BG61705B1

BG61705B1 - Метод и състав за определяне имунната активност на биологичноактивни вещества

Info

Publication number: BG61705B1
Application number: BG98720A
Authority: BG
Inventors: Anna Inglot; Zofia Blach-Olszewska
Original assignee: Torf Et
Priority date: 1991-10-26
Filing date: 1994-04-14
Publication date: 1998-03-31
Also published as: NO941444D0; SK44094A3; DE69220078D1; HU9401185D0; FI941920A7; US5543300A; LV12140A; DK0609255T3; GR930300100T1; ES2061424T1; SG72665A1; DE609255T1; FI941920A0; HK1002610A1; AU2650992A; WO1993008470A1; AU678343B2; EP0539610A1; GR3024457T3; ATE153763T1

Description

Настоящото изобретение се отнася до метод състав за тестване на някои биологично активни субстанции определяне на тяхната имунологична активност по отношение на способността им

Да ин дух. тир ат продуцирането на ци т ок и н и . Ци т ок и н и т е, к ат о (IFN) туморонекротизпращи фактори (TNF) са хормоноподобни

протеини, които играят важна ропя в почти процеси, всички имунни отговорни за поддържане на хомеостазата.Продуцирането на такива цитокини може да бъде индуктирано от определени субстанции, които благодарение на тяхната биологична и имунологична активност са приложими за терапия с нея заболявания тестване на имуннат на имунна а активност субстанции.Предмет на такъв метод

Методът съгласно дали изпитваната продуцирането на ефективна проверка недостатъчност методи за точно изобретението е свързани и лесно биологично създаването изобретението позволява субстанция е в състояние различни цитокини, както на свойствата на дадените да се активни на един определи да индуктира и бързата и субстанции, а именно имунната им активност на всеки етап от тяхното продуциране, разделяне, пречистване и формиране на окончателния състав. Настоящото изобретение осигурява също състав и китове за осъществянате на посочения метод.

Използваните до сега тестове за определяне на имунната активност са многобройни, но трудни за осъществяване. Когато се изпитва клинично нов терапевтичен състав с имунологичен ефект, неговата ефективност се оценява чрез установяване на множество добре известни и аналитично определими свойства на имунните системи чрез прилагане на стандартни методи. След като вече активността на състава е доказана, се налага провеждането на индивидуални състоянието на пациента по отношение на неговата /или нейната/ имунна реакци я ъ клиничните изследвания оценяването на нивата на IFN серума може да се окаже трудно, неточно заблуждаващо

Инт ерферони т е често се произвеждат локално в различни тъкани, живеят кратко, тяхното действие се ограничава в непосредствена близост и те са здраво свързани

клетъчните рецептори и протеините-носители.

□т др уг а т рана, технологичните процеси за производство, пречистване активни субстанции, като и/или отделяне на имунологично например торфени екстракти, са обикновено многостепенни процеси, при които винаги има нужда от създаване на надежден и бърз тест, позволяващ пълен контрол на често имат екстракти , имунната субстанции производството. Освен това, тъй като субстанциите комплексно естество, както е в случая с торфените активност и

Също е необходимо т естване, на отделните фракции на такива да се намери микроскопски тъй като анализираните продукти са много

Следните четири основни находки позволяват да метод за скъпи се решат поставените проблеми:

1.Някои имуноактивни торфени екстракти индуктират продуцирането на цитокини като интерферони и туморонеиротизиращи фактори в in vitro култури от периферни кръвни левкоцити (PBL), като индукцията зависи от дозата.

2.Бета—интерферона /и алфа-туморонекротизиращия фактор/ се продуцират в значително по-големи количества от BALB/c миши перитонеапни кпетки-гостоприемници (RPC), когато са третирани с имуноактивни торфени екстракти в сравнение със спонтанното отделяне на тези цитокини при нетретирани проби.

3.Някои торфени екстракти при тестване in vitro показват синергичен ефект в комбинация с известни имуномодулатори, като селено-органични съединения, р хлорфенипамид на 3-метил-5—бензоламино-изотиазол-4карбоксилна киселина и индометацин. Това позволява използването на много по-малки количества от имунологична активните субстанции за показване на тяхната активност.

4.FBL от здрави доброволци, третирани с ТТР /известен торфен дериват/, вземан през устата в дневна доза от 5«^, тествани за индукция на цитокините апфа-интерферон, гама интерферсн алфа-туморонекротизиращ фактор, губят

способността

ЦИТОКИНИ през да реагират на ТТР разтвора след устат а приблизително

Методът култури от с продуциране на продължително непрекъснато приемане на ТТР си възвръщат тази способност след две седмици прекъсване съгласно изобретението включва третиране на човешки суспензия от субстанция с след което /РРС/ цел да тези периферни кръвни левкоцити /PBL/ или с разтвор от подлежащата на тестване се индуктира цитокини се продуцирането на цитокини.

определят по стандартни идентификационни методи.

PBL културата, използвана съгласно първия вариант на метода, е с малка трайност, приготвена е от пресни левкоцити на здрави хора в хранителна среда, подходяща за тъканни култури.Предпочитаната гъстота на 6 култура е около 8 х 10 готовата за употреба левкоцити /mi. Предпочитаната концентрация на изпитвания разтвор е от

В частност, мет одът е подходящ за

0, 1 до ΣΟΟ^ς/Μΐ тестване на т орфен и екстракти

Микроскопското определяне възможно.

когато изпитваният разтвор, например торфен екстракт или негова фракция, се смеси с имуномодулиращ агент като нестероиден противовъзпалителен медикамент, за предпочитане субст анци я подбрана от групата, включваща селено-органични съединения, като ebselen, определени производни на изотиазола като рхлорфениламид на

3-метил-5-6ензоламино-изотиазол-4карбоксилна киселина, индометацин, както и аналози, хомолози и метаболити на такива субстанции.

