BRPI0611326A2

BRPI0611326A2 - receptores de células t melano-a de alta afinidade

Info

Publication number: BRPI0611326A2
Application number: BRPI0611326-5A
Authority: BR
Inventors: Bent Karsten Jakobsen; Nathaniel Ross Liddy
Original assignee: Medigene Ltd
Priority date: 2005-06-01
Filing date: 2006-05-31
Publication date: 2010-08-31
Also published as: JP2008545426A; EP1893642A2; ZA200710009B; EA012507B1; WO2006129085A2; AU2006253941B2; EA200702677A1; WO2006129085A3; CN101189261B; CA2610786A1; AU2006253941A1; CN101189261A; MX2007014919A; US8217144B2; GB0511124D0; AU2006253941A2; US20080292549A1

Abstract

RECEPTORES DE CéLULAS T MELANO-A DE ALTA AFINIDADE. A presente invencao fornece TCRs com uma afinidad (KD) me- nor ou igual a 3 <109>M, e/ou uma taxa de separacao (k0ff) de 1 x 10-3 ou mais baixa, para o complexo AAGIGILTV-HLA-A*O2O1. Estes TC Rs sao ü- teis, seja isolados ou associados com um agente terap²utico, para atacar células cancerosas presentes nesse complexo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "RECEPTORESDE CÉLULAS T MELANO-A DE ALTA AFINIDADE".

A presente invenção refere-se a receptores de células-T (TCRs)com a propriedade de se ligar a AAGIGILTV-HLA-A*0201 e compreendendopelo menos um domínio variável da cadeia α do TCR e/ou pelo menos umdomínio variável da cadeia β do TCR caracterizado pelo fato de o referidoTCR ter um K0 para o referido complexo AAGIGILTV-HLA-A*0201 menor ouigual a 3 μΜ e/ou uma taxa de separação (K3ff) de 1 χ 10'3 S"1 ou mais baixa.

Antecedentes da Invenção

O peptídio AAGIGILTV deriva da proteína melano-A (Mart-1) queé expressa pela maioria das amostras novas de melanoma e por aproximada-mente 60% das linhagens celulares de melanoma, assim como de melanócitosnormais. ((Coulie et ai, (1994) J. Exp. Med. 180: (1) 1-4) e Kawakami et ai,(1994) PNAS USA 91: 3515). As moléculas de HLA classe I destas células cance-rosas apresentam peptídios desta proteína, incluindo o AAGIGILTV (SEQ ID N243) (Melano-A27-35). O complexo AAGIGILTV-HLA-A*0201 parece ser umalvo imunodominante para células-T específicas para melanoma. ((Kawa-kami et ai, (1994) PNAS USA 91: 3515) e (Rivoltini et ai, (1995) J. Immunol154: 2257). Portanto, este complexo peptídio-HLA oferece um marcador decâncer que pode ser vetorizado por TCRs1 por exemplo com a finalidade dedistribuir agentes citotóxicos ou imunoestimulantes para as células cancero-sas. No entanto, para tanto seria desejável que o TCR tivesse uma afinidademais alta e/ou uma taxa de separação mais baixa para o complexo peptídio-HLA que os TCRs nativos específicos para esse complexo.

Breve Descrição da Invenção

Esta invenção coloca à disposição pela primeira vez TCRs comalta afinidade (K0) da interação menor ou igual a 3 μΜ e/ou uma taxa de se-paração ("off-rate") (Roff) de 1 χ 10"3 S"1 ou mais baixa para o complexoAAGIGILTV-HLA-A*0201. Tais TCRs são úteis, seja isolados ou associadoscom um agente terapêutico, para atacar células cancerosas apresentandoaquele complexo.

Descrição Detalhada da InvençãoA presente invenção fornece um receptor de células-T (TCR)com a propriedade de se ligar a AAGIGILTV-HLA-A*0201 e compreendendopelo menos um domínio variável da cadeia α do TCR e/ou pelo menos umdomínio variável da cadeia β do TCR caracterizado pelo fato de o referidoTCR ter um K0 para o referido complexo AAGIGILTV-HLA-A*0201 menor ouigual a 3 μΜ e/ou uma taxa de separação ("off-rate") (koft) de 1 χ 10"3 S"1 oumais baixa.

Em uma outra modalidade da presente invenção os referidosTCRs têm um Kd para o complexo AAGIGILTV-HLA-A*0201 menor ou iguala 1 μΜ.

A medição do K0 pode ser feita por qualquer um dos métodosconhecidos. Um método preferido é o método de ressonância de plasmôniode superfície (Biacore) do exemplo 4.

A título de comparação, a interação de uma variante solúvel li-gada por dissulfeto do TCR MEL nativo (vide SEQ ID N2 9 para a cadeia ado TCR e SEQ ID N2 10 para a cadeia β do TCR) e do complexoAAGIGILTV-HLA-A*0201 tem um K0 de aproximadamente 4 μΜ medido pe-lo método básico da Biacore do exemplo 4.

O TCR MEL nativo específico para o complexo AAGIGILTV-HLA-A*0201 possui o emprego a seguir do gene de cadeia V-alfa e V-beta(usando a terminologia do T ceíi receptor Factsbook, (2001) LeFranc & Le-Franc1 Academic Press, ISBN 0-12-441352-8, vide abaixo):

Cadeia-alfa: - TRAV 12-2

Cadeia-beta: - TRBV 30

O TCR MEL nativo pode ser usado como um gabarito no qualpodem ser introduzidas várias mutações que conferem alta afinidade e/oubaixa taxa de separação para a interação entre os TCRs da invenção e ocomplexo AAGIGILTV-HLA-A*0201. Assim sendo a invenção inclui TCRsque são alterados em relação à região variável da cadeia α (vide figura 1a eSEQ ID N2 1) em relação à região variável da cadeia β (vide figura 1b e SEQID N2 2) do TCR MEL nativo em pelo menos uma região determinadora decomplementaridade (CDR) e/ou uma região de estrutura da região variáveldo mesmo. Também é considerado que outras regiões hipervariáveis nasregiões variáveis dos TCRs da invenção, tais como as regiões hipervariáveis4 (HV4), podem ser alteradas para produzir um mutante de alta afinidade.

Os TCRs nativos existem nas formas heterodiméricas αβ ou γδ.

No entanto, já foi mostrado que TCRs recombinantes consistindo em umaúnica cadeia α de TCR ou em uma única cadeia β de TCR se ligam às mo-léculas MHC do peptídio.

Em uma modalidade o TCR da invenção compreende um domí-nio variável da cadeia α e um domínio variável da cadeia β de TCR.

Como será óbvio para os versados na técnica as mutações naseqüência da cadeia a do TCR e/ou na seqüência da cadeia β do TCR po-dem ser uma ou mais substituições, deleções ou inserções. Estas mutaçõespodem ser efetuadas usando qualquer método apropriado que inclui, porémsem limitação, aqueles baseados na reação de cadeia de polimerase (PCR),clonagem baseada em enzimas de restrição, ou procedimentos de clona-gem independente da ligação (LIC). Estes métodos estão descritos em deta-lhes em muitos dos textos tradicionais de biologia molecular. Para maioresdetalhes referentes à mutagênese por reação de cadeia de polimerase(PCR) e clonagem baseada em enzimas de restrição vide (Sambrook &Russell, (2001) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3rd Ed.) CSHLPress). Outras informações sobre procedimentos de LIC podem ser encon-tradas em (Rashtchian, (1995) Curr Opin Biotechnol 6 (1): 30-6). Exposiçãoa fagos oferece um meio pelo qual é possível gerar bibliotecas de variantesde TCR. Métodos adequados para a exposição de fagos e subseqüente ras-treamento de bibliotecas de variantes de TCR contendo cada um uma liga-ção dissulfeto não nativa intercadeias estão descritos em detalhes em (Li etai, (2005) Nature Biotech 23 (3): 349-354) e no documento WO2004/04404.

Deve ser observado que qualquer TCR αβ que compreendeemprego similar do gene V-alfa e V-beta e portanto seqüência de aminoáci-dos similar àquela do TCR MEL poderia ser um TCR gabarito conveniente.Seria então possível introduzir no DNA codificando uma ou ambas as regi-ões variáveis do TCR αβ gabarito as alterações necessárias para produziros TCRs de alta afinidade alterados da invenção. Como ficará óbvio para osversados na técnica, as mutações necessárias podem ser introduzidas porinúmeros métodos, por exemplo mutagênese direcionada para o sítio.

A menos que de outra forma especificado, as seqüências deaminoácidos de TCR desta invenção geralmente são fornecidas incluindoum resíduo metionina (Met ou M) N-terminal. Como sabem os versados natécnica este resíduo pode ser removido durante a produção de proteínasrecombinantes. Como será óbvio para os versados na técnica, pode serpossível truncar as seqüências apresentadas no terminal C e/ou no terminalN do mesmo, por 1, 2, 3, 4, 5 ou mais resíduos, sem afetar significativamen-te as características de ligação de pMHC do TCR, todas essas variantestriviais estando abrangidas pela presente invenção.

Conforme usado neste relatório o termo "região variável" abran-ge todos os aminoácidos de um dado TCR que não estão incluídos no do-mínio constante codificado pelo gene TRAC para as cadeias α do TCR e oTRBC1 ou TRBC2 para as cadeias β do TCR. (T cell receptor Factsbook,(2001) LeFranc & LeFranc, Academic Press, ISBN 0-12-441352-8).

Conforme usado neste relatório o termo "domínio variável" a-brange todos os aminoácidos de um dado TCR que estão incluídos na se-qüência de aminoácidos codificada por um gene TRAV para as cadeias α doTCR e um gene TRBV para as cadeias β do TCR. (T cell receptor Factsbo-ok, (2001) LeFranc & LeFranc, Academic Press, ISBN 0-12-441352-8).

As modalidades da invenção incluem TCRs alterados que com-preendem mutação de um ou mais dos aminoácidos da região variável dacadeia-alfa correspondendo a: 28D, 29R, 30G, 31S, 49M, 511, 53S, 54N,72Y, 94V, 95A, 96G, 97K, 98S, e 99T, por exemplo as mutações correspon-dendo a:

28D?F, 28D?Y, 28D?S, 28D?N,29R?Q, 29R7L, 29R?I, 29R7F,30G7H,31S7A,49Μ?Ι,

51Ι?Τ,

53S7R,

54Ν?Ε,

72Υ7Η,

94V7D, 94V7P, 94V7S, 94V7L, 94V7N, 95A7G,95A7S, 95Α7Ε,

96G7N, 96G7P, 96G7V, 96G7M, 96G7L, 96G7R,97K7R, 97Κ7Υ, 97K7V, 97K7L, 97Κ7Η, 97K7G, 97Κ7Ι, 97Κ7Ρ,98S7L, 98S7M, 98S7R,99T7L ou 99T7R

A numeração usada acima é a mesma que aquela mostrada nafigura 1a e na SEQ ID N2 1

As modalidades da invenção incluem TCRs alterados que com-preendem mutação de um ou mais dos aminoácidos da região variável dacadeia-beta correspondendo a: 45L, 51S, 52V, 53G, 54I, 76I, 100G, 101T,102G, 103E, 104L e 105F, usando a numeração mostrada na SEQ ID N2 2é/são alterados, por exemplo as mutações correspondendo a:45L7P,

51S7Y, 51S7F, 51S7W,

52V7G,

53G7P,

54I7F, 547Y,

76I7V,

100G7N,

101T7M, 101T7L, 101T7V,102G7S, 102G7N, 102G7T,103E7G,104L7W,

105F7S, 105F7A, 105F7Q, 105F7D or 105F7E

A numeração usada acima é a mesma que aquela mostrada nafigura Ibena SEQ ID N2 2Outras modalidades preferidas da invenção são apresentadaspor TCRs compreendendo uma das seqüências alteradas de aminoácidosda região variável da cadeia-alfa mostradas na figura 6 (SEQ ID NoS: 11 a24) ou na figura 20 (SEQ ID NoS: 47 a 53). Variantes fenotipicamente silen-ciosas de tais TCRs também fazem parte desta invenção.

Outras modalidades preferidas da invenção são apresentadaspor TCRs compreendendo uma das seqüências alteradas de aminoácidosda região variável da cadeia-beta mostradas na figura 21 (SEQ ID NoS: 54 a67). Variantes fenotipicamente silenciosas de tais TCRs também fazem par-te desta invenção.

TCRs nativos existem nas formas heterodiméricas αβ ou γδ. Noentanto, já foi demonstrado que TCRs recombinantes consistindo nos ho-modímeros αα ou ββ se ligam às moléculas MHC de peptídios. Assim sen-do, uma modalidade da invenção e constituída por homodímeros αα de TCRou homodímeros ββ de TCR.

Outras modalidades preferidas são apresentadas por TCRs dainvenção compreendendo a seqüência de aminoácidos da região variável dacadeia-alfa e as combinações de seqüências de aminoácidos da região va-riável da cadeia-beta listadas abaixo, sendo que variantes fenotipicamentesilenciosas de tais TCRs também fazem parte desta invenção:

<table>table see original document page 7</column></row><table><table>table see original document page 8</column></row><table>

Modalidades preferidas fornecem TCRs da invenção compreen-dendo:a região variável da cadeia-alfa mostrada na SEQ ID N2 11 e aregião variável da cadeia-beta mostrada na SEQ ID Ns 2,

a região variável da cadeia-alfa mostrada na SEQ ID Ns 47 e aregião variável da cadeia-beta mostrada na SEQ ID N2 2.

a região variável da cadeia-alfa mostrada na SEQ ID N2 48 e aregião variável da cadeia-beta mostrada na SEQ ID N2 2.

a região variável da cadeia-alfa mostrada na SEQ ID N2 53 e aregião variável da cadeia-beta mostrada na SEQ ID N2 2.

a região variável da cadeia-alfa mostrada na SEQ ID N2 11 e aregião variável da cadeia-beta mostrada na SEQ ID N2 54.

a região variável da cadeia-alfa mostrada na SEQ ID N2 11 e aregião variável da cadeia-beta mostrada na SEQ ID N2 55.

a região variável da cadeia-alfa mostrada na SEQ ID N2 11 e aregião variável da cadeia-beta mostrada na SEQ ID N2 56.

a região variável da cadeia-alfa mostrada na SEQ ID N2 11 e aregião variável da cadeia-beta mostrada na SEQ ID N2 57.

a região variável da cadeia-alfa mostrada na SEQ ID N2 11 e aregião variável da cadeia-beta mostrada na SEQ ID N2 58.

a região variável da cadeia-alfa mostrada na SEQ ID N2 11 e aregião variável da cadeia-beta mostrada na SEQ ID N2 62.

a região variável da cadeia-alfa mostrada na SEQ ID N2 11 e aregião variável da cadeia-beta mostrada na SEQ ID N2 65.

a região variável da cadeia-alfa mostrada na SEQ ID N2 11 e aregião variável da cadeia-beta mostrada na SEQ ID N2 66.

Ou variantes fenotipicamente silenciosas de qualquer um dosTCRs acima.

Em uma outra modalidade preferida os TCRs da invenção com-preendendo as combinações de regiões variáveis detalhadas acima com-preendem ainda a seqüência de aminoácidos da região constante da ca-deia-alfa mostrada na figura 7a (SEQ ID N2 25) e uma das seqüências daregião constante de aminoácidos da cadeia-beta mostradas nas figuras 7b e 7c(SEQ ID NoS: 26 e 27) ou variantes fenotipicamente silenciosas dos mesmos.Conforme usado neste relatório o termo "variantes fenotipicamentesilenciosas" refere-se aos TCRs que têm um Kd para o referido complexoAAGIGILTV-HLA-A*0201 menor ou igual a 3 μΜ. Por exemplo, como sabemos versados na técnica, pode ser possível produzir TCRs que incorporamalterações mínimas em suas regiões constantes e/ou variáveis em relaçãoàqueles descritos em detalhes acima sem alterar a afinidade e/ou a taxa deseparação para a interação com o complexo AAGIGILTV-HLA-A*0201. Taisvariantes triviais estão incluídas no escopo desta invenção. Os TCRs nosquais foram feitas uma ou mais substituições conservadoras também fazemparte desta invenção.

Em um amplo aspecto, os TCRs da invenção estão na forma deTCRs de cadeia simples (scTCRs) ou de TCRs diméricos (dTCRs) comodescrito nos documentos WO 04/033685 e WO 03/020763.

Uma forma adequada de scTCR compreende um primeiro seg-mento constituído por uma seqüência de aminoácidos correspondendo auma região variável da cadeia α do TCR1 um segundo segmento constituídopor uma seqüência de aminoácidos correspondendo a uma região variávelda cadeia do TCR fundida ao terminal N de uma seqüência de aminoácidoscorrespondendo a uma seqüência extracelular do domínio constante da ca-deia β do TCR, e uma seqüência Iigadora ligando o terminal C do primeirosegmento ao terminal N do segundo segmento.

Alternativamente o primeiro segmento pode ser constituído poruma seqüência de aminoácidos correspondendo a uma região variável dacadeia β do TCR; o segundo segmento pode ser constituído por uma se-qüência de aminoácidos correspondendo a uma seqüência da região variá-vel da cadeia α do TCR fundida ao terminal N de uma seqüência de amino-ácidos correspondendo a uma seqüência extracelular do domínio constanteda cadeia α do TCR.

Os scTCRs acima pode ainda compreender uma ligação dissul-feto entre as primeira e segunda cadeias, a referida ligação dissulfeto sendouma ligação que não possui equivalente nos receptores de células-T αβ na-tivos, e onde o comprimento da seqüência Iigadora e a posição da ligaçãodissulfeto são tais que as seqüências do domínio variável dos primeiro esegundo segmentos são mutuamente orientados substancialmente damesma maneira que nos receptores de células-T αβ nativos.

Mais especificamente o primeiro segmento pode ser constituídopor uma seqüência de aminoácidos correspondendo a uma seqüência daregião variável da cadeia α do TCR fundida ao terminal N de uma seqüênciade aminoácidos correspondendo a uma seqüência extracelular do domínioconstante da cadeia α do TCR1 o segundo segmento pode ser constituídopor uma seqüência de aminoácidos correspondendo a uma região variávelda cadeia β do TCR fundida ao terminal N de uma seqüência de aminoáci-dos correspondendo à seqüência extracelular do domínio constante da ca-deia β do TCR1 e uma ligação dissulfeto pode ser fornecida entre as primeirae segunda cadeias, a referida ligação dissulfeto sendo uma ligação que nãopossui equivalente nos receptores de células-T αβ nativos.

Nas formas de scTCR acima, a seqüência Iigadora pode ligar oterminal C do primeiro segmento ao terminal N do segundo segmento, e po-de ter a fórmula -PGGG-(SGGGG)n-P- onde η é 5 ou'6 e Pé prolina, G églicina e S é serina.

-PGGG-SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG-P (SEQ ID N2 41)-PGGG-SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG-P (SEQ ID N2 42)

Uma forma dTCR adequada dos TCRs da presente invençãocompreende

um primeiro polipeptídio onde uma seqüência correspondendo auma seqüência da região variável da cadeia α do TCR é fundida ao terminalN de uma seqüência correspondendo a uma seqüência extracelular do do-mínio constante da cadeia α do TCR, e um segundo polipeptídio onde umaseqüência correspondendo a uma seqüência da região variável da cadeia βdo TCR fundida ao terminal N de uma seqüência correspondendo a umaseqüência extracelular do domínio constante da cadeia β do TCR, o primeiroe o segundo polipeptídios sendo ligados por uma ligação dissulfeto que nãopossui equivalente nos receptores de células-T αβ nativos.

O primeiro polipeptídio pode compreender uma seqüência daregião variável da cadeia α do TCR é fundida ao terminal N de uma seqüên-cia correspondendo a uma seqüência extracelular do domínio constante dacadeia a do TCR1 e um segundo polipeptídio onde uma seqüência corres-pondendo a uma seqüência da região variável da cadeia β do TCR é fundidaao terminal N de uma seqüência correspondendo a uma seqüência extrace-lular do domínio constante da cadeia β do TCR1 o primeiro e o segundo poli-peptídios sendo ligados por uma ligação dissulfeto entre os resíduos cisteínaque substituem Thr 48 do exon 1 de TRAC*01 e Ser 57 do exon 1 deTRBC1*01 ou TRBC2*01 ou o equivalente não humano do mesmo, (a no-menclatura "TRAC" neste relatório é aquela do T cell receptor Factsbook1(2001) LeFranc & LeFranc1 Academic Press, ISBN 0-12-441352-8).

A forma dTCR ou scTCR dos TCRs da invenção pode ter se-qüências de aminoácidos correspondendo a seqüências das regiões cons-tante e variável extracelulares αβ de TCR humano, e uma ligação dissulfetopode ligar resíduos de aminoácido das referidas seqüências do domínioconstante, esta ligação dissulfeto não tendo equivalente nos TCRs nativos.

A ligação dissulfeto está entre os resíduos cisteína correspondendo aos re-síduos de aminoácidos cujos átomos de carbono β têm menos de 0,6 nm dedistância nos TCRs nativos, por exemplo entre os resíduos cisteína quesubstituem o Thr 48 do exon 1 de TRAC*01 e o Ser 57 do exon 1 deTRBCroi ou TRBC2*01 ou o equivalente não humano do mesmo. Outrossítios em que cisteínas podem ser introduzidas para formar a ligação dissul-feto são os seguintes resíduos no exon 1 de TRAC*01 para a cadeia α doTCR e TRBC1*01 ou TRBC2*01 para a cadeia β do TCR:

<table>table see original document page 12</column></row><table>

Modalidades específicas da invenção fornecem um TCR da in-venção que é um dTCR compreendendoum primeiro polipeptídio onde uma seqüência correspondendo auma seqüência da região variável da cadeia α do TCR é fundida ao terminalN de uma seqüência correspondendo a uma seqüência extracelular do do-mínio constante da cadeia α do TCR1 e

um segundo polipeptídio onde uma seqüência correspondendo auma seqüência da região variável da cadeia β do TCR fundida ao terminal Nde uma seqüência correspondendo a uma seqüência extracelular do domí-nio constante da cadeia β do TCR,

o primeiro e o segundo polipeptídios sendo ligados por uma li-gação dissulfeto que não possui equivalente nas células-T αβ nativas entreos resíduos cisteína que substituem o Thr 48 do exon 1 de TRAC*01 e Ser57 do exon 1 de TRBC1*01 ou TRBC2*01 ou o equivalente não humano domesmo.

Além da ligação dissulfeto não nativa mencionada acima, a for-ma dTCR ou scTCR dos TCRs da invenção pode incluir uma ligação dissul-feto entre os resíduos que correspondem àqueles ligados por uma ligaçãodissulfeto nos TCRs nativos.

