BRPI0618865A2 - área topográfica e altamente conservada, moléculas, ácido nucleico, proteìna, anticorpos, célula hospedeira, composição farmacêutica, e, método - Google Patents

Abstract

AREA TOPOGRáFICA E ALTAMENTE CONSERVADA, MOLéCULAS, áCIDO NUCLEICO, PROTEìNA, ANTICORPOS, CéLULA HOSPEDEIRA, COMPOSIçãO FARMACêUTICA, E, MéTODO. A presente invenção se refere à indústria farmacêutica, descreve-se uma área conservada da superficie da proteína E, empregável no desenvolvimento de moléculas de amplo espectro úteis na prevenção e/ou tratamento das infecções por vírus dengue 1-4 e outros flavivírus. Além disso, a presente invenção se refere às proteínas quiméricas para uso como vacinas e tratamento profilático e terapêutico contra os quatro serotipos do vírus da dengue e outros flavivírus.

Description

ÁREA TOPOGRÁFICA E ALTAMENTE CONSERVADA, MOLÉCULAS, ÁCIDO NUCLEICO, PROTEÍNA, ANTICORPOS, CÉLULA HOSPEDEIRA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, MÉTODO"

Campo da invenção

A presente invenção se refere à indústria farmacêutica, descreve-se uma área conservada da superfície da proteína E, empregável no desenvolvimento de moléculas de amplo espectro úteis na prevenção e/ou tratamento das infecções por vírus dengue 1-4 e outros flavivírus. A invenção descreve métodos e proteínas úteis para o tratamento profilático e/ou terapêutico dos quatros sorotipos do vírus de dengue e alternativamente, de outros flavivírus.

Técnica anterior

O complexo de vírus do Dengue (DV) pertence à família Flaviviridae e é composta por quatro vírus ou sorotipos (DV1-DV4) relacionados genética e antigenicamente. O DV é transmitido ao homem por mosquito, fundamentalmente o Aedes aegypti. A infecção provoca manifestações clínicas que variam desde assintomáticas e benignas como uma doença febril indiferenciada até manifestações mais severas como Febre Hemorrágica (FHD) e o potencialmente fatal Síndrome do Choque por Dengue (SCD). As manifestações clínicas mais severas estão usualmente associadas a infecções seqüenciais com dois sorotipos diferentes do vírus (.Halstead,S.B. Neutralization and antibody-dependent enhancement of dengue viruses. Adv. Vírus Res. 60:421-67., 421-467, 2003. Hammon WMc. New haemorragic fever in children in the Philippines and Thailand. Trans Assoc Physicians 1960; 73: 140-155).

Realizaram-se vários estudos epidemiológicos evidenciando como fator de risco a infecção seqüencial por dois sorotipos virais diferentes (Kourí GP, Guzmán MG, Bravo JR. Why dengue hemorrhagic fever in Cuba? 2. An integral analysis. Trans Roy Soc Trop Med Hyg 1987; 72: 821-823). Este fenômeno foi explicado mediante a teoria de potenciação mediada por anticorpos (ADE), a qual se baseia em um aumento da infectividade viral por incremento na entrada do complexo vírus-anticorpo à célula, assistida pelos receptores Fc da célula alvo (monócitos) {Halstead SB. Pathogenesis of dengue: challenges to molecular biology. Science 1988; 239: 476-481).

A glicoproteína de envolvimento (proteína E) é a proteína estrutural maior de envolvimento do vírus. A estrutura tridimensional de um fragmento do ectodomínio da proteína E dos vírus DEN2 e DEN3 foi resolvida recentemente por difração de raios-x (Modis, Y., Ogata, S., Clements, D. & Harrison, S. C. A ligand-binding pocket in the dengue virus envelope glycoprotein. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A 100, 6986- 6991,2003. Modis, Y., Ogata, S., Clements, D., and Harrison, S.C. Variable Surface Epitopes in the Crystal Structure of Dengue Virus Type 3 Envelope Glycoprotein. J. ViroL 79, 1223-1231, 2005), mostrando grandes similitudes estruturais com a estrutura cristalina da proteína E do vírus de encefalite transmitido por carrapato {Rey, F. A., Heinz, F.X., Mandl.C, Kunz1C. & Harrison, S.C. The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution. Nature 375, 291-298, 1995). A alta similitude estrutural está em concordância com a similitude entre as seqüências da proteína E, a conservação de 6 pontes dissulfeto e a coincidência da localização de resíduos identificados como funcionais em diferentes flavivírus tais como determinantes antigênicos, mutantes de atenuação e mutantes de escape.

A proteína E é composta de três domínios estruturais: o domínio I, N-terminal em seqüência e central na estrutura 3 D, o domínio II ou de dimerização, que contém o peptídeo de fusão altamente conservado em flavivírus e o domínio III, dobramento tipo IgG e envolvido na interação com receptores celulares.

A proteína E é uma glicoproteína multifuncional que possui um papel chave em várias etapas da replicação do vírus. Esta proteína é o alvo fundamental dos anticorpos neutralizantes contra o vírus, media a interação com os receptores celulares e é a proteína de fusão que media a fusão da membrana viral e a membrana plasmática do hospedeiro {Heinz, F. X, and S. L. Allison. 2003. Flavivirus structure and membrane fusion. Adv. Virus Res. 59:63-97. Modis, Y, S. Ogatai D. Clements, and S. C. Harrison. 2004. Structure of the dengue virus envelope protein after membrane fusion. Nature 427:313-319. Rey 2004. Chen, Y., T. Maguire, R. E. Hileman, J. R. Fromm, J. D. Esko, R. J.Linhardt, and R. M. Marks. 1997. Dengue virus infectivity depends on envelope protein binding to target cell heparan sulfate. Nat. Med. 3:866- 871. Navarro-Sanchez, E., R. Altmeyer, A. Amara, O. Schwartz, F. Fieschi, J. L. Virelizier, F. Arenzana-Seisdedos, and P. Despres. 2003. Dendritic-cell-specific ICAM3-grabbing non-integrin is essential for the produdive infedion of human dendritic cells by mosquito-cell-derived dengue viruses. EMBO Rep. 4:1-6. Tassaneetrithep, B., Τ. H. Burgess, A. Granelli- Piperno, C. Trumpfheller, J. Finke, W. Sun, M. A. Eller, K. Pattanapanyasat, S. Sarasombath, D. L Birx, R. M. Steinman, S. Schlesinger, and M. A. Marovich. 2003. DC-SIGN (CD209) mediates dengue virus infection of human dendritic cells. J. Exp. Med. 197:823-829).

Esta proteína se encontra ancorada à membrana do vírus e suas funções estão ligadas às mudanças de conformação importantes tanto de estrutura terciária como quaternária. Quando o vírus é ainda intracelular, esta proteína se encontra em forma de heterodímeros associada à proteína preM {Allison, S. L, K. Stadler, C. W. Mandl, C. Kunz, and F. X. Heinz. 1995. Synthesis and secretion of recombinant tick-borne encephalitis virus protein E in soluble and particulate form. J. Virol. 69:5816-5820. Rice, C. M. 1996. Flaviviridae: the viruses and their replication, p. 931-959. In Β. N. Fields, D. N. Knipe, Ρ. M. Howley, R. M. Chanock, J. L. Melnick, Τ. P. Monath, B. Roizman, and S. E. Straus (edit.), Virology, 3rd edit. Lippincott-Raven, Philadelphia, Pa.). Neste estado viral, denomina-o de vírions imaturos, estes vírions são defeituosos para realizar fusão de membranas e se demonstrou que sua infectividade in vitro é muito inferior aos vírions maduros extracelulares (<Guirakhoo, F., Heinz, F. X., Mandl, C. W., Holzmann, H. & Kunz, C. Fusion activity, of flaviviruses: comparison of mature and immature (prM containing) tick-borne encephalitis virions. J. Gene. Virol. 72, 1323- 1329, 1991. Guirakhoo, F., Bolin, R. A. & Roehrig, J. T. The Murray Valley encephalitis virus prM protein confers acid resistance to virus particles and alters the expression of epitopes within the R2 domain of E glycoprotein. Virology 191, 921-931, 1992). Postula-se que a função dos heterodímeros é o de inibir a união da proteína E à membrana durante o passo dos vírions imaturos por compartimentos intracelulares que por seu pH ácido poderiam ativar o processo de fusão de membranas. Além disso a proteína preM poderia funcionar como uma chaperona no dobramento e ensamblagem da proteína E (Lorenz, I. C, Allison, S. L, Heinz, F. X. & Helenius, A. Folding and dimerization of tick-borne encephalitis virus envelope proteins prM and E in the endoplasmic reticulum. J. Virol. 76, 5480-5491, 2002). No momento de secreção dos vírions ao exterior das células hospedeiras, a proteína preM é processada proteoliticamente por proteases de hospedeiro (furinas), a proteína E forma homodímeros, e se reorganiza a envoltura dando lugar aos vírions maduros {Stadler, K., Allison, S. L, Schalich, J. & Heinz, F. X. Proteolytic activation of tick-borne encephalitis virus by furin. J. Virol. 71, 8475-8481, 1997. Elshuber, S., Allison, S. L, Heinz, F. X. & Mandl, C. W. Cleavage of protein prM is necessary for infection of BHK-21 cells by tick-borne encephalitis virus. J. Gen. Virol. 84, 183-191, 2003). Determinou-se por criomicroscopia eletrônica a estrutura dos vírions maduros a uma resolução de 9.5 Á (Zhang W, Chipman PR, Corver J, Johnson PR, Zhang E, Mukhopadhyay S, Baker TS, Strauss JH, Rossmann MG, Kuhn RJ. Visualization of membrane protein domains by cryo-electron microscopy of dengue virus. Nat Struct Biol. 2003, 10: 907-12. Kuhn, R. J. et al. Structure of dengue vírus: implications for flavivirus organization, maturation, andfusion. Cell 108, 717-725, 2002) e vírions imaturos a 12.5 Á (Zhang, Y. et al. Structures of immature flavivirus particles. EMBO J. 22, 2604- 2613, 2003). Estes vírions têm simetria icosaédrica T=3. Nos vírions maduros os dímeros da proteína E se localizam paralelos à membrana do vírus, cobrindo quase toda a superfície. Estes vírions maduros são completamente infectivos e nesta conformação interatuam com os receptores celulares e com os anticorpos. Uma vez que interatuam com seu receptores, os vírions são internalizados mediante um processo de endocitose mediado por receptores. Uma vez localizados em endossomas, com pH ligeiramente ácido a proteína E muda de conformação e induz o processo de fusão de membranas (Allison, S. L et al. Oligomeric rearrangement of tick-borne encephalitis virus envelope proteins induced by an acidic pH. J. Virol 69, 695-700, 1995). Neste processo a proteína passa de dímeros a trímeros. A estrutura trimérica pós-fusogênica da proteína E foi elucidada recentemente (Modis, Y., Ogata, S., Clements, D. & Harrison, S. C. Structure of the dengue virus envelope protein after membrane fusion. Nature 427, 313-319 (2004). Bressanelli, S. et al. Structure of a flavivirus envelope glyeoprotein in its low-pH-induced membrane fusion conformation. EMBO J. 23, 728- 738 (2004)), mostrando que a formação de trímeros vai acompanhada de mudanças importantes de estrutura terciária, os monômeros se associam paralelamente com o extremo do domínio II, ou região de peptídeo de fusão interagindo com as membranas. A análise conjunta das estruturas cristalinas resolvidas e as estruturas dos vírions indicam que durante as diferentes etapas de ciclo de replicação viral, os vírions se submetem a reorganizações em que a estrutura terciária e quaternária da proteína Eeo virion em seu conjunto mudam profundamente.

A proteína E é o alvo fundamental dos anticorpos neutralizantes gerados durante a infecção viral. Durante a infecção com um sorotipo geram anticorpos de longa duração neutralizantes contra a infecção com o sorotipo homólogo. Durante os primeiros meses posteriores à infecção estes anticorpos são neutralizantes também contra sorotipos heterólogos, no entanto, esta capacidade se perde passado 9 meses da infecção (.Halstead S. B. Neutralization and antibody-dependent enhancement of dengue viruses. Adv Virus Res. 2003,60: 421-67. Sabin, A. B. 1952. Research on dengue during World War II. Am. J. Trop. Med. Hyg.l: 30-50.)

A nível molecular as variações aminoacídicas na superfície da proteína E entre os diferentes sorotipos do vírus de dengue, provocam que os anticorpos gerados contra um sorotipo possuam em geral menor afinidade pelo resto dos sorotipos. Uma afinidade suficientemente baixa dos anticorpos pode resultar na perda da capacidade de neutralização, mas estes ainda podem se unir à superfície dos vírions em quantidade suficiente para facilitar a união do vírus às células portadoras de receptores de FC {Halstead, S. B., and E. J. O Rourke. 1977. Dengue viruses and mononuclear phagocytes. I. Infection enhancement by non-neutralizing antibody. J. Exp. Med. 146:201-217. Littaua, R., I. Kurane, and F. A. Ennis. 1990. Human IgG Fc receptor II mediates antibody-dependent enhancement of dengue virus infection. J. Immunol. 144:3183-3186).

Adicionalmente, durante uma infecção secundária o incremento a título da população de anticorpos de baixa afinidade supera o dos novos anticorpos com alta afinidade pelo novo sorotipo de DV, por isso as células B de cor e as células plasmáticas preexistentes são ativadas mais rapidamente do que as células B virgens. O padrão da resposta de anticorpos durante a convalescença em infecções secundárias é influenciado grandemente pelo sorotipo da infecção primária de DV, um fenômeno referido como "pecado antigênico original" {Halstead, S.B., Rojanasuphot, S., and Sangkawibha, N. 1983. Original antigenic sin in dengue. Am. J. Trop. Med. Hyg. 32:154-156).

Por outro lado, anticorpos monoclonais de alto título de neutralização podem provocar imunoamplificação in vitro com diluições suficientemente baixas (Brandt, W. E., J. M. McCown, Μ. K Gentry, and P. K Russell. 1982. Infection enhancement of dengue type 2 virus in the U-937 human monocyte cell Iine by antibodies to flavivirus cross-reactive determinants. Infect. Immun. 36:1036-1041. Halstead, S. B., C. N. Venkateshan, Μ. K Gentry, and LK. Larsen. 1984. Heterogeneityofinfection enhancement of dengue 2 strains by monoclonal antibodies. J. Immunol. 132:1529-1532. Morens, D. M., S. B. Halstead, and N. J. Marchette. 1987. Profiles of antibody-dependent enhancement of dengue virus type 2 infection.

Microb. Pathog. 3:231-237).

A estrutura antigênica da proteína E de flavivirus foi estudada intensamente utilizando painéis de anticorpos monoclonais murinos e um conjunto de análises bioquímicas e biológicas, que incluem ensaios de concorrência, sensibilidade do reconhecimento a procedimentos como redução de pontes dissulfeto e tratamento com SDS, reconhecimento de fragmentos de digestões proteolíticas e peptídeos sintéticos, ensaios virológicos de neutralização e inibição da hemoaglutinação, obtenção de mutantes de escape, provas sorológicas dos Mabs, etc. {Heinz. T. Roehrig, J.T., Bolin, RA. and Kelly, R.G. Monoclonal Antibody Mapping of the Envelope Glycoprotein of the Dengue 2 Virus, Jamaica, VLROLOGY 246, 317-328, 1998. Heinz, F. X, and Roehrig, J. T. (1990). Flaviviruses. In "Immunochemistry of Viruses. II. The Basis for Serodiagnosis and Vaccines " (M.H. V. Van Regenmortel and A.R. Neurath, Eds.), pp. 289-305. Elsevier, Amsterdam. Mandl, C. W., Guirakhoo, F. G., Holzmann, H., Heinz, F. X., and Kunz, C. (1989). Antigenic structure of the flavivirus envelope protein E at the molecular levei, using tick-borne encephalitis virus as a model. J. Virol. 63, 564-571. I. L Serafin and J. G. Aaskov. Identification of epitopes on the envelope (E) protein of dengue 2 and dengue 3 viruses using monoclonal antibodies. Arch Virol (2001) 146: 2469-2479). Definiram-se 3 domínios antigênicos A, B e C que se correspondem com os três domínios estruturais II, III e I respectivamente. Os anticorpos que reconhecem um epítopo em particular, mostram características funcionais muito similares. Os epítopos do domínio A (equivalente ao domínio estrutural II) são destruídos pela redução de pontes dissulfetos e os Mabs que reconhecem estes epítopos são inibidores da hemoaglutinação, neutralizam a infecção viral e inibem a fusão de membranas mediada pelo vírus. Em particular o epítopo Al, definido no vírus de dengue é reconhecido por anticorpos de especificidade tipo grupo, ou seja, que mostram alta reatividade cruzada entre os flavivírus. Os Mabs 4G2 (anti- DV2) e 6B6C (anti-JEV) reconhecem este epítopo. O reconhecimento do epítopo diminui em várias ordens em caso de vírions imaturos e não aumenta com tratamento dos vírions maduros com pH ácido (Guirakhoo, F., R. A. Bolin, and J. T. Roehrig. 1992. The Murray Valley encephalitis virus prM protein confers acid resistance to virus particles and alters the expression of epitopes within the R2 domain of E glycoprotein. Virology 191:921-931).

Desenvolvimento de vacinas

Na atualidade não se dispõe de tratamentos específicos contra o DV e suas manifestações severas. O controle de mosquito é custoso e majoritariamente ineficiente. O tratamento clínico baseado em manejo apropriado de fluidos para corrigir a hipovolemia permitiu a redução da mortalidade por FHD, no entanto os tratamentos seguem sendo problemáticos em muitos países subdesenvolvidos. Estimam-se umas 30 000 mortes anuais por FHD e a taxa de mortalidade e gastos associados com a doença são comparáveis com outras doenças de primeira prioridade em saúde pública (Shepard DS, Suaya JA, Halstead SB, Nathan MB, Gubler DJ, Mahoney RT, Wang DN, Meltzer Ml.Cost-effectiveness of a pediatric dengue vaccine. Vaccine. 2004, 22(9-10): 1275-80).

Vários candidatos vacinais se encontram atualmente em diferentes etapas de desenvolvimento (Barrett, A.D. 2001. Current status of flavivirus vaccines. Ann. Ν. Y. Acad. Sei. 951:262-271. Chang GJ, Kuno G, Purdy DE, Davis BS. 2004 Recent advancement in flavivirus vaccine development. Expert Rev Vaccines. 2004 3(2): 199-220). As estratégias abordadas incluem vacinas vivas atenuadas, vírus quiméricos, DNA plasmídico e vacinas por subunidades. Cepas atenuadas dos quatros sorotipos se desenvolveram com as metodologias regulares de propagação em células primárias de rins de cãoes e macacos (Bhamarapravati, N., and Sutee, E. 2000. Live attenuated tetravalent dengue vaccine. Vaccine. 18:44-47. Eckels, K.H., et al. 2003. Modiflcation of dengue virus strains by passage in primary dog kidney cells: preparation of candidate vaccines and immunization of monkeys. Am. J. Trop. Med. Hyg. 69:12-16. Innis, B. L, and Eckels, KH. 2003. Progress in development of a live-attenuated, tetravalent dengue virus vaccine by the United States Army Medicai Research and Materiel Command. Am. J. Trop. Med. Hyg. 69:1-4). O avanço desta estratégia foi afetado pela ausência de modelos animais e marcadores in vitro de atenuação em humanos. Neste sentido, obtiveram clones de cDNA dos quatros sorotipos aos quais introduziram mutações e variações atenuantes, que em teoria diminuem a probabilidade de reversão a fenótipos de virulência (Blaney, J. E., Jr., Manipon, G.G., Murphy, B.R., and Whitehead, S.S. 2003. Temperature sensitive mutations in the genes encoding the NSl, NS2A, NS3, and NS5 nonstructural proteins of dengue virus type 4 restrict replication in the brains of mice. Arch. Virol. 148:999-1006. Durbin, A.P., et al. 2001. Attenuation and immunogenicity in humans of a Iive dengue virus type-4 vaccine candidate with a 30 nucleotide deletion in its 3 '-untranslated region. Am. J. Trop. Med. Hyg. 65:405-413. Patent: Zeng L, Markoff L, WOOOl4245, 1999).

Outra estratégia foi a criação de variantes de flavivirus quiméricos para os quatros sorotipos, cada um consiste nos genes estruturais de preM e E de um sorotipo de DV e os genes do Core e as proteínas não estruturais do vírus da febre amarela ou de uma cepa atenuada de DV ou outro vírus (Guirkhoo F, Arroyo J, Pugachev KV et al. Construction, safety, and immunogenicity in non-human primates of a chimeric yellow fever-dengue virus tetravalent vaccine. J Virol 2001; 75: 7290-304. Huang CY, Butrapet S, Pierro DJ et al. Chimeric dengue type 2 (vaccine strain PDK-53)/dengue type 1 virus as a potential candidate dengue type 1 vírus vaccine. J Virol 2000; 74: 3020-28. Markojf L, Pang X, Houng HS, et al. Derivation and characterization of a dengue 1 host-range restricted mutant virus that is attenuated and highly immunogenic in monkeys. J Virol 2002; 76: 3318-28. Patent: Stockmair and schwan Hauesser, W09813500, 1998. Patent: Clark andElbing: W09837911, 1998. Patent: Lai CJ, US6184024, 1994).

Em general, com respeito às estratégias baseadas em vacinas vivas atenuadas existem múltiplas incógnitas sobre os possíveis benefícios destas pelos fenômenos de reversão de virulência, interferência viral e recombinações intergenômicas (Seligman SJ, Gould EA 2004 Iive flavivírus vaccines: reasons for caution. Lancet. 363(9426).2073-5). As vacinas de DNA plasmídico que expressam proteínas de DV se encontram em etapas têmporas de desenvolvimento, igual às baseadas em proteínas recombinantes (Chang, GJ., Davis, B.S., Hunt, A.R., Holmes, D.A., and Kuno, G. 2001. Flavivirus DNA vaccines: current status and potential. Ann. Ν. E. Acad. Sei. 951:272- 285. Simmons, M., Murphy, G.S., Kochel, T., Raviprakash, K, and Hayes, CG. 2001. Characterization of antibody responses to combinations of a dengue-2 DNA and dengue-2 recombinant subunit vaccine. Am. J. Trop. Med. Hyg. 65:420-426. Patent: Hawaii Biotech Group, Inc; W09906068 1998. Feighny, R., Borrous, J. and Putnak R. Dengue type-2 virus envelope protein made using recombinant baculovirus protects mice against virus challenge. Am. J. Trop. Med. Hyg. 1994. 50(3). 322-328; Deubel, V, Staropoli, I., Megret, F., et al. Affinity-purified dengue-2 virus envelope glycoprotein induzes neutralising antibodies andprotective immunity in mice. Vaccine. 1997. 15, 1946-1954). Vários candidatos baseados nas estratégias anteriores mostraram proteção em modelos animais, e alguns mostraram segurança e imunogenicidade em etapas têmporas de ensaios clínicos.

O obstáculo principal no desenvolvimento de vacinas se situa na necessidade de conseguir proteção contra os quatros sorotipos. Considera- se que em humanos, a infecção com um sorotipo do vírus de dengue induz imunidade de por vida contra o mesmo sorotipo. A imunização contra um sorotipo só consegue proteção contra o resto dos sorotipos (imunidade heterotípica) por um curto período de tempo entre 2-9 meses {Sabin, A. B. 1952. Research on dengue during World War II. Am. J. Trop. Med. Hyg. 1:30-50). Além disso, uma proteção ineficiente contra algum sorotipo poderia sensibilizar ao organismo e colocá-lo em perigo de manifestações severas da doença associadas a uma resposta imune heteróloga de natureza patológica em caso de uma infecção posterior com esse sorotipo (Rothman AL 2004 Dengue: defining protective contra pathologic immunity J. Clin. Invest. 113:946-951). No entanto, o desenvolvimento de formulações tetravalentes efetivas das vacinas vivas atenuadas e as proteínas recombinantes disponíveis resultou uma tarefa difícil, requerendo o uso de regimes complicados de imunização multidose.