Примери на селено-органични съединения,които могат да се използват за тази цел^са дадени с формулите от 1 до 3. Предпочитан вариант е съединението с формула 2 /ebselen/!

(1) Si s-C2-(N-фенилкарбоксиамидо)1-фенипдиселенид

(2) 2-фенил-1,2-бензизоселеназол-З(2Н)-он (Ebselen PZ 51) □

(3) Bi s—С2-(N-(2—пиридил)карбоксиамидо)]-хенилдиселенид.

Примери за производни на изотиазсла, които могат да се използват за горепосочените цепи са съединения с обща формула I където R γ

сн

СН---CONHR

II

С—NHCOR е халофенил, за фенил и Rj е нискомолекулен алкил, (I) за предпочитане метил.

Хапогеннният атом в халофенилната група, хлорфенилна група R/

е за предпочитане да бъде 8 р-позицията на фенипния пръстен.

Предпочитаното съединение с горната формула I е рхлорфениламид на 3-метил-5-бензопамино-изотиазол-4карбоксилна киселина, т.е. съединение с формула I, където R^ е р-хлорфенил, Rg е фенил и Rj е метил. По-натаТЪК За. удобства това съединение ire се означава като съединение регистрирана търговска марка VRATIZ0за това съединение в Полша синтез свойства

691 са

Всички описани е Arch. Immunol имуномодулат орни агенти, et Ther. Exp за които се

1973, 21, споменава по-горе като приложими за микроскопско определяне, селено-органичните индометацина имат противовъзпалителни съединения , производните на изотиазола и общото свойство, че са средства, които потискат нестероидни синтеза на простагпандини. Те съгласно изобретението. По тази причина са особено полезни за микроопределяне. Усилването на резултатите е от порядъка на 5—20 пъти.

От всички разновидности на нестероидните противовъзпалителни съединения, приложими за цепите на усилване, селено-органичните съединения <1,2 и 3) и съединението ITCL. и специално индометацинът, са най подходящи .

В настоящото изобретение се използват оазпични антисеруми за разпознаване на отделните индуктирани

ЦЙТОКИНИ.

Тези серуми са известни и се използват за определяне и стандартизация на различни цитокини

Идентификацията на индуктираните цитокини трябва да се извърши в момента на завършване на тяхното формиране и преди протеолизата им

Някои от различните индуктирани цитокини се формират бавно и

са устойчиви в разтвор, като например гама-интерферона, докато други се формират бързо и са лесно податливи на протеолиза, като н апример туморонекротизпращите фактори

Гореописаният метод може да се използва и за определяне на имунната реакция на различни индивиди спрямо дадена имуноактивна субстаниия, като се осигури тази реакция да не бъде стимулирана от други фактори, като например вирусна или бактериална инфекция. Методът може да бъде използван и за определяне на реакцията спрямо лекарствените препарати на отделни пациенти за определяне на оптималната доза на терапевтичен индуктор на цитокини като ТТР, както и за определяне на

Методът се ефективна схема за приемане на лекарството базира върху оценката на хипореактивното

състояние спрямо индуктирането на интерферони

Методът съгласно изобретението е също и метод за определяне на имунната реакция на различни индивиди спрямо терапия, в която се използват имуномодулаторни субстанции при индуктирането на цитокини

Този метод се характеризира с това, че

PBL култура от човешки индивид се третира през определени интервали от време с разтвор на и мун омодулат орна субстанция.

приемана с цел да индуктира цитокини, след което циток инит е се определят по стандартни методи (включително и теста ELISA за определяне на цитокини) за да се установи момента на развиване на хипореакция към продължителното й приемане и момента субстанцията спед на възвръщане на реактивната способност към една допълнителна доза след известен период на прекъсване. Препоръчителните интервали от време са от 7-14 дни.

Предпочитан вариант на метода съгласно изобретението е прилагането му за терапия чрез торфен екстрат като имуномодулаторна субстанция, индуктираща продуцирането на ци ток ин и.

Съгласно най-предпочитания вариант на изобретението методът се прилага за терапия чрез ТТР като имуномодулаторна субстанция, индуктираща продуцирането на ци-окини. ТТР е обект на изобретение, заявено с международна заявка

No.РСТ/ЕР97 '00491, където подробно са описани неговите характеристики и начина на производство. С оглед на това настоящото изобретение е свързано с ТТР, когато е използван, изпитван или определян по метода от настоящото изобретение.

Съг ласно вт ори я вари ант на изобретението методът е процес за производство пречист ван е, отделяне и други необходими операции за получаване на имуноактивни субстанции. Например, когато суспензия от RPC се третира с разтвора, подлежащ на тестване, се индуктира миши бета-интерферон, както и туморонекротизиращ фактор. И двата могат да бъдат открити и качествено определени по стандартните идентификационни мет оди

Съгласно този суспензия от пресни миши клетки/lMji.

вариант на метода се използва съдържаща приблизително 1х10^б

RPC,

Разтворът, подлежащ на изпитване, се приготвя х рани т елка среда Eagle или

RPMI-164O с добавка от

107.

телешки ембрионален серум

Получените резултати се сравняват с калибрована крива, получена за еталонна субстанция

Като еталонна субстанция може да се използва т ест вана методът е фракции .

