Met Ala Phe Gly Ser Thr Ser Ser Ala Gln Ala Ala Gly -90 -85 -80 Lys Ser Asn Gly Glu Lys Lys Tyr Ile Val Gly Phe Lys Gln Thr Met-75 -70 -65 -60Ser Thr Met Ser Ala Ala Lys Lys Lys Asp Val Ile Ser Glu Lys Gly -55 -50 -45 Gly Lys Val Gln Lys Gln Phe Lys Tyr Val Asp Ala Ala Ser Ala Thr -40 -35 -30 Leu Asn Glu Lys Ala Val Lys Glu Leu Lys Lys Asp Pro Ser Val Ala -25 -20 -15 Tyr Val Glu Glu Asp His Val Ala His Ala Tyr Ala Gln Ser Val Pro -10 -5 -1 1 5Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu His Ser Gln Gly Tyr 10 15 20 Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp Ser Gly Ile Asp Ser 25 30 35 Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala Ser Met Val Pro Ser 40 45 50 Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His Gly Thr His Val Ala 55 60 65 Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly Val Ala70 75 80 85Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly Ser 90 95 100 Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu Trp Ala Ile Ala Asn 105 110 115 Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Ser Gly Ser Ala 120 125 130 Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala Ser Gly Val Val Val 135 140 145 Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly Ser Ser Ser Thr Val150 155 160 165Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp 170 175 180 Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Pro Glu Leu Asp 185 190 195 Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr Leu Pro Gly Asn Lys 200 205 210 Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly 215 220 225 Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Trp Thr Asn Thr Gln230 235 240 245Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys Leu Gly Asp Ser Phe 250 255 260 Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala Ala Ala Gln 265 270 275 <210> 11

\<211> 269<212> PRT

<213> Bacillus Ientus<220>

<221> mat_peptídeo<222> (1)..(269)<400> 11

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile225 230 235 .240

Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 - 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg260 265

<210> 12<211> 380<212> PRT

<213> Bacillus clausii<220>

<221> SINAL<222> (1)..(27)<220>

<221> PROPEP<222> (28)..(111)<220>

<221> mat_peptídeo<222> (112)..(380)<4 00> 12

Met Lys Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu

-110 -105 -100

Ile Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala Ala Glu Glu Ala

-95 -90 -85

Lys Glu Lys Tyr Leu Ile Gly Phe Asn Glu Gln Glu Ala Val Ser Glu '-80 -75 -70 -65

Phe Val Glu Gln Val Glu Ala Asn Asp Glu Val Ala Ile Leu Ser Glu-60 -55 -50

\12 Glu Glu Glu Val Glu Ile Glu Leu Leu His Glu Phe Glu Thr Ile Pro -45 -40 -35 Val Leu Ser Val Glu Leu Ser Pro Glu Asp Val Asp Ala Leu Glu Leu -30 -25 -20 Asp Pro Ala Ile Ser Tyr Ile Glu Glu Asp Ala Glu Val Thr Thr Met -15 -10 -5 -1Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala1 5 10 15 His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser 35 40 45 Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr 50 55 60 His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu65 70 75 80Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala 85 90 95 Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala 100 105 110 Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser 115 120 125 Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly 130 135 140 Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser145 150 155 160Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln 165 170 175 Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile 180 185 190 Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr 195 200 205 Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala 210 215 220 Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile225 230 235 240Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu 245 250 255 Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg- 260 265

<210> 13

<211> 378

<212> PRT

<213> Bacillus sp.