Anticorpos: Imunização passiva

Uma estratégia alternativa ao uso de vacinas para a prevenção do dengue é a imunização passiva com anticorpos neutralizantes. Com este fim foi descrito a obtenção de anticorpos de chimpanzé humanizados tais como o 5H2 neutralizante anti dengue 4 (Men, R., T. Yamashiro, A. P. Goncalvez, C. Wernly, D. J. Schofield, S. U. Emerson, R. H. Purcell, and C. J. Lai. 2004. Identification of chimpanzee Fab fragments by repertoire cloning and production of a full-length humanized immunoglobulin Gl antibody that is highly ejficient for neutralization of dengue type 4 virus. J. Virol. 78:4665- 4674) e de neutralização cruzada contra os quatros sorotipos tais como o 1A5 (Goncalvez, Α.Ρ., R. Men, C. Wernly, R. Η. Purcell, and CJ. Lai. 2004. Chimpanzee Fab fragments and a derived humanized immunoglobulin Gl antibody that efficiently cross-neutralize dengue type 1 and type 2 viruses. J. Virol. 78: 12910-12918).

O uso de imunização passiva poderia ser útil tanto com fins profiláticos como terapêuticos levando em conta que se demonstrou que o nível de viremia é um fator importante na severidade da doença {Wang, W. K. D. E. Chão, C. L. Kao, H. C. Wu, E. C. Liu, C. M. Li, S. C. Lin, J. H. Huang, and C. C. King. 2003. High leveis of plasma dengue viral Ioad during defervescence in patients with dengue haemorrhagic fever: implications for pathogenesis. Virology 305:330-338. Vaughn, D. W., Green, S., Kalayanarooj, S., Innis, B.L., Nimmannitya, S., Suntayakorn, S., Endy, T.P., Raengsakulrach, B., Rothman, A.L., Ennis, F.A. and Nisalak, A. Dengue Viremia Titer, Antibody Response Pattern, and Virus Serotype Correlate with Disease Severity. J. Infect. Dis. 2000; 181: 2-9). No entanto a aplicação de anticorpos também pode ter suas dificuldades. De acordo com a hipótese de incremento de infecção mediada por anticorpos (ADE), no momento que a concentração de anticorpos abaixa a níveis subneutralizantes, os imunocomplexos vírus- anticorpo podem amplificar a entrada de vírus nas células portadoras de receptores de FC e aumentar a replicação do vírus nestas células. Portanto necessitaria de manter altos os níveis de anticorpo para evitar colocar em risco o paciente de sofrer manifestações severas da doença.

Uma possibilidade é obter cadeias de anticorpos modificadas no FC para diminuir a interação com seus receptores. Uma estratégia particularmente atraente é a mutação de resíduos do FC que afetem especificamente a interação com FCyR-I, FCyR-II e FCyRIII, mas não a interação com o FCRn envolvido na reciclagem dos anticorpos e portanto determinante do tempo de vida média in vivo.

Uma alternativa é a identificação de anticorpos neutralizantes incapazes de provocar ADE. Descreveu-se um anticorpo com esta característica {Patent: Bavarian Nordic Res. Inst. W09915692, 1998), o qual neutraliza DV2 sem causar ADE em um modelo in vitro. No entanto, não se descreveram anticorpos similares contra outros sorotipos. Também não existem dados da caracterização deste anticorpo em modelos in vivo. Uma dificuldade adicional é que os modelos animais disponíveis não reproduzem as características da infecção em humanos.

Também em relação ao uso de anticorpos, propôs-se uma estratégia baseada na obtenção de complexos biespecíficos de anticorpos anti- dengue e anti-receptor 1 do complemento de eritrócitos. Estes complexos denominados heteropolímeros provocam a união do vírus a eritrócitos e desta maneira aumenta grandemente a depuração do vírus da corrente sangüínea, sendo redirecionado para os tecidos (Hahn CS, Freneh OG, Foley P, Martin EM, Taylor RP. 2001. Bispeeifie monoelonal antibodies mediate binding of dengue virus to erythroeytes in a monkey model of passive viremia. J Immunol. 2001 166:1057-65). Descrição detalhada da invenção

Na invenção se define uma área ou epítopo na superfície da proteína E (de envolvimento) altamente conservada em flavivírus e a aplicação deste epítopo como alvo para a obtenção de moléculas eficazes para o tratamento profilático e terapêutico contra os quatros sorotipos do vírus de dengue e outros flavivírus. Em sua aplicação para o desenho de vacinas a invenção demonstra que, gerando uma resposta de anticorpos focalizada nesta região da proteína E, se consegue um efeito neutralizante e protetor de similar magnitude contra os quatros sorotipos de dengue. Desta maneira se elimina a resposta contra o resto da proteína, de maior variabilidade e potencialmente indutora de anticorpos neutralizantes de natureza sorotipo específica (ou subcomplexo específica) e potencialmente imunoamplificadora contra o resto dos sorotipos. Como as propriedades antigênicas da área descrita são topográficas, a invenção inclui o desenho de mutações e conexões estabilizadoras que garantem o dobramento correto e secreção do subdomínio da proteína E que inclui o mencionado epítopo. Em sua aplicação para o desenvolvimento de agentes de imunização passiva, com fins tanto profiláticos como terapêuticos, a invenção define moléculas recombinantes capazes de se unirem simultaneamente a duas, três ou múltiplas cópias simétricas deste epítopo na superfície dos vírions maduros de flavivírus, e possuem propriedades neutralizantes e protetoras superiores a anticorpos naturais e a seus fragmentos FAb, devido a um efeito combinado de maior avidez, e interferência com as mudanças estruturais a que se submetem os vírions nas etapas temporãs do ciclo de replicação viral.

Em um primeiro objeto da invenção se descreve o desenho de proteínas recombinantes que conseguem reproduzir as propriedades antigênicas e estruturais do mencionado epítopo da proteína E. Uma das proteínas recombinantes descritas é reconhecida por um anticorpo monoclonal de rato capaz de neutralizar os quatros sorotipos do vírus dengue, e que também reconhece outros flavivírus. A imunização com esta proteína recombinante quimérica consegue induzir uma resposta de anticorpos neutralizante e protetora contra os quatros sorotipos do vírus dengue e outros flavivírus. A invenção descreve uma maneira para desenhar a proteína recombinante quimérica, que permite o dobramento correto do domínio da proteína E que contém um epítopo neutralizante comum aos flavivírus. Este epítopo é de natureza topográfica, e suas propriedades antigênicas são dependentes da estrutura 3D. As moléculas resultantes desta invenção são aplicáveis à indústria farmacêutica na obtenção de preparados vacinais contra o vírus de dengue e outros flavivírus bem como de diagnósticos médios que contenham estas proteínas.

No segundo objeto da invenção se descreve o desenho de outras proteínas recombinantes com um potente caráter neutralizante contra os quatros sorotipos do vírus de dengue e outros flavivírus. A seqüência aminoacídica destas proteínas contém um domínio de união, um segmento espaçador e um domínio denominado domínio de multimerização. O domínio de união possui a capacidade de se unir a um epítopo da proteína de envolvimento altamente conservado em todos os flavivírus e conteúdo nas proteínas do primeiro objeto de invenção descrito anteriormente. Em uma variante, os domínios de união consistem em fragmentos de anticorpos de corrente simples capazes de reconhecer o epítopo conservado. Os segmentos espaçadores são seqüências de 3-20 resíduos, ricos em resíduos preferencialmente hidrofílicos, polares, de cadeia lateral pequena, que trazem ao segmento grande mobilidade. Estes segmentos não devem interferir com o dobramento independente dos domínios de união e de multimerização e, além disso, devem ser resistentes à hidrólise pelas proteases séricas.

Os domínios de multimerização da presente invenção são proteínas ou domínios destas que em seu estado nativo se encontram associados formando preferencialmente dímeros ou trímeros, ainda que não se descartem estruturas quaternárias de maior grau de associação. Estes domínios são selecionados de proteínas humanas séricas ou extracelulares, para evitar a geração de auto-anticorpos. Uma propriedade essencial dos domínios de multimerização considerados nesta invenção é que não possuam a propriedade de interatuar com os receptores Fc envolvidos no processo de imunoamplificação da infecção do vírus de dengue mediada por anticorpos. A estrutura quaternária dos domínios de multimerização pode ser dependente de interações covalentes e/ou não covalentes.

Em uma das variantes o domínio de multimerização está baseado no fragmento Fc de anticorpos humanos, incluindo a região da bisagra que media pontes dissulfetos intercatenários que estabilizam a estrutura dimérica. Estes fragmentos Fc estão desprovidos de glicosidação, bem mediante deglicosidação química ou enzimática, ou por sua expressão em um organismo não glicosidante, como a bactéria E. coli. Os domínios Fc não glicosidados podem ser obtidos também em células de organismos superiores quando contêm mutações em sua seqüência que alteram o padrão NXT/S. Os domínios Fc não glicosidados perdem a capacidade de união aos receptores FcyR-I ao III, capazes de mediar imunoamplificação in vitro; no entanto não se afeta a interação com o receptor FcRn, propriedade favorável para atingir tempos de vida média elevados in vivo.

Em outra variante o domínio de multimerização é um fragmento helicoidal da matrilina humana que forma trímeros.

A conexão do domínio de união ao domínio de multimerização mediante espaçadores flexíveis permite a união simultânea da proteína quimérica a múltiplas monômeros da proteína E adjacentes na estrutura icosaédrica dos vírions maduros dos flavivírus. Assim, para uma variante de seqüência [domínio de união]-[espaçador]-[domínio de multimerização], que resulte em uma proteína dimérica se poderá conseguir a união simultânea de dois monômeros de proteína E. Se se produz uma proteína trimérica se conseguiriam unir três monômeros.

O título de neutralização de proteínas quiméricas descritas no segundo objeto da presente invenção é superior ao dos Fab e inclui anticorpos completos. Estas proteínas recombinante unem os vírions com maior avidez, e a união simultânea de vários monômeros interfere com as trocas de estrutura quaternária necessárias no processo de fusão de membranas. As moléculas resultantes desta invenção são aplicáveis à indústria farmacêutica na obtenção de agentes profiláticos e/ou terapêuticos contra o vírus de dengue e outros flavivírus bem como de médios diagnósticos que contenham estas proteínas. Desenho de proteína quimérica com objetivos vacinais.

A concepção atualmente aceita é que uma vacina efetiva contra o dengue deve ser capaz de gerar uma resposta de anticorpos neutralizante contra os quatros sorotipos. No entanto, a glicoproteína E da envoltura viral é variável entre os sorotipos. A variabilidade em seqüência provoca que a resposta global contra a proteína seja neutralizante contra o sorotipo homólogo, mas não contra os sorotipos heterólogos, aumentando ao mesmo tempo a possibilidade de anticorpos imunopotenciadores da infecção.

A presente invenção descreve um método para o desenho de vacinas por subunidades contra o dengue, que geram uma resposta uniformemente neutralizante e protetora contra os quatros sorotipos. O desenho se baseia em primeiro lugar na identificação de áreas ou epítopos da superfície da proteína, cuja conservação é total ou muito alta entre os sorotipos e que, além disso, estão expostos na superfície dos vírions maduros. Mediante uma análise de conservação dos resíduos da proteína se conseguiu identificar um cluster de resíduos conservados expostos (figura 1 e 2, tabela 1). A área total da superfície do cluster é de 417 Â2, trazido por 25 resíduos. Esta área é comparável com os valores típicos da superfície de interação entre anticorpos e proteínas. O epítopo é de natureza topográfica incluindo resíduos longínquos na estrutura primária da proteína E, mas próximos na estrutura tridimensional.

Em segundo lugar, a invenção descreve o desenho de proteínas recombinantes quiméricas que contenham o epítopo conservado, maximizando a relação entre resíduos conservados/variáveis apresentados ao sistema imune e conseguindo a estabilização da estrutura tridimensional do epítopo em forma similar como se encontra no contexto da proteína E completa. Descrevem-se duas topologias possíveis:

B-L-C e C-L-B,

onde B é o segmento Leu237-Val252 e C é o segmento Lys64-Thrl20 da glicoproteína E de dengue 2 ou os segmentos homólogos dos outros sorotipos ou de outro flavivírus, ou seqüências similares com mais de 80% de identidade de resíduos em relação a qualquer das anteriores. Os segmentos homólogos a B e C em seqüências de flavivírus se definem mediante a utilização de programas de alinhamento de pares de seqüências ou de múltiplas seqüências tais como o BLAST, FASTA e CLUSTAL (Altschul, S.F., Gish W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, DJ. 1990, Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol 215: 403-410. Pearson WR, Lipman DJ.

Improved tools for biological sequence comparison. Proc Natl Acad Sei U S A. 1988, 85:2444-8. Higgins D., Thompson J., Gibson T. Thompson J. D., Higgins D. G., Gibson T. J. 1994; CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). Estes alinhamentos de seqüências permitem também definir em seqüências de outros flavivírus os resíduos homólogos (também referidos como equivalentes ou correspondentes) aos resíduos de alta conservação identificados na tabela 1 do exemplo 1 para o caso particular da seqüência do vírus dengue 2.

Em ambas topologias descritas, L são seqüências espaçadoras tipicamente dentre IelO resíduos cujo papel é conectar os segmentos BeC de forma estabilizante com respeito ao dobramento da proteína quimérica, de maneira que a estrutura 3D do epítopo seja similar à estrutura adotada no contexto da proteína E completa. Nas duas variantes topológicas da proteína quimérica se inclui integralmente o epítopo conservado e se exclui o resto da proteína mais variável. A proteína quimérica representa um subdomínio do domínio estrutural II da glicoproteína de envolvimento. Este subdomínio localizado no extremo do domínio II é composto estruturalmente por duas folhas beta antiparalelas empacotadas uma contra outra. A maior é composta por três fibras (segmento C) e a menor é uma forquilha beta (segmento Β). O subdomínio contém duas pontes dissulfeto e está conectado ao resto da glicoproteína E por quatro pontos, consistindo com a natureza topográfica do epítopo conservado. No entanto a superfície de contato entre o subdomínio e o resto da proteína é de 184 Â2, o que representa somente 12% da superfície acessível total do subdomínio, consistindo isto com a factibilidade de obter um dobramento correto do subdomínio mediante conexões estabilizantes descritas nas duas variantes topológicas anteriores. A invenção inclui a possibilidade de incrementar a estabilidade termodinâmica da proteína quimérica mediante mutações em resíduos não acessíveis na superfície do virion e portanto não envolvidos na interação com anticorpos.

Uma idéia central e inovadora da presente invenção é que é possível desenvolver uma vacina por subunidade baseada em uma única cadeia de proteína, que seja efetiva contra os quatros sorotipos de dengue. As estratégias atuais baseadas em candidatos recombinantes pressupõem o uso de menos quatros proteínas E recombinantes, uma por cada sorotipo combinadas em uma formulação vacinai {Patente: Hawaii Biotech Group, Inc; W09906068 1998). Avaliaram-se também como possíveis candidatos fragmentos da proteína E, mas até agora os trabalhos focaram no domínio III, expresso em forma de proteínas de fusão com proteínas portadoras (Patente: Centro de Ingeniería Genética y Biotecnologia; WO/2003/008571. Simmons M, Murphy GS, Hayes CG. Short repon: Antibody responses of mice immunized with a tetravalent dengue recombinant protein subunit vaccine. Am J Trop Med Hy g. 2001,65:159-61. Hermida L, Rodriguez R, Lazo L, Silva R, Zulueta A, Chinea G, Lopez C, Guzman MG, Guillen G. A dengue-2 Envelope fragment inserted within the structure of the P64k meningococcal protein carrier enables a functional immune response against the virus in mice. J Virol Methods. 2004 Jan; 115(1) :41-9). O domínio III é capaz de gerar resposta neutralizante mas específica a cada sorotipo, por isso que um preparado vacinai deve incluir as seqüências dos quatros sorotipos.

A proteína quimérica PMEC1 do exemplo 1 da presente invenção se corresponde com uma topologia B-L-C, com seqüências de fragmentos B e C do vírus dengue 2 e seqüência conectora de dois resíduos Gly-Gly. Descreve-se um gene que codifica para a proteína quimérica PMEC1. O plasmídeo pET-sPMECl-His6 codifica para a proteína PMEC1 fusionada pelo extremo N-terminal ao peptídeo líder peIB, e pelo C-terminal a uma seqüência codificante para 6 histidinas (Seqüência No. 12).

A proteína quimérica PMEC 1 foi obtida de forma solúvel no periplasma da bactéria E. coli. Desenvolveu-se um processo de purificação facilmente escalável por cromatografia de quelatos metálicos (IMAC) que permitiu a obtenção da proteína pura para os estudos posteriores. A proteína purificada foi analisada por espectrometria de massas; o sinal de massa/z obtido corresponde com o valor teórico calculado a partir da seqüência de PMEC1 e assumindo a formação de duas pontes dissulfeto.

Demonstrou-se um forte reconhecimento da proteína PMEC1 pelos líquidos ascíticos hiperimunes obtidos contra os quatros sorotipos do vírus de dengue e pelo AcM 4G2. Este reconhecimento é dependente da correta formação de pontes dissulfetos, o que sugere que a proteína PMEC1 se encontra em uma conformação similar à adotada pela região correspondente da proteína E nativa.

Ao imunizar com a proteína quimérica PMEC 1 recombinante se obteve resposta neutralizante e protetora em ratos, e altos títulos contra os quatros sorotipos do vírus de dengue. Paralelamente se realizou o ensaio de IΗΑ obtendo-se títulos positivos contra os quatros sorotipos. No ensaio de neutralização in vitro atingiram títulos de 1:1280 contra os quatros sorotipos do vírus. Finalmente se realizou um ensaio de proteção em ratos, conseguindo proteção com PMEC1 em 80 a 90% dos animais, contra os quatros sorotipos.

Modelagem do complexo Mab 4G2- proteína E

No Exemplo 8 mostra o resultado de modelagem da estrutura do complexo do Fab 4G2 com a proteína E. Este anticorpo reconhece e neutraliza os quatros sorotipos do vírus dengue e outros flavivírus.

O modelo foi obtido por acoplamento molecular utilizando o método CLUSPRO (http://structure.bu.edu/Proiects/ PPDocking/cluspro.html). Utilizou-se a estrutura cristalográfica do Fab 4G2 (arquivo PDB 1 uyw) e os arquivos PDB Ioan e Ioan correspondentes à estrutura dimérica da proteína E de dengue 2. A tabela 8 mostra os valores de parâmetros característicos da interfase entre a proteína Eeo Fab; os valores calculados para o complexo modelado são similares aos complexos proteína-anticorpos cuja estrutura cristalográfica foram determinados experimentalmente (tabela 9).

O modelo obtido indica que o epítopo do Mab 4G2 inclui a região de alta conservação em flavivírus identificada nesta invenção. A tabela 1 mostra o conjunto de resíduos que conformam o epítopo estrutural pré- referido (resíduos da E em contato com o anticorpo) e aqueles que conformam a área de alta conservação. O 71% dos resíduos que conformam o epítopo estrutural reconhecido pelo anticorpo segundo o modelo obtido pertencem a área de alta conservação.

Posteriormente se obteve um modelo do complexo Fab 4G2- proteína E no contexto do virion maduro, acoplando a estrutura complexo pré- referida na estrutura do vírus de dengue 2 determinada por criomicroscopia eletrônica. Desta forma, obteve-se um modelo em que todos os epítopos do Mab 4G2 (180) presentes no virion estão ocupados por Fab.

A distância interatômica dos resíduos C-terminais da cadeia pesada dos Fabs unidos aos 90 dímeros de proteína E no virion, é de 100 Â. Esta mesma distância medida para Fabs associados aos monômeros da unidade assimétrica que não estão associados como dímeros é de 120 Â em um caso e 80 Â em outro.

Estas distâncias não são compatíveis estereoquimicamente com a seqüência e características estruturais das moléculas IgG, sugerindo que o anticorpo 4G2 se une ao vírus de forma monovalente.

Esta predição é apoiada pelos resultados mostrados no exemplo 12, onde se mostra que o Fab 4G2 e o Mab 4G2 possuem títulos neutralizantes similares. Isto contrasta com dados obtidos para outros anticorpos antivirais nos quais a união divalente provoca um aumento da capacidade de neutralização de até 2-3 ordens {Drew PD, Moss MT, Pasieka TJ, Grose C, Harris WJ, Poder AJ. Multimeric humanized varicella-zoster vírus antibody fragments to gH neutralize virus while monomeric fragments do not. J Gen Virol. 2001; 82:1959-63. Lantto J, Fletcher JM, Ohlin Μ. A divalent antibody format is required for neutralization of human cytomegalovirus via antigenic domain 2 on glycoprotein B. J Gene Virol. 2002; 83: 2001-5).

Esta característica do anticorpo 4G2 poderia ser comum a vários anticorpos anti- flavivírus, como é o caso do anticorpo de chimpanzé 1A5 contra o domínio A da proteína E {Goncalvez AP, Men R, Wernly C, Purcell RH, IAi CJ. Chimpanzee Fab fragments and a derived humanized immunoglobulin Gl antibody that efficiently cross-neutralize dengue type 1 and type 2 viruses. J Virol. 2004; 78: 12910-8). Em general, o balanço do poder de neutralização entre o anticorpo e seu Fab dependerá do epítopo reconhecido pelo anticorpo, a identidade do anticorpo e dos detalhes estereoquímicos do complexo. Assim, o Mab 4E11 que reconhece um epítopo do domínio B, é 50 vezes mais neutralizante do que sua Fab correspondente (Thullier, P., P. Lafaye, F. Megret, V. Deubel, A. Jouan, and J. C. Mazie. 1999. A recombinant Fab neutralizes dengue virus in vitro. J. Biotechnol. 69:183-190).

Desenho de moléculas neutralizantes multivalentes

A presente invenção descreve o desenho e a obtenção de moléculas capazes de se unirem simultaneamente a duas ou três cópias do epítopo conservado na superfície do virion. No total o virion expõe 180 cópias do epítopo conservado descrito na presente invenção, os quais podem ser agrupados em 90 duplas de epítopos correspondentes a dímeros da proteína E ou em 60 trios de epítopos correspondentes às cópias dos três monômeros de proteína E que conformam a unidade assimétrica do virion. Estas moléculas são capazes de se unirem de forma di- ou trivalente e apresentam uma afinidade pelo virion e poder de neutralização superior em variados ordens aos anticorpos neutralizantes que reconhecem o epítopo conservado definido nesta invenção. Estas moléculas neutralizam os quatros sorotipos do vírus de dengue e outros flavivírus, por isso são úteis para o tratamento profilático e/ou terapêutico do dengue e alternativamente de outros flavivírus.

A seqüência das moléculas (proteínas) di- ou trivalentes da presente invenção são descritas com a seguinte fórmula:

[S]-[L]-[D] ou [S]-[L]-[T] onde [S] é a seqüência de um fragmento de anticorpo de cadeia simples (scFv) que reconhece o epítopo conservado descrito nesta invenção, [L] é uma seqüência espaçadora tipicamente dentre 3 e 20 aminoácidos, [D] é a seqüência de uma proteína ou fragmento desta capaz de dimerizar, e [T] é a seqüência de uma proteína ou fragmento desta capaz de trimerizar. As seqüências de [D] e [T], são proteínas ou domínios de proteínas que não interatuam com receptores Fc capazes de mediar o fenômeno de imunopotenciação da infecção viral. Desta maneira se evita a possibilidade de provocar a concentrações subneutralizantes das moléculas di/trivalentes, o aumento da infecção viral em células portadoras de receptores de Fc. Portanto as moléculas descritas são superiores aos anticorpos no que respeita sua incapacidade de provocar ADE. Além disso, estas moléculas possuem um tamanho superior aos fragmentos de anticorpos scFv e portanto maior tempo de vida média in vivo.

As seqüências [D] e [T] correspondem a proteínas e fragmentos de proteínas humanas extracelulares, preferencialmente séricas, evitando a possibilidade da indução de uma resposta de autoanticorpos gerada contra proteínas intracelulares ou de outras espécies.

De maneira geral, os domínios [D]/[T] podem ser substituídos por domínios de multimerização com um grau de oligomerização superior, sempre que se elejam seqüências espaçadoras compatíveis com a união multivalente.

