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BRPI0411900B1 - compostos e composições farmacêuticas compreendendo os mesmos - Google Patents

compostos e composições farmacêuticas compreendendo os mesmos Download PDF

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BRPI0411900B1
BRPI0411900B1 BRPI0411900A BRPI0411900A BRPI0411900B1 BR PI0411900 B1 BRPI0411900 B1 BR PI0411900B1 BR PI0411900 A BRPI0411900 A BR PI0411900A BR PI0411900 A BRPI0411900 A BR PI0411900A BR PI0411900 B1 BRPI0411900 B1 BR PI0411900B1
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BR
Brazil
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guanidine
compounds
protein
virus
bacterial
Prior art date
Application number
BRPI0411900A
Other languages
English (en)
Inventor
Premkumar Anita
Dinneen Ewart Gary
Elizabeth Wilson Lauren
William Gage Peter
Best Wayne
Original Assignee
Biotron Ltd
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Priority claimed from AU2003903850A external-priority patent/AU2003903850A0/en
Priority claimed from AU2003904692A external-priority patent/AU2003904692A0/en
Application filed by Biotron Ltd filed Critical Biotron Ltd
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Publication of BRPI0411900B1 publication Critical patent/BRPI0411900B1/pt
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Abstract

"compostos antivirais e métodos". a presente invenção refere-se a compostos tendo atividade antiviral e métodos de utilizar os compostos para tratar infecções virais.

Description

SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Os inventores surpreendentemente descobriram que certos compostos que incluem-se na classificação de acilguanidinas substituídas têm atividade antiviral contra viroses de uma faixa de diferentes famílias de vírus. Sem pretender ser ligado por qualquer teoria particular ou mecanismo de ação, e a despeito de dogma corrente, parece possível que a replicação viral possa ser retardada inibindo-se ou de outro modo sub-regulando a atividade de canais de íon expressos na célula hospedeira. Desse modo, o impacto negativo dos compostos da presente invenção sobre a replicação viral pode ser mediado pela inibição ou de outro modo por sub-regulação de um canal de íon de membrana que contou com o vírus para a replicação. Este canal de íon de membrana pode ser um canal de íon de membrana viral (exógeno para a célula hospedeira) ou um canal de íon de célula hospedeira como um resultado de infecção viral (endógeno para a célula hospedeira).
Como um exemplo, os compostos da presente invenção podem inibir a função de Vpu ou p7 e desse modo inibir a continuação do ciclo de 25 vida do HIV ou HCV respectivo.
O vírus da SARS codifica uma proteína E que é mostrada pela primeira vez, pelos presente inventores, agir como um canal de íon. Quando as proteínas E similares estão presente em outras coronaviroses, os compostos, composições e métodos da presente invenção terão utilidade na ini30 bição e/ou tratamento de infecções por outras coronaviroses.
A presente invenção é concernida com novos compostos antivirais que incluem-se na classificação de acilguanidinas substituídas. Ela não
Figure BRPI0411900B1_D0001
3« inclui em seu escopo o uso dos compostos 5-(N,N-hexametileno)amilorida e
5-(N,N-dimetil)-amilorida para retardar, reduzir ou de outro modo inibir a ati vidade de crescimento viral e/ou funcional de HIV.
Conseqüentemente, um primeiro aspecto da presente invenção fornece uma acilguanidina com atividade antiviral.
De acordo com um segundo aspecto, a presente invenção fornece um composto antiviral de Fórmula I
Figure BRPI0411900B1_D0002
onde R1-R4 são independentemente grupos aromáticos, grupos heteroaromáticos, grupos alquilaromáticos, grupos alquilheteroaromáticos, grupos de alquenilaromáticos, grupos alquenilheteroaromáticos, grupos cicloalquilaromáticos, grupos cicloalquilheteroaromáticos, grupos de ariloxialquila, grupos de heteroariloxialquila, os referidos grupos são mono ou policíclicos, e são opcionalmente substituídos com um ou mais substituintes independentemente selecionados de hidrogênio, hidróxi, nitro, halo, amina, amina substituída, amina substituída por alquila, amina substituída por cicloalquila, amina substituída por arila, Ci_6 alquila, Cve alquilóxi, C3_6 cicloalquila, C^e alquila halo substituída, Ci_6 alquilóxi halo substituído, fenila, Ci_6 alquenoila, Cs-ecicloal quenoíla, C-j_6 alquenoóxi, benzo, arila, arila substituída, PrS, h2n ou nh2 o
De acordo com um terceiro aspecto, a presente invenção fornece um composto antiviral de Fórmula I
Figure BRPI0411900B1_D0003
Figure BRPI0411900B1_D0004
ou sais farmaceuticamente aceitáveis destes, em que,
Ri =
Figure BRPI0411900B1_D0005
Figure BRPI0411900B1_D0006
Figure BRPI0411900B1_D0007
Figure BRPI0411900B1_D0008
Figure BRPI0411900B1_D0009
Figure BRPI0411900B1_D0010
R2, R3 θ R4 são independente mente hidrogênio,
Figure BRPI0411900B1_D0011
Figure BRPI0411900B1_D0012
e em que
X = hidrogênio, hidróxi, nitro, halo, C1.6 alquila, C1.6 alquilóxi, C3-6 cicloalquila, C1.6 alquila halo substituída, Ci_e alquilóxi halo substituído, fenila,
Ci_6alquenoíla, Ο3.θ cicloalquenoíla, Ci-ealquenoóxi, ou benzo;
Ra, Rb, Rc, Rd, Re, Rf, Rh, Rk, R|_, Rm, Rn, Ro, Rp independentemente = hidrogênio, amino, halo, Ci .5 alquila, C1 _ 5 alquilóxi, hidróxi, arila, arila substituída, amina substituída, amina substituída por mono ou dialquila,
Figure BRPI0411900B1_D0013
amina substituída por cicloalquila, amina substituída por arila,
H3C
Figure BRPI0411900B1_D0014
Rg, Rj independentemente = hidrogênio, hidróxi, halo, ou C1 _ 5 alquila;
Rj = hidrogênio, amina, halo, C1.5 alquila, C1. 5 alquilóxi, hidróxi, arila, arila substituída, amina substituída, amina substituída por alquila, ami10 na substituída por cicloalquila, amina substituída por arila, PrS,
Figure BRPI0411900B1_D0015
Preferivelmente, os compostos da invenção incluem o seguinte :
5-(N,N-hexametÍleno)amilorida compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0016
Cloridrato de 5-(N,N-Dimetil)amílorida compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0017
5-(N-metil-N-isobutil)amilorida compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0018
Figure BRPI0411900B1_D0019
Figure BRPI0411900B1_D0020
5-(N-etil-N-isopropil)amilorida (aqui referido como El PA), compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0021
N-(3,5-Diamino-6-cloro-pirazÍna-2-carbonil)-N'-fenil-guanidina, compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0022
N-Benzil-N’-(3,5-diamino-6-cloro-pirazina-2-carbonil)-guanidina, compreendendo a estrutura
O NH2
Figure BRPI0411900B1_D0023
Amilorida de 3-metóxi compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0024
3-metóxi-5-(N,N-hexametileno)-amilorida compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0025
3-hidróxi- 5-hexametilenoimino-amilorida compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0026
Hexametilenoimino-6-fenil-2-piraxina carboxamida compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0027
N-arrudino-3,5-diamino-6-fenil-2-pirazinacarboxamida compreendendo a es5 trutura
Figure BRPI0411900B1_D0028
5-(N,N-hexametileno)amilorida compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0029
N-amidino-3-amino-5-fenil-6-cloro-2-pirazinacarboxamida compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0030
Figure BRPI0411900B1_D0031
3'4 DicloroBenzamila compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0032
Cl
Cl
HCI 2'4 DicloroBenzamila compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0033
5-(N-metil-N-guanidinocarbonil-metil)amilorida compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0034
Cloridrato 5-(N,N-dietil)amilorida compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0035
Cloridrato 5-(N,N-dimetil)amilorida compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0036
Figure BRPI0411900B1_D0037
5-terc-butilamino-amilorida compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0038
6-lodoamilorida compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0039
Amilorida de Bodipi-FL compreendendo a estrutura O NH2
Figure BRPI0411900B1_D0040
5-(4-fluorofenil)amilorida compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0041
1-naftoilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0042
NH2
2-naftoilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0043
Figure BRPI0411900B1_D0044
N,N'-bis(2-naftoil)guanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0045
N,N'-bis(1-naftoiI)guanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0046
N,N'-bis(2-naftoil)-N”-fenilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0047
Figure BRPI0411900B1_D0048
Figure BRPI0411900B1_D0049
6-metóxi -2-naftoilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0050
N-Cinamoil-N\N'-dimetilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0051
cinamoilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0052
Figure BRPI0411900B1_D0053
4-fenilbenzoilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0054
N-(cinamoil)-N'fenilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0055
(3-fenilpropanoil)guanidina compreendendo a estrutura
O NH
Figure BRPI0411900B1_D0056
N,N,-bis-(cinamoil)~N-fenÍlguanÍdina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0057
Figure BRPI0411900B1_D0058
Figure BRPI0411900B1_D0059
N-(3-fenilpropanoil)N'-fenilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0060
N,N,-bis(3-fenilpropanoil)-N-fenilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0061
Figure BRPI0411900B1_D0062
trans-3-furanacriloilguanidina compreendendo a estrutura
O NH
Figure BRPI0411900B1_D0063
N-(6-hidróxi- 2-naftoil)-N'-fenilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0064
Figure BRPI0411900B1_D0065
(4-Fenoxibenzoil)guanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0066
N,N'-Bis(amidino)naftaleno~2,6-dicarboxamida compreendendo a estrutura
I o nh2 nh2
Y Y
nh2 o
6-bromo-2-naftoilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0067
Figure BRPI0411900B1_D0068
2-(2-naftil)acetoilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0069
Figure BRPI0411900B1_D0070
(Fenilacetil)guanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0071
H
Figure BRPI0411900B1_D0072
N,N'-Bis(3-fenilpropanoil)guanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0073
Benzoilguanidina compreendendo a estrutura
O NH
Figure BRPI0411900B1_D0074
(4-Clorofenóxi-acetil]guanidina compreendendo a estrutura
O NH
Figure BRPI0411900B1_D0075
Figure BRPI0411900B1_D0076
[(E)-3-(4-Dimetilaminofenil)-2-metilacriloil]guanidina compreendendo a estru tura
Figure BRPI0411900B1_D0077
(4-Clorocinamoil)guanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0078
(4-Bromocinamoil)guanidina compreendendo a estrutura
O NH2
Br (4~Metoxicinamoil)guanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0079
Figure BRPI0411900B1_D0080
Figure BRPI0411900B1_D0081
(5-Fenil-penta-2,4-dienoil)guanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0082
(3-Bromocinamoil)guanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0083
(3-Metoxicinamoil)guanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0084
(3-Clorocinamoil)guanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0085
(2-Clorocinamoil)guanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0086
(2-Bromocinamoil)guanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0087
(2-Metoxicinamoil)guanidina compreendendo a estrutura *1
Figure BRPI0411900B1_D0088
Figure BRPI0411900B1_D0089
(trans-2-Fenilciclopropanocarbonil)guanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0090
[3-(3-Piridil)acriloil]guanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0091
(4-HidroxÍcinamoil)guanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0092
(Quinolina-2-carbonil)guanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0093
(4-Nitrocinamoil)guanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0094
(3-Nitrocinamoil)guanidina compreendendo a estrutura
O NH
Figure BRPI0411900B1_D0095
NO2 (2-Nitrocinamoil)guanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0096
(a-Metilcinamoil)guanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0097
Figure BRPI0411900B1_D0098
trans-3-(1-naftil)acriloilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0099
4-fenilcinamoilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0100
3-(trifluorometil)cinamoilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0101
Figure BRPI0411900B1_D0102
CH3
4-(trifluorometil)cinamoilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0103
Figure BRPI0411900B1_D0104
Figure BRPI0411900B1_D0105
2-(trifluorometil)cinamoilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0106
Figure BRPI0411900B1_D0107
4-metilcinamoilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0108
Figure BRPI0411900B1_D0109
3-fluorocinamoilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0110
2-fluorocinamoilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0111
4-fluorocinamoilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0112
Figure BRPI0411900B1_D0113
3,4-diclorocinamoilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0114
2,4-diclorocinamoilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0115
2,6-diclorocinamoilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0116
4-etoxicinamoilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0117
3,4-(metilenodióxí)cinamoilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0118
3-(2-naftil)acriloilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0119
Figure BRPI0411900B1_D0120
4-t-butilcinamoilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0121
3,4,5-trimetoxicinamoilguanidína compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0122
NH
Figure BRPI0411900B1_D0123
2-(1-Naftil)acetoilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0124
2,5-dimetilcinamoilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0125
2,3-difluorocÍnamoilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0126
F
3-fenilcinamoilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0127
Figure BRPI0411900B1_D0128
3-(trans-hept-1-en-1-il)cinamoilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0129
2-etilcinamoilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0130
Figure BRPI0411900B1_D0131
2-cloro-6-fluorocinamoilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0132
3-t-butilcinamoilguanidina compreendendo a estrutura
0 NH Ã Λ N NH2 H
h3c^ ^CH3
ch3
3,4-difluorocinamoilguanidina compreendendo a estrutura >»
Ο ΝΗ
Figure BRPI0411900B1_D0133
νη2
5-bromo-2-fluorocínamoilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0134
3“(trifluorometóxi )cinamoilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0135
NH
Figure BRPI0411900B1_D0136
NH2
2-etoxícinamoilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0137
OCH2CH3
2-t-butilcinamoilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0138
Figure BRPI0411900B1_D0139
Cloridrato de cinamoilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0140
Figure BRPI0411900B1_D0141
2,3,5,6-tetrametilcinamoilguanidina compreendendo a estrutura (Bit 134)
Figure BRPI0411900B1_D0142
Figure BRPI0411900B1_D0143
2,3-dimetilcinamoilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0144
3-etoxicinamoilguanidina compreendendo a estrutura
O NH
Figure BRPI0411900B1_D0145
cloridrato de 3-isopropilcinamoil de guanidina compreendendo a estrutura
OCH2CH3
Figure BRPI0411900B1_D0146
Figure BRPI0411900B1_D0147
Figure BRPI0411900B1_D0148
2-(ciclohex-1-en-1-ÍI)cínamoilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0149
2,4,6-trimetilcínamoilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0150
(5-Fenil-penta-2,4-dienoil)guanidina compreendendo a estrutura
O NH
Figure BRPI0411900B1_D0151
õ-^-bromofeniOpenta^Adienoilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0152
5-(2'“bromofenil)penta-2,4-dienoilguanidina compreendendo a estrutura
Figure BRPI0411900B1_D0153
Figure BRPI0411900B1_D0154
Furanacriloila compreendendo a estrutura
O NH
Figure BRPI0411900B1_D0155
Preferivelmente, os compostos da invenção são capazes de reduzir, retardar ou senão inibir o crescimento viral e/ou replicação.
Preferivelmente, a atividade antiviral dos compostos da invenção é contra viroses tais como aquelas que pertencem à família dos Lentivírus, e a família de viroses de Coronavírus. Por exemplo, os compostos da invenção exibem atividade antiviral contra viroses tais como o Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), vírus da Síndrome Respiratória Aguda Severa (SARS), vírus da Hepatite de Camundongo (), e vírus da Hepatite C (HCV).
De acordo com um quarto aspecto da presente invenção, é fornecida uma composição farmacêutica compreendendo um composto antiviral de acordo com qualquer uma do primeiro, segundo ou terceiro aspectos, e opcionalmente um ou mais veículos ou derivados farmacêuticos aceitáveis, onde o referido composto é capaz de reduzir, retardar ou senão inibir o crescimento viral e/ou replicação.
Preferivelmente, a atividade antiviral dos compostos da invenção é contra viroses tais como aqueles que pertencem à família do Lentivírus, e a família de viroses do Coronavírus. Por exemplo, os compostos da invenção exibem atividade antiviral contra viroses tais como o o Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), Vírus da Síndrome Respiratória Aguda Severa (SARS), Coronavírus humano 229E, Coronavírus humano OC43, Vírus da Hepatite de Camundongo (MHV), Coronavírus bovino (BCV), Coronavírus respiratório porcino (PRCV), Vírus da Hepatite C (HCV) e Vírus da Arterite Equina (EAV).
Outras Coronaviroses que podem ser inibidas ou suas infecções tratadas pelos compostos da invenção são aquelas listadas na Tabela 1.
As composições da invenção podem também compreender uma ou mais moléculas ou compostos antivirais conhecidos.
De acordo com um quinto aspecto, é fornecido um método para reduzir, retardar ou senão inibir o crescimento e/ou replicação de um vírus compreendendo contatar uma célula infectada com o referido vírus ou exposta ao referido vírus com um composto de acordo com qualquer um dos primeiro, segundo ou terceiro aspectos.
Preferivelmente, o vírus é da família do Lentivírus, ou da família do Coronavírus. Mais preferivelmente, o vírus é o Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), Vírus da Síndrome Respiratória Severa (SARS), Coronavírus humano 229E, Coronavírus humano OC43, Vírus da Hepatite de Camundongo (MHV), Coronavírus bovino (BCV), Coronavírus respiratório porcino (PRCV), Vírus da Hepatite de Camundongo (MHV), Vírus da Hepatite C (HCV), ou Vírus da Arterite Eqüina (EAV). Mais preferivelmente, o vírus é HIV-1, HIV-2, o vírus da SARS, Coronavirose 229E, Coronavírus OC43, PRCV, BCV, HCV, ou EAV.
Outras Coronaviroses que podem ser inibidas ou suas infecções tratadas pelos compostos da invenção são aquelas listadas na Tabela 1.
De acordo com um sexto aspecto, é fornecido um método para prevenir a infecção de uma célula exposta a um vírus compreendendo contatar a referida célula com um composto de acordo com qualquer um dos primeiro, segundo ou terceiro aspectos.
Preferivelmente, o vírus é da família do Lentivírus, ou da família do Coronavírus. Mais preferivelmente, o vírus é Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), Vírus da Síndrome Respiratória Severa (SARS), Coronavírus humano 229E, Coronavírus humano OC43, vírus de Hepatite de Camundongo (MHV), Coronavírus bovino (BCV), Coronavírus respiratório porcino (PRCV), vírus da Hepatite de Camundongo (MHV), vírus da Hepatite C (HCV), ou Vírus da Arterite Eqüina (EAV). Mais preferivelmente, o vírus é HIV-1, HIV-2, o vírus da SARS, Coronavirose 229E, Coronavírus OC43, PRCV, BCV, HCV, EAV.
Outras Coronaviroses que podem ser inibidas ou suas infecções
Figure BRPI0411900B1_D0156
Figure BRPI0411900B1_D0157
tratadas pelos compostos da invenção são aquelas listadas na Tabela 1.
De acordo com a sétimo aspecto da invenção, é fornecido um método para o tratamento terapêutico ou profilático de um indivíduo infectado com ou exposto a um vírus, compreendendo a administração de um composto de acordo com qualquer um dos primeiro, segundo ou terceiro aspectos, a um paciente em necessidade do referido tratamento.
Preferivelmente, a infecção com um vírus ou exposição a um vírus ocorre com viroses que pertencem à família do Lentivírus, ou à família do Coronavírus. Mais preferivelmente, a infecção ou exposição ocorre com HIV, SARS, Coronavírus humano 229E, Coronavírus humano OC43, Vírus da Hepatite de Camundongo (MHV), Coronavírus bovino (BCV), Coronavírus respiratório porcino (PRCV), Vírus da Hepatite C (HCV), ou Vírus da Arterite de Equino (EAV). Mais preferivelmente, a infecção ou exposição ocorre com HIV-1, HIV-2, SARS, Coronavírus humano 229E, Coronavírus humano OC43, Vírus da Hepatite C (HCV), ou Vírus da Arterite Eqüina (EAV).
Outras Coronaviroses que podem ser inibidas ou suas infecções tratadas pelos compostos da invenção são aquelas listadas na Tabela 1.
O paciente da inibição viral é geralmente um mamífero tal como, porém não limitado a animal humano, primata, e de criação (por exemplo ovelha, vaca, cavalo, asno, porco), animal de companhia (por exemplo, cão, gato), animal de teste de laboratório (por exemplo camundongo, coelho, rato, cobaia, hamster), animal silvestre cativo (por exemplo raposa, veado). Preferivelmente, o paciente é um primata, ou cavalo. Mais preferivelmente, o paciente é um ser humano.
De acordo com um oitavo aspecto, é fornecido um método de sub-regular uma atividade funcional de canal de íon de membrana em uma célula infectada com um vírus, que compreende contatar a referida célula com um composto de acordo com qualquer um do primeiro, segundo ou terceiro aspectos.
O canal de íon de membrana pode ser endógeno para a célula ou exógeno para a célula.
Preferivelmente, o canal de íon de membrana do qual a ativida-
Figure BRPI0411900B1_D0158
de funcional é sub-regulada é aquele que as Lentiviroses, e Coronaviroses utilizam para mediar replicação viral e incluem, por exemplo, o canal de íon Vpu de membrana de HIV, o canal de íon P7 de membrana de HCV, o canal de íon de membrana de proteína E de Coronavírus, e o canal de íon de membrana de proteína E de SARS.
Preferivelmente, a infecção com um vírus ou exposição a um vírus ocorre com viroses que pertencem à família Lentivírus, ou a família Coronavírus. Mais preferivelmente, a infecção ou exposição ocorre com HIV, SARS, Coronavírus humano 229E, Coronavírus humano OC43, Vírus da Hepatite de Camundongo (MHV), Coronavírus bovino (BCV), Coronavírus respiratório porcino (PRCV), Vírus da Hepatite C (HCV), ou Vírus da Arterite Eqüina (EAV). Mais preferivelmente, a infecção ou exposição ocorre com HIV-1, HIV-2, SARS, Coronavírus humano 229E, Coronavírus humano OC43, Vírus da Hepatite C (HCV), ou Vírus da Arterite Eqüina (EAV).
De acordo com um nono aspecto da presente invenção, é fornecido um método de reduzir, retardar ou ainda inibir o crescimento e/ou replicação de um vírus que infectou uma célula, o referido método compreendendo contatar a referida célula infectada com um composto de acordo com qualquer um dos primeiro, segundo ou terceiro aspectos, onde o referido composto sub-regula a atividade funcional de um canal de íon de membrana derivado do referido vírus e expresso na referida célula infectada.
Preferivelmente, a infecção ocorre com um vírus que pertence à família Lentivírus, ou a família Coronavírus. Mais preferivelmente, a infecção ou exposição ocorre com HIV, SARS, Coronavírus humano 229E, Coronavírus humano OC43, Vírus da Hepatite de Camundongo (MHV), Coronavírus bovino (BCV), Coronavírus respiratório porcino (PRCV), Vírus da Hepatite C (HCV), ou Vírus da Arterite Eqüina (EAV). Mais preferivelmente, a infecção ou exposição ocorre com HIV-1, HIV-2, SARS, Coronavírus humano 229E, Coronavírus humano OC43, Vírus da Hepatite C (HCV), ou Vírus da Arterite Eqüina (EAV).
Outras Coronaviroses que podem ser inibidas ou suas infecções tratadas pelos compostos da invenção são aquelas listadas na Tabela 1.
Figure BRPI0411900B1_D0159
3«
Preferivelmente, o canal de íon de membrana do qual a atividade funcional é sub-regulada é aquele que as Lentiviroses, e Coronaviroses utilizam para mediar a replicação viral e inclui, por exemplo, o canal de íon Vpu de membrana de HIV, o canal de íon P7 de membrana de HCV, e o canal de íon de membrana de proteína E de Coronavírus.
De acordo com décimo aspecto, a presente invenção fornece um método de reduzir, retardar ou ainda inibir o crescimento e/ou replicação de um vírus que infectou uma célula em um mamífero, o referido método compreendendo administrar ao referido mamífero um composto de acordo com qualquer um do primeiro, segundo ou terceiro aspectos, ou uma composição farmacêutica de acordo com o quarto aspecto, onde o referido composto ou referida composição sub-regula a atividade funcional de um canal de íon de membrana expresso na referida célula infectada.
Preferivelmente, a infecção ocorre com um vírus que pertence à família Lentivírus, ou a família Coronavírus. Mais preferivelmente, a infecção ou expressão ocorre com HIV, SARS, Coronavírus humano 229E, Coronavírus humano OC43, Vírus da Hepatite de Camundongo (MHV), Coronavírus bovino (BCV), Coronavírus respiratório porcino (PRCV), Vírus da Hepatite C (HCV), ou Vírus da Arterite Eqüina (EAV). Mais preferivelmente, a infecção ou exposição ocorre com HIV-1, HIV-2, SARS, Coronavírus humano 229E, Coronavírus humano OC43, Vírus da Hepatite C (HCV), ou Vírus da Arterite Eqüina (EAV).
Outras Coronaviroses que podem ser inibidas ou suas infecções tratadas pelos compostos da invenção são aquelas listadas na Tabela 1.
Preferivelmente, o canal de íon de membrana do qual a atividade funcional é sub-regulada, é aquele que as Lentiviroses, e Coronaviroses utiliza para mediar a replicação viral e inclui, por exemplo, o canal de íon Vpu de membrana de HIV, o canal de íon P7 de membrana de HCV, e o canal de íon de membrana de proteína E de Coronavírus.
O paciente da inibição viral é geralmente um mamífero tal como, porém não limitado a animal humano, primata, ou de criação (por exemplo ovelha, vaca, cavalo, asno, porco), animal de companhia (por exemplo, cão, gato), animal de teste de laboratório (por exemplo camundongo, coelho, rato, cobaia, hamster), animal silvestre cativo (por exemplo raposa, veado). Preferivelmente, o paciente é um primata, ou cavalo. Mais preferivelmente, o paciente é um ser humano.
De acordo com um décimo primeiro aspecto, a presente invenção fornece um método para o tratamento terapêutico ou profilático de um paciente infectado com ou exposto a um vírus compreendendo administrar ao referido paciente um composto de acordo com qualquer um dos primeiro, segundo ou terceiro aspectos, ou uma composição farmacêutica de acordo com o quarto aspecto, onde o referido composto ou referida composição sub-regula a atividade funcional de um canal de íon de membrana derivado do referido vírus.
Preferivelmente, a infecção ocorre com um vírus que pertence à família Lentivírus, ou a família de viroses de Coronavírus. Mais preferivelmente, a infecção ou exposição ocorre com HIV, SARS, Coronavírus humano 229E, Coronavírus humano OC43, Vírus da Hepatite de Camundongo (MHV), Coronavírus bovino (BCV), Coronavírus respiratório porcino (PRCV), Vírus da Hepatite C (HCV), ou Vírus de Arterite Eqüina (EAV). Mais preferivelmente, a infecção ou a exposição ocorre com HIV-1, HIV-2, SARS, Coronavírus humano 229E, Coronavírus humano OC43, Vírus da Hepatite C (HCV), ou Vírus da Arterite Eqüina (EAV).
Outras Coronaviroses que podem ser inibidas ou suas infecções tratadas pelos compostos da invenção são aquelas listadas na Tabela 1.