<220>

<221> SINAL<222> (1)..(27)<220>

<221> PROPEP<222> (28)..(110)<220>

<221> mat_peptideo<222> (111)..(378)<400> 13

Met Asn Lys Lys Met Gly Lys Ile Val Ala Gly Thr Ala Leu Ile

-110 -105 - 100 Ile Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Gln Ala Ala Glu Glu Ala-95 -90 -85 80Lys Glu Lys Tyr Leu -75 Ile Gly Phe Lys Glu -70 Gln Glu Val Met Ser -65 GlnPhe Val Asp Gln -60 Ile Asp Gly Asp Glu -55 Tyr Ser Ile Ser Ser -50 Gln AlaGlu Asp Val Glu Ile Asp Leu Leu His Glu Phe Asp Phe Ile Pro Val-45 -40 -35 Leu Ser -30 Val Glu Leu Asp Pro -25 Glu Asp Val Asp Ala -20 Leu Glu Leu AspPro Ala Ile Ala Tyr Ile Glu Glu Asp Ala Glu Val Thr Thr Met Gln-15 -10 -5 -1 1Thr Val Pro Trp 5 Gly Ile Asn Arg Val 10 Gln Ala Pro Ile Ala 15 Gln SerArg Gly Phe 20 Thr Gly Thr Gly Val 25 Arg Val Ala Val Leu 30 Asp Thr GlyIle Ser 35 Asn His Ala Asp Leu 40 Arg Ile Arg Gly Gly 45 Ala Ser Phe ValPro Gly Glu Pro Asn Ile Ser Asp Gly Asn Gly His Gly Thr Gln Val50 55 60 65Ala Gly Thr Ile Ala 70 Ala Leu Asn Asn Ser 75 Ile Gly Val Leu Gly 80 ValAla Pro Asn Val Asp Leu Tyr Gly Val Lys Val Leu Gly Ala Ser Gly 85 90 95 Ser Gly Ser 100 Ile Ser Gly Ile Ala 105 Gln Gly Leu Gln Trp 110 Ala Ala AsnAsn Gly Met His Ile Ala Asn Met Ser Leu Gly Ser Ser Ala Gly Ser 115 120 125 Ala Thr Met Glu Gln Ala Val Asn Gln Ala Thr Ala Ser Gly Val Leu130 135 140 145Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Asn Val Gly Phe Pro 150 155 160 Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln Asn Asn 165 170 175 Asn Arg Ala Thr Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile Val Ala 180 185 190 Pro Gly Val Gly Val Gln Ser Thr Val Pro Gly Asn Gly Tyr Ala Ser 195 200 205 Phe Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Val Ala Ala210 215 220 225Leu Val Lys Gln Lys 230 Asn Pro Ser Trp Ser 235 Asn Val Gln Ile Arg 240 AsnHis Leu Lys Asn Thr Ala Thr Asn Leu Gly Asn Thr Thr Gln Phe Gly 245 250 255 Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg 260 265

<210> 14<211> 269<212> PRT

<213> Thermomyces Ianuginosus<220>

<221> mat_peptideo<222> (1)..()<4 00> 14

Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr1 5 10 15 Ser Ala Ala Ala 20 Tyr Cys Gly Lys Asn 25 Asn Asp Ala Pro Ala 30 Gly ThrAsn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp 35 40 45 Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val Thr 50 55 60 Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu Ile Val Leu Ser Phe65 70 75 80Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly Asn Leu Asn Phe Asp 85 90 95 Leu Lys Glu Ile 100 Asn Asp Ile Cys Ser 105 Gly Cys Arg Gly His 110 Asp GlyPhe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr Leu Arg Gln Lys Val 115 120 125

\Glu Asp 130 Ala Val Arg Glu His 135 Pro Asp Tyr Arg Val 140 Val Phe Thr GlyHis Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Asp Leu Arg145 150 155 160Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val 165 170 175 Gly Asn Arg Ala 180 Phe Ala Glu Phe Leu 185 Thr Val Gln Thr Gly 190 Gly ThrLeu Tyr Arg 195 Ile Thr His Thr Asn 200 Asp Ile Val Pro Arg 205 Leu Pro ProArg Glu 210 Phe Gly Tyr Ser His 215 Ser Ser Pro Glu Tyr 220 Trp Ile Lys SerGly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp Ile Val Lys Ile Glu Gly225 230 235 240Ile Asp Ala Thr Gly 245 Gly Asn Asn Gln Pro 250 Asn Ile Pro Asp Ile 255 ProAla His Leu Trp 260 Tyr Phe Gly Leu Ile 265 Gly Thr Cys Leu <210> 15