Com a multimerização (incluindo dimerização e trimerização) desenhada se consegue aumentar a avidez dos fragmentos e de sua capacidade intrínseca de neutralização já que a união multipuntual ao vírus estabiliza a estrutura do virion maduro, interferindo com as mudanças de estrutura quaternária associadas ao processo de fusão de membranas. Além disso, se consegue o aumento de tempo de vida médio in vivo por aumento da tara molecular. Estas proteínas recombinantes, que incluem fragmentos Fv do anticorpo, podem se converter em agentes terapêuticos e/ou imunoprofilácticos, efetivos para o controle de focos de epidemias.

A presente invenção descreve um gene que codifica para uma proteína quimérica denominada TB4G2. O plasmídeo pET-TB4G2-LH codifica para a proteína TB4G2 fusionada pelo extremo N-terminal ao peptídeo líder pelB, e pelo C-terminal a uma seqüência codificante para 6 histidinas (Seqüência No. 16).

A proteína quimérica TB4G2 contém os seguintes elementos em direção amino- a carbóxi-terminal: (a) a região variável da cadeia leve do anticorpo monoclonal 4G2 (Seqüência No. 25), (b) uma seqüência espaçadora flexível (Seqüência No. 26), (c) a região variável da cadeia pesada do anticorpo monoclonal 4G2 (Seqüência No. 27), (d) uma seqüência espaçadora flexível de 15 resíduos (Seqüência No. 28), (e) um fragmento da matrilina humana que confere à molécula a capacidade de trimerizar-se em solução (Seqüência No. 51).

A proteína quimérica TB4G2 corresponde à variante topológica [S]-[L]-[T], onde [S] é um fragmento scFv do anticorpo 4G2, [L] é um espaçador de 15 resíduos compostos por resíduos de GLY e SER, e [T] é um domínio de trimerização da matrilina humana que forma uma estrutura helicoidal coiled-coil trimérica, onde as hélices alfa se alinham de forma paralela (Dames SA, Kammerer RA, Wiltscheck R, Engel J, Alexandrescu AT. NMR strueture of a par aliei homotrimerie coiled coil. Nat Struet Biol. 1998; 5: 687-91). Este segmento da matrilina trimeriza covalentemente mediante a formação de pontes dissulfetos entre cisteínas situadas no extremo N-terminal da hélice. O peptídeo líder peEB permite a localização periplasmática da proteína TB4G2 e portanto seu dobramento in vivo, com a formação correta das pontes dissulfetos dos domínios de união e trimerização.

De acordo com os modelos do complexo Fv 4G2-virion as distâncias que separam os extremos C-terminais da região variável da cadeia pesada dos fragmentos Fv unidos aos três monômeros da unidade assimétrica são de 36, 58 e 70 Â. Estes três átomos se encontram circunscritos em uma esfera de raio 35 Â, por isso o segmento espaçador [L] tem que ser capaz de adotar conformações compatíveis com esta distância.

Teoricamente um segmento de 15 resíduos em conformação estendida tem dimensões de 52.5 Â. No entanto tal conformação não é necessariamente a mais estável, e em general as propriedades estruturais dos peptídeos são determinadas por sua seqüência. Os peptídeos ricos em GLY e SER são intrinsecamente flexíveis, capazes de adotar múltiplas conformações em solução. A predição de conformações com PRELUDE {Rooman MJ, Koeher JPl Wodak SJ. Predietion of protein backbone eonformation based on seven strueture assignments. Influenee of local interactions. J Mol Biol. 1991; 221:961-79) realizada no exemplo 9, indica que as conformações mais favoráveis para a seqüência de [L] (seqüência No 28) possuem uma distância entre os extremos amino e carbóxi-terminais de aproximadamente 35 Á. Portanto o desenho da proteína quimérica TB4G2 é estruturalmente compatível com a união simultânea dos três monômeros de E da unidade assimétrica.

A proteína quimérica TB4G2 foi obtida de forma solúvel no periplasma da bactéria Ε. coli. Desenvolveu-se um processo de purificação facilmente escalável por cromatografia de quelatos metálicos (EMAC) que permitiu a obtenção das proteínas puras. A proteína purificada foi analisada em eletroforese de SDS-PAGE. A proteína tratada em condições redutoras migra para uma banda correspondente à massa do monômero de TB4G2, e para uma banda correspondente a um trímero em condições não redutoras.

Finalmente foi realizado o ensaio de neutralização contra os quatros sorotipos do vírus de dengue em células BHK-21, com o objetivo de comparar a capacidade neutralizante de TB4G2 com respeito ao anticorpo original 4G2 e seus fragmentos proteolíticos Fab e (Fab' A proteína TB4G2 mostrou títulos de neutralização similares contra os quatros sorotipos e superiores em 2-3 ordens ao anticorpo e seus fragmentos.

A presente invenção descreve um gene (Seqüência No. 17) que codifica para uma proteína quimérica denominada MA4G2.

A proteína quimérica MA4G2 (Seqüência No. 56) contém os seguintes elementos em direção amino- a carbóxi-terminal: (a) a região variável da cadeia leve do anticorpo monoclonal 4G2 (Seqüência No. 25), (b) uma seqüência espaçadora flexível (Seqüência No. 26), (c) a região variável da cadeia pesada do anticorpo monoclonal 4G2 (Seqüência No. 27), (d) uma seqüência espaçadora flexível de 3 resíduos (Gly-Gly-Gly), (e) os domínios bisagra, CH2 e CH3 da imunoglobulina humana IgGl (Seqüência No. 52). No domínio CH2 da IgGI humana, a proteína não sofreu mutação ASN297- >GLN.

A proteína quimérica MA4G2 corresponde à variante topológica [S]-[L]-[D], definida na presente invenção, onde [S] é um fragmento scFv de uma corrente do anticorpo 4G2, [L] é um espaçador de 3 resíduos, de seqüência GLY-GLY-GLY, e [D] os domínios bisagra, CH2 e CH3 da imunoglobulina humana IgGL. A região bisagra media a formação de pontes dissulfetos intercatenários entre duas proteínas idênticas, que estabilizam uma estrutura dimérica. A mutação ASN297->GLN no domínio CH2 da IgGI humana previne sua glicosilação em células eucarióticas e sua capacidade de união aos receptores FcyR I-III, que mediam a imunoamplificação in vitro. Desta forma, a diferença do anticorpo original 4G2, a proteína desenhada não apresenta riscos de provocar ADE a concentrações subneutralizantes. No entanto, retém a capacidade de interagir com o receptor FcRn5 propriedade favorável para atingir tempos de vida média elevados in vivo, de forma similar aos anticorpos naturais.

O plasmídeo pET-MA4G2-LH (Seqüência No. 20) codifica para a proteína MA4G2 fusionada pelo extremo N-terminal ao peptídeo líder pelB (Seqüência No. 24) e pelo extremo C-terminal com uma fila de 6 Histidinas. O peptídeo líder pelB permite a localização periplasmática da proteína MA4G2, onde ocorre a formação correta das pontes dissulfetos intracatenários (os domínios de união, CH2 e CH3) e entre as regiões bisagras (intercatenários). A fila de histidinas permite a purificação por cromatografia de quelatos metálicos.

O modelo 3 D do complexo formado entre MA4G2 e o dímero da proteína E (exemplo 9), bem como os resultados dos ensaios de neutralização (exemplo 12) indicam que a proteína quimérica MA4G2 é estereoquimicamente compatível com a união simultânea dos monômeros associados em dímeros na estrutura dos vírions maduros, conseguindo uma potenciação considerável na atividade biológica.

Um aspecto central da presente invenção consiste em que moléculas capazes de contatar a área da alta conservação da proteína E, interferem com a função desta proteína, constituindo candidatos potenciais como agentes antivirais de amplo espectro contra flavivírus. Como mostra o exemplo 12 os fragmentos do anticorpo 4G2, incluindo o scFv possuem uma atividade neutralizante similar ao anticorpo completo, indicando que não é necessária a bivalência na atividade antiviral e esta depende da interferência na função da proteína E ao se unir à área de alta conservação e que esta atividade é de amplo espectro contra flavivírus. Portanto métodos atrativos para a identificação de moléculas com estas características, são aqueles que permitam identificar moléculas protéicas, peptídicas e moléculas pequenas que se unam à área de alta conservação. Tal é o caso, de métodos baseados no bloqueio da união de anticorpos que reconhecem a área de alta conservação, como por exemplo o Mab 4G2 e seus fragmentos Fab, fab2, scFv ou as proteínas quiméricas descritas na presente invenção, as quais estão baseadas no lugar de união de anticorpos. Estes ensaios podem ser ensaios imunoenzimáticos, radioimunoensaios, ensaios com sondas fluorescentes que permitam quantificar a união das moléculas à proteína E, vírions ou proteínas quiméricas descritas na presente invenção que contêm a área de alta conservação. Estes ensaios, podem ser úteis para a identificação de potenciais moléculas com atividade antiviral de amplo espectro contra flavivírus, mediante triagem in vitro, de bibliotecas de compostos químicos, incluindo aquelas geradas por métodos de química combinatória.

Igualmente, a identificação de moléculas candidatas pode se realizar por métodos de tiagem virtual, assistido por computadores. Estes métodos estão baseados em procedimentos computacionais de acoplamento molecular, com os quais se podem modelar complexos de moléculas unidas a proteínas e quantificar a fortaleza ou energia da união por meio de funções de pontuação, calculadas a partir das coordenadas do complexo. Exemplos destes procedimentos computacionais de acoplamento molecular são os programas GOLD (Jones, G. e cols., 1997. Development and validation of a genetic algorithm for flexible docking. J. Mol. Biol 267, 727-748), DOCK (Kuntz, I. D. e cols., 1982 A geometric approach to macromolecule-ligand interactions. J. Mol. Biol 161, 269-288) e FLEXX (iOlender, R. and Rosenfeld, R., 2001. A fast algorithm for searching for molecules containing a pharmacophore in very large virtual combinatorial libraries. J. Chem. Inf Comput. Sei. 41, 731- 738). Por meio destes procedimentos podem ser tríadas bibliotecas virtuais de moléculas como por exemplo à base de compostos ZINC (Irwing, JJ. and Scoichet, B.K., 2005. Zinc - A free Database of commercially available compounds for virtual screening. J. Chem. Inf. Model. 45, 177-182) e determinar aquelas que são antecipadas como potenciais unidoras do lugar ativo selecionado na proteína receptor. No caso correspondente à presente invenção o lugar de união consiste na área de alta conservação da proteína E previamente definida. Pode-se utilizar as coordenadas atômicas das estruturas cristalográficas da proteína E, disponíveis na base de dados PDB ou modeladas por meio de procedimentos computacionais como o método de modelagem por homologia.

Descrição das Figuras

Figura 1. Representação em esquema de cores da conservação de resíduos da superfície da proteína E de flavivírus. Azul escuro significa resíduos de maior grau de conservação nas seqüências de flavivírus, vermelho são resíduos de maior variabilidade.

A elipse assinala a região de alta conservação do extremo do domínio II da proteína. Os valores de conservação foram calculados utilizando o programa CONSURF, considerando o alinhamento múltiplo de seqüências de todos os flavivírus disponíveis na base de dados SWISSPROT. Estes valores foram graficados na superfície da proteína utilizando o programa PyMol.

Figura 2. Representação em esquema de cores da conservação de resíduos da superfície da proteína E do vírus de dengue. Azul escuro significa resíduos de maior grau de conservação nas seqüências de isolamentos de vírus dengue, Vermelho são resíduos de maior variabilidade. A elipse assinala a região de alta conservação do extremo do domínio II da proteína. Os valores de conservação foram calculados utilizando o programa CONSURF, considerando o alinhamento múltiplo de seqüências dos quatros sorotipos do vírus de dengue, disponíveis na base de dados SWISSPROT. Estes valores foram graficados na superfície da proteína utilizando o programa PyMol.

Figura 3. Modelo da estrutura tridimensional da proteína quimérica PMEC1. B é o segmento Leu237-Val252 e C é o segmento Lys64- Thr 120 da glicoproteína E de dengue 2. L é o segmento espaçador de dois resíduos. O modelo 3D da proteína foi obtido com o pacote de programas WHATIF e graficado com PyMol.

Figura 4. Plasmídeo pET-sPMECl.

Figura 5: Plasmídeo pET-scFv 4G2 LH.

Figura 6A: Plasmídeo pET-TB4G2 LH.

Figura 6B: Plasmídeo pET-MA4G2 LH.

Figura 7. Caracterização físico-química da proteína quimérica PMEC1-His6. A: Eletroforese SDS-PAGE da proteína purificada por cromatografia de afinidade por quelatos metálicos (trilha 1) e reduzida e carbamidometilada (trilha 2). B: Análise da proteína por cromatografia de fase reversa RP-C4, a seta indica o pico majoritário. C: Espectro de massas do bico majoritário coletado na cromatografia de fase reversa.

Figura 8. Representação esquemática dos resultados de 13 simulações computacionais de acoplamento molecular (programa CLUSPRO) entre o fragmento Fv do Mab 4G2 e a proteína E de dengue 2. As colunas mostram em um esquema de cores as características estruturais das primeiras 30 melhores soluções (clusters) obtidas em cada simulação. Cada solução é representada com três propriedades. A primeira mostra em que domínio da proteína E está localizado o epítopo correspondente à solução (amarelo, vermelho e azul para domínio I, II e III respectivamente), duas cores significa interfase em dois domínios e a cor violeta interação com três domínios. As letras LeT significam que o epítopo envolve o segmento espaçador (entre domínio I e III) ou o peptídeo de fusão da proteína E respectivamente. A segunda propriedade representada com as cores branco, cinza ou preto indica se o epítopo está localizado na superfície da proteína E para o interior do virion, lateral ou para o exterior respectivamente, sendo somente esta última relevante assumindo que a união do Fab não depende de mudanças maiores na estrutura do virion. A terceira propriedade corresponde ao paratopo do anticorpo, verde se envolve os CDR (solução relevante) ou não envolve os CDR (solução incorreta). As soluções compatíveis com dados experimentais são aquelas representadas com as cores amarelo-preto-verde e são indicadas com setas. As duas primeiras filas, localizadas sobre as colunas das soluções indicam a definição de ligando e receptor utilizadas em cada simulação, incluindo o identificador do arquivo pdb da estrutura da proteína E analisada. O programa de acoplamento molecular utilizado (Dot ou Zdock) se mostra embaixo de cada coluna.

Figura 9. Modelo do complexo entre o virion maduro de dengue 2 e 180 correntes de Fab4G2. O modelo foi obtido acoplando o complexo Fab4G2-proteína E na estrutura do virion maduro obtida por criomicroscopia eletrônica (1THD). Na figura mostram as distâncias entre os resíduos do extremo C-terminal dos fragmentos Fab associados a três monômeros da unidade assimétrica do virion.

Figura 10. Modelo do complexo formado pela proteína quimérica MA4G2 e o dímero da proteína Ε. A figura foi obtida com o programa PyMol.

Figura 11. Predição de estabilidade de confôrmeros de peptídeos de seqüência (GGGS^GGG em função da distância entre os extremos N e C-terminais. As predições foram realizadas com o programa PRELUDE.

EXEMPLOS DE REALIZAÇÃO

Exemplo 1. Desenho da proteína quimérica PMEC

Com o objetivo de identificar regiões conservadas na superfície da proteína E se realizou uma análise de conservação com o método CONSURF (ConSurf .identification offunctional regions in proteins by surface-mapping of phylogenetic information. Glaser, F., Pupko, T., Paz, I., Bell R.E., Bechor-Shental, D., Martz, E. and Ben-Tal, N.; 2003;

Bioinformatics 19: 163-164). No extremo do domínio II se observa uma porção da superfície altamente conservada tanto entre os quatros sorotipos do vírus de dengue como entre todos os flavivírus (figuras 1 e 2).

A área de alta conservação define um epítopo topográfico, conformado por resíduos próximos na estrutura tridimensional mas longínquos na seqüência da proteína Ε. A área está compreendida em um subdomínio estrutural localizado no extremo do domínio II, o qual é conformado por dois segmentos lineares da proteína E, Leu237-Val252 (segmento B) e Lys64-Thrl20 (segmento C). A tabela 1 mostra a listagem de resíduos do subdomínio que estão localizados na superfície exterior do virion e portanto acessível à interação com anticorpos. Os resíduos com alta conservação definem a área ou epítopo identificada nesta invenção.

A inspeção da estrutura do domínio II da proteína E, indica que o subdomínio apresenta características estruturais similares aos domínios estruturalmente independentes. A área de contato com o resto da proteína é de 184 Â2, que representa somente 12 % da área acessível do subdomínio. Além disso, esta porção da estrutura é definida como domínio na base de dados CATH (domínio CATH lsvb03,

http://www. b iochem. ucl. ac. uk/bsm/cath/cath. html). Tabela 1. Definição de resíduos relevantes na presente invenção, localizados no extremo do domínio II da proteína E e expostos na superfície do virion.

<table>table see original document page 34</column></row><table>

AA: aminoácido, No.E DEN2: número do resíduo na seqüência da proteína E de dengue 2, No.PMCEl: número do resíduo na seqüência da proteína quimérica PMEC1, ACC: área acessível ao solvente calculada com WHATIF (Vriend G. WHATIF: a molecular modeling and drug designprogram. JMol Graph. 1990; 8: 52-6, 29). Utilizou-se um modelo atômico do dímero da proteína E obtido mediante o acoplamento independente da estrutura 3 D dos domínios estruturais I, II e III (arquivo pdb loan) na estrutura do virion maduro (arquivo pdb 1THD), CONS: Pontuação de conservação calculada com CONSURF levando em conta um alinhamento de seqüências de flavivírus e dos quatros sorotipos de dengue respectivamente. Os valores negativos indicam maior conservação e em negrito assinalam os valores correspondentes a resíduos definidos como de alta conservação, epítopo: resíduos em contato com o Fab 4G2 segundo o modelo 3D obtido por acoplamento molecular no exemplo 8. Consideram-se os resíduos que possuem ao menos um átomo cuja esfera de van der waals se encontra separada menos de 3 Â da esfera de van der waals de um átomo do Fab,*ASN22 glicosidada em vírus DEN2.

Para obter o subdomínio dobrado de forma independente em primeiro lugar é necessário conectar os dois segmentos em uma única corrente polipeptídica. Duas possíveis conexões ou topologias são possíveis:

B-L-C e C-L-B

onde L é um segmento espaçador. O segmento espaçador tem que ser estereoquimicamente compatível com a estrutura tridimensional do subdomínio e no caso ideal prover efeito estabilizante na estabilidade termodinâmica da proteína quimérica. A distância entre os carbonos alfa dos resíduos Val252 e Lys64 é de 6.6 Â, por isso a topologia B-L-C pode ser obtida com espaçadores de um ou mais resíduos. Uma análise das estruturas de possíveis giros conectores na base de dados PDB, que sejam compatíveis com a estrutura dos segmentos âncora (comando DGINS no menu DGLOOP do pacote de programas WHATIF), indica que conexões de dois resíduos são mais comuns do que conexões de um resíduo. No caso da topologia C-L-B, a distância entre os carbonos alfa dos resíduos Thrl20 e Leu237 é de 11.1Â, consistente com conexões de 3-4 resíduos ou mais.

A proteína quimérica PMECl (seqüência 14) da presente invenção se corresponde com uma topologia B-L-C3 com seqüências de fragmentos B e C do vírus dengue 2 e seqüência conectora de dois resíduos Gly-Gly.

Como seqüências BeC podem ser escolhidas não só as seqüências correspondentes ao vírus DEN2 como também as seqüências homólogas de outros flavivírus incluindo mas não se limitando a DEN1, DEN3, DEN4, vírus da Encefalite Japonesa, vírus de Encefalite Transmitida por Carrapato, vírus do Nilo Ocidental, vírus do Valle Murray, vírus da Encefalite de San Louis, vírus LANGAT, vírus da Febre Amarela, vírus Powassan, (seqüências 29-42).

Além disso as proteínas quiméricas desenhadas de acordo com o método descrito acima podem sofrer mutações em um ou múltiplos resíduos com o objetivo de incrementar a estabilidade termodinâmica da proteína ou eficiência no dobramento correto. Poderão sofrer mutações resíduos que não se encontram acessíveis à interação com anticorpos na superfície dos vírions maduros descritos na tabela 1. Os resíduos susceptíveis de sofrerem mutações são resíduos internos na estrutura e/ou na superfície lateral e interna da estrutura 3D/4D da proteína E no virion maduro. As proteínas que sofreram mutação podem ser obtidas utilizando-se métodos experimentais combinatórios como por exemplo bibliotecas de fagos filamentosos. Também poderão desenhar utilizando métodos teóricos como por exemplo FOLDX, POPMUSIC, Rosseta. As seqüências 43-50 se correspondem com análogos da proteína quimérica PMECl que sofreram mutação em múltiplas posições. Modelos tridimensionais destas proteínas apresentam boa compactação e qualidade dos modelos. Também são possíveis mutações da cara exposta da proteína, especialmente em posições que não são conservadas estritamente entre os vírus dengue e/ou flavivírus, sempre que as mutações não afetem a interação com os anticorpos neutralizantes e protetores dirigidos contra o subdomínio conservado da proteína E.

Exemplo No. 2 - Construção do plasmídeo pET-sPMECl

Para obter um gene recombinante que codifique para a proteína PMECl (Seqüência No. 1 ) partiu-se do gene da proteína E do envoltório do vírus DEN2 (Seqüência No. 2 ) da cepa 1409, genótipo Jamaica, presente no plasmídeo p30-VD2 (Deubel V, Kinney R. M., Trent D. W.; "Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the structural proteins of dengue type 2 virus, Jamaica genotype", Virology 155(2):365- 377, 1986). Este gene codifica para a proteína que se mostra na Seqüência No. 3. Mediante o método de Agarwal e cols. (Agarwal KL, Büchi H, Caruthers MH, Gupta N, Khorana HG, Kumas A, Ohtsuka E, Rajbhandary UL, van de Sande JH, Sgaramella Vl Weber H, Yamada T, Total synthesis of the Gene for an alanine transfer ribonucleic acid from yeast, 1970, Nature 227, 27-34) e partindo de oligonucleotídeos sintetizados em fase sólida pelo método dos fosforamiditos (Beaucage SL, Caruthers MHl Deoxynucleoside phosphoramidites- A new elass of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis., Tetrahedron Letters, 1981, 22, 1859) obteve-se uma molécula de DNA de dupla corrente (Seqüência No. 4) que codifica para a proteína PMEC1, e que consta dos seguintes elementos: 1) Um lugar de reconhecimento para a enzima de restrição Nco I, onde se encontra o códon de iniciação que codifica para o aminoácido metionina (M) seguido por um códon codificante para o aminoácido alanina (A) (Seqüência No. 5); 2) Um fragmento correspondente à seqüência compreendida desde a posição 709 até a posição 756 do gene para a proteína E do vírus Dengue 2 cepa Jamaica 1409 (Seqüência No. 6), que codifica para a seqüência peptídica mostrada na Seqüência No. 7, compreendida entre as posições 237 a 252 da Seqüência No. 3, 3) Um segmento de união codificante para 2 glicinas em sucessão (Seqüência No. 8), 4) Um fragmento correspondente à seqüência compreendida desde a posição 190 até a posição 360 da Seqüência No. 2, que codifica para a seqüência peptídica mostrada na Seqüência No. 9 (compreendida entre as posições 64-120 da Seqüência No. 3), onde se introduziu uma mutação silente que elimina o lugar de restrição Nco I presente na posição 284-289 da dita seqüência (Seqüência No. 10) e 5) Um lugar de reconhecimento para a enzima de restrição Xho I, onde se encontram dois códons que codificam para os aminoácidos leucina e ácido glutâmico, respectivamente (Seqüência No. 11). Esta molécula sintética foi digerida com as enzimas de restrição Nco I e Xho I (Promega Benelux b.v., Holanda) nas condições especificadas pelo fabricante, e ligou o T4 DNA ligasa (Promega Benelux, b.v., Holanda), sob as condições especificadas pelo fabricante, ao plasmídeo pET22b (Novagen, Inc.) previamente digerido da mesma maneira. A reação obtida foi transformada na cepa de Escherichia coli XL-IBlue (Bullock WO, Fernández JM, Short JM. XL-IBlue: A high efficiency plasmid transforming recA Escherichia coli K12 strain with beta-galactosidase seleetion. Bioteehniques 1987;5:376-8) segundo Sambrook et al. (Sambrook J, Fritseh EF, Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. New York, USA: CoId Spring Harbor Laboratory Press; 1989) e os plasmídeos presentes nas colônias obtidas em meio seletivo foram pesquisados mediante análise de restrição. Um dos plasmídeos recombinantes resultantes foi denominado pET-sPMECl (Figura 4) e sua seqüência de DNA foi verificada mediante seqüenciamento automático (Seqüência No. 12)

O plasmídeo pET-sPMECl codifica para a proteína PMECl fusionada, pelo extremo N- terminal, ao peptídeo líder do gene pelB, e pelo C-terminal a uma seqüência codificante para 6 histidinas (Seqüência No. 13). Isto permite, por um lado, que a referida proteína seja processada mediante remoção do peptídeo líder e secretada ao periplasma de E. coli, cujas condições oxidantes permitem o correto dobramento e formação dos enlaces dissulfeto de PMEC1, e por outro lado permite uma purificação fácil de referida proteína usando cromatografia de afinidade por quelatos metálicos (IMAC) (iSulkowski, E. (1985) Purification of proteins by IMAC. Trends Biotechnol. 3, 1-7). A seqüência final da proteína, denominada PMEC1-His6, depois de seu processamento e secreção ao periplasma, é mostrada na Seqüência No. 14.

