BRPI0611053A2 - método para detecção de um ou mais analitos, kit para detecção de pelo menos um analito, conjugados do analito e um fluoróforo de criptato de európio, uso dos conjugados - Google Patents

Abstract

MéTODO PARA DETECçAO DE UM OU MAIS ANALITOS, KIT PARA DETECçAO DE PELO MENOS UM ANALITO, CONJUGADOS DO ANALITO E UM FLUOROFORO DE CRIPTATO DE EUROPIO, USO DOS CONJUGADOS A presente invenção refere-se a métodos para a detecção de um ou mais analitos, em particular, patógenos, vírus, priónios, bactérias, parasitas, produtos farmacêuticos, antibióticos, citostáticos, substâncias psicoativas, narcórticos, analgésicos, drogas cardíacas, metabólitos, inibidores de coagulação, hormónios, interleucinas,citocinas, drogas para melhorar o desempenho, drogas, toxinas, substâncias nocivas, pesticidas, inseticidas,conservantes de madeira, herbicidas, fungicidas, explosivos, vitaminas e sabores, pela provisão de um conjugado do analito e um fluoróforo de criptato de európio ou respectívamente um fluoróforo de criptato de térbio juntamente com um anticorpo que é específico para o analito e um anticorpo que é especifico para o fluoróforo de criptato de európio ou respectivamente o fluoróforo de criptato de térbio e por determinar de modo espectroscópico o resfriamento brusco de fluorescência que ocorre quando o analito é adicionado. Além disso, a presente invenção refere-se a conjugados do analitoe o fluoróforo de criptato de európio ou respectivamente o fluoróforo de criptato de térbio bem como a um kit para a detecção de analitos.

Description

MÉTODO PARA DETECÇÃO DE UM OU MAIS ANALITOS, KIT PARADETECÇÃO DE PELO MENOS UM ANALITO, CONJUGADOS DO ANALITO E UMFLUORÓFORO DE CRIPTATO DE EURÓPIO, USO DOS CONJUGADOS

A presente invenção refere-se a métodos para a detecçãode um ou mais analitos pelo fornecimento de um conjugado doanalito e um fluoróforo criptato de európio (ou térbio) juntocom uma quantidade definida de anticorpos que são específicospara o analito e uma quantidade específica de anticorpos quesão específicos para o fluoróforo criptato de európio (outérbio) determinando, de modo espectroscópico, o resfriamentode fluorescência que ocorre quando o analito é adicionado.Adicionalmente, a presente invenção refere-se a conjugados doanalito e fluoróforo criptato de európio (ou térbio) assimcomo a um kit contendo os componentes exigidos para adetecção de um ou mais analitos.

Vários métodos usando anticorpos específicos para adetecção de analitos diferentes são conhecidos. Por exemplo,EP 0 343 346 B descreve um imunoensaio de fluorescência. US4.261.968 descreve um método para a detecção de um analitousando anticorpos e resfriadores de fluorescência, onde ograu de resfriamento de fluorescência correlaciona-sediretamente com a quantidade de analitos a ser determinado.

A presente invenção objetiva fornecer um método simplesque pode ser universalmente aplicado para a detecção dequaisquer substâncias, assim como fornecer compostosadequados para o referido método.

o referido objetivo é alcançado pela revelação técnicadas reivindicações independentes da presente invenção.Modalidades vantajosas adicionais da invenção resultam dasreivindicações dependentes, da descrição e dos exemplos.

A presente invenção relaciona-se a um método para adetecção de um ou mais analitos, onde o método compreende asseguintes etapas:

a) fornecer os três componentes a seguir:- um conjugado do analito e um fluoróforo criptato deeurópio,- um anticorpo especifico para o analito, e

- um anticorpo especifico para o fluoróforo criptato deeurópio, onde o conjugado do analito e um fluoróforo criptatode európio apenas permitem a um único anticorpo ser ligado aomesmo tempo,

b) adição do analito, e

c) medição espectroscópica da fluorescência dofluoróforo criptato de európio.

Também, Térbio pode ser usado ao invés do európio, deforma que qualquer especificação dada aqui é válida para oeurópio e o térbio. Dessa maneira, a presente invençãorelaciona-se a um método para a detecção de um ou maisanalitos, onde o método compreende as seguintes etapas:

a) fornecer os três componentes a seguir:

- um conjugado do analito e um fluoróforo criptato deeurópio,

- um anticorpo especifico para o analito, e

- um anticorpo especifico para o fluoróforo criptato deeurópio, onde o conjugado do analito e um fluoróforo criptatode európio apenas permitem a um único anticorpo ser ligado aomesmo tempo,

b) adição do analito, e

c) medição espectroscópica da fluorescência dofluoróforo criptato de térbio.

Três componentes são exigidos para o método e acordo coma invenção: primeiramente um conjugado da substância a serdetectada, isto é, o analito, e um fluóforo e em segundolugar um anticorpo que é especifico para a substância a serencontrada e em terceiro lugar, um segundo anticorpo que éespecifico para o fluóforo. Peróxido de hidrogênio é umquarto componente preferido. A função do dito componente édescrita em maiores detalhes abaixo. O analito, a presença doqual ou concentração do qual é para ser determinada, pode serconsiderado um componente adicional. 0 referido componente,entretanto, não é obrigatório, como o ensaio de acordo com ainvenção pode também ser usado para detectar a ausência de umcerto analito.

O termo "fluorescência" ou "resfriadores defluorescência" como usado aqui pretende descrever qualquerefeito de luminescência; conseqüentemente incluifosforescência de forma que os termos "fluorescência" ourespectivamente "resfriadores de fluorescência" tambémcompreendem "fosforescência" ou respectivamente "resfriadoresde fosforescência".

Geralmente, todos os tipos atuais de anticorpos podemser usados tais como, por exemplo, anticorpos policlonais,anticorpos monoclonais, anticorpos humanizados, anticorposhumanos, anticorpos químicos, anticorpos recombinados,anticorpos biespecíficos assim como fragmentos de anticorpos,onde anticorpos monoclonais são preferidos.

Fragmentos de anticorpo, aptâmeros, mimotopes,fragmentos de fab, fragmentos de fc, peptídeos, lectinas,nucleotídeos, peptidominéticos, gapmers, ribozimas,oligômeros CpG, DNAzimas, "riboswitches" ou lipideos podemser usados ao invés de anticorpos.

Métodos para produzir os referidos componentes,especialmente anticorpos e anticorpos monoclonais, sãoconhecidos àqueles versados na técnica.

Preferivelmente, os anticorpos que são específicos parao analito (anticorpos específicos do analito) e os anticorposque são específicos para o conjugado de analito e fluoróforo(anticorpos específicos do fluoróforo) são usados em umarazão definida e conhecida. O termo anticorpo específico doanalito descreve um anticorpo que especificamente se liga aoanalito, onde, em respeito à referida ligação, é irrelevantese o analito está completamente ou apenas parcialmente ligadopelo anticorpo ou se uma parte do ligador e/ou do fluoróforotambém está ligada pelo anticorpo ou se até o ligador e/ou ofluoróforo está/estão completamente envolvidos na ligação. Oúnico aspecto importante consiste no fato que a ligação temque acontecer de tal forma que nem um segundo anticorpoespecífico do analito nem um anticorpo específico dofluoróforo sejam capazes de ligar. Similarmente, em respeitoao anticorpo especifico do fluoróforo, não é relevante se oreferido anticorpo liga o fluoróforo completamente ou apenasparcialmente e se o ligador e/ou o analito está/estãocompletamente ou parcialmente envolvidos na ligação. Oanticorpo especifico do fluoróforo, também, tem que estarligado de tal maneira que nem um anticorpo especifico doanalito nem um anticorpo especifico do fluoróforo adicionalsejam capazes de ligação. Dessa maneira, o tipo de ligação deanticorpo não é essencial à invenção, uma vez que nenhumoutro anticorpo pode ser ligado ao mesmo tempo.

O conjugado de analito/fluoróforo é projetado de formaque apenas um único anticorpo pode ser ligado ao mesmo aomesmo tempo. Conseqüentemente, a ligação de dois anticorposespecíficos do analito ou dois anticorpos específicos dofluoróforo ou um anticorpo específico do analito e umanticorpo específico do fluoróforo ao mesmo tempo é excluída.

Adicionalmente, a invenção é baseada no princípio de quefluorescência do conjugado de fluoróforo do analito não ésignificantemente afetada pela ligação do anticorpoespecífico do analito, enquanto a ligação do anticorpoespecífico do fluoróforo leva a fluorescência sendo resfriadaou ao menos na fluorescência sendo reduzida de formamensurável.

Se uma solução dos referidos três componentes, isto é,anticorpo específico do analito e do conjugado e anticorpoespecífico do fluoróforo forem fornecidos, o conjugado nasolução é ligado por um dos dois anticorpos; conseqüentementeé, por exemplo, ligado a uma extensão de 50% pelo anticorpoespecífico do analito e a uma extensão de cerca de 50% peloanticorpo específico de fluoróforo. Uma pequena quantidadeestá presente em forma de não-ligação.

Se uma solução de amostra contendo a substância a serdetectada, isto é, o analito for adicionado à referidasolução, o analito e o.conjugado contendo o analito competempelo sítio de ligação no anticorpo específico do analito.Conseqüentemente, uma parte do anticorpo especifico doanalito liga-se a liberações do conjugado e o conjugado seliga à substância a ser detectada, isto é, o analito. 0 ditoprocedimento leva a um aumento na concentração de conjugadoslivres, que, entretanto, são imediatamente ligados peloanticorpo especifico de fluoróforo, presente em excesso nasolução. Devido à ligação do anticorpo especifico defluoróforo, a fluorescência é resfriada, um fato que pode sermedido de modo espectroscópico.