подлежащата на изпитване по традиционен начин изключително подходящ за имуноактивна субстанция,

Както беше отбелязано, торфени екстракти и техни

Настоящият метод е много прост и ефикасен в сравнение с други известни мет оди, защот о се основава на директна индукция на бета-интерферон, вместо както мн ог о от конвенционалните т ест ове на вторичния ефект от образуването на антитела. Досега не беше възможно да се намери подобен метод поради факта че имунната система на мишката значително се различава от човешката имунна система и тестовете за разпознаване на имунната реакция при хора

като например наличието на интерферони в тъкани от далак или лимфни възли не са приложими за най-добрите лабораторни животни, т.е. мишките от типа BALB/c

Сега е установено, че може да реакция на BALB/c мишките, когато клетки гостоприемници тестване. Използва се животни

Резултатите биологичният материал създаде съответстваща

При метода се получи чисто имунна се изберат перитонеални биологичен левкоцити (RPC) като биологичен мат ери ал за прясна суспензия от тези необходимо да се получават би могъл да линия от съг ласно материал, а (PBL) или гостоприемници (RPC) от се за се клетки именно жертват само по три няколко часа култивира

Също и да се макрофаги изобретението се използва култури от периферни кръвни суспензия от перитонеални клетки

BALB/c пабораторни мишки. Наличието и концентрацията на всеки цитокин се определя по методи за тестване и стандартизация на интерферони , известни от

Methods in Enzymology,1986, vol.119, part

С: Inter-feron , издание на Sidney Pestka

Чрез определянето на пъпния спектър от индуктирани цитокини се определя ИМУННИЯТ СТЯТУС На ПЯЦИвНТа

За точната оценка на резултатите и при двата варианта на метода е важно биологичният материал да бъде подбран от подходящи донори

В случая с използването на човешки левкоцити, пробивзети от индивиди с хипореактивност /редки случаи/, т реакцияjтрябва да бъдат В случая с използването на миша RPC суспензия

е. ниско ниво на имунна трябва да бъдат изключени проби от допълнително стимулирани животни /например инфектирани/. Пробите не трябва да се вземат от твърде млади или твърде стари животни, тъй като тези животни имат възрастово зависима недостатъчност при продуциране на цитокини. Трябва да се подбират 5-8 седмични здрави животни. Проби, показващи много високо спонтанно продуциране на цитокиниj също би трябвало да се изключат, особено при тестване на имунорегулаторни субстанции, защото

никакво усилвана на индуктирането на цитокини, даже и спадане не може да бъде наблюдавано.

Вариантът усилването на а понякога на метода съгласно изобретението, в който резултатите се постига чрез смесване нестероиден противовъзпапитепен медикамент / една от по-г оре, селенс—органичните съединения 1 като съединението ITCL или или 3, но за предпочитане индометацин/ на субстанцията, подлежаща на изпитване с микротест, особено подходящ за определяне на активността на интерферон и туморонекротизиращ фактор. Този тест е икономичен, бърз, приложим за тестване на голям брой проби едновременно, подходящ автоматизиране

Двата варианта на описани подробно

Приготвяне за стандартизиране и частично метода съгласно изобретението помощта на примери^както следва разтвор субстанцията, подлежаща за са и зследеане!

Субстанцията, подлежаща на изследване, например торфен екстракт, се разтваря в двойно дистипирана вода в концентрация 10 «д/м1 .Пробата през 0. 45 jU m, филтри. След

600 се стерилизира чрез филтриране kPa max Millipore ^z ан т и бак т ери ци дн и това се правят разтвори в пълноценна RPMI

1640 среда, съдържаща топлинно дезактивиран ембрионален волски серум (FBS)

А) Вариант с

PBL!

Съсиреци от здрав кръводарител могат да се вземат στ регионални я център по кръвопреливане. Друга възможност за осигуряване на периферни кръвни левкоцити тяхното изолиране доброволци от хепаринизирана венозна кръв чрез Ficol 1-Hypaque от здрави (ипи Histopaque /-е;

центруфугиране с градиент на интензитета g

1.077 последващо двойно измиване на клетките

Еритроцитите се разтварят /лизират/ чрез третиране с NH CL по CanteLL и

ДР

(Cantel1, part i al

Enzymol

К. , Hirvonen, S., Kauppinen, H.L.

! F’roduction and purification of Human Immune Interferon

119, 54, донор, съдържащи

Meth

1988) . Използвани са левкоцитите от един приблизително 8x10 певкоцити/м! в RPMI1640 среда с добавка от 107.

L— гпутамин и антибиотици тестват повторно немитогенен FBS

1000 мол. обема на ци т ок и н и е

За PBL

Ин дукторите ембрионален волски серум (FBS),

Всички количества от FBS се нултурите на ци т ок и н и от културите» В случая.

Chemicals, Sweden

PBL се инкубират

С за 20 Ь

4°С и се филтрат ът фитохемоглутамин или Sigma, и се се използва само се добавят към 200въведеният индуктор

РНА (Pharmacia Fine

USA). Индуктираните култури атмосфера с 57 центрофугират съдържание на С0^ при филтратът се съхранява от ⁰ при тества за интерферон в рамките на една седмица за определяне на туморонекротизиращ да се съхранява при -90 или течен фактор трябва азот, за да се предотврати дезактивирането му вследствие на протеолиза

Тест за интерферон

В микротарелки се приготвят сляти монослоеве от А549 клетки в Dulbecco модифицирана Minimum Essential Medium

107. FBS, L-глутамин антибиотици (пеницилин

100 (DMEM) с ед./ц/ и стрептомицин

100 Ju, g/wl интерферонови проби при 37 *C за 20 J, се инкубират се добавят на COg. След това клетките се

Разредените към клетъчните във въздух с тарелките монослоеве и съдържание измиват и се възбуждат с енцефаломиокардитен вирус след 48 |ч. инкубация.

(EMCV). Титърът на IFN се определя когато цитопатогенният ефект на вируса е намален с 507..

