BRPI0619599A2 - método para inibir células de linhagem de tumor e para inibir o crescimento de tumores em um paciente - Google Patents

Abstract

<UM>MéTODO PARA INIBIR CéLULAS DE LINHAGEM DE TUMOR E PARA INIBIR O CRESCIMENTO DE TUMORES EM UM PACIENTE<MV>. Descrevem-se neste contexto métodos para inibir o crescimento de tumores que compreendem alvejar uma célula de linhagem de tumor no paciente com um agente ou tratamento que modifica quimicamente uma molécula especifica de célula de linhagem de tumor, impedindo desta forma a proliferação de células de linhagem de tumores.

Description

MÉTODO PARA INIBIR CÉLULAS DE LINHAGEM DE TUMORES E PARA INIBIR O CRESCIMENTO DE TUMORES EM UM PACIENTE

Pedido Relacionado

O presente pedido reivindica o beneficio do pedido provisório U.S. No. 60/748.951, depositado em 9 de dezembro de 2005. A totalidade dos ensina- mentos do pedido supracitado fica incorporada neste contexto por referência.

Antecedentes da Invenção

Os cientistas reconheceram a semelhança das células de tumores e construções de tecidos pato- lógicos (tais como teratocarcinomas) com as células e tecidos de embriões prematuros. Células de linhagem embrionárias normais, mas não diferenciadas foram ca- pazes de dar origem a órgãos por processos indefini- dos os quais, logicamente, tiveram de incluir rápido aumento no número de células e diferenciação para an- lage de órgão e subseqüente organogênese. Os tumores malignos desenvolvem-se em proporções similares aos fetos prematuros e contêm nichos que são seja histo- logicamente não diferenciados ou organizados com uma aparência de tecido normal.

Adicionalmente aos glicosoaminoglicans antigênicos complexos na superfície da célula, os "antigenos carcino-embrionários", moléculas envolvi- das na aderência de células e reestruturação de teci- do, por exemplo, caderinas, cateninas, metaloprotea- ses, são expressos em tecidos fetais e tumores.

Os tumores imitam o uso mitocondrial de aminoácidos para reduzir oxigênio sob as condições hipóxicas de tecidos fetais prematuros.

A oncogênese, da mesma forma que a onto- gênese, parece originar-se por descendência linear através de um conjunto desdobrável de células de li- nhagem. Somente uma pequena fração de células prove- nientes de um tumor humano têm a capacidade de formar novos tumores como xenoenxertias em roedores imuno- suprimidos. Experiências de xenoenxertias de dilui- ção limitantes mostraram que uma ou mais células en- tre as células tumorigênicas putativas exibem propri- edades semelhantes a células de linhagem em que elas são capazes de gerar novos tumores que contêm células inflexíveis adicionais, bem como de regenerar as po- pulações fenotipicamente misturadas de células pre- sentes no tumor original.

O conceito de capacidade de monoclonagem de tumores foi estabelecido nos inícios de 1900, e no século 20 foi determinado que praticamente todas as formas de câncer inicial-tardio passam por um período prolongado de pré-neoplasia e que estas colônias pré- neoplásticas eram elas próprias monoclonais e resultan- tes de mais que uma mutação citogenética incomum a par- tir do DNA embrionário. No começo do século 21, tenta- tivas diretas de se enriquecerem populações de células de tumores com células de "linhagem" para experiências de transplante/diluição demonstraram que não só eram as células de linhagem de tecido as células com toda a probabilidade de origem de pré-neoplasia, mas que os próprios tumores continham células de "linhagem". Foi sugerida moderna reiteração da hipótese de que os tu- mores são, com efeito, estruturas fetais heterogêneas consideravelmente bem organizadas. Era de se esperar que células de linhagem "carcinoembrionária" aumentas- sem em número e dessem origem a tipos de células dife- renciadas povoando os nichos altamente heterogêneos dentro da massa do tumor. Entretanto, o reconhecimen- to de células como células de linhagem no desenvolvi- mento de órgãos e tumores, ainda não foi consumado.

Foram usados vários marcadores antigênicos empregados por todo o campo de células de linhagem pa- ra enriquecer células capazes de regenerar tecidos ou tumores freqüentemente para um alto grau. Entretanto, nenhumas células dentro destas populações enriquecidas demonstraram qualquer propriedade celular morfológica microscópica que as marcasse como células de linhagem. Se for verdade que tumores resultam de uma única célu- la de linhagem, é requerido um meio para identificá- las e coletá-las como uma população de células de li- nhagem homogênea suficiente para análise de analitos moleculares e bioquímicos. Somente então poderá al- guém focar a potência de tecnologias de ordem macromo- lecular (genômica, proteômica, glicômica e outras) e formas poderosas de análise bioquímica, tais como es- pectrometria de ressonância magnética nuclear de ângu- lo mágico.

Sumário da Invenção

A invenção refere-se a métodos para iden- tificação de células de linhagem de tumor e para des- truir seletivamente e especificamente células de linha- gem de tumor sem ou com prejuízo mínimo para as células de linhagem normais ou de manutenção em seu ambiente próximo. Expõe-se neste contexto a descoberta inespe- rada de que células de linhagem de tumor contêm núcleos onde, durante a divisão nuclear, o genoma é, durante um período de tempo significativo e utilizável, DNA substan- cialmente torcido único (ssDNA). Pela utilização de agen- tes, por exemplo, agentes químicos ou enzimáticos, que vi- sam e alteram ssDNA (por exemplo, reagentes de alquilação, nucleases específicas de cordão único, agentes que visam maquinismos de replicação, agentes que visam segregação e agentes que visam uma ou mais moléculas específicas de cé- lulas de linhagem), o material nuclear de células de Ii- nhagem de tumor é visado para destruição, uma vez que o ssDNA modificado seria incapaz de sofrer outra replicação de volta ao DNA de cordão duplo (dsDNA) . Uma molécula es- pecífica da célula de linhagem de tumor é uma molécula presente nas células de linhagem de tumor, preferentemente no núcleo, e não nas células das células circundantes. Moléculas específicas de células de tumor específicas po- dem ser visadas, pelo que a visagem e interrupção da fun- ção ou atividade da molécula específica de célula de li- nhagem de tumor impedem ou inibem o crescimento de cé- lulas de tumor. Por exemplo, qualquer agente que impe- de a replicação de ssDNA, por exemplo, uma molécula que torna híbrido o DNA, mas é incapaz de ser estendido, por exemplo, um oligo-nucleotídeo modificado ou deriva- do de ácido nucléico, por exemplo, um ácido nucléico do fosfato-7 necessário para extensão ou um ácido nucléico de peptídio. São conhecidos métodos na técnica desti- nados a distribuir agentes ou tecido de tumor em um pa- ciente, onde esses agentes impedirão a replicação do genoma ssDNA, e dessa maneira impedirão a proliferação das células de linhagem de tumor.

De acordo com uma concretização, métodos destinam-se à prevenção ou inibição seletiva de cresci- mento (por exemplo, divisão nuclear ou celular) de cé- lulas de linhagem de tumor sem impedir ou inibir subs- tancialmente o crescimento das células circundantes (por exemplo, manutenção das células de linhagem). Em particular, enquanto a célula de linhagem visada está sendo submetida à divisão nuclear, o método compreende contactar a célula com um agente capaz de entrar no nú- cleo da célula e modificar ou alterar o ssDNA do nú- cleo, resultando na prevenção ou na inibição de maior di- visão nuclear e celular da célula visada.

De acordo com outra concretização, métodos destinam-se a um método para inibir o crescimento de tumor em um paciente que compreende a visagem de uma célula de linhagem de tumor no paciente com um agente ou tratamento que altera ou modifica uma molécula especifica de célula de linhagem de tumor (por exemplo, ssDNA), impedindo ou inibindo desta forma a replicação de ssDNA e finalmente impedindo ou inibindo a proliferação de células de linha- gem de tumor. Em uma concretização particular, o agente objetiva uma molécula especifica de célula de linhagem de tumor que é sintetizada dentro da célula e segrega nos nú- cleos campaniformes filiais. De acordo com uma concreti- zação, a molécula especifica de célula de linhagem de tu- mor é DNA de torça única (ssDNA). Em outra concretização, o agente é um agente químico, radio agente, enzima ou tra- tamento por radiação, pelo que é visada uma molécula espe- cífica de célula de tumor.