Uma redução da fluorescência da solução indica apresença da substância a ser detectada, pelo analito, onde ograu de resfriamento de fluorescência lança luz na quantidadedo analito na amostra de solução.

Dessa maneira, os métodos da invenção são baseados noprincipio geral de estabelecer uma conexão entre a redução dafluorescência e a presença e concentração de um certoanalito.

Evidentemente, será aparente àqueles versados na técnicaque, em lugar dos anticorpos de resfriamento dafluorescência, tais anticorpos podem ser usados com ganho ouaumento mensurável da fluorescência do fluóforo se ligado aum fluoróforo criptato de európio (ou respectivamentefluoróforo criptato de térbio) ou se ligado a um conjugado deanalito e fluoróforo criptato de európio (ou respectivamente fluoróforo criptato de térbio). A expressão "aumentomensurável" descreve um aumento que pode ser distintivamentedeterminado por meio de métodos espectroscópicos, edistinguida da fluorescência de segundo plano. Nos referidosmétodos da invenção, o grau do aumento na fluorescência e a concentração do analito a serem medidas, são co-relacionados.

Dessa maneira, a presente invenção relaciona-se emparticular a anticorpos sendo capazes de ligar a umfluoróforo criptato de európio (ou, respectivamentefluoróforo criptato de térbio) e/ou um conjugado do analito eum fluoróforo criptato de európio (ou respectivamentefluoróforo criptato de térbio) e sendo capaz de resfriar oureduzir mensuravelmente a fluorescência do fluoróforo devidoà referida ligação.

Por outro lado, a presente invenção também se relacionaa anticorpos sendo capazes de ligar a um fluoróforo criptatode európio (ou respectivamente um fluoróforo criptato detérbio) e/ou um conjugado do analito e um fluoróforo criptatode európio (ou respectivamente um fluoróforo criptato detérbio) e de crescimento ou aumento mensurável dafluorescência do fluoróforo devido à referida ligação.

O fluoróforo criptato de európio (ou respectivamente afluoróforo criptato de térbio) preferivelmente usado sãoaqueles descritos aqui.

Os anticorpos da invenção são produzidos de acordo commétodos padrões, por exemplo, por meio de técnicas hibridoma(Kohler e Milstein, Nature 1975, 256, 495-497), pelo uso devirus Epstein Barr, rato Xeno ou por meio de células queestão permanentemente viáveis em cultura de célula e queproduzem anticorpos (Pasqualini e Arap, Proc. Natl. Acad.Sei. USA 2004, 6, 257-259). Adicionalmente, os anticorpospodem ser derivados de bibliotecas de anticorposrecombinantes produzidos, por exemplo, por meios de displayribossoma ou display de fagos, ou técnicas similares.

Anticorpos reduzindo a fluorescência de lantanidasligadas por criptato ou ligadas por quelato, particularmentede európio (Eu3+) e térbio (Eu3-) ou tais anticorposintensificando a fluorescência de lantanidas ligadas porcriptato ou ligadas por quelato, particularmente de európio(Eu3+) e térbio (Eu3-), pode ser usada para estabelecer váriossistemas de mensuração. Em particular, isso se refere a suaaplicação em procedimentos de exame para células produtorasde anticorpo de especificidade desejada e a determinação deafinidades de anticorpo em relação à afinidade de ligação deum anticorpo conhecido. Similarmente, tais anticorpos podemser usados para o desenvolvimento de imunoensaios baseados natransferência de energia de ressonância fluorescente (FRET).

A aplicação descrita aqui é direcionada ao uso dos anticorposacima mencionados em um ensaio homogêneo em solução.Evidentemente, tais anticorpos em ensaios de fase sólida,particularmente na forma de um microconjunto podem também serusados, assim como os anticorpos da invenção quando sistemasde tempo real PCR são percebidos.

As amostras a seguir podem ser particularmente usadascomo soluções de amostra: amostras de saliva, amostras desangue, amostras de urina, amostras de muco, amostras detecido digestivo, amostras de água, amostras de águasresiduais, amostras de processos de produção química,amostras de solo extraído, amostras de alimento, amostras deprocessos de produção biológica e bioquímica, soluçõesfermentadas e similares. Amostras de soro assim como amostrasdiluídas de tipos acima mencionados ou extratos diluídos de, por exemplo, amostras de sujeira, amostras de muco, soluçõesde fermentação e similar são particularmente preferidas. Apreparação de soluções diluídas adequadas para métodos deanálise espectroscópica será aparente àqueles versados natécnica.

Qualquer analito contra o qual anticorpos podem serproduzidos e que podem ser ligados a um fluoróforo criptatode európio (ou respectivamente a fluoróforo criptato detérbio) pode ser usado como substância para ser detectado.Uma ligação ; covalente, possivelmente via um ligador doanalito, ao fluoróforo criptato de európio (ourespectivamente a fluoróforo criptato de térbio) é preferido.O ligador está situado entre o analito e o fluoróforocriptato de európio (ou respectivamente a fluoróforo criptatode térbio) e pode consistir de quaisquer fragmentos oucomponentes químicos que aumentem a distância entre o analitoe o fluoróforo criptato de európio (ou respectivamente afluoróforo criptato de térbio), onde a distância não deve sertão grande que, devido a distância entre o analito e ofluoróforo criptato de európio (ou respectivamente afluoróforo criptato de térbio), a ligação simultânea de umanticorpo específico do analito e o anticorpo específico dofluoróforo será possível.

EXEMPLOS DE ANALITOS POSSÍVEIS INCLUEM:

Analitos de diagnósticos humanos:

Patógenos: vírus: por exemplo, sarampo, influenza, SARS,HIV, hepatite, herpes, meningoencefalite por carrapato, etc.

Priônios

Bactéria: por exemplo, tuberculose, doença de Lyme,cólera, pertussis, etc.

Parasitas: por exemplo, malária, leishmania, etc.

Marcadores de Tumor

EXEMPLOS DE MARCADORES DE TUMOR INCLUEM:

Microglobulina beta 2, ferritina, p53, corticotropina(ACTH), hormônio do crescimento (GH, hGH), prolactina (PRL),gonadotrofina coriônica (hCG e CG), calcitonina (CT) ,tiroglobulina (tg), antígeno carcinoembriônico (CEA),antígenos CA 125, 72-4, 15-3 e 19-9, alfa-fetoproteína (AFP),antígeno específico de próstata (PSA), transferase galactose II.

EXEMPLOS DE PATÓGENOS INCLUEM:

Brucela IgG e IgM; pneumonia clamídia Iga, IgG e IgM;clamídia tracomatis IgA, IgG e IgM; CMV IgG e IgM; vírus dadengue IgG e IgM; EBV-VCA IgA, IgC e IgM; H. pilori IgA, IgGe IgM; HSV 1+2 IgG e IgM; sarampo IgG e IgM; caxumba IgG eIgM; micoplasma IgG e IgM; rubéola IgG e IgM; salmonela IgG eIgM; toxoplasma IgA, IgG e IgM; treponea palidum IgG e IgM;VZV IgG e IgM; hepatite A, B, C; HIVlf 2.

FARMACÊUTICOS:

Por exemplo, Antibióticos (ampicilina, amoxicilina,penicilina, etc.)

Citostáticos (doxurubicina, cisplatina, etc.)

Substâncias psicoativas

Narcóticos

Analgésicos

Drogas cardíacas

Inibidores de coagulação

METABÓLITOS:Por exemplo, hormônios (hormônios esteróides,gonadotrofinas, etc.)

Interleucinas e citocinas, etc.

Triodotironinas

Proteínas de plasma

Enzimas (secretases, lípases, fosfatases, etc.)

Lipidios (colesterol, etc.)

Fatores de doença (diagnósticos auto-imunes, etc.)

METAS NA MEDICINA ESPORTIVA:

Drogas de aumento de performance (anfetaminas, hormôniosde crescimento, eritropoietina, etc.)

Drogas: por exemplo, heroína, cocaína, LSD,e tc.

Toxinas: micotoxinas, toxinas bacterianas: toxina dacólera, toxina pertussis, etc.

EXEMPLOS DE ANTIBIÓTICOS, ANTIMICÓTICOS E DROGASANTIVIRAIS INCLUEM:

Aciclovir, ampicilina, amoxicilina, aminogrlicosides,anfotericina B, azitromicina, cefazolina, cefapima,cefataxima, cefatetan, cefapodoxima, cefatazidima,cefatizoma, cefatriaxona, cefuroxima, cefalexina,cloramfenicol, clotrimazol, ciprofloxacin, claritromicina,clindamicina, dapsone, dicloxacilina, doxiciclina,lactobionato de eritromicina, fluconazol, foscarnet,ganciclovir, gatifloxacina, imipenem/cilastatina, isoniazid,itraconazol, cetoconazol, metronidazol, nafacilina,nitrofurantoina, nistatina, pentamidina, penicilina,piperacilina/tazobactam, rifampin, quinupristina,dalfopristina, ticarcilina/clavulanato, trimetropinasulfametoxazol, valaciclovir, vancomicina

EXEMPLOS DE HORMÔNIOS INCLUEM:

ACTH, C-peptídeo, cortisol, DHEA-S, estradiol, estriol,testosterona, insulina, proinsulina, progesterona, PTH.

EXEMPLOS DE INTERLEUCINAS, CITOCINAS E FATORES DECRESCIMENTO INCLUEM:

Eritropoietina (EPO), hormônio de crescimento humano(hGH) , interleucina 1 a 18, fator-α, β de necrose de tumor(TNF-ct/ β), fator de crescimento de fibroblasto (FGF) ,granulócito, macrófago, fator de estimulação de colônia demacrófago/granulócito (G-CSF, M-CSF, GM-CSF), fator decrescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimentoplaqueta (PGF), óxidos de nitrogênio, leucotrienes.

