BR112018008946B1 - Variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante, método de produção dos mesmos, composição de limpeza, método de limpeza, polinucleotídeo, vetor de expressão e célula hospedeira - Google Patents
Variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante, método de produção dos mesmos, composição de limpeza, método de limpeza, polinucleotídeo, vetor de expressão e célula hospedeira Download PDFInfo
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Abstract
A presente invenção refere-se a mananases a partir de Paenibacillus sp., polinucleotídeos que codificam as mananases, composições que contêm as mananases e métodos para uso das mesmas. As composições que contêm mananases são adequadas ao uso como detergentes e para limpeza de tecidos e superfícies duras, bem como em uma variedade de outras aplicações industriais.
Description
[001] Este pedido refere-se e reivindica o benefício de prioridadedos Pedidos de Patente Provisórios dos Estados Unidos com os Números de Série 62/251.516 depositado em 5 de novembro de 2015 e 62/278.387 depositado em 13 de janeiro de 2016, cujas totalidades são incorporadas ao presente documento a título de referência.
[002] A presente invenção refere-se a mananases a partir dePaenibacillus sp., polinucleotídeos que codificam as mananases, composições que contêm as mananases e métodos para uso das mesmas. As composições que contêm mananases são adequadas para uso como detergentes e para limpeza de tecidos e superfícies duras, bem como em uma variedade de outras aplicações industriais.
[003] O conteúdo da listagem de sequências enviadoeletronicamente com o pedido como um arquivo de texto ASCII (Nome: NB40843WOPCT_ST25; Tamanho: 321KB; Criado em: 3 de novembro de 2016) faz parte do pedido e é incorporado ao mesmo a título de referência em sua totalidade.
[004] As enzimas mananase, o que inclui endo-β-mananases,foram empregadas em limpeza com detergente para a remoção de manchas de goma através da hidrolisação de mananos. Uma variedade de mananos é encontrada na natureza, tais como, por exemplo, manano linear, glucomanano, galactomanano e glucogalactomanano. Cada manano é compreendido por polissacarídeos que contêm uma cadeia principal ligada a β-1,4 de resíduos de manose que podem ser substituídos até 33% por resíduos de glicose (Yeoman et al., Adv Appl Microbiol, 70:1, 2010, Elsevier). Em galactomananos ouglucogalactomananos, resíduos de galactose são ligados em ligações alfa-1,6 à cadeia principal de manano (Moreira e Filho, Appl Microbiol Biotechnol, 79:165, 2008). Desse modo, a hidrólise de manano a seus açúcares componentes exige endo-1,4-β-mananases que hidrolisam as ligações de cadeia principal para gerar mano-oligossacarídeos de cadeia curta que são adicionalmente degradados para monossacarídeos por 1,4-β-manosidases.
[005] Embora as mananases, tais como, por exemplo, endo-β-mananases sejam conhecidas na técnica de enzimas industriais, ainda existe uma necessidade de mananases adicionais que sejam adequadas para condições e usos particulares.
[006] Variantes, composições e métodos aqui revelados sereferem a uma mananase recombinante ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo gerado através de técnicas de biologia molecular convencionais (consulte, por exemplo, Sambrook et al, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press). Outra modalidade se refere a uma variante de mananase, um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo da mesma que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre: (i) uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 1, 2, 3, 4, 6, 10, 19, 28, 30, 38, 59, 60, 61, 62, 63, 66, 67, 68, 70, 71, 74, 75, 78, 80, 82, 93, 97, 103, 111, 124, 129, 131, 135, 136, 139, 143, 150, 167, 168, 184, 213,214, 217, 225, 228, 235, 242, 244, 258, 259, 261, 283, e 284, e (ii) uma inserção na posição 298; em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Uma modalidade adicional se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 19, 38, 59, 67, 68, 71, 74, 97, 129, 167, 168, 184, 225, 228, 235, 242, 244, 258, e 261; em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14.
[007] Ainda outra modalidade adicional se refere a uma variantede mananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre: (i) uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre M1X, A2X, T3X, G4X, Y6X, N10X, P19X, G28X, S30X, T38X, S59X, L60X, Y61X, T62X, K63X, L66X, N67X, A68X, K70X, N71X, N74X, V75X, Q78X, K80X, I82X, K93X, N97X, V103X, E111X, I124X, Y129X, T131X, S135X, A136X, D139X, K143X, N150X, F167X, P168X, Q184X, N213X, K214X, A217X, G225X, T228X, Y235X, Q242X, K244X, S258X, G259X, N261X, D283X, e T284X e (ii) uma inserção na posiçãoZ298.01X; em que X é qualquer aminoácido; e em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Ainda outra modalidade adicional se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre P19X, T38X, S59X, N67X, A68X, N71X, N74X, N97X, Y129X, F167X, P168X, Q184X, G225X, T228X, Y235X, Q242X, K244X, S258X, e N261X; em que X é qualquer aminoácido; e em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14.
[008] Ainda outra modalidade adicional se refere a uma variantede mananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre: (i) uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre X1V, X1L, X2S, X3R, X4S, X6E, X10T, X10S, X19E, X28A, X28S, X30T, X38E, X59D, X59V, X60Q, X61W, X62E, X63R, X63L, X66V, X67D, X68S, X70R, X71D, X74E, X74S, X75L, X78D, X78H, X80T, X82M, X93R, X97D, X97L, X103I, X111D, X111S, X124V, X129M, X131A, X135L, X136L, X139M, X143Q, X143R, X150T, X167Y, X168A, X168S, X184D, X184L, X213A, X214I, X217P, X225C, X225P, X228V, X235L, X242L, X244L, X258D, X259P, X261Q, X261R, X283S, X284A, e X284E, e (ii) uma inserção na posição Z298.01Q; em que X é qualquer aminoácido; e em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Ainda outra modalidade adicional se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre X19E, X38E, X59V, X67D, X68S, X71D, X74E, X74S, X97D, X97L, X129M, X167Y, X168A, X168S, X184D, X184L, X225C, X225P, X228V, X235L, X242L, X244L, X258D, X261Q, e X261R; em que X é qualquer aminoácido; e em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14.
[009] Outra modalidade adicional se refere a uma variante demananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre: (i) uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre M1V, M1L, A2S, T3R, G4S, Y6E, N10T, N10S, P19E, G28A, G28S, S30T, T38E, S59D, S59V, L60Q, Y61W, T62E, K63R, K63L, L66V, N67D, A68S, K70R, N71D, N74E, N74S, V75L, Q78D, Q78H, K80T, I82M, K93R, N97D, N97L, V103I, E111D, E111S, I124V, Y129M,T131A, T135L, A136L, D139M, K143Q, K143R, N150T, F167Y, P168A, P168S, Q184D, Q184L, N213A, K214I, A217P, G225C, G225P, T228V, Y235L, Q242L, K244L, S258D, G259P, N261Q, N261R, D283S, T284A, e T284E, e (ii) uma inserção na posição Z298.01Q; em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Outra modalidade se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre P19E, T38E, S59D, S59V, N67D, A68S, N71D, N74E, N74S, N97D, N97L, Y129M, F167Y, P168A, P168S, Q184D, Q184L, G225C, G225P, T228V, Y235L, Q242L, K244L, S258D, N261Q, e N261R, em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14.
[0010] Outra modalidade se refere a uma variante de mananase, um polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre: (i) uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 129-244, 129-143-244, 38-258, 38-143-258, 19-184, 19-143-184, 97-225, 97-143-225, 60-61, 67-168, 67-143-168, 63-71, 63-71-143, 228-235, e 143-228-235; (ii) uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre Y129X-K244X, Y129X-K143X-K244X. T38X-S258X, T38X-K143X-S258X, P19X-Q184X, P19X-K143X-Q184X, N97X-G225X,N97X-K143X-G225X, L60X-Y61X, N67X-P168X, N67X-K143X-P168X, K63X-N71X, K63X-N71X-K143X, T228X-Y235X, e K143X-T228X-Y235X, em que X é qualquer aminoácido; (iii) uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre X129M-X244L, X129M- X143Q-X244L, X38E-X258D, X38E-X143Q-X258D, X19E-X184D, X19E-X143Q-X184D, X19E-X184L, X19E-X143Q-X184L, X97DX225C, X97D-X143Q-X225C, X97D-X225P, X97D-X143Q-X225P, X60Q-X61W, X67D-X168S, X67D-X143Q-X168S, X63L-X71D, X63L- X71D-X143Q, X63R-X71D, X63R-X71D-X143Q, X228V-X235L, eX143Q-X228V-X235L, em que X é qualquer aminoácido; e (iv) Y129M- K244L, Y129M-K143Q-K244L, T38E-S258D, T38E-K143Q-S258D,P19E-Q184D, P19E-K143Q-Q184D, P19E-Q184L, P19E-K143Q-Q184L, N97D-G225C, N97D-K143Q-G225C, L60Q-Y61W, N97D-G225P, N97D-K143Q-G225P, N67D-P168S, N67D-K143Q-P168S,K63L-N71D, K63L-N71D-K143Q, K63R-N71D, K63R-N71D-K143Q,T228V-Y235L, e K143Q-T228V-Y235L; em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14.
[0011] Uma modalidade adicional se refere a uma variante demananase, ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende P19E-T38E-K63L-N71D-Y129M-Q184L-K244L-S258D- N261R; N67D-Y129M-P168S-Q184L-K244L-S258D-G259P; P19E-K63L-N67D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-G225C-T228V-K244L; P19E-T38E-N67D-N97D-Y129M-P168S-Q184L-K244L-S258D-N261R;P19E-T38E-N67D-N71D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-P168S-G225C-K244L-S258D-N261R; T38E-K63L-N71D-N97D-Y129M-Q184L-G225C-T228V-Q242L-K244L-S258D-N261R; P19E-K63L-N71D-N97D- Y129M-Q184L-G225C-K244L-S258D-G259P; N10T-T38E-S59V-L60Q- K63R-L66V-A68S-N74S-V75L-N97D-V103I-Y129M-F167Y-Q184L- A217P-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-T38E-N67D-N71D-N97D-Y129M-F167Y-Q184L-A217P-K244L-S258D-N261R; T38E-K63L-N67D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-P168S-Q184L-K244L-S258D-N261R; P19E-T38E-N67D-Y129M-P168S-Q184L-K244L-S258D-N261R; P19E-N67D-N97D-Y129M-P168S-Q184L-K244L; P19E-T38E-K63L-N71D-Y129M-P168S-G225C-T228V-K244L- S258D-N261R; P19E-T38E-N67D-N97D-Q184L-A217P-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R; N10T-P19E-G28S-S30T-T38E-N67D-N71D-N97D-Y129M-P168S-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N97D- V103I-Y129M-K143Q-F167Y-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D- N261R-Z298.01Q; P19E-T38E-N67D-N71D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-P168S-G225C-T228V-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E- T38E-S59V-L60Q-K63L-K70R-N71D-Q78D-K80T-N97D-E111D- Y129M-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-T38E-K63L-N71D-N97D-V103I-Y129M-F167Y-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-T38E-N67D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-K143Q-Q184L-A217P- G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-T38E-S59V-L60Q-K63L-N97D-V103I-Y129M-F167Y-Q184L-G225C- Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N97D-V103I-Y129M-F167Y-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-Q78D-K80T-N97D-I124V-Y129M-K143Q-F167Y-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10S-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63L-N67D-Q78H-K80T-I82M-N97D-Y129M- K143Q-F167Y-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N97D-Y129M- K143Q-P168S-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R- Z298.01Q; G4S-N10T-P19E-T38E-N67D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63L-K70R-N71D-Q78D-K80T-N97D- Y129M-T131A-F167Y-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63L-K70R-N71D-Q78D-K80T-N97D-E111D-Y129M-P168S-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N97D-Y129M-P168S-Q184L-K214I-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q- K63R-N67D-N97D-Y129M-K143Q-P168S-Q184L-G225P-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; M1V-P19E-S30T-T38E-T62E- N67D-N71D-Q78D-N97D-Y129M-K143R-F167Y-P168S-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-T284A-Z298.01Q; Y6E-N10T-P19E-G28S-S30T-T38E-K63L-N67D-N71D-N97D-E111S-Y129M-S135L-P168S-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261Q- D283S-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N71D-N97D-V103I-Y129M-K143Q-P168S-Q184L-G225P-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; A2S-P19E-G28S-S30T-T38E- K63R-N67D-N71D-N74E-K93R-N97D-Y129M-N150T-P168S-Q184L- N213A-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261Q-Z298.01Q; M1L-N10T-P19E-G28A-S30T-T38E-K63L-N67D-N71D-Q78D-N97D-Y129M- A136L-P168A-Q184L-N213A-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R- Z298.01Q; P19E-T38E-S59V-K63R-N67D-N97D-V103I-Y129M-F167Y- Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-G28A-S30T-T38E-K63R-N67D-N97D-Y129M-Q184L-G225C- T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; T3R-N10T-P19E-G28A-S30T-T38E-T62E-N67D-N71D-K93R-N97L-E111S-Y129M- D139M-P168S-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261Q-Z298.01Q; N10T-P19E-G28A-S30T-T38E-S59D-N67D-A68S-N71D-K93R-N97D-Y129M-K143Q-P168S-Q184D-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-T284E-Z298.01Q; P19E-K63L-N71D-Y129M-P168S- Q184L-G225C-K244L; P19E-N67D-N71D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-P168S-Q184L-K244L; P19E-T38E-N67D-Y129M-P168S-Q184L-T228V-K244L; P19E-T38E-N67D-Y129M-Q184L-K244L-S258D-N261R; P19E-K63L-N71D-Y129M-P168S-Q184L-K244L-S258D-N261R; P19E-T38E-K63L-N71D-Y129M-P168S-Q184L-K244L-S258D- G259P; K63L-N71D-Y129M-K143R-P168S-Q184L-G225C-T228V-K244L-S258D-G259P; ou P19E-T38E-K63L-N71D-Y129M-P168S- Q184L-K244L-S258D-N261R, em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14.
[0012] Outra modalidade se refere a um Clado NDL de mananasesque compreende um ou mais variantes de mananase aqui descritos ou um polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo do mesmo, em que a dita variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma compreende um ou mais motivos selecionados dentre a: motivo WXaKNDLXXAI (SEQ ID NO:15) nas posições 31-40, em que Xa é F ou Y e X é qualquer aminoácido ("Motivo 1"); motivo LDXXXGPXGXLT (SEQ ID NO:16) nas posições 263-274, em que X é qualquer aminoácido "Motivo de Deleção 1"); motivo LDX1V/AT/AGPX2GX3LT (SEQ ID NO:17) nas posições 263-274, em que Xi é um M ou L, X2 é N, A ou S e X3 é S, T ou N "Motivo de Deleção 2"); e motivo LDM/LATGPN/AGS/TLT (SEQ ID No:18) nas posições 263-274 "Motivo de Deleção 3"), em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. O Clado NDL de mananases é descrito de maneira mais completa no Pedido de Patente Internacional n° PCT/US15/40057, depositado em 10 de julho de 2015, subsequentemente publicado como WO2016/007929.
[0013] Em outras modalidades, a variante de mananase é umaendo-β-mananase. Em algumas modalidades, a variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma, tem pelo menos 70% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:13. Em algumas modalidades, a variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma, tem atividade de mananase, como, por exemplo, atividade em galactomanano de goma de alfarrobeira ou glucomanano de konjac. Em algumas modalidades, a variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma, tem atividade de mananase na presença de um tensoativo. Em algumas modalidades, a variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma, retém pelo menos 10%, 20%, 30%, 40% ou 50% de atividade de mananase residual a uma temperatura de cerca de 40°C a cerca de 70°C, cerca de 45°C a cerca de 65°C, cerca de 50°C a cerca de 60°C, cerca de 60°C a cerca de 70°C ou cerca de 56°C por um período de pelo menos 5 minutos.
[0014] Em algumas modalidades, a variante de mananase,polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma, tem atividade de limpeza em uma composição detergente. Em algumas modalidades, a variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma, tem atividade de mananase na presença de uma protease. Em algumas modalidades, a variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma, retém pelo menos 50% de atividade de mananase na presença de uma protease e/ou um tensoativo por cerca de 15 ou mais dias de ou cerca de 15 a cerca de 40 dias. Em algumas modalidades, a variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma, tem a capacidade de hidrolisar um substrato selecionado do grupo que consiste em goma guar, goma de alfarrobeira e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, a variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma, não compreende adicionalmente um módulo de ligação de carboidrato.
[0015] Outra modalidade se refere a composições de limpeza quecompreendem um ou mais variantes de mananase ou polipeptídeos recombinantes ou fragmentos ativos dos mesmos aqui descritos. Em algumas modalidades, a composição de limpeza compreende adicionalmente um tensoativo. Em algumas modalidades, o tensoativo é um tensoativo iônico. Em algumas modalidades, o tensoativo iônico é selecionado do grupo que consiste em um tensoativo aniônico, um tensoativo catiônico, um tensoativo zwitteriônico e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, a composição compreende adicionalmente uma enzima selecionado do grupo que consiste em acil transferases, amilases, alfa-amilases, beta-amilases, alfa- galactosidases, arabinases, arabinosidases, aril esterases, beta-galactosidases, beta-glucanases, carrageenases, catalases, celobio- hidrolases, celulases, condroitinases, cutinases, endo-beta-1, 4- glucanases, endo-beta-mananases, exo-beta-mananases, esterases, exo-mananases, galactanases, glucoamilases, hemicelulases, hialuronidases, queratinases, lacases, lactases, ligninases, lipases, enzimas lipolíticas, lipoxigenases, mananases, metaloproteases, oxidases, pectato liases, pectina acetil esterases, pectinases, pentosanases, peridrolases, peroxidases, fenoloxidases, fosfatases, fosfolipases, fitases, poligalacturonases, proteases, pululanases, redutases, ramnogalacturonases, beta-glucanases, tanases, transglutaminases, xilano acetil-esterases, xilanases, xiloglucanases, xilosidases e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, a composição compreende adicionalmente uma protease e uma amilase. Em algumas modalidades, a composição de limpeza é selecionada dentre um detergente para lavagem de roupas, um detergente amaciante de tecido, um detergente para lavagem de louças e um detergente para limpeza de superfícies rígidas. Em algumas modalidades, a composição é uma composição granular, em pó, sólida, em barra, líquida, em tablete, em gel, em pasta, em espuma, em folha ou em dose unitária. Em algumas modalidades, a composição de limpeza está sob uma forma selecionada dentre um líquido, um pó, um sólido granulado e um tablete.
[0016] Modalidades adicionais se referem a um método de limpezaque compreende colocar uma superfície ou item que compreende uma sujeira ou mancha que compreende manano em contato com uma (i) variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma aqui descrito ou (ii) uma composição de limpeza aqui descrita, em que o manano contido na dita sujeira ou mancha é hidrolisado.
[0017] Algumas modalidades se referem ainda a ácidos nucleicosou ácidos nucleicos isolados que codificam as variantes de mananase ou polipeptídeos recombinantes ou fragmentos ativos dos mesmos aqui descritos. Modalidades adicionais se referem a um vetor de expressão que compreende um ácido nucleico ou ácido nucleico isolado aqui descrito ligado de maneira operacional a uma sequência reguladora. Modalidades adicionais se referem a uma célula hospedeira que compreende um vetor de expressão aqui descrito ou ácidos nucleicos que codificam as variantes de mananase ou polipeptídeos recombinantes ou fragmentos ativos dos mesmos aqui descritos. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula bacteriana ou uma célula fúngica. Modalidades adicionais se referem a métodos de produção de uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma aqui descrito que compreende: transformar de maneira estável uma célula hospedeira com um vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo que codificam variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma; cultivar a célula hospedeira transformada sob condições adequadas para produzir uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma; e recuperar a variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma.
[0018] A Figura 1 mostra o desempenho de limpeza de mananasePspMan138 e de mananase comercial (MANNAWAY 4L®, Novozymes AS, Dinamarca) em Goma de Alfarrobeira (CFT C-S-73) a 16oC em Detergente Líquido para Lavagem de Roupas.
[0019] As Figuras 2A-E mostram o alinhamento MUSCLE dasformas maduras de mananases do Clado NDL incluindo mananases PspMan138 e PspMan4 com as sequências de várias formas maduras de outra mananase incluindo BciMan1,Bac.sp._BAD99527.1(1WKY_A), B_nealsonii_AGU71466.1, Bac.sp_WO2015022428-0015 e B. lentus_WO2014100018-0002, cujo alinhamento inclui uma caixa ao redor dos motivos de Clado NDL nas posições 31-40 e 263-274.
[0020] A Figura 3 mostra uma árvore filogenética para aminoácidosdas formas maduras de várias mananases que foram construídas usando o programa de construção Geneious Tree e inclui várias mananases do clado NDL incluindo as mananases PspMan138 e PspMan4.
[0021] A Figura 4 mostra o desempenho de limpeza de mananasePspMan118 e de mananase comercial (MANNAWAY® 4L, Novozymes AS, Dinamarca) em Goma de Alfarrobeira (CFT C-S-73) a 16oC em Detergente em Pó para Lavagem de Roupas.
[0022] A Figura 5 retrata uma comparação estrutural da mananase1WKY_A com a variante de mananase PspMan118, sendo que a cadeia principal da mananase 1WKY_A é mostrada em cinza e a cadeia principal da mananase PspMan118 é mostrada em preto.
[0023] A Figura 6 retrata uma comparação estrutural das estruturasde PspMan118 e 1WKY_A na retrata dos motivos de NDL e Deleção de PspMan118.
[0024] A Figura 7A retrata uma comparação do enovelamento decadeia principal das mananases de PspMan148 (preto) e 2WHL_A (cinza claro) com a porção química de manotriosila ligada a 2WHL_A mostrada como bastões cinza (para indicar a localização relativa do local de ligação de substrato) e as cadeias laterais das dezoito substituições de aminoácido presentes em PspMan148 mostrado como figuras de bastões pretos.
[0025] A Figura 7B retrata uma comparação do enovelamento decadeia principal das mananase de PspMan148 (preto) e 2WHL_A (cinza claro) com a porção química de manotriosial ligada a 2WHL_A mostrado como bastões cinza (para indicar a localização relativa do local de ligação de substrato) e as posições das sete substituições (S30T, S59V, L60Q, K63R, T228V, S258D e N261R) em PspMan148 em torno de e próximo ao local de ligação de substrato mostrado como esferas pretas.
[0026] A Figura 7C retrata uma comparação do enovelamento decadeia principal das mananase PspMan148 (preto) e 2WHL_A (cinza claro) com a porção química de manotriosila ligada a 2WHL_A mostrado como bastões cinzas (para indicar a localização relativa do local de ligação de substrato) e as onze substituições de superfície em PspMan148 mostradas como esferas pretas.
[0027] São descritas no presente documento endo-β-mananasesde Paenibacillus sp., polinucleotídeos que codificam tais endo-β- mananases, composições de limpeza contendo tais mananases e métodos de uso dos mesmos. Em uma modalidade, as endo-β- mananases de Paenibacillus sp. descritas no presente documento têm atividade de glicosil hidrolase e/ou são estáveis na presença de uma composição de limpeza e/ou protease. Esses recursos das endo-β- mananases descritas no presente documento fazem com que as mesmas sejam bem adequadas para uso em uma variedade de aplicações de limpeza e outras aplicações industriais, por exemplo, onde a enzima pode hidrolisar mananos na presença do tensoativo, protease e/ou outros componentes encontrados em uma composição de detergente.
[0028] Os termos a seguir são definidos por motivo de clareza. Ostermos e abreviações não definidos devem estar de acordo com seus significados comuns conforme usados na técnica. Por exemplo, termos técnicos e científicos não definidos no presente documento têm o mesmo significado como comumente entendido por um indivíduo versado na técnica à qual essa revelação pertence (Consultar, por exemplo, Singleton and Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2a Edição, John Wiley and Sons, NY 1994; e Hale and Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY 1991).
[0029] Os termos singulares “um/uma” e “o/a” incluem a referênciaplural a não ser que o contexto indique claramente de outro modo.
[0030] Os termos "manano endo-1,4-β-manosidase","endo-1,4-β- mananase", "endo-β-1,4-mannase", "β-mananase B", "β-1, 4-manano 4- mananohidrolase", "endo-β-mananase", "β-D-mananase", "1,4-β-D- manano manano-hidrolase" ou "endo-β-mananase" (EC 3.2.1.78) se referem a uma enzima com capacidade para hidrólise aleatória de ligações 1,4-β-D-manosidicas em mananos, galactomananos e glucomananos. Endo-1,4-β-mananases são membros de diversas famílias de glicosil hidrolases, o que inclui GH26 e GH5. Em particular, endo-β-mananases constituem um grupo de polissacarídeos que degradam mananos e indicam enzimas que têm capacidade para clivar cadeias de poliose que contêm unidade de manose (isto é, têm capacidade para clivar ligações glicosídicas em mananos, glucomananos, galactomananos e galactogluco-mananos). As "endo-β- mananases" descritas no presente documento podem possuir atividades enzimáticas adicionais (por exemplo, atividades de endo-1,4- β-glucanase, 1,4-β-manosidase e celodextrinase).
[0031] Os termos "mananase", "enzima manosídica", "enzimamanolítica", "enzima de mananase", "polipeptídeos de mananase" ou "proteínas de mananase" se referem a uma enzima, polipeptídeo ou proteína que podem degradar manano. A enzima mananase pode, por exemplo, ser uma endo-β-mananase, uma exo-β-mananase ou uma glicosil hidrolase. Conforme usado no presente documento, a atividade de mananase pode ser determinada de acordo com qualquer procedimento conhecido na técnica (Consultar, por exemplo, Lever, Anal. Biochem, 47:273, 1972; Eriksson and Winell, Acta Chem. Scand., (1968), 22:1924; US 6.602.842; e WO95/35362A1).
[0032] Conforme usado no presente documento, "mananos" sãopolissacarídeos que têm uma cadeia principal composta de manose ligada a β-1,4; "glucomananos" são polissacarídeos que têm uma cadeia principal de manose e glicose ligados a β-1,4 mais ou menos regularmente alternados; "galactomananos" e "galactoglucomananos" são mananos e glucomananos com ramificações laterais de galactose ligadas a alfa-1,6. Esses compostos podem ser acetilados. A degradação de galactomananos e galactoglucomananos é facilitada por remoção completa ou parcial das ramificações laterais de galactose. Adicionalmente, a degradação dos mananos, glucomananos, galactomananos e galactoglucomananos acetilados é facilitada por desacetilação completa ou parcial. Os grupos acetila podem ser removidos por álcali ou por manano acetilesterases. Os oligômeros que são liberados das mananases ou por uma combinação de mananases e alfa-galactosidase e/ou manano acetil esterases podem ser adicionalmente degradados para liberar maltose por β-manosidase e/ou β-glucosidase.
[0033] O termo "modificação” se refere a qualquer mudança oualteração em uma sequência de aminoácidos, o que inclui a substituição de um aminoácido na posição identificada da sequência de aminoácidos de interesse por um aminoácido que é diferente do aminoácido inicial, deleção de um aminoácido na posição identificada da sequência de aminoácidos de interesse, inserção de um aminoácido na posição identificada da sequência de aminoácidos de interesse, substituição de uma cadeia lateral de aminoácido na sequência de aminoácidos de interesse e/ou modificação química da sequência de aminoácidos de interesse.
[0034] Os termos "atividade catalítica" ou "atividade" descrevemquantitativamente a conversão de um determinado substrato em condições de reação definidas. O termo "atividade residual" é definido como a razão da atividade catalítica da enzima em um determinado conjunto de condições para a atividade catalítica em um conjunto diferente de condições. O termo "atividade específica" descreve quantitativamente a atividade catalítica por quantidade de enzima em condições de reação definidas.
[0035] O termo "estabilidade de pH" descreve a habilidade de umaproteína para suportar uma exposição limitada aos valores de pH que desviam significativamente do pH em que sua estabilidade é ideal (por exemplo, mais de uma unidade de pH acima ou abaixo do ideal de pH), sem perder sua atividade em condições em que sua atividade é mensurável.
[0036] O termo "estabilidade de detergente" se refere à estabilidadede um componente de composição de detergente especificado (tal como uma enzima hidrolítica) em uma mistura de composição de detergente.
[0037] O termo "peridrolase" se refere a uma enzima comcapacidade para catalisar uma reação que resulta na formação de um perácido adequado para aplicações tais como limpeza, branqueamento e desinfecção.
[0038] O termo "aquoso", conforme usado nas expressões"composição aquosa" e "ambiente aquoso" se refere a uma composição que é constituída de pelo menos 50% de água. Uma composição aquosa pode conter pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de água.
[0039] O termo "tensoativo" se refere a qualquer compostogeralmente reconhecido na técnica como tendo qualidades ativas na superfície. Tensoativos geralmente incluem compostos aniônicos, catiônicos, não iônicos e zwitteriônicos que são adicionalmente descritos no presente documento.
[0040] O termo "propriedade de superfície” é usado em referência àcarga eletrostática, assim como às propriedades tais como a hidrofobicidade e hidrofilicidade exibidas pela superfície de uma proteína.
[0041] O termo "estabilidade de quelante" se refere a endo-β-mananases da presente revelação que retêm uma quantidade específica de atividade enzimática durante um período de tempo em condições prevalecentes durante o processo manosídico, hidrolisante, de limpeza ou outros processos revelados no presente documento, por exemplo, enquanto expostas a ou em contato com agentes quelantes. Em algumas modalidades, a mananase retém pelo menos cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 92%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99% de atividade de mananase após o contato com um agente quelante durante um determinado período de tempo, por exemplo, pelo menos cerca de 10 minutos, cerca de 20 minutos, cerca de 40 minutos, cerca de 60 minutos, cerca de 100 minutos, etc.
[0042] Os termos "estabilidade térmica" e "termoestável" se referea mananases que retêm uma quantidade especificada depois da exposição a temperaturas elevadas durante um período de tempo em condições prevalecentes durante os processos manosídico, hidrolisante, de limpeza e outros processos, por exemplo, enquanto expostas a temperaturas elevadas. Em algumas modalidades, a mananase retém pelo menos cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 92%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99% de atividade de mananase após a exposição a temperaturas elevadas, por exemplo, pelo menos cerca de 50 °C, cerca de 55 °C, cerca de 60 °C, cerca de 65 °C ou cerca de 70 °C, durante um determinado período de tempo, por exemplo, pelo menos cerca de 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 40 minutos, 50 minutos, 60 minutos, 120 minutos, 180 minutos, 240 minutos, 300 minutos, etc.
[0043] O termo "atividade de limpeza" se refere ao desempenho delimpeza alcançado por uma endo-β-mananase em condições prevalecentes durante os processos manosídico, hidrolisante, de limpeza e outros processos relevados no presente documento. Em algumas modalidades, o desempenho de limpeza é determinado pela aplicação de vários arranjos de limpeza relacionados a manchas sensíveis à enzima oriundas de produtos alimentícios, agentes domésticos ou produtos de cuidados pessoais. Algumas dessas manchas incluem, por exemplo, sorvete, ketchup, molho barbecue, maionese, sopas, achocolatado, pudim de chocolate, sobremesas congeladas, xampu, loção corporal, produtos de proteção solar, pasta dental, farinha de semente de alfarroba ou guar conforme determinado por várias metodologias cromatográfica, espectrofotométrica ou outras metodologias quantitativas após a submissão das manchas a condições de lavagem padrão. Ensaios exemplificativos incluem, mas sem limitação, aqueles descritos nos documentos número WO99/34011, US 6.605.458 e US 6.566.114, assim como, aqueles métodos descritos nos Exemplos.
[0044] Os termos "superfície limpa" e "tecido limpo" se referem auma superfície ou tecido, respectivamente, que tem uma remoção de mancha percentual de pelo menos 10%, preferencialmente pelo menos 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ou 40% de uma superfície ou tecido sujos.
[0045] O termo "quantidade eficaz" quando usado em combinaçãocom uma variante de mananase ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos se refere à quantidade de variante de mananase ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos necessários para alcançar o nível desejado de atividade enzimática na composição de limpeza especificada. Tais quantidades eficazes são prontamente determinadas por um indivíduo de habilidade comum na técnica e têm base em muitos fatores, tais como a variante de mananase ou polipeptídeo recombinante particular ou fragmento ativo dos mesmos que é usado, a aplicação de limpeza, a composição específica da composição de limpeza e se uma composição líquida ou seca (por exemplo, em grânulo, barra, pó, sólida, líquida, tablete, gel, pasta, espuma, lâmina ou dose unitária) é exigida.
[0046] O termo "ingrediente adjunto" quando usado em combinaçãocom uma composição de limpeza significa qualquer material líquido, sólido ou gasoso selecionado para o tipo particular de composição de limpeza desejada e a forma do produto (por exemplo, composição em líquido, grânulo, pó, barra, pasta, aspersão, tablete, gel, dose unitária, lâmina ou espuma), cujos materiais são também preferencialmente compatíveis com a variante de mananase ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos usada na composição. Em algumas modalidades, granular composições estão em forma "compacta", enquanto em outras modalidades, as composições líquidas estão em uma forma "concentrada".
[0047] Os termos "composições de limpeza" e "formulações delimpeza" se referem a misturas por adição de ingredientes químicos que encontram uso na remoção de compostos indesejados (por exemplo, sujeira ou manchas) de itens ou superfícies a serem limpas, tais como, por exemplo, tecido, louças, lentes de contato, superfícies sólidas, cabelo, pele e dentes. As composições ou formulações podem estar na forma de um líquido, gel, grânulo, pó, barra, pasta, aspersão, tablete, gel, dose unitária, lâmina ou espuma, dependendo da superfície ou item a ser limpo e a forma desejada da composição ou formulação.
[0048] Os termos "composição de detergente" e "formulação dedetergente" se referem a misturas de ingredientes químicos destinados para o uso em um meio de lavagem para a limpeza de objetos sujos. Composições/formulações de detergente em geral incluem pelo menos um tensoativo e podem incluir opcionalmente enzimas hidrolíticas, oxidorredutases, adjuvante técnico, agentes de branqueamento, ativadores de alvejante, agentes de oxidação negra, corantes fluorescentes, inibidores de empelotamento, agentes de mascaramento, ativadores de enzima, antioxidantes e solubilizantes.
[0049] O termo "composição de lavagem de louças" se refere atodas as formas de composições o que inclui, por exemplo, granular, dose unitária e formas líquidas para limpeza de louças e talheres. Em algumas modalidades, a composição de lavagem de louças é uma composição de "lavagem de louças automática" que encontra uso em máquinas de lavagem de louças automáticas. O termo "louças" se refere a louças (por exemplo, pratos, copos, vidros, tigelas e recipientes) e talheres (por exemplo, utensílios que incluem, mas sem limitação a colheres, facas e garfos) de qualquer material, o que inclui, mas sem limitação, cerâmica, plástico, metais, porcelana, vidro e acrílico.
[0050] O termo "branqueamento" se refere ao tratamento de ummaterial (por exemplo, tecido, lavagem de roupas, polpa, etc.) ou superfície para uma extensão de tempo suficiente e em pH apropriado e condições de temperatura para efetuar um clareamento (isto é., branqueamento) e/ou limpeza do material. Exemplos de substâncias químicas adequadas para branqueamento incluem, mas sem limitação, ClO2, H2O2, perácidos e NO2.
[0051] O termo "desempenho de lavagem" de uma variante demananase ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos se refere à contribuição da variante ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos paro lavar que fornece desempenho de limpeza adicional à composição de detergente. O desempenho da lavagem é comparado sob condições de lavagem relevantes. O termo "condições de lavagem relevantes" é usado no presente documento para indicar as condições, particularmente temperatura de lavagem, tempo, mecânica de lavagem, concentração de bolhas de sabão, tipo de detergente e dureza da água, realmente usada nas tarefas domésticas em um segmento do mercado de detergente de louças ou roupas.
[0052] Conforme usado no presente documento, o termo"desinfetar" se refere à remoção de contaminantes das superfícies, assim como a inibição ou o extermínio de micróbios nas superfícies dos itens.