A forma dTCR ou scTCR dos TCRs da invenção de preferêncianão contém uma seqüência correspondente a seqüências transmembrano-sas ou citoplasmáticas dos TCRs nativos.

Modalidades geralmente preferidas da invenção fornecem TCRssolúveis compreendendo:

a seqüência de aminoácidos da cadeia-alfa de SEQ ID N2 29 e aseqüência de aminoácidos da cadeia-beta de SEQ ID Ns 10.

a seqüência de aminoácidos da cadeia-alfa de SEQ ID Ns 68 e aseqüência de aminoácidos da cadeia-beta de SEQ ID N2 10.

a seqüência de aminoácidos da cadeia-alfa de SEQ ID N2 69 e aseqüência de aminoácidos da cadeia-beta de SEQ ID N2 10.

a seqüência de aminoácidos da cadeia-alfa de SEQ ID N2 70 e aseqüência de aminoácidos da cadeia-beta de SEQ ID N2 10.

a seqüência de aminoácidos da cadeia-alfa de SEQ ID N2 29 e aseqüência de aminoácidos da cadeia-beta de SEQ ID N2 71.a seqüência de aminoácidos da cadeia-alfa de SEQ ID N2 29 e aseqüência de aminoácidos da cadeia-beta de SEQ ID N- 72.

a seqüência de aminoácidos da cadeia-alfa de SEQ ID N2 29 e aseqüência de aminoácidos da cadeia-beta de SEQ ID N2 73.

a seqüência de aminoácidos da cadeia-alfa de SEQ ID N2 29 e aseqüência de aminoácidos da cadeia-beta de SEQ ID N2 74.

a seqüência de aminoácidos da cadeia-alfa de SEQ ID N2 29 e aseqüência de aminoácidos da cadeia-beta de SEQ ID N2 75.

a seqüência de aminoácidos da cadeia-alfa de SEQ ID N2 29 e aseqüência de aminoácidos da cadeia-beta de SEQ ID N2 76.

a seqüência de aminoácidos da cadeia-alfa de SEQ ID N2 29 e aseqüência de aminoácidos da cadeia-beta de SEQ ID N2 77.

a seqüência de aminoácidos da cadeia-alfa de SEQ ID N2 29 e aseqüência de aminoácidos da cadeia-beta de SEQ ID N2 78.

Também é fornecido um ácido nucléico ou ácidos nucléicos co-dificando os TCRs da invenção. Um tal ácido nucléico ou ácidos nucléicospodem ser fornecidos em uma forma que tenha sido adaptada para expressãoem uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica. Células hospedeiras a-dequadas incluem, porém sem limitação, células bacterianas, de levedura,de mamíferos ou de insetos. Por exemplo, a célula hospedeira pode seruma célula T humana ou uma célula-tronco hematopoiética humana.

Um tal ácido nucléico ou ácidos nucléicos adaptados é/são alte-rados para refletir a preferência do códon da célula hospedeira na qual ele éintroduzido. As mutações introduzidas são mutações silenciosas que nãoafetam a seqüência de aminoácidos do polipeptídio ou polipeptídios codifi-cados dessa maneira. GeneArt (Regensburg, Alemanha) oferece um serviçode otimização de ácidos nucléicos adequados (GeneOptimizer®). O docu-mento WO 2004/059556, de propriedade da GeneArt, fornece outros deta-lhes do processo de otimização.

Outras modalidades geralmente preferidas da invenção são ofe-recidas por ácidos nucléicos consistindo nas seqüências de DNA da cadeiaα do TCR de comprimento integral de SEQ ID N°s 33, 35 ou 37 (figuras Í2a,13a, ou 14a, respectivamente) e na seqüência de DNA da cadeia β do TCRde SEQ ID N- 39 (mostrada na figura 15a). Uma complementaridade de áci-do nucléico para qualquer um dos mencionados acima, ou uma seqüênciade RNA correspondente também fazem parte desta invenção. Além disso,como ficará óbvio para os versados na técnica tal ácido nucléico ou ácidosnucléicos codificando os TCRs da invenção também podem compreenderseqüências não-codificadoras (íntron).

As seqüências de DNA da cadeia de TCR MEL do tipo selvagemde comprimento integral e alta afinidade de SEQ ID NoS: 31, 33, 35, 37 e 39codificam as seqüências de aminoácidos de SEQ ID NoS: 32, 34, 36, 38, e40 respectivamente. (Figuras 11b, 12b, 13b, 14b e 15b respectivamente).

As seqüências de aminoácidos de SEQ ID NoS: 33, 35 e 37compreendem as regiões variáveis da cadeia-alfa do TCR MEL de alta afini-dade de SEQ ID NoS: 11, 15 e 23 respectivamente.

Como ficará óbvio para os versados na técnica tais seqüênciasde DNA de cadeia de TCR de comprimento integral codificam as seguintesseqüências:

Uma seqüência-líder e as seqüências extracelular, transmem-branosa, e citoplasmática do TCR.

As seqüências de DNA de comprimento integral fornecidas nes-ta invenção também incluem seqüências de reconhecimento dè enzimas derestrição para facilitar a ligação no vetor de escolha.Monômeros de TCR PEGuiIados

Em uma modalidade particular um TCR da invenção é associa-do a pelo menos uma cadeia polialquileno glicol. Esta associação pode serfeita de várias maneiras conhecidas pelos versados na técnica. Em umamodalidade preferida as cadeias polialquileno são covalentemente ligadasao TCR. Em uma outra modalidade as cadeias polietileno glicol do presenteaspecto da invenção compreendem pelo menos duas unidades repetitivaspolietileno.

Complexos de TCR multivalentes

Um aspecto da invenção fornece um complexo de TCR multiva-lente compreendendo pelo menos dois TCRs da invenção. Em uma modali-dade deste aspecto, pelo menos duas moléculas de TCR são ligadas pormeio de porções Iigadoras para formar complexos multivalentes. De prefe-rência os complexos são solúveis em água, de modo que a porção Iigadoradeve ser selecionada de acordo. Além disso, é preferível que a porção Iiga-dora seja capaz de se prender a posições definidas nas moléculas de TCR,para que seja minimizada a diversidade estrutural dos complexos formados.Uma modalidade do presente aspecto é fornecida por um complexo de TCRda invenção onde a cadeia polimérica ou seqüência Iigadora peptídica seestende entre resíduos de aminoácido de cada TCR que não estão localiza-dos em uma seqüência da região variável do TCR.

Como os complexos da invenção podem ser usados em medici-na, as porções Iigadoras devem ser escolhidos tendo em vista sua adequa-bilidade farmacêutica, por exemplo sua imunogenicidade.

Exemplos de porções Iigadoras que preenchem os critérios de-sejáveis acima são conhecidos na literatura, por exemplo na literatura defragmentos de anticorpos fixadores.

Existem duas classes de Iigador que são preferidas para uso naprodução de moléculas de TCR multivalentes da presente invenção. Umcomplexo de TCR da invenção no qual os TCRs são ligados por uma cadeiapolialquileno glicol constitui uma modalidade "do presente aspecto.

A primeira é polímeros hidrofílicos tais como polialquileno glicóis.Os mais comumente usados desta classe são à base de polietileno glicol ouPEG, cuja estrutura está mostrada abaixo.

HOCH2CH2O (CH2CH2O)n-CH2CH2OH

onde η é maior que dois. No entanto, outros são à base de outros polialqui-leno glicóis opcionalmente substituídos adequados incluem polipropilenoglicol, e copolímeros de etileno glicol e propileno glicol.

Tais polímeros podem ser usados para tratar ou conjugar agen-tes terapêuticos, particularmente agentes terapêuticos à base de polipeptí-dios ou proteínas, para conseguir alterações benéficas para o perfil farma-cocinético do agente terapêutico, por exemplo depuração renal reduzida,meia-vida aumentada no plasma, imunogenicidade reduzida, e solubilidadeaumentada. Acredita-se que tais aperfeiçoamentos no perfil farmacocinéticodo conjugado PEG-agente terapêutico resultem da molécula ou moléculasde PEG formando um 'envoltório' em torno do agente terapêutico que blo-queia estericamente a reação com o sistema imunológico e reduz a degra-dação proteolítica. (Casey et al., (2000) Tumor Targetting 4 235-244). O ta-manho do polímero hidrofílico usando pode ser em particular selecionadocom base no uso terapêutico desejado do complexo de TCR. Assim sendo,por exemplo, onde o produto destina-se a deixar a circular e penetrar no te-cido, por exemplo para uso no tratamento de um tumor, pode ser vantajosousar polímeros de baixo peso molecular da ordem de 5 kDa. Existem nume-rosos artigos de revisão e livros que descrevem detalhadamente o uso dePEG e moléculas similares em formulações farmacêuticas. Por exemplo,vide Harris (1992) Polyethylene Glycol Chemistry - Biotechnical and Biome-dical Applications, Plenum1 New York, NY. ou Harris & Zalipsky (1997) Che-mistry and Biological Applications of Polyethylene Glycol ACS Books, Wa-shington, D.C.

O polímero usado pode ter uma conformação linear ou ramifica-da. Moléculas de PEG ramificado, ou derivados das mesmas, podem serinduzidas pela adição de porções ramificadoras que incluem glicerol e oli-gômeros de glicerol, pentaéritritol, sorbitol e lisina.

Geralmente, o polímero vai ter um grupo ou grupos quimicamen-te reativos em sua estrutura, por exemplo em um ou ambos os terminais,e/ou em ramificações do esqueleto, para permitir que o polímero se ligue asítios alvo no TCR. Este grupo ou grupos quimicamente reativos podem serligados diretamente ao polímero hidrofílico, ou podem ter um grupo/porçãoespaçadora entre o polímero hidrofílico e a química reativa como mostradoabaixo:

Química reativa-Polímero hidrofílico-Química reativa

Química reativa-Espaçador-Polímero hidrofílico-Spacer-Químicareativa

O espaçador usado na formação de construções do tipo descritoacima pode ser qualquer porção orgânica que seja uma cadeia não reativaquimicamente estável. Tais espaçadores incluem, porém sem limitação, osseguintes:

-(CH2)n- onde η = 2 a 5

-(CH2)3NHCO(CH2)2

Um complexo de TCR da invenção no qual um radical espaça-dor alquileno divalente está localizado entre a cadeia polialquileno glicol eseu ponto de ligação a um TCR do complexo constitui uma outra modalida-de do presente aspecto.

Um complexo de TCR da invenção no qual a cadeia polialqüile-no glicol compreende pelo menos duas unidades repetitivas polietileno glicolconstitui uma outra modalidade do presente aspecto.

Existem numerosos fornecedores comerciais de polímeros hi-drofílicos ligados, diretamente ou via um espaçador, a químicas reativas quepodem ser úteis na presente invenção. Esses fornecedores incluem NektarTherapeutics (CA, EUA), NOF Corporation (Japão), Sunbio (Coréia do Sul) eEnzon Pharmaceuticals (NJ, EUA).

Polímeros hidrofílicos comercialmente disponíveis ligados, dire-tamente ou via um espaçador, a químicas reativas que podem ser úteis napresente invenção incluem, porém sem limitação, os seguintes:

<table>table see original document page 18</column></row><table><table>table see original document page 19</column></row><table>

Uma grande variedade de químicas de acoplamento pode serusada para acoplar moléculas de polímeros a agentes terapêuticos à basede proteínas e peptídios. A escolha da química de acoplamento mais apro-priada depende bastante do sítio de acoplamento desejado. Por exemplo, asquímicas de acoplamento a seguir foram usadas associadas a um ou maisdos terminais de moléculas de PEG (Fonte: Nektar Molecular EngineeringCatalogue 2003):

N-maleimidaVinil sulfona

Carbonato de benzotriazola

Propionato de succinimidila

Butanoato de succinimidil

Tio-éster

Acetalde idos

Acrilatos

Biotina

Aminas primárias

Como mencionado acima polímeros não à base de PEF tambémoferecem Iigadores adequados para a multimerização dos TCRs da presen-te invenção. Por exemplo, podem ser usadas porções contendo terminaismaleimida ligados por cadeias alifáticas tais como BMH e BMOE (Pierce,produtos Nos 22330 e 22323).

Ligadores peptídicos constituem a outra classe de Iigadores deTCR. Estes Iigadores são compreendidos de cadeias de aminoácidos, efuncionam para produzir Iigadores simples ou domínios de multimerizaçãoaos quais moléculas de TCR podem ser presas. O sistema biotina / estrep-tavidina foi anteriormente usado para produzir tetrâmeros de TCR (vide odocumento WO/99/60119) para estudos de ligação in vitro. No entanto, aestreptavidina é um polipeptídio derivado de micróbios e como tal não é exa-tamente adequado para uso em um agente terapêutico.

Um complexo de TCR da invenção no qual os TCRs são ligadospor um Iigador peptídico derivado de um domínio de multimerização humanoconstitui uma outra modalidade do presente aspecto.

Existem numerosas proteínas humanas que contêm um domíniode multimerização que poderia ser usado na produção de complexos multi-valentes de TCR. Por exemplo o domínio de tetramerização de p53 que foiutilizado para produzir tetrâmeros de fragmentos do anticorpo scFv que a-presentaram maior persistência no soro e taxa de separação significativa-mente reduzida em relação ao fragmento monoméricõ de scFv. (Willuda etai (2001) J. Biol. Chem. 276 (17): 14385-14392). A hemoglobina tambémtem um domínio de tetramerização que poderia ser potencialmente usadopara este tipo de aplicação.

Um complexo multivalente de TCR da invenção compreendendopelo menos dois TCRs constitui uma modalidade final deste aspecto, ondepelo menos um dos referidos TCRs é associado a um agente terapêutico.

Em um aspecto um TCR (ou complexo multivalente do mesmo)da presente invenção pode alternativamente ou adicionalmente compreen-der uma cisteína reativa no terminal C ou no terminal N de suas cadeias alfaou beta.Uso diagnóstico e terapêutico

Em um aspecto o TCR da invenção pode ser associado a umagente terapêutico ou a uma porção detectável. Por exemplo, o referido a-gente terapêutico ou porção detectável pode ser covalentemente ligado ao TCR.

Em uma modalidade da invenção o referido agente terapêuticoou porção detectável é covalentemente ligado ao terminal C de uma ou deambas as cadeias do TCR.

Em um aspecto o scTCR ou uma ou ambas as cadeias dTCRdos TCRs da presente invenção podem ser marcados com uma porção de-tectável, por exemplo um marcador que seja adequado para fins de diagnós-tico. Tais TCRs marcados são úteis em um método para detectar um com-plexo AAGIGILTV-HLA-A*0201, método este que compreende contatar oligando de TCR com um TCR (ou uma complexo multimérico de TCR de altaafinidade) que é específico para o ligando de TCR; e para detectar a ligaçãoao ligando de TCR. Em complexos tetraméricos de TCR formados por e-xemplo, usando heterodímeros biotinilados, pode-se usar estreptavidina flu-orescente para proporcionar um marcador detectável. Tal tetrâmero de TCRmarcado com fluorescência é adequado para uso em análise por FACS, porexemplo para detectar células apresentando antígeno contendo o complexoAAGIGILTV-HLA-A*0201 para o qual estes TCRs de alta afinidade são es-pecíficos.

Uma outra maneira pela qual é possível detectar os TCRs solú-veis da presente invenção é pelo uso de anticorpos específicos para TCR,em particular anticorpos monoclonais. Existem muitos anticorpos anti-TCRcomercialmente disponíveis, tais como aFI e PFI, que reconhecem os domí-nios constantes das cadeias α e β, respectivamente.

Em um outro aspecto um TCR (ou complexo multivalente domesmo) da presente invenção pode alternativamente ou adicionalmente serassociado (por exemplo covalentemente ligado ou de outra forma ligado) aum agente terapêutico que pode ser, por exemplo, uma porção tóxica parauso no extermínio de células, ou uma molécula efetora imune tal como umainterleucina ou uma citocina. Um complexo multivalente de TCR da invençãopode ter capacidade de ligação aumentada para um ligando de TCR em re-lação a um receptor de células-T do tipo selvagem não-multimérico ou umheterodímero do receptor de células-T da invenção. Por conseguinte, oscomplexos multivalentes de TCR de acordo com a invenção são particular-mente úteis para rastrear ou atacar células que apresentam antígenos parti-culares in vitro ou in vivo, e também são úteis como intermediários para aprodução de outros complexos multivalentes de TCR tendo tais empregos.

Estes TCRs ou complexos multivalentes de TCR podem ser portanto serfornecidos em uma formulação farmaceuticamente aceitável para uso in vivo.

A invenção também fornece um método para distribuir um agen-te terapêutico para uma célula-alvo, método este que compreende contatarcélulas-alvo potenciais com um TCR ou um complexo multivalente de TCRde acordo com a invenção em condições que permitam prender o TCR oucomplexo multivalente de TCR à célula-alvo, o referido TCR ou complexomultivalente de TCR sendo específico para o complexo AAGIGILTV-HLA-A*0201 e tendo um agente terapêutico associado ao mesmo.

Em particular, o TCR solúvel ou complexo multivalente de TCRda presente invenção pode ser usado para distribuir agentes terapêuticospara o local de células apresentando um antígeno particular. Isto é útil emmuitas situações e, em particular, contra tumores. É possível distribuir umagente terapêutico que exerça seu efeito no local mas não apenas na célulaà qual ele se liga. Portanto, uma estratégia particular considera moléculasantitumorais ligadas a TCRs ou a complexos multivalentes de TCR de acor-do com a invenção específicas para antígenos contra tumores.

Muitos agentes terapêuticos podem ser empregados com estafinalidade, por exemplo compostos radioativos, enzimas (perforina por e-xemplo) ou agentes quimioterápicos (cisplastina por exemplo). Para garantirque efeitos tóxicos sejam exercidos no local desejado a toxina pode estar nointerior de um Iipossoma ligado à estreptavidina para que o composto sejaliberado lentamente. Isto vai impedir efeitos nocivos durante o transporte nocorpo e garantir que a toxina tenha efeito máximo depois da ligação do TCRàs células apresentando o antígeno relevante.

Outros agentes terapêuticos adequados incluem:

■ agentes citotóxicos de moléculas pequenas, isto é, compostoscom capacidade de eliminar células mamíferas com peso molecular menorque 700 dáltons. Tais compostos também podem conter metais tóxicos ca-pazes de ter efeito citotóxico. Além disso, deve ficar entendido que estesagentes citotóxicos de moléculas pequenas também incluem pró-fármacos,isto é, compostos que se decompõem ou são convertidos em condições fisi-ológicas para liberar agentes citotóxicos. Exemplos desses agentes incluemcisplatina, derivados de maitansina, rachelmycin, caliqueamicina, docetaxel,etoposida, gencitabina, ifosfamida, irinotecano, melfalano, mitoxantrona,"sorfimer sodiumphotofrin II", temozolmida, topotecano, glicuronato de trime-treato, auristatina E vincristina e doxorrubicina;

■ citotoxinas peptídicas, isto é, proteínas ou fragmentos dasmesmas com capacidade para eliminar células mamíferas. Incluindo, porémsem limitação, ricina, toxina diftérica, exotoxina A da bactéria pseudomonas,DNAase e RNAase;

■ radionuclídeos, isto é, isótopos instáveis de elementos que sedecompõem com a emissão simultânea de uma ou mais das partículas α ouβ, ou raios γ, incluindo, porém sem limitação, iodo 131, rênio 186, índio 111,ítrio 90, bismuto 210 e 213, actínio 225 e astatina 213; agentes quelantespodem ser usados para facilitar a associação destes radionuclídeos aosTCRs de alta afinidade, ou multímeros dos mesmos;

• pró-fármacos, incluindo, porém sem limitação, pró-fármacosenzimáticos direcionados para anticorpos;

• imunoestimulantes, isto é, porções que estimulam uma respos-ta imunológica. Incluindo, porém sem limitação, citocinas tais como IL-2 eIFN, superantígenos e mutantes dos mesmos, complexos de pHLA e quimi-ocinas tais como IL-8, fator plaquetário 4, proteína estimuladora do cresci-mento de melanoma etc., anticorpos ou fragmentos da mesma, ativadoresde complemento, domínios de proteínas xenogênicas, domínios de proteí-nas alogênicas, domínios de proteínas virais/bacterianas, peptídios vi-rais/bacterianos e anticorpos determinantes anti-células-T (por exemplo anti-CD3 ou anti-CD28).

Fragmentos e variantes de anticorpos funcionais

Fragmentos e variantes/análogos de anticorpos que são ade-quados para uso nas composições e métodos descritos neste relatório in-cluem, porém sem limitação, os seguintes.

Fragmentos de anticorpos

Como sabem os versados na técnica, é possível produzir frag-mentos de um dado anticorpo que retêm substancialmente as mesmas ca-racterísticas de ligação que aquelas do anticorpo primitivo. A descrição aseguir oferece detalhes de tais fragmentos:

Minicorpos - Estas construções consistem em anticorpos comuma porção Fc truncada. Como tais eles retêm os domínios de ligação com-pletos do anticorpo do qual derivam.

Fragmentos Fab - Estes compreendem uma única cadeia levede imunoglobulina covalentemente ligada à parte de uma cadeia pesada deimunoglobulina. Como tais, os fragmentos Fab compreendem um único sítiode combinação de antígeno. Os fragmentos Fab são definidos pela porçãode uma IgG que pode ser liberada por tratamento com papaína. Estes frag-mentos normalmente são produzidos por técnicas de DNA recombinante.(Reeves et ai., (2000) Lecture Notes on Immunology (4th Edition) Publicadopor Blackwell Science).

Fragmentos F(ab')p - Estes compreendem os dois sítios decombinação de antígeno e a região da dobradiça de um único anticorpo. Osfragmentos F(ab')2 são definidos pela porção de uma IgG que pode ser libe-rada por tratamento com pepsina. epsin. Estes fragmentos normalmente sãoproduzidos por técnicas de DNA recombinante. (Reeves et ai, (2000) Lectu-re Notes on Immunology (4th Edition) Publicado por Blackwell Science).

Fragmentos Fv - Estes compreendem um domínio pesado vari-ável de imunoglobulina ligado a um domínio leve variável de imunoglobulina.Já foram produzidos diversos modelos de Fv. Estes incluem dsFvs, nosquais a associação entre os dois domínios é intensificada por uma ligaçãodissulfeto introduzida. Alternativamente, é possível formar scFvs usando umIigador peptídico para ligar os dois domínios como um único polipeptídio.Construções de Fvs contendo um domínio variável de uma cadeia pesadaou leve de imunoglobulina associada ao domínio variável e constante dacadeia pesada ou leve de imunoglobulina correspondente também já foramproduzidas. Fvs também já foram multimerizados para formar diacorpos etriacorpos (Maynard et al., (2000) Annu Rev Biomed Eng 2 339-376)

Nanobodies™ - Estas construções, comercializadas por Ablynx(Bélgica), compreendem um único domínio pesado variável de imunoglobu-lina sintética derivado de um anticorpo de um camelídeo (por exemplo ca-melo ou lhama).