Breve Descrição dos Desenhos

A Figura 1 é um sumário de imagens explica- tivas. A) Exemplos de morfotipos nucleares observados nas células de interfase e prófase prematura (E.P.) em intes- tino fetal humano, mucosa de cólon normal, adenomas e ade- no-carcinomas. B) Imagem de alta resolução (x 1400) de nú- cleos campaniformes de intestino fetal. DNA condensado parece criar um anel que mantém uma abertura na estrutura de sino oco. Escala gráfica, 5 μm.

As Figuras 2A e B são imagens de intestino embrionário, 5-7 semanas. Figura 2A: Imagem de contraste de fase (quadro esquerdo) e imagem de núcleos coloridos (do meio) e a imagem transfundida (direita) mostram as disposições lineares de núcleos dentro do sincício tubular de -50 micrometros de diâmetro. Figura 2B: Imagem de alta resolução dos núcleos mostra estruturas campaniformes o- cas. A orientação "da cabeça aos pés" dos sinos é preser- vada em todos os tubos embrionários observados, mas os tu- bos coleiam para trás e para diante de forma tal que tubos paralelos podem ter orientação dos núcleos campaniformes antiparalela localmente. Escalas gráficas, 50 μm em am- pliação baixa e 5μm em ampliação alta.

As Figuras 3A-D mostram imagens de fissão nuclear de núcleos campaniformes em intestino fetal. Fi- guras 3A e B: Fissão nuclear simétrica. Núcleos campani- formes emergem a partir de núcleos campaniformes de forma assemelhada. Figuras 3C e D: Fissão nuclear assimétrica. Um núcleo esférico e um núcleo em forma de charuto emergem de um núcleo campaniforme. Escala gráfica, 5 μm.

As Figuras 4A-C mostram imagens provenientes de foliculos de cólon adultos normais. Figura 4A: Folicu- los de cerca de 2000 núcleos esferóides, esféricos ou dis- cóides ocasionalmente (<1/100) continham um núcleo (seta) campaniforme reconhecível localizado no fundo do folículo. Figura 4B: Base de folículo mostrando outro núcleo campa- niforme. Figura 4C: Morfotipos de núcleos de interfase e mitóticos das paredes e da superfície luminal em um folí- culo bem estendido. As imagens ampliadas mostram: (i) nú- cleos de interfase esféricos e ovóides, (ii, iii) prófases prematuras de núcleos de forma esférica e oval, e (iv) e um núcleo anatelofase. Escalas gráficas, 100 μm para ima- gens de baixa e 5 pn para imagens de alta ampliação.

As Figuras 5A-E mostram imagens a partir de Adenomas. Figura 5A: Foliculo de adenomas de rami- ficação ampla característica. Figura 5B: Uma estru- tura semelhante a foliculo irregular encontrada por toda a parte de adenomas. Tipicamente dois, mas por ve- zes 1, 4 ou mesmo 8, núcleos campaniformes (insertos) apa- recem na base destas estruturas grandes semelhantes a fo- liculo irregulares (>4000 células). Figura 5C: Um cacho de células de morfótipo nuclear similares que contém um núcleo campaniforme. Estas formas de cachos contêm exata- mente um total de 16, 32, 64, e 128 células. Painel es- querdo, coloração de Feulgen-Giemsa. Painel direito, ima- gem autofluorescente de contraste de fase. Figura 5D: Contextos em que núcleos campaniformes aparecem nos adeno- mas: (i) Cacho com 31 núcleos ovóides e um núcleo campa- niforme, (ii) Múltiplos núcleos campaniformes em disposi- ção de ombro com ombro, (iii) Núcleos campaniformes dis- postos em um padrão lado a lado (seta), (iii). Mistura ir- regular de - 2 50 núcleos com vários núcleos campaniformes sugestivos de base de foliculo nascente. Figura 5E: Es- trutura semelhante a foliculo irregular que contém aparen- temente emplastros clonais de células de 5 diferentes mor- fotipos nucleares com um núcleo campaniforme (seta) na ba- se. Escalas gráficas, 100 μm (em "a,b") e 5μm (em "e") .

As Figuras 6A-E mostram imagens provenien- tes de adenocarcinomas. Figura 6A: Estruturas semelhan- tes a folículos muito grandes (células >8000), com ra- mificações com pontos de ruptura freqüentes. A seta indica um exemplo de uma estrutura semelhante a folícu- lo de -250 células, encontrada principalmente perto da su- perfície do tumor. Figura 6B: Massa de tumor interior com múltiplos núcleos campaniformes (~3% de todos morfotipos nucleares). Figura 6C: Núcleos campaniformes na Figura 6B orientados nas configurações sinciciais da cabeça aos pés e não-sinciciais lado a lado. Figura 6D: Fissão nuclear simétrica em adenocarcinoma. Figura 6E: Fissão nuclear assimétrica de um sino que cria um núcleo em forma de cha- ruto em adenocarcinoma. Estruturas assemelhadas foram ob- 10 servadas em metástases cólicas para o fígado. Escala grá- fica, 5 μm.

As Figuras 7A-D são ilustrações dos está- gios em citometria de imagem quantitativa no estudo em tecidos e células humanos. Figura 7A: Descarte cirúr- gico de cólon recente pronto para fixação. Figura 7B: Preparação de lamina microscópica que mostra o resultado do desenvolvimento de uma seção de 1 mm através de um pó- lipo (posicionamento de um pólipo, salientado de cima para baixo). Figura 7C: Desdobramentos de núcleos de células (na cor magenta) observáveis para os folículos completos. Todos os núcleos de folículos são preservados, quando comparados com as seções de 5 μ (coloração de BrdU e co- loração de H&M), ilustradas anteriormente. Figura 7D: Es- tação de trabalho para análise de imagem de software "A- xioscop microscope-AxioCam color CCD camera-KS 4 00" moto- rizada .

As Figuras 8A e B são ilustrações de um "alvo de interesse" na aplicação de FISH para explorar núcleos campaniformes não-divididos e divididos em tumo- res. Figura 8A: Tratamento com cromato (coloração mais escura por cauda do teor de DNA mais elevado por μm2) cria os cromossomas de prófase que lembram a estrutura única dispostos como dois círculos paralelos. Estes cír- culos colocados no desenho ilustram a predição destes cromossomas específicos pode ser encontrada neste local específico dos núcleos campaniformes. Figura 8B: Distri- buição de tratamento com cromato e alterações de posicio- namento de cromossomas específicos como transformação i- maginária (núcleos "campaniformes para ovais" neste caso) tomando lugar por toda a divisão assimétrica dos núcleos campaniformes.

As Figuras 9A-D são imagens que ilustram os resultados de hibridização fluorescente in situ do cro- mossoma 11 nos núcleos esféricos de células humanas TK- 6. Figura 9A: Dois pares de cromossomas em desdobramentos de cromossomas prófase. Figura 9B: Coloração nuclear DA- PI de núcleos esféricos. Figura 9C: O mesmo par de cro- mossomas hibridizado com sonda de fluorescência FITC. Fi- gura 9D: Imagem fundida de coloração de cromossomas de interfases DAPI e FITC. Escala gráfica, 5 micrômetros.

A Figura 10 mostra imagens de divisão nucle- ar simétrica de núcleos campaniformes dispostos em sincí- cios.

A Figura 11 mostra imagens que ilustram a localização de DNA em núcleos campaniformes submetidos a divisão nuclear. A Figura 12 mostra a disposição e composi- ção (ssDNA ou dsDNA) de material nuclear durante a divi- são nuclear de núcleos campaniformes.

