BRPI0611703A2 - modificações da isoforma do cspcna e seus usos - Google Patents

Abstract

MODIFICAçõES DA ISOFORMA DO CSPCNA E SEUS USOS. Métodos e composições para detectar a presença da isoforma do csPCNA mediante identificar uma ou mais das modificações pós-traducionais são revelados. Métodos para identificar a isoforma do csPCNA através das modificações pós-traducionais incluindo níveis de metil-esterificação são revelados.

Description

"MODIFICAÇÕES DA ISOFORMA DO CSPCNA E SEUS USOS" Campo"

A presente revelação está relacionada à detecção de células malignas envolvendo o uso de modificações para uma proteína específica de câncer.

Antecedentes

Um dos menos compreendidos e mais complexos pro- cessos de doença é a transformação que ocorre quando uma cé- lula se torna maligna. Esse processo envolve ambos mutações genéticas e transformações proteômicas, o resultado do que, permite à célula escapar aos controles normais; impedindo a apropriada divisão celular. As células cancerosas comparti- lham alguns dos atributos comuns. A maioria das células can- cerosas proliferam fora dos controles normais do ciclo celu- lar, apresentam alterações morfológicas e apresentam diver- sos rompimentos em relação aos processos celulares.

O câncer é usualmente diagnosticado quando um tu- mor se torna visível após o primeiro início das alterações celulares. Muitos cânceres são diagnosticados após biópsia de amostra ser examinada por histologia quanto às anormali- dades morfológicas, evidências de proliferação celular e de irregularidades genéticas. O tratamento efetivo para malig- nidade depende freqüentemente da capacidade para detectar de modo confiável, a presença de células malignas nos primeiros estágios de uma doença tal que um tratamento eficaz possa ser iniciado num estágio quando a doença é mais suscetível a tal tratamento. Desse modo, existe uma necessidade quanto a ser capaz de detectar de modo confiável uma célula potenci- almente maligna que não tenha progredido até o estágio his- tológico reconhecido como maligno, mas que possa progredir para um estado maligno. Existe também uma necessidade quanto a uma técnica rápida, minimamente invasiva que possa detec- tar ou tratar de modo confiável células malignas ou potenci- almente malignas.

O antigeno nuclear de célula proliferativa (PCNA) é uma proteína nuclear de 29 kDa e sua expressão em células durante as fases S e G2 do ciclo celular, torna a proteína um bom marcador da proliferação celular. Ele também se mos- trou participar em muitos das rotas moleculares responsáveis pela vida e morte da célula. Seu aparecimento periódico na fase S do núcleo sugere um envolvimento na replicação do DNA. O PCNA foi posteriormente identificado como um fator acessório da DNA polimerase em células de mamíferos e um fa- tor essencial para a replicação SV40 DNA in vitro. Adicio- nalmente ao funcionamento como uma proteína de adesão ao DNA e um fator acessório da DNA polimerase em células de mamífe- ros, o PCNA interage com um número de outras proteínas en- volvidas na transcrição, controles do ciclo celular, remode- lagem da cromatina, recombinação, apoptose, e outras formas de reparos do DNA. Além de ser diverso em sua ação, muitos parceiros ligantes do PCNA são se interligam por meio de su- as contribuições à herança precisa das funções celulares por meio de cada nova geração de células. 0 PCNA pode atuar como uma molécula controladora que coordena o processamento no cromossomo.

O PCNA é também conhecido interagir com outros fa- tores do tipo FEN-1, DNA ligase, e DNA metil transferase. Adicionalmente, o PCNA era também conhecido ser um partici- pante essencial nas múltiplas rotas de reparo de DNA. As in- terações com múltiplos participantes geralmente se baseiam em mecanismos que permitem ao PCNA interagir seletivamente em um modo ordenado e energeticamente favorável.

Indícios com respeito a um mecanismo das funções do PCNA foram inicialmente descobertos através da investiga- ção do DNA sintessoma, um complexo multiproteína da replica- ção do DNA presente em células de mamíferos. Estudos avali- ando a atividade sintética do DNA sintessoma identificaram uma taxa de erro aumentada em células malignas quando compa- radas às células não malignas. Esses resultados sugerem que uma alteração estrutural a um ou mais componentes do DNA sintessoma em células malignas tenha ocorrido. A análise i- munoblot 2D-PAGE do PCNA, um componente essencial do DNA sintessoma, revelou duas isoformas distintas com borrões i- soelétricos amplamente diferentes (pis). Uma isoforma do PCNA revelou um pi significativamente básico e estava pre- sente em ambas as células maligna e não maligna. A outra i- soforma tinha um pi ácido e foi encontrado exclusivamente em células malignas. Devido à sua presença apenas em células malignas, essa isoforma foi denominada isoforma específica de câncer ou csPCNA, e a alteração pós-traducional que é responsável para o padrão de migração 2D-PAGE do PCNA perma- nece indeterminada.

Alguns estudos de marcação com PCNA sugerem que a migração do PCNA foi mais possivelmente não devido às alte- rações tais como fosforilação, acetilação, glicosilação, ou sialização. Estudos conflitantes têm surgido na tentativa de identificar modificações pós-traducionais ao PCNA. Por exem- plo, a fosforilação do PCNA foi reportada influenciar sua ligação aos sítios da síntese do DNA. Um outro estudo rei- vindicou que o PCA foi, apesar de tudo, não fosforilado mas acetilado. Em adição a esses estudos, a análise de levedura de PCNA se mostrou ser ele o alvo da onipresença em resposta ao dano e sumoilação do DNA em ausência de danos. Devido à evidência diversa e conflitante para o PCNA, é difícil iden- tificar quais modificações, se houver, são responsáveis quanto ao surgimento e funções da isoforma do csPCNA.

Portanto, a identificação das corretas modifica- ções pós-traducionais do csPCNA é desejável para desenvolver métodos diagnósticos e também para desenvolver terapêuticas com base nas interações do csPCNA com seus parceiros. As cé- lulas cancerosas malignas expressam uma isoforma do PCNA de- nominada PCNA específica de câncer (csPCNA) e as células não malignas expressam uma isoforma denominada PCNA não maligna (nmPCNA). Composições e métodos eficazes para diferençar as duas isoformas são necessárias para o diagnóstico e o trata- mento de cânceres.

SUMÁRIO

Novas modificações pós-traducionais de csPCNA são identificadas. A esterificação metílica do csPCNA é identi- ficada. Uma abordagem 2D-PAGE/cromatografia líquida em para- lelo com espectrometria de massa (LC-MS/MS) foi usada para analisar a isoforma csPCNA e para identificar esterificações metílicas presentes no csPCNA. As modificações por esterifi- cação metílica foram localizadas aos específicos resíduos glutâmicos e aspárticos.

Uma análise estrutural de uma única isoforma PCNA de caráter ácido (csPCNA) isolada a partir de células de câncer de mama por meio de eletroforese bidimensional (2D- PAGE) e cromatografia líquida em paralelo com espectrometria de massa (LC-MS/MS) é revelada aqui. Os ésteres metílicos se localizaram aos 16 resíduos específicos de ácido glutâmico e aspártico do csPCNA. A esterificação metílica do csPCNA re- presenta um novo tipo de modificação pós-traducional em cé- lulas de mamíferos que estão relacionadas na condução de al- gumas das diversas funções do PCNA.

Um método de detectar uma isoforma de antígeno nu- clear de célula proliferativa específica de câncer (csPCNA) em uma amostra biológica inclui as etapas de:

detectar uma modificação pós-traducional compreen- dendo um éster metílico num ou mais resíduos aminoácidos da isoforma do csPCNA na amostra suspeita de conter a isoforma do csPCNA; e

determinar a presença da isoforma do csPCNA medi- ante comparar os níveis de ésteres metílicos na isoforma do csPCNA com uma isoforma não-malignizante do PCNA.

Algumas das amostras biológicas incluem um fluido corporal, tal como sangue, plasma, linfa, soro, fluido pleu- ral, fluido espinal, saliva, cuspe, urina, suco gástrico, suco pancreático, fluido de ascite, fluido sinovial, leite, e sêmen. Uma amostra biológica também inclui uma amostra de tecido tal como de tecidos obtidos a partir de mama, prósta- ta, pulmão, cólon, epitelial, conectivo, cervical, esofági- co, cérebro, timo, tireóide, pâncreas, testículo, ovário, intestino, bexiga, estomago, sarcomas de tecido mole, osteo- sarcoma, leucemia, linfoma, carcinoma, adenocarcinoma, pla- centa, fibroso, tecido de célula germinativa, e extratos desses mencionados. Qualquer amostra biológica que seja ca- paz de conter csPCNA é adequada para análise.

Em um aspecto, o éster metílico está presente num ácido aspártico ou num ácido glutâmico ou numa combinação desses mencionados da isoforma do csPCNA. Um éster metílico está presente num ou mais dos 16 resíduos de ácido aspártico ou de ácido glutâmico corresponde às posições 3, 85, 93, 94, 104, 109, 115, 120, 132, 143, 174, 189, 201, 238, 255, e 259 do aminoácido da isoforma do csPCNA. Os peptídeos cs-PCNA derivados que incluem os 16 resíduos modificados de ácido aspártico ou glutâmico são como a seguir:

MFEmAR;

IEmDEEGS;

IEDEEmGS;

VSDYEmMK;

MPSGEmFAR;

LSQTSNVDmK;

CAGNEmDIITLR;

FSASGEmLGNGNIK;

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LMDmLDVEQLGIPEQEYSCVVK;

ATPLSSTVTLSMSADVPLVVEmYK; e

LSQTSNVDKEEEAVTIEMNEmPVQLTFALR, onde Em representa um resíduo ácido glutâmico metil-esterifiçado e Dm representa um resíduo de ácido aspártico metil-esterifiçado.

Em um aspecto, a detecção da isoforma csPCNA é re- alizada usando uma análise por espectrometria de massa, por exemplo, através de análise de cromatografia líquida (LC) espectrometria de massa (MS). Qualquer método adequado para a detecção de ésteres metílicos ou resíduos aminoácidos me- til-esterif içados é aplicável.

