BR0211941B1

BR0211941B1 - Processo para produzir 2-ceto-l-gulonato de sódio por fermentação e recuperar cristais de monoidrato de ácido 2 ceto-l-gulônico.

Info

Publication number: BR0211941B1
Application number: BRPI0211941-2A
Authority: BR
Inventors: Ignace Andre Debonne; Willy Richard Obyn; Catherine Gwenaelle Michelle Peuzet; Jean-Claude Marie-Pierre Ghistlain D Troostembergh
Original assignee: Cerestar Holding Bv
Priority date: 2001-08-15
Filing date: 2002-08-02
Publication date: 2015-02-24
Also published as: US20050019881A1; GB0119864D0; ATE417117T1; EP1417324A2; WO2003016508A3; WO2003016508A2; AU2002331380A1; EP1417324B1; BR0211941A; CN1571846A; DK1417324T3; US7091013B2; DE60230287D1; CN100449000C

Description

“PROCESSO PARA PRODUZIR 2-CETO-L-GULONATO DE SÓDIO POR FERMENTAÇÃO E RECUPERAR CRISTAIS DE MONOIDRATO DE ÁCIDO 2-CETO-L-GULÔNICO” Campo Técnico A presente invenção refere-se a um processo para a produção de 2-ceto-L-gulonato de sódio e a recuperação de monoidrato de ácido 2-ceto-L-gulônico com elevados rendimentos de recuperação.

Antecedentes da Invenção Sabe-se que ácido 2-ceto-L-gulônico pode ser produzido por fermentação a partir de L-sorbose e/ou sorbitol. FR 1 376 741 refere-se a um processo para a preparação de ácido 2-ceto-L-gulônico, que é um intermediário na produção de ácido L-ascórbico (= vitamina C).

Demonstrou-se que a mistura fermentativa pode ser usada diretamente para esterificação de ácido 2-ceto-L-gulônico em ácido L-ascórbico. EP 0 518 136 descreve um método para a preparação de ácido 2-ceto-L-gulônico que compreende o cultivo de uma cultura mista de microorganismo (A) que pertence ao gênero Gluconobacter ou Acetobacter, e um microorganismo (B) capaz de produzir ácido 2-ceto-L-gulônico a partir de L-sorbose e ambos os referidos microorganismos estão co-existindo no meio durante pelo menos parte de todo o período de cultivo. EP 0 278 447 refere-se a um processo de fermentação para produzir ácido 2-ceto-L-gulônico por conversão de L-sorbose por meio de culturas mistas de microorganismos compreendendo Gluconobacter oxydans e Bacillus megaterium. EP 0 972 843 refere-se a um processo de fermentação contínuo para a fabricação de ácido 2-ceto-L-gulônico a partir de sorbitol por fermentação com microorganismos, em cujo processo um meio nutriente contendo sorbitol é incubado em um primeiro vaso de fermentação com um microorganismo capaz de converter sorbitol em L-sorbose, e o caldo de fermentação resultante é transferido continuamente para um segundo vaso de fermentação onde ele é incubado com um microorganismo capaz de converter L-sorbose em ácido 2-ceto-L-gulônico. EP 0 213 591 descreve um processo para produzir ácido 2-ceto-L-gulônico e vitamina C, respectivamente, e o método ainda descreve que o isolamento de ácido 2-ceto-L-gulônico pode ser afetado pela formação de um sal ou por uso da diferença em propriedades entre o produto e impurezas como solubilidade, capacidade de adsorção e coeficiente de distribuição entre dois solventes. Apesar do uso de um adsorvente como resinas de troca de íons ser descrito como sendo um dos processos mais convenientes para isolamento do produto, o ácido 2-ceto-L-gulônico assim obtido em geral não é puro. EP 0 221 707 refere-se a um método para produzir ácido 2-ceto-L-gulônico e descreve um método de colheita em que o caldo de cultura é isentado de células por filtração, centrifugação ou tratamento com carbono ativado e concentração da solução. A extração com solvente, cromatografia, precipitação ou dessalinização podem ser aplicadas em uma combinação apropriada e/ou repetição. WO 01/09152 refere-se a um processo para a purificação de ácido 2-ceto-L-gulônico por cromatografia de líquido contínua usando uma resina de troca de íons fracamente básica. Refere-se principalmente à recuperação de ácido 2-ceto-L-gulônico substancialmente isento de água a partir de soluções aquosas. EP 0 359 645 refere-se a um processo para obter ácido 2-ceto-L-gulônico puro a partir de um caldo de fermentação contendo o sal de cálcio de ácido 2-ceto-L-gulônico. Referido processo compreende a separação dos insolúveis, concentração do meio, precipitação de sulfato de cálcio por adição de ácido sulfurico concentrado, tratamento com resina de troca de cátions, remoção de íons de ácido forte por trocador de ânions, concentração e separação de ácido 2-ceto-L-gulônico por cristalização. EP 0 805 210 refere-se a um processo em que 2-ceto-L-gulonato de sódio é cristalizado do caldo de fermentação, os cristais obtidos são pulverizados e colocados em suspensão em um álcool inferior contendo um ácido isento de água e fmalmente o sal de 2-ceto-L-gulonato é convertido em um éster de alquila inferior de ácido 2-ceto-L-gulônico.

Existe uma outra necessidade para ter um processo para obter ácido 2-ceto-L-gulônico em altos rendimentos de recuperação em que a etapa de purificação é simples e facilmente reprodutível. A presente invenção provê este processo.

Sumário da invenção A presente invenção descreve um processo para produzir 2-ceto-L-gulonato de sódio por fermentação e recuperação de cristais de monoidrato de ácido 2-ceto-L-gulônico e referido processo compreende as seguintes etapas: a) converter fermentativamente sorbitol em pelo menos 50 g/1 de 2-ceto-L-gulonato de sódio, b) remover os microorganismos do meio de fermentação, assim obtendo um caldo de fermentação reduzido em microorganismo, preferivelmente caldo de fermentação isento de microorganismos, c) converter 2-ceto-L-gulonato de sódio em ácido 2-ceto-L-gulônico no caldo de fermentação reduzido em microorganismo, e remover as proteínas em uma concentração abaixo de 2400 ppm (medida como nitrogênio em substância seca) para obter um caldo de fermentação purificado, e/ou ajustar o pH de caldo de fermentação purificado para evitar a formação de vitamina C em uma concentração maior do que 3% (com base na substância seca) durante a evaporação subseqüente de água, d) evaporar água do caldo de fermentação purificado para obter um caldo de fermentação purificado concentrado, e e) recuperar os cristais de monoidrato de ácido 2-ceto-L-gulônico por cristalização a partir de caldo de fermentação purificado concentrado com um rendimento de recuperação para ácido 2-ceto-L-gulônico de 80% ou maior. A presente invenção ainda refere-se a um processo em que, no referido processo, a conversão em ácido 2-ceto-L-gulônico e a remoção de proteínas é efetuada por tratamento de troca de íons consistindo de resina de troca de cátions.