Използва се МТТ (3-С4.5-диметилтиазол-2-ил1-2,5-дифенилтетразо-лиумбромид) метода ( Hansen,

Nielsen, S.

Е and Berg

К.

! Re-examination and

Further

Development of a Precise and Rapid Dye Method for

Measuring Cell

Growth/Cell Kill. J.Immunol

Meth. 1989,

119,

203-210 ) за измерване на убитите клетки в ELISA скенер.

Лаборат орните стандарти за интерферон

IFN трябва да бъдат включени във всички тестове, гама-интерферон (специфична естествени човешки левкоцитни например рекомбинантен човешки активност 2x10^ units/mg., алфа-интерферон (3x10® IU/ml) и гама-интерферон (2х10^б IU/ml) .

Тест за туморонекротизиращ фактор TNF

Цитотоксичната активност на TFN в L-929 клетките по Flick и Gifford (Flick, D.A., Gifford, G.E.ϊComperison of in Vitro Cell Cytotoxic Assays for Tumor Necrosis Factor. J. Immunol . Meth. 88, 1667, 1984). Разтвор от пробите и актиномицетин D (5 yUg/ml) се добавят към монослойните клетъчни култури. След инкубация при 37* С за 20 |я цитотоксичният ефект на TNF се определя или чрез микроскопска експертиза културите или чрез МТТ метода.

Количеството, предизвикващо 507. деструкция на клетъчните култури^ се определя като една единица активност на TNF. Сравнението с препарат от алфа-TNF (Genetech Inc.,USA) показва, че една единица в тестовете е равна на 100-200 pg/ml TNF.

Тест за неутрализация на цитокини

Цитокините, продуцирани от PBL, третирани с изпитваните препарати, могат да се идентифицират чрез тест за неутрализация със специфични антитела (Inglot et al., Grganoselenides as potential immunostimulants and inducers of interleron дата and other cytokines in human peripheral blood leukocytes, Experientia 1990, 46, 308-311), Също така могат да се използват различни ELISA китове за определяне на имунната активност на даден цитокин .

Комен т ар

Във филтратите, пимфатични

клетки, могат да се открият и идентифицират чрез други стандартни методи различни от TNF )ипи IFN цитокини, например интерлевкини (IL-1-10),

GM-CSF, TGF - бета и др.

Б) RFC вариант за индуктиране на цитокини

Миши перитонеални клетки-гостоприемници се получават от около шест инжектиране седмични BALB/c мишки, умъртвени с на 5иХ пълноценна

RPMI-1640 среда етер, чрез при стайна температура

Промивната среда, ледено студени 50 милилитрови съдържаща RPC^ce центротрофужни тръби. RPC поставя не са изплакнати нито центрофугирани. Клетките се изброяват

Buerker хемоцитометър клетки /нп$.

и се суспензират до плътност от

1-1.5x10

Тази плътност се изисква за всички препаратите (от 0.1

Отрицателният и

Отрицателният контрол измерва спонтанното отделяне на TNF или IFN gt RPC, инкубирани с пълноценна RPMI-1640 среда без стандартен липопопизахариден индуктор (LPC -From Е.

col 1

055:35, Sigma 1-10yu.g/ml ) . Всички култури се инкубират при 26° С за 20 k * След това културите се центрофугират при

1000 оборота за 10 ТК\ЧП. и филтратът се отделя. С помощта на автоматична пипета филтратите се разреждат от 1:2 до 1:256.

Биотест з?, цитокини

Зг. да се определи активността на TNF във филтрати от миши перитонеални клетки-гостоприемници RPC^ce използват 20 часови L-929 монослойни клетъчни култури.

Мишите фибробластоподобни L-929 клетки, 2x10 клетки на

гнездо в 100 моларни обема пълноценна 9е>-гнездови плоскодънни тарелки и се при 37^С^за да се получи монослой.

среда, се поставят инкубират за 20 k

Преместването на филтрата трябва да се извърши много внимателно, продължение

Инкубирането на L-929

- при 37^0 в култ урите се провежда в на атмосфера с

57. съдържание на С0 2

Оценки

1) Отчитане на цитот ок сичния ефект под обърнат микроскоп

2) МТТ- тест (3-С4.5-диметилтиазол-2-ил3-2, 5дифени лтетразолиум бромид, сигма).

За измерване на убитите клетки в L-929 културите във всяка микротарелка се добавят по 25 моларни обема от МТТ оцветяващ разтвор в концентрация от 5тд/м.1.

После тарелките се инкубират за 2 k при температура

С в атмосфера с

57. съдържание на С0д, .

След това във всяка тарелка се добавят 100 моларни обема разтворител, съдържащ 45 диметилформамид 13.5 д. SDS (sodium dodecil suphate) и 55 ml дестилирана вода.

Извършва се инкубиране в продължение на 12 Ь при 37° С в CGg инкубатор.Резултатът ат цветния МТТ тест се отчита в

Multiskan 340/CC разчитащо устройство (лабораторна система), използващо 570 нанометров филтър. Трябва да се използва съответният рекомбинантен алфа - туморонекротизиращ фактор TNF-(Z.

Биотест за интерферон

Интерферонът се тества чрез потискане на цитопатичния ефект, причинен от миши енцефапомиокардитен вирус (EMCV in mouse L-929 cells, reference Mu IFN алфа/бета, standard from National Institute of Health Bethesda, MD, USA). Цитопатичният ефект се наблюдава през обърнат микроскоп и също се измерва чрез метода МТТ, както е описано по-долу!

МТТ метод съгласно Perg и др.