Exemplo No. 3 - Expressão e purificação de PMEC1-His6

O plasmídeo pET-sPMECl se transformou (Sambrook J, Fritseh EF1 Maniatis T. Molecular eloning: A laboratory manual. New York, USA: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989) na cepa de E. coli BL21(DE3) (,Studier, F. W. and B. A. Moffatt "Use of bacteriophage Tl RNA polymerase to direet selective high-level expression of cloned genes." J.Mol.Biol. 189.1 (1986): 113-30) e a partir de uma colônia isolada inoculou um cultivo de 50 ml de meio Luria-Bertani suplementado com ampicilina a 50 μg/ΜL. (LBA) que foi aumentado 12 horas a 30°C com uma agitação de 350 r.p.m. A partir deste cultivo inoculou-se 1 1 de meio LBA com uma densidade ótica a 620 nm (OD620) de 0.05, que foi aumentado durante 8 h a 28°C até fase exponencial tardia e depois induzido mediante a adição de isopropiltiogalactosídeo (IPTG), seguindo o crescimento nas mesmas condições durante mais 5 horas.

O cultivo induzido assim obtido foi centrifugado a 5000 χ g por 30 min. a 4°C e da biomassa resultante se extraiu a fração periplásmica mediante o método de Ausubel et ai. (Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. and Struhl, K (1989) in Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, New York). A fração periplásmica foi dialisada em tampão fosfato 50 mM pH 7/imidazol 20 mM usando uma membrana com um peso de corte de 1000 Da e a proteína PMEC1-His6 foi obtida da mesma mediante cromatografia de afinidade por quelatos metálicos (Sulkowski, E. 1985, Purification of proteins by IMAC. Trends Biotechnol. 3, 1-7) usando Ni-NTA agarose (Qiagen Benelux Β. V., Holanda) de acordo às instruções do fabricante.

Exemplo 4. Caracterização físico-química da proteína quimérica PMECl-Hisó

A preparação de PMECl-Hisó purificada por cromatografia de quelatos metálicos mostra uma banda majoritária em SDS-PAGE (figura 7A) que migra com uma massa aparente correspondente com a massa esperada para a proteína (aproximadamente 9500 Da), sendo evidente o alto grau de pureza alcançado na preparação. Nesta mesma figura se aprecia que a banda correspondente a PMECl-Hisó reduzida e carbamidometilada (rastro 2, figura 7A) mostra uma migração eletroforética ligeiramente menor do que em condições não redutoras (rastro 1, figura 7A). Este comportamento indica que a proteína se encontra pregueada com as cisteínas envolvidas em pontes dissulfeto intracatenários.

Uma alíquota de 80 μg de PMECl-Hisó foi analisada em uma coluna de fase reversa C44.6x250 mm (J.T. Baker, EEUU). A corrida cromatográfica foi realizada a 37°C empregando um sistema cromatográfico de alta pressão equipado com duas bombas e um controlador. Para a eluição da proteína se aplicou um gradiente de 10 a 60 % (v/v) de acetonitrila em 0.1% (v/v) de ácido trifluoroacético com um fluxo de 0.8 ml/min e a detecção foi realizada a 226 nm. No cromatograma se obteve um único pico confirmando o elevado grau de homogeneidade da preparação (figura 7B).

O pico majoritário da análise em RP-HPLC foi analisado por espectrometria de massas com o objetivo de obter a massa molecular da proteína com uma maior exatidão e verificar a formação da ponte dissulfeto. Os espectros de massas foram adquiridos em um espectrômetro de massas híbrido com geometria octogonal QTOF-2TM (Micromass, UK) equipado com fonte de ionização por eletronebulização Z-spray. O programa de processamento dos espectros de massas empregado foi o MassLynx versão 3.5 (Micromass, UK). O espectro de massas da espécie majoritária da preparação de PMEC1-His6 possui uma massa molecular de 9219.51 Da (figura 7C), este valor se diferencia em 0.05 Da da massa média esperada de acordo com a seqüência do gene. Esta análise confirma que os resíduos de cisteína da molécula estão envolvidos na formação de pontes dissulfeto. Ao mesmo tempo, esta análise descarta a presença de outras modificações pós- traducionais não desejadas, como degradação nos extremos ou modificação de aminoácidos susceptíveis.

Exemplo 5. Caracterização antigênica de PMECl

A fração purificada de PMECl se caracterizou tanto por reconhecimento em dotblott com diferentes soros policlonais e monoclonais murinos obtidos por imunização com as correspondentes preparações virais, bem como por soros humanos positivos a Dengue (tabela 2 e 3). Como controle nos ensaios se incluiu uma proteína recombinante que consiste no domínio III da proteína do invólucro do vírus DEN- 2 do genótipo Jamaica, fiisionada a uma seqüência de seis His (DIIIe2). A diferença da proteína PMEC1, DIIIe2 compreende uma região de maior variabilidade da proteína do envoltório. O domínio III expresso por via recombinante em E. coli é fortemente reconhecido por líquidos ascíticos hiperimunes (LAH) anti-DEN apresentando uma marcada especificidade pelo sorotipo homólogo e perde consideravelmente sua reatividade pela redução da única ponte dissulfeto presente nesse domínio. Esta reatividade específica ao sorotipo homólogo foi também encontrada no caso dos anticorpos humanos. Também por modo de controle se incluiu nos ensaios o reconhecimento com o AcM 3H5 que a diferença do AcM 4G2 tem um reconhecimento sorotipo específico por um epítopo presente no domínio III de DEN-2. Igualmente no AcM 4G2, o reconhecimento do 3H5 ao DEN-2 é afetado pelo tratamento da preparação com um agente redutor (Roehrig JT, Volpe KE, Squires J, Hunt AR, Davis BS, Chang GJ. Contribution of disulfide bridging to epitope expression of the dengue type 2 virus envelope glycoprotein. J Virol. 2004; 78: 2648-52). Tabela 2. Reatividade da proteína PMEC 1 frente a anticorpos monoclonais e policlonais em Dotblott.

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* Foram aplicados 10 μg das proteínas purificadas PMCEl e DIII e2. RC: proteína previamente reduzida e carboximetilada. A intensidade do sinal obtido foi avaliado desde + até +++.

** Os líquidos ascíticos hiperimunes (LAHi) foram utilizados 1:100 enquanto os anticorpos monoclonais 4G2 e 3H5 foram utilizados a uma concentração de 10 μg/ml.

*** tbE: vírus de Encefalitis transmitida por Carrapato, YFV: Vírus da Febre Amarela; SLV: Vírus da Encefalitis de San Luis. GF: reação cruzada com grupo de flavivírus.

Os líquidos ascíticos hiperimunes obtidos contra os quatros sorotipos do vírus de dengue e o AcM 4G2 reconheceram a proteína em uma magnitude similar. No caso do resto dos flavivírus ensaiados o maior reconhecimento correspondeu ao vírus da encefalitis de St Louis, com um sinal similar ao obtido para dengue 1-4. Os LAIH anti-TBE e anti-YF também reconheceram a proteína ainda que em menor magnitude. O reconhecimento é dependente da formação de pontes dissulfetos, indicando que a proteína se encontra corretamente pregueada, em uma conformação similar à adotada no contexto da estrutura nativa da proteína E.

A proteína PMECl foi caracterizada adicionalmente através de Dot-blotting empregando soros humanos de diferentes qualidades. Empregaram-se soros de indivíduos com infecção primária por DEN-1, DEN- 2, DEN-3 e DEN-4, também foram avaliados soros de indivíduos com infecção secundária por DEN-2 e DEN-3. Empregaram-se misturas de soros de três indivíduos infectados na mesma epidemia, com sintomas clínicos e resultados de sorologia similares. Em todos os soros se determinou a reatividade dos Acs IgM frente aos antígenos virais e PMEC1.

Tabela 3. Reatividade da proteína PMEC 1 frente a anticorpos de origem humana em Dot-blott.

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* Misturas de soros de indivíduos convalescentes de infecção primária (IP) por DEN-1, DEN-2, DEN-3 e DEN-4.

** Misturas de soros de indivíduos com infecção secundária (IS) por DEN-2 e DEN-3.

*** Foram aplicados 10 μg das proteínas purificadas PMCEl e DIIIe2. RC: proteína previamente reduzida e carboximetilada. A intensidade do sinal obtido foi avaliado desde + até +++.

Ag DEN: Mistura de antígenos virais dos quatros sorotipos obtidos de sobrenadantes de células Vero infectadas.

Ctrl Neg: Preparação controle obtida de sobrenadantes de células Vero sem infectar.

As misturas de soros humanos foram empregadas em uma diluição 1/400 enquanto os anticorpos monoclonais 4G2 e 3H5 foram utilizados em uma concentração de 10 μg/ml.

Os soros humanos provenientes de infecções com os diferentes sorotipos do vírus reconheceram a proteína em uma magnitude similar. Os sinais mais intensos foram obtidos para os soros pertencentes a indivíduos com infecção secundária que correspondem com os soros de maior título em ensaios de ELISA de reconhecimento anti-viral. Exemplo 6. Caracterização da resposta de anticorpos gerada por PMECl

Foram imunizados 80 ratos Balb/c com 20 μg por via intraperitoneal da preparação purificada de PMEC1, utilizando o adjuvante de Freund. Uma parte dos animais (10 ratos) sangraram depois da quarta dose e determinou por ELISA a presença de anticorpos anti-DEN. Foram obtidos altos títulos contra os quatros sorotipos do vírus de dengue (tabela 4). Paralelamente se realizou o ensaio de IHA obtendo-se títulos positivos contra os quatros sorotipos (tabela 5). Finalmente se realizou o ensaio de neutralização in vitro atingindo títulos de 1/1280 igualmente contra os quatros sorotipos do vírus (tabela 6). Tabela 4. Títulos de anticorpos anti-DEN dos soros obtidos depois da imunização com PMEC1.

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*Os títulos foram determinados por diluição ao ponto final. Cada soro foi avaliado paralelamente com uma preparação de antígeno viral obtido em cérebro de rato lactante (Clarke, D. M., Casais, J. Techniques for hemaglutination and hemaglutination-inhibition with arthropode-borne viruses. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 1958. 7:561- 573.) e com uma preparação controle de cérebro não infectado processado da mesma forma.

Tabela 5. Títulos por IHA dos soros dos animais imunizados com a proteína PMEC1.

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* Os títulos IHA foram definidos como a maior diluição capaz de inibir a hemoaglutinação de eritrócitos de ganso frente a 8 unidades hemoaglutinantes virais.

Tabela 6. Ensaio de neutralização viral com os soros dos animais imunizados com PMEC1. <table>table see original document page 46</column></row><table>

* Os títulos neutralizantes se definiram como a maior diluição do soro onde se obteve 50% de redução do número de placas virais em células BHK-21. Exemplo 7. Ensaio de proteção

Para a avaliação da proteção conferida aos ratos ante o teste com DEN letal pela imunização com PMEC1, utilizaram-se os ratos que não sangraram nos ensaios descritos anteriormente de caracterização da resposta de anticorpos. Os animais imunizados com PMECl foram divididos em quatro grupos (15 animais por grupo) que foram testados cada um com um sorotipo viral diferente e um grupo controle de 10 animais que não foi submeteu ao teste. Cada um dos animais recebeu uma dose de 100 LD50 de DEN letal por inoculação intracraneal e foram observados durante 21 dias para obter as porcentagens de letalidade. Utilizaram-se como controles positivos grupos de 15 ratos imunizados com as quatro preparações virais (DEN-1, DEN-2, DEN-3 e DEN-4). Todos os ratos destes grupos sobreviveram enquanto os ratos do grupo controle (-) para cada sorotipo, adoeceram nos 7-11 dias posteriores ao teste obtendo-se 100% de mortalidade. Finalmente, os grupos imunizados com a proteína PMECl apresentaram entre um 80% e 90% de proteção obtendo-se em todos os casos diferenças significativas em relação ao grupo controle (tabela 7)

Tabela 7. Porcentagens de sobrevida em ratos imunizados com as variantes de proteínas ensaiadas frente ao teste com vírus DEN letal

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* Calculou-se: (# de ratos sobreviventes)/ (# total de ratos). Os dados de sobreviventes foram tomados 21 depois do teste.

Exemplo 8. Predição da estrutura do complexo 4G2-proteína E

Com o objetivo de modelar a estrutura do complexo antígeno- anticorpo realizou-se um estudo de acoplamento molecular da estrutura cristalográfica do fragmento Fab de anticorpo 4G2 (1uyw) e duas estruturas cristalográficas da proteína E do envoltório do vírus dengue 2 (arquivos do PDB Ioan e loan). Utilizou-se o método CLUSPRO (http://nrc.bu.edu/cluster/, S. R. Comeau, D. W. Gatchell, S. Vajda, CJ. Camacho. ClusPro: an automated docking and discrimination method for the prediction of protein complexes. (2004) Bioinformatics, 20, 45-50), incluindo dois programas diferentes de geração de estruturas de possíveis complexos: DOT e ZDOCK ÇMandell JG, Roberts VA, Pique ME, Kotlovyi V, Mitchell JC, Nelson E, Tsigelny I, Ten Eyck LF. (2001) Protein docking using continuum electrostatics and geometric fit. Protein Eng 14:105-13. Chen R, Li L, Weng Z (2003) ZDOCK: An Initial-stage Protein-Docking Algorithm. Proteins 52:80-87).

Realizaram-se 13 simulações de acoplamento molecular variando os seguintes parâmetros: o programa de acoplamento (DOT ou ZDOCK), a definição de ligante/receptor (fragmento Fv do anticorpo ou proteína E), a estrutura cristalográfica da proteína E (loan e loan), a estrutura quaternária da proteína E (monômero ou dímero), filtrado de soluções que envolvam o lugar de união do Fv ou o segmento N- terminal 1-120 da proteína E (opção Attract em DOT). A figura 7 apresenta de forma esquemática os resultados das simulações. Consideraram-se como soluções possíveis os complexos em que o epítopo estivesse localizado no domínio II da proteína E, acessível à interação com os anticorpos na estrutura do virion e o paratopo consistiria na região hipervariável do anticorpo. A localização do epítopo Al (epítopo reconhecido pelo Mab 4G2) no domínio II é apoiada por dados experimentais e também se determinou que anticorpos relacionados com este epítopo reconhecem o fragmento proteolítico constituído pelos aminoácidos 1-120 da proteína E (Roehrig, J.T., Bolin, R. A. and Kelly, R.G. Monoclonal Antibody Mapping of the Envelope Glycoprotein of the Dengue 2 Virus, Jamaica. 1998, Virology 246: 317-328).

Obtiveram-se seis soluções possíveis, estruturalmente muito similares. A tabela 8 mostra os valores de parâmetros característicos da interfase entre a proteína Eeo Fv, os valores calculados para o complexo modelado são similares aos complexos proteína-anticorpos cuja estrutura cristalográfica foram determinados experimentalmente (tabela 9).

A superfície de contato da proteína E com o anticorpo envolve 4 segmentos da seqüência o que concorda com a natureza topográfica do epítopo dependente do dobramento correto da proteína, sendo o reconhecimento susceptível à redução das pontes dissulfetos.

O epítopo estrutural definido pelo modelo tridimensional contém a região de alta conservação nos flavivírus, o qual é consistente com a ampla reatividade cruzada deste anticorpo e com o reconhecimento da proteína quimérica PMECl no exemplo 5. O modelo sugere, além disso, que o mecanismo de neutralização do anticorpo seja mediado por impedimentos estéricos da união da proteína E a membranas e/ou interferência com a trimerização associada ao processo de fusão.

Além disso, o epítopo reconhecido pelo anticorpo coincide com a zona de interação entre a proteína Eea proteína preM inferida a partir da densidade eletrônica correspondente a preM observada nos estudos de criomicroscopia eletrônica dos vírions imaturos. A pressão evolutiva para a conservação da superfície intermolecular pode explicar a alta conservação deste epítopo da proteína E. Por outro lado, a geração de mutantes de escape nesta superfície é menos provável já que tais mutações precisariam ser compensadas com mutações simultâneas estabilizantes na superfície da proteína preM. De fato mutantes de escape obtidos contra o anticorpo estão localizados na região bisagra entre o domínio II e I, e os vírus mutantes apresentam um alto grau de atenuação e defeitos na capacidade de fusionar membranas (Aaskov). Isto constitui uma propriedade favorável das proteínas quiméricas PMEC da presente invenção como candidatos vacinais recombinantes contra flavivírus.

A seguir modelamos a interação entre o Fab4G2 e a proteína E no contexto dos vírions maduros. Com este objetivo acoplamos a estrutura do complexo obtida previamente na estrutura do virion maduro obtida por criomicroscopia eletrônica. Para obter o modelo se utilizou: 1) o arquivo PDB ITHD correspondente à estrutura do virion obtido por criomicroscopia eletrônica, 2) as coordenadas do complexo entre o Fab4G2 e o monômero da proteína E obtida previamente por acoplamento molecular e 3) aplicaram por último as operações de simetria icosaédrica do arquivo 1THD. Desta forma, obteve-se um modelo em que todos os epítopos do Mab 4G2 (180) presentes no virion estão ocupados pelo Fab (figura 9). Tabela 8. Propriedades da interface do modelo do complexo Fv4G2-proteína E.

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* os parâmetros da interface proteína-proteína foram calculados utilizando o servidor http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/PP/server/

A análise da distância entre os extremos C-terminais dos Fabs indica que a união bivalente do anticorpo não é possível sem maiores modificações na estrutura dos vírions. Esta observação está de acordo com os resultados obtidos no exemplo 12, que mostram que os títulos neutralizantes de quantidades equimolares do Fab e o Mab são similares. Isto contrasta com os aumentos típicos (2-3 ordenes) em avidez dos anticorpos envolvidos em uniões bivalentes.

Tabela 9. Propriedades características em complexos proteína-anticorpos*.

<table>table see original document page 50</column></row><table> <table>table see original document page 51</column></row><table>

*Jones, S. and Thornton, J. M. (1996). Principies of Protein-Protein Interactions Derived From Structural Studies PNAS. Vol. 93 p. 13-20. http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/PP/server/

Exemplo 9. Desenho das proteínas quiméricas MA4G2 (bivalente) e TB4G2 (trivalente)

A seguir procedemos realizar o desenho de proteínas quiméricas baseadas no lugar de união do anticorpo 4G2, que permitam a união simultânea a dois ou mais monômeros da proteína E no virion maduro. O modelo dos Fab unidos ao virion obtido no exemplo 8 mostra que as distâncias entre os resíduos do extremo c- terminal da cadeia pesada dos Fabs associados aos monômeros de E na unidade assimétrica são de 80, 100 e 120 Â, muito distantes para permitir a união bivalente do anticorpo (figura 9). As mesmas distâncias medidas entre moléculas de diferentes unidades assimétricas são ainda maiores. Em troca as distâncias entre os extremos Ο- terminais da cadeia pesada dos fragmentos Fv são de 36, 58 e 70 Â. Estes três átomos se encontram circunscritos em uma esfera de raio 35 À o qual é um indicador de que a união trivalente é possível com a fusão a domínios de trimerização utilizando peptídeos espaçadores de tara média (10-15 resíduos).

As distâncias entre os extremos c-terminais dos Fv unidos a dímeros de E na estrutura do virion é de 36 Â, por isso a união bivalente é possível mediante a fusão dos fragmentos Fv a domínios de dimerização com espaçadores pequenos (5- 10 resíduos). Desenho de molécula tipo mini-anticorpo (união bivalente)

Como exemplo de união bivalente foi desenhada a proteína quimérica MA4G2 cuja seqüência contém, em ordem N a C-terminal, os seguintes elementos:

1- scFV: fragmento Fv de cadeia única do Mab 4G2, com seqüência VL-espaçador-VH (Seqüências No. 25, 26 e 27), VL é a região variável da cadeia leve do Mab 4G2 e VH é a região variável da cadeia pesada deste anticorpo.

2- GGG: espaçador de três Gly

3- Bisagra-CH2-CH3: corresponde à seqüência da IgGI humana, que sofreu mutação no lugar de glicosidação N297>Q (Seqüência No. 52)

A proteína MA4G2 é um dímero quando se expressam em procariontes ou eucariontes, por que o domínio bisagra do anticorpo permite a dimerização por formação de pontes dissulfeto intercatenários e resulta em um Fc humano. A região bisagra traz, além disso, suficiente espaçamento e flexibilidade que permite a incorporação de uma seqüência espaçadora de somente 3 resíduos (GGG) entre o domínio scFv e o Fe. A figura 10 mostra um modelo 3D do complexo MA4G2-dímero de proteína E, consistente com a união bivalente.

A presença da mutação no lugar de glicosidação permite a obtenção do Fc não glicosidado em células de organismos superiores. Os domínios Fc não glicosidados perdem a capacidade de união aos receptores FcyRI-III, capazes de mediar imunoamplificação in vitro ÇLund, J., Takahashi, N., Pound, J. D., Goodail, M., and Jefferis, R. 1996, J. Immunol. 157, 4963-4969. Lund, J., Takahashi, N., Pound, J. D., Goodail, M., Nakagawa, H., and Jefferis, R. 1995, FASEB. J. 9, 115-119). Desta forma a diferença do anticorpo original, a proteína desenhada não apresenta risco de provocar ADE a concentrações subneutralizantes. No entanto, a proteína retém a capacidade de interagir com o receptor FcRn, propriedade favorável para atingir tempo de vida média elevados in vivo, de forma similar aos anticorpos naturais.

Proteína quimérica trivalente TB4G2

Como exemplo de união trivalente foi desenhada a proteína quimérica TB4G2 de seqüência scFv-espaçador-T onde:

1 - scFv é o fragmento Fv de cadeia única do Mab 4G2, com seqüência vL-espaçador- vH (Seqüências No. 25, 26 e 27), vL é a região variável da cadeia leve do Mab4G2 e vH é a região variável da corrente pesada

2 - espaçador é um segmento de seqüência (GGGS^GGG (seqüência 28)

3 - T é um domínio de trimerização helicoidal da proteína matrilina humana (seqüência 51).

O domínio de trimerização da matrilina consiste em uma hélice alfa que trimeriza numa estrutura "coiled-coil" trimérica paralela, formando além disso, seis pontes dissulfetos na que participam duas cisteínas do extremo N-terminal. A estrutura trimérica helicoidal é altamente estável dG= 7 kcal/mol a 50 0C {Wiltscheck R, Kammerer RA, Dames SA, Schulthess T, Blommers MJ, Engel J, Alexandrescu AT. Heteronuelear NMR assignments and secondary structure of the eoiled eoil trimerization domain from cartilage matrix protein in oxidized and redueedforms. Protein Sei. 1997; 6: 1734-45). As pontes dissulfetos garantem a trimerização ainda em concentrações muito baixas, uma vantagem sobre uma trimerização baseada somente em interações não covalentes.