Uma análise por espectrometria de massa de um pep- tídeo csPCNA-derivado resulta num deslocamento de massa de 14 Da como comparado a um correspondente peptídeo não modi- ficado.

Um método de diagnóstico ou de prognóstico de ma- lignidade, o método inclui as etapas de:

detectar a isoforma do antígeno nuclear de célula proliferativa específica de câncer (csPCNA) em uma amostra biológica mediante identificar um estado de modificação pós- traducional da isoforma csPCNA que distingue a isoforma csPCNA de uma isoforma do PCNA não-malignizante (nmPCNA); e diagnosticar a malignidade com base na detecção do csPCNA na amostra biológica.

Uma modificação pós-traducional tal como metil- esterif icação é detectada no csPCNA e os níveis de metil- esterificação no csPCNA versus nmPCNA são usados na determi- nação da malignidade.

Um peptideo de antigeno nuclear de célula prolife- rativa (PCNA) modificado inclui uma seqüência aminoácido se- lecionada a partir de:

MFEmAR;

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IEDEEmGS;

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LSQTSNVDKEEEAVTIEMNEmPVQLTFALR, onde Em representa um resíduo ácido glutâmico metil-esterifiçado e Dm representa um resíduo de ácido aspártico metil-esterifiçado.

Em um aspecto, os peptídeos modificados de csPCNA ou PCNA são pós-traducionalmente modificados. Em um outro aspecto, os peptídeos modificados do csPCNA ou PCNA são expostos a uma etapa de digestão protease. Em um outro aspecto, os peptídeos modificados de csPCNA ou nmPCNA são sintéticos. Em um aspecto, o método de detectar uma isoforma de antígeno nuclear de célula proliferativa especifica de câncer (csPCNA) em uma amostra biologica inclui determinar os níveis completos de metil-esterificação do csPCNA e nmPCNA e determinar que a amostra biologica possui o csPCNA com base nos níveis de metil-esterificação.

Aspectos adicionais da presente revelação se tornarao mais evidentes por aqueles usualmente versados na técnica quando da consideracao da descrição detalhada apresentada a seguir das modalidades representativas do melhor modo de realizar o assunto da invenção como presentemente percebido.

Breve Descrição dos Desenhos

A Figura 1 apresenta a identificação de csPCNA a partir da caracterização do peptídeo por 2D-PAGE por LC- MS/MS. (A) mostra um gel representativo 2D-PAGE tingido com Coomassie blue de um extrato nuclear de célula MDA MB 468 (2 mg). Múltiplos borrões foram escolhidos para a proteólise com tripsina e identificado por LC-MS/MS. csPCNA é identifi- cado (seta preta) no lado ácido do gel com um pi aproximado de 4,6. Três representações dimensionais do 2D-PAGE detecta dois borrões correspondentes a csPCNA, um borrão de modesta abundância (seta preta), um borrão mais ácido de baixa abun- dância (seta branca) detectado pelo software de análise 2D. Borrões de proteína (i-v) outros que PCNA que foram identi- ficados na análise são apresentados na Tabela I. (B) mostra cromatograma de pico base dos peptídeos derivados da diges- tão tripsina do csPCNA. (C) ilustra o espectro de massa de um peptídeo csPCNA eluindo a 43,3 min. A análise do espectro de massa em paralelo do ion 1038,7 m/z (D) o identificou co- mo um peptideo duplamente carregado correspondente aos resí- duos 92-110 do PCNA humano. (E) é um espectro de massa que mostra a eluição de um ion 1045, 5 m/z a 43, 74 min. A dife- rença de massa dos íons ligeiramente carregados é duas vezes a diferença do ion duplamente carregado e o ion 1045,4 m/z, portanto, apresenta um deslocamento de massa de +14 Da. (F) mostra que o espectro de massa em paralelo do ion 1045,4 m/z é quase idêntico àquele na parte D exceto que a totalidade dos íons-y estão deslocados por 14 Da. 0 deslocamento em massa de apenas o ion bl8 situa o 14 Da adicional no ácido glutâmico na posição 109 do csPCNA.

A Figura 2 mostra a criação de mapas de seqüência escalonada de peptídeo de csPCNA. (A) Cromatogramas de pico base representativos que mostram a eluição dos peptídeos de- rivados da clivagem do csPCNA com tripsina (azul), tripsi- na/CNBr (verde) , GluC (vermelho) , e AspN (preto) . (B) mapas de csPCNA de seqüências identificadas por LC-MS/MS. As posi- ções dos ésteres metílicos estão denotadas (Xm).

A Figura 3 mostra que a cauda C-terminal do PCNA está metil-esterifiçada em múltiplos sítios. (A) Eluição de três diferentes peptídeos derivados da cauda C-terminal do csPCNA. O cromatograma do pico base de csPCNA digerido com tripsina comparado aos cromatogramas de íons selecionados do peptídeo IEDEEGS (778,5 m/z) e os peptídeos IEDEEGS metil- esterif içados (792,5). Os peptídeos metil-esterifiçados pos- suem uma aumentada hidrofobicidade e eluem mais tarde no gradiente de fase reversa. (B) A interpretação do espectro de massa em paralelo para o peptideo não modificado mostra a fragmentação de um peptideo de carga única com a seqüência IEDEEGS. A perda neutra de água (-18 Da) é comumente obser- vada com muitos dos ions fragmento. Adicionalmente, um ion fragmento representando a perda neutra da água e o grupo CO do íon-y4 é observado em 373, 9 m/z. (C) O espectro de massa em paralelo do ion 792, 3 m/z do peptideo elui primeiro no cromatograma acima. Os ions b3-6 podem ser identificados no espectro e todos estão deslocados por 14 Da mas os ions y3 e y5 não estão deslocados, sugerindo que a modificação se si- tua num ou noutro de leucina ou ácido glutâmico do N- terminal. (D) 0 espectro de massa em paralelo do ion 792,3 m/z do peptideo eluindo em segundo na separação. Os ions B5 e b6 contêm o deslocamento 14 Da como acima, mas os ions b3 e b4 não, consistente com o éster metilico no ácido glutâmi- co na posição 5 no peptideo.

A Figura 4 mostra imunoblot de PCNA.

A Figura 5 mostra uma seqüência aminoácido de PCNA (1-262 aminoácidos).

DESCRIÇÃO DETALHADA

A proteína do antígeno nuclear de célula prolife- rativa (PCNA) está alterado em células cancerosas, o PCNA é uma proteína de 28 kDa com uma mobilidade eletroforética e- quivalente àquela de uma proteína de 36 kDa. O PCNA é um fa- tor acessório requerido pela DNA polimerase δ para mediar a altamente eficiente atividade da replicação do DNA. O DNA sintessoma purificado a partir de uma célula maligna contém pelo menos duas formas de PCNA. As duas espécies de PCNA di- ferem significativamente em suas cargas totais. Desse modo, uma forma ácida, malignizante ou especifica de câncer, de PCNA, csPCNA, e uma forma de PCNA básica, não malignizante, nmPCNA, podem ser diferençadas sobre um gel bidimensional de poliacrilamida.

O csPCNA de caráter ácido está expresso em linha- gens de células malignas, tais como HeLa (carcinoma cervical humano), Hs578T (carcinoma de mama), HL-60 (leucemia promie- logênica humana), FM3A (carcinoma mamário de rato), PC 10 (carcinoma de próstata), LNCaP (carcinoma de próstata), LN99 (carcinoma de próstata) MD-MB468 (carcinoma de mama humano) , MCF-7 (carcinoma de mama), KGE 90 (carcinoma de esôfago- cólon) , KYE 350 (carcinoma de esôfago-cólon) , SW 48 (carcinoma de esôfago-cólon) e T98 (glioma maligno). O csPCNA de caráter ácido está também expresso em células malignas obtidas a partir de tumores de mama humano, tumores de próstata, tumores cerebrais, tumores gastrintestinais ou de esôfago-cólon humano, tumores de mama murino e em leucemia mielogênica crônica humana. The csPCNA de caráter ácido não é detectado em linhagens de células não malignas, tais como em linhagens de células mamárias Hs578Bst e MCF- 10A, ou em amostra de soro ou de tecido não maligno, tal como de mama.

Uma abordagem da caracterização do peptideo por LC-MS/MS foi usada para seqüenciar uma isoforma do csPCNA encontrado em células malignas. Um novo tipo de modificação pós-traducional presente em numerosos resíduos de csPCNA foi identificado. Essa modificação, metil-esterificação, estava presente nos 16 diferentes resíduos de ácido aspártico e á- cido glutâmico em csPCNA. Seqüência aminoácido não modifica- do de PCNA é mostrada na Figura 5. Esses ésteres metílicos foram inicialmente identificados como deslocamentos 14 Da na massa do peptídeo e foram localizados em um ou outro dos re- síduos de ácido glutâmico ou aspártico por espectrometria de massa em paralelo. A quantificação relativa dos peptídeos metil-esterifiçados indicou que as proteínas de csPCNA em células malignas incluem diversas moléculas contendo um ou mais éteres metílicos que ocorrem em múltiplos resíduos ao longo da extensão da proteína. A esterificação metílica de resíduos específicos é provável de resultar em discretas al- terações conformacionais na proteína, e essas alterações po- dem promover e/ou romper as interações proteína/proteína.

Os efeitos da esterificação metílica sobre as fun- ções das proteínas de mamíferos não são ainda bem compreen- didos. Muito da pesquisa do passado quanto à esterificação metílica de proteínas de mamíferos estava focada no envelhe- cimento da proteína e no reparo dos resíduos isoaspartila por meio da enzima proteína isoaspartato metil transferase (PIMT). Entretanto, a maioria dos ésteres metílicos presen- tes no csPCNA são encontrados nos resíduos de ácido glutâmi- co e não nos resíduos de ácido aspártico sugerindo que a mo- dificação ocorre através de uma rota alternativa.

