BR112021000620A2 - métodos e composições com uso de células dendríticas recombinantes para terapia contra câncer - Google Patents

Abstract

“MÉTODOS E COMPOSIÇÕES COM USO DE CÉLULAS DENDRÍTICAS RECOMBINANTES PARA TERAPIA CONTRA CÂNCER”. A presente invenção se refere a métodos e composições para o tratamento de câncer através da indução de uma resposta imune pela administração de células dendríticas que expressam proteínas heterólogas. Em algumas modalidades, uma célula dendrítica compreende uma ou mais moléculas de ácido nucleico heterólogas que codificam CD40L e CXCL13. Em algumas modalidades, a célula dendrítica compreende ainda uma molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica CD93. Ainda, em modalidades adicionais, as células dendríticas que expressam proteínas heterólogas são ativadas.

Description

“MÉTODOS E COMPOSIÇÕES COM USO DE CÉLULAS DENDRÍTICAS RECOMBINANTES PARA TERAPIA CONTRA CÂNCER” REIVINDICAÇÃO DE PRIORIDADE

[0001] Este pedido reivindica prioridade para o Pedido Provisório US N° 62/698,254, depositado em 15 de julho de 2018, que é incorporado neste documento por referência na sua totalidade.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequência, que foi submetida eletronicamente no formato ASCII e está incorporada por meio deste a título de referência em sua totalidade. A referida cópia ASCII, criada em 3 de julho de 2019, tem o nome 146616_00302_SL.txt e tem

14.051 bytes.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0003] As terapias do câncer abrangem uma ampla gama de abordagens terapêuticas, incluindo cirúrgica, radiação, quimioterapia, bem como imunoterapia baseada em células.

Embora essas várias abordagens terapêuticas forneçam uma ampla seleção de tratamentos, as terapêuticas existentes sofrem de muitas desvantagens, incluindo uma falta de seletividade de células-alvo em relação às células saudáveis, toxicidade e resistência do câncer ao tratamento.

Abordagens mais recentes utilizando terapêuticas direcionadas que interferem com os principais processos celulares das células cancerígenas, preferencialmente em relação às células normais, levaram a regimes quimioterápicos com menos efeitos colaterais em comparação com terapias não direcionadas, como o tratamento por radiação.

[0004] A imunoterapia do câncer também surgiu como uma abordagem terapêutica promissora para aumentar e complementar os padrões de tratamento existentes. Vide, por exemplo, Miller et al. Cancer Cell; 27:439-449 (2015). Essas abordagens incluem a utilização de anticorpos para modular o sistema imunológico para matar as células cancerosas. As respostas imunes antitumorais em alguns pacientes com tumores sólidos foram aumentadas pelo tratamento anti-PD1.

No entanto, apenas uma fração dos pacientes responde a tal tratamento, destacando a necessidade de abordagens adicionais e mais tratamentos de câncer para aumentar e complementar os padrões terapêuticos de cuidado existentes.

SUMÁRIO

[0005] São fornecidas neste documento células dendríticas compreendendo uma ou mais moléculas de ácido nucleico heterólogas que codificam para CD40L e/ou CXCL13.

[0006] Em algumas modalidades, uma ou mais moléculas de ácido nucleico heterólogas codificam CD93.

[0007] É ainda fornecida neste documento uma célula dendrítica compreendendo uma proteína CD40L heteróloga e uma proteína CXCL13 heteróloga.

[0008] Em algumas modalidades, a célula compreende ainda uma proteína CD93 heteróloga.

[0009] São fornecidas ainda neste documento células dendríticas ativadas por antígeno, em que a célula dendrítica compreende uma ou mais moléculas de ácido nucleico heterólogas que codificam para CD40L e/ou CXCL13. Em algumas modalidades, uma ou mais moléculas de ácido nucleico heterólogas codificam CD93.

[0010] Em algumas modalidades, a célula dendrítica ativada por antígeno é ativada por exposição a um ou mais antígenos.

[0011] Em algumas modalidades, o antígeno é um antígeno tumoral.

[0012] Em algumas modalidades, o antígeno é um antígeno viral.

[0013] Em algumas modalidades, o antígeno é um lisado celular.

[0014] Em algumas modalidades, o lisado celular é alogênico ou autólogo para a célula dendrítica ativada por antígeno.

[0015] Em algumas modalidades, o lisado celular é um lisado que compreende um, ou uma combinação de lisados de células de melanoma alogênico.

[0016] Em algumas modalidades, o lisado de células de melanoma alogênico é um lisado de células DDM-1.7, um lisado de células DDM-1.13 ou uma combinação dos mesmos.

[0017] Em algumas modalidades, o lisado de célula é um lisado de célula inteira.

[0018] Em algumas modalidades, o lisado celular é um lisado de células tumorais.

[0019] É ainda fornecida neste documento uma composição de compreender uma célula descrita neste documento (célula dendrítica recombinante ou célula ativada ou composição relacionada), em que a composição não compreende um antígeno heterólogo.

[0020] É fornecida neste documento ainda uma composição farmacêutica compreendendo células fornecidas neste documento.

[0021] São ainda fornecidos neste documento métodos de tratamento de um tumor sólido, câncer ou malignidade em um sujeito, compreendendo a administração ao sujeito de qualquer uma das células ou composições fornecidas neste documento.

[0022] São ainda fornecidos neste documento métodos de tratamento de um tumor sólido, câncer ou malignidade em um sujeito, compreendendo a administração ao sujeito de qualquer uma das células ou composições fornecidas neste documento.

[0023] Em algumas modalidades, o método compreende ainda: triar um perfil de expressão de proteína de um tumor ressecado ou amostra de biópsia do sujeito para comparar com um perfil de expressão de proteína de um lisado de tumor alogênico antes da administração; e administrar uma célula dendrítica ativada do lisado de tumor alogênico ou composição de células dendríticas ativadas se pelo menos três fragmentos do perfil de expressão de proteína do tumor ressecado ou amostra de biópsia corresponderem ao perfil de expressão de proteína do lisado de tumor alogênico.

[0024] Em algumas modalidades, o lisado de tumor alogênico é derivado de uma linhagem de células de melanoma alogênica selecionada do grupo consistindo em DDM-1.7, DDM-

1.13, ou uma combinação destes.

[0025] Em algumas modalidades, a célula dendrítica não tem o mesmo tipo de HLA que o sujeito.

[0026] Em algumas modalidades, o câncer é um tumor sólido selecionado do grupo consistindo em fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, osteossarcoma,

e outros sarcomas, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, carcinoma de cólon/câncer colorretal, neoplasia maligna linfoide, câncer de pâncreas, câncer de mama, cânceres pulmonares, câncer ovariano, câncer de próstata, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basais, adenocarcinoma, carcinoma das glândulas sudoríparas, carcinoma medular de tireoide, carcinoma papilar de tireoide, feocromocitomas, carcinoma de glândulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, carcinoma medular, carcinoma broncogênico, carcinoma de células renais, hepatoma, carcinoma do duto biliar, coriocarcinoma, tumor de Wilms, câncer do colo do útero, tumor testicular, seminoma, carcinoma de bexiga, melanoma, e tumores do SNC (tais como, um glioma (tal como glioma do tronco encefálico e gliomas mistos), glioblastoma (também conhecido como glioblastoma multiforme), astrocitoma, linfoma do SNC, germinoma, meduloblastoma, Schwannoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, neuroblastoma, retinoblastoma e metástases cerebrais.

[0027] Em algumas modalidades, a via de administração é via injeção intratumoral, peritumoral, intradérmica, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal.

[0028] Em algumas modalidades, a administração é via injeção subcutânea, intratumoral ou intradérmica.

[0029] Em algumas modalidades, a célula dendrítica ou composição é congelada ou criopreservada e descongelada antes da administração.

[0030] Em algumas modalidades, a célula dendrítica não é pulsada com um antígeno antes da administração.

[0031] É fornecido adicionalmente neste documento um kit compreendendo qualquer uma das células dendríticas ou composições fornecidas neste documento. Em algumas modalidades, as células dendríticas ou composições são congeladas ou criopreservadas em um recipiente e, opcionalmente, compreendendo um lisado de tumor alogênico congelado ou criopreservado em um recipiente separado.

[0032] Ainda é fornecido neste documento um kit que compreende qualquer uma das células dendríticas ou composições descritas neste documento, em que a célula dendrítica ou composição é congelada ou criopreservada em um recipiente e, opcionalmente, compreendendo um lisado de tumor autólogo congelado ou criopreservado em um recipiente separado.

[0033] Ainda é fornecido neste documento um kit compreendendo qualquer uma das células dendríticas ou composições descritas neste documento, em que a célula dendrítica ativada ou composição é congelada ou criopreservada em um recipiente.

[0034] Em algumas modalidades, o kit compreende ainda recipientes separados compreendendo um ou mais tampões e, opcionalmente, compreendendo um ou mais agentes de ativação.

[0035] Em algumas modalidades, o kit compreende ainda instruções para incubar e/ou processar as células dendríticas ou composições.

[0036] Ainda é fornecido neste documento um método de tratamento de câncer em um sujeito que compreende: triar um perfil de expressão de proteína de um tumor ressecado ou amostras de biópsia do sujeito para comparar com um perfil de expressão de proteína de um lisado de tumor alogênico antes da administração; se pelo menos três fragmentos do perfil de expressão de proteína do tumor ressecado ou amostras de biópsia corresponderem ao perfil de expressão de proteína do lisado de tumor alogênico, administrar, ao sujeito, qualquer uma das células dendríticas ou composições fornecidas neste documento; ou se os pelo menos três fragmentos do perfil de expressão de proteína do tumor ressecado ou amostras de biópsia não corresponderem ao perfil de expressão de proteína de lisado de tumor alogênico, então (a) administrar ao sujeito uma composição compreendendo um lisado de tumor autólogo pulsado com qualquer uma das células dendríticas ou composições descritas neste documento ou (b) administrar ao sujeito qualquer uma das células ou composições descritas neste documento, que não foi pulsada com um antígeno.

[0037] É ainda fornecido neste documento um método de tratamento de câncer em um sujeito, compreendendo a administração ao sujeito de qualquer uma das células dendríticas ou composições conforme fornecidas neste documento, em que a célula dendrítica ou composição não foi pulsada com um antígeno tumoral.

[0038] É fornecido adicionalmente neste documento um método de tratamento de câncer em um sujeito, compreendendo a administração ao sujeito de qualquer uma das células dendríticas ou composições conforme fornecidas neste documento, em que a célula dendrítica foi pulsada com um antígeno tumoral ou lisado.

[0039] É ainda fornecido neste documento um método de ativação do sistema imunológico, compreendendo a administração a um sujeito em necessidade de uma quantidade eficaz de qualquer uma das células dendríticas ou composições descritas neste documento.

[0040] É fornecido ainda neste documento um método de produção de células dendríticas imaturas compreendendo: cultura de monócitos CD14+ e/ou CD1a+ que expressam, de forma heteróloga, CD40L, CXCL13, e opcionalmente CD93 em células dendríticas imaturas in vitro.

[0041] Em algumas modalidades, o método compreende o contato do dendrítico imaturo com uma composição que compreende um ou mais dentre: TNF-α, IL-1β, IFN-α, IFN-γ e pIC.

[0042] Em algumas modalidades, o método compreende ainda a produção de monócitos CD14+ que expressam heterologicamente CD40L, CXCL13 e, opcionalmente, CD93.

[0043] Em algumas modalidades, a produção compreende o contato de monócitos CD14+ com um ou mais vetores que codificam CD40L, CXCL13 e, opcionalmente, CD93.

[0044] Em algumas modalidades, o vetor é um vetor adenoviral recombinante, um vetor retroviral recombinante ou um vetor lentiviral recombinante ou uma combinação dos mesmos.

[0045] Em algumas modalidades, a produção dos monócitos CD14+ que expressam, de forma heteróloga, CD40L, CXCL13 e, opcionalmente, CD93 compreende o contato dos monócitos com um ou mais construtos de CRISPR que produzem monócitos CD14+ que expressam, de forma heteróloga, CD40L, CXCL13 e, opcionalmente, CD93.

[0046] Em algumas modalidades, o construto CRISPR é CAS9.

[0047] Em algumas modalidades, o contato compreende transfecção, transdução, eletroporação, infecção ou qualquer combinação dos mesmos.

[0048] Em algumas modalidades, o método compreende ainda congelar as células dendríticas imaturas.

[0049] Em algumas modalidades, o método compreende ainda o contato das células dendríticas imaturas com um lisado de tumor autólogo ou lisado de tumor alogênico antes da maturação.

[0050] Em algumas modalidades, o método compreende ainda congelar as células dendríticas após maturação.

[0051] Em algumas modalidades, os monócitos CD14+ são ainda modificados para expressar CD93 de forma heteróloga.

[0052] Em algumas modalidades, o lisado de tumor alogênico é derivado de uma linhagem de células de melanoma alogênica selecionada do grupo consistindo em DDM-1.7, DDM-

1.13, ou uma combinação destes.

[0053] Em algumas modalidades, o lisado é um lisado de célula inteira.

[0054] Em algumas modalidades, a resposta de enxerto contra tumor (GVT) é aumentada no paciente.

[0055] Em algumas modalidades, num período de tempo de 4-14 dias após a administração das células dendríticas ou composições, é administrado ainda, ao paciente, um inibidor de checkpoint imune, incluindo qualquer um ou uma combinação de dois inibidores de checkpoint, incluindo um inibidor de PD-1 ou PD-L1 (B7-H1), tal como um anticorpo anti-PD-1, incluindo nivolumabe (Nivolumabe da Bristol-Myers Squibb), pembrolizumabe/lambrolizumabe, também conhecido como MK-3475 (Keytruda da Merck), pidilizumabe (Curetech), AMP-224 (Amplimmune), ou um anticorpo anti-PD-L1, incluindo MPDL3280A (Roche), MDX-1105 (Bristol Myer Squibb), MEDI-4736 (AstraZeneca) e MSB-0010718 C (Merck), um antagonista de CTLA-4, tal como um anticorpo anti-CTLA-4, incluindo o anticorpo anti-CTLA4 YervoyTM (ipilimumabe, Bristol-Myers Squibb), tremelimumabe (Pfizer), Ticilimumabe (AstraZeneca) ou AMGP-224 (Glaxo Smith Kline), ou um anticorpo tumor- específico trastuzumabe (Herceptin) para câncer de mama, rituximabe (Rituxan) para linfoma, ou cetuximabe (Erbitux).

[0056] Em algumas modalidades, o método compreende ainda a administração de um ou mais agentes adicionais comumente usados para tratar o câncer.

[0057] Em algumas modalidades, o agente adicional é selecionado a partir de radiação, quimioterapia, um conjugado de anticorpo e droga e um anticorpo imunomodulador.

[0058] Em algumas modalidades, a quimioterapia é de cisplatina, carboplatina, paclitaxel, docetaxel, gencitabina, vinorelbina, vinblastina, irinotecano, etoposídeo ou pemetrexedo, ou combinações dos mesmos, ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.

[0059] Em algumas modalidades, o anticorpo imunomodulador é um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti- PD-L1, um anticorpo anti-CD40, um anticorpo anti-CTLA-4 ou um anticorpo anti-OX40 ou qualquer combinação dos mesmos.

[0060] Em algumas modalidades, o conjugado anticorpo-droga tem como alvo c-Met quinase, LRRC15, EGFR ou CS1, ou qualquer combinação dos mesmos.

[0061] Em algumas modalidades, o tratamento ou aumento da resposta imune é repetido periodicamente por períodos de tempo de uma vez a cada 5 dias, uma vez por semana, uma vez a cada 10 dias, uma vez a cada 14 dias, uma vez a cada 21 dias, uma vez a cada mês, até uma vez a cada dois meses, uma vez a cada 3 meses, uma vez a cada 4 meses, uma vez a cada 5 meses, uma vez a cada 6 meses, ou uma vez a cada 7 meses, ou uma vez a cada 8 meses, ou uma vez a cada 9 meses, ou uma vez a cada 10 meses, ou uma vez a cada 11 meses, ou uma vez por ano como um tratamento de manutenção enquanto o paciente apresentar melhora ou doença estável/sem progressão.

[0062] São divulgados, neste documento, métodos e composições para o tratamento de câncer através da indução de uma resposta imune pela administração de células dendríticas que expressam proteínas heterólogas. Em algumas modalidades, uma célula dendrítica compreende uma ou mais moléculas de ácido nucleico heterólogas que codificam CD40L e CXCL13. Em algumas modalidades, a célula dendrítica compreende ainda uma molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica CD93. Em outras modalidades, uma célula dendrítica compreende uma ou mais moléculas de ácido nucleico heterólogas que codificam CD40L e CD93. Em outras modalidades, uma célula dendrítica compreende uma ou mais moléculas de ácido nucleico heterólogas que codificam CXCL13 e CD93.

[0063] Em algumas modalidades, uma célula dendrítica superexpressando CD40L e CXCL13 e, opcionalmente, CD93 pode ser uma célula dendrítica ativada por antígeno. Em algumas modalidades, o antígeno pode ser um antígeno tumoral ou um antígeno viral. Em algumas modalidades, as células dendríticas são alogênicas ou autólogas para o sujeito.

[0064] Em outras modalidades, um método de tratamento de câncer em um sujeito compreende a administração ao sujeito de uma composição compreendendo uma célula dendrítica, em que a célula dendrítica superexpressa uma ou mais proteínas selecionadas de CD40L, CXCL13 e CD93. Em algumas modalidades, o método compreende ainda:

(a) obter um perfil de expressão de proteína de um tumor ressecado ou amostra de biópsia do sujeito;

(b) comparar o perfil de expressão de proteína do tumor ressecado ou amostra de biópsia com o perfil de expressão de proteína de um lisado de células de melanoma; e

(c) se pelo menos três marcadores no perfil de expressão de proteína do tumor ressecado ou amostra de biópsia corresponderem ao perfil de expressão de proteína do lisado de células de melanoma, então cocultivar a célula dendrítica com o lisado de células de melanoma para ativar a célula dendrítica, e administrar ao sujeito uma composição compreendendo a célula dendrítica ativada;

ou

(d) se pelo menos três marcadores no perfil de expressão de proteína do tumor ressecado ou amostra de biópsia não corresponderem ao perfil de expressão de proteína do lisado de células de melanoma, então cocultivar a célula dendrítica com o tumor autólogo ou lisado de biópsia para ativar a célula dendrítica e administrar ao sujeito uma composição compreendendo a célula dendrítica autologamente ativada.

[0065] Em uma modalidade adicional, um método de produção de células dendríticas imaturas compreende: (a) isolar monócitos CD14+ de um sujeito; (b) superexpressar CD40L, CXCL13 e CD93 nos monócitos CD14+ isolados; e (c) diferenciar os monócitos CD14+ em células dendríticas imaturas in vitro.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0066] As Figuras 1A-D são diagramas e esquemas que mostram vários processos de expressão e ativação em certas células imunes. A Fig. 1A é um diagrama que mostra o mecanismo de ação da expressão CD40L. A Fig. 1B é um diagrama que mostra o processo de recrutamento imunológico da expressão de CXCL13. A Fig. 1C é um esquema que mostra o ciclo de imunidade ao câncer. A Fig. 1D é um esquema que mostra vários estágios de maturação de células dendríticas.

[0067] As Figuras 2A-F são imagens de citometria de fluxo de monócitos CD14+ isolados por CliniMACS para fenotipagem e avaliação de pureza.

[0068] As Figuras 3A-P são imagens de citometria de fluxo que mostram a fenotipagem de uma amostra de células alodendríticas imaturas (alloDCs). Ilustrando que a amostra foi analisada para os seguintes marcadores: Linage negativo: (CD3-, CD56-, CD19-, CD66b-), CD45+, CD14-, CD40L+, CXL13+,

CD1c+, CD11b+, CD11c+, HLA-DR+, CD86+, CD80low, CD83-, CD16Low, CD33+, CD163-, CD206+, CD209, CD40L.

[0069] As Figuras 4A-B são imagens de citometria de fluxo que mostram que alloDCs recombinantes imaturos exibem capacidade fagocitótica.

[0070] As Figuras 5A-D são imagens de indicadores fluorescentes de proliferação de células T alogênica estimulada por alloDC mostrada pela diluição de coloração com éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE).

[0071] As Figuras 6A-B são imagens de tumor colorretal de um paciente, antes (Fig. 6A) e seis meses após o tratamento (Fig. 6B) com a vacina alloDC CD40L+ carregada com tumor autólogo.

[0072] As Figuras 7A-D são imagens de múltiplas metástases hepáticas de um paciente de um tumor colorretal, antes (Fig. 7A, Fig. 7C) e seis meses após o tratamento (Fig.

7B e Fig. 7D) com a vacina alloDC CD40L+ carregada com tumor autólogo.

[0073] As Figuras 8A-D são imagens de tumores de mama ductais metastáticos invasivos de um paciente, antes (Fig. 8A, Fig. 8C) e seis meses após o tratamento (Fig. 8B e Fig. 8D) com a vacina alloDC CD40L+ CXCL13+ carregada com tumor autólogo.

[0074] A Figura 9 é um esquema que mostra uma visão geral exemplar para a administração da vacina alloDC recombinante descrita neste documento.

[0075] A Figura 10 é um gráfico que mostra a proliferação de células T em cocultura para DCs recombinantes que expressam CD40L, CD40L+ CXCL13 ou Expressão tripla de CD40L+ CXCL13+ CD93, com a expressão tripla mostrando a maior quantidade de proliferação de células T.

[0076] A Figura 11 é um gráfico que mostra a proliferação de células NK em cocultura para DCs recombinantes que expressam CD40L, CD40L+ CXCL13 ou Expressão tripla de CD40L+ CXCL13+ CD93, com a expressão tripla mostrando a maior quantidade de proliferação de células NK.

[0077] A Figura 12 são imagens de classificação de células para determinar a ativação de células B determinando por citometria de fluxo os níveis de expressão de CD69 em células CD19+ no dia 4.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0078] As presentes modalidades são direcionadas, em parte, a métodos e composições relacionadas a células dendríticas transduzidas com CD40L, CXCL13 e/ou CD93. O CD40L, CXCL13 e/ou CD93 podem ser humanos. Em algumas modalidades, o CD40L, CXCL13 e/ou CD93 é um roedor (camundongo ou rato) ou porco. As células que compreendem as proteínas expressas de forma heteróloga podem ser referidas como células recombinantes. As composições podem ser uma composição de DC recombinante autônoma (célula dendrítica) ou, em modalidades alternativas, as células DC recombinantes podem ser ativadas por antígeno pelo contato das células, o que também pode ser referido como "carregamento", com lisado de tumor ou alternativamente, carregado com lisado de tumor alogênico ("disponível no mercado") como uma vacinação e/ou adjuvante imunológico para indivíduos com tumores sólidos e malignidades. Em algumas modalidades, o lisado de tumor é alogênico em referência à fonte das células dendríticas. Em algumas modalidades, o lisado de tumor é autólogo em referência à fonte das células dendríticas.

[0079] As células dendríticas (DCs) são células profissionais de processamento de antígenos. Elas têm vários receptores que aumentam a captação de antígenos e são especializadas em converter esses antígenos em complexos MHC-peptídeo que podem ser reconhecidos pelos linfócitos.

[0080] Embora não desejando estar limitado pela teoria, as presentes composições e métodos são baseados, pelo menos em parte, na capacidade das células dendríticas recombinantes (ou transgênicas) para construir uma reação leucocitária mista (MLR) no sítio da injeção. Quando testado em um ensaio clínico bem conhecido - MLR, alloDCs recombinantes, conforme descrito neste documento, foram os principais estimuladores e foram excepcionalmente potentes.