Além disso, a presente invenção refere-se a um processo compreendendo as seguintes etapas: a) preparar um meio de cultura de fermentação contendo uma fonte de nitrogênio e, como sorbitol como fonte de carbono, b) inocular o meio de cultura de fermentação com microorganismos para converter sorbitol em L-sorbose, c) deixar os microorganismos crescer até pelo menos 100 g/1 de L-sorbose serem obtidos no meio de fermentação, d) terminar a conversão de sorbitol em L-sorbose, e) inocular o meio de cultura de fermentação com uma cultura mista de microorganismos para converter L-sorbose em 2-ceto-L-gulonato de sódio, f) deixar os microorganismos crescer até pelo menos 50 g/1 de 2-ceto-L-gulonato de sódio serem obtidos no meio de fermentação, g) remover os microorganismos do meio de fermentação por filtragem para obter um caldo de fermentação reduzido em microorganismo, preferivelmente caldo de fermentação isento de microorganismos, h) converter com resina de troca de cátions 2-ceto-L-gulonato de sódio em ácido 2-ceto-L-gulônico no caldo de fermentação reduzido em microorganismos, e remover proteínas em uma concentração abaixo de 2000 ppm de proteínas (medida como nitrogênio em substância seca) para obter um caldo de fermentação purificado e/ou ajustar o pH do caldo de fermentação purificado para evitar, durante a evaporação subseqüente de água, a formação de vitamina C em uma concentração maior do que 2,5%, preferivelmente não maior que 1 % (com base em substância seca), i) evaporar água do caldo de fermentação purificado para obter um caldo de fermentação purificado concentrado, e j) recuperar os cristais de monoidrato de ácido 2-ceto-L-gulônico por cristalização do caldo de fermentação purificado concentrado com um rendimento de recuperação para ácido 2-ceto-L-gulônico de 80% e maior. A presente invenção refere-se a um processo em que, na etapa g), a filtração é microfiltração, na etapa h), referido caldo de fermentação purificado compreende não mais que 1800 ppm de proteínas (medido como nitrogênio em substância seca) e o pH ajustado é maior que 1,5 e, na etapa j), o rendimento de recuperação de ácido 2-ceto-L-gulônico é 85% ou maior. A presente invenção ainda refere-se a um processo em que, na etapa b), o microorganismo está pertencendo ao gênero Gluconobacter e, na etapa e), a cultura mista de microorganismo está pertencendo ao gênero Gluconobacter e Bacillus.

A presente invenção especificamente refere-se a um processo em que, na etapa e), o microorganismo é uma cultura mista de Gluconobacter oxydans, preferivelmente Gluconobacter oxydans SCB 329 depositado sob o Tratado de Budapeste em BCCM/LMG (Belgian Coordinated Collections of Micro-organisms/ Bactéria Collection Laboratorium voor Microbiologie Universiteit Gent por Cerestar Holding B.V. Nijverheidsstraat 1, NL-4551 LA

Sas van Gent, Holanda) em 24/04/2001 sob o número LMG P - 20356, e Bacillus thuringiensis, preferivelmente Bacillus thuringiensis (SCB 933) TCV 393 depositado sob o Tratado de Budapeste em BCCM/LMG (Belgian Coordinated Collections of Micro-organisms/ Bactéria Collection Laboratorium voor Microbiologie Universiteit Gent por Cerestar Holding B.V. Nijverheidsstraat 1, NL-4551 LA Sas van Gent, Holanda) em 24/04/2001, sob o número LMG P-20355, e na referida cultura mista, os microorganismos estão presentes no começo do crescimento em uma relação de colônias de Gluconobacter para colônias de Bacillus entre 300:1 e 1:10.

Além disso, a presente invenção refere-se a uma cultura mista de Gluconobacter oxydans, preferivelmente Gluconobacter oxydans SCB 329 depositada em BCCM/LMG em 24/04/2001 sob o número LMG P - 20356, e Bacillus thuringiensis, preferivelmente Bacillus thuringiensis (SCB 933) TCV 393 depositado junto ao BCCM/LMGem 24/04/2001 sob o número LMB P-20355 para produzir ácido 2-ceto-L-gulônico.

Especificamente, a presente invenção refere-se à referida cultura mista de microorganismos em que os microorganismos estão presentes no começo do crescimento em uma relação de colônias de Gluconobacter para colônias de Bacillus de 25:1. A presente invenção refere-se a um Gluconobacter oxydans SCB 329 depositado junto ao BCCM/LMGem 24/04/2001 sob o número LMG P 20356 para produzir ácido 2-ceto-L-gulônico. A presente invenção ainda refere-se a um Bacillus thuringiensis (SCB 933) TCV 393 depositado junto ao BCCM/LMGem 24/04/2001 sob o número LMG P - 20355 para produzir ácido 2-ceto-L-gulônico. A presente invenção ainda refere-se ao uso de microorganismo Gluconobacter oxydans SCB 329 depositado junto ao BCCM/LMGem 24/04/2001 sob o número LMG P- 20356, e microorganismo Bacillus thuringiensis (SCB 933) TCV 393 depositado em BCCM/ LMG em 24/04/2001 sob o número LMG P 20355 para produzir ácido 2-ceto-L-gulônico.

Finalmente, a presente invenção refere-se ao uso em que os referidos microorganismos são aplicados em uma cultura mista para produzir ácido 2-ceto-L-gulônico.

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção descreve um processo para produzir 2-ceto-L-gulonato de sódio por fermentação e recuperação de cristais de monoidrato de ácido 2-ceto-L-gulônico e referido processo compreende as seguintes etapas: a) converter fermentativamente sorbitol em pelo menos 50 g/1 de 2-ceto-L-gulonato de sódio, b) remover os microorganismos do meio de fermentação, assim obtendo um caldo de fermentação reduzido em microorganismos, preferivelmente caldo de fermentação isento de microorganismos, c) converter 2-ceto-L-gulonato de sódio em ácido 2-ceto-L-gulônico no caldo de fermentação reduzido em microorganismo, e remover as proteínas em uma concentração abaixo de 2400 ppm (medida como nitrogênio em substância seca) para obter um caldo de fermentação purificado, e/ou ajustar o pH de caldo de fermentação purificado para evitar a formação de vitamina C em uma concentração maior do que 3% (com base na substância seca) durante a evaporação subseqüente de água, d) evaporar água do caldo de fermentação purificado para obter um caldo de fermentação purificado concentrado, e e) recuperar os cristais de monoidrato de ácido 2-ceto-L-gulônico por cristalização a partir de caldo de fermentação purificado concentrado com um rendimento de recuperação para ácido 2-ceto-L-gulônico de 80% ou maior. A fim de recuperar ácido 2-ceto-L-gulônico do caldo de fermentação, o caldo de fermentação é isentado de microorganismos e o 2-ceto-L-gulonato de sódio produzido é convertido em ácido 2-ceto-L-gulônico no caldo de fermentação isento de microorganismos. O rendimento de recuperação de ácido 2-ceto-L-gulônico depende fortemente da pureza do caldo de fermentação de microorganismos. A fim de obter um rendimento de recuperação de 80% ou mais para o ácido 2-ceto-L-gulônico, a presente invenção demonstra uma etapa de purificação, que compreende ou um de dois tratamentos que podem ser aplicados separadamente ou que podem ser aplicados em seqüência.