[0053] A forma "compacta" das composições de limpeza nopresente documento é a melhor refletida por densidade e, em termos de composição, pela quantidade de sal de carga inorgânico. Os sais de carga inorgânicos são ingredientes convencionais das composições de detergente na forma de pó. Em composições de detergenteconvencionais, os sais de carga estão presentes em quantidades substanciais, tipicamente cerca de 17 a cerca de 35% em peso da composição total. Em contrapartida, em composições compactas, o sal de carga está presente em quantidades que não excedem cerca de 15% da composição total. Em algumas modalidades, o sal de carga está presente em quantidades que não excedem cerca de 10% ou, com mais preferência, cerca de 5% em peso da composição. Em algumas modalidades, os sais de carga inorgânica são selecionados dentre os sais de metal alcalino e alcalino-terroso de sulfatos e cloretos. Em algumas modalidades, um sal de carga preferencial é sulfato de sódio.
[0054] O termo "tecido" se refere a, por exemplo, material tecido,costurado e não tecido, assim como fibras de poliéster e filamentos que podem ser convertidos para, por exemplo, tecidos de fios e tecidos, costurados ou não tecidos. O termo engloba material feito a partir de fibras naturais, assim como sintéticas (por exemplo, fabricadas).
[0055] Um ácido nucleico ou polinucleotídeo é "isolado" quando omesmo é pelo menos parcial ou completamente separado dos outros componentes, o que inclui, mas sem limitação, por exemplo, outras proteínas, ácidos nucleicos e células. De modo similar, um polipeptídeo, proteína ou peptídeo é "isolado" quando o mesmo é parcial ou completamente separado de outros componentes, o que inclui, mas sem limitação, por exemplo, outras proteínas, ácidos nucleicos e células. Em base molar, uma espécie isolada é mais abundante do que são outras espécies em uma composição. Por exemplo, uma espécie isolada pode compreender pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% (em uma base molar) de todas as espécies macromoleculares presentes. De preferência, a espécie de interesse é purificada até homogeneidade essencial (isto é, espécies contaminantes não podem ser detectadas na composição por métodos de detecção convencional). A pureza e a homogeneidade podem ser determinadas com o uso de um número de técnicas bem conhecidas na arte, como eletroforese de gel de agarose ou de poliacrilamida de um ácido nucleico ou uma amostra de proteína, respectivamente, seguida pela visualização no manchamento. Se desejado, uma técnica de alta resolução, como cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) ou um meio semelhante pode ser utilizado para purificação do material.
[0056] O termo "purificado" conforme aplicado aos ácidos nucleicosou polipeptídeos, de modo geral, denotados como um ácido nucleico ou polipeptídeo que é essencialmente livre de outros componentes conforme determinado pelas técnicas analíticas bem conhecidas na técnica (por exemplo, um polipeptídeo ou polinucleotídeo purificado forma uma banda discreta em um gel eletroforético, eluato cromatográfico e/ou um meio submetido à centrifugação de gradiente por densidade). Por exemplo, um ácido nucleico ou polipeptídeo que origina essencialmente uma banda em um gel eletroforético é "purificado". Um ácido nucleico ou polipeptídeo purificado é pelo menos cerca de 50% puro, usualmente pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% ou mais puro (por exemplo, por cento, em peso, em uma base molar). Em um sentido relacionado, uma composição é enriquecida para uma molécula quando há um aumento substancial na concentração da molécula após aplicação de uma técnica de purificação ou enriquecimento. O termo "enriquecido" se refere a um composto, polipeptídeo, célula, ácido nucleico, aminoácido, ou outro material especificado ou componente que está presente em uma composição em uma concentração relativa ou absoluta que é maior do que em uma composição inicial.
[0057] Conforme usado no presente documento, um "polipeptídeo"se refere a uma molécula que compreende uma pluralidade de aminoácidos ligados por ligações de peptídeo. Os termos "polipeptídeo," "peptídeo" e "proteína" são usados indistintamente. Proteínas podem opcionalmente ser modificadas (por exemplo, glicosiladas, fosforiladas, aciladas, farnesiladas, preniladas e sulfonadas) para adicionar funcionalidade. Quando tais sequências de aminoácidos exibem atividade, as mesmas podem ser denominadas "enzima". São usados os códigos convencionais de uma letra ou três letras para resíduos de aminoácidos, com sequências de aminoácidos sendo apresentadas na orientação padrão amino-para-carbóxi terminal (isto é, N^C).
[0058] O termo "polinucleotídeo" engloba DNA, RNA, heteroduplexe moléculas sintéticas com capacidade para codificar um polipeptídeo. Os ácidos nucleicos podem ser de filamento único ou filamento duplo e podem ter modificações químicas. Os termos "ácido nucleico" e "polinucleotídeo" são usados indistintamente. Uma vez que o código genético é degenerado, pode ser usado mais do que um códon para codificar um aminoácido particular, e as presentes composições e métodos abrangem sequências de nucleotídeos que codificam uma sequência de aminoácidos particular. A menos que indicado de outro modo, sequências de ácidos nucleicos são apresentadas na orientação 5‘-para-3‘.
[0059] Conforme usado no presente documento, os termos "tipo selvagem" e "nativo" se referem a polipeptídeos ou polinucleotídeos que são encontrados na natureza.
[0060] Os termos “do tipo selvagem” e “parental” relativamente a umpolipeptídeo, se referem a um polipeptídeo que ocorre naturalmente e que não inclui uma substituição, inserção, ou deleção feita por humano em uma ou mais posições de aminoácidos. De modo similar, os termos "do tipo selvagem" e "parental", em relação a um polinucleotídeo, se referem a um polinucleotídeo de ocorrência natural que não inclui uma substituição, inserção ou deleção feita por humano em um ou mais nucleosídeos. Contudo, observa-se que um polinucleotídeo de codificação de um polinucleotídeo do tipo selvagem ou parental não se limita a um polinucleotídeo de ocorrência natural e engloba qualquer polinucleotídeo de codificação de polinucleotídeo do tipo selvagem ou parental.
[0061] O termo "referência", em relação a um polipeptídeo, se referea um polipeptídeo de ocorrência natural que não inclui uma substituição, inserção, deleção feita pelo humano em uma ou mais posições de aminoácido, assim como um polipeptídeo que inclui uma ou mais substituições, inserções ou deleções feitas por humano em uma ou mais posições de aminoácido. De modo similar, o termo "referência", em relação a um polinucleotídeo, se refere a um polinucleotídeo de ocorrência natural que não inclui uma similarmente, inserção ou deleção feita pelo humano em um ou mais nucleosídeos, assim como um polinucleotídeo que inclui uma ou mais substituições, inserções ou deleções feitas pelo humano em um ou mais nucleosídeos. Contudo, observa-se que um polinucleotídeo de codificação de um polinucleotídeo do tipo selvagem ou parental não se limita a um polinucleotídeo de ocorrência natural e engloba qualquer polinucleotídeo de codificação de polinucleotídeo do tipo selvagem ou parental.
[0062] O código de uma letra "Z" identifica uma inserção ou deleçãoem uma sequência de aminoácidos parental ou de referência. Para uma inserção relativa à sequência parental ou de referência, o código de uma letra "Z" está na esquerda do número de posição e inclui adicionalmente um número (por exemplo, .01) antes de cada aminoácido que é inserido para indicar a ordem das inserções. Por exemplo, a inserção de um aminoácido, glutamina (Q), na posição 298 seria retratada como "Z298.01Q"; a inserção de um aminoácido, X (em que X pode ser qualquer aminoácido) na posição 298 seria retratado como "Z298.01X"; e a inserção de três aminoácidos alanina (A), serina (S) e tirosina (Y) entre a posição 87 e 88 seriam retratados como "Z87.01A/Z87.02S/Z87.03Y". Para uma deleção, o código de uma letra "Z" está do lado direito do número de posição. Por exemplo, a deleção de uma alanina (A) da posição 100 seria retratada como A100Z. Uma combinação de algumas das inserções e deleções acima seriam retratadas conforme a seguir:"G87S/Z87.01A/Z87.02S/Z87.03Y/A100Z".
[0063] O termo "variante de mananase" se refere a um polipeptídeoque é derivado de um polipeptídeo de referência através da substituição, adição ou deleção, de um ou mais aminoácidos, tipicamente através de técnicas de DNA recombinante. Uma variante de mananase pode diferir de um polipeptídeo de referência por um pequeno número de resíduos de aminoácido e pode ser definido pelo nível de homologia/identidade de sequência de aminoácidos primária com o polipeptídeo de referência ao longo do comprimento do domínio catalítico. Por exemplo, uma variante de mananase tem pelo menos 59%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência de aminoácido com um polipeptídeo de referência. O polipeptídeo de referência inclui mananases de ocorrência natural e recombinantes dentro da subfamília GH5_8 de mananases (endo-1,4 β- manosidases, EC 3.2.1.78). Essa subfamília GH5_8 é descrita de modo mais completo em Aspeborg et al (2012), "Evolution, substrate specificity and subfamily classification of glycosyl hydrolase family 5 (GH5)", BMC Evolutionary Biology, 12:186. Mananases bacterianas GH5_8 exemplificadoras incluem, por exemplo, mananases do Clado NDL, como, por exemplo, PspMan4 (SEQ ID NO:14) e PspMan9 (SEQ ID NO:30); e outras mananases como, por exemplo, Bac. sp.1WKY_A (BAD99527.1)(SEQ ID NO:43), B. agaradhaerens 2WHL_A (resíduos 30-330 de Q5YEX6)(SEQ ID NO:45), WO2015022428-0015(SEQ ID NO:44), resíduos 32-330 de US6566114-002 (SEQ ID NO:160) e resíduos 32-340 de US6566114-002 (SEQ ID NO:162). O Clado NDL de mananases é descrito de maneira mais completa no Pedido de Patente Internacional n° PCT/US15/40057, depositado em 10 de julho de 2015, subsequentemente publicado como WO2016/007929.
[0064] O termo "polinucleotídeo variante" se refere a umpolinucleotídeo que codifica uma variante de mananase, tem um grau especificado de homologia/identidade com um polinucleotídeo parental, ou hibridiza em condições estringentes para um polinucleotídeo parental ou complemento do mesmo. Por exemplo, um polinucleotídeo variante tem pelo menos 59%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência de nucleotídeo com um polinucleotídeo parental.
[0065] A identidade de sequência pode ser determinada com o usode programas tais como BLAST, ALIGN e CLUSTAL com o uso de parâmetros padrão. (Consulta, por exemplo, Altschul et al. [1990] J. Mol. Biol. 215:403 a 410; Henikoff et al. [1989] Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:10915; Karin et al. [1993] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873; e Higgins et al. [1988] Gene 73:237 a 244). Software para realizar análise BLAST está publicamente disponível junto ao National Center for Biotechnology Information (NCBI). Os bancos de dados podem também ser pesquisados com o uso de FASTA (Pearson et al. [1988] Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85:2.444 a 2.448). Uma indicação de que dois polipeptídeos são substancialmente idênticos é que o primeiro polipeptídeo tem imunologicamente reatividade cruzada com o segundo polipeptídeo. Tipicamente, os polipeptídeos que diferem por substituições de aminoácidos conservadoras têm imunologicamente reatividade cruzada. Portanto, um polipeptídeo é substancialmente idêntico a um segundo polipeptídeo, por exemplo, quando os dois polipeptídeos diferem apenas por uma substancialmente conservadora. Outro algoritmo útil para comparação de múltiplas sequências proteicas é o programa MUSCLE do software Geneious (Biomatters Ltd.) (Robert C. Edgar. MUSCLE: alinhamento de múltiplas sequências com alta precisão e alto rendimento Nucl. Acids Res. (2004) 32 (5): 1.792 a 1.797).
[0066] O termo "derivado de" abrange os termos "originado a partirde", "obtido a partir de", "obtenível a partir de", "isolado a partir de" e "criado a partir de" e indica geralmente que um material especificado encontra a sua origem em outro material especificado ou tem recursos que podem ser descritos em referência ao outro material especificado.
[0067] O termo "hibridização" se refere ao processo pelo qual umfilamento de ácido nucleico se junta a um filamento complementar através do pareamento de base, conforme conhecido na técnica.
[0068] O termo "condições de hibridização" se refere às condiçõesnas quais as reações de hibridização são conduzidas. Essas condições são tipicamente classificadas pelo grau de "estringência" das condições sob as quais a hibridização é medida. O grau de estringência pode se basear, por exemplo, na temperatura de fusão (Tm) da sonda ou complexo de ligação a ácido nucleico ou sonda. Por exemplo, a "estringência máxima” ocorre tipicamente a cerca de Tm-5°C (5°C abaixo da Tm da sonda); "estringência alta" a cerca de 5 a 10°C abaixo da Tm; "estringência intermediária" a cerca de 10 a 20°C abaixo da Tm da sonda; e "baixa estringência" a cerca de 20 a 25°C abaixo da Tm. Alternativa ou adicionalmente, condições de hibridização podem ser baseadas nas condições de sal ou força iônica de hibridização e/ou uma ou mais lavagens de estringência, por exemplo, 6X SSC = estringência muito baixa; 3X SSC = estringência baixa a média; 1X SSC = estringência média; e 0,5X SSC = estringência alta. Funcionalmente, podem ser usadas condições de máxima estringência para identificar sequências de ácidos nucleicos com identidade estrita ou identidade quase estrita com a sonda de hibridização; enquanto que são usadas condições de alta estringência para identificar sequências de ácidos nucleicos com cerca de 80% ou mais de identidade de sequência com a sonda. Para aplicações que requerem elevada seletividade, é tipicamente desejável para usar condições relativamente estringentes para formar os híbridos (p.ex., condições salinas relativamente baixas e/ou elevada temperatura).
[0069] Os termos "substancialmente similar" e "substancialmenteidêntico" no contexto de pelo menos dois ácidos nucleicos ou polipeptídeos significa que um polinucleotídeo ou polipeptídeo compreende uma sequência que tem pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com uma sequência parental ou de referência ou uma sequência que inclui substituições, inserções e deleções ou modificações de aminoácidos feitas apenas para desviar-se da presente descrição sem adicionar funcionalidade.
[0070] O termo "vetor de expressão" se refere a um construto deDNA que contém uma sequência de DNA que codifica o polipeptídeo especificado e é operacionalmente ligado a uma sequência de controle adequada com capacidade para efetuar a expressão dos polipeptídeos em um hospedeiro adequado. Tais sequências de controle incluem um promotor para efetuar a transcrição, uma sequência operadora opcional para controlar tal transcrição, uma sequência codificando locais de ligação de ribossomo de mRNA adequados, e sequências que controlam a terminação de transcrição e tradução. O vetor pode ser um plasmídeo, uma partícula de fago, ou simplesmente uma inserção genômica potencial. Uma vez transformado em um hospedeiro adequado, o vetor pode se replicar e funcionar independentemente do genoma do hospedeiro, ou pode, em alguns casos, se integrar no próprio genoma.
[0071] O termo “recombinante”, se refere a material genético (istoé, ácidos nucleicos, polipeptídeos que eles codificam, e vetores e células compreendendo esses polinucleotídeos) que foi modificado para alterar a sua sequência ou características de expressão, tal como por mutação da sequência codificadora para produzir um polipeptídeo alterado, fusão da sequência codificadora com a de um outro gene, colocação de um gene sob o controle de um promotor diferente, expressão de um gene em um organismo heterólogo, expressão de um gene a níveis diminuídos ou elevados, expressão de um gene condicional ou constitutivamente de forma diferente em relação ao seu perfil natural de expressão, e semelhantes. Geralmente, os ácidos nucleicos recombinantes, polipeptídeos, e células neles baseadas foram manipulados pelo homem de modo a não serem idênticos a ácidos nucleicos, polipeptídeos e células relacionadas encontradas na natureza.
[0072] Uma “sequência-sinal” se refere a uma sequência deaminoácidos ligada à parte N-terminal de um polipeptídeo, e que facilita a secreção da forma madura da proteína da célula. A forma madura da proteína extracelular carece da sequência-sinal que é clivada durante o processo de secreção.
[0073] O termo “marcador seletivo” ou “marcador selecionável” serefere a um gene capaz de expressão em uma célula hospedeira que permite facilidade de seleção desses hospedeiros contendo um ácido nucleico ou vetor introduzido. Exemplos de marcadores selecionáveis incluem, mas sem limitação, substâncias antimicrobianas (por exemplo, higromicina, bleomicina ou cloranfenicol) e/ou genes que conferem uma vantagem metabólica, tal como uma vantagem nutricional, à célula hospedeira. O termo "produto de gene selecionável" se refere a um gene que codifica uma atividade enzimática que confere resistência a uma antibiótico ou fármaco na célula em que o marcador selecionável é expresso.
[0074] O termo “elemento regulador”, conforme usado no presentedocumento, se refere a um elemento genético que controla algum aspecto da expressão das sequências de ácidos nucleicos. Por exemplo, um promotor é um elemento regulador que facilita a iniciação da transcrição de uma região codificadora operacionalmente ligada. Elementos reguladores adicionais incluem sinais de splicing, sinais de poliadenilação e sinais de terminação.
[0075] O termo "células hospedeiras" geralmente se referem ahospedeiros procarióticos ou eucarióticos que são transformados ou transfectados com vetores construídos com o uso de técnicas de DNA recombinante conhecidas na técnica. As células hospedeiras transformadas têm capacidade para replicar vetores de codificação das variantes de proteína ou expressar a variante de proteína desejada. No caso dos vetores que codificam a pré ou pró forma da variante de proteína, tais variantes, quando expressas, são tipicamente secretadas da célula hospedeira para o meio de célula hospedeira.
[0076] O termo “introduzido” no contexto da inserção de umasequência de ácidos nucleicos em uma célula, significa transformação, transdução ou transfecção. Meios de transformação incluem a transformação de protoplastos, precipitação de cloreto de cálcio, eletroporação, ADN nu, e semelhantes conhecidos na técnica. (Consultar, Chang e Cohen [1979] Mol. Gen. Genet. 168:111 a 115; Smith et al. [1986] Appl. Env. Microbiol. 51:634; e o artigo de revisão de Ferrari et al., in Harwood, Bacillus, Plenum Publishing Corporation, páginas 57 a 72, 1989).
[0077] O termo "cerca de" quando usado em combinação com umvalor numérico se refere a uma faixa de -10% a +10% do valor numérico. Por exemplo, a expressão um "valor de pH de cerca de 6" se refere a valores de pH de 5,4 a 6,6.
[0078] Quaisquer títulos usados no presente documento sãofornecidos em razão de conveniência e não devem ser interpretados como limitações. A descrição incluída abaixo de um título pode se aplicar ao relatório descritivo como um todo.
[0079] Variantes, composições e métodos revelados no presentedocumento se referem a uma mananase recombinante, ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo dos mesmos que compreende duas ou mais modificações, em que tais variantes são técnicas de biologia molecular convencionais (consultar, por exemplo, Sambrook et al, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press). Em uma modalidade, a mananase variante ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo do mesmo compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre pelo menos uma substituição, pelo menos uma deleção e pelo menos uma inserção. Em algumas modalidades, a modificação compreende uma combinação de mutações, como, por exemplo, uma combinação de pelo menos uma substituição e pelo menos uma deleção, pelo menos uma deleção e pelo menos uma inserção, pelo menos uma inserção e pelo menos uma substituição ou pelo menos uma substituição, pelo menos uma deleção e pelo menos uma inserção.
[0080] Uma modalidade se refere a uma variante de mananase, umpolipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo da mesma que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre: (i) uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 1, 2, 3, 4, 6, 10, 19, 28, 30, 38, 59, 60, 61, 62, 63, 66, 67, 68, 70, 71, 74, 75, 78, 80, 82, 93, 97, 103, 111, 124, 129, 131, 135, 136, 139, 143, 150, 167, 168, 184, 213, 214, 217, 225, 228, 235, 242, 244, 258, 259, 261, 263, 276, 283, e 284 e (ii) uma inserção na posição 298; em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Ainda outra modalidade se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre: (i) uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 1, 2, 3, 4, 6, 10, 19, 28, 30, 38, 59, 60, 62, 63, 66, 67, 68, 70, 71, 74, 75, 78, 80, 82, 93, 97, 103, 111, 124, 129, 131, 135, 136, 139, 143, 150, 167, 168, 184, 213, 214, 217, 225, 228, 235, 242, 244, 258, 259, 261, 263, 276, 283, e 284 e (ii) uma inserção na posição 298; em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Ainda outra modalidade se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre: (i) uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 1, 2, 3, 4, 6, 10, 19, 28, 30, 38, 59, 60, 62, 63, 66, 67, 68, 70, 71, 74, 75, 78, 80, 82, 93, 97, 103, 111, 124, 129, 131, 135, 136, 139, 143, 150, 167, 168, 184, 213, 214, 217, 225, 228, 235, 242, 244, 258, 259, 261, 283, e 284 e (ii) uma inserção na posição 298; em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Ainda outra modalidade adicional se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre: (i) uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 1, 4, 6, 10, 19, 28, 30, 38, 59, 60, 63, 66, 67, 68, 70, 71, 74, 75, 78, 80, 82, 97, 103, 111, 124, 129, 131, 143, 167, 168, 184, 214, 217, 225, 228, 235, 242, 244, 258, 259, 261, 263, 276, e 284 e (ii) uma inserção na posição 298; em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14.
[0081] Uma modalidade adicional se refere a uma variante demananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre: (i) uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 19, 30, 38, 59, 60, 63, 67, 68, 71, 74, 97, 103, 129, 167, 168, 184, 225, 228, 235, 242, 244, 258, e 261, e (ii) uma inserção na posição 298; em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Outra modalidade se refere a uma variante de mananase, um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo da mesma que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre: (i) uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 19, 30, 38, 59, 60, 63, 67, 97, 103, 129, 167, 184, 225, 228, 235, 244, 258, e 261, e (ii) uma inserção na posição 298; em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Ainda outra modalidade adicional se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 19, 38, 59, 67, 68, 71, 74, 97, 129, 167, 168, 184, 225, 228, 235, 242, 244, 258, e 261; em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14.
[0082] Outra modalidade adicional se refere a uma variante demananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre: (i) uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre M1X, A2X, T3X, G4X, Y6X, N10X, P19X, G28X, S30X, T38X, S59X, L60X, Y61X, T62X, K63X, L66X, N67X, A68X, K70X, N71X, N74X, V75X, Q78X, K80X, I82X, K93X, N97X, V103X, E111X, I124X, Y129X, T131X, S135X, A136X, D139X, K143X, N150X, F167X, P168X, Q184X, N213X, K214X, A217X, G225X, T228X, Y235X, Q242X, K244X, S258X, G259X, N261X, L263X, F276X, D283X, e T284X e (ii) uma inserção na posição Z298.01X; em que X é qualquer aminoácido; e em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Uma outra modalidade adicional se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre: (i) uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre M1X, A2X, T3X, G4X, Y6X, N10X, P19X, G28X, S30X, T38X, S59X, L60X, T62X, K63X, L66X, N67X, A68X, K70X, N71X, N74X, V75X, Q78X, K80X, I82X, K93X, N97X, V103X, E111X, I124X, Y129X, T131X, S135X, A136X, D139X, K143X, N150X, F167X, P168X, Q184X, N213X, K214X, A217X, G225X, T228X, Y235X, Q242X, K244X, S258X, G259X, N261X, L263X, F276X, D283X, eT284X e (ii) uma inserção na posição Z298.01X; em que X é qualquer aminoácido; e em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Ainda outra modalidade adicional se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre: (i) uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre M1X, G4X, Y6X, N10X, P19X, G28X, S30X, T38X, S59X, L60X, K63X, L66X, N67X, A68X, K70X, N71X, N74X, V75X, Q78X, K80X, I82X, N97X, V103X, E111X, I124X, Y129X, T131X,K143X, F167X, P168X, Q184X, K214X, A217X, G225X, T228X, Y235X, Q242X, K244X, S258X, G259X, N261X, L263X, F276X, e T284X, e (ii) uma inserção na posição Z298.01X; em que X é qualquer aminoácido; e em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Ainda outra modalidade adicional se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre: (i) uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre M1X, A2X, T3X, G4X, Y6X, N10X, P19X, G28X, S30X, T38X, S59X, L60X, T62X, K63X, L66X, N67X, A68X, K70X, N71X, N74X, V75X, Q78X, K80X, I82X, K93X, N97X, V103X, E111X, I124X, Y129X, T131X, S135X, A136X, D139X, K143X, N150X, F167X, P168X, Q184X, N213X, K214X, A217X, G225X, T228X, Y235X, Q242X, K244X, S258X, G259X, N261X, D283X, eT284X, e (ii) uma inserção na posição Z298.01X; em que X é qualquer aminoácido; e em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14.
[0083] Ainda outra modalidade adicional se refere a uma variantede mananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre: (i) uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre P19X, S30X, T38X, S59X, L60X, K63X, N67X, A68X, N71X, N74X, N97X, V103X, Y129X, F167X, P168X, Q184X, G225X T228X, Y235X, Q242X, K244X, S258X, e N261X e (ii) uma inserção na posiçãoZ298.01X; em que X é qualquer aminoácido; e em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Ainda outra modalidade adicional se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre: (i) uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre P19X, S30X, T38X, S59X, L60X, K63X, N67X, N97X, V103X, Y129X, F167X, Q184X, G225X T228X, Y235X, K244X, S258X, e N261X e (ii) uma inserção na posição Z298.01X; em que X é qualquer aminoácido; e em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Ainda outra modalidade adicional se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre: (i) uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre P19X, T38X, S59X, N67X, A68X, N71X, N74X, N97X, Y129X, F167X, P168X, Q184X, G225X T228X, Y235X, Q242X, K244X, S258X, e N261X; em que X é qualquer aminoácido; e em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14.
[0084] Uma modalidade adicional se refere a uma variante demananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre: (i) uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre X1V, X1L, X2S, X3R, X4S, X6S, X6E, X10T, X10S, X19E, X28A, X28S, X30T, X38E, X59D, X59V, X60Q, X62E, X63R, X63L, X63E, X66V, X67D, X68S, X70R, X71D, X74E, X74S, X75L, X78D, X78H, X80T, X82M, X93R, X97D, X97L, X103I, X111D, X111S, X124V, X129M, X131A, X135L, X136L, X139M, X143Q, X143R, X150T, X167Y, X168A, X168S, X184D, X184L, X213A, X214I, X217P, X225C, X225P, X228V, X235L, X242L, X244L, X258D, X259P, X261Q, X261R, X263E, X276Y, X283S, X284A, e X284E, e (ii) uma inserção na posição Z298.01Q; em que X é qualquer aminoácido; e em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Outra modalidade adicional se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre: (i) uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre X1V, X1L, X2S, X3R, X4S, X6S, X6E, X10T, X10S, X19E, X28A, X28S, X30T, X38E, X59D, X59V, X60Q, X61W, X62E, X63R, X63L, X63E, X66V, X67D, X68S, X70R, X71D, X74E, X74S, X75L, X78D, X78H, X80T, X82M, X93R, X97D, X97L, X103I, X111D, X111S, X124V,X129M, X131A, X135L, X136L, X139M, X143Q, X143R, X150T, X167Y, X168A, X168S, X184D, X184L, X213A, X214I, X217P, X225C, X225P, X228V, X235L, X242L, X244L, X258D, X259P, X261Q, X261R, X263E, X276Y, X283S, X284A, e X284E, e (ii) uma inserção na posição Z298.01Q; em que X é qualquer aminoácido; e em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Ainda outra modalidade adicional se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre: (i) uma ou mais substituições em uma ou mais posiçõesselecionadas dentre X1V, X1L, X2S, X3R, X4S, X6E, X10T, X10S,X19E, X28A, X28S, X30T, X38E, X59D, X59V, X60Q, X62E, X63R,X63L, X66V, X67D, X68S, X70R, X71D, X74E, X74S, X75L, X78D,X78H, X80T, X82M, X93R, X97D, X97L, X103I, X111D, X111S, X124V, X129M, X131A, X135L, X136L, X139M, X143Q, X143R, X150T, X167Y, X168A, X168S, X184D, X184L, X213A, X214I, X217P, X225C, X225P, X228V, X235L, X242L, X244L, X258D, X259P, X261Q, X261R, X283S, X284A, e X284E, e (ii) uma inserção na posição Z298.01Q; em que X é qualquer aminoácido; e em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Uma outra modalidade adicional se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre: (i) uma ou mais substituições em uma ou mais posiçõesselecionadas dentre X1V, X1L, X2S, X3R, X10T, X19E, X28A, X28S,X30T, X38E, X59D, X59V, X60Q, X62E, X63R, X63L, X66V, X67D,X68S, X70R, X71D, X74E, X78D, X80T, X82M, X97D, X97L, X103I,X111D, X111S, X124V, X129M, X131A, X139M, X143Q, X143R,X150T, X167Y, X168A, X168S, X184D, X184L, X213A, X214I, X217P, X225C, X225P, X228V, X235L, X244L, X258D, X259P, X261Q, X261R, X283S, X284A, e X284E, e (ii) uma inserção na posição Z298.01Q; em que X é qualquer aminoácido; e em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Ainda outra modalidade adicional se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre: (i) uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre X1V, X4S, X6S, X6E, X10T, X10S, X19E, X28S, X30T, X38E, X59V, X60Q, X63R, X63L, X66V, X67D, X68S, X70R, X71D, X74S, X75L, X78D, X78H, X80T, X82M, X97D, X103I, X111D, X124V, X129M, X131A, X143Q, X143R, X167Y, X168S, X184L, X214I, X217P, X225C, X225P, X228V, X235L, X242L, X244L, X258D, X259P, X261R, X263E, X276Y, e X284A, e (ii) uma inserção na posição Z298.01Q; em que X é qualquer aminoácido; e em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14.
[0085] Outra modalidade adicional se refere a uma variante demananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre: (i) uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre X19E, X30T, X38E, X59V, X60Q, X63R, X63L, X63E, X67D, X68S, X71D, X74E, X74S, X97D, X97L, X103I, X129M, X167Y, X168A,X168S, X184D, X184L, X225C, X225P, X228V, X235L, X242L, X244L, X258D, X261Q, e X261R, e (ii) uma inserção na posição Z298.01Q; em que X é qualquer aminoácido; e em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Ainda outra modalidade adicional se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre: (i) uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre X19E, X38E, X59V, X67D, X68S, X71D, X74E, X74S, X97D, X97L, X129M, X167Y, X168A, X168S, X184D, X184L, X225C, X225P, X228V, X235L, X242L, X244L, X258D, X261Q, e X261R; em que X é qualquer aminoácido; e em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Ainda outra modalidade adicional se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre: (i) uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre X19E, X38E, X59V, X67D, X68S, X71D, X74E, X97D, X97L, X129M, X167Y, X168A, X168S, X184D, X184L, X225C, X225P, X228V, X235L, X244L, X258D, X261Q, e X261R; em que X é qualquer aminoácido; e em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Ainda outra modalidade adicional se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre: (i) uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre X19E, X30T, X38E, X59V, X60Q, X63R, X63L, X63E, X67D, X97D, X103I, X129M, X167Y, X184L, X225C, X225P, X228V, X235L, X244L, X258D, e X261R, e (ii) uma inserção na posição Z298.01Q; em que X é qualquer aminoácido; e em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14.
[0086] Uma modalidade adicional se refere a uma variante demananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre: (i) uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre M1V, M1L, A2S, T3R, G4S, Y6S, Y6E, N10T, N10S, P19E, G28A, G28S, S30T, T38E, S59D, S59V, L60Q, Y61W, T62E, K63R, K63L, K63E, L66V, N67D, A68S, K70R, N71D, N74E, N74S, V75L, Q78D, Q78H, K80T, I82M, K93R, N97D, N97L, V103I, E111D, E111S, I124V, Y129M, T131A, T135L, A136L, D139M, K143Q, K143R, N150T, F167Y, P168A, P168S, Q184D, Q184L, N213A, K214I, A217P, G225C, G225P, T228V, Y235L, Q242L, K244L, S258D, G259P, N261Q, N261R, L263E, F276Y, D283S, T284A, e T284E, e (ii) uma inserção na posiçãoZ298.01Q; em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Ainda outra modalidade adicional se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre: (i) uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre M1V, M1L, A2S, T3R, G4S, Y6S, Y6E, N10T, N10S, P19E, G28A, G28S, S30T, T38E, S59D, S59V, L60Q, T62E, K63R, K63L, K63E, L66V, N67D, A68S, K70R, N71D, N74E, N74S, V75L, Q78D, Q78H, K80T, I82M, K93R, N97D, N97L, V103I, E111D, E111S, I124V, Y129M, T131A, T135L, A136L, D139M, K143Q, K143R, N150T, F167Y, P168A, P168S, Q184D,Q184L, N213A, K214I, A217P, G225C, G225P, T228V, Y235L, Q242L, K244L, S258D, G259P, N261Q, N261R, L263E, F276Y, D283S, T284A, e T284E, e (ii) uma inserção na posição Z298.01Q; em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Ainda outra modalidade adicional se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre: (i) uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre M1V, M1L, A2S, T3R, G4S, Y6E, N10T, N10S, P19E, G28A, G28S, S30T, T38E, S59D, S59V, L60Q, T62E, K63R, K63L, L66V, N67D, A68S, K70R, N71D, N74E, N74S, V75L, Q78D, Q78H, K80T, I82M, K93R, N97D, N97L, V103I, E111D, E111S, I124V, Y129M, T131A, T135L, A136L, D139M, K143Q, K143R, N150T, F167Y, P168A, P168S, Q184D, Q184L, N213A, K214I, A217P, G225C, G225P, T228V, Y235L, Q242L, K244L, S258D, G259P, N261Q, N261R, D283S, T284A, e T284E, e (ii) uma inserção na posição Z298.01Q; em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Ainda outra modalidade adicional se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre: (i) uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre M1V, M1L, A2S, T3R, N10T, P19E,G28A, G28S, S30T, T38E, S59D, S59V, L60Q, T62E, K63R, K63L, L66V, N67D, A68S, K70R, N71D, N74E, Q78D, K80T, I82M, N97D, N97L, V103I, E111D, E111S, I124V, Y129M, T131A, D139M, K143Q, K143R, N150T, F167Y, P168A, P168S, Q184D, Q184L, N213A, K214I, A217P, G225C, G225P, T228V, Y235L, K244L, S258D, G259P, N261Q, N261R, D283S, T284A, e T284E, e (ii) uma inserção na posiçãoZ298.01Q; em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Uma outra modalidade adicional se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre: (i) uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre M1V, G4S, Y6S, Y6E, N10T, N10S, P19E, G28S, S30T, T38E, S59V, L60Q, K63R, K63L, K63E, L66V, N67D, A68S, K70R, N71D, N74S, V75L, Q78D, Q78H, K80T, I82M, N97D, V103I, E111D, I124V, Y129M, T131A, K143Q, K143R, F167Y, P168S, Q184L, K214I, A217P, G225C, G225P, T228V, Y235L, Q242L, K244L, S258D, G259P, N261R, L263E, F276Y, e T284A, e uma inserção na posição Z298.01Q; e em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14.
[0087] Uma modalidade adicional se refere a uma variante demananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre: (i) uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre P19E, S30T, T38E, S59D, S59V, L60Q, K63R, K63L, K63E, N67D, A68S, N71D, N74E, N74S, N97D, N97L, V103I, Y129M, F167Y, P168A, P168S, Q184D, Q184L, G225C, G225P, T228V, Y235L, Q242L, K244L, S258D, N261Q, e N261R, e (ii) uma inserção na posição Z298.01Q; em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Ainda outra modalidade adicional se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre duas ou mais substituições selecionado dentre P19E, T38E, S59D, S59V, N67D, A68S, N71D, N74E, N97D, N97L, Y129M, F167Y, P168A, P168S, Q184D, Q184L, G225C, G225P,T228V, Y235L, K244L, S258D, N261Q, e N261R; em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Outra modalidade se refere a uma variante de mananase, um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo da mesma que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre: (i) uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre P19E, S30T, T38E, S59V, L60Q, K63R, K63L, K63E, N67D, N97D, V103I, Y129M, F167Y, Q184L, G225C, G225P T228V, Y235L, K244L, S258D, e N261R, e (ii) uma inserção na posição Z298.01Q; em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14.
