BR9607651B1

BR9607651B1 - proteìna de superfìcie de neisseria meningitidis resistente a proteinase k.

Info

Publication number: BR9607651B1
Application number: BRPI9607651-8A
Authority: BR
Inventors: Bernard R Brodeur; Denis Martin; Josee Hamel; Clement Rioux
Priority date: 1995-03-17
Filing date: 1996-03-15
Publication date: 2011-02-08
Also published as: IL117483A; JP2007159583A; MX9707061A; AU4934396A; EA001789B1; WO1996029412A1; NO326425B1; JP2003189879A; AP1027A; NO974264D0; CZ291497A3; TR199700971T1; SK287456B6; SI9620035A; KR19980703099A; CA2215161A1; GEP20032977B; AR052377A2; RO117924B1; JP4271231B2

Description

PROTEÍNA SUPERFICIAL DE NEISSERIA MENINGITIDISRESISTENTE A PROTEINASE K

CAMPO TÉCNICA DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um antigenoimunologicamente acessível, altamente conservado nasuperfície de organismos de Neisseria meningitidis.Este antigeno único fornece a base para novos agentesimunoterapêuticos, profiláticos e de diagnóstico úteisno tratamento, prevenção e diagnóstico de doenças deNeisseria meningitidis. Mais particularmente, apresente invenção refere-se a uma proteína superficialde Neisseria meningitidis resistente a proteinase Ktendo um peso molecular aparente de 22 kDa, asseqüências de aminoácido derivado e nucleotídeocorrespondentes (SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 26),processos de DNA recombinantes para a produção daproteína superficial de 22 kDa de Neisseriameningitidis, anticorpos que se ligam à proteínasuperficial de 22 kDa de Neisseria meningitidis eprocessos e composições para o diagnóstico, tratamentoe prevenção de doenças de Neisseria meningitidis.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Neisseria meningitidis é uma principal causa demorte e morbidez em todo o mundo. Neisseriameningitidis causa doenças tanto endêmicas comoepidêmicas, principalmente meningite e meningococcemia[Gold, Evolution of meningococcal disease, pág. 69,Vedros N.A., CRC Press (1987); Schwartz e outr-os, Clin.Micobriol. Rev., 2, pág. S118 (1989)]. Na realidade,este organismo é uma das causas mais comuns, apósHaemophilus influenzae tipo b, de meningite bacteriananos Estados Unidos, totalizando aproximadamente 205 detodos os casos. Foi bem documento que atividadebactericida de soro é o principal mecanismo de defesacontra Neisseria meningitidis e que proteção contrainvasão pela bactéria está correlacionada à presença nosoro de anticorpos anti-meningococais [Goldschneider eoutros, J. Exp. Med. 129, pág. 1307 (1969);Goldschneider e outros, J. Exp. Med., 129, pág. 1327(1969)].

Neisseria meningitidis são subdivididos emgrupos serológicos de acordo cem a presença deantigenos capsulares. Atualmente, 12 sorogrupos sãoreconhecidos, porém sorogrupos A, B, C, Y e W-135 sãomais comumente encontrados. Nos sorogrupos, sorótipos,subtipos e imunotipos podem ser identificados emproteínas de membrana externa e lipopolissacarideo[Frasch e outros, Rev. Infect. Dis. 7, pág. 504(1985)].

As vacinas de polissacarídeo capsularesatualmente disponíveis são não eficazes contra todos osisolados de Neisseria meningitidis e não induzemefetivamente a produção de anticorpos de proteção embebês [Frasch, Clin. Microbiol. Rev. 2, pág. S134(1989); Reingold e outros, Lancet, pág. 114 (1985);Zollinger, em Woodrow e Levine, New generationvaccines, pág. 325, Mareei Dekker Inc. N. Y. (1990)]. Opolissacarideo capsular de sorogrupos A, C, Y e W-135 éatualmente utilizado em vacinas contra este organismo.Estas vacinas de polissacarideos são eficazes a curtoprazo, contudo as pessoas vacinadas não desenvolvem umamemória imunológica, de modo que devem ser revacinadasem um período de três anos para manter seu nível deresistência.

Adicionalmente, estas vacinas de polissacarideonão induzem níveis suficientes de anticorposbactericidas para obter a proteção desejada em criançascom menos de dois anos de idade, que são as principaisvítimas desta doença. Nenhuma vacina eficaz contraisolados de sorogrupo B está atyalmente disponívelembora estes organismos sejam uma das principais causasde doenças meningococcal em países desenvolvidos.Realmente, o polissacarideo de sorogrupo B não é um bomimunógeno, induzindo apenas uma resposta deficiente deIgM de baixa especificidade que não é protetora[ Gotschlich e outros, J. Exp. Med., pág. 129, 1349(1969); Skevakis e outros, J. Infect. Dis., 149, pág.387 (1984); Zollinger e outros, J. Clin. Invest., 63,pág. 836 (1979)]. Além disso, a presença de estruturasreativas transversais estreitamente similares nasglicoproteínas de tecido de cérebro humano neonatal[Finne e outros, Lancet, pág. 355 (1983)] poderiamdesencorajar tentativas em aperfeiçoar aimunogenicidade de polissacarideo de sorogrupo B.Para obter uma vacina mais eficaz, outrosantigenos superficiais de Neisseria meningitidis comolipopolissacarídeo, proteínas de pêlos e proteínaspresentes na membrana externa estão sob investigação.

A presença de uma resposta imune humana e anticorposbactericidas contra certos destes antigenossuperficiais proteináceos no soro de voluntáriosimunizados e pacientes convalescentes foi demonstrada[Mandrell e Zollinger, Infect. Immun., 57, pág. 1590(1989); Poolman e outros, Infect. Immun., 40, pág. 398(1983); Rosenquist e outros, J. Clin. Microbiol., 26,pág. 1543 (1988); Wedege e Froholm, Infect. Immun. 51,pág. 571 (1986) ; Wedege e Michaelsen, J. Clin.Microbiol., 25, pág. 1349 (1987)].

Além disso, anticorpos monoclonais orientadoscontra proteínas de membrana externa, como classe 1,2/3 e 4, foram também reportados como sendobactericidas e protegendo contra infecçõesexperimentais em animais [Brodeur e outros., Infec.Immun., 50, pág. 510 (1985); Frasch e outros, Clin.Invest. Med., 9, pág. 101 (1986); Saukkonen e outrosMicrob. Pathogen., 3, pág. 261 fl987); Saukkonen eoutros, Vaccine, 7, pág. 325 (1989)].

Preparados de antígeno baseados em proteínas demembrana externa de Neisseria meningitidis demonstraramefeitos imunogênicos em animais e em seres humanos ealguns deles foram testados em experimentos clínicos[Bjune e outros, Lancet, pág. 1093 (1991); Costa eoutros, NIPH Annals., 14, pág. 215 (1991); Frasch eoutros, MecL Trop., 43, pág. 177 (1982); Frasch eoutros, Eur. J. Clin. Microbiol., 4, pág. 533 (1985);Frasch e outros em Robbins, Bacterial Vaccines, pág.262, Praeger Publieations, N.Y. (1987); Fraseh eoutros, J. Infee. Dis., 158, pág. 710 (1988); Moreno eoutros, lnfec. Immun., 47, pág. 527 (1985); Rosenqviste outros, J. Clin. Mierobiol., 26, pág. 1543 (1988);Sierra e outros, NIPH Annals, 14, pág. 195 (1991);Wedege e Froholm, Infec. Immun. 51, pág. 571 (1986);Wedege e Michaelsen, J. Clin. Mierobiol., 25 pág. 1349(1987); Zollinger e outros, J. Clin. Invest., 63, pág.836 (1979); Zollinger e outros, NIPH Annals, 14, pág.211 (1991)]. Contudo, a existência de grandevariabilidade antigênica entre cepas nas proteínas demembrana externa pode limitar seu uso em vacinas[ Frasch, Clin. Microb., Rev. 2, pág. S134 (1989)].Realmente, grande parte destes preparados induziramanticorpos bactericidas que foram limitados ao mesmosorótipo ou sorótipo relacionado do qual o-antígeno foiextraído [Zollinger em Woodrow e Levine, New GenerationVaccines, pág. 325, Mareei Dekker Inc., N.Y. (1990)].Além disso, a proteção conferida por estas vacinas emcrianças pequenas ainda tem de ser claramenteestabelecida. As proteínas de membrana externa deNeisseria meningitidis altamente conservadas como aclasse 4 [Munkley e outros Microb. pathog., 11, pág.447 (1991)] e a proteína de lábio (também denominadaΗ. 8) [Woods e outros, Infect. Immun., 55, pág. 1927(1987)] não são candidatos a vacina interessantes umavez que não causam a produção de anticorposbactericidas. Para aperfeiçoar estes preparados devacina, há necessidade de proteínas altamenteconservadas que estariam presentes na superfície detodas as cepas de Neisseria meningitidis e que seriamcapazes de extrair anticorpos bactericidas paradesenvolver uma vacina de espectro amplo.

O diagnóstico atual de laboratório de Neisseriameningitidis é feito, normalmente por técnicas comométodo Gram de preparados de mancha, aglutinação delátex ou aglutinação em conjunto, e a cultura eisolamento em meios enriquecidos e seletivos [Morello eoutros, em Balows, Manual of Clinicai Microbiology,pág. 258, American Society for Microbiology, Washington(1991)]. Testes de degradação de carboidrato sãonormalmente realizados para confirmar a identificaçãode isolados de Neisseria meningitidis. Grande partedos procedimentos descritos são processos demorados queexigem pessoal treinado. Kits de aglutinação ouaglutinação em conjunto comerciais contendo sorospolivalentes dirigidos contra os antígenos capsularesexpressos pelos sorogrupos mais predominantes sãoutilizados para rápida identificação de Neisseriameningitidis. Contudo, estes soros polivalentesfreqüentemente reagem transversalmente nãoespecificamente com outros espécies de bactérias e poreste motivo devera ser sempre utilizadas em combinaçãocom cultura e método de Gram. Por conseguinte, hánecessidade de alternativas eficientes a estes ensaiosde diagnóstico que aperfeiçoarão a rapidez econfiabilidade do diagnóstico.

REVELAÇÃO DA INVENÇÃO

A presente invenção resolve os problemasmencionados acima pela provisão de um antigenoimunologicamente acessível, altamente conservado nasuperfície de organismos de Neisseria meningitidis.

São também fornecidos moléculas de DNA recombinantesque codificam para o antigeno acima, hospedeirosunicelulares transformados com aquelas moléculas deDNA, e um processo para fazer antigeno recombinante,substancialmente puro. São também fornecidosanticorpos específicos para o antigeno de Neisseriameningitidis acima. O antigeno e anticorpos dapresente invenção fornecem a base para processos únicose composições farmacêuticas para a detecção, prevençãoe tratamento de doenças de Neisseria meningitidis.

O antigeno preferido é a proteína superficialde 22 kDa de Neisseria meningitidis, incluindofragmentos, análogos e seus derivados. Os anticorpospreferidos são os anticorpos monoclonais Me-I e Me-7específicos para a proteína superficial de 22 kDa deNeisseria meningitidis. Estes anticorpos são altamentebacteriolíticos contra Neisseria meningitidis epassivamente protegem camundongos contra infecçãoexperimental.

A presente invenção fornece ainda processospara isolar antigenos superficiais de Neisseriameningitidis novos e anticorpos específicos aos mesmos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 ilustra as seqüências de aminoácidoderivado e nucleotídeo da proteína de superfície de 22kDa 608B da cepa Neisseria meningitidis (SEQ ID NO: 1,SEQ ID NO: 2) . Símbolos de três letras convencionaissão utilizados para os resíduos de aminoácido. Oquadro de leitura aberta estende-se do codon de partidana base 143 até o codon de parada na base 667. Oquadro indica o sítio de ligação de ribossomo putativoao passo que a seqüência promotora -10 putativa ésublinhada. Um peptídeo de sinal de 19 aminoácidostambém é sublinhado.

A figura 2 é uma fotografia de um gel SDS-PAGEa 14% manchado com Coomassie Blue exibindo digestos deα-quimotripsina e tripsina de preparados de membranaexterna (B:2a:PI.2) 608B da cepa Neisseriameningitidis. A faixa 1 contém os seguintes marcadoresde peso molecular: Fosforilase b (97.400); albumina desoro bovino (66.200); ovalbumina (45.000); anidrasecarbônica (31.000); inibidor de tripsina de soja(21.500) e lisozima (14.400). A faixa 2 contémpreparado de membrana externa de controle não digerido.A faixa 3 contém preparado tratado com a-quimotripsina(2mg de enzima por mg de proteína) ; a faixa 4 contémpreparado tratado com tripsina.

A figura 3a é uma fotografia de um gel SDS-PAGEa 14% manchado com Coomassie Blue exibindo digestos deproteinase K de preparados de membrana externa(B:2a:P1.2) 608B de cepa Neisseria meningitidis. Asfaixas 1, 3, 5 e 7 contêm controle não digerido. Asfaixas 2, 4, 6 e 8 contêm preparados de membranaexterna digeridos com proteinase K (2 IU por mg deproteína) . As faixas 1 a 4 contêm preparados tratadosem pH 7,2. As faixas 5 a 8 contêm preparados tratadosem pH 9,0. As faixas 1, 2, 5 e 6 contêm preparadostratados sem SDS. As faixas 3, 4, 7 e 8 contêmpreparados tratados na presença de.SDS. Marcadores depeso molecular são indicados à esquerda (emkilodaltons).

A figura 3b é uma fotografia de gel SDS-PAGE a14% manchado com Coomassie Blue exibindo os perfis demigração de proteína de 22 kDa recombinante purificadopor afinidade. A faixa 1 contém marcadores de pesomolecular: fosforilase b (97.400), albumina de sorobovino (66.200), ovalbumina (45.000), anidrasecarbônica (31.000), inibidor de tripsina de soja(21.500) e lisozima (14.400). A faixa 2 contém 5 ug deproteína de 22 kDa recombinante purificado porafinidade de controle. A faixa 3 contém 5 ug deproteína de 22 kDa recombinante purificada porafinidade aquecida a IOO0C por 5 min. A faixa 4 contém5 ug de proteína de 22 kDa recombinante purificada porafinidade aquecida a 100°C por 10 min. A faixa 5contém 5 ug de proteína de 22 kDa recombinantepurificada por afinidade aquecida a 100°C por 15 min.

A figura 4 é uma fotografia de géis SDS-PAGE a14% manchados com Coomassie Blue e seus imunoborrõesOcidentais correspondentes mostrando a reatividade deanticorpos monoclonais específicos à proteínasuperficial de 22 kDa de Neisseria meningitidis. Opreparado de membrana externa de cepa de Neisseriameningitidis 608B (B:2a:P1.2) (A) não tratado); (B)Proteinase K tratada (2 IU por mg de proteína) . Afaixa 1 contém marcadores de peso molecular e perfil demigração característico em gel SDS-PAGE a 14% depreparados de membrana externa. A faixa 2 contém Me-2;a faixa 3 contém Me-3; a faixa 4 contém Me-5; a faixa 5contém Me-7; e a faixa 6 contém um anticorpo monoclonalde controle não relacionado. Os marcadores de pesomolecular são fosforilase b (97.400), albumina de sorobovino 966.200), ovalbumina (45.0001, anidrasecarbônica (31.000), inibidor de tripsina de soja(21.500) e lisozima (14.400). Os resultados deimunoborrão mostrados na figura 4 para Me-2, Me-3, Me-5, Me-6 e Me-7 são compatíveis com os resultados deimunoborrão obtidos para Me-I.

A figura 5 é uma ilustração gráfica daatividade de ligação dos anticorpos monoclonais acélulas bacterianas intactas. Os resultados paraanticorpos monoclonais representativos Me-5 e Me-7 sãoapresentados em contagens por minuto ("CPM") no eixovertical. As várias cepas bacterianas utilizadas noensaio são mostradas no eixo horizontal. Um anticorpomonoclonal especifico de porin de Neisseriameningitidis Haemophilus influerizae foi utilizado comoum controle negativo. Contagens de fundo abaixo de 500CPM foram registradas e foram subtraídas dos valores deligação.

A figura 6 é uma fotografia de géis SDS-PAGE a14% manchados e seu imunoborrão Ocidentalcorrespondente demonstrando a purificação da proteínasuperficial de Neisseria " meningitidis de 22 kDarecombinante de sobrenadante de cultura concentrada decepa de Escherichia coli BL21 (DE3) . A figura 6 (A) éuma fotografia de um gel de SDS-PAGE a 14% manchado comprata e Coomassie Blue. A faixa 1 contém os seguintesmarcadores de peso molecular: fosforilase b (97.400),albumina de soro bovino (66.200), ovalbumina (45.000)anidrase carbônica (31.000), inibidor de- tripsina desoja (21.500) e lisozima (14.400). A faixa 2 contémpreparado de proteína de membrana externa extraído decepa de Neisseria meningitidis 608B (sorótipoB: 2a:pl.2) (10 mg). A faixa 3 contém sobrenadante decultura concentrada de Escherichia coli BL21(DE3) (10mg). A faixa 4 contém proteína superficial deNeisseria meningitidis de 22 kDa recombinantepurificado por afinidade (1 mg). A figura 6 (B) é umafotografia de um gel SDS-PAGE a 14% manchado comCoomassie Blue de digestos de α-quimotripsina, tripsinae proteinase K de proteína superficial de Neisseriameningitidis de 22 kDa recombinante purificada porafinidade. A faixa 1 contém os seguintes marcadores depeso molecular: fosforilase b (97.400), albumina desoro bovino (66.200), ovalbumina (45.000), anidrasecarbônica (31.000), inibidor de tripsina de soja(21.500) e lisozima (14.400). As faixas 2 a 5 contêmproteína de superfície de Neisseria meningitidis de 22kDa recombinante purificada (2 mg) . As faixas 7 a 10contêm albumina de soro bovino (2 mg). As faixas 2 e 7contêm proteína não digerida ("NT"). As faixas 3 e 8contêm proteína tratada com α-quimotripsina ("C") (2 mgde enzima por mg de proteína) . As faixas 4 e 9 contêmproteína tratada com tripsina ("T") (2 mg de enzima pormg de proteína) . As faixas 5 e 10 contêm proteínatratada com proteinase K ("K") (2 iU por mg deproteína). A figura 6 (C) é uma fotografia deimunoborrão Ocidental de um gel duplicata utilizandoanticorpo monoclonal Me-5.

A figura 7 é uma ilustração gráfica daatividade bactericida de anticorpos monoclonais deproteína superficial de 22 kDa anti- Neisseriameningitidis purificados com proteína A contra cepaNeisseria meningitidis 608B (B:2a:P1.2). O eixovertical do gráfico mostra a percentagem desobrevivência das bactérias de Neisseria meningitidisapós exposição a várias concentrações de anticorporaonoclonal (mostrado no eixo horizontal do gráfico).

A figura 8 ilustra as seqüências de aminoácidoderivado e nucleotideo da proteína de superfície de 22kDa MCH88 da cepa Neisseria meningitidis (SEQ ID NO: 3,SEQ ID NO: 4). Símbolos de três letras, convencionais,são utilizados para os resíduos de aminoácido. Oquadro de leitura aberta estende-se do códon de partidana base 116 até o codon de parada na base 643.

A figura 9 ilustra as seqüências de aminoácidoderivado e nucleotideo da proteína superficial de 22kDa Z4063 da cepa Neisseria meningitidis (SEQ ID NO: 5;SEQ ID NO:6). Símbolos de três letras convencionaissão utilizados para os resíduos de aminoácido. Oquadro de leitura aberta estende-se do codon de partidana base 208 até o codon de parada na base 732.

A figura 10 ilustra as seqüências de aminoácidoderivado e nucleotideo da proteína superficial de 22kDa de cepa Neisseria meningitidis b2 (SEQ ID NO: 7,SEQ ID NO: 8). Símbolos de três letras convencionaissão utilizados para os resíduos de aminoácido. Oquadro de leitura aberta estende-se do codon de partidana base 241 até o codon de parada na base 7 65.