Durante a conversão de 2-ceto-L-gulonato de sódio em ácido 2-ceto-L-gulônico, as proteínas residuais são removidas em uma concentração abaixo de 2400 ppm nitrogênio (com base em substância seca e medido com analisador Mitsubishi TN-05). Em segundo lugar, o pH de referido caldo de fermentação isento de microorganismos purificado é ajustado, assim a formação de vitamina C durante a evaporação subseqüente de água é evitada ou sua concentração não é maior do que 4% (com base em substância seca). Conseqüentemente, o alto rendimento de recuperação para ácido 2-ceto-L-gulônico pode ser obtido pela remoção de proteínas e/ou o ajuste do pH do caldo de fermentação purificado.

Por remoção das proteínas residuais a uma concentração abaixo de 2400 ppm no caldo de fermentação purificado, a etapa de cristalização subseqüente é facilitada devido à pureza aumentada do caldo de fermentação purificado, e a viscosidade reduzida deste caldo de fermentação purificado.

Por ajuste do pH de referido caldo de fermentação purificado, a formação de vitamina C é evitada ou sua concentração não é maior do que ^°eo caldo de fermentação purificado concentrado tem uma pureza maior, assim facilitando a cristalização e o aumento do rendimento de recuperação. A aplicação de ambos os tratamentos subseqüentemente, isto é, remoção de proteínas residuais e ajuste do pH do caldo de fermentação purificado tem um efeito cumulativo e o rendimento de recuperação de ácido 2-ceto-L-gulônico é com certeza maior do que 80%. A conversão de 2-ceto-L-gulonato de sódio em ácido 2-ceto-L-gulônico e a remoção de proteína podem ser realizadas por aplicação de um tratamento de troca de íons consistindo de um íon de troca de cátions. O tratamento de troca de íons é simplificado e um trocador de ânions é supérfluo. O efeito positivo do tratamento de purificação sobre o rendimento de recuperação de ácido 2-ceto-L-gulônico é independente do processo de fermentação aplicado. A fermentação pode ser realizada ou em batelada ou continuamente. A fermentação de sorbitol em 2-ceto-L-gulonato de sódio pode ser uma fermentação em uma etapa, por exemplo como descrito em EP 0 518 136, ou a conversão fermentativa pode ser um processo de fermentação contínuo em duas etapas como é descrito em EP 0 972 843.

Especificamente, a presente invenção refere-se a um processo compreendendo as seguintes etapas: a) preparar um meio de cultura de fermentação contendo uma fonte de nitrogênio e, como sorbitol como fonte de carbono, b) inocular o meio de cultura de fermentação com microorganismos para converter sorbitol em L-sorbose, c) deixar os microorganismos crescer até pelo menos 100 g/1 de L-sorbose serem obtidos no meio de fermentação, d) terminar a conversão de sorbitol em L-sorbose, e) inocular o meio de cultura de fermentação com uma cultura mista de microorganismos para converter L-sorbose em 2-ceto-L-gulonato de sódio, f) deixar os microorganismos crescer até pelo menos 50 g/1 de 2-ceto-L-gulonato de sódio serem obtidos no meio de fermentação, g) remover os microorganismos do meio de fermentação por filtragem para obter um caldo de fermentação reduzido em microorganismos, preferivelmente caldo de fermentação isento de microorganismos, h) converter com resina de troca de cátions 2-ceto-L-gulonato de sódio em ácido 2-ceto-L-gulônico no caldo de fermentação reduzido em microorganismos, e remover proteínas em uma concentração abaixo de 2000 PPm de proteínas (medida como nitrogênio em substância seca) para obter um caldo de fermentação purificado e/ou ajustar o pH do caldo de fermentação purificado para evitar, durante a evaporação subseqüente de água, a formação de vitamina C em uma concentração maior do que 2,5%, preferivelmente não maior que 1 % (com base em substância seca), i) evaporar água do caldo de fermentação purificado para obter um caldo de fermentação purificado concentrado, e j) recuperar os cristais de monoidrato de ácido 2-ceto-L-gulônico por cristalização do caldo de fermentação purificado concentrado com um rendimento de recuperação para ácido 2-ceto-L-gulônico de 80% e maior. A produção fermentativa de L-sorbose a partir de D-sorbitol é conhecida e este processo é parte de processo Reichstein bem conhecido. As várias cepas de Gluconobacter são conhecidas como produzindo L-sorbose a partir de D-sorbitol.

Esta fermentação é continuada até pelo menos 100 g/1 de L-sorbose serem obtidos no meio de fermentação. A formulação de L-sorbose é analisada por HPLC (coluna Ca).

Entre as duas etapas de fermentação, o caldo de fermentação pode ser pasteurizado em uma temperatura maior do que 50°C, preferivelmente em uma temperatura maior do que 80°C. A conversão de L-sorbose em ácido 2-ceto-L-gulônico é caracterizada em que uma cultura mista de microorganismos Gluconobacter oxydans e Bacillus thuringiensis é usada, mais preferivelmente uma cultura mista de Gluconobacter oxydans SCB 329 depositada em BCCM/LMG em 24/04/2001 sob o número LMG P - 20356, e Bacillus thuringiensis (SCB 933) TCV 393 depositada em BCCM/ LMG em 24/04/2001 sob o número LMG P - 20355. A relação quantitativa na cultura mista de colônias de Gluconobacter para colônias de Bacillus no começo do crescimento pode estar na faixa entre 300:1 e 1:10, preferivelmente na referida cultura mista, os microorganismos estão presentes no começo do crescimento em uma relação de colônias de Gluconobacter para colônias de Bacillus de 25:1. A produção de ácido 2-ceto-L-gulônico é efetuada por cultivo da cultura de microorganismos mista em um meio contendo L-sorbose assim como nutrientes apropriados. Altemativamente, o processo pode ser realizado por cultivo dos microorganismos mistos, a seguir, levando as células completas ou um extrato isento de células coletado da cultura em contato com L-sorbose. A temperatura de fermentação está entre cerca de 25 °C e 35 °C. O meio de cultura geralmente contém uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, substâncias inorgânicas, vitaminas, elementos de traço, e outros fatores de promoção do crescimento. Várias substâncias orgânicas ou inorgânicas podem ser usadas como fonte de nitrogênio, como extrato de levedura, extrato de carne, peptona, caseína, licor de milho, aminoácidos, nitratos, uréia, sais de amônio e outros. Como substâncias inorgânicas, sulfato de magnésio, sulfato de potássio, cloretos ferrosos e férricos, carbonato de cálcio e outros podem ser usados. O processo de fermentação pode ser realizada em um pH entre 5 e 8, preferivelmente entre cerca de 6 e 8 e, conseqüentemente, ácido 2-ceto-L-gulônico é produzido como seu sal correspondente, preferivelmente sal de sódio.