O segmento espaçador composto de Gly e Ser, é altamente flexível. Seqüências de composição similar foram utilizadas em múltiplas ocasiões como seqüências espaçadoras em engenharia de proteínas. Ainda que uma seqüência de 10 resíduos possa propiciar um distanciamento espacial de 35 Â, compatível com a união trivalente ao virion, isto somente se conseguiria para uma conformação totalmente estendida do segmento. Em solução o segmento espaçador pode adotar um grande número de conformações possíveis, que se encontram em equilíbrio termodinâmico, por isso a adoção de uma conformação totalmente estendida significaria uma perda de caráter entrópico considerável.

Para explorar as propriedades estruturais do segmento espaçador se realizou uma predição de estrutura de peptídeo de seqüência (GGGS)3GGG de 15 resíduos, utilizando o programa PRELUDE. Este método leva em conta potenciais estatísticos de interações locais por isso se utilizou para a predição de estrutura de peptídeos. Na figura 11 se mostra a relação entre os valores de energia e a distância entre os extremos NeC- terminais para as conformações do segmento mais prováveis. As conformações energeticamente mais favoráveis correspondem com dimensões de 35 Â, sendo muito desfavoráveis as conformações mais estendidas (mais de 40 Â).

Portanto a seqüência de espaçador escolhida é estruturalmente adequada para o desenho de união trivalente, de acordo com a simulação computacional.

Exemplo 10 - Obtenção de plasmídeos codificantes para um fragmento de anticorpo de cadeia única (scFv 4G2), uma molécula trivalente (TB4G2), e um mini-anticorpo de cadeia única (MA4G2) com as regiões variáveis do anticorpo 4G2

Para obter um fragmento de anticorpo de corrente única, uma proteína multimérica, e um mini-anticorpo de corrente única (MA4G2) com as regiões variáveis do anticorpo monoclonal 4G2, sintetizaram-se, mediante o método de Agarwal e cols. (Agarwal KL, Büchi H, Caruthers MH, Gupta N, Khorana HG, Kumas A, Ohtsuka E, Rajbhandary UL, van de Sande JH, Sgaramella V, Weber H, Yamada T, Total synthesis of the Gene for an alanine transfer ribonucleic acid from yeast, (1970), Nature 227, 27-34) e partindo de oligonucleotídeos sintetizados em fase sólida pelo método dos fosforamiditos (.Beaucage SL, Caruthers MH1 Deoxynucleoside phosphoramidites- A new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis., Tetrahedron Letters, (1981), 22, 1859) moléculas de DNA de dupla corrente (Seqüência No. 15, Seqüência No. 16 e Seqüência No. 17), cada uma das quais foi digerida com as enzimas de restrição Nco I e Xho I (Promega Benelux b.v., Holanda) nas condições especificadas pelo fabricante. Cada molécula digerida foi posteriormente unida usando T4 DNA ligasa (Promega Benelux, b.v., Holanda), sob as condições especificadas pelo fabricante, ao plasmídeo pET22b (Novagen, Inc.) previamente digerido da mesma maneira. As reações obtidas foram transformadas na cepa de Eseherichia coli XL-IBlue (Bullock WO, Fernández JM, Short JM. XL-I Blue: A high efficiency plasmid transforming recA Eseheriehia coli K12 strain with beta-galactosidase selection. Biotechniques 1987;5:376-8) segundo Sambrook et al. (Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. New York, USA: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989) e os plasmídeos presentes nas colônias obtidas em meio seletivo foram pesquisados mediante análise de restrição. A seqüência de vários plasmídeos recombinantes resultantes de cada transformação foi verificada mediante seqüenciamento automático, e para cada reação foi escolhida uma molécula representativa cuja seqüência correspondesse com a esperada. Estes plasmídeos foram denominados pET-scFv 4G2 LH (Figura 5, Seqüência No. 18 ) para a expressão do fragmento de anticorpo de corrente única, pET-TB4G2 LH (Figura 6A, Seqüência No. 19) para a expressão da molécula multimérica, e pET-MA4G2 LH (Figura 6B, Seqüência No. 20) para a expressão do mini-anticorpo de corrente única que porta as regiões variáveis do 4G2.

Estes plasmídeos permitem a expressão em Escheriehia coli, induzível por isopropil-tio-galactosídeo (IPTG) e sob o promotor T7, das proteínas codificadas pelas bandas sintéticas anteriormente descritas (Seqüência No. 15, Seqüência No. 16 e Seqüência No. 17) e que em suas respectivas formas imaturas ou não processadas (Seqüência No. 21, Seqüência No. 22 e Seqüência No. 23) contêm os seguintes elementos em direção amino- a carbóxi-terminal: Para a proteína imatura scFv 4G2 LH, a) O peptídeo sinal pelB (Seqüência No. 24), b) Os aminoácidos M (Metionina) e A (Alanina), introduzidos devido à estratégia de clonagem, c) a região variável da cadeia leve do anticorpo monoclonal 4G2 (Seqüência No. 25), d) uma seqüência de união (Iinker) flexível (Seqüência No. 26), e) a região variável da cadeia pesada do anticorpo monoclonal 4G2 (Seqüência No. 27), f) os aminoácidos L (Leucina) e E (Ácido glutâmico), introduzidos devido à estratégia de clonagem, e g) um segmento C- terminal de 6 histidinas; para a proteína imatura TB4G2 LH: a) O peptídeo sinal pelB (Seqüência No. 24), b) Os aminoácidos M (Metionina) e A (Alanina), introduzidos devido à estratégia de clonagem, c) a região variável da cadeia leve do anticorpo monoclonal 4G2 (Seqüência No. 25), d) uma seqüência de união (Iinker) flexível (Seqüência No. 26), e) a região variável da cadeia pesada do anticorpo monoclonal 4G2 (Seqüência No. 27), f) uma seqüência de união (linker) flexível (Seqüência No. 28), g) um fragmento da matrilina humana que confere à molécula a capacidade de trimerizar em solução (Seqüência No. 51), h) os aminoácidos L (Leucina) e E (Ácido glutâmico), introduzidos devido à estratégia de clonagem, e e) um segmento C-terminal de 6 histidinas; e para a proteína imatura MA4G2 LH: a) O peptídeo sinal pelB (Seqüência No. 24), b) os aminoácidos M (Metionina) e A (Alanina), introduzidos devido à estratégia de clonagem, c) a região variável da cadeia leve do anticorpo monoclonal 4G2 (Seqüência No. 25), d) uma seqüência de união (Iinker) flexível (Seqüência No. 26), e) a região variável da cadeia pesada do anticorpo monoclonal 4G2 (Seqüência No. 27), f) uma seqüência de união (Iinker) flexível formada por 3 glicinas (G) em sucessão, g) um fragmento de região constante do gene das imunoglobulinas tipo IgGI humanas que consta da região bisagra, o domínio CH2 e o domínio CH3, onde o aminoácido C (Cisteína) da região bisagra sofreu mutação para S (Serina) e o lugar de glicosilação potencial do domínio CH2 foi eliminado mediante a mutação de um N (Asparagina) para Q (Glutamina) (Seqüência No. 52), h) os aminoácidos L (Leucina) e E (Ácido glutâmico), introduzidos devido à estratégia de clonagem, e e) um segmento C-terminal de 6 histidinas.

Estes elementos permitem, por um lado, que as referidas proteínas, denominadas respectivamente scFv 4G2 e TB4G2, sejam processadas mediante remoção do peptídeo líder e secretadas ao periplasma de E. coli, cujas condições oxidantes permitem o correto dobramento e formação de seus enlaces dissulfeto, e por outro lado permitem sua fácil purificação usando cromatografia de afinidade por quelatos metálicos (IMAC) (Sulkowski, E. (1985) Purification of proteins by IMAC. Trends Biotechnol. 3, 1-7). A seqüência final tanto de scFv 4G2 quanto TB4G2 e MA4G2 depois de seu processamento e secreção ao periplasma, é mostrada na Seqüência No. 53, Seqüência No. 54 e Seqüência No. 55.

Exemplo 11 - Expressão e purificação de scFv 4G2, TB4G2 e MA4G2

Para a purificação de scFv 4G2, TB4G2 e MA4G2 a partir de pET-scFv4G2 LHl pET-TB4G2 LH e pET-MA4G2, respectivamente, se seguiu o mesmo processo, que se descreve a seguir. O plasmídeo correspondente se transformou (Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. New York, USA: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989) na cepa de E. coli BL21 (DE3) (Studier, F. W. and B. A. Moffatt. "Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high- levei expression of cloned genes." J.Mol.Biol. 189.1 (1986): 113-30) e a partir de uma colônia isolada inoculou um cultivo de 50 ml de meio Luria-Bertani suplementado com ampicilina a 50 μg/ml (LBA) que foi aumentado 12 horas a 3O°C com uma agitação de 350 r.p.m. A partir deste cultivo inoculou 11 de meio LBA com uma densidade ótica a 620 nm (OD620) de 0.05, que foi aumentado durante 8 h a 28° C até fase exponencial tardia e depois induzido mediante a adição de isopropiltiogalactosídeo (EPTG), seguindo o crescimento nas mesmas condições durante mais 5 horas.

O cultivo induzido assim obtido foi centrifugado a 5000 x g por 30 min. a 4°C, e da biomassa resultante se extraiu a fração periplásmica mediante o método de Ausubel et ai. (Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. and Struhl, K (1989) in Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, New York). A fração periplásmica foi dialisada em tampão fosfato 50 mM PH 7/imidazol 20 mM usando uma membrana com um peso de corte de 6000 Da, e a proteína TB4G2 foi purificada da mesma mediante cromatografia de afinidade por quelatos metálicos (Sulkowski, E. (1985) Purification of proteins by IMAC. Trends Biotechnol. 3, 1-7) usando Ni-NTA agarose (Qiagen Benelux Β. V., Holanda) de acordo às instruções do fabricante.

Exemplo 12. Neutralização da infecção viral das proteínas MAG4G2 e TB4G2.

Com o objetivo de caracterizar a atividade biológica in vitro das proteínas quiméricas MA4G2 e TB4G2, e realizar sua comparação com o Mab 4G2 e seus fragmentos Fab, Fab2 e scFv4G2, realizou-se um ensaio de neutralização por redução de número de placas em células BHK-21 (tabela 10). Os fragmentos Fab e Fab2 do Mab 4G2 foram obtidos mediante digestão com papaína e pepsina respectivamente do anticorpo completo e purificado por cromatografia de afinidade de proteína A. As isoformas foram isoladas mediante cromatografia de intercâmbio iônico. Os títulos neutralizantes foram definidos como a maior diluição da molécula onde se obteve 50% de redução de número de placas virais. A concentração inicial das diferentes moléculas ensaiadas foi ajustada a uma concentração equimolar. Tabela 10. Ensaio de neutralização viral de MA4G2, TB4G2, Mab4G2 e seus fragmentos Fab5 Fab2 e scFv4G2.

<table>table see original document page 59</column></row><table>

* Os títulos neutralizantes foram definidos como a maior diluição da molécula onde se obteve 50% de redução do número de placas virais em células BHK- 21. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> Centro de Ingeniería Genética y Biotecnologia

<120> MÉTODOS E PROTEÍNAS PARA O TRATAMENTO PROFILÁTICO E/OU TERAPÊUTICO DE QUARTO SOROTIPOS DO VIRUS DA DENGUE E OUTROS FLAVIVÍRUS <130> <140> <141> <160> <170> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>

2.1

56

PatentIn Ver. 1

75 PRT

Seqüência Artificial

Descrição da seqüência artificial: Seqüência de polipeptideo PMECl 1

Val Thr Lys Asn His Ala Lys Lys Asp Val Val Val Gly Gly Lys Thr

1 5 10 15

Asn Thr Thr Thr Ser Arg Cys Thr Gly Ser Asn Asp Lys Arg Cys Lys

20 25 30

His Ser Met Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Gly Lys Gly

35 40 45

Gly Val Thr Cys Ala Met Thr 50 55

<210> 2

1485 DNA

Virus da dengue tipo 2

<211> <212> <213> <220> <221> <222> <223>

gene

(1)..(1485)

Gene da glicoproteina E de envelope da cepa Jamaica 1409 do vírus DEN2. Este gene está contido no plasmídeo p30-VD2 <400> 2

atgcgttgca taggaatatc aaatagagac tttgtagaag gggtttcagg aggaagctgg 60 gttgacatag tcttagaaca tggaagttgt gtgacgacga tggcaaaaaa taaaccaaca 120 ttggattttg aactgataaa aacagaagcc aaacaacctg ccactctaag gaagtactgt 180 atagaagcaa agctgaccaa tacaacaaca gaatctcgtt gcccaacaca aggggaaccc 240 agtctaaatg aagagcagga caaaaggttc ctctgcaaac actccatggt agacagagga 300 tggggaaatg gatgtggatt atttggaaag ggaggcattg tgacctgtgc tatgtttaca 360 tgcaaaaaga acatggaagg aaaagtcgtg ctgccagaaa atttggaata caccatcgtg 420 ataacacctc actcaggaga agagcacgct gtaggtaatg acacaggaaa acatggcaag 480 gaaatcaaaa taacaccaca gagttccatc acagaagcag aactgacagg ctatggcact 540 gtcacgatgg agtgctctcc gagaacgggc ctcgacttca atgagatggt gctgctgcag 600 atggaagaca aagcttggct ggtgcacagg caatggttcc tagacctgcc gttaccatgg 660 ctacccggag cggacacaca aggatcaaat tggatacaga aagagacatt ggtcactttc 720 aaaaatcccc acgcgaagaa acaagatgtc gttgttttag gatctcaaga aggggccatg 780 cacacggcac tcacaggggc cacagaaatc cagatgtcat caggaaactt actgttcaca 840 ggacatctca agtgcaggct gagaatggac aaactacagc tcaaaggaat gtcatactct 900 atgtgtacag gaaagtttaa aattgtgaag gaaatagcag aaacacaaca tggaacaata 960 gttatcagag tacaatatga aggggacggc tctccatgta agatcccttt tgagataatg 1020 gatttggaaa aaagacacgt cttaggtcgc ctgattacag ttaacccgat cgtaacagaa 1080 aaagatagcc cagtcaacat agaagcagaa cctccattcg gagacagcta catcatcata 1140 ggagtagagc cgggacaatt gaaactcaac tggtttaaga aaggaagttc catcggccaa 1200 atgtttgaga caacaatgag aggagcgaag agaatggcca ttttaggtga cacagcctgg 1260 gattttggat ccctgggagg agtgtttaca tctataggaa aggctctcca ccaagttttc 1320 ggagcaatct atggggctgc ttttagtggg gtctcatgga ctatgaaaat cctcatagga 1380 gtcatcatca catggatagg aatgaattca cgtagcacct cactgtctgt gtcactagta 1440 ttggtgggag tcgtgacact gtacctggga gctatggtgc aggct 1485

<210> 3 <211> 495 <212> PRT

<213> Vírus da dengue tipo 2 <220>

<223> Polipeptideo. Glicoproteina E de envelope vírus DEN2 cepa Jamaica 1409 tradução do gene E do plasmídeo p30-VD2 <400> 3

Met Arg Cys Ile Gly Ile Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Val Ser 15 10 15

Gly Gly Ser Trp Val Asp Ile Val Leu Glu His Gly Ser Cys Val Thr 20 25 30 Thr Met Ala Lys Asn Lys Pro Thr Leu Asp Phe Glu Leu Ile Lys Thr 35 40 45 Glu Ala Lys Gln Pro Ala Thr Leu Arg Lys Tyr Cys Ile Glu Ala Lys 50 55 60 Leu Thr Asn Thr Thr Thr Glu Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Pro 65 70 75 80 Ser Leu Asn Glu Glu Gln Asp Lys Arg Phe Leu Cys Lys His Ser Met 85 90 95 Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Gly 100 105 110 Ile Val Thr Cys Ala Met Phe Thr Cys Lys Lys Asn Met Glu Gly Lys 115 120 125 Val Val Leu Pro Glu Asn Leu Glu Tyr Thr Ile Val Ile Thr Pro His 130 135 140 Ser Gly Glu Glu His Ala Val Gly Asn Asp Thr Gly Lys His Gly Lys 145 150 155 160 Glu Ile Lys Ile Thr Pro Gln Ser Ser Ile Thr Glu Ala Glu Leu Thr 165 170 175 Gly Tyr Gly Thr Val Thr Met Glu Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp 180 185 190 Phe Asn Glu Met Val Leu Leu Gln Met Glu Asp Lys Ala Trp Leu Val 195 200 205 His Arg Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu Pro Trp Leu Pro Gly Ala 210 215 220 Asp Thr Gln Gly Ser Asn Trp Ile Gln Lys Glu Thr Leu Val Thr Phe 225 230 235 240 Lys Asn Pro His Ala Lys Lys Gln Asp Val Val Val Leu Gly Ser Gln 245 250 255 Glu Gly Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu Ile Gln Met 260 265 270 Ser Ser Gly Asn Leu Leu Phe Thr Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Arg 275 280 285 Met Asp Lys Leu Gln Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly 290 295 300 Lys Phe Lys Ile Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile 305 310 315 320 Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro 325 330 335 Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys Arg His Val Leu Gly Arg Leu Ile 340 345 350 Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile Glu 355 360 365 Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Ile Ile Gly Val Glu Pro 370 375 380 Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Gln 385 390 395 400 Met Phe Glu Thr Thr Met Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala Ile Leu Gly 405 410 415 Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Leu Gly Gly Val Phe Thr Ser Ile 420 425 430 Gly Lys Ala Leu His Gln Val Phe Gly Ala Ile Tyr Gly Ala Ala Phe 435 440 445 Ser Gly Val Ser Trp Thr Met Lys Ile Leu Ile Gly Val Ile Ile Thr 450 455 4 60 Trp Ile Gly Met Asn Ser Arg Ser Thr Ser Leu Ser Val Ser Leu Val 465 470 475 480

Leu Val Gly Val Val Thr Leu Tyr Leu Gly Ala Met Val Gln Ala 485 490 495

<210> 4 <211> 242 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: Codifica a proteína PMEC1, contém sítios de restrição para clonagem en vetores de DNA, contém uma mutação silenciosa destruindo o sítio Nco I interno <220> <223> DNA de filamento duplo sintético <400> 4

ccatggcatt ggtcactttc aaaaatcccc acgcgaagaa acaagatgtc gttgttggag 60 gtggaaagct gaccaataca acaacagaat ctcgttgccc aacacaaggg gaacccagtc 120 taaatgaaga gcaggacaaa aggttcctct gcaaacactc tatggtagac agaggatggg 180 gaaatggatg tggattattt ggaaagggag gcattgtgac ctgtgctatg tttacactcg 240 ag 242

<210> 5 <211> 7 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: Contém um sitio de restrição Nco I, um códon ATG codificando o sítio de restrição Nco I de metionina, um códon ATG codificando metionina e um códon GCA para alanina <220>

<223> Fragmento de oligonucleotideo <400> 5

catggca 7

<210> 6 <211> 48 <212> DNA

<213> Vírus da dengue tipo 2 <220>

<223> Fragmento de oligonucleotideo <220>

<223> Contém a seqüência 709-756 do gene codificando a proteína E vírus DEN2 cepa Jamaica 14 09 <400> 6

ttggtcactt tcaaaaatcc ccacgcgaag aaacaagatg tcgttgtt 48

<210> 7 <211> 16 <212> PRT

<213> Vírus da dengue tipo 2 <22 0>

<223> Fragmento de peptídeo. Corresponde ao fragmento 237-252 da proteína E vírus DEN2 cepa Jamaica 1409 <400> 7

Leu Val Thr Phe Lys Asn Pro His Ala Lys Lys Gln Asp Val Val Val

1 5 10 15

<210> 8 <211> 9 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: Contém 3 códons codificando 3 glicinas consecutivas <220>

<223> Fragmento.de oligonucleotideo <400> 8

ggaggtgga 9

<210> 9 <211> 57 <212> PRT

<213> Vírus da dengue tipo 2 <220>

<223> Fragmento de peptídeo. Corresponde ao fragmento 64-120 da proteína E vírus DEN2 cepa Jamaica 14 09 <400> 9

Lys Leu Thr Asn Thr Thr Thr Glu Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu 1 5 10 15 Pro Ser Leu Asn 20 Glu Glu Gln Asp Lys 25 Arg Phe Leu Cys Lys 30 His Ser Met Val Asp 35 Arg Gly Trp Gly Asn 40 Gly Cys Gly Leu Phe 45 Gly Lys Gly Gly Ile Val Thr Cys Ala Met Phe Thr

50 55

<210> 10 <211> 171 <212> DNA <213> Vírus da dengue tipo 2 <220>

<223> Fragmento de oligonucleotídeo. Contém a seqüência 190-360 do gene codificando a proteína E do vírus DEN2 da cepa Jamaica 1409. <400> 10

aagctgacca atacaacaac agaatctcgt tgcccaacac aaggggaacc cagtctaaat 60 gaagagcagg acaaaaggtt cctctgcaaa cactccatgg tagacagagg atggggaaat 120 ggatgtggat tatttggaaa gggaggcatt gtgacctgtg ctatgtttac a 171

<210> 11 <211> 6 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial:Contém um sítio de restrição Xho I que contém um códon CTC codificando leucina e um códon GAG codificando um ácido glutâmico <220>

<223> Fragmento de oligonucleotídeo. <4 00> 11

ctcgag 6

<210> 12 <211> 5664 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial :Codifica a expressão da proteína sPMECl-His6 sob o promotor T7 <220>