Em algumas modalidades, as DCs podem ser alogênicas para o sujeito. Em tais modalidades, as DCs podem ser referidas como alloDCs. alloDCs são células que são alogênicas em comparação com o sujeito ao qual estão sendo administradas.

[0081] Em algumas modalidades, as DCs são transduzidas com CD40L e/ou CXCL13, a fim de maximizar a atração das células T e B dos pacientes e gerar a cascata de resposta imunológica celular e humoral antitumoral. Em algumas modalidades, as DCs são transduzidas com CD40L e CXCL13. Em algumas modalidades, as DCs são transduzidas com CD40L, CXCL13 e CD93. Em algumas modalidades, as DCs são transduzidas com CD40L e CD93. Em algumas modalidades, as DCs são transduzidas com CXCL13 e CD93. Em algumas modalidades, as células não são transduzidas com CD93. Em algumas modalidades, as DCs não expressam CD93 de forma heteróloga.

[0082] Em outras modalidades opcionais, a transdução dos alloDCs CD40L+ e CXCL13+ com CD93 facilita a conversa cruzada entre as DCs alogênicas e as DCs hospedeiras, criando uma imunogenicidade antitumoral de hospedeiro estável e sustentada.

[0083] Em algumas modalidades, monócitos CD14+ humanos são transfectados com um vetor recombinante que codifica CD40L e CXCL13 (e opcionalmente CD93), ou qualquer combinação dos mesmos, conforme descrito neste documento, para ser expresso de forma estável nos monócitos humanos.

Monócitos transduzidos positivamente podem ser selecionados e os monócitos podem então ser diferenciados em DCs imaturos e/ou maduros in vitro. Para os pacientes malignos ressecados e biopsiados, o lisado de tumor autólogo pode ser gerado e o lisado de tumor pode ser apresentado aos alloDCs recombinantes imaturos (imalloDCs recombinantes) para o lisado tumoral autólogo a ser processado pelo imalloDCs recombinante. Em algumas modalidades, o perfil de expressão de proteína das amostras de tumor ressecadas e amostras de biópsia são triados. Se o perfil de expressão indica pelo menos 3 fragmentos compartilhados com GMP-MCV, então as imDC recombinantes são carregadas com GMP-MCV antes que as DCs sejam maturadas in vitro. Para qualquer paciente não ressecável e não biopsiável, o CD40L+ CXCL13+ alloDC recombinante (ou opcionalmente incluindo ainda CD93+) pode ser administrado ao paciente sem carregamento de antígeno como um adjuvante imunológico. Usando esta abordagem CD40L+ CXCL13+ (opcional) CD93 AlloDC, os pacientes com câncer em estágio avançado podem montar uma nova resposta imunológica antitumoral celular e humoral aos antígenos tumorais e, sem estarem ligados a qualquer mecanismo específico, aumentar a resposta imunológica.

[0084] Outro lisado de tumor que pode ser usado para ativar as DCs recombinantes, inclui DDM-1.7 e/ou DDM-1.13.

Uma descrição de DDM-1.7 e DDM-1.13 pode ser encontrada nas Patentes US N°s 7,771,998 e 7,723,107 (incluindo as informações de depósito publicamente disponíveis: ECACC 01112339 e ECACC 01112338, respectivamente), cada uma das quais são incorporadas neste documento por referência em sua totalidade.

[0085] Tal como utilizado neste documento, as células dendríticas que são imaturas são aquelas que têm as seguintes características de marcador: CD1a positivo, CD14 negativo e CD83 negativo/baixo.

[0086] Em algumas modalidades, a fonte de células dendríticas pode ser de sangue periférico de doador e inclui células dendríticas derivadas de monócitos CD14+ ou células CD34+. Em algumas modalidades, o doador não é o mesmo que o sujeito sendo tratado com as células dendríticas e composições descritas neste documento.

[0087] Nos últimos anos, percebeu-se que uma maneira eficiente de entrega de antígeno às células T, especialmente às células T não expostas, é por meio de células dendríticas.

As células dendríticas (DC) são as células apresentadoras de antígeno mais eficientes e a imunoterapia baseada em DC já foi usada em diferentes configurações para o tratamento do câncer ((Kugler et al., 2000, Nat. Med., v. 6, pp. 332-336; Nestle et al., 1998, Nature (Med.), v. 4, pp. 328-332; Thurner et al., 1999, J. Exp. Med., V. 190, pp. 1669-1678)) demonstrando alta potência desta forma de imunização.

[0088] Uma das propriedades únicas das DCs é sua capacidade de captar proteínas exógenas por endocitose, que são então processadas e apresentadas como epítopos peptídicos em sua superfície em conjunto com antígenos MHC de classe I. As células dendríticas que apresentam antígeno podem ser reconhecidas por células T citotóxicas. Esta propriedade é importante quando os antígenos de células tumorais são aplicados na forma de lisados tumorais ou corpos apoptóticos adicionados exogenamente. Acredita-se que a alta atividade endocítica esteja associada ao estado imaturo de diferenciação de DC com base na comparação de DC imaturas e maduras (Sallusto et al., 1995, J. Exp. Med., V. 182, pp.

389-400).

[0089] Em algumas modalidades, as células dendríticas recombinantes são tratadas com interferon-alfa (IFN-α) e/ou 5'-aza-2'desoxicitidina (Aza) antes ou durante o carregamento das células dendríticas recombinantes com lisado de células tumorais/e ou antígeno. Vide https://doi.org/10.1101/531616.

[0090] Em algumas modalidades, monócitos CD14+ humanos purificados são transduzidos com um vetor recombinante, como um vetor adenoviral ou lentiviral, compreendendo CD40L humano e CXCL13 e, opcionalmente, também construtos CD93, permitindo que as moléculas recombinantes sejam expressas em monócitos humanos purificados. Monócitos positivamente transduzidos são então selecionados e então diferenciados em DCs imaturas (imDC) in vitro, e são referidos como DCs alogênicos recombinantes (alloDCs recombinantes). Em algumas modalidades, a expressão é uma expressão estável. Em algumas modalidades, a expressão é superexpressão. "Superexpressão" refere-se a um nível que é de pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% ou 500% sobre os níveis de expressão nativa. Os níveis de expressão nativa referem-se aos níveis de expressão das células que não foram transduzidas com um vetor para expressar a proteína ou proteínas heterólogas de interesse, como CD40L, CXCL13 e/ou CD93.

[0091] Uma descrição dos vários estádios de células dendríticas e fatores de maturação/ativação é mostrada na Fig. 1D (Ver, Front Immunol. 2013; 4: 438, que é incorporado neste documento por referência na sua totalidade).

[0092] Em algumas modalidades, as DCs recombinantes são amadurecidas pelo contato das células com fatores de maturação após o carregamento com lisado de células tumorais e/ou antígeno. Tais fatores de maturação incluem pelo menos: IL-1β, IL-6, TNF-α e PGE2, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em algumas modalidades, as DCs recombinantes são maturadas pelo contato das células com fatores de maturação antes de serem colocadas em contato com o lisado de células tumorais e/ou antígeno. Em algumas modalidades, as DCs são maturadas com os fatores de maturação e não são colocadas em contato com o lisado de células tumorais e/ou antígeno. Em algumas modalidades, as células dendríticas recombinantes são cultivadas ou incubadas com uma citocina selecionada do grupo que consiste em IL-4, GM-CSF, IL-13, IFN-γ, Flt-31, SCF e TNF-α.

Abreviações WBC: glóbulos brancos IPA: álcool isopropílico 70% QA: Garantia de Qualidade QC: Controle de Qualidade Vol.: Volume RT: Temperatura ambiente DC: Células Dendríticas imDC: Células dendríticas imaturas mDC: Células dendríticas maduras

AlloDC: Células dendríticas alogênicas MCV: MalCancerVac GM-CSF: Fator Estimulador de Colônia de Granulócitos- Macrófagos IL-4: Interleucina 4 IL-1β: Interleucina 1 β IL-15: Interleucina 15 TNFα: Fator de Necrose Tumoral α pIC: Polinossínico: ácido policitidílico IFN-α: Interferon α IFN-γ: Interferon γ CXCL13: Ligante 13 de quimiocina de motivo C-X-C CD40L: ligante de CD40 MAGE: antígeno associado ao melanoma MOI: Multiplicidade de infecção

[0093] Conforme usado neste pedido e nas reivindicações, as formas singulares "um", "uma" e "o" incluem as formas plurais, a menos que o contexto dite claramente o contrário. Além disso, o termo "inclui" significa "compreende."

[0094] Os termos "paciente" e "sujeito" são intercambiáveis e podem ser interpretados como significando qualquer organismo vivo que pode ser tratado com compostos da presente invenção. Como tal, os termos "paciente" e

"sujeito" podem incluir, sem limitação, qualquer mamífero não humano, primata ou humano. Em algumas modalidades, o "paciente" ou "sujeito" é um mamífero, como camundongos, ratos, outros roedores, coelhos, cães, gatos, suínos, bovinos, ovelhas, cavalos, primatas ou humanos. Em algumas modalidades, o paciente ou sujeito é um adulto, criança ou bebê. Em algumas modalidades, o paciente ou sujeito é um humano.

[0095] O termo "cerca de" quando imediatamente precedendo um valor numérico significa uma faixa de mais ou menos 10% desse valor, por exemplo, "cerca de 50" significa 45 a 55, "cerca de 25.000" significa 22.500 a 27.500, etc., a menos que o contexto da divulgação indica o contrário, ou é inconsistente com tal interpretação. Por exemplo, em uma lista de valores numéricos como "cerca de 49, cerca de 50, cerca de 55," cerca de 50" significa uma faixa que se estende a menos da metade do (s) intervalo (s) entre os valores anteriores e subsequentes, por exemplo, mais de 49,5 para menos de 52,5. Além disso, as frases "inferior a cerca de" um valor ou "superior a cerca de" um valor devem ser entendidas em vista da definição do termo "cerca de" fornecida neste documento. Além disso, se um intervalo for escrito como “cerca de X a Y”, “cerca de” modifica os valores X e Y, a menos que o contexto indique o contrário.

[0096] Os termos “administrar”, “administrando” ou “administração”, conforme usados neste documento, referem- se a administrar diretamente um composto, célula, composição ou composição farmacêutica, que também pode ser referido como um agente de interesse. Em algumas modalidades, as composições foram esterilizadas ou filtradas para remover quaisquer partículas virais ou bacterianas.

[0097] Os termos "coadministração" ou semelhantes, destinam-se a abranger a administração dos agentes terapêuticos selecionados a um único paciente, e pretendem incluir regimes de tratamento em que os agentes são administrados pela mesma ou diferente via de administração ou na mesma hora ou diferente.

[0098] Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de uma composição é uma quantidade suficiente para atingir o efeito desejado, ou seja, para melhorar, prevenir ou melhorar uma condição, doença ou sintoma indesejado de um paciente.

A atividade contemplada pelos presentes métodos pode incluir tratamento terapêutico e/ou profilático, conforme apropriado. A dose específica pode ser determinada pelas circunstâncias particulares que envolvem o caso, incluindo, por exemplo, a terapêutica administrada, a via de administração e a condição a ser tratada. A quantidade eficaz administrada pode ser determinada por um médico à luz das circunstâncias relevantes, incluindo a condição a ser tratada, a escolha da terapêutica a ser administrada e a via de administração escolhida.

[0099] O termo "inibir" inclui a administração de uma terapêutica de modalidades neste documento para prevenir o início dos sintomas, aliviar os sintomas ou eliminar a doença, condição ou distúrbio.

[0100] Por "farmaceuticamente aceitável", pretende- se significar que o carreador, diluente ou excipiente deve ser compatível com os outros ingredientes da terapêutica e não prejudicial para o seu receptor.

[0101] Os termos "tratar", "tratado" ou "tratando", como utilizados neste documento, referem-se a tratamento terapêutico e medidas profiláticas ou preventivas, em que o objetivo é inibir, prevenir ou desacelerar (diminuir) uma condição fisiológica indesejada, distúrbio ou doença, ou melhorar, inibir ou de outra forma obter resultados clínicos benéficos ou desejados. Resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, sem limitação, melhora ou alívio dos sintomas; diminuição da extensão da condição, distúrbio ou doença; estabilização (ou seja, sem agravamento) do estado da condição, distúrbio ou doença; atraso no início ou desaceleração da progressão da condição, distúrbio ou doença; melhoria da condição, distúrbio ou estado de doença;

e remissão (seja parcial ou total), seja detectável ou indetectável, ou aumento ou melhora da condição, distúrbio ou doença. O tratamento inclui a obtenção de uma resposta clinicamente significativa sem níveis excessivos de efeitos colaterais. O tratamento também inclui o prolongamento da sobrevida em comparação à sobrevida esperada se não houver tratamento.

[0102] O termo transicional "compreendendo", que é sinônimo de "incluindo", "contendo" ou "caracterizado por", é inclusivo ou em aberto e não exclui elementos adicionais não recitados ou etapas do método. Em contraste, a frase de transição "consistindo em" exclui qualquer elemento, etapa ou ingrediente não especificado na reivindicação. A frase de transição "consistindo essencialmente em" limita o escopo de uma reivindicação aos materiais ou etapas especificadas "e aqueles que não afetam materialmente as características básicas e novas" da invenção reivindicada. Em modalidades ou reivindicações onde o termo compreendendo é usado como a frase de transição, tais modalidades também podem ser imaginadas com a substituição do termo "compreendendo" pelos termos "consistindo em" ou "consistindo essencialmente em."

[0103] São divulgados, neste documento, métodos e composições para o tratamento de câncer através da indução de uma resposta imune pela administração de células dendríticas que expressam proteínas heterólogas. Em algumas modalidades, as DCs expressam heterologicamente CD40L e CXCL13. Em algumas modalidades, as DCs expressam heterologicamente CD40L, CXCL13 e CD93. Em algumas modalidades, as DCs expressam heterologicamente CD40L e CD93. Em algumas modalidades, as DCs expressam heterologicamente CXCL13 e CD93. Em algumas modalidades, as DCs não expressam CD93 de forma heteróloga.

[0104] Em algumas modalidades, as células dendríticas serão alogênicas em relação ao sujeito ao qual são administradas e, como tal, não são restritas pela expressão de HLA. A natureza alogênica das células em comparação com o sujeito é uma vantagem adicional para montar um efeito antitumoral melhorado.

[0105] Em algumas modalidades, as células dendríticas podem ser autólogas ao sujeito ao qual são administradas.

[0106] Assim, embora não desejando ser limitado pela teoria, aspectos da presente invenção se referem ao fornecimento de células dendríticas que expressam proteínas heterólogas (por exemplo, alloDCs recombinantes) a um paciente, para induzir uma resposta imunológica melhorada ao câncer (tumor) no paciente. Os métodos e composições descritos neste documento têm muitas vantagens sobre as composições e métodos anteriores, incluindo a falta de cocultura em células alimentadoras, bem como para minimizar os riscos de contaminação da composição celular devido ao curto tempo de cultura/incubação in vitro para o alloDC recombinante e opcionalmente carregar com antígenos autólogos ou "disponíveis no mercado", e facilidade e velocidade de preparação e entrega da composição celular ao paciente, juntamente com efeitos colaterais mínimos da composição celular, que são tipicamente apenas de Grau 1 (ou menos efeitos colaterais). Essas células allo-DC recombinantes e composições fornecem o benefício adicional de induzir a resposta imune celular e humoral no paciente.

Além disso, a alorreatividade do hospedeiro contra as DCs incompatíveis com HLA amplificará a resposta imune específica do tumor. Esses métodos também servem para fornecer um "efeito de vacina" treinando o hospedeiro, as células imunes do paciente para reconhecer e matar de forma semelhante o alvo do câncer e aumentar as respostas celulares e humorais do hospedeiro. Em algumas modalidades, o sujeito que recebe as células vê as células como estranhas e montará uma resposta imunológica contra as células, que pode ser referida como rejeição das células. Esta "rejeição" pode amplificar a resposta imune específica do tumor no sujeito.

[0107] O termo "anticorpo", tal conforme usado neste documento, refere-se a uma molécula de imunoglobulina que se liga especificamente a um antígeno. Os anticorpos podem ser imunoglobulinas intactas derivadas de fontes naturais ou de fontes recombinantes e podem ser porções imunorreativas de imunoglobulinas intactas. Os anticorpos podem existir em uma variedade de formas incluindo, por exemplo, anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, Fv, Fab e F(ab)2, bem como anticorpos de cadeia simples e anticorpos humanizados.

[0108] O termo "fragmento de anticorpo" refere-se a uma porção de um anticorpo intacto e refere-se às regiões variáveis determinantes antigênicas de um anticorpo intacto.

Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, sem limitação, Fab, Fab', F(ab')2, e fragmentos de Fv, anticorpos lineares; anticorpos de scFv e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo.

[0109] O termo "antígeno" conforme usado neste documento, é definido como uma molécula que provoca uma resposta imunológica. Esta resposta imunológica pode envolver a produção de anticorpos ou a ativação de células imunologicamente competentes específicas, ou ambas. O antígeno também pode ser usado in vitro para ativar as DCs, o que é comparável a uma resposta imune. O técnico no assunto entenderá que qualquer macromolécula, incluindo praticamente todas as proteínas ou peptídeos, pode servir como um antígeno.

Além disso, os antígenos podem ser derivados de

DNA recombinante ou genômico.

Um técnico no assunto compreenderá que qualquer DNA, que compreende sequências de nucleotídeo ou uma sequência de nucleotídeo parcial que codifica uma proteína que induz uma resposta imunológica,

portanto, codifica um "antígeno" à medida que esse termo é usado neste documento.

Além disso, um técnico no assunto compreenderá que um antígeno não precisa ser codificado apenas por uma sequência de nucleotídeo de comprimento completo de um gene.

É facilmente evidente que as modalidades incluem, sem limitação, o uso de sequências de nucleotídeos parciais de mais de um gene e que essas sequências de nucleotídeos são organizadas em várias combinações para induzir a resposta imune desejada.

Além disso, um técnico no assunto entenderá que um antígeno não precisa ser codificado por um "gene" de forma alguma.

Fica imediatamente evidente que um antígeno pode ser gerado de forma sintetizada ou pode derivar de uma amostra biológica.

Tal amostra biológica pode incluir, sem limitação, uma amostra de tecido, uma amostra de tumor, uma célula ou um fluido biológico.

Conforme descrito neste documento, o antígeno pode ser um lisado de células tumorais.

Exemplos de lisados de células tumorais incluem, sem limitação, aqueles descritos neste documento,

lisados preparados a partir de biópsias tumorais ou ressecções tumorais. Os métodos de preparação de lisados são conhecidos e qualquer método pode ser usado.

[0110] O termo "câncer" conforme utilizado neste documento é definido como doença caracterizada pelo crescimento rápido e descontrolado de células aberrantes. As células cancerosas podem se espalhar localmente ou através da corrente sanguínea e do sistema linfático para outras partes do corpo. Exemplos de vários cânceres incluem, sem limitação, câncer de mama, câncer de próstata, câncer de ovário, câncer cervical, câncer de pele, câncer de pâncreas, câncer colorretal, câncer renal, câncer de fígado, câncer cerebral, linfoma, leucemia, câncer de pulmão e semelhantes.

[0111] Os cânceres que podem ser tratados incluem tumores que não são vascularizados, ou ainda não substancialmente vascularizados, bem como tumores vascularizados. Os tipos de câncer a serem tratados com as células dendríticas recombinantes descritos neste documento incluem, sem limitação, carcinoma, blastoma e sarcoma, e certas leucemias ou neoplasias linfoides, tumores benignos e malignos e malignidades, por exemplo, sarcomas, carcinomas e melanomas. Tumores/cânceres adultos e tumores/cânceres pediátricos também estão incluídos.

[0112] Os tumores sólidos são massas anormais de tecido que geralmente não contêm cistos ou áreas líquidas.

Os tumores sólidos podem ser benignos ou malignos.

Diferentes tipos de tumores sólidos são nomeados de acordo com o tipo de células que os formam (como sarcomas, carcinomas e linfomas). Exemplos de tumores sólidos, como sarcomas e carcinomas, incluem fibrossarcoma, mixossarcoma,

lipossarcoma, condrossarcoma, osteossarcoma, e outros sarcomas, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing,

leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, carcinoma de cólon,

neoplasia maligna linfoide, câncer de pâncreas, câncer de mama, cânceres pulmonares, câncer ovariano, câncer de próstata, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basais, adenocarcinoma,

carcinoma das glândulas sudoríparas, carcinoma medular de tireoide, carcinoma papilar de tireoide, feocromocitomas,

carcinoma de glândulas sebáceas, carcinoma papilar,

adenocarcinomas papilares, carcinoma medular, carcinoma broncogênico, carcinoma de células renais, hepatoma,

carcinoma do duto biliar, coriocarcinoma, tumor de Wilms,

câncer do colo do útero, tumor testicular, seminoma,

carcinoma de bexiga, melanoma, e tumores do SNC (tais como,

um glioma (tal como glioma do tronco encefálico e gliomas mistos), glioblastoma (também conhecido como glioblastoma multiforme), astrocitoma, linfoma do SNC, germinoma,

meduloblastoma, Schwannoma, craniofaringioma, ependimoma,

pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, neuroblastoma, retinoblastoma e metástases cerebrais).

[0113] O termo "efeito antitumoral", tal como utilizado neste documento, refere-se a um efeito biológico que pode ser manifestado por uma diminuição no volume do tumor, uma diminuição no número de células tumorais, uma diminuição no número de metástases, um aumento na expectativa de vida, ou melhora de vários sintomas fisiológicos associados à condição cancerosa. Um "efeito antitumoral" também pode ser manifestado pela capacidade das células recombinantes e composições terapêuticas para prevenir a ocorrência de tumor em primeiro lugar.

[0114] Tal conforme usado neste documento, o termo "autólogo" pretende referir-se a qualquer material derivado do mesmo indivíduo ao qual mais tarde será reintroduzido no indivíduo.

[0115] "Alogênico" refere-se a uma amostra (enxerto, célula ou população de células) derivada de um animal diferente da mesma espécie ao qual a amostra é posteriormente introduzida. Em algumas modalidades, as células dendríticas recombinantes são completamente incompatíveis com HLA em comparação com o sujeito que recebe as células dendríticas recombinantes, ao contrário das situações em transplantes renais e de medula óssea em que HLA-A, -B e -DR correspondentes são benéficos para a sobrevivência do enxerto. Nos presentes métodos para tratar o câncer e/ou aumentar e/ou melhorar a resposta imune, as células dendríticas recombinantes que expressam CD40L, CXCL13 e, opcionalmente, CD93 podem atrair células T e, por exemplo, gerar respostas imunes humorais, que servem para direcionar as células cancerosas e se ligam a elas, e as matam, liberando antígenos de células tumorais. Esse ciclo se repete com as células dendríticas recombinantes alogênicas, até que sejam mortas pelas respostas imunes da célula hospedeira.

Isso pode acontecer, por exemplo, dentro de cerca de 4 a cerca de 7 dias (e possivelmente durante um intervalo estendido de cerca de 4 a cerca de 15 dias). Assim, há risco reduzido ou nenhum risco para GVHD (doença do enxerto versus hospedeiro) com um período de vida tão curto para as DCs recombinantes alogênicas. No entanto, no processo de reconhecer e matar células tumorais e liberar antígenos para esse período de cerca de 4 a cerca de 7 dias, as células alogênicas podem, em algumas modalidades, servir para vacinar as células dendríticas hospedeiras e outras células imunes para reconhecer e matar células tumorais. Consulte, adicionalmente, o artigo de revisão Cancer Sci. Janeiro de 2019; 110 (1): 16-22, que é incorporado neste documento por referência em sua totalidade. A indução de imunidade antitumoral é um processo cíclico que pode ser autopropagado.