[0088] Outra modalidade se refere a uma variante de mananase ouum polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre 129-244, 129-143-244, 38-258, 38-143-258, 19-184, 19-143-184, 97-225, 97-143-225, 67-168, 67-143168, 60-61, 63-71, 63-71-143, 228-235, e 143-228-235 em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Ainda outra modalidade se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre 129-244, 129-143-244, 38-258, 38-143-258, 19-184, 19-143-184, 97-225, 97-143-225, 67-168, 67-143-168, 63-71, 63-71-143, 228-235, e 143-228-235 em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Uma modalidade adicional se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre 129-244, 38-258, 19-184, 97-225, 67-168, 63-71, e 228-235 em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Ainda outra modalidade adicional se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre 129-143-244, 38-143-258, 19-143-184, 97-143-225, 67-143-168, 63-71-143, e 143-228-235, em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Ainda outra modalidade adicional se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 129244, 38-258, 19-184, 97-225, 67-168, 63-71, e 228-235, em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Ainda outra modalidade adicional se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 129-143-244, 38-143-258, 19-143-184, 97-143-225, 67-143-168, 63-71-143, e 143-228-235, em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14.
[0089] Outra modalidade se refere a uma variante de mananase ouum polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre Y129X-K244X, Y129X-K143X- K244X, T38X-S258X, T38X-K143X-S258X, P19X-Q184X, P19X-K143X-Q184X, N97X-G225X, N97X-K143X-G225X, L60X-Y61X, N67X- P168X, N67X-K143X-P168X, K63X-N71X, K63X-N71X-K143X, T228X- Y235X, e K143X-T228X-Y235X; em que X é qualquer aminoácido; e em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Ainda outra modalidade se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre Y129X-K244X, Y129X-K143X-K244X, T38X-S258X, T38X-K143X-S258X, P19X-Q184X, P19X-K143X-Q184X, N97X-G225X,N97X-K143X-G225X, N67X-P168X, N67X-K143X-P168X, K63X-N71X, K63X-N71X-K143X, T228X-Y235X, e K143X-T228X-Y235X; em que X é qualquer aminoácido; e em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. A modalidade adicional se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre Y129X- K244X, T38X-S258X, P19X-Q184X, N97X-G225X, N67X-P168X, K63X- N71X, e T228X-Y235X; em que X é qualquer aminoácido; e em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Ainda outra modalidade adicional se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre Y129X-K143X-K244X, T38X-K143X-S258X, P19X- K143X-Q184X, N97X-K143X-G225X, N67X-K143X-P168X, K63X-N71X-K143X, e K143X-T228X-Y235X; em que X é qualquer aminoácido; e em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Ainda outra modalidade adicional se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre Y129X-K244X, Y129X-K143X-K244X, T38X-S258X, T38X-K143X-S258X, P19X-Q184X, P19X-K143X-Q184X, N97X-G225X, N97X-K143X-G225X, N67X-P168X, N67X-K143X-P168X, K63X-N71X, K63X- N71X-K143X, T228X-Y235X, e K143X-T228X-Y235X; em que X é qualquer aminoácido; e em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Ainda outra modalidade adicional se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre Y129X-K244X, T38X-S258X, P19X-Q184X, N97X-G225X, N67X-P168X, K63X-N71X, e T228X-Y235X; em que X é qualquer aminoácido; e em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Ainda outra modalidade se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre Y129X-K143X-K244X, T38X-K143X-S258X, P19X-K143X-Q184X, N97X-K143X-G225X,N67X-K143X-P168X, K63X-N71X-K143X, e K143X-T228X-Y235X; em que X é qualquer aminoácido; e em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14.
[0090] Outra modalidade se refere a uma variante de mananase ouum polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre X129M-X244L, X129M-X143Q- X244L, X38E-X258D, X38E-X143Q-X258D, X19E-X184D, X19E-X143Q-X184D, X19E-X184L, X19E-X143Q-X184L, X97D-X225C,X97D-X143Q-X225C, X97D-X225P, X97D-X143Q-X225P, X60Q-X61W, X67D-X168S, X67D-X143Q-X168S, X63L-X71D, X63L-X71D- X143Q, X63R-X71D, X63R-X71D-X143Q, X228V-X235L, e X143Q- X228V-X235L; em que X é qualquer aminoácido; e em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Ainda outra modalidade se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre X129M-X244L, X129M-X143Q-X244L, X38E-X258D, X38E-X143Q-X258D, X19E-X184D, X19E-X143Q-X184D, X19E-X184L, X19E-X143Q-X184L, X97D-X225C, X97D-X143Q-X225C, X97D-X225P, X97D-X143Q-X225P, X67D-X168S, X67D-X143Q-X168S, X63L-X71D, X63L-X71D-X143Q, X63R-X71D, X63R-X71D-X143Q,X228V-X235L, e X143Q-X228V-X235L; em que X é qualquer aminoácido; e em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Uma modalidade adicional se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre X129M- X244L, X38E-X258D, X19E-X184D, X19E-X184L, X97D-X225C, X97D- X225P, X67D-X168S, X63L-X71D, X63R-X71D, e X228V-X235L, em que X é qualquer aminoácido; e em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Ainda outra modalidade adicional se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre X129M- X143Q-X244L, X38E-X143Q-X258D, X19E-X143Q-X184D, X19E-X143Q-X184L, X97D-X143Q-X225C, X97D-X143Q-X225P, X67D-X143Q-X168S, X63L-X71D-X143Q, X63R-X71D-X143Q, e X143Q-X228V-X235L, em que X é qualquer aminoácido; e em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Uma modalidade adicional se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre X129M-X244L, X129M-X143Q-X244L, X38E- X258D, X38E-X143Q-X258D, X19E-X184D, X19E-X143Q-X184D,X19E-X184L, X19E-X143Q-X184L, X97D-X225C, X97D-X143Q- X225C, X97D-X225P, X97D-X143Q-X225P, X67D-X168S, X67D-X143Q-X168S, X63L-X71D, X63L-X71D-X143Q, X63R-X71D, X63R- X71D-X143Q, X228V-X235L, e X143Q-X228V-X235L; em que X é qualquer aminoácido; e em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Outra modalidade se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre X129M-X244L, X38E-X258D, X19E-X184D, X19E-X184L, X97DX225C, X97D-X225P, X67D-X168S, X63L-X71D, X63R-X71D, eX228V-X235L, em que X é qualquer aminoácido; e em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Ainda outra modalidade se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre uma ou mais substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre X129M-X143Q-X244L, X38E-X143Q-X258D, X19E-X143Q-X184D, X19E-X143Q-X184L, X97D-X143Q-X225C,X97D-X143Q-X225P, X67D-X143Q-X168S, X63L-X71D-X143Q, X63R- X71D-X143Q, e X143Q-X228V-X235L, em que X é qualquer aminoácido; e em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14.
[0091] Outra modalidade se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre Y129M-K244L, Y129M-K143Q- K244L, T38E-S258D, T38E-K143Q-S258D, P19E-Q184D, P19E-K143Q-Q184D, P19E-Q184L, P19E-K143Q-Q184L, N97D-G225C,N97D-K143Q-G225C, N97D-G225P, N97D-K143Q-G225P, L60Q-Y61W, N67D-P168S, N67D-K143Q-P168S, K63L-N71D, K63L-N71D- K143Q, K63R-N71D, K63R-N71D-K143Q, T228V-Y235L, e K143Q-T228V-Y235L; em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Ainda outra modalidade se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre Y129M- K244L, Y129M-K143Q-K244L, T38E-S258D, T38E-K143Q-S258D,P19E-Q184D, P19E-K143Q-Q184D, P19E-Q184L, P19E-K143Q-Q184L, N97D-G225C, N97D-K143Q-G225C, N97D-G225P, N97D-K143Q-G225P, N67D-P168S, N67D-K143Q-P168S, K63L-N71D,K63L-N71D-K143Q, K63R-N71D, K63R-N71D-K143Q, T228V-Y235L, e K143Q-T228V-Y235L; em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Uma modalidade adicional se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre Y129M- K244L, T38E-S258D, P19E-Q184D, P19E-Q184L, N97D-G225C, N97D-G225P, N67D-P168S, K63L-N71D, K63R-N71D, e T228V-Y235L; em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Ainda outra modalidade adicional se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende duas ou mais modificações selecionadas dentre Y129M-K143Q-K244L, T38E- K143Q-S258D, P19E-K143Q-Q184D, P19E-K143Q-Q184L, N97D- K143Q-G225C, N97D-K143Q-G225P, N67D-K143Q-P168S, K63L- N71D-K143Q, K63R-N71D-K143Q, e K143Q-T228V-Y235L; em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14.
[0092] Uma modalidade adicional se refere a uma variante demananase, ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende P19E-T38E-K63L-N71D-Y129M-Q184L-K244L-S258D- N261R ; N67D-Y129M-P168S-Q184L-K244L-S258D-G259P; P19E-K63L-N67D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-G225C-T228V-K244L; P19E-T38E-N67D-N97D-Y129M-P168S-Q184L-K244L-S258D-N261R;P19E-T38E-N67D-N71D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-P168S-G225C- K244L-S258D-N261R; T38E-K63L-N71D-N97D-Y129M-Q184L-G225C-T228V-Q242L-K244L-S258D-N261R; P19E-K63L-N71D-N97D- Y129M-Q184L-G225C-K244L-S258D-G259P; N10T-T38E-S59V-L60Q- K63R-L66V-A68S-N74S-V75L-N97D-V103I-Y129M-F167Y-Q184L- A217P-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-T38E-N67D-N71D-N97D-Y129M-F167Y-Q184L-A217P-K244L-S258D- N261R; T38E-K63L-N67D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-P168S-Q184L-K244L-S258D-N261R; P19E-T38E-N67D-Y129M-P168S-Q184L-K244L-S258D-N261R; P19E-N67D-N97D-Y129M-P168S-Q184L-K244L; P19E-T38E-K63L-N71D-Y129M-P168S-G225C-T228V-K244L- S258D-N261R; P19E-T38E-N67D-N97D-Q184L-A217P-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R; N10T-P19E-G28S-S30T-T38E-N67D-N71D-N97D-Y129M-P168S-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N97D- V103I-Y129M-K143Q-F167Y-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-T38E-N67D-N71D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-P168S-G225C-T228V-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E- T38E-S59V-L60Q-K63L-K70R-N71D-Q78D-K80T-N97D-E111D-Y129M-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-T38E-K63L-N71D-N97D-V103I-Y129M-F167Y-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-T38E-N67D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-K143Q-Q184L-A217P- G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-T38E-S59V-L60Q-K63L-N97D-V103I-Y129M-F167Y-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N97D-V103I-Y129M-F167Y-Q184L-G225C-T228V- Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-S30T-T38E-59V-L60Q- K63R-N67D-Q78D-K80T-N97D-I124V-Y129M-K143Q-F167Y-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10S-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63L-N67D-Q78H-K80T-I82M-N97D-Y129M- K143Q-F167Y-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N97D-Y129M- K143Q-P168S-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; G4S-N10T-P19E-T38E-N67D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63L-K70R-N71D-Q78D-K80T-N97D- Y129M-T131A-F167Y-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63L-K70R-N71D-Q78D-K80T-N97D-E111D-Y129M-P168S-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-S30T-T38E-S59V- L60Q-K63R-N67D-N97D-Y129M-P168S-Q184L-K214I-G225C-Y235L- K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q- K63R-N67D-N97D-Y129M-K143Q-P168S-Q184L-G225P-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; M1V-P19E-S30T-T38E-T62E- N67D-N71D-Q78D-N97D-Y129M-K143R-F167Y-P168S-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-T284A-Z298.01Q; Y6E-N10T-P19E-G28S-S30T-T38E-K63L-N67D-N71D-N97D-E111S-Y129M-S135L-P168S-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261Q-D283S-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N71D-N97D-V103I-Y129M-K143Q-P168S-Q184L-G225P-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; A2S-P19E-G28S-S30T-T38E- K63R-N67D-N71D-N74E-K93R-N97D-Y129M-N150T-P168S-Q184L- N213A-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261Q-Z298.01Q; M1L-N10T-P19E-G28A-S30T-T38E-K63L-N67D-N71D-Q78D-N97D-Y129M-A136L-P168A-Q184L-N213A-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-T38E-S59V-K63R-N67D-N97D-V103I-Y129M-F167Y- Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-G28A-S30T-T38E-K63R-N67D-N97D-Y129M-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; T3R-N10T-P19E-G28A-S30T-T38E-T62E-N67D-N71D-K93R-N97L-E111S-Y129M-D139M-P168S-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261Q-Z298.01Q; N10T-P19E-G28A-S30T-T38E-S59D-N67D-A68S-N71D-K93R-N97D-Y129M-K143Q-P168S-Q184D-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-T284E-Z298.01Q; P19E-K63L-N71D-Y129M-P168S-Q184L-G225C-K244L; P19E-N67D-N71D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-P168S-Q184L-K244L; P19E-T38E-N67D-Y129M-P168S-Q184L-T228V-K244L; P19E-T38E-N67D-Y129M-Q184L-K244L-S258D-N261R; P19E-K63L-N71D-Y129M-P168S-Q184L-K244L-S258D-N261R; P19E-T38E-K63L-N71D-Y129M-P168S-Q184L-K244L-S258D-G259P; K63L-N71D-Y129M-K143R-P168S-Q184L-G225C-T228V- K244L-S258D-G259P; ou P19E-T38E-K63L-N71D-Y129M-P168S- Q184L-K244L-S258D-N261R, em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14.
[0093] Uma modalidade adicional se refere a uma variante demananase, ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende P19E-T38E-N67D-N97D-Y129M-P168S-Q184L-K244L- S258D-N261R; N10T-P19E-G28S-S30T-T38E-N67D-N71D-N97D-Y129M-P168S-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N97D-V103I-Y129M-F167Y-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N97D-Y129M-K143Q-P168S-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N97D-Y129M-K143Q-P168S-Q184L-G225P-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N71D-N97D-V103I-Y129M-K143Q-P168S-Q184L-G225P-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; A2S-P19E-G28S-S30T-T38E-K63R-N67D-N71D-N74E-K93R-N97D-Y129M-N150T-P168S-Q184L-N213A-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261Q-Z298.01Q; T3R-N10T-P19E-G28A-S30T-T38E-T62E-N67D-N71D-K93R-N97L-E111S-Y129M-D139M-P168S-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261Q-Z298.01Q; ou N10T-P19E-G28A-S30T-T38E- S59D-N67D-A68S-N71D-K93R-N97D-Y129M-K143Q-P168S-Q184D- G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-T284E-Z298.01Q, em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14.
[0094] Uma outra modalidade adicional se refere a uma variante demananase, ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende N67D-Y129M-P168S-Q184L-K244L-S258D-G259P;P19E-T38E-N67D-N97D-Y129M-P168S-Q184L-K244L-S258D-N261R; P19E-T38E-N67D-N71D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-P168S-G225C-K244L-S258D-N261R; T38E-K63L-N67D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-P168S-Q184L-K244L-S258D-N261R; P19E-T38E-N67D-Y129M-P168S-Q184L-K244L-S258D-N261R; P19E-N67D-N97D-Y129M-P168S-Q184L-K244L; N10T-P19E-G28S-S30T-T38E-N67D-N71D-N97D-Y129M-P168S-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-T38E-N67D-N71D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-P168S- G225C-T228V-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N97D-Y129M-K143Q-P168S-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N97D-Y129M-P168S-Q184L-K214I-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N97D-Y129M-K143Q-P168S-Q184L-G225P-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; M1V-P19E-S30T-T38E-T62E-N67D-N71D-Q78D-N97D-Y129M-K143R-F167Y-P168S-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-T284A-Z298.01Q; Y6E-N10T-P19E-G28S-S30T-T38E-K63L-N67D-N71D-N97D-E111S- Y129M-S135L-P168S-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261Q-D283S-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N71D-N97D-V103I-Y129M-K143Q-P168S-Q184L-G225P-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; A2S-P19E-G28S-S30T-T38E-K63R-N67D-N71D-N74E-K93R-N97D-Y129M-N150T-P168S-Q184L-N213A-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261Q-Z298.01Q; T3R-N10T-P19E-G28A-S30T-T38E-T62E-N67D-N71D-K93R-N97L-E111S-Y129M-D139M-P168S-Q184L-G225C-Y235L- K244L-S258D-N261Q-Z298.01Q; N10T-P19E-G28A-S30T-T38E-S59D-N67D-A68S-N71D-K93R-N97D-Y129M-K143Q-P168S-Q184D- G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-T284E-Z298.01Q; P19E-N67D-N71D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-P168S-Q184L-K244L; ou P19E- T38E-N67D-Y129M-P168S-Q184L-T228V-K244L; em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14.
[0095] Uma modalidade adicional se refere a uma variante demananase, ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende P19E-T38E-K63L-N71D-Y129M-Q184L-K244L-S258D- N261R; N67D-Y129M-P168S-Q184L-K244L-S258D-G259P; P19E-K63L-N67D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-G225C-T228V-K244L; P19E-T38E-N67D-N97D-Y129M-P168S-Q184L-K244L-S258D-N261R;P19E-T38E-N67D-N71D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-P168S-G225C- K244L-S258D-N261R; T38E-K63L-N71D-N97D-Y129M-Q184L-G225C-T228V-Q242L-K244L-S258D-N261R; P19E-K63L-N71D-N97D- Y129M-Q184L-G225C-K244L-S258D-G259P; N10T-T38E-S59V-L60Q- K63R-L66V-A68S-N74S-V75L-N97D-V103I-Y129M-F167Y-Q184L- A217P-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-T38E-N67D-N71D-N97D-Y129M-F167Y-Q184L-A217P-K244L-S258D- N261R; T38E-K63L-N67D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-P168S-Q184L-K244L-S258D-N261R; P19E-T38E-N67D-Y129M-P168S-Q184L-K244L-S258D-N261R; P19E-N67D-N97D-Y129M-P168S-Q184L-K244L; P19E-T38E-K63L-N71D-Y129M-P168S-G225C-T228V-K244L- S258D-N261R; N10T-P19E-G28S-S30T-T38E-N67D-N71D-N97D-Y129M-P168S-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N97D-V103I-Y129M-K143Q-F167Y-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-T38E-N67D-N71D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-P168S-G225C-T228V-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-T38E-S59V-L60Q-K63L-K70R-N71D-Q78D-K80T-N97D-E111D-Y129M-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-T38E-K63L-N71D-N97D-V103I-Y129M-F167Y-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-T38E-N67D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-K143Q-Q184L-A217P-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-T38E-S59V-L60Q-K63L- N97D-V103I-Y129M-F167Y-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N97D-V103I-Y129M-F167Y-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-Q78D-K80T-N97D-I124V-Y129M-K143Q-F167Y-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10S-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q- K63L-N67D-Q78H-K80T-I82M-N97D-Y129M-K143Q-F167Y-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N97D-Y129M-K143Q-P168S-Q184L- G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; G4S-N10T-P19E-T38E-N67D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63L-K70R-N71D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-T131A- F167Y-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63L-K70R-N71D-Q78D-K80T-N97D-E111D-Y129M-P168S-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N97D-Y129M-P168S-Q184L-K214I-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N97D-Y129M-K143Q-P168S-Q184L-G225P-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; M1V-P19E-S30T-T38E-T62E-N67D-N71D-Q78D-N97D-Y129M-K143R-F167Y-P168S-Q184L-G225C-Y235L-K244L- S258D-N261R-T284A-Z298.01Q; Y6E-N10T-P19E-G28S-S30T-T38E-K63L-N67D-N71D-N97D-E111S-Y129M-S135L-P168S-Q184L-G225C- T228V-Y235L-K244L-S258D-N261Q-D283S-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N71D-N97D-V103I-Y129M- K143Q-P168S-Q184L-G225P-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R- Z298.01Q; A2S-P19E-G28S-S30T-T38E-K63R-N67D-N71D-N74E-K93R-N97D-Y129M-N150T-P168S-Q184L-N213A-G225C-Y235L- K244L-S258D-N261Q-Z298.01Q; M1L-N10T-P19E-G28A-S30T-T38E-K63L-N67D-N71D-Q78D-N97D-Y129M-A136L-P168A-Q184L-N213A- G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-T38E-S59V-K63R-N67D-N97D-V103I-Y129M-F167Y-Q184L-G225C-T228V- Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-G28A-S30T-T38E-K63R-N67D-N97D-Y129M-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L- S258D-N261R-Z298.01Q; T3R-N10T-P19E-G28A-S30T-T38E-T62E-N67D-N71D-K93R-N97L-E111S-Y129M-D139M-P168S-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261Q-Z298.01Q; N10T-P19E-G28A-S30T-T38E-S59D-N67D-A68S-N71D-K93R-N97D-Y129M-K143Q- P168S-Q184D-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-T284E-Z298.01Q; P19E-K63L-N71D-Y129M-P168S-Q184L-G225C-K244L;P19E-N67D-N71D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-P168S-Q184L-K244L;P19E-T38E-N67D-Y129M-P168S-Q184L-T228V-K244L; P19E-T38E-N67D-Y129M-Q184L-K244L-S258D-N261R; P19E-K63L-N71D-Y129M-P168S-Q184L-K244L-S258D-N261R; P19E-T38E-K63L-N71D- Y129M-P168S-Q184L-K244L-S258D-G259P; K63L-N71D-Y129M-K143R-P168S-Q184L-G225C-T228V-K244L-S258D-G259P; ou P19E- T38E-K63L-N71D-Y129M-P168S-Q184L-K244L-S258D-N261R; em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14.
[0096] Uma outra modalidade adicional se refere a uma variante de mananase, ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende P19E-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N97D-V103I-Y129M-K143Q-F167Y-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R- Z298.01Q; N10T-P19E-T38E-N67D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-K143Q- Q184L-A217P-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-Q78D-K80T-N97D-I124V- Y129M-K143Q-F167Y-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10S-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63L-N67D-Q78H-K80T-I82M-N97D-Y129M-K143Q-F167Y-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q- K63R-N67D-N97D-Y129M-K143Q-P168S-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N97D-Y129M-K143Q-P168S-Q184L-G225P- T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N71D-N97D-V103I-Y129M-K143Q-P168S-Q184L-G225P-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q;ou N10T-P19E-G28A-S30T-T38E-S59D-N67D-A68S-N71D-K93R-N97D-Y129M-K143Q-P168S-Q184D-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-T284E-Z298.01Q; em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14.
[0097] Outra modalidade se refere a uma variante de mananase, ouum polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende P19E- T38E-K63L-N71D-Y129M-Q184L-K244L-S258D-N261R; P19E-T38E-N67D-N97D-Y129M-P168S-Q184L-K244L-S258D-N261R; P19E-T38E-N67D-N71D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-P168S-G225C-K244L-S258D-N261R; T38E-K63L-N71D-N97D-Y129M-Q184L-G225C- T228V-Q242L-K244L-S258D-N261R; N10T-T38E-S59V-L60Q-K63R-L66V-A68S-N74S-V75L-N97D-V103I-Y129M-F167Y-Q184L-A217P- G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-T38E-N67D-N71D-N97D-Y129M-F167Y-Q184L-A217P-K244L-S258D-N261R;T38E-K63L-N67D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-P168S-Q184L-K244L-S258D-N261R; P19E-T38E-N67D-Y129M-P168S-Q184L-K244L-S258D-N261R; P19E-T38E-K63L-N71D-Y129M-P168S-G225C-T228V-K244L-S258D-N261R; P19E-T38E-N67D-N97D-Q184L-A217P- G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R; N10T-P19E-G28S-S30T- T38E-N67D-N71D-N97D-Y129M-P168S-Q184L-G225C-Y235L-K244L- S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N97D- V103I-Y129M-K143Q-F167Y-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-T38E-N67D-N71D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-P168S-G225C-T228V-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E- T38E-S59V-L60Q-K63L-K70R-N71D-Q78D-K80T-N97D-E111D-Y129M-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-T38E-K63L-N71D-N97D-V103I-Y129M-F167Y-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-T38E-N67D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-K143Q-Q184L-A217P-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-T38E-S59V-L60Q-K63L-N97D-V103I-Y129M-F167Y-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N97D-V103I-Y129M-F167Y-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-Q78D-K80T-N97D-I124V-Y129M-K143Q-F167Y-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10S-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63L-N67D-Q78H-K80T-I82M-N97D-Y129M- K143Q-F167Y-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N97D-Y129M- K143Q-P168S-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R- Z298.01Q; G4S-N10T-P19E-T38E-N67D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63L-K70R-N71D-Q78D-K80T-N97D- Y129M-T131A-F167Y-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63L-K70R-N71D-Q78D-K80T-N97D-E111D-Y129M-P168S-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N97D-Y129M-P168S-Q184L-K214I-G225C-Y235L- K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-60Q-K63R-N67D-N97D-Y129M-K143Q-P168S-Q184L-G225P-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; M1V-P19E-S30T-T38E-T62E- N67D-N71D-Q78D-N97D-Y129M-K143R-F167Y-P168S-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-T284A-Z298.01Q; Y6E-N10T-P19E-G28S-S30T-T38E-K63L-N67D-N71D-N97D-E111S-Y129M- S135L-P168S-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261Q-D283S-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N71D-N97D-V103I-Y129M-K143Q-P168S-Q184L-G225P-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; A2S-P19E-G28S-S30T-T38E- K63R-N67D-N71D-N74E-K93R-N97D-Y129M-N150T-P168S-Q184L- N213A-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261Q-Z298.01Q; M1L-N10T-P19E-G28A-S30T-T38E-K63L-N67D-N71D-Q78D-N97D-Y129M-A136L-P168A-Q184L-N213A-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-T38E-S59V-K63R-N67D-N97D-V103I-Y129M-F167Y- Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01; N10T-P19E-G28A-S30T-T38E-K63R-N67D-N97D-Y129M-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; T3R-N10T-P19E-G28A-S30T-T38E-T62E-N67D-N71D-K93R-N97L-E111S-Y129M- D139M-P168S-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261Q-Z298.01Q; N10T-P19E-G28A-S30T-T38E-S59D-N67D-A68S-N71D-K93R-N97D-Y129M-K143Q-P168S-Q184D-G225C-Y235L-K244L- S258D-N261R-T284E-Z298.01Q; P19E-T38E-N67D-Y129M-Q184L-K244L-S258D-N261R; P19E-T38E-K63L-N71D-Y129M-P168S-Q184L- K244L-S258D-G259P; ou P19E-T38E-K63L-N71D-Y129M-P168S- Q184L-K244L-S258D-N261R; em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14.
[0098] Ainda outra modalidade se refere a uma variante demananase, ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende P19E-T38E-K63L-N71D-Y129M-Q184L-K244L-S258D- N261R; P19E-T38E-N67D-N97D-Y129M-P168S-Q184L-K244L-S258D-N261R; P19E-K63L-N71D-N97D-Y129M-Q184L-G225C-K244L-S258D-G259P; P19E-T38E-N67D-N71D-N97D-Y129M-F167Y-Q184L-A217P-K244L-S258D-N261R; P19E-T38E-N67D-Y129M-P168S-Q184L-K244L-S258D-N261R; P19E-N67D-N97D-Y129M-P168S-Q184L-K244L; P19E-T38E-N67D-N97D-Q184L-A217P-G225C- T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R; N10T-P19E-G28S-S30T-T38E-N67D-N71D-N97D-Y129M-P168S-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N97D- V103I-Y129M-K143Q-F167Y-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-T38E-S59V-L60Q-K63L-K70R-N71D-Q78D-K80T-N97D-E111D-Y129M-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-T38E-N67D-Q78D-K80T-N97D- Y129M-K143Q-Q184L-A217P-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D- N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-T38E-S59V-L60Q-K63L-N97D-V103I-Y129M-F167Y-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N97D-V103I-Y129M-F167Y-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R- Z298.01Q; P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-Q78D-K80T- N97D-I124V-Y129M-K143Q-F167Y-Q184L-G225C-Y235L-K244L- S258D-N261R-Z298.01Q; N10S-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63L-N67D-Q78H-K80T-I82M-N97D-Y129M-K143Q-F167Y-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N97D-Y129M-K143Q-P168S-Q184L-G225C- T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; G4S-N10T-P19E-T38E-N67D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q- K63L-K70R-N71D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-T131A-F167Y-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63L-K70R-N71D-Q78D-K80T-N97D-E111D-Y129M-P168S-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R- Z298.01Q; P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N97D-Y129M-P168S-Q184L-K214I-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N97D-Y129M- K143Q-P168S-Q184L-G225P-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; M1V-P19E-S30T-T38E-T62E-N67D-N71D-Q78D-N97D-Y129M-K143R-F167Y-P168S-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D- N261R-T284A-Z298.01Q; Y6E-N10T-P19E-G28S-S30T-T38E-K63L-N67D-N71D-N97D-E111S-Y129M-S135L-P168S-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261Q-D283S-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N71D-N97D-V103I-Y129M- K143Q-P168S-Q184L-G225P-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; A2S-P19E-G28S-S30T-T38E-K63R-N67D-N71D-N74E-K93R-N97D-Y129M-N150T-P168S-Q184L-N213A-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261Q-Z298.01Q; M1L-N10T-P19E-G28A-S30T-T38E-K63L-N67D-N71D-Q78D-N97D-Y129M-A136L-P168A-Q184L-N213A- G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-T38E-S59V-K63R-N67D-N97D-V103I-Y129M-F167Y-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-G28A-S30T- T38E-K63R-N67D-N97D-Y129M-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L- S258D-N261R-Z298.01Q; T3R-N10T-P19E-G28A-S30T-T38E-T62E-N67D-N71D-K93R-N97L-E111S-Y129M-D139M-P168S-Q184L- G225C-Y235L-K244L-S258D-N261Q-Z298.01Q; N10T-P19E-G28A-S30T-T38E-S59D-N67D-A68S-N71D-K93R-N97D-Y129M-K143Q- P168S-Q184D-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-T284E- Z298.01Q; P19E-K63L-N71D-Y129M-P168S-Q184L-G225C-K244L;P19E-N67D-N71D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-P168S-Q184L-K244L;P19E-T38E-N67D-Y129M-P168S-Q184L-T228V-K244L; P19E-T38E-N67D-Y129M-Q184L-K244L-S258D-N261R; P19E-K63L-N71D-Y129M-P168S-Q184L-K244L-S258D-N261R; P19E-T38E-K63L-N71D- Y129M-P168S-Q184L-K244L-S258D-G259P; ou P19E-T38E-K63L- N71D-Y129M-P168S-Q184L-K244L-S258D-N261R; em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14.
[0099] Uma outra modalidade se refere a uma variante demananase, ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende P19E-K63L-N67D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-G225C-T228V-K244L; P19E-T38E-N67D-N71D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-P168S-G225C-K244L-S258D-N261R; T38E-K63L-N71D-N97D-Y129M-Q184L-G225C-T228V-Q242L-K244L-S258D-N261R; P19E-K63L-N71D-N97D-Y129M-Q184L-G225C-K244L-S258D-G259P;N10T-T38E-S59V-L60Q-K63R-L66V-A68S-N74S-V75L-N97D-V103I- Y129M-F167Y-Q184L-A217P-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R- Z298.01Q; P19E-T38E-N67D-N97D-Q184L-A217P-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R; N10T-P19E-G28S-S30T-T38E-N67D-N71D-N97D-Y129M-P168S-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D- N261R-Z298.01Q; P19E-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N97D-V103I- Y129M-K143Q-F167Y-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-T38E-N67D-N71D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-P168S-G225C-T228V-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-T38E-S59V-L60Q-K63L-K70R-N71D-Q78D-K80T-N97D-E111D-Y129M-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-T38E- K63L-N71D-N97D-V103I-Y129M-F167Y-Q184L-G225C-T228V-Y235L- K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-T38E-N67D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-K143Q-Q184L-A217P-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-T38E-S59V-L60Q-K63L- N97D-V103I-Y129M-F167Y-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N97D-V103I-Y129M-F167Y-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-Q78D-K80T-N97D-I124V-Y129M-K143Q-F167Y-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10S-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q- K63L-N67D-Q78H-K80T-I82M-N97D-Y129M-K143Q-F167Y-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N97D-Y129M-K143Q-P168S-Q184L- G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; G4S-N10T- P19E-T38E-N67D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63L-K70R-N71D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-T131A- F167Y-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63L-K70R-N71D-Q78D-K80T-N97D-E111D-Y129M-P168S-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N97D-Y129M-P168S-Q184L-K214I-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N97D-Y129M-K143Q-P168S-Q184L-G225P-T228V-Y235L-K244L-S258D- N261R-Z298.01Q; M1V-P19E-S30T-T38E-T62E-N67D-N71D-Q78D- N97D-Y129M-K143R-F167Y-P168S-Q184L-G225C-Y235L-K244L- S258D-N261R-T284A-Z298.01Q; Y6E-N10T-P19E-G28S-S30T-T38E-K63L-N67D-N71D-N97D-E111S-Y129M-S135L-P168S-Q184L-G225C- T228V-Y235L-K244L-S258D-N261Q-D283S-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N71D-N97D-V103I-Y129M- K143Q-P168S-Q184L-G225P-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R- Z298.01Q; A2S-P19E-G28S-S30T-T38E-K63R-N67D-N71D-N74E-K93R-N97D-Y129M-N150T-P168S-Q184L-N213A-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261Q-Z298.01Q; M1L-N10T-P19E-G28A-S30T-T38E-K63L-N67D-N71D-Q78D-N97D-Y129M-A136L-P168A-Q184L-N213A- G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-T38E-S59V-K63R-N67D-N97D-V103I-Y129M-F167Y-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-G28A-S30T-T38E-K63R-N67D-N97D-Y129M-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L- S258D-N261R-Z298.01Q; ou N10T-P19E-G28A-S30T-T38E-S59D- N67D-A68S-N71D-K93R-N97D-Y129M-K143Q-P168S-Q184D-G225C- Y235L-K244L-S258D-N261R-T284E-Z298.01Q; em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14.
[00100] Outra modalidade adicional se refere a uma variante de mananase, ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende P19E-T38E-K63L-N71D-Y129M-Q184L-K244L-S258D- N261R; T38E-K63L-N71D-N97D-Y129M-Q184L-G225C-T228V-Q242L-K244L-S258D-N261R; P19E-K63L-N71D-N97D-Y129M-Q184L- G225C-K244L-S258D-G259P; P19E-T38E-K63L-N71D-Y129M-P168S- G225C-T228V-K244L-S258D-N261R; P19E-T38E-S59V-L60Q-K63L-K70R-N71D-Q78D-K80T-N97D-E111D-Y129M-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-T38E-K63L-N71D- N97D-V103I-Y129M-F167Y-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L- S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63L-K70R-N71D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-T131A-F167Y-Q184L-G225C- Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63L-K70R-N71D-Q78D-K80T-N97D-E111D-Y129M- P168S-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q;Y6E-N10T-P19E-G28S-S30T-T38E-K63L-N67D-N71D-N97D-E111S- Y129M-S135L-P168S-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D- N261Q-D283S-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N71D-N97D-V103I-Y129M-K143Q-P168S-Q184L-G225P- T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; A2S-P19E-G28S-S30T-T38E-K63R-N67D-N71D-N74E-K93R-N97D-Y129M-N150T- P168S-Q184L-N213A-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261Q-Z298.01Q; M1L-N10T-P19E-G28A-S30T-T38E-K63L-N67D-N71D-Q78D-N97D-Y129M-A136L-P168A-Q184L-N213A-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-K63L-N71D-Y129M-P168S-Q184L-G225C-K244L; P19E-K63L-N71D-Y129M-P168S-Q184L-K244L-S258D-N261R; P19E-T38E-K63L-N71D-Y129M-P168S-Q184L- K244L-S258D-G259P; K63L-N71D-Y129M-K143R-P168S-Q184L-G225C-T228V-K244L-S258D-G259P; ou P19E-T38E-K63L-N71D- Y129M-P168S-Q184L-K244L-S258D-N261R; em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14.