EXEMPLOS DE PROTEÍNAS DE PLASMA E OUTRAS MOLÉCULAS DEPLASMA INCLUEM:

Proteína C-reativa (CRP), albumina, fatores decoagulação, fatores complementares, imunoglobulinas (IgA,IgE, IgG, IgM), fosoholipases, vasopressina, homocisteína,mioglobina, troponina I, caspases, insulina, determinação dogrupo sangüíneo, fator rhesus, alfa amilase, colinesterase,creatina quinase, gama-GT, GOT-ASAT, GPT/ALAT. LDH, lipasepancreática, fosfatases, bilirrubina, glicose, creatinina,lipoproteínas.

EXEMPLOS DE DIAGNÓSTICOS AUTO-IMUNE INCLUEM:

ACA IgG, ANA Screen IgG, cardiolipina IgA, cardiolipinaIgG, cardiolipina IgM, cardiolipina total ab, dsDNA IgG, abmitocondrial (MA), RNP/Sm IgG, Scl-70, Sm IgG, SSA IgG, SSBIgG, tiroglobulina (tg) ab, peroxidase de tiróide (TPO) IgG

METAS NA MEDICINA ESPORTIVA:

Drogas de aumento de performance (anfetaminas, hormôniosde crescimento, eritropoietina, etc.)

Drogas: por exemplo, heroína, cocaína, LSD,etc eprodutos de degradação dos mesmos.

Toxinas: micotoxinas, toxinas bacterianas: toxina dacólera, toxina pertussis, etc.

EXEMPLOS DE DROGAS DE AUMENTO DE PERFORMANCE INCLUEM:

Agentes anabólicos, por exemplo, bolasterona, boldenona,desidroclorometiltestosterona, diidrotestosterona, clostebol,fluoximesterona, mesterolona, metandienona, metenolona,metiltestosterona, nandrolona, noretandrolona, oxandrolona,oximesterona, oximetolona; estanozolol, testosterona ecompostos relacionados química ou farmacologicamente; beta-2agonistas (por exemplo, clenbuterol); anfetaminas: porexemplo, amineptina, anfetamina, anfetaminil, benzetamina,dimetilanfetamina, etilanfetamina, fenetilina, fenproporex,furfenorex, mesocarb, metoxifenamina, metilanfetamina,metilfenidato, morazona, pemolina, fendimetrazina, pipradol,pirovalerona e compostos relacionados química oufarmacologicamente testados; corticosteróides paraadministração oral, intramuscular ou intravenosa; hormôniospeptídeos e análogos dos mesmos: por exemplo, gonadotrofinacoriônica HCG (hormônio sexual humano), corticotrofina(ACTH), hormônio do crescimento (HGH, somatotropina),eritropoietina (EPO). Quaisquer fatores correspondentesliberados das substâncias mencionadas acima são igualmentepermitidos.

Estimulantes: por exemplo, amifenazol, cafeína, catin,clorefentermina, clobenzorex, clorprenalina, cropropamida,crotetamida, efedrina, etafedrina, etamivan, fencamfamin,mefenorex, metilefedrina, nicetamida, pentetrazol,fenilpropanolamina, prolintane, profilexedrina, estriquininae compostos relacionados química ou farmacologicamente.

Narcóticos/ analgésicos: por exemplo, alfaprodina,anileridina, buprenorfina, dextromoramida, dextropropoxifena,diamorfina, dipipanona, etoeptazina, etilmorfina, levorfanol,metadona, morfina, nalbufina, pentazocina, petidina,trimeperidina e compostos relacionados química oufarmacologicamente.

EXEMPLOS DE DROGAS INCLUEM:

Anfetaminas, barbitúricos, benzodiazepinas,canabinóides, metabólito de cocaína, cotinina, fentanil,flunitrazepam, LSD, metamfetamina, morfina, opiáceos, PCP,triciclos.

ANALITOS DA MEDICINA VETERINÁRIA:

Patógenos, farmacêuticos, metabólitos, drogas de aumentode performance, toxinas, etc.

ANALITOS DE DIAGNÓSTICOS AMBIENTAIS (AR, ÁGUA, ANÁLISEDE SUJEIRA):

Substâncias nocivas: pesticidas (PCB, atrazina, etc).Inseticidas (firetróides, toxina turingiensis de bacilo,etc. )

Preservadores de madeira (Lindan, etc.)

Herbicidas (diuron, monuron, etc.)

Fungicidas

Toxinas e explosivos (por exemplo, dioxina, TNT, etc.)

Colorantes e vernizes

Poluentes ambientais, substâncias tóxicas

EXEMPLOS DE COLORANTES E VERNIZES INCLUEM:

Ftalatos, corantes azo, éteres glicol, estéres glicol,dioxinas.

EXEMPLOS DE INSETICIDAS INCLUEM:

dimetoato, deltametrina, diflubenzuron, alfa-, zeta-cipermetrina, fenoxicarb, tebufenpirad, pirimicarb,azadiraquitin, butóxido de piperonila, piretrina,flocoumafen, clorpirifos, permetrina, chalcogran, éster metilde ácido carboxilico decadieno, ipsdienol, (S)-cis-verbenol,metilbutenol

OS EXEMPLOS DE PESTICIDAS INCLUEM:

3,4,5-trimetacarb, 3-hidróxi carbofuran, 5-hidróxi-cletodim sulfona, 5-hidróxi imidacloprid, 5-hidróxitiabendazol, 6-cloro-3-fenil-piridazina-4-(metabólitopiridato), acefato, acetamiprid, acibenzolar-S-metila,aclonifen, acrinatrin, alaclor, aldicarb, sulfóxido dealdicarb, aldoxicarb, ametrina, amidosulfuron, aminocarb,anilazina, atrazina, avermectin Bla, avermectin Blb,azametifos, azinfos-etila, azinfos-metila, azoxistrobina,benalaxila, bendiocarb, benfuracarb, bensulfuron metila,benzoximato, bifenox, bitertanol, boscalid, bromacil,bromuconazol, bupirimato, buprofezina, butocarboxim,sulfóxido de butocarboxim, butoxicarboxim, buturon, carbaril,carbendazim, carbetamidas, carbofuran, carbosulfan, carboxin,carfentrazona-etila, clorbromuron, clorfenvinfos,clorfluazuron, cloridazon, clorotoluron, cloroxuron,clorpirifos, clorsulfuron, clortiofos, cinosulfuron,cletodim, cletodim imina sulfona, cletodim imina sulfoxida,cletodim sulfona, cletodim sulfóxido, clodinafop-propargila,clofentezina, clomazona, clopiralid, cloquintocet-mexila,coumafos, cianazina, cianofenfos, ciazofamid, cicloato,cimoxanil, ciprodinil, ciromazina, daminozida, deltametrina,demeton-s-metila, demeton-s-metil-sulfona, desmedifam,desmetilformamido-pirimicarb, desmetil-pirimicarb, dialifos,di-alato, diazinon, diclofluanid, diclorvos, diclobutrazol,dietofencarb, difenoconazol, difenoxuron, difIufenican,dimefuron, dimetaclor, dimetenamid, dimetoato, dimetomorf,diniconazol, difenilamina, disulfoton, diuron, dodemorf, EPN,epoxiconazol, etiofencarb, etiofencarb sulfona, etiofencarbsulfóxido, etion, etirimol, etofumesato, etoprofos,etofenprox, etrimfos, famoxadona, fenamifos, fenarimol,fenazaquin, fenbuconazol, fenfuram, fenexamid, fenoxaprop-etila, fenoxicarb, fenpiclonil, fenpropatrina, fenpropidina,fenpropimorf, fenpiroxiraato, fention, fenuron, flamprop-isopropila, flamprop-metila, flazasulfuron, florasulam,fluazifop-butila, flufenacet, fIufenoxuron, fluometuron,fluoroglicofeno-etila, fluquinconazol, fluridona, fluroxipir-meptila, flurtamona, flusilazol, flutriafol, folpet, fonofos,fostiazato, fuberidazol, furatiocarb, haloxifop-etotila,haloxifop-metila, heptenofos, hexaconazol, hexazinona,hexitiazox, imazalil, imidacloprid, indoxacarb, iodosulfuron-metila, iprodiona, iprovalicarb, isazofos, isofenfos,isoproturon, isoxation, kresoxim-metila, linuron, malaoxon,malation, MCPA-butotila, mecarbam, mepanipirim, metalaxila,metamitron, metazaclor, metconazol, metabenztiazuron,metamidofos, metfuroxam, metidation, metiocarb, metomila,metoxifenozida, metobromuron, metolaclor, metosulam,metoxuron, metribuzin, metsulfuron-metila, molinato,monocrotofos, monolinuron, raonuron, miclobutanil, naled,napropamidas, neburon, nicosulfuron, nicotina, nuarimol,ofurace, ometoato, oxadixila, oxamila, oxamil-oxima,oxicarboxin, oxidemeton-metila, paclobutrazol, paraoxon-metila, paration, paration-metila, penconazol, pencicuron, pendimetalina, fenmedifam, fentoato, forato, foratosulfóxido, fosalona, fosmet, fosfamidon, foxim, picolinafen,picoxistrobin, pirimicarb, pirimifos-etila, pirimifos-metila,primisulfuron-metila, procloraz, procimidona, profenofos,promecarb, prometrina, propaclor, propamocarb, propargita,propetamfos, profam, propiconazol, propoxur, propizamida,prosulfocarb, prosulfuron, protiofos, pimetrozina,piraclostrobin, pirazofos, piridaben, piridafention,piridato, pirimetanil, piriproxifen, quinalfos, quinmerac,quinoclamina, quinoxifen, quizalofop-etila, rimsulfuron,rotenona, simazina, simetrin, espiroxamina, sulfosulfuron,sulfotep, sulprofos, tebuconazol, tebufenozida, tebufenpirad,tebutam, tebutiuron, terbacil, terbufos, terbumeton,terbutilazina, terbutrin, tetraclorvinfos, tetraconazol,tiabendazol, tiacloprid, tiametoxam, tifensulfuron-metila,tiodicarb, tiofanox, tiofanox sulfona, tiofanox sulfóxido,tiofanato (-etila), tiofanato-metila, tolclofos-metila,tolilfluanid, triadimefon, triadimenol, triasulfuron,triazofos, tribenuron-metila, triclorfon, triciclazol,trietazina, trifloxistrobin, triflumizol, triflusulfuron-metila, triticonazol, vamidotion.