É possível que a esterificação metílica do PCNA altere sua conformação e, em efeito, oculte e/ou exponha es- pecíficos sítios ligantes de proteína e determine sua fun- ção. A análise da seqüência de LC-MS/MS do PCNA recombinante foi também realizada e evidência quanto à esterificação me- tilica foi encontrada. A esterificação metilica encontrada no PCNA pode, portanto, estabilizar os específicos estados conformacionais de uma proteína de outro modo desordenada. Adicionalmente, o cálculo do potencial eletrostático do PCNA mostra que a superfície externa do trímero PCNA possui po- tencial altamente negativo e uma abundância de resíduos de ácido glutâmico e aspártico. A metilação desses resíduos po- derá, portanto, alterar esse potencial e, em efeito, alterar a topologia da superfície da proteína.

A caracterização do peptídeo por LC-MS/MS de uma isoforma específica, csPCNA, resolvida por 2D-PAGE é revela- da. A utilização de uma combinação de abordagens proteolíti- cas, mapas seqüenciados escalonados do peptídeo de csPCNA foram gerados, identificando 100% da seqüência da proteína do csPCNA por LC-MS/MS. Uma nova modificação pós-traducional presente no csPCNA foi idenfifiçada. Esteres metílicos apa- receram em pelo menos um dos 16 resíduos específicos ácido glutâmico e/ou aspártico na isoforma csPCNA. Essas modifica- ções, podem alterar a estrutura do trímero PCNA e em fazendo isso, promovem mudanças conformacionais que podem ser rele- vantes para as interações proteína/proteína ordenadas.

Uma amostra biológica pode ser uma amostra de fluido corporal, que pode incluir sangue, plasma, linfa, so- ro, fluido pleural, fluido espinal, saliva, cuspe, urina, sêmen, lágrimas, fluido senovial ou qualquer fluido corporal que possa ser testado quanto à presença da isoforma de csPC- NA. De modo alternativo, a amostra biológica pode ser uma amostra de tecido, onde as células da amostra de tecido pos- sa ser suspeita de ser maligna. Por exemplo, seções de teci- do ou culturas de células podem ser montadas sobre lâminas de vidro ou de plástico e contatadas com os anticorpos de acordo com protocolos imuno-citoquimicos padrões. Os extra- tos de tecido ou os concentrados de células ou extratos de células são também adequados.

Em uma outra modalidade, um método para diagnosti- car malignidade é provido. 0 método compreende a etapa de detectar csPCNA em uma amostra biológica obtida a partir de um indivíduo ou particularmente um paciente suspeito de pos- suir uma condição de malignidade, onde a etapa de detectar o csPCNA envolve detectar níveis de modificação pós- traducional envolvendo os metil-ésteres revelados aqui.

Em uma outra modalidade, um método de auxiliar no diagnóstico de malignidade é provido. 0 método compreende a etapa de detectar modificações pós-traducionais em csPCNA em células malignas numa amostra de tecido comparada ao PCNA em células normais, onde as células normais da amostra de teci- do são suspeitas de serem malignas, e onde a etapa de detec- tar o csPCNA envolve detectar ésteres metílicos no csPCNA. É para ser entendido que as células malignas não estão limi- tadas a, células malignas em tecidos tais como mama, prósta- ta, sangue, cérebro, pâncreas, musculatura lisa ou estriada, fígado, baço, timo, pulmão, ovário, pele, coração, tecido conectivo, rim, bexiga, intestinos, estomago, glândula adre- nal, nodos linfáticos, ou de colo de útero, ou em linhagens de células, por exemplo, Hs578T, MCF-7, MDA-MB468, HeLa, HL60, FM3A, BT-474, MDA-MB-453, T98, LNCaP, LN 99, PC 10, SK-OV-3, MKN-7, KGE 90, KYE 350, ou SW 48.

Em uma outra modalidade, um método para ajudar no prognóstico do desenvolvimento de malignidade é provido. O método envolve detectar csPCNA em uma amostra de tecido me- diante detectar modificações pós-traducionais reveladas a- qui, onde as células da amostra de tecido possam ser suspei- tas de serem malignas, e correlacionar os níveis de csPCNA com a progressão de uma doença maligna em particular. Além disso, a detecção e a análise das modificações pós- traducionais no csPCNA podem ser usadas para prognosticar a resposta do potencial de sobrevivência para um paciente que desenvolveu uma malignidade.

É para ser entendido que as doenças que podem ser diagnosticadas ou prognosticadas utilizando os anticorpos incluem, mas não estão limitadas a, malignidades tais como diversas formas de glioblastoma, glioma, astrocitoma, menin- gioma, neuroblastoma, retinoblastoma, melanoma, carcinoma de cólon, carcinoma e pulmão, adenocarcinoma, carcinoma de colo de útero, carcinoma de ovário, carcinoma de bexiga, linfo- blastoma, leucemia, osteosarcoma, carcinoma de mama, hepato- ma, nefroma, carcinoma adrenal, ou carcinoma de próstata, carcinoma de esôfago. Se uma célula maligna expressa a iso- forma de csPCNA, as técnicas reveladas aqui são capazes de detectar a isoforma de csPCNA.

Técnicas de detecção envolvendo a detecção de mo- dificações pós-traducionais reveladas aqui, podem também de- tectar malignidade em alguns tipos de tumores invasivos e não invasivos em tecido mamário que incluem cistos ductais, metaplasia apocrina, adenose esclerosante, hiperplasia do duto epitelial, não atípica, papilomatose intraductal, alte- rações de célula colunar, lesão esclerosante radial (cica- triz radial), adenoma de mamilo, papiloma intraductal, fi- broadenoma, papiloma de lactante, hiperplasia epitelial duc- tal atípica, hiperplasia lobular atípica, carcinoma ductal in-situ sub-classifiçado como graus nucleares 1, 2, e 3, carcinoma lobular in-situ, carcinoma lobular pleomórfico in- situ, lipoma intra-mamário, hamartoma mamário, tumor de cé- lula granular, necrose gordurosa intra-mamária, ,hiperplasia estromal pseudoangiomatosa (PASH), melanoma maligno envol- vendo a mama, tumor filódio-benigno, limiar, e subclasses malignas, e sarcoma da mama.

Em uma outra modalidade, os métodos revelados aqui are usados para determinar o estágio de malignidade nos tu- mores, mediante comparar os níveis de csCPNA em um tumor ao longo do tempo, para acompanhar a progressão de uma doença maligna, ou uma resposta do paciente ao tratamento. Os méto- dos podem ser também usados para detectar células malignas que tenham se liberado de um tumor e estejam presentes na corrente sangüínea do paciente, através de métodos para fa- zer ensaios numa amostra de sangue quanto à presença da iso- forma do csPCNA. A amostra biológica pode ser obtida a par- tir de pacientes humanos ou de pacientes veterinários.

O termo "anticorpo" inclui anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento completo), anticorpos policlonais, anticorpos multi-especificos (por ex., anticorpos bi-especificos), e fragmentos de anticorpos contanto que eles apresentem a desejada atividade ou especi- ficidade biológica.

Anticorpos que especificamente reconheçam nmPCNA ou csPCNA pós-traducionalmente modificados podem ser feitos.

O termo "proteína ou peptídeo modificado" se refe- re à presença de uma ou mais modificações pós-traducionais presentes nas proteínas csPCNA ou nmPCNA ou peptídeos deri- vadas dessas proteínas. 0 termo também se refere a peptídeos sintéticos e isolados e purificados de csPCNA e nmPCNA que contenham uma ou mais modificações pós-traducionais. 0 termo também se refere a peptídeos de csPCNA e PCNA digeridos por protease e peptídeos de csPCNA e PCNA fragmentados por meio de quaisquer métodos que contenham uma mais modificações pós-traducionais.

Todos os produtos químicos usados aqui foram obti- dos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) ou Fisher Scientific (Hampton, NH) a menos que de outro modo estabelecido. Água e acetonitrila de grau para espectrometria de massa formação obtidos da Honeywell Burdick e Jackson (Morristown, NJ).

csPCNA e nmPCNA presentes nas amostras obtidas a partir dos indivíduos são analisados quanto às modificações pós-traducionais utilizando técnica padrão. Por exemplo, as análises espectrométricas são técnicas adequadas. A análise por espectrometria de massa pode estar acoplada com outras técnicas.

Células de câncer de mama MDA MBA 4 68 e MCF7 fo- ram obtidas da ATCC e mantidas em DMEM (MediaTech, Herndon, VA) contendo 10% FCS (BioWhittaker, Walkersville, MD) e An- tibiótico-Antimicótico (Invitrogen, Carlsbad, CA). As célu- las foram crescidas em pratos de 100 mm para cultura de cé- lulas até confluência de 60-70%, enxaguados e raspados com um raspador de borracha para dentro de PBS frio em gelo an- tes da peletização. As células foram fracionadas até um ex- trato nuclear como descrito em Malkas e outros, Biochemistry 1990, 29, 6362-6374. Em resumo, as células foram homogenei- zadas usando um homogeneizador Dounce™ e o núcleo peletiza- do. As proteínas nucleares foram em seguida extraídas com 150 mM KCl por 2 h a 4 0C e as membranas peletizadas por ul- tracentrifugação. Os extratos foram congelados a -80 0C até utilização.