[00101] Outra modalidade adicional se refere a uma variante de mananase, ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende P19E-T38E-N67D-N97D-Q184L-A217P-G225C-T228V- Y235L-K244L-S258D-N261R; P19E-T38E-S59V-L60Q-K63L-K70R-N71D-Q78D-K80T-N97D-E111D-Y129M-Q184L-G225C-T228V- Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-T38E-K63L-N71D-N97D-V103I-Y129M-F167Y-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-T38E-N67D-Q78D-K80T-N97D- Y129M-K143Q-Q184L-A217P-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N97D-V103I-Y129M-F167Y-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N97D-Y129M-K143Q-P168S-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; G4S-N10T-P19E-T38E-N67D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63L-K70R-N71D-Q78D-K80T-N97D-E111D-Y129M-P168S-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N97D-Y129M-K143Q-P168S-Q184L-G225P- T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; Y6E-N10T-P19E-G28S-S30T-T38E-K63L-N67D-N71D-N97D-E111S-Y129M-S135L- P168S-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261Q-D283S-Z298.01Q; N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N71D-N97D-V103I-Y129M-K143Q-P168S-Q184L-G225P-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-T38E-S59V-K63R-N67D-N97D-V103I-Y129M-F167Y-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; ou N10T-P19E-G28A-S30T-T38E-K63R- N67D-N97D-Y129M-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14.
[00102] Ainda outra modalidade adicional se refere a uma variante de mananase, ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo do mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N97D-V103I- Y129M-F167Y-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R- Z298.01Q, em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14.
[00103] Em uma modalidade adicional, a variante de mananase ou polipeptídeo recombinante é selecionada dentre SEQ ID NOs:13 e 46 a 91. Ainda em uma modalidade adicional, a variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante é selecionada dentre SEQ ID NOs:13, 49, 60, 69, 74, 77, 78, 82 e 83.
[00104] Outra modalidade é direcionada a um Clado NDL de mananases que compreende uma ou mais variantes de mananase descritas no presente documento, ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo dos mesmos, em que a dita variante, ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos compreende adicionalmente um ou mais motivos selecionados a partir de um: motivo WXaKNDLXXAI (SEQ ID NO:15) nas posições 31-40, em que Xa é F ou Y e X é qualquer aminoácido ("Motivo 1"); motivo LDXXXGPXGXLT (SEQ ID NO:16) nas posições 263-274, em que X é qualquer aminoácido "Motivo de Deleção 1"); motivo LDX1V/AT/AGPX2GX3LT (SEQ ID NO:17) nas posições 263-274, em que Xi é um M ou L, X2 é N, A ou S e X3 é S, T ou N "Motivo de Deleção 2"); e motivo LDM/LATGPN/AGS/TLT (SEQ ID No:18) nas posições 263-274 "Motivo de Deleção 3"), em que as posições de aminoácido da variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Ainda outra modalidade adicional é direcionada a um Clado NDL de mananases que compreende uma ou mais variantes de mananase descritas no presente documento ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo dos mesmos, em que a dita variante ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos compreende adicionalmente um ou mais motivos selecionados a partir de um: motivo WXaKNDLXXAI (SEQ ID NO:15) nas posições 31 a 40, em que Xa é F ou Y e X é qualquer aminoácido; motivo LDXXXGPXGXLT (SEQ ID NO:16) nas posições 263 a 274, em que X é qualquer aminoácido; motivo LDX1V/AT/AGPX2GX3LT (SEQ ID NO:17) nas posições 263 a 274, em que Xi é um M ou L, X2 é N, A ou S e X3 é S, T ou N; e motivo LDM/LATGPN/AG S/TLT (SEQ ID NO:18) nas posições 263 a 274, em que as posições de aminoácidos da variante ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14, desde que a variante, ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos não seja ACU308431, ETT37549, WP_036608478, WP_036670707, WP_017688745, WP_053782127, PamMan2, PamMan3, PtuMan2, AAX87003, WP_046227931,WP_024633848, PpaMan2, WP_017813111, PspMan9, AEX60762, WP_046214462, YP_003868989, YP_003944884, WP_017427981,AAX87002, WP_009593769, YP_006190599 ou WP_019912481.
[00105] Uma modalidade adicional é direcionada a um Clado NDL de mananases que compreende uma ou mais variantes de mananase descritas no presente documento, ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo dos mesmos, em que a dita variante, ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo compreende adicionalmente um motivo WXaKNDLXXAI (SEQ ID NO:15) nas posições 31 a 40, em que Xa é F e X é qualquer aminoácido, em que as posições de aminoácidos da variante ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14, desde que a variante, ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos não seja ACU308431, ETT37549, WP_036608478, WP_036670707, WP_017688745, WP_053782127, WP_024633848, AAX87003 ou AEX60762. Aindaoutra modalidade adicional é direcionada a um Clado NDL de mananases que compreende uma ou mais variantes de mananase descritas no presente documento ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo dos mesmos, em que a dita variante ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos compreende adicionalmente um motivo WXaKNDLXXAI (SEQ ID NO:15) nasposições 31 a 40, em que Xa é F e X é qualquer aminoácido, em que as posições de aminoácidos da variante ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14, desde que a variante, ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos não seja ACU308431, ETT37549, WP_036608478, WP_036670707,WP_017688745, WP_053782127, WP_024633848, AAX87003,AEX60762, PamMan2, PamMan3, PtuMan2, PpaMan2 ou PspMan9.
[00106] Em uma modalidade ainda adicional, um Clado NDL de mananases compreende uma ou mais variantes de mananase descritas no presente documento, ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo dos mesmos, em que a dita variante, ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos compreende adicionalmente um motivo LDX1V/AT/AGPX2GX3LT (SEQ ID NO:17) ou motivo LDM/LATGPN/AGS/TLT (SEQ ID NO:18) nas posições 263 a 274, em que Xi é um M; X2 é N, A ou S; e X3 é S, T ou N, em que as posições de aminoácidos da variante ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14, desde que a variante, ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos não seja ACU30843, ETT37549, WP_036608478, WP_036670707,WP_017688745 ou WP_046214462. Em uma modalidade ainda adicional, um Clado NDL de mananases compreende uma ou mais variantes de mananase descritas no presente documento, ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo dos mesmos, em que a dita variante, ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos compreende adicionalmente um motivoLDX1V/AT/AGPX2GX3LT (SEQ ID NO:17) ou motivoLDM/LATGPN/AGS/TLT (SEQ ID NO:18) nas posições 263 a 274, em que Xi é um M; X2 é N, A ou S; e X3 é S, T ou N, em que as posições de aminoácidos da variante ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14, desde que a variante, ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos não seja ACU30843, ETT37549, WP_036608478, WP_036670707,WP_017688745, WP_046214462 ou PamMan2. Em uma modalidade ainda adicional, o Clado NDL de mananases compreende uma ou mais variantes de mananase descritas no presente documento, ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo dos mesmos, em que a dita variante, ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos compreende adicionalmente (i) um motivo WXaKNDLXXAI (SEQ ID NO:15) nas posições 31 a 40, em que Xa é F e X é qualquer aminoácido, e (ii) um motivo LDX1V/AT/AGPX2GX3LT (SEQ ID NO:17) ou LDM/LATGPN/AGS/TLT (SEQ ID NO:18) nas posições 263 a 274, em que Xi é um M; X2 é N, A ou S; e X3 é S, T ou N, em que as posições de aminoácidos da variante ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:i4, desde que a variante, ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos não seja ACU30843, ETT37549, WP_036608478, WP_036670707 ouWP_0i7688745. Em uma modalidade ainda adicional, o Clado NDL de mananases compreende uma ou mais variantes de mananase descritas no presente documento, ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo dos mesmos, em que a dita variante, ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos compreende adicionalmente (i) um motivo WXaKNDLXXAI (SEQ ID NO:15) nas posições 31 a 40, em que Xa é F e X é qualquer aminoácido, e (ii) um motivo LDX1V/AT/AGPX2GX3LT (SEQ ID NO:17) ou LDM/LATGPN/AGS/TLT (SEQ ID NO:18) nas posições 263 a 274, em que Xi é um M; X2 é N, A ou S; e X3 é S, T ou N, em que as posições de aminoácidos da variante ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14, desde que a variante, ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos não seja ACU30843, ETT37549, WP_036608478, WP_036670707,WP_017688745 ou PamMan2.
[00107] Outra modalidade se refere a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 59%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:13. Ainda outra modalidade adicional é direcionada a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo dos mesmo que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% ou 85% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:13, desde que a variante, ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos não seja ACU30843, ETT37549, WP_036608478, WP_036670707, WP_017688745,WP_053782127, WP_024633848, AAX87003, WP_046227931,WP_017813111, AEX60762 ou WP_046214462. Ainda outramodalidade adicional é direcionada a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo dos mesmos que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% ou 85% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:13, desde que a variante, ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos não seja ACU30843, ETT37549, WP_036608478, WP_036670707,WP_017688745, WP_053782127, WP_024633848, AAX87003,WP_046227931, WP_017813111, AEX60762, WP_046214462,PamMan2, PamMan3, PtuMan2, PpaMan2 ou PspMan9. Ainda outra modalidade adicional é direcionada a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo dos mesmos que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% ou 85% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:13, desde que a variante, ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos não seja ACU30843, ETT37549, WP_036608478, WP_036670707,WP_017688745, WP_053782127, WP_024633848, AAX87003,WP_046227931, WP_017813111, AEX60762, WP_046214462 ouEP2260105-0418. Ainda outra modalidade adicional é direcionada a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo dos mesmos que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% ou 85% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:13, desde que a variante, ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos não seja ACU30843, ETT37549,WP_036608478, WP_036670707, WP_017688745, WP_053782127, WP_024633848, AAX87003, WP_046227931, WP_017813111,AEX60762, WP_046214462, EP2260105-0418, PamMan2, PamMan3, PtuMan2, PpaMan2 ou PspMan9. Ainda outra modalidade adicional é direcionada a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 88% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:13, desde que a variante, ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos não seja ACU30843, ETT37549, WP_036608478,WP_036670707, WP_017688745, WP_053782127, WP_024633848 ou AAX87003. Outra modalidade é direcionada a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 88% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:13, desde que a variante, ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo do mesmo não seja ACU30843, ETT37549, WP_036608478, WP_036670707, WP_017688745,WP_053782127, WP_024633848, AAX87003, PamMan2, PamMan3,PtuMan2, PpaMan2 ou PspMan9. Uma modalidade adicional é direcionada a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 88% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:13, desde que a variante, ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos não seja ACU30843, ETT37549, WP_036608478,WP_036670707, WP_017688745, WP_053782127, WP_024633848, AAX87003 ou EP2260105-0418. Ainda outra modalidade adicional é direcionada a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 88% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:13, desde que a variante, ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos não seja ACU30843, ETT37549, WP_036608478,WP_036670707, WP_017688745, WP_053782127, WP_024633848, AAX87003, EP2260105-0418, PamMan2, PamMan3, PtuMan2,PpaMan2 ou PspMan9. Ainda outra modalidade adicional é direcionada a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 92% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:13, desde que a variante, ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos não seja ACU30843, ETT37549, WP_036608478, WP_036670707 ouWP_017688745. Ainda outra modalidade adicional é direcionada a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 92% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:13, desde que a variante, ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos não seja ACU30843, ETT37549, WP_036608478, WP_036670707,WP_017688745, PamMan2, PamMan3 ou PtuMan2. Outra modalidade é direcionada a uma variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante ou um fragmento ativo que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:13.
[00108] Em uma modalidade, o polipeptídeo de referência é uma mananase GH5. Em ainda outra modalidade, o polipeptídeo de referência é selecionado a partir da SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:160 e SEQ ID NO:162. Em outra modalidade, uma ou mais variantes de mananase aqui descritas têm pelo menos 59%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:160 e/ou SEQ ID NO:162.
[00109] Em uma modalidade adicional, SEQ ID NO:14 é o polipeptídeo de referência a partir do qual uma ou mais variantes de mananase descritas no presente documento é derivada. Em outra modalidade, uma ou mais variante de mananase aqui descritas têm pelo menos 59%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Em uma modalidade ainda adicional, SEQ ID NO:30 é o polipeptídeo de referência a partir do qual uma ou mais variantes de mananase descritas no presente documento é derivada. Em outra modalidade, uma ou mais variante de mananase aqui descritas têm pelo menos 59%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:30. Em uma modalidade adicional, SEQ ID NO:43 é o polipeptídeo de referência a partir do qual uma ou mais variantes de mananase descritas no presente documento é derivada. Em outra modalidade, uma ou mais variante de mananase aqui descritas têm pelo menos 59%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:43. Em uma modalidade ainda adicional, SEQ ID NO:44 é o polipeptídeo de referência a partir do qual uma ou mais variantes de mananase descritas no presente documento é derivada. Em outra modalidade, uma ou mais variante de mananase aqui descritas têm pelo menos 59%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:44. Ainda em outra modalidade, SEQ ID NO:45 é o polipeptídeo de referência a partir do qual uma ou mais variantes de mananase descritas no presente documento é derivada. Em outra modalidade, uma ou mais variante de mananase aqui descritas têm pelo menos 59%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:45. Em ainda outra modalidade, SEQ ID NO:160 ou 162 é o polipeptídeo de referência a partir do qual uma ou mais variantes de mananase descritas no presente documento é derivada. Ainda em outra modalidade adicional, uma ou mais variante de mananase aqui descritas têm pelo menos 59%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência deaminoácido com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:160 ou 162. Em uma modalidade adicional, a variante de mananase é uma mananase GH5.
[00110] Em algumas modalidades, as variantes de mananase ou polipeptídeos recombinantes ou fragmentos ativos dos mesmos descritos no presente documento são isolados. Em outras modalidades, as variantes de mananase descritas no presente documento são endo- β-mananases. Em modalidades adicionais, as variantes de mananase ou polipeptídeos recombinantes ou fragmentos ativos dos mesmos descritos no presente documento têm atividade de mananase. Em ainda outras modalidades, as variantes de mananase ou polipeptídeos recombinantes ou fragmentos ativos dos mesmos descritos no presente documento têm atividade de mananase na presença de um tensoativo. Em algumas modalidades, a atividade de mananase é em goma de manano, alfarroba e/ou glucomanano de konjac. Em modalidades adicionais, as variantes de mananase ou polipeptídeos recombinantes ou fragmentos ativos dos mesmos descritos no presente documento têm atividade de limpeza em uma composição de detergente. Ainda outras modalidades são direcionadas a variantes de mananase ou polipeptídeos recombinantes ou fragmentos ativos dos mesmos que têm atividade de mananase na presença de uma protease. Adicionalmente, modalidades são direcionadas a variantes de mananase ou polipeptídeos recombinantes ou fragmentos ativos dos mesmos que hidrolisam um substrato selecionado a partir do grupo que consiste em goma guar, goma de alfarroba e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, as variantes de mananase ou polipeptídeos recombinantes ou fragmentos ativos dos mesmos descritos no presente documento não compreendem um módulo de ligação a carboidrato.
[00111] Em algumas modalidades, a variante de mananase ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos tem atividade enzimática ao longo de uma ampla faixa de condições de pH. Em determinadas modalidades, a variante de mananase ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos tem atividade enzimática a partir de um pH de cerca de 4,0 a cerca de 11,0. Em modalidades adicionais, as variantes de mananase ou polipeptídeos recombinantes ou fragmentos ativos dos mesmos têm pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 100% de atividade de mananase em um pH de cerca de 4,0 a cerca de 11,0, cerca de 4,5 a cerca de 9,0, cerca de 5,5 a cerca de 8,5 ou cerca de 6,0 a cerca de 7,5.
[00112] Em uma modalidade ainda adicional, as variantes de mananase ou polipeptídeos recombinantes ou fragmentos ativos dos mesmos têm atividade de mananase a uma temperatura que varia de cerca de 20°C a cerca de 90°C, cerca de 30°C a cerca de 80°C, cerca de 20°C a cerca de 50°C ou cerca de 30°C a cerca de 66°C. Em determinadas modalidades, as variantes de mananase ou polipeptídeos recombinantes ou fragmentos ativos dos mesmos têm pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 100% de atividade de mananase a u uma faixa de temperatura de cerca de 20 °C a cerca de 90°C, cerca de 30°C a cerca de 80°C, cerca de 20 °C a cerca de 50°C ou cerca de 30°C a cerca de 66°C.
[00113] Ainda outras modalidades adicionais são direcionadas a variantes de mananase ou polipeptídeos recombinantes ou fragmentos ativos dos mesmos descritos no presente documento, em que a variante ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos retém pelo menos 70% de sua atividade máxima de mananase em uma faixa de pH de 4,5 a 9,0, 5,5 a 8,5 ou 6,0 a 7,5. Algumas modalidades são direcionadas a variantes de mananase ou polipeptídeos recombinantes ou fragmentos ativos dos mesmos descritos no presente documento, em que a variante ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos retém pelo menos 70% de sua atividade máxima de mananase a um pH acima de 3,0, 3,5, 4,0 ou 4,5 ou em um pH abaixo de 9,0, 9,5 ou 10,0.
[00114] Em algumas modalidades, uma ou mais variantes de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma aqui descritos têm uma ou mais propriedades aprimoradas em comparação com um polipeptídeo de referência, em que a propriedade aprimorada é selecionada dentre estabilidade aprimorada na presença de protease, estabilidade aprimorada em detergente ou tampão, desempenho aprimorado de limpeza e desempenho aprimorado de limpeza envelhecido. Em outra modalidade, uma ou mais variantes de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma aqui descritos têm uma ou mais propriedades aprimoradas em comparação com um polipeptídeo de referência, em que a propriedade aprimorada é selecionada dentre estabilidade aprimorada na presença de protease, estabilidade aprimorada em detergente ou tampão, desempenho aprimorado de limpeza e desempenho aprimorado de limpeza envelhecido, em que o polipeptídeo de referência é selecionado dentre SEQ ID NO:14, 43, 44, 45 e 160. Ainda em outra modalidade, uma ou mais variantes de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma aqui descritos têm uma ou mais propriedades aprimoradas em comparação com SEQ ID NO:14, em que a propriedade aprimorada é selecionada dentre estabilidade aprimorada na presença de protease, estabilidade aprimorada em detergente ou tampão, desempenho aprimorado de limpeza e desempenho aprimorado de limpeza envelhecido. Ainda em outra modalidade, uma ou mais variantes de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma aqui descrito têm uma ou mais propriedades aprimoradas em comparação com SEQ ID NO:43, em que a propriedade aprimorada é selecionada dentre estabilidade aprimorada na presença de protease, estabilidade aprimorada em detergente ou tampão, desempenho aprimorado de limpeza e desempenho aprimorado de limpeza envelhecido. Ainda em outra modalidade adicional, uma ou mais variantes de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma aqui descrito têm uma ou mais propriedades aprimoradas em comparação com SEQ ID NO:44, em que a propriedade aprimorada é selecionada dentre estabilidade aprimorada na presença de protease, estabilidade aprimorada emdetergente ou tampão, desempenho aprimorado de limpeza edesempenho aprimorado de limpeza envelhecido. Ainda em outra modalidade adicional, uma ou mais variantes de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma aqui descrito têm uma ou mais propriedades aprimoradas em comparação com SEQ ID NO:45, em que a propriedade aprimorada é selecionada dentre estabilidade aprimorada na presença de protease, estabilidade aprimorada em detergente ou tampão, desempenho aprimorado de limpeza e desempenho aprimorado de limpeza envelhecido. Em outra modalidade, uma ou mais variantes de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma aqui descrito têm uma ou mais propriedades aprimoradas em comparação com SEQ ID NO:160, em que a propriedade aprimorada é selecionada dentre estabilidade aprimorada na presença de protease, estabilidade aprimorada emdetergente ou tampão, desempenho aprimorado de limpeza edesempenho aprimorado de limpeza envelhecido.
[00115] Em uma modalidade adicional, uma ou mais variantes de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma aqui descritos têm uma ou mais propriedades aprimoradas em comparação com um polipeptídeo de referência, em que a dita propriedade aprimorada é selecionada dentre (i) estabilidade aprimorada em detergente, em que a dita variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma retém pelo menos 10%, 20%, 30%, 40% ou 50% de atividade de mananase residual a uma temperatura de cerca de 40°C a cerca de 70°C, cerca de 45°C a cerca de 65°C, cerca de 50°C a cerca de 60°C, cerca de 60°C a cerca de 70°C ou cerca de 56°C por um período de pelo menos 5 minutos; (ii) estabilidade aprimorada na presença de a protease, em que a dita variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma retém pelo menos 50% de atividade de mananase na presença de uma protease e/ou um tensoativo por pelo menos 15 dias de ou cerca de 15 a cerca de 40 dias; (iii) desempenho aprimorado de limpeza, em que a dita variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma tem um índice de desempenho da limpeza de mancha de goma de alfarrobeira ("PI") >1; e iv) desempenho aprimorado de limpeza envelhecido, em que a dita variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma tem pelo menos 15% de atividade de limpeza remanescente após 7 horas ou pelo menos 11% de atividade de limpeza remanescente após 9 horas. Em ainda outra modalidade adicional, uma ou mais variantes de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma aqui descritas têm uma ou mais propriedades aprimoradas em comparação com um polipeptídeo de referência, em que a dita propriedade aprimorada é estabilidade aprimorada em detergente e a dita variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma retém pelo menos 10%, 20%, 30%, 40% ou 50% de atividade de mananase residual a uma temperatura de cerca de 40°C a cerca de 70°C, cerca de 45°C a cerca de 65°C, cerca de 50°C a cerca de 60°C, cerca de 60°C a cerca de 70°C ou cerca de 56°C por um período de pelo menos 5 minutos. Em ainda outra modalidade adicional, uma ou mais variantes de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma aqui descritas têm uma ou mais propriedades aprimoradas em comparação com um polipeptídeo de referência, em que a dita propriedade aprimorada é estabilidade aprimorada na presença de uma protease e a dita variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma retém pelo menos 50% de atividade de mananase na presença de uma protease e/ou um tensoativo por pelo menos 15 dias de ou cerca de 15 a cerca de 40 dias. Em ainda outra modalidade adicional, uma ou mais variantes de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma aqui descritas têm uma ou mais propriedades aprimoradas em comparação com um polipeptídeo de referência, em que a dita propriedade aprimorada é desempenho aprimorado de limpeza e a dita variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma tem um PI de limpeza de mancha de goma de alfarrobeira >1. Em ainda outra modalidade adicional, uma ou mais variantes de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma aqui descritas têm uma ou mais propriedades aprimoradas em comparação com um polipeptídeo de referência, em que a dita propriedade aprimorada é desempenho aprimorado de limpeza envelhecido e a dita variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma tem pelo menos 15% de atividade de limpeza remanescente após 7 horas ou pelo menos 11% de atividade de limpeza remanescente após 9 horas.
[00116] Em algumas modalidades, a variante de mananase ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos retém pelo menos 10%, 20%, 30%, 40% ou 50% de atividade residual demananase a uma temperatura de cerca de 40 a 70°C, cerca de 45 a 65°C, cerca de 50 a 60 °C, cerca de 60 a 70 °C ou cerca de 60°C. Em ainda outras modalidades adicionais, a variante de mananase ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos retém pelo menos 70% de sua atividade máxima de mananase a uma faixa de temperatura de cerca de 40 a 70°C, cerca de 45 a 75°C, cerca de 45 a 65°C, cerca de 50 a 60°C ou cerca de 60 a 70°C. Em outras modalidades, a variante de mananase ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos retém pelo menos 70% de sua atividade máxima de mananase a uma temperatura acima de 20°C, 25°C, 30°C, 35°C ou 40°C ou a uma temperatura abaixo de 60°C, 65°C, 70°C, 75°C ou 80°C. Em modalidades ainda adicionais, a quantidade de atividade máxima de mananase retida é determinada ao longo de um período de tempo de 5 minutos.
[00117] Em certas outras modalidades, as variantes de mananase ou polipeptídeos recombinantes ou fragmentos ativos dos mesmos descritas no presente documento incluem substituições que não afetam substancialmente a estrutura e/ou função do polipeptídeo. Substituições exemplificativas são mutações conservadoras, conforme resumido na Tabela I. Tabela I. Substituições de Aminoácido
[00118] As substituições que envolvem aminoácidos que ocorrem naturalmente são geralmente efetuadas por mutação de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo recombinante aqui descrito. A substituições que envolvem aminoácidos que não ocorrem naturalmente ou modificações químicas em aminoácidos são geralmente efetuadas modificando quimicamente um polipeptídeo recombinante aqui descrito.
[00119] Em algumas modalidades, as variantes de mananase ou polipeptídeos recombinantes ou fragmentos ativos dos mesmos são substancialmente idênticos a SEQ ID NO:13, significando que os mesmos podem conter substituições, inserções ou deleções de aminoácidos que não afetam significativamente a estrutura, função ou expressão da variante ou polipeptídeo ou fragmento ativo do mesmo. Tais variantes de mananase ou polipeptídeos recombinantes ou fragmentos ativos dos mesmos incluem aqueles concebidos apenas para contornar a presente descrição.
[00120] Em algumas modalidades, as variantes de mananase ou polipeptídeos recombinantes ou fragmentos ativos dos mesmos têm atividade de hidrolase 1,4-β-D-manosidica que inclui mananase, endo- 1,4-β-D-mananase, exo-1,4-β-D-mananase galactomananase e/ou atividade de glucomananase. Atividade de hidrolase 1,4-β-D- manosídica pode ser determinada e medida com o uso dos ensaios descritos no presente documento ou por outros ensaios conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, um polipeptídeo da presente invenção tem atividade na presença de uma composição de detergente.
[00121] Em algumas modalidades, as variantes de mananase ou polipeptídeos recombinantes ou fragmentos ativos dos mesmos descritos no presente documento são produzidos como uma proteína de fusão de terminal N e/ou C, por exemplo, para auxiliar na extração, detecção e/ou purificação e/ou para adicionar propriedades funcionais à variante ou polipeptídeos recombinantes ou fragmentos ativos dos mesmos. Exemplos de parceiros de proteína de fusão incluem, mas sem limitação, glutationa-S-transferase (GST), 6XHis, GAL4 (ligação de DNA e/ou domínios de ativação transcricional), FLAG, MYC, BCE103 (WO 2010/044786) ou outras etiquetas são bastante conhecidas por qualquer indivíduo versado na técnica. Em algumas modalidades, um local de clivagem proteolítico é fornecido entre o parceiro de proteína de fusão e a sequência de proteína de interesse para permitir a remoção das sequências de proteína de fusão. Preferencialmente, a proteína de fusão não impede a atividade das variantes de mananase ou polipeptídeos recombinantes ou fragmentos ativos dos mesmos descritos no presente documento.
[00122] Em algumas modalidades, as variantes de mananase ou polipeptídeos recombinantes ou fragmentos ativos dos mesmos descritos no presente documento são fundidos a um domínio funcional o que inclui um peptídeo líder, propeptídeo, um ou mais domínio de ligação (módulos) e/ou um domínio catalítico. Domínios de ligação adequados incluem, mas sem limitação, módulos de ligação a carboidrato (CBM) de várias especificidades que fornecem afinidade aumentada com componentes de carboidrato presentes durante a aplicação das variantes de mananase ou polipeptídeos recombinantes ou fragmentos ativos dos mesmos descritos no presente documento. Conforme descrito no presente documento, o CBM e domínio catalítico de um polipeptídeo da presente invenção são operacionalmente ligados.
[00123] Um CBM é definido como uma sequência de aminoácidos contígua dentro de uma enzima ativa em carboidrato com um enovelamento discreto que tem atividade de ligação de carboidrato. Poucas exceções são CBMs em arcabouço celulossômico em proteínas e raros casos de CBMs putativos independentes. A exigência de CBMs existentes como módulos dentro de enzimas diferencia essa classe de proteínas de ligação de carboidrato das outras proteínas de ligação de açúcar tais como lectinas e proteínas de transporte de açúcar. CBMs foram previamente classificadas como domínios de ligação de celulose (CBDs) com base na descoberta inicial de diversos módulos que se ligam à celulose (Tomme et al., Eur J Biochem, 170:575 a 581, 1988; e Gilkes et al., J Biol Chem, 263:10.401 a 10.407, 1988). Contudo,módulos adicionais em enzimas ativas em carboidrato são continuamente encontrados os quais ligam carboidratos em vez de celulose, ainda assim atendem aos critérios do CBM, por isso a necessidade de reclassificar esses polipeptídeos com o uso de terminologia mais inclusiva. A classificação prévia de domínios de ligação de celulose teve base em similaridade de aminoácido. Agrupamentos de CBDs foram chamados de "Tipos" e numerados com numerais romanos (por exemplo, CBDs Tipo I ou Tipo II). De acordo com a classificação de hidrolase de glicosídeo, esses agrupamentos são agora chamados de famílias e numerados com numerais arábicos. As famílias 1 a 13 são as mesmas que os Tipos I a XIII (Tomme et al., in Enzymatic Degradation of Insoluble Polysaccharides (Saddler, J.N. & Penner, M., eds.), Cellulose-binding domains: classification and properties. Páginas 142 a 163, American Chemical Society, Washington, 1995). Uma revisão detalhada da estrutura e modos de ligação de CBMs pode ser encontrada em Boraston et al., Biochem J, 382:769 a 781, 2004. Estima-se que a classificação de família de CBMs auxilie na identificação de CBMs, previsão de especificidade, auxilie na identificação de resíduos funcionais, revelem relações evolucionárias e possivelmente sejam preditivas de enovelamentos de polipeptídeo. Devido ao enovelamento de proteínas ser melhor conservado do que suas sequências, algumas das famílias de CBM podem ser agrupadas em superfamílias ou clãs. As famílias de CBM atuais são 1 a 63. CBDs são encontrados nos terminais N e C de proteínas ou são internos. Os híbridos de enzima são conhecidos na técnica (Consultar por exemplo, documentos número WO90/00609 e WO95/16782) e podem ser preparados através da transformação em uma célula hospedeira de um construto de DNA que compreende pelo menos um fragmento de DNA de codificação do domínio de ligação de celulose ligado, com ou sem um ligante, a uma sequência de DNA de codificação de uma variante de mananase ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos descritos no presente documento e cultivando-se a célula hospedeira para expressar o gene fundido.
[00124] Híbridos de enzima podem ser descritos pela fórmula seguir: CBM-MR-X ou X-MR-CBM, em que CBM é a região de terminal N ou terminal C de uma sequência de aminoácidos que corresponde pelo menos ao módulo de ligação de carboidrato; MR é a região intermediária (o ligante), e pode ser uma união, ou um grupo de ligação curto de cerca de 2 a cerca de 100 átomos de carbono, de cerca de 2 a cerca de 40 átomos de carbono, de cerca de 2 a cerca de 100 aminoácidos, ou de cerca de 2 a cerca de 40 aminoácidos; e X é uma região de terminal N ou terminal C de uma variante de mananase ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos descrita no presente documento que tem atividade catalítica de mananase. Adicionalmente, uma mananase pode conter mais de um CBM ou outro módulo (ou módulos)/domínio (ou domínios) de função não glicolítica. Os termos "módulo" e "domínio" são usados indistintamente na presente revelação.
[00125] Adicionalmente, exemplos não limitantes de domínioscatalíticos incluem: celulases; hemicelulases, tais como xilanase; exo- mananases; glucanases; arabinases; galactosidases; pectinases; e/ou outras atividades tais como proteases, lipases, fosfatases ácidas e/ou outros fragmentos funcionais dos mesmos. As proteínas de fusão são opcionalmente ligadas a uma variante de mananase ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos descritos no presente documento através de uma sequência de ligante simplesmente une a variante de mananase ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos e o domínio de fusão sem afetar significativamente as propriedades de componente, ou o ligante tem opcionalmente uma importância funcional para a aplicação pretendida.
[00126] Alternativamente, as variantes de mananase ou polipeptídeos recombinantes ou fragmentos ativos dos mesmos descritos no presente documento são usados em combinação com uma ou mais proteínas de interesse adicionais. Exemplos não limitantes de proteínas de interesse incluem: acil transferases, amilases, alfa- amilases, beta-amilases, alfa-galactosidases, arabinases,arabinosidases, aril esterases, beta-galactosidases, beta-glucanases, carrageenases, catalases, celobio-hidrolases, celulases,condroitinases, cutinases, endo-beta-1, 4-glucanases, endo-beta- mananases, exo-beta-mananases, esterases, exo-mananases,galactanases, glucoamilases, hemicelulases, hialuronidases, ceratinases, lacases, lactases, ligninases, lipases, enzimas lipolíticas, lipoxigenases, mananases, oxidases, pectato liases, pectina acetil esterases, pectinases, pentosanases, peroxidases, fenoloxidases, fosfatases, fosfolipases, fitases, poligalacturonases, proteases, pululanases, redutases, ramnogalacturonases, beta-glucanases, tanases, transglutaminases, acetil-xilano esterases, xilanases, xiloglucanases, xilosidases, metaloproteases e/ou outras enzimas.
[00127] Em outras modalidades, uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma aqui descritos é fundido a um peptídeo de sinalização para direcionar a secreção extracelular da variante ou polipeptídeo ou fragmento ativo do mesmo. Por exemplo, em certas modalidades, o peptídeo de sinalização é o peptídeo de sinalização nativo da variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma aqui descrito. Em outras modalidades, o peptídeo de sinalização é um peptídeo de sinalização não nativo como o peptídeo de sinalização AprE de B. subtilis.
[00128] Em algumas modalidades, um polipeptídeo da presente invenção é expresso em um organismo heterólogo, isto é, um organismo diferente de Paenibacillus spp. Organismos heterólogos exemplificadores são bactérias Gram(+) como B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, Geobacillus (antes Bacillus) stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. megaterium, B. thuringiensis, S. lividans ou S. murinus; bactéria Gram(-) como E. coli; levedura como Saccharomyces spp. ou Schizosaccharomyces spp., por exemplo, S. cerevisiae; e fungos filamentosos como Aspergillus spp., por exemplo, A. oryzae ou A. niger e T. reesei. Os métodos para a transformação de ácidos nucleicos nestes organismos são bem conhecidos na técnica. Um procedimento adequado para a transformação de células hospedeiras de Aspergillus é descrito no documento EP238023.
[00129] Em modalidades particulares, uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma aqui descrito é expresso em um organismo heterólogo como um polipeptídeo secretado, caso no qual as composições e método abrangem um método para expressar a variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma como um polipeptídeo secretado em um organismo heterólogo.
[00130] Modalidades adicionais são direcionadas a métodos de produção de uma variante de mananase ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos descritos no presente documento que compreendem: transformar estavelmente uma célula hospedeira com um vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo de codificação da variante de mananase ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos; cultivar a célula hospedeira transformada em condições adequadas para produzir a variante de mananase ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos; e recuperar a variante de mananase ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos.
[00131] Ainda outra modalidade é direcionada a um polinucleotídeo que codifica uma variante de mananase ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos descritos no presente documento. Em um aspecto, o polinucleotídeo é contido em um vetor de expressão contido em um organismo heterólogo, tal como aqueles identificados no presente documento. O polinucleotídeo pode ser ligado operacionalmente a elementos regulatórios (por exemplo, um promotor, terminador, intensificador e similares) para auxiliar na expressão das variantes codificadas ou polipeptídeos recombinantes ou fragmentos ativos dos mesmos descritos no presente documento. Uma modalidade se refere a uma sequência de polinucleotídeos que codifica uma variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma tendo uma sequência de nucleotídeos selecionado dentre SEQ ID NOs:1 e 93 a 139. Outra modalidade se refere a uma sequência de polinucleotídeos que codifica uma variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma que tem uma sequência de nucleotídeos selecionado dentre SEQ ID NOs:1, 96, 107, 114, 117, 122, 125, 126, 130 e 131.
[00132] Algumas modalidades se referem a um polinucleotídeo que codifica uma variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma que tem pelo menos 59%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% identidade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:13. Modalidades adicionais se referem a polinucleotídeos que tem pelo menos 59%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83% 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é otimizado por códon para expressão em um hospedeiro diferente, mutacionado para introduzir locais de clonagem ou, de outro modo, alterado para adicionar funcionalidade.