OS EXEMPLOS DE SUBSTÂNCIAS NOCIVAS E SUBSTÂNCIAS TÓXICASINCLUEM:

1,1,1-tricloroetano, 1,1,2,2-tetracloroetano, 1,1,2-tricloroetano, 1,1-dicloroetano, 1,1-dicloroeteno,1,2,3,4,6,7,8,9-octaclorodibenzofuran, 1,2,3,4,6,7,8-heptaclorodibenzo-p-dioxin, 1,2,3-triclorobenzeno, 1,2,3-tricloropropano, 1,2,4-triclorobenzeno, 1,2-dibromo-3-cloropropano, 1,2-dibromoetano, 1,2-diclorobenzeno, 1,2-dicloroetano, trans-1,2-dicloroeteno, 1,2-dicloroetileno,1,2-difenilidrazina, 1,3,5-trinitrobenzeno, 1,3-butadieno,1,3-diclorobenzeno, eis- e trans-3-dicloropropeno, 1,4-diclorobenzeno, 2,3,4,7,8-pentaclorodibenzofuran, 2,3,5,6-tetraclorofenol, 2,3,7,8-tetraclorodibenzofuran, 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-dioxina, 2,4,5-triclorofenol, 2,4,6-triclorofenol, 2,4,6-trinitrotolueno, 2,4-diclorofenol, 2,4-dimetilfenol, 2,4-dinitrofenol, 2,4-dinitrotolueno, 2,6-dinitrotolueno, 2-butanona, 2-cloroanilina, 2-clorofenol, 2-hexanona, 2-metilanaftaleno, 3,3'-diclorobenzidina, 4,4'-metilaenebis(2-cloroanilina), 4,6-dinitro-o-cresol, 4-aminobifenila, 4-nitrofenol, acenafteno, acetona, acroleína,aldrina, alfa-clordeno, amosita asbestos, aroclor 1016 ,1221, 1232, 1240, 1242, 1248, 1254, 1260, 1262, ácidoarsênico, asbestos, benzeno, benzidina, benzo(a)antraceno,benzo(a)pireno, benzo(b ou k)fluoranteno, benzofluoranteno,benzopireno, bis(2-cloroetila) éter, bis(2-etilaexila)adipato, bis(2-metoxietila) ftalato,bromodicloroetano, bromoform, butil benzil ftalato, butilato,arseniato de cálcio, carbazol, tetracloreto de carbono,carbofenotion, clordano, clordecona, clorobenzeno,clorodibromometano, cloroetano, clorometano, clorpirifos,criseno, crisotile asbestos, cis-clordano, alcatrão de carvão creosote, para-cresol, cresóis, cianureto,ciclotrimetilenetrinitramina (RDX) , o,p'- ou p,p'- ddd, p,p'-dde, o,p'- ou ρ,ρ'-ddt, di(2-etil hexila)ftalato, diazinon,dibenzo(a,h)antraceno, (clorado) dibenzofuran,dibenzotiofeno, dibromocloropropano, diclorobenzeno,dicloroetano, dicloroprop, diclorvos, dicofol, dieldrin,dimetoato, dimetila formamida, ácido dimetila arsinico, di-n-butil ftalato, dinitrotolueno, disulfoton, (alfa-; beta-)endosulfan (sulfato), endrin (aldeído; cetona), etoprop, éteretilico, etil benzeno, fluoranteno, formaldeido, gama-clordeno, gution, heptaclor, heptaclor epóxido,heptaclorobifenila, heptaclorodibenzofuran,heptaclorodibenzo-p-dioxina, hexaclorobenzeno,hexaclorobutadieno, alfa-, beta-, delta-, gama-hexaclorocicloecano, hexaclorociclopentadieno,hexaclorodibenzofuran, hexaclorodibenzo-p-dioxina,hexacloroetano, hidrazina, cianureto de hidrogênio,indeno(1,2,3-cd)pireno, metoxiclor, metil isobutil cetona,metil paration, cloreto de metileno, metil mercúrio, naled,naftaleno, n-nitrosodimetil amina, n-nitrosodi-n-propilamina,n-nitrosodifenil amina, orto-cresol, oxiclordano, paration,pentaclorobenzeno, pentaclorobifenila, pentaclorobutadieno,pentaclorodibenzofuran, pentaclorodibenzo-p-dioxina,pentaclorofenol, fenantreno, fenol, forato, polonium-210,bifenilas polibromadas, bifenilas policloradas,hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, p-xileno, pireno,piretrum, s,s,s-tributil fosforotritioato, estrobano,estireno, tetraclorobifenila, tetraclorodibenzo-p-dioxina,tetracloroetano, tetracloroetileno, tetraclorofenol,tiocianato, tolueno, toxafeno, trans-clordano,tributilestano, triclorobenzeno, tricloroetano,tricloroetileno, triclorofluoroetano, trifluralina, cloretode vinila.

ANALITOS DA AGRICULTURA E SILVICULTURA:

Patógenos de planta e animal, micotoxinas, poluentesambientais, etc.

ANALITOS EM ENGENHARIA DE PROCESSO / TECNOLOGIAALIMENTAR / BIOTECNOLOGIA / COSMÉTICOS:

Produtos de síntese química e biotecnológica (inclusiveprodutos primários, produtos intermediários, bioprodutos eprodutos de degradação, tais como vitaminas, aromáticos,farmacêuticos, toxinas, lipídios, aminoácidos, glicerídeos,carboidratos, fibras, adoçantes, colorantes, agentes depreservação, polissacarídeos, micotoxinas) etc.

EXEMPLOS DE ADITIVOS ALIMENTARES INCLUEM:

Acesulfam K, amido oxidado acetilado, amido acetilado,adipato diamido acetilado, fosfato diamido acetilado, alluravermelho AC, alfa tocoferol, laças de alumínio, sulfato desódio de alumínio, amaranto, substância corante de caramelode amônia, substância corante de caramelo de sulfito deamônia, annatto, antocianos, ácido málico, ácido ascorbínico,aspartame, azorubina, vermelho beterraba, bentonita, ácidobenzóico, álcool benzílico, ácido succínico, beta-apo-8'-carotenal, beta-apo-8'-éster etílico de ácido carotínico,beta-ciclodextrina, cera de abelha (branca e amarela),bifenila, bixina, ácido bórico, FK marrom, HAT marrom, FCFazul brilhante, BN preto brilhante, copolímero de butadieno-estireno, butil hidróxi anisol (BHA), hidróxi toluenobutilado (BHT), 5'-ribonucleotideo de cálcio, cantaxantina,capsantina, capsorubin, carbamida, carbóxi metil celulose,cera de carnaúba, carotenos (carotenos misturados, betacaroteno), carragenana, celulose (celulose microcristalina,pó de celulose), amarelo quinolina, clorofilas, clorofilinas,vermelho coquenila A, carbóxi metil celulose enzimaticamentehidrolisado, eritrosina, gama tocoferol, amarelo pôr-do-solS, gelan, verde S, hidróxi propil celulose, fosfato diamidohidróxi propila, hidróxi propil metil celulose, amido dehidróxi propila, indigotin I, invertase, complexos contendocobre das clorofilas, complexos contendo cobre dasclorofilinas, curcumina, fosfato de monoamido, carbóxi metilcelulose de sódio, neoesperidina DC, nisina, norbixina, amidooxidado, azul patente V, pectinas (pectina, pectina amidada),fosfato diamido fosfatizado, ácido fosfórico, polidextrose,polietileno glicol 6000, oxidatos de cera de polietileno,ésteres de polivinil dos ácidos graxos não ramificados C2-C18, polivinil polipirrolidona, polivinil pirrolidona,riboflavina, riboflavina 51-fosfato, 2G vermelho, sacarina esais Na, K e Ca dos mesmos (sacarina, sódio de sacarina,cálcio de sacarina, potássio de sacarina), isobutirato deacetato de sacarose, monolaurato de sorbitano, monooleato desorbitano, monopalmitato de sorbitano, monoestearato desorbitano, triestearato de sorbitano, octenil succinato desódio de amido, tanina, tartrazina, taumatina, tragacanto,alga eucheuma processada, carbóxi metil celulose de sódioligado, xantana.

OS EXEMPLOS DE COSMÉTICOS INCLUEM:

PEG e derivados de PEG, resinas de formaldeido,compostos de almiscar, tensides, parafinas, aminasaromáticas, metil-, butil-, etil-, propil-, isobutil,parabéns, poloxâmero 184, elastina hidrolisada, alantoina,enzimas de ácido lático, xantana.