A figura 11 ilustra a seqüência de consensoestabelecida das seqüências de DNA das quatro cepas deNeisseria e indica as substituições ou inserção denucleotídeos específicos para cada cepa.A figura 12 ilustra a seqüência de consensoestabelecida das seqüências de proteína das quatrocepas de Neisseria e indica as substituições ouinserção de resíduos de aminoácido específicos paracada cepa.

A figura 13 representa o curso de tempo daresposta imune à proteína de 22 kDa recombinante emcoelhos expresso como o título ELISA recíproco. Oscoelhos foram injetados com preparados de membranaexterna de cepa E. coli JM109 com plasmídeo pN2202 oucom plasmídeo de controle pWKS30. O desenvolvimento deresposta humoral específica foi analisado por ELISAutilizando preparados de membrana externa obtidos decepa Nelsseria meningitidis 608B (B:2a:PI.2) comoantígeno de revestimento.

A figura 14 representa o curso de tempo daresposta imune à proteína de 22 kDa recombinante emmacacos Macaca fascicularis (cynomolgus) expresso comoo título ELISA recíproco. Os dois macacos foramrespectivamente imunizados com 100 ug (K28) e 200ug(I276) de proteína 22 kDa purificada por afinidadepor injeção. O macaco de controle (K65) foi imunizadocom 150 ug de proteína recombinante não relacionadaseguindo o mesmo procedimento. 0 desenvolvimento deresposta humoral específica foi analisado por ELISAutilizando preparados de membrana externa obtidos decepa Neisseria meningitidis 608B (B:2a:PI.2) comoantígeno de revestimento.A figura 15 é uma representação gráfica dospeptideos sintéticos da invenção bem como suarespectiva posição na proteína 22 kDa total de cepaNeisseria meningitidis 608B (B:2a:P1.2).

A figura 16 é um mapa de plasmídeo pNP2204contendo o gene que codifica a proteína superficial de22 kDa Neisseria meningitidis 22 kDa, gene de proteínade superfície 22 kDa de Neisseria meningitidis; regiãode codificação de resistência à ampicilina, Ampip;ColEl, origem de replicação; cI857, gene repressorsensível á temperatura cI857 λ bacteriof ago; λΡΙ.,promotor de transcrição λ bacteriogafo; terminador detranscrição Tl. A direção de transcrição é indicadapelas setas. BglII e BamHl são os sítios de restriçãoutilizados para inserir o gene de 22 kDa no plasmídeop629.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Durante nosso estudo da ultraestrutura damembrana externa de Neisseria meningitidisidentificamos uma nova proteína com baixo pesomolecular de 22 kilodaltons que tem propriedades muitoúnicas. Esta proteína de membrana externa é altamenteresistente a tratamentos extensos com enzimasproteolíticas, como proteinase K, uma protease deserina derivada de membro de Tritirachium álbum defungo. Isto é muito surpreendente uma vez que proteínasresistentes a proteinase K são de natureza muito rarapor causa da potência, condição de pH amplo, e baixaespecificidade de ligação de peptideo desta enzima[Barrett, A.J. e N.D. Rawlings, Biochem. Soe.Transactions (1991) 19: 707-715]. Apenas algunsrelatórios descreveram proteínas de origem procarióticaque são resistentes à degradação enzimática deproteinase K. Proteínas resistentes a Proteinase Kforam encontradas em espécies Leptospira [Nicholson,V.M. e J. F. Prescott, Veterinary Microbiol. (1993)36:123 - 138], espécies Mycoplasma [Butler, G.H eoutros Infec. Immun. (1991) 59:1037-1042], Spiroplasmamirum [Bastian, F.O. e outros J. Clin. Microbiol.(1987) 25:2430-2431] e em vírus e prions [Onodera, T. eoutros Microbiol. Immunol. (1993) 37:311-316; Prusiner,S. B. e outros. proc. Nat. Acad.. Sei. USA (1993)90:2793-2797]. Aqui, descrevemos o uso desta proteínacomo meio para a prevenção, tratamento e diagnósticoaperfeiçoados de infecções por Neisseria meningitidis.

Desse modo, de acordo com um aspecto dainvenção, fornecemos uma proteína superficial deNeisseria meningitidis, imunologicamente acessível,altamente conservada, e seus fragmentos, análogos, ederivados. Como utilizado aqui, "proteína superficialde Neisseria meningitidis" significa qualquer proteínasuperficial de Neisseria meningitidis codificada por umgene de Neisseria meningitidis de ocorrência natural.A proteína de Neisseria meningitidis de acordo com ainvenção pode ser de origem natural, ou pode ser obtidaatravés da aplicação de biológica molecular com oobjetivo de produzir uma proteína recombinante, ou seufragmento.

Como utilizado aqui, "altamente conservadasignifica que o gene para a proteína superficial deNeisseria meningitidis e a própria proteína existem emmais de 50% de cepas conhecidas de Neisseriameningitidis. Preferivelmente, o gene e sua proteínaexistem em mais de 99% de cepas conhecidas de Neisseriameningitidis. Os exemplos 2 e 4 expõe processos pelosquais uma pessoa versada no estado da técnica seriacapaz de testar uma variedade de proteínas superficiaisde Neisseria meningitidis diferentes para determinar sesão "altamente conservados".

Como utilizado aqui, "imunologicamenteacessível" significa que a proteína superficial deNeisseria meningitidis está presente na superfície doorganismo e é acessível a anticorpos. O exemplo 2expõe processos pelos quais uma pessoa versada noestado da técnica seria capaz de testar uma variedadede proteínas superficiais de Neisseria meningitidisdiferentes Neisseria meningitidis para determinar sesão "imunologicamente acessíveis". A capacidade deacesso imunológico pode ser determinada por outrosprocessos, incluindo um ensaio de aglutinação, ELISA,RIA, um ensaio de imunoborrão, um ensaio de enzima-ponto, um ensaio de capacidade de acesso de superfície,microscopia de elétrons, ou uma combinação destesensaios.Como utilizado aqui, "fragmentos" da proteínasuperficial de Neisseria meningitidis incluempolipeptídeos tendo pelo menos um epítopo de peptídeo,ou seus análogos e derivados. Peptideos deste tipopodem ser obtidos através da aplicação de biologiamolecular ou sintetizados utilizando técnicas desíntese de peptídeo de fase líquida ou sólida,convencionais.

Como utilizado aqui, "análogos" da proteína desuperfície Neisseria meningitidis incluem aquelasproteínas, ou seus fragmentos, em que um ou maisresíduos de aminoácido na seqüência de ocorrêncianatural é substituído por outro resíduo de aminoácido,desde que as propriedades de proteção e funcionalidadeglobais desta proteína sejam preservadas. Taisanálogos podem ser produzidos sinteticamente, ou portecnologia de DNA recombinante, por exemplo, pormutagênese de uma proteína superficial de Neisseriameningitidis de ocorrência natural. Tais procedimentossão bem conhecidos no estado da técnica.

Por exemplo, um tal análogo é selecionado daproteína recombinante que pode ser produzida do genepara a proteína de 22 kDa de cepa Neisseria gonorrhoeaeb2, como ilustrado na figura 10. Um análogo adicionalpode ser obtido do isolamento do gene correspondente deNeisseria lactamica.

Como utilizado aqui, um "derivado" da proteínasuperficial de Neisseria meningitidis é uma proteína ouseu fragmento que foi covalentemente modificado, porexemplo, com dinitrofenol, para tornar o mesmoimunogênico em seres humanos. Os derivados da presenteinvenção também incluem derivados dos análogos deaminoácido da presente invenção.

Será entendido que seguindo os exemplos dapresente invenção, uma pessoa versada no estado datécnica pode determinar sem experimentação indevida seum fragmento, análogo ou derivado especifico seria útilno diagnóstico, prevenção ou tratamento de doenças deNelsseria meningitidis.

A presente invenção também inclui formaspoliméricas das proteínas superficiais de Neisseriameningitidis, fragmentos, análogos e derivados. Estasformas poliméricas incluem, por exemplo, um ou maispolipeptídeos que foram reticulados com reticuladorescomo avidina/biotina, gluteraldeído oudimetilsuberimidato. Tais formas poliméricas tambémincluem polipeptídeos contendo duas ou mais seqüênciasde Neisseria meningitidis contíguas em tangem ouinvertidas, produzidas de mRNAs multicistrônicosgerados por tecnologia de DNA recombinante.

A presente invenção fornece proteínassuperficiais de Neisseria meningitidis substancialmentepuras. 0 termo "substancialmente pura" significa que aproteína superficial de Neisseria meningitidis deacordo com a invenção é livre de outras proteínas deorigem Neisseria meningitidis. Preparados de proteínade superfície de Neisseria meningitidissubstancialmente pura podem ser obtidos por umavariedade de processos convencionais, por exemplo oprocedimento descrito nos Exemplos 3 e 11.

Em um aspecto adicional, a invenção forneceparticularmente uma proteína superficial de 22 kDa deNeisseria meningitidis tendo a seqüência de aminoácidoda figura 1 (SEQ ID NO: 2), ou um seu fragmento,análogo ou derivado.

Em um aspecto adicional, a invenção forneceparticularmente uma proteína superficial de 22 kDa deNeisseria meningitidis tendo a seqüência de aminoácidoda figura 8 (SEQ ID NO: 4), figura 9 (SEQ ID NO: 6) ouum fragmento, análogo ou derivado do mesmo. Talfragmento pode ser selecionado dos peptídeosrelacionados na figura 15 (SEQ ID NO: 9 a SEQ ID NO:26).

Em um aspecto adicional, a invenção fornece umaproteína superficial de 22 kDa de Neisseria gonorrhoeaetendo a seqüência de aminoácido da figura 10 (SEQ IDNO: 8), ou um seu fragmento, análogo ou derivado. Comoserá evidente do acima, qualquer referência à proteínade 22 kDa de Neisseria meningitidis também abrangeproteínas de 22 kDa isoladas de, ou feitas de genesisolados de outras espécies de Neisseriacae comoNeisseria gonorrhoeae ou Neisseria lactamica.

Uma proteína superficial de 22 kDa de Neisseriameningitidis de acordo com a invenção pode seradicionalmente caracterizado por uma ou mais dasseguintes características:

(1) tem um peso molecular apropriado de 22 kDacomo avaliado em gel SDS-PAGE;

(2) sua mobilidade eletroforética em gel SDS-PAGE não é modificada por tratamento com agentes deredução;

(3) tem um ponto isoelétrico (pi) em uma faixaem torno de pi 8 a pi 10;

(4) é altamente resistente à degradação porenzimas proteolíticas como α-quimotripsina, tripsina eproteinase K;

(5) oxidação de periodato não abole a ligaçãoespecífica de anticorpo dirigido contra a proteínasuperficial de 22 kDa Neisseria meningitidis;

(6) é um antígeno altamente conservado;

(7) é acessível a anticorpo na superfície deorganismos de Neisseria meningitidis intactos;

(8) pode induzir a produção de anticorposbactericidas;

(9) pode induzir a produção de anticorpos quepodem proteger contra infecção experimental;

(10) pode induzir,quando injetado em umhospedeiro animal, o desenvolvimento de uma respostaimunológica que pode proteger contra infecção porNeisseria meningitidis.

Esta invenção também fornece, pela primeiravez, uma seqüência de DNA codificando para a proteínasuperficial de 22 kDa de Neisseria meningitidis (SEQ IDNO: 1, NO: 3, NO: 5 E NO: 7) . As seqüências de DNApreferidas da presente invenção são selecionadas dogrupo que consiste em:

(a) a seqüência de DNA da figura 1 (SEQ ID NO: 1) ;

(b) a seqüência de DNA da figura 8 (SEQ ID NO: 3) ;

(c) a seqüência de DNA da figura 9 (SEQ ID NO: 5);

(d) a seqüência de DNA da figura 10(SEQ ID NO: 7) ;

(e) análogos ou derivados das seqüências de DNAsupra;

(f) seqüências de DNA degeneram a qualquer dasseqüências de DNA supra; e

(g) fragmentos de quaisquer das seqüências deDNA supra; em que as referidas seqüências codificam umproduto que exige a atividade imunológica da proteínasuperficial de 22 kDa de Neisseria meningitidis.

Tais fragmentos são preferivelmente peptídeoscomo ilustrado na figura 15 (SEQ ID NO: 9, até SEQ IDNO: 26) .

Preferivelmente, esta invenção também fornece,pela primeira vez, uma seqüência de DNA codificandopara a proteína superficial de 22 kDa de Neisseriameningitidis (SEQ ID NO: 1) . Seqüências de DNA maispreferidas da presente invenção são selecionadas dogrupo que consiste em:

(a) a seqüência de DNA da figura 1 (SEQ ID NO: 1) ;

(b) análogos ou derivados das seqüências de DNAsupra;

(d) fragmentos de quaisquer das seqüências deDNA acima; em que as referidas seqüências codificam umproduto que exibe a atividade imunológica da proteínasuperficial de 22 kDa de Neisseria meningitidis.

Análogos e derivados do gene de codificação deproteína superficial de 22 kDa de Neisseriameningitidis hibridizarão com o gene de codificação deproteína superficial de 22 kDa sob as condiçõesdescritas no exemplo 4.

Para fins da presente invenção, os fragmentos,análogos e derivados da proteína superficial de 22 kDade Neisseria meningitidis têm a "atividade-imunológica"da proteína superficial de 22 kDa de Neisseriameningitidis se podem induzir, quando injetados em umhospedeiro animal, o desenvolvimento de uma respostaimunológica que pode proteger contra infecção porNeisseria meningitidis. Uma pessoa versada no estadoda técnica pode determinar se uma seqüência de DNAespecífica codifica um produto que exige a atividadeimunológica da proteína superficial de 22 kDa deNeisseria meningitidis seguindo os procedimentosexpostos aqui no exemplo 6.

As proteínas superficiais de Neisseriameningitidis da presente invenção podem ser isoladaspor um processo que compreende as seguintes etapas:

a) isolar uma cultura de bactéria de Neisseriameningitidis,

b) isolar uma porção de membrana externa dacultura da bactéria; e

c) isolar o referido antígeno da porção demembrana externa.

Em particular, a etapa acima 9c) pode incluiras etapas adicionais de tratar os extratos de proteínade membrana externa de Neisseri^a meningitidis comproteinase K, seguido por fracionamento de proteínautilizando técnicas de separação convencionais comopermuta de íons e cromatografia de gel e eletroforese.

Alternativamente e preferivelmente, asproteínas superficiais de Neisseria meningitidis dapresente invenção podem ser produzidas -pelo uso detécnicas de biologia molecular, como descrito maisespecificamente no exemplo 3 aqui. 0 uso de técnicasde biologia molécula é particularmente bem adequadopara a preparação de proteína superficial de 22 kDa deNeisseria meningitidis recombinante, substancialmentepura.

Desse modo, de acordo com um aspecto adicionalda invenção fornecemos um processo para a produção deproteína superficial de 22 kDa de Neisseriameningitidis recombinante, incluindo fragmentos,análogos e seus derivados, compreendendo as etapas de(1) cultivar um organismo hospedeiro unicelulartransformado com uma molécula de DNA recombinanteincluindo uma seqüência de DNA codificando para areferida proteína, fragmento, análogo ou derivado e umaou mais seqüências de controle de expressãooperativamente ligadas à seqüência de DNA, e (2)recuperar uma proteína substancialmente pura,fragmento, análogo ou derivado.

Como é bem sabido no estado da técnica, paraobter níveis de expressão elevada de um genetransfectado em um hospedeiro, o gene deve seroperativamente ligado a seqüências de controle deexpressão de transcrição e tradução que são funcionaisno hospedeiro de expressão escolhido. Preferivelmente,as seqüências de controle de expressão, e o gene deinteresse, serão contidos em um vetor de expressão quecompreende ainda um marcador de seleção bacteriano eorigem de replicação. Se o hospedeiro de expressão foruma célula eucariótica, o vetor de expressão devecompreender ainda um marcador de expressão útil nohospedeiro de expressão.

Uma ampla variedade de combinações devetor/hospedeiro de expressão pode ser empregada paraexpressar as seqüências de DNA desta invenção. Vetoresde expressão úteis para hospedeiros eucarióticosincluem, por exemplo, vetores compreendendo seqüênciasde controle de expressão de SV40, vírus de papilomabovino, adenovírus e citomegalovírus. Vetores deexpressão úteis para hospedeiros bacterianos incluemplasmídeos bacterianos conhecidos, como plasmídeos deE. coli, incluindo col El, pCRl, pBR322, pMB9 e seusderivados, plasmídeos de faixa de hospedeiro maisampla, como RP4, DNAs de fago, por exemplo, os inúmerosderivados de fago lambda, por exemplo NM989, e outrosfagos de DNA, como M13 e fagos de DNA de perna únicafilamentosa. Vetores de expressão úteis para célulasde levedo incluem o plasmídeo 2 mu e seus derivados.Vetores úteis para células de inseto incluem pVL 941.

Além disso, qualquer de uma ampla variedade deseqüências de controle de expressão pode ser utilizadanestes vetores para expressar as seqüências de DNA dapresente invenção. Tais seqüências de controle deexpressão úteis incluem as seqüências de controle deexpressão associadas a genes estruturais dos vetores deexpressão acima. Os exemplos de seqüências de controlede expressão úteis incluem, por exemplo, os promotoresinicial e posterior de SV40 ou adenovírus, o sistemalac, o sistema trp, o sistema TAC ou TRC, as principaisregiões de operador e promotor de fago lambda, asregiões de controle de proteína de revestimento fd, opromotor para 3-fosfoglicerato quinase ou outrasenzimas glicolíticas, os promotores de fosfatase ácida,por exemplo, Pho5, os promotores do sistema de alfa-correspondência de levedo e outras seqüênciasconhecidas para controlar expressão de genes de célulasprocarióticas e eucarióticas ou seus virus, e váriascombinações das mesmas. A seqüência de controle deexpressão de proteína superficial de 22 kDa deNeisseria meningitidis é particularmente útil naexpressão da proteína de superfície de 22 kDa deNeisseria meningitidis em E. coli (Exemplo 3).

Células hospedeiras transformadas com osvetores acima formam um aspecto adicional da presenteinvenção. Uma ampla variedade de células hospedeirasunicelulares são úteis em expressar as seqüências deDNA da presente invenção. Estes hospedeiros podemincluir hospedeiros eucarioticos e procarióticos bemconhecidos, como cepas de E. coli, Pseudomonas,Bacillus, Streptomyces, fungos, levedo, células deinseto como Spodoptera frugiperda (SF9) , células deanimais como CHO e células de camundongo, células demacaco verde da África como COS 1, COS 7, BSC 1, BSC40, e BMT 10, e células humanas e células de plantas emcultura de tecido. Organismos hospedeiros preferidosincluem bactérias como E. coli e Bacillus subtilis ecélulas mamíferas em cultura de tecido.

Deve ser, evidentemente, entendido que nemtodos os vetores e seqüências de controle de expressãofuncionarão igualmente bem para expressar as seqüênciasde DNA desta invenção. Nem todos os hospedeirosfuncionarão igualmente bem com o mesmo sistema deexpressão. Contudo, uma pessoa versada no estado datécnica pode fazer uma seleção entre estes vetores,seqüências de controle de expressão e hospedeiros semexperimentação indevida e sem se afastar do âmbito dapresente invenção. Por exemplo, na seleção de umvetor, o hospedeiro deve ser considerado porque o vetordeve replicar no mesmo. 0 número de cópia do vetor, acapacidade de controlar aquele número de cópia, e aexpressão de quaisquer outras proteínas codificadaspelo vetor, como marcadores de antibiótico, tambémdevem ser consideradas.

Ao selecionar uma seqüência de controle deexpressão, uma variedade de fatores também deve serconsiderada. Estes incluem, por exemplo, a resistênciarelativa da seqüência, sua capacidade de controle, esua compatibilidade com as seqüências de DNA dapresente invenção, particularmente com relação aestruturas secundárias em potencial. Hospedeirosunicelulares devem ser selecionados por consideração desua compatibilidade com o vetor escolhido, a toxicidadedo produto codificado pelas seqüências de DNA destainvenção, suas características de secreção, suacapacidade de dobrar a proteína corretamente, suafermentação ou exigências de cultura, e a facilidade depurificação da mesma dos produtos codificados pelasseqüências de DNA da presente invenção.