A focalização isoelétrica foi realizada usando uma célula IEF e tiras 17 cm pH 4-7 Ready Strip IPG (Bio-Rad, Hercules, CA). Amostras de proteína foram dessalinizadas u- sando Colunas Protein Desalting Spin (Pierce, Rockford, IL) e liofilizadas em um equipamento speed-vac (ATR Biotech, Laurel, MD) . As amostras liofilizadas foram re-suspensas em tampão de hidratação (9 M uréia, 4% CHAPS, 0,2% Bio-Lytes (Bio-Rad, Hercules, CA), 2 mM tributilfosfina, 0,001% bromo- fenol blue) e reidratado de modo passivo nas tiras IPG por 12 h a 20 °C. A focalização isoelétrica foi realizada usando as instruções do fabricante (Bio-Rad, Hercules, CA) . Antes do SDS-PAGE, as tiras IPG foram reduzidas mediante incubação em tampão (6 M uréia, 0,375 M tris, 2% SDS, 20% glicerol, pH 8,8) contendo 20 mg/ml DTT e alquiladas no mesmo tampão con- tendo iodoacetamida em lugar do DTT. 0 SDS-PAGE foi realiza- do em géis 12% poliacrilamida (20 cm χ 20 cm) usando um e- quipamento Protean XL (Bio-Rad, Hercules, CA) com corrente constante por aproximadamente 5 h. Os géis foram fixados com 10% ácido acético/50% metanol em água e manchados com Gel Code Blue (Pierce, Rockford, IL) de um dia para o outro. 0 registro das imagem foi conseguido usando um equipamento Scanning Image Densitometer GS710 (Bio-Rad, Hercules, CA) e a análise do gel foi realizada com o software Phoretix Evo- lution 2D (NonLinear Dynamics, Inc., Durham, NC). A realiza- ção do borrão de mancha foi feita manualmente usando uma ferramenta de 1 mm (The Gel Company, San Francisco, CA).

A clivagem da proteína foi realizada com tripsina (Promega, Madison, WI), brometo de cianogênio (CNBr) (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO), GluC, ou AspN (Roche, Indianapolis, IN) como anteriormente descrito com alguma modificação (Ro- senfeld e outros, Anal Biochem 1992, 203, 173-179; van Mont- fort e outros, Biochim Biophys Acta 2002, 1555, 111-115). Em resumo, os borrões do gel foram limpos em bicarbonato de a- mônio (ABC) 25 mM/50% acetonitrila seguido por desidratação com 100% acetonitrila e secagem em um equipamento speed- vac (ATR Biotech, Laurel, MD). Os borrões foram em seguida rei- dratados em solução de protease (20 μg/ml de um ou outro de tripsina, GluC, ou AspN) em 25 mM ABC. Após 10 minutos a 4 °C, o excesso da solução de protease foi removido, substitu- ído com 25 mM de ABC recém preparado, e incubado de um dia para o outro a 37°C. Os peptídeos foram extraídos do gel por ação sônica em presença de 25 mM ABC/50% acetonitrila (uma vez) e 5% ácido fórmico/50% acetonitrila (duas vezes). Os extratos de peptídeo foram misturados e secados em um e- quipamento speed-vac. Subseqüentes clivagens com CNBr das digestões tripsina (em amostras selecionadas) foram realiza- das mediante ressuspender os extratos de peptideo secos em 70% de ácido fórmico e acrescentando CNBr a um excesso de aproximadamente 200 M relativamente ao peptideo. A clivagem por CNBr foi realizada na temperatura ambiente por 4 horas e secada em equipamento speed-vac. Todas as amostras foram ressuspensas em 1% ácido fórmico imediatamente antes da aná- lise.

HPLC em nanofluxo foi realizada usando equipamento MegraFrit (New Objective, Inc., Woburn, MA) coluna de desti- lação empacotada no local com Magic C 18Aq 5μ, 200Â (Mic- hrom, Inc., Auburn, CA) e uma coluna de silica de ponta fun- dida de 0,05 mm χ 100 mm (PolymicroTechnologies, Phoenix, AZ) auto-empacotada com material Magic C 18Aq 5μ, 100Â e montada em micro-cross mantida no lugar por meio de um está- gio nanospray usual (Gatlin e outros, Anal Biochem 1998, 263, 93-101). Os peptideos foram separados usando um gradi- ente linear de 2-50% de acetonitrila contendo 0,1% de ácido fórmico. A instrumentação consistiu de um ou outro de HPLC Surveyor e espectrômetro de massa de captura iônica LCQ Ad- vantage (ThermoElectron, Waltham, MA) ou uma Ultimate HPLC (LC Packings) e um LCQ DECA XP (ThermoElectron, Waltham, MA) . As listas de picos foram geradas a partir dos dados brutos usando Bio Works 3.1 (ThermoElectron, Waltham, MA). A pesquisa da base de dados Swissprot foi realizada usando Mascot (Matrix Science, Inc., Boston, MA)(Ver também, Creasy & Cottrell, Proteomics 2002, 2, 1426-1434). 0 ion de origem e a tolerância da massa de fragmento de 3 e 0,8 Da, respec- tivamente, e até dois sítios de clivagem perdidos foram con- siderados. Carbamidometil cisteínas e metionicas oxidadas foram selecionadas como modificações variáveis em uma procu- ra de primeira passagem da base de dados do mamífero. Uma procura tolerante a erro foi realizada onde a tripsina foi selecionada como a enzima e ésteres metil glutamato e aspar- tato foram adicionalmente considerados como modificações va- riáveis .

Embora os métodos de detectar modificação pós- traducional e seus usos relativamente à isoforma de csPCNA fossem descritos em detalhes na descrição detalhada e nos Exemplos abaixo, e com referência às suas modalidades espe- cíficas, será evidente por aqueles usualmente versados na técnica que diversas modificações e alterações podem ser feitas sem se afastar do espírito e escopo da presente in- venção. Todas as referências mencionadas aqui são incorpora- das por referência quanto ao teor.

EXEMPLOS

Os exemplos apresentados a seguir são providos pa- ra o propósito de exemplificação apenas e não são pretendi- dos a limitar a revelação que está descrita em termos amplos acima.

Exemplo 1: Caracterização Bidimensional (2D) PAGE e Peptídeo da Isoforma csPCNA

Uma fração do extrato nuclear isolada a partir de células de carcinoma de mama MDA MB 468foi redissolvida por 2D-PAGE (FIG. IA) . Múltiplos borrões possuindo massas mole- culares aparentes próximas de 36 kDa e pis igual ou próximo de 4,5 (pi SDS-PAGE MW aparente e calculado do PCNA) foram cortados do gel e submetidos à digestão no gel com tripsina. Aos peptideos resultantes foram analisados por cromatografia liquida (LC) de nanofluxo e eletrospray em paralelo com es- pectrometria de massa (LC-MS/MS) utilizando um espectrômetro de massa com captura de ion de quadripolo. As proteínas com- preendendo cada borrão foram identificadas pela procura dos dados MS em paralelo com o equipamento de procura Mascot. Com a utilização dessa abordagem o csPCNA foi localizado nos géis de 2D-PAGE. Essa abordagem permitiu a identificação e a análise de rotina do csPCNA com limitado manuseio da amostra minimizando desse modo a potencial perda de modificações pós-traducionais. A Figura IB mostra um cromatograma LC/MS de pico base dos peptideos resultantes da digestão por trip- sina em gel do csPCNA extraído dos géis de 2D-PAGE. Nesse experimento 25 peptideos cobrindo 97% do comprimento comple- to da seqüência de PCNA foram identificados. Um representa- tivo peptídeo de csPCNA identificado nesse experimento é mostrado na Figura 1C. Esse peptídeo eluiu a 43,3 min e exi- biu um m/ζ de 1038, 7 (2 + ) (FIG. 1C) . A dissociação induzida por colisão (CID) do peptídeo (Roepstorff, P. e Fohlman, J., Biomed Mass Spectrom 1984, 11, 601) revelou a seqüência AEDNADTLALVFEAPNQEK, aminoácidos 92-110 do PCNA humano (FIG. 1D).

Exemplo 2: Esterificação Metílica do cspCNA Esse exemplo demonstra que a isoforma de csPCNA apresenta esterificação metílica numa ou mais posições no aminoácido. Os dados de LC-MS/MS identificaram múltiplos peptideos apresentando deslocamento 14 Da na massa de peptí- deo de origem. De modo interessante, os deslocamentos de massa identificados sugeriram a presença de uma modificação pós-traducional—esterificação metilica. A metilação em célu- las de mamíferos é geralmente considerada uma modificação pós-traducional irreversível. Ocorrendo predominantemente nos grupos amina dos resíduos lisina e no N-terminal das proteínas, a metilação foi identificada em proteínas tais como p53 e histonas H3 e H4. Entretanto, o exame do espectro da CID para os peptideos deslocados +14 Da localizou os gru- pos metila aos resíduos de ácido aspártico e glutâmico con- sistentes com a esterificação metílica. A Figura IE mostra a eluição de um peptídeo metil-esterifiçado (1045,.4 m/z [2+]) a 43,8 min nesse experimento. Esse peptídeo eluiu próximo (25 s após) do peptídeo 1038,7 m/z (2+) não modificado (FIG. 1C), que pode ser ainda visto no espectro de MS. A fragmen- tação do íon 1045, 4 m/z (FIG. 1F) revelou um padrão muito similar ao do peptídeo 1038, 7 m/z (FIG. 1D). A maior dife- rença nesse espectro de fragmentação são deslocamentos más- sicos de +14 nas proximidades de quase todos os íons das sé- ries-y do peptídeo 1045,4 m/z comparado aos íons da série-y do peptídeo 1038,7 m/z peptide. A identifica dois íons-b com valores m/z de 1943,3 e 1800,2. O íon 1943,3 corresponde ao íon bl8 e indica uma perda de uma lisina não modificada do C-terminal. Esse íon também difere do íon bl8 (1928, 4) ob- servado no espectro de fragmentação do peptídeo 1038,7 m/z (FIG. 1D) por 14 Da sugerindo ainda que a lisina está não modificada e que o deslocamento mássico de 14-Da é um outro resíduo no peptídeo. O íon bl7 (1800,2) na FIG. 1F, na FIG.

ID indicando a perda de um ácido glutâmico (129 Da) mais um grupo metila (14 Da) ou uma perda de 143 Da entre os íons bl7 e bi8 quanto ao peptídeo 1045,4 m/z. Os picos pequenos logo à esquerda dos íons bl8 nas Figuras ID e IF possuem va- lores m/z de 1911,1 e 1925,4, respectivamente, consistentes com uma perda neutra de H20 ou NH3 proveniente dos íons bl8. Essas observações em combinação com as massas de íons-Y des- locadas localizam o éster metílico ao resíduo de ácido glu- tâmico na posição 109 na proteína do csPCNA de comprimento completo.