[00133] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica uma variante de mananase ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos descritos no presente documento é fundido a jusante de uma sequência de codificação de um peptídeo de sinal que direciona a secreção extracelular de variante ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos. Os vetores de expressão podem ser fornecidos em uma célula hospedeira heteróloga adequada para expressar uma variante ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos descritos no presente documento, ou adequado para propagar o vetor de expressão antes de introduzir o mesmo em uma célula hospedeira adequada.
[00134] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma variante ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos hibridiza para o polinucleotídeo da SEQ ID NO:1 ou o complemento da mesma em condições especificadas de hibridização. Condições exemplificativas são condições de estringente e altamente estringente, as quais são descritas no presente documento.
[00135] DNA que codifica uma variante de mananase ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo dos mesmos descritos no presente documento podem ser quimicamente sintetizados a partir de sequências publicadas ou obtidas diretamente a partir das células hospedeiras que abrigam o gene (por exemplo, através de varredura de biblioteca de cDNA ou amplificação de PCR). Em algumas modalidades, um polinucleotídeo é incluído em um cassete de expressão e/ou clonado em um vetor de expressão adequado através de técnicas de clonagem moleculares padrão. Tais cassetes de expressão ou vetores contêm sequências que auxiliam a iniciação e terminação de transcrição (por exemplo, promotores e terminadores) e geralmente contêm um marcador selecionável.
[00136] O cassete de expressão ou vetor é introduzido em uma célula hospedeira de expressão adequada, que, então, expressa a variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento correspondente da mesma aqui descrita. Hospedeiros de expressão particularmente adequados são os gêneros de hospedeiros de expressão bacterianos incluindo Escherichia (por exemplo, E. coli), Pseudomonas (por exemplo, P. fluorescens ou P. stutzerei), Proteus (por exemplo, P. mirabilis), Ralstonia (por exemplo, R. eutropha), Streptomyces, Staphylococcus (por exemplo, S. carnosus), Lactococcus (por exemplo, L. lactis) ou Bacillus (subtilis, megaterium, licheniformis, etc.). São particularmente adequados, também, hospedeiros de expressão de levedura como S. cerevisiae, S. pombe, Y. lipolytica, H. polymorpha, K. lactis ou P. pastoris. São especialmente adequados hospedeiros de expressão fúngica como C.lucknowense, Aspergillus (por exemplo, A. oryzae, A. niger, A. nidulans, etc.) ou T. reesei. Também são adequados hospedeiros de expressão de mamífero como camundongo (por exemplo, NS0), linhagens celulares de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou de Rim de Hamster Bebê (BHK). Outros hospedeiros eucarióticos tais como células de insetos ou sistemas de expressão viral (por exemplo, bacteriófagos tais como fago M13, T7 ou Lambda, ou vírus tais como Baculovírus) também são adequados para produzir uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma aqui descrito.
[00137] As sequências promotoras e/ou sinal associadas a proteínas secretadas em um hospedeiro particular de interesse são candidatas para uso na produção heteróloga e secreção de mananases nesse hospedeiro ou em outros hospedeiros. Como exemplo, em sistemas fúngicos filamentosos, os promotores que conduzem os genes para a celobio-hidrolase I (cbh1), glicoamilase A (glaA), TAKA-amilase (amyA), xilanase (exlA), o promotor gpd cbh1, cbhll, genes da endoglucanase EGI-EGV, Cel61B, Cel74A, egl1-egl5, promotor gpd, Pgk1, pki1, EF- 1alpha, tef1, cADN1 e hex1 são particularmente adequados e podem ser derivados de um número de diferentes organismos (por exemplo, A. niger, T. reesei, A. oryzae, A. awamori, e A. nidulans). Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é recombinantmente associado a um polinucleotídeo que codifica uma sequência de sinais homóloga ou heteróloga que conduz à secreção de uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma aqui descrito no espaço extracelular (ou periplásmico),permitindo desse modo a detecção direta da atividade enzimática no sobrenadante celular (ou espaço periplásmico ou lisado). Sequências sinal particularmente adequadas para E. coli, outras bactérias Gram negativas e outros organismos conhecidos na técnica incluem as que conduzem a expressão dos genes HlyA, DsbA, Pbp, PhoA, PelB, OmpA, OmpT ou Gill do fago M13. Para o B. subtilis, organismos Gram-positivos e outros organismos conhecidos na técnica, sequências de sinais particularmente adequadas incluem ainda as que conduzem a expressão de AprE, NprB, Mpr, AmyA, AmyE, Blac, SacB, e para S. cerevisiae ou outras leveduras, incluindo a toxina matadora, a sequência de sinais de Bar1, Suc2, Fator de acoplamento alfa, Inu1A ou Ggplp. As sequências-sinal podem ser clivadas por um número de peptidases-sinal, removendo-as assim do resto da proteína expressa. Em algumas modalidades, o restante do polipeptídeo é expresso isoladamente ou como uma fusão com outros peptídeos, marcadores ou proteínas localizadas no N- ou C-terminal (por exemplo, marcadores 6XHis, HA ou FLAG). Fusões adequadas incluem etiquetas, peptídeos ou proteínas que facilitam a purificação ou detecção por afinidade (por exemplo, BCE103, 6XHis, HA, proteína de ligação a quitina, tiorredoxina ou etiquetas FLAG), bem como os que facilitam a expressão, secreção ou processamento da mananase-alvo. Os sítios de processamento adequados incluem enterocinase, STE13, Kex2 ou outros locais de clivagem por protease para clivagem in vivo ou in vitro.
[00138] Uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma aqui descrito pode ser introduzida em células hospedeiras de expressão por meio de um número de métodos de transformação incluindo, mas não limitados a, eletroporação, transfecção ou transformação assistida por lipídios (“lipofecção”), transfecção mediada quimicamente (por exemplo, CaCl e/ou CaP), transformação mediada por acetato de lítio (por exemplo, de protoplastos de células hospedeiras), transformação biolística “gene gun”, transformação mediada por PEG (por exemplo, de protoplastos de células hospedeiras), fusão de protoplastos (por exemplo, usando protoplastos bacterianos ou eucarióticos), transformação mediada por lipossomas, Agrobacterium tumefaciens, transformação ou transdução de adenovírus ou outros vírus ou fagos.
[00139] Alternativamente, uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma aqui descrito pode ser expresso de maneira intracelular. Opcionalmente, após expressão intracelular das variantes enzimáticas ou secreção para o espaço periplásmico usando sequências-sinal tais como as mencionadas acima, pode ser usada uma etapa de permeabilização ou lise para liberar o polipeptídeo para o sobrenadante. A ruptura da barreira membranar é efetuada através do uso de meios mecânicos tais como ondas ultrassônicas, tratamento com pressão (prensa francesa), cavitação, ou através do uso de enzimas de digestão de membranas tais como a lisozima ou misturas enzimáticas. Como uma alternativa adicional, os polinucleotídeos que codificam uma variante de mananase ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo do mesmo aqui descrito podem ser expressos utilizando um sistema de expressão livre de células adequado. Em sistemas isentos de células, o polinucleotídeo de interesse é tipicamente transcrito com o auxílio de um promotor, mas a ligação para formar um vetor de expressão circular é opcional. Em outras modalidades, o ARN é adicionado exogenamente ou gerado sem transcrição e traduzido em sistemas isentos de células.
[00140] Outra modalidade se refere a uma composição de limpeza que compreende uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma e métodos para utilizar tais composições em aplicações de limpeza. As aplicações de limpeza incluem, sem limitação, limpeza de roupa ou têxteis, amaciamento de roupa ou têxteis, lavagem de louça (manual e automática), pré- tratamento de nódoas e semelhantes. Aplicações particulares são aquelas em que mananos (por exemplo, goma de alfarrobeira, goma guar, etc.) são um componente das sujeiras ou manchas a serem removidas.
[00141] Composições de limpeza tipicamente incluem uma quantidade eficaz de uma variante de mananase ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo do mesmo aqui descrito, por exemplo, pelo menos 0,0001 por cento em peso, de cerca de 0,0001 a cerca de 1, de cerca de 0,001 a cerca de 0,5, de cerca de 0,01 a cerca de 0,1 por cento em peso, ou até de cerca de 0,1 a cerca de 1 por cento em peso, ou mais. Uma quantidade eficaz de uma variante de mananase ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo do mesmo na composição de limpeza resulta na variante de mananase ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo do mesmo tendo atividade enzimática suficiente para hidrolisar um substrato contendo manano, como a goma de alfarroba, goma de guar ou combinações dos mesmos.
[00142] Algumas modalidades se referem a uma composição de limpeza sob uma forma selecionada de pó, líquido, granular, barra, sólido, semissólido, gel, pasta, emulsão, tablete, cápsula, dose unitária, lâmina e espuma. Em algumas modalidades, a composição de limpeza é uma composição detergente. Em outras modalidades, a composição de limpeza ou composição detergente é selecionada dentre um detergente para lavagem de roupas, um detergente amaciante de tecido, um detergente para lavagem de louças e um detergente para limpeza de superfícies rígidas.
[00143] A menos que seja notado o contrário, todos níveis de componente ou composição fornecidos no presente documento são feitos em referência ao nível ativo daquele componente ou daquela composição, e são exclusivos em termos de impurezas, por exemplo, solventes residuais ou subprodutos, que podem estar presentes em fontes comercialmente disponíveis. Os pesos de componente de enzima se baseiam na proteína ativa total. Todas as porcentagens e as razões são calculadas em peso a menos que seja indicado o contrário. Todas as porcentagens e as razões são calculadas com base na composição total a menos que seja indicado o contrário. Em composições de detergente exemplificativas, os níveis de enzima são expressos por enzima pura em peso da composição total e a menos que seja especificado de outro modo, os ingredientes detergentes são expressos em peso das composições totais.
[00144] Em algumas modalidades, as composições de limpeza aqui descritas compreendem adicionalmente um tensoativo. Em algumas modalidades, o tensoativo é selecionado de um não iônico, anfolítico, semipolar, aniônico, catiônico, zwitteriônico, e combinações e misturas dos mesmos. Em uma modalidades adicional, o tensoativo iônico é selecionado de um tensoativo aniônico, um tensoativo catiônico, um tensoativo zwitteriônico e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, as composições de limpeza aqui descritas compreendem de cerca de 0,1% a cerca de 60%, cerca de 1% a cerca de 50%, ou cerca de 5% a cerca de 40% de tensioativo em peso da composição. Tensoativos exemplificadores incluem, mas sem limitação, dodecilbenzeno sulfonato de sódio, C12-14 pareth-7, C12-15 pareth-7, C12-15 pareth sulfato de sódio, C14-15 pareth-4, laureth sulfato de sódio (por exemplo, Steol CS-370), cocoato hidrogenado de sódio, C12 etoxilados (Alfonic 1012-6, Hetoxol LA7, Hetoxol LA4), alquil benzeno sulfonatos de sódio (por exemplo, Nacconol 90G), e combinações e misturas dos mesmos. Tensoativos aniônicos incluem, mas sem limitação, alquilbenzenossulfonato linear (LAS), alfa-olefinsulfonato (AOS), alquil sulfato (sulfato de álcool graxo) (AS), etoxissulfato de álcool (AEOS ou AES), alcanossulfonatos secundários (SAS), metil ésteres de ácido alfa-sulfo graxo, ácido alquil- ou alcenilsuccínico, ou sabão. Os tensoativos não iônicos incluem, mas sem limitação, etoxilato de álcool (AEO ou AE), etoxilatos de álcool carboxilados, etoxilato de nonilfenol, alquilpoliglicosídeo, óxido de alquildimetilamina, monoetanolamida de ácido graxo etoxilada, monoetanolamida de ácido graxo, amida de ácido graxo de poli-hidróxi alquila (por exemplo, conforme descrito no documento WO92/06154), ésteres de polioxietileno de ácidos graxos, ésteres de polioxietileno sorbitano (por exemplo, TWEENs), álcoois de polioxietileno, isoálcoois de polioxietileno, éteres de polioxietileno (por exemplo, TRITONs e BRIJ), ésteres de polioxietileno, polioxietileno-p-terc-octilfenóis oucondensados de óxido de octilfenil-etileno (por exemplo, NONIDET P40), condensados de óxido de etileno com álcoois graxos (por exemplo, LUBROL), polioxietileno nonilfenóis, polialquileno glicóis (SINPERONIC F108), tensoativos à base de açúcar (por exemplo, glicopiranosídeos, tioglicopiranosídeos) e combinações e misturas dos mesmos.
[00145] Em uma modalidade adicional, as composições detergentes reveladas no presente documento compreendem adicionalmente uma mistura de tensoativos que inclui, mas sem limitação, 5 a 15% de tensoativos aniônicos, < 5% de tensoativos não iônicos, tensoativos catiônicos, fosfonatos, sabão, enzimas, perfume, metilpropionato de butilfenila, geraniol, zeólita, policarboxilados, hexil cinamal, limoneno, tensoativos catiônicos, citronelol e benzisotiazolinona.
[00146] As composições de limpeza descritas no presente documento podem incluir adicionalmente um ou mais adjuvantes técnicos de detergente ou sistemas de adjuvante técnico, um agente complexante, um polímero, um sistema de branqueamento, estabilizante, um reforçador de bolhas de sabão, um supressor de bolhas de sabão, um agente anticorrosão, um agente de suspensão de sujeira, um agente antirredeposição de sujeira, um corante, um bactericida, um hidrótopo, um inibidor de deslustre, um abrilhantador óptico, um condicionador de tecido e um perfume. As composições de limpeza descritas no presente documento podem também incluir enzimas adicionais selecionadas dentre proteases, amilases, celulases, lipases, enzimas de degradação de pectina, xiloglucanases ou éster carboxílico hidrolases adicionais.
[00147] Em algumas modalidades, a composição de limpeza descrita no presente documento compreende adicionalmente de cerca de 1%, de cerca de 3% a cerca de 60% ou até mesmo de cerca de 5% a cerca de 40% de adjuvante técnico em peso da composição de limpeza. Os adjuvantes técnicos podem incluir, mas sem limitação, os metais alcalinos, sais de amônio e alcanolamônio de polifosfatos, silicatos de metal alcalino, carbonatos de metais alcalinos e alcalino-terrosos, aluminossilicatos, compostos de policarboxilato, hidroxipolicarboxilatos de éter, copolímeros de anidrido maleico com etileno ou éter vinil metílico, ácido 1,3,5-tri-hidroxi benzeno-2,4,6-trissulônico e ácido carboximetiloxissuccínico, os vários metais alcalinos, sais de amônio e amônio substituído de ácidos poliacéticos, tais como ácido etilenodiamina tetra-acético e ácido nitrilotriacético, assim como policarboxilatos, tais como ácido melítico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido oxidissuccínico, ácido polimaleico, ácido benzeno 1,3,5- tricarboxílico, ácido carboximetiloxissuccínico e sais solúveis dos mesmos.
[00148] Em algumas modalidades, os adjuvantes técnicos de complexos iônicos de dureza solúveis em água (por exemplo, adjuvantes técnicos sequestrantes), tais como citratos e polifosfatos (por exemplo, tripolifosfato de sódio e tripolifosfato de sódio hexaidratado, tripolifosfato de potássio e tripolifosfato de sódio e potássio misturados, etc.). Qualquer adjuvante técnico adequado pode encontrar uso nas composições descritas no presente documento, incluindo aquelas conhecidas na técnica (consultar, por exemplo, o documento EP 2100949).
[00149] Conforme indicado no presente documento, em algumas modalidades, as composições de limpeza descritas no presente documento compreendem adicionalmente um ingrediente auxiliar incluindo, mas sem limitação, tensoativos, adjuvantes técnicos, alvejantes, ativadores de alvejante, catalisadores de alvejante, outras enzimas, sistemas de estabilização de enzima, quelantes, abrilhantadores ópticos, polímeros de liberação de sujeira, agentes de transferência de corante, agentes inibidores de transferência de corante, materiais catalíticos, peróxido de hidrogênio, fontes de peróxido de hidrogênio, perácidos pré-formados, agentes dispersantes poliméricos, agentes de remoção de sujeira de argila, agentes de elasticidade de estrutura, dispersantes, supressores de bolhas de sabão, corantes, perfumes, colorantes, sais de carga, hidrótopos, fotoativadores, agentes de fluorescência, condicionadores de tecido, tensoativos hidrolisáveis, solventes, conservantes, antioxidantes, agentes antiencolhimento, agentes antiamarrotamento, germicidas, fungicidas,salpicos de cor, silvercare, agentes antideslustre e/ou anticorrosão, fontes de alcalinidade, agentes solubilizantes, carreadores, auxiliares de processamento, pigmentos e agentes de controle de pH (Consultar, por exemplo, os documentos US 6.610.642; 6.605.458; 5.705.464; 5.710.115; 5.698.504; 5.695.679; 5.686.014; e 5.646.101). Em algumas modalidades, um ou mais auxiliar é incorporado, por exemplo, para ajudar ou melhorar o desempenho da limpeza, para o tratamento do substrato a ser limpo ou para modificar a estética da composição de limpeza como é o caso com perfumes, colorantes, corantes ou similares. Qualquer tal ingrediente auxiliar é adicional à variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento. A natureza precisa destes componentes adicionais, e seus níveis de incorporação, dependerá da forma física da composição e da natureza da operação de limpeza para a qual devem ser usados.
[00150] Nas modalidades em que um ou mais ingredientes auxiliares não são compatíveis com a variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma, métodos adequados podem ser empregados para manter o ingrediente auxiliar de limpeza e as mananases separados (isto é, não em contato um com o outro) até a combinação dos dois componentes ser apropriada. Tais métodos de separação incluem qualquer método adequado conhecido na técnica (por exemplo, cápsulas de gel, encapsulamento, tabletes, separação física, etc.). A seleção específica de ingredientes auxiliares adequados é prontamente feita considerando-se a superfície, o item ou o tecido a ser limpo e a forma desejada da composição para as condições de limpeza durante o uso (por exemplo, através do uso de detergente de lavagem).
[00151] As composições de limpeza descritas no presente documento são vantajosamente empregadas, por exemplo, em aplicações de lavagem de roupas, limpeza de superfície dura, aplicações de lavagem de louças, assim como aplicações cosméticas. Ademais, os polipeptídeos da presente invenção podem encontrar uso em composições líquidas e granulares.
[00152] Uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento pode também encontrar uso em produtos aditivos de limpeza. Em algumas modalidades, o aditivo é embalado em uma forma de dosagem adequada para adição a um processo de limpeza. Em algumas modalidades, o aditivo é embalado em uma forma de dosagem para adição a um processo de limpeza em que uma fonte de peroxigênio é empregada, e eficácia de branqueamento aumentada é desejada. Qualquer forma de dosagem unitária única adequada encontra uso com a presente revelação, incluindo, mas sem limitação, pílulas, tabletes, cápsulas de gel ou outra forma de dosagem unitária única, tais como líquidos ou pós pré-medidos. Em algumas modalidades, a carga (ou cargas) ou material (ou materiais) carreador é incluído para aumentar o volume de tais composições. Os materiais adequados incluem adequados incluem, mas sem limitação, vários sais de sulfato, carbonato e silicato assim como talco, argila e similares. Os materiais de carga ou carreadores para composições líquidas incluem, mas sem limitação, água ou álcoois primários e secundários de baixo peso molecular incluindo polióis e dióis. Os exemplos de tais álcoois incluem, mas sem limitação, metanol, etanol, propanol e isopropanol. Em algumas modalidades, as composições contêm de cerca de 5% a cerca de 90% de tais materiais. Cargas ácidas encontram uso na redução de pH. Alternativamente, em algumas modalidades, o aditivo de limpeza inclui um ou mais ingredientes auxiliares.
[00153] Em uma modalidade, a composição de limpeza ou aditivo de limpeza contém uma quantidade eficaz de uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento, opcionalmente em combinação com outras mananases e/ou enzimas adicionais. Em determinadas modalidades, as enzimas adicionais incluem, mas sem limitação, pelo menos uma enzima selecionada dentre acil transferases, amilases, alfa-amilases, beta-amilases, alfa-galactosidases, arabinases, arabinosidases, aril esterases, beta-galactosidases, beta-glucanases, carrageenases, catalases, celobio-hidrolases, celulases, condroitinases, cutinases, endo-beta-1, 4-glucanases, endo-beta-mananases, exo-beta-mananases, esterases, exo-mananases, galactanases, glucoamilases, hemicelulases, hialuronidases, queratinases, lacases, lactases, ligninases, lipases, enzimas lipolíticas, lipoxigenases, mananases, metaloproteases, oxidases, pectato liases, pectina acetil esterases, pectinases, pentosanases, peridrolases, peroxidases, fenoloxidases, fosfatases, fosfolipases, fitases, poligalacturonases, proteases, pululanases, redutases, ramnogalacturonases, beta-glucanases,tanases, transglutaminases, xilano acetil-esterases, xilanases, xiloglucanases, xilosidases e combinações das mesmas. Em modalidades adicionais, as composições de limpeza ou aditivos de limpeza descritos no presente documento compreendem adicionalmente uma protease e/ou amilase.
[00154] As composições de limpeza no presente documento são tipicamente formuladas de modo que, durante o uso em operações de limpeza aquosa, a água de lavagem terá um pH de cerca de 3,0 a cerca de 11. As formulações de produto líquidas são tipicamente formuladas para terem um pH puro de cerca de 5,0 a cerca de 9,0. Os produtos para lavagem de roupas granulares são tipicamente formulados para ter um pH de cerca de 8,0 a cerca de 11,0. As técnicas para controlar o pH em níveis de uso recomendados incluem o uso de tampões, álcalis, ácidos, etc. e são bem conhecidas por aqueles versados na arte.
[00155] As composições de limpeza de baixo pH adequadas têm tipicamente um pH puro de cerca de 3,0 a cerca de 5,0 ou até mesmo de cerca de 3,5 a cerca de 4,5. As composições de limpeza de baixo pH são tipicamente isentas de tensoativos que hidrolisam em tal ambiente de pH. Tais tensoativos incluem tensoativos de alquil sulfato de sódio que compreendem pelo menos uma porção química de óxido de etileno ou até mesmo de cerca de 1 a cerca de 16 mol de óxido de etileno. Tais composições de limpeza compreendem tipicamente uma quantidade suficiente de um modificador de pH, tal como hidróxido de sódio, monoetanolamina ou ácido clorídrico, para fornecer tal composição de limpeza com um pH puro de cerca de 3,0 a cerca de 5,0. Tais composições compreendem tipicamente pelo menos uma enzima estável em relação a ácidos. Em algumas modalidades, as composições são líquidas, embora em outras modalidades as mesmas sejam sólidas. O pH de tais composições líquidas é tipicamente medido como um pH puro. O pH de tais composições sólidas é medido como uma solução de sólidos 10% da composição em que o solvente é água destilada. Nessas modalidades, todas as medições de pH são tomadas a 20 °C, a não ser que indicado de outro modo.
[00156] As composições de limpeza de alto pH adequadas têm tipicamente um pH puro de cerca de 9,0 a cerca de 11,0 ou até mesmo um pH puro de 9,5 a 10,5. Tais composições de limpeza compreendem tipicamente uma quantidade suficiente de um modificador de pH, tal como hidróxido de sódio, monoetanolamina ou ácido clorídrico, para fornecer tal composição de limpeza com um pH puro de cerca de 9,0 a cerca de 11,0. Tais composições compreendem tipicamente pelo menos uma enzima estável em relação a bases. Em algumas modalidades, as composições são líquidas, embora em outras modalidades as mesmas sejam sólidas. O pH de tais composições líquidas é tipicamente medido como um pH puro. O pH de tais composições sólidas é medido como uma solução de sólidos 10% da dita composição em que o solvente é água destilada. Nessas modalidades, todas as medições de pH são tomadas a 20 °C, a não ser que indicado de outro modo.
[00157] Em algumas modalidades, a variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma está na forma de uma partícula encapsulada para proteger o mesmo de outros componentes da composição granular durante o armazenamento. Adicionalmente, o encapsulamento é também um meio de controlar a disponibilidade da variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma durante o processo de limpeza. Em algumas modalidades, o encapsulamento melhora o desempenho da variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma e/ou enzimas adicionais. Nesse sentido, a variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma é encapsulado com qualquer material de encapsulamento adequado conhecido na técnica. Tipicamente, o material de encapsulamento é solúvel em água e/ou dispersável em água. Em algumas modalidades, o material de encapsulamento tem uma temperatura de transição vítrea (Tg) de 0 °C ou mais alta. A temperatura de transição vítrea é descrita em mais detalhes no documento WO97/11151. O material de encapsulamento é tipicamente selecionado dentre carboidratos, gomas naturais ou sintéticas, quitina, quitosano, celulose e derivados de celulose, silicatos, fosfatos, boratos, álcool polivinílico, polietileno glicol, ceras de parafina e combinações dos mesmos. Quando o material de encapsulamento for um carboidrato, o mesmo é tipicamente selecionado dentre monossacarídeos, oligossacarídeos, polissacarídeos e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades típicas, o material de encapsulamento é um amido (consultar, por exemplo, os documentos EP0922499 e US 4.977.252; 5.354.559; e 5.935.826). Em algumas modalidades, o material de encapsulamento é uma microesfera produzida a partir de plástico, tais como termoplásticos, acrilonitrila, metacrilonitrila, poliacrilonitrila, polimetacrilonitrila e misturas dos mesmos; as microesferas comercialmente disponíveis que encontram uso incluem, mas sem limitação, aquelas fornecidas junto à EXPANCEL® (Stockviksverken, Suécia) e PM6545, PM6550, PM7220, PM7228, EXTENDOSPHERES®, LUXSIL®, Q-CEL® e SPHERICEL® (PQ Corp., Valley Forge, PA).
[00158] O termo "composição granular" refere-se a um conglomerado de partículas macroscópicas sólidas distintas. Pós são uma classe especial de material granular devido a seu tamanho pequeno de partícula que torna os mesmos mais coesivos e mais facilmente suspensos.
[00159] As concentrações de composições detergentes em soluções de lavagem típicas por todo o mundo variam e menos do que cerca de 800 ppm de composição detergente ("geografias de baixa concentração de detergente"), por exemplo, cerca de 667 ppm no Japão, a entre cerca de 800 ppm a cerca de 2.000 ppm ("geografias de média concentração de detergente"), por exemplo, cerca de 975 ppm nos EUA e cerca de 1.500 ppm no Brasil, a mais do que cerca de 2.000 ppm ("geografias de alta concentração de detergente"), por exemplo, cerca de 4.500 ppm a cerca de 5.000 ppm na Europa e cerca de 6.000 ppm em geografias de adjuvante técnico de fosfato de bolhas de sabão de alto teor.
[00160] Em algumas modalidades, as composições detergentesdescritas no presente documento podem ser utilizadas a uma temperatura de cerca de 10 °C a cerca de 60°C, ou de cerca de 20°C a cerca de 60 C ou de cerca de 30°C a cerca de 60°C, de cerca de 40°C a cerca de 60°C, de cerca de 40°C a cerca de 55°C ou todas as faixas dentro de 10°C a 60°C. Em algumas modalidades, as composições detergentes descritas no presente documento são usadas em "lavagem de água fria" a temperaturas de cerca de 10°C a cerca de 40°C ou de cerca de 20°C a cerca de 30°C, de cerca de 15°C a cerca de 25°C, de cerca de 15°C a cerca de 35°C ou todas as faixas dentro de 10°C a 40°C.
[00161] Como um exemplo adicional, diferentes geografias têm tipicamente diferentes durezas de água. A dureza de água é normalmente descrita em termos de Ca2+/Mg2+ misturados com grãos por galão. A dureza é uma medida da quantidade de cálcio (Ca2+) e magnésio (Mg2+) na água. A maior parte da água nos Estados Unidos é dura, mas o grau de dureza varia. A água moderadamente dura (60 a 120 ppm) a dura (121 a 181 ppm) tem 60 a 181 partes por milhão (partes por milhão convertidas em grãos por galão americano é o n° de ppm dividido por 17,1 igual aos grãos por galão) de minerais de dureza.Tabela II. Níveis de Dureza de Água
[00162] A dureza de água europeia é tipicamente maior do que cerca de 10,5 (por exemplo, cerca de 10,5 a cerca de 20,0) grãos por galão de Ca2+/Mg2+ misturados (por exemplo, cerca de 15 grãos por galão de Ca2+/Mg2+ misturados). A dureza de água norte-americana é tipicamente maior do que a dureza de água japonesa, mas menor do que a dureza de água europeia. Por exemplo, a dureza de água norte-americana pode ser entre cerca de 3 a cerca de 10 grãos, cerca de 3 a cerca de 8 grãos ou cerca de 6 grãos. A dureza de água japonesa é tipicamente menor do que a dureza de água norte-americana, usualmente menor do que cerca de 4, por exemplo, cerca de 3 grãos por galão de Ca2+/Mg2+ misturados.
[00163] Em algumas modalidades, uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento é comparável em desempenho de lavagem a mananases comercialmente disponíveis. Em algumas modalidades, uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento exibe desempenho de lavagem melhorado em comparação a mananases comercialmente disponíveis. Em algumas modalidades, uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento exibe estabilidade oxidativa melhorada, estabilidade térmica melhorada, capacidades de limpeza melhoradas sob várias condições e/ou estabilidade de quelador melhorada. Adicionalmente, uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento pode encontrar uso em composições de limpeza que não incluem detergentes, novamente, ou sozinho ou em combinação com adjuvantes técnicos e estabilizantes.
[00164] Adicionalmente às variantes de mananase ou polipeptídeos recombinantes ou fragmentos ativos dos mesmos descritos no presente documento, qualquer outra mananase adequada pode encontrar uso nas composições descritas no presente documento ou sozinha ou em combinação com as variantes ou polipeptídeos recombinantes ou fragmentos ativos dos mesmos descritos no presente documento. As mananases adequadas incluem, mas sem limitação, mananases da família GH26 de glicosil hidrolases, mananases da família GH5 de glicosil hidrolases, mananases ácidas, mananases neutras e mananases alcalinas. Os exemplos de mananases alcalinas incluem aquelas descritas nos documentos US 6.060.299; 6.566.114; e6.602.842; e WO9535362, WO9964573, WO9964619 e WO2015022428. Adicionalmente, as mananases adequadas incluem, mas sem limitação, aquelas de origem animal, vegetal, fúngica ou bacteriano. Mutantes química ou geneticamente modificados são abrangidos pela presente revelação.
[00165] Os exemplos de mananases úteis incluem endo-β- mananases de Bacillus tais como endo-β-mananase de B. subtilis (consultar, por exemplo, os documentos US 6.060.299 e WO9964573), endo-β-mananase de Bacillus sp. I633 (consultar, por exemplo, os documentos US 6.566.114 e WO9964619), endo-β-mananase de Bacillus sp. AAI12 (consultar, por exemplo, os documentos US 6.566.114 e WO9964619), endo-β-mananase de B. sp. AA349 (consultar, por exemplo, os documentos US 6.566.114 e WO9964619), endo-β-mananase de B. agaradhaerens NCIMB 40482 (consultar, por exemplo, os documentos US 6.566.114 e WO9964619), endo-β- mananase de B. halodurans , endo-β-mananase de B. clausii (consultar, por exemplo, os documentos US 6.566.114 e WO9964619), endo-β- mananase de B. licheniformis (consultar, por exemplo, os documentos US 6.566.114 e WO9964619A1), endo-β-mananases de Humicola, tal como endo-β-mananase de H. insolens (consultar, por exemplo, os documentos US 6.566.114 e WO9964619) e endo-β-mananases de Caldocellulosiruptor, tal como endo-β-mananase de C. sp. (consultar, por exemplo, os documentos US 6.566.114 e WO9964619).
[00166] Ademais, várias mananases identificadas (isto é, endo-β- mananases e exo-β-mananases) encontram uso em algumas modalidades da presente revelação, incluindo, mas sem limitação, mananase de A. bisporus (consultar, Tang et al., [2001] Appl. Environ. Microbiol. 67:2.298 a 2.303), mananase de A. tamarii (consultar, Civas et al., [1984] Biochem. J. 219:857 a 863), mananase de A. aculeatus (consultar, Christgau et al., [1994] Biochem. Mol. Biol. Int. 33:917 a 925), mananase de A. awamori (consultar, Setati et al., [2001] Protein Express Purif. 21:105 a 114), mananase de A. fumigatus (consultar, Puchart et al., [2004] Biochimica et biophysica Acta. 1674:239 a 250), mananase de A. niger (consultar, Ademark et al., [1998] J. Biotechnol. 63:199 a 210), mananase de A. oryzae NRRL ( , Regalado et al., [2000] J. Sci. Food Agric. 80:1.343 a 1.350), mananase de A. sulphureus (consultar, Chen et al., [2007] J. Biotechnol. 128(3):452 a 461), mananase de A. terrus (consultar, Huang et al., [2007] Wei Sheng Wu Xue Bao. 47(2): 280 a 284), mananase de Paenibacillus e Bacillus spp. (consultar, o documento US 6.376.445.), mananase de Bacillus AM001 (consultar, Akino et al., [1989] Arch. Microbiol. 152:10 a 15), mananase de B. brevis (consultar, Araujo e Ward, [1990] J. Appl. Bacteriol. 68:253 a 261), mananase de B. circulans K-1 (consultar, Yoshida et al., [1998] Biosci. Biotechnol. Biochem. 62(3):514 a 520), mananase de B. polimyxa (consultar, Araujo e Ward, [1990] J. Appl. Bacteriol. 68:253 a 261), mananase de Bacillus sp JAMB-750 (consultar, ,Hatada et al., [2005] Extremophiles. 9:497 a 500), mananase de Bacillus sp. M50(consultar, Chen et al., [2000] Wei Sheng Wu Xue Bao. 40:62 a 68), mananase de Bacillus sp. N 16-5(consultar, ,Yanhe et al., [2004] Extremophiles 8:447 a 454), mananase de B. stearothermophilus (consultar, Talbot e Sygusch, [1990] Appl. Environ. Microbiol. 56: 3.505 a 3.510), mananase de B. subtilis (consultar, Mendoza et al., [1994] World J. Microbiol. Biotechnol. 10:51 a 54), mananase de B. subtilis B36 (Li et al., [2006] Z. Naturforsch (C). 61:840 a 846), mananase de B. subtilis BM9602 (consultar, Cui et al., [1999] Wei Sheng Wu Xue Bao. 39(1):60 a 63), mananase de B. subtilis SA-22 (consultar, Sun et al., [2003] Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 19(3):327 a 330), mananase de B. subtilis168 (consultar, Helow e Khattab, [1996] Acta Microbiol. Immunol. Hung. 43:289 a 299), mananase de B. ovatus (consultar, Gherardini et al., [1987] J. Bacteriol. 169:2.038 a 2.043), mananase de B. ruminicola (consultar, Matsushita et al., [1991] J. Bacteriol. 173:6.919 a 6.926), mananase de C. cellulovorans (consultar, Sunna et al., [2000] Appl. Environ. Microbiol. 66:664 a 670), mananase de C. saccharolyticus (consultar, Morris et al., [1995] Appl. Environ. Microbiol. 61: 2.262 a 2.269), mananase de C. saccharolyticum (consultar, Bicho et al., [1991] Appl. Microbiol. Biotechnol. 36:337 a 343), mananase de C. fimi (consultar, Stoll et al., [1999] Appl. Environ. Microbiol. 65(6):2.598 a 2.605), mananase de C. butyricum/beijerinckii (consultar, Nakajima e Matsuura, [1997] Biosci. Biotechnol. Biochem. 61:1.739 a 1.742), mananase de C. cellulolyticum (consultar, Perret et al., [2004] Biotechnol. Appl. Biochem. 40:255 a 259), mananase de C. tertium (consultar, Kataoka e Tokiwa, [1998] J. Appl. Microbiol. 84:357 a 367), mananase de C. thermocellum (consultar, Halstead et al., [1999]Microbiol. 145:3.101 a 3.108), mananase de D. thermophilum (consultar, Gibbs et al., [1999] Curr. Microbiol. 39(6):351 a 357), mananase de Flavobacterium sp. (consultar, Zakaria et al., [1998] Biosci. Biotechnol. Biochem. 62:655 a 660), mananase de G. pulmonata (consultar, Charrier e Rouland, [2001] J. Expt. Zool. 290: 125 a 135), mananase de L. brevicula (consultar, Yamamura et al., [1996] Biosci. Biotechnol. Biochem. 60:674 a 676), mananase de L. esculentum (consultar,Filichkin et al., [2000] Plant Physiol. 134:1.080 a 1.087), mananase de P. curdlanolyticus (consultar, Pason e Ratanakhanokchai, [2006] Appl. Environ. Microbiol. 72:2.483 a 2.490), mananase de P. polimyxa (consultar, Han et al., [2006] Appl. Microbiol Biotechnol. 73(3):618 a 630), mananase de P. chrysosporium (consultar, Wymelenberg et al., [2005] J. Biotechnol. 118:17 a 34), mananase de Piromyces sp. (consultar, Fanutti et al., [1995] J. Biol. Chem. 270(49):29.314 a 29.322), mananase de P. insulars (consultar, Yamamura et al., [1993] Biosci. Biotechnol. Biochem. 7:1.316 a 1.319), mananase de P. fluorescens subsp. cellulosa (consultar, Braithwaite et al., [1995] Biochem J.305:1.005 a 1.010), mananase de R. marinus (consultar, Politz et al., [2000] Appl. Microbiol. Biotechnol. 53 (6):715 a 721), mananase de S.rolfsii (consultar, Sachslehner et al., [2000] J. Biotechnol. 80:127 a 134), mananase de S. galbus (consultar, Kansoh e Nagieb, [2004] Anton. van. Leeuwenhoek. 85:103 a 114), mananase de S. lividans (consultar, Arcand et al., [1993] J.Biochem. 290:857 a 863), mananase de T. Polysaccharolyticum (consultar, Cann et al., [1999] J. Bacteriol. 181:1.643 a 1.651), mananase de T. fusca (consultar, Hilge et al., [1998] Structure 6:1.433 a 1.444), mananase de T. maritima (consultar, Parker et al., [2001] Biotechnol. Bioeng. 75(3):322 a 333), mananase de T. neapolitana (consultar, Duffaud et al., [1997] Appl. Environ. Microbiol. 63:169 a 177), mananase de T. harzianum cepa T4 (consultar, Franco et al., [2004] Biotechnol Appl. Biochem. 40:255 a 259), mananase de T. reesei (consultar, Stalbrand et al., [1993] J. Biotechnol. 29:229 a 242) e mananase de Vibrio sp. (consultar, Tamaru et al., [1997] J. Ferment. Bioeng. 83:201 a 205).