Pode amplificar e estender as respostas das células T contra as células cancerosas. Ele também contém vários fatores inibidores para interromper o ciclo quando as células-alvo (células cancerosas) são erradicadas. O ciclo pode ser dividido em 7 etapas, conforme mostrado na Fig. 1C, começando com a liberação de antígenos cancerígenos das células cancerosas e terminando com a morte das células cancerosas.

APC, célula apresentadora de antígeno; DC, célula dendrítica.

[0116] Uma "doença" é um estado de saúde de um sujeito em que o sujeito não pode manter a homeostase e, se a doença não for melhorada, a saúde do animal continua a deteriorar-se. Em contraste, um "distúrbio" em um sujeito é um estado de saúde em que o sujeito é capaz de manter a homeostase, mas em que o estado de saúde do sujeito é menos favorável do que seria na ausência do distúrbio. Sem tratamento, um distúrbio não causa necessariamente uma diminuição adicional no estado de saúde do sujeito.

[0117] "Codificação" refere-se à propriedade inerente de sequências específicas de nucleotídeos em um polinucleotídeo, como um gene, um cDNA ou um mRNA, para servir como modelos para a síntese de outros polímeros e macromoléculas em processos biológicos tendo uma sequência definida de nucleotídeos (ou seja, rRNA, tRNA e mRNA) ou uma sequência definida de aminoácidos e as propriedades biológicas daí resultantes. Assim, um gene codifica uma proteína se a transcrição e tradução do mRNA correspondente a esse gene produzir a proteína em uma célula ou outro sistema biológico. Tanto a fita codificadora, cuja sequência de nucleotídeos é idêntica à sequência de mRNA e é geralmente fornecida em listagens de sequências, quanto a fita não codificadora, usada como molde para a transcrição de um gene ou cDNA, pode ser referida como codificando a proteína ou outro produto desse gene ou cDNA. Tal como utilizado neste documento, um vetor que codifica uma proteína de interesse refere-se a um vetor contendo uma sequência de nucleotídeos que codifica essa proteína ou proteínas.

[0118] Tal como utilizado neste documento, o termo "exógeno" refere-se a qualquer material introduzido ou produzido fora de um organismo, célula, tecido ou sistema.

Uma proteína que é referida como uma proteína heteróloga é expressa por material exógeno (vetores, sequências de nucleotídeos e semelhantes) que foi introduzido no organismo, célula, tecido ou sistema. Para evitar dúvidas, uma proteína heteróloga, um vetor heterólogo ou uma molécula de nucleotídeo heteróloga não é a mesma que pode estar presente no genoma nativo não modificado do organismo, célula, tecido ou sistema. Uma proteína, vetor ou sequência de nucleotídeos heteróloga que pode ter a mesma ou semelhante a uma sequência já presente no organismo, célula, tecido ou sistema, é expressa a partir de um local ou sequência diferente da sequência nativa encontrada no genoma desse organismo, célula, tecido ou sistema.

[0119] O termo "expressão", conforme usado neste documento, é definido como a transcrição e/ou tradução de uma sequência de nucleotídeos particular conduzida pelo seu promotor.

[0120] "Vetor de expressão" refere-se a um vetor compreendendo um polinucleotídeo recombinante compreendendo sequências de controle de expressão ligadas operativamente a uma sequência de nucleotídeo a ser expressa. Um vetor de expressão compreende elementos de ação cis suficientes para a expressão; outros elementos para expressão podem ser fornecidos pela célula hospedeira ou em um sistema de expressão in vitro. Os vetores de expressão incluem todos aqueles conhecidos no estado da técnica, tal como cosmídeos, plasmídeos (por exemplo, nus ou contidos em lipossomas) e vírus (por exemplo, lentivírus, retrovírus, adenovírus e adenovírus associados) que incorporam o polinucleotídeo recombinante.

[0121] "Homólogo" ou "Homologia" refere-se à similaridade de sequência ou identidade de sequência entre dois polipeptídeos ou entre duas moléculas de ácido nucleico.

Quando uma posição em ambas as duas sequências comparadas é ocupada pela mesma base ou subunidade monomérica de aminoácidos, por exemplo, se uma posição em cada uma das duas moléculas de DNA está ocupada por adenina, então as moléculas são homólogas nessa posição. A percentagem de homologia entre duas sequências é uma função do número de posições coincidentes ou homólogas compartilhadas pelas duas sequências, dividido pelo número de posições comparadas X

100. Por exemplo, se 6 de 10 das posições em duas sequências estiverem combinadas ou homólogas então as duas sequências são 60% homólogas. A título de exemplo, as sequências de DNA ATTGCC e TATGGC compartilham 50% de homologia. Em geral, a comparação é feita quando duas sequências estão alinhadas para gerar homologia máxima.

[0122] O termo "imunoglobulina" ou "Ig", conforme utilizado neste documento, é definido como uma classe de proteínas, que funcionam como anticorpos. Os anticorpos expressos pelas células B são por vezes referidos como o receptor de BCR (receptor de células B) ou antígeno. Os cinco membros incluídos nesta classe de proteínas são IgA, IgG, IgM, IgD e IgE.

[0123] "Isolado" significa alterado ou removido do estado natural. Por exemplo, um ácido nucleico ou um peptídeo em seu contexto normal em um animal vivo não é "isolado", mas o mesmo ácido nucleico ou peptídeo parcial ou completamente separado dos materiais coexistentes em seu estado natural é "isolado." Uma proteína ou ácido nucleico isolado podem existir em uma forma substancialmente purificada ou podem existir em um ambiente não nativo, tal como, por exemplo, em uma célula hospedeira. Um componente biológico "isolado" (como um ácido nucléico, proteína ou célula) foi substancialmente separado ou purificado de outros componentes biológicos (como fragmentos celulares, outras proteínas, ácidos nucleicos ou tipos de células). Os componentes biológicos que foram "isolados" incluem aqueles componentes purificados por métodos de purificação padrão.

[0124] Prevenir, tratar ou melhorar uma doença: "Prevenir" uma doença refere-se a inibir o desenvolvimento completo de uma doença. "Tratar" refere-se a uma intervenção terapêutica que melhora um sinal ou sintoma de uma doença ou condição patológica após ter começado a se desenvolver.

"Melhorar" refere-se à redução no número ou gravidade dos sinais ou sintomas de uma doença.

[0125] A quimioterapia inclui o tratamento com um agente químico (como um agente citotóxico) com utilidade terapêutica para o tratamento de doenças caracterizadas por crescimento celular anormal, como tumores, neoplasias, câncer e psoríase. Exemplos de quimioterapias incluem, sem limitação, aqueles descritos neste documento.

[0126] Tal como utilizado neste documento, recombinante geralmente se refere ao seguinte: Um ácido nucleico ou proteína recombinante é aquele que tem uma sequência que não ocorre naturalmente ou tem uma sequência que é feita por uma combinação artificial de dois segmentos de sequência separados de outra forma. Esta combinação artificial é frequentemente realizada por síntese química ou pela manipulação artificial de segmentos isolados de ácidos nucleicos, por exemplo, por técnicas de engenharia genética.

[0127] Tal como utilizado neste documento, são utilizadas as seguintes abreviaturas para as bases de ácido nucleico de ocorrência comum. "A" refere-se a adenosina, "C" refere-se a citosina, "G" refere-se a guanosina, "T" refere- se a timidina e "U" refere-se a uridina.

[0128] O termo "leucócitos" ou "glóbulos brancos", conforme utilizado neste documento, refere-se a qualquer célula imune, incluindo monócitos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos e linfócitos. O termo "linfócitos", como utilizado neste documento, refere-se a células comumente encontradas na linfa e incluem células assassinas naturais (células NK),

células T e células B. Será apreciado por um técnico no assunto que os tipos de células imunes listados acima podem ser divididos em subconjuntos adicionais.

[0129] O termo "leucócitos infiltrantes de tumor", conforme utilizado neste documento, refere-se a leucócitos que estão presentes em um tumor sólido.

[0130] O termo "amostra de sangue", conforme utilizado neste documento, refere-se a qualquer amostra preparada a partir de sangue, como plasma, células sanguíneas isoladas de sangue e assim por diante.

[0131] O termo "amostra purificada", tal como utilizado neste documento, refere-se a qualquer amostra na qual um ou mais subconjuntos de células são enriquecidos.

Uma amostra pode ser purificada pela remoção ou isolamento de células com base em características como tamanho, expressão de proteína e assim por diante.

[0132] Veículos farmaceuticamente aceitáveis: Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis (veículos) úteis nesta divulgação são convencionais. Remington's Pharmaceutical Sciences, por E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 15ª Edição (1975), descreve composições e formulações adequadas para distribuição farmacêutica de uma ou mais composições terapêuticas e agentes farmacêuticos adicionais.

[0133] Em geral, a natureza de um carreador ou veículo adequado para distribuição dependerá do modo particular de administração a ser empregado. Por exemplo, as formulações parentéricas geralmente compreendem fluidos injetáveis que incluem fluidos farmaceuticamente e fisiologicamente aceitáveis, como água, soro fisiológico, soluções salinas balanceadas, dextrose aquosa, glicerol ou semelhantes como um veículo. Para composições sólidas (por exemplo, formas de pó, pílula, comprimido ou cápsula), os veículos sólidos não tóxicos convencionais podem incluir, por exemplo, qualidades farmacêuticas de manitol, lactose, amido ou estearato de magnésio. Além de carreadores biologicamente neutros, as composições farmacêuticas a serem administradas podem conter pequenas quantidades de substâncias auxiliares não tóxicas, tais como agentes umectantes ou emulsificantes, conservantes e agentes tamponantes de pH e semelhantes, por exemplo, acetato de sódio ou monolaurato de sorbitano.

[0134] Em algumas modalidades, as composições, sejam soluções, suspensões ou outra forma semelhante, podem incluir um ou mais dos seguintes: DMSO, diluentes estéreis, como água para injeção, solução salina, de preferência soro fisiológico, solução de Ringer, cloreto de sódio isotônico, óleos fixos, tais como mono ou diglicerídeos sintéticos que podem servir como solvente ou meio de suspensão, polietilenoglicóis, glicerina, propilenoglicol ou outros solventes; agentes antibacterianos, tais como álcool benzílico ou metil parabeno; antioxidantes como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes, tais como ácido etilenodiaminotetracético; tampões como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajuste da tonicidade, como cloreto de sódio ou dextrose.

[0135] Conforme usado neste documento, imunodeficiente significa falta de pelo menos uma função essencial do sistema imunológico. Tal como utilizado neste documento, um sujeito "imunodeficiente" (tal como um ser humano) é aquele sem componentes específicos do sistema imunológico ou sem função de componentes específicos do sistema imunológico (como, por exemplo, células B, células T, células NK ou macrófagos). Em alguns casos, um sujeito imunodeficiente compreende uma ou mais alterações genéticas que previnem ou inibem o desenvolvimento de células imunes funcionais (como células B, células T ou células NK). Em alguns exemplos, a alteração genética está no receptor IL17 ou IL17.

[0136] Tal como utilizado neste documento, imunossuprimido refere-se a uma atividade ou função reduzida do sistema imunológico. Um sujeito pode ser imunossuprimido,

por exemplo, devido ao tratamento com um composto imunossupressor ou como resultado de uma doença ou distúrbio (por exemplo, imunossupressão resultante da infecção por HIV ou devido a um defeito genético). Em alguns casos, a imunossupressão ocorre como resultado de uma mutação genética que impede ou inibe o desenvolvimento de células imunes funcionais, como as células T.

[0137] Exemplos de tipos de câncer e distúrbios proliferativos que podem ser tratados com uma quantidade eficaz de composições celulares dendríticas recombinantes e métodos relacionados descritos neste documento incluem, sem limitação, fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcoma osteogênico, angiossarcoma, endoteliossarcoma, tumor de Ewing, carcinoma de cólon, câncer de pâncreas, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basais, adenocarcinoma, carcinoma de células renais, hepatoma, tumor de Wilm, câncer do colo do útero, câncer uterino, tumor testicular, carcinoma de pulmão, carcinoma do pulmão de células pequenas , carcinoma da bexiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, oligodendroglioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, displasia e hiperplasia. O tratamento e/ou prevenção do câncer inclui, sem limitação, o alívio de um ou mais sintomas associados ao câncer, a inibição ou redução da progressão do câncer, a promoção da regressão do câncer e/ou a promoção da resposta imune.

[0138] Em certas outras modalidades, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" é a quantidade da composição celular dendrítica recombinante que resulta em uma redução do tumor, crescimento ou disseminação do câncer em pelo menos 2,5%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 25%, pelo menos 35%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, por pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% em um paciente ou animal administrado com uma composição ou células descritas neste documento em relação ao crescimento do tumor ou propagação do câncer em um paciente (ou um animal) ou um grupo de pacientes (ou animais) não administrado com uma composição ou células da invenção.

[0139] Em algumas modalidades, as composições celulares dendríticas recombinantes podem ser administradas simultaneamente com agentes antimicrobianos, antivirais e outros agentes terapêuticos. Alternativamente, as composições celulares dendríticas recombinantes podem ser administradas em momentos selecionados antes dos momentos em que são administrados agentes antimicrobianos, antivirais e outros agentes terapêuticos.

Combinações com anticorpos

[0140] Em algumas modalidades, as composições celulares dendríticas recombinantes podem ser administradas simultaneamente com anticorpos específicos para um tipo de câncer selecionado. Alternativamente, as composições celulares dendríticas recombinantes podem ser administradas em momentos selecionados antes dos momentos em que os anticorpos específicos para um tipo de câncer selecionado são administrados. Os anticorpos específicos para um tipo de câncer selecionado incluem qualquer anticorpo aprovado para o tratamento do câncer. Os exemplos incluem trastuzumabe (Herceptin) para câncer de mama, rituximabe (Rituxan) para linfoma e cetuximabe (Erbitux) para carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço.

[0141] Exemplos adicionais de tais agentes de anticorpos incluem inibidores de PD-1 ou PD-L1 (B7-H1), como anticorpos anti-PD-1, incluindo nivolumabe (Nivolumabe da Bristol-Myers Squibb) e pembrolizumabe/lambrolizumabe, também conhecido como MK -3475 (Keytruda da Merck), pidilizumab (Curetech), AMP-224 (Amplimmune) e anticorpos anti-PD-L1, incluindo MPDL3280A (Roche), MDX-1105 (Bristol Myers Squibb), MEDI-4736 (AstraZeneca) e MSB-0010718 C (Merck). Outros inibidores de checkpoint incluem antagonistas de CTLA-4, como anticorpos anti-CTLA-4. Um exemplo de anticorpo anti-CTLA4 é YervoyTM (ipilimumab)

comercializado pela Bristol-Myers Squibb. Outros exemplos de anticorpos CTLA-4 incluem tremelimumab (Pfizer), Ticilimumab (AstraZeneca) e AMGP-224 (Glaxo Smith Kline). As combinações com quaisquer dois desses anticorpos também podem ser indicadas em certos casos.

[0142] Em algumas modalidades, as células dendríticas são isoladas de várias fontes, incluindo células mononucleares de sangue periférico.

[0143] "Células mononucleares de sangue periférico", "PBMCs" ou "células mononucleares" referem-se a células mononucleares separadas do sangue periférico normalmente usadas para imunoterapia anticâncer. As células mononucleares de sangue periférico podem ser obtidas a partir de sangue humano coletado usando métodos conhecidos, como o método de gradiente de densidade Ficoll-Hypaque.

[0144] De acordo com uma modalidade exemplar, "células mononucleares de sangue periférico" podem ser obtidas de qualquer pessoa adequada. A fonte das células do doador, incluindo fontes, tais como células mononucleares de sangue periférico, como utilizadas neste documento, pode, em algumas modalidades, ser alogênica para o paciente receptor para isolamento das células dendríticas para uso no tratamento do câncer e métodos de estimulação imunológica descritos neste documento. Assim, em algumas modalidades, o ligante inibitório doador não combina com o HLA do paciente (por exemplo, hospedeiro).

[0145] Em modalidades alternativas, a fonte das células do doador, incluindo fontes tais como células mononucleares de sangue periférico, como utilizadas neste documento, são autólogas para o paciente receptor para isolamento das células dendríticas para uso no tratamento do câncer e métodos de estimulação imunológica descritos neste documento.

Fontes de Célula

[0146] PBMCs podem ser isolados por centrifugação de gradiente de densidade Ficoll-Hypaque de amostras obtidas de filtros de redução de leucócitos descartados e não identificados (Cruz Vermelha Americana) ou doações de sangue de voluntários saudáveis com consentimento informado. As descrições de populações de células, fontes e métodos para selecionar ou enriquecer para os tipos de células desejados podem ser encontradas, por exemplo, na Patente US N°.

9,347,044. As populações de células para uso nos métodos descritos neste documento para o tratamento de mamíferos devem ser de espécies correspondentes, como células humanas.

As células podem ser obtidas de um animal, por exemplo, um paciente humano. Se as células são obtidas de um animal, elas podem ter sido estabelecidas primeiro em cultura, por exemplo, por transformação; ou mais preferencialmente, eles podem ter sido submetidos a métodos de purificação preliminares.

Por exemplo, uma população de células pode ser manipulada por seleção positiva ou negativa com base na expressão de marcadores de superfície celular; estimulado com um ou mais antígenos in vitro ou in vivo; tratado com um ou mais modificadores biológicos in vitro ou in vivo; ou uma combinação de qualquer um ou todos eles.

Em uma modalidade ilustrativa, uma população de células é submetida a seleção negativa para esgotamento de células não T e/ou subconjuntos de células T particulares.

A seleção negativa pode ser realizada com base na expressão da superfície celular de uma variedade de moléculas, incluindo marcadores de células B,

como CD19 e CD20; marcador de monócito CD14; o marcador de células NK CD56. Alternativamente, uma população de células pode ser submetida a seleção negativa para esgotamento de células hematopoiéticas não CD34.sup. + e/ou subconjuntos de células hematopoiéticas particulares.

A seleção negativa pode ser realizada com base na expressão da superfície celular de uma variedade de moléculas, como um coquetel de anticorpos (por exemplo, CD2, CD3, CD11b, CD14, CD15, CD16,

CD19, CD56, CD123 e CD235a) que podem ser usados para separação de outros tipos de células, por exemplo, via MACS ou separação por coluna.

[0147] As populações de células incluem células mononucleares de sangue periférico, sangue total ou suas frações contendo populações mistas, células do baço, células da medula óssea, linfócitos infiltrantes de tumor, células obtidas por leucaferese, tecido de biópsia, nódulos linfáticos, por exemplo, nódulos linfáticos drenando de um tumor. Os doadores adequados incluem doadores imunizados, doadores não imunizados (não exposto), doadores tratados ou não tratados. Um doador "tratado" é aquele que foi exposto a um ou mais modificadores biológicos. Um doador "não tratado" não foi exposto a um ou mais modificadores biológicos.

[0148] Os métodos de obtenção de populações de células compreendendo monócitos (a serem maturados em DCs) ou células dendríticas são bem conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, células mononucleares de sangue periférico (PBMC) podem ser obtidas conforme descrito de acordo com métodos conhecidos no estado da técnica. Exemplos de tais métodos são descritos por exemplo em: Nair, Smita et al. Current protocols in immunology vol. Chapter 7 (2012): Unit7.32. doi:10.1002/0471142735.im0732s99.

[0149] Também é possível obter uma amostra de célula de um sujeito e, em seguida, enriquecê-la para um tipo de célula desejado. Por exemplo, PBMCs podem ser isolados do sangue como descrito neste documento. A centrifugação em contrafluxo (elutriação) pode ser usada para enriquecer monócitos ou células dendríticas de PBMCs. As células também podem ser isoladas de outras células usando uma variedade de técnicas, como isolamento e/ou ativação com uma ligação de anticorpo a um epítopo na superfície celular do tipo de célula desejado, por exemplo, alguns kits de isolamento de células T usam anticorpo conjugado de grânulos para ativar as células e, em seguida, permitir a separação em coluna com os mesmos grânulos. Outro método que pode ser usado inclui a seleção negativa usando anticorpos para marcadores de superfície celular para enriquecimento seletivo para um tipo específico de célula sem ativar a célula por engajamento do receptor.

[0150] As células da medula óssea (células BM) podem ser obtidas da crista ilíaca, fêmures, tíbias, coluna, costelas ou outros espaços medulares. A medula óssea pode ser retirada do paciente e isolada por meio de várias separações e procedimentos de lavagem. Um procedimento conhecido para o isolamento de células da medula óssea compreende as seguintes etapas: a) separação centrífuga da suspensão da medula óssea em três frações e coleta da fração intermediária, ou buffycoat; b) a fração buffycoat da etapa (a) é centrifugada mais uma vez em um fluido de separação,

comumente Ficoll (uma marca comercial da Pharmacia Fine Chemicals AB), e uma fração intermediária que contém as células da medula óssea é coletada; e c) lavagem da fração coletada da etapa (b) para recuperação de células da medula óssea retransfusáveis. Além disso, as células BM podem ser coletadas por mobilização seguida de leucaferese.

[0151] As células dendríticas (DCs) são as células apresentadoras de antígenos sentinela do sistema imunológico. Essas células têm a capacidade de adquirir material antigênico de seu ambiente e, subsequentemente, iniciar respostas imunes vigorosas, e são candidatas ideais para administrar vacinas para imunoterapia contra o câncer.

As células dendríticas compreendem uma população de células heterogênea com morfologia distinta e uma ampla distribuição de tecidos. As DCs exibem marcadores de superfície celular, como CD1c+, CD14+, CD141+, CD16+, ou HLA-DR+.

[0152] Em particular, as células dendríticas atuam como uma célula apresentadora de antígeno por endocitose de proteínas exógenas que são então processadas e apresentadas como epítopos em sua superfície em conjunto com antígenos MHC de classe I e II. As células dendríticas que apresentam antígeno podem ser reconhecidas por células T citotóxicas e células T helper. O estado de maturação das células dendríticas é importante para sua atividade fagocítica/endocítica. As células dendríticas imaturas são normalmente as células mais eficientes para carregar antígenos.

[0153] As células dendríticas imaturas referem-se a células dendríticas nas quais a expressão de certos marcadores celulares CD1a, CD14 e CD83 é caracterizada por uma alta expressão de CD1a (mais de 50% das DCs na população são positivas para CD1a), nenhuma expressão ou baixa expressão de CD14 (menos de 15% das DCs na população são positivas para CD14) e baixa expressão de CD83 (menos de 25% das DCs na população são positivas para CD83).

[0154] Em algumas modalidades, as DCs são obtidas de qualquer tecido onde residem, incluindo tecidos não linfoides, como a epiderme da pele (células de Langerhans) e tecidos linfoides, como baço, medula óssea, nódulos linfáticos e timo, bem como o sistema circulatório, incluindo sangue e sangue periférico. Como as DCs ocorrem em baixo número em qualquer tecido em que residem, as DCs podem ser enriquecidas ou isoladas para uso. Qualquer um de uma série de procedimentos que envolvem separação de gradiente de densidade repetitiva, seleção positiva, seleção negativa ou uma combinação dos mesmos pode ser usado para obter populações enriquecidas de DCs. Uma vez que as DCs são obtidas, elas podem ser cultivadas em meio de cultura apropriado para expandir a população de células e/ou manter as DCs em um estado para captação, processamento e apresentação de antígeno ideal.