Em adição ao csPCNA, outras proteínas no gel foram analisadas quanto à presença de esterificação metílica. Cin- co representativos borrões de proteína são mostrados na Fi- gura IA e as identidades desses borrões e o status da este- rif icação metílica deles são apresentados na Tabela I. De modo interessante, uma das cinco proteínas (Stathmin) foi descoberta estar metil esterificada bem como acetilada na terminação-N. A esterificação metílica do csPCNA não foi o resultado do manejo da amostra (por exemplo, fixação com á- cido acético e metanol), porque a esterificação metílica foi observada apenas num pequeno subconjunto de proteínas, e de modo mais consistente em específicos resíduos do csPCNA, em lugar de sua presença ao longo de todas as proteínas presen- tes no gel. Exemplo 3. Identificação da metil-esterificação de csPCNA

Em adição ao peptideo AEDNADTLALVFEAPNQEK identi- ficado na FIG. 1, múltiplos outros peptideos de csPCNA apre- sentaram de modo consistente deslocamentos mássicos de 14 Da. Para identificar de modo bem sucedido todos os sítios da esterificação metilica, bem como identificar quaisquer ou- tras potenciais modificações pós-traducionais presentes na isoforma do csPCNA, peptideos escalonados foram gerados uti- lizando diferentes reagentes como mostrado nos mapas de se- qüência da isoforma de csPCNA. A FIG. 2A mostra experimentos representativos de cromatogramas de LC- MS/MS de picos bases derivados da digestão separadamente do csPCNA com tripsina sozinha, tripsina seguida por clivagem brometo de cianogênio (CNBr) cleavage, AspN sozinho, ou GluC sozinho. Esses traços do pico base mostram as diferenças nos perfis de eluição pa- ra os peptideos gerados usando essas técnicas. A digestão com tripsina sozinha e tripsina e CNBr proporcionaram cober- tura da seqüência e os experimentos de AspN e GluC propor- cionaram dados confirmatórios adicionais. A clivagem por CN- Br, que corta o C-terminal para resíduos metionina, reduziu o tamanho de peptideos trípticos maiores tornando aquelas seqüências sensíveis à análise LC- MS/MS utilizando captura de íons. Essa digestão combinada foi útil na caracterização de 33 resíduos de peptideo tríptico DLINEACWDISSSGVNLQSM DSSHVSLVQLTLR (PCNA resíduos 21-53) . A digestão com AspN e GluC gerou dados confirmatórios embora ela não gerasse co- bertura da seqüência completa. Isto é provavelmente devido à múltiplos fatores. For exemplo, GluC e AspN possuem um núme- ro menor de sítios de clivagem no PCNA como comparado à tripsina e, portanto, geram peptideos maiores que são mais difíceis de analisar. Adicionalmente, essas proteases reco- nhecem resíduos de ácidos aspártico e glutâmico em proteí- nas, os mesmos resíduos encontrados nesse estudo estarem me- til-esterifiçados. Portanto, a esterificação metílica pode potencialmente efetuar clivagem protease produzindo pepti- deos maiores e em última análise levando à fraca cobertura da seqüência. Essa perda de clivagem de protease pode ser usada como uma ferramenta diagnostica para detectar esteri- ficação metílica. Os peptideos gerados com um resíduo C- terminal protonado tipo peptideos trípticos produzem geral- mente espectros de CID de boa qualidade. Os dados combinados gerados a partir de múltiplos experimentos de seqüenciamento usando essa abordagem identificaram de modo consistente 16 resíduos metil-esterifiçados de ácido glutâmico e aspártico no csPCNA provenientes de células MDA MB 468 e MCF7 de cân- cer de mama (ver Tabela III). Os mapas de seqüência resul- tantes do csPCNA são apresentados na Figura 2B juntamente com quaisquer modificações identificadas por LC-MS/MS. Adi- cionalmente à esterificação metílica, diversas outras moda- lidades foram observadas. Oxidadas metioninas e carbamidome- til cisteínas foram observadas de modo consistente no csPCNA e em outras proteínas em todos os experimentos. Adicional- mente, múltiplas serinas, treonina,s e tirosinas "formila- das" foram observadas nas digestões tripsina/CNBr. Entretan- to, essas modificações são possivelmente modificações quími- cas que resultam do manejo da amostra e não são modificações pós-traducionais "naturais".

Exmplo 3A: Identificação de outras Modificações Pós-Traducionais em PCNA e csPCNA

Adicionalmente à identificação de ésteres metili- cos no csPCNA, a molécula de csPCNA inteira foi analizada quanto à presença de outras modificações pós-traducionais conhecidas. Em contraste aos relatos anteriores acerca de outras formas de PCNA, a onipresença, sumoilação, fosforila- ção, ou acetilação não foram identificadas no csPCNA. A oni- presença e sumoilação poderiam levar a um significativo des- locamento de massa no PCNA em géis 2D-PAGE, os quais não fo- ram observados com a isoforma de csPCNA. Também não foram identificados peptideos correspondentes a um ou outro de o- nipresença ou sumoilação em quaisquer dos experimentos LC- MS/MS de csPCNA, e peptideos de csPCNA não apresentaram des- locamentos mássicos consistentes com a conjugação de onipre- sença ou sumoilação indicando fortemente que o csPCNA nos borrões de gel analisados aqui não estavam nem onipresentes nem sumoilados. E, embora PCNA fosse anteriormente reportado como fosforilado, não foram encontrados dados que sustentas- sem a fosforilação de quaisquer resíduos de csPCNA nessas análises. Nenhum dos peptideos csPCNA observados nessas aná- lises demonstraram um deslocamento mássico de +80 Da e/ou uma perda neutra se H3P04 (98 Da), o que é consistente com os relatórios que mostram que PCNA está acetilado e não fos- forilado. Adicionalmente, os géis foram submetidos à imunob- Iot quanto à presença de fosfoserina, fosfotreonina, fosfo- tirosina, lisina acetilada, bem como poli (ADP)ribose e fo- ram incapazes de detectar essas modificações pós- traducionais no PCNA.

A isoforma de csPCNA em células de câncer de mama não está fosforilada, acetilada, onipresente, ou sumoilada, mas está em lugar disso, metil-esterifiçada. Similar à ace- tilação e fosforilação, a esterificação metilica pode mudar essa migração no 2D-PAGE. Entretanto, diferentemente da ace- tilação e fosforilação, que poderiam deslocar a molécula pa- ra um pI mais ácido, a esterificação metilica pode induzir a proteína a resolver num pI mais básico. Deve ser, portanto, postulado que a baixa abundância da isoforma de caráter áci- do vista na Figura IA (seta branca) pode ser uma isoforma que contenha poucos ou nenhum ésteres metílicos como compa- rado com a isoforma csPCNA.

A isoforma de csPCNA contém uma baixa quantidade de esterificação metilica comparada à forma de PCNA normal ou não maligna (nmPCNA ou simplesmente PCNA). A isoforma PCNA não maligna ou básica contém possivelmente um nível maior de esterificação metilica. Essa conclusão está baseada em parte, no fato de que a esterificação metilica modifica os resíduos de caráter ácido e pode deslocar a proteína para um pi mais básico (devido à perda da carga ácida) e a iso- forma de csPCNA está muito próxima de seu pI calculado de 4,5. Entretanto, a acetilação, fosforilação e ADP- ribosilação pode deslocar uma proteína para um pI mais ácido abaixo de 4,5 (devido à adição de uma carga ácida). Portan- to, essas modificações possivelmente não são responsáveis pelo deslocamento do pi. A medição do alcance da esterifica- ção metílica no PCNA e csPCNA determina a malignidade e não malignidade (csPCNA de nmPCNA). A utilização dos métodos re- velados aqui, os níveis de metil-esterificação de csPCNA e nmPCNA são determinados e comparados para diagnóstico de ma- lignidade. Por exemplo, a Tabela II proporciona o estado de metil-esterificação de diversos peptídeos csPCNA-derivados e a % modificada numa população heterogênea. A Tabela II pode ser usada como uma carta de comparação para determinar os diversos níveis de metil-esterificação no diagnóstico de ma- lignidade .

Exemplo 4; Semi-Quantificação de Peptídeos csPCNA Metil-Esterificados

A identificação de ésteres metílicos no csPCNA com respeito ao pi da isoforma foi também investigada. 0 PCNA tem um pi calculado de aproximadamente 4,5 e o pi de csPCNA, como determinado após calibrração no gel 2D-PAGE utilizando os pis das proteínas adjacentes, foi ligeiramente maior, de aproximadamente 4,6. Em contraste, se 100% de todos os 16 resíduos de caráter ácido identificados na Figura 2 estives- sem metil-esterifiçados, o pi da proteína poderia possivel- mente se deslocar para básico de modo mais dramático que 0,1 unidades de pH (por ex., 5,66). Podem existir resíduos adi- cionais que sejam modificados para produzir a isoforma bási- ca ou nmPCNA. A isoforma nmPCNA pode estar também metil- esterificada em resíduos diferentes e/ou adicionais que a csPCNA. Os métodos revelados aqui permitem àqueles usualmen- te versados na técnica determinar os níveis de metil- esterificação de csPCNA e nmPCNA. As abundâncias relativas dos peptideos metil-esterifiçados foi medida e comparada às dos peptideos não modificados. Isso foi conseguido mediante medir e comparar as áreas de pico de cada peptideo não modi- ficado e sua contra-parte não esterifiçada.

A comparação das áreas de pico revelou uma abun- dância relativa para cada éster metilico identificado nesse experimento LC-MS/MS como mostrado na Tabela II. Cada um dos peptideos mostram apenas esterificação metilica parcial (<25%) quando as áreas de pico são comparadas. Portanto, a isoforma de csPCNA é provável de ser compreendida de uma po- pulação heterogênea de moléculas de PCNA com o mesmo pi. Em outras palavras, uma única molécula de csPCNA apresenta um ou poucos ésteres metilicos, mas não 16. Porém um ou poucos ésteres metilicos podem ocorrer nos 16 diferentes resíduos ao longo da proteína. Essa heterogeneidade de csPCNA é ilus- trada pela presença de esterificação metilica no peptideo C- terminal do csPCNA. 0 peptideo não modificado, IEDEEGS (778 m/z), eluiu a 28,9 min (FIG. 3A) e o espectro da CID desse peptideo está consistente com um peptideo contendo resíduos de caráter ácido não modificados (FIG. 3B). De modo interes- sante, no selecionado cromatograma de íon para espécies me- til-esterifiçadas (792 m/z) desse peptideo, dois picos são identificados com tempos de retenção aumentados em 2-3 minu- tos. Isso é provável devido a um aumentado caráter hidrofó- bico e perda de carga conferida pela esterificação metilica.