Dentro destes parâmetros, uma pessoa versada noestado da técnica pode selecionar várias combinações devetor/seqüência de controle de expressão/hospedeiro queexpressarão as seqüências de DNA desta invenção emfermentação ou em cultura animal em grande escala.

Os polipeptideos codificados pelas seqüênciasde DNA da presente invenção podem ser isolados dafermentação ou cultura de célula e purificadosutilizando quaisquer de uma variedade de processosconvencionais. Uma pessoa versada no estado da técnicapode selecionar as técnicas de isolamento e purificaçãomais apropriadas sem se afastar do âmbito da presenteinvenção.

As proteínas de superfície de Neisseriameningitidis da presente invenção são úteis emcomposições profiláticas, terapêuticas e de diagnósticopara evitar, tratar e diagnosticar doenças ocasionadaspor infecção por Neisseria meningitidis.

As proteínas superficiais de Neisseriameningitidis da presente invenção são úteis emcomposições profiláticas, terapêuticas e de diagnósticopara evitar, tratar e diagnosticar doenças ocasionadaspor Neisseria gonorrhoeae, ou infecção por Neisserialactamica.

Em particular, fornecemos uma proteínasuperficial de 22 kDa de Neisseria meningitidis tendouma seqüência de aminoácido da figura 1 (SEQ ID NO: 2)ou um fragmento, análogo ou derivado do mesmo para usocomo um imunógeno e como uma vacina.Em particular, fornecemos uma proteínasuperficial de 22 kDa de Neisseria meningitidis tendouma seqüência de aminoácido da figura 1 (SEQ ID NO: 2),figura 8 (SEQ ID NO: 4), figura 9 (SEQ ID NO: 6), oufigura 10 (SEQ ID NO: 8), ou um fragmento, análogo ouderivado do mesmo para uso como um imunógeno e como umavacina.

Técnicas imunológicas padrão podem serempregadas com as proteínas superficiais de Neisseriameningitidis para utilizar as mesmas como imunógenos ecomo vacinas. Em particular, qualquer hospedeiroadequado pode ser injetado com uma quantidadefarmaceuticamente eficaz da proteína superficial de 22kDa de Neisseria meningitidis para gerar anticorposanti- Neisseria meningitidis monoclonais oupolivalentes ou induzir o desenvolvimento de umaresposta imunológica protetora contra doenças deNeisseria meningitidis. Antes da injeção dohospedeiro, as proteínas superficiais de Neisseriameningitidis podem ser formuladas em - um veículoadequado, e desse modo fornecemos uma composiçãofarmacêutica compreendendo um ou mais antígenos desuperfície de Neisseria meningitidis ou seusfragmentos. preferivelmente, o antígeno é a proteínasuperficial de 22 kDa de Neisseria meningitidis oufragmentos, análogos ou derivados dos mesmos juntamentecom um ou mais excipientes farmaceuticamenteaceitáveis. Como utilizado aqui, "quantidadefarmaceuticamente eficaz" se refere a uma quantidade deum ou mais antigenos superficiais de Neisseriameningitidis ou seus fragmentos que extrai um titulosuficiente de anticorpos anti- Neisseria meningitidispara tratar ou evitar infecção por Neisseriameningitidis.

As proteínas superficiais de Neisseriameningitidis da presente invenção também podem formar abase de um teste de diagnóstico para infecção porNeisseria meningitidis. Vários processos dediagnóstico são possíveis. Por exemplo, esta invençãofornece um processo para a detecção de antígenoNeisseria meningitidis em uma amostra biológicacontendo ou suspeita de conter antígeno Neisseriameningitidis compreendendo:

a) isolar a amostra biológica de um paciente;

b) incubar um anticorpo de proteína superficialde 22 kDa anti- Neisseria meningitidis ou seu fragmentocom a amostra biológica para formar uma mistura; e

c) detectar especificamente anticorpo ligado oufragmento ligado na mistura que indica a presença deantígeno Neisseria meningitidis.

Anticorpos preferidos no processo dediagnóstico acima são Me-I e Me-7.

Alternativamente, esta invenção fornece umprocesso para a detecção de anticorpo específico paraantígeno de Neisseria meningitidis em uma amostrabiológica contendo ou suspeita de conter o referidoanticorpo compreendendo:

a) isolar a amostra biológica de um paciente;

b) incubar uma proteina superficial deNeisseria meningitidis desta invenção ou seu fragmentocom a amostra biológica para formar uma mistura; e

c) detectar especificamente antigeno ligado oufragmento ligado na mistura que indica a presença deanticorpo especifico para antigeno de Neisseriameningitidis. Uma pessoa versada no estado da técnicareconhecerá que este teste de diagnóstico pode tervárias formas, incluindo um teste imunológico como umensaio imunossorvente ligado por enzima (ELISA) , umradioimunoensaio ou um ensaio de aglutinação de látex,essencialmente para determinar se anticorposespecíficos para a proteína estão presentes em umorganismo.

As seqüências de DNA da presente invençãotambém podem ser utilizadas para projetar sondas DNApara uso em detectar a presença da bactérias deNeisseria patogênica em uma amostra biológica suspeitade conter tal bactéria. 0 processo de detecção dapresente invenção compreende as etapas de:

a) isolar a amostra biológica de um paciente;

b) incubar uma sonda de DNA tendo uma seqüênciade DNA da presente invenção com a amostra biológicapara formar uma mistura; ec) detectar especificamente sonda de DNA ligadona mistura que indica a presença de bactéria Neisseria.

Sondas de DNA preferidas têm a seqüência de parde base da figura 1 (SEQ ID NO: 1), figura 8 (SEQ IDNO: 3), figura 9 (SEQ ID NO: 5), ou figura 10 (SEQ IDNO: 7), ou seqüência de consenso da figura 11 (SEQ IDNO: 9).

Uma sonda de DNA mais preferida tem a seqüênciade 525 pares de base da figura 1 (SEQ ID NO: 1).

As sondas de DNA da presente invenção tambémpodem ser utilizadas para detectar a circulação deácidos nucléicos Neisseria meningitidis em uma amostra,por exemplo utilizando uma reação de cadeia depolimerase, como um processo de diagnosticar infecçõespor Neisseria meningitidis. A sonda pode sersintetizada utilizando técnicas convencionais e podeser imobilizada em uma fase sólida, ou pode serrotulada com um rótulo detectável.

Uma sonda de DNA preferida para esta aplicaçãoé um oligômero tendo uma seqüência complementar a pelomenos aproximadamente 6 nucleotideos contíguos do genede proteína superficial de 22 kDa de Neisseriameningitidis da figura 1 (SEQ ID NO: 1), figura 8 (SEQID NO: 3), figura 9 (SEQ ID NO: 5), figura 10 (SEQ IDNO: 7), ou seqüência de consenso da figura 11 (SEQ IDNO: 9).

Uma sonda de DNA mais preferida para estaaplicação é um oligômero tendo uma seqüênciacomplementar a pelo menos aproximadamente 6nucleotídeos contíguos do gene de proteína superficialde 22 kDa de Neisseria meningitidis da figura 1 (SEQ IDNO: 1).

Outro processo de diagnóstico para a detecçãode Neisseria meningitidis em um paciente compreende asetapas de:

a) rotular um anticorpo da presente invenção ouseu fragmento com um rótulo detectável;

b) administrar o anticorpo rotulado oufragmento rotulado para o paciente; e

c) detectar anticorpo rotulado especificamenteligado ou fragmento rotulado no paciente que indica apresença de Neisseria meningitidis.

Para purificação de qualquer anticorpo deproteína superficial anti- Neisseria meningitidis,pode-se fazer uso de cromatografia de afinidadeempregando uma proteína superficial de Neisseriameningitidis imobilizada como o meio de afinidade.

Desse modo, de acordo com outro aspecto dainvenção, fornecendo uma proteína superficial de 22 kDade Neisseria meningitidis tendo uma seqüência deaminoácido que inclui a seqüência da figura 1 (SEQ IDNO: 2), figura 8 (SEQ ID NO: 4), figura 9 (SEQ ID NO:6), ou figura 10 (SEQ ID NO: 8), ou sua porção ou umseu análogo, covalentemente ligado a um suporteinsolúvel.Desse modo de acordo com um aspecto preferidoda invenção, fornecendo uma proteína superficial de 22kDa de Neisseria meningitidis tendo uma seqüência deaminoácido que inclui a seqüência da figura 1 (SEQ IDNO: 2), ou sua porção ou um seu análogo, covalentementeligado a um suporte insolúvel.

Uma característica adicional da invenção é ouso das proteínas superficiais de Neisseriameningitidis da presente invenção como imunógenos paraa produção de anticorpos específicos para o diagnósticoe em particular o tratamento de infecção por Neisseriameningitidis. Anticorpos adequados podem serdeterminados utilizando processos de seleçãoapropriados, por exemplo medindo a capacidade de umanticorpo específico de proteger passivamente contrainfecção por Neisseria meningitidis em um modelo deteste. Um exemplo de um modelo animal é o modelo decamundongo descrito nos Exemplos do presente. Oanticorpo pode ser um anticorpo inteiro ou um seufragmento de ligação de antígeno e pode em geralpertencer a qualquer classe de imunoglobulina. Oanticorpo ou fragmento pode ser de origem animal,especificamente de origem mamífera e maisespecificamente de origem murina, de rato ou humana.Pode ser um anticorpo natural ou um seu fragmento, ouse desejado, uma anticorpo recombinante ou fragmento deanticorpo. O termo anticorpo recombinante ou fragmentode anticorpo significa anticorpo ou fragmento deanticorpo que foram produzidos utilizando técnicas debiologia molecular. 0 anticorpo ou fragmentos deanticorpo podem ser de origem policlonal oupreferivelmente monoclonal. Pode ser especifico paradiversos epitopos associados às proteínas superficiaisde Neisseria meningitidis porém é preferivelmenteespecífico para um. Preferivelmente, o anticorpo ouseus fragmentos serão específicos para um ou maisepitopos associados à proteína superficial de 22 kDa deNeisseria meningitidis. São também preferidos osanticorpos monoclonais Me-I e Me-7 descritos aqui.

Exemplos

Para que esta invenção possa ser melhorentendida, os exemplos a seguir são expostos. Estesexemplos são para fins de ilustração apenas, e nãodevem ser considerados de modo algum como limitando oâmbito da invenção.

O Exemplo 1 descreve o tratamento de preparaçãode membrana externa de Neisseria meningitidis comenzimas proteolíticas e a identificação subseqüente daproteína superficial de 22 kDa de Neisseriameningi tidis.

O Exemplo 2 descreve a preparação de anticorposmonoclonais específicos para proteína superficial de 22kDa de Neisseria meningitidis.

O Exemplo 3 descreve a preparação de proteínasuperficial de 22 kDa recombinante de Neisseriameningi tidis.O Exemplo 4 descreve o uso de sondas de DNApara a identificação de organismos expressando aproteína superficial de 22 kDa de Neisseriameni ngi tidis.

O Exemplo 5 descreve o uso de um anticorpomonoclonal de proteína superficial de 22 kDa anti-Neisseria meningitidis para proteger camundongos contrainfecção por Neisseria meningitidis.

O Exemplo 6 descreve o uso de proteínasuperficial de 22 kDa recombinante purificado parainduzir uma resposta de proteção contra infecção porNeisseria meningitidis.

O Exemplo 7 descreve a identificação daseqüência para a proteína de 22 kDa e gene decodificação de proteína para outras cepas de Neisseriameningitidis (MCH88 e Z4063), e uma cepa de Neisseriagonorrhoeae.

O Exemplo 8 descreve a resposta imunológica decoelhos e macacos à proteína superficial de 22 kDa deNeisseria meningitidis.

O Exemplo 9 descreve o procedimento utilizadopara mapear os epítopos imunológicos diferentes daproteína superficial de 22 kDa de Neisseriameni ngi tidis.

O Exemplo 10 descreve a indução por calor de umvetor de expressão para a produção em ampla escala daproteína superficial de 22 kDa.O Exemplo 11 descreve um processo depurificação para a proteína superficial de 22kDa quandoproduzida pela tecnologia recombinante.

O Exemplo 12 descreve o uso de proteínasuperficial de 22 kDa como uma vacina humana.

Exemplo 1 Tratamento de Preparações de MembranaExterna de Neisseria men.ingit.idis com enzimasproteoliticas e a identificação subseqüente de umaenzima resistente à proteína superficial de 22 kDa deNeisseria meningitidis

Várias preparações antigênicas derivadas decélula inteira, cloreto de lítio, ou extratos desarcosila foram utilizadas para estudar aultraestrutura de membrana externa de Neisseriameningitidis. A membrana externa de bactéria Gram-negativa atua como uma interface entre o ambiente e ointerior da célula e contém grande parte dos antígenosque são livremente expostos à defesa imune hospedeira.

O principal objetivo do estudo foi a identificação denovos antígenos que podem induzir uma - resposta deproteção contra Neisseria meningitidis. Uma abordagemutilizada pelos inventores para identificar taisantígenos, foi a ruptura parcial dos preparadosantígênicos mencionados acima com enzimasproteoliticas. Os determinantes antigênicos geradospelos tratamentos enzimáticos poderiam ser entãoidentificados pela análise subseqüente das propriedadesimunológica e de proteção destes preparados antigênicostratados. Para nossa surpresa observamos apósresolução eletroforética de extratos de membranaexterna de cloreto de litio com Neisseria meningitidis,que uma faixa com baixo peso molecular, que foimanchada com Coomassie Brilhante Blue R-250, não foidestruída por tratamentos com enzima proteolítico.Coomassie Blue é utilizado para manchar proteínas epeptídeos e não tem ou tem muito pouca afinidade paraos polissacarídeos ou lipídeos que também sãocomponentes chave da membrana externa. O fato de queeste antígeno com baixo peso molecular foi manchado porCoomassie Blue sugeriu que pelo menos parte do mesmo écomposto de polipeptídeos que não são digeridos porenzimas proteolíticas, ou que são protegidos contra aação das enzimas por outras estruturas superficiais.Além disso, como demonstrado abaixo a proteinase K deenzima muito potente não digeriu este antígeno combaixo peso molecular mesmo após extensos tratamentos.

A extração de cloreto de litio foi utilizadapara obter os preparados de membrana externa dediferentes cepas de Neisseria meningitidis e foirealizada em um modo previamente descrito pelosinventores [Brodeur e outros, Infect. Immun., 50, pág.510 (1985) ] . O teor de proteína destes preparados foideterminado pelo processo Lowry adaptado a frações demembrana [Lowry e outros, J. Biol. Chem. 193, pág. 265(1951)]. Preparados de membrana externa derivados decepa de Neisseria meningitidis 608B (B :2a: PI. 2) foramtratadas por 24 horas a 37°C e agitação continua com a-quimotripsina de pâncreas bovino (E.C. 3.4.21.1)(Sigma) ou tripsina tipo 1 de pâncreas bovino (E.C.3.4.21.4) (Sigma). A concentração de enzima foiajustada em 2 mg por mg de proteína a ser tratada. Osmesmos preparados de membrana externa também foramtratados com diferentes concentrações (0,5 a 24 mg pormg de proteína) de Proteinase K de membro deTritirachium álbum (Sigma ou Boehringer Mannheim,Lavai, Canadá) (E.C. 3.4.21.14). Para promoverdigestão de proteína por proteinase K, diferentescondições experimentais foram utilizadas. As amostrasforam incubadas por 1 hora, 2 horas, 24 horas ou 48horas a 37°C ou 56°C com ou sem agitação. 0 pH dasamostras de mistura foi ajustado em pH 7,2 ou pH 9,0.

Uma % (vol/vol) de sulfato de dodecila de sódio (SDS)também foi adicionada a certas amostras. Imediatamenteapós tratamento as amostras foram resolvidas poreletroforese de gel SDS-PAGE utilizando o sistemaMiniProteanII® (Bio-Rad, Mississauga, Ontario, Canadá)em géis a 14% (peso/vol.) de acordo com as instruçõesdo fabricante. As proteínas foram aquecidas a 100°Cpor 5 minutos com 2-mercaptoetanol e SDS, separado emgéis de SDS a 14%, e manchados com Coomassie BrilliantBlue R-250.

A figura 2 apresenta o perfil de migração emgel de SDS-PAGE a 14% das proteínas presentes empreparados de membrana externa derivados de cepa deNeisseria meningitidis 608Β (Β :2a:PI.2) após tratamentoa 37 °C por 24 horas com α-quimotripsina e tripsina.Digestão proteolitica extensa das proteínas com elevadopeso molecular e de várias proteínas de membranaexterna principais pode ser observada para as amostrastratadas (figura 2, faixas 3 e 4) em comparação com ocontrole não tratado (figura 2, faixa 2). Aocontrário, uma faixa de proteína com um peso molecularaparente de 22 kDa não foi afetado mesmo após 24 horasde contato com qualquer enzima proteolitica.

Esta proteína única foi adicionalmente estudadautilizando um tratamento proteolítico mais agressivocom Proteinase K (figura 3). Proteinase K é uma dasenzimas proteolíticas mais poderosas uma vez que temuma baixa especificidade de ligação de peptídeo econdição de pH amplo. Surpreendentemente, a proteínade 22 kDa era resistente à digestão por 2 Unidadesinternacionais (UI) de proteinase K por 24 horas a 56°C(figura 3, faixa 2). Este tratamento é freqüentementeutilizado em nosso laboratório para produzirlipopolissacarídeos ou DNA que são quase livres deproteínas. Realmente, apenas pequenos polipeptídeospodem ser vistos após tal tratamento proteolíticoagressivo do preparado de membrana externa. Alémdisso, tratamentos mais longos, até 48 horas, ouconcentrações mais elevadas de enzima (até 24 UI) nãoalteraram a quantidade da proteína de 22 kDa. Aquantidade e migração em gel SDS-PAGE da proteína de 22kDa não foram afetadas quando o pH das misturas dereação foi aumentado para pH 9,0, ou quando 1,0% deSDS, uma agente de desnaturação de proteína forte foiadicionado (figura 3, faixas 4, 6 e 8). O usocombinado destas duas condições de desnaturaçãonormalmente resultaria na digestão completa dasproteínas presentes nos preparados de membrana externa,deixando apenas resíduos de aminoácido. Polipeptideosde baixo peso molecular foram freqüentemente observadosnos digestos e foram considerados coo sendo fragmentosde proteínas sensíveis não efetivamente digeridasdurante os tratamentos enzimáticos. Estes fragmentosforam mais provavelmente protegidos de degradaçãoadicional pelos carboidratos e lipídeos presentes namembrana externa. As faixas com peso molecularaparente de 28 kDa e 34 kDa que estão presentes emamostras tratadas são respectivamente a enzima residuale uma proteína de contaminação presente em todos ospreparados de enzima testados.

De modo interessante, este estudo sobre aresistência da proteína de 22 kDa a proteases indicouque outra faixa de proteína com peso molecular aparentede 18 kDa parece ser também resistente à degradaçãoenzimática (figura 3a). Dicas sobre esta faixa deproteína de 18 kDa foram obtidas quando os perfis demigração em géis SDS-PAGE de proteína de 22 kDarecombinante purificada de afinidade foram analisados(figura 3b) . A faixa de 18 kDa era evidente apenasquando a proteína de 33 kDa recombinante purificada porafinidade foi aquecida por um período prolongado detempo em tampão de amostra contendo o SDS detergenteantes de ser aplicado no gel. Análise de aminoácido N-terminal utilizando a degradação Edman (Exemplo 3)estabeleceu claramente que os resíduos de aminoácido(E-G-A-S-G-F-Y-V-Q) identificados na faixa de 18 kDacorrespondiam aos aminoácidos 1-9 (SEQ ID NO: 1) .Estes resultados indicam que as faixas de 18 e 22 kDacomo visto no SDS-PAGE são na realidade, derivados damesma proteína. Este último resultado também indicaque a seqüência principal é clivada da proteína de 18kDa madura. Estudos adicionais serão feitos paraidentificar as modificações moleculares explicando estamudança em peso molecular aparente e avaliar seuimpacto sobre as propriedades antigênicas e de proteçãoda proteína.