Anticorpos de domínio - Estas construções, comercializadas porDomantis (Bélgica), compreendem um único domínio pesado variável deimunoglobulina maturada por afinidade ou um domínio leve variável de imu-noglobulina.

Variantes e análogos de anticorpos

A característica funcional de definição de anticorpos no contextoda presente invenção é sua capacidade de se ligar especificamente a umligando alvo. Como sabem os versados na técnica é possível construir essascaracterísticas de ligação em uma gama de ootras proteínas. Exemplos devariantes e análogos de anticorpos adequados para uso nas composições emétodos da presente invenção incluem, porém sem limitação, os seguintes.

Polipeptídios fixadores à base de cadafalso de proteína ("proteinscaffold-based binding polypeptides") - Esta família de construções fixado-ras compreende análogos alterados de proteínas que contêm alças fixado-ras nativas. Exemplos incluem Affibodies, comercializados por Affibody (Su-écia), que se baseiam em um motivo de três hélices derivado de um dosdomínios fixadores de IgG da proteína A de Staphylococcus aureus. Um ou-tro exemplo inclui Evibodies, comercializados por EvoGenix (Austrália) quese baseiam nos domínios extracelulares de CTLA-4 nos quais são enxerta-dos domínios semelhantes a alças fixadoras de anticorpos. Um exemplofinal, Cytokine Traps comercializados por Regeneron Pharmaceuticals (US),enxertam domínios receptores de citocinas em cadafalsos de anticorpos("antibody scaffolds"). (Nygren et ai, (2000) Current Opinion in Structuralbiology 7:463-469) oferece uma revisão dos usos de cadafalsos para cons-truir novos sítios de ligação em proteínas. Esta revisão menciona as seguin-tes proteínas como fontes de cadafalsos: dedo de zinco CP1, Tendamistat,domínio Z (um análogo da proteína A), PST1, espirais enroladas ("Coiledcoils"), LACI-D1 e citocroma b562· Outros estudos de cadafalsos de proteínasrelataram o uso de fibronectina, proteína fluorescente verde (GFP) e repeti-ções de anquirina.

Como sabem os versados na técnica é possível produzir anti-corpos ou fragmentos, variantes ou análogos dos mesmos que se ligam avárias partes do ligando de uma dada proteína. Por exemplo, anticorpos an-ti-CD3 podem produzidos para qualquer das cadeias polipeptídicas dasquais este complexo é formado (isto é, cadeias γ, δ, ε, ζ, e η de CD3). Osanticorpos que se ligam à cadeia ε de CD3 são os anticorpos anti-CD3 pre-feridos para uso nas composições e métodos da presente invenção.

Os TCRs solúveis ou complexos multivalentes de TCR da pre-sente invenção podem ser ligados a uma enzima capaz de converter umpró-fármaco em um fármaco. Isto permite que o pró-fármaco seja convertidano fármaco somente no local em que ele é necessário (isto é, vetorizadapelos sTCR).

Acredita-se que os TCRs específicos para AAGIGILTV (SEQ IDN2 43)-HLA-A*0201 de alta afinidade apresentados nesta invenção possamser usados em métodos para diagnóstico e tratamento de câncer.

Para tratamento de câncer, a localização na vizinhança de tumo-res ou metástase aumentaria o efeito das toxinas ou imunoestimulantes.Para distribuição de vacina, o antígeno da vacina poderia ser localizado navizinhança de células apresentando antígeno, dessa forma aumentando aeficácia do antígeno. O método pode ser aplicado com a finalidade de fazerimagens.

Uma modalidade é constituída por uma célula isolada apresen-tando um TCR da invenção. Por exemplo, a referida célula pode ser umacélula T humana ou uma célula-tronco hematopoiética humana.

Outras modalidades da invenção são constituídas por uma com-posição farmacêutica compreendendo:

um TCR ou um complexo multivalente de TCR da invenção (op-cionalmente associado a um agente terapêutico), ou uma pluralidade de cé-lulas apresentando pelo menos um TCR da invenção, ou um ácido nucléicoou ácidos nucléicos codificando um TCR da invenção junto com um veículofarmaceuticamente aceitável.

A invenção também fornece um método de tratamento de cân-cer compreendendo administrar a um indivíduo sofrendo de tal doença can-cerosa uma quantidade eficaz de um TCR ou de um complexo multivalentede TCR da invenção (opcionalmente associado a um agente terapêutico), oude uma pluralidade de células apresentando pelo menos um TCR da inven-ção, ou de um ácido nucléico ou ácidos nucléicos codificando um TCR dainvenção. Em uma modalidade relacionada a invenção fornece o uso de umTCR ou de um complexo multivalente de TCR da invenção (opcionalmenteassociado a um agente terapêutico), ou de uma pluralidade de células apre-sentando pelo menos um TCR da invenção na preparação de uma composi-ção para o tratamento de câncer.

Como ficará óbvio para os versados na técnica, os canceres quesão passíveis de tratamento por composições compreendendo os TCRs dainvenção serão cânceres Melano-A+.

TCRs terapêuticos ou para imagem de acordo com a invençãogeralmente serão fornecidos como parte de uma composição farmacêuticaestéril que normalmente vai incluir um veículo farmaceuticamente aceitável.Esta composição farmacêutica pode estar em qualquer forma adequada(dependendo do método desejado para administrá-la ao paciente). Ela podeser fornecida em forma de dosagem unitária, geralmente será fornecida emum recipiente vedado e pode ser fornecida como parte de um kit. Tal kitnormalmente (embora não necessariamente) incluirá instruções de uso. Elepode incluir uma pluralidade das referidas formas de dosagem unitária.A composição farmacêutica pode ser adaptada para administra-ção por qualquer via apropriada, por exemplo, por via parenteral, transdér-mica ou por inalação, de preferência por via parenteral (incluindo subcutâ-nea, intramuscular ou, mais preferivelmente, intravenosa). Estas composi-ções podem ser preparadas por qualquer método conhecido na literatura defarmácia, por exemplo por mistura do composto ativo com o(s) veículo(s) ouexcipiente(s) em condições estéreis.

As dosagens das substâncias da presente invenção podem va-riar entre amplos limites, dependendo da doença ou distúrbio a ser tratado,da doença e da condição do indivíduo a ser tratado etc., e o médico vai es-sencialmente determinar as dosagens apropriadas a serem usadas.

Aspectos adicionais

Um scTCR ou dTCR (que de preferência é constituído por se-qüências constantes e variáveis correspondentes a seqüências humanas)da presente invenção pode ser fornecido na forma substancialmente pura,ou como uma preparação purificada ou isolada. Por exemplo, ele pode serfornecido em uma forma que seja substancialmente livre de outras proteínas.

A invenção também fornece um método para identificar um TCRde alta afinidade com a propriedade de se ligar ao AAGIGILTV-HLA-A*0201caracterizado pelo fato de o TCR (i) compreender pelo menos um domíniovariável da cadeia α do TCR e/ou pelo menos um domínio variável da ca-deia β do TCR e (ii) ter um K0 para o referido complexo AAGIGILTV-HLA-A*0201 menor que 3 μΜ, o referido método compreendendo:

(a) a produção de uma biblioteca variada de TCRs compreen-dendo os domínios variáveis das cadeias α e β do TCR MEL onde um dosdomínios variáveis das cadeias α e β ou ambos compreendem uma muta-ção (mutações);

(b) contatar a referida biblioteca variada de TCRs comAAGIGILTV-HLA-A*0201 em condições adequadas para permitir a ligaçãodos TCRs ao AAGIGILTV-HLA-A*0201; e

(c) medir o K0 da interação.As características preferidas de cada aspecto da invenção sãoas mesmas que as dos outros aspectos mutatis mutandis. Os documentosda técnica anterior mencionados neste relatório estão aqui incorporados namedida do permitido por lei.

Exemplos

A invenção está ainda descrita nos exemplos a seguir, que nãolimitam o escopo da invenção de forma alguma.

Na descrição a seguir faz-se referência aos desenhos anexosnos quais:

As figuras 1a e 1b mostram as seqüências de aminoácidos da regi-ão variável da cadeia-alfa e da região variável da cadeia-beta do TCR MELnativo respectivamente.

As figuras 2a e 2b mostram respectivamente a seqüência deDNA das versões solúveis das cadeias α e β do TCR MEL nativo.

As figuras 3a e 3b mostram respectivamente as seqüências deaminoácidos extracelulares das cadeias α e β do MEL TCR produzidas apartir das seqüências de DNA das figuras 2a e 2b.

As figuras 4a e 4b mostram respectivamente a seqüência deDNA das versões solúveis das cadeias α e β do TCR MEL alteradas paraincluir resíduos cisteína adicionais para formar uma ligação dissulfeto nãonativa. O códon alterado em cada cadeia está indicado pof sombreamento eos sítios de reconhecimento de enzima de restrição estão sublinhados.

As figuras 5a e 5b mostram respectivamente as seqüências deaminoácidos extracelulares das cadeias α e β do MEL TCR produzidas apartir das seqüências de DNA das figuras 4a e 4b. A cisteína introduzida emcada seqüência está indicada por sombreamento.

A figura 6 mostra as seqüências de aminoácidos da região variávelda cadeia-alfa de variantes de TECT MEL de alta afinidade. Os resíduosalterados estão sublinhados.

A figura 7a mostra a seqüência de aminoácidos de uma formatruncada do TRAC.

A figura 7b mostra a seqüência de aminoácidos de uma formatruncada do TRBC1.

A figura 7c mostra a seqüência de aminoácidos de uma formatruncada do TRBC2.

A figura 8a mostra o mapa de plasmídico do plasmídio pEX202.

A figura 8b mostra a seqüência de DNA do plasmídio pEX202.

A figura 9a mostra em detalhes as seqüências de aminoácidos dacadeia-alfa de uma variante de TCR MEL de alta afinidade, solúvel, preferida.

A figura 9b mostra em detalhes as seqüências de aminoácidosda cadeia-beta do TCR MEL solúvel do tipo selvagem usando a região cons-tante codificada TRBC2 fundida por meio de um Iigador peptídico à IL-2 hu-mana do tipo selvagem. As seqüências do Iigador e da IL-2 estão em itálico.

A figura 10 mostra a curva de resposta Biacore gerada para ainteração de um TCR MEL ligado a dissulfeto, solúvel, do tipo selvagem, eH LA-A AGIGILTV-H LA-A*0201

As figuras 11a e 11b mostram a seqüência de DNA da cadeia-alfa do TCR MEL do tipo selvagem e comprimento integral alterada paraproduzir expressão aumentada em células humanas e a seqüência de ami-noácidos assim codificada respectivamente.

As figuras 12a e 12b mostram a seqüência de DNA da cadeia-alfa do TCR MEL c1 do tipo selvagerrre comprimento integral alterada paraproduzir expressão aumentada em células humanas e a seqüência de ami-noácidos assim codificada respectivamente.

As figuras 13a e 13b mostram a seqüência de DNA da cadeia-alfa do TCR MEL c1d do tipo selvagem e comprimento integral alterada paraproduzir expressão aumentada em células humanas e a seqüência de ami-noácidos assim codificada respectivamente.

As figuras 14a e 14b mostram a seqüência de DNA da cadeia-alfa do TCR MEL c9 do tipo selvagem e comprimento integral alterada paraproduzir expressão aumentada em células humanas e a seqüência de ami-noácidos assim codificada respectivamente.

As figuras 15a e 15b mostram a seqüência da cadeia-alfa doTCR MEL c9 de comprimento integral alterada para produzir expressão au-mentada em células humanas e a seqüência de aminoácidos assim codifi-cada respectivamente.

A figura 16 mostra um ensaio ELISPOT demonstrando a capa-cidade de uma versão solúvel ligada por dissulfeto do TCR Mel c1 WT dealta afinidade para inibir a ativação de um clone de CTL específico para Mel.

As figuras 17a e 17b mostram as seqüências de DNA codifica-doras da ORF da cadeia-alfa do TCR MEL do tipo selvagem e comprimentointegral e as seqüências de DNA codificadoras da ORF da cadeia-beta doTCR MEL do tipo selvagem respectivamente.

A figura 18 mostra a seqüência de DNA codificadora da ORF dacadeia alta do trc MEL c1 de comprimento integral compreendendo códonsde DNA do tipo selvagem exceto para aquelas codificando os aminoácidosalterados.

A figura 19a mostra dados de FACS no nível da expressão deTCR obtida por transfecção de células Jurkat com DNA não otimizado comcódon codificando um TCR MEL c1 alfa / WT beta.

A figura 19b mostra dados de FACS no nível da expressão deTCR obtida por transfecção de células Jurkat com DNA otimizado com có-don codificando um TCR MEL c1 alfa / WT beta.

A figura 20 mostra as seqüências de aminoácidos das regiõesvariáveis de cadeias alfa adicionais do TCR MEL de alta afinidade. Os resí-duos alterados estão sublinhados.

A figura 21 mostra as seqüências de aminoácidos das regiõesvariáveis de cadeias beta adicionais do TCR MEL de alta afinidade. Os resí-duos alterados estão sublinhados.

A figura 22 mostra as seqüências de aminoácidos de cadeiasalfa solúveis do TCR MEL de alta afinidade compreendendo um resíduo cis-teína não-nativo. O resíduo cisteína não-nativo está iluminado e os resíduosalterados estão sublinhados.

A figura 23 mostra as seqüências de aminoácidos de cadeiasbeta solúveis do TCR MEL de alta afinidade compreendendo um resíduocisteína não-nativo. O resíduo cisteína não-nativo está iluminado e os resí-duos alterados estão sublinhados.

Exemplo 1 - Produção de um TCR solúvel e ligado a dissulfetocompreendendo os domínios variáveis MEL nativos

As figuras 4a e 4b mostram as seqüências de DNA das cadeias-alfa e beta solúveis e ligados por dissulfeto do TCR MEL do tipo selvagemque é específico para o complexo AAGIGILTV-HLA-A*0201. Estas seqüên-cias de DNA podem ser sintetizadas de novo por várias empresas de pes-quisa conveniadas, por exemplo GeneArt (Regensburg, Alemanha). Sítiosde reconhecimento de enzimas de restrição também são adicionados a es-tas seqüências de DNA para facilitar a ligação destas seqüências de na emplasmídios de expressão à base de pGMT7, que contêm o promotor T7 paraexpressão de alto nível em E. coli cepa BL21-DE3(pLysS) (Pan et ai, Biote-chniques (2000) 29 (6): 1234-8).

As seqüências de DNA codificando cada cadeia TCR cortada comNdel e Hindlll são ligadas em vetores pEX202 à base de pGMT7 e separa-dos, que também são cortados com Ndel e Hindlll. (Vide figura 8a para omapa plasmídico de pEX202, e figura 8b para a seqüência de DNA destevetor (SEQ ID N2 28)).

Sítios de reconhecimento de enzimas de restrição introduzidos emDNA codificando as cadeias do TCR MEL do tipo selvagem e solúvel:

Ndel - CATATG

Hindlll - AAGCTT

Ligação

Plasmídios ligados são transformados em células competentes deE. coli cepa XL1-blue e plaqueados em placas de LB/ágar contendo 100mg/ml de ampicilina. Depois de incubar por uma noite a 37°C, colônias indi-viduais são recolhidas e cultivadas em 10 ml de LB contendo 100 mg/ml deampicilina por uma noite a 37°C com agitação. Plasmídios clonados são pu-rificados usando um kit Miniprep (Qiagen) e o enxerto é sequenciado usan-do um sequenciador de DNA automático (Lark Technologies).

As figuras 5a e 5b mostram respectivamente as seqüências deaminoácidos extracelulares das cadeias α e β do MEL TCR do tipo selva-gem e ligado a dissulfeto produzidas a partir das seqüências de DNA dasfiguras 4a e 4b. As seqüências de reconhecimento de enzimas de restriçãonestas seqüências de DNA estão sublinhadas.

Exemplo 2- Produção de variantes de alta afinidade do TCRMEL solúvel e ligado a dissulfeto

O TCR MEL nativo solúvel e ligado a dissulfeto produzido damaneira descrita no exemplo 1 pode ser usado como um gabarito a partir doqual se pode produzir os TCRs da invenção que possuem uma afinidadeaumentada para o complexo AAGIGILTV (SEQ ID N2 43) -HLA-A*0201.

Exposição a fagos oferece um meio pelo qual é possível gerarbibliotecas de variantes de TCR Gag de HIV. Por exemplo, os métodos ade-quados para a exposição a fagos e rastreamento de TCR descritos em deta-lhes em (Li et ai, (2005) Nature Biotech 23 (3): 349-354) podem ser adapta-dos e aplicados a TCRs Gag de HIV.

As seqüências de aminoácidos das regiões variáveis alfa doTCR alterado que, quando combinadas com a região variável beta de MELdo tipo selvagem, demonstram alta afinidade para o complexo AAGIGILTV-HLA-A*0201 estão listadas na figura 6. (SEQ ID NoS: 11-24). Como sabemos versados na técnica as alterações de códon necessárias requeridas paraproduzir estas cadeias alteradas podem ser introduzidas no DNA codifican-do estas cadeias por mutagênese direcionada para o sítio. (Kit de mutagê-nese direcionada para o sítio QuickChange™ da Stratagene).

Em resumo, isto é obtido usando iniciadores que incorporam asalterações de códon desejados e os plasmídios pEX202 contendo o DNA dacadeia do TCR MEL relevante como gabarito para a mutagênese.

A mutagênese é realizada usando as seguintes condições: 50 ngdo plasmídio gabarito, 1 μΙ de dNTP 10 mM, 5 μΙ de tampão Pfu DNA poli-merase 10x como fornecido pelo fabricante, 25 pmol de iniciador normal("fwd primer"), 25 pmol de iniciador invertido ("rev primer"), 1 μΙ de pfu DNApolimerase num volume total de 50 μΙ. Depois de uma etapa de desnatura-ção inicial de 2 minutos a 95°C, a reação é submetida a 25 ciclos de desna-turação (95°C, 10 segundos), combinação (55°C, 10 segundos), e alonga-mento (72°C, 8 minutos). O produto resultante é digerido com a enzima derestrição Dpnl para remover o plasmídio gabarito e transformado em E. colicepa XL1-blue. A mutagênese foi verificada por sequenciamento.

Exemplo 3 - Expressão, redobradura e purificação de TCR solúvel

Os plasmídios de expressão pEX202 contendo as cadeias α doTCR MEL e as cadeias β do TCR MEL preparadas nos exemplos 1 ou 2 sãoseparadamente transformadas em E.coli cepa BL21pLysS, e colônias indivi-duais resistentes à ampicilina são cultivadas a 37°C no meio TYP (ampicili-na 100 μg/ml) até OD6oo de 0,4 antes da indução de expressão de proteínacom IPTG 0,5 mM. As células são recolhidas três horas pós-indução porcentrifugação por 30 minutos a 4000 rpm em uma centrífuga Beckman J-6B.Os péletes de células são ressuspendidos em um tampão contendo Tris-HCI50 mM, sacarose a 25% (p/v), NaEDTA 1 mM, NaAzida a 0,1% (p/v), DTT10 mM, pH 8,0. Depois de uma etapa de congelamento-descongelamentopor uma noite, as células ressuspendidas são sonicadas em explosões de 1minuto por um total de cerca de 10 minutos em um sonicador MilsonixXL2020 usando uma sonda padrão de 12 mm de diâmetro. Péletes de cor-pos de inclusão são recuperados por centrifugação por 30 minutos a 13000rpm em uma centrífuga Beckman J2-21. São então realizadas três lavagenscom detergente para remover fragmentos de células e componentes mem-branosos. Cada vez a pélete de corpos de inclusão é homogeneizada emum tampão Triton (Tris-HCI 50 mM, Triton-X100 a 0,5%, NaCI 200 mM, Na-EDTA 10 mM, NaAzida a 0,1% (p/v), DTT 2 mM, pH 8,0) antes de ser peleti-zada por centrifugação por 15 minutos a 13000 rpm em uma centrífugaBeckman J2-21. O detergente e o sal são então removidos por uma lava-gem semelhante no seguinte tampão: Tris-HCI 50 mM, NaEDTA 1 mM, Na-Azida a 0,1% (p/v), DTT 2mM, pH 8,0. Por fim, os corpos de inclusão foramdivididos em alíquotas de 30 mg e congelados a -70°C. O rendimento deproteínas dos corpos de inclusão é quantificado por solubilização com gua-nidina-HCI 6 M e medição com um ensaio de ligação a corante Bradford (PerBio).Aproximadamente 30 mg de corpos de inclusão solubilizados dacadeia β do TCR e 60 mg de corpos de inclusão solubilizados da provenien-tes de estoques congelados foram descongelados, e as amostras foram en-tão misturadas e a mistura foi diluída em 15 ml de uma solução de guanidina(cloridrato de guanidina 6 M, acetato de sódio 10 mM, EDTA 10 mM), paragarantir a desnaturação completa das cadeias. A solução de guanidina con-tendo cadeias de TCR desnaturadas e completamente reduzidas é entãoinjetada em 1 litro do seguinte tampão de redobradura: Tris 100 mM pH 8,5,L-Arginina 400 mM, EDTA 2 mM, glutationa reduzida 5 mM, glutationa oxidada0,5 mM, uréia 5 M, PMSF 0,2 mM. O par de redox (2-mercaptoetilamina e cis-tamina (até concentrações finais de 6,6 mM e 3,7 mM, respectivamente) éadicionado aproximadamente 5 minutos antes da adição das cadeias desna-turadas de TCR. A solução é deixada de lado por 5 horas ± 15 minutos. OTCR redobrado é dialisado na membrana Spectrapor 1 (Spectrum; ProdutoN0 132670) contra 10 I de Tris 10 mM pH 8,1 a 5°C ± 3°C por 18-20 horas.Depois deste período, o tampão de diálise é trocado por Tris 10 mM frescopH 8,1 (10 I) e a diálise continua a 5°C ± 3°C por mais 20 - 22 horas.

sTCR é separado dos produtos de degradação e das impurezascarregando o TCR redobrado dialisado em uma coluna de troca aniônicaPOROS 50HQ e eluindo a proteína ligada com um gradiente de NaCI de 0 -500 mM em 50 volumes de coluna usando um purificador Akta (Pharmacia).As frações de pico são armazenadas a 4°C e analisadas por SDS-PAGEcolorido com Coomassie antes de serem reunidas e concentradas. Por fim,o sTCR é purificado e caracterizado usando uma coluna de filtração de gelSuperdex 200HR previamente equilibrada no tampão HBS-EP (HEPES 10mM pH 7,4, NaCI 150 mM, EDTA 3,5 mM, nonidet p40 a 0,05%). O pico elu-indo a um peso molecular relativo de aproximadamente 50 kDa é reunido econcentrado antes de ser caracterizado por análise por ressonância deplasmônio de superfície BIAcore.