As Figuras 13A-D mostram imagens provenien- tes de preparados fetais humanos que ilustram uma série de formas nucleares anteriormente não reconhecidas. Es- tas formas dão origem aos núcleos campaniformes origi- nais. A Figura 13A mostra um núcleo com uma condensação de -10% do teor total de DNA como um "cinto" em torno do eixo longitudinal dos núcleos esféricos ou levemente o- vais. A Figura 13B mostra um núcleo em que dois "cintos" nucleares condensados parecem estar separados, mas são ainda parte de um único núcleo. A Figura 13C mostra um par de núcleos que parecem ter surgido por fissão dos nú- cleos duplamente cintados da Figura 13B. A Figura 13D mostra que cada sincicio contém um conjunto de sinos com um único par de sinos no seu ponto mediano linear com as bocas voltadas como na Figura 13C. Estas imagens mostram que uma série de divisões simétricas criam núcleos que são afastados em relação a um par central.

As Figuras 14A e B mostram morfotipos nucle- ares em adenoma de cólon (Figura 14A) e adenocarcinomas (Figura 14B). Morfotipos de carcinogênese mostram cintos similares - um ou dois em torno do eixo longitudinal dos núcleos ovais.

As Figuras 15A-C mostram a coloração FISH especifica para centrômeros humanos. A Figura 15 mostra centrômeros (brilhantes) em núcleos de forma esférica (na Figura 15A), "charuto"- (na Figura 15B) e sino- (na Figura 15C) provenientes de tecidos de cólon fetal humano de 12 semanas.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção está relacionada com a descoberta inesperada de que células de linhagem de tu- mor, por exemplo, células que se dividem conduzindo a tumores, sofrem uma divisão nuclear assimétrica. Nú- cleos campaniformes, não encontrados em tecidos adultos exceto para tecidos de tumores, passam por períodos de tempo onde o genoma é representado como DNA de torcida única (ssDNA). Este aspecto de núcleos campaniformes que se dividem assimetricamente permite a objetivação específica de células que contém esses núcleos, por exemplo, células de linhagem de tumor, para identifica- ção e destruição.

As estruturas com núcleos campaniformes são dotadas de qualidades semelhantes a células de li- nhagem em tumores humanos.

Neste contexto descrevem-se métodos que se baseiam na descoberta inesperada de que núcleos campani- formes dividem-se tanto simétrica quanto assimetricamente por processos de fissão não mitóticos em tumores humanos de cólon e pancreáticos (Gostjeva et al., 2005, Câncer Genetics and Cytogenetics, no prelo). Estes núcleos cam- paniformes aparecem em grandes números em intestino poste- rior embrionário em 5-7 onde eles são encerrados em sincí- cios tubulares e compreendem 30% de todos os núcleos e te- cidos de tumores onde eles existem em abundância em nichos "não diferenciados". Eles possuem diversas qualidades se- melhantes às células de linhagem, particularmente o "cri- tério" de divisão assimétrica e uma freqüência de fissão nuclear coerente com taxas de crescimento de tecido prene- oplástico e neoplástico de cólon humano (Herrero-Jimenez et al., 1998, 2000). Estas formas nucleares anteriormen- te não reconhecidas são elas duas a fonte de geração e di- ferenciação de tumores e deste modo objetivos para estra- tégias terapêuticas de cânceres.

As estruturas (por exemplo, células, es- truturas semelhantes a células ou sincicios) que con- têm núcleos campaniformes representam as células de li- nhagem de tumor. A sua modalidade amitótica de fissão nuclear requer maquinismo molecular que definirá objeti- vos moleculares os quais não são expressos em células de linhagem de manutenção embrionária (blastômeros) e de adul- to que parecem dividir-se por mitose. Por exemplo, a ob- servação de que estes núcleos campaniformes passam por um estágio onde o genoma é representado por ssDNA permitirá a sua objetivação e destruição. A exploração de como os nú- cleos campaniformes são organizados espacialmente, como a cromatina é dispersa nos núcleos, de se cromossomas espe- cíficos ou não ocupam territórios específicos totalmente pelo interior da lamina nuclear sugerirão busca de objeti- vos terapêuticos mais específicos e proporcionarão compre- ensão adicional da relação entre o morfótipo nuclear (for- ma) e a expressão de genes. Expõe-se neste contexto a descoberta de uma sucessão de formas nucleares fechadas distintas em adeno- mas e adenocarcinomas de cólon, de intestino posterior fe- tal, que parecem decorrer ab initio de fissão nuclear as- simétrica proveniente de núcleos campaniformes, mas subse- qüentemente dividem-se por mitose e expiram por apoptose. 0 conjunto compartilhado de formas nucleares em embriões e tumores que estão ausentes no tecido adulto sustentam a hipótese do século 19 de que tumores eram desenvolvimentos embrionários em organismos adultos (Cohnheim, J., Vir- chows Arch., 65:p.64, 1875; Sell, S., Crit. Rev. Onc. Hematol., 51:1-28, 2004).

Os métodos descritos neste contexto permi- tem que aquele versado na técnica realize in vivo a análise de pontos extremos citogenéticos dos núcleos de diferentes morfologias, com ênfase especial em núcleos campaniformes em tumores do cólon, pancreático, renal, dos ovários e outros tumores, com base em técnicas de a- nálise de imagem de micro-cópia e quantitativa de alta re- solução do estado da técnica.

As estruturas nucleares, teor de DNA e a distribuição especial de cromossomas em núcleos campa- niformes de células e sincicios podem ser caracteriza- das por métodos conhecidos daqueles versados na técni- ca, por exemplo, por meio de citometria de imagem quan- titativa e microscopia confocal. Por exemplo, essas técnicas permitem que aquele versado na técnica determine o teor de DNA total, e utilize reagentes específicos, tais como, por exemplo, sondas de hibridização de DNA laranja acridina ou torcida específica, para diferençar o ssDNA em relação ao DNA de torcida dupla (dsDNA). Esta informação pode ser usada para diferençar núcleos campaniformes de diferentes morfologias, tipos de tumores (de cólon contra pancreático) e nichos dentro dos tumores. Estas técnicas também podem ser usadas para caracterizar o progresso da síntese de DNA e detector a presença de proteínas associa- das com, por exemplo, síntese de DNA e segregação em nú- cleos campaniformes durante a fissão nuclear das formas simétricas e das diferentes formas assimétricas. Isolamento de células e sincícios com núcleos campanifor- mes como amostras homogêneas.

O método descrito neste contexto e em outros documentos (PCT/US2005/021504, depositado em 17 de junho de 2005; e pedido U.S. No.: 11/156.251, depositado em 17 de junho de 2005; cujos conteúdos ficam incorporados neste contexto por referência na sua totalidade) da preparação de tecido de tumor pode ser adaptado aos requisitos de mi- cro-dissecação a laser ativada por pressão de "catapulta" para criar amostras de células homogêneas para morfologia nuclear que pode ser aplicada a análises de metabolitos e macromoléculas. Este método permite que aquele versado na técnica identifique objetivos lógicos para retardamento da divisão, ou destruição de estruturas que contêm núcleos campaniformes em tumores humanos.

Os métodos da presente invenção são baseados em parte em meios para reconhecer morfologia nuclear em preparados de tumor não fixos de maneira que preparados homogêneos de células vivas e sincicios com núcleos campa- niformes podem ser estudados ex vivo. Os núcleos campani- formes vivos podem ser estudados para melhor compreensão de seus mecanismos de segregação e sintéticos de DNA pecu- liares e sugerir meios para interferir com estes processos em terapias de câncer.

0 "objetivo de célula de linhagem" na terapêutica de cân- cer.