Na literatura, vários quelatos com vários cátions sãoconhecidos como fluoróforos. Até proteínas ou anticorpos comuma certa quantidade de grupos aromáticos podem servir comofluoróforos. Especialmente, fluoróforo criptato de európio efluoróforo criptato de térbio mostraram ser muito vantajososem respeito à presente invenção, como dito fluoróforos têm umespectro luminescente característico que pode ser muito bemseparado da possível fluorescência de outros componentes,tais como proteínas presentes na amostra a ser medida.

Fluoróforo criptato de európio e fluoróforo criptato detérbio são distinguidos por uma absorção de luz causada pelaparte orgânica do criptato e pela transferência de energiadireta ao íon de európio. O íon de európio está presente noestado de oxidação 3+. O íon de térbio, também, está presenteno estado de oxidação 3+. O fluoróforo criptato de európio épreferivelmente excitado em um comprimento de onda de 337 nmpor meio de um laser de nitrogênio. Emissão é medida a 620 nm(e a 545 nm no caso de térbio). A fluorescência do fluoróforocriptato de európio e fluoróforo criptato de térbio ésignificantemente mais longa se comparada à dos outrosfluoróforos ou outros componentes fluorescentes da amostramedida, de forma que a fluorescência dos fluoróforos criptatode európio ou respectivamente fluoróforos criptato de térbiopodem ser bem e precisamente determinadas apesar de umpossível antecedente de fluorescência causado por outroscomponentes ou outros fluoróforos.

Em adição àquelas então chamadas "pequenas moléculas",são pequenas moléculas químicas tais como ingredientesfarmacológicos ou toxinas que podem ser ligadas diretamenteou via um ligador a um fluoróforo criptato de európio (ourespectivamente a um fluoróforo criptato de térbio); é tambémpossível ligar macromoléculas a um fluoróforo criptato deeurópio (ou respectivamente a um fluoróforo criptato detérbio). Os anticorpos específicos de fluoróforo também seligam a conjugados consistindo de uma macromolécula e umfluoróforo criptato de európio (ou, respectivamentefluoróforo criptato de térbio) de forma que os métodosdescritos aqui podem também ser usados para detecção demacromoléculas.Macromoléculas a serem mencionadas incluem em particularpolinucleotídeos, oligonucleotideos, fragmentos de DNA,fragmentos de RNA, proteínas, glicoproteínas, lipoproteínas,polissacarídeos, DNA, RNA, mimotopos, fragmentos de fab,fragmentos de fc, peptídeos, lectinas, peptidomiméticos,gapmers, ribozimas, oligômeros CpG, DNAzimas, "riboswitches",polímeros, hormônios, vitaminas, carboidratos, glicerídeos oulipídeos.

Uma modalidade preferida da presente invenção usaconjugados entre uma molécula de analito e uma molécula defluoróforo criptato de európio ou respectivo complexo. Deacordo com a invenção é também possível ligar duas moléculasdo mesmo analito a uma molécula de fluoróforo criptato deeurópio ou ligar respectivamente uma molécula de dois analitos diferentes a um fluoróforo criptato de európio. Poroutro lado, é também possível que duas moléculas idênticas ouaté mesmo diferentes de fluoróforo criptato de európio sejamligadas a uma molécula de analito. Isso pode ser vantajosopara aumentar a precisão da detecção de um certo analito oupara permitir a detecção simultânea de vários analitos. Alémdisso, será aparente àqueles versados na técnica que fornecerconjugados de mais de duas moléculas de analitos e/ oumoléculas de fluoróforo criptato de európio, tais como porexemplo, conjugados de três moléculas de analito idênticas oudiferentes e uma ou duas ou mais moléculas de fluoróforocriptato de európio. Isso também é verdadeiro para o térbio.

Criptatos preferencialmente usados são compostoscíclicos e particularmente biocíclicos. É adicionalmentepreferível que os criptatos tenham átomos de cabeça de ponte de nitrogênio. Adicionalmente, criptatos preferivelmentecontém um ou mais resíduos de piridina ou componentes depiridina e resíduos de bipiridina ou respectivamentecomponentes de bipiridina ou fragmentos de bipiridina sãoparticularmente preferidos. Desse modo, criptatos bicíclicostendo dois átomos de cabeça de ponte de nitrogênio sãoparticularmente preferidos.Além disso, componentes de piridina estãopreferencialmente presentes em um sistema cíclico,particularmente em um sistema bicíclico. Criptatos preferidostem a fórmula geral a seguir:

<formula>formula see original document page 21</formula>

Onde Χ, X*, X** independentemente um do outrorepresentam um resíduo de alquil, resíduo de alqueno, resíduode aril, resíduo de heteroaril, resíduo de alquilaril,resíduo de heteroarilquil, resíduo de ciclila, resíduo deheterociclila e particularmente comprometem um grupometileno, grupo etileno, grupo etilenóxi, grupo etileno,grupo alquileno amino, grupo alquilenóxi, grupo fenila, grupobifenila, grupo piridila, grupo bipiridila, grupobenzopiridila, grupo benzo bipiridila, grupo imidazol, grupopirrolinila e/ou grupo pirrolidinila.

Ciclos tendo o anel do tamanho de 16 a 20 átomos,preferivelmente 17 a 19 átomos são particularmentepreferidos. Nesse contexto, tamanho de anel significa queapenas aqueles átomos formando o menor anel em proximidade aoeurópio ou respectivamente térbio são considerados. Sistemasde anel cíclico e particularmente bicíclico tendo anéis dotamanho acima mencionado são particularmente bem adequadospara a incorporação do európio3+ (ou respectivamente Tb3+).Criptatos tris-bipiridil, criptatos dibipiridil piridil assimcomo criptatos bipiridil dipiridil, isto é, criptatos tendo6, 5, ou 4 anéis de piridil são particularmente preferidos.

Abaixo, alguns exemplos de criptatos em potencial com ousem Eu3+ ou respectivamente Tb3+ são mostrados, onde Tb3+ podeser usado ao invés de Eu3+.<formula>formula see original document page 22</formula>

Criptato európio TBP

<formula>formula see original document page 22</formula>

Criptato európio TBP4COOH<formula>formula see original document page 23</formula><formula>formula see original document page 24</formula><formula>formula see original document page 25</formula>

O analito pode ser ligado ao criptato por intermédio deinteração iônica, covalente ou lipofilica por intercalação ouincorporação bem como através de ligações de hidrogênio, emque a ligação covalente é preferida.

Desse modo, também se prefere que os criptatos contenhamum grupo funcional em pelo menos um anel, a cujo grupo oanalito pode ser ligado direta ou indiretamente através de umligador.

0 que se segue são grupos funcionais particularmenteapropriados: halogênios, grupos hidróxi, grupo carboxilato,grupo carbonila, grupo tiol, grupo amino, grupo cianato,grupo isocianato. A ligação com o analito é preferivelmenteexecutada por intermédio de uma ligação de imina, ligação deamida, ligação de éster, ligação de éter, adição de aldol,ligação de cetal, ligação de acetal, substituiçãonucleofilica, ligação de carbonato, ligação de uretano,ligação de tioéster, ligação de tioéter ou ligação de uréia.

As estruturas a seguir ilustram exemplos preferidos.

Onde o grupo carboxila ou os resíduos R representamsítios de ligação em potencial para uma molécula do analito.

Preferivelmente, somente uma única molécula dasubstância a ser detectada é ligada a uma molécula dofluoróforo de criptato európio (ou, respectivamente dofluoróforo de criptato térbio). Além disso, é essencial paraa invenção que somente um único anticorpo seja ligado pormolécula do conjugado consistindo em fluoróforo de criptatoeurópio (ou, respectivamente fluoróforo de criptato térbio) eo analito. Desse modo, ligadores potencialmente utilizadosnão devem ser de um tal comprimento que a distância entrefluoróforo de criptato európio (ou, respectivamentefluoróforo de criptato térbio) e o analito se tornesuficiente para um anticorpo especifico de fluoróforo e umanticorpo específico de analito ligar-se. Graças a efeitosestéricos, a ligação dos dois anticorpos a um conjugado éexcluída. As substâncias mencionadas acima podem ser ligadasao fluoróforo de criptato európio (ou, respectivamentefluoróforo de criptato térbio) como analitos.

Se utilizados juntamente com os criptatos mencionadosaqui, Eu3+ e Tb3+ permitem uma medição resolvida em tempo dafluorescência (TRF: fluorescência resolvida por tempo) edesse modo, uma distinção clara entre sinal medido e desegundo plano.

Outra modalidade da invenção tem como objetivo adetecção de anticorpos formados por um organismo e dirigidocontra um certo analito em vez de detectar o próprio analito.Na referida modalidade, um conjugado de analito e fluoróforode criptato európio (ou respectivamente fluoróforo decriptato térbio) é utilizado em combinação com um anticorpoespecífico de fluoróforo e o aumento em fluorescência édeterminado quando a solução de amostra é adicionada uma vezque o anticorpo específico de analito a ser detectado pelomenos desloca parcialmente o anticorpo específico defluoróforo no composto com o conjugado como a ligaçãosimultânea do anticorpo específico de analito e o anticorpoespecífico de fluoróforo é excluído.

Os métodos descritos aqui permitem uma mediçãoqualitativa e em particular quantitativa dos analitos. Alémdisso, os métodos de acordo com a invenção são vantajosos emque todos os imunoensaios convencionais (em particular todosos imunoensaios heterogêneos, como ELISA) podem ser adaptadosaos métodos de acordo com a invenção. Conseqüentemente,processos de trabalho seriam consideravelmente facilitadosvisto que os métodos, de acordo com a invenção, representamensaios homogêneos, isto é, usuários têm somente de misturarsua amostra com a amostra de medição e subseqüentementedeterminar sua fluorescência. Além disso, o processo pode serfacilmente automatizado, por exemplo, em diagnósticos derotina, por intermédio dos quais tanto tempo como dinheiropodem ser vantajosamente economizados.