Preferivelmente, o canal de íon de membrana do qual a atividade funcional é sub-regulada é aquele que as Lentiviroses, e Coronaviroses utilizam para mediar a replicação viral e inclui, por exemplo, o canal de íon Vpu de membrana de HIV, o canal de íon P7 de membrana de HCV, e o canal de íon de membrana de proteína E de Coronavírus.
O paciente da inibição viral é geralmente um mamífero tal como, porém não limitado a animal humano, primata, ou de criação (por exemplo ovelha, vaca, cavalo, asno, porco), animal de companhia (por exemplo, cão, gato), animal de teste de laboratório (por exemplo camundongo, coelho, rato, cobaia, hamster), animal silvestre cativo (por exemplo raposa, veado). Preferivelmente, o paciente é um primata, ou cavalo. Mais preferivelmente, o paciente é um ser humano.
De acordo com um décimo-segundo aspecto, a invenção fornece um composto antiviral selecionado do grupo consistindo em:
N-(3,5-Diamino-6-cloro-pirazina-2-carbonil)-N’-fenil-guanidina, N-Benzil-N'-(3,5-diamino-6-cloro-pirazina-2-carbonil)-guanidina, 3'4 DicloroBenzamila,
2'4 DicloroBenzamila,
5-(N-metil-N-guanidinocarbonil-metil)amilorida,
5-(N-Metil-N-isobutil)amilorida,
5-(N-Etil-N-isopropil)amilorida,
Cloridrato de 5-(N,N-Dimetil)amilorida,
5- (N,N-hexametileno)amilorida,
Cloridrato de 5-(N,N-Dietil)amilorida,
6- lodoamilorida,
Amilorida de Bodipi-FL,
3-hidróxi-5-hexametilenoimino-amilorida,
5-(4-fluorofenil)amilorida,
5- terc-butilamino-amilorida,
N-amidino-3-amino-5-fenil-6-cloro-2-pirazinacarboxamida, 3-metóxi-5-(N,N-Hexametileno)-amilorida,
3-metóxi-amilorida, hexametilenoimino-6-fenil-2-pirazinacarboximida, N-amidino-3,5-diamino-6-fenil-2-pirazinacarboxamida,
1- naftoilguanidina,
2- naftoilguanidina,
N-(2-naftoil)-N’-fenilguanidina,
N,N'-bis(2-naftoil)guanidina,
N,N'-bis(1-naftoil)guanidina,
N,N'-bis(2-naftoil)-N-fenilguanidina,
6- metóxi -2-naftoilguanidina,
3- quinolinoilguanidina, cinamoilguanidina,
4- fenilbenzoilguanidina, N-(cinamoil)-NTenílguanidina, (3-fenilpropanoil)guanidina, N,N’-bis-(cinamoil)-N-fenilguanidina, N-(3-fenilpropanoil)-N'-fenilguanidina, N,N'-bis(3-fenilpropanoil)-N-fenilguanidina, trans-3-furanacriloilguanidina,
N-(6-hidróxi- 2-naftoil)-N’-fenilguanidina, (4-Fenoxibenzoil)guanidina,
N.N-BisíamidinoJnaftaleno^e-dicarboxarnida,
N-Cinamoil-N,N'-difenilguanidina, (Fenilacetil)guanidina, N,NM3is(3-fenilpropanoil)guanidina, benzoilguanidina, (4-Clorofenóxi-acetil]guanidina, N-benzoil-N-cinamoilguanidina, [(E)-3-(4-Dimetilaminofenil)-2-metilacriloil]guanidina, (4-Clorocinamoil)guanidina, (4-Bromocinamoil)gtianidina, (4-Metoxicinamoil)guanidina, (5-Fenil-penta-2,4-dienoil)guanidina, (3-Bromocinamoil)guanidina, (3-Metoxicinamoil)guanidina, (3-Clorocinamoil)guanidina, (2-Clorocinamoil)guanidina, (2-Bromocinamoil)guanidina, (2-Metoxicinamoil)guanidina, (trans-2-Fenilciclopropanocarbonil)guanidina, [3-(3-Piridil)acriloil]guanidina, (4-Hidroxicinamoil)guanidina,
PL (Quinolina-2-carbonil)guanidina, ou os sais farmaceuticamente aceitáveis destes.
De acordo com um décimo-terceiro aspecto, uma presente invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo um composto de acordo com o décimo-segundo aspecto, e opcionalmente um ou mais
Figure BRPI0411900B1_D0160
veículos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis.
Preferivelmente, uma composição farmacêutica pode também compreender uma ou mais moléculas ou compostos antivirais conhecidos.
A menos que o contexto claramente requeira de outro modo, em toda a descrição e nas reivindicações, as palavras ’comprende’, 'compreendendo', e as similares devem ser construídas em um sentido inclusive como oposto a um sentido exclusivo ou exaustivo; o que quer dizer, no sentido de incluindo, porém não limitado a.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Figura 1 é uma representação esquemática de plasmídeos empregados para a expressão de Vpu em E. coli. A. A seqüência de aminoácido ( < 400 > 1) codificada pela estrutura de leitura aberta vpu (ORF) gerada por PCR de um clone de cDNA de cepa HXB2 de HIV- 1. A ORF de vpu foi clonada em estrutura na extremidade 3' do gene GST em p2GEX para gerar p2GEXVpu (B). Ela foi subsequentemente clonada em pPL451 para produzir o plasmideo pPL + Vpu (C).
Figura 2 é uma representação fotográfica da expressão e purificação de Vpu em E. coli. A. Western blotting após SDS-PAGE foi empregado para detectar o Vpu expresso em extratos de E. coli. Faixas 1-4 contêm amostras, em vários estágios de pureza, de Vpu expresso de p2GEXVpu: faixa 1, proteína de fusão GST-Vpu Isolada por cromatografia de afinidade de glutationa-agarose; faixa 2, Vpu liberada da proteína de fusão por tratamento com trombina; faixa 3, Vpu purificada por cromatografia de permuta de ânton de HPLC; faixa 4, Vpu após a passagem através da coluna de imunoafinidade. Faixas 5 e 6, vesículas de membrana preparadas de células induzidas por 42'C contendo pPL+Vpu ou pPL451, respectivamente. B. gel de SDS-PAGE manchado de prata: faixa 1, Vpu purificada por cromatografia de permuta de ânion de HPLC; faixa 2, Vpu após passagem através da coluna de imunoafinidade.
Figura 3 é uma representação gráfica de atividade de canal de íon observada após exposição de bicamadas de lípídeo à alíquotas contendo Vpu purificada. Em A e B, a câmara CIS continha 500 mM de NaCI e a câmara TRANS continha 50 mM de NaCI; ambas as soluções foram tamponadas em pH 6,0 com 10 mM de MES. B mostra uma curva de voltagem versus corrente gerada de dados similares àqueles mostrados em A.
Figura 4 é uma representação fotográfica de ensaios de alimentação cruzada bacteriana. Para todas as placas, a linhagem Met‘, Pro“ auxotrófica foi empregada para semear uma cobertura de ágar macia. As Placas A e B contêm um meio de gota mínima prolina negativa; em placa C o meio foi metionina negativa. Para controlar a viabilidade das células no tecido de base, os discos rotulados P e M continham prolina ou metionina adicionado, respectivamente. Os discos rotulados C e V foram inoculados com células de E. coli Met+, Pro+ contendo os plasmídeos pPL451 ou pPL+Vpu, respectivamente. As placas foram incubadas a 37°C (A e C) ou 30°C (B) durante dois dias e fotografadas acima de uma base preta com iluminação periférica de uma luz fluorescente localizada abaixo da placa. As imagens foram registradas sobre um sistema de documentação de gel de vídeo de Novalina. Halos de luz em torno dos discos rotulados por P ou M sobre todas as placas e em torno do disco rotulado V sobra a placa A indicam o crescimento da cepa de tecido de base.
Figura 5 é uma representação gráfica da avaliação de drogas para os bloqueadores de canal de Vpu potencial. A fotografia mostra uma seção de uma placa de adenina - agarose sem meio de cultura mínimo sobre a qual um tecido de células de E. coli XL-l-azuis contendo o plasmídeo pPLVpu de expressão de Vpu foi semeado. Os números 6-11 são localizados nos sítios de aplicação de várias drogas que estão sendo testadas, que foram aplicadas em gotas de 3 μΙ e deixadas embeber na agarose. A placa foi então incubada a 37°C durante 48 horas antes de ser fotografada. A totalidade cinza de base corresponde às áreas de nenhum crescimento bacteri36 ano. A área circular brilhante em torno 10 representa o crescimento de célula bacteriana como um resultado de aplicação de adenina naquela localização (controle positivo). O menor halo de crescimento bacteriano em torno 9 é devido à aplicação de 5-(N,N-hexametileno)-amilorida naquela localização.
Figura 6. A atividade de canal de íon de proteína E de SARS observada em soluções de NaCl após a exposição de bicamada de lipídeo à 3-10 pg de proteína E. A. O estado fechado é mostrado como linha sólida, as aberturas são derivações da linha. A barra de escala é de 300 ms e 5pA. A câmara CIS continha 50 mM de NaCl em 5mM de tampão de HEPES pH 7,2, a câmara TRANS continha 500 mM de NaCl em 5 mM de tampão de HEPES pH 7,2. A câmara CIS foi enterrada e a câmara TRANS foi mantida em vários potenciais entre -100 a +100 mV. B. Eventos de abertura única maior de um único canal.
Figura 7. A atividade de canal de íon de proteína E de SARS observada em soluções de NaCl após a exposição de bicamada de lipídeo a 3-10 pg de proteína E. A. O estado fechado é mostrado como linha sólida, aberturas são derivações da linha. A barra de escala é de 300 ms e 5 pA. A câmara CIS continha 50 mM de NaCl em 5 mM de tampão de HEPES pH 7,2, a câmara TRANS continha 500 mM de NaCl em 5 mM de tampão de HEPES pH 7,2. A câmara CIS foi enterrada e a câmara TRANS foi mantida em vários potenciais entre -100 a +100mV. B. Eventos de abertura única maior de um único canal.
Figura 8. Cinamoiíguanidina (Bit036) inibe a atividade de canal de íon de proteína E de SARS em solução de NaCl. A. Correntes representativas em manutenção do potencial de -40mV. A barra de escala é de 300 mS e 5pA. A atividade de canal de íon de proteína E e a atividade de canal de proteína E após a adição de 100 pM de Bit036. B. Todo o histograma de pontos em manutenção do potencial de -40mV. A atividade de canal de íon de proteína E antes e após a adição de 100 pM Bit036. C. A corrente média (pA), antes da formação de canal de íon de proteína E, atividade de canal de íon de proteína E e após a adição de 100 pM Bit036.
Figure BRPI0411900B1_D0161
Figura 9. Atividade de canal de íon de proteína E 229E em bicamadas de lipídeo em soluções de KCI.
Figura 10: Parte A mostra correntes brutas geradas pelo canal de íon de proteína E 229E em uma bicamada de lipídeo planar. O traço de topo mostra a atividade corrente antes da adição de droga e o traço inferior mostra o efeito de adição de 100 μΜ de cinamoilguanidina sobre a atividade de canal. Parte B é uma representação gráfica da corrente média seguindo através da bicamada (em unidades arbitrárias), antes e após a adição de cinamoilguanidina.
Figure BRPI0411900B1_D0162
Figura 11: Atividade de canal de íon de proteína E MHV em soluções de NaCI de bicamadas de lipídeo.
Figura 12: Parte A mostra correntes brutas geradas pelo canal de íon de proteína E MHV-E em uma bicamada de lipídeo planar. O traço de topo mostra a atividade de corrente antes da adição de droga e o traço inferior mostra o efeito de adição de 100 μΜ de cinamoilguanidina sobre a atividade de canal. Parte B é uma representação gráfica da corrente média seguindo através da bicamada (em unidades arbitrárias), antes e após a adição de cinamoilguanidina.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção é com base, em parte, na determinação surpreendente de que certos compostos que incluem-se sob a classificação de acilguanidinas substituídas que têm atividade antiviral contra viroses de uma faixa de famílias de vírus diferentes. Sem pretender ser ligado por qualquer teoria ou mecanismo de ação particular, o impacto negativo dos compostos da presente invenção sobre a replicação viral pode ser mediado pela inibição ou ainda sub-regulação de um canal de íon de membrana considerada pelo vírus para replicação. Este canal de íon de membrana pode ser um canal de íon de membrana viral (exógeno para a célula hospedeira) ou um canal de íon de célula hospedeira induzida como um resultado de infecção viral (endógeno para a célula hospedeira).
Como um exemplo, os compostos da presente invenção podem inibir a função de Vpu ou p7 e desse modo inibir a continuação do ciclo de vida de HIV ou HCV respectivo.
O vírus de SARS codifica uma proteína E que é mostrada pela primeira vez, pelos presente inventores, para agir como um canal de íon. Como proteínas E similares estão presente em outras coronaviroses, os 5 compostos, composições e métodos da presente invenção terão utilidade na inibição e/ou tratamento de infecções por outras coronaviroses.
Ao mesmo tempo que a presente invenção é concernida com novos compostos antivirais incluindo-se sob a classificação de acilguanidinas substituídas, ela não inclui em seu escopo o uso de compostos 5-(N,N10 hexametileno)amilorida e 5-(N,N-dimetil)-amilorida para retardar, reduzir ou de outro modo inibir o crescimento viral e/ou atividade funcional de HIV.
Figure BRPI0411900B1_D0163
Será entendido por aqueles versados na técnica que os compostos da invenção podem ser administrados na forma de uma composição ou formulação compreendendo veículos ou excipientes farmaceuticamente a15 ceitáveis.
As composições farmacêuticas da invenção podem também compreender uma ou mais moléculas ou compostos antivirais conhecidos. Preferivelmente, os compostos antivirais conhecidos são selecionados do grupo consistindo em Vidarabina, Aciclovir, Ganciclovir, Valganciclovir, Vala20 ciclovir, Cidofovir, Famciclovir, Ribavirina, Amantadina, Rimantadina, Interferon, Oseltamivir, Palivizumab, Rimantadina, Zanamivir, inibidores de transcriptase reversa de análogo de nucleosídeo (NRTI) tais como Zidovudina, Didanosina, Zalcitabina, Stavudina, Lamivudina e Abacavir, inibidores de transcriptase reversa de não nucleosídeo (NNRTI) tais como Nevirapina, 25 Delavirdina e Efavirenz, inibidores de protease tais como Saquinavir, Ritonavir, Indinavir, Nelfinavir, Amprenavir, e outros compostos e preparações antivirais conhecidas. Os compostos ou moléculas antivirais conhecidos podem em alguns casos agir sinergicamente com os compostos antivirais da invenção.
Tabela 1. Isolados de coronavírus conhecidos.
Grupo 1 espécie
Coronavírus canino
Coronavírus entérico canino (cepa INSAVC-1)
Coronavírus entérico canino (cepa K378)
Coronavírus felino
Coronavírus entérico felino (cepa 79-1683)
Vírus da peritonite infecciosa felina (FIPV)
Coronavírus humano 229E
Vírus da diarréia epidêmica porcina
Vírus da diarréia epidêmica porcina (cepa Br1/87)
Vírus da diarréia epidêmica porcina (cepa CV777)
Vírus da gastroenterite transmissível
Coronavírus respiratório porcino
Coronavírus de gastroenterite transmissível porcino (cepa FS772/70)
Coronavírus de gastroenterite transmissível porcino (cepa Míller)
Coronavírus de gastroenterite transmissível porcino (cepa Neb72-RT)
Coronavírus de gastroenterite transmissível porcino (cepa PURDUE)
Grupo 2 espécie
Coronavírus bovino
Coronavírus bovino (cepa F15)
Coronavírus bovino (cepa G95)
Coronavírus bovino (cepa L9)
Coronavírus bovino (cepa LSU-94LSS-051)
Coronavírus bovino (cepa LY-138)
Coronavírus bovino (cepa MEBUS)
Coronavírus bovino (cepa OK-0514-3)
Coronavírus bovino (cepa Ontarío)
Coronavírus bovino (cepa QUEBEC)
Coronavírus bovino (cepa VACINA)
Coronavírus entérico bovino (cepa 98TXSF-110-ENT)
Coronavírus respiratório canino
Coronavírus entérico de frango
Coronavírus humano OC43
Vírus da hepatite murina
Figure BRPI0411900B1_D0164
Coronavírus murino (cepa DVIM)
Vírus da hepatite murina (cepa A59)
Vírus da hepatite murina (cepa JHM)
Vírus da hepatite murina (cepa S)
Vírus da hepatite murina cepa 1
Vírus da hepatite murina cepa 2
Vírus da hepatite murina cepa 3
Vírus da hepatite murina cepa 4
Vírus da hepatite murina cepa ML-11
Vírus da encefalomielite hemaglutinante porcina
Vírus da encefalomielite hemaglutinante porcina (cepa 67N)
Vírus da encefalomielite hemaglutinante porcina (cepa IAF-404)
Vírus da pufinose
Coronavírus de rato
Coronavírus de rato (cepa 681)
Coronavírus de rato (cepa NJ)
Coronavírus sialodacríoadenite de rato
Grupo 3 espécie
Coronavírus de peru
Coronavírus de peru (cepa Indiana)
Coronavírus de peru (cepa Minnesota)
Coronavírus de peru (cepa NC95)
Vírus da bronquite infecciosa aviária
Vírus da bronquite infecciosa aviária (cepa 6/82)
Vírus da bronquite infecciosa aviária (cepa Arkansas 99)
Vírus da bronquite infecciosa aviária (cepa Beaudette CK)
Vírus da bronquite infecciosa aviária (cepa Beaudette M42)
Vírus da bronquite infecciosa aviária (cepa Beaudette US)
Vírus da bronquite infecciosa aviária (cepa Beaudette)
Vírus da bronquite infecciosa aviária (cepa D1466)
Vírus da bronquite infecciosa aviária (cepa D274)
Vírus da bronquite infecciosa aviária (cepa D3896)
Vírus da bronquite infecciosa aviária (cepa D41)
Vírus da bronquite infecciosa aviária (cepa DE072)
Vírus da bronquite infecciosa aviária (cepa GRAY)
Figure BRPI0411900B1_D0165
Vírus da bronquite infecciosa aviária (cepa H120)
Vírus da bronquite infecciosa aviária (cepa H52)
Vírus da bronquite infecciosa aviária (cepa KB8523)
Vírus da bronquite infecciosa aviária (cepa M41)
Vírus da bronquite infecciosa aviária (cepa PORTUGAL/322/82)
Vírus da bronquite infecciosa aviária (cepa SAIB20)
Vírus da bronquite infecciosa aviária (cepa UK/123/82)
Vírus da bronquite infecciosa aviária (cepa UK/142/86)
Vírus da bronquite infecciosa aviária (cepa UK/167/84)
Vírus da bronquite infecciosa aviária (cepa UK/183/66)
Vírus da bronquite infecciosa aviária (cepa UK/68/84)
Vírus da bronquite infecciosa aviária (cepa V18/91)
Vírus da bronquite infecciosa aviária (cepa Vic S)
Vírus da laringotraqueíte infecciosa aviária
Grupo preliminar 4 espécie
Coronavírus SARS
Coronavírus SARS Beijing ZY-2003
Coronavírus SARS BJ01
Coronavírus SARS BJ02
Coronavírus SARS BJ03
Coronavírus SARS BJ04
Coronavírus SARS CUHK-Su10
Coronavírus SARS CUHK-W1
Coronavírus SARS Frankfurt 1
Coronavírus SARS GZ01
Coronavírus SARS HKU-39849
Coronavírus SARS Hong Kong ZY-2003
Coronavírus SARS Hong Kong/03/2003
Coronavírus SARS HSR 1
Coronavírus SARS Sin2500
Coronavírus SARS Sin2677
Coronavírus SARS Sin2679
Coronavírus SARS Sin2748
Coronavírus SARS Sin2774
Coronavírus SARS Taiwan
Figure BRPI0411900B1_D0166
Coronavírus SARS Taiwan JC-2003
Coronavírus SARS Taiwan TC1
Coronavírus SARS Taiwan TC2
Coronavírus SARS Tor2
Coronavírus SARS TW1
Coronavírus SARS TWC
Coronavírus SARS Urbani
Coronavírus SARS Vietnam
Coronavírus SARS ZJ-HZ01
Coronavírus SARS ZJ01
coronaviroses não classsificadas
Coronavírus respiratório bovino (cepa 98TXSF-110-LUN)
Coronavírus entérico humano 4408
Coronavírus entérico
Coronavírus eqüino
Coronavírus eqüino NC99
As presente observações e descobertas atualmente permitem o
Figure BRPI0411900B1_D0167
uso de agentes tais como certas acilguanidinas substituídas, como agentes antivirais para a terapia e profilaxia de condições virais causadas por diferentes viroses. Os métodos e composições da presente invenção podem ser 5 particularmente eficazes contra viroses que contam com a formação de canal de íon para sua replicação, entretanto será entendido que este não é o único mecanismo considerado pelas viroses para replicação e que os compostos e métodos da presente invenção não estão limitados a agentes que exercem sua ação retardando ou inibindo a função de canais de íon.
Referência a canal de íon de membrana deve ser entendido como uma referência a uma estrutura que transporta íons através de uma membrana. A presente invenção estende-se a canais de íon que podem funcionar por meios tais como passivo, osmótico, ativo ou transporte por permuta. O canal de íon pode ser formado por meios intracelulares ou extracelula15 res. Por exemplo, o canal de íon pode ser um canal de íon que é naturalmente formado por uma célula para facilitar seus funcionamento normal. Alternativamente, o canal de íon pode ser formado por meios extracelulares. Os meios extracelulares incluem, por exemplo, a formação de canais de íon devido à químicas introduzidas, drogas ou outros agentes tais como ionoforos ou devido à atividade funcional de proteínas virais codificadas por um vírus que penetrou em uma célula.
Os canais de íon que são objeto de certas modalidades da presente invenção facilitam o transporte de íons através das membranas. A referida membrana pode ser qualquer membrana e não está limitada à membrana de plasma de parece celular externa. Conseqüentemente, membrana como aqui empregado abrange a membrana que circunda qualquer organela celular, tal como os aparatos de Golgi e o retículo endoplásmico, a membrana celular externa, a membrana que circunda qualquer antígeno estranho que está localizado dentro da célula (por exemplo, um envelope viral) ou a membrana de um organismo estranho que está localizado extracelularmente. A membrana é tipicamente, porém não necessariamente, composta de uma bicamada de lipídeo de fluído. O canal de íon objeto pode ser de qualquer estrutura. Por exemplo, o canal de íon Vpu é formado por Vpu que é uma proteína de membrana que é uma proteína de membrana integral codificada por HIV-1 que associa-se com, por exemplo, as membranas de retículo endoplásmico e Golgi e membranas de retículo endoplásmico de células infectadas. A referência a seguir a canais de íon de Vpu é uma referência a todos os canais de íon relacionados por exemplo P7 HCV e M2 de influenza e similares.
Referência a HIV, SARS, Coronavírus ou HCV deve ser entendida como uma referência a qualquer linhagem de vírus de HIV, SARS, Coronavírus ou HCV e que inclui homólogos e mutantes.
A referência à atividade funcional de um canal de íon deve ser entendida como uma referência a qualquer uma ou mais das funções que um canal de íon realiza ou está envolvido. Por exemplo, o canal de íon codificado por proteína Vpu, além de facilitar o transporte de Na+, K+, Cl' e POX, também desempenha um papel na degradação da molécula de CD4 no retículo endoplásmico. Sem desejar ser ligado por uma teoria particular, o canal de íon codificado por proteína Vpu é também pensado desempenhar um papel na mediação do ciclo de vida de HIV. A presente invenção não está limi44 tada ao tratamento de infecção de HIV por meio do mecanismo de inibição do ciclo de vida de HIV e, em particular, replicação de HIV. De preferência, a presente invenção deve ser entendida abranger qualquer mecanismo pelo qual os compostos da presente invenção exercem sua atividade antiviral e 5 podem incluir a inibição de viabilidade de HIV ou atividade funcional. Isto também aplica-se a HCV, Coronaviruses, e a outras viroses.
Referência à atividade funcional de um vírus deve ser entendido como uma referência de qualquer uma ou mais das funções que um vírus realiza ou está envolvido.
Referência à replicação viral deve ser entendido incluir qualquer um ou mais estágios ou aspectos do ciclo de vida viral, tal como inibindo o agrupamento de ou liberação de virions. A mediação de canal de íon de replicação viral pode ser por meios diretos ou indiretos. A referida mediação de canal de íon é por meio direto se o canal de íon interage diretamente com 15 o virion em qualquer um ou mais de seus estágios do ciclo de vida. A referida mediação de canal de íon é indireta se ele interage com uma molécula exceto aquelas do virion, que outra molécula diretamente ou indiretamente modula qualquer um ou mais aspectos ou estágios do ciclo de vida viral. Conseqüentemente, o método da presente invenção abrange a mediação de 20 replicação viral por meio da indução de uma cascata de etapas que induz à mediação de qualquer um ou mais aspectos ou estágios do ciclo de vida viral.
Referência à sub-regulação* da atividade funcional de canal de íon, deve ser entendido como uma referência à inibição parcial ou completa 25 de qualquer um ou mais aspectos da referida atividade por ambos os mecanismos direto e indireto. Por exemplo, um agente adequado pode interagir diretamente com um canal de íon para prevenir a replicação de um vírus ou, alternativamente, pode agir indiretamente para prevenir a referida replicação, por exemplo, interagindo com uma molécula exceto um canal de íon. Uma 30 outra alternativa é que a referida outra molécula interage com e inibe a atividade do canal de íon.
Avaliação quanto à moléculas que têm atividade antiviral pode ser obtida pelo âmbito de metodologias aqui descritas.
Referência à uma célula infectada com um vírus deve ser en-
Figure BRPI0411900B1_D0168
tendida como um referência a qualquer célula, procariótica ou eucariótica, que foi infectada com um vírus. Isto inclui, por exemplo, linhagens de célula imortal ou primária, culturas bacterianos e células in situ. em um sistema de avaliação adequada para compostos antivirais, as células infectadas preferidas seriam macrófagos/monócitos ou hepatócitos/células linfóides infectadas com HIV ou HCV respectivamente.
Sem limitar a presente invenção a qualquer teoria ou modo de ação, os compostos da presente invenção são pensados inibir a replicação viral ou liberação de virion de células causando os canais de íon, a saber VPU de HIV, a proteína E de SARS e outras Coronaviroses, ou P7 de HCV tornarem-se bloqueadas. A presente invenção abrange os compostos antivirais que são acilguanidinas substituída.
A presente invenção também inclui o uso de compostos 5-(N,Nhexametileno)amilorida e 5-(N,N-dirnetil)-amilorida no controle de crescimento e/ou replicação viral exceto HIV.
O objeto da inibição viral é geralmente um mamífero tal como porém não limitado a ser humano, primata, animal de criação (por exemplo ovelha, vaca, cavalo, asno, porco), animal de companhia (por exemplo cão, gato), animal de teste de laboratório (por exemplo camundongo, coelho, rato, cobaia, hamster), animal silvestre cativo (por exemplo raposa, veado). Preferivelmente, o paciente é um ser humano ou primata. Mais preferivelmente, o paciente é um ser humano.