Berg.K., Hansen М.В. и Nielsen S,Е. (1990?! Нов чувствителен биотест за точно количествено определяне активността на интерферон чрез измерване на митохондрийната дехидрогеназа в клетките (МТТ метод).ARMIS, 98, 156-162.

МТТ (3/4,5- диметил-тиазол-2-ип/2,5-дифенил тетразолиум бромид, Сигма) се разтваря в PBS в концентрация от 5Мд/м1 .

За да се измерят убитите клетки в L-929 културите, се добавят 25 моларни обема от МТТ оцветяващ разтвор с концентрация от 5мд/м1 към всяка микротарепка. Включена е и съответната контролна проба (еталон) TNF или IFN. След това тарелките се инкубират за 2 h при темпелатура 37 ° С в атмосфера с 5Z съдържание на въглероден двуокис. После във всяка тарелка се добавят по 100 моларни обема разтвор, съдържащ 45 м1 диметилформамид, 13,5 g SDS (содиум додецил сулфат) и 55мй дестилирана вода. След една нощ инкубиране о

при температура 37 С се измерва оптическата плътност при 570 нанометра с помощта на разчитащо устройство за микроппастини на Start Fax Awareness Technology Inc. 2100, ползващо буферна екстракция като контролна /празна/ проба.

Алфа-туморонекротизиращият фактор, бета-интерферонът и други цитокини могат да бъдат тествани също и с помощта на китовете ELISA.

Съставът за провеждане на метода съгласно изобретението се характеризира основно с това, че съдържа двойно обработена водна тъканна култура, среда и серум за обогатяване на средата , както и човешки периферни кръвни левкоцити или миши перитонеални клетки-гостоприемници.

Диагностичният кит (цитокино-индуктиращ кит) за използване във варианта с периферни кръвни левкоцити (PBL) на настоящия метод (за 10-20 мануални теста) може да съдържа следните съставки!

1) Двойно обработена водна тъканна култура, 100 ml

2> Histopaque (R) или Fi col 1-Hypaque (R) - 1077, (среда за градиент на плътността), 100 ml

3) RPMI-1640 - среда, 2x100 ml (със сода бикарбонат и L

глутамин, филтрирана стерилно и тествана за ендотоксини)

4) Волски ембрионален серум (FBS), 20 ml, с ниско съдържание на ендотоксини и хемоглобин

5) Пектин от Phaseolus vulgaris 0.5 mg (фитохемоглутинин PHA-P)

6) Тубуси с обло дъно с капачки от стерилен пропилен за тъканни култури 17x100 Щмп с вместимост 14ml, 25 в опаковка

7) Тарелки за тъканни култури с похлупаци, 2 тарелки, 96 гнезда, плоскодънни, стерилни.

Реагентите могат да се осигурят от Sigma Chemical Co.,St. Louis, Mo., USA или други фирми.

Такъв PBL кит може да се използва като т.н. втора фаза скринингова система за потвърждаване на резултатите, получени с PBL клетките или понякога като директна скринингова система за няколко субстанции, които могат да бъдат неактивни като имуномодулатори при гризачи, т.е.

селено-органични съединения.

Диагностичният кит (цитокино-индуктиращ кит) за използване във варианта с миши перитонеални кпеткигостоприемници (RPC) на настоящия метод (за 10-20 мануални теста) може да съдържа следните съставки:

1)Двойно обработена водна тъканна култура, 100 м1

О) RPMI-1640 - среда, 2x100 ml (със сода бикарбонат и Lглутамин, филтрирана стерилно и тествана за ендотоксини)

3) Волски	ембрионален	серум	(FBS),	20 м1 , с ниско
съдържание на	ендотоксини	и хемоглобин
4) Липополизахарид (LPS) 0.	5 mg, от	Е. coli	0127:В8

6) Тубуси с обло дъно с капачки от стерилен пропилен за тъканни култури 12x75 mm с вместимост 6ml, 25 в опаковка

7) Тарелки за тъканни култури с похлупаци, 5 тарелки, 96 гнезда, плоскодънни, стерилни.

Един състав за осъществяване на метода съгласно изобретението, въвеждащ усилване на резултатите, който е особено подходящ за микротестове, се характеризира главно с това, че съдържа от една страна PBL култура или RPC суспензия, а от друга страна нестероиден, противовъзпалителен медикамент, за предпочитане субстанция, избрана от групата на селено-органичните съединения, като ебселен, индометацин или ITCL съединение, деривати, аналози, хомолози или метаболити на тези съединения, като най предпочитан е индометацинът.

Настоящето изобретение се илюстрира със следните примерни изпълнения, като те не ограничават по-никакъв начин обхвата на изобретението:

Пример 1 ,

Индивидуални разт вори от миши перитонеални клетки гостоприемници, получени от седем-осем седмични,

умъртвени с етер женски BALB/c перитонеапната кухина на 5н1 medium (ЕМЕМ)/среда за тъканни

Eagle’s minimum essential култури/, допълнен с

107.

топлинно дезактивиран телешки серум. Утайката^получена ⁷ 6 промиване от една мишка^ съдържа 1-2 х 10

Суспензиите от клетки проби, разпределени в от два чрез клетки /Hlii.

всяка мишка се разделят на две тубуса. Едната проба се третира с друг ат а ¹⁰⁰ yUS показващ спонтанното отделяне на служи за цитокини негативен контрол,

Всички култури се инкубират при 26*С за 20 |ι и след това се центрофугират при 1000 оборота за

Wilt· Филтратите се събират и тестват за бета-интерферонова биотест, използващ микрометод за потискане ефек т, причинен от EMCV

L-929 клетки

Във всеки ет ален , който препарат от

Цитопатичният активност чрез на цитопатичния (енцефаломиокардитен тест е включен е калиброван сп оред

Ми

IFN, ефект

G002-904-511 се измерва и др., ARMIS, 98, 156-162.