[00167] As mananases adequadas adicionais incluem endo-β- mananases comercialmente disponíveis, tais como HEMICELL® (Chemgen); GAMANASE® e MANNAWAY®, (Novozymes A/S, Dinamarca); EFFECTENZ™ M 1000, PREFERENZ® M 100, PURABRITE™ e MANNASTAR™ (DuPont); e PYROLASE® 160 ePYROLASE® 200 (Diversa).
[00168] Em outras modalidades, a composição descrita no presente documento compreende uma ou mais variantes de mananase descritas no presente documento e uma ou mais enzimas adicionais. A uma ou mais enzima adicional é selecionada dentre acil transferases, alfa- amilases, beta-amilases, alfa-galactosidases, arabinosidases, aril esterases, beta-galactosidases, carrageenases, catalases, celobio- hidrolases, celulases, condroitinases, cutinases, endo-beta-1,4- glucanases, endo-beta-mananases, esterases, exo-mananases, galactanases, glucoamilases, hemicelulases, hialuronidases, queratinases, lacases, lactases, ligninases, lipases, lipoxigenases, mananases adicionais, metaloproteases, oxidases, pectato liases, pectina acetil esterases, pectinases, pentosanases, peroxidases, fenoloxidases, fosfatases, fosfolipases, fitases, poligalacturonases, proteases, pululanases, redutases, ramnogalacturonases, beta- glucanases, tanases, transglutaminases, xilano acetil-esterases, xilanases, xiloglucanases, xilosidases e qualquer combinação ou mistura das mesmas. Algumas modalidades referem-se a uma combinação de enzimas (isto é, um "coquetel") que compreende enzimas convencionais como amilase, lipase, cutinase, protease e/ou celulase em conjunto com uma ou mais variantes de mananase descritas no presente documento e/ou uma ou mais mananase adicionais.
[00169] Em algumas modalidades, as composições de limpeza aqui descritas compreendem adicionalmente uma protease. Em algumas modalidades, a composição compreende de cerca de 0,00001% a cerca de 10% de protease em peso da composição. Em outra modalidade, a composição de limpeza compreende de cerca de 0,0001% a cerca de 10%, cerca de 0,001% a cerca de 5%, cerca de 0,001% a cerca de 2% ou cerca de 0,005% a cerca de 0,5% de protease em peso da composição.
[00170] Em uma modalidade, a protease é uma serina protease. As proteases adequadas incluem aquelas de origem animal, vegetal ou microbiana. Em algumas modalidades, a protease é uma protease microbiana. Em outras modalidades, a protease é um mutante química ou geneticamente modificado. Em outra modalidade, a protease é uma protease microbiana alcalina ou uma protease semelhante à tripsina. As proteases alcalinas exemplificativas incluem subtilisinas derivadas de, por exemplo, Bacillus (por exemplo, subtilisina, lentus, amyloliquefaciens, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 e subtilisina 168). As proteases adicionais exemplificativas incluem, porém sem limitações, aquelas descritas dos documentos WO92/21760, WO95/23221, WO2008/010925, WO09/149200,WO09/149144, WO09/149145, WO10/056640, WO10/056653,WO2010/0566356, WO11/072099, WO2011/13022, WO11/140364,WO12/151534, WO2015/038792, WO2015/089447, WO2015/089441, WO2015/143360, WO2016/061438, WO2016/069548,WO2016/069544, WO2016/069557, WO2016/069563,WO2016/069569, WO2016/069552, WO2016/145428, Publicação n° US 2008/0090747, US 5.801.039, US 5.340.735, US 5.500.364, US 5.855.625, RE 34.606, US 5.955.340, US 5.700.676, US 6.312.936, US 6.482.628, US 8.530.219, Pedidos Provisórios n° US 62/331282, 62/332417, 62/343618 e 62/351649 e Pedidos PCT n° PCT/US16/32514 e PCT/US2016/038245, assim como as metaloproteases descritas nos documentos WO1999014341, WO1999033960, WO1999014342,WO1999034003, WO2007044993, WO2009058303, WO 2009058661, WO2014071410, WO2014194032, WO2014194034, WO 2014194054 e WO 2014/194117. As proteases exemplificativas incluem, mas sem limitação, tripsina (por exemplo, de origem porcina ou bovina) e a protease de Fusarium descrita no documento WO89/06270. As proteases comerciais exemplificativas incluem, mas sem limitação, as proteases MAXATASE®, MAXACAL™, MAXAPEM™, OPTICLEAN®, OPTIMASE®, PROPERASE®, PURAFECT®, PURAFECT® OXP, PURAMAX™, EXCELLASE™, PREFERENZ™ (por exemplo, P100, P110, P280), proteases EFFECTENZ™ (por exemplo, P1000, P1050, P2000), proteases EXCELLENZ™ (por exemplo, P1000), ULTIMASE® e PURAFAST™ (DuPont); ALCALASE®, BLAZE®, BLAZE® EVITY®, BLAZE® EVITY® 16L, CORONASE®, SAVINASE®, SAVINASE® ULTRA, SAVINASE® EVITY®, SAVINASE® EVERIS®, PRIMASE®, DURAZYM™, POLARZYME®, OVOZYME®, KANNASE®, LIQUANASE®, LIQUANASE EVERIS®, NEUTRASE®, PROGRESS UNO®, RELASE® e ESPERASE® (Novozymes); variantes de BLAP™ e BLAP™ (Henkel); LAVERGY™ PRO 104 L (BASF) e KAP (subtilisina de B. alkalophilus (Kao)).
[00171] Em algumas modalidades, as composições de limpeza descritas no presente documento compreendem adicionalmente uma amilase adequada. Em uma modalidade, a composição compreende de cerca de 0,00001% a cerca de 10%, cerca de 0,0001% a cerca de 10%, cerca de 0,001% a cerca de 5%, cerca de 0,001% a cerca de 2% ou cerca de 0,005% a cerca de 0,5% de amilase em peso da composição. Qualquer amilase (por exemplo, alfa e/ou beta) adequada para uso em soluções alcalinas pode ser útil para incluir em tal composição. Uma amilase exemplificativa pode ser um mutante química ou geneticamente modificado. As amilases exemplificativas incluem, mas sem limitação, aquelas de origem bacteriana ou fúngica, como, por exemplo, amilases descritas nos documentos GB 1.296.839, WO9100353, WO9402597, WO94183314, WO9510603, WO9526397, WO9535382, WO9605295, WO9623873, WO9623874, WO 9630481, WO9710342, WO9741213, WO9743424, WO9813481, WO 9826078, WO9902702, WO 9909183, WO9919467, WO9923211, WO9929876, WO9942567, WO 9943793, WO9943794, WO 9946399, WO0029560, WO0060058, WO0060059, WO0060060, WO 0114532, WO0134784, WO 0164852, WO0166712, WO0188107, WO0196537, WO02092797, WO 0210355, WO0231124, WO 2004055178, WO2004113551, WO2005001064, WO2005003311, WO 2005018336, WO2005019443, WO2005066338, WO2006002643, WO2006012899, WO2006012902, WO2006031554, WO 2006063594, WO2006066594, WO2006066596, WO2006136161, WO 2008000825, WO2008088493, WO2008092919, WO2008101894, WO2008/112459, WO2009061380, WO2009061381, WO 2009100102, WO2009140504, WO2009149419, WO 2010/059413, WO 2010088447, WO2010091221, WO2010104675, WO2010115021, WO10115028, WO2010117511, WO 2011076123, WO2011076897, WO2011080352, WO2011080353, WO 2011080354, WO2011082425, WO2011082429, WO 2011087836, WO2011098531, WO2013063460, WO2013184577, WO 2014099523, WO2014164777 e WO2015077126. As amilases comerciais exemplificativas incluem, mas sem limitação, AMPLIFY®, AMPLIFY PRIME®, DURAMYL®, TERMAMYL®, FUNGAMYL®, STAINZYME®, STAINZYME PLUS®, STAINZYME PLUS®, STAINZYME ULTRA® EVITY® e BAN™ (Novozymes); EFFECTENZ™ S 1000, POWERASE™, PREFERENZ™ S 100, PREFERENZ™ S 110, EXCELLENZ™ S 2000, RAPIDASE® e MAXAMYL® P (DuPont).
[00172] Em algumas modalidades, as composições de limpeza descritas no presente documento compreendem adicionalmente uma enzima de degradação de pectina adequada. Conforme usado no presente documento, "enzima (ou enzimas) de degradação de pectina" abrange arabinanase (EC 3.2.1.99), galactanases (EC 3.2.1.89), poligalacturonase (EC 3.2.1.15) exo-poligalacturonase (EC 3.2.1.67), exo-poli-alfa-galacturonosidase (EC 3.2.1.82), pectina liase (EC 4.2.2.10), pectina esterase (EC 3.1.1.11), pectato liase (EC 4.2.2.2), exo-poligalacturonato liase (EC 4.2.2.9) e hemicelulases, tais como endo-1,3-β-xilosidase (EC 3.2.1.32), xilan-1,4-β-xilosidase (EC 3.2.1.37) e α-L-arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55). As enzimas de degradação de pectina são misturas naturais das atividades enzimáticas mencionadas acima. As enzimas pectina incluem, portanto, as pectina metilesterases que hidrolisam as ligações de éster pectina metílico, poligalacturonases que clivam as ligações glicosídicas entre moléculas galacturônicas, e as pectina transeliminases ou liases que atuam nos ácidos pécticos para provocar a ligação não hidrolítica de ligações α-1,4 glicosídicas para formar derivados insaturados de ácido galacturônico.
[00173] As enzimas de degradação de pectina adequadas incluem aquelas de origem vegetal, fúngica ou microbiana. Em algumas modalidades, os mutantes química ou geneticamente modificados estão incluídos. Em algumas modalidades, as enzimas de degradação de pectina são enzimas de degradação de pectina alcalinas, isto é, enzimas que têm uma atividade enzimática de pelo menos 10%, pelo menos 25% ou pelo menos 40% de sua atividade máxima a um pH de cerca de 7,0 a cerca de 12. Em determinadas outras modalidades, as enzimas de degradação de pectina são enzimas que têm sua atividade máxima a um pH de cerca de 7,0 a cerca de 12. As enzimas de degradação de pectina alcalinas são produzidas por micro-organismos alcalofílicos, por exemplo, micro-organismos bacterianos, fúngicos e de levedura, tal como a espécie Bacillus. Em algumas modalidades, os micro-organismos são B. firmus, B. circulans e B. subtilis conforme descrito nos documentos JP 56131376 e JP 56068393. As enzimas de decomposição de pectina alcalinas podem incluir, mas sem limitação, galacturan-1,4-α-galacturonidase (EC 3.2.1.67), atividades de poli- galacturonase (EC 3.2.1.15), pectina esterase (EC 3.1.1.11), pectato liase (EC 4.2.2.2) e suas isoenzimas. As enzimas de decomposição de pectina alcalinas podem ser produzidas pela espécie Erwinia. Em algumas modalidades, as enzimas de decomposição de pectina alcalinas são produzidas por E.chrysanthemi, E.carotovora,E.amylovora, E.herbicola e E.dissolvens conforme descrito nos documentos JP 59066588, JP 63042988 e em World J. Microbiol. Biotechnol. (8, 2, 115 a 120) 1992. Em determinadas outrasmodalidades, as enzimas pectina alcalinas são produzidas pela espécie Bacillus conforme revelado no documento JP 73006557 e Agr. Biol. Chem. (1972), 36 (2) 285 a 293. Em algumas modalidades, ascomposições de limpeza descritas no presente documento compreendem adicionalmente cerca de 0,00001% a cerca de 10%, cerca de 0,0001% a cerca de 10%, cerca de 0,001% a cerca de 5%, cerca de 0,001% a cerca de 2% ou cerca de 0,005% a cerca de 0,5% de enzima de degradação de pectina em peso da composição.
[00174] Em algumas outras modalidades, as composições de limpeza descritas no presente documento compreendem adicionalmente uma xiloglucanase adequada. As xiloglucanases adequadas incluem, mas sem limitação, aquelas de origem vegetal, fúngica ou bacteriana. Mutantes química ou geneticamente modificados são incluídos em algumas modalidades. Conforme usado no presente documento, "xiloglucanase (ou xiloglucanases)" abrange a família das enzimas descritas por Vincken e Voragen na Universidade de Wageningen [Vincken et al (1994) Plant Physiol., 104, 99 a 107] e tem a capacidade de degradar xiloglucanos conforme descrito em Hayashi et al (1989) Annu. Rev. Plant. Physiol. Plant Mol. Biol., 40, 139 a 168. Vincken et al demonstraram a remoção de revestimento com xiloglucano da celulose da parede celular da maçã isolada por uma xiloglucanase purificada a partir de Trichoderma viride (endo-IV- glucanase). Essa enzima melhora a degradação enzimática da celulose incorporada à parede celular e funciona em sinergia com enzimas pécticas. Rapidase LIQ+ de DSM contém atividade de xiloglucanase. Em algumas modalidades, as composições de limpeza descritas no presente documento compreendem adicionalmente de cerca de 0,00001% a cerca de 10%, cerca de 0,0001% a cerca de 10%, cerca de 0,001% a cerca de 5%, cerca de 0,001% a cerca de 2% ou cerca de 0,005% a cerca de 0,5% de xiloglucanase em peso da composição. Em determinadas outras modalidades, xiloglucanases para aplicações específicas são xiloglucanases alcalinas, isto é, enzimas que têm uma atividade enzimática de pelo menos 10%, pelo menos 25% ou pelo menos 40% de sua atividade máxima a um pH na faixa de 7 a 12. Em determinadas outras modalidades, as xiloglucanases são enzimas que têm uma atividade máxima a um pH de cerca de 7,0 a cerca de 12.
[00175] Em algumas modalidades adicionais, as composições detergentes descritas no presente documento compreendem adicionalmente uma celulase adequada. Em uma modalidade, a composição compreende de cerca de 0,00001% a cerca de 10%, 0,0001% a cerca de 10%, cerca de 0,001% a cerca de 5%, cerca de 0,001% a cerca de 2% ou cerca de 0,005% a cerca de 0,5% de celulase em peso da composição. Qualquer celulase adequada pode encontrar uso em uma composição descrita no presente documento. Uma celulase exemplificativa pode ser um mutante química ou geneticamente modificado. As celulases exemplificativas incluem, mas sem limitação, aquelas de origem bacteriana ou fúngica, tais como, por exemplo, aquelas descritas nos documentos WO2005054475, WO2005056787, US 7.449.318, US 7.833.773, US 4.435.307; EP 0495257; e no Pedido Provisório n° US 62/296.678. As celulases comerciais exemplificativas incluem, mas sem limitação, CELLUCLEAN®, CELLUZYME®, CAREZYME®, ENDOLASE®,RENOZYME®, e CAREZYME® PREMIUM (Novozymes);REVITALENZ™ 100, REVITALENZ™ 200/220, e REVITALENZ® 2000 (DuPont); e KAC-500(B)™ (Kao Corporation). Em algumas modalidades, celulases são incorporadas como porções ou fragmentos de celulases do tipo selvagem ou variantes maduras, em que uma porção do terminal N é deletada (consulte, por exemplo, o documento US 5.874.276).
[00176] Em ainda outras modalidades, as composições detergentes descritas no presente documento compreendem adicionalmente uma lipase adequada. Em algumas modalidades, a composição compreende de cerca de 0,00001 % a cerca de 10%, cerca de 0,0001 % a cerca de 10%, cerca de 0,001% a cerca de 5%, cerca de 0,001% a cerca de 2% ou cerca de 0,005% a cerca de 0,5% de lipase em peso de composição. Uma lipase exemplificativa pode ser um mutante química ou geneticamente modificado. As lipases exemplificativas incluem, mas sem limitação, por exemplo, aquelas de origem bacteriana ou fúngica, tais como, por exemplo, lipase de H. lanuginosa (consultar, por exemplo, os documentos EP 258068 e EP 305216), lipase de T. lanuginosus (consultar, por exemplo, os documentos WO 2014/059360 e WO2015/010009), lipase de Rhizomucor miehei (consultar, por exemplo, os documentos EP 238023), lipase de Candida, tal como lipase de C. antarctica (por exemplo, lipase A ou B de C. antarctica) (consultar, por exemplo, o documento EP 214761), lipases de Pseudomonas, tal como lipase de P. alcaligenes e P. pseudoalcaligenes (consultar, por exemplo, o documento EP 218272), lipase de P. cepacia (consultar, por exemplo, o documento EP 331376), lipase de P. stutzeri (consultar, por exemplo, o documento GB 1.372.034), lipase de P. fluorescens, lipase de Bacillus (por exemplo, lipase de B. subtilis (Dartois et al., Biochem. Biophys. Acta 1131:253 a 260 (1993)), lipase de B. stearothermophilus (consultar, por exemplo, o documento JP 64/744992) e lipase de B. pumilus (consultar, por exemplo, o documento WO 91/16422)). As lipases clonadas exemplificativas incluem, mas sem limitação, lipase de Penicillium camembertii (consultar, Yamaguchi et al., Gene 103:61-67 (1991)), lipase de Geotricum candidum (consultar, Schimada et al., J. Biochem., 106:383 a 388 (1989)) e várias lipases de Rhizopus, tal como lipase de R. delemar (consultar, Hass et al., Gene 109:117 a 113 (1991)), lipase de R. niveus (Kugimiya et al., Biosci. Biotech. Biochem. 56:716 a 719 (1992)) e lipase de R. oryzae. Outras enzimas lipolíticas, tais como cutinases, podem também encontrar uso em uma ou mais composições descritas no presente documento, incluindo, mas sem limitação, por exemplo, cutinase derivada de Pseudomonas mendocina (consultar o documento WO 88/09367) e/ou Fusarium solani pisi (consultar o documento WO90/09446). As lipases comerciais exemplificativas incluem, mas sem limitação, M1 LIPASE™, LUMA FAST™ e LIPOMAX™ (DuPont); LIPEX®, LIPOCLEAN®, LIPOLASE® e LIPOLASE® ULTRA (Novozymes); e LIPASE P™ (Amano Pharmaceutical Co. Ltd).
[00177] Em algumas modalidades, as composições de limpezadescritas no presente documento compreendem adicionalmente peroxidases em combinação com peróxido de hidrogênio ou uma fonte do mesmo (por exemplo, um percarbonato, perborato ou persulfato). Em algumas modalidades alternativas, oxidases são usadas em combinação com oxigênio. Ambos os tipos de enzimas são usados para "clareamento de solução" (isto é, para impedir a transferência de um corante têxtil de um tecido tingido para outro tecido quando os tecidos são lavados em conjunto em um líquido de lavagem), de preferência, em conjunto com um agente intensificador (consultar, por exemplo, os documentos WO94/12621 e WO95/01426). As peroxidases/oxidases adequadas incluem, mas sem limitação, aquelas de origem vegetal, bacteriana ou fúngica. Mutantes química ou geneticamente modificados são incluídos em algumas modalidades. Em algumas modalidades, as composições de limpeza da presente revelação compreendem adicionalmente de cerca de 0,00001% a cerca de 10%, cerca de 0,0001% a cerca de 10%, cerca de 0,001% a cerca de 5%, cerca de 0,001% a cerca de 2%, cerca de 0,005% a cerca de 0,5% de peroxidase e/ou oxidase em peso da composição.
[00178] Em algumas modalidades, as composições de limpezadescritas no presente documento compreendem adicionalmente enzimas adicionais, incluindo, mas sem limitação, peridrolases (consultar, por exemplo, o documento WO 05/056782). Algumas modalidades referem-se a misturas de uma ou mais dentre protease, amilase, lipase, mananase e/ou celulase mencionadas acima.
[00179] Algumas modalidades referem-se a composições de limpeza tais como, por exemplo, aquelas descritas no documento US 6.605.458. Em algumas modalidades, as composições de limpeza descritas no presente documento são composições de limpeza de tecido granulares compactas, embora em outras modalidades a composição seja uma composição de limpeza de tecido granular útil na lavagem de roupas de tecidos coloridos. Em modalidades adicionais, a composição é uma composição de limpeza de tecido granular que fornece maciez através da capacidade de lavagem, e, em modalidades adicionais, a composição é uma composição de limpeza de tecido de líquido para tarefas pesadas (HDL). Em outras modalidades, as composições de limpeza descritas no presente documento são composições de limpeza de tecido, tais como, por exemplo, aquelas descritas no documento US 6.610.642 e 6.376.450. Em uma modalidade alternativa, ascomposições de limpeza descritas no presente documento sãocomposições de limpeza de superfície dura adequadas. As composições de limpeza de superfície dura adequadas incluem, por exemplo, aquelas descritas nos documentos US 6.610.642; 6.376.450; e 6.376.450. Em ainda outras modalidades, as composições de limpeza descritas no presente documento são composições de lavagem de louças. Em algumas modalidades adicionais, as composições descritas no presente documento são composições de cuidados orais, tais como, por exemplo, aquelas descritas nos documentos US 6.376.450 e 6.605.458. As formulações e descrições dos compostos e materiais auxiliares de limpeza contidos nos documentos anteriormente mencionados US 6.376.450; 6.605.458; e 6.610.642 encontram uso com um polipeptídeo da presente invenção.
[00180] Em ainda outras modalidades, as composições de limpeza descritas no presente documento são composições amaciante de tecido, tais como, por exemplo, aquelas descritas nos documentos GB 400898, GB 514276, EP0011340, EP0026528, EP0242919,EP0299575, EP0313146 e US 5.019.292.
[00181] As composições de limpeza descritas no presente documento podem ser formuladas em qualquer forma adequada e preparadas por qualquer processo escolhido pelo formulador, os exemplos não limitantes das quais são descritos nos documentos US 5.879.584; 5.691.297; 5.574.005; 5.569.645; 5.565.422; 5.516.448;5.489.392; e 5.486.303. Quando uma composição de limpeza com pH baixo for desejada, o pH de tal composição é ajustado por meio da adição de um material como monoetanolamina ou um material ácido como HCl.
[00182] Em algumas modalidades, as composições de limpeza descritas no presente documento são fornecidas em forma de dose unitária, incluindo tabletes, cápsulas, sachês, bolsas, folhas e bolsa multicompatimentada. Em algumas modalidades, o formato de dose unitária é projetado para fornecer liberação controlada de ingredientes dentro de uma bolsa de múltiplos compartimentos (ou outro formato de dose unitária). Os formatos de liberação controlada e dose unitária adequados são conhecidos na técnica (consultar por exemplo, os documentos EP2100949, EP2100947, WO02/102955, WO04/111178, WO2013/165725 e US 4.765.916 e 4.972.017). Em algumas modalidades, a forma de dose unitária é fornecida por tabletes envolvidos com um filme solúvel em água ou bolsas solúveis em água.
[00183] Em algumas modalidades, as composições de limpeza descritas no presente documento compreendem adicionalmente pelo menos um agente quelante. Os agentes quelantes adequados podem incluir, mas sem limitação, agentes quelantes de cobre, ferro e/ou manganês e misturas dos mesmos. Nas modalidades em que pelo menos um agente quelante é usado, as composições de limpeza da presente revelação compreendem de cerca de 0,1% a cerca de 15% ou até mesmo de cerca de 3,0% a cerca de 10% de agente quelante em peso da composição de limpeza.
[00184] Em algumas outras modalidades, as composições de limpeza descritas no presente documento compreendem adicionalmente pelo menos um auxiliar de deposição. Os auxiliares de deposição adequados incluem, mas sem limitação, polietilenoglicol, polipropilenoglicol, policarboxilato, polímero de liberação de sujeira, tal como ácido politereftálico, argilas, tais como caulinita, montmorilonita, atapulgita, ilita, bentonita, haloisita e misturas dos mesmos.
[00185] Em algumas modalidades, as composições de limpeza descritas no presente documento compreendem adicionalmente pelo menos um agente antirredeposição. Em algumas modalidades, o agente antirredeposição é um tensoativo não iônico, tal como, por exemplo, descrito no documento EP2100949. Em algumas modalidades de lavagem de louças automática, tensoativos não iônicos são usados como modificadores de superfície, em particular para revestimento, para evitar formação de filme e manchamento e melhorar o brilho.
[00186] Em algumas modalidades, as composições de limpeza descritas no presente documento compreendem adicionalmente um ou mais agentes inibidores de transferência de corantes. Os agentes de inibição de transferência de corantes adequados incluem, mas sem limitação, polímeros de polivinilpirrolidona, polímeros de N-óxidos de poliamina, copolímeros de N-vinilpirrolidona e N-vinilimidazol, poliviniloxazolidonas e polivinilimidazóis ou suas misturas. Em algumas modalidades, as composições de limpeza descritas no presente documento compreendem de cerca de 0,0001% a cerca de 10%, de cerca de 0,01% a cerca de 5% ou até mesmo de cerca de 0,1% a cerca de 3% de agente inibidor de transferência de corantes em peso da composição de limpeza.
[00187] Em algumas modalidades, as composições de limpeza descritas no presente documento compreendem adicionalmente um ou mais silicatos. Em algumas tais modalidades, silicatos de sódio (por exemplo, dissilicato de sódio, metassilicato de sódio e filossilicato cristalino) encontram uso. Em algumas modalidades, as composições de limpeza descritas no presente documento compreendem de cerca de 1% a cerca de 20% ou de cerca de 5% a cerca de 15% de silicato em peso da composição.
[00188] Em ainda outras modalidades, as composições de limpeza descritas no presente documento compreendem adicionalmente um ou mais dispersantes. Os materiais orgânicos solúveis em água incluem, mas sem limitação, os ácido homo ou copoliméricos ou seus sais, em que o ácido policarboxílico compreende pelo menos dois radicais carboxila separados entre si por não mais que dois átomos de carbono.
[00189] Em algumas modalidades adicionais, as enzimas usadas nas composições de limpeza são estabilizadas por qualquer técnica adequada. Em algumas modalidades, as enzimas empregadas no presente documento são estabilizadas pela presença de fontes solúveis em água de íons de cálcio e/ou de magnésio nas composições finalizadas. Em algumas modalidades, os estabilizantes de enzima incluem oligossacarídeos, polissacarídeos e sais de metais divalentes inorgânicos, incluindo metais alcalino-terrosos, tais como sais de cálcio. Contempla-se que várias técnicas para estabilização de enzimas encontrarão uso na presente revelação. Por exemplo, em algumas modalidades, as enzimas empregadas no presente documento são estabilizadas pela presença de fontes solúveis em água de íons de zinco (II), cálcio (II) e/ou magnésio (II) nas composições acabadas, bem como outros íons de metal (por exemplo, bário (II), escândio (II), ferro (II), manganês (II), alumínio (III), estanho (II), cobalto (II), cobre (II), níquel (II) e oxovanádio (IV)). Cloretos e sulfatos também encontram uso em algumas modalidades. Os exemplos de oligossacarídeos e polissacarídeos adequados (por exemplo, dextrinas) são conhecidos na técnica (consultar, por exemplo, o documento WO07/145964). Em algumas modalidades, inibidores de protease reversíveis, tais como compostos contendo boro (por exemplo, borato, ácido 4-formil fenil borônico) e/ou um aldeído tripeptídeo encontram uso para melhorar adicionalmente a estabilidade.
[00190] Em algumas modalidades, as composições de limpeza descritas no presente documento compreendem adicionalmente um ou mais alvejantes, ativadores de alvejante e/ou catalisadores de alvejante. Em algumas modalidades, as composições de limpeza descritas no presente documento compreendem composto (ou compostos) de branqueamento inorgânico e/ou orgânico. Os alvejantes inorgânicos podem incluir, mas sem limitação, sais de peridrato (por exemplo, sais de perborato, percarbonato, perfosfato, persulfato e persilicato). Em algumas modalidades, os sais de peridrato inorgânicos são sais de metal alcalino. Em algumas modalidades, os sais de peridrato inorgânicos estão incluídos como o sólido de cristalino, sem proteção adicional, embora em algumas outras modalidades, o sal seja revestido. Os sais adequados incluem, por exemplo, aqueles descritos no documento EP2100949. Os ativadores de alvejante são, tipicamente, precursores de perácido orgânico que intensificam a ação de branqueamento no curso da limpeza em temperaturas de 60°C e abaixo. Os ativadores de alvejante adequados para uso no presente documento incluem compostos que, sob condições de peridrólise, geram ácidos peroxicaboxílicos alifáticos que têm, de preferência, de cerca de 1 a cerca de 10 átomos de carbono, em particular de cerca de 2 a cerca de 4 átomos de carbono e/ou ácido perbenzoico opcionalmente substituído. Os ativadores de alvejante adequados incluem, por exemplo, aqueles descritos no documento EP2100949. Os catalisadores de alvejante incluem tipicamente, por exemplo, triazaciclononano de manganês e complexos relacionados e complexos de cobalto, cobre, manganês e ferro, assim como aqueles descritos nos documentos US 4.246.612; 5.227.084; 4.810.410; e WO99/06521 e EP2100949.
[00191] Em algumas modalidades, as composições de limpeza descritas no presente documento compreendem adicionalmente um ou mais complexos de metais catalíticos. Em algumas modalidades, um catalisador alvejante contendo metal encontra uso. Em outras modalidades, o catalisador de alvejante de metal compreende um sistema catalisador que compreende um cátion de metal de transição de atividade catalítica de alvejante definida (por exemplo, cátions de cobre, ferro, titânio, rutênio, tungstênio, molibdênio ou manganês), um cátion de metal auxiliar que tem pouca a nenhuma atividade catalítica de alvejante (por exemplo, cátions de zinco ou alumínio) e um sequestrante que tem constantes de estabilidade definidas para os cátions de metais auxiliares e catalíticos, particularmente, ácido etilenodiaminatetra-acético, etilenodiaminetetra (ácidometilenofosfônico) e sais solúveis em água dos mesmos são usados (consultar, por exemplo, o documento US 4.430.243). Em algumas modalidades, as composições de limpeza descritas no presente documento são catalisadas por meio de um composto de manganês. Tais compostos e níveis de uso são bem conhecidos na técnica (consultar, por exemplo, o documento US 5.576.282). Em modalidades adicionais, os catalisadores de alvejante à base de cobalto encontram uso nas composições de limpeza descritas no presente documento. Vários catalisadores de alvejante à base de cobalto são conhecidos na técnica (consultar, por exemplo, os documentos US 5.597.936 e 5.595.967) e são prontamente preparados por procedimentos conhecidos.
[00192] Em algumas modalidades adicionais, as composições de limpeza descritas no presente documento compreendem adicionalmente um complexo de metais de transição de um aglutinante macropolicíclico rígido (MRL). Como uma matéria prática, e não a título de referência, em algumas modalidades, as composições e processos de limpeza fornecidos no presente documento são ajustados para fornecer na ordem de pelo menos uma parte por cem milhões das espécies de MRL ativas no meio de lavagem aquoso e, em outras modalidades, fornecem de cerca de 0,005 ppm a cerca de 25 ppm, de cerca de 0,05 ppm a cerca de 10 ppm ou de cerca de 0,1 ppm a cerca de 5 ppm do MRL no líquido de lavagem.
[00193] Em algumas modalidades, os metais de transição no presente catalisador de alvejante à base de metal de transição incluem, mas sem limitação, manganês, ferro e cromo. Em outras modalidades, MRLs incluem, mas sem limitação, aglutinantes ultrarrígidos especiais que têm ponte cruzada (por exemplo, 5,12-dietil-1,5,8,12-tetra- azabiciclo[6.6.2] hexadecano). Os MRLs de metal de transição adequados são prontamente preparados por procedimentos conhecidos (consultar, por exemplo, o documento WO 2000/32601 e US 6.225.464).
[00194] Em algumas modalidades, as composições de limpeza descritas no presente documento compreendem adicionalmente um agente de tratamento de metais. Os agentes de tratamento de metal são usados para impedir e/ou reduzir deslustre, corrosão e/ou oxidação de metais, incluindo alumínio, aço inoxidável e metais não ferrosos (por exemplo, prata e cobre). Os agentes de tratamento de metal incluem aqueles descritos nos documentos EP2100949, WO94/26860 eWO94/26859). Em algumas modalidades, o agente de tratamento de metal é um sal de zinco. Em algumas modalidades adicionais, as composições de limpeza descritas no presente documento compreendem de cerca de 0,1% a cerca de 5% em peso de um ou mais agente de tratamento de metal.
[00195] As composições de limpeza descritas no presente documento podem ser usadas para limpar uma superfície, louça ou tecido. Tipicamente, pelo menos uma porção da superfície, louça ou tecido é colocada em contato com pelo menos uma (i) variante, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento ou (ii) pelo menos uma composição de limpeza descrita no presente documento, e, então, a superfície, louça ou tecido é opcionalmente lavada e/ou enxaguado. Para os propósitos da presente revelação, "lavagem" inclui, mas sem limitação, esfregamento e agitação mecânica. Em algumas modalidades, as composições de limpeza são tipicamente empregadas a concentrações de cerca de 500 ppm a cerca de 15.000 ppm na solução. Quando o solvente de lavagem é água, a temperatura da água está tipicamente na faixa de cerca de 5°C a cerca de 90°C e, quando o tecido é envolvido, a razão entre água e massa de tecido é tipicamente de cerca de 1:1 a cerca de 30:1.
[00196] Algumas modalidades referem-se a um método para limpar que compreende colocar em contato uma quantidade eficaz de (i) uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento ou (ii) uma composição de limpeza descrita no presente documento com um item ou superfície que compreende um sujeira ou mancha que compreende manano para hidrolisar o manano contido na sujeira ou mancha.
[00197] Em algumas modalidades, uma ou mais variantes de mananase ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo das mesmas descrito no presente documento é usado para impedir, reduzir e/ou remover um biofilme em um ou mais itens selecionados dentre um produto têxtil ou tecido.