O método da presente invenção é útil no tratamento e profilaxia de infecção viral tal como, por exemplo, porém não limitado à infecção de HIV, infecção de HCV e outras infeções vira is. Por exemplo, a atividade antiviral pode ser realizada em pacientes conhecidos estarem infectados com HIV a fim de prevenir a replicação de HIV desse modo prevenindo o início de AIDS. Alternativamente, o método da presente invenção pode ser empregado para reduzir a carga viral de soro ou aliviar os sintomas da infecção viral. Similarmente, o tratamento antiviral pode ser realizado em pacientes conhe46 cidos estarem infectados com, por exemplo, HCV, a fim de prevenir a replicação de HCV, desse modo prevenindo o outro envolvimento de hepatócito e a geração final de tecido de fígado.
O método da presente invenção pode ser particularmente útil ou nos estágios mais precoces de infecção viral para prevenir o estabelecimento de um reservatório viral em células afetadas ou como um tratamento profilático a ser aplicado imediatamente antes de ou durante um período após a exposição a uma possível fonte de vírus.
Referência aqui a terapêutico e profilático deve ser considerado em seus contextos mais amplos. O termo terapêutico não necessariamente implica que um mamífero seja tratado até recuperação total. Similarmente, profilático não necessariamente significa que o paciente não contrairá eventualmente uma condição de doença. Conseqüentemente, a terapia e profilaxia inclui a melhora dos sintomas de uma condição particular ou prevenção ou de outro modo reduzindo o risco de desenvolver uma condição particular. O termo profilaxia pode ser considerado como reduzindo a severidade do início de um condição particular. A terapia pode também reduzir a severidade de uma condição existente ou a freqüência de ataques agudos.
De acordo com os métodos da presente invenção, mais do que um composto ou composição podem ser co-administrados com um ou mais outros compostos, tais como compostos antivirais conhecidos ou moléculas. Por co-administrado entende-se a administração simultânea na mesma formulação ou em duas formulações diferentes por meio da mesma ou diferentes vias ou administração seqüencial pela mesma ou diferentes vias. Por administração seqüencial entende-se uma diferencia de tempo de segundos, minutos, horas ou dias entre a administração dos dois ou mais compostos. Os compostos antivirais objeto podem ser administrados em qualquer ordem.
As vias de administração incluem, porém não estão limitadas a intravenosamente, intraperitonealmente, subcutaneamente, intracranialmente, intradermicamente, intramuscularmente, intraocularmente, intratecalmente, íntracerebralmente, intranasalmente, transmucosalmente, por infusão,
Figure BRPI0411900B1_D0169
oral mente, retal mente, por meio de goteja mento iv, emplastro e implante. As vias íntravenosas são particularmente preferidas.
Figure BRPI0411900B1_D0170
As composições adequadas para uso injetável incluem soluções aquosas estéreis (onde água solúvel) e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções injetáveis estéreis. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietileno glicol líquido, e similares), misturas adequadas destes e óleos vegetais. A prevenção da ação de microorganismos pode ser feita por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, tirmerosal e similares. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser realizada pelo uso nas composições de agentes que retardam a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.
Soluções injetáveis estéreis são preparadas incorporando-se os compostos ativos na quantidade requerida no solvente apropriado com vários dos outros ingredientes enumerados acima, como requerido, seguido por exemplo, por esterilização de filtro ou esterilização por outros métodos apropriados. Dispersões são também contempladas e estas podem ser preparadas incorporando-se os vários ingredientes ativos esterilizados em um veículo estéril que contém o meio de dispersão básica e os outros ingredientes requeridos daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, um método preferido de preparação inclui secagem a vácuo e a técnica de secagem por congelamento que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional de uma solução de filtrado previamente estéril.
Quando os ingredientes ativos são adequadamente protegidos, eles podem ser oralmente administrados, por exemplo, com um diluente inerte ou com um veículo comestível assimilável, ou ele pode ser incluído em cápsula de gelatina de casca dura ou macia, ou ele pode ser prensado em comprimidos. Para administração terapêutica oral, o composto ativo pode ser incorporado com excipientes e empregados na forma de comprimidos ingeríveis, comprimidos bucais, trocíscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, wafers, e similares. Tais composições e preparações devem conter pelo menos 0,01% em peso, mais preferivelmente 0,1% em peso, ainda
Figure BRPI0411900B1_D0171
mais preferivelmente 1% em peso de composto ativo. A percentagem das composições e preparações pode, de fato, ser variada e pode convenientemente estar entre cerca de 1 a cerca de 99%, mais preferivelmente cerca de a cerca de 90%, ainda mais preferivelmente cerca de 5 a cerca de 80% do peso da unidade. A quantidade de composto ativo em tais composições terapeuticamente úteis tal que uma dosagem adequada seja obtida. As composições ou preparações preferidas de acordo com a presente invenção são preparadas de modo que uma forma de unidade de dosagem oral contenha entre cerca de 0,1 ng e 2000 mg de composto ativo.
Os comprimidos, trociscos, pílulas, cápsulas e similares podem também conter os componentes como a seguir listados: Um aglutinante tal como goma acácia, amido de milho ou gelatina; excipientes tais como fosfato de dicálcio; um agente desintegrante tal como amido de milho, amido de batata, ácido algínico e similares; um lubrificante tal como estearato de magnésio; e um agente adoçante tal como sacarose, lactose ou sacarina pode ser adicionado ou um agente flavorizante tal como sabor de hortelã-pimenta, óleo de gualtéria, ou cereja. Quando a forma de unidade de dosagem é uma cápsula, ela pode conter, além de materiais do tipo acima, um veículo líquido. Vários outros materiais podem estar presente como revestimentos ou para de outro modo modificar a forma física da unidade de dosagem. Por exemplo, comprimidos, pílulas, ou cápsulas podem ser revestidas com goma-laca, açúcar ou ambos. Um xarope ou elixir pode conter o composto ativo, sacarose como um agente adoçante, metila e propilparabenos como conservantes, um pigmento e flavorizante tal como sabor de cereja ou laranja. Qualquer material empregado em preparação de qualquer forma de unidade de dosagem deve ser farmaceuticamente pura e substancialmente não tóxica nas quantidades empregadas. Além disso, o(s) composto(s) ativo(s) pode(m) ser incorporado(s) em preparações e formulações de liberação sustentada.
A presente invenção também estende-se a formas adequadas para aplicação tópica tal como cremes, loções e géis. Em tais formas, os peptídeos anti-coágulo podem precisar ser modificados para permitir a penetração da barreira de superfície. Os procedimentos para a preparação de formas de unidade de dosagem e preparações tópicas são facilmente disponíveis para aqueles versados na técnica de textos tais como Pharmaceutical Handbook. A Martindale Companion Volume Ed. Ainfey Wade Nineteenth Edition The Pharmaceutical Press London,
Figure BRPI0411900B1_D0172
CRC Handbook of Chemistry e Physics Ed. Robert C. Weast Ph D. CRC Press Inc.; Goodman e Gilman's; The Pharmacological basis of Terapêuticos. Ninth Ed. McGraw Hill; Remington; e The Science e Practice of Pharmacy. Nineteenth Ed. Ed. Alfonso R. Gennaro Mack Publishing Co.
Easton Pennsylvania.
Os veículos e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis incluem quaisquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardamento da absorção e similares. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecido na técnica. Exceto a medida em que quaisquer meios convencionais ou agente é incompatível com o ingrediente ativo, o uso deste nas composições terapêuticas é contemplado. Ingredientes ativos suplementares podem também ser incorporados nas composições.
É especialmente vantajoso formular composições parenterais em forma de unidade de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A forma de unidade de dosagem como aqui empregado refere-se à unidades fisicamente discretas ajustadas como dosagens unitárias para os pacientes mamíferos a serem tratados; cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de material ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico requerido. A especificação para as novas formas de unidade de dosagem da invenção é ditada por e diretamente dependente das características incomparáveis do material ativo e o efeito terapêutico particular a ser obtido e (b) as limitações inerentes na técnica de composição.
Quantidades efetivas contempladas pela presente invenção variarão dependendo da severidade da dor e da saúde e idade do receptor. Em termos gerais, quantidades efetivas podem variar de 0,01 ng/kg de peso corporal a cerca de 100 mg/kg de peso corporal.
Quantidades alternativas incluem para cerca de 0,1 ng/kg de peso corporal a cerca de 100 mg/kg de peso corporal ou de 1,0 ng/kg de peso corporal a cerca de 80 mg/kg de peso corporal.
O objeto da inibição viral é geralmente um mamífero tal como porém não limitado a ser humano, primata, animal de criação (por exemplo ovelha, vaca, cavalo, asno, porco), animal de companhia (por exemplo cão, gato), animal de teste de laboratório (por exemplo camundongo, coelho, rato, cobaia, hamster), animal silvestre cativo (por exemplo raposa, veado). Preferivelmente, o paciente é um ser humano ou primata. Mais preferivelmente, o paciente é um ser humano.
Os métodos da presente invenção são úteis no tratamento e profilaxia de infecção viral tal como, por exemplo, porém não limitado à infecção de HIV, infecção de HCV e outras infeções virais. Por exemplo, a atividade antiviral pode ser realizada em pacientes conhecidos estarem infectados com HIV a fim de prevenir a replicação de HIV, desse modo prevenindo o início da AIDS. Alternativa mente, o método da presente invenção pode ser empregado para reduzir a carga viral do soro ou para aliviar os sintomas virais da infecção. Similarmente, o tratamento antiviral pode ser realizado em pacientes conhecidos estarem infectados com, por exemplo, HCV, a fim de prevenir a replicação de HCV, desse modo prevenindo o outro envolvimento de hepatócito e a degeneração final de tecido do fígado.
Os métodos da presente invenção podem ser particularmente úteis ou nos estágios precoces de infecção viral para prevenir o estabelecimento de um reservatório viral em células afetadas ou como um tratamento profilátíco a ser aplicado imediatamente antes de ou durante um período após a exposição a uma possível fonte de vírus.
A presente invenção será agora descrita em maiores detalhes com referência a exemplos específicos, porém não limitantes descrevendo estudos de canais de íon de membrana viral e avaliando quanto à atividade
4^ antiviral. Alguns exemplos envolvem o uso do vírus de SARS. Ficará claro a partir da descrição inclusa que outras lentiviroses, e coronaviroses e outros compostos podem ser empregados eficazmente no contexto da presente invenção. Deve ser entendido, entretanto, que a descrição detalhada é incluída somente para o propósito de exemplificar a presente invenção. Não deve ser entendido de modo algum como uma restrição à descrição ampla da invenção como mencionado acima.
Exemplo 1. Síntese dos compostos da invenção.
Os compostos da presente invenção podem ser feitos dos cloretos de ácido ou ésteres de metila correspondentes como mostrado no Esquema 1. Ambos estes métodos são bem descritos na literatura.
Figure BRPI0411900B1_D0173
Figure BRPI0411900B1_D0174
Figure BRPI0411900B1_D0175
acylgiianidine Scheme 1
Figure BRPI0411900B1_D0176
ester acid chloride
Legendas da figura: cloreto ácido, acilguanidina, éster
Os seguintes exemplos mostram esquemas sintéticos para alguns compostos da invenção.
Exemplo 2. Síntese de cinamoilguanidina de cloreto de cinamoil de ácido
cinâmico.
9 1. (COC1)2 / benzene / cat. DMF O NH
íCV OH 2. (HjJOjOzNH.Ha/ íj ar N i
NaOH / / THF
Em uma solução de ácido trans-cinâmico (1,50 g, 10,12 mmoles) em benzeno seco (30 mL) contendo uma gota de Λ/,/V-dimetilformamida foi adicionado cloreto de oxalila (5,14 g, 40,5 mmoles) causando a solução efervescer. Após refluxar durante 2 horas, a solução foi evaporada até a secura sob pressão reduzida. O sólido resultante foi dissolvido em tetrahidrofurano seco (20 mL) e adicionado lentamente em uma solução de cloridrato de guanidina em 2M de hidróxido de sódio aquoso (25mL). A reação foi agitada em temperatura ambiente durante 1 hora em seguida extraída com acetato de etila (3x50 mL). Os extratos combinados foram secados sobre sulfato de magnésio e evaporados para fornecer um óleo laranja. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna. Eluição com 10% a 20% de metanol em diclorometano forneceu Cinamoilguanidina como um sólido creme (0,829 g, 43%).
Exemplo 3
Síntese de N-amidino-3-amino-5-fenil-6-cloro-2-pirazinacarboxamida
Parte 1
Figure BRPI0411900B1_D0177
Figure BRPI0411900B1_D0178
Figure BRPI0411900B1_D0179
Na2CQj l WPhjli
TUF/FLO/Loiuane
Figure BRPI0411900B1_D0180
Em uma solução de 3-amino-5,6-dicloro-2-pirazinacarboxilato de metila (0,444 g, 2,0 mmoles) em tetrahidrofurano (5 mL) / água (10 mL) / tolueno (20 mL) foi adicionado ácido borônico de fenila (0,536 g, 4,4 mmoles), carbonato de sódio (0,699 g, 6,6 mmoles) e tetracis(trifenilfosfina)- paládio(O) (0,116 g, 0,10 mmol). A reação foi evacuada e purgada com nitrogênio diversas vezes antes de ser refluxada durante 6 horas. A camada orgânica foi separada e a camada aquosa extraída com tolueno (3 x 20 mL). Os extratos orgânicos combinados foram secados sobre sulfato de magnésio, filtrados e evaporados sob pressão reduzida para fornecer 3-amino-6-cloro-5-fenil-2pirazinacarboxilato de metila como um sólido amarelo (0,43 g, 82%).
Figure BRPI0411900B1_D0181
NaOMe meíhanol
Figure BRPI0411900B1_D0182
Em uma solução de sódio (0,040 g, 1,74 mmol) dissolvida em metanol (5 mL) foi adicionado cloridrato de guanidina (0,258 g, 2,70 mmoles) e a mistura refluxada durante 30 minutos após o que ela foi filtrada. Ao filtra53 do foi adicionado 3-amino-6-cloro-5-fenil-2-pirazinacarboxilato de metila (0,264 g, 1,0 mmol) em /V,/V-dimetilformamida (5 mL) e a solução aquecida a 75°C durante 12 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida e o resíduo cromatografado em sílica-gel eluindo com 1 % trietilamina / 5% de metanol / diclorometano. O sólido resultante foi suspenso em clorofórmio, filtrado e secado sob vácuo elevado para fornecer N-Amidino-3-amino-5fenil-6-cloro-2-pirazinacarboxamida como um sólido amarelo (0,04 g, 14%). Exemplo 4.
Síntese de hexametilenoimino-6-fenil-2-pirazinacarboxamida
Figure BRPI0411900B1_D0183
Parte 1
Figure BRPI0411900B1_D0184
Figure BRPI0411900B1_D0185
Em uma solução de 3-amino-5,6-dicloro-2-pirazinacarboxilato de metila (1,11 g, 5,0 mmoles) em tetrahidrofurano (50 mL) foi adicionado hexametilenoimina (1,49 g, 15,0 mmoles) e a reação foi refluxada durante 1 hora. A reação foi deixada resfriar e o cloridrato hexametilenoimina sólido removido por filtração. O filtrado foi evaporado e o resíduo cromatografado sobre sílica-gel. Eluição com diclorometano produziu 3-amino-6-cloro-5hexametilenoimino-2-pirazinacarboxilato de metila como um sólido esbranquiçado (1,20 g, 85%).
Figure BRPI0411900B1_D0186
Figure BRPI0411900B1_D0187
Em uma solução de 3-amino-6-cloro-5-hexametilenoimino-2pirazinacarboxilato de metila (0,350g, 1,23 mmol) em dimetilsulfóxido (5 mL) foi adicionado ácido borônico de fenila (0,166 g, 1,35 mmol), complexo de carbonato de potássio (0,511 g, 3,70 mmol) e [1,Tbis(difenilfosfino)ferroceno]dicloropaládio(ll)-diclorometano (0,041 g, 0,05 mmol). A reação foi aquecida a 90°C durante 16 horas antes de ser derramada dentro de água (50 mL) e extraída com acetato de etila (3 x 50 mL). Os extratos combinados foram secados sobre sulfato de magnésio, filtrados e evaporados para fornecer um óleo marrom que foi purificado por cromatografia em sílica-gel. Eluição com diclorometano seguida por 10% acetato de etila/diclorometano produziu 3-amino-5-hexametilenoimino-6-fenil-2pirazinacarboxilato de metila como um sólido amarelo (0,309 g, 77%).
Figure BRPI0411900B1_D0188
NILHCl
NaOMe/MeOH/THP
Figure BRPI0411900B1_D0189
Em uma solução de sódio (0,090 g, 6,17 mmoles) dissolvida em metanol (8 mL) foi adicionado cloridrato de guanidina (0,598 g, 6,26 mmoles) e a mistura foi refluxada durante 30 minutos após o que ela foi filtrada. Ao filtrado foi adicionado 3-amino-5-hexametilenoimino-6-fenil-2pirazinacarboxilato de metila (0,310 g, 0,95 mmol) em tetrahidrofurano (10 mL) e a solução refluxada durante 72 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida e o resíduo cromatografado em sílica-gel. Eluição com 5% de meta nol/dicloro metano produziu N-amidino-3-amino-5hexametilenoimino-6-fenil-2-pirazinacarboxamida como um sólido amarelo (0,116 g, 35%).
Exemplo 5. Estudos Viraís
Construção de plasmídeos recombinantes contendo estruturas de leitura aberta codificando várias proteínas de vírus.
Fragmentos de DNA complementar (cDNA) para as várias proteínas virais listadas na tabela 2 foram obtidos ou por amplificação de PCR de um clone de genoma de vírus parental, ou por síntese química direta da seqüência de polinucleotídeo. Por exemplo, a estrutura de leitura aberta codificando Vpu (Fig 1a) foi amplificada por PCR de um clone de cDNA de um fragmento de Nde I do genoma HIV-1 (HXB2 isolado, McFarlane Burnet Centre, Melbourne, Austrália) como segue: Pfu DNA polimerase nativa (Stra55 tagene; 0,035 U//II) foi escolhida para catalisar a reação de PCR para minimizar os erros introduzidos por PCR possíveis em virtude da atividade de revisão da enzima. O iniciador, de sentido, 5',
Figure BRPI0411900B1_D0190
AGTAGGATCCATGCAACCTATACC (< 400 > 2) introduz um sítio BamH1 (sublinhado) para clonagem em-estrutura com a extremidade 3’ do gene GST em p2GEX (41). Este iniciador também repara o códon de partida (T negrito substitui um Q do gene vpu que é um códon de treonina no isolado de HXB2. O iniciador, anti-sentido, 3',
TCTGGAATTLTACAGATCAT CAAC (< 400 > 3) introduz um sítio de EcoRI (sublinhado) para a outra extremidade do produto de PCR para facilitar a clonagem. Após 30 ciclos de 94°C durante 45 segundos, 55°C durante 1 min e 72°C durante 1 min em tubos eppendorf de paredes finas de 0,5 ml em um termocíclizador Perkin-Elmer, o fragmento de 268 pares de base foi purificado, digerido com BamH1 e EcoRI e ligado ao p2GEX preparado por digestão com as mesmas duas enzimas. O plasmídeo recombinante resultante é ilustrado na Figura 1 b. A estrutura de leitura aberta Vpu e os sítios de ligação BamH1 e EcoRI foram seqüenciados por seqüenciamento de ciclo, empregando-se o kit terminador de pigmento Appiied Biosystems, para confirmar a seqüência de DNA. Outros cDNAs foram sintetizados empregando os métodos do estado da técnica por GenScript Corporation (New Jersey, USA). As seqüências de códon foram otimizadas para expressão em células bacterianas, de inseto ou mamíferas, como apropriado. Os sítios de reconhecimento de enzima de endonuclease de restrição foram incorporados nas extremidades 5' e 3’ dos cDNAs sintéticos para facilitar a clonagem nos vetores de expressão de plasmídeo, pcDNA3.1, pFastBac e pPL451 para expressão das proteínas de vírus codificadas em células mamíferas, de inseto ou bacterianas, respectívamente.
As técnicas padrão de biologia molecular foram empregadas em experiências de clonagem. Por exemplo, para preparar a estrutura de leitura aberta Vpu para inserção no plasmídeo de expressão pPL451, p2GEXVpu foi primeiro digerida com BamHI e a projeção de base 5' foi enchida na Klenow DNA polimerase na presença de dNTPs. O fragmento de codificação de
Vpu foi então liberado por digestão com EcoRI, purificado de um gel de agarose e ligado no pPL451 que foi digerido com Hpa1 e EcoRI. Western blots subseqüentemente confirmaram que a construção de pPLVpu (Figura 1c) expressou Vpu após a indução de culturas a 42°C para inativar o repressor 5 de cl857 dos promotores PR e PL.
Figure BRPI0411900B1_D0191
Tabela 2. Fonte de seqüências de peptídeo ou cDNA víral.
Proteína Alvo Organismo Fonte Cepa ou Número de Acesso de Seqüência
Vpu HIV-1 cepa HXB2
Proteína CoV E de SARS Coronavírus SARS P59637
HCV p7 Vírus da Hepatite C H77 1a NP-751922
Proteína MHV-E Vírus da hepatite murina NP_068673
Proteína 229E E Coronavírus humano 229E NP__073554
Proteína M da Dengue Vírus da Dengue tipo 1 Cepa Singapore S275/90
Exemplo 6. Purificação de Vpu Recombinante de E. Coli.
As culturas de células XLI-azuis de cepa de E. coli contendo p2GEXVpu foram desenvolvidas a 30°C com vigorosa aeração em meio de
LB suplementado com glicose (6 g/L) e ampicilina (50 mg/L) para uma densidade de aproximadamente 250 unidades Klett, tempo no qual IPTG foi adicionado a uma concentração fina Ide 0,01 mM e o desenvolvimento foi continuado durante mais 4 horas. A densidade de cultura final foi de aproximadamente 280 unidades Klett. Uma vez que experiências precoces revelaram 15 que a maioria das proteínas de fusão de GST-Vpu expressas foi associada tanto com os detritos celulares quanto 30 frações de membrana, o método de Varadhachary e Maloney (Varadhachary e Maloney, 1990) foi adotado para isolar os espectros de célula osmoticamente rompida (combinando tanto os detritos celulares quanto frações de membrana) para as etapas de puri20 ficação iniciais. As células foram colhidas, lavadas, pesadas e ressuspensas para 10 mL/g de peso úmido em MTPBS contendo DTT (ImM) e MgCI2 (10mM). Lisozima (0,3 mg/ml; clara de ovo de galinha; Sigma) foi adicionada e incubada sobre gelo durante 30 minutos com suave agitação seguida por 5 minutos a 37°C. As células osmoticamente sensibilizadas foram peletizadas a 12.000g e ressuspensas para o volume original em água para romper as células. A suspensão foi então preparada para IxMTPBS/DTT empregandose cepo de tampão de 10x e os espectros foram isolados por centrifugação e ressuspensos em MTPBS/DTT ao que foi então seqüencialmente adicionado glicerol (para 20 % peso/vol) e CHAPS (para 2 % peso/vol) para fornecer um volume final de um quarto do volume original. Esta mistura foi agitada sobre gelo durante 1 hora e em seguida centrifugada a 400.000g durante 1 hora para remover material insolúvel. A proteína de fusão GST-Vpu foi purificada do extrato de detergente por cromatografia de afinidade sobre uma resina de agarose de glutationa (Sigma). A resina foi cuidadosamente lavada em 50mM de Tris pH 7,5 contendo glicerol (5 %), DTT (1 mM), e CHAPS (0,5 %) (Tampão A) e em seguida a porção de Vpu da proteína de fusão foi liberada e eluída da GST ligada por resina por tratamento de uma suspensão de 50% (v/v) das contas com trombina humana (100U/ml; 37°C durante 1 hora). PMSF (0,5 mM) foi adicionado ao eluente para eliminar qualquer atividade de trombina restante. Esta fração de Vpu foi também purificada sobre uma coluna de resina de permuta de ânion MA7Q ligada a uma HPLC de BioRad e eluída com um gradiente de NaCI linear (0-2M) em tampão A.
A Vpu foi purificada para homogeneidade - como determinado sobre géis manchados de prata - em uma coluna de imunoafinidade como segue: frações de HPLC contendo Vpu foram dessalgadas em uma coluna NAP 25 (Pharmacia) em tampão A e em seguida misturadas com as contas de agarose-anticorpo durante 1 hora em temperatura ambiente. As contas foram lavadas cuidadosamente e Vpu foi eluída aumentando-se as concentração de sal para 2M. A proteína foi quantificada empregando-se o ensaio de ligação de pigmento BioRad.
Exemplo 7. Expressão e Purificação de Vpu em E.Coli.
O plasmídeo p2GEXVpu (Figura 1) foi construído para criar uma fusão de gene em-estrutura entre as estruturas de leitura aberta GST e Vpu.
Figure BRPI0411900B1_D0192
Este sistema possibilitou a expressão induzível por IPTGdo polipeptídeo de Vpu fundido à terminal C de GST e permitiu a purificação da proteína de fusão por cromatografia de afinidade em agarose de glutationa.
Os níveis ideais de expressão de GST-Vpu foram obtidos desenvolvendo-se as culturas a 30°C para uma densidade celular de aproximadamente 250-300 unidades Klett e induzindo com baixos níveis de IPTG (0,01 mM). Para purificar a GST-Vpu, uma fração celular combinada contendo os detritos celulares e membrana de plasma foi preparada por tratamento de lisozima das células induzidas seguidas por uma centrifugação de baixa velocidade. Aproximadamente 50% da proteína GST-Vpu puderam ser solubilizados desta fração empregando-se o detergente híbrido CHAPS. A cromatografia de afinidade empregando-se contas de glutationa-agarose foi empregada para enriquecer a proteína de fusão e a trombina foi empregada para clivar a proteína de fusão no sítio de trombina de afinidade elevada entre os parceiros de fusão, liberando Vpu (Figura 2A). Em frações eluídas da coluna de permuta de ânion Vpu foi a maior proteína visível sobre os géis manchados de prata (Figura 2B, faixa 1). Finalmente, a Vpu foi purificada para homogeneidade evidente sobre uma coluna de imunoafinidade (Figura 2B, faixa 2). A seqüência de aminoácido de terminal N da faixa de proteína (excisada de géis de SDS-PAGE) correspondendo à proteína imunodetectada confirmou sua identidade como Vpu.
Exemplo 8. Reconstituição de Vpu em Vesículas de Fosfolipídeo.