Os objetivos principais dos métodos de te- rapêutica de câncer existentes são células que passam pelo ciclo de célula (Gomez-Vidal, J. et al., A., Curr. Top. Med. Chem., 4:175-202, 2004; Fischer, P. and Gia- nella-Borradori, A., Expert Opin. Investig. Drugsr 14:457-477, 2005). Nenhuma distinção é feita entre as células em trânsito entre as células de linhagem de ma- nutenção adultas que se dividem para proporcionarem cé- lulas de transição para substituírem a perda de células terminais perdidas pela morte de célula programada e as células de linhagem de tumor. A terapia visa a estrei- ta janela de regimes que exterminam todas as células de linhagem de tumor sem matar o paciente. Mas será de se esperar logicamente que as células de linhagem de manu- tenção adultas tenham a propriedade de crescimento zero de células líquido, enquanto as células de linhagem de tumor, da mesma forma que as células de linhagem fe- tais, estão por definição envolvidas no rápido cresci- mento de células líquido. Divisões de células de li- nhagem de manutenção adultas parecerão ser forçosamente de natureza assimétrica, dando origem a uma nova célula de linhagem de manutenção e uma primeira célula de transição diferenciada. Células de linhagem de tumor requererão divisões nucleares simétricas sucessivas pa- ra suportar o crescimento liquido dos tumores. É na descoberta dos núcleos campaniformes submetidos a divi- são nuclear de "taça para taça" simétrica em tumores que foi encontrado um objetivo especifico para terapias citostáticas ou citocidais.

Independente destas estratégias citocidais de quimioterapia foi a hipótese de que os tumores pode- riam ser asfixiados pela prevenção de angiogênese, por exemplo, Folkman and Ingber (Sem. Câncer Biol., 3:88- 96, 1992). Outros sugeriram abordagens para a tera- pia de câncer pelo bloqueio da diferenciação celu- lar. Mas a criação de hipóxia pode recriar as condi- ções de embriogênese prematura no que se relaciona com as células de linhagem e pode explicar os efeitos pali- ativos, mas não curativos, de táticas anti-angiogênicas (Warburg, O., Biochem. Zeitschrift, 152:479, 1924). O bloqueio da diferenciação em tumores pode bloquear a diferenciação em tecidos normais com conseqüências in- desejáveis. A compreensão de que as atuais terapias de câncer são apenas minimamente efetivas porque as célu- las de linhagem podem repovoar tumores em um curto es- paço de tempo tornou-se um estimulo poderoso para a pesquisa de características moleculares e bioquímicas peculiares às células de linhagem de tumor ao contrário das células de linhagem de manutenção adultas (Otto, W., J. Pathol., 197:527-535, 2002; Sperr, W. et al., Eur. J. Clin. Invest., 34 (Suppl 2):31-40, 2004; Vene- zia, T. et al., PLoS Biol., 2:e301, 2004). Tais carac- terísticas moleculares e/ou bioquímicas das células de linhagem de tumor, poderiam servir como objetivos na terapêutica de câncer. A descoberta de núcleos campa- niformes que são submetidos a divisões simétricas e as- simétricas em tumores de cólon, mas não em epitélio de cólon adulto, permite àquele versado na técnica diferenci- ar as células de linhagem de tumor em relação às células de linhagem de manutenção adultas (Gostjeva, E. et al., Câncer Genet. Cytogenet., 164:16-24, 2006).

Citogenética de células de linhagem em embriões, linhas de células de linhagem e tumores.

As propriedades de célula de linhagem de tu- mor incluem divisões simétricas para conseguir crescimento de célula de linhagem líquido e divisões assimétricas para conseguir auto-renovação e diferenciação. Entretanto, os mecanismos de progressão de ciclo de células, incluindo síntese de DNA e segregação na fissão nuclear, permanecem essencialmente inexplorados nas células de linhagem de em- briões e tumores. Esta escassez de esforço é compreensível na medida em que não houve marcadores citológicos diretos para identificarem as células de linhagem em seres humanos ou tecidos. As divisões assimétricas em células de linha- gem adultas de cólons de murídeos e variedades de células têm sido exploradas com a demonstração extraordinariamente importante de segregação pangenômica seletiva de fiadas de DNA de origem em células de linhagem putativas (Potten, C. et al., J. Célula Sci., 115:2381-2 388, 2002; Merok, J. et al., Câncer Res., 62:6791-6795, 2002). Este reco- nhecimento de uma modalidade especifica de célula de li- nhagem de transmissão genética de cromossomos de uma ma- neira não randômica precede o presente reconhecimento do que parece ser uma morfologia nuclear especifica de célula de linhagem e modalidade de divisões durante várias déca- das (Cairns, J., Nature, 255:197-200, 1975).

EXEMPLOS

Exemplo 1. Estabelecimento de uma fonte de tecidos e tumo- res .

Obtiveram-se espécimes de tecido e tumores adultos como descartes cirúrgicos e a partir de colabora- dores no Massachusetts General Hospital, Department de Pathology (Gostjeva, E. et al., Câncer Genet. Cytoge- net., 164:16-24, 2006). 0 uso de tumores e seções de tecido descartados anônimos foi aprovado pelo "MIT Committee on Use de Humans as Experimental subjects", através do laboratório do Prof. W. G. Thilly. Desenvolvimento de um método para a excisão de tecido, fi- xação, desdobramento e coloração de DNA.

O protocolo exposto em seguida permite a vi- sualização de núcleos de espécimes de tecido e tumores de clareza desejada para observações estruturais e quantita- tivas de cromossomos e núcleos. Elementos chave são o uso de amostras de tumores recentes fixadas dentro de 30 minu- tos da cirurgia e abstenção do procedimento padrão de sec- cionamento fino. Os núcleos campaniformes são aparente- mente vitimas prematuras de autólise em amostras de tecido e tumores e não mais discerniveis cerca de 45 minutos de- pois da ressecção. Seções de 5 micrômetros padrão sim- plesmente fatiaram as várias formas nucleares descobertas aproximadamente todas as quais tiveram diâmetros mínimos maiores do que 5 micrômetros. A técnica específica deli- neada é exposta como evidência de progresso significativo:

Dentro de um período de 30 minutos de- pois de ressecção, folhas (-1 cm2) tais como mucosa de cólon separadas ou seções de - 1 mm de espessura de adenomas, adenocarcinomas ou metástases são colocadas em pelo menos três volumes de fixador de Carnoy recém- preparado a 4°C (3:1, metanol:ácido acético glacial). Fixador novo é substituído três vezes (a cada 45 mi- nutos) e então substituído por metanol a 70%, 4°C, para armazenamento da amostra a -20°C. As seções fi- xas são enxaguadas em água destilada e colocadas em 2 ml de IN HCl a 60°C durante 8 minutes para hidrólise parcial de macromoléculas e depuração de DNA. A hi- drólise é concluída por enxaguamento em água destila- da fria. A amostra enxaguada é mergulhada em ácido acético a 45% (temperatura ambiente) durante 15 a 30 minutos para "maceração do tecido" que permite o es- palhamento e observação das seções de tecido de plan- ta e animal com suave pressão em cobre-lamelas de mi- croscópio. Cada seção macerada é bi-seccionada em peças de -0,5 χ 1 mm e transferida com 5 μΐ de ácido acético para uma lamela de microscópio sob um cobre- lamela. Para espalhamento de tecido 5 camadas de papel de filtro são colocadas no cobre-lamela. Um cabo de pinça é movido uniformemente em uma direção ao longo do papel de filtro com pressão leve e uniforme. No tecido de cólon bem espalhado não existem núcleos danificados enquanto foliculos são calcados no que é essencialmente uma monocamada. Os cobre-lamelas são removidos depois de congelamento em gelo seco e as lamelas são secadas durante uma hora. As lamelas são colocadas em recipien- tes Coplin preenchidos com reagente de Schiff para colorir DNA parcialmente depurinado (coloração de Feulgen) sob temperatura ambiente durante uma hora, enxaguado no mesmo recipiente de Coplin duas vezes com 2xSSC (citrato de tri-sódio 8,8 g/l, cloreto de sódio 17,5 g/l), uma vez durante 30 segundos r uma vez rapidamente. As lamelas são então enxaguadas com água destilada e ficam adequadas para análises de i- magem de núcleos (Gostjeva, E., Cytol. Genet., 32:13-16, 1998). Para se conseguir resolução superi- or, as lamelas são ainda coloridas com reagente Giem- sa. Imediatamente depois de enxaguamento em 2xSSC as lamelas são colocadas em solução de Giemsa a 1% (Gi- emsa, Art. 9204, Merck) durante 5 minutos, então en- xaguadas rapidamente, primeiro em amortecedor de So- renssen (diidrato de fosfato de hidrogênio dissódico 11,87 g/l, fosfato de diidrogênio de potássio 9,07 g/l), e então água destilada. As lamelas são secadas sob temperatura ambiente durante uma hora e colocadas em um recipiente de Coplin preenchido com xileno durante pelo menos 3 horas para remover a gordura. Os cobre- lamelas são colados às lamelas com meios de montagem DePex e secados durante 3 horas antes de varredura de alta resolução.