Como conclusão, a descoberta de uma proteína demembrana externa de Neisseria meningitidis com apropriedade muito rara de ser resistente à digestãoproteolítica garantiu estudo adicional de suascaracterísticas imunológicas e moleculares. A proteínasuperficial de 22 kDa recombinante purificada produzidapor Escherichia coli no Exemplo 3 também é altamenteresistente à digestão de proteinase K. Estamosatualmente tentando entender o mecanismo que confere àproteína superficial de 22 kDa de Neisseriameningitidis esta resistência incomum a enzimasproteoliticas.

Exemplo 2 Geração de Anticorpos Monoclonaisespecíficos para a proteína superficial de 22 kDa deNeisseria meningitidis

Os anticorpos monoclonais descritos aqui foramobtidos de três experimentos de fusão independentes.Camundongos fêmeas Balb/c (Charles River Laboratories,St. Constant, Québec, Canadá) foram imunizadas compreparados de membrana externa obtidos de cepas deNeisseria meningitidis 604A, 608B e 2241Crespectivamente soroagrupadas A, B e C. A extração decloreto de litio utilizada para obter estes preparadosde membrana externa foi realizada em um modoanteriormente descrito pelos inventores. [Brodeur eoutros, Infect. Immun. 50, pág. 510 (1985)]. O teor deproteína destes preparados foi determinado peloprocesso Lowry adaptado para frações de membrana [Lowrye outros, J. Biol. Chem. 193, pág. 265 (1951)]. Gruposde camundongos foram injetados intraperitonealmente ousubcutaneamente duas vezes, em intervalos de trêssemanas com 10 mg de diferentes combinações dospreparados de membrana externa descritos acima.Dependendo do grupo de camundongos, os adjuvantesutilizados para as imunizações eram adjuvante completode Freund ou incompleto (Gibco Laboratories, GrandIsland, N.Y.), ou QuilA (CedarLane Laboratories,Hornby, Ont., Canadá). Três dias antes do procedimentode fusão, os camundongos imunizados receberam umainjeção intravenosa final de 10 mg de um dos preparadosde membrana externa descritos acima. O protocolo defusão utilizado para produzir as linhas de célula dehibridoma secretando o anticorpo monoclonal desejadofoi descrito anteriormente pelos inventores [Hamel eoutros, J. Med. Microbiol25, pág. 2434 (1987)]. Aclasse, subclasse e tipo de cadeia leve de anticorposmonoclonais Me-1, Me-2, Me-3, me-5, Me-6 e Me-7 foramdeterminados por ELISA como anteriormente relatado[Martin e outros, J. Clin. Microbiol., 28, pág. 1720(1990)] e são apresentados na Tabela 1.

A especificidade dos anticorpos monoclonais foiestabelecida utilizando imunoborrão Ocidental seguindoo processo anteriormente descrito pelos inventores[Martin e outros, Eur. J. Immunol. 18, pág. 601 (1988)]com as seguintes modificações. Preparados de membranaexterna obtidos de diferentes cepas de Neisseriameningitidis foram resolvidas em géis SDS-PAGE a 14%.As proteínas foram transferidas dos géis para membranasde nitrocelulose utilizando um aparelho semi-seco (Bio-Rad). Uma corrente de 60 mA por gel (6xl0cm) foiaplicada por 10 minutos no tampão de eletroborrãoconsistindo em 25 mM Tris-HCl, 192 mM glicina e 20%(vol/vol) de metanol, pH 8,3. Os experimentos deimunoborrão Ocidental indicaram claramente que osanticorpos monoclonais Me-1, Me-2, Me-3, Me-4, Me-6 eMe-7 reconheceram seus epítopos específicos na proteínade 22 kDa de Neissería meningitidis (figura 4A) . Aanálise dos géis SDS-PAGE e os imunoborrões Ocidentaiscorrespondentes também indicaram que o peso molecularaparente desta proteína não varia de uma cepa paraoutra. Contudo, a quantidade de proteína presente nospreparados de membrana externa variou de uma cepa paraoutra e não estava relacionado ao sorogrupo da cepa.Além disso, estes anticorpos monoclonais aindareconheceram seus epítopos na proteína superficial de22 kDa de Neissería meningitidis após tratamento dopreparado de membrana externa com 2 UI de proteinase Kpor mg de proteína (tratamento descrito no Exemplo 1,supra) (figura 4B) . De modo interessante, os epítopospermaneceram intactos após a digestão de enzima dessemodo confirmando que mesmo se forem acessíveis nopreparado de membrana para os anticorpos não sãodestruídos pelo tratamento de enzima. Este resultadomencionado por último sugeriu que o mecanismo queexplica a resistência à proteinase K observada é maisprovavelmente não relacionada a estruturas desuperfície bloqueando o acesso da enzima à proteína, ouà proteção oferecida pela membrana a proteínas que sãoprofundamente embutidas. Embora não mostrado na figura4, os resultados dos imunoborrões para Me-I foramcompatíveis com os resultados para os outros cincoanticorpos monoclonais.

Uma série de experimentos foi realizada paracaracterizar parcialmente a proteína superficial de 22kDa de Neisseria meningitidis e diferenciar a mesma dasoutras proteínas superficiais meningococcal conhecidas.Nenhuma mudança em peso molecular aparente em gel SDS-PAGE da proteína superficial de 22 kDa de Neisseriameningitidis foi observada quando preparados demembrana externa foram aquecidos a 100°C por 5 minutosou a 37°C e 56°C por 30 minutos em tampão de amostra deeletroforese com ou sem 2-mercaptoetanol. Isto indicouque a migração da proteína superficial de 22 kDa,quando presente na membrana externa, não eramodificável por calor ou 2-mercaptoetanol.

A oxidação de periodato de sódio foi utilizadapara determinar se os anticorpos monoclonais reagiramcom epítopos de carboidrato presentes nos preparados demembrana externa extraídos de organismos de Neisseriameningitidis. O processo utilizado para realizar esteexperimento foi previamente descrito pelos inventores.[Martin e outros, Infect. Immun., 60, pág. 2718-2725(1992)]. O tratamento de preparados de membranaexterna com 100 mM de periodato de sódio por 1 hora emtemperatura ambiente não alterou a reatividade dosanticorpos monoclonais em relação á proteínasuperficial de 22 kDa de Neisseria meningitidis. Estetratamento abole, normalmente, a ligação de anticorposque são específicos para carboidratos.

Anticorpo monoclonal 2-1-CA2 (fornecido peloDr. A. Bhattachar jee, Walter Reed Army Institute ofResearch, Washington, D.C.) é específico para aproteína de lábio (também chamada H.8), um antigenosuperficial comum a todas as espécies de Neisseriapatogênicas. A reatividade deste anticorpo monoclonalcom preparados de membrana externa foi comparada com areatividade de anticorpo monoclonal Me-5. O anticorpomonoclonal específico de lábio reagiu com uma faixa deproteína tendo vim peso molecular aparente de 30 kDa,enquanto o anticorpo monoclonal Me-5 reagiu com a faixade proteína de 22 kDa. Este resultado indicaclaramente que não há relação entre a proteínasuperficial de 22 kDa de Neisseria meningitidis e aproteína de lábio, outra proteína de membrana externaaltamente conservada.

Para verificar a exposição da proteína de 22kDa na superfície de células bacterianas de Neisseriameningitidis intactas, um radioimunoensaio foirealizado como anteriormente descrito pelos inventores[Proulx e outros, Infec. Immun., 59, pág. 963 (1991)].Culturas bacterianas de seis horas e 18 horas foramutilizadas para este ensaio. Os seis anticorposmonoclonais foram reagidos com 9 cepas de Neisseriameningitidis (o sorogrupo da cepa é indicado emparênteses na figura 5), 2 cepas de Neisseriagonorrhoeae ("NG"), 2 cepas de Moraxella catarrhalis("MC") e 2 cepas de Neisseria lactamica ("NL"). Oradioimunoensaio confirmou que os epítopos reconhecidospelos anticorpos monoclonais são expostos na superfíciede isolados de Neisseria meningitidis intactos dediferentes sorotipos e sorogrupos e também devem seracessíveis às enzimas proteoliticas (figura 5) . Osanticorpos monoclonais ligaram fortemente a seusepítopos alvos na superfície de todas as cepas deNeisseria meningitidis testadas. Os valores de ligaçãoregistrados (entre 3.000 e 35.000 CPM), variaram de umacepa para outra, e com o estado fisiológico dabactéria. Um anticorpo monoclonal específico de porinHaemophilus influenzae foi utilizado como um controlenegativo para cada cepa bacteriana. Contagens abaixode 500 CPM foram obtidas e subseqüentemente subtraídasde cada valor de ligação. Com relação às cepas deNeisseria meningitidis testadas neste ensaio, osresultados mostrados na figura 5 para anticorposmonoclonais Me-5 e Me-7 são representativos dosresultados obtidos com anticorpos monoclonais Me-1, Me-2, Me-3 e Me-6. Com relação a outras cepas bacterianastestadas, as atividades de ligação mostradas para Me-7são representativas das atividades de ligação obtidascom outros anticorpos monoclonais que reconheciam amesma cepa bacteriana.

A conservação antigênica dos epítoposreconhecidos pelos anticorpos monoclonais também foiavaliada. Um imunoensaio de enzima-ponto foi utilizadopara a rápida seleção dos anticorpos monoclonais contraum grande número de cepas bacterianas. Este ensaio foirealizado como anteriormente descrito pelos inventores[Lussier e outros, J. Immunoassay, 10, pag. 373(1989) ] . Uma coleção de 71 cepas de Neisseriameningitidis foi utilizada neste estudo. A amostraincluiu 19 isolados de sorogrupo A, 23 isolados dosorogrupo B, 13 isolados do sorogrupo C, 1 isolado dosorogrupo 29E, 6 isolados do sorogrupo W-135, 1 isoladodo sorogrupo X, 2 isolados do sorogrupo Y, 2 isoladosdo sorogrupo Z, e 4 isolados que não foramsoroagrupados ("NS"). Estes isolados foram obtidos doCaribeean Epidemiology Centre, Port of Spain, Trinidad;Children's Hospital of Eastern Ontario, Ottawa, Canadá;Department of Saskatchewan Health, Regina, Canadá;Laboratoire de Santé Publique du Québec, Montreal,Canadá; Max-Planck institut fur Molekulare Genetik,Berlin, FRG; Montreal Children Hospital, Montreal,Canadá; Victoria General Hospital, Halifax, Canadá; enossa própria coleção de cepas. As seguintes espéciesbacterianas também foram testadas: 16 Neisseriagonorrhoeae, 4 Neisseria cinerea, 5 NeisseriaIactamicar 1 Neisseria fiava, 1 Neisseria flavaseens, 3Neisseria mucosa, 4 Neisseriaperflava/sicca, 4Neisseria perflava, 1 Neisseria Siccar 1 Neisseriasubflava e 5 Moraxella eatarrhalis, 1 Alealigenesfeaealis (ATCC 8750), 1 Citrobaeter freundii (ATCC2080), 1 Edwarsiella tarda (ATCC 15947), 1 Enterobaetereloaea (ATCC 23355), 1 Enterobaeter aerogenes (ATCC13048), 1 Eseherichia eoli, 1 Flavobacterium odoratum,1 Haemophilus influenzae tipo b (cepa Eagan), 1Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883), 1 Proteus rettgeri(ATCC 25932), 1 Proteus vulgaris (ATCC 13315), 1Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027) , 1 Salmonellatyphimuri um (ATCC 14028), 1 Serrati marcescens (ATCC8100), 1 Shigella flexneri (ATCC 12022), 1 Shigellasonnei (ATCC 9290). Foram obtidos da American TypeCultura Collection ou uma coleção mantida no LaboratoryCentre for Disease Control, Ottawa, Canadá. Asreatividades dos anticorpos monoclonais com as cepas deNeisseria mais relevantes são apresentadas na Tabela 1.Um anticorpo monoclonal, Me-7, reconheceu seu epitopoespecifico em 100% das 71 cepas de Neisseriameningitidis testadas. Este anticorpo monoclonal, bemcomo Me-2, Me-3, Me-5 e Me-6 também reagiram com certascepas que pertencem a outras espécies de Neisseriaindicando que seu epitopo especifico também é expressopor outras Neisseriaceae estreitamente relacionadas.Exceto por uma leve reação com uma cepa de Neisserialactamicaf anticorpo monoclonal Me-I reagiu apenas comisolados de Neisseria meningitidis. Me-I foiadicionalmente testado com outra amostra de 177isolados de Neisseria meningitidis e foi capaz deidentificar, corretamente, mais de 99% das cepas totaisde Neisseria meningitidis testadas. Além das cepas deNeisseria apresentadas na Tabela 1, os anticorposmonoclonais não reagiram com quaisquer das outrasespécies bacterianas mencionadas acima.

Como conclusão, seis anticorpos monoclonais quereagiram especificamente com a proteína superficial de22 kDa de Neisseria meningitidis foram geradas pelosinventores. utilizando estes anticorpos monoclonaisdemonstramos que seus epítopos específicos são 1)localizados em uma proteína de 22 kDa resistente àproteinase K presente na membrana externa de Neisseriameningitidis, 2) conservados entre isolados deNeisseria meningitidis, 3) expostos na superfície decélulas intactas de Neisseria meningitidis e acessíveisao anticorpo, e 4) a reatividade deste anticorposmonoclonais com a proteína superficial de 22 kDa deNeisseria meningitidis não é modificada por umtratamento com periodato de sódio, sugerindo que seusepítopos específicos não são localizados emcarboidratos.

Embora tenhamos descoberto que a migração daproteína de 22 kDa de Neisseria meningitidis é movida aum peso molecular aparente de aproximadamente 18 kDaquando aquecida sob condições rigorosas, observamos quea migração não é modificada por tratamento com 2-mercaptoetanol.

Demonstramos também que a proteína superficialde 22 kDa de Neisseria meningitidis não temsimilaridade antigênica com a proteína de lábio, outraproteína com peso molecular baixo e altamenteconservada presente na membrana externa de Neisseriameningitidis.

Como será apresentado no exemplo 3, estesanticorpos monoclonais também reagiram com a proteínasuperficial de 22 kDa recombinante, purificadaproduzida após transformação de cepa Escherichia coliBL21 (DE3) com um vetor de plasmídeo pNP2202 contendo ogene codificando para a proteína superficial de 22 kDade Neisseria meningitidis.<table>table see original document page 55</column></row><table><table>table see original document page 56</column></row><table>Exemplo 3 Clonagem molecular, sequenciamento dogene, elevada expressão de rendimento e purificação daproteína superficial de 22 kDa de Neisseriameningitidis

A. Clonagem Molecular

Uma biblioteca de DNA genômica LambdaGEM-Il decepa de Neisseria meningitidis 608B (B:2a:pl-2) foiconstruída de acordo com as recomendações do fabricante(Promega CO, Madison, WI) . Resumidamente, o DNAgenômico da cepa 608B foi parcialmente digerida com Sau3AI, e fragmentos variando entre 9 e 23 Kb forampurificados em gel agarose antes de serem ligados aossítios Bam HI dos braços LambdaGEM-Il. Os fagosrecombinantes resultantes foram utilizados parainfectar a cepa Escherichia coli LE392 (Promega) quefoi então revestida em placas agar LB. Dezenove placaspositivas foram identificadas após a imuno-seleção dabiblioteca com os anticorpos monoclonais específicos deproteína superficial de 22 kDa de Neisseriameningitidis do exemplo 2 utilizando - o seguinteprotocolo. As placas foram incubadas 15 minutos a -20°C para endurecer o agar superior. Filtros denitroceIulose foram suavemente aplicados sobre asuperfície das placas por 30 minutos a 4°C paraabsorver as proteínas produzidas por clones viraisrecombinantes. Os filtros foram então lavados em PBS-Tween 0,02% (vol/vol) e imunoborrados como descritoanteriormente (Lussier e outros, J. Immunoassay, 10,pág. 373 (1989)]. Após amplificação e purificação deDNA, um clone viral, designado clone 8, que tinha umainserção de 13 Kb foi selecionado para os experimentosde subclonagem. Após digestão deste clone com Sac I,dois fragmentos de 5 e 8 Kb foram obtidos. Estesfragmentos foram purificados em gel agarose e ligadosno sitio de restrição Sac I do plasmideo com númerobaixo de cópia pWKS30 [Wang e Kushner, Gene, 100, pág.195 (1991)]. Os plasmideos recombinantes foramutilizados para transformar a cepa de Escherichia coliJMl 09 (Promega) por eletroporação (Bio-Rad,Mississauga, Ont., Canadá) seguindo as recomendações dofabricante, e as colônias resultantes foramselecionadas com os anticorpos monoclonais específicospara proteína superficial de 22 kDa de Neisseriameningitidis do exemplo 2. Colônias positivas foramobservadas apenas quando as bactérias foramtransformadas com o plasmideo portando a inserção 8 Kb-Análise de borrão Ocidental (a metodologia foi descritano Exemplo 2) dos clones positivos mostrou que aproteína expressa por Escherichia coli estava completae migrou em gel SDS-PAGE como a proteína superficial de22 kDa de Neisseria meningitidis. Para reduzir aindamais o tamanho da inserção, um clone contendo ofragmento de 8 Kb foi digerido com Cla I e um fragmentode 2,75 Kb foi então ligado no sítio Cla I do plasmideopWKS30. A análise de borrão Ocidental dos clonesresultantes indicou claramente novamente que a proteínaexpressa por Escherichia coli estava completa e migrouno gel SDS-PAGE como a proteína superficial de 22 kDade Neisseria meningitidis nativa.

Após análise de restrição, dois clones,designados pNP2202 e pNP2203, foram mostrados comocarregando a inserção de 2,75 Kb em orientações opostase foram selecionados para prosseguir com osequenciamento do gene codificando para a proteínasuperficial de 22 kDa de Neisseria meningitidis. O"Double Stranded Nested Deletion Kit" da PharmaciaBiotech Inc. (Piscataway, NJ) foi utilizado de acordocom as instruções do fabricante para gerar uma série dedeleções encaixadas dos dois clones. As inserçõestruncadas resultantes foram então seqüenciadas da basede avanço M13 presente no vetor pWKS30 com o "Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit" utilizando umsequenciador automatizado da Applied Biosystems Inc.(Foster City, CA) modelo 373A de acordo com asrecomendações do fabricante.

B. Análise de seqüência

Após a inserção ser sequenciada nas duasdireções, a seqüência de nucleotídeo revelou um quadrode leitura aberta consistindo de 525 nucleotídeos(incluindo o codon de parada) codificando uma proteínacomposta de 174 resíduos de aminoácido tendo um pesomolecular previsto de 18.000 Daltons e um pi de 9.93.As seqüências de nucleotídeo e aminoácido deduzido sãoapresentadas na figura 1 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2).Para confirmar a expressão correta do geneclonado, a seqüência de aminoácido N-terminal daproteína superficial de 22 kDa derivada de cepa deNeisseria meningitidis 608B foi determinada paracomparar a mesma com a seqüência de aminoácido deduzidados dados de seqüenciar nucleotideo.

O preparado de membrana externa derivado decepa de Neisseria meningitidis 608B foi resolvido poreletroforese em um gel SDS-PAGE a 14% e transferidosobre uma membrana de difluoreto de polivinilideno(Millipore Products, Bedford MA) de acordo com umprocesso previamente descrito (Sambrook e outros,Molecular Cloning; a Laboratory manual, Cold SpringHarbor Laboratory Press (1989)]. A faixa de proteínade 22 kDa foi excisada do gel e a seguir submetida adegradação Edman utilizando o sequenciador de proteínaautomatizado modelo 473A da Applied Biosystems Inc.(Foster City, CA) seguindo as recomendações dofabricante. A seqüência de aminoácido E-G-A-S-G-F-Y-V-Q-A correspondeu a aminoácidos 1-10 (SEQ -ID NO: 2) doquadro de leitura aberta, indicando que a cepa deNeisseria meningitidis 608B, proteína superficial de 22kDa tem um peptídeo principal de 19 aminoácidos(resíduos de aminoácido -19 a -1 da SEQ ID NO: 2).