следвала контролните проби усреднено <2, за пробите , т IFN е 4-127 U/M1, усреднено графично на фиг.1 (Сравнение RFC третирани и нетретирани 2- медиана. Съгласно теста вирус) е миши вътрешнолабораторен международния еталонен NIH, Bethesda, USA.

чрез МТТ метода съгласно Berg Получените резултати са както нивото на бета-IFN е 1-8 U/jfll , ретирани с ТТР нивото на бета 16 U/ffll. Резултатите са дадени на продуцирането на бета-IFN от с ТТР. 1- граница на откриване,

Mediana р=0,0000. Всяка точка пеказеа

RPC , изолиран от всяка отделна мишка)

Пример 2

Процедурата, описана в

Пример се повтаря с група от 7 дели не на две суспензията попуч ен а от RPC на една мишка се проби , а на четири.

Пробите се разпределят

тубуса (по ml всеки)

Едиат а от пробите контрол, останалите три се третират съответно със 100, и 1yUg TTP/ml , за да се определи зависимостта на интерферона от дозата. След инкубиране температура 26° С, часа при събрания описано в

Пример фиг.2 (Зависимост отделяне на на културите за тубусите се центрофугират бета-интерферона се определя

Получените резултати на продуциранете? на IFN както са представени на от концентрацията на ТТР). Всяка крива показва резултатите, наблюдавани при суспензията на RPC ,получени от една мишка

Пример 3,

Извършва се процедурата, описана в Пример

1, само че се определя алфа-туморонекротизиращият фактор вместо бетаинтерферонът .

и нетретирани със 100 ТТР/»1 се тества ва определяне на TNF л

Миши фибробластоподобни L-929 клетки (4x10 чрез биотест в 100 моларни обема пълноценна ЕМЕМ) се поставят в 96 - гнездови плсскодънни тарелки (Falcon, Linbro, Flow) и се инкубират за 4 11 при температура 37^С в атмосфера с 57. съдържание на С02 .Пробите се разтварят в ЕМЕМ с актиномицин D (крайна концентрация 2,4 ^ид/щ1) в спомагателна тарелка. След това средата на културата над монослоя от L-929 клетки се отстранява и приготвеният разтвор се премества към тази култура с помощта на многоканална пипета. След инкубиране за

1ч при температура 37*С културите се тестват за убити клетки по метода МТТ, както е описано по-горе. Получените резултат и са както следва: за негативния контрол на апфаTNF нивото е 1-256 U/ml, усреднено 8 U/ml, а за пробите, третирани с

ТТР^ нивото е също 2-256, но средното равнище е Получените резултати са показани на фиг.З (Сравнение на продуцирането на алфа

TNF от RPC третирани и нетретирани с ТТР. 1граница откриването, 2-медиана

Съгласно тестът Medians

Р=0,0030

Всяка точка показва нивото изолирани от една

Пример 4, следsa се процедурата, както е описана

Пример 2, с изключение на това^че не се определя бета-IFN, а алфа-TNF,

Гюлученит а

У к ак т о описано по-горе в

Пример 3 резултати са показани на фиг.4 (Зависимост на продуцирането на TNF от к онцен трацият а на

ТТР)

Пример 5

А. Биологичен материал. За теста са използвани над

115 съсиреци от отделни здрави кръводарители, осигурени от

Регионалния център по кръвопреливане във

Вроцлав

Характеристиките на донорите са дадени в Таблица 1, долу.

Таблица 1

Характеристики на донорите на. кръв, използвана като източник на PBL

Възраст Брой Мъже Жени (г оди ни )

Даряване

Многократно Еднократно

21-30	24	22	2	24	—
31-40	45	44	1	45	-
41-59	46	44	2	40	6

Общо	115	110	5	109	6
7.	100	96	4	95	5

Болшинството от донорите са млади мъже, които са давали

кръв многократно. Наблюдавани са значителни различия в реакцията на PBL от отделните донори, което е отбелязано в Таблица 2 по-долу.

Както се вижда от Таблица 2, 10-30% от PBL могат да не реагират на дозата 100ykg/ml ТТР, докато само 7% не могат да бъдат стимулирани от 10 yUg/ml доза РНА и 50% не реагират на същата доза LPC при продуциране на TNF. Тези данни са съществени за правилния подбор на биологичен материал. Нереагиращите PBL култури са открити чрез оценка на негативния (непредизвикано, спонтанно отделяне на цитокини) и позитивен (третиране на културите със стандартен индуктор като РНА или LPC) тестове.

Таблица 2sIFN и TNF реакция на PBL от индивидуални донори спед стимулиране с различни дови ТТР или стандартни индуктори

Индуктор Доза Брой на Брой реагирали ϊ

Cug/lhl) тестваните IFN (%) TFN (%)

PBL

TTP	010391	100	19	13	(68)	13	(68)
		30	13	6	(46)	9	(69)
		10	15	14	¢93)	13	(87)
TTP	020391	100	14	10	(71)	11	(79)
		30	12	8	(67)	8	(67)
		10	10	5	(50(	5	(50)
TTP	101091	100	26	21	(81)	20	(77)
		30	20	9	(45)	8	(40)
		10	24	14	(58)	15	(63)
TTP	010991	100	5	5	(100)	4	(80)
		30	4	2	(50)	0	(0)

Таблица 2 - продължение

Индуктор	Доза (yug/ml) ι	Брой на естванит е PBL	IFN	Брой (7.)	реагирали :
TFN	(7.)
	10	5	Z.	(40)	3	(60)
ТТР 021091	100	5	4	(80)	4	(80)
	30	4	3	(75)	4	(100)
	10	5	3	(60)	3	(60)
ТТР 111191	100	5	3	(60)	4	(80)
	30	4	2	(50)	3	(75)
	10	5	4	(80)	2	(40)
ТТР <8х)	100	29	19	(66)	10	(34)
	30	24	14	(58)	11	(46)
	10	21	16	(76)	X.	(10)
РНА	10	69	64	(93)	54	(78)
LPS	10	41	33	(80)	21	(51)
-	-	69	36	(52)	20	(29)
Таблица 3:	Индуктиран	е на IFN или	TNF	под 1	въздейст	вието на
различни партиди 100	/п& торфен	екстракт	в международни
единици за	активност	/Units/
IFN	/ units/ml	TNF	/	units/ml

Сериен Брой на Обхват Меди- Брой на Време на тестване!