Alternativamente, maceração pode ser conse- guida por exposição a enzimas proteoliticas tais como, for exemplo, colagenase II, para se conseguir isolamento das células vivas com um morfótipo nuclear definido.

Microscópio e sistema de processamento de imagens.

0 software para análise de imagem quantita- tiva que é usado neste contexto utiliza uma abordagem de supressão de fundo adaptada a partir de sistemas de le- vantamento por satélite anteriores. Esta tecnologia foi adquirida pela Kontron Corporation na Alemanha, que foi desde então adquirida pela Zeiss, Inc. Todas as imagens foram obtidas utilizando-se um KS-400 Image Analysis Systemm, Version 3.0, customized (Zeiss, Germany) que consistia de um microscópio luminoso motorizado, Axiosco- pe™, câmara CCD colorida, AxioCam™ (Zeiss, Germany) vin- culada a um computador pessoal. As imagens são transmi- tidas a partir do microscópio sob uma ampliação de 1,4/100 da objetiva apocromática plana utilizando-se luz visível e um filtro 560 nm (verde) quando se empregou co- loração Feulgen sozinha. Não se utilize qualquer filtro quando se emprega coloração Feulgen-Giemsa. 0 pegador de moldura e exposição de luz ótima são ajustados antes de cada sessão de varredura. As imagens nucleares são gra- vadas em uma dimensão de pixel de 0,0223 χ 0,0223 micrô- metros.

Intestino embrionário.

Sete morfótipos nucleares distintos (forma esferóide grande, esferóide condensada, ovóide, de feijão, de charuto, de salsicha e campaniforme) foram encontrados por todas as amostras de intestino fetal (Figura IA) . Os núcleos campaniformes que pareceram ser mantidos abertos por cromatina condensada lembraram cromossomos condensados (Figura IB) . Os núcleos campaniformes foram organizados em uma orientação de "cabeça para os pés" linear dentro de tubos ou sincicios — 20-50 micrômetros, ou (Figura 2). 0 padrão "cabeça aos pés" dos núcleos campaniformes foi pre- servado em todos os tubos embrionários observados, mas os tubos colearam para trás e para diante de forma tal que os tubos paralelos tinham orientação localmente antiparalela dos núcleos campaniformes.

Observou-se que os núcleos campaniformes fo- ram submetidos a amitoses simétricas e paralelas, mas ape- nas dentro dos sincicios (Figura 3) . As amitoses de nú- cleos campaniformes simétricos assemelharam-se a uma sepa- ração simples de dois copos de papel empilhados. Na reso- lução mais alta, a cromatina condensada assemelhando-se a cromossomos emparelhados pareceu formar um anel que manti- nha a "boca" de sino em uma condição aberta. Fora dos sincicios tubulares observou-se que as mitoses foram freqüentemente "fechadas" para cada um dos diversos morfótipos nucleares e evidenciaram-se pequenas colô- nias que consistiam de células de idêntico morfótipo nuclear. A morfologia nuclear "fechada" especifica foi preservada na prófase prematura, tal como se encontra ilustrada na Figura 1.

Epitélio de cólon normal.

Aproximadamente todos os núcleos em folí- culos puderam ser observados a partir da base de folí- culo base até à superfície luminar (Figura 4A). Muitos dos folículos propagaram-se de uma maneira tal que foi possível discernir formas nucleares individuais. As células com núcleos ovóides ou esferóides alinharam o folículo desde o ponto logo acima da base no sentido e para a extensão epitelial dentro do lúmen (Figura 4C). Nas primeiras ~25 células da base de folículo, predomi- nou um nono morfótipo nuclear, potencialmente distinto, que pode ser caracterizado como discóide, -2-3 micrôme- tros de espessura e ~10 micrômetros de diâmetro (Figura 4B). Em menos do que 1% de todas as bases de folículos em que as células foram bem separadas discerniu-se um núcleo campaniforme solitário entre os núcleos aparen- temente discóides (Figuras 4A e 4B). Uma baixa fre- qüência assemelhada de núcleos campaniformes foi obser- vada em preparados de fígado adulto. Em um cólon adul- to sem qualquer indicação patológica de neoplasia ou pré-neoplasia nenhuma outra variante morfológica nucle- ar foi observada em uma varredura de célula-por-célula de mais que um milhar de foliculos bem espalhados. Adenomas.

Os adenomas continham muitos foliculos, indistinguiveis a partir de foliculos de cólon normais cada um com ~ 2000 células. Estas foram freqüentemen- te encontradas em formas ramificadas conforme ilustra- das na Figura 5A. Os mesmos núcleos esferóides e o- vóides nas paredes de foliculo como nos foliculos de cólon normais, mas mais freqüentemente do que no cólon normal ocorreu um ou dois núcleos campaniformes na ba- se de foliculo. Estruturas lobulares irregulares tam- bém foram observadas as quais continham até ~ 8000 cé- lulas, cujas células eram mais facilmente espalhadas pela maceração de tecido. Em quase todas as estrutu- ras irregulares haviam dois ou mais núcleos campani- formes orientados com as aberturas das campânulas na direção do corpo da estrutura (Figura 5B). Adicional- mente muitas células e grupos diversos estavam disse- minadas entre os foliculos e estruturas irregulares (Figura 5C) . Algumas estruturas regulares pareceram estar crescendo no sentido de foliculos normais de di- mensão plena que continham ~250, ~500 ou ~1000 células. Muitos grupos de células foram vistos como "anéis" de e- xatamente 8, 16, 32, 64 e 128 células cada um com um nú- cleo campaniforme (Figura 5D) .

O exame sob ampliação maior revelou que en- quanto isso a maior parte das células das paredes das es- truturas semelhantes a foliculo tinham núcleos esféricos ou ovóides como no foliculo de cólon adulto normal. Co- lônias de células com núcleos sejam eles ovóides, em for- ma de charuto ou em forma de bala apareceram nas estrutu- ras lobulares irregulares sugerindo uma fusão de diversas colônias diferentes. Colônias com núcleos ovóides e em forma de charuto foram observados no intestino embrioná- rio posterior, mas o morfótipo nuclear em forma de bala foi visto somente em adenomas e adenocarcinomas (Figura 5E) . O morfótipo nuclear em forma de bala também surgiu de a partir de núcleos campaniformes por amitoses assimé- tricas com a extremidade irregular emergindo primeiro. Observaram-se pequenas colônias de células com núcleos em forma de bala e estas colônias continham células submeti- das a mitoses comuns exceto pelo fato interessante de que as morfologias nucleares peculiares foram retidas em cer- ta extensão a partir de prófase através de anatelofase.

Embora raros em cólon adulto normal, os nú- cleos campaniformes apareceram freqüentemente e em um nú- mero de contextos de adenoma. Alguns foram encontrados como de um a dez ou mais "sinos" nos espaços entre as es- truturas semelhantes a foliculo (Figura 5D). Outros fo- ram encontrados como "sinos" únicos nas estruturas de a- nel multicelulares em que um núcleo de sino foi sempre observado no anel com (2n - 1) células esferóides ou outro morfótipo (Figuras 5C e 5D).