<211> 274<212> PRT

<213> Humicola Ianuginosa<220>

<221> VARIANTE<222> (1)..(269)<220>

<221> mat_peptideo<222> (6)..(269)<4 00> 15

Ser Pro Ile Arg Arg Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn-5 -1 1 5 10 Leu Phe Ala Gln 15 Tyr Ser Ala Ala Ala 20 Tyr Cys Gly Lys Asn 25 Asn AspAla Pro Ala Gly Thr Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro Glu 30 35 40 Val Glu 45 Lys Ala Asp Ala Thr 50 Phe Leu Tyr Ser Phe 55 Glu Asp Ser GlyVal Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu60 65 70 75Ile Val Leu Ser Phe 80 Arg Gly Ser Arg Ser 85 Ile Glu Asn Trp Ile 90 GlyAsn Leu Asn Phe 95 Asp Leu Lys Glu Ile 100 Asn Asp Ile Cys Ser 105 Gly CysArg Gly His 110 Asp Gly Phe Thr Ser 115 Ser Trp Arg Ser Val 120 Ala Asp ThrLeu Arg 125 Gln Lys Val Glu Asp 130 Ala Val Arg Glu His 135 Pro Asp Tyr ArgVal Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala140 145 150 155Gly Ala Asp Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr 160 165 170 Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val 175 180 185 Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val 190 195 200 Pro Arg 205 Leu Pro Pro Arg Glu 210 Phe Gly Tyr Ser His 215 Ser Ser Pro GluTyr Trp Ile Lys Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Arg Arg Arg Asp Ile220 225 230 235Val Lys Ile Glu Gly 240 Ile Asp Ala Thr Gly 245 Gly Asn Asn Gln Pro 250 AsnIle Pro Asp Ile 255 Pro Ala His Leu Trp 260 Tyr Phe Gly Leu Ile 265 Gly ThrCys Leu

<210> 16<211> 513<212> PRT

<213> Bacillus stearothermophilus<220>

<221> VARIANTE

<222> (1)..(513)<400> 16

Ala Ala Pro Phe Asn Gly Thr Met Met Glri Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu1 5 10 15 Pro Asp Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Ala Asn Glu Ala Asn Asn 20 25 30 Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr Lys 35 40 45 Gly Thr Ser Arg Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu Tyr Asp 50 55 60 Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr65 70 75 80Lys Ala Gln Tyr Leu Gln Ala Ile Gln Ala Ala His Ala Ala Gly Met 85 90 95 Gln Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asp His Lys Gly Gly Ala Asp Gly 100 105 110 Thr Glu Trp Val Asp Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asp Arg Asn Gln 115 120 125 Glu Ile Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Lys Phe Asp Phe 130 135 140 Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His145 150 155 160Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Ser Arg Ile Tyr 165 170 175 Lys Phe Arg Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu Phe Gly 180 185 190 Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Met Asp His Pro Glu 195 200 205 Val Val Thr Glu Leu Lys Asn Trp Gly Lys Trp Tyr Val Asn Thr Thr 210 215 220 Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser225 230 235 240Phe Phe Pro Asp Trp Leu Ser Tyr Val Arg Ser Gln Thr Gly Lys Pro 245 250 255 Leu Phe Thr Val Gly Glu Tyr Trp Ser Tyr Asp Ile Asn Lys Leu His 260 265 270 Asn Tyr Ile Thr Lys Thr Asp Gly Thr Met Ser Leu Phe Asp Ala Pro 275 280 285 Leu His Asn Lys Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Gly Gly Ala Phe Asp 290 295 300 Met Arg Thr Leu Met Thr Asn Thr Leu Met Lys Asp Gln Pro Thr Leu305 310 315 320Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Glu Pro Gly Gln Ala Leu 325 330 335 Gln Ser Trp Val Asp Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile 340 345 350 Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly Asp Tyr Tyr 355 360 365 Gly Ile Pro Gln Tyr Asn Ile Pro Ser Leu Lys Ser Lys Ile Asp Pro 370 375 380 Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His Asp Tyr385 390 395 400Leu Asp His Ser Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Gly Thr Glu 405 410 415 Lys Pro Gly Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro Gly Gly420 425 430 Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Gln His Ala Gly Lys Val Phe Tyr 435 440 445 Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr Ile Asn Ser Asp Gly 450 455 460 Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Trp Val Pro465 470 475 480Arg Lys Thr Thr Val Ser Thr Ile Ala Arg Pro Ile Thr Thr Arg Pro 485 490 495 Trp Thr Gly Glu Phe Val Arg Trp Thr Glu Pro Arg Leu Val Ala Trp 500 505 510 Pro <210> 17 <211> 481 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <220> <221> VARIANTE <222> (1).. (481) <400> 17 Val Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro Asn Asp1 5 10 15 Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ala Glu His Leu Ser Asp 20 25 30 Ile Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Thr Ser 35 40 45 Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu 50 55 60 Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys Gly Glu65 70 75 80Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn Val Tyr 85 90 95 Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr Glu Asp 100 105 110 Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val Ile Ser 115 120 125 Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro Gly Arg 130 135 140 Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Tyr Trp Tyr His Phe Asp Gly145 150 155 160Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys Phe Gln 165 170 175 Gly Lys Thr Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Phe Gly Asn Tyr Asp 180 185 190 Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val Val Ala 195 200 205 Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln Leu Asp 210 215 220 Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe Leu Arg225 230 235 240Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met Phe Thr 245 250 255 Val Ala Glu Tyr Trp Ser Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu 260 265 270 Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu His Tyr 275 280 285 Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met Arg Lys 290 295 300 Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser Val Thr305 310 315 320Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu Ser Thr 325 330 335Val Gln Thr