Os microorganismos são deixados crescer até pelo menos 50 g/1 de 2-ceto-L-gulonato de sódio ser obtido no caldo de fermentação. O processo da presente invenção descreve um processo fermentativo em que os microorganismos são deixados crescer em uma coluna borbulhada ou reator de elevação de ar.

A formação de ácido 2-ceto-L-gulônico é analisada por HLPC (coluna H+).

Os microorganismos são removidos do caldo de fermentação para obter um caldo de fermentação isento de microorganismos. Esta etapa de separação pode ser realizada por filtração, preferivelmente microfíltração.

Além disso, referido processo é caracterizado em que, na etapa h), o caldo de fermentação purificado não está compreendendo mais do que proteínas de 1800 ppm (medido como nitrogênio em substância seca) e o pH ajustado é maior que 1,5, enquanto o rendimento de recuperação de ácido 2-ceto-L-gulônico é 85% ou maior.

Especificamente, o tratamento com resina de troca de cátions pode ser conduzido de modo que o pH do caldo de fermentação purificado não está abaixo de 1,5. Ou o caldo de fermentação reduzido em microorganismos ou o isento de microorganismos é alimentado para a resina de troca de cátions até que o pH do caldo de fermentação purificado permaneça acima de 1,5 ou o tratamento é continuado até o pH está caindo abaixo de 1,5 e, subseqüentemente, o pH é aumentado acima de 1,5 por adição de álcali para o caldo de fermentação purificado. O álcali pode ser qualquer hidróxido de metal alcalino, carbonato de metal alcalino ou bicarbonato e/ou carbonato de metal alcalino-terroso ou bicarbonato, preferivelmente hidróxido de sódio ou hidróxido de potássio.

Em ainda outro método, o pH do caldo de fermentação purificado é ajustado acima de 1,5 por adição de caldo de fermentação bruto reduzido em microorganismos ou isento de microorganismos para o caldo de fermentação purificado. A fim de evitar a adição de "material estranho", o produto em bruto (= caldo de fermentação não purificado isento de microorganismos) é adicionado em uma quantidade de até 10% do volume total do caldo de fermentação purificado para ajustar o pH final acima de 1,5.

Ao ajustar o pH do caldo de fermentação purificado, a formação de vitamina C durante a evaporação de água do caldo de fermentação purificado é completamente evitada ou a tendência para formação de vitamina C é reduzida com pelo menos 40% em comparação com um processo sem ajuste de pH. A concentração de vitamina C não é maior que 3%, preferivelmente não maior que 2,5%, mais preferivelmente não maior que 1% (com base em substância seca). A redução da concentração de proteínas residuais no caldo de fermentação purificado abaixo de 2400 ppm, preferivelmente abaixo de 2000 ppm, mais preferivelmente abaixo de 1800 ppm, pode ser obtida por operação da purificação com a resina de troca de cátions de modo que a capacidade da resina é controlada pela quantidade de nitrogênio ligado e, em uma menor extensão, pelos íons sódio ligados. Este método provê que um aumento de nitrogênio súbito somente inicia no final da purificação. Todo o nitrogênio ligado à coluna irá permanecer em uma banda bastante estreita na coluna e a quantidade residual de proteínas no caldo de fermentação purificado está abaixo de 2400 ppm (medido como nitrogênio total em substância seca com analisador Mitsubishi TN-05). O controle da capacidade da resina de troca de cátions pelos íons de sódio ligado irá aumentar o volume do caldo de fermentação purificado, mas a pureza com relação às proteínas residuais será menor, conseqüentemente, o último método resulta em um menor rendimento de recuperação dos cristais de monoidrato de ácido 2-ceto-L-gulônico.

Ao aplicar o tratamento da presente invenção, elevados rendimentos de recuperação de ácido 2-ceto-L-gulônico podem ser obtidos, maiores do que 80%, preferivelmente pelo menos 85%. A presente invenção ainda refere-se a uma cultura mista de Gluconobacter oxydans, preferivelmente Gluconobacter oxydans SCB 329 depositado junto ao BCCM/LMGem 24/04/2001 sob o número LMG P -20356, e Bacillus thuringiensis, preferivelmente Bacillus thuringiensis (SCB 933) TCV 393 depositado junto ao BCCM/LMGem 24/04/2001 sob o número LMG P 20355 para produzir ácido 2-ceto-L-gulônico.

Além disso, na referida cultura mista, os microorganismos estão presentes no começo do crescimento em uma relação de colônias de Gluconobacter para colônias de Bacillus de 25:1. A presente invenção refere-se a Gluconobacter oxydans SCB 329 depositado em BCCM/LMG em 24/04/2001 sob o número LMG P -20356 para produzir ácido 2-ceto-L-gulônico. A presente invenção ainda refere-se a Bacillus thuringiensis (SCB 933) TCV 393 depositado junto ao BCCM/LMGem 24/04/2001 sob o número LMG P -20355 para produzir ácido 2-ceto-L-gulônico. A presente invenção ainda refere-se ao uso de microorganismo Gluconobacter oxydans SCB 329 depositado junto ao BCCM/LMGem 24/04/2001 sob o número LMG P -20356, e microorganismo Bacillus thuringiensis (SCB 933) TCV 393 depositado junto ao BCCM/LMGem 24/04/2001 sob o número LMG P -20355 para produzir ácido 2-ceto-L-gulônico.

Finalmente, a presente invenção refere-se ao uso em que os referidos microorganismos são aplicados em uma cultura mista para produzir ácido 2-ceto-L-gulônico. A presente invenção tem as seguintes vantagens: - elevados rendimentos de recuperação de ácido 2-ceto-L-gulônico podem ser obtidos mesmo realizando a fermentação em ausência de íons cálcio, assim resultando em um processo isento de gesso. - os microorganismos são completamente removidos por microfiltração, - os rendimentos de elevada recuperação são obteníveis por um tratamento de resina de troca de cátions único que permite a conversão completa de 2-ceto-L-gulonato de sódio em ácido 2-ceto-L-gulônico e remoção de proteínas residuais e/ou o pH do caldo de fermentação purificado é ajustado para evitar a formação subseqüente de vitamina C, - o tratamento de troca de íons é simplificado porque o tratamento com trocador de ânions é supérfluo, - a pureza obtida de referido caldo de fermentação purificado permite a cristalização direta de monoidrato de ácido 2-ceto-L-gulônico de meio aquoso, com um elevado rendimento de recuperação de 80% ou maior de ácido 2-ceto-L-gulônico, - o processo é completamente isento do uso de qualquer solvente orgânico, - a pureza de cristais de monoidrato de ácido 2-ceto-L-gulônico é de, pelo menos, 99,5%, - o monoidrato de ácido 2-ceto-L-gulônico pode ser diretamente empregado para a conversão em vitamina C. A presente invenção é ilustrada a título dos seguintes exemplos.

Exemplo 1 descreve a fermentação de D-sorbitol em L- sorbose.

Exemplo 2 descreve a segunda parte da fermentação, isto é conversão de L-sorbose em 2-ceto-L-gulonato de sódio.