[0155] Em algumas modalidades, as DCs podem ser autólogas para um sujeito que sofre de câncer, ou seja, as DCs que são administradas ao sujeito podem ser isoladas do mesmo sujeito. Em outras modalidades, as DCs podem ser alogênicas para o sujeito que sofre de câncer. Em algumas modalidades, as DCs divulgadas neste documento podem ser de qualquer subtipo, tais como DCs mieloides, DCs plasmocitoides, DCs intersticiais, DCs residentes em tecido linfoide, DCs foliculares, DCs CD14+ e semelhantes.

[0156] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos de desenvolvimento de células dendríticas geneticamente modificadas/recombinantes que expressam CD40L, CXCL13 e, opcionalmente, CD93, que podem ser usados para a terapia do câncer.

[0157] CD40L é uma proteína de membrana tipo II de 35 kDa e um membro da família de genes do fator de necrose tumoral (TNF), é expressa na superfície das células T após o reconhecimento do antígeno. O CD40L está criticamente envolvido na ativação das células T necessárias para induzir uma imunidade protetora eficaz contra os autoantígenos tumorais. (Veja, Front Immunol. 2011; 2:31, que é incorporado neste documento por referência em sua totalidade). A informação de sequência completa para CD40L humano pode ser encontrada em NCBI, Gene ID: 959.

[0158] CXCL13 é uma quimiocina expressa em células estromais foliculares de órgãos linfoides, macrófagos nas cavidades peritoneal e pleural e em células dendríticas mieloides. Foi demonstrado que se liga principalmente ao receptor CXCR5 acoplado à proteína G. CXCR5 é expresso em células B e certos subconjuntos de células T (incluindo células T helper foliculares, um subconjunto de células T CD4 de memória circulante e outras populações de células T não totalmente diferenciadas como T-helper 1 (Th1) ou T- helper 2 (Th2). CXCL13 demonstrou papéis fisiológicos na colocalização de células B e T influenciando o homing de células B1 autorreativas para placas de Peyer e outros sítios de inflamação, e desempenhando um papel no recrutamento de células Th para órgãos linfoides secundários para produção de anticorpos dependentes de T. (Vide, Front Immunol. 2016; 7: 225, que é incorporado neste documento por referência em sua totalidade). A informação de sequência completa para CXCL13 humano pode ser encontrada em NCBI, Gene ID: 10563.

[0159] CD93 humano (hCD93) é glicoproteína transmembranar tipo 1 localizada no cromossomo 20, p11.21.

Esta proteína está envolvida na interação célula-célula durante o desenvolvimento da célula B e a fagocitose. O CD93 é expresso em linhagens mieloides, células-tronco hematopoiéticas, células NK, plaquetas, microglia e células endoteliais. A informação de sequência completa para CD93 humano pode ser encontrada em NCBI, Gene ID:22918.

[0160] Em algumas modalidades, uma célula dendrítica compreende uma ou mais moléculas de ácido nucleico heterólogas que codificam CD40L e/ou CXCL13. A molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica CD40L pode ser de qualquer fonte, como humano, camundongo, rato ou porco, ou qualquer outro mamífero. A sequência de ácido nucleico de CD40L humano é divulgada como SEQ ID NO: 1. Da mesma forma, a molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica CXCL13 pode ser de qualquer fonte, tal como humano, camundongo, rato ou porco, ou qualquer outro mamífero. A sequência de ácido nucleico de CXCL13 humana é divulgada como SEQ ID NO:

2.

[0161] Em algumas modalidades, as células dendríticas podem compreender ainda uma molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica CD93. A molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica CD93 pode ser de qualquer fonte, como humano, camundongo, rato ou porco, ou qualquer outro mamífero. A sequência de ácido nucleico de CD93 humana é divulgada como SEQ ID NO: 3.

[0162] As sequências de ácido nucleico que codificam as proteínas, no entanto, podem ser outras sequências devido à natureza degenerada do código genético. Estas sequências de ácido nucleico são exemplos não limitativos e outros podem ser usados.

[0163] As correspondentes sequências de aminoácidos humanos são as seguintes: CD40L humano: SEQ ID NO:4; CXCL13 humano:SEQ ID NO: 5; e CD93 humano:SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, a proteína compreende uma substituição conservativa.

[0164] As seguintes sequências podem ser usadas como referência ao longo do presente pedido, conforme apropriado:

[0165] Em algumas modalidades, o CD40L humano é codificado por:

ATGATCGAAACATACAACCAAACTTCTCCCCGATCTGCGGCCACTGGACTGCCC ATCAGCATGAAAATTTTTATGTATTTACTTACTGTTTTTCTTATCACCCAGATGATTGG GTCAGCACTTTTTGCTGTGTATCTTCATAGAAGGTTGGACAAGATAGAAGATGAAAGGA ATCTTCATGAAGATTTTGTATTCATGAAAACGATACAGAGATGCAACACAGGAGAAAGA TCCTTATCCTTACTGAACTGTGAGGAGATTAAAAGCCAGTTTGAAGGCTTTGTGAAGGA TATAATGTTAAACAAAGAGGAGACGAAGAAAGAAAACAGCTTTGAAATGCAAAAAGGTG ATCAGAATCCTCAAATTGCGGCACATGTCATAAGTGAGGCCAGCAGTAAAACAACATCT GTGTTACAGTGGGCTGAAAAAGGATACTACACCATGAGCAACAACTTGGTAACCCTGGA AAATGGGAAACAGCTGACCGTTAAAAGACAAGGACTCTATTATATCTATGCCCAAGTCA CCTTCTGTTCCAATCGGGAAGCTTCGAGTCAAGCTCCATTTATAGCCAGCCTCTGCCTA AAGTCCCCCGGTAGATTCGAGAGAATCTTACTCAGAGCTGCAAATACCCACAGTTCCGC CAAACCTTGCGGGCAACAATCCATTCACTTGGGAGGAGTATTTGAATTGCAACCAGGTG

CTTCGGTGTTTGTCAATGTGACTGATCCAAGCCAAGTGAGCCATGGCACTGGCTTCACG TCCTTTGGCTTACTCAAACTC (SEQ ID NO: 1)

[0166] Em algumas modalidades, CXCL13 humano é codificado por:

ATGAAGTTCATCTCGACATCTCTGCTTCTCATGCTGCTGGTCAGCAGCCTCTCT CCAGTCCAAGGTGTTCTGGAGGTCTATTACACAAGCTTGAGGTGTAGATGTGTCCAAGA GAGCTCAGTCTTTATCCCTAGACGCTTCATTGATCGAATTCAAATCTTGCCCCGTGGGA ATGGTTGTCCAAGAAAAGAAATCATAGTCTGGAAGAAGAACAAGTCAATTGTGTGTGTG

GACCCTCAAGCTGAATGGATACAAAGAATGATGGAAGTATTGAGAAAAAGAAGTTCTTC AACTCTACCAGTTCCAGTGTTTAAGAGAAAGATTCCC (SEQ ID NO: 2)

[0167] Em algumas modalidades, CD93 humano é codificado por:

ATGGCCACCTCCATGGGCCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTCCTGACCCAGCCC GGGGCGGGGACGGGAGCTGACACGGAGGCGGTGGTCTGCGTGGGGACCGCCTGCTACAC GGCCCACTCGGGCAAGCTGAGCGCTGCCGAGGCCCAGAACCACTGCAACCAGAACGGGG GCAACCTGGCCACTGTGAAGAGCAAGGAGGAGGCCCAGCACGTCCAGCGAGTACTGGCC CAGCTCCTGAGGCGGGAGGCAGCCCTGACGGCGAGGATGAGCAAGTTCTGGATTGGGCT CCAGCGAGAGAAGGGCAAGTGCCTGGACCCTAGTCTGCCGCTGAAGGGCTTCAGCTGGG TGGGCGGGGGGGAGGACACGCCTTACTCTAACTGGCACAAGGAGCTCCGGAACTCGTGC ATCTCCAAGCGCTGTGTGTCTCTGCTGCTGGACCTGTCCCAGCCGCTCCTTCCCAGCCG CCTCCCCAAGTGGTCTGAGGGCCCCTGTGGGAGCCCAGGCTCCCCCGGAAGTAACATTG AGGGCTTCGTGTGCAAGTTCAGCTTCAAAGGCATGTGCCGGCCTCTGGCCCTGGGGGGC CCAGGTCAGGTGACCTACACCACCCCCTTCCAGACCACCAGTTCCTCCTTGGAGGCTGT GCCCTTTGCCTCTGCGGCCAATGTAGCCTGTGGGGAAGGTGACAAGGACGAGACTCAGA GTCATTATTTCCTGTGCAAGGAGAAGGCCCCCGATGTGTTCGACTGGGGCAGCTCGGGC CCCCTCTGTGTCAGCCCCAAGTATGGCTGCAACTTCAACAATGGGGGCTGCCACCAGGA CTGCTTTGAAGGGGGGGATGGCTCCTTCCTCTGCGGCTGCCGACCAGGATTCCGGCTGC TGGATGACCTGGTGACCTGTGCCTCTCGAAACCCTTGCAGCTCCAGCCCATGTCGTGGG GGGGCCACGTGCGTCCTGGGACCCCATGGGAAAAACTACACGTGCCGCTGCCCCCAAGG GT ACCAGCTGGACTCGAGTCAGCTGGACTGTGTGGACGTGGATGAATGCCAGGACTCCCCC TGTGCCCAGGAGTGTGTCAACACCCCTGGGGGCTTCCGCTGCGAATGCTGGGTTGGCTA TGAGCCGGGCGGTCCTGGAGAGGGGGCCTGTCAGGATGTGGATGAGTGTGCTCTGGGTC GCTCGCCTTGCGCCCAGGGCTGCACCAACACAGATGGCTCATTTCACTGCTCCTGTGAG GAGGGCTACGTCCTGGCCGGGGAGGACGGGACTCAGTGCCAGGACGTGGATGAGTGTGT GGGCCCGGGGGGCCCCCTCTGCGACAGCTTGTGCTTCAACACACAAGGGTCCTTCCACT GTGGCTGCCTGCCAGGCTGGGTGCTGGCCCCAAATGGGGTCTCTTGCACCATGGGGCCT GTGTCTCTGGGACCACCATCTGGGCCCCCCGATGAGGAGGACAAAGGAGAGAAAGAAGG GAGCACCGTGCCCCGTGCTGCAACAGCCAGTCCCACAAGGGGCCCCGAGGGCACCCCCA AGGCTACACCCACCACAAGTAGACCTTCGCTGTCATCTGACGCCCCCATCACATCTGCC CCACTCAAGATGCTGGCCCCCAGTGGGTCCCCAGGCGTCTGGAGGGAGCCCAGCATCCA TCACGCCACAGCTGCCTCTGGCCCCCAGGAGCCTGCAGGTGGGGACTCCTCCGTGGCCA CACAAAACAACGATGGCACTGACGGGCAAAAGCTGCTTTTATTCTACATCCTAGGCACC GTGGTGGCCATCCTACTCCTGCTGGCCCTGGCTCTGGGGCTACTGGTCTATCGCAAGCG GAGAGCGAAGAGGGAGGAGAAGAAGGAGAAGAAGCCCCAGAATGCGGCAGACAGTTACT CCTGGGTTCCAGAGCGAGCTGAGAGCAGGGCCATGGAGAACCAGTACAGTCCGACACCT

GGGACAGACTGC (SEQ ID NO: 3)

[0168] Em algumas modalidades, o CD40L humano compreende uma sequência de aminoácidos de:

MIETYNQTSPRSAATGLPISMKIFMYLLTVFLITQMIGSALFAVYLHRRLDKIE DERNLHEDFVFMKTIQRCNTGERSLSLLNCEEIKSQFEGFVKDIMLNKEETKKENSFEM QKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIY

AQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFEL QPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL (SEQ ID NO: 4)

[0169] Em algumas modalidades, CXCL13 humano compreende uma sequência de aminoácidos de:

MKFISTSLLLMLLVSSLSPVQGVLEVYYTSLRCRCVQESSVFIPRRFIDRIQIL

PRGNGCPRKEIIVWKKNKSIVCVDPQAEWIQRMMEVLRKRSSSTLPVPVFKRKIP (SEQ ID N: 5)

[0170] Em algumas modalidades, o CD93 humano compreende uma sequência de aminoácidos de:

MATSMGLLLLLLLLLTQPGAGTGADTEAVVCVGTACYTAHSGKLSAAEAQNHCN QNGGNLATVKSKEEAQHVQRVLAQLLRREAALTARMSKFWIGLQREKGKCLDPSLPLKG FSWVGGGEDTPYSNWHKELRNSCISKRCVSLLLDLSQPLLPSRLPKWSEGPCGSPGSPG SNIEGFVCKFSFKGMCRPLALGGPGQVTYTTPFQTTSSSLEAVPFASAANVACGEGDKD ETQSHYFLCKEKAPDVFDWGSSGPLCVSPKYGCNFNNGGCHQDCFEGGDGSFLCGCRPG FRLLDDLVTCASRNPCSSSPCRGGATCVLGPHGKNYTCRCPQGYQLDSSQLDCVDVDEC QDSPCAQECVNTPGGFRCECWVGYEPGGPGEGACQDVDECALGRSPCAQGCTNTDGSFH CSCEEGYVLAGEDGTQCQDVDECVGPGGPLCDSLCFNTQGSFHCGCLPGWVLAPNGVSC TMGPVSLGPPSGPPDEEDKGEKEGSTVPRAATASPTRGPEGTPKATPTTSRPSLSSDAP ITSAPLKMLAPSGSPGVWREPSIHHATAASGPQEPAGGDSSVATQNNDGTDGQKLLLFY

ILGTVVAILLLLALALGLLVYRKRRAKREEKKEKKPQNAADSYSWVPERAESRAMENQY SPTPGTDC (SEQ ID NO: 6).

[0171] Em algumas modalidades, a proteína é pelo menos, ou cerca de, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% homóloga às sequências fornecidas neste documento. Uma "substituição conservativa de aminoácido" é aquela na qual o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral semelhante. Famílias de resíduos de aminoácidos com cadeias laterais semelhantes foram definidas no estado da técnica. Tais famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais apolares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).

[0172] As moléculas de ácido nucleico heterólogas podem ser introduzidas em células dendríticas por quaisquer técnicas recombinantes conhecidas no estado da técnica, tais como transfecção lipossomal, transfecção química, recombinação de DNA transgênico, infecção viral, inserção de transposon, inserção de gene saltante, microinjeção, eletroporação, penetração de arma de gene e uma combinação das mesmas. Em algumas modalidades, um vetor adenoviral recombinante, um vetor adenoassociado recombinante, um vetor retroviral recombinante, um vetor lentiviral recombinante ou uma combinação dos mesmos podem ser usados para introduzir as moléculas de ácido nucleico heterólogas.

[0173] Em algumas modalidades, métodos para expressar genes desejados - CD40L, CXCL13 e CD93 podem ser usados. Tais métodos incluem a entrega de sistema CRISPR/Cas, TALENs e nucleases de dedo de zinco. Por exemplo, os sistemas TALENs e CRISPR/Cas podem ser usados para inserir elementos reguladores da transcrição específicos a montante e a jusante de um gene nativo. TALENs e CRISPR/Cas9 são capazes de gerar quebras de DNA de fita simples ou dupla em loci específicos.

Isso estimula o reparo direcionado por homologia (HDR) a partir de um molde exógeno, permitindo a inserção precisa de elementos reguladores da transcrição para ativar os genes nativos. Nucleases CRISPR/Cas podem ser entregues usando qualquer vetor de distribuição de gene, como vetor adenoviral, vetor adenoassociado, vetor retroviral, vetor lentiviral ou uma combinação dos mesmos.

[0174] Em algumas modalidades, as DCs geneticamente modificadas divulgadas neste documento podem ser cultivadas em meios nutritivos convencionais sob condições ambientais, tais como temperatura, pH e semelhantes, e são evidentes para os técnicos no assunto.

[0175] Em algumas modalidades, as DCs que superexpressam CD40L, CXCL13 e CD93 podem ser ativadas ou pulsadas por um antígeno. Em algumas modalidades, o antígeno pode ser um antígeno tumoral ou um antígeno viral. Exemplos não limitativos de antígeno tumoral incluem antígeno expresso por uma célula de câncer colorretal, uma célula de câncer de mama, uma célula de câncer de ovário, uma célula de câncer pancreático, uma célula de câncer de cabeça e pescoço, uma célula de câncer de bexiga, uma célula de câncer de fígado, uma célula de câncer renal, uma célula de melanoma, uma célula de câncer gastrointestinal, uma célula de câncer de próstata, uma célula de câncer de pulmão de célula pequena, célula de câncer de pulmão de célula não pequena, uma célula de sarcoma, uma célula de glioblastoma, célula de linfoma de células T e B, um célula de câncer endometrial ou uma célula de câncer cervical.

[0176] Em algumas modalidades, o antígeno pode ser um lisado de células cancerosas (tumor) e o lisado de células cancerosas pode ser alogênico ou autólogo para a célula dendrítica. Em algumas modalidades, o lisado de células cancerígenas pode ser um lisado de células cancerígenas de melanoma, como o lisado de células DDM-1.7, um lisado de células DDM-1.13 ou uma combinação dos mesmos.

[0177] Numerosos métodos de pulsação ou ativação de células dendríticas com antígeno são conhecidos no estado da técnica. Em algumas modalidades, o antígeno pode ser adicionado a células dendríticas cultivadas em condições que promovem a viabilidade das células, e as células têm então tempo suficiente para absorver e processar o antígeno e expressar peptídeos de antígeno na superfície celular em associação com qualquer uma das Classes I ou Classe II de MHC, um período de cerca de 24 horas (de cerca de 18 a cerca de 30 horas, de preferência 24 horas). As células dendríticas também podem ser expostas ao antígeno por transfecção com DNA que codifica o antígeno. O DNA é expresso, e o antígeno é presumivelmente processado pela via citosólica/Classe I.

[0178] Em algumas modalidades, os peptídeos isolados podem ser usados para pulsar ou ativar DCs. O peptídeo é pulsado por qualquer um de uma variedade de métodos, incluindo a incubação do peptídeo com a célula dendrítica, a incubação de uma proteína compreendendo o peptídeo com DC, transdução de DC (ou a população de monócitos expandida progenitor) com um gene que codifica o peptídeo (ou uma proteína que compreende o peptídeo), ou semelhantes.

Antígenos típicos para uso como peptídeos são derivados daqueles expressos em uma célula alvo, como uma célula transformada, uma célula cancerosa, uma célula bacteriana, uma célula infectada por parasitas ou uma célula infectada por vírus ou semelhantes. Exemplos incluem, sem limitação, os carboidratos, como mucina, antígenos tumorais, peptídeos derivados de uma proteína selecionada do grupo que consiste em HIV Gag, HIV Env, HER-2, MART-1, gp-100, PSA, HBVc, HBVs, HPV E6, HPV E7, tirosinase, MAGE-1, trp-1, antígenos micobacterianos e CEA, bem como muitos outros. Antígenos tumorais adequados para a apresentação incluem, sem limitação, c-erb-β-2/HER2/neu, PEM/MUC-1, Int-2, Hst, BRCA- 1, BRCA-2, EGFRvIII truncado, CEA, p53, ras, RK, Myc, Myb, OB-1, OB-2, BCR/ABL, GIP, GSP, RET, ROS, FIS, SRC, TRC, WTI, DCC, NF1, FAP, MEN-1, ERB-B1, antígenos MAGE e imunoglobulinas idiotípicas (por exemplo, de uma célula B de um paciente com linfoma não Hodgkin). A atividade de apresentação de antígeno de células dendríticas pode ser aumentada pela cocultura com certas citocinas, como TNF-α ou IL-1α ou IL-1β.

[0179] As células dendríticas ativadas divulgadas neste documento podem estar presentes em uma composição compreendendo carreadores, excipientes, adjuvantes ou diluentes fisiologicamente aceitáveis. Solução salina tamponada neutra ou solução salina misturada com albumina sérica são exemplos de diluentes apropriados. Os carreadores adequados incluem soluções de injeção estéreis isotônicas aquosas, que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do destinatário pretendido e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão, solubilizantes, agentes espessantes, estabilizadores e conservantes. Em algumas modalidades, a composição pode compreender um antígeno tumoral ou um antígeno viral. Em algumas modalidades, a composição é isenta de qualquer antígeno heterólogo. Em algumas modalidades, a composição compreende uma população de pelo menos cerca de 105 células dendríticas/mL, pelo menos cerca de 106 células/mL, pelo menos cerca de 107 células/mL ou mais.

[0180] Em algumas modalidades, as DCs ativadas podem ser congeladas (criopreservadas) antes da administração a um sujeito. Em algumas modalidades, as DCs ativadas podem ser congeladas suspendendo as células em meio contendo pelo menos 30% de soro e/ou plasma derivados de humanos e diminuindo a temperatura da suspensão para pelo menos -80 °C, congelando assim as DCs. Em algumas modalidades, o meio de congelamento é aproximadamente 30% de soro e/ou plasma derivado de humanos e aproximadamente 10% de um agente que evita a formação de cristais de gelo durante o congelamento, por exemplo, DMSO.

Em uma outra modalidade, a suspensão DC é mantida a -80 °C por pelo menos 24 horas e, em seguida, transferida para nitrogênio líquido durante o armazenamento. Em uma outra modalidade, a suspensão DC é descongelada a uma temperatura na faixa de 34º a 41 °C.

[0181] Também são divulgados neste documento métodos para desenvolver DCs imaturas a partir de monócitos e ativar as DCs imaturas com lisados de células tumorais alogênicas ou autólogas. Em algumas modalidades, o método inclui: (a) isolar monócitos de um sujeito; (b) superexpressão de um ou mais genes selecionados de CD40L, CXCL13 e CD93 nos monócitos isolados; e (c) diferenciar os monócitos que expressam um ou mais genes selecionados de CD40L, CXCL13 e CD93 em células dendríticas imaturas in vitro. Em algumas modalidades, os monócitos são monócitos CD14+. Em algumas modalidades, o método compreende: a diferenciação de monócitos que expressam heterologamente CD40L, CXCL13 e/ou CD93 em células dendríticas imaturas in vitro. Em algumas modalidades, os monócitos são monócitos CD14+. Em algumas modalidades, a célula é uma célula CD34+ que é transduzida e diferenciada ou expandida em um monócito e, em seguida, amadurecida como fornecido neste documento. As diferentes combinações das proteínas expressas de forma heteróloga também são descritas neste documento.

[0182] Em algumas modalidades, os monócitos são obtidos de uma variedade de fontes, como a leucaferese de células mononucleares do sangue periférico de um paciente, seguida pela elutriação do sangue periférico isolado para fornecer monócitos isolados. Os monócitos isolados podem ser geneticamente manipulados para expressar qualquer uma ou combinação das proteínas heterólogas CD40L, CXCL13 e CD93 por técnicas divulgadas neste documento, como transfecção lipossomal, transfecção química, recombinação de DNA transgênico, infecção viral, inserção de transposon, inserção de gene saltante, microinjeção, eletroporação, penetração de arma de gene e uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, um vetor adenoviral recombinante, um vetor adenoassociado recombinante, um vetor retroviral recombinante, um vetor lentiviral recombinante ou uma combinação dos mesmos podem ser usados. Métodos como a distribuição de sistema CRISPR/Cas, TALENs e nucleases de dedo de zinco também podem ser usados para superexpressar qualquer uma ou combinação das proteínas heterólogas CD40L, CXCL13 e CD93.

[0183] Em algumas modalidades, os monócitos recombinantes que expressam CD40L, CXCL13 e, opcionalmente,

CD93, são cultivados na presença de IL-3, fazendo com que os monócitos proliferem, produzindo uma população expandida de monócitos. A população expandida de monócitos é diferenciada em células dendríticas imaturas, por exemplo, por cultura da população expandida de células com GM-CSF e IL-4 (para produzir DCs de linha de base ou Tipo I) e, opcionalmente, TNF-α, IL-1β, IL-6, IFN-α, IFN-γ e PGE2.