Glu Ser Gly355

Gly Asp Ser

370Ile Leu Lys385

Phe Asp His

Val Ala Asn

Ala Lys Arg435

Asp Ile Thr450

Trp Gly Glu465Arg

<210> 18<211> 483<212> PRT<213> Bacillus sp.<220>

<221> VARIANTE<222> (1)..(483)<4 00> 18

His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr15 10 15

Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Ser Asp Ala Ser20 25 30

Asn Leu Lys Asp Lys Gly Ile Ser Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp 35 40 45 Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr 50 55 60 Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Ile Arg Thr Lys Tyr Gly65 70 75 80Thr Arg Asn Gln Leu Gln Ala Ala Val Asn Ala Leu Lys Ser Asn Gly 85 90 95 Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Ásp 100 105 110 Ala Thr Glu Met Val Lys Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn 115 120 125 Gln Glu Val Ser Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp 130 135 140 Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr145 150 155 160His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Lys Leu Asn Asn Arg 165 170 175 Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Lys Gly Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu 180 185 190 Phe Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met Asp His 195 200 205 Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr Thr Asn 210 215 220 Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His Ile Lys

225 230 235 240

Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Ile Asn His Val Arg Ser Ala Thr Gly

245 250 255

Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu Gly Ala

260 265 270

Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val Phe Asp

Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Arg340 345 350 Tyr Pro Gln Val Phe 360 Tyr Gly Asp Met Tyr 365 Gly Thr LysGln Arg Glu Ile 375 Pro Ala Leu Lys His 380 Lys Ile Glu ProAla Arg Lys 390 Gln Tyr Ala Tyr Gly 395 Ala Gln His Asp Tyr 400His Asp 405 Ile Val Gly Trp Thr 410 Arg Glu Gly Asp Ser 415 SerSer Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro Gly Gly420 425 430 Met Tyr Val Gly Arg 440 Gln Asn Ala Gly Glu 445 Thr Trp HisGly Asn Arg Ser 455 Glu Pro Val Val Ile 460 Asn Ser Glu GlyPhe His Val 470 Asn Gly Gly Ser Val 475 Ser Ile Tyr Val Gln 480Val