Núcleos campaniformes apresentaram-se como sinos únicos, mais freqüentemente na forma de um par de sinos ou ocasionalmente 4 ou 8 sinos dentro do copo bási- co de estruturas semelhantes a foliculo. Nas estruturas lobulares irregulares muito maiores, núcleos campanifor- mes foram anatomicamente integrados nas paredes das es- truturas anômalas misturadas com células de outras morfo- logias nucleares. Evidenciam-se como se estas estruturas semelhantes a foliculos irregulares fossem mosaicos de múltiplas espécies diferentes de cachos, cada um com seu próprio morfótipo nuclear. Estimou-se que adenomas gran- des 1 cm) continham cerca de 1000 núcleos campanifor- mes. Observaram-se centenas de núcleos campaniformes em cada um dos múltiplos adenomas, mas não foi observado um único núcleo campaniforme em qualquer adenoma na forma si- métrica de fissão nuclear freqüentemente encontrada em se- ções embrionárias; não obstante, observaram-se diversos exemplos de fissão nuclear assimétrica, em adenomas.

Adenocarcinomas.

Os adenocarcinomas da mesma forma que os adenomas continham a mistura de foliculos, estruturas irregulares maiores e cachos inter-foliculares de 16, 32, 64 e 128 células. Encontraram-se ainda núcleos campaniformes na forma de camisetas, pares ou números maiores na taça basal de foliculos e embutidos em volu- tas complexas nas paredes das estruturas lobulares ir- regulares maiores (Figura 6). 0 conjunto de morfótipos nucleares nos adenocarcinomas parece ser idêntico ao conjunto que foi observado nos adenomas incluindo o morfótipo em forma de bala.

Uma diferença discernivel entre adenomas e adenocarcinomas foi a de que as estruturas semelhan- tes a foliculo estavam orientadas aleatoriamente com relação à superfície de tumor. Também não foram encon- trados folículos e estruturas irregulares no interior do tumor, o que pode ser mais bem caracterizado como uma coleção eclética, mas não caótica, de estruturas meno- res, organizadas localmente.

A diferença mais notável pela qual os a- denocarcinomas diferiram dos adenomas foi o freqüente aparecimento de grupamentos aparentemente organizados de mais que centenas de núcleos campaniformes, muitos dos quais estavam freqüentemente (~1%) envolvidos em fissões nucleares simétricas. Estas fissões simétricas foram posteriormente identificadas como compreendendo material nuclear condensado. Um núcleo campaniforme teria uma quantidade de DNA igual àquela de uma célula haplóide normal. À medida que os núcleos campaniformes começam a sofrer a divisão simétrica de "taça para ta- ça", p teor de DNA aumenta para 1,05 a quantidade de DNA contido em um genoma haplóide (aproximadamente o aumento que se espera se os centrômeros são replica- dos). O teor de DNA permanece neste nível até muito depois no processo de "taça para taça" ponto este em que os dois núcleos contêm 2 vezes a quantidade do ma- terial de DNA. É durante o estágio quando talvez ape- nas os centrômeros são replicados e os cordões do genoma são separados que o genoma é organizado principalmente em ssDNA. Não até à replicação, muito tarde no proces- so o genoma se torna dsDNA novamente.

Sob baixa ampliação estas estruturas surgiram nos espaços entre estruturas semelhantes a foliculo e pareceram como uma teia de aranha ou es- queleto de nervuras de folha. Sob uma ampliação mai- or, as nervuras finas mostraram ser cordões de célu- las parcialmente ordenadas com núcleos campaniformes tendo a característica curiosa de apresentarem suas bocas orientadas na mesma direção, 90° em relação ao eixo da nervura (Figura 6C). Núcleos campaniformes também foram encontrados em sincícios delimitados lo- calmente na orientação "cabeça para os pés" (Figura 6C) observada no intestino embrionário mas não nos adenomas. Estima-se que milhões de núcleos campani- formes estejam em uma massa adenocarcinomatosa com fre- qüentes amitoses simétricas e assimétricas (Figuras 6D e 6E). Metástases de tumores cólon-retais para o fíga- do recrearam o padrão de morfótipos nucleares, folícu- los e estruturas irregulares, aparentemente não diferen- çáveis daqueles observados para adenocarcinomas.

Microscopia confocal em núcleos campaniformes simples preservados 3D e pares de núcleos campaniformes dividin- do-se simetricamente.

Para executar microscopia confocal em nú- cleos campaniformes simples preservados 3D e pares de nú- cleos campaniformes dividindo-se simetricamente, utiliza- se o "DeltaVision® RT Restoration Imaging System at Ima- ging Center, Whitehead Institute". O sistema proporciona desconvolução 2D em tempo real e projeções 3D Z para res- tauração de imagens de núcleos.

Contracoloração do citoplasma nuclear (FITC-faloidina) e (DAPI) nuclear foram aplicados para explorar a estrutura interior dos núcleos campanifor- mes. As células são espalhadas na lamela seguindo-se o mesmo procedimento usado para a coloração de Feul- gen: mediante maceração por "hidrólise". A diferença é que as fixações nos dois diferentes fixadores são aplicadas para comparar os resultados: fixador de Car- noy (4'C) e 3,7% formaldeido durante 15 min. e solução de bloqueio durante 2 horas em 2% BSA (2g), leite não- gorduroso a 0,2% (0,2g), Triton X-100 a 0,4% (400 μΐ) em 100 ml de PBS (temperatura ambiente), este último como recomendado para fixações de células de tecido vivas. Lamelas de microscópio com desdobramentos de tecido nas mesmas, depois de duas vezes lavadas em PBS, são transferidas para câmara de umidade, gotejam- se 100 ml de goticulas de anticorpos principais diluídos apropriadamente em solução de bloqueio para cobrir toda a área de dispersão e as cobre-lamelas são vedadas no topo por cimento de borracha, colocadas em recipiente embru- lhado em ouropel e colocadas em câmara de umidade em re- cinto frio durante a noite. As lamelas não vedadas são então lavadas três vezes em PBS. Retiram-se as lamelas e colocam-se novamente 100 μL de goticulas de anticorpos secundários e/ou colorações de células (por exemplo, FITC-faloidina, DAPI) diluídas apropriadamente em solução de bloqueio, para cobrir a área que contém as células es- palhadas e transferidas para a câmara de umidade colocada em recipiente. O recipiente/câmara de umidade é vedado, embrulhado em ouropel e colocado sob temperatura ambiente durante 2 horas. As lamelas são lavadas cinco vezes em PBS e preparadas de uma maneira tal que cada uma tem go- tículas de 2-5 μL de meio de suporte (anti-desvanecedor SlowFade, VectaSheild ou ProLong). Cobre-Iamelas são montadas assegurando-se que seja removido um excesso de PBS (batendo-se de leve com o canto do cobre-lamelas em uma toalha de papel). 0 número de bolhas formadas duran- te a montagem é limitado pela introdução da borda do co- bre-lamelas no meio de montagem antes de abaixá-lo com- pletamente. Os cobre-lamelas são vedados na lamela uti- lizando-se polidor de unhas e as lamelas são armazenadas no escuro a 4*C (ou -20*C durante períodos prolongados). As lamelas são visualizadas utilizando-se o DeltaVision® RT Restoration Imaging System.

0 protocolo do procedimento de Feulgen- Schiff, que demonstrou ser de precisão para a localização citoquímica de DNA e estequiometria, foi usado para medir o teor de DNA dos núcleos. 0 teor de DNA foi medido em núcleos isolados pela medição da absorvência de moléculas de um complexo de Feulgen-DNA (corante-ligante) (Kjells- trand, P., J. Microscopy, 119:391-396, 1980; Anders son, G. e Kjellstrand, P., Histochemie, 27:165-200, 1971). Realizou-se a medição de núcleos campaniformes não- divisórios (interfase) ande divisórios por intermédio da medição de densidade óptica integrada sobre a totalidade da área (IOD) de cada núcleo individual utilizando-se software adaptado a partir do sistema de análise de ima- gens KS 400 (Zeiss Inc , Germany).