[0184] Em algumas modalidades, as células dendríticas imaturas alogênicas recombinantes podem ser ativadas ou pulsadas por um antígeno. Em algumas modalidades, o antígeno pode ser um antígeno tumoral ou um antígeno viral.

Em algumas modalidades, o antígeno pode ser um lisado de células cancerosas e o lisado de células cancerosas pode ser alogênico ou autólogo para a célula dendrítica imatura. Em algumas modalidades, o lisado de células cancerígenas pode ser um lisado de células cancerígenas de melanoma, como o lisado de células DDM-1.7, um lisado de células DDM-1.13 ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, as células não são ativadas ou pulsadas por um antígeno.

[0185] Em algumas modalidades, as DCs imaturas ativadas divulgadas neste documento podem estar presentes em uma composição compreendendo carreadores, excipientes, adjuvantes ou diluentes fisiologicamente aceitáveis. Solução salina tamponada neutra ou solução salina misturada com albumina sérica são exemplos de diluentes apropriados. Em algumas modalidades, as DCs imaturas ativadas podem ser congeladas antes da administração a um sujeito. As células podem ser descongeladas antes de serem administradas ao sujeito.

[0186] Também são fornecidos neste documento métodos de tratamento de câncer em um sujeito. Em algumas modalidades, um método de tratamento de câncer em um sujeito compreende a administração ao sujeito de uma composição compreendendo uma célula dendrítica recombinante, em que a célula dendrítica expressa de forma heteróloga uma ou mais proteínas selecionadas de CD40L, CXCL13 e, opcionalmente, CD93. Conforme descrito neste documento, as células podem ser alogênicas para o sujeito. As células, em algumas modalidades, podem ser autólogas para o sujeito.

[0187] Em algumas modalidades, um método de induzir resposta imune em um sujeito que sofre de câncer compreende a administração ao sujeito de uma composição compreendendo uma célula dendrítica, em que a célula dendrítica expressa heterologamente uma ou mais proteínas selecionadas de CD40L, CXCL13 e, opcionalmente, CD93. Em algumas modalidades, as DCs expressam heterologicamente CD40L e CXCL13. Em algumas modalidades, as DCs expressam heterologicamente CD40L, CXCL13 e CD93. Em algumas modalidades, as DCs expressam heterologicamente CD40L e CD93. Em algumas modalidades, as DCs expressam heterologicamente CXCL13 e CD93. Em algumas modalidades, as DCs não expressam CD93 de forma heteróloga.

[0188] Em algumas modalidades, um método de fornecimento de vacina contra o câncer a um sujeito que sofre de câncer compreende a administração ao sujeito de uma composição compreendendo uma célula dendrítica, em que a célula dendrítica expressa de forma heteróloga uma ou mais proteínas selecionadas de CD40L, CXCL13 e, opcionalmente, CD93. Em algumas modalidades, as DCs expressam heterologicamente CD40L e CXCL13. Em algumas modalidades, as DCs expressam heterologicamente CD40L, CXCL13 e CD93. Em algumas modalidades, as DCs expressam heterologicamente CD40L e CD93. Em algumas modalidades, as DCs expressam heterologicamente CXCL13 e CD93. Em algumas modalidades, as DCs não expressam CD93 de forma heteróloga.

[0189] Em algumas modalidades, as células dendríticas (expressando heterologicamente CD40L, CXCL13 e/ou CD93) administradas são alogênicas ao sujeito. Em algumas modalidades, as células dendríticas (heterologicamente CD40L, CXCL13 e/ou CD93) administradas são autólogas ao sujeito. Em algumas modalidades, as células dendríticas administradas são células dendríticas imaturas que expressam de maneira heteróloga CD40L, CXCL13 e/ou CD93.

Em algumas modalidades, as DCs expressam heterologicamente CD40L e CXCL13. Em algumas modalidades, as DCs expressam heterologicamente CD40L, CXCL13 e CD93. Em algumas modalidades, as DCs expressam heterologicamente CD40L e CD93. Em algumas modalidades, as DCs expressam heterologicamente CXCL13 e CD93. Em algumas modalidades, as DCs não expressam CD93 de forma heteróloga.

[0190] Em algumas modalidades, o sujeito sofre de um câncer selecionado do grupo que consiste em carcinoma de cólon, câncer de mama, câncer de pâncreas, câncer de ovário, câncer de próstata, fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcoma osteogênico, cordoma, angiossarcoma, endoteliossarcoma, linfangiossarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basais, adenocarcinoma, carcinoma da glândula sudorípara, carcinoma de glândula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogênico, carcinoma de células renais, hepatoma, carcinoma do ducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionário, tumor de Wilms, câncer cervical, tumor testicular, carcinoma de pulmão, carcinoma de pulmão de células pequenas, carcinoma de bexiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, carcinoma de células de merkel, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia crônica, policitemia vera, linfoma, mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom, doença de cadeia pesada e suas combinações.

[0191] Em modalidades adicionais, o câncer é um tumor sólido selecionado do grupo consistindo em fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, osteossarcoma, e outros sarcomas, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, carcinoma de cólon, neoplasia maligna linfoide, câncer de pâncreas, câncer de mama, cânceres pulmonares, câncer ovariano, câncer de próstata, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basais, adenocarcinoma, carcinoma das glândulas sudoríparas, carcinoma medular de tireoide, carcinoma papilar de tireoide, feocromocitomas, carcinoma de glândulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, carcinoma medular, carcinoma broncogênico, carcinoma de células renais, hepatoma, carcinoma do duto biliar, coriocarcinoma, tumor de Wilms, câncer do colo do útero, tumor testicular, seminoma,

carcinoma de bexiga, melanoma, e tumores do SNC (tais como, um glioma (tal como glioma do tronco encefálico e gliomas mistos), glioblastoma (também conhecido como glioblastoma multiforme), astrocitoma, linfoma do SNC, germinoma, meduloblastoma, Schwannoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, neuroblastoma, retinoblastoma e metástases cerebrais.

[0192] Em modalidades adicionais, o método compreende ainda num período de 4-14 dias após a administração das células dendríticas recombinantes, administrar, ao paciente, um inibidor de checkpoint imunológico, incluindo qualquer um ou uma combinação de dois inibidores de checkpoint, incluindo um inibidor de PD-1 ou PD-L1 (B7-H1), tal como um anticorpo anti-PD-1, incluindo nivolumabe (Nivolumabe da Bristol-Myers Squibb), pembrolizumabe/lambrolizumabe, também conhecido como MK-3475 (Keytruda da Merck), pidilizumabe (Curetech), AMP-224 (Amplimmune), ou um anticorpo anti-PD-L1, incluindo MPDL3280A (Roche), MDX-1105 (Bristol Myer Squibb), MEDI-4736 (AstraZeneca) e MSB-0010718 C (Merck), um antagonista de CTLA-4, tal como um anticorpo anti-CTLA-4, incluindo o anticorpo anti-CTLA4 YervoyTM (ipilimumabe, Bristol-Myers Squibb), tremelimumabe (Pfizer), Ticilimumabe (AstraZeneca)

ou AMGP-224 (Glaxo Smith Kline), ou um anticorpo tumor- específico trastuzumabe (Herceptin) para câncer de mama, rituximabe (Rituxan) para linfoma, ou cetuximabe (Erbitux).

[0193] Em modalidades adicionais, o tratamento, a administração ou o aumento da resposta imune é repetido periodicamente por períodos de tempo, como aqueles nos Exemplos 1-3, enquanto o paciente exibir melhora ou doença estável/não progressiva.

[0194] Em modalidades adicionais, o tratamento, a administração ou o aumento da resposta imune são repetidos periodicamente por períodos de uma vez a cada 5 dias, uma vez por semana, uma vez a cada 14 dias, uma vez a cada 21 dias, a uma vez por mês, a uma vez a cada dois meses, a uma vez a cada 3 meses, a uma vez a cada 4 meses, a uma vez a cada 5 meses, a uma vez a cada 6 meses, ou uma vez a cada 7 meses, ou uma vez a cada 8 meses, ou uma vez a cada 9 meses, ou uma vez a cada 10 meses, ou uma vez a cada 11 meses, ou uma vez por ano como tratamento de manutenção, enquanto o paciente apresentar melhora ou doença estável/não progressiva.

[0195] Em algumas modalidades, as células dendríticas recombinantes (heterologicamente CD40L, CXCL13 e/ou CD93) administradas ao sujeito não são ativadas ou pulsadas com um antígeno antes da administração. Em algumas modalidades, as células dendríticas podem ser administradas em uma composição que compreende adjuvantes, citocinas e interleucinas que podem ajudar a induzir a resposta imune.

Em algumas modalidades, as DCs expressam heterologicamente CD40L e CXCL13. Em algumas modalidades, as DCs expressam heterologicamente CD40L, CXCL13 e CD93. Em algumas modalidades, as DCs expressam heterologicamente CD40L e CD93. Em algumas modalidades, as DCs expressam heterologicamente CXCL13 e CD93. Em algumas modalidades, as DCs não expressam CD93 de forma heteróloga.

[0196] Em algumas modalidades, o método compreende ainda: (a) obter um perfil de expressão de proteína de um tumor ressecado ou amostra de biópsia do sujeito; (b) comparar o perfil de expressão de proteína do tumor ressecado ou amostra de biópsia com o perfil de expressão de proteína de um lisado de células de melanoma; e (c) se pelo menos três marcadores no perfil de expressão de proteína do tumor ressecado ou amostra de biópsia corresponderem ao perfil de expressão de proteína do lisado de células de melanoma, em seguida, cocultura da célula dendrítica superexpressando CD40L, CXCL13 e, opcionalmente, CD93 com o lisado de células de melanoma para ativar a célula dendrítica e administrar ao sujeito uma composição compreendendo a célula dendrítica ativada; e

(d) se pelo menos três marcadores no perfil de expressão de proteína do tumor ressecado ou amostra de biópsia não corresponderem ao perfil de expressão de proteína do lisado de células de melanoma, então a cocultura da célula dendrítica superexpressando CD40L, CXCL13 e, opcionalmente, CD93 com o tumor ou amostra de biópsia para ativar a célula dendrítica e administrar ao sujeito uma composição compreendendo a célula dendrítica ativada.

Em algumas modalidades, os métodos fornecidos neste documento compreendem ainda, a triagem de um perfil de expressão de proteína de um tumor ressecado ou amostra de biópsia do sujeito para corresponder a um perfil de expressão de proteína de um lisado de tumor alogênico antes da administração; e administrar uma célula dendrítica ativada de lisado de tumor alogênico ou composição de células dendríticas ativadas se pelo menos três fragmentos do perfil de expressão de proteína do tumor ressecado ou amostra de biópsia corresponderem ao perfil de expressão de proteína do lisado de tumor alogênico. Tal como utilizado neste documento, o termo "corresponde" refere-se à comparação do perfil de expressão de proteína de uma amostra contra outra, tal como o lisado de tumor em comparação com a biópsia ou amostra de tumor ressecada. Se for encontrado um fragmento de proteína tanto no lisado como na amostra, diz-se que corresponde.

[0197] Em algumas modalidades do método descrito acima, as DCs expressam heterologicamente CD40L e CXCL13. Em algumas modalidades, as DCs expressam heterologicamente CD40L, CXCL13 e CD93. Em algumas modalidades, as DCs expressam heterologicamente CD40L e CD93. Em algumas modalidades, as DCs expressam heterologicamente CXCL13 e CD93. Em algumas modalidades, as DCs não expressam CD93 de forma heteróloga.

[0198] Em algumas modalidades, o perfil de expressão de proteína é medido ou comparado por técnicas bem conhecidas no estado da técnica, como matrizes de proteínas, proteômica, espectroscopia de massa (MALDI-MS) e semelhantes. Em algumas modalidades, o perfil de expressão de gene pode ser usado no lugar do perfil de expressão de proteína para comparação. O perfil de expressão gênica pode ser obtido usando técnicas bem conhecidas no estado da técnica, tais como matrizes de genes, microarranjo, RT-PCR e semelhantes.

[0199] Em algumas modalidades, os marcadores que são comparados entre o perfil de expressão de proteína do tumor ressecado ou amostra de biópsia e o perfil de expressão de proteína do lisado de células de melanoma são antígenos MAGE.

Ver, por exemplo, Scanlan, Matthew J. et al., Immunological Revs. 2002, 188:22-32 and Weon JL, Potts PR. The MAGE protein family and cancer. Curr Opin Cell Biol. 2015;37:1–8.

doi:10.1016/j.ceb.2015.08.002, cada um dos quais é incorporado por referência em sua totalidade.

[0200] Em algumas modalidades, o lisado de células de melanoma é derivado de uma linhagem celular selecionada a partir do grupo que consiste em DDM-1.7, DDM-1.13 ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o lisado de células de melanoma é o lisado de tumor MCV, ou um que corresponde a alguma porção do perfil de expressão do lisado tumoral MCV.

[0201] Em algumas modalidades, a via de administração é via injeção intratumoral, peritumoral, intradérmica, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal. As composições são administradas para estimular uma resposta imune e podem ser administradas por injeção em bolus, infusão contínua, liberação sustentada de implantes ou outra técnica adequada.

[0202] Apenas para fins de ilustração, o método pode ser praticado obtendo e salvando amostras de sangue do sujeito antes da infusão para análise e comparação subsequentes. Geralmente, pelo menos cerca de 104 a 106 e tipicamente, entre 1 × 108 e 1× 1010 células são infundidas por via intravenosa ou intraperitoneal em um paciente de 70 kg ao longo de cerca de 60-120 minutos.

[0203] Em alguns aspectos, qualquer um dos métodos de tratamento descritos neste documento pode compreender ainda a administração de uma ou mais terapias anticâncer adicionais ao indivíduo. Várias classes de agentes anticâncer podem ser usadas. Exemplos não limitativos incluem: terapia de radiação, agentes alquilantes (por exemplo, cisplatina, carboplatina ou oxaliplatina), antimetabólitos (por exemplo, azatioprina ou mercaptopurina), antraciclinas, alcaloides vegetais (incluindo, por exemplo, alcaloides de vinca (tais como vincristina, vinblastina, vinorelbina, ou vindesina) e taxanos (como paclitaxel, taxol ou docetaxel)), inibidores da topoisomerase (por exemplo, camptotecinas, irinotecano, topotecano, amsacrina, etoposídeo, fosfato de etoposídeo ou teniposídeo), podofilotoxina (e seus derivados, como etoposídeo e teniposídeo), anticorpos (por exemplo, monoclonal ou policlonal), inibidores de tirosina quinase (por exemplo, mesilato de imatinibe (Gleevec® ou Glivec®)), tratamentos hormonais, receptores solúveis e outros antineoplásicos (por exemplo, dactinomicina, doxorrubicina, epirrubicina, bleomicina, mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucil ou ifosfamida).

[0204] Além disso, em algumas modalidades, as células e composições fornecidas neste documento podem ser usadas como adjuvantes a, ou com, outros agentes ou tratamentos com propriedades anticâncer (Ver Patente US N°.

9,914,783, que é incorporada neste documento por referência em sua totalidade). Quando usados como adjuvante, as DCs recombinantes e composições relacionadas e outro (s) agente (s) podem ser formulados juntos em uma única formulação farmacêutica de combinação ou podem ser formulados e administrados separadamente, seja em um único regime de dosagem coordenada ou em diferentes regimes de dosagem. Os agentes administrados adjuvantes a ou com as DCs recombinantes e composições relacionadas terão tipicamente atividades complementares às DCs recombinantes e composições relacionadas, de modo que as células e outros agentes não se afetem adversamente.

[0205] Os agentes que podem ser usados em conjunto com os anticorpos anti-PD-1 incluem, sem limitação, agentes alquilantes, inibidores de angiogênese, anticorpos, antimetabólitos, antimitóticos, antiproliferativos, antivirais, inibidores da aurora quinase, promotores da apoptose (por exemplo, inibidores da família Bcl-2), ativadores da via do receptor de morte, inibidores de quinase Bcr-Abl, anticorpos BiTE (engatador de células T biespecífico), conjugados de drogas de anticorpos, modificadores de resposta biológica, inibidores de tirosina quinase de Bruton (BTK), inibidores de quinase dependentes de ciclina, inibidores do ciclo celular, inibidores da ciclooxigenase-2, DVDs, inibidores do receptor do homólogo do oncogene viral da leucemia (ErbB2), inibidores do fator de crescimento, inibidores da proteína de choque térmico (HSP) -90, inibidores da histona desacetilase (HDAC), terapias hormonais, imunológicos, inibidores de inibidores de proteínas de apoptose (IAPs), antibióticos intercalantes, inibidores de quinase, inibidores de cinesina, inibidores de Jak2, alvo de mamíferos de inibidores de rapamicina, microRNAs, inibidores de quinase regulados por sinal extracelular ativados por mitogênio, proteínas de ligação multivalentes, drogas anti-inflamatórias não esteroidais (NSAIDs), inibidores de poli ADP (difosfato de adenosina)- ribose polimerase (PARP), quimioterápicos de platina, inibidores de polo-like quinase (Plk), inibidores de fosfoinositídeo-3 quinase (PI3K), inibidores de proteassoma, análogos de purina, análogos de pirimidina, inibidores de receptor de tirosina quinase, retinoides/deltoides alcaloides vegetais, pequenos ácidos ribonucleicos inibitórios (siRNAs), inibidores de topoisomerase, inibidores de ubiquitina ligase , e semelhantes, bem como combinações de um ou mais desses agentes.

[0206] Os anticorpos BiTE são anticorpos biespecíficos que direcionam as células T para atacar as células cancerosas, ligando simultaneamente as duas células.

A célula T então ataca a célula cancerosa alvo. Exemplos de anticorpos BiTE incluem adecatumumab (Micromet MT201), blinatumomab (Micromet MT103) e semelhantes. Sem estar limitado pela teoria, um dos mecanismos pelos quais as células T induzem apoptose da célula cancerosa alvo é por exocitose dos componentes dos grânulos citolíticos, que incluem perforina e granzima B.

[0207] Os siRNAs são moléculas com bases de RNA endógenas ou nucleotídeos quimicamente modificados. As modificações não abolem a atividade celular, mas, ao contrário, conferem estabilidade aumentada e/ou potência celular aumentada. Exemplos de modificações químicas incluem grupos fosforotioato, 2'-desoxinucleotídeo, ribonucleotídeos contendo 2'-OCH.sub.3, 2'-F- ribonucleotídeos, 2'-metoxietil ribonucleotídeos, combinações dos mesmos e semelhantes. O siRNA pode ter comprimentos variados (por exemplo, 10-200 bps) e estruturas (por exemplo, em forma de gancho, fitas simples/duplas, protuberâncias, cortes/lacunas, incompatibilidades) e são processados em células para fornecer silenciamento de gene ativo. Um siRNA de fita dupla (dsRNA) pode ter o mesmo número de nucleotídeos em cada fita (extremidades cegas) ou extremidades assimétricas (saliências). A saliência de 1-2 nucleotídeos pode estar presente na fita sense e/ou antisense, bem como nas extremidades 5' e/ou 3' de uma dada fita.

[0208] As proteínas de ligação multivalentes são proteínas de ligação que compreendem dois ou mais sítios de ligação ao antígeno. As proteínas de ligação multivalentes são projetadas para ter os três ou mais sítios de ligação ao antígeno e geralmente não são anticorpos de ocorrência natural. O termo "proteína de ligação multiespecífica" significa uma proteína de ligação capaz de se ligar a dois ou mais alvos relacionados ou não relacionados. As proteínas de ligação de domínio variável duplo (DVD) são proteínas de ligação a proteínas tetravalentes ou multivalentes que compreendem dois ou mais sítios de ligação ao antígeno. Esses DVDs podem ser monoespecíficos (ou seja, capazes de se ligar a um antígeno) ou multiespecíficos (ou seja, capazes de se ligar a dois ou mais antígenos). As proteínas de ligação DVD compreendendo dois polipeptídeos de DVD de cadeia pesada e dois polipeptídeos de DVD de cadeia leve são referidas como DVD Ig's. Cada metade de um DVD Ig compreende um polipeptídeo de DVD de cadeia pesada, um polipeptídeo de DVD de cadeia leve e dois sítios de ligação ao antígeno. Cada sítio de ligação compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve com um total de 6 CDRs envolvidos na ligação ao antígeno por sítio de ligação ao antígeno.

[0209] Os agentes alquilantes incluem, sem limitação, altretamina, AMD-473, AP-5280, apaziquona, bendamustina, brostallicina, busulfano, carboquona, carmustina (BCNU), clorambucil, CLORETAZINE® (laromustina, VNP 40101M), ciclofosfamida, dacarbazina, estramustina, fotemustina, glufosfamida, ifosfamida, KW-2170, lomustina (CCNU), mafosfamida, melfalano, mitobronitol, mitolactol, nimustina, nitrogênio mostarda N-óxido, ranimustina, temozolomida, tiotepa, TREANDA® (bendamustina), treosulfano e trofosfamida.

[0210] Os inibidores de angiogênese incluem, sem limitação, inibidores do receptor tirosina quinase específico do endotélio (Tie-2), inibidores do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), inibidores do receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), inibidores do ligante tipo delta 4 (DLL4), inibidores do receptor do fator de crescimento da insulina-2 (IGFR-2), inibidores da metaloproteinase-2 (MMP-2) da matriz, inibidores da metaloproteinase-9 (MMP-9) da matriz, inibidores do receptor do fator de crescimento derivado das plaquetas (PDGFR), análogos da trombospondina e inibidores do receptor tirosina quinase do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR).

[0211] Os conjugados de anticorpo e droga incluem, sem limitação, aqueles que têm como alvo a c-Met quinase (por exemplo, ADCs descritos na Pat. US Nº 7,615,529), LRRC15, CD30 (por exemplo, ADCETRIS® (brentuximabe vedotin)), CS1 (por exemplo, ADCs descritos na publicação US Nº 20160122430), DLL3 (por exemplo, rovalpituzumabe tesirina (ROVA-T)), HER2 (por exemplo, KADCYLA® (trastuzumabe emtansina)), EGFR (por exemplo, ADCs descritos na publicação US Nº 20150337042) e receptor de prolactina (por exemplo, ADCs descritos na publicação US Nº 20140227294).

[0212] Os antimetabólitos incluem, sem limitação, ALIMTA® (pemetrexed dissódico, LY231514, MTA), 5- azacitidina, XELODA® (capecitabina), carmofur, LEUSTAT® (cladribina), clofarabina, citarabina, citarabina ocfinosida, citosina arabinosídea, decitabina, deferoxamina, doxifluridina, eflornitina, EICAR (5-etinil-1-.beta.-D- ribofuranosilimidazol-4-carboxamida), enocitabina, etnilcitidina, fludarabina, 5-fluorouracil sozinho ou em combinação com leucovorina, GEMZAR® (gencitabina), hidroxiureia, ALKERAN® (melfalan), mercaptopurina, 6- mercaptopurina ribosídeo, metotrexato, ácido micofenólico, nelarabina, nolatrexed, ocfosfato, pelitrexol, pentostatina,

raltitrexedo, ribavirina, triapina, trimetrexato, S-1, tiazofurina, tegafur, TS-1, vidarabina e UFT.

[0213] Os antivirais incluem, sem limitação, ritonavir, aciclovir, cidofovir, ganciclovir, foscarnet, zidovudina, ribavirina e hidroxicloroquina.

[0214] Os inibidores de Aurora quinase incluem, sem limitação, ABT-348, AZD-1152, MLN-8054, VX-680, inibidores de quinase específicos de Aurora A, inibidores de quinase específicos de Aurora B e inibidores de quinase pan-Aurora.