Exemplo 4 - Caracterização por ressonância de plasmônio desuperfície Biacore da ligação de sTCR a pMHC específico

Um biossensor de ressonância de plasmônio de superfície da(Biacore 3000®) foi usado para analisar a ligação de TCRs MEL solúveis aoligando peptídio-MHC cognato. Isto foi facilitado pela produção de comple-xos de pMHC individuais (descritos abaixo) que foram imobilizados em umasuperfície de ligação revestida com estreptavidina em de forma semi-orientada, possibilitando verificar de forma eficiente a ligação de um receptorde células-T solúvel a até quatro pMHC diferentes (imobilizados em célulasde fluxo separadas) simultaneamente. A injeção manual do complexo deHLA permite que o nível preciso de moléculas classe I imobilizadas seja fa-cilmente manipulado.

Moléculas HLA-A*0201 classe I biotiniladas foram redobradas invitro de corpos de inclusão expressos em bactérias contendo as proteínasde subunidades constituintes e peptídio sintético, seguido de purificação ebiotinilação enzimática in vitro (0'Callaghan et aí. (1999) Anal. Biochem.266: 9-15). A cadeia pesada HLA-A*0201 foi expressa com um traçador debiotinilação de terminal C que substitui os domínios transmembranosos ecitoplasmáticos da proteína em uma construção apropriada. Foram obtidosníveis de expressão de corpos de inclusão de -75 mg/litro de cultura bacte-riana. A cadeia leve MHC ou p2-microglobulina também foi expressa comocorpos de inclusão em E. coli a partir de uma construção apropriada, em umnível de -500 mg/litro de cultura bacteriana.

Células de E. coli foram Iisadas e os corpos de inclusão forampurificados até uma pureza de aproximadamente 80%. A proteína dos cor-pos de inclusão foi desnaturada em guanidina-HCI 6 M, Tris 50 mM pH 8,1,NaCI 100 mM, DTT 10 mM, EDTA 10 mM, e foi redrobada a uma concentra-ção de 30 mg/litro de cadeia pesada, 30 mg/litro de β2ηι em L-arginina-HCI0,5 M, Tris 100 mM pH 8,1, cistamina 3,7 mM, β-cisteamina 6,6 mM, 4mg/ml do peptídio AAGIGILTV que a molécula HLA-A*0201 requer que sejacarregado, por adição de um único pulso de proteína desnaturada no tam-pão de redobradura a < 5°C. A redobradura foi deixada chegar ao fim a 4°Cpor pelo menos 1 hora.

O tampão foi trocado por diálise em 10 volumes de Tris 10 mMpH 8,1. Foram necessárias duas trocas de tampão para reduzir suficiente-mente a força iônico da solução. A solução de proteína foi então filtrada a-través de um filtro de acetato de celulose de 1,5 μιη e carregada em umacoluna de troca aniônica POROS 50HQ (volume do leito 8 ml). A proteína foieluída com um gradiente linear de NaCI 0 - 500. O complexo HLA-A*0201-peptído eluiu a aproximadamente 250 mM de NaCI, e as frações de picoforam recolhidas, um coquetel de inibidores de protease (CaIbiochem) foiadicionado e as frações foram resfriadas em gelo.

As moléculas pMHC traçadas por biotinilação tiveram o tampãotrocado por Tris 10 mM pH 8,1, NaCI 5 mM usando uma coluna de dessali-nização rápida Pharmacia equilibrada no mesmo tampão. Imediatamentedepois da eluição, as frações contendo proteína foram resfriadas e gelo eum coquetel de inibidores de protease (CaIbiochem) foi adicionado. Foramentão adicionados reagentes de biotinilação: biotina 1 mM, ATP 5 mM (tam-ponado até pH 8), MgCl2 7,5 mM, e 5 μg/ml da enzima BirA (purificada deacordo com 0'Callaghan et al. (1999) Anal. Biochem. 266: 9-15). A misturafoi então deixada incubar à temperatura ambiente por uma noite.

As moléculas pHLA-A*0201 biotiniladas foram purificadas usan-do cromatografia por filtração em gel. Uma coluna Superdex 75 HR 10/30Pharmacia foi previamente equilibrada com PBS filtrado e 1 ml da misturareacional de biotinilação foi carregado e a coluna foi desenvolvida com PBSa 0,5 ml/min. As moléculas pHLA-A*0201 biotiniladas eluíram como um picoúnico a aproximadamente 15 ml. As frações contendo proteína foram reuni-das, resfriadas em gelo, e um coquetel de inibidores de protease foi adicio-nado. A concentração de proteína foi determinada usando um ensaio deligação de Coomassie (PerBio) e alíquotas das moléculas pHLA-A*0201 bio-tiniladas foram armazenadas congeladas a -20°C. Estreptavidina foi imobili-zada por métodos tradicionais de acoplamento de amina.

Estes complexos imobilizados são capazes de ligar tanto os re-ceptores de células-T quanto o co-receptor CD8aa, ambos podendo ser in-jetados na fase solúvel. Ligação específica do TCR é obtida mesmo a con-centrações baixas (pelo menos 40 μg/ml), sugerindo que o TCR é relativa-mente estável. Observa-se que as propriedades de ligação de sTCR a p-MHC são qualitativa e quantitativamente similares se o sTCR for usado iso-lado na fase solúvel ou na fase imobilizada. Este é um controle importantepara a atividade parcial das espécies solúveis e também sugere que com-plexos de pMHC biotiniladas são biologicamente tão ativos quanto comple-xos não biotinilados.

As interações entre TCRs MEL solúveis contendo uma nova li-gação intercadeias e seu pMHC cognato ou uma combinação de pMHC irre-levante, cuja produção está descrita acima, foram analisadas em um bios-sensor de ressonância de plasmônio de superfície (SPR) Biacore 3000®. ASPR mede as alterações no índice de refração expressas em unidades deresposta (RU) próximas a uma superfície do sensor em uma célula de fluxopequeno, um princípio que pode ser usado para detectar interações de re-ceptor ligando e para analisar sua afinidade e seus parâmetros cinéticos. Ascélulas de fluxo de teste foram preparadas por imobilização dos complexosHLA-peptídio individuais em células de fluxo separadas por meio da ligaçãoentre a biotina ligada em forma cruzada a β2ηι e estreptavidina que foramquimicamente ligadas de forma cruzada à superfície ativada das células defluxo. O ensaio foi então realizado passando sTCR pelas superfícies dasdiferentes células de fluxo a uma taxa de fluxo constante, e assim medindoa resposta à SPR.

Como medir a constante de ligação de equilíbrio

Diluições sucessivas do sTCR MEL do tipo selvagem ou altera-do foram preparadas e injetadas a uma taxa de fluxo constante de 5 μΙ/minem duas células de fluxo diferentes; uma revestida com -1000 RU do com-plexo AAGIGILTV-HLA-A*0201 específico, a segunda revestida com -100RU do complexo HLA-A2 -peptídio inespecífico. A resposta foi normalizadapara cada concentração usando a medida da célula de controle. A resposta dosdados normalizados foi representada graficamente versus a concentração daamostra de TCR e ajustada a uma hipérbole para calcular a constante de liga-ção de equilíbrio, Kd. (Price & Dwek, Principies and Problems in PhysicalChemistry for Biochemists (2nd Edition) 1979, Clarendon Press, Oxford).

Como medir parâmetros cinéticosPara TCRs de alta afinidade o K0 foi determinado medindo-seexperimentalmente a constante da taxa de dissociação, kd, e a constante dataxa de associação, ka. A constante de equilíbrio Kd foi calculada como kd/ka.

TCR foi injetado em duas células diferentes, uma revestida com-300 RU do complexo HLA-A2-AAGIGILTV específico, a segunda revestidacom -300 RU do complexo HLA-A2 -peptídio inespecífico. A taxa de fluxo foiajustada em 50 μΙ/min. Tipicamente foram injetados 250 μΙ de TCR a umaconcentração de -3 μΜ. Tampão foi então circulado até a resposta retornarà linha basal. Os parâmetros cinéticos foram calculados usando o softwareBiaevaluation. A fase de dissociação também foi ajustada a uma equaçãode decomposição exponencial simples permitindo o cálculo da meia-vida.

Resultados

A interação entre um TCR MEL do tipo selvagem solúvel e liga-do a dissulfeto (consistindo nas cadeias α e β de TCR descritas em detalhesnas SEQ ID NoS 9 e 10 respectivamente) e o complexo AAGIGILTV-HLA-A*0201 foi analisada usando os métodos acima e apresentou um K0 de 4μΜ. (Vide figura 12 para a curva de resposta Biacore).

TCRs contendo o uso da região variável especificado na tabelaa seguir apresentam um Kd menor ou igual a 3 μΜ. Com base em experiên-cias com TCRs de alta afinidade diferentes dos TCRs MEL da presente in-venção (vide por exemplo Li etal., Nature Biotech 2005 23 (3): 349-354) es-pera-se que alguns ou todos os TCRs especificados na tabela a seguir te-nham um koft de 1 χ 10'3 s'1 ou mais baixo, e na verdade isto mostrou ser ocaso pela preparação de TCRs solúveis compreendendo estes domíniosvariáveis (vide Tabela 1 abaixo).

<table>table see original document page 39</column></row><table>Seqüência da região variável da cadeia-alfa, SEQ ID N2 Seqüência da região variável da cadeia-beta, SEQ ID Ns

<table>table see original document page 40</column></row><table><table>table see original document page 41</column></row><table>

Tabela 1 - Dados da Biacore para a interação de TCRs MEL solúveis, dealta afinidade e ligados a dissulfeto compreendendo regiões variáveis defini-das e o AAGIGILTV-HLA-A*0201 peptídio-MHC cognato.

Exemplo 5 - Produção de uma proteína de fusão de TCR MELde alta afinidade solúvel - IL-2 humana WT

Os métodos substancialmente como descritos nos exemplos 1 a3 podem ser usados para produzir uma proteína de fusão de TCR MEL dealta afinidade solúvel - IL-2 humana WT. Em resumo, o DNA codificando oIigador desejado e a IL-2 humana WT são adicionados à extremidade 3' daseqüência de DNA da cadeia-beta do TCR MEL do tipo selvagem solúvel eligado a dissulfeto imediatamente antes do códon TAA ("de terminação"). Afigura 9b mostra a seqüência de aminoácidos de uma proteína de fusãocompreendendo uma cadeia-beta do TCR MEL do tipo selvagem ligado adissulfeto fundida à IL-2 humana WT via uma seqüência Iigadora (SEQ IDN2 30). A porção Iigadora e a porção IL-2 desta proteína de fusão estão indi-cadas em itálico. O DNA codificando esta construção pode ser então ligadoao pEX202. A proteína de fusão de TCR MEL de alta afinidade - IL-2 podeser então expressa combinando-se esta proteína de fusão de cadeia-betacom uma cadeia alta do TCR MEL de alta afinidade solúvel e ligado a dissul-feto contendo qualquer uma das regiões variáveis descritas em detalhas nafigura 6 (SEQ ID NoS: 11 - 24) usando os métodos substancialmente da ma-neira descrita no exemplo 3. Por exemplo, a figura 9a (SEQ ID N2 29) mos-tra a seqüência de aminoácidos de uma cadeia-alfa do TCR MEL de altaafinidade solúvel e ligado a dissulfeto contendo a região variável descrita emdetalhes nas SEQ ID N2 11.

Exemplo 6 - Ensaio ELISPOT para avaliar a inibição in vitro daativação de células-T citotóxicas (CTL) por TCRs Mel CIcWT Mel de altaafinidade solúveis

O método a seguir proporciona um meio de avaliação da capa-cidade de TCRs Mel de alta afinidade Mel c1 cWT para inibir a ativação declones de células-T reativos com AAGIGILTV-HLA-A*0201.

O TCR Mel de alta afinidade solúvel Mel c1 cWT utilizado nestaexperiência continha o domínio variável da cadeia-alfa do TCR Mel e regiõesvariáveis da cadeia-beta do TCR Mel WT de (SEQ ID N2 11) e (SEQ ID N-2) respectivamente. As seqüências de aminoácidos completas das cadeia-alfa e beta de TCR deste TCR solúvel e ligado a dissulfeto estão mostradasna figura 9a (SEQ ID N2 29) e na figura 5b (SEQ ID N2 10) respectivamente.

Reaaentes:

Meio de ensaio: 10% de FCS (heat-inactivated, Gibco1 cat#10108-165), 88% de RPMI 1640 (Gibcoi cat# 42401-018), 1% de glutamina(Gibco, cat# 25030-024) e 1% penicilina/estreptomicina (Gibco, cat# 15070-063).Tampão de lavagem: 0,01 M de PBS/0,05% de Tween 20 (1 sa-chê de solução salina tamponada com fosfato com Tween 20, pH 7,4 daSigma, Cat. # P-3563 dissolvido em 1 litro de água destilada dá a composi-ção final 0,01 M de PBS1 0,138 M de NaCI, 0,0027 M de KCI, 0,05 % de Tween 20).

PBS (Gibco, cat#10010-015).

Kit Diaclone EIiSpot (IDS): O kit EIiSpot contém todos os outrosreagentes necessários, isto é, anticorpos de captura e de detecção, leite empó desnatado, BSA, estreptavidina-fosfatase alcalina, solução de BCIP/NBT(IFN-γ humano PVDF Eli-spot 20 χ 96 cavidades com placas (IDS cat# DC-856.051.020, DC-856.000.000.

O método a seguir baseia-se nas instruções dos fabricantes for-necidas com cada kit mas contém algumas alterações.

Método

100 μL de anticorpo de captura foram diluídos em 10 ml de PBSestéril por placa. 100 μΙ do anticorpo de captura diluído foram divididos emalíquotas e introduzidos em cada cavidade e deixados por uma noite a 4°C,ou por 2 horas à temperatura ambiente. As placas foram então lavadas trêsvezes com 450 μΙ de tampão de lavagem, lavadora de placas de 96 cavida-des Ultrawash, (Thermo Life Sciences) para remover o excesso de anticorpode captura. 100 μΙ de leite desnatado a 2% foram então adicionados a cadacavidade. (Um frasco de leite em pó desnatado fornecido com o kitELISPOT foi dissolvido em 50 ml de PBS estéril). As placas foram entãoincubadas à temperatura ambiente por duas horas antes de serem lavadasmais três vezes com 450 ml de tampão de lavagem, lavadora de placas de96 cavidades Ultrawash, (Thermo Life Sciences).

Células cancerosas alvo Mel 624 e Mel 526 foram desprendidasde seus balões de cultura de tecido usando tripsina, lavadas uma vez porcentrifugação (280 χ g por 10 minutos) em meio de ensaio e ressuspendidasa 1 χ 106AnI no mesmo meio. 50 ul desta suspensão foram então adiciona-dos à placa de ensaio para dar um número total de células-alvo de 50.000células/cavidade.Células-alvo T2 pulsadas com ELAGIGILTV também foram usa-das como controle. Este peptídio análogo foi usado já que ele tem maiorafinidade para HLA-A*0201 do que o peptídio WT.

Estas células pulsadas com peptídio foram lavadas uma vez porcentrifugação (280 χ g por 10 minutos) em meio de ensaio e ressuspendidasa 1 χ 106/ml no mesmo meio. 50 ul desta suspensão foram então adiciona-dos à placa de ensaio para dar um número total de células-alvo de 50.000células/cavidade.

Um clone de células-T (KA/C5) (células efetoras), produzido porestimulação autóloga com o peptídio ELAGIGILTV, foi colhido por centrifu-gação (280 χ g por 10 minutos) e ressuspendido a 1 χ 105 células/ml nomeio de ensaio para dar 5000 células/cavidades quando 50 μΙ foram adicio-nados à placa de ensaio.

Os TCRs Mel de alta afinidade solúveis do TCR Mel de alta afi-nidade Mel c1 cWT foram diluídos no meio de ensaio a uma concentraçãode 3x para dar uma concentração final de 1x quando 50 ul foram adiciona-dos à placa em um volume final de 150 μΙ. A faixa de concentração dos T-CRs Mel de alta afinidade testados foi de 1 μΜ-1 nM.

Foram então preparados cavidades contendo os seguintes itens(o volume de reação final em cada cavidade foi de 100 μΙ):

Amostras de teste (adicionadas em ordem)

50 μΙ de células-alvo Mel 624 ou Mel 526.

50 ul da concentração desejada de TCRs Mel c1 cWT de altaafinidade solúveis.

50 ul de células efetoras do clone da célula T KA/C5.Controles negativos

50 μΙ de células-alvo

50 ul da concentração mais alta de TCRs Mel c1 cWT de altaafinidade solúveis.

50 μΙ de meio de ensaio e

50 μΙ de células efetoras

50 μΙ da concentração mais alta de TCRs Mel c1 cWT de altaafinidade solúveis

50 μΙ de meio de ensaio e50 μΙ de células efetoras50 μΙ de células-alvo

50 μΙ da concentração mais alta solúvel de um mTCr de alta afi-nidade (específico para HLA-A*0201- Tax) irrelevante

50 μΙ de meio de ensaioControles positivos

50 μΙ de células-alvo Mel 624, Mel 526, ou T2 pulsadas compeptídio

50 μΙ de células efetoras

50 μΙ de meio de ensaio

As placas foram então incubadas por uma noite a 37°C/5% CO2.

As placas foram então lavadas seis vezes com tampão de lavagem antes deser extraído o excesso de tampão. 550 μΙ de água destilada foram entãoadicionados a cada frasco de anticorpo de detecção fornecido com o kitELISPOT para preparar uma solução diluída. 100 μΙ da solução diluída deanticorpo de detecção foram então ainda diluídos em 100 ml de PBS/1% deBSA por placa e 100 μΙ da solução diluída de anticorpo de detecção foramdivididos em alíquotas e introduzidos em cada cavidade. As placas foramentão incubadas à temperatura ambiente por 90 minutos.

Depois deste período as placas foram lavadas três vezes comtampão de lavagem (três vezes com 450 μΙ de tampão de lavagem, lavadorade placa de 96 cavidades Ultrawash (Thermo Life Sciences) e drenadas atéa secura. 10 μΙ de estreptavidina-fosfatase alcalina foram então diluídos com10 ml de PBS/1% de BSA por placa e 100 μΙ da estreptavidina diluída foramadicionados a cada cavidade e incubados à temperatura ambiente por 1 ho-ra. As placas foram então novamente lavadas três vezes com 450 μΙ detampão de lavagem e drenadas até a secura.

100 μΙ da solução suprida com BCIP/NBT foram adicionados acada cavidade e as placas foram cobertas com folha de alumínio e deixadasdesenvolver por 5 - 15 minutos. As placas foram verificadas regularmentedurante este período quanto à formação de manchas para decidir quandoterminar a reação.

As placas foram então lavadas vigorosamente com água doce esacudidas antes de serem colocadas de lado e deixadas secar sobre a ban-cada.

Uma vez secas, as placas foram lidas usando uma leitoraELISPOT (Autoimmun Diagnotistika, Alemanha).

O número de manchas que apareceram em cada cavidade éproporcional ao número de células-T ativadas. Portanto, qualquer reduçãono número de manchas nos cavidades contendo o TCR Mel de alta afinida-de indica inibição da ativação do clone KA/C5 CTL.

Resultados

Como mostrado na figura 16 os TCRs Mel de alta afinidade so-lúveis c1 cWT foram eficazes em inibir a ativação do clone KA/C5 CTL. Es-tes dados indicam que foi obtido 100% de inibição da ativação de CTL u-sando 1 μΜ de TCRs Mel de alta afinidade solúveis c1 cWT.

Exemplo 7 - Comparação dos níveis de expressão de TCR emcélulas Jurkat transfectadas com DNA otimizado com códon e DNA não oti-mizado com códon codificando um TCR MEL de alta afinidade (cia WT1β) 4χ 106 células Jurkat cultivadas em RMPI contendo 10% de células de meio- de soro de bezerro fetal inativadas com calor foram lavadas em meio livrede soro e transfectadas com:

a) 5 pg de plasmídio livre de endotoxina pCIneo contendo a se-qüência não otimizada com códon codificando a cadeia do TCR mutante decomprimento integral MELa c1 mais 5 pg de plasmídio livre de endotoxinapCI contendo a seqüência não otimizada com códon codificando a cadeia doTCR de comprimento integral MELp wt (as ORFs destas seqüências estãomostradas na figura 18 (SEQ ID Ns 46) e na figura 17b (SEQ ID N2 45) res-pectivamente); ou

b) 5 pg de plasmídio livre de endotoxina pCIneo contendo umacadeia do TCR mutante de comprimento integral MELa c1 otimizada comcódon de ORF mais 5 pg de plasmídio livre de endotoxina pCI contendouma cadeia do TCR de comprimento integral MELp otimizada com códon deORF (as ORFs destas seqüências estão mostradas na figura 12a (SEQ IDN2 33) e na figura 15a (SEQ ID N- 39) respectivamente).

A transfecção foi obtida por eletroporação usando cubetas de0,4 cm usando condições de 0,27 kV e 975 pF em um aparelho GenepulserBioRad.

As células foram colocadas em 6 ml de RPMI contendo 20% desoro de bezerro fetal inativadas com calor a 37°C por 72 horas.

As células foram coloridas em um volume de 100 μΙ de PBS ü-sando 1 μΙ (0,54 μg) do tetrâmero estreptavidina p/HLA-A2 marcado com PE(o peptídio foi o peptídio de MEL heteroclítico ELAGIGILTV ou um peptídiode NY-ESO de controle negativo SLLMWITQC).

Depois de 20 minutos à temperatura ambiente as células foramlavadas uma vez com 5 ml de RPMI e ressuspendidas em 800 μΙ de RPMI eanalisadas em instrumento FC500 Beckman Coulter.