Tyr305Met

Ala

Leu

Tyr

Asp385Asp

Thr

Gly

Trp

Asp465Val

Pro290Asp

His

Leu

Thr

Tyr370Pro

Tyr

Ala

Gly

Thr450Gly

Asn

275Leu

Met

Ala

Glu

Leu355Gly

Ile

Leu

His

Asn435Asp

Trp

Lys

His Tyr

Arg Gln

Val Thr325Ser Phe340

Thr Arg

Ile Pro

Leu Glu

Asp His405Pro Asn420

Lys TrpIle ThrGly Asn

Asn

Ile310Phe

Val

Glu

Thr

Ala390His

Ser

Met

Gly

Phe470

Leu295Phe

Val

Glu

Gln

His375Arg

Asn

Gly

Phe

Asn455Ser

280

Tyr Asn

Asn Gly

Asp Asn

Glu Trp345Gly Tyr360

Gly Val

Gln Lys

Ile Ile

Leu Ala425Val Gly440

Lys AlaVal Asn

Ala Ser

Thr Val315His Asp330

Phe Lys

Pro Ser

Pro Ala

Tyr Ala395Gly Trp410

Thr Ile

Arg Asn

Gly Thr

Gly Gly475

285Lys Ser300

Val Gln

Ser Gln

Pro Leu

Val Phe365Met Lys380

Tyr Gly

Thr Arg

Met Ser

Lys Ala445Val Thr460

Ser Val

Gly Gly Asn

Lys His Pro320

Pro Glu Glu

335Ala Tyr Ala350

Tyr Gly Asp

Ser Lys Ile

Arg Gln Asn400

Glu Gly Asn

415Asp Gly Ala430

Gly Gln Val

Ile Asn Ala

Ser Ile Trp480

Claims

1. Protease, caracterizada pelo fato de que tem pelo menos 50% de identidade com os aminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 2, para o usocomo um medicamento.

2. Protease de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de quea) a protease compreende uma seqüência de aminoácidoselecionada do grupo que consiste dos aminoácidos de 1 a 274 da SEQ IDNO: 2, aminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 5, aminoácidos de 1 a 275 daSEQ ID NO: 6, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 7, aminoácidos de 1a 275 da SEQ ID NO: 8, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 9,aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 10, aminoácidos de 1 a 269 da SEQID NO: 11, aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 12, e aminoácidos de 1 a-268 da SEQ ID NO: 13; e/oub) a protease é uma variante de uma seqüência de aminoácidoselecionada do grupo que consiste dos aminoácidos de 1 a 274 da SEQ IDNO: 2, aminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 5, aminoácidos de 1 a 275 daSEQ ID NO: 6, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 7, aminoácidos de 1a 275 da SEQ ID NO: 8, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 9,aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 10, aminoácidos de 1 a 269 da SEQID NO: 11, aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 12, e aminoácidos de 1 a-268 da SEQ ID NO: 13, em que a variante difere da respectiva seqüência deaminoácido em não mais do que vinte e cinco aminoácidos, e em que:(i) a variante compreende pelo menos uma substituição,deleção e/ou inserção de um ou mais aminoácidos quando comparada com arespectiva seqüência de aminoácido; e/ou(ii) a variante compreende pelo menos uma deleção pequenaquando comparada com a respectiva seqüência de aminoácido; e/ou(iii) a variante compreende pelo menos uma extensão determinal N ou C pequenas quando comparada com a respectiva seqüência deaminoácido; e/ouc) a protease é uma variante alélica de uma protease tendo osaminoácidos selecionados do grupo que consiste dos aminoácidos de 1 a 274da SEQ ID NO: 2, aminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 5, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 6, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 7,aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 8, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ IDNO: 9, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 10, aminoácidos de 1 a 269da SEQ ID NO: 11, aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 12, eaminoácidos de 1 a 268 da SEQ ID NO: 13; e/oud) a protease é um fragmento de uma protease tendo osaminoácidos selecionados do grupo que consiste dos aminoácidos de 1 a 274da SEQ ID NO: 2, aminoácidos de 1 a 274 da SEQ ED NO: 5, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 6, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 7,aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 8, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ IDNO: 9, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 10, aminoácidos de 1 a 269da SEQ ID NO: 11, aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 12, eaminoácidos de 1 a 268 da SEQ ID NO: 13.