<223> Plasmideo. <4 00> 12

taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa ttcccctcta gaaataattt 60 tgtttaactt taagaaggag atatacatat gaaatacctg ctgccgaccg ctgctgctgg 120 tctgctgctc ctcgctgccc agccggcgat ggccatggca ttggtcactt tcaaaaatcc 180 ccacgcgaag aaacaagatg tcgttgttgg aggtaagctg accaatacaa caacagaatc 240 tcgttgccca acacaagggg aacccagtct aaatgaagag caggacaaaa ggttcctctg 300 caaacactct atggtagaca gaggatgggg aaatggatgt ggattatttg gaaagggagg 360 cattgtgacc tgtgctatgt ttacactcga gcaccaccac caccaccact gagatccggc 420 tgctaacaaa gcccgaaagg aagctgagtt ggctgctgcc accgctgagc aataactagc 480 ataacccctt ggggcctcta aacgggtctt gaggggtttt ttgctgaaag gaggaactat 540 atccggattg gcgaatggga cgcgccctgt agcggcgcat taagcgcggc gggtgtggtg 600 gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag cgcccgctcc tttcgctttc 660 ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtc aagctctaaa tcgggggctc 720 cctttagggt tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc ccaaaaaact tgattagggt 780 gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga tagacggttt ttcgcccttt gacgttggag 840 tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc caaactggaa caacactcaa ccctatctcg 900 gtctattctt ttgatttata agggattttg ccgatttcgg cctattggtt aaaaaatgag 960 ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaatttt aacaaaatat taacgtttac aatttcaggt 1020 ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca 1080 aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg 1140 aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc 1200 cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg 1260 ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt 1320 cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta 1380 ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat 1440 gacttggttg agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga 1500 gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca 1560 acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact 1620 cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc 1680 acgatgcctg cagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact 1740 ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt 1800 ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt 1860 gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt 1920 atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata 1980 ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag 2040 attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat 2100 ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa 2160 aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca 2220 aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt 2280 ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg 2340 tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc 2400 ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga 2460 cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc 2520 agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc 2580 gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca 2 640 ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg 2700 tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta 2760 tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct 2820 cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag 2880 tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa 2940 gcggaagagc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc 3000 atatatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagtatacac 3060 tccgctatcg ctacgtgact gggtcatggc tgcgccccga cacccgccaa cacccgctga 3120 cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc 3180 cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga ggcagctgcg 3240 gtaaagctca tcagcgtggt cgtgaagcga ttcacagatg tctgcctgtt catccgcgtc 3300 cagctcgttg agtttctcca gaagcgttaa tgtctggctt ctgataaagc gggccatgtt 3360 aagggcggtt ttttcctgtt tggtcactga tgcctccgtg taagggggat ttctgttcat 3420 gggggtaatg ataccgatga aacgagagag gatgctcacg atacgggtta ctgatgatga 3480 acatgcccgg ttactggaac gttgtgaggg taaacaactg gcggtatgga tgcggcggga 3540 ccagagaaaa atcactcagg gtcaatgcca gcgcttcgtt aatacagatg taggtgttcc 3600 acagggtagc cagcagcatc ctgcgatgca gatccggaac ataatggtgc agggcgctga 3660 cttccgcgtt tccagacttt acgaaacacg gaaaccgaag accattcatg ttgttgctca 3720 ggtcgcagac gttttgcagc agcagtcgct tcacgttcgc tcgcgtatcg gtgattcatt 3780 ctgctaacca gtaaggcaac cccgccagcc tagccgggtc ctcaacgaca ggagcacgat 3840 catgcgcacc cgtggggccg ccatgccggc gataatggcc tgcttctcgc cgaaacgttt 3900 ggtggcggga ccagtgacga aggcttgagc gagggcgtgc aagattccga ataccgcaag 3960 cgacaggccg atcatcgtcg cgctccagcg aaagcggtcc tcgccgaaaa tgacccagag 4020 cgctgccggc acctgtccta cgagttgcat gataaagaag acagtcataa gtgcggcgac 4080 gatagtcatg ccccgcgccc accggaagga gctgactggg ttgaaggctc tcaagggcat 4140 cggtcgagat cccggtgcct aatgagtgag ctaacttaca ttaattgcgt tgcgctcact 4200 gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc 4260 ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgcca gggtggtttt tcttttcacc agtgagacgg 4320 gcaacagctg attgcccttc accgcctggc cctgagagag ttgcagcaag cggtccacgc 4380 tggtttgccc cagcaggcga aaatcctgtt tgatggtggt taacggcggg atataacatg 4440 agctgtcttc ggtatcgtcg tatcccacta ccgagatatc cgcaccaacg cgcagcccgg 4500 actcggtaat ggcgcgcatt gcgcccagcg ccatctgatc gttggcaacc agcatcgcag 4560 tgggaacgat gccctcattc agcatttgca tggtttgttg aaaaccggac atggcactcc 4 620 agtcgccttc ccgttccgct atcggctgaa tttgattgcg agtgagatat ttatgccagc 4680 cagccagacg cagacgcgcc gagacagaac ttaatgggcc cgctaacagc gcgatttgct 4740 ggtgacccaa tgcgaccaga tgctccacgc ccagtcgcgt accgtcttca tgggagaaaa 4800 taatactgtt gatgggtgtc tggtcagaga catcaagaaa taacgccgga acattagtgc 4860 aggcagcttc cacagcaatg gcatcctggt catccagcgg atagttaatg atcagcccac 4920 tgacgcgttg cgcgagaaga ttgtgcaccg ccgctttaca ggcttcgacg ccgcttcgtt 4980 ctaccatcga caccaccacg ctggcaccca gttgatcggc gcgagattta atcgccgcga 5040 caatttgcga cggcgcgtgc agggccagac tggaggtggc aacgccaatc agcaacgact 5100· gtttgcccgc cagttgttgt gccacgcggt tgggaatgta attcagctcc gccatcgccg 5160 cttccacttt ttcccgcgtt ttcgcagaaa cgtggctggc ctggttcacc acgcgggaaa 5220 cggtctgata agagacaccg gcatactctg cgacatcgta taacgttact ggtttcacat 5280 tcaccaccct gaattgactc tcttccgggc gctatcatgc cataccgcga aaggttttgc 5340 gccattcgat ggtgtccggg atctcgacgc tctcccttat gcgactcctg cattaggaag 5400 cagcccagta gtaggttgag gccgttgagc accgccgccg caaggaatgg tgcatgcaag 54 60 gagatggcgc ccaacagtcc cccggccacg gggcctgcca ccatacccac gccgaaacaa 5520 gcgctcatga gcccgaagtg gcgagcccga tcttccccat cggtgatgtc ggcgatatag 5580 gcgccagcaa ccgcacctgt ggcgccggtg atgccggcca cgatgcgtcc ggcgtagagg 5640 atcgagatct cgatcccgcg aaat 5664

<210> 13 <211> 108 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: Proteína imatura sPMEC1-His6 do plasmídeo pET-PMEC1, antes da secreção no periplasma <220>

<223> Proteína. <400> 13

Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Ala Leu Val Thr Phe Lys Asn Pro His

20 25 30

Ala Lys Lys Gln Asp Val Val Val Gly Gly Gly Lys Leu Thr Asn Thr 35 40 45 Thr Thr 50 Glu Ser Arg Cys Pro 55 Thr Gln Gly Glu Pro 60 Ser Leu Asn Glu Glu Gln Asp Lys Arg Phe Leu Cys Lys His Ser Met Val Asp Arg Gly 65 70 75 80 Trp Gly Asn Gly Cys 85 Gly Leu Phe Gly Lys 90 Gly Gly Ile Val Thr 95 Cys Ala Met Phe Thr 100 Leu Glu His His His 105 His His His

<210> 14 <211> 83 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial :Esta é uma proteína madura codificada pelo pET-PMECl, após secretada no periplasma o peptideo de sinal é removido <220>

<223> Proteína. <4 00> 14

Leu Val Thr Phe Lys Asn Pro

1 5

Gly Gly Lys Leu Thr Asn Thr 20

Gly Glu Pro Ser Leu Asn Glu 35

His Ser Met Val Asp Arg Gly 50 55

Lys Gly Gly Ile Val Thr Cys

65 70

His His His

<210> 15 <211> 734 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial : Contém um gene codificando um fragmento de anticorpo de cadeia única exibindo as regiões variáveis de mAb 4G2 <220>

<223> DNA sintético de filamento duplo. <4 00> 15

ccatggcaaa cattgtgatg acccaatctc ccaaatccat gggtcacctt gacctgcaag gccagtgaga atgtggttac agaaaccaga gcagtctcct aaactgctga tatacggggc tccccgatcg cttcacaggc agtggatctg caacagattt tgcaggctga agaccttgca gattatcact gtggacaggg tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaag agggtaaatc ccaaagtcga cgaggtccag ctgcaacaat ctggacctga cagtgaagat atcctgcaag acttctggat acacattcac tgaagcagag ccacggaaag agccttgcgt ggattggagg gtactaacta cagcccgaac ttcaagggca aggccacatt gcacagccta catggacctc cgcagcctgt catctgagga caaggatcta tcattacgac ggatacttcg atgtctgggg tctcctcact cgag <210> 16 <211> 905 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial :Contém um gene codificando uma proteína exibindo as regiões variáveis de mAb 4G2 e um domínio trimérico de matrilina <220>

<223> Polinucleótido sintético. <4 00> 16

ccatggcaaa cattgtgatg acccaatctc ccaaatccat gtccatgtca gtaggagaga 60 gggtcacctt gacctgcaag gccagtgaga atgtggttac ttatgtttcc tggtatcaac 120 agaaaccaga gcagtctcct aaactgctga tatacggggc atccaaccgg tacactgggg 180 tccccgatcg cttcacaggc agtggatctg caacagattt cactctgacc atcagcagtg 240 tgcaggctga agaccttgca gattatcact gtggacaggg ttacagctat ccgtacacgt 300 tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaag agggtaaatc ctcaggatca ggctccgaat 360

His Ala Lys Lys Gln Asp Val Val Val

10 15

Thr Thr Glu Ser Arg Cys Pro Thr Gln

25 30

Glu Gln Asp Lys Arg Phe Leu Cys Lys

40 45

Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly 60

Ala Met Phe Thr Leu Glu His His His 75 80

gtccatgtca gtaggagaga 60 ttatgtttcc tggtatcaac 120 atccaaccgg tacactgggg 180 cactctgacc atcagcagtg 240 ttacagctat ccgtacacgt 300 ctcaggatca ggctccgaat 360 gctggtgaag cctgggactt 420 tgaatatacc atacactggg 480 tattgatcct aacagtggtg 540 gactgttgac aagtcctcca 600 ttctgcagtc tacttctgtg 660 cgcagggacc gccgtcaccg 720

734 ccaaagtcga cgaggtccag ctgcaacaat ctggacctga gctggtgaag cctgggactt 420 cagtgaagat atcctgcaag acttctggat acacattcac tgaatatacc atacactggg 480 tgaagcagag ccacggaaag agccttgcgt ggattggagg tattgatcct aacagtggtg 540 gtactaacta cagcccgaac ttcaagggca aggccacatt gactgttgac aagtcctcca 600 gcacagccta catggacctc cgcagcctgt catctgagga ttctgcagtc tacttctgtg 660 caaggatcta tcattacgac ggatacttcg atgtctgggg cgcagggacc gccgtcaccg 720 tctcctcagg tggtggttcc ggtggtggtt ccggtggtgg ttccggtggt ggtgaagacc 780 cgtgcgcttg cgaatccctg gttaaattcc aggctaaagt tgaaggtctg ctgcaggctc 840 tgacccgtaa actggaagct gtttccaaac gtctggctat cctggaaaac accgttgttc 900 tcgag 905

<210> 17 <211> 1439 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial : Contém um gene codificando a síntese de um mini-anticorpo de cadeia única exibindo as regiões variáveis de mAb 4G2 <220>

<223> DNA sintético de filamento duplo. <400> 17

ccatggcaaa cattgtgatg acccaatctc ccaaatccat gtccatgtca gtaggagaga 60 gggtcacctt gacctgcaag gccagtgaga atgtggttac ttatgtttcc tggtatcaac 120 agaaaccaga gcagtctcct aaactgctga tatacggggc atccaaccgg tacactgggg 180 tccccgatcg cttcacaggc agtggatctg caacagattt cactctgacc atcagcagtg 240 tgcaggctga agaccttgca gattatcact gtggacaggg ttacagctat ccgtacacgt 300 tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaag agggtaaatc ctcaggatca ggctccgaat 360 ccaaagtcga cgaggtccag ctgcaacaat ctggacctga gctggtgaag cctgggactt 420 cagtgaagat atcctgcaag acttctggat acacattcac tgaatatacc atacactggg 480 tgaagcagag ccacggaaag agccttgcgt ggattggagg tattgatcct aacagtggtg 540 gtactaacta cagcccgaac ttcaagggca aggccacatt gactgttgac aagtcctcca 600 gcacagccta catggacctc cgcagcctgt catctgagga ttctgcagtc tacttctgtg 660 caaggatcta tcattacgac ggatacttcg atgtctgggg cgcagggacc gccgtcaccg 720 tctcctcagg cggtggcgag cccaaatctt ctgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc 780 cagcacctga actcctgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca 840 ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag 900 accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa 960 agccgcggga ggagcagtac cagagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc 1020 accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag 1080 cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca 1140 ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca 1200 aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca 1260 actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc 1320 tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg 1380 aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtccccgggt aaactcgag 1439 <210> 18 <211> 6159 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: Plasmídeo de expressão sob o promoter T7 correspondente a um fragmento de anticorpo de cadeia única exibindo as regiões variáveis de mAb 4G2 <220>

<223> Plasmídeo. <4 00> 18

ccatggcaaa cattgtgatg acccaatctc ccaaatccat gtccatgtca gtaggagaga 60 gggtcacctt gacctgcaag gccagtgaga atgtggttac ttatgtttcc tggtatcaac 120 agaaaccaga gcagtctcct aaactgctga tatacggggc atccaaccgg tacactgggg 180 tccccgatcg cttcacaggc agtggatctg caacagattt cactctgacc atcagcagtg 240 tgcaggctga agaccttgca gattatcact gtggacaggg ttacagctat ccgtacacgt 300 tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaag agggtaaatc ctcaggatca ggctccgaat 360 ccaaagtcga cgaggtccag ctgcaacaat ctggacctga gctggtgaag cctgggactt 420 cagtgaagat atcctgcaag acttctggat acacattcac tgaatatacc atacactggg 480 tgaagcagag ccacggaaag agccttgcgt ggattggagg tattgatcct aacagtggtg 540 gtactaacta cagcccgaac ttcaagggca aggccacatt gactgttgac aagtcctcca 600 gcacagccta catggacctc cgcagcctgt catctgagga ttctgcagtc tacttctgtg 660 caaggatcta tcattacgac ggatacttcg atgtctgggg cgcagggacc gccgtcaccg 720 tctcctcact cgagcaccac caccaccacc actgagatcc ggctgctaac aaagcccgaa 780 aggaagctga gttggctgct gccaccgctg agcaataact agcataaccc cttggggcct 840 ctaaacgggt cttgaggggt tttttgctga aaggaggaac tatatccgga ttggcgaatg 900 ggacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc tggactcttg ttccaaactg gaacaacact ataagggatt ttgccgattt cggcctattg taacgcgaat tttaacaaaa tattaacgtt tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat tccaatgatg agcactttta aagttctgct cgggcaagag caactcggtc gccgcataca accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg accggagctg aatgaagcca taccaaacga ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg attaatagac tggatggagg cggataaagt ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct cagcagagcg cagataccaa atactgtcct caagaactct gtagcaccgc ctacatacct tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta actgggtcat ggctgcgccc cgacacccgc gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg ggtcgtgaag cgattcacag atgtctgcct ccagaagcgt taatgtctgg cttctgataa gtttggtcac tgatgcctcc gtgtaagggg tgaaacgaga gaggatgctc acgatacggg aacgttgtga gggtaaacaa ctggcggtat agggtcaatg ccagcgcttc gttaatacag atcctgcgat gcagatccgg aacataatgg tttacgaaac acggaaaccg aagaccattc agcagcagtc gcttcacgtt cgctcgcgta aaccccgcca gcctagccgg gtcctcaacg ccgccatgcc ggcgataatg gcctgcttct cgaaggcttg agcgagggcg tgcaagattc tcgcgctcca gcgaaagcgg tcctcgccga ctacgagttg catgataaag aagacagtca cccaccggaa ggagctgact gggttgaagg cctaatgagt gagctaactt acattaattg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa gtattgggcg ccagggtggt ttttcttttc ttcaccgcct ggccctgaga gagttgcagc cgaaaatcct gtttgatggt ggttaacggc tcgtatccca ctaccgagat atccgcacca attgcgccca gcgccatctg atcgttggca ttcagcattt gcatggtttg ttgaaaaccg gctatcggct gaatttgatt gcgagtgaga gccgagacag aacttaatgg gcccgctaac

ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac 960 tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc 1020 aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt 1080 acttgattag ggtgatggtt cacgtagtgg 1140 tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag 1200 caaccctatc tcggtctatt cttttgattt 1260 gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt 1320 tacaatttca ggtggcactt ttcggggaaa 1380 ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat 1440 atattgaaaa aggaagagta tgagtattca 1500 tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca 1560 tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta 1620 ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt 1680 atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc 1740 ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc 1800 catgacagta agagaattat gcagtgctgc 1860 cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa 1920 ggatcatgta actcgccttg atcgttggga 1980 cgagcgtgac accacgatgc ctgcagcaat 2040 cgaactactt actctagctt cccggcaaca 2100 tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc 2160 agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat 2220 ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag 2280 gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa 2340 atatatactt tagattgatt taaaacttca 2400 cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc 2460 agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc 2520 ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc 2580 accaactctt tttccgaagg taactggctt 2640 tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt 2700 cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc 2760 gttggactca agacgatagt taccggataa 2820 gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac 2880 gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg 2940 cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga 3000 tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact 3060 ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa 3120 ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc 3180 taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg 3240 agtgagcgag gaagcggaag agcgcctgat 3300 tatttcacac cgcatatatg gtgcactctc 3360 agccagtata cactccgcta tcgctacgtg 3420 caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt 3480 ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc 3540 cgaggcagct gcggtaaagc tcatcagcgt 3600 gttcatccgc gtccagctcg ttgagtttct 3660 agcgggccat gttaagggcg gttttttcct 3720 gatttctgtt catgggggta atgataccga 3780 ttactgatga tgaacatgcc cggttactgg 3840 ggatgcggcg ggaccagaga aaaatcactc 3900 atgtaggtgt tccacagggt agccagcagc 3960 tgcagggcgc tgacttccgc gtttccagac 4020 atgttgttgc tcaggtcgca gacgttttgc 4080 tcggtgattc attctgctaa ccagtaaggc 4140 acaggagcac gatcatgcgc acccgtgggg 4200 cgccgaaacg tttggtggcg ggaccagtga 4260 cgaataccgc aagcgacagg ccgatcatcg 4320 aaatgaccca gagcgctgcc ggcacctgtc 4380 taagtgcggc gacgatagtc atgccccgcg 4440 ctctcaaggg catcggtcga gatcccggtg 4500 cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg 4560 tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc 4620 accagtgaga cgggcaacag ctgattgccc 4680 aagcggtcca cgctggtttg ccccagcagg 4740 gggatataac atgagctgtc ttcggtatcg 4800 acgcgcagcc cggactcggt aatggcgcgc 4860 accagcatcg cagtgggaac gatgccctca 4920 gacatggcac tccagtcgcc ttcccgttcc 4980 tatttatgcc agccagccag acgcagacgc 5040 agcgcgattt gctggtgacc caatgcgacc 5100 agatgctcca cgcccagtcg cgtaccgtct tcatgggaga aaataatact gttgatgggt 5160 gtctggtcag agacatcaag aaataacgcc ggaacattag tgcaggcagc ttccacagca 5220 atggcatcct ggtcatccag cggatagtta atgatcagcc cactgacgcg ttgcgcgaga 5280 agattgtgca ccgccgcttt acaggcttcg acgccgcttc gttctaccat cgacaccacc 5340 acgctggcac ccagttgatc ggcgcgagat ttaatcgccg cgacaatttg cgacggcgcg 5400 tgcagggcca gactggaggt ggcaacgcca atcagcaacg actgtttgcc cgccagttgt 54 60 tgtgccacgc ggttgggaat gtaattcagc tccgccatcg ccgcttccac tttttcccgc 5520 gttttcgcag aaacgtggct ggcctggttc accacgcggg aaacggtctg ataagagaca 5580 ccggcatact ctgcgacatc gtataacgtt actggtttca cattcaccac cctgaattga 5640 ctctcttccg ggcgctatca tgccataccg cgaaaggttt tgcgccattc gatggtgtcc 5700 gggatctcga cgctctccct tatgcgactc ctgcattagg aagcagccca gtagtaggtt 57 60 gaggccgttg agcaccgccg ccgcaaggaa tggtgcatgc aaggagatgg cgcccaacag 5820 tcccccggcc acggggcctg ccaccatacc cacgccgaaa caagcgctca tgagcccgaa 5880 gtggcgagcc cgatcttccc catcggtgat gtcggcgata taggcgccag caaccgcacc 5940 tgtggcgccg gtgatgccgg ccacgatgcg tccggcgtag aggatcgaga tctcgatccc 6000 gcgaaattaa tacgactcac tataggggaa ttgtgagcgg ataacaattc ccctctagaa 6060 ataattttgt ttaactttaa gaaggagata tacatatgaa atacctgctg ccgaccgctg 6120 ctgctggtct gctgctcctc gctgcccagc cggcgatgg 6159

<210> 19 <211> 6330 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial :Plasmideo de expressão sob o promotor T7 correspondendo a uma proteína exibindo as regiões variáveis de mAb 4G2 e um domínio trimérico de matrilina <220>

<223> Plasmídeo. <400> 19

ccatggcaaa cattgtgatg acccaatctc ccaaatccat gtccatgtca gtaggagaga 60 gggtcacctt gacctgcaag gccagtgaga atgtggttac ttatgtttcc tggtatcaac 120 agaaaccaga gcagtctcct aaactgctga tatacggggc atccaaccgg tacactgggg 180 tccccgatcg cttcacaggc agtggatctg caacagattt cactctgacc atcagcagtg 240 tgcaggctga agaccttgca gattatcact gtggacaggg ttacagctat ccgtacacgt 300 tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaag agggtaaatc ctcaggatca ggctccgaat 360 ccaaagtcga cgaggtccag ctgcaacaat ctggacctga gctggtgaag cctgggactt 420 cagtgaagat atcctgcaag acttctggat acacattcac tgaatatacc atacactggg 480 tgaagcagag ccacggaaag agccttgcgt ggattggagg tattgatcct aacagtggtg 540 gtactaacta cagcccgaac ttcaagggca aggccacatt gactgttgac aagtcctcca 600 gcacagccta catggacctc cgcagcctgt catctgagga ttctgcagtc tacttctgtg 660 caaggatcta tcattacgac ggatacttcg atgtctgggg cgcagggacc gccgtcaccg 720 tctcctcagg tggtggttcc ggtggtggtt ccggtggtgg ttccggtggt ggtgaagacc 780 cgtgcgcttg cgaatccctg gttaaattcc aggctaaagt tgaaggtctg ctgcaggctc 840 tgacccgtaa actggaagct gtttccaaac gtctggctat cctggaaaac accgttgttc 900 tcgagcacca ccaccaccac cactgagatc cggctgctaa caaagcccga aaggaagctg 960 agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc tctaaacggg 1020 tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg·attggcgaat gggacgcgcc 1080 ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact 1140 tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc 1200 cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt 1260 acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc 1320 ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt 1380 gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt tataagggat 1440 tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa 1500 ttttaacaaa atattaacgt ttacaatttc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg 1560 aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata 1620 accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg 1680 tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac 1740 gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact 1800 ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat 1860 gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga 1920 gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac 1980 agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat 2040 gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac 2100 cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct 2160 gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgcagcaa tggcaacaac 2220 gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga 2280 ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg 2340 gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact 2400 ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac 24 60 tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga actgtcagac caagtttact catatatact taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca actgagatac ctacagcgtg agctatgaga ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca tgctctgatg ccgcatagtt aagccagtat tggctgcgcc ccgacacccg ccaacacccg cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg caccgtcatc accgaaacgc gcgaggcagc gcgattcaca gatgtctgcc tgttcatccg ttaatgtctg gcttctgata aagcgggcca ctgatgcctc cgtgtaaggg ggatttctgt agaggatgct cacgatacgg gttactgatg agggtaaaca actggcggta tggatgcggc gccagcgctt cgttaataca gatgtaggtg tgcagatccg gaacataatg gtgcagggcg cacggaaacc gaagaccatt catgttgttg cgcttcacgt tcgctcgcgt atcggtgatt agcctagccg ggtcctcaac gacaggagca cggcgataat ggcctgcttc tcgccgaaac gagcgagggc gtgcaagatt ccgaataccg agcgaaagcg gtcctcgccg aaaatgaccc gcatgataaa gaagacagtc ataagtgcgg aggagctgac tgggttgaag gctctcaagg tgagctaact tacattaatt gcgttgcgct cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gccagggtgg tttttctttt caccagtgag tggccctgag agagttgcag caagcggtcc tgtttgatgg tggttaacgg cgggatataa actaccgaga tatccgcacc aacgcgcagc agcgccatct gatcgttggc aaccagcatc tgcatggttt gttgaaaacc ggacatggca tgaatttgat tgcgagtgag atatttatgc gaacttaatg ggcccgctaa cagcgcgatt acgcccagtc gcgtaccgtc ttcatgggag gagacatcaa gaaataacgc cggaacatta tggtcatcca gcggatagtt aatgatcagc accgccgctt tacaggcttc gacgccgctt cccagttgat cggcgcgaga tttaatcgcc agactggagg tggcaacgcc aatcagcaac cggttgggaa tgtaattcag ctccgccatc gaaacgtggc tggcctggtt caccacgcgg tctgcgacat cgtataacgt tactggtttc gggcgctatc atgccatacc gcgaaaggtt acgctctccc ttatgcgact cctgcattag gagcaccgcc gccgcaagga atggtgcatg cacggggcct gccaccatac ccacgccgaa ccgatcttcc ccatcggtga tgtcggcgat ggtgatgccg gccacgatgc gtccggcgta atacgactca ctatagggga attgtgagcg tttaacttta agaaggagat atacatatga tgctgctcct cgctgcccag ccggcgatgg <210> 20 <211> 6864 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

gataggtgcc tcactgatta agcattggta 2520 ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt 2580 taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga 2640 agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc 2700 aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt 2760 ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc 2820 gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc 2880 aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg 2940 aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg 3000 gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga 3060 aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc 3120 aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg 3180 cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg 3240 cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt 3300 tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc 3360 tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg 3420 ggaagcggaa gagcgcctga tgcggtattt 3480 ccgcatatat ggtgcactct cagtacaatc 3540 acactccgct atcgctacgt gactgggtca 3600 ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc 3660 tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt 3720 tgcggtaaag ctcatcagcg tggtcgtgaa 3780 cgtccagctc gttgagtttc tccagaagcg 3840 tgttaagggc ggttttttcc tgtttggtca 3900 tcatgggggt aatgataccg atgaaacgag 3960 atgaacatgc ccggttactg gaacgttgtg 4020 gggaccagag aaaaatcact cagggtcaat 4080 ttccacaggg tagccagcag catcctgcga 4140 ctgacttccg cgtttccaga ctttacgaaa 4200 ctcaggtcgc agacgttttg cagcagcagt 42 60 cattctgcta accagtaagg caaccccgcc 4320 cgatcatgcg cacccgtggg gccgccatgc 4380 gtttggtggc gggaccagtg acgaaggctt 4440 caagcgacag gccgatcatc gtcgcgctcc 4500 agagcgctgc cggcacctgt cctacgagtt 4560 cgacgatagt catgccccgc gcccaccgga 4620 gcatcggtcg agatcccggt gcctaatgag 4680 cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt 4740 gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc 4 800 acgggcaaca gctgattgcc cttcaccgcc 4860 acgctggttt gccccagcag gcgaaaatcc 4 920 catgagctgt cttcggtatc gtcgtatccc 4 980 ccggactcgg taatggcgcg cattgcgccc 5040 gcagtgggaa cgatgccctc attcagcatt 5100 ctccagtcgc cttcccgttc cgctatcggc 5160 cagccagcca gacgcagacg cgccgagaca 5220 tgctggtgac ccaatgcgac cagatgctcc 5280 aaaataatac tgttgatggg tgtctggtca 5340 gtgcaggcag cttccacagc aatggcatcc 5400 ccactgacgc gttgcgcgag aagattgtgc 54 60 cgttctacca tcgacaccac cacgctggca 5520 gcgacaattt gcgacggcgc gtgcagggcc 5580 gactgtttgc ccgccagttg ttgtgccacg 5640 gccgcttcca ctttttcccg cgttttcgca 5700 gaaacggtct gataagagac accggcatac 5760 acattcacca ccctgaattg actctcttcc 5820 ttgcgccatt cgatggtgtc cgggatctcg 5880 gaagcagccc agtagtaggt tgaggccgtt 5940 caaggagatg gcgcccaaca gtcccccggc 6000 acaagcgctc atgagcccga agtggcgagc 6060 ataggcgcca gcaaccgcac ctgtggcgcc 6120 gaggatcgag atctcgatcc cgcgaaatta 6180 gataacaatt cccctctaga aataattttg 6240 aatacctgct gccgaccgct gctgctggtc 6300