Resultados

Os dados de coloração com FACs mostrados na figura 19a e nafigura 19b são o nível de coloração do tetrâmero de pMHC cognato obtidopara células Jurkat transfectadas com o DNA não otimizado com códon e oDNA otimizado com códon codificando o TCR MEL c1 alfa / WT beta. Estesdados demonstraram que foi obtido um nível alto de expressão de superfíciede TCR usando o DNA otimizado com códon comparado com aquele obtidousando o DNA não otimizado com códon correspondente.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Avidex Ltd

Jakobsen, Bent KLiddy, Nathaniel R<120> RECEPTORES DE CÉLULAS-T MELANO-A DE ALTA AFINIDADE

<130> 77MG

<140> PCT/GB2006/001980<141> 2006-05-31<150> GB 0511124.0<151> 2005-05-31<160> 78

<170> PatentIn version 3.3<210> 1<211> 110<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 1

Met Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu15 10 15

Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Ãsp Arg Gly Ser Gln20 25 30

Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile35 40 45

Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala50 55 60

Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser65 70 75 80Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Val Ala Gly85 90 95

Lys Ser Thr Phe Gly Asp Gly Thr Thr Leu Thr Val Lys Pro100 105 110

<210> 2

<211> 115

<212> PRT.

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Ser Gln Thr Xle His Gln Trp Pro Ala Thr Leu Val Gln Pro Val5 10 15

Gly Ser Pro Leu Ser Leu Glu Cys Thr Val Glu Gly Thr Ser Asn Pro20 25 30

Asn Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Arg Gly Leu Gln Leu Leu35 40 45

Phe Tyr Ser Val Gly Ile Gly Gln Ile Ser Ser Glu Val Pro Gln Asn50 55 60

Leu Ser Ala Ser Arg Pro Gln Asp Arg Gln Phe Ile Leu Ser Ser Lys65 70 75 80

Lys Leu Leu Leu Ser Asp Ser Gly Phe Tyr Leu Cys Ala Trp Ser Glu85 90 95

Thr Gly Leu Gly Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu100 105 110Thr Val Leu115

<210> 3<211> 621<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 3

atgcaaaaag aagttgaaca aaattctgga cccctcagtg ttccagaggg agccattgcc 60

tctctcaact gcacttacag tgaccgaggt' tcccagtect tcttctggta cagacaatat 120tctgggaaaa gccctgagtt gataatgttc atatactcca atggtgacaa agaagatgga 180aggtttacag cacagctcaa taaagccagc cagtatgttt ctctgctcat cagagactcc 240cagcccagtg attcagccac ctacctctgt gccgtgaacg ttgcaggcaa atcaaccttt 300ggggatggga ctacgctcac tgtgaagcca aatatccaga accctgaccc tgccgtgtac 360cagctgagag actctaagtc gagtgacaag tctgtctgcc tattcaccga ttttgattct 420caaacaaatg tgtcacaaag taaggattct gatgtgtata tcacagacaa aactgtgcta 480gacatgaggt ctatggactt caagagcaac agtgctgtgg cctggagcaa caaatctgac 540tttgcatgtg caaacgcctt caacaacagc attattccag aagacacctt cttccccagc 600ccagaaagtt cctaagcttg a 621

<210> 4

<211> 744

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

atgtctcaga ctattcatca atggccagcg accctggtgc agcctgtggg cagcccgctc 60

tctctggagt gcactgtgga gggaacatca aaccccaacc tatactggta ccgacaggct 120

gcaggcaggg gcctccagct gctcttctac tccgttggta ttggccagat cagctctgag 180

gtgccccaga atctctcagc ctccagaccc caggaccggc agttcatcçt gagttctaag 240

aagctcctcc tcagtgactc tggcttctat ctctgtgcct ggtccgagac agggttaggc 300

accggggagc tgttttttgg agaaggctct aggctgaccg tactggagga cctgaaaaac 3 60

gtgttcccac ccgaggtcgc tgtgtttgag ccatcagaag cagagatctc ccacacccaa 420aaggccacac tggtgtgcct ggccaccggt ttctaccccg accacgtgga gctgagctgg 480

tgggtgaatg ggaaggaggt gcacagtggg gtcagcacag acccgcagcc cctcaaggag 540

cagcccgccc tcaatgactc cagatacgct ctgagcagcc gcctgagggt ctcggccacc 600

ttctggcagg acccccgcaa ccacttccgc tgtcaagtcc agttctacgg gctctcggag 660

aatgacgagt ggacccagga tagggccaaa cccgtcaccc agatcgtcag cgccgaggcc 720

tggggtagag cagactaagc ttga 744

<210> 5

<211> 204

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Met Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu1 5 10 15

Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln20 25 30

Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile35 40 45

Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala50 55 60

Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser65 70 75 80

Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Val Ala Gly85 90 95

Lys Ser Thr Phe Gly Asp Gly Thr Thr Leu Thr Val Lys Pro Asn Ile100 105 110Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser115 - 120 125

Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val130 135 140

Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu145 150 155 160

Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser165 170 175

Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile180 185 190

Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser195 200

<210> 6

<211> 245

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Met Ser Gln Thr Ile His Gln Trp Pro Ala Thr Leu Val Gln Pro Val1 5 10 15

Gly Ser Pro Leu Ser Leu Glu Cys Thr Val Glu Gly Thr Ser Asn Pro20 25 30

Asn Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Arg Gly Leu Gln Leu Leu

35

40

45Phe Tyr Ser Val Gly Ile Gly Gln Ile Ser Ser Glu Val Pro Gln Asn50 55 60

Leu Ser Ala Ser Arg Pro Gln Asp Arg Gln Phe Ile Leu Ser Ser Lys65 70 75 80

Lys Leu Leu Leu Ser Asp Ser Gly Phe Tyr Leu Cys Ala Trp Ser Glu85 90 95

Thr Gly Leu Gly Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu100 105 110

Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val115 120 125

Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu130 135 140

Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp145 150 155 160

Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln165 170 175

Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser180 185 190

Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg Asn His195 200 205

Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp210 215 220

Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala225 230 235 240

Trp Gly Arg Ala Asp245

<210> 7<211> 628<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<22 0>

<223> Codificação de DNA em uma cadeia-alfa MEL TCR solúvel no códon Cys

apresentado e sítios de reconhecimento de enzimas restritas<400> 7

tatacatatg caaaaagaag ttgaacaaaa ttctggaccc ctcagtgttc cagagggagc 60

cattgcctct ctcaactgca cttacagtga ccgaggttcc cagtccttct tctggtacag 120acaatattct gggaaaagcc ctgagttgat aatgttcata tactccaatg gtgacaaaga 180agatggaagg tttacagcac agctcaataa agccagccag tatgtttctc tgctcatcag 240agactcccag cccagtga"tt cagccaccta cctctgtgcc gtgaacgttg caggcaaatc 300aacctttggg gatgggacta cgctcactgt gaagccaaat atccagaacc ctgaccctgc 360cgtgtaccag ctgagagact ctaagtcgag tgacaagtct gtctgcctat tcaccgattt 420tgattctcaa acaaatgtgt cacaaagtaa ggattctgat gtgtatatca cagacaaatg 480tgtgctagac atgaggtcta tggacttcaa gagcaacagt gctgtggcct ggagcaacaa 540atctgacttt gcatgtgcaa acgccttcaa caacagcatt attccagaag acaccttctt 600ccccagccca gaaagttcçt aagcttga 628

<210> 8

<211> 751

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Codificação de DNA em uma cadeia-beta MEL TCR solúvel no códon Cys

sítios de reconhecimento de enzimas restritas

ttcatcaatg gccagcgacc ctggtgcagc ctgtgggcag 60

ctgtggaggg aacatcaaac cccaacctat actggtaccg 12 0

tccagctgct cttctactcc gttggtattg gccagatcag 180

tctcagcctc cagaccccag gaccggcagt tcatcctgag 240

gtgactctgg cttctatctc tgtgcctggt ccgagacagg 300

tttttggaga aggctctagg ctgaccgtac tggaggacct 360

aggtcgctgt gtttgagcca tcagaagcag agatctccca 420

tgtgcctggc caccggtttc taccccgacc acgtggagct 480

aggaggtgca cagtggggtc tgcacagacc cgcagcccct 540

atgactccag atacgctctg agcagccgcc tgagggtctc 600

cccgcaacca cttccgctgt cáagtccagt tctacgggct 660

cccaggatag ggccaaaccc gtcacccaga tcgtcagcgc 720

actaagcttg a 751

<211> 204<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Solução de cadeia-alfa Mel TCR apresentando resíduo Cys<400> 9

Met Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu15 10 15

Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln

20 25 30

Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile

35 40 45

Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala50 55 60

apresentado e<400> 8

tatacatatg tctcagactacccgctctct ctggagtgcaacaggctgca ggcaggggccctctgaggtg ccccagaatcttctaagaag ctcctcctcagttaggcacc ggggagctgtgaaaaacgtg ttcccacccgcacccaaaag gccacactgggagctggtgg gtgaatgggacaaggagcag cccgccctcaggccaccttc tggcaggaccctçggagaat gacgagtggacgaggcctgg ggtagagcag<210> 9Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser65 70 75 80

Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Val Ala Gly

85 90 95

Lys Ser Thr Phe Gly Asp Gly Thr Thr Leu Thr Val Lys Pro Asn Ile

100 105 110

Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser

115 120 125

Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val

130 135 140

Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu145 150 155 160

Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser

165 170 175

Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile

180 185 190

Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser

195 200

<210> 10<211> 245<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Solução de cadeia-beta Mel TCR apresentando resíduo Cys<400> 10

Met Ser Gln Thr Ile His Gln Trp Pro Ala Thr Leu Val Gln Pro Val15 10 15

Gly Ser Pro Leu Ser Leu Glu Cys Thr Val Glu Gly Thr Ser Asn Pro

20 25 30

Asn Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Arg Gly Leu Gln Leu Leu35 40 45Phe Tyr Ser Val Gly Ile Gly Gln Ile Ser Ser Glu Val Pro Gln Asn

50 55 60

Leu Ser Ala Ser Arg Pro Gln Asp Arg Gln Phe Ile Leu Ser Ser Lys65 70 75 80

Lys Leu Leu Leu Ser Asp Ser Gly Phe Tyr Leu Cys Ala Trp Ser Glu

85 90 95

Thr Gly Leu Gly Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu

100 105 110

Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val

115 120 125

Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu

130 135 140

Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp145 150 155 160

Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln

165 170 175

Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser

180 185 190

Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg Asn His

195 200. 205

Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Ãsn Asp Glu Trp

210 215 220

Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala225 230 235 240

Trp Gly Arg Ala Asp245

<210> 11<211> 110<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220><223> Domínio variável de cadeia-alfa Mel TCR de alta-afinidade<400> 11

Met Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu15 10 15

Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln20 25 30

Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile35 40 45

Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala50 55 60

Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser65 70 75 80

Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Asp Gly Gly85 90 95

Arg Leu Thr Phe Gly Asp Gly Thr Thr Leu Thr Val Lys Pro100 105 110

<210> 12<211> 110<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Domínio variável de cadeia-alfa Mel TCR de alta-afinidade<400> 12

Met Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu1 5 10 15Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln20 25 30

Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile35 40 45

Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala50 55 60

Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser65 70 75 80

Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Val Gly Gly85 90 95.

Arg Leu Thr Phe Gly Asp Gly Thr Thr Leu Thr Val Lys Pro100 105 110

<210> 13<211> 110 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Domínio variável de cadeia-alfa Mel TCR de alta-afinidade<400> 13

Met Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu1 5 10 15

Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln20 25 30Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile35 40 45

Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala50 55 60

Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser65 70 75 80

Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Asp Ala Gly85 90 95

Arg Leu Thr Phe Gly Asp Gly Thr Thr Leu Thr Val Lys Pro100 105 110

<210> 14<211> 110<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<22 0>

<223> Domínio variável de cadeia-alfa Mel TCR de alta-afinidade<400> 14

Met Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu1 5 10 15

Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln20 25 30

Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile35 40 45

Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala50 55 60

Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser65 70 75 80

Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Asp Gly Gly85 90 95

Lys Leu Thr Phe Gly Asp Gly Thr Thr Leu Thr Val Lys Pro100 105 110

<210> 15<211> 110<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Domínio variável de cadeia-alfa Mel TCR de alta-afinidade<400> 15

Met Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu1 5 10 15

Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln20 25 30

Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile35 40 45

Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala50 55 60

Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser65 70 75 80Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Asp Gly Gly85 90 95

Arg Ser Thr Phe Gly Asp Gly Thr Thr Leu Thr Val Lys Pro100 105 110

<210> 16<211> 110<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Domínio variável de cadeia-alfa Mel TCR de alta-afinidade<400> 16

Met Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu1 5 10 15

Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln20 25 30

Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly-Lys Ser Pro Glu Leu Ile35 40 45

Ile Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala50 55 60

Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser65 70 75 80

Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Val Gly Gly

85

90

95Tyr Leu Leu Phe Gly Asp Gly Thr Thr Leu Thr Val Lys Pro100 105 110

<210> 17<211> 110<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Domínio variável de cadeia-alfa Mel TCR de alta-afinidade<400>· 17

Met Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu15 10 15

Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln20 25 30

Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile35 40 45

Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala50 "55 '60

Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser65 70 75 80

Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Pro Gly Gly85 90 95

Val Leu Thr Phe Gly Asp Gly Thr Thr Leu Thr Val Lys Pro100 105 110

<210> 18<211> 110<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Domínio variável de cadeia-alfa Mel TCR de alta-afinidade<400> 18

Met Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu1 5 10 15

Gly Ala IleAla Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln20 25 30

Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile35 40 45

Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala50 55 60

Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser65 70 75 80

Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Pro Gly Gly85 90 95

Leu Leu Thr Phe Gly Asp Gly Thr Thr Leu Thr Val Lys Pro100 105 110

<210> 19<211> 110<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220><223> Domínio variável de cadeia-alfa Mel TCR de alta-afinidade<400> 19

Met Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu1 5 10 15

Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln20 25 30

Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile35 40 45

Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala50 55 60

Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser65 70 75 80

Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Ser Gly Asn85 90 95

His Met Thr Phe Gly Asp Gly Thr Thr Leu Thr Val Lys Pro100 105 110

<210> 20<211> 110<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Domínio variável de cadeia-alfa Mel TCR de alta-afinidade<400> 20

Met Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu15 10 15Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln20 25 30

Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile35 40 45

Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala50 55 60

Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser65 70 75 80

Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Leu Ser Pro85 90 95

Gly Leu Thr Phe Gly Asp Gly Thr Thr Leu Thr Val Lys Pro100 105 110

<210> 21<211> 110<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Domínio variável de cadeia-alfa Mel TCR de alta^afinidade<400> 21

Met Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu15 10 15

Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala50 55 60

Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser65 70 75 80

Gln Pro Ser Asp "Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Val Gly Val85 90 95

Ile Leu Arg Phe Gly Asp Gly Thr Thr Leu Thr Val Lys Pro100 105 110

<210> 22<211> 110<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Domínio variável de cadeia-alfa Mel TCR de alta-afinidade<400> 22

Met Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu1 5 10 15

Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln20 25 30

Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile35 40 45

Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala50 55 60

Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser65 70 75 80

Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Asn Gly Met85 90 95

Pro Ser Thr Phe Gly Asp Gly Thr Thr Leu Thr Val Lys Pro100 105 110

<210> 23<211> 110<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Domínio variável de cadeia-alfa Mel TCR de alta-afinidade<400> 23

Met Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu1 5 10 15

Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln20 25 30

Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile35 40 45

Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala50 55 60

Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser65 70 75 80Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Val Gly Leu85 90 95

Ile Leu Leu Phe Gly Asp Gly Thr Thr Leu Thr Val Lys Pro100 105 110

<210> 24<211> 110<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Domínio variável de cadeia-alfa Mel TCR de alta-afinidade<400> 24

Met Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu1 5 10 15

Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln20 25 30

Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile35 40 45

Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala50 55 60

Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser65 70 75 80

Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Ser Glu Arg

85

90

95Pro Arg Thr Phe Gly Asp Gly Thr Thr Leu Thr Val Lys Pro100 105 110

<210> 25

<211> 47

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 25

Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys1 5 10 " 15

Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr20 25 30

Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys35 40 45

<210> 26

<211> 56

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 26

Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro1 5 10 15

Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu20 25 30

Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn35 40 45

Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val50 55

<210> 27

<211> 56

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 27

Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro1 5 10 15

Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu20 25 30

Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn35 40 45

Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val50 55

<210> 28<211> 3857<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência de DNA do plasmídeo PEX202<400> 28

gatctcgatc ccgcgaaatt aatacgactc actataggga gaccacaacg gtttccctct 60

agaaataatt ttgtttaact ttaagaagga gatatacata tgcagaagga agtggagcag 120aactctggac ccctcagtgt tccagaggga gccattgcct ctctcaactg cacttacagt 180gaccgaggtt cccagtcctt cttctggtac agacaatatt ctgggaaaag ccctgagttg 240ataatgtcca tatactccaa tggtgacaaa gaagatggaa ggtttacagc acagctcaat 300aaagccagcc agtatgtttc tctgctcatc agagactccc agcccagtga ttcagccacc 360tacctctgtg ccgttacaac tgacagctgg gggaaattgc agtttggagc agggacccag 420

gttgtggtca ccccagatat ccagaaccct gaccctgccg tgtaccagct gagagactct 480

aaatccagtg acaagtctgt ctgcctattc accgattttg attctcaaac aaatgtgtca 540

caaagtaagg attctgatgt gtatatcaca gacaaaactg tgctagacat gaggtctatg 600

gacttcaaga gcaacagtgc tgtggcctgg agcaacaaat ctgactttgc atgtgcaaac 660

gccttcaaca acagcattat tccagaagac accttcttcc ccagcccaga aagttccccc 720

gggggtagaa tcgcccggct ggaggaaaaa gtgaaaacct tgaaagctca gaactcggag 780

ctggcgtcca cggccaacat gctcagggaa caggtggcac agcttaaaca gaaagtcatg 840

aactactagg atccatggta agcttgaatt ccgatccggc tgctaacaaa gcccgaaagg 900

aagctgagtt ggctgctgcc accgctgagc aataactagc ataacccctt ggggcctcta 960

aacgggtctt gaggggtttt ttgctgaaag gaggaactat atccggataa ttcttgaaga 1020

cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta taggttaatg tcatgataat aatggtttct 1080

tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc 1140

taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa 1200

tattttgtta aaattcgcgt taaatttttg ttaaatcagc tcatttttta accaataggc 1260

cgaaatcggc aaaatccctt ataaatcaaa agaatagacc gagatagggt tgagtgttgt 1320

tccagtttgg aacaagagtc cactattaaa gaacgtggac tccaacgtca aagggcgaaa 1380

aaccgtctat cagggcgatg gcccactacg tgaaccatca ccctaatcaa gttttttggg 1440

gtcgaggtgc cgtaaagcac taaatcggaa ccctaaaggg agcccccgat ttagagcttg 1500

acggggaaag ccggcgaacg tggcgagaaa ggaagggaag aaagcgaaag gagcgggcgc 1560

tagggcgctg gcaagtgtag cggtcacgct gcgcgtaacc accacacccg ccgcgcttaa 1620

tgcgccgcta cagggcgcgt caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat 1680

ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata 1740

aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct 1800

tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa 1860

agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa 1920

cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt 1980

taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtgttgac gccgggcaag agcaactcgg 2040

tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca 2100

tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa 2160

cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt 2220

gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc 2280cataccaaac gacgagcgtg acaccacgatactattaact ggcgaactac ttactctagcggcggataaa gttgcaggac cacttctgcgtgataaatct ggagccggtg agcgtgggtctggtaagccc tcccgtatcg tagttatctaacgaaataga cagatcgctg agataggtgcccaagtttac tcatatatac tttagattgactaggtgaag atcctttttg ataatctcatccactgagcg tcagaccccg tagaaaagatgcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaaggatcaagag ctaccaactc tttttccgaaaaatactgtc cttctagtgt agccgtagttgcctacatac ctcgctctgc taatcctgttgtgtcttacc gggttggact caagacgataaacggggggt tcgtgcacac agcccagcttcctacagcgt gagctatgag aaagcgccactccggtaagc ggcagggtcg gaacaggagactggtatctt tatagtcctg tcgggtttcgatgctcgtca ggggggcgga gcctatggaacctggccttt tgctggcctt ttgctcacatggataaccgt attaccgcct ttgagtgagcgcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcggagcatctgtgc ggtatttcac accgcaatgggcatagttaa gccagtatac actccgctatgacacccgcc aacacccgct gacgcgccctacagacaagc tgtgaccgtc tccgggagctcgaaacgcgc gaggcag

<210> 29

<211> 204

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

gcctgcagca atggcaacaa cgttgcgcaa 2340

ttcccggcaa caattaatag actggatgga 2400

ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc 2460

tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga 2520

cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga 2580

ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga 2640

tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat 2700

gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt 2760

caaaggatct tcttgagatc ctttttttct 2820

accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc 2880

ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc 2940

aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc 3000

accagtggct gctgccagtg gcgataagtc 3060

gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg 3120

ggagcgaacg acctacaccg aactgagata 3180

gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta 3240

gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc 3300

ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg 3360

aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt 3420

gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt 3480

tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga 3540

agagcgcctg atgcggtatt ttctccttac 3600

tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc 3660

cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc 3720

gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt 3780

gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac 3 840

3857<220>

<223> Cadeia-alfa Mel TCR solúvel de alta afinidade<400> 29

Met Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu1 5 10 15

Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln20 25 30

Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile35 40 45

Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala50 55 60

Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser65 70 75 80

Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Asp Gly Gly85 90 95

Arg Leu Thr Phe Gly Asp Gly Thr Thr Leu Thr Val Lys Pro Asn Ile100 105 110

Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser115 120 125

Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val130 135 140

Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu145 150 155 160Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser165 170 175

Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile180 185 190

Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser195 200

<210> 30<211> 380<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Cadeia-beta solúvel em Mel TCR solúvel apresentando resíduo Cys fun-dido através de ligação peptídica a um tipo humano selvagem IL-2<400> 30

Met Ser Gln Thr Ile His Gln Trp Pro Ala Thr Leu Val Gln Pro Val15 10 15

Gly Ser Pro Leu Ser Leu Glu Cys Thr Val Glu Gly Thr Ser Asn Pro20 25 30

Asn Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Arg Gly Leu Gln Leu Leu35 40 45

Phe Tyr Ser Val Gly Ile Gly Gln Ile Ser Ser Glu Val Pro Gln Asn50 55 60

Leu Ser Ala Ser Arg Pro Gln Asp Arg Gln Phe Ile Leu Ser65 70 75

Ser Lys

80Lys Leu Leu Leu Ser85

Thr Gly Leu Gly Thr100

Thr Val Leu Glu Asp115

Phe Glu Pro Ser Glu130

Val Cys Leu Ala Thr145

Trp Val Asn Gly Lys165

Pro Leu Lys Glu Gln180

Ser Arg Leu Arg Val195

Phe Arg Cys Gln Val210

Thr Gln Asp Arg Ala225

Trp Gly Arg Ala Asp

Asp Ser Gly Phe Tyr Leu90

Gly Glu Leu Phe Phe Gly105

Leu Lys Asn Val Phe Pro120

Ala Glu Ile Ser His Thr135

Gly Phe Tyr Pro Asp His150 155

Glu Val His Ser Gly Val170

Pro Ala Leu Asn Asp Ser185

Ser Ala Thr Phe Trp Gln200

Gln Phe Tyr Gly Leu Ser215

Lys Pro Val Thr Gln Ile230 235

Pro Gly Ala Pro Thr Ser

Cys Ala Trp Ser Glu95

Glu Gly Ser Arg Leu110

Pro Glu Val Ala Val125.