Esta estação operacional de análise de imagens particular (vide Figura 9D) consiste de um mi- croscópio Axioscop 2 MOT (Zeiss) acoplado com câmara AxioCam color CCD (Zeiss) conectada a um computador, montada por Carl Zeiss Inc. Engineers, é capaz de mi- croscopia de imagem de alta resolução de estruturas de célula e nucleares, que tem cerca de 1000 bp de DNA por pixel em medições de cromossomos de prófase prematu- ros. Portanto, são possíveis medições exatas de domí- nios de cromatina condensada de pares - IMb em núcleos de interfase. Imagens foram examinadas sob parâmetros constantes de ampliação, exposição de luz e limiar (contorno) dos núcleos utilizando-se filtro verde de 560 nm. Esta forma de medição do teor de DNA foi es- colhida como promissora para os resultados mais exatos (Biesterfeld. S. et al., Anal. Quant. Cytol. Histol., 23:123-128, 2001; Hardie, D. et al., J. Histochem. Cyto- chem., 50:735 - 749, 2002; Gregory and Hebert, 2002; Gregory, 2005).

Hibridização Fluorescente in situ para definir a dis- tribuição especial de todos os 24 cromossomos humanos em núcleos campaniformes em interfase e durante fissão nuclear.

Utilizou-se FISH para determinar a tota- lidade dos cromossomos que estão envolvidos na conden- sação que aparece como um "anel" no topo dos núcleos campaniformes. Basicamente, a rotulação dos cromosso- mos no "anel" é prognosticada como um meio para anali- sar a sua transformação quando núcleos campaniformes dão origem a núcleos de morfologia diferente (tal como se encontra ilustrada na Figura 10B), bem como o de- senvolvimento de um marcador de fluorescência para re- conhecer estes núcleos por outros meios que não morfo- logia nuclear.

Células de tumor de não mais que 1-5 χ 10^7 células por lamela são espalhadas na lamela. As Iame- las fixadas de duas maneiras diferentes de espalhamento de células: uma usada no protocolo para citometria de imagem de DNA de Feulgen e a outra proposta por Gibson para iso- lamento de células epiteliais a partir de espécimes de bi- ópsia de colonoscópio (Gibson, P. et al., Gastroentero- logy, 96:283-291, 1989). Este último é basicamente a tomada de um tecido de tumor dentro de 30 minutos da cirurgia e imediatamente colocá-lo em 50 ml de solução salina equilibrada de Hank fria, então lavada. Os espé- cimes são então fragmentados com uma lâmina de bisturi e digeridos durante 1,5 h em 4 ml de meio de colagenase- Dispase (meio de cultura contendo 1,2 U/ml Dispase I (Boe- hringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Ind.) e 50 U/ml colagenase tipo IV (Worthington, Biochemical Corp., Freehold, N.J.). A pílula é espalhada na superfície da lamela de microscópio por pressão deslizante suave no co- bre-lamelas. O espalhamento por maceração de "hidrólise" serve como controle positivo para verificar se ocorreu qualquer distorção de morfologia nuclear campaniforme de- pois da aplicação de tratamento de colagenase-Dispase para espalhamento de células. As lamelas preparadas são então submetidas a secagem e colocadas a 370C durante a noite. As lamelas são então desidratadas sucessivamente em etanol gelado a 70%, 80%, 100% sob temperatura ambiente durante 2 minutos cada uma e secadas completamente, submetidas a desnaturação em 70% formamida/2xSSC a 72 °C durante 2 minu- tos e imediatamente desidratadas novamente com a mesma se- qüência e secadas completamente. Preparam-se misturas de hibridização que contêm 7 μl de amortecedor de hibridiza- ção, 2 μl de água estéril, e 1 μl de sonda. As misturas são desnaturadas a 72°C durante 8 até 12 minutos e imedia- tamente adicionadas a lamelas que então cobertas, vedadas com cimento de borracha, e colocadas a 37 °C em uma caixa escura umedecida durante a noite.

As lamelas são então desidratadas em Eta- nol a 70% frio, etanol a 80% frio, e etanol a 100% sob temperatura ambiente durante 2 minutos cada uma; desna- turadas em formamida a 70%, 2xSSC a 72°C durante 50-60 segundos, na dependência da extensão da desnaturação do ácido acético. As lamelas são desidratadas novamente em etanol a 70% frio, etanol a 80% frio, e etanol a 100% sob temperatura ambiente durante 2 minutos cada uma. A mistura de hibridização inclui 7 μl de amorte- cedor de hibridização, 1,5 μl de H2O estéril, e 1,5 μl. São aplicadas sondas Whole Chromosome Paint (Vysis) com corante, seja ele Spectrum Orange ou Spectrum Green fluorescente. A mistura de hibridização é desnaturada durante 5-10 minutos a 72°C e as lamelas subseqüente- mente secas completamente. Uma mistura de hibridização é aplicada às lamelas, cobre-lamelas e vedadas com ci- mento de borracha. As lamelas são então incubadas durante a noite a 370C em uma caixa umedecida. No dia seguinte, as lamelas são lavadas em formamida a50%, 2xSSC a 420C du- as vezes durante 8 minutos cada uma. As lamelas são então lavadas com 2xSSC a 370C durante 8 minutos e então lavadas três vezes em IxPBD (0,05% Tween, 4xSSC) sob temperatura ambiente durante 1 minuto cada uma. Então, adicionam-se 10 μl de DAPI II Antifade, 125 ng/ml (Vysis) e cobre- lamelas. 0 excesso de DAPI II Antifade é removido por ma- ta-borrão e as lamelas vedadas com cimento de borracha. As lamelas são mantidas no escuro a -2O0C antes do proce- dimento de varredura de imagem.

Uso de citometria de DNA quantitativo para síntese de DNA de seqüência antes, durante e depois de fissão nuclear de núcleos campaniformes.

As técnicas descritas neste contexto per- mitem a detecção de diferenças tão baixas quanto 2% en- tre quaisquer dois núcleos ou as anatelofases de núcleos filiais durante mitose em culturas de células humanas. Estas técnicas foram usadas para se determinar quando o DNA é sintetizado por células ou sincícios que contêm núcleos campaniformes. Isto envolveu a varredura de núcleos que parecem estar no processo de fissão nucle- ar. Observa-se que de um modo geral núcleos campani- formes fetais contêm a quantidade esperada de DNA de uma célula humana diplóide por comparação com o teor de DNA de linfócitos humanos na mesma lamela colorida. Além disso, observa-se que a quantidade de DNA em nú- cleos campaniformes de lesões e tumores pré- neoplásticos humanos desvenda uma ampla variação em torno de um meio que é em média maior do que a quanti- dade de DNA diplóide. Medições realizadas revelaram uma outra descoberta totalmente inesperada: a sintese de DNA é concordante de preferência a preceder o pro- cesso de fissão nuclear para as fissões nucleares assi- métricas que envolvem núcleos campaniformes. Os núcleos apresentam-se como estando bem juntos no processo de sepa- ração de "taça para taça" antes de um aumento no teor de DNA total a partir da quantidade de núcleo individual ser claramente detectado. A quantidade total de DNA aumenta a partir de um valor baixo que se aproxima da média de nú- cleos de tumores individuais em núcleos que começam apa- rentemente a fissão e alcançam cerca de duas vezes o teor nuclear médio em núcleos que parecem ter justamente com- pletado a fissão.

Exemplo 2. Núcleos sincícios campaniformes na organogênese fetal.

Uma série de formas nucleares anteriormente não reconhecidas foi identificada em preparados fetais hu- manos que deram origem aos núcleos campaniformes. Estas formas foram detectadas na quinta semana, como foram os primeiros sincicios tubulares, que continham núcleos cam- paniformes. Exemplos destes estão ilustrados nas Figuras 13A-D. Esta é uma descoberta importante que marca a tran- sição morfológica a partir de núcleos esféricos, mitóti- cos, de embriogênese prematura, para os núcleos campani- formes amitóticos posteriores, que representam a família de células de "linhagem" geradora de crescimento líquido e diferenciação.