Uma busca de bases de dados estabelecidasconfirmou que a cepa de Neisseria meningitidis 608B,proteína superficial de 22 kDa (SEQ ID NO: 2) ou seugene (SEQ ID NO: 1) não foram descritos anteriormente.C. Expressão de rendimento elevado epurificação da proteína superficial de 22 kDa deNeisseria meningitidis recombinante

O seguinte processo foi desenvolvido paramaximizar a produção e purificação da proteínasuperficial de 22 kDa de Neisseria meningitidisrecombinante expresso em Escherichia coli. Esteprocesso se baseia na observação de que a proteínasuperficial de 22 kDa recombinante produzido pela cepade Escherichia coli BL21 (DE3) [Studier e Moffat,J.Mol. Biol., 189, pág. 113 (1986)] portando o plasmídeopNP2202 pode ser encontrado em grandes quantidades namembrana externa, porém também pode ser obtido dosobrenadante de cultura no qual é a proteína maisabundante. O sobrenadante de cultura era portanto omaterial utilizado para purificar a proteína de 22 kDarecombinante utilizando cromatografia por afinidade(figura 6A).

Para gerar uma matriz de cromatografia porafinidade, anticorpos monoclonais Me-2, -Me-3 e Me-5(descritos no Exemplo 2) foram imobilizados em sefaroseativado por CNBr 4B (Pharmacia Biotech Inc.,Piscataway, NJ) de acordo com as instruções dofabricante.

Para preparar o sobrenadante de cultura, umacultura durante a noite de cepa de Escherichia coliBL21 (DE3), abrigando o plasmídeo pNP2202 foi inoculadaem caldo LB (Gibco Laboratories, Grand Island, N.Y.)contendo 25 mg/ml de ampicilina (Sigma) e foi incubado4 horas a 37°C com agitação. As células bacterianasforam removidas do meio de cultura por duascentrifugações a 10.000 Xg por 10 minutos a 4°C. Osobrenadante de cultura foi filtrado sobre uma membranade 0,22 mm (Millipore, Bedfords, MA) e a seguirconcentrado aproximadamente 100 vezes utilizando umamembrana de ultrafiltração (Amicon Co., Beverly, MA)com um cor te molecular de 10.000 Daltons. Parasolubilizar totalmente as vesiculas de membrana,Empigen BB (Calbiochem Co., LaJolla, CA)) foiadicionado ao sobrenadante de cultura concentrado atéuma concentração final de 1% (vol/vol). A suspensãofoi incubada em temperatura ambiente por uma hora,dialisado durante a noite contra vários litros de 10 mMTris-HCl tampão, pH 7,3 contendo 0,05% Empigen BB(vol/vol) e centrifugado a 10.000Xg por 20 minutos a4°C. A preparação de antigeno foi adicionada à matrizde afinidade e incubada durante a noite a 4°C comagitação constante. A pasta de gel foi -despejada emuma coluna de cromatografia e lavada extensamente com10 mM Tris-HCl tampão, pH 7,3 contendo 0,05% Empigen BB(vol/vol). A proteína de 22 kDa recombinante foi entãoeluída da coluna com 1 M LiCl em 10 mM Tris-HCl tampão,pH 7,3. A solução contendo a proteína eluída foidialisada extensamente contra vários litros de 10 mMTris-HCl tampão, pH 7,3 contendo 0,05% Empigen BB.Géis SDS-PAGE manchados com prata e Coomassie Blue[Tsai e Frasch, Analytical Biochem., 119, pág. 19(1982)] foram utilizados para avaliar a pureza daproteína superficial de 22 kDa recombinante em cadaetapa do processo de purificação e resultadosrepresentativos são apresentados na figura 6A. Acoloração de prata dos géis demonstrou claramente que oprocesso de purificação gerou uma proteína de 22 kDarecombinante relativamente pura apenas com umaquantidade muito pequena de lipopolissacarídeo deEscherichia coli.

A resistência à clivagem proteolítica daproteína superficial de 22 kDa recombinante, purificadatambém foi verificada e os resultados são apresentadosna figura 6B. Proteína superficial de 22 kDarecombinante purificada foi tratada como descrito noexemplo 1 com α-quimotripsina e tripsina a 2 mg por mgde proteína e com 2 UI de proteinase K por mg deproteína por 1 hora a 37°C com agitação constante.Nenhuma redução na quantidade de proteína foi observadaapós quaisquer destes tratamentos. Em comparação,digestão parcial ou completa dependendo da enzimaselecionada foi observada para a proteína de controleque era neste caso albumina de soro bovino (BSA,Sigma). Adicionalmente, períodos mais longos detratamento não resultaram em qualquer modificação daproteína. Estes resultados mencionados por últimodemonstraram que células de Escherichia colitransformadas podem expressar a proteína superficial de22 kDa recombinante completa e que esta proteína tambémé altamente resistente à ação destas três enzimasproteolíticas como era a proteína nativa encontrada emNeisseria meningitidis. Além disso, a proteínasuperficial de 22 kDa recombinante purificada que não éembutida na membrana externa de Escherichia coli aindaé altamente resistente à ação das enzimasproteolíticas.

Verificamos também o efeito dos tratamentosenzimáticos sobre as propriedades antigênicas daproteína de 22 kDa recombinante. Como determinado porELISA e imunoborrão Ocidental, os anticorposmonoclonais descritos no Exemplo 2 reconheceramfacilmente a proteína superficial de 22 kDarecombinante que foi purificada de acordo com oprocesso descrito acima (figura 6C) . Além disso, areatividade do anticorpo monoclonal Me-5, bem como areatividade dos outros anticorpos monoclonaisespecíficos de proteína 22 kDa, com a proteínasuperficial de 22 kDa recombinante purificada não foialterado por qualquer dos tratamentos de enzima, dessemodo confirmando que as propriedades antigênicas daproteína de 22 kDa recombinante parecem similaresàquelas descritas para a proteína nativa.

Dados importantes foram apresentados no exemplo3 e podem ser resumidos como a seguir:

1) as seqüências de aminoácido e nucleotídeocompletas da proteína superficial de 22 kDa deNeisseria meningitidis foram obtidas (SEQ ID NO: 1; SEQID NO: 2);

2) sequenciamento N-terminal da proteína nativaconfirmou que o gene de 22 kDa de Neisseriameningitidis foi realmente clonado;

3) esta proteína não foi descritaanteriormente;

4) é possível transformar um hospedeiro comoEscherichia coli e obter expressão da proteínasuperficial de 22 kDa de Neisseria meningitidisrecombinante em rendimento elevado;

5) é possível obter a proteína recombinanteisenta de outras moléculas de Neisseria meningitidis equase isenta de componentes produzidos por Escherichiacoli;

6) a proteína superficial de 22 kDarecombinante purificada permanece altamente resistenteà ação de enzimas proteolíticas como a-quimotripsina,tripsina e proteinase K; e

7) as propriedades antigênicas da proteína de22 kDa recombinante comparadas àquelas descritas para aproteína superficial de 22 kDa de Neisseriameningitidis nativa.

Exemplo 4 Conservação Molecular do GeneCodificando para a Proteína Superficial de 22 kDa deNeisseria meningitidis

Para verificar a conservação molecular entreisolados de Neisseria do gene codificando para aproteína superficial de 22 kDa de Neisseriameningitidis, um ensaio de hibridização de borrão-pontode DNA foi utilizado para testar diferentes espécies deNeisseria e outras espécies de bactérias.Primeiramente, o gene de 525 pares de base codificandopara a proteína superficial de 22 kDa de Neisseriameningitidis foi amplificado por PCR, purificado em gelagarose e rotulado por carga aleatório com o sistema derotulação e detecção de DNA DIG não radioativo(Boehringer Mannheim, Lavai, Canadá) seguindo asinstruções do fabricante.

O ensaio de borrão ponto de DNA foi feito deacordo com as instruções do fabricante (BoehringerMannheim). Resumidamente, as cepas bacterianas a seremtestadas foram pontilhadas sobre uma membrana de náilonde carga positiva (Boehringer Mannheim) , seca e aseguir tratada como descrito no guia de usuário doSistema DIG para elevações de colônia. Pré-hibridizações e hibridizações foram feitas a 42°C comsoluções contendo 50% de formamida (Sigma).. A soluçãode pré-hibridização também continha 100 mg/ml de DNA deesperma de arenque desnaturado (Boehringer Mannheim)como um agente de bloqueio adicional para evitarhibridização não específica da sonda de DNA. Aslavagens de severidade e etapas de detecção utilizandoo substrato PPD lumigen quimiluminescente também foramfeitas como descrito no guia de usuário do Sistema DIG.Para as 71 cepas de Neisseria meningitidistestadas os resultados obtidos com anticorpo monoclonalMe-7 e a sonda de DNA de 525 pares de base estavam emperfeito acordo. De acordo com os resultados, todas ascepas de Neisseria meningitidis testadas têm o gene deproteína superficial de 22 kDa de Neisseriameningitidis e expressam a proteína uma vez que foramtodos reconhecidos pelo anticorpo monoclonal, dessemodo confirmando que esta proteína é altamenteconservada entre os isolados de Neisseria meningitidis(Tabela 2).

A sonda de DNA também detectou o genecodificando para a proteína superficial de 22 kDa deNeisseria meningitidis em todas as cepas de Neisseriagonorrhoeae testadas.

Ao contrário, o anticorpo monoclonal Me-7reagiu apenas com 2 das 16 cepas de Neisseriagonorrhoeae testadas indicando que o epítopo específicoestá de um certo modo ausente, inacessível oumodificado em cepas de Neisseria gonorrhoeae ou quegrande parte das cepas de Neisseria gonorrhoeae nãoexpressam a proteína mesmo se tiverem a seqüência decodificação em seu genoma (Tabela 2).

Uma boa correlação entre os dois processos dedetecção foi também observado para Neisseria lactamica,uma vez que apenas uma cepa de Neisseria lactamica foiverificada ter o gene sem expressar a proteína (Tabela2). Este resultado também poderia ser explicado pelosmesmos motivos apresentados no último parágrafo.

Isto pode indicar que, embora o 22 kDa não sejaexpresso, ou não acessível na superfície de cepas deNeisseria gonorrhoeae, o gene de codificação deproteína de 22 kDa das cepas Neisseria gonorrhoeae eNeisseria lactamica pode ser utilizado para construçãode plasmídeos recombinantes utilizados para a produçãoda proteína superficial de 22 kDa ou análogos. Todatal proteína ou análogos podem ser utilizados para aprevenção, detecção, ou diagnóstico de infecções porNeisseria . Mais particularmente, tais infecções podemser selecionadas de infecções de Neisseriameningitidis, Neisseria gonorrhoeae,· e Neisserialactamica. Portanto, a proteína superficial de 22 kDaou análogos, pode ser utilizada para a fabricação deuma vacina contra tais infecções. Além disso, aproteína de 22 kDa ou análogos, pode ser utilizada paraa fabricação de um kit para a detecção ou diagnósticode tais infecções.

Os resultados obtidos com cepas Moraxellacatharralis mostraram que das 5 cepas testadas, 3reagiram com anticorpo monoclonal Me-7, porém nenhumadelas reagiu com a sonda DNA indicando que o genecodificando para a proteína superficial de 22 kDa deNeisseria meningitidis está ausente do genoma destascepas (Tabela 2) .Várias outras espécies de Neisseria bem comooutras espécies bacterianas (vide rodapé, Tabela 2)foram testadas e nenhuma delas foi verificada serpositiva por quaisquer dos dois testes. Este resultadomencionado por último parece indicar que o gene para aproteína superficial de 22 kDa é compartilhado apenasentre espécies estreitamente relacionada deNeisseriacae.

Tabela 2. Reatividade da sonda de DNA de 525pares de base e anticorpo monoclonal Me-7 comdiferentes espécies de Neisseria

<table>table see original document page 69</column></row><table>

1 As seguintes espécies de Neisseria e outrasespécies bacterianas também foram testadas com os doisensaios e forneceram resultados negativos: 1 Neisseriacinerea, 1 Neisseria fiava, 1 Neisseria flavescens, 2Neisseria mucosa, 4 Neisseria perflava/sicca, 1Neisseria perflava, 1 N. sicca, 1 N. subflava, 1Alcaligenes feacalis (ATCC 88750), 1 Bordetellapertussis (9340), 1 Bordetella bronchiseptica, 1Citrobacter freundi (ATCC 2080), 1 Edwarsiella tarda(ATCC 15947), 1 Enterobacter eloaea (ATCC 23355), 1Enterobacter aerogenes (ATCC 13048), 1 Eschirieia eoli,1 Flavobacterium odoratum, 1 Haemophilus influenzaetipo b (cepa Eagan), 1 Klebsiella pneumoniae (ATCC13883), 1 Proteus rettgeri (ATCC 25932), 1 Proteusvulgaris (ATCC 13315), 1 Pseudomonas aeruginosa (ATCC9027), 1 Salmonella typhimurim (ATCC 14028), 1 Serratimareeseens (ATCC 8100), 1 Shigella flexneri (ATCC12022), 1 Shigella sonnei (ATCC 9290), e 1 Xanthomonasmaltophila.

Como conclusão, o ensaio de hibridização de DNAindicou claramente que o gene codificando para aproteína superficial de 22 kDa de Neisseriameningitidis é altamente conservada entre o Neisseriapatogênico. Além disso, os resultados obtidosmostraram claramente que esta sonda de DNA poderia setornar uma ferramenta valiosa para a detecção rápida edireta de bactérias Neisseria patogênica em espécimeclinico. Esta sonda poderia mesmo ser aperfeiçoadapara discriminar entre Neisseria meningitidis eNeisseria gonorrhoeae.Exemplo 5 Propriedades Bacterioliticas e deproteção dos Anticorpos Monoclonais

A atividade bacteriolitica dos anticorposmonoclonais específicos para proteína superficial de 22kDa de Neisseria meningitidis purificada foi avaliadain vitro de acordo com um processo descritoanteriormente [Brodeur e outros, Infect. Immun. 50,pág. 510 (1985); Martin e outros, Infect. Immun., 60,pág. 2718 (1992)]. Na presença de um complemento desoro de porquinho da índia, anticorpos monoclonaispurificados Me-I e Me-7 exterminaram de forma eficientea cepa Neisseria meningitidis 608B. Concentraçõesrelativamente baixas de cada um destes anticorposmonoclonais reduziram em mais de 50% o número debactérias viáveis. A utilização de concentrações maiselevadas de anticorpos monoclonais purificados Me-I eMe-7 resultou em uma diminuição acentuada (até 99%) nonúmero de unidades de formação de colônia bacteriana.De modo importante, a atividade bacteriolitica destesanticorpos monoclonais é dependente do complemento, umavez que inativação térmica do soro de porquinho daíndia por 30 minutos a 56°C aboliu totalmente aatividade de extermínio. Os outros anticorposmonoclonais não apresentaram atividade bacterioliticasignificante contra a mesma cepa. Os resultadosrepresentativos, combinados de vários experimentos sãoapresentados na figura 7, em que os resultadosmostrados para Me-7 são representativos e compatíveiscom os resultados obtidos para Me-1. Os resultadosmostrados para Me-2 são representativos e compatíveiscom os resultados obtidos para os outros anticorposmonoclonais Me-3, Me-5 e Me-6.

Um modelo de camundongo de infecção, que foidescrito previamente por um dos inventores [Brodeur eoutros, Infect. Immun., 50, pág. 510 (1985); Brodeur eoutros, Can J. Microbiol., 32, pág. 33 (1986)] foiutilizado para avaliar a atividade de proteção de cadaanticorpo monoclonal. Resumidamente, camundongosBalb/c foram injetados intraperitonealmente com 600 mlde fluido ascítico contendo os anticorpos monoclonais18 horas antes do desafio bacteriano. os camundongosforam então desafiados com iam ml de uma suspensãocontendo 1000 unidades de formação de colônia de cepade Neisseria meningitidis 608B, 4% mucina (Sigma) e1,6% hemoglobina (Sigma). Os resultados combinados devários experimentos são apresentados na Tabela 3. Éimportante observar que apenas os anticorposmonoclonais bacteriolíticos Me-1 e Me-7 protegeram oscamundongos contra infecção por Neisseria meningitidisexperimental. Realmente, a injeção de fluido ascíticocontendo estes dois anticorpos monoclonais antes dodesafio bacteriano aumentaram significativamente a taxade sobrevivência de camundongos Balb/c para 70% ou maisem comparação com os 9% observados nos grupos decontrole recebendo 600 ml de fluido ascítico induzidopor Sp2/0 ou 600 ml de fluido ascítico contendoanticorpos monoclonais não relacionados- Os resultadostambém indicaram que 80% dos camundongos sobreviveram ainfecção se foram anteriormente injetados com 400 ug deMe-7 purificado com proteína A 18 horas antes dodesafio bacteriano. Experimentos subseqüentes estãosendo atualmente feitos para determinar a concentraçãode anticorpo mínima necessária para proteger 50% doscamundongos. Taxas de sobrevivência inferiores de 20 a40% foram observadas para os outros anticorposmonoclonais específicos de proteína superficial de 22kDa de Neisseria meningitidis.

Tabela 3 Avaliação do potencial deimunoproteção dos anticorpos monoclonais específicospara proteína superficial de 22 kDa contra cepa deNeisseria meningitidis 608B (B :2a: PI. 2)

<table>table see original document page 73</column></row><table>Como conclusão, os resultados indicaramclaramente que um anticorpo especifico para a proteínasuperficial de 22 kDa de Neisseria meningitidis podeproteger eficientemente camundongos contra um desafioletal experimental. A indução de anticorpos deproteção por um antígeno é um dos critérios maisimportantes para justificar pesquisa adicional sobrecandidato de vacina em potencial.

Exemplo 6 Imunização com Proteína superficialde 22 kDa recombinante purificada confere proteçãocontra desafio bacteriano subseqüente

A proteína superficial de 22 kDa recombinantepurificada foi preparada de acordo com o protocoloapresentado no Exemplo 3, e foi utilizada para imunizarcamundongos Balb/C para determinar seu efeito deproteção contra desafio com uma dose letal de Neisseriameningitidis 608B (B:2a:P1.2). Foi decidido utilizar aproteína recombinante purificada ao invés da proteínameningococcal nativa para assegurar que não havia outroantígeno meningococcal no preparado de vacina utilizadodurante estes experimentos. 0 modelo de infecção decamundongo utilizado nestes experimentos foi descritopreviamente por um dos inventores [Brodeur e outros,Infec. Immun., 50, pág. 510 (1985); Brodeur e outros,Can. J. Microbiol. 32, pág. 33 (1986)]. Os camundongosforam individualmente injetados subcutaneamente trêsvezes em intervalos de três semanas com 100 ml dopreparado de antígeno contendo 10 ou 20 ug porcamundongo da proteína superficial de 22 kDarecombinante purificada. QuilA era o adjuvanteutilizado para estes experimentos a uma concentração de25 ug por injeção. Os camundongos nos grupos decontrole foram injetados seguindo o mesmo procedimentocom 10 ou 20 ug de BSA, 20 ug de sobrenadante decultura concentrada de cepa Eschericia coli BL21 (DE3)portando o plasmídeo pWKS30 sem o gene de inserção paraa proteína meningococcal preparada como descrito noexemplo 3, ou solução salina tamponada com fosfato.Amostras de soro de cada camundongo foram obtidas antesde cada injeção para analisar o desenvolvimento daresposta imune contra a proteína recombinante. Duassemanas após a terceira imunização os camundongos emtodos os grupos foram injetados intraperitonealmentecom 1 ml de uma suspensão contendo 1000 unidades deformação de colônia de cepa de Neisseria meningitidis608B em 4% mucina (Sigma) e 1,6% hemoglobina (Sigma).

Os resultados destes experimentos sãoapresentados na Tabela 4. Oitenta por cento (80%) doscamundongos imunizados com a proteína superficial de 22kDa recombinante purificada sobreviveram ao desafiobacteriano em comparação com 0 a 42% nos grupos decontrole. De modo importante, os camundongos no grupode controle injetados com sobrenadante de cultura deEscherichia coli concentrado não foram protegidoscontra o desafio bacteriano. Este resultado mencionadopor último demonstrou claramente que os componentespresentes no meio de cultura e os antigenos deEscherichia coli que poderiam estar presentes empequenas quantidades após purificação não contribuempara a proteção observada contra Neisseriameningitidis.