Gln Lys Ala Thr Leu140

Val Glu Leu Ser Trp160

Cys Thr Asp Pro Gln175

Arg Tyr Ala Leu Ser190

Asp Pro Arg Asn His205

Glu Asn Asp Glu Trp220

Val Ser Ala Glu Ala240

Ser Ser Thr Lys Lys245 250 255

Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu260 265 270

Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr275 280 285

Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln290 295 300

Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala305 310 315 320

Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile325 330 335

Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys340 345 350

Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp355 360 365

Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr370 375 380

<210> 31

<211> 839

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Codificação de DNA em toda a extensão de um códon otimizado WT semuma cadeia-alfa MEL TCR<400> 31

ctcgagccgc caccatgatg aagagcctgctgagctgggt gtggagccag cagaaggaggccgagggcgc catcgccagc ctgaactgcatctggtatcg gcagtacagc ggcaagagccgcgacaagga ggacggccgg ttcaccgccctgctgatccg ggacagccag cccagcgacactgggaagag caccttcggc gacggcaccaccgaccccgc cgtgtaccag ctgcgggacatcaccgactt cgacagccag accaatgtgaccgacaagaccgtgctggac atgcggagcaggagcaacaa gagcgacttc gcctgcgccaacaccttttt ccccagcccc gagagcagctagaccgacac caacctgaac ttccagaacctgaaagtggc tgggttcaac ctgctgatga

gggtgctgct ggtgatcctg tggctgcagc 60

tggagcagaa cagcggcccc ctgagcgtgc 120

cctacagcga ccggggcagc cagagcttct 180

ccgagctgat tatgttcatc tacagcaacg 240

agctgaacaa ggccagccag tatgtgagcc 300

gcgccaccta cctgtgcgcc gtgaacgtgg . 360

ccctgaccgt gaagcccaac atccagaacc 420

gcaagagcag cgacaagtct gtgtgcctgt 480

gccagagcaa ggacagcgac gtgtacatca 540

tggacttcaa gagcaacàgc gccgtggcct 600

acgccttcaa caacagcatc atccccgagg 660

gcgacgtgaa actggtggag aagagcttcg 720

tgagcgtgat cggcttcaga atcctgctgc 780

ccctgcggct gtggagcagc taaacgcgt 839

<210> 32

<211> 272

<212> PRT

<213> - Homo sapiens

<400> 32

Met Met Lys Ser Leu Arg Val Leu Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu1 5 10 15

Ser Trp Val Trp Ser Gln Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro20 25 30

Leu Ser Val Pro Glu Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser35 40 45

Asp Arg Gly Ser Gln Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly LysSer Pro Glu Leu Ile65

Gly Arg Phe Thr Ala85

Leu Ile Arg Asp Ser100

Val Asn Val Ala Gly115

Val Lys Pro Asn Ile130

Asp.Ser Lys Ser Ser145

Ser Gln Thr Asn Val165

Asp Lys Thr Val Leu180

Ala Val Ala Trp Ser195

Asn Asn Ser Ile Ile210

55

Met Phe Ile Tyr Ser70

Gln Leu Asn Lys Ala90

Gln Pro Ser Asp Ser105

Lys Ser Thr Phe Gly120

Gln Asn Pro Asp Pro135

Asp Lys Ser Val Cys Leu150 155

Ser Gln Ser Lys Asp Ser170

Asp Met Arg Ser Met Asp185

Asn Lys Ser Asp Phe Ala200

Pro Glu Asp Thr Phe Phe215

60

Asn Gly Asp Lys Glu Asp75 80

Ser Gln Tyr Val Ser Leu95

Ala Thr Tyr Leu Cys Ala110

Asp Gly Thr Thr Leu Thr125

Ala Val Tyr Gln Leu Arg140

Phe Thr Asp Phe Asp160

Asp Val Tyr Ile Thr175

Phe Lys Ser Asn Ser190

Cys Ala Asn Ala Phe205

Pro Ser Pro Glu Ser220Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn225 230 235 240

Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu245 250 255

Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser260 265 270

<210> 33<211> 839<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Codificação de DNA em toda a extensão de um códon otimizado de alta

afinidade em uma cadeia-alfa Mel TCR<400> 33

ctcgagccgc caccatgatg aagagcctgc gggtgctgct ggtgatcctg tggctgcagc 60

tgagctgggt gtggagccag cagaaggagg tggagcagaa cagcggcccc ctgagcgtgc 120ccgagggcgc catcgccagc ctgaactgca cctacagcga ccggggcagc cagagcttct 180tctggtatcg gcagtacagc ggcaagagcc ccgagctgat tatgttcatc tacagcaacg 240gcgacaagga ggacggccgg ttcaccgccc agctgaacaa ggccagccag tatgtgagcc 300tgctgatccg ggacagccag cccagcgaca gcgccaccta cctgtgcgcc gtgaacgacg 360gcggcagact gaccttcggc gacggcacca ccctgaccgt gaagcccaac atccagaacc 420ccgaccccgc cgtgtaccag ctgcgggaca gcaagagcag cgacaagtct gtgtgcctgt 480tcaccgactt cgacagccag accaatgtga gccagagcaa ggacagcgac gtgtacatca 540ccgacaagac cgtgctggac atgcggagca tggacttcaa gagcaacagc gccgtggcct 600ggagcaacaa gagcgacttc gcctgcgcca acgccttcaa caacagcatc atccccgagg 660acaccttttt ccccagcccc gagagcagct gcgacgtgaa actggtggag aagagcttcg 720agaccgacac caacctgaac ttccagaacc tgagcgtgat cggcttcaga atcctgctgc 780tgaaagtggc tgggttcaac ctgctgatga ccctgcggct gtggagcagc taaacgcgt 839<210> 34<211> 272<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Extensão de um códon otimizado de alta afinidade em uma cadeia-alfa

Mel TCR<400> 34

Met Met Lys Ser Leu Arg Val Leu Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu1 5 10 15

Ser Trp Val Trp Ser Gln Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro20 25 30

Leu Ser Val Pro Glu Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser35 40 45

Asp Arg Gly Ser Gln Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys50 55 60

Ser Pro Glu Leu Ile Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp65 70 75 80

Gly Arg Phe Thr Ala Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu85 90 95

Leu Ile Arg Asp Ser Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala100 105 110

Val Asn Asp Gly Gly Arg Leu Thr Phe Gly Asp Gly Thr Thr Leu Thr115 120 125Val Lys Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg130 135 140

Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp145 150 155 160

Ser Gln Thr Asri Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr165 170 175

Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser180 185 190

Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe195 200 205

Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser210 215 220

Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn225 230 235 240

Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu245 250 255

Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser260 265 270

<210> 35<211> 839<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220><223> Codificação de DNA em toda a extensão de um códon otimizado WT sem

uma cadeia-alfa MEL TCR<400> 35

ctcgagccgc caccatgatg aagagcctgc gggtgctgct ggtgatcctg tggctgcagc 60

tgagctgggt gtggagccag cagaaggagg tggagcagaa cagcggcccc ctgagcgtgc 120

ccgagggcgc catcgccagc ctgaactgca cctacagcga ccggggcagc cagagcttct 180

tctggtatcg gcagtacagc ggcaagagcc ccgagctgat tatgttcatc tacagcaacg 240

gcgacaagga ggacggccgg ttcaccgccc agctgaacaa ggccagccag tatgtgagcc 300

tgctgatccg ggacagccag cccagcgaca gcgccaccta cctgtgcgcc gtgaacgacg 360

gcggcagaag caccttcggc gacggcacca ccctgaccgt gaagcccaac atccagaacc 420

ccgaccccgc cgtgtaccag ctgcgggaca gcaagagcag cgacaagtct gtgtgcctgt 480

tcaccgactt cgacagccag accaatgtga gccagagcaa ggacagcgac gtgtacatca 540

ccgacaagac cgtgctggac atgcggagca tggacttcaa gagcaacagc gccgtggcct 600

ggagcaacaa gagcgacttc gcctgcgcca acgccttcaa caacagcatc atccccgagg 660

acaccttttt ccccagcccc gagagcagct gcgacgtgaa actggtggag aagagcttcg 720

agaccgacac caacctgaac ttccagaacc tgagcgtgat cggcttcaga atcctgctgc 780

tgaaagtggc tgggttcaac ctgctgatga ccctgcggct gtggagcagc taaacgcgt 839

<210> 36

<211> 272

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Cadeia-alfa MEL· TCR com a Ita afinidade em toda extensão

<400> 36

Met Met Lys Ser Leu Arg Val Leu Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu1 5 .10 15

Ser Trp Val Trp Ser Gln Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro20 25 30

Leu Ser Val Pro Glu Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser35 40 45

Asp Arg Gly Ser Gln Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys50 55 60

Ser Pro Glu Leu Ile Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp65 70 75 80

Gly Arg Phe Thr Ala Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu85 90 95

Leu Ile Arg Asp Ser Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala100 105 110

Val Asn Asp Gly Gly Arg Ser Thr Phe Gly Asp Gly Thr Thr Leu Thr115 120 125

Val Lys Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg130 135 140

Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp145 150 155 160

Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr165 170 175

Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser180 185 190

Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe195 200 205Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser210 215 220

Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn225 230 235 240

Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu245 250 255

Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser260 265 270

<210> 37<211> 839<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Codificação de DNA em toda a extensão de um códon otimizado de alta

afinidade em uma cadeia-alfa MEL TCR<400> 37

ctcgagccgc caccatgatg aagagcctgc gggtgctgct ggtgatcctg tggctgcagctgagctgggt gtggagccag cagaaggagg tggagcagaa cagcggcccc ctgagcgtgcccgagggcgc catcgccagc ctgaactgca cctacagcga ccggggcagc cagagcttcttctggtatcg gcagtacagc ggcaagagcc ccgagctgat tatgttcatc tacagcaacggcgacaagga ggacggccgg ttcaccgccc agctgaacaa ggccagccag tatgtgagcctgctgatccg ggacagccag cccagcgaca gcgccaccta cctgtgcgcc gtgaacgtgggcctgatcct gctgttcggc gacggcacca ccctgaccgt gaagcccaac atccagaaccccgaccccgc cgtgtaccag ctgcgggaca gcaagagcag cgacaagtct gtgtgcctgttcaccgactt cgacagccag accaatgtga gccagagcaa ggacagcgac gtgtacatcaccgacaagac cgtgctggac atgcggagca tggacttcaa gagcaacagc gccgtggcctggagcaacaa gagcgacttc gcctgcgcca acgccttcaa caacagcatc atccccgaggacaccttttt ccccagcccc gagagcagct gcgacgtgaa actggtggag aagagcttcg

60120180240300360420480540600660720agaccgacac caacctgaac ttccagaacc tgagcgtgat cggcttcaga atcctgctgc 780tgaaagtggc tgggttcaac ctgctgatga ccctgcggct gtggagcagc taaacgcgt 839

<210> 38

<211> 272

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Cadeia-alfa MEL· TCR com alta afinidade em toda extensão

<400> 38

Met Met Lys Ser Leu Arg Val Leu Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu1 5 10 15

Ser Trp Val Trp Ser Gln Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro20 25 30

Leu Ser Val Pro Glu Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser35 40 .45

Asp Arg Gly Ser Gln Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys50 .55 60

Ser Pro Glu Leu Ile Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp65 70 75 80

Gly Arg Phe Thr Ala Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu85 90 95

Leu Ile Arg Asp Ser Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala100 105 110

Val Asn Val Gly Leu Ile Leu Leu Phe Gly Asp Gly Thr Thr Leu Thr115 120 125

Val Lys Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg130 135 140

Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp145 150 155 160

Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr165 170 175

Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser180 185 190

Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala-Phe195 200 205

Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser210 215 220

Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn225 230 235 240

Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu245 250 255

Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser260 265 270

<210> 39<211> 956<212> DNA<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Codificação de DNA em toda a extensão de um códon otimizado WT semuma cadeia-alfa MEL TCR<400> 39

ggatccgccg ccaccatgct gtgcagcctg ctggccctgc tgctgggcac cttcttcgga 60

gtgcggagcc agaccatcca ccagtggccc gccacactgg tgcagcctgt gggcagcccc 120

ctgagcctgg agtgcaccgt ggagggcacc agcaacccca acctgtactg g.tatcggcag 180

gccgcaggga gggggctgca gctgctgttc tactctgtgg gcatcggcca gatcagcagc 240

gaggtgcccc agaacctgag cgcctccagg ccccaggacc ggcagttcat cctgagcagc 300

aagaagctgc tgctgagcga cagcggcttc tacctgtgcg cctggagcga gaccggcctg 3 60

ggcaccggcg agctgttctt cggcgagggc tccaggctga ccgtgctgga ggacctgaag 420

aacgtgttcc cccccgaggt ggccgtgttc gagcccagcg aggccgagat cagccacacc 480

cagaaggcta ccctggtgtg tctggccacc ggcttctacc ccgaccacgt ggagctgtcc 540

tggtgggtga acggcaagga ggtgcacagc ggcgtgtcta ccgaccccca gcccctgaag 600

gagcagcccg ccctgaacga cagccggtac tgcctgtcct ccagactgag agtgagcgcc 660

accttctggc agaacccccg gaaccacttc cggtgccagg tgcagttcta cggcctgagc 720

gagaacgacg agtggaccca ggaccgggcc aagcccgtga cccagattgt gagcgccgag 780

gcctggggca gagccgactg cggcttcacc agcgagagct accagcaggg cgtgctgagc 840

gccaccatcc tgtacgagat cctgctgggc aaggccaccc tgtacgccgt gctggtgtct 900

gccctggtgc tgatggctat ggtgaagcgg aaggacagcc ggggctaagc ggccgc 956

<210> 40<211> 310<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Toda extensão WT da cadeia-beta MEL TCR<400> 40

Met Leu Cys Ser Leu Leu Ala Leu Leu Leu Gly Thr Phe Phe Gly Val15 10 15Arg Ser Gln Thr Ile His Gln Trp Pro Ala Thr Leu Val Gln Pro Val20 25 30

Gly Ser Pro Leu Ser Leu Glu Cys Thr Val Glu Gly Thr Ser Asn Pro35 40 45

Asn Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Arg Gly Leu Gln Leu Leu50 55 60

Phe Tyr Ser Val Gly Ile Gly Gln Ile Ser Ser Glu Val Pro Gln Asn65 70 75 80

Leu Ser Ala Ser Arg Pro Gln Asp Arg Gln Phe Ile Leu Ser Ser Lys85 90 95

Lys Leu Leu Leu Ser Asp Ser Gly Phe Tyr Leu Cys Ala Trp Ser Glu100 105 110

Thr Gly Leu Gly Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu115 120 125

Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val130 135 140

Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu145 150 155 160

Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp165 170 175

Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln180 185 190Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser195 200 205

Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His210 215 220

Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp225 230 235 240

Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala245 250 255

Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly260 265 270

Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr275 280 285

Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys290 295 300

Arg Lys Asp Ser Arg Gly305 310

<210> 41

<211> 30

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Pequena ligação scTCR

<400> 41Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Pro20 25 30

<210> 42<211> 35<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Longa ligação scTCR<400> 42

Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly20 25 30

Gly Gly Pro35

<210> 43

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 43

Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val15

<210> 44<211> 816<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 44

atgatgaaat ccttgagagt tttactagtg atcctgtggc ttcagttgag ctgggtttgg 60

agccaacaga aggaggtgga gcagaattct ggacccctca gtgttccaga gggagccatt 120

gcctctctca actgcactta cagtgaccga ggttcccagt ccttcttctg gtacagacaa 180

tattctggga aaagccctga gttgataatg ttcatatact ccaatggtga caaagaagat 240

ggaaggttta cagcacagct caataaagcc agccagtatg tttctctgct catcagagac 300

tcccagccca gtgattcagc cacctacctc tgtgccgtga acgttgcagg caaatcaacc 360

tttggggatg ggactacgct cactgtgaag ccaaatatcc agaaccctga ccctgccgtg 420

taccagctga gagactctaa atccagtgac aagtctgtct gcctattcac cgattttgat 480

tctcaaacaa atgtgtcaca aagtaaggat tctgatgtgt atatcacaga caaaactgtg 540

ctagacatga ggtctatgga cttcaagagc aacagtgctg tggcctggag caacaaatct 600

gactttgcat gtgcaaacgc cttcaacaac agcattattc cagaagacac cttcttcccc 660

agcccagaaa gttcctgtga tgtcaagctg gtcgagaaaa gctttgaaac agatacgaac 720

ctaaactttc aaaacctgtc agtgattggg ttccgaatcc tcctcctgaa agtggccggg 780

tttaatctgc tcatgacgct gcggctgtgg tccagc 816

<210> 45

<211> 930

<212> DNA

<213> . Homo sapiens

<400> 45

atgctctgct ctctccttgc ccttctcctg ggcactttct ttggggtcag atctcagact 60

attcatcaat ggccagcgac cctggtgcag cctgtgggca gcccgctctc tctggagtgc 120

actgtggagg gaacatcaaa ccccaaccta tactggtacc gacaggctgc aggcaggggc 180

ctccagctgc tcttctactc cgttggtatt ggccagatca gctctgaggt gccccagaat 240

ctctcagcct ccagacccca ggaccggcag ttcatcctga gttctaagaa gctcctcctc 300

agtgactctg gcttctatct ctgtgcctgg tccgagacag ggttaggcac cggggagctg 3 60

ttttttggag aaggctctag gctgaccgta ctggaggacc tgaaaaacgt gttcccaccc 420

gaggtcgctg tgtttgagcc atcagaagca gagatctccc acacccaaaa ggccacactg 480

gtgtgcctgg ccacaggctt ctaccccgac cacgtggagc tgagctggtg ggtgaatggg 540aaggaggtgc acagtggggt cagcacagac ccgcagcccc tcaaggagca gcccgccctc 600

aatgactcca gatactgcct gagcagccgc ctgagggtct cggccacctt ctggcagaac 660

ccccgcaacc acttccgctg tcaagtccag ttctacgggc tctcggagaa tgacgagtgg 720

acccaggata gggccaaacc tgtcacccag atcgtcagcg ccgaggcctg gggtagagca 780

gactgtggct tcacctccga gtcttaccag caaggggtcc tgtctgccac catcctctat 840

gagatcttgc tagggaaggc caccttgtat gccgtgctgg tcagtgccct cgtgctgatg 900

gccatggtca agagaaagga ttccagaggc 930

<210> 46<211> 816<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> ORF cadeia-alfa MEL· TCR Codificando um DNA de alta afinidade<400> 46

atgatgaaat ccttgagagt tttactagtg atcctgtggc ttcagttgag ctgggtttgg 60

agccaacaga aggaggtgga gcagaattct ggacccctca gtgttccaga gggagccatt 120

gcctctctca actgcactta cagtgaccga ggttcccagt ccttcttctg gtacagacaa 180

tattctggga aaagccctga gttgataatg ttcatatact ccaatggtga caaagaagat 240

ggaaggttta cagcacagct caataaagcc agccagtatg tttctctgct catcagagac 300

tcccagccca gtgattcagc cacctacctc tgtgccgtga acgatggggg tcgtcttacc 360

tttggggatg ggactacgct cactgtgaag ccaaatatcc agaaccctga ccctgccgtg 420

taccagctga gagactctaa atccagtgac aagtctgtct gcctattcac cgattttgat 480

tctcaaacaa atgtgtcaca aagtaaggat tctgatgtgt atatcacaga caaaactgtg 540

ctagacatga ggtctatgga cttcaagagc aacagtgctg tggcctggag caacaaatct 600

gactttgcat gtgcaaacgc cttcaacaac agcattattc cagaagacac cttcttcccc 660

agcccagaaa gttcctgtga tgtcaagctg gtcgagaaaa gctttgaaac agatacgaac 720

ctaaactttc aaaacctgtc agtgattggg ttccgaatcc tcctcctgaa agtggccggg 780

tttaatctgc tcatgacgct gcggctgtgg tccagc 816

<210> 47<211> 110<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Domínio variável de cadeia-alfa Mel TCR de alta-afinidade

<400> 47

Met Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu

1 5 10 15

Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Phe Gln Gly Ser Gln20 25 30

Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile35 40 45

Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala50 55 60

Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser65 70 75 80

Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Val Ala Gly85 90 95

Lys Ser Thr Phe Gly Asp Gly Thr Thr Leu Thr Val Lys Pro100 105 110

<210> 48<211> 110<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Domínio variável de cadeia-alfa Mel TCR de alta-afinidade<400> 48

Met Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu1 5 10 15

Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Phe Leu Gly Ser Gln20 25 30

Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile35 40 45

Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala50 55 60

Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser65 70 75 80

Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Val Ala Gly85 90 95

Lys Ser Thr Phe Gly Asp Gly Thr Thr Leu Thr Val Lys Pro100 105 110

<210> 49<211> 110<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Domínio variável de cadeia-alfa Mel TCR de alta-afinidade<400> 49

Met Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu1 5 10 15Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Tyr Gln Gly Ala Gln20 25 30

Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile35 40 45

Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala50 55 60

Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser65 70 75 80

Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Val Ala Gly85 90 95

Lys Ser Thr Phe Gly Asp Gly Thr Thr Leu Thr Val Lys Pro100 105 110

<210> 50<211> 110<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Domínio variável de cadeia-alfa Mel TCR de alta-afinidade<400> 50

Met Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu1 5 10 15

Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Ser Ile His Ala Gln20 25 30

Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile35 40 45

Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala50 55 60

Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser65 70 75 80

Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Val Ala Gly85 90 95

Lys Ser Thr Phe Gly Asp Gly Thr Thr Leu Thr Val Lys Pro100 105 110

<210> 51<211> 110<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Domínio variável de cadeia-alfa Mel TCR de alta-afinidade<400> 51

Met Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu1 5 10 15

Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asn Leu Gly Ser Gln20 25 30

Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile35 40 45

Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala50 55 60Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser65 70 75 80

Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Val Ala Gly85 90 95

Lys Ser Thr Phe Gly Asp Gly Thr Thr Leu Thr Val Lys Pro100 105 110

<210> 52<211> 110<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Domínio variável de cadeia-alfa Mel TCR de alta-afinidade<400> 52

Met Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu1 5 10 15

Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Phe Gly Ala Gln20 25 30

Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile35 40 45

Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala50 55 60

Lys Ser Thr Phe Gly Asp Gly Thr Thr Leu Thr Val Lys Pro100 105 110

<210> 53<211> 110<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Domínio variável de cadeia-alfa Mel TCR de alta-afinidade<400> 53

Met Gln Lys Glu Vai. Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu15 10 15

Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln20 25 30

Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile35 40 45

Met Phe Thr Tyr Arg Glu Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala50 55 60

Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln His Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser65 70 75 80

Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Val Ala Gly85 90 95

Lys Ser Thr Phe Gly Asp Gly Thr Thr Leu Thr Val Lys Pro100 105 110

<210> 54<211> 115<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Domínio variável de cadeia-beta MEL TCR de alta-afinidade<400> 54

Met Ser Gln Thr Ile His Gln Trp Pro Ala Thr Leu Val Gln Pro Val15 10 15

Gly Ser Pro Leu Ser Leu Glu Cys Thr Val Glu Gly Thr Ser Asn Pro20 25 30

Asn Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Arg Gly Pro Gln Leu Leu35 40 45

Phe Tyr Tyr Gly Pro Phe Gly Gln Ile Ser Ser GlU Val Pro Gln Asn50 55 60

Leu Ser Ala Ser Arg Pro Gln Asp Arg Gln Phe Ile Leu Ser Ser Lys65 70 75 80

Lys Leu Leu Leu Ser Asp Ser Gly Phe Tyr Leu Cys Ala Trp Ser Glu85 90 95

Thr Gly Leu Gly Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu100 105 110

Thr Val Leu115<210> 55<211> 115

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Domínio variável de cadeia-beta MEL TCR de alta-afinidade

<400> 55

Met Ser Gln Thr Ile His Gln Trp Pro Ala Thr Leu Val Gln Pro Val1 5 10 15

Gly Ser Pro Leu Ser Leu Glu Cys Thr Val Glu Gly Thr Ser Asn Pro20 25 30

Asn Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Arg Gly Pro Gln Leu Leu35 40 45

Phe Tyr Phe Gly Pro Phe Gly Gln Ile Ser Ser Glu Val Pro Gln Asn50 55 60

Leu Ser Ala Ser Arg Pro Gln Asp Arg Gln Phe Ile Leu Ser Ser Lys65 70 75 80

Lys Leu Leu Leu Ser Asp Ser Gly Phe Tyr Leu Cys Ala Trp Ser Glu85 90 95

Thr Gly Leu Gly Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu100 105 110

Thr Val Leu

115<210> 56<211> 115<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Domínio variável de cadeia-beta MEL TCR de alta-afinidade

<400> 56

Met Ser Gln Thr Ile His Gln Trp Pro Ala Thr Leu Val Gln Pro Val1 5 10 15

Gly Ser Pro Leu Ser Leu Glu Cys Thr Val Glu Gly Thr Ser Asn Pro20 25 30

Asn Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Arg Gly Pro Gln Leu Leu35 40 45

Phe Tyr Phe Gly Pro Tyr Gly Gln Ile Ser Ser Glu Ala Pro Gln Asn50 55 60

Leu Ser Ala Ser Arg Pro Gln Asp Arg Gln Phe Ile Leu Ser Ser Lys65 70 75 80

Lys Leu Leu Leu Ser Asp Ser Gly Phe Tyr Leu Cys Ala Trp Ser Glu85 90 95

Thr Gly Leu Gly Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu100 105 110

Thr Val Leu115

<210> 57<211> 115

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Domínio variável de cadeia-beta MEL TCR de alta-afinidade

<400> 57

Met Ser Gln Thr Ile His Gln Trp Pro Ala Thr Leu Val Gln Pro Val

1 5 10 15

Gly Ser Pro Leu Ser Leu Glu Cys Thr Val Glu Gly Thr Ser Asn Pro20 25 30

Asn Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Arg Gly Pro Gln Leu Leu35 40 45

Phe Tyr Trp Gly Pro Phe Gly Gln Ile Ser Ser Glu Val Pro Gln Asn50 55 60

Leu Ser Ala Ser Arg Pro Gln Asp Arg Gln Phe Ile Leu Ser Ser Lys65 70 75 80

Lys Leu Leu Leu Ser Asp Ser Gly Phe Tyr Leu Cys Ala Trp Ser Glu85 90 95

Thr Gly Leu Gly Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu100 105 110

Thr Val Leu115

<210> 58<211> 115

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Domínio variável de cadeia-beta MEL TCR de alta-afinidade

<400> 58

Met Ser Gln Thr Ile His Gln Trp Pro Ala Thr Leu Val Gln Pro Val

1 5 10 15

Gly Ser Pro Leu Ser Leu Glu Cys Thr Val Glu Gly Thr Ser Asn Pro20 25 30

Asn Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Arg Gly Leu Gln Leu Leu35 40 45

Phe Tyr Ser Val Gly Ile Gly Gln Ile Ser Ser Glu Val Pro Gln Asn50 55 60

Leu Ser Ala Ser Arg Pro Gln Asp Arg Gln Phe Ile Leu Ser Ser Lys65 70 75 80

Lys Leu Leu Leu Ser Asp Ser Gly Phe Tyr Leu Cys Ala Trp Ser Glu85 90 95

Thr Gly Leu Gly Met Gly Gly Trp Gln Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu100 105 110

Thr Val Leu115

<210> 59<211> 115<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Domínio variável de cadeia-beta MEL TCR de alta-afinidade<400> 59

Met Ser Gln Thr Ile His Gln Trp Pro Ala Thr Leu Val Gln Pro Val1 5 10 15

Gly Ser Pro Leu Ser Leu Glu Cys Thr Val Glu Gly Thr Ser Asn Pro20 25 30

Asn Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Arg Gly Leu Gln Leu Leu35 40 45

Phe Tyr Ser Val Gly Ile Gly Gln Ile Ser Ser Glu Val Pro Gln Asn50 55 60

Leu Ser Ala Ser Arg Pro Gln Asp Arg Gln Phe Ile Leu Ser Ser Lys65 70 75 80

Lys Leu Leu Leu Ser Asp Ser Gly Phe Tyr Leu Cys Ala Trp Ser Glu85 90 95

Thr Gly Leu Gly Met Gly Gly Trp Ser Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu100 105 110

Thr Val Leu115

<210> 60

<211> 115

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Domínio variável de cadeia-beta MEL TCR de alta-afinidade<400> 60

Met Ser Gln Thr Ile His Gln Trp Pro Ala Thr Leu Val Gln Pro Val1 5 10 15

Gly Ser Pro Leu Ser Leu Glu Cys Thr Val Glu Gly Thr Ser Asn Pro20 25 30

Asn Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Arg Gly Leu Gln Leu Leu35 40 45

Phe Tyr Ser Val Gly Ile Gly Gln Ile Ser Ser Glu Val Pro Gln Asn50 55 60

Leu Ser Ala Ser Arg Pro Gln Asp Arg Gln Phe Ile Leu Ser Ser Lys65 70 75 80

Lys Leu Leu Leu Ser Asp Ser Gly Phe Tyr Leu Cys Ala Trp Ser Glu85 90 95

Thr Gly Leu Gly Met Gly Gly Trp Ala Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu100 105 110

Thr Val Leu115

<210> 61

<211> 115

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220><223> Domínio variável de cadeia-beta MEL TCR de alta-afinidade<400> 61

Met Ser Gln Thr Ile His Gln Trp Pro Ala Thr Leu Val Gln Pro Val1 5 10 15

Gly Ser Pro Leu Ser Leu Glu Cys Thr Val Glu Gly Thr Ser Asn Pro20 25 30

Asn Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Arg Gly Leu Gln Leu Leu35 40 45.

Phe Tyr Ser Val Gly Ile Gly Gln Ile Ser Ser Glu Val Pro Gln Asn50 55 60

Ser Arg Pro Gln Asp Arg Gln Phe Ile Leu Ser Ser Lys70 75 80

Lys Leu Leu Leu Ser Asp Ser Gly Phe Tyr Leu Cys Ala Trp Ser Glu85 90 95

Thr Gly Leu Gly Val Gly Gly Trp Asp Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu100 105 110

Thr Val Leu115

<210> 62

<211> 115

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Domínio variável de cadeia-beta MEL TCR de alta-afinidade

Leu Ser Ala65<400> 62

Met Ser Gln Thr Ile His Gln Trp Pro Ala Thr Leu Val Gln Pro Val1 5 10 15

Gly Ser Pro Leu Ser Leu Glu Cys Thr Val Glu Gly Thr Ser Asn Pro20 25 30

Asn Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Arg Gly Leu Gln Leu Leu35 40 45

Phe Tyr Ser Val Gly Ile Gly Gln Ile Ser Ser Glu Val Pro Gln Asn50 55 60

Leu Ser Ala Ser Arg Pro Gln Asp Arg Gln Phe Ile Leu Ser Ser Lys65 70 75 80

Lys Leu Leu Leu Ser Asp Ser Gly Phe Tyr Leu Cys Ala Trp Ser Glu85 90 95

Thr Gly Leu Gly Val Gly Gly Trp Glu Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu100 105 110

Thr Val Leu115

<210> 63

<211> 115

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Domínio variável de cadeia-beta MEL TCR de alta-afinidade

<400> 63Met Ser Gln Thr Ile His Gln Trp Pro Ala Thr Leu Val Gln Pro Val1 5 10 15

Gly Ser Pro Leu Ser Leu Glu Cys Thr Val Glu Gly Thr Ser Asn Pro20 25 30

Asn Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Arg Gly Leu Gln Leu Leu35 40 45

Phe Tyr Ser Val Gly Ile Gly Gln Ile Ser Ser Glu Val Pro Gln Asn50 55 60

Leu Ser Ala Ser Arg Pro Gln Asp Arg Gln Phe Val Leu Ser Ser Lys65 70 75 80

Lys Leu Leu Leu Ser Asp Ser Gly Phe Tyr Leu Cys Ala Trp Ser Glu85 90 95

Thr Gly Leu Asn Thr Ser Gly Trp Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu100 105 110

Thr Val Leu115

<210> 64

<211> 115

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Domínio variável de cadeia-beta MEL TCR de alta-afinidade

<400> 64

Met Ser Gln Thr Ile His Gln Trp Pro Ala Thr Leu Val Gln Pro Val1 5 10 15

Gly Ser Pro Leu Ser Leu Glu Cys Thr Val Glu Gly Thr Ser Asn Pro20 25 30

Asn Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Arg Gly Leu Gln Leu Leu35 40 45

Phe Tyr Ser Val Gly Ile Gly Gln Ile Ser Ser Glu Val Pro Gln Asn50 55 60

Leu Ser Ala Ser Arg Pro Gln Asp Arg Gln Phe Ile Leu Ser Ser Lys65 70 75 80

Lys Leu Leu Leu Ser Asp Ser Gly Phe Tyr Leu Cys Ala Trp Ser Glu85 90 95

Thr Gly Leu Asn Thr Asn Gly Trp Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu100 105 110

Thr Val Leu115

<210> 65

<211> 115

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Domínio variável de cadeia-beta MEL TCR de alta-afinidade

<400> 65

Met Ser Gln Thr Ile His Gln Trp Pro Ala Thr Leu Val Gln Pro Val1 5 10 15Gly Ser Pro Leu Ser Leu Glu Cys Thr Val Glu Gly Thr Ser Asn Pro20 25 30

Asn Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Arg Gly Leu Gln Leu Leu35 40 45

Phe Tyr Ser Val Gly Ile Gly Gln Ile Ser Ser Glu Val Pro Gln Asn50 55 60

Leu Ser Ala Ser Arg Pro Gln Asp Arg Gln Phe Ile Leu Ser Ser Lys65 70 75 80

Lys Leu Leu Leu Ser Asp Ser Gly Phe Tyr Leu Cys Ala Trp Ser Glu85 90 95

Thr Gly Leu Asn Leu Gly Gly Trp Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu100 105 110

Thr Val Leu115

<210> 66

<211> 115

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Domínio variável de cadeia-beta MEL TCR de alta-afinidade

<400> 66

Met Ser Gln Thr Ile His Gln Trp Pro Ala Thr Leu Val Gln Pro Val1 5 10 15Gly Ser Pro Leu Ser Leu Glu Cys20

Asn Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala35 40

Thr Val Glu Gly Thr Ser Asn Pro25 30

Ala Gly Arg Gly Leu Gln Leu Leu45

Phe Tyr Ser Val Gly Ile Gly Gln Ile Ser Ser Glu Val Pro Gln Asn50 55 60

Leu Ser Ala Ser Arg Pro Gln Asp Arg Gln Phe Ile Leu Ser Ser Lys65 70 75 80

Lys Leu Leu Leu Ser Asp Ser Gly Phe Tyr Leu Cys Ala Trp Ser Glu85 90 95

Thr Gly Leu Asn Val Ser Gly Trp Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu100 105 110

Thr Val Leu115

<210> 67

<211> 115

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Domínio variável de cadeia-beta MEL TCR de alta-afinidade

<400> 67

Met Ser Gln Thr Ile His Gln Trp Pro Ala Thr Leu Val Gln Pro Val1 5 10 15

Gly Ser Pro Leu Ser Leu Glu Cys Thr Val Glu Gly Thr Ser Asn Pro20 25 30

Asn Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Arg Gly Leu Gln Leu Leu35 40 45

Phe Tyr Ser Val Gly Ile Gly Gln Ile Ser Ser Glu Val Pro Gln Asn50 55 60

Leu Ser Ala Ser Arg Pro Gln Asp Arg Gln Phe Ile Leu Ser Ser Lys65 70 75 80

Lys Leu Leu Leu Ser Asp Ser Gly Phe Tyr Leu Cys Ala Trp Ser Glu85 90 95

Thr Gly Leu Asn Thr Thr Gly Trp Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu100 105 110

Thr Val Leu115

<210> 68<211> 204<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Cadeia-alfa Mel TCR solúvel de alta afinidade incluindo um resíduo

CYS apresentado<400> 68

Met Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu1 5 10 15

Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Phe Gln Gly Ser Gln20 25 30

Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile35 40 45

Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala50 55 60

Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser65 70 75 80

Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Val Ala Gly85 90 95

Lys Ser Thr Phe Gly Asp Gly Thr Thr Leu Thr Val Lys Pro Asn Ile100 105 110

Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser115 120 125

Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val130 135 140

Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu145 150 155 160

Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser165 170 175

Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile180 185 190Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser195 200

<210> 69<211> 204<212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Cadeia-alfa Mel TCR solúvel de alta afinidade incluindo um resíduo

CYS apresentado<400> 69

Met Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu1 5 10 15

Gly Ala.Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Phe Leu Gly Ser Gln20 25 30

Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile35 40 45

Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala50 55 60

Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser65 70 75 80

Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Val Ala Gly85 90 95

Lys Ser Thr Phe Gly Asp Gly Thr Thr Leu Thr Val Lys Pro Asn Ile100 105 110Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser115 120 125

Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val130 135 140

Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu145 150 155 160

Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser165 170 175

Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile180 185 190

Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser195 200

<210> 70<211> 204<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Cadeia-alfa Mel TCR solúvel de alta afinidade incluindo um resíduo

CYS apresentado<400> 70

Met Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu15 10 15

Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln

20

25

30Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile35 40 45

Met Phe Thr Tyr Arg Glu Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala50 55 60

Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln His Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser65 70 75 80.

Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Val Ala Gly85 90 95

Lys Ser Thr Phe Gly Asp Gly Thr Thr Leu Thr Val Lys Pro Asn Ile100 105 110

Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser115 120 125

Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val130 135 140

Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu145 150 155 160

Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser165 170 175

Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile180 185 190

Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser

195

200<210> 71<211> 245<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Cadeia-beta Mel TCR solúvel de alta afinidade incluindo um resíduo

CYS apresentado<400> 71

Met Ser Gln Thr Ile His Gln Trp Pro Ala Thr Leu Val Gln Pro Val1 5 10 15

Gly Ser Pro Leu Ser Leu Glu Cys Thr Val Glu Gly Thr Ser Asn Pro20 25 30

Asn Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Arg Gly Pro Gln Leu Leu35 40 45

Phe Tyr Tyr Gly Pro Phe Gly Gln Ile Ser Ser Glu Val Pro Gln Asn50 55 60

Leu Ser Ala Ser Arg Pro Gln Asp Arg Gln Phe Ile Leu Ser Ser Lys65 70 75 80

Lys Leu Leu Leu Ser Asp Ser Gly Phe Tyr Leu Cys Ala Trp Ser Glu85 90 95

Thr Gly Leu Gly Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu100 105 110

Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val115 120 125Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu130 135 140

Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp145 150 155 160

Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln165 170 175

Pro Leü Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser180 185 190

Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg Asn His195 200 205

Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp210 215 220

Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala225 230 235 240

Trp Gly Arg Ala Asp245

<210> 72<211> 245<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Cadeia-beta Mel TCR solúvel de alta afinidade incluindo um resíduoCYS apresentado<400> 72

Met Ser Gln Thr Ile His Gln Trp Pro Ala Thr Leu Val Gln Pro Val1 5 10 15

Gly Ser Pro Leu Ser Leu Glu Cys Thr Val Glu Gly Thr Ser Asn Pro20 25 30

Asn Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Arg Gly Pro Gln Leu Leu35 40 45

Phe Tyr Phe Gly Pro Phe Gly Gln Ile Ser Ser Glu Val Pro Gln Asn50 55 60

Leu Ser Ala Ser Arg Pro Gln Asp Arg Gln Phe Ile Leu Ser Ser Lys65 70 75 80

Lys Leu Leu Leu Ser Asp Ser Gly Phe Tyr Leu Cys Ala Trp Ser Glu85 90 95

Thr Gly Leu Gly Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu100 105 110

Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val115 120 125

Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu130 135 140

Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp145 150 155 160

Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln165 170 175

Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser180 185 190

Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg Asn His195 200 205

Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp210 215 220

Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala225 230 235 240

Trp Gly Arg Ala Asp245

<210> 73<211> 245<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Cadeia-beta Mel TCR solúvel de alta afinidade incluindo um resíduo

CYS apresentado<400> 73

Met Ser Gln Thr Ile His Gln Trp Pro Ala Thr Leu Val Gln Pro Val1 5 10 15

Gly Ser Pro Leu Ser Leu Glu Cys Thr Val Glu Gly Thr Ser Asn Pro20 25 30

Asn Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Arg Gly Pro Gln Leu Leu35 40 45

Phe Tyr Phe Gly Pro Tyr Gly Gln Ile Ser Ser Glu Ala Pro Gln Asn50 55 60

Leu Ser Ala Ser Arg Pro Gln Asp Arg Gln Phe Ile Leu Ser Ser Lys65 70 75 80

Lys Leu Leu Leu Ser Asp Ser Gly Phe Tyr Leu Cys Ala Trp Ser Glu85 90 95

Thr Gly Leu Gly Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu100 105 110

Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val115 120 125

Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu130 135 140

Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp145 150 155 160

Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln165 170 175

Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser180 185 190

Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg Asn His195 200 205Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp210 215 220

Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala225 230 235 240

Trp Gly Arg Ala Asp245

<210> 74<211> 245<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Cadeia-beta Mel TCR solúvel de alta afinidade incluindo iam resíduo

CYS apresentado<400> 74

Met Ser Gln Thr Ile His Gln Trp Pro Ala Thr Leu Val Gln Pro Val1 5 10 15

Gly Ser Pro Leu Ser Leu Glu Cys Thr Val Glu Gly Thr Ser Asn Pro20 25 30

Asn Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Arg Gly Pro Gln Leu Leu35 40 45

Phe Tyr Trp Gly Pro Phe Gly Gln Ile Ser Ser Glu Val Pro Gln Asn50 55 60

Leu Ser Ala Ser Arg Pro Gln Asp Arg Gln Phe Ile Leu Ser Ser Lys

65 70 75 80Lys Leu Leu Leu Ser Asp Ser Gly Phe Tyr Leu Cys Ala Trp Ser Glu85 90 95

Thr Gly Leu Gly Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu100 105 110

Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val115 120 125

Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu130 135 140

Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp145 150 155 160

Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln165 170 175

Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser180 185 190

Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg Asn His195 200 205

Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp210 215 220

Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala225 230 235 240

Trp Gly Arg Ala Asp245<210> 75<211> 245<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Cadeia-beta Mel TCR solúvel de alta afinidade incluindo um resíduo

CYS apresentado<400> 75

Met Ser Gln Thr Ile His Gln Trp Pro Ala Thr Leu Val Gln Pro Val1 5 10 15

Gly Ser Pro Leu Sér Leu Glu Cys Thr Val Glu Gly Thr Ser Asn Pro20 25 30

Asn Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Arg Gly Leu Gln Leu Leu35 40 45

Phe Tyr Ser Val Gly Ile Gly Gln Ile Ser Ser Glu Val Pro Gln Asn50 55 60

Leu Ser Ala Ser Arg Pro Gln Asp Arg Gln Phe Ile Leu Ser Ser Lys65 70 75 80

Lys Leu Leu Leu Ser Asp Ser Gly Phe Tyr Leu Cys Ala Trp Ser Glu85 90 95

Thr Gly Leu Gly Met Gly Gly Trp Gln Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu100 105 110

Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp145 150 155 160

Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln165 170 175

Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser180 185 190

Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg Asn His195 200 205

Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp210 215 220

Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala225 230 235 240

Trp Gly Arg Ala Asp245

<210> 76<211> 245<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223 Cadeia-beta Mel TCR solúvel de alta afinidade incluindo um resíduoCYS apresentado<400> 76

Met Ser Gln Thr Ile His Gln Trp Pro Ala Thr Leu Val Gln Pro Val1 5 10 15

Gly Ser Pro Leu Ser Leu Glu Cys Thr Val Glu Gly Thr Ser Asn Pro20 25 30

Asn Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Arg Gly Leu Gln Leu Leu35 40 45

Phe Tyr Ser Val Gly Ile Gly Gln Ile Ser Ser Glu Val Pro Gln Asn50 55 60

Leu Ser Ala Ser Arg Pro Gln Asp Arg Gln Phe Ile Leu Ser Ser Lys65 70 75 80

Lys Leu Leu Leu Ser Asp Ser Gly Phe Tyr Leu Cys Ala Trp Ser Glu85 90 95

Thr Gly Leu Gly Val Gly Gly Trp Glu Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu100 105 110

Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val115 120 125

Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu130 135 140

Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp145 150 155 160

Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln165 170 175

Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser180 185 190

Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg Asn His195 200 205

Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp210 215 220

Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala225 230 235 240

Trp Gly Arg Ala Asp245

<210> 77<211> 245<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Cadeia-beta Mel TCR solúvel de alta afinidade incluindo um resíduo

CYS apresentado<400> 77

Met Ser Gln Thr Ile His Gln Trp Pro Ala Thr Leu Val Gln Pro Val1 5 10 15

Gly Ser Pro Leu Ser Leu Glu Cys Thr Val Glu Gly Thr Ser Asn Pro20 25 30

Asn Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Arg Gly Leu Gln Leu Leu35 40 45

Phe Tyr Ser Val Gly Ile Gly Gln Ile Ser Ser Glu Val Pro Gln Asn50 55 60

Leu Ser Ala Ser Arg Pro Gln Asp Arg Gln Phe Ile Leu Ser Ser Lys65 70 75 80

Lys Leu Leu Leu Ser Asp Ser Gly Phe Tyr Leu Cys Ala Trp Ser Glu85 90 95

Thr Gly Leu Asn Leu Gly Gly Trp Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu100 105 110

Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Vai.115 120 125

Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu130 135 140

Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp145 150 155 160

Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln165 170 175

Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser180 185 190

Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala225 230 235 240

Trp Gly Arg Ala Asp245

<210> 78<211> 245<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Cadeia-beta Mel TCR solúvel de alta afinidade incluindo um resíduo

CYS apresentado<400> 78

Met Ser Gln Thr Ile His Gln Trp Pro Ala Thr Leu Val Gln Pro Val1 5 10 15

Gly Ser Pro Leu Ser Leu Glu Cys Thr Val Glu Gly Thr Ser Asn Pro20 25 30

Asn Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Arg Gly Leu Gln Leu Leu35 40 45

Phe Tyr Ser Val Gly Ile Gly Gln Ile Ser Ser Glu Val Pro Gln Asn50 55 60

Leu Ser Ala Ser Arg Pro Gln Asp Arg Gln Phe Ile Leu Ser Ser Lys65 70 75 80Lys Leu Leu Leu Ser Asp Ser Gly Phe Tyr Leu Cys Ala Trp Ser Glu85 90 95

Thr Gly Leu Asn Val Ser Gly Trp Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu100 105 110

Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro GlU Val Ala Val115 120 125

Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu130 135 140

Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp145 150 155 160

Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln165 170 175

Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser180 185 190

Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg Asn His195 200 205

Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp210 215 220

Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala225 230 235 240

Trp Gly Arg Ala Asp245

Claims

1. Receptor de células-T (TCR) com a propriedade de se ligar aAAGIGILTV-HLA-A*0201, caracterizado pelo fato de que compreende pelomenos um domínio variável da cadeia α do TCR tendo uma SEQ ID N0:1,exceto aquele de um ou mais aminoácidos 28D, 29R, 30G, 31S, 49M, 511,-53S, 54N, 72Y, 94V, 95A, 96G, 97K, 98S e 99T que é/são mutantes, e/oupelo menos um domínio variável da cadeia β do TCR tendo uma SEQ IDN°:2, exceto aquele de um ou mais aminoácidos 45L, 51S1 52V, 53G, 54I,-76I, reOG, 101T, 102G, 103E, 104L e 105F que é/são mutantes, em que oreferido TCR tem um K0 para o referido complexo AAGIGILTV-HLA-A*0201menor ou igual a 3 μΜ e/ou uma taxa de separação (k0ff) de 1 χ 103 S~1 oumais baixa.