6330 <223> Descrição da seqüência artificial : Plasmideo de expressão sob o promotor T7 correspondendo a um fragmento de anticorpo de cadeia única exibindo as regiões variáveis de mAb 4G2 <220>

<223> Plasmideo. <400> 20

catggcaaac attgtgatga cccaatctcc caaatccatg tccatgtcag taggagagag 60 ggtcaccttg acctgcaagg ccagtgagaa tgtggttact tatgtttcct ggtatcaaca 120 gaaaccagag cagtctccta aactgctgat atacggggca tccaaccggt acactggggt 180 ccccgatcgc ttcacaggca gtggatctgc aacagatttc actctgacca tcagcagtgt 240 gcaggctgaa gaccttgcag attatcactg tggacagggt tacagctatc cgtacacgtt 300 cggagggggg accaagctgg aaataaaaga gggtaaatcc tcaggatcag gctccgaatc 360 caaagtcgac gaggtccagc tgcaacaatc tggacctgag ctggtgaagc ctgggacttc 420 agtgaagata tcctgcaaga cttctggata cacattcact gaatatacca tacactgggt 480 gaagcagagc cacggaaaga gccttgcgtg gattggaggt attgatccta acagtggtgg 540 tactaactac agcccgaact tcaagggcaa ggccacattg actgttgaca agtcctccag 600 cacagcctac atggacctcc gcagcctgtc atctgaggat tctgcagtct acttctgtgc 660 aaggatctat cattacgacg gatacttcga tgtctggggc gcagggaccg ccgtcaccgt 720 ctcctcaggc ggtggcgagc ccaaatcttc tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc 780 agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac 840 cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga 900 ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa 960 gccgcgggag gagcagtacc agagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca 1020 ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc 1080 ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac 1140 cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa 1200 aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa 1260 ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct atagcaagct 1320 caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga 1380 ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tccccgggta aactcgagca 1440 ccaccaccac caccactgag atccggctgc taacaaagcc cgaaaggaag ctgagttggc 1500 tgctgccacc gctgagcaat aactagcata accccttggg gcctctaaac gggtcttgag 1560 gggttttttg ctgaaaggag gaactatatc cggattggcg aatgggacgc gccctgtagc 1620 ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc 1680 gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt 1740 ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac 1800 ctcgacccca aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag 1860 acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa 1920 actggaacaa cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg atttataagg gattttgccg 1980 atttcggcct attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac 2040 aaaatattaa cgtttacaat ttcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct 2100 atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga 2160 taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc 2220 cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg 2280 aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc 2340 aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact 2400 tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc 2460 ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag 2520 catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat 2580 aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt 2640 ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa 2700 gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgcag caatggcaac aacgttgcgc 2760 aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg 2820 gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt 2880 gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca 2940 gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat 3000 gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca 3060 gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg 3120 atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg 3180 ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt 3240 ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg 3300 ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata 3360 ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca 3420 ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag 3480 tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc 3540 tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga 3600 tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg 3660 tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac 3720 gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg 3780 tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg 3840 ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct 3900 gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc 3960 gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc tgatgcggta ttttctcctt 4020 acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg 4080 atgccgcata gttaagccag tatacactcc gctatcgcta cgtgactggg tcatggctgc 4140 gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc 4200 cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc 4260 atcaccgaaa cgcgcgaggc agctgcggta aagctcatca gcgtggtcgt gaagcgattc 4320 acagatgtct gcctgttcat ccgcgtccag ctcgttgagt ttctccagaa gcgttaatgt 4380 ctggcttctg ataaagcggg ccatgttaag ggcggttttt tcctgtttgg tcactgatgc 4440 ctccgtgtaa gggggatttc tgttcatggg ggtaatgata ccgatgaaac gagagaggat 4500 gctcacgata cgggttactg atgatgaaca tgcccggtta ctggaacgtt gtgagggtaa 4560 acaactggcg gtatggatgc ggcgggacca gagaaaaatc actcagggtc aatgccagcg 4 620 cttcgttaat acagatgtag gtgttccaca gggtagccag cagcatcctg cgatgcagat 4 680 ccggaacata atggtgcagg gcgctgactt ccgcgtttcc agactttacg aaacacggaa 4740 accgaagacc attcatgttg ttgctcaggt cgcagacgtt ttgcagcagc agtcgcttca 4800 cgttcgctcg cgtatcggtg attcattctg ctaaccagta aggcaacccc gccagcctag 4860 ccgggtcctc aacgacagga gcacgatcat gcgcacccgt ggggccgcca tgccggcgat 4 920 aatggcctgc ttctcgccga aacgtttggt ggcgggacca gtgacgaagg cttgagcgag 4 980 ggcgtgcaag attccgaata ccgcaagcga caggccgatc atcgtcgcgc tccagcgaaa 5040 gcggtcctcg ccgaaaatga cccagagcgc tgccggcacc tgtcctacga gttgcatgat 5100 aaagaagaca gtcataagtg cggcgacgat agtcatgccc cgcgcccacc ggaaggagct 5160 gactgggttg aaggctctca agggcatcgg tcgagatccc ggtgcctaat gagtgagcta 5220 acttacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca 5280 gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgccaggg 5340 tggtttttct tttcaccagt gagacgggca acagctgatt gcccttcacc gcctggccct 5400 gagagagttg cagcaagcgg tccacgctgg tttgccccag caggcgaaaa tcctgtttga 5460 tggtggttaa cggcgggata taacatgagc tgtcttcggt atcgtcgtat cccactaccg 5520 agatatccgc accaacgcgc agcccggact cggtaatggc gcgcattgcg cccagcgcca 5580 tctgatcgtt ggcaaccagc atcgcagtgg gaacgatgcc ctcattcagc atttgcatgg 5640 tttgttgaaa accggacatg gcactccagt cgccttcccg ttccgctatc ggctgaattt 5700 gattgcgagt gagatattta tgccagccag ccagacgcag acgcgccgag acagaactta 5760 atgggcccgc taacagcgcg atttgctggt gacccaatgc gaccagatgc tccacgccca 5820 gtcgcgtacc gtcttcatgg gagaaaataa tactgttgat gggtgtctgg tcagagacat 5880 caagaaataa cgccggaaca ttagtgcagg cagcttccac agcaatggca tcctggtcat 5940 ccagcggata gttaatgatc agcccactga cgcgttgcgc gagaagattg tgcaccgccg 6000 ctttacaggc ttcgacgccg cttcgttcta ccatcgacac caccacgctg gcacccagtt 6060 gatcggcgcg agatttaatc gccgcgacaa tttgcgacgg cgcgtgcagg gccagactgg 6120 aggtggcaac gccaatcagc aacgactgtt tgcccgccag ttgttgtgcc acgcggttgg 6180 gaatgtaatt cagctccgcc atcgccgctt ccactttttc ccgcgttttc gcagaaacgt 6240 ggctggcctg gttcaccacg cgggaaacgg tctgataaga gacaccggca tactctgcga 6300 catcgtataa cgttactggt ttcacattca ccaccctgaa ttgactctct tccgggcgct 6360 atcatgccat accgcgaaag gttttgcgcc attcgatggt gtccgggatc tcgacgctct 6420 cccttatgcg actcctgcat taggaagcag cccagtagta ggttgaggcc gttgagcacc 6480 gccgccgcaa ggaatggtgc atgcaaggag atggcgccca acagtccccc ggccacgggg 6540 cctgccacca tacccacgcc gaaacaagcg ctcatgagcc cgaagtggcg agcccgatct 6600 tccccatcgg tgatgtcggc gatataggcg ccagcaaccg cacctgtggc gccggtgatg 6660 ccggccacga tgcgtccggc gtagaggatc gagatctcga tcccgcgaaa ttaatacgac 6720 tcactatagg ggaattgtga gcggataaca attcccctct agaaataatt ttgtttaact 6780 ttaagaagga gatatacata tgaaatacct gctgccgacc gctgctgctg gtctgctgct 6840 cctcgctgcc cagccggcga tggc 6864

<210> 21 <211> 272 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: Fragmento de anticorpo de cadeia única exibindo as regiões variáveis de mAb 4G2 <220>

<223> Proteína.

<400> 21 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala 20 Met Ala Met Ala Asn 25 Ile Val Met Thr Gln 30 Ser Pro Lys Ser Met 35 Ser Met Ser Val Gly 40 Glu Arg Val Thr Leu 45 Thr Cys Lys Ala Ser 50 Glu Asn Val Val Thr 55 Tyr Val Ser Trp Tyr 60 Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg 85 Phe Thr Gly Ser Gly 90 Ser Ala Thr Asp Phe 95 Thr Leu Thr Ile Ser 100 Ser Val Gln Ala Glu 105 Asp Leu Ala Asp Tyr 110 His Cys Gly Gln Gly 115 Tyr Ser Tyr Pro Tyr 120 Thr Phe Gly Gly Gly 125 Thr Lys Leu Glu Ile 130 Lys Glu Gly Lys Ser 135 Ser Gly Ser Gly Ser 140 Glu Ser Lys Val Asp Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly 145 150 155 160 Thr Ser Val Lys Ile 165 Ser Cys Lys Thr Ser 170 Gly Tyr Thr Phe Thr 175 Glu Tyr Thr Ile His 180 Trp Val Lys Gln Ser 185 His Gly Lys Ser Leu 190 Ala Trp Ile Gly Gly 195 Ile Asp Pro Asn Ser 200 Gly Gly Thr Asn Tyr 205 Ser Pro Asn Phe Lys 210 Gly Lys Ala Thr Leu 215 Thr Val Asp Lys Ser 220 Ser Ser Thr Ala Tyr Met Asp Leu Arg Ser Leu Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe 225 230 235 240 Cys Ala Arg Ile Tyr His Tyr Asp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala 245 250 255 Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser Leu Glu His His His His His His

260 265 270

<210> 22 <211> 329 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial : Proteína exibindo as regiões variáveis

de mAb 4G2 e um domínio trimérico de matrilina

<220>

<223> Proteína. <400> 22

Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Ala Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro

20 25 30

Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys

35 40 45

Ala Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

50 55 60

Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 65 70 75-80

Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys

100 105 110

Gly Gln Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

115 120 125

Glu Ile Lys Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val

130 135 140

Asp Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly 145 150 155 160

Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu

165 170 175

Tyr Thr Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Ala Trp

180 185 190

Ile Gly Gly Ile Asp Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ser Pro Asn

195 200 205

Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala

210 215 220

Tyr Met Asp Leu Arg Ser Leu Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe 225 230 235 240

Cys Ala Arg Ile Tyr His Tyr Asp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala

245 250 255

Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 260 265 270 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Glu Asp Pro Cys Ala Cys Glu Ser Leu

275 280 285

Val Lys Phe Gln Ala Lys Val Glu Gly Leu Leu Gln Ala Leu Thr Arg

290 295 300

Lys Leu Glu Ala Val Ser Lys Arg Leu Ala Ile Leu Glu Asn Thr Val 305 310 315 320

Val Leu Glu His His His His His His 325

<210> 23 <211> 507 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: Mini-anticorpo de cadeia única exibindo

as regiões variáveis de mAb 4G2

<220>

<223> Proteína. <400> 23 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Ala Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro 20 25 30 Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys 35 40 45 Ala Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 50 55 60 Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys 100 105 110 Gly Gln Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val 130 135 140 Asp Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly 145 150 155 160 Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu 165 170 175 Tyr Thr Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Ala Trp 180 185 190 Xle Gly Gly Ile Asp Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ser Pro Asn 195 200 205 Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 210 215 220 Tyr Met Asp Leu Arg Ser Leu Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe 225 230 235 240 Cys Ala Arg Ile Tyr His Tyr Asp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala 245 250 255 Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Glu Pro Lys Ser Ser 260 265 270 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 275 280 285 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 290 295 300 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 305 310 315 320 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 325 330 335 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr 340 345 350 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 355 360 365 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 370 375 380 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 385 390 395 400 Tyr Thr Leu Pro Pro ín·; Ser Arg Glu Glu Met /ι η Thr Lys Asn Gln Val A 1 ^ Ser

405 410 415 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 420 425 430 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 435 440 445 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 450 455 460 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 465 470 475 480 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 485 490 495 Pro Gly Lys Leu Glu His His His His His His

500 505

<210> 24 <211> 22 <212> PRT <213> Erwinia carotovora <220> <223> Peptideo de sinal. <220> <223> Peptideo de sinal pelB <400> 24

Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala

15 10 15

Ala Gln Pro Ala Met Ala 20

<210> 25

<211> 107

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<223> Polipeptídeo. <220>

<223> Seqüência da região variável de cadeia leve de mAb 4G2. <400> 25

Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr 20 Leu Thr Cys Lys Ala 25 Ser Glu Asn Val Val 30 Thr Tyr Val Ser Trp 35 Tyr Gln Gln Lys Pro 40 Glu Gln Ser Pro Lys 45 Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp 85 Tyr His Cys Gly Gln 90 Gly Tyr Ser Tyr Pro 95 Tyr Thr Phe Gly Gly 100 Gly Thr Lys Leu Glu 105 Ile Lys <210> 26

<211> 14 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial : Seqüência de ligador conectando as regiões variáveis do fragmento scFv <220>

<223> Peptideo. <400> 26

Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp

15 10

<210> 27 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <220>

<223> Polipeptídeo. <220>

<223> Seqüência da região variável de cadeia pesada de mAb 4G2. <400> 27

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile 20 Ser Cys Lys Thr Ser 25 Gly Tyr Thr Phe Thr 30 Glu Tyr Thr Ile His 35 Trp Val Lys Gln Ser 40 His Gly Lys Ser Leu 45 Ala Trp Ile Gly Gly 50 Ile Asp Pro Asn Ser 55 Gly Gly Thr Asn Tyr 60 Ser Pro Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Asp Leu Arg Ser 85 Leu Ser Ser Glu Asp 90 Ser Ala Val Tyr Phe 95 Cys Ala Arg Ile Tyr 100 His Tyr Asp Gly Tyr 105 Phe Asp Val Trp Gly 110 Ala Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 28 <211> 15 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: Seqüência do segmento de ligador conectando o domínio de matrilina no domínio variável de cadeia pesada de mAb 4G2 <220>

<223> Fragmento de peptídeo. <400> 28

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 15 10 15

<210> 29 <211> 75 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial :Esta é a proteína madura PMEC exibindo segmentos B e C do virus da dengue2 <220>

<223> Proteína. <400> 29

Leu Val Thr Phe Lys Asn Pro His Ala Lys Lys Gln Asp Val Val Val 1 5 10 15 Gly Gly Lys Leu 20 Thr Asn Thr Thr Thr 25 Glu Ser Arg Cys Pro 30 Thr Gln Gly Glu Pro 35 Ser Leu Asn Glu Glu 40 Gln Asp Lys Arg Phe 45 Leu Cys Lys His Ser 50 Met Val Asp Arg Gly 55 Trp Gly Asn Gly Cys 60 Gly Leu Phe Gly Lys Gly Gly Ile Val Thr Cys Ala Met Phe Thr 65 70 75

<210> 30

<211> 75

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial : Esta é uma proteína madura PMEC

exibindo segmentos ] B e ' C do vírus da dengue 1 <220> <223> Proteína. <400> 30 Leu Val Thr Phe Lys Thr Ala His Ala Lys Lys Gln Glu Val Val Val 1 5 10 15 Gly Gly Lys Ile Ser Asn Thr Thr Thr Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln 20 25 30 Gly Glu Ala Thr Leu Val Glu Glu Gln Asp Thr Asn Phe Val Cys Arg 35 40 45 Arg Thr Phe Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly 50 55 60 Lys Gly Ser Leu Ile Thr Cys Ala Lys Phe Lys 65 70 75

<210> 31 <211> 75 <212> PRT <213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial : Esta é uma proteína madura PMEC

exibindo segmentos B e C do vírus da dengue 3

<220>

<223> Proteína. <400> 31

Leu Val Thr Phe Lys Asn Ala His Ala Lys Lys Gln Glu Val Val Val

1 5 10 15

Gly Gly Lys Ile Thr Asn Ile Thr Thr Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln

20 25 30

Gly Glu Ala Ile Leu Pro Glu Glu Gln Asp Gln Asn Tyr Val Cys Lys

35 40 45

His Thr Tyr Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly

50 55 60

Lys Gly Ser Leu Val Thr Cys Ala Lys Phe Gln 65 70 75

<210> 32 <211> 75 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial : Esta é uma proteína madura PMEC

exibindo segmentos B e C do vírus da dengue 4

<220>

<223> Proteína. <400> 32

Met Val Thr Phe Lys Val Pro His Ala Lys Arg Gln Asp Val Thr Val

1 5 10 15

Gly Gly Ser Ile Ser Asn Ile Thr Thr Ala Thr Arg Cys Pro Thr Gln

20 25 30

Gly Glu Pro Tyr Leu Lys Glu Glu Gln Asp Gln Gln Tyr Ile Cys Arg

35 40 45

Arg Asp Val Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly

50 55 60

Lys Gly Gly Val Val Thr Cys Ala Lys Phe Ser 65 70 75

<210> 33 <211> 75 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial : Esta é uma proteína madura PMEC

exibindo segmentos B e ( C do virus do oeste ι do Nilo <220> <223> Proteína. <400> 33 Leu Met Glu Phe Glu Glu Pro His Ala Thr Lys Gln Ser Val Val Ala 1 5 10 15 Gly Gly Ser Val Ser Asp Leu Ser Thr Arg Ala Ala Cys Pro Thr Met 20 25 30 Gly Glu Ala His Asn Glu Lys Arg Ala Asp Pro Ala Phe Val Cys Lys 35 40 45 Gln Gly Val Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly 50 55 60 Lys Gly Ser Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ala 65 70 75

<210> 34 <211> 75 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: Esta é uma proteína madura PMEC

exibindo segmentos B e C do virus da encefalite japonesa

<220>

<223> Proteína. <400> 34

Leu Met Glu Phe Glu Gly Ala His Ala Thr Lys Gln Ser Val Val Ala

1 5 10 15

Gly Gly Ser Val Thr Asp Ile Ser Thr Val Ala Arg Cys Pro Thr Thr 20 25 30

Gly Glu Ala His Asn Glu Lys Arg Ala Asp Ser Ser Tyr Val Cys Lys

35 40 45

Gln Gly Phe Thr Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly

50 55 60

Lys Gly Ser Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ser 65 70 75

<210> 35 <211> 75 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial : Esta é uma proteína madura PMEC exibindo segmentos B e C do virus da encefalite de Murray Valley <220> <223> Proteína. <4 00> 35

Leu Val Glu Phe Glu Glu Pro His Ala Thr Lys Gln Ser Val Val Ala

15 10 15

Gly Gly Thr Val Ser Asp Val Ser Thr Val Ser Asn Cys Pro Thr Thr

20 25 30

Gly Glu Ser His Asn Thr Lys Arg Ala Asp His Asn Tyr Leu Cys Lys

35 40 45

Arg Gly Val Thr Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly

50 55 60

Lys Gly Ser Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe Thr 65 70 75

<210> 36 <211> 75 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: Esta é uma proteína madura PMEC

exibindo segmentos ;B e C do vírus kunjin <220> <223> Proteína. <4 00> 36 Leu Met Glu Phe Glu Glu Pro His Ala Thr Lys Gln Ser Val Ile Ala 1 5 10 15 Gly Gly Thr Val Ser Glu Leu Ser Thr Lys Ala Ala Cys Pro Thr Met 20 25 30 Gly Glu Ala His Asn Asp Lys Arg Ala Asp Pro Ser Phe Val Cys Lys 35 40 45 Gln Gly Val Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly 50 55 60 Lys Gly Ser Ile Asp Thr. Cys Ala Lys Phe Ala 65 70 .75

<210> 37

<211> 75

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: Esta é uma proteína madura PMEC exibindo segmentos B e C do virus da encefalite de St Louis <220>

<223> Proteína.

<400> 37

Leu Val Glu Phe Glu Glu Pro His Ala Thr Lys Gln Thr Val Val Ala 1 5 10 15 Gly Gly Thr Leu 20 Asp Thr Leu Ser Thr 25 Val Ala Arg Cys Pro 30 Thr Thr Gly Glu Ala 35 His Asn Thr Lys Arg 40 Ser Asp Pro Thr Phe 45 Val Cys Lys Arg Asp 50 Val Val Asp Arg Gly 55 Trp Gly Asn Gly Cys 60 Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe Thr 65 70 75

<210> 38 <211> 75 <212> PRT <213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: Esta é uma proteína madura PMEC exibindo segmentos B e C do virus da febre amarela <220>

<223> Proteína. <400> 38

Leu Val Glu Phe Glu Pro Pro His Ala Ala Thr Ile Arg Val Leu Ala

1 5 10 15

Gly Gly Val Leu Thr His Val Lys Ile Asn Asp Lys Cys Pro Ser Thr

20 25 30

Gly Glu Ala His Leu Ala Glu Glu Asn Glu Gly Asp Asn Ala Cys Lys

35 40 45

Arg Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly

50 55 60

Lys Gly Ser Ile Val Ala Cys Ala Lys Phe Thr 65 70 75

<210> 39 <211> 75 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial : Esta é uma proteína madura PMEC exibindo segmentos B e C do virus da encefalite de origem em carrapato <220>

<223> Proteína. <4 00> 39

Leu Val Glu Phe Gly Ala Pro His Ala Val Lys Met Asp Val Tyr Asn 1 5 10 15 Gly Gly Lys Leu 20 Ser Asp Thr Lys Val 25 Ala Ala Arg Cys Pro 30 Thr Met Gly Pro Ala 35 Thr Leu Ala Glu Glu 40 His Gln Ser Gly Thr 45 Val Cys Lys Arg Asp 50 Gln Ser Asp Arg Gly 55 Trp Gly Asn His Cys 60 Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ile Val Thr Cys Val Lys Ala Ser 65 70 75

<210> 40 <211> 75 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: Esta é uma proteína madura PMEC

exibindo segmentos B e C do vírus LANGAT

<220>

<223> Proteína. <400> 40

Leu Val Glu Phe Gly Thr Pro His Ala Val Lys Met Asp Val Phe Asn

1 5 10 15

Gly Gly Lys Leu Thr Gly Thr Lys Val Ala Ala Arg Cys Pro Thr Met

20 25 30

Gly Pro Ala Thr Leu Pro Glu Glu His Gln Ser Gly Thr Val Cys Lys

35 40 45

Arg Asp Gln Ser Asp Arg Gly Trp Gly Asn His Cys Gly Leu Phe Gly

50 55 60

Lys Gly Ser Ile Val Thr Cys Val Lys Phe Thr 65 70 75

<210> 41 <211> 75 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial : Esta é uma proteína madura PMEC exibindo segmentos B e C do vírus Looping ill <220>

<223> Proteína. <4 00> 41

Leu Val Glu Phe Gly Ala Pro His Ala Val Lys Met Asp Val Tyr Asn

1 5 10 15

Gly Gly Lys Leu Ser Glu Thr Lys Val Ala Ala Arg Cys Pro Thr Met 20 25 30 Gly Pro Ala 35 Ala Leu Ala Glu Glu 40 Arg Gln Ile Gly Thr 45 Val Cys Lys Arg Asp 50 Gln Ser Asp Arg Gly 55 Trp Gly Asn His Cys 60 Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ile Val Ala Cys Val Lys Ala Ala

65 70 75

<210> 42

<211> 75

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: Esta é uma proteína madura PMEC exibindo segmentos B e C do vírus POWASSAN <220>

<223> Proteína.