A resolução desses dois picos foi, portanto, indicativa de uma diferença na estrutura desses peptideos. A inspeção do espectro da CID identifica que os peptideos estão metil- esterifiçados mas em diferentes resíduos (FIGS. 3C e D). De- vido ao fato de não serem observados peptideos abrigando és- teres metílicos em ambos os resíduos, a aparência desses peptideos muito provavelmente resultou da análise de uma po- pulação heterogênea de csPCNA.

É possível que a heterogeneidade observada e a baixa porcentagem de espécies possam ser o resultado da fá- cil labilidade das modificações metil-ésteres por si só. Al- guns relatórios indicam que modificações de metil esterifi- cação de proteína tiveram vida curta em soluções neutras e básicas. Portanto, ésteres metílicos de proteína, como aque- les encontrados em csPCNA, pode hidrolisar espontaneamente deixando um resíduo não modificado e metanol. Adicionalmen- te, as condições básicas e oxidantes de SDS-PAGE podem tam- bém levar à perda de ésteres metílicos do PCNA, e tentativas para resolver a isoforma PCNA básica, uma forma de PCNA al- tamente metil-esterifiçada, ao seu pi básico aparenta exibir uma regressão espontânea no sentido de um pi de caráter mais ácido (Figura 4).

Um alto nível de ésteres metílicos provavelmente induzem o PCNA a focar num pi básico como mostrado no imu- noblot na Figura 4 (aproximadamente pH 8,8-9,0). Todavia, a focalização dessa isoforma pode não ser uniforme (raiada) e pode estar presente numa intensidade mais baixa. Os pHs bá- sicos nos quais essa isoforma se resolve podem não ser con- dutivos para manter a totalidade da esterificação metílica na proteína. A incapacidade para focar num pi específico ob- servado nesse gel (FIG. 4) é provavelmente devido à concomi- tante perda de um ou mais dos ésteres metilicos devido à fo- calização num pH básico. A hidrólise espontânea dos ésteres metilicos ocorre, liberando metanol e uma cadeia aminoácido lateral não modificada. A regeneração das cadeias laterais de caráter ácido por meio dessa "hidrólise básica" provavel- mente induz o pi do PCNA a deslocar de um básico para um mais ácido, como evidenciado pelo acúmulo de PCNA no sentido dos lados mais ácidos do gel (pH 7).

A identificação e a análise da metil-esterificação pode ser realizada sob condições que minimizem a perda de ésteres metilicos. Por exemplo, um método de descrever 2D- PAGE de caráter ácido que utiliza condições capazes de pre- servar os ésteres metilicos da proteína são descritos (O1Connor e outros, Anal Biochem 1985, 148, 79-86). Entre- tanto, muitas das proteases disponíveis que identificam PCNA são ativas em pHs de neutro para básico e é possível que al- guma quantidade significativa da esterificação metílica pos- sa se perder durante a digestão.

Na célula intacta ou em extratos, a(s) enzima(s) responsável pela esterificação metílica pode estar ativa e pode modifi- car resíduos que tenham perdido ésteres metilicos por hidró- lise espontânea. A separação de PCNA da enzima(s) responsá- vel pela esterificação metílica e incubação nas condições que sustentam hidrólise (por exemplo, pH acima de 7,0) podem levar à perda de um ou mais ésteres metilicos. Por exemplo, tais perdas de ésteres metilicos podem ser minimizadas medi- ante manter uma condição ligeiramente ácida durante o manejo e análise da amostra.

Tabela I. Análise do status da metil-esterificação de diversas proteínas

<table>table see original document page 35</column></row><table>

a: as posições dos borrões de proteína estão iden- tificadas na Figura IA.

b: peptídeos demonstraram claramente deslocamento mássico +14 em um ou outro dos resíduos de ácido aspártico ou glutâmico.

c: cobertura da seqüência é calculada mediante di- vidir o número de resíduos aminoácidos identificados pelo número total de resíduos na proteína.

Tabela II: Estado de Metil-esterificação de diversos

<table>table see original document page 36</column></row><table> <table>table see original document page 37</column></row><table>

a: modificações de peptideo apresentadas são meti- onina oxidada (Mo), carbamidometil cisteina (Cca), ácido glutâmico metil-esterifiçado (Em), e ácido aspártico metil- esterificado (Dm).

b: o percentual de éster metilico foi calculado mediante dividir as áreas de pico dos peptideos metil- esterif içados pelas áreas de pico combinada para os pepti- deos metil-esterifiçados e não modificados.

c: pontuações Mascot são reportadas como 10log(P), onde P é a probabilidade de que a compatibilização seja um evento randômico.

d: dados gerados usando LCQ DECA XP comparado a um LCQ Advantage.

Tabela III: Posições aminoácidos de ésteres metí- licos no csPCNA

<table>table see original document page 37</column></row><table> <table>table see original document page 38</column></row><table> Listagem de Seqüência

<110> INDIANA UNIVERSITY RESEARCH AND TECHNOLOGY CORPORATION

<120> Modificações isoformes CSPCNA e seus usos

<130> 29920-200292

<140> PCT/US06/024774

<141> 2006-06-26

<150> 60/694,159

<151> 2005-06-27

<160> 30

<170> PatentIn Ver. 3.3

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptídeo sintético

<220>

<221> MOD_RES <222> (3)

<223> Glu metil-esterificado <400> 1

Met Phe Glu Ala Arg 1 5

<210 > 2 <211> 7 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptídeo sintético

<220>

<221> MOD_RES <222> (2)

<223> Glu metil-esterificado

<400> 2

Ile Glu Asp Ulu Glu Gly Ser 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptídeo sintético <220>

<221> MOD_RES <222> (5)

<223> Glu metil-esterificado <400> 3

Ile Glu Asp Glu Glu Gly Ser 1 S

<210> 4 <211> 7 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptídeo sintético

<220>

<221> MOD_RES <222> (5)

<223> Glu metil-esterificado <400> 4

Val Ser Asp Tyr Glu Met Lys 1 5

<210> 5 <211> 8 <212> PRT

<213> -Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptídeo sintético <220>

<221> MOD_RES <222> (5)

<223> Glu metil-esterificado

<400> 5

Met Pro Ser Gly Glu Phe Ala Arg 1 5 <210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptídeo sintético

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)

<223> Asp metil-esterificado

<400> 6

Leu Ser Gln Thr Ser Asn Val Asp Lys 1 5

<210> 7 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptídeo sintético

<220>

<221> MOD_RES <222> (S)

<223> Glu metil-esterificado

<400> 7

Cys Ala Gly Asn Glu Asp Ile Ile Thr Leu Arg 1 5 10

<210> 8 <211> 13 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptídeo sintético

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)

<223> Glu metil-esterificado

<400> 8

Phe Ser Ala Ser Gly Glu Leu Gly Asn Gly Asn Ile Lys 1 5 10 <210> 9 <211> 19 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptídeo sintético

<220>

<221> MOD_RES <222> (18)

<223> Glu metil-esterificado <400> 9

Ala Glu Asp Asn Ala Asp Thr Leu Ala Leu Val Phe Glu Ala Pro Asn 15 10 15

Gln Glu Lys

<210> 10

<211> 19

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptídeo sintético

<220>

<221> MOD_RES <222> (2)

<223> Glu metil-esterificado

<400> 10

Ala Glu Asp Asn Ala Asp Thr Leu Ala Leu Val Phe Glu Ala Pro Asn 15 10 15

Gln Glu Lys

<210> 11 <211> 19 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptídeo sintético

<220>

<221> M0D_RES <222> (3)

<223> Asp metil-esterificado <400> 11

Ala Glu Asp Asn Ala Asp Thr Leu Ala Leu Val Phe Glu Ala Pro Asn 15 10 15

Gln Glu Lys

<210> 12

<211> 19

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptídeo sintético

<220>

<221> M0D_RES <222> (13)

<223> Glu metil-esterificado <400> 12

Ala Glu Asp Asn Ala Asp Thr Leu Ala Leu Val Phe Glu Ala Pro Asn 15 10 15

Gln Glu Lys

<210> 13

<211> 21

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptídeo sintético

<220>

<221> M0D_RES <222> (3)

<223> Asp metil-esterificadó <400> 13

Leu Met Asp Leu Asp Val Glu Gln Leu Gly Ile Pro Glu Gln Glu Tyr 15 10 15

Ser Cys Val Val Lys 20

<210> 14 <211> 23 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptídeo sintético <220>

<221> MOD_RES <222> (21)

<223> Glu metil-esterificado <400> 14

Ala Thr Pro Leu Ser Ser Thr Val Thr Leu Ser Met Ser Ala Asp Val 1 5 10 15

Pro Leu Val Val Glu Tyr Lys 20

<210> 15 <211> 29 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptídeo sintético <220>

<221> M0D_RES <222> (20)

<223> Glu metil-esterificado <400> 15

Leu Ser Gln Thr Ser Asn Val Asp Lys Glu Glu Glu Ala Val Thr Xle 1 5 10 15

Glu Met Asn Glu Pro Val Gln Leu Thr Phe Ala Leu Arg 20 25

<210> 16 <211> 7 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptídeo sintético

<400> 16

Ile Glu Asp Glu Glu Gly Ser 1 5

<210> 17 <211> 19 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptídeo sintético <400> 17