Além disso, é particularmente preferido que uma certaquantidade de peróxido de hidrogênio (H2O2) seja adicionada àsolução de amostra contendo o conjugado de fluoróforo decriptato európio (ou respectivamente fluoróforo de criptatotérbio) e analito bem como o anticorpo especifico de analitoe o anticorpo específico de fluoróforo. Foi mostrado queperóxido de hidrogênio tem influências positivas sobre afluorescência, isto é, os efeitos de luminescência. Emparticular, peróxido de hidrogênio parece aumentar ourespectivamente intensificar luminescência, que resulta em umaumento significativo na medição de sensibilidade ourespectivamente permite que quantidades muito pequenas deanalito sejam medidas. 0 modo de ação de peróxido dehidrogênio, entretanto, não é claro.

Preferivelmente, pelo menos uma quantidade equimolar,com relação ao conjugado, de peróxido de hidrogênio éadicionada. Quantidades mais elevadas de peróxido dehidrogênio, como excesso molar de 2 vezes (equivalentes de 2mol), um excesso molar de 3 vezes (equivalentes de 3 mol), umexcesso molar de 5 vezes (equivalentes de 5 mol) ou umexcesso molar de 10 vezes (equivalentes de 10 mol), comrelação ao conjugado são igualmente possíveis. Portanto, operóxido de hidrogênio pode ser utilizado em uma razão molarcom relação ao conjugado de 0,1:1 a 50:1, preferivelmente de0,5:1 a 10:1, adicionalmente preferido de 0,1:1 a 4:1 eparticularmente preferido de 1:1 a 2 (H2O2): 1 (conjugado).

Outra modalidade preferida da presente invençãocompreende a adição de outro luminóforo à solução de amostrado anticorpo especifico de analito e do anticorpo especificode fluoróforo bem como do conjugado de fluoróforo de criptatoeurópio (ou, respectivamente fluoróforo de criptato térbio) eo analitor. Esse luminóforo adicional serve para transferirou respectivamente receber sinais de fluorescência(luminescência) por intermédio de FRET (transferência deenergia de ressonância de fluorescência), de modo queanalitos diferentes possam ser analisados em uma amostra demedição. O referido luminóforo adicional ou referidosluminóforos adicionais são preferivelmente denominados pontosde quantum de diferentes comprimentos de onda. Tal composiçãoconsistindo no conjugado, dois anticorpos e pontos quantumpermitem uma seleção multiplex de vários analitos diferentesem uma amostra de medição.

Além disso, a presente invenção é dirigida a umacomposição compreendendo:

a) um conjugado do analito e um fluoróforo de criptatoeurópio, (ou respectivamente fluoróforo de criptato térbio)em que o conjugado do analito e um fluoróforo decriptato európio (ou respectivamente fluoróforo de criptatotérbio) somente permite que um único anticorpo seja ligado aomesmo tempo,

b) um anticorpo especifico para o analito e

c) um anticorpo especifico para o fluoróforo de criptatoeurópio (ou respectivamente fluoróforo de criptato térbio)

A referida composição pode conter ainda peróxido dehidrogênio e/ou luminóforos adicionais como componenteadicional.

Tal composição é um componente essencial de um kit paraa detecção de vários analitos. Tal kit contém pelo menos umadas composições acima mencionadas para a detecção de um oumais analitos e um ou mais recipientes de amostra paraexecutar a reação bem como uma instrução sobre como a reaçãodeve ser realizada.

Além disso, uma composição também pode conter conjugadosdiferentes de diferentes analitos com os mesmos ou comfluoróforos de criptato európio (ou respectivamentefluoróforos de criptato térbio) diferentes e diferentesanticorpos específicos de analito para detectarsimultaneamente a presença de analitos diferentes.

O método de acordo com a invenção refere-se à realizaçãode um imunoensaio homogêneo. Em um sistema homogêneo, aamostra de medição (contendo uma pluralidade de outroscomponentes, dos quais tipo, concentração e influência sobreo sistema de medição são amplamente desconhecidos e oanalito) e o sistema de medição (contendo os componentes paragerar o sinal de medição) são combinados. Diretamente apósisso, a medição é executada, isto é, todos os componentes daamostra de medição (mesmo aqueles que influenciam de formanão específica e conseqüentemente adulteram o sistema demedição e desse modo o sinal de medição) permanecem nosistema. As referidas interferências podem ser somentecontroladas desde que as medições ocorram em uma matrizdefinida (por exemplo, uma solução aquosa do analito). Taissistemas, entretanto, não têm relevância prática. Paramedições praticamente relevantes (por exemplo, em material desoro de pacientes, resíduos de produção ou digestões deamostras de solo) o sinal de medição e o sinal de segundoplano têm de ser distinguidos. Somente se esses pré-requisitos forem atendidos, as vantagens do sistema homogêneocom relação à simplicidade do processo de medição e a reduçãoresultante de tempo e trabalho se tornarão evidentes.

O método, de acordo com a invenção, é um imunoensaio deresfriamento de fluorescência homogêneo. Os contextosdescritos anteriormente são também válidos para esse sistema.Os sistemas utilizando fluoróforos "simples" (comofluoresceína) são conhecidos há aproximadamente 20 anos -porém, nunca tiveram relevância prática devido aos motivosdescritos, apesar da função inquestionável do sistema e suasvantagens óbvias. O problema que não tinha sido resolvido atéo presente consistia nos efeitos de matriz descritos.

Na mistura de amostra de medição e sistema de mediçãonão somente o fluoróforo como também uma pluralidade deoutros componentes a partir da amostra de medição (porexemplo, proteínas de soro) é excitada de tal modo que setornam fluorescentes. Nesse contexto, a emissão de luz nosreferidos fluoróforos ocorre na mesma janela de tempo que aemissão dos componentes que permanecem na mistura de mediçãoda amostra de medição. O tipo e intensidade do sinal desegundo plano dependem da composição individual da amostra demedição e não podem ser determinados antecipadamente. Comoresultado, as medições de amostras de medição praticamenterelevantes (como soros de pacientes) não podem serrealizadas.

Entretanto, tais problemas podem ser resolvidos porintermédio de medição de fluorescência resolvida em tempo(TRF) . Para a referida finalidade, os fluoróforos utilizadosaté o presente são deslocados por quelatos ou respectivamentecriptatos dos elementos térbio e európio. Devido a transiçõesde energia isenta de radiação no referido complexo a emissãode luz é retardada. Como descrito anteriormente, oscomponentes da amostra de medição bem como o fluoróforo sãoexcitados de tal modo que se tornam fluorescentes ao mesmotempo. 0 sinal de medição, entretanto, pode ser detectadoapós a fluorescência de segundo plano ter desvanecido. Dessemodo, amostras praticamente relevantes também podem seranalisadas. Isso é tornado possível pela combinação doprincípio de teste homogêneo com uma medição da fluorescênciaresolvida em tempo.

O método de acordo com a invenção é, portantoparticularmente apropriado para medir amostras que incluemuma pluralidade de outros componentes, como amostras desangue ou amostras de solo, sem exigir uma purificação préviada amostra de medição.EXEMPLOS

Exemplo 1:

1) Preparação de um soro imune contra criptato európioTBP

Imunização de um camundongo balb/c com:

50 μg de estreptavidina - criptato de európio TBP - Iaimunização

25 μg de estreptavidina - criptato de európio de TBP -2a imunização (após um mês)

tirar sangue e extração de soro (conhecido peloespecialista)

2) Detecção da ligação de criptato de európio TBP pelosoro (figura 1)

Preparação de um conjugado de teste:

Acoplamento de criptato de európio TBP pela ligação degrupos amino livre por intermédio de glutaraldeido de acordocom os métodos conhecidos por uma pessoa versada na técnica.

Detecção de ligação de anticorpo para conjugado BSA emLISA

3) Detecção de resfriamento de fluorescência devido àligação de anticorpos a criptato európio TBP (figura 2)

Amostra de medição (150 μΐ) consistindo em:

Criptato de európio TBP 1:200000 (concentração final) 75μl

Soro imune contra Criptato de európio TBP série dediluição 75 μl ou respectivamente

Três soros pré-imunes (círculos)

Três soros imunes contra três outros antígenos(quadrados)

Medição fluorescente:

Excitação 337 nra; emissão 620 nm:

4) Detecção do deslocamento do anticorpo de ligação defluoróforo pelo anticorpo de ligação de analito (figura 3)

Preparação de um conjugado de analito (fluoresceina) efluoróforo (criptato de európio)

Isotiocianatos de fluoresceína (FITC) e criptato deeurópio TBP (0,03 mM) foram reagidos em uma razão molar de2:1. PBS foi utilizado como meio e o tempo de reação foi de 4horas em temperatura ambiente.

Amostra de medição (150 μΐ) consistindo em:

Conjugado 1:200000 (concentração final) 75 μl

Soro imune contra criptato európio TBP 1:200(concentração final) 37,5 μΐ

Anticorpo DE-I (anticorpo antifluoresceina) ourespectivamente 37,5 μΐ

Medição de fluorescência:

Excitação 337 nm; emissão 620 nm.

A figura 3 exibe os valores medidos das amostras demedição números 1 a 4.

<table>table see original document page 33</column></row><table>

Exemplo 2: Experimentos com relação a quelato de európio

Objetivo

Detecção de anticorpos policlonais que resfriam afluorescência de quelatos de európio em amostras de soro

Sistema de modelo

Animais de teste (camundongos balb/c) foram imunizadoscom conjugados de OVA/quelato de európio (OVA = ovalbumina).