Tabela 4 Imunização com Proteína superficial de22 kDa Recombinante Purificada confere proteção contradesafio bacteriano subseqüente com cepa de Neisseriameningitidis 608B (B:2a:P1.2)

<table>table see original document page 76</column></row><table><table>table see original document page 77</column></row><table>

Conclusão

A injeção de proteína superficial de 22 kDarecombinante purificada protegeu, imensamente, oscamundongos imunizados contra o desenvolvimento de umainfecção letal por Neisseria meningitidis.

Anticorpos de acordo com esta invenção sãoexemplificados por linhas de célula de hibridoma demurino produzindo anticorpos monoclonais Me-I e Me-7depositados no American Type Culture Collection emRockville, Maryland, EUA em 21 de julho de 1995. Osdepósitos receberam números de acesso HB 11959 (Me-I) eHB 11958 (Me-7).

Exemplo 7 Análise de seqüência de outras cepasde Neisseria meningitidis e de Neisseria gonorrhoeae

O fragmento de DNA digerido ciai de 2,75 kbcontendo o gene codificando para a proteína superficialde 22 kDa foi isolada do DNA genômico das diferentescepas de Neisseria meningitidis e Neisseria gonorrhoeaecomo descrito no Exemplo 3.

a) cepa MCH8 8: a seqüência de nucleotídeo dacepa MCH88 (isolado clínico) é apresentada na figura 8(SEQ ID NO: 3). Da evidencia experimental obtida dacepa 608B (Exemplo 3), uma seqüência principal putativafoi deduzida correspondendo a aminoácido -19' a -1 (M-K-K-A-L-A-A-L-1-A-L-A-L-P-A-A-A-L-A) . Uma busca debases de dados estabelecidas confirmou que a proteínasuperficial de 22 kDa de cepa de Neisseria meningitidisMCH 188 (SEQ ID NO: 4) ou seu gene (SEQ ID NO: 3) nãoforam descritos anteriormente.

b) cepa Z4063: a seqüência de nucleotideo dacepa Z4063 (Wang J. -F e outros Infect. Immun., 60,pág. 5267 (1992)) é apresentada na figura 9 (SEQ ID NO:5). Da evidência experimental obtida da cepa 608B(Exemplo 3), uma seqüência principal putativa foideduzida correspondendo a aminoácido -19 a -1 (M-K-K-A-L-A-T-L-I-A-L-A-L-P-A-A-A-L-A). Uma busca de bases dedados estabelecidas confirmou que a proteínasuperficial de 22 kDa da cepa Neisseria meningitidisZ4063 (SEQ ID NO: 6) ou seu gene (SEQ ID NO: 5) nãoforam descritos anteriormente.

c) cepa de Neisseria gonorrhoeae b2: aseqüência de nucleotideo da cepa Neisseria gonorrhoeaeb2 (sorótipo 1, Nat. Ref. Center for Neisseria, LCDC,Ottawa, Canadá) é descrita na figura 10 (SEQ ID NO: 7) .Da evidência experimental obtida da cepa 608B (Exemplo3) , uma seqüência principal putativa foi deduzidacorrespondendo a aminoácido -19 a -1 (M-K-K-A-L-A-A-L-I-A-L-A-L-P-A-A-A-L-A) . Uma busca de bases de dadosestabelecidas confirmou que a proteína superficial de22 kDa de cepa Neisseria gonorrhoeae b2 (SEQ ID NO: 8)ou seu gene (SEQ ID NO: 7) não foram previamentedescritos.

A figura 11 mostra a seqüência de consensoestabelecida da seqüência de DNA de todas as quatrocepas testadas. A cepa MCH8 8 mostrou uma inserção deum codon (TCA) no nucleotideo 217, porém em geral asquatro cepas mostraram homologia surpreendente.

A figura 12 ilustra a homologia entre aseqüência de aminoácido deduzida obtida das quatrocepas. Há identidade maior do que 90% entre todas asquatro cepas.

Exemplo 8 Resposta imunológica de coelhos emacacos à proteína superficial de Neisseriameningitidis de 22 kDa

Coelhos e macacos foram imunizados com aproteína 22kDa recombinante para avaliar a resposta deanticorpo em espécies outras do que o camundongo.

a) Coelhos

Coelhos machos da Nova Zelândia foramimunizados com preparados de membrana externa obtidosda cepa E. coli JM109 com o plasmideo pN2202 ou com oplasmídeo de controle pWKS30 (a cepa e os plasmídeossão descritos no exemplo 3). A extração de cloreto delitio utilizada para obter estes preparados de membranaexterna foi realizada em um modo previamente descritopelos inventores [Brodeur e outros, Infect. Immun. 50,510 (1985)]. O teor de proteína destes preparados foideterminado pelo processo Lowry adaptado a frações demembrana [Lowry e outros, J. Biol. Chem. 193, 265(1951) ] . Os coelhos foram injetados subcutaneamente eintramuscularmente em vários locais duas vezes emintervalos de três semanas com 150 ug de um dospreparados de membrana externa descritos acima. QuilA,em uma concentração final de 20% (vol./vol.) (CedarLaneLaboratories, Hornby, Ont., Canadá) foi o adjuvanteutilizado para estas imunizações. 0 desenvolvimento daresposta humoral especifica foi analisada por ELISAutilizando preparados de membrana externa extraídos dacepa Neisseria meningitidis 608B (B:2a:PI.2) comoantígeno de revestimento e por imunoborrão Ocidentalseguindo processos já descritos pelos inventores[Brodeur e outros, Infect. Immun. 50, 510 (1985);Martin e outros, Eur. J. Immunol. 18, 601 (1988)].Imunoglobulinas anti-coelho Donkey rotuladas comperoxidase ou fosfatase alcalina (JacksonImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) foramutilizadas para estes ensaios.

A injeção de preparado de membrana externa deE. coli contendo a proteína recombinante de 22 kDa emcombinação com adjuvante QuilA induziu no coelho umaforte resposta humoral específica de 1/32.000 coodeterminado por ELISA (figura 13). Os anticorposinduzidos após a injeção da proteína de 22 kDarecombinante reagiram com a proteína de 22 kDarecombinante, purificada, porém mais importante tambémreconheceram a proteína nativa como expresso, dobrada eembutida na membrana externa de Neisseria meningitidis.Os experimentos de imunoborrão Ocidental indicaramclaramente que os anticorpos presentes após a segundainjeção reconheceram na membrana de nicrocelulose amesma faixa de proteína que aquela revelada por Me-2Mab (descrito no Exemplo 2), que é específico para aproteína de 22 kDa.

b) Macacos

Dois macacos Macaca fascicularis (cynomolgus)foram respectivamente imunizados com duas injeções de100 ug (K28) e 200 ug (1276) de proteína de 22 kDarecombinante purificado por afinidade por injeção. Osprocessos utilizados para produzir e purificar aproteína da cepa E. coli BL21De3 foram descritos noexemplo 3. Alhidrogenl, a uma concentração final de20% (vol./vol.) (CedarLane Laboratories, Hornby, Ont.,Canadá), foi o adjuvante utilizado para estasimunizações. Os macacos receberam duas injeçõesintramusculares em intervalos de três semanas. Ummacaco de controle (K65) foi imunizado com um preparadode proteína recombinante não relacionada seguindo osmesmos procedimentos. Os soros foram analisados comodescrito acima. Imunoglobulinas anti-humanas de Cabrarotuladas com Peroxidase ou fosfatase alcalina (JacksonImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) foramutilizados para estes ensaios.A resposta de anticorpo específica de macacoK28 que foi imunizada com 100 ug de proteína purificadapor injeção pareceu mais rápida e mais forte do queaquela observada para o macaco 127 6 que foi injetadocom 200 ug de proteína (figura 14) . Os anticorposespecíficos para a proteína de 22 kDa nativa comodetectado por imunoborrão Ocidental já estavampresentes no soro dos macacos imunizados vinte e umdias após a primeira injeção, porém estavam ausentes nosoro do macaco de controle após duas injeções doantígeno de controle.

Conclusão

Os dados apresentados nos Exemplos 2 e 5mostraram claramente que a injeção da proteína de 22kDa recombinante pode induzir uma resposta humoral deproteção em camundongos que é dirigida contra cepas deNeisseria meningitidis. Mais importante, os resultadosapresentados nestes exemplo demonstram que estaresposta imunológica não é limitada apenas a umaespécie, porém esta proteína superficial - recombinantetambém pode estimular o sistema imune de outrasespécies como coelho ou macaco.

Exemplo 9 Mapeamento de Epitopo da proteína de22 kDa de Neisseria meningitidis

A proteína superficial de 22 kDa de Neisseriameningitidis foi mapeada em epítopo utilizando umprocesso descrito por um dos inventores [Martin eoutros Infect. Immun. (1991): 59:1457-1464]. Aidentificação dos epitopos lineares foi realizadautilizando 18 peptideos sintéticos de sobreposiçãoabrangendo toda a seqüência de proteína de 22 kDa deNeisseria meningitidis derivada da cepa 608B (figura15) e soro hiperimune obtido após imunização com estaproteína. A identificação de porções imunodominantesna proteína de 22 kDa pode ser útil no projeto de novasvacinas eficientes. Além disso, a localização destesepitopos de célula B também fornece informaçõesvaliosas sobre a configuração estrutural da proteína namembrana externa de Neisseria meningitidis.

Todos os peptideos foram sintetizados porBioChem Immunosystems Inc. (Montreal, Canadá) com osintetizador de peptídeo automatizado da AppliedBiosystems (Foster City, Calif.). Peptideos sintéticosforam purificados por cromatografia líquida de pressãoelevada de fase inversa. Peptideos CS-845, CS-847, CS-848, CS-851, CS-852 e CS-856 (figura 15) foramsolubilizadas em um pequeno volume de 6M guanidina-HCl(J.T. Baker, Ontario, Canadá) ou sulfóxido de dimetila(J.T. Baker). Estes peptideos foram então ajustados a1 mg/ml com água destilada. Todos os outros peptideoseram livremente solúveis em água destilada e tambémforam ajustados para 1 mg/ml.

Ensaios imunossorventes ligados por enzima depeptídeo (ELISA) foram realizados revestindo peptideossintéticos sobre placas de microtitulação (Immulon 4,Dynatech Laboratories Inc., Chantilly, VA) a umaconcentração de 50 ug/ml em 5 0 mM de tampão decarbonato, pH 9,6. Após incubação durante a noite emtemperatura ambiente, as placas foram lavadas comsolução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo0,05% (peso/vol.) Tween 20 (Sigma Chemical Co., St.Louis, MO.) e bloqueado com PBS contendo 0,5%(peso/vol.) de albumina de soro bovino (Sigma). Sorosobtidos de camundongos e macacos imunizados comproteína superficial de 22 kDa recombinante purificadopor afinidade foram diluídos e 100 ul por cavidade decada diluição foram adicionados às placas de ELISA eincubados por 1 h a 37°C. As placas foram lavadas trêsvezes, e 100 ul de imunoglobulinas anti-humanas ouanti-camundongo de cabra conjugadas em fosfatasealcalina (Jackson ImmunoResearch Laboratories, WestGover, PA) diluídas de acordo com as recomendações dofabricante foram adicionados. Após incubação por lha37°C, as placas foram lavadas e 100 ul de dietanolamina(10% (vol/vol), pH 9,8) contendo p-nitro-fenilfosfato(Sigma) a 1 mg/ml foi adicionado. Após 60 min., areação (λ=410 mti) foi lida espectrofotometricamente comuma leitora de microplaca.

Antisoros de camundongo e macaco obtidos apósimunização com proteína de 22 kDa recombinantepurificada por afinidade (Exemplo 8) foram utilizadoscom sucesso em combinação com dezoito peptídeossintéticos de sobreposição para localizar epítopos decélula B na proteína. Estes epitopos são agrupadas emtrês domínios antigênicos na proteína.

A primeira região é localizada entre resíduosde aminoácido 51 e 86. A análise de computadorutilizando diferentes algoritmos sugeriu que estaregião tem a probabilidade mais elevada de serimunologicamente importante uma vez que é hidrofílico eexposto superficial. Além disso, a comparação dasquatro seqüências de proteína que é apresentada nafigura 12 indica que uma das principais variações, queé a inserção de um resíduo de aminoácido na posição 73,também é localizada nesta região.

Os antisoros identificaram iam segundo domínioantigênico localizado entre resíduos de aminoácido 110e 140. De modo interessante, a análise de seqüênciarevelou que sete dentre quatorze resíduos de aminoácidoque não são conservados entre as quatro seqüências deproteína são agrupados nesta região da proteína.

Um terceiro domínio antigênico localizado emuma porção altamente conservada da proteína, entreresíduos de aminoácido 31 e 55, foi reconhecido apenaspelos soros de macacos.

Exemplo 10 Vetor de expressão induzivel porcalor para a produção em grande escala da proteínasuperficial de 22 kDa

O gene codificando para a proteína superficialde 22 kDa de Neisseria meningitidis foi inserido noplasmídeo p629 [George e outros Bio/technology 5: 600-603 (1987)]. Um cassete do gene repressor sensível àtemperatura do bacteriofago λ cI857, do qual o promotorPr funcional foi deletado, é carregado pelo plasmídeop629 que utiliza o promotor PL para controlar a sínteseda proteína superficial de 22 kDa. A inativação dorepressor cI857 por uma mudança de temperatura de 30°Cpara temperaturas acima de 380C resulta na produção daproteína codificado pelo plasmídeo. A indução deexpressão de gene em células de E. coli por uma mudançade temperatura é vantajosa para fermentação em grandeescala uma vez que pode ser facilmente obtido comfermentadores modernos. Outros vetores de expressãoinduzível normalmente exigem a adição de moléculasespecíficas como lactose ou isopropiltio-β-Ό-galactoside (IPTG) no meio de cultura para induzir aexpressão do gene desejado.

Um fragmento de 540 nucleotídeos foiamplificado por PCR do DNA genômico de cepa deNeisserla meningitidis 608B utilizando as duasseguintes bases de oligonucleotídeo (OCRR8: 5'-TAATAGATCTATGAAAAAAGCACTTGCCAC-3' e OCRR 9: 3'-CACGCGCAGTTTAAGACTTCTAGATTA-5' ). Estas basescorrespondem às seqüências de nucleotídeo encontradasnas duas extremidades do gene de 22 kDa. Parasimplificar a clonagem do produto PCR, um sítio derestrição Bll II (AGATCT) foi incorporado na seqüênciade nucleotídeo destas bases. O produto PCR foipurificado em gel agarose antes de ser digerido com BglII. Este fragmento Bgl II de aproximadamente 525 paresde base foi então inserido nos sítios de Bgl II e BamHI do plasmídeo p629. 0 plasmídeo contendo a inserçãode produto PCR denominada pNP2204 foi utilizado paratransformar a cepa E. coli DH5aF'IQ. Uma mapa parcialdo plasmídeo pNP2204 é apresentado na figura 16. Ascolônias resultantes foram selecionados com anticorposmonoclonais específicos de proteína superficial de 22kDa de Neisseria meningitidis descritos no Exemplo 2.

A análise de borrão Ocidental dos clones resultantesindicou claramente que a proteína sintetizada porE.coli estava completa e migrou em gel SDS-PAGE como aproteína superficial de 22 kDa de Neisseriameningitidis nativa. DNA de plasmídeo foi purificadodo clone selecionado e a seguir sequenciado. Aseqüência de nucleotídeo da inserção presente noplasmídeo correspondeu perfeitamente a seqüência denucleotídeo do gene codificando para a proteína de 22kDa de Neisseria meningitidis apresentado na figura 1.

Para estudar o nível de síntese- da proteínasuperficial de 22 kDa, o plasmídeo induzível portemperatura pNP2204 foi utilizado para transformar ascepas E. coli seguintes: W3110, JM105, BL21, TOPP1,TOPP2 e TOPP3. O nível de síntese da proteínasuperficial de 22 kDa e a localização da proteína nasfrações celulares diferentes foram determinados paracada cepa. Culturas de frasco de agitação em caldo LB(Gibco BRL, Life Technologies, Grand Island, NY)indicaram que uma mudança de temperatura de 30°C para39°C induziu eficientemente a expressão do gene. Aavaliação do custo de tempo do nivel de síntese indicouque a proteína apareceu, como determinado em gel SDS-PAGE, 30 min. após indução e que a quantidade deproteína aumentou constantemente durante o período deindução. Níveis de expressão entre 8 e 10 mg deproteína de 22 kDa por litro foram determinados paracepas E. coli W3110 e TOPPl. Para as duas cepas,grande parte da proteína de 22 kDa é incorporada namembrana externa bacteriana.

Exemplo 11 Purificação da proteína de 22 kDa deNeisseria meningitidis

Uma vez que a vasta maioria da proteína de 22kDa é encontrada embutida na membrana externa de cepasE. coli, o protocolo de purificação apresentado nesteExemplo é diferente de um já descrito no Exemplo 3 ondeuma grande quantidade de proteína foi liberada nosobrenadante de cultura. Uma cultura durante a noiteincubada a 30°C de cepa E. coli W3110 ou TOPPlabrigando o plasmídeo pNP2204 foi inoculado em caldo LBcontendo 50 ug/ml de Ampicilina (Sigma) e foi cultivadoa 30°C com agitação (250 rpm) até atingir uma densidadede célula de 0,6 (X=600nm) , em cujo ponto a temperaturade incubação foi mudada para 39°C por três a cincohoras para induzir a produção da proteína. As célulasbacterianas foram colhidas por centrifugação a 8.000 xgpor 15 minutos a 4°C e lavadas duas vezes em soluçãosalina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,3. As célulasbacterianas foram ultrassonicamente rompidas(desintegração balística ou desintegração mecânica comuma prensa francesa também pode ser utilizada).

Células não rompidas foram removidas por centrifugaçãoa 5.000 xg por 5 minutos e descartadas. As membranasexternas foram separadas de componentes citoplásmicospor centrifugação a 100.000 xg por lha 10°C. Aspelotas contendo membrana foram suspensas novamente emum pequeno volume de PBS, pH 7,3. Para solubilizar aproteína superficial de 22 kDa das membranas,detergentes como Epigen BB (Calbiochem Co., LaJolla,CA), Zwittergent-3,14 (Calbiochem Co.) ou β-octilglucoside (Sigma) foram utilizados. O detergentefoi adicionado à fração de membrana na concentraçãofinal de 3% e a mistura foi incubada por lha 20°C. Omaterial não solúvel foi removido por centrifugação a100.000 xg por lha 10°C.

A proteína de 22 kDa foi eficientementesolubilizada por qualquer três dos detergentes, contudoβ-octilglucoside tinha a vantagem de facilmente removervárias proteínas de membrana indesejáveis uma vez quenão foram solubilizadas e poderiam ser separadas dosobrenadante por centrifugação. Para remover odetergente, o sobrenadante contendo 22 kDa foidialisado extensamente contra várias mudanças detratamento de Proteinase K tampão PBS (como no exemplo1) pode ser utilizado para remover adicionalmenteproteínas indesejáveis da preparação de proteínasuperficial de 22 kDa. Precipitação diferencialutilizando sulfato de amônio ou solventes orgânicos, eultrafiltração são duas etapas adicionais que podem serutilizadas para remover ácido nucléico indesejado econtaminantes de lipopolissacarídeo das proteínas antesda permeação de gel e cromatografia de permuta iônicapodem ser eficientemente utilizados para obter aproteína de 22 kDa purificada. Cromatografia porafinidade, como descrito no Exemplo 3, também pode serutilizado para purifiçar a proteína de 22 kDa.

Exemplo 12 Uso de proteína superficial de 22kDa como uma vacina humana

Para formular uma vacina para uso humano,antígenos de proteína superficial de 22 kDa apropriadospodem ser selecionados dos polipeptídeos descritosaqui. Por exemplo, uma pessoas versada na técnicapoderia projetar uma vacina em torno do polipeptídeo de22 kDa ou seus fragmentos contendo um epítopoimunogênico. O uso de técnicas de biologia molecular éparticularmente bem adequado para a preparação deantígenos recombinantes substancialmente puros.