As proteolipossomas contendo Vpu foram preparadas pelo método de diluição de detergente (Novo, 1990). Uma mistura de lipídeos (PE:PC:PS; 5:3:2; 1 mg de lipídeo total) dissolvida em clorofórmio foi secada sob uma corrente de gás de nitrogênio e ressuspensa em 0,1 ml de tampão de fosfato de potássio (50 mM, pH 7,4) contendo DTT (1 mM). Uma alíquota de 25 μΙ contendo Vpu purificada foi adicionada, seguida por octilglicosídeo para uma concentração final de 1,25 % (peso/vol). Esta mistura foi submetida a três ciclos de congelamento em nitrogênio líquido, descongelamento e sonicação em um sonicador do tipo banho (20-30 segundos) e foi então rapidamente diluída em 200 volumes do tampão de fosfato de potássio. As
Figure BRPI0411900B1_D0193
proteolipossomas foram coletadas por centrifugação a 400.000 g durante 1 hora e ressuspensas em aproximadamente 150 μΙ de tampão de fosfato. Exemplo 9. Ensaiando Atividade de Canal de íon de Vpu
Vpu purificada foi testada quanto a sua capacidade de induzir a atividade de canal em bicamadas de lipídeo planas empregando-se técnicas padrão como descrito em outro lugar (Miller, 1986; e Piller e outro, 1996). A solução nas câmaras CIS e TRANS foram separadas por uma parede de plástico Delrin® contendo um orifício circular pequeno de aproximadamente 100 pm diâmetro através da qual uma bicamada de lipídeo foi maquilada a fim de formar um selo elétrico de resistência elevada. As bicamadas foram
Figure BRPI0411900B1_D0194
maquiladas de uma mistura (8:2) de palmitoil-oleoli-fosfatidil-etanolamina e palmitoil-oleolifosfatidil-colina (Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama) em n-decano. As soluções nas duas câmaras continham tampão de MES (10 mM, pH 6,0) ao que várias concentrações de NaC1 ou KC1 foram adicionadas. Correntes foram registradas com um amplificador Axopatch® 200. O potencial elétrico entre as duas câmaras pode ser manipulado entre +/-200 mV (TRANS com relação a CIS baseado). Alíquotas contendo Vpu foram adicionadas à câmara CIS como uma solução detergente ou após a incorporação da proteína nas vesículas de fosfolipídeo. A câmara foi agitada até as correntes serem observadas.
Exemplo 10. Vpu Forma Canais de íon em Bicamadas de Lipídeo.
Para ensaiar quanto à formação de canal de íon por Vpu, a reconstituição em bicamadas de lipídeo planas foi realizada. Quando amostras (contendo entre 7 e 70 ng de proteína) de Vpu recombinante purificada foram adicionadas a 1 ml de tampão na câmara de CIS do aparato de bicamada, flutuações de corrente foram detectadas após períodos de agitação que variaram de 2 a 30 minutos (Figura 3). Este tempo tomado para observar a atividade de canal aproximadamente correlacionado com a quantidade de proteína adicionada à câmara. Nenhum canal foi detectado quando as alíquotas de tampão de controle ou vesículas de lipídeo de controle foram adicionadas à câmara CIS. Naquelas experiências de controle as câmaras puderam ser agitadas por mais do que uma hora sem o aparecimento de ativi60 dade de canal.
Exemplo 11. Propriedades dos Canais de Vpu.
A atividade de canal foi observada em mais de 40 experiências individuais com amostras de Vpu preparadas de cinco purificações independentes. Em diferentes experiências, a amplitude das correntes variou acima de uma ampla faixa e, novamente, pareceu aproximadamente correlacionarse com a quantidade de proteína adicionada. Os menores e maiores canais medidos tiveram condutâncias de 14 pS e 280 pS, respectivamente. Os canais foram consistentemente menores quando as vesículas de lipídeo contendo Vpu foram preparadas e fundidas à bicamada em vez de quando a proteína purificada em solução detergente foi adicionada. Isto pode ser porque o primeiro método incluiu tratamento com concentrações elevadas de detergente e a etapa de diluição que pode ter favorecido o rompimento de grandes agregados em monômeros.
Uma ligação entre a amplitude da corrente e a voltagem foi linear e o potencial reverso em soluções contendo um gradiente de dez vezes de NaCI (500 mM de CIS; 50 mM de TRANS) foi +30mV (Figura 3B). Um potencial reverso similar foi obtido quando soluções continham KCI ao invés de NaCI. Em 5 experiências com NaCI ou KCI nas soluções sobre qualquer dos lados da membrana, o potencial reverso médio foi de 31,0 +/-1,2mV (+/SEM). Isto é mais negativo do que o esperado para um canal seletivamente permeável para cátions sozinhos. Empregando-se atividades de íon na equação Goldman-Hodgkin-Katz fornece uma relação de Ρν3/Ροι de cerca de 5,5 indicando que os canais são também permeáveis aos íons de cloreto. Uma tentativa foi feita para reduzir a corrente de ânion substituindo fosfato por íons de cloreto. Quando um gradiente de Na-fosfato (150 mM Na+ & 100mM fosfato CIS; 15mM Na+ & 10 mM fosfato TRANS, pH 6.8) foi empregado ao invés do gradiente de NaCI, o potencial reverso foi de 37,1 +/- 0,2 (+/-SEM, n=2) novamente indicando uma relação de permeabilidade de cátion/ânion de cerca de 5. (Para cálculos envolvendo as soluções de fosfato, as atividades somadas dos ânios mono e bivalentes foram empregadas e foi assumido que as duas espécies foram igualmente permeáveis). A curva de
Figure BRPI0411900B1_D0195
corrente-voltagem agora exibiu canais de retificação que não foram observados nas soluções de NaCI. Pode-se concluir que os canais formados por Vpu são igualmente permeáveis a Na+ e K+ e são também permeáveis, embora em uma menor extensão, ao cloreto bem como íons de fosfato.
Exemplo 12. Bioensaio Bacteriano para Avaliar o Potencial das Drogas de Bloqueio de Canal de íon.
Este bioensaio é baseado na observação de que a expressão de Vpu em E. coli resulta em um canal de Vpu ativo localizado na plasmalema que dissipa o gradiente de sódio de transmembrana. Como uma conseqüência disto a atividade de canal de Vpu, metabólitos cujo acúmulo dentro das células é mediado por um co-transportador dependente de sódio (for exemplo prolina ou adenina) vazam da célula mais rápido do que eles podem ser sintetizados de modo que os níveis intracelulares de metabólitos tornem-se limitantes para o crescimento da célula. Desse modo, uma célula de E. coli expressando Vpu é incapaz de desenvolver-se em meios de gotejamento mínimo sem adenina ou prolina. Entretanto, na presença de uma droga que bloqueia o canal de Vpu, a célula é uma vez mais capaz de possibilitar restabelecer seu gradiente de sódio de transmembrana - devido à ação de outras bombas de íon na membrana - e o vazamento de metabólitos é prevenido possibilitando o crescimento. Experiências para demonstrar que a Vpu pode formar canais de sódio na membrana de plasma de E. coli foram realizadas como segue.
Para expressar VPU não fundida em E. coli, a estrutura de leitura aberta vpu foi clonada no plasmídeo pPL451 para criar o plasmídeo recombinante pPL-Vpu (Figura 1b). Neste vetor os promotores lambda Pl e PR fortes são empregados para direcionar a expressão de Vpu sob o controle do repressor c1857 a uma temperatura sensível, tal que quando desenvolvida a 30°C a expressão seja firmemente reprimida e possa ser induzida aumentando-se a temperatura entre 37°C e 42°C. Sobre placas de ágar, células contendo pPL-Vpu cinza qundo incubadas a 30°C e 37°C porém não a 42°C, ao mesmo tempo que linhagens de controle desenvolveram-se bem a 42°C. Culturas líquidas de células contendo pPL-Vpu foram desenvolvidas a
Figure BRPI0411900B1_D0196
30°C para OD6oo,= 0,84 então movidas para desenvolverem-se a 42°C durante duas horas (a densidade celular final foi de OD6oo,= 0,75). A fração de membrana de plasma foi preparada e o manchamento do oeste, empregando-se um anticorpo que especificamente liga-se à terminal C de Vpu, detectou uma faixa única a aproximadamente 16 kDa, indicando que a Vpu foi expressa e associada com as membranas (Figura 2A, faixa 5).
Exemplo 13. Experiências de Alimentação Cruzada Revelaram que a Prolina Vaza das Células que Expressam Vpu.
A captação de prolina por E. coli é bem caracterizada e o transporte ativo do aminoácido dentro das células é conhecido usar o gradiente de sódio como a fonte de energia (Yamato e outro, 1994). Para detectar se ocorre vazamento de prolina, o seguinte ensaio de alimentação cruzada foi usado: Um tecido de uma cepa de E. coli auxotrófica para prolina e metionina (Mef Pro’), foi semeado e derramado como uma camada de ágar macia sobre as placas de meios de gotejamento mínimo sem prolina, porém contendo metionina. Os discos de filtro poroso estéreis foram inoculados com uma linhagem Mef Pro+ (XL-1 azul) contendo ou o plasmídeo de controle pPL451 ou pPL-Vpu e colocado sobre o ágar macio. As placas foram então incubadas a 37°C ou 30°C durante dois dias. Após aquele tempo um crescimento halo da cepa Mef Pro' foi claramente visível circundando o disco inoculado com as células contendo pPL-Vpu incubadas a 37°C (Figura 4A). Este crescimento pode apenas ser devido ao vazamento de prolina das células expressando Vpu sobre o disco. Nenhum tal vazamento foi aparente da cepa de controle a 37°C nem em torno de qualquer cepa sobre as placas desenvolvidas a 30°C (Figura 4B).
Ao contrário do transporte de prolina, a permease de metionina de E. coli é conhecida pertencer à família de transportador ABC (Rosen, 1987) e portanto ser energizada por ATP. Experiências de alimentação cruzada idênticas àquelas descritas acima foram estabelecidas por nós exceto que a linhagem Mef Pro' foi disseminada sobre placas de gotejamento mínimo sem metionina porém contendo prolina. Nenhum crescimento desta cepa foi evidente em torno de qualquer dos discos (Figura 4C), indicando
Figure BRPI0411900B1_D0197
D que a metionina não estava vazando das células XL-1 azuis mesmo quando Vpu estava sendo expressa.
Exemplo 14. Células de E.Coli Expressando Vpu Requerem Adenina no Meio Externo para Crescimento.
Foi observado que, devido a uma mutação não caracterizada na trilha de síntese de adenina, o crescimento de células de E. coli da linhagem XLI-azul expressando Vpu a 37°C foi dependente da presença de adenina no meio. Isto permitiu o desenvolvimento de um bioensaio ainda mais simples para a atividade de canal de íon de Vpu do que o ensaio de alimentação cruzada de prolina acima descrito: Um tecido de células XL1-azuis contendo o plasmídeo pPL-Vpu é semeado sobre uma placa de agarose sem adenina no meio, alíquotas pequenas de drogas a serem testadas quanto à inibição do canal de Vpu são manchadas sobre a agarose em locais discretos e as placas são incubadas a 37°C durante um período de tempo adequado (1236 horas). Halos de crescimento em torno de um sítio de aplicação de droga particular indicam que a droga inibiu a expressão da atividade de canal de íon de Vpu que previne o crescimento na ausência da droga. (Figura 5). Exemplo 15
Ensaio de Compostos em Bicamadas de Lipídeo Planas para a Atividade de Bloqueio de Canal de Vpu.
Compostos foram caracterizados quanto a sua capacidade de bloquear a atividade de canal de íon de Vpu reconstituída dentro das bicamadas de lipídeo planas. O peptídeo de terminal N de Vpu (resíduos 1-32) dissolvido em trifluoroetanol foi adicionado à câmara CIS chamber do aparato de bicamada e as soluções foram agitadas até as correntes de íon serem observadas, indicando a incorporação de um ou mais canais de íon de Vpu dentro da bicamada. Após registrar a atividade de canal durante alguns minutos, as drogas foram adicionadas às soluções nas câmaras CIS e TRANS - com agitação - para uma concentração final de 100 μΜ. A atividade de canal foi então registrada durante pelo menos mais três minutos e o efeito da adição de droga sobre a corrente de íon foi determinado comparando-se a atividade do canal antes e após a adição da droga. Para cada experiência, o efeito da droga foi classificado em quatro categorias: bloco forte, se a corrente foi inibida aproximadamente 90-100%; bloco fraco, aprox. 50-90% de inibição; bloco parcial, <50%; e nenhum efeito. As experiências foram negligenciadas se correntes maiores do que ±50 pA foram geradas após a adição de N-peptídeo de Vpu porque em tais casos é possível que agregados de peptídeo não-nativos contribuam para o rompimento da bicamada. Tais agregados, em virtude de sua estrutura desorganizada não podem ser especificamente bloqueados pelas drogas nas concentrações testadas.
Tabela 3. Sumarisa os resultados das experiências da bicamada. Um novo resultado destas experiências foi o fortalecimento do bloco de canais de Vpu observados com Fenamila. A fenamila tem um derivado do grupo de fenila no grupo de guanidina de amilorida. A amilorida sozinha não é um bloqueador de Vpu, ao passo que a adição do grupo de hexametileno na posição 5 do anel de pirazina criou uma estrutura (HMA) que bloqueia o canal em concentrações tão baixas quanto 25μΜ. Estes novos resultados com Fenamila, entretanto, agora mostram que um derivado hidrofóbico volumoso na extremidade oposta da molécula pode também tornar a amilorida um eficaz bloqueador de canal de Vpu. Interessantemente, a benzamila,
Figure BRPI0411900B1_D0198
com uma estrutura muito similar foi muito menos eficaz no bloqueio do canal de Vpu.
Tabela 3: Sumário de Compostos que inibem o Canal de íon de Vpu em Bicamadas.
Composto N° de Exper. Resultados
Fenamila
MIA
Benzamila
EIPA
HMA (5-Fenil-penta-2,4dienoil)guanidina
6-metóxi -2-naftoilguanidina (2-Clorocinamoil)guanidina
3x bloco forte
1x bloco forte; 1x fraco
3x bloco parcial; 7x nenhum efeito
3x bloco fraco;
1 x bloco forte;
6x bloco forte
5x bloco forte
4x forte; 2x bloco parcial s
Composto N° de Exper. Resultados
3-(trifluorometil)cinamoilgua- 5 4x bloco fortes; 1x nenhum
nidina efeito
N-{5-[3-( 5-G ua n id ino- 4 3x bloco forte; 1x nenhum
pentiloximetil)-benzilóxi]- efeito
pentil}-guanidina
4-fenilbenzoilguanidina 3 3x bloco forte
3-metilcinamoilguanidina 4 2x bloco forte; 2x partial
(3-Clorocinamoil)guanidina 4 2x bloco forte; 2x partial
N-(3-fenilpropanoil)-N’- 1 1x bloco forte
fenilguanidina
(3-Bromocinamoil)guanidina 3 3x bloco parcial-forte
5-terc-butilamino-amilorida 3 3x bloco parcial
N-amidino-3-amino-5-fenil-6- 3 3x bloco parcial
cloro-2-pirazinacarboxamida
3-metóxi-HMA 3 3x bloco parcial
5-(N-Metil-N- 1 1x bloco parcial
isobutil)amilorida
5-(N-Etil-N-isopropil)amilorida 1 1x bloco parcial
2-naftoilguanidina 7 7x bloco fraco
N,N'-bis(3-fenilpropanoil)-N- 7 7x bloco fraco
fenilguanidina
cinamoilguanidina 3 3x bloco fraco
(5-Fenil-penta-2,4- 6 6x bloco forte
dienoil)guanidina
Exemplo 16. Avaliação de Composto emoreaando o Bioensaio Bacteriano
Figure BRPI0411900B1_D0199
para a Proteína Vpu.
Os halos de crescimento em torno do sítio de aplicação de drogas particulares - como descrito no exemplo 14 - foram mencionados em 5 uma classificação entre zero e seis refletindo o tamanho e densidade da zona de crescimento de célula bacteriana. Classificações maiores do que 3 representam forte inibição da proteína Vpu; classificações entre 1,5 e 3 representam inibição moderada e classificações entre 0,01 e 1,5 representam inibição satisfatória.
Tabela 4. Lista as classificações para a inibição de proteína Vpu no bioensaio bacteriano.
Tabela 4
Composto Inibição de Vpu (classificação/N° de vezes testadas)
(3-Clorocinamoil)guanidina 4,38/4
(3-Bromocinamoil)guanidina 4,3/24
(2-Clorocinamoil)guanidina 4,0/4
(2-Bromocinamoil)guanidina 3,7/2
3-(trifluorometil)cinamoilguanidina 3,7/2
5-bromo-2-fluorocinamoilguanidina 3,5/2
3-metilcinamoilguanidina 3,4/2
2-metilcinamoilguanidina 3,1/2
2,3-dimetilcinamoilguanidina 3,1/2
cinamoilguanidina 2,96/12
6-metóxi -2-naftoilguanidina 2,9/4
trans-3-(1-naftil)acriloilguanidina 2,9/3
3,4-diclorocinamoilguanidina 2,9/3
2,6-diclorocinamoilguanidina 2,88/2
4-fenilbenzoilguanidina 2,75/5
2-etilcinamoilguanidina 2,75/2
(4-Clorocinamoil)guanidina 2,7/5
2-naftoilguanidÍna 2,7/11
2,5-dimetilcinamoilguanidina 2,69/2
Cloridrato de 3-isopropilcinamoilguanidina 2,6/2
(5-Fenil-penta-2,4-dienoil)guanidina 2,56/2
3-fenilcinamoilguanidina 2,54/3
(4-Bromocinamoil)guanidina 2,5/4
5-(3'-bromofenil)penta-2,4-dienoilguanidina 2,5/2
3-(ciclohex-1 -en-1 -il)cinamoilguanidina 2,5/2
3-(trifluorometóxi )cinamoilguanidina 2,44/2
2-(trifluorometil)cinamoilguanidina 2,4/2
N,N'-bis(3-fenilpropanoil)-N-fenilguanídína 2,25/3
2-etoxicinamoilguanidina 2,25/2
N-(3-fenilpropanoil)-N'-fenilguanidina 2,21/3
4-(trifluorometil)cinamoílguanÍdina 2,2/2
(4-Metoxicinamoil)guanidina 2,13/3
Figure BRPI0411900B1_D0200
Composto Inibição de Vpu (classificação/N° de vezes testadas)
2-t-butilcinamoilguanidina 2,13/2
4-metilcinamoilguanidina 2,1/2
2-fluorocinamoilguanidina 2,1/2
2-fenilcinamoilguanidina 2,1/2
N-(6-hidróxi-2-naftoil)-N'-fenilguanidina 2,06/2
3-t-butilcinamoilguanidina 2,06/2
3,4-difluorocinamoilguanidina 2,06/2
5-(N,N-hexametileno)amilorida 1,9/31
3-fluorocinamoilguanidina 1,9/2
5-bromo-2-metoxicinamoilguanidina 1,9/2
3-etoxicinamoilguanidina 1,9/2
3,4-(metÍlenodióxi)cinamoilguanidina 1,88/2
(2-Metoxicinamoil)guanidina 1,7/4
HC1 de 2'4 DícloroBenzamila 1,7/2
2,3,5,6,-tetrametÍlcinamoilguanidina 1,6/2
3-(2-naftil)acriloilguanidina 1,56/2
2-(1-naftil)acetoilguanidina 1,56/2
2,3-difluorocinamoilguanidina 1,56/2
(3“Metoxicinamoil)guanidina 1,52/6
4-isopropilcinamoilguanidina 1,4/2
2,4,6-trimetilcinamoilguanidina 1,4/2
N-(cinamoil)-N'fenilguanidina 1,25/3
2-(ciclohex-1 -en-1 -il)cinamoilguanidina 1,2/2
2-(2-naftil)acetoilguanídina 1,19/2
(4-Hidroxicinamoil)guanidina 1,1/2
4-fenilcinamoilguanidina 1,1/2
4-fluorocinamoilguanidina 1,1/2
N,N'-bis-(cinamoil)-N-fenilguanidina 0,94/2
(2-Furanacriloil)guanidina 0,94/2
sal de metanossulfonato de fenamila 0,9/5
Cloridrato de benzamila 0,9/3
(3-Nitrocinamoil)guanidina 0,9/1
Benzioilguanidina 0,88/2
(4-Fenoxibenzoil)guanidina 0,81/2
Figure BRPI0411900B1_D0201
Composto Inibição de Vpu (classificação/N° de vezes testadas)
3-(trans-hept-1-en-1-il)cinamoilguanidina 0,81/2
5-(N-Metil-N-isobutil)amilorida 0,8/2
2-ciclohexilcinamoilguanidina 0,8/2
4-etoxicinamoilguanidina 0,69/2
2,4-diclorocinamoilguanidina 0,63/2
5-(N-Etil-N-isopropil)amilorida 0,6/3
N-amÍdino-3-amino-5-hexametilenoimino-6- 0,6/2
fenÍl-2-pirazinacarboxamida
(a-Metilcinamoil)guanidina 0,6/2
Cloridrato de cinamoilguanidina 0,6/2
[(4-Clorofenóxi-acetil]guanidina 0,56/2
N-amidino-3-amino-5-fenil-6-cloro-2- 0,5/11
pirazinacarboxamida
5-(4-fluorofenil)amilorida 0,4/6
(trans-2-Fenilciclopropanocarbonil)guanidina 0,4/2
(2-NÍtrocinamoil)guanidina 0,4/2
trans-3-Furanacriloilguanidina 0,38/2
1-naftoilguanidina 0,3/2
5-terc-butilamino-amilorida 0,2/7
3-metóxi-HMA 0,2/4
(3-fenilpropanoil)guanidina 0,2/4
4-t-butilcinamoilguanidina 0,19/2
Cloridrato de 5-(N,N-Dimetil)amilorida 0,1/2
N,N'-Bis(3-fenilpropanoil)guanidina 0,1/2
N-Benzoil-N'-cinamoilguanidina 0,06/2
1 -bromo-2-naftoilguanidina 0,06/2
Figure BRPI0411900B1_D0202
Exemplo 11. Efeito de compostos em Replicação de HIV em Macrófagos e Monócitos Humanos.
Monócitos humanos foram isolados de sangue periférico e cultivado ou durante 24 horas (monócitos de um dia de idade) ou durante 7 dias 5 para permitir a diferenciação em macrófagos derivados de monócito (MDM). Estas células foram expostas à preparações livres de célula de isolados de HIV e deixadas absorver durante 2 horas antes de completar a aspiração do meio, lavar uma vez com meio livre de vírus e ressuspensão em meio fresco.
As células foram expostas a várias concentrações de composto 24 horas antes da infecção ou após a infecção. A subsequente replicação de HIV, em várias vezes após a infecção, foi comparada em células expostas a drogas e em células não expostas a drogas (controles). A progressão e extensão de 5 replicação viral foi ensaiada empregando-se um método de PCR de DNA de
HIV (Fear e outros, 1998) ou um método ELISA para quantificar p24 em sobrenadantes de cultura (Kelly e outros, 1998).
A tabela 5 fornece exemplos de resultados obtidos empregandose este ensaio e compostos antivirais de teste.
Tabela 5
Figure BRPI0411900B1_D0203
Composto Concentração de droga μΜ Porcentagem de Controle Positivo
Nenhum - controle positivo 100%
4-fenilbenzoilguanídina 10 26
5 4
2,5 9
1, 216
0,625 10
Nenhum - controle positivo 100%
(3-Bromocinamoil)guanidÍna 10 3
5 1
2,5 9
1,25 59
0,625 116
Nenhum - controle positivo 100%
3-(trifluorometil)cinamoilguanidina 10 11
5 8
2,5 25
1,25 27
0,625 38
Nenhum - controle positivo 100%
5-(N, N-hexametileno)amilorida 10 6
5 21
2,5 50
1,25 19
0,625 30
Exemplo 18. Coronavírus de SARS.
Proteína SARS E forma um canal de íon Síntese de Peptídeo
Um peptídeo correspondente à proteína E SARS-CoV (isolados Tor2 e Urbani) de tamanho natural (MYSFVSEETGTLIVNSVLLFLAFWFLLVTLAILTALRLCAYCCNIVNVSLVKP TVYVYSRVKNLNSSEGVPDLLV) e um segundo peptídeo compreendendo os primeiros 40 aminoácidos da proteína E de tamanho natural que corresponde ao domínio de transmembrana (MYSFVSEETGTLIVNSVLLFLAFWFLLVTLAILTALRLC) foram sintetizados manualmente empregando-se química de FMOC e síntese de peptídeo de fase sólida. A síntese foi no Biomolecular Resource Facility (John Curtin School of Medicai Research, ANU, Austrália) empregando-se um sintetizador de peptídeo SymphonyR de Protein Technologies Inc. (Tucson, AZ, USA) de acordo com as instruções dos fabricantes.
Exemplo 19. Purificação de peptídeo
A análise espectral de massa do peptídeo sintético revelou que a preparação continha quantidades significantes de material com relação de m/z menor do que o esperado para o produto de tamanho natural. A maioria destes é presumidamente peptídeos truncados gerados durante o processo de síntese de peptídeo. Para enriquecer a proteína E de tamanho natural, o seguinte procedimento foi empregado, o qual conta com a solubilidade diferencial das moléculas menores e do peptídeo de tamanho natural. A preparação bruta foi suspensa em 12 mg/ml em 70% de CH3CN, 0,1% de TFA e vortexado durante 10 minutos. Esta suspensão foi centrifugada a 10.000 g durante 10 minutos a 20 °C. O sobrenadante foi descartado e as frações insolúveis foram extraídas com 70% de CH3CN, 0,1% de TFA, como acima, duas vezes mais. O material insolúvel contendo a proteína E foi secado empregando-se Speedvac e 0 peso do produto final foi empregado para calcular a produção. O peptídeo purificado foi analisado por espectrometria de massa Bruker Omniflex MALDI-TOF em matriz HABA em 2,5 mg/ml em metanol em uma relação de 1:1 e espectros foram obtidos no modo linear posi-
Figure BRPI0411900B1_D0204
tivo. Uma turfa clara em relação de m/z de 8.360,1 foi observada como esperado para o peso molecular calculado da proteína E de tamanho natural e 4422,3 para a proteína E de terminal N.
Exemplo 20. Bicamadas de lipídeos planares
A proteína E de vírus SARS foi ressuspensa em 1 mg/ml em 2,2,2-trifluoroetanol. A capacidade de proteína E de vírus SARS para formar canais de íon foi testada em um equipamento de bicamada Warner (Warner instruments, Inc. 1125 Dixwell Avenue, Hamden, CT 06514) como segue; Uma mistura de lipídeo de 3 : 1 : 1, Etanolamina de fosfatidila de 1 -Palmitoil2-oleoiila: Serina de fosfatidila de 1-Palmitoil-2-oleolila: Colina de fosfatidila de 1-Palmitoil-2-oleolila em CHCI3 foi secada sob gás de N2 θ ressuspensa a 50 mg/ml em n-decano. As bicamadas foram pintadas através de um orifício circular de aproximadamente 100 pm de diâmetro em uma xícara Delrin® separando a solução aquosa nas câmeras CIS e TRANS. A câmera CIS continha uma solução de 500 mM de NaCI ou KCI, em um tampão HEPES de 5 mM de pH 7,2, a câmara TRANS continha uma solução de 50 mM de NaCI ou KCI, em um tampão HEPES de 5 mM de pH 7,2. Os eletrodos de prata revestidos em cloreto com 2% de pontes de agarose são colocados nas soluções de câmara CIS e TRANS. Os peptídeos de terminal N ou de tamanho natural de proteína E SARS (3 -10 ug) foram adicionados à câmara CIS, que foi agitada até a atividade de canal ser detectada. A câmara CIS foi aterrada e a câmara TRANS foi mantida em vários potenciais de controle variando entre + 100 a - 100 mV. As correntes foram registradas empregando-se um amplificador Warner modelo BD-525D, filtradas em 1 kHz, amostragem a 5 kHz e digitalmente registradas no disco rígido de um PC empregando-se um software desenvolvido em casa.