[00198] Uma ou mais variantes de mananase ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo das mesmas descrito no presente documento hidrolisa cadeias de polissacarídeo contendo unidades de manose, incluindo, porém sem limitação, mananos, galactomananos e glucomananos, tornando tais polipeptídeos particularmente úteis para realizar reações de hidrólise de manano envolvendo substratos de polissacarídeo contendo ligações 1,4-β-D-manosidicas. Em termos gerais, uma molécula doadora é incubada na presença de uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento sob condições adequadas para realizar uma reação de hidrólise de manano, seguida, opcionalmente, pelo isolamento de um produto da reação. Alternativamente, no contexto de um gênero alimentício, o produto pode se tornar um componente do gênero alimentício sem isolamento. Em determinadas modalidades, a molécula doadora é uma cadeia de polissacarídeo que compreende unidades de manose, incluindo, mas sem limitação, mananos, glucomananos, galactomananos e galactoglucomananos.
[00199] Em uma modalidade, uma ou mais variantes de mananase ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo das mesmas descrito no presente documento é usado em um processo para extrair óleo de caroço de palma. Outra modalidade refere-se a um processo para extrair óleo de caroço de palma de caroços de palma ou uma farinha de caroço de palma que compreende fornecer caroços de palma e/ou farinha de caroço de palma e tratar as ditas sementes ou torta com uma ou mais variantes de mananase ou polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo das mesmas descrito no presente documento.
[00200] Em uma modalidade, uma composição que compreende uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento é usada para processar e/ou fabricar ração para animais ou alimento para seres humanos. Em ainda outra modalidade, uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento pode ser um aditivo para ração para animais não humanos. Em outra modalidade, uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento pode ser útil para alimento para seres humanos, tal como, por exemplo, um aditivo para alimento para seres humanos.
[00201] Diversos fatores nutricionais podem limitar a quantidade de material vegetal não custoso que pode ser usado para preparar ração para animais e alimento para seres humanos. Por exemplo, o material vegetal contendo oligomananos tais como manano, galactomanano, glucomanano e galactoglucomanano pode reduzir a capacidade do animal de digerir e absorver compostos nutricionais tais como minerais, vitaminas, açúcares e gorduras. Esses efeitos negativos são, em particular, devido à alta viscosidade dos polímeros contendo manano e à capacidade de os polímeros contendo manano absorverem compostos nutricionais. Esses efeitos podem ser reduzidos incluindo-se uma enzima na ração que degrada os polímeros contendo manano, tal como uma enzima endo-β-mananase descrita no presente documento, permitindo, assim, uma proporção mais alta de polímeros contendo manano tipicamente encontrados em material vegetal não custoso a ser incluído na ração, o que reduz finalmente o custo da razão. Adicionalmente, uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento pode quebrar os polímeros contendo manano em açúcares mais simples que podem ser mais prontamente assimilados para fornecer energia adicional.
[00202] Em uma modalidade adicional, a ração para animais contendo material vegetal é incubada na presença de uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento sob condições adequadas para quebrar polímeros contendo manano.
[00203] Em outra modalidade, uma composição melhoradora de pão compreende uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento, opcionalmente em combinação com uma foto de manano ou glucomanano ou galactomanano e adicional e opcionalmente em combinação com uma ou mais outras enzimas.
[00204] O termo "animal não humano" inclui todos os animais não ruminantes e ruminantes. Em uma modalidade particular, o animal não ruminante é selecionado a partir do grupo que consiste em, mas sem limitação, cavalos animais monogástricos, tais como, mas sem limitação, porcos, aves, suínos e peixes. Em modalidades adicionais, o porco pode ser, mas sem limitação, um leitão, um porco em crescimento e uma porca; as aves podem ser, mas sem limitação, um peru, um pato e uma galinha incluindo, mas sem limitação, um frango de corte e uma poedeira; e o peixe pode ser, mas sem limitação, salmão, truta, tilápia bagre e carpas; e crustáceos incluindo, mas sem limitação, camarões e pitus. Em uma modalidade adicional, o animal ruminante é selecionado a partir do grupo que consiste em, mas sem limitação, gado, bezerros jovens, cabras, ovelhas, girafas, bisão, alce, renas, iaques, búfalo- d'água, veado, camelos, alpacas, lhamas, antílope, antilocapra e nilgó.
[00205] Em algumas modalidades, uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento é usado para pré-tratar a ração em vez de como um aditivo de ração. Em algumas modalidades, uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento é adicionado ou usado para pré-tratar a ração para porcos desmamados, porcos de viveiro, leitões, porcos de engorda, porcos em crescimento, porcos em terminação, galinhas poedeiras, frangos de corte e perus.
[00206] Em outra modalidade, uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento é adicionado ou usado para pré-tratar a ração de material vegetal tal como caroço de palma, coco, coniaco, goma de alfarrobeira, goma guar, soja, cevada, aveia, linho, trigo, milho, linhaça, polpa cítrica, semente de algodão, amendoim, colza, girassol, ervilhas e lupinos.
[00207] Uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento é termoestável, e, como um resultado, uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento pode ser usado nos processos de produzir ração peletizada em que calor é aplicado à mistura de ração antes da etapa de peletização. Em outra modalidade, uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento é adicionado aos outros ingredientes de ração ou antes da etapa de peletização ou após a etapa de peletização (isto é, aos péletes de ração já formados).
[00208] Em ainda outra modalidade, as composições de suplemento de ração ou processamento de alimento que contêm uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento podem conter opcional e adicionalmente outros substituintes selecionados dentre agentes corantes, compostos de aroma, estabilizantes, vitaminas, minerais e outras enzimas de melhoramento de ração ou alimento. Isso se aplica, em particular, às assim chamadas pré-misturas.
[00209] Em ainda outra modalidade, um aditivo alimentício de acordo com a presente invenção pode ser combinado em uma quantidade apropriada com outros componentes alimentícios, tal como, por exemplo, uma proteína de cereal ou planta para formar um produto alimentício processo.
[00210] Em uma modalidade, uma composição de ração paraanimais e/ou composição de aditivo de ração para animais e/ou alimento para animais de estimação compreende um polipeptídeo descrito no presente documento.
[00211] Outra modalidade refere-se a um método para preparar uma composição de ração para animais e/ou composição de aditivo de ração para animais e/ou alimento para animais de estimação que compreende misturar uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento com um ou mais ingredientes de ração para animais e/ou ingredientes de aditivo de ração para animais e/ou ingredientes de alimento para animais de estimação.
[00212] Uma modalidade adicional refere-se ao uso de uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento para preparar uma composição de ração para animais e/ou composição de aditivo de ração para animais e/ou alimento para animais de estimação. O sintagma "alimento para animais de estimação" significa alimento para um animal doméstico, tais como, mas sem limitação, cães; gatos; gerbos; hamsters; chinchilas; ratos mercol; porquinhos-da-índia; aves de estimação, tais como canários, periquitos e papagaios; répteis de estimação, tais como tartaruga, lagartos e cobras; e animais de estimação aquáticos, tais como peixes tropicais e rãs.
[00213] Os termos ração para animais, "gênero alimentício" e "forragem" são usados intercambiavelmente e podem compreender um ou mais materiais alimentícios selecionados dentre o grupo que compreende a) cereais, como pequenos grãos (por exemplo, trigo, cevada, centeio, aveias e combinações dos mesmos) e/ou grãos grandes como maís ou sorgo; b) subprodutos de cereais, como farinha de milho com glúten, Grãos Secos de Destilaria com Solúveis (DDGS) (particularmente Grãos Secos de Destilaria com Solúveis à base de milho (cDDGS), farelo de trigo, sêmea de trigo, farelo fino de trigo, farelo de arroz, cascas de arroz, cascas de aveia, semente de palma e polpa de cítricos; c) proteína obtida a partir de fontes como soja, girassol, amendoim, tremoço, ervilhas, fava, algodão, canola, farinha de peixe, proteína de plasma seca, farinha de carne e ossos, proteína da batata, soro, copra e gergelim; d) óleos e gorduras obtidos a partir de fontes vegetais e animais; e e) minerais e vitaminas.
[00214] Em um aspecto, a composição ou aditivo alimentício pode ser líquido ou sólido.
[00215] Em um aspecto da invenção, a composição alimentícia é uma bebida, incluindo, mas sem limitação, uma bebida fermentada, tal como cerveja e vinho.
[00216] No contexto da presente invenção, o termo "bebida fermentada" significa compreender qualquer bebida produzida por um método que compreende um processo de fermentação, tal como uma fermentação microbiana, tal como uma fermentação bacteriana e/ou de levedura.
[00217] Em um aspecto da invenção, a bebida fermentada é cerveja. O termo "cerveja" significa compreender mosto fermentado produzido por fermentação/infusão de um material vegetal contendo amido. Muitas vezes, a cerveja é produzida a partir de malte ou adjunto, ou qualquer combinação de malte e adjunto como material vegetal contendo amido. Como usado aqui, é entendido que o termo "malte" significa qualquer grão de cereal maltado, como cevada ou trigo maltado.
[00218] Conforme usado no presente documento, o termo "adjunto" refere-se a qualquer material vegetal contendo amido e/ou açúcar que não seja malte, tal como malte de trigo ou cevada. Os exemplos de adjuntos incluem, por exemplo, grits de milho comuns, grits de milho refinados, levedura moída de cerveja, arroz, sorgo, amido de milho refinado, cevada, amido de cevada, cevada descascada, trigo, amido de trigo, cereal torrificado, flocos de cereal, centeio, aveia, batata, tapioca, mandioca e xaropes, tal como xarope de milho, xarope de cana- de-açúcar, xarope de açúcar invertido, xaropes de cevada e/ou trigo e similares podem ser usados como uma fonte de amido.
[00219] Conforme usado no presente documento, o termo "farelada" refere-se a uma pasta fluida aquosa de qualquer material vegetal contendo amido e/ou açúcar tal como grão pronto para moagem, por exemplo, compreendendo malte de cevada esmagada, cevada esmagada e/ou outro adjunto ou uma combinação dos mesmos, misturados com água para serem posteriormente separados em mosto e grãos gastos.
[00220] Como usado aqui, o termo "mosto" se relaciona com o escoamento líquido não fermentado após a extração do malte moído durante a brassagem.
[00221] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método para preparar uma bebida fermentada, tal como cerveja, que compreende misturar uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento com um malte e/ou adjunto.
[00222] Os exemplos de cerveja compreendem: cerveja puro malte, cerveja fermentada sob a "Reinheitsgebot", ale, IPA, lager, amarga, Happoshu (segunda cerveja), terceira cerveja, cerveja seca, cerveja sem álcool, cerveja suave, cerveja com baixo teor de álcool, cerveja de baixa caloria, porter, cerveja do tipo bock, stout, licor de malte, cerveja não alcoólica, licor de malte não alcoólico e similares, assim como bebidas de malte e cereal alternativas, tais como bebidas de malte com sabor de fruta, por exemplo, bebidas de malte com sabor cítrico, tal como com sabor de limão, laranja, lima ou bagas; bebidas de malte com sabor de licor, por exemplo, bebidas de malte com sabor de vodca, rum ou tequila; ou bebidas de malte com sabor de café, tal como licor de malte com sabor de cafeína; e similares.
[00223] Um aspecto da invenção refere-se ao uso de uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento na produção de uma bebida fermentada, tal como uma cerveja.
[00224] Outro aspecto refere-se a um método para fornecer uma bebida fermentada que compreende a etapa de colocar uma farelada e/ou mosto em contato com uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento.
[00225] Um aspecto adicional se relaciona com um método de provisão de uma bebida fermentada compreendendo os passos seguintes: (a) preparar uma farelada, (b) filtrar a farelada para obter um mosto e (c) fermentar o mosto para obter uma bebida fermentada, tal como uma cerveja, em que uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento é adicionado: (i) à farelada do etapa (a) e/ou (ii) ao mosto da etapa (b) e/ou (iii) ao mosto da etapa (c).
[00226] De acordo com ainda outro aspecto, uma bebida fermentada, tal como uma cerveja, é produzida ou fornecida por um método que compreende a etapa (ou etapas) de (1) colocar uma farelada e/ou um mosto em contato com uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento; e/ou (2) (a) preparar uma farelada, (b) filtrar a farelada para obter um mosto e (c) fermentar o mosto para obter uma bebida fermentada, tal como uma cerveja, em que uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento é adicionado: (i) à farelada da etapa (a) e/ou (ii) ao mosto da etapa (b) e/ou (iii) ao mosto da etapa (c).
[00227] Em termos gerais, o extrato de café é incubado na presença de uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento sob condições adequadas para hidrolisar galactomananos presentes no extrato de café líquido.
[00228] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método para preparar produtos assados que compreende a adição de uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento à massa, seguida pelo assamento da massa. Os exemplos de produtos assados são bem conhecidos por aqueles versados na técnica e incluem, pães, rocamboles, massas folhadas, massas fermentadas doces, pãezinhos, bolos, bolachas, cookies, biscoitos, waffles, wafers, tortilhas, cereais matinais, produtos extrudidos e similares.
[00229] Uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento pode ser adicionado à massa como parte de uma composição melhoradora de pão. Os melhoradores de pão são composições que contêm uma variedade de ingredientes que melhoram as propriedades da massa e a qualidade dos produtos de panificação, por exemplo, pães e bolo. Os melhoradores de pão são frequentemente adicionados em processos de panificação industriais devido ao fato de que seus efeitos benéficos, por exemplo, a estabilidade de massa e a textura e volume de pão. Os melhoradores de pão usualmente contêm gorduras e óleos assim como aditivos como emulsificantes, enzimas, antioxidantes, oxidantes, estabilizantes e agentes redutores. Adicionalmente a qualquer um dos polipeptídeos da presente invenção, outras enzimas que podem também estar presentes no melhorador de pão ou que podem ser usados de outro modo em conjunto com qualquer um dos polipeptídeos da presente invenção incluem amilases, hemicelulases, complexos amilolíticos, lipases, proteases, xilanases, pectinases, pululanases, enzimas de degradação de polissacarídeo de não amido e enzimas de oxirredução como glicose oxidase, lipoxigenase ou ácido ascórbico oxidase.
[00230] Em uma modalidade, uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento pode ser adicionado à massa como parte de uma composição melhoradora de pão que também compreende uma fonte de glucomanano e/ou galactomanano, tal como goma de coniaco, goma guar, goma de alfarrobeira (Ceratonia siliqua), farinha de copra, manano de marfim vegetal (Phytelephas macrocarpa), extrato de manano de algas marinhas, farinha de coco e a parede celular da levedura de cerveja (pode ser seca ou usada na forma de extrato de levedura de cerveja). Outros derivados de manano aceitáveis para uso na presente invenção incluem homopolímero de manano β-1,4-ligado não ramificado e mano-oligossacarídeos (manobiose, manotriose, manotetraose e manopentoase). Uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento pode ser adicionalmente usado ou sozinho ou em combinação com um glucomanano e/ou galactomanano e/ou galactoglucomanano para melhorar a tolerância de massa; flexibilidade de massa e/ou pegajosidade de massa; e/ou estrutura de migalhas de pão, assim como retardar o endurecimento do pão. Em outro aspecto, os hidrolisados de mananase atuam como prebióticos solúveis tais como mano-oligossacarídeos (MOS) que promovem a proliferação de bactérias de ácido láctico comumente associadas à boa saúde quando encontradas em densidades de população favoráveis no cólon.
[00231] Em um aspecto, a massa à qual qualquer polipeptídeo da invenção é adicionado compreende farelo ou aveia, arroz, painço, maís ou farinha de legume adicionalmente ou em vez de farinha de trigo pura (isto é, não é uma massa de farinha branca pura).
[00232] Em outra modalidade, uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento pode ser adicionado a leite ou qualquer outro produto lácteo ao qual foi adicionado um glucomanano e/ou galactomanano. As fontes típicas de glucomanano e/ou galactomanano são listadas acima nos aspectos de panificação e incluem goma guar ou de coniaco. A combinação de uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento com um glucomanano e/ou galactomanano libera hidrolisados de mananase (mano-oligossacarídeos) que atuam como prebióticos solúveis promovendo-se o crescimento e proliferação seletivos de bactérias probióticas (especialmente bactérias de ácido lático de Bifidobacteria e Lactobacillus) comumente associadas à boa saúde quando encontradas em densidades de população favoráveis no intestino grosso ou cólon.
[00233] Outro aspecto refere-se a um método para preparar leite ouprodutos lácteos que compreende a adição de uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento e qualquer glucomanano ou galactomanano ou galactoglucomanano.
[00234] Em outro aspecto, uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento é usado em combinação com qualquer glucomanano ou galactomanano antes ou após a adição a um gênero alimentício à base de laticínios para produzir um gênero alimentício à base de laticínios que compreende hidrolisados de manano prebióticos. Em um aspecto adicional, o produto lácteo contendo mano-oligossacarídeo assim produzido tem a capacidade de aumentar a população da microflora intestinal humana benéfica, e, em ainda outro aspecto, o gênero alimentício à base de laticínios pode compreender uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento juntamente com qualquer fonte de glucomanano e/ou galactomanano e/ou galactoglucomanano e uma dose suficiente para a inoculação de pelo menos uma cepa de bactéria (tal como Bifidobacteria ou Lactobacillus) conhecida por ser benéfica ao intestino grosso humano. Em um aspecto, o gênero alimentício à base de laticínios é um iogurte ou bebida de leite.
[00235] A variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento encontra uso adicional no branqueamento auxiliado por enzima de polpas de papel, tais como polpas químicas, polpas semiquímicas, polpas kraft, polpas mecânicas e polpas preparadas pelo método de sulfito. Em termos gerais, as polpas de papel são incubadas com uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento sob condições adequadas para o branqueamento da polpa de papel.
[00236] Em algumas modalidades, as polpas são polpas livres de cloro com oxigênio, ozônio, peróxido ou peroxiácidos. Em algumas modalidades, uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento é usado no branqueamento auxiliado por enzima de polpas produzidas por métodos de polpação modificados ou contínuos que exibem baixos teores de lignina. Em algumas outras modalidades, uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento é aplicado sozinho ou, de preferência, em combinação com as enzimas xilanase e/ou endoglucanase e/ou alfa- galactosidase e/ou celobio-hidrolase.
[00237] Galactomananos, tais como goma guar e goma de alfarrobeira, são amplamente usados como agentes espessantes, por exemplo, em alimentos (por exemplo, sorvete) e pasta de impressão para impressão têxtil, tais como impressões em camisas. Assim, uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento também encontra uso na redução da espessura ou viscosidade de substratos contendo manano. Em algumas modalidades, uma ou mais variantes de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo das mesmas descrito no presente documento é usado para hidrolisar galactomananos em um alimento (por exemplo, sorvete) fabricando corrente de refugo. Em determinadas modalidades, uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento é usada para reduzir a viscosidade de alimento residual no equipamento de processamento facilitando, assim, a limpeza após o processamento. Em determinadas outras modalidades, uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento é usado para reduzir a viscosidade da pasta de impressão, facilitando, assim, a remoção por lavagem da pasta de impressão excedente após as impressões têxteis. Em termos gerais, um substrato contendo manano é incubado com uma variante de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo da mesma descrito no presente documento sob condições adequadas para reduzir a viscosidade do substrato contendo manano.
[00238] Em ainda outra modalidade, uma ou mais variantes de mananase, polipeptídeo recombinante ou fragmento ativo das mesmas descrito no presente documento pode ser usado na indústria de óleo e gás para, por exemplo, controlar a viscosidade de fluidos de perfuração; aumentar a taxa na qual os fluidos usados no fraturamento hidráulico criam fraturas subterrâneas que se estendem o poço para a rocha; limpar a torta de filtro de poço; e combinações dos mesmos.
[00239] Outros aspectos e modalidades das presentes composições e métodos serão evidentes a partir da descrição anterior e dos exemplos a seguir. Várias modalidades alternativas além daquelas descritas no presente documento podem ser empregadas na prática da invenção sem se afastar do espírito e escopo da invenção. Consequentemente, as reivindicações, e não as modalidades específicas descritas no presente documento, definem o escopo da invenção, e, como tais, os métodos e as estruturas dentro do escopo nas reivindicações e seus equivalentes são assim cobertos.
[00240] Manipulações de DNA para gerar a variante de PspMan4 mananase de Paenibacillus sp. PspMan138 foram executadas com o uso de técnicas de biologia molecular convencionais (consultar, por exemplo, Sambrook et al, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press). Uma sequência de DNA artificial foi gerada que introduziu múltiplas modificações de aminoácido na sequência de PspMan4 mananase de Paenibacillus sp. do tipo selvagem, tal mananase do tipo selvagem é mais completamente descrita no documento PCT/US15/40057 depositado em 10 de julho de 2015, que foi subsequentemente publicado como o documento WO2016/007929.
[00241] A sequência de nucleotídeos do gene PspMan138 é apresentada como SEQ ID NO:1 (incluindo a sequência que codifica o peptídeo de sinalização nativo previsto).
[00242] Os cassetes de DNA que compreendem promotor de B. subtilis aprE (SEQ ID NO:2) e o peptídeo de sinalização de B. subtilis aprE (SEQ ID NO:3) foram sintetizados. Com o uso das técnicas conhecidas na arte, fragmentos de PCR foram montados com o uso da Montagem Gibson para produzir os cassetes de expressão finais. A sequência de aminoácidos do peptídeo de sinalização aprE de B. subtilis codificado por SEQ ID NO:3 é apresentada como SEQ ID NO:4.
[00243] O cassete de expressão que incorpora o gene PspMan138 e outros elementos descritos acima foi clonado no vetor bifuncional (shuttle) de replicação pHYT e transformado em uma cepa adequada de B. subtilis. O vetor pHYT foi derivado de pHY300PLK (Takara) adicionando-se um terminador após o gene de resistência à tetraciclina com o uso dos sítios BstEII e EcoRI (SEQ ID NO:5). O sítio HindIII em pHY300PLK foi também removido com o uso de um ligante clonado nos sítios BamHI e HindIII (SEQ ID NO:6).
[00244] Os fragmentos de DNA que compreendem o cassete de expressão de B. subtilis (SEQ ID NO:7) e o gene PspMan138 (SEQ ID NO:1) foram amplificados por PCR com o uso dos iniciadores listadas na Tabela 1 (SEQ ID NOs:8 a 11).
[00245] A sequência de ácidos nucleicos para o cassete de expressão de B. subtilis é apresentada como SEQ ID NO:7:
[00246] Com o uso das técnicas conhecidas na arte, fragmentos de PCR foram montados com o uso da Montagem Gibson (SGI DNA n° de catálogo GA1100-10) para produzir os cassetes de expressão finais. As células de B. subtilis foram transformadas e cultivadas em LB solidificado por ágar suplementado com 5 μg/ml de cloranfenicol.
[00247] A sequência de aminoácidos da proteína precursora de PspMan138 codificada pelo gene PspMan138 é apresentada como SEQ ID NO:12. A sequência de aminoácidos da enzima madura, PspMan138 (298 aminoácidos), é apresentada como SEQ ID NO:13.
[00248] Para gerar as amostras de enzima de variante PspMan4 (a sequência de aminoácidos da proteína madura é apresentada como SEQ ID NO:14) e PspMan138 (SEQ ID NO:13) para caracterização bioquímica, o crescimento seletivo das células de B. subtilis transformadas foi realizado em placas de microtitulação de 96 cavidades (MTPs) a 37°C por 68 horas em meio de cultivo (meios semidefinidos enriquecidos à base de tampão MOPS, com ureia como a principal fonte de nitrogênio, glicose como a principal fonte de carbono e suplementado com 1% de soytone para crescimento celular robusto) em cada cavidade. As culturas foram coletadas por centrifugação a 3.600 rpm por 45 min e filtradas através de placas de filtro Multiscreen® (EMD Millipore, Billerica, MA, EUA) com o uso de um sistema de vácuo Millipore. Os sobrenadantes de cultura filtrados foram usados para os ensaios descritos abaixo.
[00249] A atividade de mananase das variantes PspMan4 e PspMan138 da mesma foi testada medindo-se a hidrólise do galactomanano de goma de alfarrobeira (LBG) em solução. O substrato usado foi solução de LBG 0,28% (em p/v) em tampão de Tris-HCl a 50 mM, pH 7,5 (tampão de diluição de substrato). Para preparar uma solução de substrato de trabalho, LBG em pó (Produto n° G0753, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) foi dissolvido em uma solução aquecida de tampão de Tris-HCl a 50 mM, pH 7,5, sob agitação. Mediante o resfriamento até a temperatura ambiente, a solução foi centrifugada, e o sobrenadante transparente foi usado como a solução de substrato. As amostras de enzima foram diluídas em tampão de diluição de enzima (tampão MOPS a 50 mM, pH 7,2, contendo 0,005% de TWEEN®-80), e as alíquotas das soluções enzimáticas diluídas foram adicionadas a um MTP de poliestireno transparente de fundo plano contendo a solução de substrato de LBG. A placa foi vedada e incubada a 40 °C com agitação a 900 rpm por 10 min (por exemplo, em um incubador/agitador iEMS, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Após a incubação, os açúcares redutores liberados foram quantificados com o uso do ensaio de reagente BCA (n° de catálogo 23225, Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL). Especificamente, alíquotas de cada cavidade da placa de ensaio LBG foram adicionadas a uma placa de PCR contendo solução de reagente de trabalho BCA (preparada de acordo com as instruções do fabricante); a razão entre amostra e reagente de trabalho foi 1:9 (em v/v). As placas foram vedadas e incubadas em um termociclo (por exemplo, Tetrad2 Peltier Thermal Cycler, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) a 95 °C por 2 a 3 min. Após a placa ter resfriado até 30 °C, a solução de reação foi transferida para um MTP de poliestireno transparente de fundo plano fresco (por exemplo, Costar 9017), e a absorbância foi medida a 562 nm em um espectrofotômetro leitor de placas (por exemplo, SpectraMax Plus 384, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). O valor de absorbância de uma amostra que não contém mananase (branco) foi subtraído dos valores de absorbância das amostras contendo mananase. A absorbância resultante foi tomada como uma medição da atividade de mananase.
[00250] A estabilidade das variantes PspMan4 e PspMan138 da mesma foi testada sob a condição de estresse em uma solução aquosa 10% (em v/v) do detergente líquido para lavagem de roupas TIDE® comercialmente disponível (Original scent, Procter and Gamble, adquirido em supermercados locais em 2014 e inativado por calor com o uso do protocolo descrito no Exemplo 4 abaixo) medindo-se a atividade residual das amostras após a incubação a uma temperatura elevada (56°C) por 5 min.
[00251] Uma solução aquosa 12,5% (em v/v) do detergente inativado por calor foi preparada, e amostras de enzima dos sobrenadantes de cultura filtrados foram misturadas com o volume apropriado dessa solução detergente para alcançar uma concentração de detergente final de 10% (em v/v). Para medir a atividade inicial (sem estresse), alíquotas dessa mistura foram imediatamente diluídas em tampão MOPS a 50 mM, pH 7,2, TWEEN®-80 0,005% e avaliadas quanto à atividade em LBG com o uso do "Ensaio de Atividade de Mananase" anteriormente descrito neste documento. Para medir a atividade com estresse, as amostras de enzima que foram misturadas com a solução detergente foram incubadas em uma placa de PCR vedada a 56 °C por 5 min em um termociclo (Tetrad2 Peltier Thermal Cycler, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), então, diluídas em tampão MOPS a 50 mM, pH 7,2, TWEEN®-80 0,005% e avaliadas quanto à atividade conforme descrito no "Ensaio de Atividade de Mananase" acima.
[00252] Uma vez que os valores de atividade com estresse e sem estresse foram medidos por hidrólise do substrato de LBG conforme descrito acima, a % de atividades residuais foi calculada tomando-se uma razão entre a atividade com estresse e sem estresse e multiplicando por 100. Os resultados são resumidos na Tabela 2, mostrando que PspMan138 reteve atividade enzimática após esse teste de estresse de temperatura no detergente líquido para lavagem de roupas TIDE®.
[00253] As enzimas mananase foram isoladas de sobrenadantes de cultura de Bacillus clarificados por precipitação de sulfato de amônio em tampão MES pH 5,3. A purificação foi alcançada por cromatografia de troca hidrofóbica, seguida por diálise em tampão MES a 50 mM, pH 6,0. Propilenoglicol foi, então, adicionado a uma concentração final de 40%, e as amostras armazenadas refrigeradas até caracterização adicional.
[00254] O desempenho de lavagem de PspMan138 e uma mananase comercial (MANNAWAY® 4 l, Novozymes AS, Dinamarca) foi testado em uma aplicação de detergente para lavagem de roupas o uso de um Tergômetro. A avaliação do desempenho foi conduzida a 16°C. A carga de sujeira consistia em duas amostras de goma de alfarrobeira CFT C-S-73 (LBG) (Center for Testmaterials BV, Vlaardingen, Holanda) em um béquer de tergômetro preenchido com 1 l de água deionizada. A dureza de água foi ajustada a 100 ppm (Ca:Mg 3:1), e o pH ajustado a 8,2 com o uso de HEPES a 5 mM. O Detergente Líquido para Lavagem de Roupas Tide® inativado por calor (Original scent, adquirido em supermercados locais em 2014) foi adicionado aos béqueres a 1 g/l. O protocolo de inativação por calor é descrito abaixo no Exemplo 4. Cada mananase foi adicionada aos béqueres em várias doses por um tempo de lavagem de 15 min. Após o tratamento de lavagem, as amostras foram secar por centrifugação seguido por secagem ao ar.
[00255] Cada amostra foi medida antes e após o tratamento com o uso de um colorímetro (Konica Minolta Chroma Meter CR-410, abertura de 50 mm). A diferença nos valores L, a, b foi convertida em diferença de cor total (dE) conforme definido pelo espaço de cor CIE-LAB. Esses valores foram usados para determinar o nível de limpeza das amostras, e os resultados foram expressos como remoção de manchas percentual (% de SRI). Os resultados para limpeza de amostras CS-73 por PspMan138 e MANNAWAY® 4 l são mostrados na Figura 1. Nesse ensaio de limpeza, PspMan138 e MANNAWAY® 4 l exibiram remoção de manchas comparável em sujeira LBG.
[00256] Os detergentes líquidos para lavagem de roupas listados na Tabela 3 apresentada no presente documento abaixo foram adquiridos em supermercados locais. Para abolir a atividade enzimática de fundo, as enzimas presentes nesses detergentes comerciais foram inativadas aquecendo-se os detergentes a 95°C por 3 a 4 horas. Após o aquecimento, os detergentes foram avaliados quanto à atividade enzimática por meio dos ensaios de atividade de protease e amilase apresentados no presente documento abaixo. Após o aquecimento dos detergentes por 4 horas, a atividade de protease e amilase não foi detectada. Ademais, a ausência de atividade de mananase em detergentes inativados por calor foi mostrada pelo ensaio de atividade no substrato LBG descrito sob "Ensaio de Atividade de Mananase Residual" abaixo.
[00257] As atividades de enzima foram medidas diluindo-se primeiramente o detergente 1:5 em tampão MOPS a 50 mM, pH 7,2.
[00258] Ensaio de Protease: A atividade de protease foi medida com o uso do substrato de succinil-L-alanil-L-alanil-L-prolil-L-fenil-p- nitroanilida (suc-AAPF-pNA, Sigma: S-7388) tampão a pH 8,6 e 25°C. As soluções de reagente usadas foram: Tris/HCl a 100 mM, pH 8,6, contendo TWEEN®-80 0,005% (tampão de diluição de Tris); tampão de Tris a 100 mM, pH 8,6, contendo CaCl2 a 10 mM e TWEEN®-80 0,005% (tampão de Tris/Ca); e suc-AAPF-pNA a 160 mM em DMSO (solução de estoque suc-AAPF-pNA) (Sigma: S-7388). O ensaio foi realizado adicionando-se 10 ul de detergente diluído a cada cavidade contendo 150 ul de tampão de diluição de Tris, imediatamente seguido pela adição de 100 ul de 2 mg/ml de solução de trabalho de suc-AAPF-pNA a 25°C. As reações foram avaliadas visualmente versus detergente para lavagem de roupas comercial não aquecido, em que a geração de cor indica a atividade enzimática.
[00259] Ensaio de amilase: O ensaio de alfa-amilase Ceralpha foi realizado com o uso do kit Ceralpha HR (Megazyme, Wicklow, Irlanda). O substrato usado foi uma mistura do oligossacarídeo definido "malto- heptaosídeo de p-nitrofenila bloqueado de extremidade não redutora (BP-NPG7) e níveis em excesso de alfa-glucosidase (que não tem nenhuma atividade no substrato nativo devido à presença do ‘grupo de bloqueio')". Para iniciar a reação, detergente comercial diluído foi adicionado ao substrato em um tampão MOPS a 50 mM, pH 7,2 a 25°C. As reações foram avaliadas visualmente versus detergente para lavagem de roupas comercial não aquecido, em que a geração de cor indica a atividade enzimática.
[00260] Amostras de PspMan138 e mananase comercial (MANNAWAY® 4 l, Novozymes AS, Dinamarca) foram adicionadas aos detergentes inativados por calor listados na Tabela 3 para uma concentração final de 0,3% (em p/p). Adicionalmente à mananase, protease BPN'-Y217L subtilisina foi adicionada aos detergentes a 3,0% (em p/p). Os detergentes contendo amostras de mananase e protease foram colocados a 37 °C. As alíquotas foram removidas em vários pontos de tempo (0 a 28 dias) e congeladas. A atividade de mananase residual de todas as amostras foi avaliada como apresentado mais adiante neste documento.
[00261] A atividade de β-1,4-mananase da mananase foi medida quantificando-se o açúcar redutor liberado. O substrato usado foi LBG galactomanano 0,28% (Sigma G0753). Os açúcares liberados foram quantificados com o uso de ácido dinitrossalicíclico (DNS) que reage com açúcares redutores; sua absorbância a 540 nm é proporcional à atividade enzimática.
[00262] O ensaio foi realizado pelo pré-equilíbrio de 0,4 ml de alíquotas da solução de substrato de trabalho (2,8 g/l de LBG em tampão de Tris-HCl a 50 mM, pH 7,5, preparado conforme descrito no Exemplo 2) a 40 °C em um banho de água por 10 min. A reação foi iniciada pela adição de 0,1 ml de 1,9 ppm de solução de mananase na solução de substrato pré-equilibrada, misturada e incubada a 40°C por 15 min. A reação foi terminada pela adição de 0,6 ml de reagente de ácido 3,5-dinitrossalicílico (ácido 3,5-dinitrossalicílico a 43,8 mM, hidróxido de sódio a 400 mM, tartarato de potássio e sódio tetraidratado a 1,06 M). Os tubos de reação foram colocados em um banho de água a 100°C por 15 min, então, resfriados em banho de gelo por 5 min e adicionalmente equilibrados à temperatura ambiente por 10 min. A absorbância foi medida a 540 nm para determinar a atividade enzimática relativa em LBG galactomanano.
[00263] Os dados de atividade de mananase residual para cada mananase foram, então, ajustados com o uso de um modelo de decaimento exponencial de uma fase. A meia-vida (em dias) foi determinada a partir desses dados e é apresentada na Tabela 4. A meia-vida é o tempo em que 50% da atividade de mananase original é observada. A meia-vida de PspMan138 é melhorada através de MANNAWAY® 4 l (denominada "Referencial" na Tabela 4) emdetergentes líquidos para lavagem de roupas comercialmente disponíveis na presença de protease.
[00264] As proteínas relacionadas foram identificadas por uma pesquisa BLAST (Altschul et al., Nucleic Acids Res, 25:3.389 a 3.402, 1997) no banco de dados de proteína não redundante NCBI com o uso da sequência de aminoácidos madura de PspMan138 (SEQ ID NO:13) e um subconjunto são mostrados na Tabela 5A. Uma pesquisa similar que foi executada no banco de dados Genome Quest Patent com os parâmetros de pesquisa definidos para os valores padrão com o uso da sequência de aminoácidos de proteína madura de PspMan138 (SEQ ID NO:13) como a sequência de consulta e um subconjunto são mostrados na Tabela 5B.