2. TCR como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fatode que compreende uma ou mais mutações na região variável da cadeia-alfaselecionado entre 28D^F, 28D^Y, 28D^S, 28D^N, 29R-*Q, 29R^L,-29R—>1, 29R—>F, 30G->H, 31S->A, 49M->I, 51I->T, 53S^R, 54N^E,-72Y—H, 94V-+D, 94V^P, 94V^S1 94V^L, 94V->N, 95A~>G, 95A-»S',-95A—>E, 9G6^N, 96G^P, 96G^V, 96G^M, 96G-+L, 96G->R, 97K^R,-97K^Y, 97K—Λ/, 97K^L, 97K^H, 97K^G, 97K^I, 97K-+P, 98S^L,-98S—»M, 98S—>R, 99T^L ou 99T^R usando a numeração mostrada naSEQ ID N2 1.

3. TCR como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fatode que compreende uma ou mais mutações na região variável da cadeia-beta selecionado entre 45L-+P, 51S^Y, 51S^F, 51S-+W, 52V-^G,-53G—>P, 54I—»F, 54^Y, 7I6^V, 100G-^N, 101T->M, 101T->L, 101Τ-Λ/,-102G^S, 102G^N, 102G->T, 103E^G, 104L-+W, 105F^S, 105F^A,-105F->Q, 105F—>D, ou 105F—>E usando a numeração mostrada na SEQ IDNs 2.

4. TCR como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fatode que compreende uma das seqüências de aminoácidos da região variávelda cadeia-alfa das SEQ ID NoS: 11 a 24 ou 47 a 53.

5. TCR como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fatode que compreende uma das seqüências de aminoácidos da região variávelda cadeia-beta das SEQ ID NoS: 54 a 67.

6. TCR de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fatode que compreende os pares de regiões variáveis da cadeia-alfa e betamostrados na tabela a seguir:<table>table see original document page 133</column></row><table><table>table see original document page 134</column></row><table>

7. TCR como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fatode que compreende ainda a seqüência de aminoácidos da região constanteda cadeia-alfa mostrada na SEQ ID N2 25, e/ou uma das seqüências da re-gião constante de aminoácidos da cadeia-beta mostradas nas SEQ ID NoS:-26 e 27.

8. TCR solúvel, caracterizado pelo fato de que compreende aseqüência de aminoácidos da cadeia-alfa de SEQ ID N2 29 ou SEQ ID N2:-68 ou SEQ ID N2: 69 ou SEQ ID N2: 70, e a seqüência de aminoácidos dacadeia-beta de SEQ ID N2 10.

9. TCR solúvel, caracterizado pelo fato de que compreende aseqüência de aminoácidos da cadeia-alfa de SEQ ID N2 29 e a seqüência deaminoácidos da cadeia-beta de SEQ ID N2 71 ou SEQ ID N2: 72 ou SEQ IDN2: 73 ou SEQ ID N2: 74 ou SEQ ID N2: 75 ou SEQ ID N2: 76 ou SEQ ID N2:-77 ou SEQ ID N2: 78.<table>table see original document page 135</column></row><table>

10.

11.

12.

13.

14.

15. TCR de acordo com a reivindicação 3, compreendendo aregião variável da cadeia-alfa mostrada na SEQ ID N2 11 e a região variávelda cadeia-beta mostrada na SEQ ID Ns 2.

16. TCR de acordo com a reivindicação 3, compreendendo aregião variável da cadeia-alfa mostrada na SEQ ID N2 47 e a região variávelda cadeia-beta mostrada na SEQ ID N2 2.

17. TCR de acordo com a reivindicação 3, compreendendo aregião variável da cadeia-alfa mostrada na SEQ ID N2 48 e a região variávelda cadeia-beta mostrada na SEQ ID N2 2.

18. TCR de acordo com a reivindicação 3, compreendendo aregião variável da cadeia-alfa mostrada na SEQ ID N2 53 e a região variávelda cadeia-beta mostrada na SEQ ID N2 2.

19. TCR de acordo com a reivindicação 3, compreendendo aregião variável da cadeia-alfa mostrada na SEQ ID N2 11 e a região variávelda cadeia-beta mostrada na SEQ ID N2 54.

20. TCR de acordo com a reivindicação 3, compreendendo aregião variável da cadeia-alfa mostrada na SEQ ID N2 Hea região variávelda cadeia-beta mostrada na SEQ ID N2 55.

21. TCR de acordo com a reivindicação 3, compreendendo aregião variável da cadeia-alfa mostrada na SEQ ID N2 11 e a região variávelda cadeia-beta mostrada na SEQ ID N2 56.

22. TCR de acordo com a reivindicação 3, compreendendo aregião variável da cadeia-alfa mostrada na SEQ ID N2 11 e a região variávelda cadeia-beta mostrada na SEQ ID N2 57.

23. TCR de acordo com a reivindicação 3, compreendendo aregião variável da cadeia-alfa mostrada na SEQ ID N- 11 e a região variávelda cadeia-beta mostrada na SEQ ID N- 58.

24. TCR de acordo com a reivindicação 3, compreendendo aregião variável da cadeia-alfa mostrada na SEQ ID N2 11 e a região variávelda cadeia-beta mostrada na SEQ ID Ne 62.

25. TCR de acordo com a reivindicação 3, compreendendo aregião variável da cadeia-alfa mostrada na SEQ ID N- 11 e a região variávelda cadeia-beta mostrada na SEQ ID N- 65.

26. TCR de acordo com a reivindicação 3, compreendendo aregião variável da cadeia-alfa mostrada na SEQ ID N2 11 e a região variávelda cadeia-beta mostrada na SEQ ID N2 66.

27. TCR como definido em qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes compreendendo ainda a seqüência de aminoácidos da regiãoconstante da cadeia-alfa mostrada na SEQ ID N2 25, e/ou uma das seqüên-cias da região constante de aminoácidos da cadeia-beta mostradas nasSEQ ID NoS: 26 e 27.

28. TCR como definido em qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes que é um receptor de células-T dimérico (dTCR) ou um recep-tor de células-T da cadeia simples (scTCR).

29. TCR como definido em qualquer uma das reivindicações 5 a-28 que é um scTCR compreendendoum primeiro segmento constituído por uma seqüência de amino-ácidos correspondendo a uma região variável da cadeia α do TCRum segundo segmento constituído por uma seqüência de ami-noácidos correspondendo a uma seqüência da região variável da cadeia βdo TCR fundida ao terminal N de uma seqüência de aminoácidos corres-pondendo a uma seqüência extracelular do domínio constante da cadeia βdo TCR1 euma seqüência Iigadora ligando o terminal C do primeiro seg-mento ao terminal N do segundo segmento.

30. TCR de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 28que é um scTCR compreendendoum primeiro segmento constituído por uma seqüência de amino-ácidos correspondendo a uma região variável da cadeia β do TCRum segundo segmento constituído por uma seqüência de ami-noácidos correspondendo a uma seqüência da região variável da cadeia αdo TCR fundida ao terminal N de uma seqüência de aminoácidos corres-pondendo a uma seqüência extracelular do domínio constante da cadeia αdo TCR1 euma seqüência Iigadora ligando o terminal C do primeiro seg-mento ao terminal N do segundo segmento.

31. TCR de acordo com a reivindicação 29 ou 30, compreen-dendo ainda uma ligação dissulfeto entre a ligação entre as primeira e se-gunda cadeias, a referida ligação dissulfeto sendo uma ligação que nãopossui equivalentes nos receptores de células-T αβ nativos, e onde o com-primento da seqüência Iigadora e a posição da ligação dissulfeto são taisque as seqüências do domínio variável dos primeiro e segundo segmentossão mutuamente orientadas substancialmente da mesma maneira que nosreceptores de células-T αβ nativos.

32. scTCR como definido em qualquer uma das reivindicações-29 a 31, onde na parte de ligação a seqüência Iigadora liga o terminal C doprimeiro segmento ao terminal N do segundo segmento.

33. scTCR como definido em qualquer uma das reivindicações-29 a 32, onde na parte de ligação a seqüência Iigadora tem a fórmula -PGGG-(SGGGG)5-P- (SEQ ID N2 41) ou -PGGG-(SGGGG)6-P- (SEQ ID N2-42) onde P é prolina, G é glicina e S é serina.

34. TCR como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a-3 ou 5 a 28 que é um dTCR compreendendoum primeiro polipeptídio onde uma seqüência correspondendo auma seqüência da região variável da cadeia α do TCR é fundida ao terminalN de uma seqüência correspondendo a uma seqüência extracelular do do-mínio constante da cadeia a do TCR, eum segundo polipeptídio onde uma seqüência correspondendo auma seqüência da região variável da cadeia β do TCR fundida ao terminal Numa seqüência correspondendo a uma seqüência extracelular do domínioconstante da cadeia β do TCR, o primeiro e o segundo polipeptídios sendoligados por uma ligação dissulfeto que não tem equivalentes nos receptoresde células-T αβ nativos.

35. TCR de acordo com a reivindicação 34, onde a ligação dis-sulfeto liga resíduos de aminoácidos das referidas seqüências do domínioconstante, ligação dissulfeto esta que não tem equivalentes em TCRs nativos.

36. TCR de acordo com a reivindicação 35, onde a referida Iiga-ção dissulfeto está entre resíduos cisteína correspondentes a resíduos deaminoácidos cujos átomos de carbono β estão a menos de 0,6 nm de dis-tância nos TCRs nativos.

37. TCR de acordo com a reivindicação 35, onde a referida liga-ção dissulfeto está entre resíduos cisteína substituindo a Thr 48 do exon 1do TRAC*01 e a Ser 57 do exon 1 do TRBC1*01 ou TRBC2*01 ou o equiva-lente não humano do mesmo.

38. TCR como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou 5 a 28 que é um dTCR compreendendoum primeiro polipeptídio onde uma seqüência correspondendo auma seqüência da região variável da cadeia α do TCR é fundida ao terminalN de uma seqüência correspondendo a uma seqüência extracelular do do-mínio constante da cadeia α do TCR, eum segundo polipeptídio onde uma seqüência correspondendo auma seqüência da região variável da cadeia β do TCR fundida ao terminal Numa seqüência correspondendo a uma seqüência extracelular do domínioconstante da cadeia β do TCR, o primeiro e o segundo polipeptídios sendoligados por uma ligação dissulfeto que não tem equivalentes na célula T αβ-nativa entre resíduos cisteína substituindo a Thr 48 do exon 1 do TRAC*01 ea Ser 57 do exon 1 do TRBC1*01 ou TRBC2*01 ou o equivalente não hu-mano do mesmo.

39. TCR de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 38, onde a parte de ligação do dTCR ou do scTCR inclui uma ligação dissul-feto entre os resíduos correspondentes àqueles ligados por uma ligação dis-sulfeto nos TCRs nativos.

40. TCR como definido em qualquer uma das reivindicações 14a 39, onde a parte de ligação do dTCR ou do scTCR não contém uma se-qüência correspondente a seqüências transmembranosas ou citoplasmáti-cas dos TCRs nativos.

41. TCR solúvel compreendendo a seqüência de aminoácidosda cadeia-alfa de SEQ ID N2 29 e a seqüência de aminoácidos da cadeia-betade SEQ ID N2 10

42. TCR solúvel compreendendo a seqüência de aminoácidosda cadeia-alfa de SEQ ID N2 68 e a seqüência de aminoácidos da cadeia-betade SEQ ID N2 10.

43. TCR solúvel compreendendo a seqüência de aminoácidosda cadeia-alfa de SEQ ID N2 69 e a seqüência de aminoácidos da cadeia-beta de SEQ ID N2 10.

44. TCR solúvel compreendendo a seqüência de aminoácidosda cadeia-alfa de SEQ ID N2 70 e a seqüência de aminoácidos da cadeia-betade SEQ ID N2 10.

45. TCR solúvel compreendendo a seqüência de aminoácidosda cadeia-alfa de SEQ ID N2 29 e a seqüência de aminoácidos da cadeia-beta de SEQ ID N2 71,

46. TCR solúvel compreendendo a seqüência de aminoácidosda cadeia-alfa de SEQ ID N2 29 e a seqüência de aminoácidos da cadeia-beta de SEQ ID N2 72.

47. TCR solúvel compreendendo a seqüência de aminoácidosda cadeia-alfa de SEQ ID N2 29 e a seqüência de aminoácidos da cadeia-beta de SEQ ID N2 73.

48. TCR solúvel compreendendo a seqüência de aminoácidosda cadeia-alfa de SEQ ID N2 29 e a seqüência de aminoácidos da cadeia-beta de SEQ ID N2 74.

49. TCR solúvel compreendendo a seqüência de aminoácidosda cadeia-alfa de SEQ ID N2 29 e a seqüência de aminoácidos da cadeia-beta de SEQ ID N2 75.

50. TCR solúvel compreendendo a seqüência de aminoácidosda cadeia-alfa de SEQ ID N2 29 e a seqüência de aminoácidos da cadeia-beta de SEQ ID N2 76.

51. TCR solúvel compreendendo a seqüência de aminoácidosda cadeia-alfa de SEQ ID N2 29 e a seqüência de aminoácidos da cadeia-beta de SEQ ID N2 77.

52. TCR solúvel compreendendo a seqüência de aminoácidosda cadeia-alfa de SEQ ID N2 29 e a seqüência de aminoácidos da cadeia-beta de SEQ ID N2 78.

53. TCR como definido em qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes onde o TCR é associado a pelo menos uma cadeia polialquile-no glicol.

54. TCR de acordo com a reivindicação 53, onde a(s) cadeia(s)polialquileno glicol é/são covalentemente ligadas ao TCR.

55. TCR de acordo com a reivindicação 53 ou reivindicação 54,onde a(s) cadeia(s) polialquileno glicol compreende(m) pelo menos duasunidades repetitivas polietileno glicol.

56. TCR como definido em qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes compreendendo ainda uma cisteína reativa no terminal C ou noterminal N das cadeias alfa ou beta do mesmo.

57. TCR de acordo com qualquer uma das reivindicações pre-cedentes associado a um agente terapêutico ou a uma porção detectável.

58. TCR de acordo com a reivindicação 57, onde o TCR é cova-Ientemente ligado a um agente terapêutico ou a uma porção detectável.

59. TCR de acordo com a reivindicação 57, onde o agente tera-pêutico ou a porção detectável é covalentemente ligada ao terminal C deuma das cadeias do TCR ou de ambas.

60. TCR como definido em qualquer uma das reivindicações 57-30 a 59, associado a um agente terapêutico é uma molécula efetora imune.

61. TCR de acordo com a reivindicação 60, onde a moléculaefetora imune é uma citocina.

62. TCR de acordo com a reivindicação 60 onde a molécula efe-tora imune é IL-2, ou uma variante funcional ou um fragmento da mesma.

63. TCR como definido em qualquer uma das reivindicações 57a 59, onde o agente terapêutico é um agente citotóxico.

64. TCR como definido em qualquer uma das reivindicações 57a 49, onde o agente terapêutico é um radionuclídeo.

65. Complexo de TCR multivalente compreendendo pelo menosdois TCRs como definido em qualquer uma das reivindicações precedentes.

66. Complexo de TCR multivalente compreendendo pelo menosdois TCRs como definido em qualquer uma das reivindicações precedentesligados por uma cadeia de polímero não peptídica ou uma seqüência Iigado-ra peptídica.

67. Complexo de TCR de acordo com a reivindicação 65, onde acadeia de polímero ou a seqüência Iigadora peptídica se estende entre osresíduos de aminoácidos de cada TCR que não estão localizados em umaseqüência da região variável do TCR.

68. Complexo de TCR de acordo com uma das reivindicações 66 ou 67, onde os TCRs estão ligados por uma cadeia polialquileno glicol oupor um Iigador peptídico derivado de um domínio de multimerização humano.

69. Complexo de TCR de acordo com a reivindicação 68, ondeum radical espaçador alquileno divalente está localizado entre a cadeia poli-alquileno glicol e seu ponto de ligação a um TCR do complexo.

70. Complexo de TCR de acordo com a reivindicação 68 ou coma reivindicação 69, onde a cadeia polialquileno glicol compreende pelo me-nos duas unidades repetitivas polietileno glicol.

71. Complexo de TCR multivalente compreendendo pelo menosdois TCRs de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 56, onde (i)pelo menos um dos referidos TCRs está associado a um agente terapêuticode acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 64.

72. Célula isolada apresentando um TCR como definido emqualquer uma das reivindicações 1 a 52.

73. Célula isolada de acordo com a reivindicação 72, que é umacélula T humana ou uma célula-tronco hematopoiética humana.

74. Ácido nucléico ou ácidos nucléicos codificando um TCR co-mo definido em qualquer uma das reivindicações precedentes.

75. Ácido nucléico ou ácidos nucléicos de acordo com a reivindi-cação 74, adaptados para expressão em uma célula bacteriana, de levedu-ra, de mamífero ou de inseto.

76. Ácido nucléico ou ácidos nucléicos de acordo com a reivindi-cação 74, adaptado para expressão em uma célula T humana ou em umacélula-tronco hematopoiética humana.

77. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 76, consistin-do em uma das seqüências de DNA da cadeia α do TCR de comprimentointegral de SEQ ID NoS: 33, 35 ou 37 e a seqüência de DNA da cadeia β doTCR de SEQ ID N2 39 ou um ácido nucléico complementar a mesma ouuma seqüência de RNA correspondente.

78. Composição farmacêutica compreendendo um TCR ou umcomplexo de TCR multivalente como definido em qualquer uma das reivindi-cações 1 a 71, ou uma pluralidade de células de acordo com as reivindica-ções 72 ou 73, ou um ácido nucléico ou ácidos nucléicos de acordo com asreivindicações 74 a 77 junto com um veículo farmaceuticamente aceitável.

79. Método de tratamento de câncer compreendendo adminis-trar a um indivíduo sofrendo de tal câncer uma quantidade eficaz de umTCR ou de um complexo de TCR multivalente de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 71, ou de uma pluralidade de células de acordo comas reivindicações 72 ou 73, ou de um ácido nucléico ou ácidos nucléicos deacordo com qualquer uma das reivindicações 74 a 77.

80. Uso de um TCR ou de um complexo de TCR multivalente deacordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 71, ou de uma pluralidadede células de acordo com as reivindicações 72 ou 73, ou de um ácido nu-cléico ou ácidos nucléicos de acordo com qualquer uma das reivindicações 74 a 77 na preparação de uma composição para o tratamento de câncer.

81. Método para identificar um TCR de alta afinidade com a pro-priedade de se ligar ao AAGIGILTV-HLA-A*0201 caracterizado pelo fato deo TCR (i) compreender pelo menos um domínio variável da cadeia α do TCRe/ou pelo menos um domínio variável da cadeia β do TCR e (ii) ter um Kppara o referido complexo AAGIGILTV-HLA-A*0201 menor que 3 μΜ, o refe-rido método compreendendo:(a) a produção de uma biblioteca variada de TCRs compreen-dendo os domínios variáveis das cadeias α e β do TCR MEL onde um dosdomínios variáveis das cadeias α e β ou ambos compreendem uma muta-ção (mutações);(b) contatar a referida biblioteca variada de TCRs comAAGIGILTV-HLA-A*0201 em condições adequadas para permitir a ligaçãodos TCRs ao AAGIGILTV-HLA-A*0201; e(c) medir o Kd da interação.