As amostras de soro preparadas foram testadas em relação àsua característica de resfriamento brusco da fluorescência deum conjugado de BSA/quelato de európio. O quelato de európioutilizado foi [EuL] tendo a seguinte estrutura, onde Lnrepresenta európio:<formula>formula see original document page 34</formula>

Preparação do conjugado de proteína/quelato de európio:

O quelato de európio [EuL] estava presente na forma de éster de NHS. 0 acoplamento às proteínas de veículo BSA(albumina de soro bovino) e OVA ocorreu durante a noite emtemperatura ambiente em tampão de fosfato, pH 7,4.

Subseqüente ao acoplamento, o conjugado foi dialisadocontra PBS e utilizado no teste sem purificação oucaracterização prévia.

Imunização dos animais de teste com [EuL]-OVA e extraçãode soro

2 camundongos balb/c:

A primeira imunização foi realizada com 100 μg deconjugado em adjuvante de Freund completo. A segundaimunização ocorreu após um mês com 50 μg do conjugado sem oadjuvante. 0 sangue foi tirado uma semana após a 2aimunização.

Teste dos soros imunes para resfriamento brusco dafluorescência de um conjugado [EuL]-BSA

A amostra de medição é composta de 75 μΐ das amostras desoro diluído e 75 μΐ de conjugado de [EuL]/BSA (diluição1:10000; concentração final). Todos os componentes da amostrade medição foram diluídos em PBS-NKS (5% de soro de vitelo em PBS).

A fluorescência foi medida após uma hora no criptor(Cezanne). A excitação foi causada por intermédio de um laserde nitrogênio em 337 nm; a medição resolvida em tempo dafluorescência foi realizada em 620 nm.

Resultado

Um soro TW906-1 (soro a partir da imunização 906-1)mostrou o efeito de resfriamento brusco de fluorescênciadesejado, isto é, anticorpos estavam presentes no soro cujosanticorpos resfriaram bruscamente (em analogia ao criptato) afluorescência de quelatos de európio (vide a figura 4).

Exemplo 3: Experimentos com relação ao criptato deeurópio de hapteno

Objetivo

Detecção do deslocamento de um anticorpo monoclonalresfriando bruscamente a fluorescência de európio a partir desua ligação com um conjugado de hapteno (molécula pequena) efluoróforo (criptato de európio) por intermédio de umasegunda molécula ligando o hapteno no conjugado bem como usodo referido efeito para determinar a concentração do hapteno.

Sistema de modelo

Um conjugado de criptato de európio (fluoróforo) ebiotina (vitamina H) (hapteno, analito) foi utilizado. 0anticorpo monoclonal G24-BA9 que resfria bruscamente afluorescência de criptatos de európio foi deslocado de sualigação para o fluoróforo pela proteína estreptavidinaligando biotina. O referido efeito poderia ser invertido poradministração externa do analito livre (biotina). As mudançasde fluorescência ocorrendo nesse contexto permitem adeterminação da concentração do analito livre (biotina).

Preparação do conjugado de criptato de európio/biotina(vitamina H) Eu (NH2)-biotina

Materiais:Criptato NH2 (cisbio) criptato NH2 = criptato de európioTBP, vide acima no texto).Biotina NHS (Fluka)

Acoplamento:

Biotina NHS e criptato NH2 foram pré-dissolvidos em

DMSO. Os dois componentes foram misturados em uma razão molarde 7 (criptato) para 1 (biotina) em uma reação deacoplamento. 0 acoplamento ocorreu durante a noite emtemperatura ambiente em um tampão de carbonato 0.1 Μ, pH 9.0.o conjugado de biotina Eu(NH2) foi utilizado sem o conjugadoser adicionalmente purificado.

Determinação da concentração de biotina (vitamina H) noimunoensaio de resfriamento brusco de fluorescência

Os quatro componentes a seguir foram misturados emreações de medição de respectivamente 150 μΐ em concentraçõesfinais especificadas:

Criptato Eu-NH2-biotina diluição 1: 300000Resfriador brusco - G24-BA9 - 20 μg/ml (anticorpo decriptato)

Anticorpo de deslocamento - estreptavidina - 3 μg/ml

Analito - biotina - diluição série 0 a 100 ng/ml

Todos os componentes da amostra de medição foramdiluídos em PBS-NKS (5% de soro de vitelo em PBS).

A f luorescência foi medida após uma hora no criptor(Cezanne). A excitação foi causada por intermédio de um laserde nitrogênio em 337 nm; a medição resolvida em tempo dafluorescência foi realizada em 620 nm.

Resultado

Estreptavidina poderia ser deslocada de sua ligação paraEu-NH2-biotina por biotina livre. Desse modo, G24-BA9 poderialigar o fluoróforo que levou ao resfriamento brusco defluorescência. Em vista dos materiais utilizados (emparticular em vista do primitivismo do conjugado usado), oensaio é surpreendentemente sensível (vide a figura 7).

Exemplo 4: Experimentos com relação a criptato deeurópio de proteínaObjetivo

Detecção do deslocamento de um anticorpo monoclonal queresfria bruscamente a fluorescência de európio a partir desua ligação a um conjugado de proteína (macromolécula) efluoróforo (criptato de európio) por intermédio de anticorposespecificamente ligando a proteína no conjugadoSistema de modelo

Um conjugado de criptato de európio (fluoróforo) eperoxidase (POD) (analito) foram utilizados. 0 anticorpomonoclonal G24-BA9 resfriando bruscamente a fluorescência decriptatos de európio foi deslocado de sua ligação para ofluoróforo pela peroxidase de ligação de anticorpo (POD). 0referido efeito poderia ser invertido por adição externa doanalito livre (POD).

Preparação do conjugado criptato de európio/peroxidase(POD Eu (NH2) -POD

Materiais:

Criptato NH2 (cisbio) (criptato NH2 = criptato deeurópio TBP, vide acima no texto).

Peroxidase (sigma)

Acoplamento:

Um grupo de aldeído reativo foi gerado nos resíduos deaçúcar do peroxidase e o POD desse modo ativado, foisubseqüentemente dessalinizado contra 0.1 M NaHC03. 0 PODdesse modo preparado foi misturado com criptato NH2 em umarazão equimolar. 0 acoplamento ocorreu durante a noite emtemperatura ambiente. Grupos de aldeído não acoplados forambloqueados por intermédio de etanol amina, pH 8, e oconjugado foi dialisado contra PBS. L conjugado Eu(NH2)-POD30 foi utilizado sem purificação adicional do conjugado.

Deslocamento de G24-BA9 a partir de sua ligação comEu(NH2)-POD por intermédio de soros anti-POD

Os quatro componentes a seguir foram misturados emreações de medição de respectivamente 150 μL nasconcentrações finais especificadas:

Criptato - Eu-NH2-POD - diluição 1:2000Resfriador brusco - G24-BA9 - 5 μς/πιΐ

Anticorpo de deslocamento - soros anti POD - diluição1:1000

Analito - POD - 20 μς/πιΐ

Todos os componentes da amostra de medição foramdiluídos em PBS-NKS (5% de soro de vitelo em PBS).

A f luorescência foi medida após uma hora no criptor(Cezanne). A excitação foi causada por intermédio de um laserde nitrogênio em 337 nm; a medição resolvida em tempo dafluorescência foi realizada em 620 nm.

Resultado:

Do total de quatro soros anti-POD, TW738 mostrou oefeito desejado. Os anticorpos policlonais contidos no soroforam parcialmente capazes de deslocar G24-BA9 de sua ligaçãopara Eu-(NH2)-P0D. 0 referido efeito poderia ser invertidopor administração do POD de analito livre (vide a figura 5).

Descrição da figura 5:

No experimento, os soros de quatro animais de testeimunizados com POD (peroxidase) foram utilizados (a.POD). Umsoro pré-imune bem como um soro imune dirigido contra BSA(albumina de soro bovino) ou respectivamente GFP (proteínafluorescente verde) foram utilizados como controles. Os sorosforam diluídos a 1:1000.

A luminescência de um conjugado Eu(NH2)/P0D foideterminada na presença do anticorpo G24-BA9 resfriandobruscamente a luminescência. Os experimentos foram executadospara testar até cujo ponto os anticorpos ligando POD contidosnos soros imunes (a.POD) foram capazes de deslocar oanticorpo G24-BA9 a partir de sua ligação para o conjugado.

Como resultado desse deslocamento, um aumento naluminescência poderia ser esperado. 0 soro TW738 a.POD mostraesse efeito. Os outros soros imunes, bem como o soro pré-imune, foram negativos.

o efeito observado no soro TW738 a.POD poderia serinvertido por administração de um excesso de POD livre. Nessecaso, os anticorpos de ligação de pOD que eram ligados noconjugado, principalmente ligaram o POD livre e não oconjugado. Desse modo, o conjugado ligado por G24-BA9 eresfriamento brusco simultâneo da luminescência foramobservados.

Deslocamento de G24-BA9 a partir de sua ligação aEu(NH2)-POD por intermédio de anticorpos monoclonais ligandoPOD

Os quatro componentes a seguir foram misturados emreações de medição de respectivamente 150 μΐ nasconcentrações finais especificadas:

Criptato - Eu-NH2POD - diluição 1:2000

Resfriador brusco - G24-BA9 - 5 μg/ml

Anticorpo de deslocamento - anticorpo anti-POD - 20ug/ml

Analito - POD - 20 μς/πιΐ

Todos os componentes da amostra de medição foramdiluídos em PBS-NKS (5% de soro de vitelo em PBS).

A fluorescência foi medida após uma hora no criptor(Cezanne). A excitação foi causada por intermédio de um laserde nitrogênio a 337 nm; a medição resolvida em tempo dafluorescência foi realizada em 620 nm.