As drogas a serem testadas quanto a sua capacidade de inibir a atividade de canal de íon de proteína E SARS foram preparadas em 50 mM em uma solução de 50% de DMSO: 50% de metanol. Para experimentos testando a capacidade de compostos de inibir a atividade de canal de íon da proteína E, 100 μΜ a 400 μΜ de composto foi adicionado à câmara CIS ao mesmo tempo que agitando durante 30 segundos. As correntes de bicamada
Figure BRPI0411900B1_D0205
foram registradas antes da atividade de canal, durante a atividade de canal e após a adição da droga.
Entre os compostos testados foi a cinamoilguanidina (Bit036), um composto que foi mostrado em experimentos anteriores ser antiviral e inibir a proteína de canal de íon de outras viroses.
Exemplo 20,1. Eletroforese de gel de poliacrilamida
A proteína E purificada foi dissolvida em 1 mg/ml, 5 mg/ml e 10 mg/ml em, 6 M de Uréia, 10% de Glicerol, 5% de SDS, 500 mM de DTT, 0,002% de Bromofenol azul, 62,5 mM de HCI de Tris (pH 8,3). Os peptídeos em soluções foram aquecidos a 100 °C durante 20 minutos antes de 30 pL de amostras serem desenvolvidas em gel de empilhamento 4 -20% (Gradipore). Padrão pré-manchado SeeBlue® (Invitrogen) foi empregado para marcadores de peso molecular.
Exemplo 20,2 Resultados
Para testar se a proteína E SARS forma canais de íon o peptídeo sintético purificado foi reconstituído em bicamadas de lipídeo planares (21). Tipicamente, 3 pg de proteína E de tamanho natural SARS foi adicionado à câmara CIS, ao mesmo tempo que agitada. Esta câmara CIS continha 500 mM de NaCI e a câmara TRANS continha 50 mM de NaCI. Em 60 experimentos, as correntes de íon devido a atividade de canal de íon da proteína E SARS foram observadas após cerca de 5 - 15 minutos de agitação. A atividade foi detectada mais rapidamente e seguramente com um potencial de controle de aproximadamente -100 mV através da bicamada. As correntes registradas a -100 mV, (A) e a -60 mV (B) em um destes experimentos são mostradas na Figura 6. Naquele experimento o potencial reverso foi cerca de +48 mV e as condutâncias de canal foram calculadas para serem 52pS e 26pS, respectivamente. Isto indica que a ligação de correntevoltagem não é linear. Em dez outros experimentos, onde nenhuma proteína foi adicionada à câmara CIS, nenhuma atividade de canal de íon foi detectada, mesmo após registrando durante mais de 1 hora.
A figura 7a mostra traços de corrente típicos registrados durante uma faixa de potenciais em soluções de NaCI. Naquele experimento a dire-
Figure BRPI0411900B1_D0206
ção do fluxo de corrente inverteu a +48 mV (Figura 7b). A curva IV mostra que nas voltagens menores o fluxo de corrente médio através da bicamada é pequena em potenciais maiores existe um aumento na corrente média através da bicamada, resultando em uma ligação não linear IV. Em sete experimentos independentes, o potencial reverso médio foi +48,3 + 2,3 mV (média ± de 1 SEM), indicando que os canais foram cerca de 37 vezes mais permeáveis a íon de Na+ do que a íons de CF O potencial reverso é próximo ao potencial de equilíbrio de Na+ (+53 mV), portanto o canal é seletivo para íons de Na+. Para estes 7 experimentos a condutância de canal variou entre 95- 164 pS; a condutância média foi de 130 ± 13 pS.
O canal de íon da proteína E SARS é ligeiramente menos seletivo para íons de K+ do que íons de Na+. A figura 8b mostra registros de correntes em soluções de KCI em uma variação de potenciais. Neste experimento as correntes inverteram a +31 mV. Em sete experimentos similares o potencial reverso médio de canal de íon da proteína E foi de +34,5 ± 2,5 mV. Portanto o canal de íon da proteína E SARS é de cerca de 7,2 vezes mais permeável para íons de K+ do que íons de CF Em sete experimentos, a variação da condutância de canal variou entre 24-166 pS, a condutância média foi de 83,4 ± 26 pS.
Resultados similares foram obtidos com um segundo peptídeo sintético, o qual correspondeu aos primeiros quarenta aminoácidos de terminal N da proteína E SARS peptídeo de terminal N (21). O potencial reverso médio na solução de NaCl em quatro experimentos foi de +46,3 + 2,5 mV, indicando que o canal de íon formado pelo peptídeo de terminal N é de cerca de 25 vezes mais permeável para íon de Na+ do que para íons de CI-. O peptídeo de terminal N da proteína E SARS foi suficiente para a formação de canais de íon com propriedades como aquelas da proteína E SARS de tamanho natural. Portanto, o filtro de seletividade para a proteína E SARS está mais provavelmente contido dentro dos primeiros quarenta aminoácidos do terminal N.
O peptídeo de terminal N da proteína E SARS também formou canais de íon na solução de KCI que foi similarmente seletiva para íons de
Figure BRPI0411900B1_D0207
Κ+ comparada à proteína E de tamanho natural. Em cinco experimentos independentes o potencial reverso de canal médio foi de +39,5 ± 3,6 mV, portanto o canal é de cerca de 11 vezes mais permeável para íons de K+ do que íons de Cf. SDS-PAGE do peptídeo da proteína E de tamanho natural purificado mostrou faixa correspondente para a proteína E de tamanho natural (Dados não mostrados). Faixas maiores de tamanho variável até cerca de 20 kDa foram detectadas, sugerindo que a proteína E SARS pode formar homooligômeros.
Exemplo 21. Canal de íon da proteína E SARS é bloqueado por cinamoilguanidina e outros compostos
A atividade do canal de íon da proteína E em soluções de NaCI foi significantemente reduzida (p > 0,01, n = 6 experimentos) adicionando-se de 100 a 200 μΜ de cinamoilguanidina à câmara CIS. A corrente· média através da bicamada foi reduzida a linha de referência por 100 μΜ de cinamoilguanidina. Em experimentos onde os canais de íon da proteína E possuem condutância maior, de 100 a 200 μΜ de cinamoilguanidina reduziu a corrente média através da bicamada cerca de 4 vezes. Similarmente, em quatro outros experimentos, de 100 a 200 μΜ de cinamoilguanidina bloqueou os canais formados pela proteína E de tamanho natural nas soluções de KCI. Em dois experimentos adicionais, o peptídeo de terminal N da proteína E SARS foi bloqueado por de 100 a 200 μΜ de cinamoilguanidina, demonstrando que o sítio de ligação da droga cinamoilguanidina está localizado dentro dos primeiros quarenta aminoácidos do domínio de terminal N da proteína E. Outros compostos testados em bicamadas quanto a seus efeitos sobre a proteína E SARS são mostrados abaixo na Tabela 6.
Figure BRPI0411900B1_D0208
Tabela 6
Composto % de redução da corrente média por 100 μΜ
5-( N, N-hexametileno)amilorida 91 ±7
6-metóxi-2-naftoilguanidina 92 ±16
HCl de 2'4 DicloroBenzamil 78 ±0
N,N,-bis(3fenilpropanoil)-N-fenilguanidina 88 ±6
(3-Bromocinamoil)guanidína 37 + 11
Composto % de redução da corrente média por 100 μΜ
(2-Bromocinamoil)guanidina 88 ±6
T rans-3-(1 -naftil)acriloilguanidina 66 ±2
Figure BRPI0411900B1_D0209
Exemplo 21,1 Resultados e Descrição
Foi mostrado que a proteína E SARS pode formar canais de íon em membranas de bicamada de lipídeo. As correntes de íon inverteram em potenciais positivos, o que demonstra que os canais de íon da proteína E 5 são seletivos para cátions monovalentes sobre ânions monovalentes. Os canais de íon da proteína E foram cerca de 37 vezes mais seletivos para íons de Na+ sobre íons de Cl- e cerca de 7,2 vezes mais seletivos para íons K+ sobre íons de CI-. Em 60 experimentos a condutância de Na+ do canal de íon da proteína E variou de tão baixo como 26 pS a tão alto como 164 pS. 10 SDS-PAGE mostrou que a proteína E forma homo-oligômeros, e supõe-se que as condutâncias maiores foram provavelmente devido a agregação do peptídeo da proteína E induzindo a canais de íon maiores ou a abertura síncrônica de muitos canais de íon. As correntes de canal único foram observadas em diversos experimentos e a partir destes a condutância de canal foi 15 calculada ser dependente da voltagem.
Os primeiros 40 aminoácidos do terminal N que contêm o domínio hidrofóbico da proteína E do vírus SARS são suficientes para a formação de canais de íon sobre bicamadas de lipídeo planares. O canal de íon da proteína E de terminal N possui a mesma seletividade e condutância como o 20 canal de íon da proteína E de tamanho natural.
A atividade de canal de íon da proteína E de tamanho natural do vírus SARS e a atividade de canal de íon da proteína E de domínio de terminal N sobre bicamadas de lipídeo planares em soluções de NaCI e KCI foram inibidas adicionando-se entre 100 μΜ a 200 μΜ de cinamoilguanidina à 25 câmara CIS. A inibição ou a inibição parcial da atividade de canal de íon da proteína E pela cinamoilguanidina foi observada em sete experimentos independentes em solução de NaCI e quatro experimentos independentes em solução de KCI.
Todas as coronaviroses conhecidas codificam uma proteína E com um domínio de transmembrana de terminal N hidrofóbico portanto todas as proteínas E de coronaviroses podem formar canais de íon sobre bicamadas de lipídeo planares. Isto indica que a proteína E pode ser um alvo adequado para drogas antivirais e potencialmente interrompe a dispersão de coronavírus de células de hospedeiro infectadas. As drogas que bloqueiam o canal de íon da proteína E podem ser terapia antiviral eficaz para o tratamento de diversas significantes doenças de coronavírus veterinário e humano incluindo SARS e resfriado comum.
Figure BRPI0411900B1_D0210
Exemplo 22. Bioensaio bacteriano para analisar o potencial das drogas de bloqueio de canal de íon da proteína E SARS-CoV.
Q canal de íon da proteína E SARS-CoV inibe o desenvolvimento da célula bacteriana.
Um bioensaio da função da proteína E SARS-CoV em células bacterianas foi desenvolvido. Um fragmento de cDNA sintético codificando a proteína E SARS-CoV foi clonado no plasmideo pPL451 de expressão, produzindo um vetor no qual a expressão da proteína E é induzível pela temperatura, como descrito no Exemplo 4. A inibição do desenvolvimento das células E. coli expressando a proteína E a 37 °C foi observada como um indicador da função do canal de íon p7 dissipando o gradiente de Na+ normal mantido pelas células bacterianas.
Exemplo 23. Análise de Composto empregando-se o Bioensaio bacteriano para proteína E do coronavírus SARS.
Os halos de crescimento em torno do sítio de aplicação de drogas particulares - como descrito no exemplo 14 - foram classificados como descrito no exemplo 15.
A tabela 7 lista as classificações para a inibição da proteína E SARS-CoV no bioensaio bacteriano.
Tabela 7
Composto Inibição da proteína E SARS (classificação/N0 de vezes testado)
2,3-difluorocinamoilguanidina 4,50 /1
3,4-diclorocinamoilguanidina 4,15/2
4-t-butilcínamoilguanidina 4,00 /1
3-(2-naftil)acriloilguanidina 3,88 /1
(3-Clorocinamoil)guanidina 3,87 /3
3-(ciclohex-1 -en-1 -il)cinamoilguanidina 3,75 /1
2,5-dimetilcinamoilguanidina 3,63 /1
Trans-3-(1-naftil)acriloilguanidina 3,38 / 2
4-isopropilcinamoilguanidina 3,16/2
(3-Bromocinamoil)guanidina 3,15/27
6-metóxi-2-naftoilguanidina 3,13/3
5-(N-Metil-N-isobutÍI)amilorida 3,13/2
3-fenilcinamoilguanidina 3,13/1
(2-Clorocinamoil)guanidina 3,1 /3
HCI de 2'4 DicloroBenzamil 3,00 /2
4-fenilcinamoilguanidina 2,75 / 2
4-(trifluorometil)cinamoilguanidina 2,75 /1
3-(trifluorometóxi)cinamoilguanidina 2,71 /1
3-(trifluorometil)cinamoilguanidina 2,67 /1
2-etoxicinamoilguanidina 2,57 /1
Cloridrato de cinamoilguanidina 2,50 /1
4-etoxicinamoilguanidina 2,48 / 2
(2-Bromocinamoil)guanidina 2,47 / 3
2,6-diclorocinamoilguanidina 2,25 /1
3,4,5-trimetoxicinamoilguanidina 2,25 /1
5-terc-butilamino-amilorida 2,01 /2
3-t-butilcinamoilguanidina 2,00/1
5-bromo-2-fluorocinamoilguanidina 2,00/1
(4-Clorocinamoil)guanidina 1,94 /2
2-t-butilcinamoilguanidina 1,86/1
2-ciclohexilcinamoilguanidina 1,83/1
Figure BRPI0411900B1_D0211
Composto Inibição da proteína E SARS (classificação/N0 de vezes testado)
6-lodoamilorida 1,75 /2
3-(trans-hept-1 -en-1 -il)cinamoilguanidina 1,71/1
(4-Bromocinamoil)guanidina 1,69/2
(4-Hidroxicinamoil)guanidina 1,63/2
N-(3-fenilpropanoil)-N'-fenilguanidina 1,57 /2
(3-Nitrocinamoil)guanidina 1,51/2
3-fluorocinamoilguanidina 1,50/1
2-(1-naftil)acetoilguanidina 1,50/1
2-etilcinamoilguanidina 1,50/1
Cloridrato de 5-(N,N-Dimetil)amilorida 1,38/2
2-naftoilguanidina 1,38 /2
5-(4-fluorofenil)amilorida 1,38 /1
2-(trifluorometil)cinamoilguanidina 1,38/1
N-(6-Hidróxi-2-naftoil)-N'fenilguanidina 1,35/3
(trans-2Fenilciclopropanocarbonil)guanidina 1,34/3
N,N'-bis(3fenilpropanoil)-N-fenilguanidina 1,33 /3
1-naftoilguanidina 1,32 /3
Cloridrato de benzamil 1,32 /2
3-metóxi-HMA 1,25 /1
4-metilcinamoilguanidina 1,25/1
4-fluorocinamoilguanidina 1,25/1
3,4“(metilenodióxi)cinamoilguanidina 1,25/1
5-(N,N-hexametileno)amilorida 1,2/3
N-(cinamoil)-N'fenilguanidina 1,19/2
5-(N-Etil-N-isopropil)amilorida 1,07/2
3-meti lei namo i Ig ua n id i na 1,00/1
2-metilcinamoilguanidina 1,00/1
2,3,5,6-tetrametilcinamoilguanidina 1,00/1
T rans-3-Furanacriloilguanidina 0,88/2
Figure BRPI0411900B1_D0212
Composto Inibição da proteína E SARS (classificação/N0 de vezes testado)
(4-Metoxicinamoil)guanidina 0,88 / 2
(2-Furanacriloil)guanidina 0,82 /2
(3-fenilpropanoil)guanidina 0,73 / 5
2-(2-naftil)acetoilguanidina 0,71 /1
Cinamoilguanidina 0,69 /3
(2-Metoxicinamoil)guanidina 0,69 / 2
[3-(3-Piridil)acriloil]guanidina 0,67/3
4-fenilbenzoilguanidina 0,63 /2
2,4-diclorocinamoilguanidina 0,63/2
(3-Metoxicinamoil)guanidina 0,63/2
2-fluorocinamoilguanidina 0,63 /1
(4-Fenoxibenzoil)guanidina 0,57 /2
(a-Metilcinamoil)guanidina 0,50 /1
5-(3*-bromofenil)penta-2,4dienoilguanidina 0,5/1
(5-Fenil-penta-2,4-dienoil)guanidina 0,44 /2
(Quinolina-2-carbonil)guanidina 0,41 /1
(Fenilacetil)guanidina 0,32 / 3
N,N'-Bis(amÍdino)naftaleno-2,6dicarboxamida 0,25 /2
6-bromo-2-naftoilguanidina 0,25 /1
1 -bromo-2-naftoilguanidina 0,25 /1
2-cloro-6-fluorocinamoilguanidina 0,25/1
[(4-Clorofenóxi-acetil)]guanÍdina 0,19/2
Sal de metanossulfonato de Fenamila 0,13/2
N-Benzoil-N'-cinamoilguanidina 0,13/2
N-(2-naftoil)-N'-fenilguanidina. 0,07 /2
Figure BRPI0411900B1_D0213
Exemplo 24, Ensaio antiviral SARS para testar compostos contra a replicação do coronavírus SARS (SARS-CoV),
Os compostos foram testados contra SARS-CoV (cepa Hong
Kong) empregando-se placa de vírus purificada três vezes em células Vero.
O vírus estoque foi gerado infectando-se as células Vero em MOl = 1x
Figure BRPI0411900B1_D0214
TCIDso por 100 células.
Exemplo 24,1 Análise para atividade antiviral empregando-se o ensaio de microtítulo de vírus
As monocamadas das células Vero desenvolvidas em frascos de 25 cm2 foram infectadas em uma multiplicidade de 1 : 50 e imediatamente tratadas após a infecção com compostos em duas concentrações, 10 uM e 2 uM. Uma monocamada infectada de controle permaneceu não tratada. As amostras de meios de cultura foram tomadas em 48 horas após a infecção. Duas alíquotas de cada uma das amostras (titulações 1 e 2) foram serialmente log diluídas e 12 réplicas de diluições log -4 a -7 adicionadas às células em placas de microtítulo. Quatro dias depois, as cavidades nas placas de microtítulo foram classificadas para efeito citopático (CPE) e os valores de titulação calculados com base no número de cavidades positivas de CPE nas 4 diluições. Os títulos de controle foram de 4,8 e 5,9 TCIDso x 106 (média de 5,35 x 106).
Exemplo 25: Efeito dos compostos no ensaio antiviral SARS CoV:
Três compostos selecionados foram testados para atividade contra SARS-CoV de acordo com o método descrito no exemplo 21. Para trans3-(1-naftil)acriloilguanidina e cinamoilguanidina uma diminuição em título de vírus de aproximadamente 80% foi observada em uma concentração de 10 uM e uma redução de aproximadamente 50% foi observada persistir em 2 μΜ de trans-3-(1-naftil)acriloilguanidina.
A tabela 8 fornece dados de titulação de vírus apresentados como % de um controle (SARS CoV desenvolvido durante 48 horas na ausência dos compostos).
Figure BRPI0411900B1_D0215
Tabela 8
Composto TCID50 médio (x 106) Título (% de controle)
Nome Concentração (uM)
Cinamoilguanidina 10 1,3 24
2 4,4 82
Trans-3-(1naftil)acriloilguanidina 10 1,15 22
2 2,45 46
10 5,95 111
Composto TCID50 médio (x106) Título (% de controle)
Nome Concentração (uM)
6-metóxi-2naftoilguanidina 10 5,95 111
2 6,35 118
Controle 0 5,35 100
Figure BRPI0411900B1_D0216
Exemplo 26. Coronavírus Human 229E
Síntese e Purificação de um Peptídeo Correspondente á Proteína E-229E
Um peptídeo correspondente à proteína E- 229E de tamanho natural (seqüência:
FLKLVDDHALWNVLLWCWLIVILLVCITIIKLIKLCFTCHMFCNRTVYGPIKN
VYHIYQSYMHIDPFPKRVIDF; número de acesso NP_073554) foi sintetizado manualmente empregando-se a química FMOC e síntese de peptídeo de fase sólida. A síntese foi feita na Biomolecular Resource Facilíty (John Curtin School of Medicai Research, ANU, Australia) empregando um SymphonyR 10 Peptide Synthesiser de Protein Technologies Inc. (Wobum, MS, USA) de acordo com as instruções do fabricante para fornecer as amidas de terminal C, o acoplamento foi feito com HBTU e de hidroxibenzotriazol em Nmetilpirrolidona. Cada dos ciclos de síntese empregou acoplamento duplo e um excesso de 4 vezes dos aminoácidos. Os grupos de proteção de a-N 15 Fmoc temporários foram removidos empregando-se 20% de piperidina em
DMF.
O peptídeo sintético bruto foi purificado empregando-se o kit ProteoPlus® (Qbiogene inc, CA), seguindo as instruções dos fabricantes. Em síntese, os peptídeos foram diluídos em tampão de carga (60 mM de Tris20 HCI pH 8,3, 6M de uréia, 5% de SDS, 10% de glicerol, 0,2% azul bromofenol, ±100 mM de β-mercaptoetanol) e desenvolvidos em géis de poliacrilamida gradiente de 4-20% (Gradipore, NSW, Australia) em tampão de eletroforese de tris-glicina (25 mM de Tris, 250 mM de glicina, 0,1% de SDS). Os peptídeos foram manchados com gel código azul (Promega, NSW) e as fai25 xas correspondentes ao peptídeo de tamanho natural foram excisadas do gel.
A fatia de gel foi transferida para o tubo ProteoPLUS® e enchida com tampão de eletroforese de tris-glicina. Os tubos foram emergidos em tampão de eletroforese de tris-glicina e submetidos a 100 volts durante aproximadamente 1 hora. A polaridade da corrente elétrica foi invertida durante 1 minuto para aumentar a quantidade de proteína recuperada. Os peptídeos foram colhidos e centrifugados a 13.000 rpm durante 1 minuto. Os peptídeos purificados foram secados em um Speedvac e o peso do produto final foi usado para calcular o rendimento.
Exemplo 27. A proteína E-229E forma canais de íon em bicamadas de lipídeo planas.
Os estudos de bicamada de lipídeo foram realizados como em outro lugar descrito (Sunstrom, 1996; Miller, 1986). Uma mistura de lipídeo de palmitoil-oleoil-fosfatidiletanolamina, palmitoil-oleoil-fosfatidilserina e palmitoil-oleoil-fosfatidilcolina (5:3:2) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama) foi empregada. A mistura de lipídeo foi maquilada sobre uma abertura de 150 a 200 pm na parede de uma xícara delrin de 1 ml. A abertura separa duas câmaras, eis e trans, ambas contendo soluções de sal em diferentes concentrações. A câmara eis foi conectada ao solo e a câmara trans à energia de um amplificador Axopatch 200. Normalmente a câmara eis continha ou 500 mM de NaCI ou 500 mM de KCI e a trans 50 mM de NaCI ou 50 mM de KCI. A formação de bicamada foi monitorada eletricamente pela amplitude do pulso de corrente generado por uma rampa de corrente. Os potenciais foram medidos na câmara trans com relação à cis. O peptídeo sintético foi adicionado à câmara cis e agitado até a atividade de canal ser observada. As correntes foram filtradas a 1000 Hz, digitalizadas a 5000 Hz e armazenadas em disco magnético.
O peptídeo sintético E 229E foi dissolvido em 2,2,2-trifluoretanol (TFE) a 0,05 mg/ml a 1 mg/ml. 10 μΙ disto foram adicionados à câmara cis (1 ml de volume aquoso) do aparato de bicamada, que foi agitada por meio de um pulga magnética. As correntes iônicas, indicando atividade de canal na bicamada, foram tipicamente detectadas dentro de 15 a 30 minutos. Após os canais serem detectados o potencial de retenção através da bicamada foi variado entre -100mV e +100mV para caracterizar o tamanho e a polaridade do fluxo de corrente e possibilitar o potencial reverso ser determinado.
Figure BRPI0411900B1_D0217
Figure BRPI0411900B1_D0218
Em 15 experiências onde a câmara c/s continha 500 mM de solução de NaCI e a câmara trans continha 50 mM de solução de NaCI, o potencial reverso médio da atividade de canal foi calculado ser de 22 ±7 (SEM) mV. Em 13 experiências onde a câmara cis continha 500 mM de solução de KCI e a câmara trans continha 50 mM de solução de KCI, o potencial reverso médio da atividade de canal foi calculado ser de 38 ±4 (SEM) mV. Estes resultados indicam que a proteína E 229E forma canais de íon seletivos de cátion que são ligeiramente mais seletivos para íons de K+ do que de Na+.
A Figura 9 mostra exemplos de dados de corrente bruta para o canal de íon E 229E em vários potenciais de retenção (cis com relação a trans) em soluções de KCI assimétricas (500/50 mM). O gráfico é um plot representativo de corrente de bicamada média (pA; y-axis) versus o potencial de retenção (mV; x-axis).
Exemplo 28. Os compostos químicos inibem a atividade de canal de íon do peptídeo sintético de proteína E 229E.
Para testar compostos quanto a sua capacidade de bloquear ou de outro modo inibir o canal de íon formado pela proteína E 229E, pequenas alíquotas de soluções contendo os compostos foram adicionadas às soluções aquosas banhando os lipídeos planos em que a atividade de canal de peptídeo foi reconstituída e o efeito da adição de composto sobre as correntes iônicas foi registrado e medido.
As soluções de estoque de composto foram tipicamente preparadas a 500 mM em DMSO. Esta solução foi também diluída a 50 mM, ou menor concentração em 50% de DMSO / 50% de metanol e 2 μΙ do composto apropriadamente diluído foram adicionados às câmaras cis e/ou trans para produzir a concentração final desejada.
No exemplo mostrado na Figura 10, a adição de 100 μΜ de cinamoilguanidina à câmara cis reduziu enormemente o fluxo de corrente através do canal de íon E 229E.
Examplo 29. Bioensaio Bacteriano para Avaliar o Potencial das Drogas de Bloqueio de Canal de íon de Proteína E 229E-CoV.
O Canal de íon de proteína E 229E-CoV E inibe o crescimento de Célula
Figure BRPI0411900B1_D0219
Bacteriana. ι η
Um bioensaio de função de proteína E 229E-CoV em células 4/ bacterianas foi desenvolvido. Um fragmento de cDNA sintético codificando a proteína E 229E-CoV foi clonado no plasmídeo de expressão pPL451, crian5 do um vetor no qual a expressão de proteína E é induzível pela temperatura, como descrito no Exemplo 4. A inibição do crescimento de células E.coli expressando a proteína E a 37°C foi observada como um indicador de função de canal de íon p7 dissipando o gradiente de Na+ normal mantido pelas células bacterianas.
Exemplo 30. Avaliação de Composto empregando-se o Bioensaio Bacteriano para a Proteína E 229E-CoV.
Os halos de crescimento em torno do sítio de aplicação de drogas particulares - como descrito no exemplo 14 - foram classificados como descrito no exemplo 15.
A Tabela 9 lista as classificações quanto à inibição de proteína E
229E-CoV no bioensaio bacteriano.