[0215] Os inibidores da proteína Bcl-2 incluem, sem limitação, ABT-263 (navitoclax), AT-101 ((-) gossipol), GENASENSE® (G3139 ou oblimersen (oligonucleotídeo antisense direcionado a Bcl-2)), IPI-194, IPI-565, N-(4-(4-((4'- cloro(1,1'-bifenil)-2-il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-- (((1R)-3-(dimetilamino)-1- ((fenilsulfanil)metil)propil)amino)-3- nitrobenzenosulfonamida), N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)-5,5- dimetil-1-ciclohex-1-en-1-il)metil)piperazin-1-il)benzoil)- 4-(((1R)-3-(morfolin-4-il)-1-((fenilsulfanil)metil- )propil)amino)-3- ((trifluorometil)sulfonil)benzenossulfonamida, venetoclax e GX-070 (obatoclax).

[0216] Os inibidores da quinase Bcr-Abl incluem, sem limitação, DASATINIB® (BMS-354825) e GLEEVEC® (imatinib).

[0217] Os inibidores de BTK incluem, sem limitação, ibrutinibe e acalabrutinibe.

[0218] Os inibidores de CDK incluem, sem limitação, AZD-5438, BMI-1040, BMS-032, BMS-387, CVT-2584, flavopiridol, GPC-286199, MCS-5A, PD0332991, PHA-690509, seliciclib (CYC- 202, R-roscovitina), abemaciclibe, palbociclib. e ZK-304709.

[0219] Os inibidores de COX-2 incluem, sem limitação, ABT-963, ARCOXIA® (etoricoxib), BEXTRA® (valdecoxib), BMS347070, CELEBREX® (celecoxib), COX-189 (lumiracoxib), CT-3, DERAMAXX® (deracoxib), JTE-522, 4- metil-2-(3,4-dimetilfenil)-1-(4-sulfamoilfenil-1H-pirrol)-, MK-663 (etoricoxib), NS-398, parecoxib, RS-57067, SC-58125, SD-8381, SVT-2016, S-2474, T-614 e VIOXX® (rofecoxib).

[0220] Os inibidores de EGFR incluem, sem limitação, ABX-EGF, imunolipossomas anti-EGFR, vacina EGF, EMD-7200, ERBITUX® (cetuximabe), HR3, anticorpos IgA, IRESSA® (gefitinibe), TARCEVA® (erlotinibe ou OSI -774), TAGRISSO® (osimertinib), TP-38, proteína de fusão EGFR e TYKERB® (lapatinib).

[0221] Os inibidores do receptor ErbB2 incluem, sem limitação, CP-724-714, CI-1033 (canertinibe), HERCEPTIN® (trastuzumabe), TYKERB® (lapatinibe), OMNITARG® (2C4, pertuzumabe), TAK-165, GW- 572016 (ionafarnib), GW-282974,

EKB-569, PI-166, dHER2 (vacina HER2), APC-8024 (vacina HER- 2), anticorpo biespecífico anti-HER/2neu, B7.her2IgG3, anticorpos biespecíficos AS HER2 trifuncionais, mAB AR-209 e mAB 2B-1.

[0222] Os inibidores da histona desacetilase incluem, sem limitação, depsipeptídeo, LAQ-824, MS-275, trapoxina, ácido suberoilanilida hidroxâmico (SAHA), TSA e ácido valproico.

[0223] Os inibidores de HSP-90 incluem, sem limitação, 17-AAG-nab, 17-AAG, CNF-101, CNF-1010, CNF-2024, 17-DMAG, geldanamicina, IPI-504, KOS-953, MYCOGRAB® (anticorpo recombinante humano para HSP-90), NCS-683664, PU24FCl, PU-3, radicicol, SNX-2112, STA-9090 e VER49009.

[0224] Os inibidores de proteínas de apoptose incluem, sem limitação, HGS1029, GDC-0145, GDC-0152, LCL-161 e LBW-242.

[0225] Os ativadores da via do receptor de morte incluem, sem limitação, TRAIL, anticorpos ou outros agentes que têm como alvo TRAIL ou receptores de morte (por exemplo, DR4 e DR5), como Apomab, conatumumab, ETR2-ST01, GDC0145 (lexatumumab), HGS-1029, LBY-135, PRO-1762 e trastuzumabe.

[0226] Os inibidores de cinesina incluem, sem limitação, inibidores de Eg5, tais como AZD4877, ARRY-520; e inibidores CENPE, tais como GSK923295A.

[0227] Os inibidores de JAK-2 incluem, sem limitação, CEP-701 (lesaurtinib), XL019 e INCB018424.

[0228] Os inibidores de MEK incluem, sem limitação, ARRY-142886, ARRY-438162, PD-325901 e PD-98059.

[0229] Os inibidores de mTOR incluem, sem limitação, AP-23573, CCI-779, everolimus, RAD-001, rapamicina, temsirolimus, inibidores TORC1/TORC2 competitivos de ATP, incluindo PI-103, PP242, PP30 e Torin 1.

[0230] As drogas anti-inflamatórias não esteroidais incluem, sem limitação, AMIGESIC® (salsalato), DOLOBID® (diflunisal), MOTRIN® (ibuprofeno), ORUDIS® (cetoprofeno), RELAFEN® (nabumetona), FELDENE® (piroxicam), creme de ibuprofeno, ALEVE® (naproxeno) e NAPROSYN® (naproxeno), VOLTAREN® (diclofenaco), INDOCIN® (indometacina), CLINORIL® (sulindac), TOLECTIN® (tolmetina), LODINE® (etodolac), TORADOL® (cetorolac) e DAYPRO® (oxaprozina).

[0231] Os inibidores de PDGFR incluem, sem limitação, C-451, CP-673 e CP-868596.

[0232] Os quimioterápicos de platina incluem, sem limitação, cisplatina, ELOXATIN® (oxaliplatina) eptaplatina, lobaplatina, nedaplatina, PARAPLATIN® (carboplatina), satraplatina e picoplatina.

[0233] Os inibidores da quinase do tipo Polo incluem, sem limitação, BI-2536.

[0234] Os inibidores da fosfoinositida-3 quinase (PI3K) incluem, sem limitação, wortmanina, LY294002, XL-147, CAL-120, ONC-21, AEZS-127, ETP-45658, PX-866, GDC-0941, BGT226, BEZ235 e XL765.

[0235] Os análogos da trombospondina incluem, sem limitação, ABT-510, ABT-567, ABT-898 e TSP-1.

[0236] Os inibidores de VEGFR incluem, sem limitação, ABT-869, AEE-788, ANGIOZYME ™ (uma ribozima que inibe a angiogênese (Ribozyme Pharmaceuticals (Boulder, Colorado) e Chiron (Emeryville, Calif.)), Axitinibe (AG- 13736), AZD-2171, CP-547.632, CYRAMZA® (ramucirumabe), IM- 862, MACUGEN® (pegaptamibe), NEXAVAR® (sorafenibe, BAY43- 9006), pazopanibe (GW-786034), vatalanibe (PTK-787, ZK - 222584), SUTENT® (sunitinibe, SU-11248), STIVARGA® (regorafenibe), VEGF trap e ZACTIMA ™ (vandetanibe, ZD- 6474).

[0237] Os antibióticos incluem, sem limitação, antibióticos intercalantes aclarubicina, actinomicina D, amrubicina, anamicina, adriamicina, BLENOXANE® (bleomicina), daunorrubicina, CAELYX® ou MYOCET® (doxorrubicina lipossomal), elsamitrinucina, epirbucina, glarbuicina, ZAVEDOS® (idarubicina), mitomicina C, nemorrubicina, neocarzinostatina, peplomicina, pirarrubicina, rebeccamicina, stimalamer, estreptozocina, VALSTAR®

(valrubicina) e zinostatina.

[0238] Os inibidores da topoisomerase incluem, sem limitação, aclarubicina, 9-aminocamptotecina, amonafida, amsacrina, becatecarina, belotecano, BN-80915, CAMPTOSAR® (cloridrato de irinotecano), camptotecina, CARDIOXANE® (dexrazoxina), diflomotecano, edotecarina, ELLENCE® ou PHARMORUBICIN® (epirrubicina), etoposídeo, exatecano, 10- hidroxicamptotecina, gimatecan, lurtotecan, mitoxantrona, Onivyde ™ (irinotecano lipossomal), oratecina, pirarbucina, pixantrona, rubitecano, sobuzoxano, SN-38, tafluposídeo e topotecano.

[0239] Os anticorpos incluem, sem limitação, AVASTIN® (bevacizumabe), anticorpos específicos de CD40, chTNT-1/B, denosumabe, ERBITUX® (cetuximabe), HUMAX-CD4® (zanolimumabe), anticorpos específicos de IGF1R, lintuzumabe, anticorpos específicos de OX-40, PANOREX® (edrecolomabe), RENCAREX® (WX G250), RITUXAN® (rituximabe), ticilimumabe, trastuzumabe, pertuzumabe, VECTIBIX® (panitumumabe) e anticorpos CD20 tipos I e II.

[0240] As terapias hormonais incluem, sem limitação, ARIMIDEX® (anastrozol), AROMASIN® (exemestano), arzoxifeno, CASODEX® (bicalutamida), CETROTIDE® (cetrorelix), degarrelix, deslorelina, DESOPAN® (trilostano), dexametasona, DROGENIL® (flutamida), EVISTA® (raloxifeno),

AFEMA™ (fadrozol), FARESTON® (toremifeno), FASLODEX® (fulvestrante), FEMARA® (letrozol), formestano, glicocorticoides, HECTOROL® (doxercalciferol), RENAGEL® (carbonato de sevelâmero), lasofoxifeno, acetato de leuprolida, MEGACE® (megesterol), MIFEPREX® (mifepristona), NILANDRON™ (nilutamida), NOLVADEX® (citrato de tamoxifeno), PLENAXIS™ (abarelix), prednisona, PROPECIA® (finasterida), rilostano, SUPREFACT® (buserelina), TRELSTAR® (hormônio liberador de hormônio luteinizante (LHRH)), VANTAS® (implante de Histrelina), VETORYL® (trilostano ou modrastano) e ZOLADEX® (fosrelina, goserelina).

[0241] Deltoides e retinoides incluem, sem limitação, seocalcitol (EB1089, CB1093), lexacalcitrol (KH1060), fenretinida, PANRETIN® (aliretinoína), ATRAGEN® (tretinoína lipossomal), TARGRETIN® (bexaroteno) e LGD-1550.

[0242] Os inibidores de PARP incluem, sem limitação, ABT-888 (veliparibe), KU-59436, AZD-2281 (olaparibe), AG- 014699 (rucaparibe), MK4827 (niraparibe), BMN-673 (talazoparibe), iniparibe, BSI -201, BGP-15, INO-1001 e ONO-

2231.

[0243] Alcaloides vegetais incluem, sem limitação, vincristina, vinblastina, vindesina e vinorelbina.

[0244] Os inibidores de proteassoma incluem, sem limitação, VELCADE® (bortezomibe), KYPROLIS® (carfilzomib),

MG132, NPI-0052 e PR-171.

[0245] Exemplos de imunológicos incluem, sem limitação, interferons, inibidores de checkpoint imunológico, agentes coestimuladores e outros agentes de aumento da imunidade. Os interferons incluem interferon alfa, interferon alfa-2a, interferon alfa-2b, interferon beta, interferon gama-1a, ACTIMMUNE® (interferon gama-1b) ou interferon gama-n1, suas combinações e semelhantes. Os inibidores de checkpoint imunológico incluem anticorpos que têm como alvo PD-L1 (por exemplo, durvalumabe, atezolizumabe, avelumabe, MEDI4736, MSB0010718C e MPDL3280A) e CTLA4 (antígeno linfocitário citotóxico 4; por exemplo, ipilimumabe, tremelimumabe). Os agentes coestimuladores incluem, sem limitação, anticorpos contra CD3, CD40, CD40L, CD27, CD28, CSF1R, CD137 (por exemplo, urelumab), B7H1, GITR, ICOS, CD80, CD86, OX40, OX40L, CD70, HLA -DR, LIGHT, LIGHT- R, TIM3, A2AR, NKG2A, KIR (por exemplo, lirilumab), TGF- .beta. (por exemplo, fresolimumabe) e suas combinações.

[0246] Outros agentes incluem, sem limitação, ALFAFERONE® (IFN-.alpha.), BAM-002 (glutationa oxidada), BEROMUN® (tasonermina), BEXXAR® (tositumomabe), CAMPATH® (alemtuzumabe), dacarbazina, denileucina, epratuzumabe, GRANOCYTE® (lenograstim), lentinano, alfa interferon de leucócito, imiquimod, vacina de melanoma, mitumomabe,

molgramostim, MYLOTARG ™ (gemtuzumabe ozogamicina), NEUPOGEN® (filgrastim), OncoVAC-CL, OVAREX® (oregovomabe), pemtumomabe (Y-muHMFG1), PROVENGE® (sipuleucel-T), sargaramostim, sizofilan, teceleucina, THERACYS® (Bacillus Calmette-Guerin), ubenimex, VIRULIZIN® (imunoterápico, Lorus Pharmaceuticals) Z-100 (Substância Específica de Maruyama (SSM)), WF-10 (tetraclorodecaóxido (TCDO)), PROLEUKIN® (aldesleucina), ZADAXIN® (timalfasina), ZINBRYTA® (processo de alto rendimento de daclizumabe) e ZEVALIN® (.sup.90Y- Ibritumomabe tiuxetano).

[0247] Modificadores de resposta biológica são agentes que modificam os mecanismos de defesa de organismos vivos ou respostas biológicas, tais como sobrevivência, crescimento ou diferenciação de células de tecido para direcioná-los para ter atividade antitumoral e incluem, sem limitação, krestin, lentinan, sizofiran, picibanil PF- 3512676 (CpG-8954) e ubenimex.

[0248] Análogos de pirimidina incluem, sem limitação, citarabina (ara C ou Arabinósido C), citosina arabinósido, doxifluridina, FLUDARA® (fludarabina), 5-FU (5- fluorouracil), floxuridina, GEMZAR® (gemcitabina), TOMUDEX® (ratitrexed) e TROXATYL ™ (triacetiluridina troxacitabina).

[0249] Os análogos de purina incluem, sem limitação, LANVIS® (tioguanina) e PURINETHOL® (mercaptopurina).

[0250] Os agentes antimitóticos incluem, sem limitação, batabulina, epotilona D (KOS-862), N-(2((4- hidroxifenil)amino)piridin-3-il)-4- metoxibenzenossulfonamida, ixabepilona (BMS 247550), TAXOL® (paclitaxel), TAXOTERE® (docetaxel), PNU100940 (109881), patupilona, XRP-9881 (larotaxel), vinflunina e ZK-EPO (epotilona sintética).

[0251] Os inibidores da ubiquitina ligase incluem, sem limitação, inibidores de MDM2, como nutlins, e inibidores de NEDD8, como MLN4924.

[0252] As DCs recombinantes e composições relacionadas também podem ser usadas para aumentar a eficácia da terapia de radiação. Exemplos de radioterapia incluem radioterapia de feixe externo, radioterapia interna (isto é, braquiterapia) e radioterapia sistêmica.

[0253] As DCs recombinantes e composições relacionadas podem ser administradas adjuvantes a ou com outros agentes quimioterapêuticos, tais como ABRAXANE ™ (ABI-007), ABT-100 (inibidor de farnesil transferase), ADVEXIN® (vacina Ad5CMV-p53), ALTOCOR® ou MEVACOR® (lovastatina), AMPLIGEN® (poli I: poli C12U, um RNA sintético), APTOSYN® (exisulind), AREDIA® (ácido pamidrônico), arglabina, L-asparaginase, atamestano (1- metil-3,17-diona-androsta- 1,4-dieno), AVAGE® (tazaroteno),

AVE-8062 (derivado de combreastatina) BEC2 (mitumomabe),

caquectina ou cachexina (fator de necrose tumoral),

canvaxina (vacina), CEAVAC® (vacina contra o câncer),

CELEUK® (celmoleucina), CEPLENE® (dicloridrato de histamina), CERVARIX® (vacina de papilomavírus humano),

CHOP® (C: CYTOXAN® (ciclofosfamida); H: ADRIAMYCIN®

(hidroxidoxorubicina); O: Vincristina (ONCOVIN®); P:

prednisona), CYPAT ™ (acetato de ciproterona), combrestatina

A4P, DAB (389) EGF (domínios catalíticos e de translocação da toxina da difteria fundidos através de um ligante His-Ala ao fator de crescimento epidérmico humano) ou TransMID-107R

™ (toxinas da difteria), dacarbazina, dactinomicina, ácido

5,6-dimetilxantenona-4-acético (DMXAA), eniluracil, EVIZON

™ (lactato de esqualamina), DIMERICINE® (loção de lipossoma

T4N5), discodermolida, DX-8951f (mesilato de exatecano),

enzastaurina, EPO906 (epitilona B), GARDASIL® (vacina recombinante de papilomavírus humano quadrivalente (Tipos 6,

11, 16, 18)), GASTRIMMUNE®, GENASENSE®, GMK (vacina conjugada de gangliósido), GVAX® (vacina de câncer de próstata), halofuginona, histrelina, hidroxicarbamida, ácido ibandrônico, IGN-101, IL-13-PE38, IL-13-PE38QQR (cintredekin besudotox), exotoxina IL-13-pseudomonas, interferon-alfa.,

interferon-.gamma., JUNOVAN™ ou MEPACT™ (mifamurtida),

lonafarnibe, 5,10-metilenotetra-hidrofolato, miltefosina

(hexadecilfosfocolina), NEOVASTAT® (AE-941), NEUTREXIN®

(enzima trimetrexato glucuronato), NIPENT® (pentostatina),

ONCONASE® (uma enzima ribonuclease), ONCOPHAGE® (tratamento de vacina de melanoma), ONCOVAX® (vacina de IL-2), ORATHECIN™

(rubitecano), OSIDEM® (droga celular baseada em anticorpos),

OVAREX® MAb (anticorpo monoclonal murino), paclitaxel,

PANDIMEX™ (saponinas agliconas de ginseng compreendendo

20(S)protopanaxadiol (aPPD) e 20(S)protopanaxatriol (aPPT)),

panitumumabe, PANVAC®-VF (vacina experimental contra o câncer), pegaspargase, PEG Interferon A, fenoxodiol,

procarbazina, rebimastat, REMOVAB® (catumaxomab), REVLIMID®

(lenalidomida), RSR13 (efaproxiral), SOMATULINE® LA

(lanreotida), SORIATANE® (acitretina), estaurosporina

(Streptomyces staurospores), talabostato (PT100), TARGRETIN®

(bexaroteno), TAXOPREXIN® (DHA-paclitaxel), TELCYTA®

(canfosfamida, TLK286), temilifeno, TEMODAR® (temozolomida),

tesmilifeno, talidomida, THERATOPE® (STn-KLH), thymitaq

(dicloridrato de 2-amino-3,4-dihidro-6-metil-4-oxo-5-(4-

piridiltio)quinazolina), TNFERADE™ (adenovetor:

transportador de DNA contendo o gene para tumor fator de necrose-.alfa.), TRACLEER® ou ZAVESCA® (bosentan),

tretinoína (Retin-A), tetrandrina, TRISENOX® (trióxido de arsênico), VIRULIZIN®, ucraína (derivado de alcaloides da planta de celidônia-maior), vitaxina (anticorpo anti-

alphavbeta3), XCYTRIN® (motexafin gadolínio), XINLAY™ (atrasentan), XYOTAX ™ (paclitaxel poliglumex), YONDELIS® (trabectedina), ZD-6126, ZINECARD® (dexrazoxano), ZOMETA® (ácido zolendrônico) e zorrubicina, bem como combinações de qualquer um desses agentes.

KITS

[0254] Além disso, certos componentes ou modalidades dessas composições de células dendríticas recombinantes podem ser fornecidos em um kit. Por exemplo, qualquer uma das composições de células dendríticas recombinantes, bem como as composições autólogas ou outras composições de lisado de células tumorais, podem ser fornecidas congeladas e embaladas como um kit, sozinhas ou junto com recipientes separados de qualquer um dos outros agentes das etapas de pré-condicionamento ou de pós-condicionamento, e instruções opcionais de uso.

[0255] Algumas modalidades também são direcionadas a qualquer uma das composições celulares acima mencionadas em um kit. Em algumas modalidades, o kit pode compreender ampolas, seringas descartáveis, cápsulas, frascos, tubos ou semelhantes. Em algumas modalidades, o kit pode compreender um recipiente de dose única ou recipientes de dose múltipla compreendendo a formulação tópica das modalidades deste documento. Em algumas modalidades, cada recipiente de dose pode conter uma ou mais doses unitárias.

Em algumas modalidades, o kit pode incluir um aplicador.

Em algumas modalidades, os kits incluem todos os componentes necessários para as etapas de condicionamento/tratamento.

Em algumas modalidades, as composições celulares podem ter conservantes ou ser livres de conservantes (por exemplo, em um recipiente de uso único). Em algumas modalidades, as composições de células dendríticas recombinantes que expressam qualquer um ou mais de CD40L, CXCL13 ou CD93 podem ser preparadas e congeladas em um estágio imaturo, adequado para envio a um hospital ou centro de tratamento.

Em algumas modalidades, os antígenos para carregamento, autólogos ou,

por exemplo, lisado de células de melanoma derivados de uma linhagem celular como DDM-1.7, DDM-1.13 ou uma combinação dos mesmos, podem ser preparados e congelados separadamente das composições de células dendríticas recombinantes, usando métodos padrão, de modo que essas composições possam ser enviadas para um hospital ou centro de tratamento para processamento adicional e administração ao paciente.

Em ainda outras modalidades, as composições de células dendríticas recombinantes que expressam qualquer um ou mais de CD40L, CXCL13 ou CD93 podem ser preparadas e misturadas com o autólogo desejado ou, por exemplo, lisado de células de melanoma derivado de uma linhagem celular, tal como DDM-

1.7, DDM- 1.13, para facilitar o carregamento das células dendríticas recombinantes com os antígenos tumorais, após o qual esta mistura é congelada, de modo que essas composições possam ser enviadas para um hospital ou centro de tratamento para processamento adicional e administração ao paciente.

[0256] Além disso, em certos pacientes, espera-se que qualquer um dos métodos ou regimes de tratamento seja repetido periodicamente para aumentar a resposta do sistema imunológico aos tumores ou agente(s) infeccioso(s). Esse tratamento periódico pode variar de uma vez a cada semana, mês, a uma vez a cada dois meses, a uma vez a cada 3 meses, a uma vez a cada 4 meses, a uma vez a cada 5 meses, a uma vez a cada 6 meses, ou uma vez a cada 7 meses, ou uma vez a cada 8 meses, ou uma vez a cada 9 meses, ou uma vez a cada 10 meses, ou a cada 11 meses, ou uma vez por ano como um tratamento de manutenção pelo tempo que o paciente precisar.

Perfil dos Tratamentos

[0257] Em algumas modalidades, as alloDCs são transduzidas com CD40L e CXCL13, a fim de maximizar a atração das células T e B dos pacientes e gerar a cascata de resposta imunológica celular e humoral antitumoral.

[0258] Em outras modalidades opcionais, a transdução dos alloDCs CD40L+ e CXCL13+ com CD93 facilita ainda mais a interação entre as DCs alogênicas e as DCs hospedeiras,

criando uma imunogenicidade antitumoral de hospedeiro estável e sustentada.