Resultado:

0 efeito desejado podia ser observado em dois de umtotal de 33 anticorpos monoclonais de ligação de PODtestados. Anticorpos monoclonais B92-FG9 e E17-DA3 foramcapazes de parcialmente deslocar G24-BA9 a partir de sualigação com Eu(NH2)-POD. 0 referido efeito poderia serinvertido por administração do POD de analito livre. Acombinação dos dois anticorpos em uma reação provou serparticularmente bem sucedida (vide a figura 6).

Descrição da figura 6:

Os dois anticorpos monoclonais B92-FG9 e E17-DA3dirigidos contra POD foram utilizados no experimento.

A luminescência de um conjugado Eu(NH2)-POD foideterminada na presença do anticorpo G24-BA9 resfriandobruscamente a luminescência. Os experimentos foram realizadospara testar até que ponto uma mistura dos dois anticorposligando POD era capaz de deslocar o anticorpo G24-BA9 apartir de sua ligação com o conjugado. Como resultado dessedeslocamento, um aumento na luminescência poderia ser esperado.

A primeira barra ilustra a luminescência sem osanticorpos ligando pOD. A segunda barra ilustra as razões napresença dos anticorpos ligando POD. Um aumento naluminescência é observado. A terceira barra ilustra que aadição de POD livre inverte o referido efeito e reduzsignificativamente a luminescência.

Exemplo 5: Aumento em luminescência devido a peróxido dehidrogênio

Aumento na luminescência de criptatos de európio devidoa peróxido de hidrogênio

Criptato de európio TBP (Eu (TBP)-estreptavidina, 10-8 M)e peróxido de hidrogênio (peróxido de hidrogênio uréia, 10-5%) foram utilizados no experimento. 0 volume de medição erade 400 μΐ. A luminescência foi medida em um espectrômetro degrade ICCD (Andor).

Como resultado, a luminescência do criptato de európioTBP foi aumentada em 30% devido à adição de peróxido dehidrogênio (vide a figura 8).

Exemplo 6: experimentos com relação a quelato de térbioObj etivo

Detecção de anticorpos policlonais resfriandobruscamente a fluorescência de quelatos de térbio em amostrasde soro

Sistema de modelo

Animais de teste (camundongos balb/c) foram imunizadoscom conjugados de OVA/quelato de térbio como descrito noexemplo 2. Similarmente, o mesmo criptato do exemplo 2 foiutilizado, com a diferença de que nesse exemplo Ln representatérbio [TbL].

Preparação dos conjugados de quelato de térbio/proteinaO quelato de térbio [TbL] estava presente na forma deNHS-éster. O acoplamento às proteínas veiculo BSA (albuminade soro bovino) e OVA ocorreu durante a noite em temperaturaambiente em tampão de fosfato, pH 7,4.

Subseqüente ao acoplamento, o conjugado foi dialisadocontra PBS e utilizado no teste sem purificação prévia oucaracterização.

Imunização dos animais de teste com [TbLj-OVA e extraçãode soro

2 camundongos balb/C foram imunizados como descrito noexemplo 2.

Teste do soro imune em relação a sua característica pararesfriar a fluorescência de um conjugado [EuL]-BSA

A amostra de medição foi composta de 7 5 μΐ das amostrasde soro diluído e 75 μΐ de conjugado [TbL] -BSA (diluição1:1000; concentração final). Todos os componentes da amostrade medição foram diluídos em PBS-NKS (5% de soro de vitelo emPBS) .

A f luorescência foi medida após uma hora no criptor(Cezanne). A fluorescência de quelato de térbio foideterminada em 54 5 nm.

Resultado:

Os dois soros, TW907-1 (soro a partir da imunização 907-1) e TW907-2 (soro a partir da imunização 907-2) mostraramefeito de resfriamento brusco de fluorescência, isto é,anticorpos estavam presentes no soro, cujos anticorposresfriaram bruscamente (em analogia ao criptato) afluorescência de quelatos de térbio (vide a figura 9).

Claims (18)

1. Método para detecção de um ou mais analitos,caracterizado pelo fato de que o método compreende asseguintes etapas:a) fornecer os seguintes três componentes- um conjugado do analito e um fluoróforo de criptato deeurópio ou um fluoróforo de criptato de térbio,- um anticorpo especifico para o analito, e- um anticorpo especifico para o fluoróforo de criptatode európio ou especifico para o fluoróforo de criptato detérbio, em que o conjugado do analito e um fluoróforo decriptato de európio ou o conjugado do analito e um fluoróforode criptato de térbio permite somente que um único anticorposeja ligado,b) adição do analito, ec) medição espectroscópica da fluorescência dosfluoróforos de criptato de európio ou medição espectroscópicada fluorescência dos fluoróforos de criptato de térbio.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado por compreender peróxido de hidrogênio.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2,caracterizado por compreender pelo menos um luminóforoadicional.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que uma ligaçãocovalente entre uma molécula de analito e uma molécula dofluoróforo de criptato de európio está presente no conjugadode analito e fluoróforo de criptato de európio ou em que umaligação covalente entre uma molécula de analito e uma molécula do fluoróforo de criptato de térbio está presente noconjugado de analito e fluoróforo de criptato de térbio.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesanteriores, caracterizado pelo fato de que o analito éselecionado do grupo que compreende:patógenos, vírus, priônios, bactérias, parasitas,produtos farmacêuticos, antibióticos, citostáticos,substâncias psicoativas, narcórticos, analgésicos, drogascardíacas, metabólitos, inibidores de coagulação, hormônios,interleucinas, citocinas, drogas para melhorar o desempenho,drogas, toxinas, substâncias nocivas, pesticidas,inseticidas, conservantes de madeira, herbicidas, fungicidas,explosivos, vitaminas e sabores.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesanteriores, caracterizado pelo fato de que a razãò deanticorpo específico para o analito e anticorpo específicopara o fluoróforo de criptato de európio é definida e, em quea razão de anticorpo específico para o analito e anticorpoespecífico para o fluoróforo de criptato de térbio édefinido.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesanteriores, caracterizado pelo fato de que o fluoróforo decriptato de európio ou o fluoróforo de criptato de térbiocompreende um criptato de tris-bipiridina.

8. Composição, caracterizada por compreender:a) um conjugado do analito e um fluoróforo de criptatode európio, em que o conjugado do analito e um fluoróforo decriptato de európio permite somente que um único anticorposeja ligado,b) um anticorpo específico para o analito ec) um anticorpo específico para o fluoróforo de criptatode európio.

9. Composição, caracterizada por compreender:a) um conjugado do analito e um fluoróforo de criptatode térbio, em que o conjugado do analito com um fluoróforo decriptato de térbio permite somente que um único anticorposeja ligado,b) um anticorpo específico para o analito, ec) um anticorpo específico para o fluoróforo de criptatode térbio.

10. Composição, de acordo com a reivindicação 8 ou 9,caracterizada por compreender peróxido de hidrogênio.

11. Composição, de acordo com a reivindicação 8, 9 ou-10, caracterizada por compreender pelo menos um luminóforoadicional.

12. Kit para detecção de pelo menos um analito,caracterizado por compreender:a) um conjugado do analito e um fluoróforo de criptatode európio, em que o conjugado do analito e um fluoróforo decriptato de európio permitem somente que um único anticorposeja ligado,b) um anticorpo especifico para o analito ec) um anticorpo especifico para o fluoróforo de criptatode európio.

13. Kit para detecção de pelo menos um analito,caracterizado por compreender:a) um conjugado do analito e um fluoróforo de criptatode térbio, em que o conjugado do analito com um fluoróforo decriptato de térbio permite somente que um único anticorposeja ligado,b) um anticorpo especifico para o analito, ec) um anticorpo especifico para o fluoróforo de criptatode térbio.

14. Kit, de acordo com a reivindicação 12 ou 13,caracterizado por compreender peróxido de hidrogênio.

15. Kit, de acordo com a reivindicação 12, 13 ou 14,caracterizado por compreender pelo menos um luminóforoadicional.

16. Conjugados do analito e um fluoróforo de criptato deeurópio, ou conjugados do analito e um fluoróforo de criptatode térbio, caracterizados pelo fato de que o analito éselecionado do grupo que compreende:patógenos, virus, priônios, bactérias, parasitas,produtos farmacêuticos, antibióticos, citostáticos,substâncias psicoativas, narcórticos, analgésicos, drogascardíacas, metabólitos, inibidores de coagulação, hormônios,interleucinas, e citocinas, drogas para melhorar odesempenho, drogas, toxinas, substâncias nocivas, pesticidas,inseticidas, conservantes de madeira, herbicidas, fungicidas,explosivos, vitaminas, sabores e o fluoróforo de criptato deeurópio ou o fluoróforo de criptato de térbio compreende umcriptato de tris-bipiridina.

17. Conjugados, de acordo com a reivindicação 16,caracterizados pelo fato de que o analito é covalentementeligado ao fluoróforo de criptato de európio ou ao fluoróforode criptato de térbio.

18. Uso dos conjugados, como definidos na reivindicação-16 ou 17, caracterizado pelo fato de que a detecção deanalitos selecionada do grupo que compreende:patógenos, virus, priônios, bactérias, parasitas,produtos farmacêuticos, antibióticos, citostáticos,substâncias psicoativas, narcórticos, analgésicos, drogascardíacas, metabólitos, inibidores de coagulação, hormônios,interleucinas, citocinas, drogas para melhorar o desempenho,drogas, toxinas, substâncias nocivas, pesticidas,inseticidas, conservantes de madeira, herbicidas, fungicidas,explosivos, vitaminas e sabores.