Exemplo 3 descreve o tratamento de resina de troca de cátions em que o teor de proteínas residuais é levado abaixo de 2400 ppm de nitrogênio (medido com analisador Mitsubishi TN-05) seguido pela cristalização direta.

Exemplo 4 descreve o tratamento com resina de troca de cátions e o ajuste de pH acima de 1,5 por adição de caldo de fermentação bruto isento de microorganismos, para evitar a formação de vitamina C.

Exemplo 5 descreve o ajuste de pH por adição de NaOH.

Exemplos 6 e 7 são exemplos comparativos demonstrando que o rendimento de recuperação é menor quando o teor de proteínas residuais está acima de 2400 ppm, e a formação de vitamina C quando o pH do eluente não é ajustado, respectivamente.

Exemplos Exemplo 1 - Fermentação de D-sorbitol em L-sorbose Gluconobacter oxydans NRRL B72 foi cultivado a 28 °C durante 2 dias em um frasco Roux contendo 75 ml de um meio composto de 50 g/1 de D-sorbitol (Cerestar C&16122), 3,75 g/1 (ds) de licor de milho, 0,45 g/1 (NH4)2S04, 0,11 g/1 (NH4)2HP04, 0,08 g/1 MgS04. 7H20, 1,0 g/1 monoidrato de acetato de cálcio, e 20 g/1 de ágar. O pH foi ajustado a 5,0 com ácido acético concentrado antes da esterilização.

As células foram recuperadas em 50 ml de uma solução NaCl 0,9% e inoculadas em um fermentador de 2 1 contendo 1,35 1 de um meio de cultura composto de 100 g/1 de D-sorbitol (Cerestar C#16122), 3,75 g/1 (ds) de licor de milho, 0,45 g/1 (NH4)2S04, 0,11 g/1 (NH4)2HP04, 0,08 g/1 MgS04. 7H20, 1,0 g/1 monoidrato de acetato de cálcio, e 100 ppm de anti-espumante.

Após 24 h de cultivo a 32 °C, 1,0 WM e 700 RPM, 300 ml de cultura foram inoculados em um fermentador de 20L contendo 13,7 1 de um meio composto de 230 g/1 de D-sorbitol (Cerestar CAri6122), 5,25 g/1 (ds) de licor de milho, 0,45 g/1 (NH4)2S04, 0,11 g/1 (NRO.HPO,, 0,08 g/1 MgS04. 7Η2Ο, 1,0 g/1 monoidrato de acetato de cálcio, e 100 ppm de anti-espumante. Após esterilização, 0 pH foi ajustado a 5,0 - 5,2 por uso de 40% (p/v) de hidróxido de sódio. A fermentação foi continuada a 35 °C e 0,5 WM até consumo total de sorbitol inicial. O pC>2 foi controlado a 50% por variação de RPM (durante a fase de conversão máxima), no entanto, o p02 cai abaixo de 50%). Vinte e uma horas foram necessárias para converter o sorbitol inicial, com um rendimento em peso de 96%. No final para conversão de sorbitol para L-sorbose, um tratamento de pasteurização foi aplicado para inativar a biomassa (60°C durante 2 h).

Exemplo 2 - Fermentação de L-sorbose em 2-ceto-L-gulonato de sódio Gluconobacter oxydans SCB 329 depositado junto ao BCCM/LMGem 24/04/2001 sob o número LMG P - 20356 foi cultivado em um frasco Roux contendo 75 ml de um meio composto de 10,0 g/1 L-sorbose cristalino, 2,0 g/1 glucose cristalina, 5,0 g/1 extrato de levedura, 5,0 g/1 peptona de arroz, 0,5 g/1 KH2P04, 0,2 g/1 MgS04.7H20, 20 g/1 MOPS (ácido 3 -N-morfolino-propanossulfônico) e 20 g/1 ágar. O valor do pH do meio foi ajustado a 7,5 antes da esterilização. Após 24 h de cultivo a 28 °C, Bacillus thuringiensis (SCB 933) TCV 393 depositado junto ao BCCM/LMGem 24/04/2001 sob o número LMG P - 20355 foi inoculado no mesmo frasco fazendo 2 batidas longitudinais. A incubação foi continuada durante 24 h a 28°C.

Uma relação de Gluconobacter oxydans para Bacillus thuringiensis de 25 a 1 foi obtida.

Gluconobacter oxydans e Bacillus thuringiensis foram recuperados em 50 ml de uma solução NaCl e inoculados em um frasco tamponado contendo 0,7 1 de um meio de cultura composto de 15,0 g/1 L-sorbose cristalina, 2,0 g/Ί glucose, 1,5 g/1 (ds) de licor de milho, 5,0 g/1 de extrato de levedura, 5,0 g/1 de peptona de arroz, 4,0 g/1 uréia, 5,0 g/1 KH2P04, 0,2 g/1 MgS04. 7H2O e 4,0 g/1 de carbonato de cálcio. L-sorbose e glucose foram esterilizados separadamente. O valor de pH das proteínas e mistura de sais foi ajustado antes da esterilização para obter 6,8 após a esterilização. A cultura de semente (1) foi incubada a 28 °C com 150 RPM de agitação transversal durante 24 h. 28 ml de cultura de semente foram transferidos para um fermentador de 2 1 contendo 1,4 1 de mesmo meio como descrito acima, mais 0,3 g/1 de antiespumante à base de silício. O fermentador foi fixado a 28°C, 0,7 WM e 850 rpm durante 14 h para obter a cultura de semente 2. 140 ml desta cultura de semente 2 foram inoculados em um segundo fermentador de 2 1 contendo 1,26 ml de um meio composto de 30 g/1 de sorbitol, 2,0 g/1 de glucose, 14,0 g/1 (ds) licor de milho, 5,0 g/1 de extrato de levedura,0,5 g/1 KH2PO4, 0,1 g/1 MgS04, 0,2 g/1 de antiespumante à base de silício, a pH 6,8 (ajustado por adição de hidróxido de sódio após esterilização). Esta cultura de semente 3 foi cultivada a 28 °C, 0,7 WM, 850 rpm durante 14 h. O pH foi mantido a 6,8 por adição de hidróxido de sódio.

Após 14 h de cultura, 84 ml de cultura de semente 3 foram transferidos para um fermentador de 2 1 contendo 1,316 ml do mesmo meio, como usado na cultura de semente 3, exceto que a concentração de extrato de levedura foi aumentada até 10,0 g/1. Os parâmetros de cultivo foram também idênticos à cultura de semente 3, e a cultura de semente 4 foi obtida. 0,7 1 de cultura de semente 4 foi inoculado em um fermentador de produção de 20 1 contendo 10,5 1 de um meio composto de 890 g de sorbose pasteurizada (obtida no exemplo 1), 168 g (ds) de licor de milho, 3,1 g de extrato de levedura, 7,0 g KH2P04, 1,4 g MgS04. 7H20 e 4,2 g de antiespumante à base de silício. L-sorbose foi adicionada em um modo estéril as proteínas estéreis e mistura de sais. O valor do pH do meio foi ajustado a 7,0 antes da inoculação. A aeração foi mantida a 0,5 WM e p02 controlado a 40 ^ por variação de rpm. O pH foi mantido a 7,0 por adição de hidróxido de sódio. A formação de espuma foi controlada usando uma solução a 10% de antiespumante à base de silício. Após 12 h de fermentação, 580 g de L-sorbose pasteurizado foram adicionados em um modo estéril. Trinta e seis horas foram necessárias para alcançar uma concentração de L-sorbose residual menor do que 1 g/1 e 96% (rendimento em peso) de ácido 2-ceto-L-gulônico foram obtidos.