[0259] Em pacientes cujos tumores podem ser biopsiados ou ressecados, o perfil de expressão de proteínas das amostras de tumor ressecadas e amostras de biópsia são triados. Se o perfil de expressão indicar pelo menos 3 fragmentos compartilhados com GMP-MCV, então o imDC recombinante é carregado com GMP-MCV (um listato tumoral alogênico ou "disponível no mercado") antes que as DCs sejam maturadas in vitro.

[0260] Para pacientes cujas amostras não possuem fragmentos de tumor compartilhados com listatos alogênicos/disponíveis no mercado, lisado de tumor autólogo é gerado e o lisado de tumor apresentado aos alloDCs recombinantes imaturos para que o lisado de tumor autólogo seja processado e apresentado pelos alloDCs imaturos recombinantes.

[0261] Para qualquer paciente não ressecável e não biopsiável, a composição de células recombinantes CD40L+ CXCL13+ alloDC (ou opcionalmente incluindo ainda CD93+) será administrada ao paciente sem carregamento de antígeno como um adjuvante imunológico. Usando esta abordagem CD40L + CXCL13 + (opcional) CD93 AlloDC, os pacientes com câncer em estágio avançado podem montar uma nova resposta imunológica antitumoral celular e humoral a neoantígenos tumorais e fortalecer a resposta imunológica existente com terapia rápida, eficiente e de baixo custo.

Um resumo dessas opções é descrito abaixo:

[0262] Opção 1: O perfil de expressão de proteína das amostras de tumor ressecadas e amostras de biópsia são triados para correspondência cruzada com o perfil de expressão de lisado de tumor MelCancerVac (MCV). Se o perfil de expressão indicar pelo menos 3 fragmentos iguais com o lisado de tumor GMP-MCV, o produto disponível no mercado, vacina de DC alogênica recombinante estimulada/ativada pulsada de lisado de tumor de MCV (lisado de tumor de alloDC/MCV) pode ser usado para o paciente.

[0263] Opção 2: Se o perfil de expressão da proteína não corresponder ao perfil do lisado de MCV, o lisado de tumor autólogo é apresentado a alloDCs recombinantes imaturos, para serem amadurecidos após a pulsação in vitro.

[0264] Opção 3: Para pacientes não ressecáveis e sem biópsia, alloDC recombinante CD40L + CXCL13 (e opcionalmente CD93) pode ser administrada como um adjuvante imunológico sem pulsação ou ativação do antígeno.

[0265] Uma opção para fazer as células DC recombinantes é usar o vetor adenoviral recombinante/CRISPR Cas9 para transduzir os CD40L e CXCL13 nos monócitos CD14+ humanos purificados em vez do vetor lentiviral ou vetor retroviral. A eficiência da transdução e a funcionalidade dos monócitos transduzidos serão avaliadas, incluindo migração, diferenciação e secreção de citocinas para garantir que os monócitos recombinantes/transgênicos possam ser diferenciados em DCs funcionais e imunogênicas.

[0266] O uso de adenovírus (AdV) é benéfico por uma série de razões, incluindo alta eficiência de transdução para muitos tipos de células, incluindo células de origem hematopoiética independente de seu estado mitótico. Outro benefício é que o AdV com defeito de replicação demonstrou um perfil de segurança clinicamente. Além disso, AdV fornece um alto nível de expressão do transgene, e as DCs transduzidas por AdV podem apresentar proteínas antigênicas de maneira eficaz. Os vetores adenovirais recombinantes podem transfectar com sucesso DCs imaturas com 95% de eficiência. (Ver: Lei Zhong, et al. Eur. J. Immunol.

1999.29:964-972.) No entanto, também se espera que sistemas de vetores virais adicionais possam ser utilizados, incluindo vetores lentivirais. (Vide, fontes comerciais tais como Vectalys (Toulouse França) e métodos relacionados na Patente US Nº 10,272,111).

[0267] O ligante 13 (CXCL13) de quimiocina (motivo C-X-C), também conhecido como quimioatrator de linfócitos B

(BLC) ou quimiocina 1 de atração de células B (BCA-1), é um ligante de proteína que em humanos é codificado pelo gene CXCL13. CXCR5 é o receptor para CXCL13. A expressão das quimiocinas inicia uma alça positiva de recrutamento e estímulo de linfócitos. A superexpressão de CXCL13 nas células epiteliais intestinais promoveu um aumento acentuado no número de células B na lâmina própria e um aumento no tamanho e no número de folículos linfoides no intestino delgado. (Ver, F. Marchesi et al. Mucosal Immunology. 2009.

2(6):486-494.)

[0268] Esses resultados sugerem que a superexpressão de CXCL13 no intestino durante condições inflamatórias favorece a mobilização de células B e de células LTi e NK com funções imunomoduladoras e reparadoras.

[0269] O ligante CD40 (CD40L), também denominado CD154, é uma proteína que faz parte da superfamília de moléculas do TNF. Ele se liga ao CD40 em células apresentadoras de antígeno (APC), o que leva a muitos efeitos dependendo do tipo de célula alvo. No total, o CD40L tem três parceiros de ligação: CD40, integrina α5β1 e αIIbβ3.

CD154 atua como uma molécula coestimuladora e é particularmente importante em um subconjunto de células T chamadas células T foliculares auxiliares (células TFH). Nas células TFH, CD40L promove a maturação e função das células

B, envolvendo CD40 na superfície das células B e, portanto, facilitando a comunicação célula-célula. A expressão estável de CD40L permite que as DCs produzam IL-12 para superar a imunossupressão e desencadear a diferenciação de células T de memória.

[0270] CD93 é uma O-sialoglicoproteína de aproximadamente 120 kDa que, dentro do sistema hematopoiético, é expressa seletivamente nas células da linhagem mieloide. Sua estrutura primária e função eram desconhecidas até recentemente. A clonagem de expressão retroviral foi utilizada para isolar o cDNA de CD93. A análise da sequência revelou que CD93 é idêntica a uma proteína nos fagócitos humanos denominada receptor de C1q (C1qRp). C1qRp foi demonstrada anteriormente mediando o aumento da fagocitose em monócitos e foi sugerido que é um receptor de C1q e duas outras moléculas estruturalmente relacionadas. Ao estudar transdutantes CD93 e células de controle, verificou-se que as células que expressam CD93 têm maior capacidade de se ligar a C1q. Além disso, foi demonstrado que as células dendríticas imaturas (DC) expressam CD93/C1qRp, e as DC maduras, conhecidas por terem capacidade reduzida de captação de antígeno e por terem perdido a capacidade de fagocitar, mostram expressão de CD93/C1qRp fraca a negativa.

As células que são usadas como a fonte das células para transdução com as proteínas heterólogas fornecidas neste documento podem ser de qualquer doador. Em algumas modalidades, o doador é triado para estabelecer que as células isoladas do doador seriam consideradas alogênicas ao sujeito ao qual são administradas. Em algumas modalidades, os critérios de triagem do doador podem incluir dados demográficos do doador, incluindo: idade do doador, gênero do doador, etnia do doador, doador ABO/Rh; doador IMC (peso e altura), doador HLA tipagem de alta resolução.

[0271] Além disso, em algumas modalidades, as amostras de doadores podem ter um teste de painel completo para transfusão de sangue (FDA), em material de leucoforese (ou qualquer que seja o material de origem) incluindo: teste de CMV; teste sorológico para sífilis e pesquisa de anticorpos; e painel de doenças infecciosas compreendendo um ou mais dos seguintes testes: Anticorpo do Núcleo da Hepatite B (EIA Anti-HBs); Antígeno de Superfície da Hepatite B (EIA HBsAg); Anticorpo do Vírus da Hepatite C (EIA anti-HCV); Ab vírus da imunodeficiência humana (HIV1/2 mais O); Anticorpo de vírus linfotrópico T humano (HTLV-I/II); Teste de ácido nucléico de HIV-1/HGV/HBV; Teste de ácido nucléico do WNV; Anticorpo de Trypanasoma cruzi; e Zika. Assim, em algumas modalidades, as células do doador ou as células que são administradas ao paciente são derivadas de um doador que está livre de CMV, sífilis, Hepatite A, Hepatite B, Hepatite C, HIV, HTLV-I/II, Vírus do Nilo Ocidental (WNV), Trypanosoma cruzi e/ou Zika.

[0272] As amostras podem ser avaliadas quanto às porcentagens de monócitos e contagem por analisador hematológico e citometria de fluxo.

[0273] As amostras podem ser coletadas por aférese ou por coleta de sangue total e sujeitas a inspeção padrão.

Em certos casos, a coleta será por coleta de leucoferese Optia. As amostras serão analisadas quanto à viabilidade e CD14 +% e os monócitos CD14+ serão contados.

[0274] É outra opção conduzir o isolamento de monócitos negativos usando CliniMACS de acordo com os procedimentos padrão.

Pureza pós-isolamento e contagem de células

[0275] Em algumas modalidades, transfectam-se monócitos purificados com vetor adenoviral compreendendo CD40L e CXCL13 (e para certas modalidades CD40L, CXCL13 e CD93).

[0276] Em algumas modalidades, transfectam-se monócitos purificados com vetor lentiviral compreendendo CD40L e CXCL13 (e para certas modalidades CD40L, CXCL13 e CD93).

[0277] Após a exposição ao vetor viral, os monócitos transduzidos positivamente podem ser selecionados. Por exemplo, as células podem ser selecionadas com um ou mais dos seguintes marcadores positivos ou negativos: Linhagem negativa (CD3-, CD56-, CD19-, CD66b-), CD45+, CD14+, CD40L+, CXCL13+, CD1c+, CD11b+, CD11c+, HLA-DR+, CD86+, CD80low, CD83-, CD16Low, CD33+, CD163-, CD206+ ou CD209.

[0278] Em certos casos, a eficiência de transdução das células será avaliada, antes da classificação positiva, para que o rendimento possa ser calculado. A eficiência de transdução é necessária/útil para determinar o rendimento esperado de células de monócitos CD40L+ CXCL13+ ou CD40L+ CXCL13+ CD93+.

[0279] Conforme fornecido neste documento, as células podem ser monócitos e podem ser diferenciadas em células dendríticas imaturas in vitro. Em algumas modalidades, as células (transduzidas ou não transduzidas) são centrifugadas para isolar as células. As células podem ser, por exemplo, centrifugadas a 400 xg durante 10 minutos à temperatura ambiente (TA) com baixo intervalo. As células centrifugadas podem ser separadas de seu sobrenadante. As células centrifugadas podem ser ressuspensas com X-VIVO 15, GM-CSF humano recombinante, tal como (1000 unidades/ml) e IL-4 (1000 unidades/ml) em frasco de cultura de células, e as células podem ser permitidas diferenciar os monócitos na incubadora por pelo menos ou cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 dias. Em algumas modalidades, as células podem se diferenciar por cerca de 4 a cerca de 8 dias.

[0280] Em algumas modalidades, as células diferenciadas podem então ser coletadas do meio de cultivo de células e centrifugadas. Por exemplo, em algumas modalidades, o meio de cultura de células é coletado dos frascos de cultura para tubos de centrífuga. O PBS pode ser colocado em frascos de cultura de células para cobrir a superfície dos frascos. O frasco de cultura de células pode ser incubado com PBS a 37 °C, incubadora de 5% de CO2 por cerca de 30 minutos. Em algumas modalidades, o conteúdo dos frascos é coletado nos tubos de centrífuga batendo nos frascos após a incubação. Os frascos podem ser enxaguados e coletados em tubos de centrifugação. Em algumas modalidades, as células coletadas podem ser centrifugadas, por exemplo, a 400 xg por 10 minutos à temperatura ambiente com baixo intervalo. Após a centrifugação, as células são separadas do seu sobrenadante e as células são isoladas. As células podem ser ressuspensas e analisadas quanto à viabilidade.

[0281] Em algumas modalidades, as amostras são analisadas quanto à contagem e identificação de citometria de fluxo de biomarcadores relacionados. Eles podem ser analisados por ou podem ser selecionados com um ou mais dos seguintes marcadores positivos ou negativos: Linhagem negativa (CD3-, CD56-, CD19-, CD66b-), CD45+, CD14+, CD40L+, CXCL13+, CD1c+, CD11b+, CD11c+, HLA-DR+, CD86+, CD80low, CD83-, CD16Low, CD33+, CD163-, CD206+ ou CD209.

[0282] Conforme fornecido neste documento, os monócitos podem ser transduzidos com um vetor viral, como um lentivírus ou um adenovírus. Qualquer protocolo para transdução viral pode ser usado. Por exemplo, as células podem ser cultivadas em um coquetel de meio. Em algumas modalidades, o meio compreende 100ng/mL de mFlt3L/mTPO/mSCF e 30 ng/mL de mIL-3. As células podem, por exemplo, ser cultivadas neste meio incubadas a 37 ºC e 5% de CO2 por 24 horas ou até serem ativadas. Após a ativação, as células podem ser pré-tratadas com PGE2. As células podem então ser transduzidas com o vetor apropriado. Em algumas modalidades, o vírus é adicionado em um MOI (multiplicidade de infecção) de 10, 100 ou 100. Após as transduções, as células podem ser isoladas usando, por exemplo, grânulos ou produtos de purificação que se ligam a uma ou mais das proteínas heterólogas codificadas pelo vetor. Por exemplo, as células podem ser coletadas após o processo de transdução usando microesferas CD40L (Miltenyi) para purificar as células que expressam o CD40L.

[0283] Em algumas modalidades, para diferenciar os monócitos transduzidos, como células transduzidas CD34 + Lentivirus+ em monócitos CD14 + CD16 +, as células CD34+ Lv+ purificadas podem ser expandidas por 3-10 dias por cultura de 1 ×105 células CD34+/ml no meio de expansão em um G-Rex 10M (meio X ‐ VIVO 10; soro AB humano 10%; rhSCF 50 ng/mL (R&D Systems); TPO 15 ng/mL (R&D Systems); IL‐3 30 ng/mL (R&D Systems); Flt-3L 30 ng/mL (R&D Systems). Após a expansão das células (1-10 dias), as células podem ser movidas para o meio de diferenciação em um G-Rex 100M por 14 dias. Um exemplo não limitativo de meio de diferenciação inclui, sem limitação, IMDM com 20% de soro AB humano; SCF 25 ng/mL (R&D Systems); M‐CSF 30 ng/mL (R&D Systems); IL-3 30 ng/mL (R&D Systems); e Flt-3L 30 ng/mL (R&D Systems). As células podem então ser incubadas em um coquetel de diferenciação por cerca de, ou pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 dias. Um exemplo não limitativo de um coquetel de diferenciação é RPMI-1640; 3% de soro AB humano; GM-CSF 900 UI/mL; IL-4 1000 UI/mL; TNF alfa 400 UI/mL; e TGF beta1 0,2 ng/mL. O coquetel de diferenciação pode aumentar a diferenciação dos monócitos em células dendríticas imaturas.

[0284] Em algumas modalidades, para aumentar ainda mais a maturação das células dendríticas imaturas, as células podem ser incubadas em um coquetel de maturação. Em algumas modalidades, o coquetel de maturação compreende um antígeno, um lisado tumoral ou uma célula tumoral viva. Exemplos destes são fornecidos neste documento. O coquetel de maturação pode incluir, por exemplo, GM-CSF 500 IU/mL; IL-15 400ng/nL; IFN gama 100ng/mL; TNF alfa 2ng/mL; e PgE2 2mcg/mL. Os valores são apenas exemplificativos e não se limitam a esses valores.

Portanto, em algumas modalidades, a composição de maturação (coquetel) compreende GM-CSF, IL-15, IFN gama, TNF alpha e/ou PgE2. As células podem ser incubadas nestas composições de maturação por cerca de 12 a cerca de 48 horas, cerca de 20 a cerca de 40 horas, cerca de 30 a cerca de 38 horas, cerca de ou pelo menos 12, 16, 18, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44 ou 48 horas. O coquetel de maturação também pode compreender TNF-α, IL-1β, IFN-α, IFN-γ e/ou pIC.

[0285] Os resultados de uma experiência usando uma ou mais dessas modalidades são ilustrados nas Figs. 2A-F, uma fenotipagem representativa e avaliação de pureza usando monócitos CD14 + isolados por CliniMACS.

[0286] As DCs recombinantes imaturas mostraram exibir capacidade fagocitótica ilustrada nas Figs. 4A-B.

Para os resultados mostrados nas Figs. 4A-B, a fagocitose de partículas de Escherichia coli ( E. coli) marcadas com fluorescência pelo produto DC imaturo foi observada por citometria de fluxo. A Fig. 4A é o controle negativo; enquanto a Fig. 4B mostra que 86,13% do produto fagocitou as partículas de E. coli marcadas com fluorescência. Os ensaios usados podem ser qualquer ensaio fagocitótico.

[0287] Além disso, as Figs. 5A-D mostram que as DCs recombinantes estimularam a proliferação de células T alogênicas, conforme indicado pela diluição de éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE). Para os resultados mostrados nas Figs. 5A-D, as células T alogênicas foram marcadas com CFSE e cocultivadas com alloDCs recombinantes. A proliferação das células T pode ser observada pela diluição de CFSE. A coluna da esquerda (Fig.

5A e C) mostrou a proliferação no Dia 4, e a coluna da direita mostrou a proliferação no Dia 7 (Fig. 5B e D). Estes resultados ilustram que os alloDCs recombinantes estimularam a proliferação de células T alogênicas.

[0288] Um aspecto útil das presentes composições e métodos inclui a capacidade de armazenar DCs recombinantes para fornecer uma vacina disponível no mercado para uso em um hospital local, para facilidade de tratamento do paciente.

Essas DCs recombinantes podem então ser tratadas de três maneiras diferentes: (1) podem ser carregadas com lisado de tumor autólogo, ou (2) em outros casos, podem ser carregadas com lisado de tumor MCV (o Dandrit GMP, se ≥ 3 epítopos do tumor do paciente está presente no pool de antígeno MCV), ou outro lisado tumoral alogênico disponível comercialmente; ou (3) não poderia haver carga de antígeno no caso de tumores não ressecáveis.

[0289] Na próxima etapa da preparação da vacina DC recombinante, os alloDCs recombinantes são maturados com um coquetel de citocinas humanas recombinantes, tais como aquelas descritas acima.

[0290] Em seguida, as células são fenótipos e avaliadas funcionalmente (como mostrado nas Figs. 4-5), bem como a serem avaliados quanto à expressão dos transgenes relevantes (por exemplo, CD40L, CXCL13 e CD93). Finalmente, as DCs recombinantes são congeladas ou, mais especificamente, criopreservadas, tipicamente em uma criopreservação de taxa controlada e então utilizadas em um ambiente clínico após o descongelamento. Essas células servem como base para a vacina biológica de DC recombinante/adjuvante imunológico para o tratamento de cânceres, tumores e doenças malignas. Um esquema do tratamento, preparação de células e processo de vacinação é mostrado na Fig. 9.

[0291] Em algumas modalidades, as células são congeladas, o que pode ser referido como criopreservação. As células podem, por exemplo, ser congeladas usando CryoStor

CS5 (meio de congelamento). No entanto, este é um exemplo não limitativo de meio de congelamento e outros meios de congelamento podem ser usados. As células podem ser inicialmente resfriadas a 4 °C. Em seguida, as células podem ser ainda mais resfriadas a cerca de -20 °C. As células podem ser centrifugadas ou ressuspensas em meio de congelamento adicional e, em seguida, resfriadas a -90 °C de uma maneira gradual. As células podem então ser armazenadas em nitrogênio líquido. Em algumas modalidades, as células são congeladas em uma cryobag (bolsa criogênica).

[0292] As células podem ser descongeladas em banho- maria a 37 °C. Em algumas modalidades, as células são descongeladas sem movê-las no banho-maria, ou seja, nenhum movimento de figura 8 ou sacudidela. As células podem então ser colocadas em contato com plasma e meios de descongelamento aquecidos. As células podem então ser analisadas quanto à viabilidade antes de serem administradas ao sujeito. Exemplos dos marcadores são fornecidos neste documento e acima.

[0293] Em algumas modalidades, as células dendríticas são amadurecidas com um coquetel de citocinas e/ou carregam as DC com lisado de tumor autólogo/MCV. Por exemplo, as DCs imaturas viáveis podem ser cultivadas com lisado de tumor ou MCV com as células DC. Isso pode ser feito na presença de um coquetel de maturação, como descrito acima, ou, por exemplo, uma composição que compreende TNF-α, IL-1β, IFN-α, IFN-γ e pIC. As células podem ser incubadas com esta composição por cerca de 12 a cerca de 36 horas, tal como, ou cerca de, ou pelo menos, 20, 22, 24, 26, 28 ou 30 horas. As células maduras podem então ser coletadas e analisadas. As células maduras também podem ser congeladas usando meio de congelamento e processo de congelamento em etapas, tal como descrito neste documento.

[0294] Conforme descrito neste documento, as células podem ser incubadas ou carregadas com um lisado de tumor. O lisado de tumor pode ser preparado de qualquer maneira. Por exemplo, em algumas modalidades, o material do tumor é fornecido (isolado, obtido, ressecado, etc.). A amostra pode ser congelada rapidamente em nitrogênio líquido. Em algumas modalidades, a amostra está livre de tecido não maligno.

Isso pode significar que a amostra foi removida sem qualquer tecido não maligno ou que a amostra foi processada posteriormente para remover tal tecido não maligno. A amostra pode então ser descongelada e congelada rapidamente de 1 a 5 vezes para ajudar a lisar as células. O lisado pode ser centrifugado e filtrado para preparar o lisado tumoral. O lisado pode ser armazenado congelado, por exemplo, em freezer-80oC.

[0295] As modalidades são agora descritas com referência aos exemplos a seguir. Estes exemplos são fornecidos apenas para fins de ilustração e as modalidades não devem de forma alguma ser interpretadas como sendo limitadas a estes exemplos, mas sim devem ser interpretadas para abranger toda e qualquer variação que se torne evidente como resultado do ensino fornecido neste documento. Os técnicos no assunto reconhecerão prontamente uma variedade de parâmetros não críticos que podem ser alterados ou modificados para produzir resultados essencialmente semelhantes.

EXEMPLO 1 Paciente irressecável com câncer colorretal metastático

[0296] Um paciente do sexo masculino foi diagnosticado com câncer colorretal aos 29 anos e teve um tumor colorretal primário de 6 cm removido no momento do diagnóstico. O paciente optou por não receber quimioterapia adjuvante. O paciente apresentou recidiva da lesão tumoral primária com múltiplas metástases mesentéricas e hepáticas 18 meses após a cirurgia inicial. O paciente foi submetido a cirurgia de colostomia de emergência devido a recidiva do tumor primário (16cm) que obstruía a passagem colorretal.

Uma biópsia foi retirada do tumor primário do paciente durante a cirurgia de colostomia. Três semanas após a cirurgia, o paciente passou a receber DCs alogênicas pulsadas com células tumorais autólogas apresentando CD40L, maturadas com coquetel de maturação, conforme descrito neste documento acima. O paciente não recebeu nenhum outro tratamento. O esquema de dosagem da vacina foi de1x106 células carregadas com Allo-DC CD40L+ injetadas por via subcutânea a cada 15 dias. As Figuras 6A-B são imagens de varredura CAT/PET (CT) que mostram redução significativa na massa tumoral 6 meses (12 injeções) após o tratamento de células carregadas com Allo-DC CD40L+. O tumor primário encolheu de 12 cm para 17,3 mm x 34,5 mm (Fig. 6B) após 6 meses de tratamento com a vacina alloDC CD40L+ carregada com células tumorais autólogas. Estas células foram transduzidas para expressar CD40L, e espera-se que as células alloDC transduzam ainda mais com CXCL13 e, opcionalmente, CD93 aumentará ainda mais os efeitos antitumorais (carregados com tumor autólogo), ao longo das linhagens das células alloDC CD40L+.