Tabela 9
Composto Inibição de proteína E 229E (classificação)
4-isopropilcinamoilguanidína 4,9
3,4-diclorocinamoilguanidina 4,4
3-(trifluorometóxi )cinamoilguanidina 4,1
4-t-butilcinamoilguanidina 4,0
Cloridrato de 3-isopropilcinamoilguanidina 4,0
3-t-butilcinamoilguanidina 3,9
2-t-butilcinamoilguanidina 3,9
trans-3-(1-naftil)acriloilguanidina 3,7
5-bromo-2-metoxicinamoilguanidina 3,6
2,3-difluorocinamoilguanidina 3,3
3-(2-naftil)acriloilguanidina 3,0
2-fenilcinamoilguanidina 3,0
3-fenilcinamoilguanidina 2,9
3-(ciclohex-1-en-1-il)cinamoilguanidina 2,4
4-fenilbenzoilguanidina 2,3
Composto Inibição de proteína E 229E (classificação)
3-(trífluorometil)cinamoilguanidina 2,3
(4-Fenoxibenzoil)guanidina 2,3
4-(trifluorometil)cínamoilguanidina 2,3
2-(ciclohex-1 -en-1 -il)cinamoilguanidina 2,3
(4-Bromocinamoil)guanidina 2,0
5-(N,N-hexametileno)amilorida 1,9
1-naftoilguanidina 1,9
5-(4-fluorofenil)amilorida 1,8
(5-Fenil-penta-2,4-dienoil)guanidina 1,8
(3-Bromocinamoil)guanidina 17
2,5-dimetilcinamoilguanidina 1,6
2-(trifluorometil)cinamoilguanidina 1,5
6-metóxi -2-naftoilguanidina 1,4
(4-Clorocinamoil)guanidina 1,4
(3-Metoxicinamoil)guanidina 1,4
5-bromo-2-fluorocinamoilguanidina 1,4
Cloridrato de 5-(N,N-Dimetil)amilorida 1,3
Cinamoilguanidina 1,3
(2-Metoxicinamoil)guanidina 1,1
(a-Metilcinamoil)guanidina 1,0
4-fenilcinamoilguanidina 1,0
2,6-diclorocinamoilguanidina 1,0
(2-Bromocinamoil)guanidina 0,9
2,4,6-trimetilcinamoilguanidina 0,9
(trans-2-Fenilciciopropanocarbonil)guanidina 0,8
(3-Clorocinamoil)guanidina 0,8
2-(1-naftil)acetoilguanidina 0,8
2-etilcinamoilguanidina 0,8
2-ciclohexilcinamoilguanidina 0,8
(4-Hidroxicinamoil)guanidina 0,6
2-etoxicinamoilguanidina 0,6
3-metilcinamoilguanidina 0,5
2-metilcinamoilguanidina 0,5
3-fluorocinamoilguanidina 0,5
Figure BRPI0411900B1_D0220
Composto Inibição de proteína E 229E (classificação)
Cloridrato de cinamoilguanidina 0,5
2,3-dimetilcinamoilguanidina 0,5
2-fluorocinamoilguanidina 0,4
4-fluorocinamoilguanidina 0,4
3,4-difluorocinamoilguanidina 0,4
5-terc-butilamino-amilorida 0,3
2-naftoilguanidina 0,3
N,N’-Bis(amidino)naftaleno-2,6-dicarboxamida 0,3
N,N'-Bis(3-fenilpropanoil)guanidina 0,3
4-metilcinamoilguanidina 0,3
5-(3'-bromofenil)penta-2,4-dienoilguanidina 0,3
2,3,5,6,-tetrametilcinamoilguanidina 0,3
3-etoxicinamoilguanidina 0,3
N,N'-bis(3-fenilpropanoil)-N-fenilguanidina 0,1
(4-Metoxicinamoil)guanidina 0,1
(2-Clorocinamoil)guanidina 0,1
(3-Nitrocinamoil)guanidina 0,1
4-etoxicinamoilguanidina 0,1
3,4,5-trimetoxicinamoilguanidina 0,1
2-(2-naftil )aceto i Ig ua nid i na 0,1
N-(3-fenilpropanoil)-N'-fenilguanidina 0,1
Figure BRPI0411900B1_D0221
Exemplo 31: Ensaio Antíviral para testar compostos contra a replicação de coronavírus humano 229E (229E).
Para determinar a atividade antiviral de compostos contra a replicação do coronavírus humano 229E (ATCC VR-740), um ensaio medindo 5 a redução no número de placas formadas em monocamadas de células MRC-5 infectadas por 229E (fibroblastos de pulmão humano; ATCC CCL171) foi desenvolvido: Primeiro, uma cepa de trabalho de vírus foi preparada por amplificação em células MRC-5. Isto foi então empregado para infectar as monocamadas confluentes de células MRC-5 desenvolvidas em placas 10 de cultura de tecido de 6 cavidades por exposição ao vírus em um MOI de aprox. 0,01 pfu/célula durante 1 hora a 35°C em 5% de CO2. O inóculo infectivo foi removido e substituído com meio de cultura fresco (DMEM suplemen87 tado com 10% de soro de bezerro fetal) contendo várias concentrações de teste de compostos ou o nível apropriado de solvente empregado para os compostos (controle). As placas foram subseqüentemente incubadas a 35°C (em 5% de CO2) durante 3 a 5 dias após a infecção, tempo após 0 qual 0 sobrenadante de cultura foi removido e as células foram manchadas com 0,1% de solução violeta cristal em 20% de etanol durante 10 minutos. As placas foram contadas em todas as cavidades e a redução percentual em número de placa comparada ao controle de solvente foi calculada. As medições foram realizadas em duplicada para quadruplicar as cavidades.
Tabela 10
Figure BRPI0411900B1_D0222
Redução de Placa (% de controle / N° experiências)
Composto 5 uM 2,5 uM 1 uM
2-t-butilcinamoilguanidina 100/1 100/3 050/3
4-isopropilcinamoilguanidina 100/1 100/2 057/2
3,4-diclorocinamoilguanidina 100/3 099/4 086/3
3-(trifluorometóxi)cinamoilguanidina 100/2 098/4 077/3
2,6-diclorocinamoilguanidina 100/1 097/3 066/2
2-(ciclohex-1-en-1- 100/1 097/3 021 /1
il)cinamoilguanidina
2-ciclohexilcinamoilguanidina 070/1 097/2 089/2
5-bromo-2-metoxicinamoilguanidina 100/2 096/4 088/3
2-fenilcinamoilguanidina 100/1 096/3 100/1
5-(2’-bromofenil)penta-2,4- 100/2 095/3 079/2
dienoilguanidina
4-t-butilcinamoilguanidina 100/1 095/3 084/3
3-fenilcinamoilguanidina 094/3 077/2
(3-Bromocinamoil)guanidina 100/2 093/3 072/2
(4-Bromocinamoil)guanidina 094/1 091/3 073/2
5-(N,N-hexametileno)amilorida 089/ 091/2 033/1
trans-3-(1-naftil)acriloilguanidina 100/1 091/2 064/2
3-(2-naftil)acríloilguanidina 100/1 091/2 062/2
2,4-diclorocinamoilguanidina 100/2 090/4 064/3
(2-Nitrocinamoil)guanidina 085/2 090/2 046/2
3-(trifluorometil)cinamoilguanidina 097/2 089/4 064/3
Redução de Placa (% de controle / N° experiências)
Composto 5 uM 2,5 uM 1 uM
5-bromo-2-fluorocinamoilguanidina 100/1 088/3 063/2
4-metilcinamoilguanidina 091/2 087/4 063/2
(3-Clorocinamoil)guanidÍna 100/1 086/3 009/1
(4-Metoxícinamoil)guanidina 100/1 085/4 057/3
(4-Clorocinamoil)guanidina 100/2 084/2 051/2
3-fluorocinamoilguanídina 095/1 083/3 051 /2
3-(ciclohex-1-en-1il)cinamoilguanidina 100/1 082/3 063/2
(a-Metilcinamoil)guanidÍna 023/1 082/1 036 /2
2,3,5,6,-tetrametilcinamoilguanidina 098/2 079/4 064/3
2-fluorocinamoilguanidina 090/1 079/3 045/2
4-(trifluorometil)cinamoilguanidína 100/1 079/1 052/1
(3-Nitrocinamoil)guanidina 100/1 079/1 045/1
2,5-dimetilcÍnamoilguanidína 092/2 078/1 078/1
3-t-butilcinamoilguanidina 100/1 077/4 030/3
(3-Metoxicinamoil)guanidina 089/1 075/2 030/1
3-metilcinamoilguanidina 095/1 074/3 044/1
Cloridrato de 3-isopropilcinamoilguanídina 089/1 074/3 014/1
(2-Bromocinamoil)guanidina 095/2 072/2 043/2
3-etoxicinamoilguanidina 100/1 072/3 057/1
(5-Fenil-penta-2,4-dienoil)guanidina 100/1 072/2 069/1
(2-Clorocinamoil)guanidina 095/2 072/2 040/2
4-etoxicinamoilguanidina 073/1 069/2 057/1
4-fluorocinamoilguanidina 100/1 067/3 034/2
3,4-difluorocinamoílguanidína 085/1 065/3 042/2
N-(3-fenilpropanoil)-N'fenilguanidina 051/1 064/1 000/1
2,4,6-trimetilcinamoilguanidina 075/2 063/3 062/2
2-metilcinamoilguanídina (trans-2-Fenilciclopropanocarbonil)guanidina [(E)-3-(4-Dimetilaminofenil)-2metilacriloil]guanidina 074/2 063/3 063/2 059/1 053/3 022/1
Figure BRPI0411900B1_D0223
π
Redução de Placa (% de controle / N° experiências)
Composto 5 uM 2,5 uM 1 uM
N-Benzoil-N-cinamoilguanidina 056/1
4-fenilbenzoilguanidina 076/1 055/2 071/1
trans-3-Furanacriloilguanidina 055/2 018/1
(4-Fenoxibenzoil)guanidina 069/1 054/3 040/2
(2-Metoxicinamoil)guanidina 051 /1 053/2 024/1
N-amidino-3-amino-5-fenil-6-cloro-2- 074/2 052/2 038/1
pirazinacarboxamida
N-(cinamoil)-N'fenilguanidina 084/1 048/2 035/1
cinamoilguanidina 095/2 047/2 059/1
3,4-(metilenodióxi)cinamoilguanidina 084/1 046/1 019/1
N,N'-Bis(amidino)naftalenO2,6- 045/1
dicarboxamida
2,3-dimetilcinamoilguanidina 073/1 044/2 024/1
5-(3'-bromofenil)penta-2,4- 044/1
dienoilguanidina
N,N’-Bis(3-fenilpropanoil)guanidina 041/1
3-metóxi-amilorida 029/2 039/3 022/2
2,3-difluorocinamoilguanidina 036/1
1-naftoilguanidina 036/1
(3-fenilpropanoil)guanidina 036/1
6-metóxi -2-naftoilguanidina 49/3 030/4
cloridrato 5-(N,N-Dimetil)amilorida 027/1
2-etoxicinamoilguanidina 027/1
2-naftoilguanidina 027/1
3,4,5-trimetoxicinamoílguanidina 027/1
3-metóxi -HMA 027/1
Benzioilguanidina 026/1
2-(trifluorometil)cinamoilguanidina 022/1
N-amÍdino-3,5-diamino-6-finil-2- 022/1
pirazinacarboxamida
cloridrato de cinamoilguanidina 020/1
(Quinolina-2-carbonil)guanidina 015/3 019/3 006/2
(4-Hidroxicinamoil)guanidina 019/1
5-(4-fluorofenil)amilorida 018/1
Redução de Placa (% de controle / N° experiências)
Composto 5 uM 2,5 uM 1 uM
2-( 1 -nafti l)acetoi Ig uanidina (2-Furanacriloil)guanidina [3-(3-Piridil)acriloil]guanidina N-Cinamoil-MK-dimetilguanidína N-(2-naftoil)-N'-fenilguanidina 2-(2-naftil)acetoilg uanidina N,N'-bis(3-fenilpropanoil)-Nfenilguanidina (Fenifacetil)guanidina 018/1 018/1 018/1 015/1 011/1 009/1 009/1 009/1
Figure BRPI0411900B1_D0224
Exemplo 32: Ensaio Antíviral de Coronavírus OC43 Humano para testar os compostos contra a replicação de coronavírus humano OC43.
Para determinar a atividade antíviral de compostos contra a replicação do coronavírus humano OC43 (ATCC VR-759), um ensaio ELISA foi desenvolvido medindo-se a liberação da proteína N viral nos sobrenadantes de cultura de monocamadas de células MRC-5 infectadas por OC43 (fibroblastos de pulmão humano; ATCC CCL-171): Primeiro, uma cepa de trabalho de vírus foi preparada por amplificação em células MRC-5. Isto foi então empregado para infectar monocamadas confluentes de células MRC-5 desenvolvidas em placas de cultura de tecido de 6 cavidades por exposição ao vírus em uma MOI de aprox. 0,01 pfu/célula durante 1 hora a 35°C em 5% de CO2. O inóculo infectivo foi removido e substituído com meio de cultura fresco (DMEM suplementado com 10% de soro de bezerro fetal) contendo várias concentrações de teste dos compostos ou do nível apropriado de solvente empregado para os compostos (controle). As placas foram subseqüentemente incubadas a 35°C (em 5% de CO2) durante 5 dias após a infecção, tempo após o qual o sobrenadante de cultura foi colhido e os detritos celulares removidos por centrifugação a 5000 x g durante 10 minutos. Para a detecção de antígeno N, amostras de 100 μΙ de sobrenadante de cultura clarificado foram adicionadas às cavidades duplas de uma placa Maxí-Sorb de 96 cavidades; 100 μΙ de tampão de RIPA foram adicionados por cavidade com misturação e a placa foi coberta e incubada a 4°C durante a noite para pos91 sibilitar a ligação da proteína às cavidades de plástico. No dia seguinte, a solução de revestimento foi descartada, as cavidades foram lavadas cuidadosamente com PBST, e o bloqueio de sítios de ligação de proteína não ocupados foi realizado por incubação de 1% de BSA em PBS durante 1,5 ho5 ra. A proteína N OC43 de reconhecimento de anticorpo foi empregada a 1/800 de diluição em PBS (1 hora a 37°C) e o anticorpo secundário (fosfatase alcalina anticamundongo de cabra) foi empregado para a reação de desenvolvimento de cor. A densidade ótica das cavidades foi lida a 405 nm e o efeito dos compostos determinado por comparação do nível de sinal na pre10 sença de composto ao nível de sinal de um controle de solvente.
Exemplo 33: Efeito de compostos em ensaio antivíral de OC43
Os compostos foram avaliados quanto à atividade contra a replicação de OC43 de acordo com o método descrito no exemplo 22. Os resultados são mostrados na tabela 11.
Tabela 11
Figure BRPI0411900B1_D0225
Composto Inibição de Vírus a 2,5 uM
3-metilcinamoilguanidina 100
trans-3-(1-naftil)acriloilguanidina 100
(3-Bromocinamoil)guanidina 100
(2-ClorocinamoÍI)guanidina 96
3,4-diclorocinamoilguanidina 90
3-(trifluorometil)cinamoÍlguanidina 84
(trans-2-Fenilciclopropanocarbonil)guanidina 71
4-isopropilcinamoilguanidina 68
Cinamoilguanidina 57
6-metóxi -2-naftoilguanidina 47
2,4-diclorocinamoilguantdina 36
(4-Clorocinamoil)guanidina 36
5-(N,N-hexametileno)amilorida 30
(4-Bromocinamoil)guanidina 29
2,6-diclorocinamoilguanidina 27
5-bromo-2-metoxicinamoilguanidina 24
(5-Fenil-penta-2,4-dienoil)guanidina 9
3-(trifluorometóxi )cinamoilguanidina 4
2-t-butilcinamoilguanidina 4
Exemplo 34. Vírus da Hepatite de Camundongo (MHV).
Síntese e Purificação de um Peptídeo Correspondendo à Proteína E de
MHV-A59.
Um peptídeo correspondendo à proteína E MHV-A59 de tamanho natural (seqüência:
MFNLFLTDTVWYVGQIIFIFAVCLMVTIIWAFLASIKLCIQLCGLCNTL
VLSPSÍYLYDRSKQLYKYYNEEMRLPLLEVDDI; número de acesso
Figure BRPI0411900B1_D0226
NP__068673) foi sintetizado manualmente empregando-se a química FMOC e a síntese de peptídeo de fase sólida. A síntese foi feita na Biomolecular 10 Resource Facility (John Curtin School of Medicai Research, ANU, Australia) empregando-se um SymphonyR Peptide Synthesiser da Protein Technologies Inc. (Woburn, MS, USA) de acordo com as instruções dos fabricantes para fornecer amidas de terminal C, o acoplamento foi feito com HBTU e hidroxibenzotriazol em N-metilpirrolidona. Cada dos ciclos de síntese empregou 15 acoplamento duplo e um excesso de 4 vezes dos aminoácidos. Os grupos de proteção de α-N Fmoc temporários foram removidos empregando-se 20% de piperidina em DMF.
O peptídeo sintético bruto foi purificado empregando-se o kit ProteoPlus® (Qbiogene inc. CA), seguindo as instruções dos fabricantes. Em 20 síntese, os peptídeos foram diluídos em tampão de carga (60 mM Tris-HCI pH 8,3, 6M de uréia, 5% de SDS, 10% de glicerol, 0,2% azul bromophenol, ± 100 mM de β-mercaptoetanol) e desenvolvidos em géis de poliacrilamida gradiente de 4 a 20% (Gradipore, NSW, Austrália) em tampão de eletroforese de tris-glicina (25 mM de Tris, 250 mM de glicina, 0,1% SDS). Os peptí25 deos foram manchados com gel código azul (Promega, NSW) e as faixas correspondentes ao peptídeo de tamanho natural foram excisadas do gel.
A fatia de gel foi transferida para tubo ProteoPLUS® e enchida com tampão de eletroforese de tris-glicina. Os tubos foram emergidos em tampão de eletroforese de tris-glicina e submetidos a 100 volts durante apro30 ximadamente 1 hora. A polaridade da corrente elétrica foi invertida durante 1 minuto para aumentar a quantidade de proteína recuperada. Os peptídeos foram colhidos e centrifugados a 13.000 rpm durante 1 minuto. Os peptídeos n
purificados foram secados em um Speedvac e o peso do produto final foi empregado para calcular o rendimento.
Exemplo 35: A proteína E de MHV forma canais de íon em bicamadas de lipídeo planas.
Os estudos de bicamada de lipídeo foram realizados como em outro lugar descrito (Sunstrom, 1996; Miller, 1986). Uma mistura de lipídeo de palmitoil-oleoil-fosfatidiletanolamina, palmitoil-oleoil-fosfatidilserina e palmitoil-oleoil-fosfatidilcolina (5:3:2) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama) foi empregada. A mistura de lipídeo foi maquilada sobre uma abertura de 10 150 a 200 pm na parede de uma xícara delrin de 1 ml. A abertura separa duas câmaras, cis e trans, ambas contendo soluções de sal em diferentes concentrações. A câmara cis foi conectada ao solo e a câmara trans à energia de um amplificador Axopatch 200. Normalmente a câmara cis continha ou 500 mM de NaCI ou 500 mM de KCI e a trans 50 mM de NaCI ou 50 mM de KCI. A formação de bicamada foi monitorada eletricamente pela amplitude do pulso de corrente gerada por uma rampa de corrente. Os potenciais foram medidos na câmara trans com relação à cis. O peptídeo sintético foi adicionado à câmara cis e agitado até a atividade de canal ser observada. As correntes foram filtradas a 1000 Hz, digitalizadas a 5000 Hz e armazena20 das em disco magnético.
O peptídeo sintético MHV E foi dissolvido em 2,2,2-trifluoretanol (TFE) a 0,05 mg/ml a 1 mg/ml. 10 μΙ disto foram adicionados à câmara cis (1 ml de volume aquoso) do aparelho de bicamada, que foi agitada por meio de um pulga magnética. As correntes iônicas, indicando atividade de canal na 25 bicamada, foram tipicamente detectadas dentro de 15 a 30 minutos. Após os canais serem detectados o potencial de retenção através da bicamada foi variado entre -100mV e +100mV para caracterizar o tamanho e a polaridade do fluxo de corrente e possibilitar o potencial reverso ser determinado.
Em 14 experiências onde a câmara cis continha 500 mM de so30 lução de NaCI e a câmara trans continha 50 mM de solução de NaCI, o potencial reverso médio da atividade de canal foi calculado ser de 49 ± 1 (SEM) mV. Em 11 experiências onde a câmara cis continha 500 mM de soÁÁl
Figure BRPI0411900B1_D0227
lução de KCI e a câmara trans continha 50 mM de solução de KCI, o potencial reverso médio da atividade de canal foi calculado ser de 13 + 6 (SEM) mV. Estes resultados indicam que a proteína E MHV forma canais de íon seletivos de cátion que são mais seletivos para íons de K+ do que de Na+.
Figura 11 mostra exemplos de dados de corrente bruta para o canal de íon de MHV E em vários potenciais de retenção (eis com relação a trans) em soluções de NaCI assimétricas (500/50 mM). O gráfico é um plote representativo da corrente de bicamada média (pA; eixo-y) versus potencial de retenção (mV; x-eixo).
Exemplo 36. Os compostos químicos inibem a atividade de canal de íon do peptídeo sintético de proteína E de MHV.
Para testar os compostos quanto à sua capacidade de bloquear ou de outro modo inibir o canal de íon formado pela proteína MHV E, pequenas alíquotas de soluções contendo os compostos foram adicionadas às soluções aquosas banhando os lipídeos planos em que a atividade de canal de peptídeo foi reconstituía e o efeito da adição do composto sobre as correntes iônicas foi registrado e medido.
Soluções de cepa de composto foram tipicamente preparadas a 500 mM em DMSO. Esta solução foi também diluída a 50 mM, ou concentração menor em 50% de DMSO / 50% de metanol e 2 μΙ do composto apropriadamente diluído foi adicionada às câmaras c/s e/ou trans para produzir a concentração final desejada.
No exemplo mostrado na Figura 12 abaixo, a adição de 100 μΜ de cinamoifguanidina à câmara cis reduziu enormemente o fluxo de corrente através do canal de íon.
Exemplo 37. Bioensaio Bacteriano para Avaliar o Potencial de Drogas de Bloqueio de Canal de íon de proteína E de MHV.
Q Canal de íon de Proteína E de MHV inibe o crescimento de Célula Bactéria na.
Um bioensaio de função de proteína E de MHV em células bacterianas foi desenvolvido. Um fragmento de cDNA sintético codificando a proteína E de MHV foi clonado no plasmídeo pPL451 de expressão, criando um vetor no qual a expressão da proteína E é induzível pela temperatura, como descrito no Exemplo 4. A inibição do crescimento de células de E.coli expressando a proteína E a 37°C foi observada como um indicador de função de canal de íon p7 dissipando o gradiente Na+ normal mantido pelas 5 células bacterianas.
Exemplo 38. Avaliação de Composto empregando o Bioensaio Bacteriano para a Proteína E de MHV.
Os halos de crescimento em torno do sítio de aplicação de drogas particulares - como descrito no exemplo 14 - foram classificados como 10 descrito no exemplo 15.
A Tabela 12 lista as classificações quanto à inibição de proteína
E de MHV no bioensaio bacteriano.
Tabela 12
Composto Inibição de Proteína E de MHV (classificação )
4-isopropilcinamoilguanidina 4,5
Cloridrato de 3-isopropilcinamoilguanidina 4,2
4-t-butilcinamoilguanidina 4,1
3-(trifluorometóxi)cinamoilguanidina 4,1
3-t-butilcinamoilguanidina 4,0
3,4-diclorocinamoilguanidina 3,8
2,3-difluorocinamoilguanidina 3,8
2-t-butilcinamoilguanidina 3,8
3-fenilcinamoilguanidina 3,7
2-fenilcinamoílguanidina 3,4
5-bromo-2-metoxicinamoilguanidína 3,3
2-(ciclohex-1 -en-1 -il)cinamoilguanidina 3,3
3-(trifluorometil)cinamoilguanidina 2,9
3-(ciclohex-1 -en-1 -il)cinamoilguanidina 2,9
trans-3-(1-naftil)acriloilguanidina 2,8
4-(trifluorometil)cinamoilguanidina 2,8
3-(2-naftil)acriloilguanidína 2,8
2-(trifluorometil)cinamoilguanidina 2,7
(4-Fenoxibenzoil)guanidina 2,4
(3-Bromocinamoil)guanidina 2,4
Composto Inibição de Proteína E de MHV (classificação)
2,5-dimetilcinamoilguanidina 2,3
5-bromo-2-fluorocinamoilguanidina 2,1
6-metóxi -2-naftoilguanidina 1,8
4-fenilbenzoilguanidina 1,8
(4-Bromocinamoil)guanidina 1,8
1-naftoilguanidina 1,7
(5-Fenil-penta-2,4-dienoil)guanidina 1,4
(2-Bromocinamoil)guanidina 1,4
(4-Clorocinamoil)guanidina 1,3
2-metilcinamoilguanidina 1,2
2,6-diclorocinamoilguanidina 1,2
2,4,6-trimetilcinamoilguanidina 1,2
5-(N,N-hexametileno)amilorida 1,1
Cinamoilguanidina 1,1
Cloridrato de cinamoilguanidina 1,1
(a-Metilcinamoil)guanidina 1,0
2,3-dimetilcinamoilguanidina 1,0
2-ciclohexilcinamoilguanidina 0,9
N-(3-fenilpropanoil)-N'-fenilguanidina 0,8
N,N'-bis(3-fenilpropanoil)-N-fenilguanidina 0,8
(3-Metoxicinamoil)guanidina 0,8
(2-Metoxicinamoíl)guanidina 0,8
3-fluorocinamoilguanidina 0,8
2-fluorocinamoilguanidina 0,8
2,4-diclorocinamoilguanidina 0,8
2-etilcinamoilguanidina 0,8
(2-Clorocinamoil)guanidina 0,7
(4-Hidroxicinamoil)guanidina 0,7
2-etoxicinamoilguanidina 0,7
2-naftoilguanidina 0,6
(trans-2-Fenilciclopropanocarbonil)guanidina 0,6
cloridrato de 5-(N,N-Dimetil)amilorida 0,5
5-(4-fluorofeni()amilorida 0,5
3-metilcinamoilguanidina 0,5
Figure BRPI0411900B1_D0228
♦ Composto Inibição de Proteína E de MHV (classificação )
(3-Clorocinamoil)guanidina 0,4
4-metilcinamoilguanidina 0,4
4-etoxicinamoilguanidina 0,4
2-(1-naftil)acetoilguanidina 0,4
3,4-difluorocinamoilguanidina 0,4
2-(2-naftil)acetoilguanidina 0,4
2,3,5,6,-tetrametilcinamoilguanidina 0,4
(4-Metoxicinamoil)guanidina 0,3
3,4-(metilenodióxi)cinamoilguanidina 0,3
3-etoxicinamoilguanidina 0,3
4-fluorocinamoilguanidina 0,2
1 -bromo-2-naftoilguanidina 0,2
5-terc-butilamino-amilorida 0,1
(3-Nitrocinamoil)guanidina 0,1
9 3,4,5-trimetoxicinamoilguanidina 0,1
5-(3’-bromofenil)penta-2,4-dienoilguanidina 0,1
Figure BRPI0411900B1_D0229
Exemplo 39. Ensaio Antiviral de MHV para testar compostos contra a replicação de Vírus da Hepatite de Camundongo (MHV),
Para determinar a atividade antiviral de compostos contra a replicação de MHV (cepa MHV-A59: ATCC VR-764), um ensaio medindo a 5 redução no número de placas formadas em monocamadas de células L929 infectadas por MHV (ATCC CCL-a) foi desenvolvido: Primeiro, uma cepa de trabalho de vírus foi preparada por amplificação em células 1469 de clone de NCTC (ATCC CCL-9.1). Isto foi então empregado para infectar monocamadas confluentes de células L929 desenvolvidas em placas de cultura de teci10 do de 6 cavidades por exposição ao vírus em um MOI de 0,01 pfu/célula ou 1 pfu/célula durante 30 minutos a 37°C em 5% de CO2. O inóculo infectivo foi removido e substituído com meio de cultura fresco (DMEM suplementado com 10% de soro de cavalo) contendo várias concentrações de teste de compostos ou o nível apropriado de solvente empregado para os compostos 15 (controle). As placas foram subseqüentemente incubadas a 37°C (em 5% de CO2) durante 16-24 horas após a infecção, tempo após 0 qual o sobrena98 dante de cultura foi removido e as células foram manchadas com 0,1% de solução violeta cristal em 20% de etanol durante 10 minutos. As placas foram contadas em todas as cavidades e a redução da percentagem em número de placa comparado ao controle de solvente foi calculada. As avalia5 ções foram realizadas em duplicata para quadruplicar as cavidades.