[00265] A identidade percentual (PID) para ambos os conjuntos de pesquisa é definida como o número de resíduos idênticos divididos pelo número de resíduos alinhados no alinhamento de pares de sequências. A coluna identificada "comprimento da sequência" refere-se ao comprimento (em aminoácidos) das sequências de proteína associadas aos Números de Acesso listados, ao mesmo tempo que a coluna identificada "Comprimento de alinhamento" refere-se ao comprimento (em aminoácidos) da sequência de proteína alinhada usada para o cálculo de PID.
[00266] Um alinhamento das sequências de aminoácidos de proteína madura para mananases do clado NDL incluindo PspMan138 (SEQ ID NO:13) e PspMan4 parental (SEQ ID NO:14) com as sequências de aminoácidos de proteína madura de outra mananase incluindo as formas maduras de BciMan1_BAA25878.1 (SEQ ID NO:40), Bac.sp._BAD99527.1 (SEQ ID NO:43), B_nealsonii_AGU71466.1 (SEQ ID NO:42), Bac.sp_WO2015022428-0015 (SEQ ID NO:44), B. lentus_WO2014100018-0002 (SEQ ID NO:41), US6566114-002 (SEQ ID NO:160) e PamMan2, PamMan3, PtuMan2, PpaMan2 e PspMan9 (que são descritas de modo mais completo no Pedido de Patente Internacional n° PCT/US15/40057 que foi depositado em 10 de julho de 2015 e subsequentemente publicado como WO2016/007929) é mostrado na Figura 2. As sequências foram alinhadas com parâmetros padrão com o uso do programa MUSCLE do software Geneious (Biomatters Ltd.) (Robert C. Edgar. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput Nucl. Acids Res. (2004) 32 (5): 1.792 a 1.797). Uma árvore filogenética para assequências de aminoácidos das formas maduras de várias mananases da Figura 2 foi construída com o uso do programa construtor Geneious Tree e é representada na Figura 3.
[00267] As sequências de aminoácidos de PspMan138 (SEQ ID NO:13) e PspMan4 parental (SEQ ID NO:14) foram alinhadas com o uso do software CLUSTALW (Thompson et al., Nucleic Acids Research, 22:4.673 a 4.680, 1994) com parâmetros padrão e mostradas na Figura 2. O alinhamento mostrou que PspMan138 e PspMan4 compartilham um motivo que se estende entre os resíduos Trp31 e Ile40, em que as posições de aminoácido do polipeptídeo são numeradas por correspondência com a sequência aminos apresentada em SEQ ID NO:14. As NDL mananases compartilham características para criar um clado, subsequentemente chamado de Clado NDL, em que o termo NDL deriva dos resíduos conservados NDL próximos ao terminal N (Asn34- Asp35-Leu36). Esse motivo pode ser descrito como WXaKNDLXXAI (SEQ ID NO:15), em que Xa é F ou Y, e X é qualquer aminoácido ("Motivo 1"). O motivo é descrito de maneira mais completa no Pedido de Patente Internacional n° PCT/US15/40057, depositado em 10 de julho de 2015, subsequentemente publicado como WO2016/007929.
[00268] Os membros do Clado NDL também compartilham um motivo conservado com o recurso-chave de uma deleção que não está presente no Bacillus sp. JAMB-602_BAD99527.1 (Akita et al (2004) Acta Cryst. D60:1.490 a 1.492) e outras sequências de mananase de referência, tais como B_nealsonii_AGU71466.1 eBciman1_B_circulans_BAA25878.1 (doravante o "Motivo de Deleção"). O Motivo de Deleção ocorre entre os resíduos Leu263-Asp264 (LD) e Leu273-Thr274 (LT), em que as posições de aminoácido dopolipeptídeo são numeradas por correspondência com a sequência de aminos apresentada em SEQ ID NO:14, e inclui a sequência LDXXXGPXGXLT (SEQ ID NO:16), em que X é qualquer aminoácido ("Motivo de Deleção 1"); LDX1V/AT/AGPX2GX3LT (SEQ ID NO:17), em que X1 é L ou M, X2 é N, A ou S, e X3 é S, T ou N ("Motivo de Deleção 2"); ou LDM/LATGPN/AGS/TLT (SEQ ID NO:18) ("Motivo de Deleção 3"). O Motivo de Deleção é descrito de maneira mais completa no Pedido de Patente Internacional n° PCT/US15/40057, depositado em 10 de julho de 2015, subsequentemente publicado como WO2016/007929.
[00269] Manipulações de DNA para gerar variantes PspMan4 de Paenibacillus sp. adicionais foram executadas conforme descrito no Exemplo 1 com os iniciadores listados na Tabela 1. A lista de variantes PspMan4 geradas com substituições de sequência em relação à PspMan4 parental (SEQ ID NO:14) é mostrada na Tabela 6. As sequências de aminoácidos das variantes PspMan4 maduras: PspMan115-122, PspMan124-130, PspMan132-145, PspMan148,PspMan150-158, PspMan6153, PspMan6428, PspMan6435, PspMan6574, PspMan6668, PspMan6670, PspMan6722,PspMan7154, PspMan_HM48-64, PspMan_HM66-67 e PspMan_HM71 são apresentadas nas SEQ ID NOs:46 a 91, 141 a 159 e 161.
[00270] A sequência de ácidos nucleicos para o peptídeo de sinalização nativo das variantes PspMan4 é apresentada como SEQ ID NO:92. As sequências de nucleotídeos dos genes que codificam as variantes PspMan4 maduras: PspMan115-122, PspMan124-130,PspMan132-145, PspMan148, PspMan150-158, PspMan6153,PspMan6428, PspMan6435, PspMan6574, PspMan6668,PspMan6670, PspMan6722 e PspMan7154 são apresentadas em SEQ ID NOs:93 a 139. A sequência de aminoácidos do peptídeo de sinalização das variantes PspMan4 é apresentada como SEQ ID NO:140.
[00271] Para gerar as amostras de enzima de variante PspMan4 para caracterização bioquímica, o crescimento seletivo das células de B. subtilis transformadas foi realizado em MTPs de 96 cavidades a 37°C por 68 horas em meio de cultivo (meios semidefinidos enriquecidos à base de tampão MOPS, com ureia como a principal fonte de nitrogênio, glicose como a principal fonte de carbono e suplementado com 1% de soytone para crescimento celular robusto) em cada cavidade. As culturas foram coletadas por centrifugação a 3.600 rpm por 45 min e filtradas através de placas de filtro Multiscreen® (EMD Millipore, Billerica, MA, EUA) com o uso de um sistema de vácuo Millipore. Os sobrenadantes de cultura filtrados foram usados para os ensaios descritos abaixo.
[00272] As variantes PspMan4 foram testadas quanto ao desempenho de limpeza em pequenas amostras de goma de alfarrobeira (LBG) (CFT C-S-73, Center for Testmaterials, Vlaardingen, Holanda) em relação ao desempenho da parental conforme indicado no exemplo abaixo.
[00273] O desempenho de limpeza foi medido com o uso de um ensaio de alto rendimento desenvolvido para medir a remoção de galactomanano de solos técnicos. O ensaio mede a liberação de LBG dos solos técnicos contendo LBG. A reação BCA que usa um reagente comercialmente disponível (n° de catálogo 23225, Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL) é usada para medir as extremidades redutoras de oligossacarídeos em solução na presença de enzima, em comparação um controle em branco. Essa medição correlaciona-se com o desempenho de limpeza da enzima. Como a mananase hidrolisa galactomananos, oligossacarídeos de comprimentos variados com extremidades redutoras são supostamente liberados da amostra de algodão. O ácido bicinconínico no reagente BCA permite, então, a detecção colorimétrica altamente sensível de Cu1+ formado pela redução de Cu2+.
[00274] Duas pequenas amostras de LBG de 5,5 cm de diâmetro (CFT C-S-73) foram colocadas em cada cavidade de uma placa de ensaio de 96 cavidades de não ligação de fundo plano (por exemplo, Corning 3641). As enzimas foram diluídas em tampão MOPS a 50 mM, pH 7,2, contendo TWEEN®-80 0,005%. Tampão de ensaio de pequena amostra (HEPES a 25 mM, pH 8, CaCl2 a 2 mM, TWEEN®-80 0,005%) e alíquotas de enzimas diluídas foram adicionados a cada cavidade da placa de ensaio de pequena amostra de 96 cavidades para um volume combinado de 100 μl. As placas foram vedadas e incubadas a 25 °C com agitação a 1150 rpm por 20 min (por exemplo, em um incubador/agitador iEMS, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Após a incubação, os açúcares redutores liberados foram quantificados com o uso do ensaio de reagente BCA conforme descrito na seção de "Ensaio de Atividade de Mananase" do Exemplo 2. A absorbância resultante foi tomada como uma medição do desempenho de limpeza. Os valores de desempenho de limpeza PI foram calculados dividindose o desempenho de limpeza das variantes por este da parental na mesma concentrações de proteína. Os valores teóricos para o desempenho de limpeza da enzima parental nas concentrações de proteína relevantes foram calculados com o uso dos parâmetros extraídos de um ajuste de Langmuir dos valores medidos para uma curva padrão da enzima parental. A Tabela 7 apresenta variantes PspMan4 que têm desempenho de limpeza melhorado em relação à PspMan4 parental no ensaio de pequena amostra descrito acima.
[00275] A estabilidade das variantes PspMan4 foi testada sob condições de estresse em tampão MOPS a 50 mM, pH 7,2, TWEEN®- 80 0,005% nas temperaturas indicadas na Tabela 8 medindo-se a atividade residual das amostras após a incubação a uma temperatura elevada por 5 min. As condições usadas para os ensaios de estabilidade de proteína em tampão são apresentadas na Tabela 8.
[00276] Para medir a atividade inicial (sem estresse), as amostras de enzima foram diluídas em tampão MOPS a 50 mM, pH 7,2, TWEEN®- 80 0,005% e avaliadas imediatamente quanto à atividade em LBG, com o uso do ensaio descrito sob a seção de "Ensaio de Atividade de Mananase" no Exemplo 2. Para medir a atividade com estresse, as amostras de enzima diluídas em tampão MOPS a 50 mM, pH 7,2, TWEEN®-80 0,005% foram incubadas em uma placa de PCR vedada a uma temperatura elevada (conforme indicado na Tabela 8) por 5 min em um termociclo (Tetrad2 Peltier Thermal Cycler, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), então, avaliadas quanto à atividade conforme na seção de "Ensaio de Atividade de Mananase" no Exemplo 2.
[00277] Uma vez que os valores de atividade com estresse e sem estresse foram medidos por hidrólise do substrato de LBG conforme descrito acima, a % de atividades residuais foi calculada tomando-se uma razão entre a atividade com estresse e sem estresse e multiplicando por 100. A Tabela 9 apresenta as variantes PspMan4 que têm estabilidade melhorada em relação à PspMan4 parental no ensaio de estabilidade sob as condições descritas na Tabela 8.
* ND: não determinado
[00278] A estabilidade das variantes PspMan4 foi testada sob condições de estresse em uma solução aquosa 10% (em v/v) do detergente líquido para lavagem de roupas TIDE® comercialmente disponível (Original scent, Procter and Gamble, adquirido em supermercados locais em 2014 e inativado por calor com o uso do protocolo descrito no Exemplo 4) medindo-se a atividade residual das amostras após a incubação a uma temperatura elevada (conforme indicado na Tabela 10) por 5 min.
[00279] Uma solução aquosa 12,5% (em v/v) do detergente inativado por calor foi preparada, e amostras de enzima dos sobrenadantes de cultura filtrados foram misturadas com o volume apropriado dessa solução detergente para alcançar uma concentração de detergente final de 10% (em v/v). Para medir a atividade inicial (sem estresse), alíquotas dessa mistura foram imediatamente diluídas em tampão MOPS a 50 mM, pH 7,2, TWEEN®-80 0,005% e avaliadas quanto à atividade em LBG com o uso do Ensaio de Atividade de Mananase descrito no Exemplo 2. Para medir a atividade com estresse, as amostras de enzima misturadas com a solução detergente foram incubadas em uma placa de PCR vedada a uma temperatura elevada (conforme indicado na Tabela 10) por 5 min em um termociclo (Tetrad2 Peltier Thermal Cycler, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), então, diluídas em tampão MOPS a 50 mM, pH 7,2, TWEEN®-80 0,005% e avaliadas quanto à atividade conforme descrito no "Ensaio de Atividade de Mananase" no Exemplo 2.
[00280] Uma vez que os valores de atividade com estresse e sem estresse foram medidos por hidrólise do substrato de LBG conforme descrito acima, a % de atividades residuais foi calculada tomando-se uma razão entre a atividade com estresse e sem estresse e multiplicando por 100, em que a margem de erro estava dentro de 5%. A Tabela 11 apresenta as variantes PspMan4 que têm estabilidade melhorada em relação à PspMan4 parental no ensaio de estabilidade sob as condições descritas na Tabela 10.
* ND: não determinado
[00281] PspMan118 foi isolada de sobrenadantes de cultura de Bacillus clarificados por precipitação de sulfato de amônio em tampão MES pH 5,3. A purificação foi alcançada por cromatografia de troca hidrofóbica, seguida por diálise em tampão MES a 50 mM, pH 6,0. Propilenoglicol foi, então, adicionado a uma concentração final de 40%, e as amostras armazenadas refrigeradas até caracterização adicional.
[00282] O desempenho de lavagem de PspMan118 e uma mananase comercial (MANNAWAY® 4 l, Novozymes AS, Dinamarca) foi testado em uma aplicação de detergente para lavagem de roupas o uso de um Tergômetro. A avaliação do desempenho foi conduzida a 16 °C. A carga de sujeira consistia em duas amostras de LBG CFT C-S-73 (Center for Testmaterials BV, Vlaardingen, Holanda) em um béquer de tergômetro preenchido com 1 l de água deionizada. A dureza da água foi ajustada em 100 ppm (3:1 de Ca:Mg). O Detergente Líquido para Lavagem de Roupas Em Pó Ultra Tide® Clean Breeze inativado por calor (adquirido em supermercados locais em 2014) foi adicionado aos béqueres a 0,6 g/l. Cada mananase foi adicionada aos béqueres em várias doses por um tempo de lavagem de 12 min. Após o tratamento de lavagem, as amostras foram secar por centrifugação seguido por secagem ao ar. Cada amostra foi medida antes e após o tratamento com o uso de um colorímetro (Konica Minolta Chroma Meter CR-410, abertura de 50 mm).
[00283] A diferença nos valores L, a, b foi convertida em diferença de cor total (dE) conforme definido pelo espaço de cor CIE-LAB. Esses valores foram usados para determinar o nível de limpeza das amostras, e os resultados foram expressos como remoção de manchas percentual (% de SRI). Os resultados para limpeza de amostras CFT C-S-73 por PspMan118 e MANNAWAY® 4 l são mostrados na Figura 4. Nesse ensaio de limpeza, PspMan118 e MANNAWAY® 4 l exibiram remoção de manchas comparável em sujeira LBG em detergente para lavagem de roupas em pó.
[00284] As estruturas tridimensionais das variantes PspMan4, PspMan118 e PspMan148, foram determinadas com o uso do método cristalográfica por raios X.
[00285] PspMan118 (SEQ ID NO:49) com mutações P19E/T38E/N67D/N97D/ Y129M/P168S/Q184L/K244L/S258D/N261R(em que as posições de aminoácido são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14) foi cristalizada com o uso do método de gota suspensa começando com uma solução de proteína 1% em tampão MES a 50 mM pH 6,0 com cloreto de sódio a 50 mM. A solução de reservatório continha fosfato de sódio a 0,7 M, fosfato de potássio a 0,8 M e HEPES a 0,1 M pH 7,5. Os cristais cresceram no grupo de espaço P212121 tendo uma molécula na unidade assimétrica com as dimensões da célula unitária a=53,2 Â, b=76,7 Â, e c=77,3 Â.
[00286] PspMan148 (SEQ ID NO:74) com mutações N10T/P19E/S30T/T38E/S59V/L60Q/K63R/N67D/N97D/Y129M/K143Q/P168S/Q184L/G225P/T 228V/Y235L/K244L/S258D/N261R/Z298.01Q (em que as posições de aminoácido são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14) foi cristalizada com o uso do método de gota suspensa começando com uma solução de proteína 1% em tampão MES a 50 mM pH 6,0 com cloreto de sódio a 50 mM. A solução de reservatório continha 2-propanol 16%, cloreto de cálcio a 0,16 M e acetato de sódio a 80 mM, pH 4.6. Os cristais cresceram no grupo de espaço P212121 tendo uma molécula na unidade assimétrica com as dimensão da célula unitária a=52,8 Â, b=77,0 Â, e c=78,5 Â.
[00287] Os dados para cristais de PspMan118 e PspMan148 foram coletados em um sistema de difração Bruker X8 Proteum a uma resolução de 1,8 Â e 1,7 Â, respectivamente. As estatísticas adicionas para a coleta de dados são apresentadas na Tabela 12.
[00288] A estrutura de PspMan118 foi determinada com o uso de substituição molecular com as coordenadas de resíduos 27 a 326 de mananase de Bacillus sp. JAMB-602 (número de acesso BAD99527.1, entrada PDB 1WKY_A) como um modelo de partida. O modelo foi ajustado com o uso do pacote de software Coot [Emsley, P. et al (2010), Acta Cryst. D; 66:486 a 501].
[00289] A estrutura de PspMan148 foi determinada com o uso de substituição molecular pelas coordenadas de PspMan118 como um modelo de partida. As coordenadas foram ajustadas para acomodar a densidade de elétron para as substituições adicionais e ajustadas com o uso do pacote de software Coot. Uma densidade fraca e esparsa foi observada para o resíduo adicional, Z298.01Q, inserido na terminação C de PspMan148. Após os ajustes de encaixe e retroencaixe, as coordenadas para ambas as estruturas foram refinadas com o uso do programa REFMAC com definições-padrão no pacote de software CCP4.
[00290] Os modelos finais tiveram boa estereoquímica, conforme relatado na Tabela 13. Para referência, as coordenadas das variantes PspMan118 e PspMan148 poderiam ser alinhadas com um desvio de rms (raiz média quadrática) geral de 0,133Â para 1.954 átomos comuns.
*Valores para a carcaça externa são apresentados entre parênteses
[00291] As coordenadas dos monômeros de PspMan118 são sobrepostas com os domínios catalíticos de duas outras estruturas de mananase: Manase de Bacillus sp. cepa JAMB-602 (entrada PDB 1WKY_A) e mananase de B. agaradhaerens cepa NCIMB 40482 (entrada PDB 2WHL_A), com um desvio rms geral de 0,38Â e 0,42Â, respectivamente, com o uso de todos os átomos comuns. Assim, ainda que essas três enzimas compartilhem apenas cerca de 60% de identidade de sequência de aminoácidos sobre os resíduos 1 a 295 de PspMan4, todas as três mananases compartilham um enovelamento comum para os domínios catalíticos.
[00292] A Figura 5 retrata uma comparação estrutural da mananase 1WKY_A com a variante PspMan118, em que o enovelamento de cadeia principal de 1WKY_A (mostrado em cinza) é comparado com o enovelamento de cadeia principal de PspMan118 (mostrado em preto). A Figura 5 mostra que a PspMan118 compartilha um sítio de ligação de cátion comum com 1WKY_A, e que 1WKY_A tem um domínio de ligação de carboidrato adicional. O sítio de ligação de cátion que PspMan118 compartilha com 1WKY_A é formado pelo oxigênio da carbonila do resíduo Gly225, a cadeia lateral de Asp231, o oxigênio da carbonila de Thr232 e a cadeia lateral de Glu234.
[00293] PspMan118 e PspMan148 podem ser, ainda, caracterizadas por dois motivos: (i) um motivo NDL nas posições N34D35L36 e (ii) um motivo de deleção que abrange as posições 263 a 274 (em que as posições de aminoácido são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14) em relação a outras sequências de mananase GH5, tais como aquelas exemplificadas por 1WKY_A e 2WHL_A. A Figura 6 retrata outra comparação estrutural de PspMan118 com 1WKY_A, em que essa comparação mostra que os resíduos que abrangem os motivos NDL e de Deleção de PspMan118 estão em proximidade um ao outro.
[00294] A estrutura de mananase 2WHL_A de B. agaradhaerens foi relatada como um complexo de manotriosila-enzima. A estrutura de PspMan148 foi alinhada com 2WHL_A para estudar a localização dos sítios variantes em relação à ligação de manotriose no sítio ativo. PspMan148 foi escolhida para comparação visto que inclui todas as 10 substituições presentes em PspMan118, assim como nove substituições adicionais e uma inserção na terminação C. Como com PspMan118, é possível alinhar a estrutura de PspMan148 com aquela de 2WHL_A, resultando em um desvio rms geral de 0,405Â para 1.660 átomos comuns. A sobreposição das estruturas de PspMan148 e 2WHL_A é retratada nas Figuras 7A a 7C.
[00295] Na Figura 7A, o enovelamento de cadeia principal de 2WHL_A é representado esquematicamente em cinza claro, e a manotriose é mostrada como bastões cinza claro. A cadeia principal de PspMan148 é mostrada em preto com as cadeias laterais dos dezenove aminoácidos substituídos mostradas como figuras de bastão preto. O aminoácido Z298.01Q inserido em PspMan148, que foi desordenado no mapa de densidade de elétron, não está incluído nessa figura.
[00296] Sete das dezenove substituições em PspMan148 estão situadas no sítio de ligação de substrato. Esses incluem S30T, S59V, L60Q, K63R, T228V, S258D e N261R (em que as posições deaminoácido são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14). A Figura 7B mostra a sobreposição das estruturas de PspMan148 e 2WHL_A com as substituições de sítio de ligação de substrato mostradas como esferas pretas. Entre essas substituições, L60Q introduz uma cadeia lateral que pode ser vista em posições homólogas em ambas as estruturas de 1WKY_A e 2WHL_A. Dois outros resíduos encontrados no sítio ativo de PspMan148 são comuns tanto a 1WKY_A quanto 2WHL_A: Trp61 e Trp260 (em que as posições de aminoácido são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14). Considerando-se as fortes similaridades estruturas entre essas mananases, pode-se esperar que introduzir as substituições que conferem melhora em PspMan4 em sítios estruturalmente homólogos em qualquer uma das mananases 1WKY_A ou 2WHL_A poderia conferir melhoras similares em desempenho e/ou estabilidade a essas moléculas.
[00297] Na Figura 7B, a porção química manotriosila ligada à mananase 2WHL_A é mostrada como bastões cinzas para indicar a localização relativa do sítio de ligação de substrato. As posições das sete substituições (S30T, S59V, L60Q, K63R, T228V, S258D e N261R) em PspMan148 em torno e próximas ao sítio de ligação de substrato são mostradas como esferas pretas.
[00298] Conforme visto na Figura 7C, as doze substituições remanescentes em PspMan148 são distribuídas na superfície da molécula (mostradas como esferas pretas). Dessas doze substituições, Q184L e G225P são de interesse particular. A substituição Q184L introduz uma cadeia lateral de leucina que protege uma ponte de sal entre Arg149 e Glu182, estabilizando, assim, a proteína. A substituição G225P introduz um resíduo de prolina de enrijecimento onde o oxigênio da carbonila de cadeia principal forma um ligante ao cátion (um íon de cálcio em PspMan148), estabilizando potencialmente, assim, o cálcio ligado, o que poderia tornar a enzima menos sensível aos quelantes presentes em formulações detergentes.
[00299] As variantes PspMan4 foram testadas quanto aodesempenho de limpeza antes e depois da incubação em detergente a 100% à temperatura ambiente. A % de atividade de limpeza remanescente após a incubação foi comparada com a atividade de limpeza inicial antes da incubação.
[00300] O detergente líquido para lavagem de roupas comercialmente disponível usado para a incubação foi adquirido em supermercados locais (Nome do detergente: Total Color; Fabricante: Private label; País de aquisição: Suíça; Ano da aquisição: 2011) e inativado por aquecimento com o uso do protocolo descrito no Exemplo 4 acima.
[00301] Um minidisco de agitação (Tumble Stir Disk, Número de catálogo P 721F-1, V&P Scientific, San Diego, CA) foi colocado em cada cavidade de uma MTP de 96 cavidades de polipropileno de baixa ligação de fundo em U, seguido pela adição de detergente líquido Total Color a 100%. As amostras de enzima de sobrenadantes de cultura filtrados foram adicionadas a essa MTP preenchida com detergente (razão de aproximadamente 1:11(v/v) entre amostra e detergente) e misturadas com o uso de um aparelho de agitação por tambor magnético (série VP710, V&P Scientific, San Diego, CA) por 5 min. O desempenho de limpeza inicial (ponto no tempo T=0) foi medido retirando-se uma alíquota de cada cavidade da placa de incubação de detergente-enzima e executando-se o ensaio de desempenho de limpeza por pequena amostra de tecido descrito no Exemplo 8 acima. A razão entre amostra e tampão na placa de ensaio por pequena amostra de tecido foi 1:9 (v/v).
[00302] A placa de detergente-enzima foi, então, incubada à temperatura ambiente pela quantidade de tempo indicada nos cabeçalhos das Tabelas 14A e 14B (7 horas e 9 horas, respectivamente) e a atividade de limpeza remanescente após a incubação foi determinada retirando-se uma alíquota de cada cavidade da placa de incubação de enzima-detergente ao final do período de incubação e executando-se o ensaio de desempenho de limpeza por pequena amostra de tecido descrito no Exemplo 8 acima. A razão entre amostra e tampão na placa de ensaio por pequena amostra de tecido foi 1:9 (v/v). Um valor de limpeza residual (% de atividade de limpeza remanescente) foi obtido considerando-se uma razão entre a atividade de limpeza (medida no ensaio de limpeza por pequena amostra de tecido) após a incubação e a atividade de limpeza inicial medida no tempo T=0 e multiplicando-se por 100.
[00303] As Tabelas 14A 14B e listam o desempenho de variantes PspMan4 no ensaio de desempenho de limpeza envelhecido (mostrado como % de atividade de limpeza remanescente após o período de incubação indicado) em comparação com a PspMan4 parental.
Claims (11)
1. Variante de mananase ou um polipeptídeo recombinante apresentando atividade de mananase, caracterizada pelo fato de que é derivada de um polipeptídeo de referência GH5 e consiste em uma sequência de aminoácido resultante de de duas ou mais modificações em SEQ ID NO: 14, em que a primeira modificação é N97D-G225Cem que as modificações adicionais são selecionadas de:P19E-K63L-N67D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-G225C- T228V-K244L;P19E-T38E-N67D-N97D-Y129M-P168S-Q184L-K244L- S258D-N261R;P19E-T38E-N67D-N71D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-P168S- G225C-K244L-S258D-N261R;T38E-K63L-N71D-N97D-Y129M-Q184L-G225C-T228V- Q242L-K244L-S258D-N261R;P19E-K63L-N71D-N97D-Y129M-Q184L-G225C-K244L- S258D-G259P;N10T-T38E-S59V-L60Q-K63R-L66V-A68S-N74S-V75L-N97D-V103I-Y129M-F167Y-P19E-T38E-N67D-N71D-N97D-Y129M-F167Y-Q184L- A217P-K244L-S258D-N261R;T38E-K63L-N67D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-P168S-Q184L-K244L-S258D-N261R;P19E-T38E-N67D-N97D-Q184L-A217P-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R;N10T-P19E-G28S-S30T-T38E-N67D-N71D-N97D-Y129M- P168S-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q;P19E-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N97D-V103I-Y129M-K143Q-F167Y-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q;P19E-T38E-N67D-N71D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-P168S- G225C-T228V-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q;P19E-T38E-S59V-L60Q-K63L-K70R-N71D-Q78D-K80T- N97D-E111D-Y129M-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D- N261R-Z298.01Q;N10T-T38E-K63L-N71D-N97D-V103I-Y129M-F167Y-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q;N10T-P19E-T38E-N67D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-K143Q- Q184L-A217P-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q;N10T-P19E-T38E-S59V-L60Q-K63L-N97D-V103I-Y129M- F167Y-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q;P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N97D-V103I-Y129M-F167Y-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R- Z298.01Q;P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-Q78D-K80T- N97D-I124V-Y129M-K143Q-F167Y-Q184L-G225C-Y235L-K244L- S258D-N261R-Z298.01Q;N10S-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63L-N67D-Q78H-K80T-I82M-N97D-Y129M-K143Q-F167Y-Q184L-G225C-Y235L- K244L-S258D-N261R-Z298.01Q;N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N97D-Y129M-K143Q-P168S-Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D- N261R-Z298.01Q;G4S-N10T-P19E-T38E-N67D-Q78D-K80T-N97D-Y129M- Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q;N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63L-K70R-N71D-Q78D-K80T-N97D-Y129M-T131A-F167Y-Q184L-G225C-Y235L- K244L-S258D-N261R-Z298.01Q;N10T-P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63L-K70R-N71D- Q78D-K80T-N97D-E111D-Y129M-P168S-Q184L-G225C-T228V- Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q; P19E-S30T-T38E-S59V-L60Q-K63R-N67D-N97D-Y129M- P168S-Q184L-K214I-G225C-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q;M1V-P19E-S30T-T38E-T62E-N67D-N71D-Q78D-N97D- Y129M-K143R-F167Y-P168S-Q184L-G225C-Y235L-K244L-S258D- N261R-T284A-Z298.01Q;Y6E-N10T-P19E-G28S-S30T-T38E-K63L-N67D-N71D- N97D-E111S-Y129M-S135L-P168S-Q184L-G225C-T228V-Y235L- K244L-S258D-N261Q-D283S-Z298.01Q;A2S-P19E-G28S-S30T-T38E-K63R-N67D-N71D-N74E- K93R-N97D-Y129M-N150T-P168S-Q184L-N213A-G225C-Y235L- K244L-S258D-N261Q-Z298.01Q;M1L-N10T-P19E-G28A-S30T-T38E-K63L-N67D-N71D- Q78D-N97D-Y129M-A136L-P168A-Q184L-N213A-G225C-Y235L- K244L-S258D-N261R-Z298.01Q;P19E-T38E-S59V-K63R-N67D-N97D-V103I-Y129M-F167Y- Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q;N10T-P19E-G28A-S30T-T38E-K63R-N67D-N97D-Y129M- Q184L-G225C-T228V-Y235L-K244L-S258D-N261R-Z298.01Q;N10T-P19E-G28A-S30T-T38E-S59D-N67D-A68S-N71D- K93R-N97D-Y129M-K143Q-P168S-Q184D-G225C-Y235L-K244L- S258D-N261R-T284E-Z298.01Q;opcionalmente em que a variante de mananase ou polipeptídeo recombinante compreende ainda um ou mais motivos selecionados de:(i) motivo WXaKNDLXXAI (SEQ ID NO:15) nas posições 31-40, em que Xa é F ou Y e X é qualquer aminoácido;(ii) motivo LDXXXGPXGXLT (SEQ ID NO:16) nas posições 263-274, em que X é qualquer aminoácido;(iii) motivo LDX1V/AT/AGPX2GX3LT (SEQ ID NO:17) nas posições 263-274, em que X1 é um M ou L, X2 é N, A ou S e X3 é S, T ou N; e(iv) motivo LDM/LATGPN/AGS/TLT (SEQ ID NO:18) nas posições 263-274.
2. Variante de mananase ou polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que consiste em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:13.
3. Variante de mananase ou polipeptídeo recombinante de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a atividade de mananase ocorre na presença de um surfactante e/ou uma protease.
4. Variante de mananase ou polipeptídeo recombinante de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a referida variante tem uma ou mais propriedades melhoradas quando comparada a um polipeptídeo de referência; em que a propriedade melhorada é selecionada entre estabilidade melhorada na presença de protease, estabilidade melhorada em detergente ou tampão; e desempenho de limpeza melhorado, opcionalmente em que a propriedade melhorada é(i) estabilidade melhorada em detergente, onde a referida variante de mananase ou polipeptídeo recombinante retém pelo menos 10%, 20%, 30%, 40% ou 50% de atividade de mananase residual a uma temperatura de cerca de 40°C a cerca de 70°C, cerca de 45°C a cerca de 65°C, cerca de 50°C a cerca de 60°C, cerca de 60°C a cerca de 70°C, ou cerca de 56°C durante um período de tempo de pelo menos 5 minutos;(ii) estabilidade melhorada na presença de protease, em que a referida variante de mananase ou polipeptídeo recombinante retém pelo menos 50% de atividade de mananase na presença de uma protease e/ou um surfactante durante pelo menos 15 dias ou de cerca de 15 a cerca de 40 dias;(iii) desempenho de limpeza melhorado, em que a referida variante de mananase ou polipeptídeo recombinante ou tem um PI de limpeza de manchas de goma de alfarroba >1; e(iv) desempenho de limpeza envelhecido melhorado, em que a referida variante de mananase ou polipeptídeo recombinante tem pelo menos 15% de atividade de limpeza restante após 7 horas ou pelo menos 11% de atividade de limpeza restante após 9 horas.
5. Composição de limpeza, caracterizada pelo fato de que compreende a variante de mananase ou polipeptídeo recombinante como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que a composição de limpeza opcionalmente compreende ainda: pelo menos um tensoativo; pelo menos um íon selecionado dentre cálcio e zinco; pelo menos um ingrediente auxiliar; pelo menos um estabilizante; a partir de cerca de 0,001% a cerca de 1,0% em peso da dita variante de mananase ou polipeptídeo recombinante, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4; pelo menos um agente de branqueamento; e/ou pelo menos uma enzima ou derivado de enzima selecionado dentre acil transferases, amilases, alfa-amilases, beta- amilases, alfa-galactosidases, arabinases, arabinosidases, aril esterases, beta-galactosidases, beta-glucanases, carrageenases, catalases, celobio-hidrolases, celulases, condroitinases, cutinases, endo-beta-1,4-glucanases, endo-beta-mananases, exo-beta-mananases, esterases, exo-mananases, galactanases, glucoamilases, hemicelulases, hialuronidases, queratinases, lacases, lactases, ligninases, lipases, enzimas lipolíticas, lipoxigenases, mananases, oxidases, pectato liases, pectina acetil esterases, pectinases, pentosanases, peridrolases, peroxidases, fenoloxidases, fosfatases, fosfolipases, fitases, poligalacturonases, proteases, pululanases, redutases, ramnogalacturonases, beta-glucanases, tanases, transglutaminases, xilano acetil-esterases, xilanases, xiloglucanases, xilosidases, metaloproteases e uma combinação das mesmas.
6. Composição de limpeza, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a composição de limpeza:(i) é uma composição de detergente selecionada dentre um detergente para lavagem de roupas, um detergente amaciante de tecido, um detergente para lavagem de louças e um detergente para limpeza de superfície rígida; e/ou(ii) está em uma forma selecionada dentre um líquido, um pó, um sólido granulado, um tablete, uma folha e uma dose unitária; e/ou(iii) contém fosfato ou é livre de fosfato e/ou contém boro ou é livre de boro.
7. Método para limpeza, caracterizado pelo fato de que compreende colocar uma superfície ou item que compreende uma sujeira ou mancha que compreende manano em contato com (i) a variante de mananase ou polipeptídeo recombinante, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou (ii) a composição de limpeza, como definida na reivindicação 5 ou 6, em que o manano contido na dita sujeira ou mancha é hidrolisado, em que o dito item é opcionalmente louça ou tecido.
8. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que consiste em uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre SEQ ID NOs: 1 e 93-139 ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas que codificam a mesma sequência de aminoácidos codificando uma variante de mananase ou polipeptídeo recombinante como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
9. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 8.
10. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor de expressão, como definido na reivindicação 9, em que a célula hospedeira é uma célula fúngica, de levedura ou bacteriana.
11. Método para produção da variante de mananase ou polipeptídeo recombinante como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende:(a) transformar de forma estável a célula hospedeira, como definida na reivindicação 10 com o vetor de expressão como definido na reivindicação 9;(b) cultivar a dita célula hospedeira transformada sob condições adequadas para a dita célula hospedeira para produzir a dita variante de mananase, polipeptídeo recombinante; e(c) recuperar a dita variante de mananase, polipeptídeo recombinante.
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