EXEMPLO 2: Homem de 69 anos com câncer colorretal metastático irressecável

[0297] Paciente do sexo masculino foi diagnosticado com câncer colorretal aos 68 anos. Um tumor colorretal primário de cinco centímetros (5cm) foi removido no momento do diagnóstico. O paciente recebeu 6 meses de regime FOLFOX.

Na avaliação de acompanhamento após o tratamento com FOLFOX,

o paciente apresentou recidiva da lesão tumoral primária com múltiplas metástases hepáticas e pulmonares. Após o seguimento, o paciente iniciou esquema com FOLFIRINOX. Seis meses após o início do tratamento com FOLFIRINOX, o paciente foi submetido a cirurgia de colostomia de emergência devido à recidiva do tumor primário obstruindo a passagem colorretal. O paciente passou a receber vacina alloDC pulsada de tumor autólogo apresentando CD40L, maturado com coquetel de maturação, conforme descrito neste documento acima.

[0298] O paciente recebeu capecitabina apenas durante o tratamento vacinal. O esquema de dosagem da vacina foi de 2x106 células injetadas por via subcutânea a cada 15 dias. As imagens CT/PET nas Figs. 7A-D mostram redução significativa nas massas hepáticas e pulmonares seis meses (12 injeções) após a vacina alloDC CD40L+ carregada com tratamento de células tumorais autólogas. Essas células foram transduzidas para expressar CD40L, e espera-se que as células alloDC transduzam ainda mais com CXCL13 e, opcionalmente, CD93 aumentará ainda mais os efeitos antitumorais (carregados com tumor autólogo), ao longo das linhagens das células alloDC CD40L+.

EXEMPLO 3: Mulher de 45 anos com câncer de mama ductal metastático invasivo

[0299] Paciente do sexo feminino com diagnóstico de câncer de mama HER-2 positivo, ER e PR negativo, e fez mastectomia em 2008 (T1cN2M0). A paciente recebeu TAC por 6 meses e entrou em remissão. Em 2010, a PET revelou evidências de metástases. A paciente recebeu Gemcitabina, Carboplatina, Trastuzumabe e houve progresso. Em seguida, a paciente recebeu bortezomibe e lapatinibe e a doença ainda progrediu mais. O tratamento de terceira linha com ado-trastuzumabe emtansina começou em 2013 até 2015. A progressão nos pulmões continuou.

[0300] A paciente em seguida recebeu o tratamento de quinta linha com trastuzumabe e vinorelbina a partir de agosto de 2015 e foi interrompido em abril de 2016 devido à progressão. O tratamento de sexta linha com trastuzumabe, bortezomibe e eribulina começou em abril de 2016 e foi interrompido em julho de 2016 devido à progressão. O tratamento de sétima linha foi iniciado com ado-trastuzumabe emtansina e pablociclibe em julho de 2017, e foi interrompido em janeiro de 2018 devido à progressão. O tratamento de oitava linha com fulvestrant, trastuzumabe e pablociclibe foi administrado de janeiro a agosto de 2017 e interrompido devido à progressão.

[0301] A paciente foi diagnosticada com metástase cerebral em outubro de 2017 com craniotomia direita e 5 lesões cerebrais totais foram tratadas com radiocirurgia estereotáxica. A paciente não havia recebido mais nenhum tratamento cerebral naquela época. A paciente iniciou tratamento com trastuzumabe, ixabepilona e capecitabina em fevereiro de 2018 e descontinuou o tratamento em abril de 2018 devido à progressão. A paciente recebeu radiação em todo o cérebro em agosto de 2018 para estar fisicamente apta a viajar para receber os tratamentos de imunoterapia. A paciente recebeu terapia celular adotiva como tratamento inicial antes de seu procedimento de biópsia de tumor broncoscópico em setembro de 2018.

[0302] A paciente começou a receber CD40L pulsado de células tumorais autólogas e CXCL13 expressando alloDCs maturadas com coquetel de maturação, conforme descrito neste documento, em setembro de 2018. A dose de vacinação foi de 106 células injetadas por via subcutânea (sub-Q). O esquema da vacina foi o seguinte: injeções #1- #4 a cada 7 dias, #5- #8 a cada 10 dias, #9- #12 a cada 15 dias (total de 12 injeções sub-Q em 130 dias). As imagens de TC e PET/TC nas Figs. 8A-D mostram redução significativa nas lesões pulmonares um mês após o tratamento com células tumorais autólogas pulsadas alloDC CD40L+ CXCL13+.

[0303] Essas células foram transduzidas para expressar CD40L e CXCL13, e espera-se que as células alloDC transduzidas com CD93 aumentem ainda mais os efeitos antitumorais (carregados com tumor autólogo), ao longo das linhagens das células alloDC CD40L+ CXCL13+, em vista de os resultados sinérgicos in vitro como mostrado abaixo nas Figs.

10-12.

Exemplo 4: Teste In vitro Proliferação de células T (Fig. 10)

[0304] O lisado de tumor obtido de um paciente com câncer de mama é usado para produzir DCs maduras modificadas por genes usando um lentivírus que expressa CD40L+ CXCL13+ CD93, ou CD40L+ CXCL13, ou apenas CD40L. Allo-DCs maduras (2x104) são então cocultivadas células T CD3+ de sangue periférico (1x106) em meio TexMACS (Miltenyi) suplementado com 500 UI/mL IL-2 (R&D Systems) em triplicatas. A persistência das alloDCs foi medida por citometria de fluxo (CD86 e CD1a) 48h após a semeadura. Em cada condição, não foram detectados allo-DCs viáveis às 48h da cocultura.

[0305] Proliferação de células NK (Fig. 11)

[0306] O lisado de tumor obtido de um paciente com câncer de mama é usado para produzir DCs maduras modificadas por genes usando um lentivírus que expressa CD40L+ CXCL13+ CD93, ou CD40L+ CXCL13, ou apenas CD40L. Allo-DCs maduras (1x104) são então cocultivadas células NK CD16 + CD56 + de sangue periférico (5x105) em meio de células NK (Miltenyi) com a presença de 500UI/mL de IL2 em triplicata. A persistência das alloDCs foi medida por citometria de fluxo (CD86 e CD1a) 48h após a semeadura. Em cada condição, não foram detectados allo-DCs viáveis às 48h da cocultura.

Ativação de células B (Fig. 12)

[0307] O lisado de tumor obtido de um paciente com câncer de mama é usado para produzir DCs maduras modificadas por genes usando um lentivírus que expressa CD40L+ CXCL13+ CD93, ou CD40L+ CXCL13, ou apenas CD40L. Allo-DCs maduras (1x104) são então cocultivadas células B CD19 + de sangue periférico (2,5x105) em meio RPMI 1640 com 5% de soro AB humano e 1 mM de glutamax em triplicata. O nível de ativação das células B foi por citometria de fluxo, determinando os níveis de expressão de CD69 em células CD19+ no dia 4.

[0308] Os resultados das Figs. 10-12 mostram os efeitos sinérgicos da coexpressão de todos os três receptores nas DCs recombinantes. Na Fig. 10, a proliferação de células T foi usada como substituto para indicar o aumento da resposta imune celular às DCs recombinantes. O maior aumento na proliferação de células T foi mostrado para as DC recombinantes triplas (CD40L+ CXCL13+ e CD93). Da mesma forma, na Fig. 11, a proliferação de células NK (natural killer) em cocultura com as DCs recombinantes foi usada como outro substituto para o aumento da resposta imune celular in vivo. Da mesma forma, na Fig. 11, o maior aumento na proliferação de células NK foi mostrado para a cocultura com a construção tripla. Finalmente, na Fig. 12, o nível de ativação de células B em cocultura foi utilizado como substituto para a ativação de células B in vivo. A ativação das células B foi determinada através da análise das células cocultivadas para a expressão de CD69 em células CD19+ no dia 4. Nessas coculturas, as DC triplas recombinantes (CD40L+ CXCL13+ e CD93) também exibiram o maior nível de expressão de CD69+, indicando analogamente, ativação do sistema imune humoral.

Métodos Padrão

[0309] Métodos padrão em biologia molecular são descritos em Sambrook, Fritsch e Maniatis (1982 & 1989 2a Edição, 2001 3a Edição) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook e Russel (2001) Molecular Cloning, 3a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, CA). Métodos padrão também aparecem em Ausbel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols.1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, NY, que descreve a clonagem em células bacterianas e mutagênese de DNA (Vol. 1), clonagem em células de mamíferos e leveduras (Vol. 2), glicoconjugados e expressão de proteínas (Vol. 3)

e bioinformática (Vol. 4).

[0310] Métodos para purificação de proteínas, incluindo imunoprecipitação, cromatografia, eletroforese, centrifugação e cristalização, são descritos (Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York). A análise química, a modificação química, a modificação pós-tradução, a produção de proteínas de fusão, a glicosilação de proteínas, são descritas (ver, por exemplo, Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., Nova York; Ausubel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, pp. 16.0.5-16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; pp. 45-89; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., pp.

384-391). A produção, purificação e fragmentação de anticorpos policlonais e monoclonais são descritas (Coligan, et al. (2001) Current Protcols in Immunology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York; Harlow e Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow e Lane, supra). Técnicas padrão para caracterizar interações ligante/receptor estão disponíveis (ver, por exemplo, Coligan, et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., Nova York).

[0311] Todas as referências citadas neste documento são incorporadas por referência na mesma extensão como se cada publicação individual, entrada de banco de dados (por exemplo, sequências Genbank ou entradas GeneID), pedido de patente ou patente, fosse especificamente e individualmente indicada para ser incorporada por referência. Esta declaração de incorporação por referência é pretendida pelos Requerentes, de acordo com 37 CFR §1.57(b)(1), como relacionando-se a cada publicação individual, entrada de banco de dados (por exemplo, sequências Genbank ou entradas GeneID), pedido de patente ou patente, cada um dos quais está claramente identificado em conformidade com 37 CFR §1.57(b)(2), mesmo que tal citação não seja imediatamente adjacente a uma declaração de incorporação específica por referência. A inclusão de declarações de incorporação específicas por referência, se houver, dentro da especificação, não enfraquece de forma alguma esta declaração geral de incorporação por referência. A citação das referências contidas neste documento não pretende ser uma admissão de que a referência é pertinente ao estado da técnica, nem constitui qualquer admissão quanto ao conteúdo ou data dessas publicações ou documentos.

[0312] A presente invenção não deve ser limitada em escopo pelas modalidades específicas descritas neste documento.

De fato, várias modificações da invenção além daquelas mostradas e descritas neste documento se tornarão evidentes para os técnicos no assunto a partir da descrição anterior e das figuras anexas.

Tais modificações se destinam a permanecer dentro do escopo das reivindicações anexas.

Claims (58)

REIVINDICAÇÕES

1. Célula dendrítica caracterizada por compreender uma ou mais moléculas de ácido nucleico heterólogas que codificam CD40L e CXCL13.

2. Célula dendrítica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a uma ou mais moléculas de ácido nucleico heterólogas codificar(em) CD93.

3. Célula dendrítica caracterizada por compreender uma proteína CD40L heteróloga e uma proteína CXCL13 heteróloga.

4. Célula dendrítica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por compreender ainda uma proteína CD93 heteróloga.

5. Célula dendrítica ativada por antígeno, caracterizada por a célula dendrítica compreender uma ou mais moléculas de ácido nucleico heterólogas que codificam CD40L e CXCL13.

6. Célula dendrítica ativada por antígeno, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por a uma ou mais moléculas de ácido nucleico heterólogas codificar(em) CD93.

7. Célula dendrítica ativada por antígeno, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizada por a célula ser ativada pela exposição a um ou mais antígenos.

8. Célula dendrítica ativada por antígeno, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por o antígeno ser um antígeno tumoral.

9. Célula dendrítica ativada por antígeno, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por o antígeno ser um antígeno viral.

10. Célula dendrítica ativada por antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7-9, caracterizada por o antígeno ser um lisado celular.

11. Célula dendrítica ativada por antígeno, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por o lisado celular ser alogênico ou autólogo em relação à célula dendrítica ativada por antígeno.

12. Célula dendrítica ativada por antígeno, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizada por o lisado celular ser um lisado que compreende um, ou uma combinação de lisados de células de melanoma alogênicos.

13. Célula dendrítica ativada por antígeno, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por o lisado de células de melanoma alogênico ser um lisado de células DDM-1.7, um lisado de células DDM-1.13 ou uma combinação destes.

14. Célula dendrítica ativada por antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10-13, caracterizada por o lisado celular ser um lisado de célula inteira.

15. Célula dendrítica ativada por antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10-13, caracterizada por o lisado celular ser um lisado de células tumorais.

16. Composição caracterizada por compreender uma célula, em que a composição está isenta de um antígeno heterólogo.

17. Composição farmacêutica caracterizada por compreender uma célula conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-16.

18. Método de tratamento de um tumor sólido, câncer ou neoplasia maligna em um sujeito, caracterizado por compreender a administração, ao sujeito, de qualquer uma das células dendríticas ou composições conforme definidas nas reivindicações 1-4 ou 16-17.

19. Método de tratamento de um tumor sólido, câncer ou neoplasia maligna em um sujeito, caracterizado por compreender a administração, ao sujeito, de qualquer uma das células dendríticas ou composições conforme definidas nas reivindicações 5-14 ou 15-17.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por compreender ainda: rastrear um perfil de expressão de proteína de um tumor ressecado ou amostra de biópsia do sujeito para comparar com um perfil de expressão de proteína de um lisado de tumor alogênico antes da administração; e administrar uma célula dendrítica ativada do lisado de tumor alogênico ou composição de células dendríticas ativadas se pelo menos três fragmentos do perfil de expressão de proteína do tumor ressecado ou amostra de biópsia corresponderem ao perfil de expressão de proteína do lisado de tumor alogênico.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por o lisado de tumor alogênico ser derivado de uma linhagem de células de melanoma alogênica selecionada do grupo consistindo em DDM-1.7, DDM-1.13, ou uma combinação destes.

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18-21, caracterizado por a célula dendrítica não ter o mesmo tipo de HLA que o sujeito.

23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18-22, caracterizado por o câncer ser um tumor sólido selecionado do grupo consistindo em fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, osteossarcoma, e outros sarcomas, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, carcinoma de cólon/câncer colorretal, neoplasia maligna linfoide, câncer de pâncreas, câncer de mama, cânceres pulmonares, câncer ovariano, câncer de próstata, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basais, adenocarcinoma, carcinoma das glândulas sudoríparas, carcinoma medular de tireoide, carcinoma papilar de tireoide, feocromocitomas, carcinoma de glândulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, carcinoma medular, carcinoma broncogênico, carcinoma de células renais, hepatoma, carcinoma do duto biliar, coriocarcinoma, tumor de Wilms, câncer do colo do útero, tumor testicular, seminoma, carcinoma de bexiga, melanoma, e tumores do SNC (tais como, um glioma (tal como glioma do tronco encefálico e gliomas mistos), glioblastoma (também conhecido como glioblastoma multiforme), astrocitoma, linfoma do SNC, germinoma, meduloblastoma, Schwannoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, neuroblastoma, retinoblastoma e metástases cerebrais.

24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18-23, caracterizado por a via de administração ser através de injeção intratumoral, peritumoral, intradérmica, subcutânea, intramuscular ou intraperitoneal.

25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18-24, caracterizado por a administração ser através de injeção subcutânea, intratumoral ou intradérmica.

26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18-25, caracterizado por a célula dendrítica ou composição ser criopreservada e descongelada antes da administração.

27. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por a célula dendrítica não ser pulsada com um antígeno antes da administração.

28. Kit caracterizado por compreender qualquer uma das células dendríticas ou composições conforme definidas nas reivindicações 1-17, em que a célula dendrítica ou composição é congelada ou criopreservada em um recipiente e compreende, opcionalmente, um lisado de tumor alogênico criopreservado em um recipiente separado.

29. Kit caracterizado por compreender qualquer uma das células dendríticas ou composições conforme definidas nas reivindicações 1-17, em que a célula dendrítica ou composição é congelada ou criopreservada em um recipiente e compreende, opcionalmente, um lisado de tumor autólogo congelado ou criopreservado em um recipiente separado.

30. Kit caracterizado por compreender qualquer uma das células dendríticas ou composições conforme definidas nas reivindicações 10-15, ou 17, em que a célula dendrítica ativada ou composição é congelada em um recipiente.

31. Kit, de acordo com a reivindicação 29 ou 30, caracterizado por compreender ainda recipientes separados compreendendo um ou mais tampões, e compreender,

opcionalmente, um ou mais agentes de ativação.

32. Kit, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por compreender ainda instruções para incubar e/ou processar as células dendríticas ou composições.

33. Método de tratamento de câncer em um sujeito, caracterizado por compreender: rastrear um perfil de expressão de proteína de um tumor ressecado ou amostras de biópsia do sujeito para comparar com um perfil de expressão de proteína de um lisado de tumor alogênico antes da administração; se pelo menos três fragmentos do perfil de expressão de proteína do tumor ressecado ou amostras de biópsia corresponderem ao perfil de expressão de proteína do lisado de tumor alogênico, administrar, ao sujeito, qualquer uma das células dendríticas ou composições conforme definidas nas reivindicações 1-15; ou se os pelo menos três fragmentos do perfil de expressão de proteína do tumor ressecado ou amostras de biópsia não corresponderem ao perfil de expressão de proteína de lisado de tumor alogênico, então (a) administrar, ao sujeito, uma composição compreendendo um lisado de tumor autólogo pulsado com qualquer uma das células dendríticas ou composições conforme definidas nas reivindicações 1-10, 14 ou 16, ou

(b) administrar, ao sujeito, qualquer uma das células ou composições conforme definidas nas reivindicações 1-4 ou 16, que não foram pulsadas com um antígeno.

34. Método de tratamento de câncer em um sujeito, caracterizado por compreender a administração, ao sujeito, de qualquer uma das células dendríticas ou composições conforme definidas nas reivindicações 1-4 ou 16, em que a célula dendrítica ou composição não foi pulsada com um antígeno tumoral.

35. Método de tratamento de câncer em um sujeito, caracterizado por compreender a administração, ao sujeito, de qualquer uma das células dendríticas ou composições conforme definidas nas reivindicações 1-17, em que a célula dendrítica foi pulsada com um antígeno tumoral ou lisado.

36. Método de ativação do sistema imunológico, caracterizado por compreender a administração, a um sujeito em necessidade, de uma quantidade eficaz de qualquer uma das células dendríticas ou composições conforme definidas nas reivindicações 1-17.

37. Método de produção de células dendríticas imaturas, caracterizado por compreender: cultura de monócitos CD14+ e/ou CD1a+ que expressam, de forma heteróloga, CD40L, CXCL13, e opcionalmente CD93 em células dendríticas imaturas in vitro.

38. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por compreender ainda o contato da célula dendrítica imatura com uma composição compreendendo um ou mais dentre: TNF-α, IL-1β, IFN-α, IFN-γ e pIC.

39. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por compreender ainda a produção de monócitos CD14+ que expressam, de forma heteróloga, CD40L, CXCL13 e, opcionalmente, CD93.

40. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado por a produção compreender o contato de monócitos CD14+ com um ou mais vetores que codificam CD40L, CXCL13 e, opcionalmente, CD93.

41. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado por o vetor ser um vetor adenoviral recombinante, um vetor retroviral recombinante ou um vetor lentiviral recombinante, ou uma combinação destes.

42. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado por a produção dos monócitos CD14+ que expressam, de forma heteróloga, CD40L, CXCL13 e, opcionalmente, CD93 compreender o contato dos monócitos com um ou mais construtos de CRISPR que produzem monócitos CD14+ que expressam, de forma heteróloga, CD40L, CXCL13 e, opcionalmente, CD93.

43. Método, de acordo com a reivindicação 42,

caracterizado por o construto de CRISPR ser CAS9.

44. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40-43, caracterizado por o contato compreender transfecção, transdução, eletroporação, infecção ou qualquer combinação destes.

45. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por compreender ainda o congelamento das células dendríticas imaturas.

46. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por compreender ainda o contato das células dendríticas imaturas com um lisado de tumor autólogo ou lisado de tumor alogênico antes da maturação.

47. Método, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado por compreender ainda o congelamento das células dendríticas após a maturação.

48. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por os monócitos CD14+ serem ainda modificados para expressar CD93 de forma heteróloga.

49. Método, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado por o lisado de tumor alogênico ser derivado de uma linhagem de células de melanoma alogênica selecionada do grupo consistindo em DDM-1.7, DDM-1.13, ou uma combinação destes.

50. Método, de acordo com a reivindicação 46,

caracterizado por o lisado ser um lisado de célula inteira.

51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18-27 ou 33-36, caracterizado por a resposta enxerto versus tumor (GVT) ser aumentada no paciente.

52. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18-27 ou 33-36, caracterizado por, num período de tempo de 4-14 dias após a administração das células dendríticas ou composições, ser administrado ainda, ao paciente, um inibidor de checkpoint, incluindo qualquer um ou uma combinação de dois inibidores de checkpoint, incluindo um inibidor de PD-1 ou PD-L1 (B7-H1), tal como um anticorpo anti-PD-1, incluindo nivolumabe (Nivolumabe da Bristol-Myers Squibb), pembrolizumabe/lambrolizumabe, também conhecido como MK-3475 (Keytruda da Merck), pidilizumabe (Curetech), AMP-224 (Amplimmune), ou um anticorpo anti-PD-L1, incluindo MPDL3280A (Roche), MDX-1105 (Bristol Myer Squibb), MEDI-4736 (AstraZeneca) e MSB-0010718 C (Merck), um antagonista de CTLA-4, tal como um anticorpo anti-CTLA-4, incluindo o anticorpo anti-CTLA4 YervoyTM (ipilimumabe, Bristol-Myers Squibb), tremelimumabe (Pfizer), Ticilimumabe (AstraZeneca) ou AMGP-224 (Glaxo Smith Kline), ou um anticorpo tumor-específico trastuzumabe (Herceptin) para câncer de mama, rituximabe (Rituxan) para linfoma, ou cetuximabe (Erbitux).

53. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18-27, 33-36, 51 ou 52, caracterizado por compreender ainda a administração de um ou mais agentes adicionais comumente usados para tratar o câncer.

54. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado por o agente adicional ser selecionado dentre radiação, quimioterapia, um conjugado de anticorpo-droga e um anticorpo imunomodulador.

55. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado por a quimioterapia ser de cisplatina, carboplatina, paclitaxel, docetaxel, gencitabina, vinorelbina, vinblastina, irinotecano, etoposida ou pemetrexede, ou combinações destes, ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.

56. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado por o anticorpo imunomodulador ser um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti-PD-L1, um anticorpo anti-CD40, um anticorpo anti-CTLA-4, ou um anticorpo anti- OX40, ou qualquer combinação destes.

57. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado por o conjugado de anticorpo-droga alvejar c- Met quinase, LRRC15, EGFR ou CS1 ou qualquer combinação destes.

58. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18-27, 33-36, 51 ou 52-54, caracterizado por o tratamento ou aumento da resposta imune ser repetido periodicamente por períodos de tempo de uma vez a cada 5 dias, 10 dias, uma vez a cada 14 dias, uma vez a cada 21 dias, uma vez a cada mês, até uma vez a cada dois meses, uma vez a cada 3 meses, uma vez a cada 4 meses, uma vez a cada

5 meses, uma vez a cada 6 meses, ou uma vez a cada 7 meses,

ou uma vez a cada 8 meses, ou uma vez a cada 9 meses, ou uma vez a cada 10 meses, ou uma vez a cada 11 meses, ou uma vez por ano como um tratamento de manutenção enquanto o paciente apresentar melhora ou doença estável/sem progressão.