24Й -=> Меди- бдни МедиNo. пробите ана пробите Обхват ана Обхват ана

Конт- 333 <10- 10 41 9-750 27 9-80 9 ролн а проба 100 без ин — дуктор

Таблица 3 — продължение

	IFN	/ units/ml	TNf	- /	units/ml
Сериен	Брой на	Обхват	Меди-	Брой	на	Време на 24¼ Меди	тестване: - бдни Меди-
No.	проби т е		ана	пробите	Обхват	ана	Обхват	ана
310R0	•5	5- 30	30	3		ND	ND	9-80	80
291290	21	10- 3000	100	14		ND	ND	9-750	40
010391	23	10- 2000	60	17		ND	ND	9-160	9
020391	19	10- 1000	30	32		9-750	200	9-250	27

Кондиционираният екстракт се съхранява при 4°С преди изпитанията.

Използвани са периферни кръвни донори (8x10^ клетки/|пй) .

левк оцит и от здрави

Б. Проведени експерименти

Проби от торфен екстракт от различни производствени партиди, изброени както е показано в Таблица 3, се изпитват с помощта на PBL, както е описано по-горе. В експериментите, мнтерферонът (IFN) и туморонекротизиращият фактор (TNF) са определени качествено съгласно гореописаната стандартна процедура, а тяхната активност е определена и изразена в международни единици за активност. Експериментите са

повторени многократно, както е посочено в Таблица 3. Получените обхвати и медиани също са дадени.

За илюстрация подобен тест е направен и със стандартизиран торфен препарат. При концентрация 30 yu g/ml активността на интерферона е с обхват 30-300 международни единици за активност, докато при концентрация 100уид/ий тя е 300-1000 международни единици за активност.

Междинни концентрации показват линейна зависимост между дозировката и реакцията.

Имуноактивните торфени екстракти, тествани в горния пример, са продуктите, описани в международната заявка No. РСТ/ЕР92/00491.

От посочените в Таблица 3 данни става ясно, че при PBL културите негативният и позитивен контрол са от съществено значение при оценяване на резултатите.

Освен това, експериментите показват, че когато една нереагираща PBL култура не се вземе под внимание и се прави статистическа оценка на голям брой експерименти, ефективността на тестовете съгласно изобретението не може да бъде изследвана.

За повече от две години са определени цитокиноиндуктиращата активност на над 20 различни партиди ТТР, включително и стандартни търговски портиди от него чрез биологичен тест, 2) партиди, отхвърлени от производитея поради неадекватна биологична активност при мишки, по-ниска от установения стандарт и 3) препарати от лабораторни торфени екстракти в малки количества. Получените резултати са представени в Таблица 4 по-долу под формата средни нива на индуктираните IFN и TNF (с калкулиране на стандартните отклонения - SD и статистическата значимост).

Таблица 4 : Въздействие на различните партиди ТТР върху продуцирането на IFN и TNF в човешки PBL

Ин дук т ор

Доза

IFN

TNF

	(^g/ml )	Log	10 units/ml	1 (+ SD)
ТТР 010391	100	1.41	= 1.07b	1.26 = 0.91c
	30	0.96	= 1.07	1.25 = 0.88b
	10	1.81	= 0.58c	1.45 = 0.63c
ТРР 020391	100	1.23	= 0.81a	1.35 = 0.75c
	30	1. 12	= 0.90	1.14= 0.83b
	10	0. 75	= 0.76	0.86 = 0.90
ТТР 101091	100	1.70	= 0.91c	1.38 = 0.81c
	30	0.99	= 1.12	0.62 = 0.80
	10	1.22	= 1.07a	0.94 = 0.76b
ТТР 010991	100	2. 24	= 0.30c	1.35 = 0.73b
	30	1.00	= 1.00	0.0
	10	0.56	= 0. 68	0.88 = 0.73
ТТР 021091	100	1.72	= 0.87b	1.49 = 0.84b
	30	1.39	= 0.81	1.79 = 0.20c
	10	1.11	= 0.91	1.01 = 0.84
ТТР 111191	100	1.36	= 1.12	1.18= 0.62b
	30	1.00	= 1.00	1.21 = 0.71a
	10	1.56	⁼ 0803	0.54 = 0.66
ТТР (8Х)	100	1.04	= 0.82a	0.63 = 0.91
	30	0.88	= 0.81	0.75 = 0.84
	10	1. 10	= 0.70b	0.13 = 0.40a
РНА	10	2.08	= 0.79c	1.67 = 0.99c
LF'S	10	1.36	= 0.80c	0.97 = 1.01b
	—	0.64	= 0.63	0.42 = 0.67

всички резултати от титруването на IFN или TNF. Нереагиращи те проби са взети като 0.

а-с Различно от - (спонтанно продуциране на цитокини) при а - р<0.05,при b - р<0.01 или при с - р<0.001.