Exemplo 3 - Purificação com resina de troca de cátions - cristalização 1) tratamento de troca de cátions 41,2 kg de caldo de fermentação isento de microorganismos (= filtrado de microfiltração) a 12,4% d.s. foram passados sobre uma coluna contendo 17 1 de resina de troca de cátions forte (Lewatit® S2528). 50,3 kg de caldo de fermentação isento de microorganismos purificados a 8,8% d.s. foram obtidos.

Esta solução foi analisada para teor em N em um analisador Mitsubishi TN-05.

Os resultados obtidos são mostrados na tabela 1.

Tabela 1 2) Cristalização 39,1 kg de caldo de fermentação purificado isento de microorganismos foram concentrados em pressão reduzida em uma concentração de 62,5% d.s. 5,5 kg deste licor concentrado foram transferidos para um cristalizador de resfriamento em batelada. O programa de resfriamento foi o seguinte: em 1 h de 60°C a 50°C, subseqüentemente em 3 h de 50°C a 25°C.

No final do ciclo de resfriamento, a massecuite foi quantitativamente transferida para uma centrífuga de laboratório em batelada operando a 1750 g-força e 1705 g de cristais de monoidrato de ácido 2-ceto- L-gulônico foram recuperados com uma pureza de 99,2% e teor de umidade total de 10%. O licor mãe restante tendo uma pureza de 68% foi concentrado a 71% d.s. 2665 g de licor concentrado foram transferidos para um cristalizador de resfriamento e o mesmo perfil de temperatura como para a primeira cristalização foi aplicado. A centrifugação da massecuite resultou em mais 990 g de cristais com uma pureza de 98,9% e um teor de umidade de 11%.

Uma recuperação total de 85% de ácido 2-ceto-L-gulônico foi obtida.

Exemplo 4 - Ajuste do pH por adição de caldo de fermentação bruto isento de microorganismos 47 kg de filtrado de microfiltração (pH = 1,5, d.s. = 8%) com um teor de vitamina C de 0,54% (com base em d.s.) foram misturados com 5 1 de caldo de fermentação bruto isento de microorganismos (não purificado) (pH = 5,3 d.s. = 11,2%, vitamina C = 0,44% em d.s.). A mistura obtida tinha um pH de 1,83, o teor de vitamina C foi de 0,53% (com base em ds) e a substância seca total foi de 8,7%.

Esta mistura foi concentrada em uma panela a vácuo de 20 1 pequena, a um volume final de 6,3 kg a uma substância seca de 60,8%. A temperatura do licor durante a concentração foi em tomo de 50°C e para o final da temperatura aumentou a 60°C - 65°C.

No final da etapa de concentração, o teor de vitamina C final foi 0,97% (com base na substância seca).

Este licor concentrado foi transferido para um cristalizador de resfriamento que foi operado com o seguinte perfil de temperatura: mantendo a temperatura a 60°C durante 3 h, resinando de 60°C a 45°C em 2 horas e em 12 horas de 45°C a 10°C.

No final do ciclo de cristalização, o caldo de fermentação purificado concentrado, isento de microorganismos, tinha um teor de vitamina C de 2,37% com base em substância seca.

Exemplo 5 - com aiuste de pH nor adição de NaOfí: A 31900 g de filtrado de microfiltração (pH = 1,27, ds = 12,8%), 150 g de solução de NaOH a 31% foram adicionados. O pH aumentou a 1,35. Foi então concentrado em um evaporador rotativo sob vácuo a 7000 g a 60% ds. A temperatura do licor durante a evaporação foi em tomo de 50°C e aumentou para o final a 60°C - 65 °C. O teor de vitamina C no final da evaporação foi de 2,6% em ds.

Este licor foi transferido para um cristalizador de resfriamento quando 1 g de semente foi adicionado e operado como a seguir: mantendo-se a 60°C durante 3 h para reduzir a super-saturação, resinando de 60°C a 45 °C em 2 h e de 45 °C a 10°C em 12 horas. A massecuite foi centrifugada e 1950 g de cristais de ácido 2-ceto-L-gulônico a 10,5% de umidade com pureza de 99,8% foram obtidos.

Os licores-mãe residuais foram concentrados e cristalizados como acima em duas outras etapas consecutivas levando a respectivamente 610 g a 9,9% de umidade e 99,3% de pureza e 477 g cristais a 10,7% de umidade e 96,5% de pureza de ácido 2-ceto-L-gulônico.

Isto resultou em um rendimento de recuperação total de 85,3%.

Exemplo 6 - (Comparativo) - Resina de troca de cátions - Cristalização 1) Tratamento de troca de cátions - Teor de N não abaixo de 2400 rpm (em d.s.) 47,8 kg de filtrado de microfiltração (= equivalente a 2,7 volumes de leito) foram passados sobre 171 de resina de troca de cátions forte (Lewatit S2528). 57,7 kg de caldo de fermentação purificado isento de microorganismos a 8,9% ds foram obtidos com um teor de N de 2400 ppm em d.s. (medido com analisador Mitsubishi TN-05).

Os resultados obtidos são mostrados na tabela 2.

Tabela 2 i 2) Cristalização 39,1 g de caldo de fermentação purificado isento de microorganismos foram concentrados a pressão reduzida a 62,5 % d.s. 5.5 kg deste licor concentrado foram transferidos para um cristalizador de restriamento em batelada. O seguinte prourama de resfriamento foi usado: de 60°C a 50°C em 1 h. de 50°C a 25 °C em 3 horas.

No final do ciclo de resfriamento, a massecuite foi quantitativamente transferida para uma centrífuga de laboratório em batelada operando a 1750 g-força e 1690 g de cristais foram recuperados como monoidrato de ácido 2-ceto-L-gulônico a uma pureza de 99,2% e teor de umidade total de 10%. O licor-mãe restante tinha uma pureza de 67,5% e concentrado a 71% d.s. 2700 g de licor concentrado foram transferidos para um cristalizador de resfriamento e o mesmo perfil de temperatura como para a primeira cristalização foi aplicado. A centrifugação desta massecuite ofereceu dificuldade na separação do licor-mãe dos cristais. Devido ao maior teor de proteína, a viscosidade da suspensão foi aumentada. Assim, a suspensão precisou ser diluída para ser capaz de recuperar os cristais. A centrifugação da massecuite diluída resultou em 820 g de cristais e uma pureza de 98,9% e um teor de umidade de 11 %.

Uma recuperação global de 79% para ácido 2-ceto-L-gulônico foi obtida.