Exemplo 40. Efeito de compostos em ensaio antíviral de MHV.
A Tabela 13 fornece os resultados obtidos deste estudo.
Tabela 13
Composto Percentual de redução em número de placa / N° experiências
20 uM 10 uM 1 uM
5-(3'-bromofenil)penta-2,4-dienoilguanidina N/D 99/2 66/1
5-bromo-2-metoxicinamoilguanidina N/D 100/1 66/1
3-fenilcinamoilguanidina Tóxico 86/2 64/3
2,3-difluorocinamoilguanidina Tóxico 92/3 64/2
3-etoxicinamoilguanidina 100/1 89/2 58/1
5-(2'-bromofenil)penta-2,4-dienoilguanidina Tóxico 100/1 57/1
Cloridrato de cinamoil guanidina 85/1 72/2 56/1
(2-Clorocinamoil)guanidina 95/2 88/3 53/3
Cinamoilguanidina 97/8 88/8 52/7
(4-Bromocinamoil)guanidina Tóxico/ 2 98/3 52/3
(2-Bromocinamoil)guanidina 91 /2 89/3 52/3
(4-Metoxicinamoil)guanidina 98/4 96/4 51 /3
(a-Metilcinamoil)guanidina 81 /2 75/3 51/2
3,4-diclorocinamoilguanidina 91/2 96/1 50/2
2-(ciclohex-1 -en-1 -il)cinamoilguanidina N/D 97/1 50/1
3,4-difluorocinamoilguanidina Tóxico 91 /2 50/1
3-t-butilcinamoilguanidina Tóxico 94/3 49/2
2-etoxicinamoilguanidina 93/2 85/3 48/2
trans-3-Furanacriloilguanidina 70/1 65/1 48/1
N-amidino-3-amino-5-hexametilenoimino- 84/1 52/2 48/1
6-fenil-2-pirazinacarboxamida
(2-Nitrocinamoil)guanidina 97/1 77/2 47/1
4-(trífluorometil)cinamoilguanidina 97/3 95/3 46/3
3,4-(metilenodióxi)cinamoilguanidina 93/3 82/3 45/3
Composto Percentual de redução em número de placa / N° experiências
20 uM 10 uM 1 uM
5-(N-Metil-N-isobutil)amilorida 92/1 85/1 44/2
(4-Clorocinamoil)guanidina 97/2 88/2 43/3
2,4-diclorocinamoilgiianidina 76/1 73/1 43/1
N-(3-fenilpropanoil)-N’-fenilguanidina 80/1 65/1 43/1
(3-Nitrocinamoil)guanidina 95/2 77/3 42/3
2-fenilcinamoilguanidina N/D 100/1 42/1
4-isopropilcinamoilguanidina 95/3 93/3 41 /3
3-(trifluorometóxi )cinamoilguanidina 100/1 90/3 41 /2
3-(trifluorometil)cinamoilguanidina 98/1 83/1 40/1
(4-Nitrocinamoil)guanidina 97/1 75/3 40/3
3-(2-naftil)acriloilguanidina 93/1 93/1 40/1
4-etoxicinamoilguanidina 96/1 92/1 40/1
2,6-diclorocinamoilguanidina 91/1 70/1 40/1
2,5-dimetilcinamoilguanidina 95/3 91/3 39/3
(3-Bromocinamoil)guanidina 95/2 90/3 39/3
(3-Clorocinamoil)guanidina 94/1 86/2 39/2
3-metilcinamoilguanidina ! 90/1 88/1 39/1
(3-Metoxicinamoil)guanidÍna 92/2 87/2 37/3
2-t-butilcinamoilguanidina N/D 98/2 37/1
[(E)-3-(4-Dimetilaminofenil)-2metilacriloiljguanidina 56/1 45/1 37/1
N,N'-bis(1-naftoil)guanidina 58/1 52/2 35/1
3-metóxi -HMA 15/1 31 /1 35/1
5-terc-butilamino-amilorida 89/4 84/4 34/4
trans-3-(1-naftil)acriloilguanidina 95/2 86/3 34/3
6-metóxi -2-naftoilguanidina 88/3 56/3 34/3
2-naftoilguanidina 67/2 36/2 34/2
2-etilcinamoilguanidina 96/1 81 /2 34/1
2,3-dimetilcinamoilguanidina 95/1 79/2 34/1
N-Cinamoil-N,N'-difenilguanidina 97/1 72/2 34/1
cloridrato de 3-isoprapilcinamoilguanidina N/D 99/2 32/1
(4-Fenoxibenzoil)guanidina 73/1 65/1 32/1
(trans-2Fenilciclopropanocarbonil)guanidina 77/2 64/2 31/2
Figure BRPI0411900B1_D0230
100
Composto Percentual de redução em número de placa / N° experiências
20 uM 10 uM 1 uM
3-fluorocinamoilguanidina 100/1 93/2 31/1
5-bromo-2-fluorocinamoilguanidina Tóxico 81/2 31/1
N,N’-bis-(cinamoil)-N”-fenilguanidina 16/1 38/2 31/1
3-quinolinoilguanidina 27/1 36/2 30/1
2,4,6-trimetilcinamoilguanidina 91/2 61/3 27/2
1 -bromo-2-naftoilguanidina 31/1 27/2 27/1
N-amidino-3,5-diamino-6-finil-2- 53/1 39/2 25/1
pirazinacarboxamída
N-Cinamoil-N',N'-dimetilguanidina 92/2 65/3 24/2
(2-Metoxicinamoil)guanidina 90/2 85/2 23/2
2-(2-naftil)acetoilguanidina 52/1 20/2 23/1
4-fenilcinamoilguanidina 53/1 36/1 21 /3
[3-(3-Piridil)acriloil]guanidina 81 /2 73/2 21 /2
3,4,5-trimetoxicinamoilguanidina 84/1 84/1 21 /1
4-metilcinamoÍlguanidina 93/1 89/1 20/1
4-fluorocinamoilguanidina 86/1 83/1 20/1
2-metilcinamoilguanidina 91 /1 82/1 20/1
6-bromo-2-naftoilguanidina 65/1 37/2 19/1
cloridrato de 5-(N,N-Dimetil)amilorida 42/4 7/4 17/4
(5-Fenil-penta-2,4-dienoil)guanidina 27/1 24/1 17/1
2-ciclohexilcinamoilguanidina 100/1 74/2 16/1
5-(4-fluorofenil)amilorida 4/1 25/1 16/1
Benzioilguanidina 22/1 39/2 14/1
N-Benzoil-N’-cinamoilguanidina 0/1 0/1 14/1
5-(N,N-hexametileno)amilorida 84/2 89/1 13/2
N-(cinamoil)-N’fenilguanidina 83/1 88/1 13/1
(4-Hidroxicinamoil)guanidina 19/1 15/1 13/1
2-(trifluorometil)cinamoilguanidina 19/1 15/1 13/1
(Quinolína-2-carbonil)guanídina 86/1 84/1 12/1
2-(1-naftil)acetoÍlguanidina -19/1 02/1 11/1
2-cloro-6-fluorocinamoilguanidina 100/1 84/2 9/1
N-amidino-3-amino-5-fenil-6-cloro-2- 20/1 20/2 9/1
pirazinacarboxamida
4-fenilbenzoilguanidina 32/1 24/1 5/1
101
Composto Percentual de redução em número de placa / N° experiências
20 uM 10 uM 1 uM
N,N'-bis(2-naftoil)guanidina 5/1 3/2 3/1
(Fenilacetil)guanidina 35/1 22/1 3/1
1-naftoilguanidina 71/3 62/3 2/3
N,N'-bis(3-fenilpropanoil)-N-fenilguanidina 67/3 40/4 1 /3
3-hídróxi- 5-hexametilenoímino-amilorida 16/1 22/2 1/1
HCI de 2'4-diclorobenzamila 12/2 0/3 0/3
2,3,5,6,-tetrametilcinamoilguanidina N/D 68/2 0/1
Cio rid rato de Benza mi Ia 0/1 26/1 0/1
6-íodoamilorÍda 28/1 21/1 0/1
N,N’-Bis(amidino)naftaleno-2,6dicarboxamida 19/1 16/1 0/1
[(4-Clorofenóxi-acetil]guanidina 19/1 16/1 0/1
(3-fenilpropanoil)guanidina 51/1 03/1 0/1
2-fluorocinamoilguanidina 76/1 73/1
6-bromo-2-naftoilguanidina 43/1
(2-Furanacriloil)guanidina 67/2 63/2 -3/2
N-(6-hidróxi- 2-naftoil)-N'-fenilguanidina 43/1 39/1 -5/1
HCI de Amilorida 21/1 18/1 -5/1
3-(trans-hept-1-en-1-il)cinamoilguanidina T/1 23(T) /1 -6/1
3-metóxi -amilorida 60/2 47/3 -7/2
N,N'-Bis(3-fenilpropanoil)guanidina 41 /3 30/4 -8/3
3-(ciclohex-1 -en-1 -il)cinamoilguanidina T/1 2/2 -19/1
Figure BRPI0411900B1_D0231
Exemplo 41. Coronavírus respiratório porcino (PRCV)
Ensaio Antiviral para testar compostos contra a replicação de coronavírus respiratório porcino (PRCV).
Para determinar a atividade antiviral de compostos contra a re5 plicação do coronavírus respiratório porcino (ATCC VR-2384), um ensaio medindo a redução no número de placas formadas em monocamadas de células ST infectadas por PRCV (cepa de célula de testículo fetal porcino, ATCC CRL-1746) foi desenvolvido: Células ST confluentes em placas de 6 cavidades foram infectadas com uma passagem quaternária de cepa AR310 10 de vírus respiratório porcino (PRCV) em três diluições 10‘1, 50'1 e 10’2 em
102
PBS para fornecer uma faixa de números de placas para contar. 100 ul de vírus diluído foram adicionados por cavidade em um volume de 1 ml de meios de cultura. As placas foram incubadas durante uma hora em uma plataforma de recife em temperatura ambiente para permitir o vírus adsorver às 5 células. O sobrenadante viral foi removido e 2 ml / cavidade de revestimento contendo 1% de agarose Seaplaque em 1x MEM, 5% de FCS foram adicionados a cada cavidade. Os compostos a serem testados foram adicionados à mistura de revestimento diluindo-se os compostos de cepa congelada para uma concentração de modo que o mesmo volume de composto/solvente 10 seja adicionado ao revestimento para cada concentração de composto. O volume de composto/solvente nunca excedeu a 0,07% do volume do revestimento. O solvente empregado para dissolver compostos foi o DMSO e metanol misturados em proporções iguais. Os compostos foram testados quanto à atividade de formação de antiplaca em quatro concentrações, 0,1 uM, 1 15 uM, 10 uM e 20 uM. Ou duplicatas ou quadruplicatas foram realizadas em cada concentração. Controles foram realizados onde o mesmo volume de solvente foi adicionado ao revestimento. O revestimento foi deixado estabelecer em temperatura ambiente durante 20 minutos. As placas foram então incubadas a 37°C durante 2 dias. As monocamadas foram então fixadas e 20 manchadas durante a noite em temperatura ambiente adicionando 1 ml/cavidade de 0,5% de azul de metileno, 4% de formaIdeído. A agarose e mancha de revestimento foram então enxagüadas para visualizar a monocamada manchada e fixada.
Exemplo 42: Efeito de compostos em ensaio antiviral de PRCV.
Os compostos foram avaliados quanto à atividade contra a replicação de PRCV de acordo com o método descrito no exemplo 29. A tabela 14 fornece valores EC50 para alguns dos compostos testados.
Figure BRPI0411900B1_D0232
Tabela 14
Composto EC50 (uM)
5-(N,N-hexametileno)amilorida 0,06
6-metóxi -2-naftoilguanidina 0,04
Cinamoilguanidina 0,08
103
Composto EC50 (uM)
N-(3-fenilpropanoil)-N’-fenilguanidina 19
3-metilcinamoilguanidina 1,43
(3-Bromocinamoil)guanidína 11,2
(trans-2-Fenilciclopropanocarbonil)guanidina 17,2
trans-3-(1-naftil)acriloilguanidina 19,1
2-(2-naftil)acetoilguanidina 119,6
Exemplo 43. Coronavírus bovino.
Figure BRPI0411900B1_D0233
Ensaio Antíviral para testar compostos contra a replicação de coronavírus bovino (BCV).
Para determinar a atividade antíviral de compostos contra a re5 plicação de coronavírus bovino (ATCC VR-874), um ensaio medindo a redução no número de placas formadas em monocamadas de células de MDBK infectadas por BCV (linhagem de célula de rim bovino; ATCC CCL-22) foi desenvolvida: células MDBK confluentes em placas de 6 cavidades foram infectadas com uma passagem secundária de BCV com vírus serialmente 10 diluído para 10’3, 5'5 e 10'4 em PBS para fornecer uma faixa de números de placas para contagem. 100 ul de vírus diluído foram adicionados por cavidade em um volume de 1 ml de meios de cultura. As placas foram incubadas durante uma hora para permitir o vírus adsorver às células. O sobrenadante viral foi removido e 2 ml/cavidade de revestimento contendo 1% de agarose 15 Seaplaque em 1x MEM, 5% de FCS foram adicionados a cada cavidade. Os compostos a serem testados foram adicionados à mistura de revestimento diluindo-se os compostos de uma cepa congelada de 0,5 M para uma concentração de modo que o mesmo volume de composto/solvente seja adicionado ao revestimento para cada concentração de composto. O volume de 20 composto/solvente nunca excedeu 0,07% do volume do revestimento. O solvente empregado para dissolver compostos foi DMSO e metanol misto em proporções iguais. Os compostos foram testados quanto à atividade de formação de anti-placa em quatro concentrações, 0,1 uM, 1 uM, 10 uM e 20 uM. As quadruplicatas foram realizadas em cada concentração. Os controles 25 foram realizados onde o mesmo volume de solvente foi adicionado ao revestimento. O revestimento foi deixado estabelecer em temperatura ambiente
104 durante 20 minutos. As placas foram então incubadas a 37°C durante 7 dias.
As monocamadas foram então fixadas e manchadas adicionando-se 1 ml/cavidade de 0,5% de azul de metileno, 4% formaldeído.
Exemplo 44: Efeito de compostos em ensaio antiviral de BCV
Os compostos foram avaliados quanto à atividade contra a repli-

Claims (1)

  1. cação de BCV de acordo com o método descrito no exemplo 31. A tabela 15 fornece valores EC50 para alguns compostos testados.
    Tabela 15
    Composto EC50 uM (3-Bromocinamoil)guanidina 3 3-(trifluorometil)cinamoilguanidÍna 3 6-metóxi -2-naftoilguanidina 9 5-(N,N-hexametÍleno)amilorida 9 trans-3-(1-naftil)acriloilguanidina 13 Cinamoilguanidina 42 (5-Fenil-penta-2,4-dienoil)guanidina 95 2-(2-naftil)acetoilguanidina 99 (trans-2»Fenilciclopropanocarbonil)guanidina 109 N-(3-fenilpropanoil)-N'-fenilguanidína 156 4-fenilbenzoilguanidina 190
    Exemplo 45: Atividade de Canal de íon de Proteína P7 de Vírus da Hepatite
    C.
    Teste de um Peptídeo P7 Sintético para atividade de canal em bicamadas de lipídeo artificial.
    Um peptídeo imitando a proteína P7 codificada pelo vírus da Hepatite C (HCV) foi sintetizado tendo a seguinte seqüência de aminoácido:
    ALENLVILNAASLAGTHGLVSFLVFFCFAWYLKGRWVPGAVYA
    FYGMWPLLLLLLALPQRAYA
    Estudos de bicamada de lipídeo foram realizados como descrito em outro lugar (Miller, 1986). Uma mistura de lipídeo de palmitoil-oleoilfosfatídiletanolamina, palmitoil-oleoil-fosfatidilserina e palmitoil-oleoíl20 fosfatidilcolina (5:3:2) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama) foi empregada. A mistura de lipídeo foi maquilada sobre uma abertura de 150 a 200 (m
    105 na parede de uma xícara delrin de 1 ml. A abertura separa duas câmaras, cis e trans, ambas contendo soluções de sal em diferentes concentrações. A câmara cis foi conectada ao solo e a câmara trans à energia de um amplificador Axopatch 200. Normalmente a câmara cis continha 500 mM de KCI e 5 a trans 50 mM de KCI. A formação de bicamada foi monitorada eletricamente pela amplitude do pulso de corrente gerado por uma rampa de corrente. Os potenciais foram medidos na câmara trans com relação à cis. A proteína foi adicionada à câmara cis e agitada até a atividade de canal ser observada.
    As correntes foram filtradas a 1000 Hz, digitalizadas a 2000 Hz e armazena10 das em disco magnético. O peptídeo P7 foi dissolvido em 2,2,2trifluorethanol (TFE) a 10 mg/ml. 10 (I disto foram adicionados à câmara cis da bicamada que foi agitada. A atividade de canal foi observada em 15 a 20 minutos.
    Quando o peptídeo P7 foi adicionado à câmara cis e agitado, a 15 atividade de canal foi registrada. O potencial na câmara trans foi de -80 mV e as correntes são descendentes. As correntes inverteram em +50 mV próximo ao potencial de equilíbrio de potássio nestas soluções indicando que os canais foram seletivos de cátion. A amplitude de pico de canal aberto é de 1,7 pA correspondendo a uma condutância de canal de cerca de 14 pS. Na 20 maioria das experiências, canais simples tinham um tamanho muito mais largo, presumivelmente por causa da agregação do peptídeo P7. As correntes inverteram em torno de +40 mV nesta experiência. Em algumas experiências a solução na câmara cis foi de 150 mM de KCI e 15 mM de KCI na câmara trans. O peptídeo P7 novamente produziu correntes que inverteram.
    Resultados similares foram obtidos quando ambas as câmaras continham NaCl. As correntes registradas em uma experiência quando a câmara cis continha 500 mM de NaCl e a câmara trans 50 mM de NaCl. Novamente as correntes inverteram entre +40 e +60 mV, próximo ao potencial de equilíbrio de Na+ indicando que os canais foram muito mais permeáveis a 30 Na+ do que a K+.
    Os canais formados pelo peptídeo P7 foram bloqueados por 5(N,N-hexametileno)amilorida (HMA).
    106
    A adição do peptídeo P7 produziu a atividade de canal. A adição de 2 μΙ de 50 μΜ de HMA à câmara cis seguido por agitação resultou em desaparecimento da atividade de canal. O bloqueio da atividade de canal produzido pelo peptídeo P7 com 100 μΜ de HMA foi registrado em 4 experi5 ências. Em 2 experiências, os canais de sódio (500/50) foram bloqueados por 500 μΜ de HMA.
    Quando 10 mM de CaCI2 foi adicionado à câmara cis (soluções K) o potencial reverso das correntes produzido pelo peptídeo P7 deslocou-se para potenciais mais negativos indicando um decréscimo na relação de 10 Pk/Pci-
    Quando a câmara cis continha 500 mM de CaCI2 e a câmara trans 50 mM de CaCl2, ambas as correntes positiva e negativa foram observadas em potenciais em torno de +20 mV e não foi possível determinar um potencial reverso.
    Exemplo 46. Expressão Recombinante de Proteína Ρ7 de HCV.
    Dois fragmentos de cDNA, cada qual codificando o mesmo polipeptídeo correspondente à seqüência de aminoácido da proteína p7 de HCV-1a, foram sintetizados comercialmente por GeneScript Os dois cDNAs diferiram em seqüência de nucleotídeo tal que em um cDNA (cDp7.coli) os 20 códons foram otimizados para expressão da proteína p7 em E. coli ao mesmo tempo que os outros códon de cDNA (”cDp7.mam) foram negativados para a expressão em linhagens de célula mamífera. cDp7.coli foi clonado no plasmideo pPL451 como um fragmento de BamHI/EcoRI para a expressão em E. coli. cDp7.mam foi clonado em vetores (por exemplo, o vírus da vací25 nia pcDNA3.1, pfastBac-1) para a expressão de p7 em linhagens de célula mamífera.
    Exemplo 47. Papel de p7 no realce de Florescimento de VLP de Gag
    O florescimento de partículas tipo vírus (VLP) de células HeLa cultivadas resulta da expressão de proteínas Gag retrovirais nas células e 30 co-expressão de canais de íon virais pequenos, tal como M2, Vpu e 6K, com a proteína Gag realça o florescimento. Interessantemente, os canais de íon virais podem realçar o florescimento de partículas de vírus heterólogas. Por107 tanto, para avaliar o realce do florescimento por p7 ele foi co-expresso com a proteína Gag de HIV-1 Gag em células HeLa, e a liberação de VLP no meio de cultura foi medido por Gag ELISA. Para conseguir isto, os plasmídeos pcDNAp7 (pc DNA3.1 = pcDp7.mam como descrito no Exemplo 20, p7 ex5 presso sob o controle do promotor T7) e pcDNAGag (proteína Gag de HIV-1 expressa sob o controle do promotor T7) foram co-transfectados em células HeLa infectadas com a cepa de vírus da vacínia vTF7.3 (expressa T7 RNA polimerase) e os sobrenadantes de cultura foram coletados para o ensaio de ELISA após 16 horas de incubação.
    Exemplo 48. Ensaio da capacidade de compostos inibirem a atividade funcional de canal de íon de p7.
    Os dois métodos de detectar a atividade funcional de canal de íon de p7, descrita nos Exemplos 33 a 35, foram empregados para ensaiar a capacidade de compostos inibirem o canal de p7. No caso do Exemplo 33, 15 os compostos foram testados quanto à sua capacidade de inibir a atividade de canal de p7 em bicamadas de lipídeo planas. No caso do Exemplo 35 os compostos foram testados quanto à sua capacidade para reduzir o número de VLPs liberadas de células expressando tanto a p7 quanto a Gag de HIV1.
    Exemplo 49.
    Bioensaio Bacteriano para Avaliar o Potencial de Drogas de Bloqueio de Canal de íon de Proteína p7 de HCV.
    O Canal de íon de p7 de HCV inibe o crescimento de Célula Bacteriana,
    Um bioensaio de função de p7 em células bacterianas foi desen25 volvido. O fragmento de cDNA sintético codificando p7 cDp7.coli foi clonado no plasmídeo de expressão pPL451, criando o vetor pPLp7, no qual a expressão de p7 é induzível por temperatura, como descrito no Exemplo 4. A inibição do crescimento de células de E. coli expressando p7 a 37°C foi observada como um indicador de função de canal de íon de p7 dissipando o gradiente de Na+ normal mantido pelas células bacterianas.
    Exemplo 50: Avaliação de Composto empregando o Bioensaio Bacteriano para proteína p7 de HCV.
    108
    Os halos de crescimento em torno do sítio de aplicação de drogas particulares - como descrito no exemplo 14 - foram classificados como descrito no exemplo 15.
    A Tabela 16 lista as classificações quanto à inibição da proteína 5 p7 de HCV no bioensaio bacteriano.
    Tabela 16
    Composto Inibição de proteína p7 de HCV (classificação/N° de vezes testadas) 2,3-dimetilcinamoilguanidina 3.88 /2 2,4,6-trimetilcinamoilguanidina 3,75/1 5-bromo-2-fluorocinamoilguanidína 3,73 /6 (4-Bromocinamoil)guanidina 3.47 /4 2,5-dimetilcinamoilguanidina 3.43 /4 3-(trífluorometíl)cinamoilguanidina 3,34 /3 4-(trifluorometil)cinamoilguanidina 3,33 /5 6-metóxi -2-naftoilguanidina 3,33 /3 (2-Clorocinamoil)guanidina 3,31 /6 (4-Clorocinamoil)guanidina 3,16/4 (2-Bromocinamoil)guanidina 3,00 /3 2,6-diclorocinamoilguanidina 3,00 /3 (3-Bromocinamoil)guanidina 2,92 /3 (3-Clorocinamoil)guanidina 2,75/3 2-(trifluorometíl)cinamoilguanidina 2,63 /3 (4-Fenoxibenzoil)guanidina 2,63 /1 3,4-diclorocinamoilguanidina 2,59 /3 4-isopropilcinamoilguanidina 2,51 /2 trans-3-(1-naftil)acriloilguanidina 2,44 /2 4-t-butilcinamoilguanidina 2,42/2 2-t-butilcinamoÍlguanidina 2,36 /2 2-etilcinamoilguanidina 2,36 /2 4-metilcinamoilguanidina 2,32 /2
    109
    Composto Inibição de proteína p7 de HCV (classificação/N0 de vezes testadas) 5-bromo-2-metoxicinamoilguanidina 2,32 /2 3-(trifluoro metóxi )cinamoilguanidina 2,26 /2 2-ciclohexilcinamoilguanidina 2,26 /2 1-naftoilguanidina 2,25 /1 3-t-butilcinamoilguanidina 2,23/2 4-fenilbenzoilguanidina 2.19/2 (5-Fenil-penta-2,4-dienoil)guanidina 2.13/1 N-(cinamoil)-N'fenilguanidina 2.13/1 cloridrato de 3- 2,00 ! 1 isopropilcinamoilguanidina cloridrato de Benzamila 2,0/1 N-(3-fenilpropanoil)-N’-fenilguanidina 2,0/1 N.N-bis^-fenilpropanoiQ-N- 2,0/1 fenilguanidina 3-(2-naftil)acriloilguanidina 1,93 /2 5-(N-Metil-N-isobutil)amilorida 1,88 /1 HCI de 2'4 DicloroBenzamila 1,88/1 5-terc-butilamino-amilorida 1,88 /1 5-(N-Etil-N-isopropil)amilorida 1,88 /1 (4-Metoxicinamoil)guanidina 1,88 /1 4-fluorocinamoilguanidina 1,86 /1 (3-Nitrocinamoil)guanidina 1,71 /1 4-etoxicinamoilguanidina 1,63/1 (4-Hidroxicinamoil)guanidina 1,63 /1 (trans-2- 1,63/1 Fenilciclopropanocarboniljguanidina 3-etoxicinamoilguanidína 1,63/1 2,3,5,6,-tetrametilcinamoilguanidina 1,51 /2 4-fenilcinamoilguanidina 1,5/1 trans-3-Furanacriloilguanidina 1,38/1
    110
    Composto Inibição de proteína p7 de HCV (classificação/N0 de vezes testadas) N-(6-hidróxi- 2-naftoil)-N'-fenilguanidina 1,38 /1 (2-Furanacriloil)guanidína 1,38 /1 3-(ciclohex-1 -en-1 -il)cinamoilguanidina 1,32 /2 cloridrato de cinamoilguanidina 1,32 /2 5-(N,N-hexametileno)amilorida 1,28 /4 2,3-difluorocinamoilguanidina 1,24 /1 2-(1-naftil)acetoilguanidina 1,14/1 (a-MetÍlcinamoil)guanidina 1,14/1 (2-Nitrocinamoil)guanidina 1,14/1 6-lodoamilorida 1,13/1 3,4-(metilenodióxi)cinamoilguanidina 1,13/1 2-etoxicinamoilguanidina 1,00 /1 Cinamoilguanidina 1,00 /1 2-fenilcinamoilguanidina 1,00/1 2-(ciclohex-1-en-1-il)cinamoilguanidina 1,00 /1 2-naftoilguanidina 1,0/3 3-fenilcinamoilguanidina 1,0 /1 cloridrato de 5-(N,N-Dimetil)amilorida 1,0/1 5-(4-fl uo rofen i I )a m ilorid a 1,0 /1 (3-Metoxicinamoil)guanidina 1,0/1 2-fluorocinamoilguanidina 1,0/1 5-(3'-bromofenil)penta-2,4dienoilguanidina 1,0 /1 [(4-Clorofenóxi-acetil]guanidina 1,0 /1 (3-fenilpropanoil)guanidina 1,0/1 2-cloro-6-fluorocinamoilguanidina 0,88 /1 3-fluorocinamoilguanidina 0,86 /1 2-metilcinamoilguanidina 0,75 /1 (2-Metoxicinamoil)guanidina 0,75 /1
    111
    Composto Inibição de proteína p7 de HCV (classificação/N0 de vezes testadas) 1 -bromo-2-naftoilguanidina 0,75 /1 3,4,5-trimetoxicinamoilguanidina 0,71 /1 3-metilcinamoilguanidina 0,63 /1 3-(trans-hept-1-en-1-il)cinamoilguanidina 0,50 /1 HCI de amilorida 0,5/2 Sal de metanossulfonato de fenamila 0,5/1 2,4-diclorocinamoilguanidina 0,38 /1 (4-Nitrocinamoil)guanidina 0,25 /1 3,4-difluorocinamoilguanidina 0,13/1 [(E)-3-(4-Dimetilaminofenil)-2metilacriloil]guanidina 0,03 /4
    Exemplo 51: Vírus da Arterite Equina (EAV)
    Ensaio Antiviral para testar compostos contra a replicação de vírus da arterite equina (EAV).