3. Protease de acordo com a reivindicação 2, caracterizadapelo fato de que a protease tem uma seqüência de aminoácido selecionada dogrupo que consiste dos aminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 2,aminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 5, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ IDNO: 6, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 7, aminoácidos de 1 a 275 daSEQ ID NO: 8, aminoácidos de 1 a 275 da SEQ ID NO: 9, aminoácidos de 1a 275 da SEQ ID NO: 10, aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 11,aminoácidos de 1 a 269 da SEQ ID NO: 12, e aminoácidos de 1 a 268 da SEQID NO: 13.

4. Protease de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizada pelo fato de que está em combinação com uma lipase ouuma amilase, para o uso como um medicamento.

5. Protease de acordo com qualquer uma das reivindicações de-1 a 3, caracterizada pelo fato de que está em combinação com uma lipase euma amilase, para o uso como um medicamento.

6. Protease, caracterizada pelo fato de estar em combinaçãocom uma lipase e/ou uma amilase de acordo com as reivindicações 4 ou 5, emque(i) a lipase tem pelo menos 70 % de identidade com uma lipasetendo os aminoácidos de 1 a 269 da SEQID NO: 15; e(iii) a amilase tem pelo menos 70 % de identidade com umaamilase selecionada do grupo que consiste de:a) uma amilase tendo os aminoácidos de 1 a 481 da SEQ IDNO: 16,b) uma amilase tendo os aminoácidos de 1 a 481 da SEQ IDNO: 17, ec) uma amilase tendo os aminoácidos de 1 a 483 da SEQ IDNO: 18.

7. Protease, caracterizado pelo fato de estar em combinaçãocom uma lipase e/ou uma amilase de acordo com as reivindicações 4 ou 5, emque(i) a protease tem os aminoácidos de 1 a 274 da SEQ ID NO: 2(ii) a lipase compreende os aminoácidos de 2 a 269 da SEQ IDNO: 15; e(iii) a amilase é uma amilase selecionada do grupo queconsiste de:a) uma amilase que compreende os aminoácidos de 1 a 481 daSEQ ID NO: 16,b) uma amilase tendo os aminoácidos de. 1 a 481 da SEQ IDNO: 17, ec) uma amilase tendo os aminoácidos de 1 a 483 da SEQ IDNO: 18.

8. Uso de uma protease como definida em qualquer uma dasreivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de ummedicamento para o tratamento de distúrbios digestivos, insuficiênciaexócrina pancreática, pancreatite, fibrose cística, diabete tipo I e/ou diabetetipo II.

9. Uso de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelofato de que ainda compreende o uso de uma lipase ou uma amilase.

10. Uso de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelofato de que ainda compreende o uso de uma lipase e de uma amilase.

11. Uso de acordo com as reivindicações 9 ou 10,caracterizado pelo fato de que a lipase e/ou a amilase estão de acordo com asreivindicações 6 ou 7.

12. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende uma protease como definida em qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 3, junto com pelo menos um material auxiliar farmaceuticamenteaceitável.

13. Composição de acordo com a reivindicação 12,caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma lipase ou uma amilase.

14. Composição de acordo com a reivindicação 12,caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma lipase e uma amilase.

15. Composição de acordo com as reivindicações 13 ou 14,caracterizada pelo fato de que a lipase e/ou amilase estão de acordo com asreivindicações 6 ou 7.

16. Método para o tratamento de doença, a dita doença sendodistúrbios digestivos, insuficiência exócrina pancreática, pancreatite, fibrosecística, diabete tipo I e/ou diabete tipo II, caracterizado pelo fato de ser pelaadministração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteasecomo definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 3.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizadopelo fato de que compreende ainda administrar uma quantidadeterapeuticamente eficaz de uma lipase ou de uma amilase.

18. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizadopelo fato de que compreende ainda administrar uma quantidadeterapeuticamente eficaz de uma lipase e de uma amilase.

19. Método de acordo com as reivindicações 17 ou 18,caracterizado pelo fato de que a lipase e/ou amilase estão de acordo com asreivindicações 6 ou 7.