Exemplo 7 - sem ajuste do pH 31900 g de filtrado de microfiltração (pH = 1,27, ds = 12,8%) com um teor de vitamina C de 1,68% em ds foram concentrados em um evaporador rotativo sob vácuo a 7000 g a 57,5% d.s. A temperatura do licor durante a evaporação foi em tomo de 50°C e aumentou para o final a 60°C -65 °C. O teor de vitamina C no final de evaporação foi de 3,1 % em ds. Este licor foi transferido para um cristalizador de resfriamento onde 1 g de semente foi adicionado e operado como a seguir: mantendo a 60°C durante 3 h para reduzir a super-saturação, resinando de 60°C a 45 °C em 2 h e de 45 °C a 10°C em 12 horas. A massecuite foi centrifugada e o licor-mãe foi também analisado para vitamina C; o teor foi de 5,9% em ds. 1740 g de cristais de ácido 2-ceto-L-gulônico a 10,6% de umidade e pureza de 99,8% foram recuperados.

Os licores-mãe residuais foram concentrados e cristalizados como acima em duas outras etapas consecutivas levando a uma massa de cristal de respectivamente 714 g de cristais a 9,8% de umidade e pureza de 99,3% e 355 g de cristais a 10% de umidade e 97,7% de pureza.

Isto resultou em um rendimento de recuperação total de 79%. O teor de vitamina C do licor-mãe final foi 14% em ds.

BELGIAN COORDINATED COLLECTIONS OF MICRO-ORGANISMS - BCCM LMG COLLECTION Página 1 do formulário BCCM/LMG/BP/4/ 01-89 - Recebimento no caso de um depósito original Tratado de Budapeste para o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para os Fins de Procedimentos de Patente Recebimento no caso de um depósito original expedido de acordo com a Regra 7.1 pela Autoridade Depositária Internacional BCCM/LMG identificada no final da próxima página Formulário Internacional BCCM / LMG / BP / 4 / 01-89 Para: Nome do Depositante: CERESTAR HOLDING B.V.

Endereço: Nijverheidsstraat 1 NL - 4551 LA Sas van Gent Holanda I. Identificação do microorganismo 1.1. - Referência de identificação dada pelo depositante: I. 2 - Número de acesso dado pela Autoridade Depositária Internacional BELGIAN COORDINATED COLLECTIONS OF MICRO-ORGANISMS - BCCM LMG COLLECTION Página 2 do formulário BCCM/LMG/BP/4/ 01-89 - Recebimento no caso de um depósito original II. Descrição científica e/ou designação taxonômica proposta O microorganismo identificado sob I acima foi acompanhado por: (marcar com uma cruz a caixa(s) aplicável (eis): □ uma descrição científica GD uma designação taxonômica proposta III. Recebimento e aceitação Esta Autoridade Depositária Internacional aceita o microorganismo identificado sob I acima, que foi recebido pela mesma (data do depósito original): 24 de abril de 2001 IV. Autoridade Depositária Internacional Belgian Coordinated Collections of Micro-organisms (BCCM) Laboratorium voor Microbiologie - Bacterlenverzameling (LMG) Universiteit Gent K.L. Ledeganckstraat 35 B-9000 Gent, Bélgica Assinatura(s) de pessoa(s) com poderes para representar a Autoridade Depositária Internacional ou funcionário(s) autorizado(s): Dr. D. Janssens, curador EDA Data: 21 de maio de 2001 BELGIAN COORDINATED COLLECTIONS OF MICRO-ORGANISMS - BCCM LMG COLLECTION Página 1 do formulário BCCM/LMG/BP/9/ 01-89 - Declaração de Viabilidade Tratado de Budapeste para o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para os Fins de Procedimentos de Patente Declaração de Viabilidade expedida de acordo com a Regra 10.2 pela Autoridade Depositária Internacional BCCM/LMG identificada na seguinte página Internacional - Formulário BCCM/LMG/BP/9/ 01 -89 Para : Parte à qual a declaração de viabilidade é expedida: Nome : JC de Troostembergh Endereço : CERESTAR França Havenstraat 84 B-1800 Vilvoorde I. Depositante: 1.1 Nome : CERESTAR HOLDING B.V. 1.2 Endereço : Nijverheidsstraat 1 NL - 4551 LA Sas van Gent II. Identificação do microorganismo II. 1 Número de acesso dado pela Autoridade Depositária Internacional: 11*2 Data do depósito original (ou quando foi feito um novo depósito ou transferência, a dada relevante mais recente): 24 de abril de 2001 III. Declaração de Viabilidade A viabilidade do microorganismo identificado sob II acima foi testada em 2 de maio de 2001 (Colocar a data. Nos casos com referência à Regra 10.2 (a)(ii) e (iii), fazer referência ao teste de viabilidade mais recente).

Nesta data, o referido microorganismo estava: (marcar a caixa aplicável com uma cruz): Ξ viável □ não mais viável BELGIAN COORDINATED COLLECTIONS OF MICRO-ORGANISMS - BCCM LMG COLLECTION Página 2 do formulário BCCM/LMG/BP/9/ 01-89 - Declaração de Viabilidade IV. Condições sob as quais o teste de viabilidade foi realizado: (Preencher se a informação for solicitada e se os resultados do teste derem negativo). V. Autoridade Depositária Internacional Belgian Coordinated Collections of Micro-organisms (BCCM) Laboratorium voor Microbiologie - Bacterienverzameling (LMG) Universiteit Gent K.L. Ledeganckstraat 35 B - 9000 Gent, Bélgica Assinatura(s) de pessoa(s) com poderes para representar a Autoridade Depositária Internacional ou íuncionário(s) autorizado(s): Dr. D. Janssens, curador EDA Data : 21 de maio de 2001 BELGIAN COORDINATED COLLECTIONS OF MICRO-ORGANISMS - BCCM LMG COLLECTION Página 1 do formulário BCCM/LMG/BP/4/ 01-88 - Recebimento no caso de um depósito original Tratado de Budapeste para o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para os Fins de Procedimentos de Patente Recebimento no caso de um depósito original expedido de acordo com a Regra 7.1 pela Autoridade Depositária Internacional BCCM/LMG identificado no final da próxima página Formulário Internacional BCCM / LMG / BP / 4 / 01-88 Para Nome do Depositante: CERESTAR HOLDING B.V.