<400> 42

Leu Val Glu Phe Gly Pro Pro His Ala Val Lys Met Asp Val Phe Asn 1 5 10 15 Gly Gly Lys Leu 20 Thr Asn Thr Lys Val 25 Glu Ala Arg Cys Pro 30 Thr Thr Gly Pro Ala 35 Thr Leu Pro Glu Glu 40 His Gln Ala Asn Met 45 Val Cys Lys Arg Asp 50 Gln Ser Asp Arg Gly 55 Trp Gly Asn His Cys 60 Gly Phe Phe Gly Lys Gly Ser Ile Val Ala Cys Ala Lys Phe Glu 65 70 75

<210> 43 <211> 75 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: Esta é uma seqüência correspondente proteína madura PMEC mutada nas posições de aminoácidos inacessíveis para interação com anticorpos <220>

<223> Proteína. <400> 43

Asp Thr Val Tyr Arg Asn Glu His Asn Lys Lys His Asp Val Val Ser 1 5 10 15 Ala Ser Lys Leu 20 Thr Asn Thr Thr Thr 25 Glu Ser Arg Cys Thr 30 Gly Gln Gly Val Ala 35 Thr Leu Asn Glu Asp 40 Glu Asp Lys Arg Phe 45 Asn Cys Tyr Leu Asp 50 Leu Val Tyr Arg Gly 55 Trp Gly Asn Gly Cys 60 Gly Asp Arg Gly Leu Gly Phe Ile Lys Gln Cys Ser Met Lys Val 65 70 75

<210> 44 <211> 75 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial : Esta é uma seqüência correspondente proteína madura PMEC mutada nas posições de aminoácidosinacessíveis para interação com anticorpos <220>

<223> Proteína. <4 00> 44

Asp Thr Glu Ile Tyr Asn Glu His Gly Lys Lys Thr Asp Val Val Thr 1 5 10 15 Thr Ala Lys Leu 20 Thr Asn Thr Thr Thr 25 Glu Ser Arg Cys Pro 30 Gly Gln Gly Glu Gln 35 Thr Leu Asn Glu Asp 40 Ala Asp Gln Arg Phe 45 Phe Cys Val Lys Asp 50 Leu Val Tyr Arg Gly 55 Trp Gly Asn Gly Cys 60 Gly Val Arg Gly Trp Gly Thr Ile Gln Gln Cys Val Met Lys Val 65 70 75

<210> 45 <211> 75 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial : Esta é uma seqüência correspondente proteína madura PMEC mutada nas posições de aminoácidosinacessíveis para interação com anticorpos <220>

<223> Proteína. <400> 45

Asp Thr Val Val Arg Thr Glu His Lys Lys Lys Ile Asp Val Val Ser 1 5 10 15 Ser Thr Lys Leu 20 Thr Asn Thr Thr Thr 25 Glu Ser Arg Cys Pro 30 Gly Gln Gly Glu Ser 35 Thr Leu Asn Glu Glu 40 Glu Asp Glu Arg Phe 45 Asp Cys Gln Gln Asp 50 Gln Val Leu Arg Gly 55 Trp Gly Asn Gly Cys 60 Gly Val Pro Gly Trp Gly Asn Xle Lys Lys Cys Ala Met Lys Glu 65 70 75

<210> 46 <211> 75 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial : Esta é uma seqüência correspondente proteína madura PMEC mutada nas posições de aminoácidosinacessíveis para interação com anticorpos <220>

<223> Proteína. <400> 46

Glu Ser Val Ser Val Asn Glu His Lys Lys Lys Asn Asp Val Val Ser 1 5 10 15 Asp Thr Lys Leu 20 Thr Asn Thr Thr Thr 25 Glu Ser Arg Cys Pro 30 Gly Gln Gly Glu Pro 35 Thr Leu Asn Glu Glu 40 Glu Asp Glu Arg Phe 45 Asp Cys Gln Lys Asp 50 Leu Val Tyr Arg Gly 55 Trp Gly Asn Gly Cys 60 Gly Val Arg Gly Trp Gly Trp Ile Lys Lys Cys Ala Met Lys Val 65 70 75

<210> 47 <211> 75 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: Esta é uma seqüência correspondente proteína madura PMEC mutada nas posições de aminoácidosinacessíveis para interação com anticorpos <220>

<223> Proteína. <400> 47

Lys Val Val Ser Arg Asn Glu His Arg Lys Lys Asn Asp Val Val Ser 1 5 10 15 Glu Thr Lys Leu 20 Thr Asn Thr Thr Thr 25 Glu Ser Arg Cys Pro 30 Asn Gln Gly Glu Ala 35 Thr Leu Asn Glu Asp 40 Glu Asp Glu Arg Phe 45 Glu Cys Val Lys Asp 50 Val Val Tyr Arg Gly 55 Trp Gly Asn Gly Cys 60 Gly Glu Arg Gly Leu Gly Thr Ile Gln Gln Cys Trp Met Asn Glu 65 70 75

<210> 48 <211> 75 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: Esta ê uma seqüência correspondente proteína madura PMEC mutada nas posições de aminoácidosinacessíveis para interação com anticorpos <220> <223> Proteína. <400> 48

Asp Asp Glu Tyr Tyr Leu Glu His Tyr Lys Lys Leu Asp Val Val Ser 1 5 10 15 Arg Thr Lys Leu 20 Thr Asn Thr Thr Thr 25 Glu Ser Arg Cys Pro 30 Gly Gln Gly Gln Ala 35 Thr Leu Asn Glu Glu 40 Glu Asp Glu Arg Phe 45 Gln Cys Phe Val Ala 50 Leu Val Ile Arg Gly 55 Trp Gly Asn Gly Cys 60 Gly Val Val Gly Trp Gly Ser Ile Val Val Cys Lys Met Lys Ile 65 70 75

<210> 49 <211> 75 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: Esta é uma seqüência correspondente proteína madura PMEC mutada nas posições de aminoácidosinacessíveis para interação com anticorpos <220>

<223> Proteína. <400> 49

Asp Thr Val Val Val Asn Glu His Asn Lys Lys Ile Asp Val Val Ser 1 5 10 15 Thr Ser Lys Leu 20 Thr Asn Thr Thr Thr 25 Glu Ser Arg Cys Pro 30 Gly Gln Gly Pro Ala 35 Thr Leu Asn Glu Ala 40 Glu Asp Glu Arg Phe 45 Asp Cys Gln Phe Ser 50 Tyr Val Tyr Arg Gly 55 Trp Gly Asn Gly Cys 60 Gly Lys Arg Gly Leu Gly Pro Ile Leu Val Cys Ala Met Lys Val 65 70 75

<210> 50 <211> 75 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: Esta é uma seqüência correspondente proteína madura PMEC mutada nas posições de aminoácidosinacessíveis para interação com anticorpos <220>

<223> Proteína. <400> 50

Asp Asn Val Val Val Asn Glu His Tyr Lys Lys Thr Asp Val Val Ser 1 5 10 15 Ser Thr Lys Leu Thr Asn Thr Thr Thr Glu Ser Arg Cys Pro Gly Gln 20 25 30 Gly Tyr Pro Thr Leu Asn Glu Gln Ser Asp Glu Arg Phe Val Cys Phe 35 40 45 Val Asp Tyr Val Ile Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Val Asp Gly 50 55 60 Trp Gly Pro Ile Val Val Cys Lys Met Lys Ile 65 70 75

<210> 51 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<223> Fragmento de peptídeo. <220>

<223> Seqüência do domínio de trimerização de matrilina. <400> 51

Glu Asp Pro Cys Ala Cys Glu Ser Leu Val Lys Phe Gln Ala Lys Val

15 10 15

Glu Gly Leu Leu Gln Ala Leu Thr Arg Lys Leu Glu Ala Val Ser Lys

20 25 30

Arg Leu Ala Ile Leu Glu Asn Thr Val Val 35 40 <210> 52

<211> 232

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Polipeptideo. <220>

<223> Seqüência do fragmento FC do domínio de articulação da molécula IgGl, CH2 e CH3.

<400> 52

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230

<210> 53 <211> 250 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: Fragmento de anticorpo de cadeia única exibindo as regiões variáveis de mAb 4G2, após secretado no periplasma <220>

<223> Proteína. <400> 53

Met Ala Asn Ile Val Met

1 5

Val Gly Glu Arg Val Thr 20

Thr Tyr Val Ser Trp Tyr 35

Leu Ile Tyr Gly Ala Ser 50

Thr Gly Ser Gly Ser Ala 65 70

Gln Ala Glu Asp Leu Ala 85

Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 100

Ser Ser Gly Ser Gly Ser 115

Gln Ser Gly Pro Glu Leu 130

Cys Lys Thr Ser Gly Tyr 145 150

Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser

10 15

Leu Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val

25 30

Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu

40 45

Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe

55 60

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val 75 80

Asp Tyr His Cys Gly Gln Gly Tyr Ser Tyr

90 95

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Glu Gly Lys

105 110

Glu Ser Lys Val Asp Glu Val Gln Leu Gln

120 125

Val Lys Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser 135 140

Thr Phe Thr Glu Tyr Thr Ile His Trp Val 155 160 Lys Gln Ser His Gly 165 Lys Ser Leu Ala Trp 170 Ile Gly Gly Ile Asp 175 Pro Asn Ser Gly Gly 180 Thr Asn Tyr Ser Pro 185 Asn Phe Lys Gly Lys 190 Ala Thr Leu Thr Val 195 Asp Lys Ser Ser Ser 200 Thr Ala Tyr Met Asp 205 Leu Arg Ser Leu Ser 210 Ser Glu Asp Ser Ala 215 Val Tyr Phe Cys Ala 220 Arg Ile Tyr His Tyr Asp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Ala Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ser Leu Glu His 245 His His His His His 250

<210> 54 <211> 307 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: Seqüência da proteína multivalente exibindo as regiões variáveis de mAb 4G2 e o domínio trimérico de matrilina após secretado no periplasma <220>

<223> Proteína.

<400> 54 Met Ala Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser 1 5 10 15 Val Gly Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val 20 25 30 Thr Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Gly Tyr Ser Tyr 85 90 95 Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Glu Gly Lys 100 105 110 Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp Glu Val Gln Leu Gln 115 120 125 Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser 130 135 140 Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Thr Ile His Trp Val 145 150 155 160 Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Ala Trp Ile Gly Gly Ile Asp Pro 165 170 175 Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ser Pro Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr 180 185 190 Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Asp Leu Arg Ser 195 200 205 Leu Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ile Tyr His 210 215 220 Tyr Asp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Ala Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly 245 250 255 Gly Glu Asp Pro Cys Ala Cys Glu Ser Leu Val Lys Phe Gln Ala Lys 260 265 270 Val Glu Gly Leu Leu Gln Ala Leu Thr Arg Lys Leu Glu Ala Val Ser 275 280 285 Lys Arg Leu Ala Ile Leu Glu Asn Thr Val Val Leu Glu His His His 290 295 300 His His His 305

<210> 55

<211> 485

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da seqüência artificial: Seqüência do mini-anticorpo de cadeia

única exibindo as regiões variáveis of mAb 4G2 <220>

<223> Proteína. <400> 55

Met Ala Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser 1 5 10 15 Val Gly Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val 20 25 30 Thr Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Gly Tyr Ser Tyr 85 90 95 Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Glu Gly Lys 100 105 110 Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp Glu Val Gln Leu Gln 115 120 125 Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser 130 135 140 Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Thr Ile His Trp Val 145 150 155 160 Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Ala Trp Ile Gly Gly Ile Asp Pro 165 170 175 Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ser Pro Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr 180 185 190 Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Asp Leu Arg Ser 195 200 205 Leu Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ile Tyr His 210 215 220 Tyr Asp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Ala Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ser Gly Gly Gly Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys 245 250 255 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 260 265 270 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 275 280 285 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 290 295 300 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 305 310 315 320 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 325 330 335 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 340 345 350 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 355 360 365 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 370 375 380 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 385 390 395 400 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 405 410 415 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 420 425 430 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 435 440 445 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 450 455 460 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Leu Glu His 465 470 475 480 His His His His His 485

<210> 56

<211> 479

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição da seqüência artificial: Seqüência do mini-anticorpo de cadeia

única MA4G2 exibindo as regiões variáveis de mAb 4G2

<220>

<223> Proteína.

<400> 5b Met Ala Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser 1 5 10 15 Val Gly Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val 20 25 30 Thr Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Gly Tyr Ser Tyr 85 90 95 Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Glu Gly Lys 100 105 110 Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp Glu Val Gln Leu Gln 115 120 125 Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser 130 135 140 Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Thr Ile His Trp Val 145 150 155 160 Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Ala Trp Ile Gly Gly Ile Asp Pro 165 170 175 Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ser Pro Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr 180 185 190 Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Asp Leu Arg Ser 195 200 205 Leu Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ile Tyr His 210 215 220 Tyr Asp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Ala Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ser Gly Gly Gly Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys 245 250 255 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 260 265 270 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 275 280 285 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 290 295 300 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 305 310 315 320 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 325 330 335 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 340 345 350 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 355 360 365 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 370 375 380 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 385 390 395 400 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 405 410 415 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 420 425 430 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 435 440 445 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 450 455 460 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Leu Glu 4 65 470 475

Claims (40)

1. Área topográfica e altamente conservada, caracterizada pelo fato de que está exposta no vírion maduro, e que representa um epítopo comum aos flavivírus, empregável no desenvolvimento de moléculas de amplo espectro úteis na prevenção e/ou tratamento das infecções por vírus dengue 1-4 e outros flavivírus.

2. Área topográfica e altamente conservada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida área é um epítopo da proteína E da envoltura dos flavivírus e esta definida pelos seguintes resíduos da proteína E de dengue 2 ou os resíduos correspondentes em outros flavivírus: ASN67, THR69, THR70, SER72, ARG73, CYS74, LEU82, GLU84, GLU85, ASP87, VAL97, ARG99, GLY100, TRP101, GLY102, ASNl03, GLY104, CYS105, GLY106, METI 18, HIS244, LYS246, LYS247, GLN248, VAL252.

3. Area topográfica, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizada pelo fato de que está exposta na superfície da proteína E dos seguintes flavivírus: vírus do Ocidente do Nilo, Vírus de encefalite de St Louis, dengue 1, dengue 2, dengue 3, dengue 4, vírus da encefalite japonesa, vírus da febre amarela, vírus kunjin, vírus da doença da selva Kyasanur, vírus de Encefalite Transmitida por Carrapato, vírus do Valle Murray, vírus LANGAT, vírus da doença Louping, vírus Powassan.

4. Moléculas de acordo com a reivindicação 1, úteis na prevenção e/ou tratamento das infecções por vírus dengue 1-4 e outros flavivírus, baseadas na área topográfica descrita nas reivindicações 1-3, caracterizadas pelo fato de que serem capazes de induzir uma resposta de anticorpos neutralizantes e de reatividade cruzada ante os quatro serotipos do vírus dengue e outros flavivírus, em indivíduos imunizados com as mesmas.

5. Moléculas de acordo com a reivindicação 4, caracterizadas pelo fato de que são proteínas ou peptídeos quiméricos recombinantes ou sintéticos identificados na listagem de seqüências como ID SEQ 14, ID SEQ do 29 a 50.

6. Moléculas proteicas de acordo com a reivindicação 4, caracterizadas pelo fato de que estrutura primária se corresponde com a seqüência A-B-L-C onde A é a seqüência de um peptídeo entre 0 e 30 aminoácidos, B é a seqüência do fragmento Leu237-Val252 da proteína E do vírus dengue 2 ou a seqüência homologa a esta dos vírus dengue 1, dengue 3 ou dengue 4 ou qualquer flavivírus, L é uma seqüência entre 3 e 10 aminoácidos cuja função é de espaçador estabilizador e C é a seqüência do fragmento Lys64-Thr120 da proteína E do vírus dengue 2 ou a seqüência homologa dos vírus dengue 1, dengue 3 ou dengue 4 ou qualquer flavivírus.

7. Moléculas proteicas de acordo com a reivindicação 4, caracterizadas pelo fato de que estrutura primária se corresponde com a seqüência A-C-L-B onde A é a seqüência de um peptídeo entre 0 e 30 amino ácidos, B é a seqüência do fragmento Leu237-Val252 da proteína E do vírus dengue 2 ou a seqüência homologa dos vírus dengue 1, dengue 3 ou dengue 4 ou qualquer flavivírus, L é uma seqüência entre 3 e 10 aminoácidos cuja função é de ligador estabilizador e C é a seqüência do fragmento Lys64- Thr 120 da proteína E do vírus dengue 2 ou a seqüência homologa dos vírus dengue 1, dengue 3 ou dengue 4 ou qualquer flavivírus.

8. Proteína de acordo com as reivindicações 6 e 7 caracterizada pelo fato de que A é um peptídeo sinal de secreção bacteriano.

9. Proteína de acordo com as reivindicações 6 e 7 caracterizada pelo fato de que A é um peptídeo sinal de fermentos ou células de mamíferos.

10. Proteína de fusão, sintética ou recombinante, caracterizada pelo fato de que é formada pelas moléculas descritas nas reivindicações 4-9, e a fusão N- ou C-terminal de um ou mais segmentos peptídicos ou proteicos que sejam capazes de aumentar seu efeito protetor e/ou terapêutico, ou facilitem sua purificação e/ou detecção.

11. Proteína de fusão, sintética ou recombinante, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a fusão N- ou C- terminal seja um ou vários segmentos peptídicos ou proteico que contenham epítopos de células T auxiliadoras.

12. Proteína de fusão, sintética ou recombinante, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a fusão N- ou C- terminal seja uma fila de Histidinas.

13. Acido nucleico caracterizada pelo fato de que codifica para uma proteína correspondente às reivindicações 4 a 12.

14. Célula hospedeira procariota ou eucariota caracterizada pelo fato de que contém o ácido nucleico de acordo com a reivindicação 13.

15. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que contém uma ou mais proteínas de acordo com as reivindicações 4 a 12, capaz de induzir no organismo receptor uma resposta imune de anticorpos neutralizantes e protetora com reatividade cruzada contra os vírus dengue 1-4.

16. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que contém uma ou mais proteínas de acordo com as reivindicações 4 a 12, capaz de induzir no organismo receptor uma resposta imune de anticorpos neutralizantes e protetora com reatividade cruzada contra outros flavivírus.

17. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que é capaz de induzir no organismo receptor uma resposta imune de anticorpos neutralizantes e protetora com reatividade cruzada contra dengue 1-4 e outros flavivírus, em cuja base estejam vetores vivos ou DNA nu, contendo genes que codificam para as proteínas descritas nas reivindicações 4 a 12.

18. Moléculas proteicas e peptídeos, sintéticas ou recombinantes, de acordo com as reivindicações 5 a 12, caracterizadas pelo fato de que são úteis como reativos diagnósticos para a detecção de anticorpos anti-flavivírus.

19. Moléculas de acordo com a reivindicação 1, úteis na prevenção e/ou tratamento das infecções por vírus dengue 1-4 e outros flavivírus, baseadas na área topográfica descrita nas reivindicações 1-3, caracterizadas pelo fato de que são capazes de impedir ou atenuar a infecção viral devido a sua interação com esta área topográfica.

20. Moléculas de acordo com a reivindicação 19, caracterizadas pelo fato de que esta molécula é um anticorpo humano ou produzido em outra espécie.

21. Anticorpo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que esta molécula apresenta uma reatividade cruzada entre diferentes flavivírus e é neutralizante da infecção viral.

22. Moléculas de utilização na prevenção e/ou tratamento das infecções por vírus dengue 1-4 e outros flavivírus, de acordo com as reivindicações 19 a 21, caracterizadas pelo fato de que estas moléculas são um fragmento recombinante ou proteolítico do anticorpo.

23. Molécula de acordo com a reivindicação 22,caracterizada pelo fato de que esta molécula é um fragmento recombinante do anticorpo tipo Fv de corrente singela (scFv).

24. Molécula de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que está unida com ou sem espaçadores a uma região de origem proteica que permite sua assemblagem como uma molécula de reconhecimento multivalente dos vírions maduros.

25. Molécula de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que a região proteica unida a esta molécula contém um espaçador e as regiões dobradiças, CH2 e CH3 de uma imunoglobulina humana, como descrito em SEQ ID: 55 e 56.

26. Molécula de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que a região proteica associada contém um espaçador e um domínio de trimerização, como descrito em SED ID: 54.

27. Ácido nucleico caracterizada pelo fato de que codifica para uma proteína correspondente às reivindicações 18 a 26.

28. Célula hospedeira procariota ou eucariota caracterizada pelo fato de que contém um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 27.

29. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que contém uma ou mais proteínas das descritas nas reivindicações 18 a 26, capaz de impedir ou atenuar a infecção viral com os vírus dengue 1-4.

30. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que contém uma ou mais proteínas das descritas nas reivindicações 18 a 26, capaz de impedir ou atenuar a infecção viral com outros flavivírus.

31. Moléculas proteicas e peptídeos, sintéticos ou recombinantes, de acordo com as reivindicações 18 a 26, caracterizadas pelo fato de que são úteis como reativos diagnósticos para a detecção de flavivírus.

32. Molécula útil como candidato terapêutico de amplo espectro contra flavivírus caracterizada pelo fato de que é identificada com um método que compreenda o contato da referida molécula com a área ou epítopo conservado da proteína E, de acordo as reivindicações 1 a 3, onde a união da referida molécula indique um candidato terapêutico de amplo espectro.

33. Molécula de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que a referida molécula é selecionada dentre a seguinte classe de compostos: proteínas, peptídeos, peptideomiméticos e moléculas pequenas

34. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a referida molécula está inclusa em uma biblioteca de compostos.

35. Método de acordo a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a referida biblioteca de compostos é gerada por métodos combinatórios.

36. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a referida união é determinada mediante um ensaio in vitro.

37. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o referido ensaio consiste no bloqueio da união de moléculas de acordo as reivindicações 19 a 24, a área conservada de acordo com as reivindicações 1 a 3.

38. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o referido ensaio consiste no bloqueio da união de moléculas de acordo as reivindicações 19 a 24, as moléculas proteicas segundo as reivindicações 4 a 7.

39. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a referida união é determinada mediante um ensaio in vivo.

40. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que consiste em um método assistido por computadores que compreende: 1) as coordenadas atômicas correspondentes aos resíduos que conformam a área de alta conservação da proteína E de acordo com as reivindicações 1 a 3, e a referidas coordenadas estão disponíveis em bases de dados de estrutura de proteínas ou modeladas por métodos computacionais ou determinadas por métodos experimentais 2) as coordenadas atômicas de moléculas, as quais foram determinadas experimentalmente ou modeladas por métodos computacionais 3) um procedimento computacional de acoplamento molecular que permita determinar se a referida molécula é antecipada a contatar a área de alta conservação.