A composição de vacina pode ter uma variedadede formas. Estas incluem, por exemplo, formas dedosagem sólida, semi-sólida e líquida, como pós,soluções líquidas ou suspensões, e lipossomas. Combase em nossa crença de que os antígenos de proteínasuperficial de 22 kDa da presente invenção podemextrair uma resposta imune de proteção quandoadministrados a um ser humano, as composições dapresente invenção serão similares àquelas utilizadaspara imunizar seres humanos com outras proteínas epolipeptídeos, por exemplo tétano e difteria.Portanto, as composições da presente invençãocompreenderão, preferivelmente, um adjuvantefarmaceuticamente aceitável como adjuvante de Freundincompleto, hidróxido de alumínio, um peptídeo demuramila, uma emulsão de água em óleo, um lipossoma, umISCOM ou CTB, ou uma subunidade não tóxica B de toxinade cólera. Mais preferivelmente, as composiçõesincluirão uma emulsão de água em óleo ou hidróxido dealumínio como adjuvante.

A composição seria administrada ao paciente emqualquer de diversas formas farmaceuticamenteaceitáveis incluindo intramuscular, intradérmica,subcutânea ou tópica. Preferivelmente, a vacina seráadministrada intramuscularmente.

Geralmente, a dosagem consistirá de uma injeçãoinicial, mais preferivelmente com adjuvante, deaproximadamente 0,01 a 10 mg, e preferivelmente 0,1 a1,0g de antígeno de proteína superficial de 22 kDa porpaciente, seguido mais provavelmente por uma ou maisinjeções de reforço. Preferivelmente, reforços serãoadministrados aproximadamente 1 e 6 meses após ainjeção inicial.Uma consideração relacionada ao desenvolvimentode vacina é a questão de imunidade de mucosa. A vacinade mucosa ideal será seguramente tomada oralmente ouintranasalmente como uma ou algumas doses e extrairiaanticorpos de proteção nas superfícies apropriadasjuntamente com imunidade sistêmica. A composição devacina de mucosa pode incluir adjuvantes, veículos empartículas inertes ou vetores vivos recombinantes.

Os anticorpos de proteína superficial anti-22kDa desta invenção são úteis para imunoterapiapassiva e imunoprofilaxia de seres humanos infectadoscom Neisseria meningitidis ou bactérias relacionadascomo Neisseria gonorrhoeae ou lactamica. As formas dedosagem e regimes para tal imunização passiva seriamsimilares àquelas de outras imunoterapias passivas.

Um anticorpo de acordo com a presente invençãoé exemplificado por um hibridoma produzindo Me-I MAbsou Me-7 depositado no American Type Culture Collectionem Rockvilie,Maryland, EUA em 21 de julho de 1995, eidentificado como Linhas de Célula de -Hibridoma deMurino, Me-I e Me-7, respectivamente. Estes depósitosforam atribuídos números de acesso HB 11959 (Me-I) e HB11958 (Me-7).

Embora tenhamos descritos aqui diversasmodalidades da presente invenção, é evidente que nossasmodalidades básicas podem ser alteradas para forneceroutras modalidades que utilizam as composições eprocessos da presente invenção. Portanto, seráapreciado que o âmbito da presente invenção incluitodas as modalidades alternativas e variações que sãodefinidas na especificação acima e pelas reivindicaçõesapensas ã presente; e a invenção não deve ser limitadapelas modalidades especificas que foram apresentadasaqui como exemplo.

Claims

1. Molécula de DNA recombinante caracterizada pelofato de compreender:(a) uma seqüência de DNA selecionada de:(i) (SEQ ID NO: 1);(ii) (SEQ ID NO:1) da base 143 para a base 667; e(iii) (SEQ ID NO: 1) da base 200 para a base 667;e (b) uma ou mais seqüências de controle de expressãoheterólogas operativamente ligadas à seqüência de DNA.

2. Molécula de DNA recombinante, caracterizada pelofato de compreender:(a) uma seqüência de DNA selecionada de:qualquer uma de:(SEQ ID NO: 3) da base 116 para a base 643,(SEQ ID NO: 3) da base 173 para a base 643,(SEQ ID NO: 5) da base 208 para a base 732,(SEQ ID NO: 5) da base 265 para a base 732,(SEQ ID NO: 7) da base 241 para a base 765,(SEQ ID NO: 7) da base 298 para a base 765,(b) e uma ou mais seqüências de controle de expressãoheterólogas operativamente ligadas à seqüência de DNA.

3. Molécula, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que aseqüência de controle de expressão heteróloga compreendeuma seqüência de expressão induzível.

4. Molécula, de acordo com a reivindicação 3,caracterizada pelo fato de que a expressão da seqüência deDNA é induzida por estímulos selecionados dentre:temperatura, presença de lactose e presença de IPTG.

5. Molécula, de acordo com a reivindicação 3,caracterizada pelo fato de que as seqüências de controle deexpressão heterólogas compreendem uma seqüência depromotor.

6. Plasmídeo caracterizado pelo fato de compreenderum vetor de expressão recombinante que compreende amolécula de DNA recombinante da reivindicação 1 ou 2.

7. Microorganismo transgênico caracterizado pelofato de ser um microorganismo procariótico transformado comuma molécula de DNA recombinante da reivindicação 1 ou 2 .

8. Microorganismo transgênico, de acordo com areivindicação 7, caracterizado pelo fato de serselecionado de: cepas de E. coli JM109, E. coli BL21(DE3) , E. coli DH5aF'IQ, E. coli W3110, E. coli JM105, E.coli BL21, E. coli TOPP1, E. coli TOPP2 e E. coli TOPP3 .

9. Composição farmacêutica caracterizada pelo fatode compreender pelo menos um adjuvante farraaceuticamenteaceitável selecionado a partir de hidróxido de alumínio,peptídeo muramil, emulsão de água em óleo, lipossoma,toxina cólera subunidade B, QuilA™, e ISCOM™ (complexoimunoestimulante) , e um polipeptídeo recombinanteselecionado de(a) um polipeptídeo recombinante compreendendo umaseqüência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 2;(b) um polipeptídeo recombinante compreendendo umaseqüência de aminoácido apresentada em qualquer uma dasSEQ ID NOS: 4, 6 e 8;(c) um polipeptídeo recombinante compreendendo umaseqüência de aminoácido selecionada de SEQ ID NO: 9, SEQID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO:- 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ IDNO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQID NO: 25 e SEQ ID NO: 26;(d) um polipeptídeo recombinante compreendendoaminoácidos 31 a 5 5 de SEQ ID NO: 2;(e) um polipeptídeo recombinante compreendendoaminoácidos 51 a 8 6 de SEQ ID NO: 2;(f) um polipeptídeo recombinante compreendendoaminoácidos 110 a 140 de SEQ ID NO: 2.(g) um polipeptídeo recombinante codificado pelamolécula de DNA recombinante de acordo com a reivindicação 1; e(h) um polipeptídeo recombinante codificado pelamolécula de DNA recombinante de acordo com a reivindicação 2.

10. Processo para detecção de um antígeno de umabactéria de Neisseria em uma amostra biológica contendo oususpeita de conter um antígeno de uma bactéria de Neisseriacaracterizado pelo fato de compreender:a) isolar a amostra biológica de um paciente;b) incubar um anticorpo ou antígeno ligado aofragmento deste, como uma sonda para detectar o antígeno, oqual anticorpo ou antígeno ligado ao fragmento deste seliga especificamente a uma proteína compreendendo umaseqüência de aminoácido apresentada em qualquer uma das SEQID NOS: 2, 4, 6 e 8, com a amostra biológica para formaruma mistura; ec) detectar ligação do anticorpo ou antígeno ligadoao fragmento deste, ao antígeno na mistura, indicando,deste modo, a presença do antígeno de uma bactéria deNeisseria na amostra biológica.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 10,caracterizado pelo fato de que a bactéria de Neisseria éNeisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae ou Neisserialactaiuica.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 10,caracterizado pelo fato de que o anticorpo é produzido poruma linha de célula de hibridoma designada pelo número dedepósito HB 11958 ou por uma linha de célula de hibridomadesignada pelo número de depósito HB 11959.

13. Processo para a detecção de anticorposespecíficos para antígeno de Neisseria meningitidis em umaamostra biológica contendo ou suspeita de conter osanticorpos caracterizado pelo fato de compreender:a) isolar a amostra biológica de um paciente;b) incubar um antígeno compreendendo a seqüência deaminoácido apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 2,- 4, 6 e 8, ou fragmento imunologicamente acessível deste coma amostra biológica para formar uma mistura; ec) detectar o antígeno, ou fragmento deste,especificamente ligado na mistura que indica a presença deanticorpo específico para o antígeno de Neisseriameningitidis.

14. Processo, de acordo com a reivindicação 13,caracterizado pelo fato de que o antígeno compreende umfragmento da proteína de superfície de 22 kDa de Neisseriameningitidis, em que o fragmento compreende uma seqüênciade aminoácido selecionada de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18,SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22,SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26,a seqüência de aminoácido apresentada nas posições 31 a 55da SEQ ID NO: 2, a seqüência de aminoácido apresentada nasposições 51 a 86 da SEQ ID NO: 2 e a seqüência de aminoácidoapresentada nas posições 110 a 140 da SEQ ID NO: 2.

15. Processo, de acordo com a reivindicação 13,caracterizado pelo fato de que o anticorpo detectado é umanticorpo produzido por uma linha de célula de hibridomadesignada pelo número de depósito HB 11958 ou por uma linhade célula de hibridoma designada pelo número de depósito HB 11959.

16. Processo para detecção de uma bactéria deNeisseria meningitidis patogênica em uma amostra biológicacontendo ou suspeita de conter a bactéria caracterizadopelo fato de compreender:a) isolar a amostra biológica de um paciente;b) incubar uma sonda de DNA, tendo a seqüência de umDNA que codifica pelo menos uma porção proteína desuperfície de 22kDa de Neisseria meningitidis em que aseqüência de DNA codificando pelo menos uma porção daproteína de superfície é selecionada de(i) (SEQ ID NO:1);(ii) uma seqüência de DNA que codifica umpolipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidoapresentada na SEQ ID NO: 2 ou um fragmento da mesma, emque o fragmento compreende pelo menos um epítopoimunogênico;(iii) (SEQ ID NO: 1) da base 143 para a base 667; e(iv) (SEQ ID NO: 1) da base 200 para a base 667; ec) detectar a sonda de DNA especificamentehibridizada na mistura que indica a presença de umabactéria de Neisseria meningitidis.

17. Processo de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato de que a sonda de DNA tem aseqüência compreendendo bases 200 a 6 64 de SEQ ID NO: 1.

18. Processo, de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato de que a sonda de DNA tem umaseqüência de uma porção de bases 200 a 664 da SEQ ID NO: 1.

19. Processo, de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato de que a sonda de DNA é umoligômero compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que écomplementar a pelo menos 6 nucleotideos contíguos entre asbases 200 a 664 da SEQ ID NO: 1.

20. Processo para detecção de uma bactéria deNeisseria meningitidis patogênica em uma amostra biológicacontendo ou sendo suspeita de conter tal bactériacaracterizado por compreender:a) isolar a amostra biológica de um paciente;b) incubar uma sonda de DNA, tendo a seqüência deDNA apresentada na SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7,ou uma porção da mesma; ou tendo uma seqüência de DNA quecodifica um polipeptídeo compreendendo a seqüência de DNAapresentada na SEQ ID NO: 4, 6 ou 8, ou uma porção damesma, com a amostra biológica para formar uma mistura; ec) detectar a sonda de DNA especificamentehibridizada na mistura que indica a presença de umabactéria de Neisseria.

21. Processo, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que a sonda de DNA tem umaseqüência de toda ou uma porção da seqüência compreendendobases 173 a 640 da SEQ ID NO: 3.

22. Processo, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que a sonda de DNA tem umaseqüência de toda ou uma porção da seqüência compreendendobases 265 a 729 da SEQ ID NO: 5.

23. Processo, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que a sonda de DNA tem umaseqüência de toda ou uma porção da seqüência compreendendobases 298 a 762 da SEQ ID NO: 7.

24.

Processo, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que a sonda de DNA é umoligômero, compreendendo uma seqüência de nucleotideo que écomplementar a pelo menos 6 nucleotideos contíguos de umaseqüência selecionada de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 e SEQID NO: 7, ou o complemento desta.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA(1) INFORMAÇÕES GERAIS:(i) Depositante: Brodeur, Bernard RMartin, DenisHamel, JoseeRioux, Clement(ii) Titulo da Invenção: PROTEÍNA SUPERFICIALDE NEISSERIA MENINGIDITIS RESISTENTE A PROTEINASE K(iii) Número de seqüências: 2 6(iv) Endereço de correspondência:(a) Destinatário: Goudreau Gage Dubuc &Martineau Walker(b) rua: 800 Place Victoria, Suite 3400, Tourde la Bourse© cidade: Montreal(d) estado: Quebec(e) pais: Canadá(f) código postal: H4Z IES(v) forma legível por computador:(a) tipo de meio: disco flexível(b) computador: IBM PC compatível© sistema operacional: PC-DOS/MS-DOS(d) software: PatentIn Release # 1.0, versão#1.25(vi) dados atuais do pedido:(a) número do pedido:(b) data de depósito:© classificação:(vii) dados do pedido anterior:(a) número do pedido: US 08/406.362(b)data de depósito: 17 de març.

de 1995(vii) dados do pedido anterior:(a) número do pedido: US(provis) 60/001.983(b) data de depósito: 04-agost-1995(viii) informações de agente/advogado:(a) nome: Leclerc/Dubuc/Prince,Alain/Jean/Gaetan© referência/número de dossiê: BIOVAC-I PCT(ix) informações de telecomunicações:(a) telefone: 514-397-7400(b) telefax: 514-397-4382(2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 1:.(i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO; 830 pares de base(B) TIPO: ácido nucléico© FILAMENTO: Duplo(DO TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genômico)(iii) HIPOTÉTICO: não(iv) ANTI-SENTIDO: não(vi) FONTE ORIGINAL:(A) ORGANISMO: Neisseria meningitidis(B) CEPA: 608B(ix) CARACTERÍSTICA:(A) NOME/TECLA: CDS(B) LOCALIZAÇÃO: 143...667(ix) CARACTERÍSTICA:(A) NOME/TECLA: sig_peptídeo(B) LOCALIZAÇÃO: 143...199(ix) CARACTERÍSTICA:(A) NOME/TECLA: mat_peptídeo(B) LOCALIZAÇÃO: 200.667(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 1:tTGGCAAAGC AGCCG5ATAC CGCTACGTAT CTTGAAGTAT TGAAÀATATT ACGATGCAAAÊCAAAGAAAATT TAAGTATAAT ACAGCAGGAT TCTTTAACGG ATTCTTAACA ATTTTTCTAA 123CTGACCATAA AGGAACCAAA AT ATG AAA AAA GCA CTT GCC ACA CTG ATT GCC 172Met Lys Lys Ala Leu AXa T^r Leu Ile Ala-19 -15 -10CTC GCT CTC CCG GCC GCC GCA CTG GCG GAA GGC GCA TCC GGC TTT TAC 220Leu Ala Leu Pro Ala Ala Ala Leu Ala Glu Gly Ala Ser Gly Phe Tyr-5 1 5GTC CAA GCC GAT GCC GCA CAC GCA AAA GCC TCA AGC TCT TTA GGT TCT 268Val Gln Ala Asp Ala Ala His Ala Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gly Ser-10 15 20GCC AAA GGC TTt AGC CCG CGC ATC TCC GCA GGC TAC CGC ATC AAC GAC 316Ala Lys Gly Phe Ser Pro Ar9 Xle Ser Ala Gly Tyr Arg Ile Asn Asp-25 30 35CTC CGC TIC GCC GTC GAT TAC ACG CGC TAC AAA AAC TAT AAA GCC CCA 364Leu Aro Phe Ala Val Asp Tyr Thr Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys Ala Pro-40 45 50 55TCC ACC GAT TTC AAA CTT TAC AGC ATC GGC GCG TCC GCC ATT TAC GAC 412Ser Thr Asp Phe Lys Leu Tyr Ser Ile Gly Ala Ser Ala Ile Tyr Asp- 60- 508TTC GAC ACC CAA TCG CCC GTC AAA CCG TAT CTC GGC GCG CGC TTG AGC 460Phe Asp Thr Gln Ser Pro Val Lys Pro Tyr Leu Gly Ala Arg Leu Ser- 75 80 65CTC AAC CGC GCC TCC GTC GAC TTG GGC GGC AGC GAC AGC TTC AGC CAA£n S E 15 Val Asp Leu Gly Gly Ser Asp Ser Phe Ser Gln- 90 95 100XCC ΤΓΓ ATC GGC CTC GGC GTA TTG ACG GGC GTA AGC TAT GCC GTT ACC 556Sr Í5 SS Su Gly Val Leu Thr Gly Val Ser TVx Ala Val Itr- 105 110 115- 70CCG AAT GTC GAT TTC GAT GCC GGC TAC CGC TAC AAC TAC ATC GGC AAA 604Pro Asn Val Asp Leu Asp Ala Gly Tyx Arg Tyr Asn Tyr Ile Gly Lys- 120 125 130 135GTC AAC ACT GTC AAA AAC GTC CGT TCC GGC GAA CTG TCC GTC GGC GTG 652Val Asn Tbr Val Lys Asn Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Val Gly Val- 140 145 150CGC GTC AAA TTC TGATATGCGC CTTATTCTGC AAACCGCCGA GCCTTCGGCG 704Arg Val Lys Phe- 155GTTTTGTTTT CTCCCACCGC AACTACACAA GCCGGCGSTT TTGTACGATA ATCCCGAATG 7 64CTGCGGCTTC TGCCGCCCTA TTTTTTGAGG AATC CGAAAT GTCCAAAACC ATCATCCACA- 824ACA(2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 2:(i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 2:Met Lys Lvs Ala Leu Ala Thr Leu Ile Ala Leu Aia Leu Pro Ala Ala-19 -15 -10 -5Ala Leu Ala Glu Gly Ala Ser Gly Phe Tyr Val Gln Ala Asp Ala Ala- 1 5 10His Ala Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gly Ser Ala Lys Gly Phe Ser Pro- 15 20 25Arg Ile Ser Ala Gly Tyr Arg Ile Asn Asp Leu Arg Phe Ala Val Asp- 30 35 40 45Tyr Thr Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys Ala Pro Ser Thr Asp Phe Lys Leu- 50 55Tyr Ser Ile Gly Ala Ser Ala Ile Tyr Asp Phe Asp Thr Gln Ser Pro- 65 70 75Val Lys Pro Tyr Leu Gly Ala Are Leu Ser Leu Asn Arg Ala Ser Val- 80 85 90Asp Leu Gly Gly Ser Asp Ser Phe Ser Gln Thr Ser Ile Gly Leu Gly- 95 100 105Val Leu Thr Gly Val Ser Tyr Ala Val Thr Pro Asn Val Asp Leu Asp- 110 115 120 l25Ala Gly Tyr Arg IVr Asn Tyr Ile Gly Lys Val Asn Thr Val Lys Asn- 130 135 HOVal Arg Ser Gly Glu Leu Ser Val Gly Val Arg Val Lys Phe- 145 ISO 155- 830(2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 3:(i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO; 710 pares de base(B) TIPO: ácido nucléico© FILAMENTO: Duplo(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genômico)(iii) HIPOTÉTICO: não(iv) ANTI-SENTIDO: não(vi) FONTE ORIGINAL:(A) ORGANISMO: Neisseria meningitidis(B) CEPA: MCH88(ix) CARACTERÍSTICA:(A) NOME/TECLA: CDS(B) LOCALIZAÇÃO: 116...643(ix) CARACTERÍSTICA:(A) NOME/TECLA: sig_peptídeo(B) LOCALIZAÇÃO: 116...172(ix) CARACTERÍSTICA:(A) NOME/TECLA: mat_peptídeo(B) LOCALIZAÇÃO: 173...643(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ ID NOGTATCTTGA.G GCATTGAAAA TATTACAATG CAAAAAGAAA ATTTCAGTAT AATACGGCAG 60GAr-CTTTAA CGGATTCTTA ACCATTTTTC TCCCTGACCA TAAAGGAATC AAGAT ATC- 118Met-19AAA AAA GCA CTT GCC GCA CTC ATT GCC CTC GCC CTC CCG GCC GCC GCA 166Lys Lvs Ala Leu Ala Ala Leu Ile Ala Leu Ala Leu Pro Ala Ala Ala-1