Endereço Nijverheidsstraat 1 NL - 4551 LA Sas van Gent Holanda I. Identificação do microorganismo I I· - Referência de identificação dada pelo depositante: I. 2 - Número de acesso dado pela Autoridade Depositária Internacional BELGIAN COORDINATED COLLECTIONS OF MICRO-ORGANISMS - BCCM LMG

COLLECTION Página 2 do formulário BCCM/LMG/BP/4/ 01-88 - Recebimento no caso de um depósito _______________________________ original II. Descrição científica e/ou designação taxonômica proposta O microorganismo identificado sob I acima foi acompanhado por: (marcar com uma cruz a caixa(s) aplicável (eis): m uma descrição científica Ξ uma designação taxonômica proposta III. Recebimento e aceitação Esta Autoridade Depositária Internacional aceita o microorganismo identificado sob I acima, que foi recebido pela mesma (data do depósito original): 24 de abril de 2001 IV. Autoridade Depositária Internacional Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM) Laboratorium voor Microbiologie - Bacterlenverzameling (LMG) Universiteit Gent K.L. Ledeganckstraat 35 B-9000 Gent, Bélgica Assinatura(s) de pessoa(s) com poderes para representar a Autoridade Depositária Internacional ou funcionário(s) autorizado(s): Data: 21 de maio de 2001 BELGIAN COORDINATED COLLECTIONS OF MICRO-ORGANISMS - BCCM LMG

COLLECTION Página 1 do formulário BCCM/LMG/BP/9/ 01-88 - Declaração de Viabilidade Tratado de Budapeste para o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para os Fins de Procedimentos de Patente Declaração de Viabilidade expedida de acordo com a Regra 10.2 pela Autoridade Depositária Internacional BCCM/LMG identificada na seguinte página Internacional - Formulário BCCM/LMG/BP/9/ 01 -88 Para : Parte à qual a declaração de viabilidade é expedida: Nome : JC de Troostembergh Endereço : CERESTAR França Havenstraat 84 B-1800 Vilvoorde I. Depositante: I.INome CERESTAR HOLDING B.V. I. 2 Endereço : Nijverheidsstraat 1 NL - 4551 LA Sas van Gent II. Identificação do microorganismo II. 1 Número de acesso dado pela Autoridade Depositária Internacional: IF2 Data do depósito original (ou quando foi feito um novo depósito ou transferência, a dada relevante mais recente): 24 de abril de 2001 III. Declaração de Viabilidade A viabilidade do microorganismo identificado sob II acima foi testada em 2 de maio de 2001 (Colocar a data. No casos com referência Regra 10.2 (a)(ii) e (iii), fazer referência ao teste de viabilidade mais recente).

Nesta data, o referido microorganismo estava: (marcar a caixa aplicável com uma cruz): Ξ viável □ não mais viável BELGIAN COORDINATED COLLECTIONS OF MICRO-ORGANISMS - BCCM LMG COLLECTION Página 2 do formulário BCCM/LMG/BP/9/ 01-88 - Declaração de Viabilidade IV. Condições sob as quais o teste de viabilidade foi realizado: (Preencher se a informação for solicitada e se os resultados do teste derem negativo). V. Autoridade Depositária Internacional Belgian Coordinated Collections of Micro-organisms (BCCM) Laboratorium voor Microbiologie - Bacterienverzameling (LMG) Universiteit Gent K.L. Ledeganckstraat 35 B - 9000 Gent, Bélgica Assinatura(s) de pessoa(s) com poderes para representar a Autoridade Depositária Internacional ou funcionário(s) autorizado(s): Dr. D. Janssens, curador IDA

Data: 21 de maio de 2001 REIVINDICAÇÕES E Processo para produzir 2-ceto-L-gulonato de sódio por fermentação e recuperar cristais de monoidrato de ácido 2-ceto-L-gulônico, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: a) converter fermentativamente sorbitol em pelo menos 50 g/1 de 2-ceto-L-gulonato de sódio, b) remover os microorganismos do meio de fermentação, assim obtendo um caldo de fermentação reduzido em microorganismos, preferivelmente um caldo de fermentação isento de microorganismos, c) converter 2-ceto-L-gulonato de sódio em ácido 2-ceto-L-gulônico no caldo de fermentação reduzido em microorganismos, e remover as proteínas em uma concentração abaixo de 2400 ppm (medida como nitrogênio em substância seca) para obter um caldo de fermentação purificado, e/ou ajustar o pH de caldo de fermentação purificado para evitar a formação de vitamina C em uma concentração maior do que 3% (com base na substância seca) durante a evaporação subseqüente de água, d) evaporar água do caldo de fermentação purificado para obter um caldo de fermentação purificado concentrado, e e) recuperar os cristais de monoidrato de ácido 2-ceto-L-gulônico por cristalização a partir de caldo de fermentação purificado concentrado com um rendimento de recuperação para ácido 2-ceto-L-gulônico de 80% ou maior.

Claims

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, na etapa c) do referido processo, a conversão em ácido 2-ceto-L-gulônico e a remoção de proteínas são obtidas por tratamento de troca de íons consistindo de uma resina de troca de cátions.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: a) preparar um meio de cultura de fermentação contendo uma fonte de nitrogênio e, como sorbitol como fonte de carbono, b) inocular o meio de cultura de fermentação com microorganismos para converter sorbitol em L-sorbose, c) deixar os microorganismos crescer até pelo menos 100 g/1 de L-sorbose serem obtidos no meio de fermentação, d) terminar a conversão de sorbitol em L-sorbose, e) inocular o meio de cultura de fermentação com microorganismos para converter L-sorbose em 2-ceto-L-gulonato de sódio, f) deixar os microorganismos crescer até pelo menos 50 g/1 de 2-ceto-L-gulonato de sódio serem obtidos no meio de fermentação, g) remover os microorganismos do meio de fermentação por filtragem para obter um caldo de fermentação reduzido em microorganismos, preferivelmente caldo de fermentação isento de microorganismos, h) converter com resina de troca de cátions 2-ceto-L-gulonato de sódio em ácido 2-ceto-L-gulônico no caldo de fermentação reduzido em microorganismos, e remover proteínas em uma concentração abaixo de 2000 ppm de proteínas (medida como nitrogênio em substância seca) para obter um caldo de fermentação purificado e ajustar o pH do caldo de fermentação purificado para evitar a formação de vitamina C em uma concentração maior do que 2,5% (com base em substância seca), preferivelmente não maior do que 1% (com base em substância seca) durante a subseqüente evaporação de água, i) evaporar água do caldo de fermentação purificado para obter um caldo de fermentação purificado concentrado, e j) recuperar os cristais de monoidrato de ácido 2-ceto-L-gulônico por cristalização do caldo de fermentação purificado concentrado com um rendimento de recuperação para ácido 2-ceto-L-gulônico de 80% e maior.
4. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que, na etapa g), a filtração é microfiltração, na etapa h), referido caldo de fermentação purificado compreende não mais que 1800 ppm de proteínas (medido como nitrogênio em substância seca) e o pH ajustado é maior do que 1,5 e, na etapa j), o rendimento de recuperação de ácido 2-ceto-L-gulônico é 85% ou maior.
5. Processo de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que na etapa e), o microorganismo é uma cultura mista de Gluconobacter oxydans, preferivelmente Gluconobacter oxydans SCB 329 depositado junto ao BCCM/LMG em 24/04/2001 sob o número LMG P - 20356, e Bacillus thuringiensis, preferivelmente Bacillus thuringiensis (SCB 933) TCV 393 depositado junto ao BCCM/LMG em 24/04/2001, sob o número LMG P-20355, e na referida cultura mista, os microorganismos estão presentes no começo do crescimento em uma relação de colônias de Gluconobacter para colônias de Bacillus entre 300:1 e 1:10.