Ala Glu Asp Asn Ala Asp Thr Leu Ala Leu Val Phe Glu Ala Pro Asn 15 10 15

Gln Glu Lys

<210> 18 <211> 33 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptídeo sintético <400> 18

Asp Leu Ile Asn Glu Ala Cys Trp Asp Ile Ser Ser Ser Gly Val Asn 15 10 15

Leu Gln Ser Met Asp Ser Ser His Val Ser Leu Val Gln Leu Thr Leu 20 25 30

Arg

<210> 19 <211> 5 <212> PRT

<213 > Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptídeo sintético <220>

<221> MODJRES

<222> (1)

<223> Metoxidado

<220>

<221> M0D_RES

<222> {3)

<223> Glu metil-esterificado

<400> 19

Met Phe Glu Ala Arg 1 5 <210> 20 <211> 7 <212> PRT

<213 > Seqüência Artificial <220>

<223 > Descrição da seqüência artificial: peptídeo sintético

<400> 20

Val Ser Asp Tyr Glu Met Lys 1 5

<210> 21 <211> 8 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptídeo sintético

<220>

<221> MOD_RES <222> (1) <223> Met oxidado

<220>

<221> MOD_RES <222> (5)

<223> Glu metil-esterificado

<400> 21

Met Pro Ser Gly Glu Phe Ala Arg 1 5

<210> 22 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptídeo sintético

<220>

<221> M0D_RES <222> (1)

<223> Cys carbamido-metil <220>

<221> M0D_RES <222> (5)

<223> Glu metil-esterificado <400> 22

Cys Ala Gly Asn Glu Asp Ile Ile Thr Leu Arg 1 5 10

<210> 23

<211> 21

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptídeo sintético

<220>

<221> MOD_RES <222> (2)

<223> Met oxidado

<220>

<221> MOD_RES <222> (3)

<223> Asp metil-esterificado <220>

<221> MOD_RES <222> (18)

<223> Cys carbamido-metil

<400> 23

Leu Met Asp Leu Asp Val Glu Gln Leu Gly Ile Pro Glu Gln Glu Tyr 1 5 10 15

Ser Cys Val Val Lys 20

<210> 24 <211> 23 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptídeo sintético

<220>

<221> M0D_RES

<222> (12)

<223> Metoxidado

<220>

<221> MOD_RES

<222> (21)

<223> Glu metil-esterificado <400> 24

Ala Thr Pro Leu Ser Ser Thr Val Thr Leu Ser Met Ser Ala Asp Val 15 10 15

Pro Leu Val Val Glu Tyr Lys 20

<210> 25

<211> 29

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220> <223>

Descrição da seqüência artificial: peptídeo sintético

<220>

<221> M0D_RES <222> (18) <223> Metoxidado

<220>

<221> M0D_RES <222 > (20)

<223> Glu metil-esterificado

<400> 25

Leu Ser Gln Thr Ser Asn Val Asp Lys Glu Glu Glu Ala Val Thr Ile 15 10 15

Glu Met Asn Glu Pro Val Gln Leu Thr Phe Ala Leu Arg 20 25

<210> 26 <211> 261 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223 > Descrição da seqüência artificial: peptídeo sintético

<220>

<221> M0D_RES <222> (3)

<223> Glu metil-esterificado <220>

<221> M0D_RES <222> (85)

<223> Glu metil-esterificado <220>

<221> MOD_RES <222 > (93)

<223> Glu metil-esterificado <220>

<221> MOD_RES <222> (94)

<223> Asp metil-esterificado <220>

<221> MOD_RES <222> (104)

<223> Glu metil-esterificado <220>

<221> MOD_RES <222> (109)

<223> Glu metil-esterificado <220>

<221> MOD_RES <222> (115)

<223> Glu metil-esterificado <220>

<221> MOD_RES <222> (120)

<223> Asp metil-esterificado <220>

<221> MOD_RES <222> (143)

<223> Glu metil-esterificado <220>

<221> MOD_RES <222> (174)

<223> Glu metil-esterificado <220>

<221> MOD_RES <222> (189)

<223> Asp metil-esterificado <220>

<221> MOD_RES <222> (201)

<223> Glu metil-esterificado" <220>

<221> MOD_RES <222> (238)

<223> Glu metil-esterificado <220>

<221> MOD_RES <222> (256)

<223> Glu metil-esterificado <220>

<221> MOD_RES

<222> (259)

<223> Glu metil-esterificado

<400> 26

Met Phe Glu Ala Arg Leu Val Gln Gly Ser Ile Leu Lys Lys Val Leu 1 5 10 15

Glu Ala Leu Lys Asp Leu Ile Asn Glu Ala Cys Trp Asp Ile Ser Ser 20 25 30

Ser Gly Val Asn Leu Gln Ser Met Asp Ser Ser His Val Ser Leu Val 35 40 45

Gln Leu Thr Leu Arg Ser Glu Gly Phe Asp Thr Tyr Arg Cys Asp Arg 50 55 60

Asn Leu Ala Met Gly Val Asn Leu Thr Ser Met Ser Lys Ile Leu Lys 65 70 75 80

Cys Ala Gly Asn Glu Asp Ile Ile Thr Leu Arg Ala Glu Asp Asn Ala 85 90 95

Asp Thr Leu Ala Leu Val Phe Glu Ala Pro Asn Gln Glu Lys Val Ser 100 105 110

Asp Tyr Glu Met Lys Leu Met Asp Leu Asp Val Glu Gln Leu Gly Ile 115 120 125

Pro Glu Gln Glu Tyr Ser Cys Val Val Lys Met Pro Ser Gly Glu Phe 130 135 140

Ala Arg Ile Cys Arg Asp Leu Ser His Ile Gly Asp Ala Val Val Ile 145 150 155 160

Ser Cys Ala Lys Asp Gly Val Lys Phe Ser Ala Ser Gly Glu Leu Gly 165 170 175

Asn Gly Asn Ile Lys Leu Ser Gln Thr Ser Asn Val Asp Lys Glu Glu 180 185 190

Glu Ala Val Thr Ile Glu Met Asn Glu Pro Val Gln Leu Thr Phe Ala 195 200 205

Leu Arg Tyr Leu Asn Phe Phe Thr Lys Ala Thr Pro Leu Ser Ser Thr 210 215 220

Val Thr Leu Ser Met Ser Ala Asp Val Pro Leu Val Val Glu Tyr Lys 225 230 235 240

Ile Ala Asp Met Gly His Leu Lys Tyr Tyr Leu Ala Pro Lys Ile Glu 245 250 255

Asp Glu Glu Gly Ser 260 <210> 27 <211> 261 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptídeo sintético

<220>

<221> MOD_RES <222> (3)

<223> Glu metil-esterificado

<220>

<221> MOD_RES <222> (85)

<223> Glu metil-esterificado

<220>

<221> MOD_RES

<222> {104)

<223> Glu metil-esterificado

<220>

<221> MOD_RES <222> (109)

<223> Glu metil-esterificado

<220>

<221> MOD_RES

<222> (115)

<223> Glu metil-esterificado

<220>

<221> MOD_RES <222> (143)

<223> Glu metil-esterificado

<220>

<221> MOD_RES <222> (174)

<223> Glu metil-esterificado

<220>

<221> MOD_RES <222> (256)

<223> Glu metil-esterificado

<400> 27

Met Phe Glu Ala Arg Leu Val Gln Gly Ser Ile Leu Lys Lys Val Leu 1 5 10 15

Glu Ala Leu Lys Asp Leu Ile Asn Glu Ala Cys Trp Asp Ile Ser Ser 20 25 30

Ser Gly Val Asn Leu Gln Ser Met Asp Ser Ser His Val Ser Leu Val 35 40 45 Gln Leu Thr Leu Arg Ser Glu Gly Phe Asp Thr Tyr Arg Cys Asp Arg 50 55 60

Asn Leu Ala Met Gly Val Asn Leu Thr Ser Met Ser Lys Ile Leu Lys 65 70 75 - 80

Cys Ala Gly Asn Glu Asp Ile Ile Thr Leu Arg Ala Glu Asp Asn Ala 85 90 95

Asp Thr Leu Ala Leu Val Phe Glu Ala Pro Asn Gln Glu Lys Val Ser 100 105 110

Asp Tyr Glu Met Lys Leu Met Asp Leu Asp Val Glu Gln Leu Gly Ile 115 120 125

Pro Glu Gln Glu Tyr Ser Cys Val Val Lys Met Pro Ser Gly Glu Phe 130 135 140

Ala Arg Ile Cys Arg Asp Leu Ser His Ile Gly Asp Ala Val Val Ile 145 150 155 160

Ser Cys Ala Lys Asp Gly Val Lys Phe Ser Ala Ser Gly Glu Leu Gly 165 170 175

Asn Gly Asn Ile Lys Leu Ser Gln Thr Ser Asn Val Asp Lys Glu Glu 180 185 190

Glu Ala Val Thr Ile Glu Met Asn Glu Pro Val Gln Leu Thr Phe Ala 195 200 205

Leu Arg Tyr Leu Asn Phe Phe Thr Lys Ala Thr Pro Leu Ser Ser Thr 210 215 220

Val Thr Leu Ser Met Ser Ala Asp Val Pro Leu Val Val Glu Tyr Lys 225 230 235 240

Ile Ala Asp Met Gly His Leu Lys Tyr Tyr Leu Ala Pro Lys Ile Glu 245 250 255

Asp Glu Glu Gly Ser 260

<210> 28 <211> 141 <212> PRT

< 213> Seqüência Artificial <220>

c223> Descrição da seqüência artificial: peptídeo sintético

<220>

<221> MOD_RES <222> (43)

<223> Glu metil-esterificado <220>

<221> MOD_RES <222> (54)

<223> Asp metil-esterificado <220>

<221> MOD_RES <222> (66)