5 -10 15CTG GCG GAA GGC GCA TCC GGC TTT TAC GTC CAA GCC GAT GCC GCA CAC 214Leu Ala Glu Gly Ala Ser Gly Pbe Tyr Val Gln Ala Asp Ala Ala His- 1 5 10GCC AAA GCC TCA AGC TCT ΠΑ GGT TCT GCC AAA GGC TTC AGC CCG CGC 262Ala Lys Aia Ser Ser Ser Leu Gly Ser Ala Lys Gly Phe Ser Pro Arg- 15 20 2$ 30ATC TCC GCA GGC TAC CGC ATC AAC GAC CTC CGC TTC GCC GTC GAT TAC 310Tle Ser Ala Gly Tyr Arg Ile Asn Asp Leu Arg Phe Ala Val Asp Tyr- 35 40 45ACG CGC TAC AAA AAC TAT AAA CAA GTC CCA TCC ACC GAT TTC AAA CTT 358Thr Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys Gln Val Pro Ser Thr Asp Phe Lys Leu- 50TAC AGC ATC GGC GCG TCC GCC ATT TAC GAC TTC GAC ACC CAA TCC CCCTyr Ser Ile Gly Ala Ser Ala Ile Tyr Asp Phe Asp Thr Gln Ser Pro- 65 70 75- 406GTC AAA CCG TAT CTC GGC GCG CGC TTG AGC CTC AAC CGC GCC TCC GTC 454Val Lys Pro Tyr Leu Gly Ala Arg Leu Ser Leu Asn Arg Ala Ser Val- 80 85 90GAC TTT AAC GGC AGC GAC AGC TTC AGC CAA ACC TCC ACC GGC CTC GGC 502Asp Phe Asn Gly Ser Asp Ser Phe Ser Gln Thr Ser Ώιτ Gly Leu Gly- 95 100 105 110GTA TTC GCG GGC GTA AGC TAT GCC GTI ACC CCG AAT GTC GAT TTG GAT 550Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Ala Val Thr Pro Asn Val Asp Leu Asp- 115 120 125GCC GGC TAC CGC TAC AAC TAC ATC GGC AAA GTC AAC ACT GTC AAA AAT 596Ala Gly Tyr Arg Tyr Asn Tyr Ile Gly Lys Val Asn Thr Val Lys Asn- 130 135 140GTC CG" TCC GGC GAA CTG TCC GCC GGC GTA CGC GTC AAA TTC TC-ATATACGC 650Vai Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ala Gly Val Arg Val Lys Phe- 145 150 155CTTkTTZZZZ AAACCGCCGA GCCTTTCGGC GGTTTTC-TTT TCCGCCC-CCC- CAACTACAC?-. 7" C(2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 4:(i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 4:Met Lys Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Ala Leu Ala Leu Pro Aia Ala-19 -15 -10 -5Ala Leu Ala Glu Gly Ala Ser Gly Phe Tyr Val Gln Ala Asp Ala Ala- 1 5 10His Ala Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gly Ser Ala Lys Gly Pbe Ser Pro- 15 20 25Arg Ile Ser Ala Gly Tyr Arg Ile Asn Asp Leu Arg Phe Ala Val Asp- 30 35 40 45Tyr Thx Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys Gln Val Pro Ser Thr Asp Phe Lys- 50 55 60Leu Tyr Ser Ile Gly Ala Ser Ala Ile Tyr Asp Phe Asp Thr Gln Ser- 65 70 75Pro Val Lys Pro Tyr Leu Gly Ala Arg Leu Ser Leu Asn Arg Ala Ser- 80 85 90Val Asp Phe Asn Gly Ser Asp Ser Phe Ser Gln Thr Ser Thr Gly Leu- 95 100 105Gly Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Ala Val Thr Pro Asn Val Asp Leu- 110 115 120 125Asp Ala Gly Tyr Arg Tyi Asn Tyr Ile Gly Lys Val Asn Thr Val Lys- 130 135 140Asn Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ala Gly Val Arg Val Lys Phe- 145 150 155(2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 5:-(i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 850 pares de base(B) TIPO: ácido nucléico© FILAMENTO: duplo(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genômico)(iii)HIPOTÉTICO: NENHUM(iv) ANTI-SENTIDO: NENHUM(vi) FONTE ORIGINAL:(A) ORGANISMO: Neisseria meningitidis(B) CEPA: z4 063(IX) CARACTERÍSTICA:(A) NOME/TECLA: CDS(B) LOCALIZAÇÃO: 208... 732(ix) CARACTERÍSTICA:(A) NOME/TECLA: sig_peptídeo(B) LOCALIZAÇÃO: 208...264(ix) CARACTERÍSTICA:(A) NOME/TECLA: mat_peptideo(B) LOCALIZAÇÃO: 265...732(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 5:CACCCATCCG CCGCGTGATG CCGCCACCAC CATTTAAAGG CAACGCGCGG GTTAACGGCT 60TTGCCGTCGG CAAAGCAGCC GGATACCGCT ACGTATCTTG AAGTATTAAA AATATTACGA 120TGCAAAAAGA AAATTTAAGT ATAATAAAGC AGAATTCTrr AACGGATTCT TAACAATTTT 180TCTAACTGAC CATAAAGGAA CCAAftAT ATS AAA AAA GCA CTT GCC ACA CTGMet Lys Lys Ala L«u Ala Thr Leu- 231-19-15- 279- 327- 375AAC GAC CTC CGC TTC GCC GTC GAT TAC ACG CGC TAC AAA AAC TAT AAA 423Asn Asp Leu Arg Phe Ala Val Asp Tyr Ttir Ara Tyr Lys Asn Tyr Lys- 40 45 SOGCC CCA TCC ACC GAT TTC AAA CTT TAC AGC ATC GGC GCG TCC GCC ATT 471Ala Pro Ser Thr Asp Phe Lys Leu Tyr Ser Ile Gly Ala Ser Ala Ile- 55 60 65TAC GAC TTC GAC ACC CAA TCG CCC GTC AAA CCG TAT CTC GGC GCG CGC 519Tyr Asp Phe Asp Thr Gln Ser Pro Val Lys Pro Tyr Leu Gly Aia Arg- 70 75 80 85TTC AGC CTC AAC CGC GCC TCC GTC GAC TIG GGC GGC AGC GAC AGC TTC 567Leu Ser Leu Asn Arg Ala Ser Val Asp Leu C-Iy Gly Ser Asp Ser Phe- 90 95 100AGC CAA ACC TCC ACC GGC CTC GGC GTA TTG C-CS GGC GTA ACG TAT GCC 615Ser Gln Thr Ser Thr Gly Leu Gly Val Leu Aia Gly Val Ser Tyr Ala- 105 110GTT ACC CCG AAT GTC GAT TTG GAT GCC GGC TAC CGC TAC AAC TAC ATC 663Val Thr Prc Asn Vai Asd Leu Asp Aia Giy Tyr Ar= Tyr As?. T/r Ile- 120 125 130GC-C AAA GTC AAC ACT GTC AAA AAC GTC CGT TCC GGC GAA CTC- TCC GCC 71:Gly Lys Vai Asn Tnr Val Lys Asn Vai Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ala- 155 140 145GGT GTG CC-C GTC AAA TTC TGATATGCGC CTTATTCTC-C AAACCC-CCGA 759Gly Val Ara Val Lys Pbe- 150 155GCCTTCGGCG GTTTTGTTTT CTGCCACCGC AACTAfACAA GCCGGCGGTT TTGTACGATA 819ATCCCGAATG CTGCGGCTTC TGCCGCCCTA T 850(2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 6:(i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 17 4 aminoácidos(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 6:Met Lys Lys Ala Leu Ala Ibr Leu Ile Ala Leu Ala Leu Pro Ala Ala-19 -15 -10 ~SAla Leu Ala C-Iu Gly fila. Ser Gly Phe Tyr Val Gln Ala Asp Ala Ala- 1 5 10His Ala Lvs Ala Ser Ser Ser Leu Gly Ser Aia Lys Gly Phe Ser Pro- 15 20 25Arg Ile ce- Aia Gly Tyr Arg Ile Asn Asp Leu Arg Phe Ala Val Asp- 30 35 40 45TVt- 1^hr Ara Tyr Lys Asn Tyr Lys Ala Pro Ser Thr Asp Pne Lys Leu- 50 55 60Tyr Ser Ile Gly Ala Ser Ala Ile Tyx Asp- 65 76Phe Asp Thr Gln Ser Pro- 75Val Lys Pro- 80Tyr Leu Gly Ala Arg Leu Ser- 85Leu Asn Arg Ala Ser Val- 90Asp Leu Gly- 95Gly Ser Asp Ser Phe Ser Gln- 100Thr Ser Thr Gly Leu Gly- 105Val Leu Ala- 110Gly Val Ser Tyr Ala Val Thr- 115Pro Asn Val Asp Leu Asp- 120- 125Ala Gly Tyr Arg Tyr Asn Tyr Ile Gly Lys- 130 335- 135Val Asn Thr Val Lys Asn- 140Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Aia Gly Val- 145 150Arg Val Lys Phe- 155(2) INFORMAÇÕES PAElA SEQ ID NO: 7:(i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 810 pares de base(B) TIPO: ácido nucléico© FILAMENTO: duplo(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genômico)(iii) HIPOTÉTICO: NÃO(iv) ANTI-SENTIDO: Não(vi) FONTE ORIGINAL:(A) ORGANISMO: Neisseria gonorrhoeae(B) CEPA: b2(ix) CARACTERÍSTICA:(A) NOME/TECLA: CDS(B) LOCALIZAÇÃO: 242... 765(IX) CARACTERÍSTICA:(A) NOME/TECLA: sig_peptideo(B) LOCALIZAÇÃO: 241...297(ix) CARACTERÍSTICA:(A) NOME/TECLA: mat_peptídeo(B) LOCALIZAÇÃO: 298...765(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 7:CCCCGCCTTT GCGGTTTITr CCAAACCGTT TGCAAGTTTC ACCCATCCGC CGCGTGATGC 60CGCCGTTTAA GGGCAACGCG CGGGTTAACG GATTTGCCGT CGGCAAAGCA GCCGGATGCC 120GCCGCGTATC TTGAGGCATT GAAAATATTA CGATGCAAAA AGAAAATTTC AGTATAATAC 180GGCAGGATTC TTTAACGGAT TATTAACAAT TTTTCTCCCT GACCATAAAG GAACCAAAAT 240ATG AAA AAA GCA CTT GCC GCA CTG ATT GCC CTC GCA CTC CCG GCC GCCMez Lys Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Ala Leu Ala Leu Pro Ala Ala-19 -15 -10 15TAC ACG CGC TAC AAA AAC TAT AAA GCC CCA TCC ACC GAT TTC AAA CTTTvr Thr Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys Ala Pro Ser Thr Asp Phe Lys Leu- 50 55 60TAC AGC TC C-GC GCG TCC C-TC ATT TAC GAC TTC GAC ACC CAA TCG CCCTvx Se- Ile Gly Ala Ser Val Ile Tyr Asp Phe Asp Tfcr Gln Ser Prc- 65 10 75- 288GCA CTC GCG GAA GGC GCA TCC GGC TTT TAC GTC CAA GCC GAT GCC GCA 336Ala Leu Ala Glu Gly Ala Ser Gly Phe Tyr Val Gln Ala Asp Ala Ala- 1 5 10CAC GCC AAA GCC TCA AGC TCT TTA GGT TCT GCC AAA GGC TTC AGC CCG 384His Ala Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gly Ser Ala Lys Gly Phe Ser Pro- 15 20 25CGC ATC TCC GCA GGC TAC CGC ATC AAC GAC CTC CGC TTC GCC GTC GAT 432Arg Ile Ser Ala Gly Tyr Arg Ile Asn Asp Leu Arg Phe Ala Val Asp- 30 35 40 45- 480- 528GTC AAA CCG TAT TTC GGC GCG CGC TTJ AGC CTC .AAC CGC GCT TCC C-CC 57£Val Lys Pro Tyr Pne Gly Ala Arg Leu Ser Leu Asn Arg Ala Ser Ala- 80 85 SOCAC TTG GGC GGC AGC GAC AGC TTC AGC AAA ACC TCC GCC GGC CTC GGC 624His Leu Gly Gly Ser Asp Ser Phe Ser Lys Thr Ser Ala Gly Lèu Gly- 95 100 105GTA TTG GCG GGC GTA AGC TAT GCC GTT ACC CCG AAT GTC GAT TTG GAT 672Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Ala Val Thr Pro Asn Val Asp Leu Asp- 110 115 120 125GCC GGC TAC CGC TAC AAC TAC GTC GGC AAA GTC AAC ACT GTC AAA AAC 720Ala Gly Tyr Arg Tyr Asn Tyr Val Gly Lys Val Asn Thr Val Lys Asn- 130 135 140GTC CGT TCC GGC GAA CTG TCC GCC GGC GTG CGC GTC AAA TTC TGATATACGC 772Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ala Gly Val Arg Val Lys Phe- 145 150 155GTTATTCCGC AAACCGCCGA GCCTTCGGCG GTTmTG- 810(2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 8:(i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 174 aminoácidos(B) TIPO: Aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 8:Met Lys Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Ala Leu Ala Leu Pro Ala Ala-19 -15 -10 "5Ala Leu Ala Glu Gly Ala Ser Gly Phe Tyr Val Gln Ala Asp Ala Ala- 1 5 10His Ala Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gly Ser Ala Lys Gly Phe Ser Pro- 15 '20 25Arg Ile Ser Ala Gly Tyr Arg Ile Asn Asp Leu Arg Phe Ala Val Asp- 30 35 40 45Tyr Thr Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys Ala Pro Ser Thr Asp Phe Lys Leu- 50 55 60Tyr Ser Ile Gly Ala Ser Val Ile Tyr Asp Phe Asp Thr Gln Ser Pro- 65 70 75Val Lys Pro Tyr Phe Gly Ala Arg Leu Ser Leu Asn Arg Ala Ser Ala- 80 85 90His Leu Gly Gly Ser Asp Ser Phe Ser Lys Thr Ser Ala Gly Leu Gly- 95 100 105Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Ala Val Thr Pro Asn Val Asp Leu Asp- 110 120 125Ma Gly Tyr Ar5 IStt Asn Tyr Val Gly Lvs Val Asn Thr Val Lys Asn130 Val Ar5 Ser C-Iy Giu Leu Ser Ala Glv Val Arç Val Lys Phe145 150(2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 9(I) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 16 aminoácidos(B) TIPO : aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína(vi) FONTE ORIGINAL:(A) ORGANISMO: Neisseria meningitidis(B) cepa: 608BMet Lys Lys Ala Leu Ala Tlir Leu Ile Ala Leu Ala Leu Pro Ala Ala- 1 5 10(2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 10:(1) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos(B) tipo: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína(vi) FONTE ORIGINAL:(A) ORGANISMO: Neisseria meningitidis(B) CEPA: 608b(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 10:Leu Ala Leu Pro Ala Ala Ala Leu Ala Glu Gly Ala Ser Gly Phe- 1 5 10 15(2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 11:(i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos(B) TIPO : aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína(vi) FONTE ORIGINAL:(A) ORGANISMO: Neisseria meningitidis(B) CEPA: 608B(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 11:Gly Ala Ser Gly Phe Tyr Val Gln Ala Asp Ala Ala His Ala Lys- 5 10 15(2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO:12:(1) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína(vi) FONTE ORIGINAL:(A) ORGANISMO: Neisseria meningitidis(B) CEPA: 608b(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 12:Ala Ala His Ala Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gly Ser AIa Lys Gly- 1 5 10 I5(2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO:12:(i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína(vi) FONTE ORIGINAL:(A) ORGANISMO: Neisseria meningitidis(B) CEPA: 608b(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 13:Gly Ser Ala Lys Gly Phe Ser Pro Arg Ile Ser Ala Gly Tyx Arg- 1 5 10 15(2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO:14:(1) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína(vi) FONTE ORIGINAL:(A) ORGANISMO: Neisseria meningitidis(B) CEPA: 608B(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 14:Ser Ala Gly Tyr Arg Ile Asn Asp Leu Arc Phe Aia Vai Asp Tyr- 1 5 10 15(2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 15:(i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 16 aminoácidos(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína(vi) FONTE ORIGINAL:(A) ORGANISMO: Neisseria meningitidis(B) CEPA: 608b(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 15:Phe Ala Val Asp Tyr Thr Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys Ala Pro Ser Thr- 1 5 10 15(2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 16:(í) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína(vi) FONTE ORIGINAL:(A) ORGANISMO: Neisseria meningitidis(B) CEPA: 608b(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 16:Tyr Lys Ala Pro Ser Thr Asp Phe Lys Leu Tyx Ser Ile Gly Ala- 1 5 10 15(2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO:17:(i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína(vi) FONTE ORIGINAL:(A) ORGANISMO: Neisseria meningitidis(B) CEPA: 608b(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 17:Tyr Ser Tie Gly AIa Ser Ala Ile Tyr Asp Phe Asp Thr Gln Ser- 1 5 IC 15(2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO:18:(i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína(vi) FONTE ORIGINAL:(A) ORGANISMO: Neisseria meningitidis(B) CEPA: 608b(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 18:Phe Asp Thr Gln Ser Pro Val Lys Pro Tyr Lea Gly Ala Arg Leu- 1 5 10 15(2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO:19:(1) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína(vi) FONTE ORIGINAL:(A) ORGANISMO: Neisseria meningitidis(B) CEPA: 608b(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 19:Leu Gly Ala Arg Leu Ser Leu Asn Arg Ala Ser Val Asp Leu Gly- 1 5 10 15(2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 20:(i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA: .(A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína(vi) FONTE ORIGINAL:(A) ORGANISMO: Neisseria meningitidis(B) CEPA: 608b(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 20:Ser Val Asp Leu Gly Glv Ser Asp Ser Phe Ser Gln Thr Ser Ile- 1 5 10 15(2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO:21:(i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína(vi) FONTE ORIGINAL:(A) ORGANISMO: Neisseria meningitidis(B) CEPA: 608b(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 21:Ser GLn Thr Ser Ile Gly Leu Gly Val Leu Thr Gly Val Ser Tyr- 1 5 10 15(2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 22:(i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína(vi) FONTE ORIGINAL:(A) ORGANISMO: Neisseria meningitidis(B) CEPA: 608b(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 22:Thr Gly Val Ser Tyr Ala Val Thr Pro Asn Val Asp Leu Asp Ala- 1 5 10 15(2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 23:(1) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína(vi) FONTE ORIGINAL:(A) ORGANISMO: Neisseria meningitidis(B) CEPA: 608b(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 23:Val Asp Leu Asp Ala Gly Tyx Arg Tyr Asn Tyr Ile Gly Lys Val- 1 5 10 15(2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 24:(1) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína(vi) FONTE ORIGINAL:(A) ORGANISMO: Neisseria meningitidis(B) CEPA: 608b(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 24:Tyr Ile Gly Lys Val Asn Thx Val Lys Asn Val Arg Ser Gly Glu- 1 5 10 15(2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO:25:(i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 14 aminoácidos(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína(vi) FONTE ORIGINAL:(A) ORGANISMO: Neisseria meningitidis(B) CEPA: 608b(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 25:Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Val Gly Val Arg Val Lys Phe- 1 5 10(2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO:26:(i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 25 aminoácidos(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína(vi) FONTE ORIGINAL:(A) ORGANISMO: Neisseria meningitidis(B) CEPA: 608b(xi) DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 26:Phe Ala Val Asp Tyr Thr Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys Ala Pro Ser Thr- 1 5 10 15Asp Pne Lvs Leu Tyr Ser Ile Gly Ala- 20 25