    Para determinar a atividade antiviral de compostos contra a re5 plicação de EAV (cepa Bucyrus; ATCC VR-796), um ensaio medindo a redução no número de placas formadas em monocamadas de células BHK-21 infectadas por EAV (ATCC CCL-10) foi desenvolvido: Uma cepa de vírus foi amplificada em células RK-13 (ATCC CCL-37) e isto foi então empregado para infectar monocamadas confluentes de células BHK-21 desenvolvidas 10 em placas de cultura de 6 cavidades por exposição ao vírus em uma MOI de
    5X103 pfu/célula durante 1 hora a 37°C de 5% de CO2. O inóculo infectivo foi removido e as células foram revestidas com um revestimento de placa sea 1% (Cambrex Bio Science) em MEM contendo 10% de FCS e 10, 5 ou 1 μΜ de compostos a serem testados ou o nível apropriado de solvente em15 pregado para os compostos (controle). As placas foram subseqüentemente incubadas a 37°C (em 5% de CO2) durante 3 dias após a infecção, tempo após 0 qual o sobrenadante de cultura foi removido e as células foram manchadas com 0,1% de solução violeta cristal em 20% de etanol durante 10 minutos. As placas foram contadas em todas as cavidades e a percentagem
    112 de redução em número de placa comparada ao controle de solvente foi calculada. As medições foram realizadas em duplicata para quadruplicar as cavidades.
    Exemplo 52: Efeito de compostos em ensaio antiviral de EAV.
    Os compostos foram avaliados quanto à atividade contra a replicação de EAV de acordo com o método descrito no exemplo 35. Os resultados expressos como valores IC50 são mostrados na tabela 17.
    Tabela 17
    Composto IC50 5-(N,N-hexametileno)amilorida 7,5 μΜ (3-Bromocinamoil)guanidina 10 μΜ trans-3-(1-naftil)acriloilguanidina 7,5 μΜ 2-t-butilcinamoilguanidina 1 μΜ 2-(ciclohex-1-en-1-il)cinamoilguanidina 10 μΜ
    « Exemplo 53: Flavivírus da Dengue
    Síntese de Peptídeo da Proteína M do Vírus da Dengue
    Os 40 aminoácidos de terminal C da proteína M da cepa tipo 1 do vírus da Dengue Singapore S275/90 (Fu e outro 1992) (ALRHPGFTVIALFLAHAIGTSITQKGIIFILLMLVTPSMA) foram sintetizados empregando-se o método Fmoc. A síntese foi feita em um Symphony Peptide Synthesiser de 15 Protein Technologies Inc (Tucson, Arizona) como empregado para fornecer amidas de terminal C, o acoplamento foi feito com HBTU e hidroxibenzotriazol em N-metilpirrolidona. Cada dos ciclos de síntese empregou acoplamento duplo e um excesso de 4-vezes dos aminoácidos. Os grupos de proteção α-N Fmoc foram removidos empregando-se 20% de piperidina em DMF.
    Exemplo 54. Incorporação da proteína do vírus M da Dengue em bicamadas de lipídeo.
    Os estudos de bicamada de lipídeo foram realizados como descrito em outro lugar (Sunstrom, 1996; Miller, 1986). Uma mistura de lipídeo de palmitoil-oleoil-fosfatidiletanolamina, palmitoil-oleoil-fosfatidilserina e pal25 mitoil-oleoil-fosfatidilcolina (5:3:2) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama) foi usada. A mistura de lipídeo foi maquilada sobre uma abertura de 150-200 μΐη na parede de uma xícara delrin de 1 ml. A abertura separa duas câmaras, cis e trans, ambas contendo soluções de sal em diferentes concentrações. A câmara cis foi conectada ao solo e a câmara trans à energia de um amplificador Axopatch 200. Normalmente a câmara cis continha 500 mM KCI e a trans 50 mM de KCI. A formação de bicamada foi monitorada eletricamente pela amplitude do pulso de corrente gerado por uma rampa de corrente. Os potenciais foram medidos na câmara trans com relação à cis. A proteína foi adicionada à câmara cis e agitada até a atividade de canal ser observada. As correntes foram filtradas a 1000 Hz, digitalizadas a 5000 Hz e armazenadas sobre disco magnético.
    O peptídeo de terminal C de proteína M do vírus da dengue (DMVC) foi dissolvido em 2,2,2-trifluorethanol (TFE) a 0,05 mg/ml a 1 mg/ml. 10 μΙ disto foram adicionados à câmara cis da bicamada que foi agitada. A atividade de canal foi observada em 15 a 30 minutos.
    Exemplo 55: Amilorida de hexametileno (HMA) para inibir a atividade de canal de íon do peptídeo de terminal C da proteína M do vírus da dengue.
    Soluções de 50 mM de HMA foram preparadas primeiro preparando-se uma solução de 500 mM em DMSO. Esta solução foi também diluída para 50 mM de HMA empregando-se 0,1 M de HCI. 2 μΙ da HMA de 50 mM foram adicionados à câmara cis após a atividade de canal ser observada. A câmara cis continha 1 ml de solução preparando a concentração final de HMA de 100 μΜ.
    Exemplo 56. Ensaio Antiviral para testar compostos contra os Efeitos do flavivírus da Dengue contra citoproliferação.
    Os compostos foram testados a 10, 5, 2,5, 1,25 e 0,625 μΜ quanto à atividade contra a cepa da Dengue 1 Hawaii empregando-se um ensaio de citoproliferação que avalia o efeito da infecção do vírus da dengue sobre a proliferação de LLC-MK2, células de rim de macaco reso. As células LLC-MK2 foram infectadas com uma quantidade predeterminada de vírus, titulada tal que a proliferação de célula em culturas infectadas seja significantemente reduzida em comparação com os controles não infectados. As células infectadas foram então semeadas em 1,5x103 células por cavidade
    114 em uma placa de 96 cavidades. Controles negativos (nenhum vírus, nenhum composto experimental), controles positivos (vírus, nenhum composto experimental), e controles de citotoxicidade (composto experimental, nenhum vírus) foram realizados com cada ensaio de droga. As culturas foram deixadas 5 desenvolver durante 7 dias e em seguida Azul Alamar, um pigmento fluorescente que mede o metabolismo das culturas (vermelho/ox), foi adicionado a cada cultura e o valor de fluorescência para cada cultura foi medido. O controle negativo sem composto experimental vírus foi fixado a 100%. Os controles positivos e as culturas com composto foram classificados calculando10 se sua fluorescência média como uma percentagem do controle negativo.
    Pelo menos seis réplicas de cavidades foram medidas para cada condição experimental.
    Exemplo 57: Efeito de compostos em ensaio antiviral da Dengue :
    Tabela 18
    Droga Concentração de Droga μΜ Percentual Antiviral de Controle Negativo cinamoilguanidina Controle Negativo 0 NA Controle Positivo 0 76,5% 10 17,1% 5 38,6% 2,5 58,3% 1,25 72,6% 0,625 76,6% (2-clorocinamoil)guanidina Controle Negativo 0 NA Controle Positivo 0 80,3% 10 8,4% 5 7.7% 2,5 22,7% 1,25 52,5% 0,625 64,3% Trans-3-(1-naftil)acriloilguanidina Controle negativo 0 NA
    115
    Droga Concentração de Droga μΜ Percentual Antiviral de Controle Negativo Controle positivo 0 80,4% 10 6,8% 5 12,4% 2,5 38,7% 1,25 73,7% 0,625 77,7%
    Ν.Α. - não aplicável
    Exemplo 58: Correlação Positiva entre Ensaio Bacteriano e Ensaios Antivirais.
    Exemplo 58.1: Correlação Positiva entre Ensaio Bacteriano de Vpu e Dados anti-HIV-1.
    Um estudo correlativo foi realizado para medir a correlação entre as classificações de atividade designadas para compostos testados no ensaio bacteriano de Vpu e a capacidade destes compostos para inibir o HIV-1 no ensaio antiviral.
    Exemplo 58.2. Metodologia
    Os dados de antígeno p24 para doze compostos representando várias acil-guanidinas substituídas foram comparados com as classificações de atividade obtidas para aqueles compostos no ensaio bacteriano de Vpu. Os dados de cada ensaio foram inicialmente ordenados por categoria quanto à eficácia. A ordem de categoria para o ensaio bacteriano de Vpu foi determinada de todas as classificações de atividade, quanto mais elevada a indicação de classificação maior a eficácia. A ordem de categoria para o ensaio anti-HIV-1 foi determinada com base no valor médio total de antígeno p24 medido em sobrenadantes de cultura em todas as concentrações de droga testadas, com a menor classificação indicando a maior eficácia. As duas ordens de categoria geradas foram então comparadas estatisticamente gerando o coeficiente de correlação de Categoria de Spearman's.
    Exemplo 58.3. Resultados e Conclusão
    O coeficiente de correlação de Spearman foi de 0,785 que, por comparação com uma tabela estatística de valores críticos (para n=12), indi116 ca que as duas ordens de categoria estão significantemente positivamente correlacionadas (P<0,01) (Tabela 19a).
    Além disso, uma comparação diferente da ordem de categoria de ensaio Bacteriano de Vpu com uma classificação sim/não para se os da5 dos antivirais indicaram uma redução de p24 de pelo menos uma ordem de magnitude, alinhado o grupo 'sim' de compostos com os compostos de ponta 6 pelo ensaio bacteriano (Tabela 19b).
    Estes resultados são indicativos de que a correlação positiva existe entre os ensaios bacterianos e os ensaios antivirais quando realizados 10 de acordo com a presente invenção. O ensaio bacteriano pode portanto ser uma ferramenta útil na avaliação quanto aos compostos que exibem atividade antiviral.
    Tabela 19a. Comparação da ordem de Categoria de eficácia de 12 acílquanidinas substituídas no ensaio bacteriano de Vpu e ensaio anti-HIV.
    Composto Ordem de categoria de ensaio bacteriano ordem de categoria p24 diA2 (3-bromocinamoil)guanÍdina 1 1 0 3-(trifluorometil)cinamoilguanidina 2 2 0 3-metilcinamoilguanidina 3 3 0 cinamoilguanidina 4 4 0 trans -3-( 1 -naftil)acriloilguanidina 5,5 7 2,25 6-metóxi -2-naftoilguanidina 5,5 5 0,25 4-fenilbenzoilguanidina 7 11 16 (5-fenil-penta-2,4-dienoil)guanidina 8 9 1 N-(3-fenilpropanoil)-N'fenilguanidina 9 12 9 Amilorida de hexametileno 10 6 16 2-(2-naftil)acetoilguanidina 11 10 1 (trans-2fenilciclopropanocarbonil)guanidina 12 8 16 Soma diA2 61,5 Coeficiente de correlação Spearman 0,785 Valor de P >0,01
    117
    Tabela 19b.
    Compostos Ordenados pela ordem de categoria de p24 Classificação Bacteriana de Vpu Ordem de categoria de ensaio Bacteriano I Pelo menos 1x redução log observada em ensaio de p24 ? (3-bromocinamoil)guanidina 4,3 1 sim 3-(trifluorometil)cinamoilguanidina 3,7 2 sim 3-metilcinamoilguanidina 3,4 3 sim cinamoilguanidina 3,0 4 sim trans -3-(1 -naftii)acriloílguanidina 2,9 5,5 sim 6-metóxi -2-naftoilguanidina 2,9 5,5 sim 4-fenilbenzoilguanidina 2,8 7 nenhum (5-fenil-penta-2,4dienoil)guanidina 2,6 8 nenhum N-(3-fenilpropanoil)-N’fenilguanidina 2,2 9 nenhum Amilorida de hexametileno 1,9 10 nenhum 2-(2-naftil)acetoilguanidina 1,2 11 nenhum (trans-2-fenilciclopropanocarbonil)guanidina 0,4 12 nenhum
    Exemplo 58.4. Correlação Entre a Inibição Percentual de formação de placa de MHV e classificação de bioensaio bacteriano de MHV-E
    Uma correlação positiva foi observada entre as classificações de atividade designadas para compostos quando testados no bioensaio bacteriano de proteína E de Vírus da Hepatite de Camundongo e a inibição percentual exibida por estes compostos no ensaio de placa do Vírus da Hepatite de Camundongo.
    Exemplo 58.5. Método:
    Os dados de atividade de redução de placa MHV para 96 compostos avaliados foram classificados de o maior a pelo menos a redução de placa percentual e as ordens de categoria foram designadas para a lista de compostos. Isto foi realizado para dados gerados para expor a ambas as concentrações de 10 μΜ e 1 μΜ dos compostos, dando origem a duas listas
    118 de ordem de categoria.
    Similarmente, uma lista de ordem de categoria foi gerada para as classificações de bioensaio bacteriano de MHVE para os mesmos 96 compostos. Onde um ou mais compostos tiveram a mesma classificação, foi calculada a média dos valores de categoria para aquele grupo.
    O teste estatístico de Spearman para [como descrito em Mathematical Statistics with Applications (2a edição): Mendenhall, W., Scheaffer, RL.,& Wackerly, DD. Duxbury Press, Boston Massachusetts - 1981] foi empregado para comparar as ordens de categoria. Em síntese, isto envolveu o cálculo da Soma de quadrados (SS) das diferenças entre os valores de categoria para cada composto, e em seguida gerando o coeficiente de Correlação de Categoria de Spearman (Rs) de acordo com a fórmula: Rs = 1(6.SS/n(n2-1)), onde n é o número de compostos classificados por categoria (96 neste caso). Rs é então comparado a uma tabela de valores críticos para determinar a significância estatística (valores de P ).
    Exemplo 58.6. Sumário de Resultados:
    Esta tabela sumariza os valores de Rs e P gerados como um resultado das comparações em pares indicadas entre as ordens de categoria.
    Tabela 20
    Comparação Rs P Correlação Positiva ? Placa a 10μΜ Placa a 1 μΜ 0,689 >99,5 Sim Bacteriana Placa a 10μΜ 0,444 >99 Sim Placa a 1 μΜ 0,406 >98,5 Sim Ordem Aleatorízada -0,382 n/s Nenhuma
    Exemplo 58.7. Conclusões:
    A comparação da ordem de categoria de 96 compostos ensaiados no bioensaio bacteriano e o ensaio antiviral mostrou que a ordem de categoria de ensaio bacteriano de MHVE para os compostos testados é significantemente positivamente correlacionada com as ordens de categoria
    119 geradas pelo ensaio de redução de placa de MHV. A correlação significante entre os ensaios é altamente indicativa de que qualquer dos ensaios pode ser utilizado para identificar compostos que podem ser úteis. O ensaio bacteriano pode desse modo ser uma ferramenta útil na avaliação quanto aos 5 compostos que exibem atividade antiviral.
    Exemplo 58.8, Correlação Entre a Inibição Percentual da formação de placa de 229E e a classificação de bioensaio bacteriano de 229E-E.
    Uma correlação positiva foi observada entre as classificações de atividade designadas para os compostos quando testados no bioensaio bac10 teriano de proteína E 229E de Coronavírus humano e a inibição percentual exibida por estes compostos no ensaio de placa 229E de Coronavírus humano.
    Exemplo 58.9. Método:
    Os dados de atividade de redução de placa de 229E para 97 15 compostos avaliados contra 2,5 μΜ de concentração de composto foram classificados de maior a pelo menos a redução percentual de placa e as ordens de categoria foram designadas para a lista de compostos. Similarmente, uma lista da ordem de categoria foi gerada para as classificações de bioensaio bacteriano de 229E E para os mesmos 97 compostos. Onde um ou 20 mais compostos tinham a mesma classificação, foi calculada a média dos valores de categoria para aquele grupo.
    O teste estatístico de Spearman para [como descrito em Mathematical Statistics with Applications” (2a edição): Mendenhall, W., Scheaffer, RL.,& Wackerly, DD. Duxbury Press, Boston Massachusetts - 1981] foi 25 empregado para comparar as ordens de categoria. Em síntese, isto envolve o cálculo da Soma dos quadrados (SS) das diferenças entre os valores de categoria para cada composto, e em seguida geração do coeficiente de Correlação de Categoria de Spearman (Rs) de acordo com a fórmula: Rs = 1(6.SS/n(n2-1)), onde n é o número de compostos classificados por categoria 30 (97 neste caso). Rs é então comparado à uma tabela de valores críticos para determinar a significância estatística (valores P).
    Exemplo 58.9.1. Sumário de Resultados e Conclusões
    120
    Esta tabela sumariza os valores Rs e P gerados como um resul- tado das comparações em pares indicadas entre as ordens de categoria.
    Tabela 21
    Comparação Rs P Correlação Positiva Placa a 2,5μΜ Bacteriana 0,584 >99,5 Sim aleatorízado -0,382 n/s Nenhum
    Os resultados acima indicam que a ordem de categoria de en5 saio bacteriano de 229E para os compostos testados é significantemente positivamente correlacionada com as ordens de categoria geradas pelo ensaio de redução de placa de 229E. Este resultado combinado com aquele mostrado nos Exemplos 49,1 e 49,4, fornece forte evidência de que qualquer dos ensaios pode ser utilizado para identificar os compostos que podem ser 10 úteis. O ensaio bacteriano pode desse modo ser uma ferramenta útil na avaliação quanto aos compostos que exibem a atividade antiviral.
    Aqueles versados na técnica apreciarão que a invenção aqui descrita seja suscetível a variações e modificações exceto aquelas especificamente descritas. Deve ser entendido que a invenção inclui todas as tais 15 variações e modificações. A invenção também inclui todas as etapas, aspectos, composições e compostos relativos a ou indicados neste relatório descritivo, individualmente ou coletivamente, e quaisquer e todas as combinações de quaisquer duas ou mais das referidas etapas ou aspectos.
    121
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    reivindicações 1. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a fór- mula (I): .R3 O N AM H 1 R (I)
    ou sais farmaceuticamente aceitável destes, na qual,
    Ri =
    R2, R3 e R4 são independentemente hidrogênio,
    Petição 870180061688, de 18/07/2018, pág. 9/18
    Rn
    Rp (E) e na qual
    X = hidrogênio, hidróxi, nitro, halo, C1-6 alquila, C1-6 alquilóxi, C3-6 cicloalquila, C1-6 alquila halo substituída, C1-6 alquilóxi halo substituído, fenila, C1-6 alqueneila, C3-6 cicloalqueneila, C1-6 alquenóxi, ou benzo;
    Rd , Re , Rf , Rh , Rk , Rl , Rm , Rn , Ro , Rp independentemente = hidrogênio, amino, halo, C1-5 alquil, alquilóxi C1-5, hidróxi, aril, arila substituída, amino substituído, amino substituída por mono ou dialquila, amino substituído por cicloalquila, amino substituído por arila,
    H2N .n nh2 o ou PrS;
    Rg , Ri independentemente = hidrogênio, hidróxi, halo, ou C1-5 alquila;
    Rj = hidrogênio, amino, halo, C1-5 alquila, C1-5 alquilóxi, hidróxi, arila, arila substituída, amino substituído, amino substituída por alquila, amino substituída por cicloalquila, amino substituída por arila, PrS, ou nh2 o e na qual
    Petição 870180061688, de 18/07/2018, pág. 10/18 fenilpropanoil)guanidina;
    quando R1 é quando R1 é naftil)acriloilguanidina;
    x-mquando R1 é 1 quila halo substituída, quando Ri é C6H5CH=CH, R2 é hidrogênio e R3 é fenila, R4 não pode ser fenila;
    quando R1 é fenila, R2 é hidrogênio, e R3 é benzoíla, R4 não pode ser benzoíla;
    quando R1 é fenila, R2 é benzila substituída , R3 é hidrogênio e R4 é hidrogênio, Rn, Ro e Rp não podem ser hidrogênio;
    quando R1 é fenila, R3 é hidrogênio e R4 é hidrogênio, R2 não pode ser benzila ou fenila;
    quando R1 é fenila, R2 é hidrogênio, R3 não pode ser fenila junto com R4 como benzoíla;
    quando R1 é fenila, R2 é hidrogênio, R3 e R4 ambos não podem ser benzila;
    quando R1 é o composto é N-(3-fenilpropanoil)-N'fenilguanidina, N,N'-bis(3-fenilpropanoil)-N-fenilguanidina ou N,N'-Bis(3*
    X-Z*
    X
    X , o composto é cinamoilguanidina;
    e Ri é hidrogênio, o composto é trans-3-(1, Ri é hidrogênio e X é C1-6 alquila, halo, C1-6 alhidrogênio ou nitro, o composto é 4-tbutilcinamoilguanidina, 3-t-butilcinamoilguanidina, 2-t-butilcinamoilguanidina,
    2-etilcinamoilguanidina, 4-isopropilcinamoilguanidina, cloridrato de 3isopropilcinamoilguanidina, 4-metilcinamoilguanidina, 3- fluorocinamoilguanidina, 2-fluorocinamoilguanidina, 2(trifluorometil)cinamoilguanidina ou 3-(trifluorometil)cinamoilguanidina;
    Petição 870180061688, de 18/07/2018, pág. 11/18 , Rg é hidrogênio e qualquer um de Rd, Re ou Rf é halo ou alcóxi, o composto é 5-bromo-2-metóxicinamoilguanidina, 5bromo-2-fluorocinamoilguanidina ou 3,4-difluorocinamoilguanidina; e
    Rk hidrogênio e Rj é hidrogênio ou C1-5alcóxi, o composto é N-(2-naftoil)-N'-fenilguanidina, ou N,N'-bis(2-naftoil)guanidina.
    2. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um composto antiviral como definido na reivindicação 1 e, opcionalmente, um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis.
    3. Composto, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo consistindo em:
    1-naftoilguanidina,
    N-(2-naftoil)-N'-fenilguanidina,
    N,N'-bis(2-naftoil)guanidina,
    N,N'-bis(1-naftoil)guanidina,
    N,N'-bis(2-naftoil)-N''-fenilguanidina,
    3- quinolinoilguanidina, cinamoilguanidina,
    4- fenilbenzoilaguanidina,
    N-(cinamoil)-N'fenilguanidina,
    N,N'-bis-(cinamoil)-N''-fenilguanidina,
    N-(3-fenilpropanoil)-N'-fenilguanidina,
    N,N'-bis(3fenilpropanoil)-N-fenilguanidina,
    N-(6-Hidróxi-2-naftoil)-N'-fenilguanidina, (4-fenoxibenzoila)guanidina,
    N,N'-Bis(amidino)naftaleno-2,6-dicarboxamida,
    N''-Cinamoil-N,N'-difenilguanidina, (Fenilacetil)guanidina,
    N,N'-Bis(3-fenilpropanoil)guanidina, benzoilguanidina,
    Petição 870180061688, de 18/07/2018, pág. 12/18 (4-Clorofenoxi-acetil)guanidina,
    N-benzoil-N'-cinamoilguanidina, [(E)-3-(4-Dimetilaminofenil)-2-metilacriloil]guanidina, (5-fenil-penta-2,4-dienoil)guanidina, (4-Hidróxicinamoil)guanidina, e (Quinolina-2-carbonil)guanidina, ou sais farmaceuticamente aceitáveis destes.
    4. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um composto como definido na reivindicação 3 e um ou mais veículos farmaceuticalmente aceitáveis.
    Petição 870180061688, de 18/07/2018, pág. 13/18
    1/14
    2/14
    ORF alB57
    Fig.1c
    3/14
    1. 2,--3- 4. . 5- 6.
    Fig. 2a
    Fig. 2b
    4/14
    - 2 Óτη V +90 mV
    2ρΑ|___
    200ms
    Fig. 3 a
    5/14
    Fig.3b
    6/14
    Fig.4a Fig.4b
    Fig.4c
    37'C, Placa Met 7/14 «
    Fig.5
    8/14
    Τ ψ............
    -50mV
    -10mV
    OmV +10rnV tdiiáà£ü^£!í!Íy!ÍÍiiSí!S3íiíí5as*x2!ífc±xíi53jÍMàáii*»i»AKííSlx^±M3iKli4teí)ciüsSí +50mV
    Fig. 6 b
    Tensão
    9/14
    100ms ’+40mV +80mV .
    Fig.7a
    10/14
    5pA
    SOOrnS
    Atividade de canal de proteína E
    WO^MBit036.
    Fig. 8 a <c 'o c <φ □ cr S>
    Histograma de todos os pontos 2000 - Oug Bit036
    1S00 4
    1600 4 1400 f 1200-j1000 4
    SOO 4 “ewrf
    4Q0 4 .200 -20 -16 -12 -0
    Corrente (pA) *rtrtA Histograma de todos os pontos 3ÜQ0- 100ugBit036
    2500
    Corrente (pA)
    Fig. 8 b
    -3J
    Fig.8c
    11/14
    Fig.9 10OmV rriV r
    OrtiV
    -20 mV
    -100 mV
    -40 mV
    2pa[___
    100 ms
    12/14
    Fig.10
    Pré-droga
    Pós-droga
    13/14
    Fig.11
    90mV mV mV mV
    OmV
    -20 mV
    -40 mV '
    -60 mV
    -----.WasíÇaí*^^ ifrW-íW 2pÁ[____
    -90 mV
    14/14
    Α
    Fig. 12
    Α ρΑ
    200 mS
    Pré-droga
    Pós-droga
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