<223> Glu metil-esterificado <400> 28

Ala Leu Lys Asp Leu Ile Asn Glu 1 5

Ala Cys Trp Asp Ile Ser Ser Ser 10 15

Gly Val Asn Leu Gln Ser Met Asp 20

Ser Ser His Val Ser Leu Val Gln 25 30

Leu Thr Leu Arg Ser Glu Ala Pro Asn Gln Glu Lys Val Ser Asp Tyr 35 40 45

Glu Met Lys Leu Met Asp Leu Asp Val Glu Gln Leu Gly Ile Pro Glu 50 55 60

Gln Glu Tyr Ser Cys Val Val Lys Met Pro Ser Gly Glu Leu Gly Asn 65 70 75 80

Gly Asn Ile Lys Leu Ser Gln Thr Ser Asn Val Asp Lys Glu Glu Glu 85 90 95

Ala Val Thr Ile Glu Met Asn Glu Pro Val Gln Leu Thr Phe Ala Leu 100 105 110

Arg Tyr Leu Asn Phe Phe Thr Lys Ala Thr Pro Leu Ser Ser Thr Val 115 120 125

Thr Leu Ser Met Ser Ala Asp Val Pro Leu Val Val Glu 130 135 140

<210> 29 <211> 154 <212> PRT

<213 > Seqüência Artificial <220>

<223 > Descrição da seqüência artificial: peptídeo sintético <400> 29

Asp Leu Ile Asn Glu Ala Cys Trp Asp Ile Ser Ser Ser Gly Val Asn 1 5 10 15

Leu Gln Ser Met Asp Ser Ser His Val Ser Leu Val Gln Leu Thr Leu 20 25 30

Arg Ser Glu Gly Phe Asp Arg Asn Leu Ala Met Gly Val Asn Leu Thr 35 40 45 Ser Met Ser Lys Ile Leu Lys Cys Ala Gly Asn Glu Asp Ile Ile Thr 50 55 60

Leu Arg Ale Glu Asp Asn Alci Asp Thr Leu Als Leu Val Phe Glu Ala 65 70 75 80

Pro Asn Gln Glu Lys Val Ser Asp Tyr Glu Met Lys Leu Met Asp Leu 85 90 95

Ser His Ile Gly Asp Gly Val Lys Phe Ser Ala Ser Gly Glu Leu Gly 100 105 110

Asn GXy Asn Ile Lys Leu Ser Gln Thr Ser Asn Val Asp Val Pro Leu 115 120 125

Val Val Glu Tyr Lys Ile Ala Asp Met Gly His Leu Lys Tyr Tyr Leu 130 135 140

Ala Pro Lys Ile Glu Asp Glu Glu Gly Ser 145 150

<210> 30 <211> 261 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: peptídeo sintético

<400> 30

Met Phe Glu Ala Arg Leu Val Gln 1 5

Glu Ala Leu Lys Asp Leu Ile Asn 20

Ser Gly Val Asn Leu Gln Ser Met

35 40

Gln Leu Thr Leu Arg Ser Glu Gly 50 55

Asn Leu Ala Met Gly Val Asn Leu 65 70

Gly Ser Ile Leu Lys Lys Val Leu 10 15

Glu Ala Cys Trp Asp Ile Ser Ser 25 30

Asp Ser Ser His Val Ser Leu Val 45

Phe Asp Thr Tyr Arg Cys Asp Arg 60

Thr Ser Met Ser Lys Ile Leu Lys 75 80

Cys Ala Gly Asn Glu Asp Ile Ile Thr Leu Arg Ala Glu Asp Asn Ala 85 90 95

Asp Thr Leu Ala Leu Val Phe Glu Ala Pro Asn Gln Glu Lys Val Ser 100 105 110

Asp Tyr Glu Met Lys Leu Met Asp Leu Asp Val Glu Gln Leu Gly Ile 115 120 125

Pro Glu Gln Glu Tyr Ser Cys Val Val Lys Met Pro Ser Gly Glu Phe 130 135 140 Ala Arg Ile Cys Arg Asp Leu Ser His Ile Gly Asp Ala Val Val Ile 145 150 155 160

Ser Cys Ala Lys Asp Gly Val Lys Phe Ser Ala Ser Gly Glu Leu Gly 165 170 175

Asn Gly Asn Ile Lys Leu Ser Gln Thr Ser Asn Val Asp Lys Glu Glu 180 185 190

Glu Ala Val Thr Ile Glu Met Asn Glu Pro Val Gln Leu Thr Phe Ala 195 200 205

Leu Arg Tyr Leu Asn Phe Phe Thr Lys Ala Thr Pro Leu Sèr Ser Thr 210 215 220

Val Thr Leu Ser Met Ser Ala Asp Val Pro Leu Val Val Glu Tyr Lys 225 230 235 240

Ile Ala Asp Met Gly His Leu Lys Tyr Tyr Leu Ala Pro Lys Ile Glu 245 250 255

Asp Glu Glu Gly Ser 260

Claims (22)

1. Método, de detectar uma isoforma do antigeno nuclear de célula profiferativa específica, de câncer (csPC- NA) em uma amostra biológica, o método sendo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: detectar uma modificação pós-traducional compreen- dendo um éster metílico num ou mais resíduos aminoácidos da isoforma do csPCNA na amostra suspeita de conter a isoforma do csPCNA; e determinar a presença da isoforma do csPCNA medi- ante comparar os níveis de ésteres metílicos na isoforma do csPCNA com uma isoforma não-malignizante do PCNA.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra biológica é um fluido corporal.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por o fluido corporal ser selecionado a partir de sangue, plasma, linfa, soro, fluido pleural, fluido espi- nal, saliva, cuspe, urina, suco gástrico, suco pancreático, fluido de ascite, fluido sinovial, leite, e sêmen.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra biológica é uma a- mostra de tecido.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o tecido é selecionado a par- tir de mama, próstata, pulmão, cólon, epitelial, conectivo, cervical, esofágico, cérebro, timo, tireóide, pâncreas, tes- tículo, ovário, intestino, bexiga, estomago, sarcomas de te- cido mole, osteosarcoma, leucemia, linfoma, carcinoma, ade- nocarcinoma, placenta, fibroso, tecido de célula germinati- va, e extratos desses mencionados.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o éster metilico está presen- te num ácido aspártico.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o éster metilico está presen- te num ácido glutâmico.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o éster metilico está presen- te num ou mais dos 16 resíduos de ácido aspártico ou de áci- do glutâmico na isoforma do csPCNA.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o éster metilico presente num ou mais dos 16 resíduos de ácido aspártico ou de ácido glu- tâmico corresponde às posições 3, 85, 93, 94, 104, 109, 115, -120, 132, 143, 174, 189, 201, 238, 255, e 259 do aminoácido da isoforma do csPCNA.

10. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o éster metilico está presen- te num ou mais dos 16 resíduos de ácido aspártico ou de áci- do glutâmico correspondentes aos peptídeos com resíduos ami- noácidos modificados selecionados a partir de MFEmAR; IEmDEEGS; IEDEEmGS; VSDYEmMK; MPSGEmFAR; LSQTSNVDmK; CAGNEmDIITLR; FSASGEmLGNGNIK; AEDNADTLALVFEAPNQEmK; AEmDNADTLALVFEAPNQEK; AEDmNADTLALVFEAPNQEK; AEDNADTLALVFEmAPNQEK; LMDmLDVEQLGIPEQEYSCVVK; ATPLSSTVTLSMSADVPLVVEmYK; e LSQTSNVDKEEEAVTIEMNEmPVQLTFALR, onde Em representa um resíduo ácido glutâmico metil-esterifiçado e Dm representa um resíduo de ácido aspártico metil-esterifiçado.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a detecção da isoforma do csPCNA é realizada usando uma análise espectrométrica.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a análise espectrométrica de massa é análise espectrométrica de massa (MS) por cromato- grafia líquida (LC).

13. Método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a análise espectrométrica de massa de um peptídeo derivado do csPCNA resulta em um deslo- camento de massa de 14 Da como comparado a um correspondente peptídeo não modificado.

14. Método, de diagnóstico ou de prognóstico de malignidade, o método sendo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: detectar a isoforma do antígeno nuclear de célula profiferativa especifica de câncer (csPCNA) em uma amostra biológica mediante identificar um estado de modificação pós- traducional da isoforma csPCNA que distingue a isoforma csPCNA de uma isoforma do PCNA não-malignizante (nmPCNA); e diagnosticar a malignidade com base na detecção do csPCNA na amostra biológica.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que a modificação pós-traducional é a metil-esterificação.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que a metil-esterif icação está presente num ou mais dos 16 resíduos de ácido aspártico ou de ácido glutâmico na isoforma do csPCNA.

17. Método, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que a modificação pós-traducional compreende determinar os níveis da metil-esterificação da isoforma do csPCNA e da isoforma do nmPCNA.

18. Método de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o éster metílico presente num ou mais dos 16 resíduos de ácido aspártico ou de ácido glu- tâmico corresponde às posições 3, 85, 93, 94, 104, 109, 115, - 120, 132, 143, 174, 189, 201, 238, 255, e 259 do aminoácido da isoforma do csPCNA.

19. Peptídeo do antígeno nuclear de célula proli- ferativa (PCNA) modificado, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma seqüência aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste de MFEmAR; IEmDEEGS; IEDEEmGS; VSDYEmMK; MPSGEmFAR; LSQTSNVDmK; CAGNEmDIITLR; FSASGEmLGNGNIK; AEDNADTLALVFEAPNQEmK; AEmDNADTLALVFEAPNQEK; AEDmNADTLALVFEAPNQEK; AEDNADTLALVFEmAPNQEK; LMDmLDVEQLGIPEQEYSCVVK; ATPLSSTVTLSMSADVPLVVEmYK; e LSQTSNVDKEEEAVTIEMNEmPVQLTFALR, onde Em representa um resíduo ácido glutâmico metil-esterifiçado e Dm representa um resíduo de ácido aspártico metil-esterifiçado.

20. Peptídeo modificado de acordo com a reivindi- cação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que os peptídeos são pós-traducionalmente modificados.

21. Peptídeo modificado de acordo com a reivindi- cação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que os peptídeos são expostos a uma etapa de digestão da protease.

22. Peptídeo modificado de acordo com a reivindi- cação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que os peptídeos são sintéticos.