Estas descobertas são congruentes através dos tipos de tecidos, uma vez que eles foram observados em uma série de preparados de tecidos incluindo, por exemplo, músculo, membros em desenvolvimento, tecido nervoso e ór- gãos viscerais, incluindo o estômago, pâncreas, bexiga, pulmão e fígado. Os sincicios são encontrados como cachos de ~16-24 sincicios regularmente espaçados dentro da massa de órgão em desenvolvimento, cada um com ~16 núcleos cam- paniformes. Os sincicios são evidentes no último material humano desenvolvido disponível (~5 semanas) e desaparece- ram na décima - terceira semana. Depois da décima - se- gunda semana os núcleos campaniformes são regularmente distribuídos em três dimensões de uma maneira peculiar pa- ra cada órgão.

A Figura 13A mostra um núcleo com uma con- densação de -10% do teor de DNA total como um "cinto" em torno do eixo longitudinal dos núcleos esféricos ou ligei- ramente ovais. A Figura 13B mostra um núcleo em que dois "cintos" nucleares condensados parecem ter-se separado, mas ainda são parte de um núcleo individual. A Figura 13C mostra um par de núcleos que parecem ter surgido por fis- são dos dois núcleos em cinto da Figura I3B. A Figura 13D mostra que cada sincicio contém um conjunto de cintos com um par de cintos individuais no seu ponto mediano linear tendo bocas voltadas como na Figura 13C. Estas imagens sugerem-nos que uma série de divisões simétricas criam nú- cleos que se afastam em relação a um par central. A es- trutura de sincicio é detectada em grupos tão pequenos quanto quatro núcleos campaniformes.

Em estudos dos morfótipos nucleares de car- cinogênese, núcleos mostraram cintos similares - um ou dois - em torno do eixo longitudinal de núcleos ovais - em pequenos números em adenomas de cólon (Figura 14A) e ade- nocarcinomas (Figura 14B). Esta descoberta confirma e am- plia o suporte para a hipótese geral de que a oncogênese compartilha de muitas etapas de transição fenotipica chave da ontogênese presente, entretanto na ordem inversa de apa- recimento.

Coloração FISH especifica para centrômeros humanos.

Núcleos campaniformes extra-sincicios contêm efetivamente DNA humano. A maior parte dos cen- trômeros encontram-se associados com a região de DNA condensada na boca dos núcleos campaniformes em amostras fetais. De acordo com um aspecto interessante, proto- colos FISH padrão não colorem intra-sincicios campani- formes ou núcleos de outras formas, sugerindo que a ba- inha que contém elemento contrátil do sincicio pode bloquear a entrada dos reagentes FISH. A Figura 15 mostra centrômeros (em verde) de núcleos na forma esfé- rica (Figura 15A), de "charuto"-(Figura 15B) e de sino - (Figura 15C) a partir de tecidos de cólon fetal huma- no com 12 semanas.

Observou-se igualmente que o teor de DNA dos núcleos gêmeos é igual em amitoses fetais de nú- cleos campaniformes, mas eles revelam um grau acentuado de segregação de DNA desigual em amitoses de núcleos campaniformes em tumores humanos a partir dos múltiplos tecidos de origem. Muito embora nenhum exemplo de fis- são amitótica entre os núcleos campaniformes de pólipos pré-neoplásticos de cólon tenha sido encontrado, obser- va-se que a dispersão acentuada de teor de DNA entre as dúzias de núcleos campaniformes encontrados por pólipo sugerem que a divisão de DNA desigual é um fenômeno que é operacional em pré-neoplasia bem como em neoplasia, mas não em fissões fetais de núcleos campaniformes.

Estas observações ampliam as observações de Virchow e Cohnheim de que tecido de tumor e tecido embrionário têm aspectos histológicos similares, ao mesmo tempo em que também expandem aquelas de Boveri de que células de tumor em mitose revelam uma grande fração de cromosso- mos anômalos comuns a todas as células do tumor- suge- rindo uma origem comum anterior na formação ou segrega- ção cromossômica instável. Morfologia nuclear em camundongos.

Todas as várias formas de núcleos, em par- ticular incluindo os núcleos campaniformes, formas pré- sinciciais e sinciciais em morfologia quase idêntica às Figuras 13A-D foram encontradas em tecido de camundongos fetais, com as formas pré-sinciciais primeiro detectadas em fetos de 12,5 dias, então em 14,5 - 16,5 dias, es- treitamente paralelas ao periodo de definição de órgãos no camundongo fetal. Embora estas descobertas no camun- dongo não sejam surpreendentes dadas as observações hu- manas, elas abrem um amplo espectro de possibilidades de estudos de organogênese em espécies não humanas não éti- cas ou possíveis em seres humanos.

Em amostras de descartes fetais fixos de qualidade variáveis da quinta até à décima - sexta sema- na de gestação, os sincícios não são mais evidentes, mas núcleos campaniformes são distribuídos em padrões regu- lares na totalidade dos órgãos em desenvolvimento.

Exemplo 3.

Sincícios e núcleos campaniformes abundantes do intestino primitivo são usados para aplicar uma série de procedimentos histoquímicos, incluindo FISH, para defi- nir as posições de cromossomos e elementos cromossômicos, várias moléculas contráteis (por exemplo, actin) e outros marcadores identificáveis, incluindo aqueles comumente de- nominados "marcadores de células de linhagem". As técni- cas descritas neste contexto são aplicadas à tarefa de co- letar núcleos sinciciais e individuais utilizando o ins- trumento de micro-dissecção ZEISS-P.A.L.M.. 0 critério de êxito é a coleta de uma série de amostras homogêneas com relação às formas sinciciais ou morfótipos nucleares em números iguais ou maiores do que 10.000 equivalentes nu- cleares, números suficientes para a varredura de mRNAs ce- lulares, proteínas e glicoseaminoglicans que são mais comuns.

Muito embora esta invenção fosse ilustrada e descrita com particularidade com referência a concre- tizações preferidas da mesma, será compreendido por a- queles versados na técnica que várias alterações na forma e detalhes poderão ser realizadas sem com isso fugir do escopo da invenção abrangido pelas reivindica- ções em anexo.η.

Claims (12)

1. Método para inibir células de linhagem de tumor, caracterizado pelo fato de compreender alve- jar a célula de linhagem de tumor com um agente ou tra- tamento que modifica quimicamente uma molécula especí- fica de célula de linhagem de tumor, impedindo desta forma a proliferação de células de linhagem de tumor.

2. Método, de acordo com a reivindicação -1, caracterizado pelo fato de que a molécula específica de célula de linhagem de tumor é sintetizada e segrega- da em núcleos campanulares.

3. Método, de acordo com a reivindicação -1, caracterizado pelo fato de que a molécula específica de célula de linhagem de tumor é DNA de trançado sim- pies (ssDNA).

4. Método, de acordo com a reivindicação -1, caracterizado pelo fato de que o agente é um agente químico.

5. Método, de acordo com a reivindicação -1, caracterizado pelo fato de que o agente é uma enzi- ma .

6. Método, de acordo com a reivindicação -1, caracterizado pelo fato de que o tratamento é por radiação.

7. Método para inibir o crescimento de tumores em um paciente, caracterizado pelo fato de com- preender alvejar uma célula de linhagem de tumor no pa- ciente com um agente ou tratamento que modifica quimi- camente a molécula especifica de célula de linhagem de tumor, impedindo desta forma a proliferação de células de linhagem de tumores.

8. Método, de acordo com a reivindicação -7, caracterizado pelo fato de que a molécula especifica de célula de linhagem de tumor é sintetizada e segrega- da em núcleos campanulares.

9. Método, de acordo com a reivindicação -7, caracterizado pelo fato de que a molécula especifica de célula de linhagem de tumor é DNA de traçado simples (s s DNA) .

10. Método, de acordo com a reivindicação -7, caracterizado pelo fato de que o agente é um agente químico.

11. Método, de acordo com a reivindicação -7, caracterizado pelo fato de que o agente é uma enzi- ma .

12. Método, de acordo com a reivindicação -7, caracterizado pelo fato de que o tratamento é por radiação.