Стойностите Mediana , съответстващи на резултатите от Таблица 4, са дадени в следващата Таблица 5, а подбрани данни са представени в графичен вид на фиг.5 и 6, илюстриращи въздействието на различните партиди ТТР съответно върху продуцирането на IFN и TNF.

Таблица 5! Въздействие на различните партиди ТТР върху продуцирането на IFN и TNF от човешки PBL

Индуктор	Доза	IFN	TNF
	(yug/mi)	Uni ts/ml^
ТТР 010391	100	30	27
	30	< 10	27
	10	100	27
ТТР 020391	100	30	50
	30	30	34
	10	<10	<9
ТТР 101091	100	100	34
	30	<10	<9
	10	45	18
ТТР 910991	100	300	27
	30	<10	<9
	10	<10	18
ТТР 021091	100	100	27
	30	60	80
	10	60	27
ТТР 111101	100	100	18
	30	<10	40
	10	100	<9

Таблица 5 - продължение

Индуктор	Доза (j<g/ml )	IFN Uni ts/ml	TNF
ТТР (8х)	100	20	<9
	30	10	<9
	10	20	<9
РНА	10	200	80
LPS	10	30	27
-	-	10	<9

Стойностите Medians са изчисленикато са взети предвид всички резултати от титруването на IFN или TNF.

Идентификацията на индуктираните цитокини е извършена чрез неутрализация на IFN и TNF, индуктирани чрез ТТР,

Горните резултати от експериментите са пояснени съответно с фигури 5 и 6.

Въздействието на различните партиди

ТТР върху продуцирането на IFN от човешки PBL е показано на фиг

Използвани са седем различни партиди

ТТР. Всяка точка от графиката съответства на PBL от отделен здрав донор

Активността на

INF съответства на антивирусни единици

Потъмнената зона показва границата на

X сри зонталиите линии пок авват средните стойности

Индуктпрането на

IFN от и 100yi<g/ml ТТР е статистически значимо (при р

0.05)

Въздействиет о на различните партиди

ТТР върху продуцирането на TNF от човешки PBL е показано на фиг.6

I

Активността на TNF е изразена в цитотоксични единици за миши L-929 клетки. Реакцията спрямо въздействието на 30, 100 и 200bg/ml TTP е значителна ( при р < 0.05).

В експериментите са използвани сипни поликлонални антисеруми, а именно:. антИбСТвСТВвН алфа-интерферон, антилимфобпастоиден (Namalwa) алфа-интерферон и анТИбСТбСТВвН гама-интерферон за неутрализиране на антивирусната активност във филтрата от PBL културите, третирани по 20 К с три различни дозировки ТТР. Резултатите, представени на фиг.7 (Резултати от неутрализацията на интерфероните чрез поликлонални анти-интерферонови серуми), показват, че порциите интерферон тип алфа- и гама-, продуцирани от PBL от различни кръводарители, варират значително. Предполага се, че отделянето на интерферон при всеки донор има отделна индивидуална характеристика.

Неутрализационните тестове, проведени със силен поликлонален заешки анти-алфа-туморонекротизиращ фактор серум (Genzyme Inc.),показват, че индуктираният с ТТР туморонекротизиращ фактор е главно от типа алфа-. Беше потвърдено чрез резултатите от подобни неутрализационни тестове със заешки поликлонален анти-бета-туморонекротизиращ фактор серум (Genzyme Inc.), който не неутрализира активността на индуктирания с ТТР туморонекротизиращ фактор.

фигура 7 показва резултатите от неутрализацията на интерфероните посредством поликлонални ННТИИНТбрфврОНОВИ серуми, филтратите, съдържащи интерферона от PBL културите, инкубирани с ТТР ( използвани са три различни дозировки ТТР и седем различни

PBL ) _л се 7 интерферонови серуми. 1 третират с посочените антинетретирани препарати;

третирани с анти-апфа-HuIFN;

третирани с анти-HuIFN-Ly;

третирани с анти-HuIFN-y*'

Пример с цел да се

Процедурата, описана θ Пример 5?се извършва покаже усилващият ефект от присъствието на усилвател, например индометацин, съгласно изобретението

Всяка PBLкултура се разделя на няколко проби. Едната от т ях служи за негативен контрол, показващ спонтанното отделяне на цитокини, другата служи за позитивен контрол и се третира със стандартен мощен и н дук тор на цитокини от посоченото по-долу естество, а останалите проби се третират

с от 1 до както и

100 ,ug/ml ТТР, ТТР I т аблици

6Ь партиден No 010391 или 020391,

ТТР 11, което е посочено съответно в партиди и 6с у ( Таблица

6а ^4cg/ml ) или 10 индометацин + ТТР от същите g/ml съединение ITCL + ТТР от същите партиди ( Таблица 6Ь)^или още 10 или 20yfcg/ml сепеноорганични съединения <1),(2) или (3), както са изяснени погоре + ТТР от същите партиди. Така са определени

IFN и TNF във филтратите от инкубираните култури

Получените резултати са посочени в Таблици 6а, b и с по-долу усилване индукцията на цитокини в

присъствие на индометацин

Таблица 6аί Ефект на

Експеримент ален индуктор	Ин до- метацин	Концентрация g/ml	Ци т ок и н и IFN	(units/ml) TNF
1.а)ТТР 010391	-	100	300	750
. η _	-	10	30	250
_ и _	-	1	20	80
	+	100+5	1000	2200
— и _	+	10+5	200	750
_п __	+	1+5	<10	250
LPS	-	10	200	500
-	-	-	<10	9
—		5	20	27

Таблица 6а - продължение

Експериментален и н дук т ор	Ин домет ацин	Концентрация yUg/ml	Цитокини IFN	(uni ts/ml) TNF
2.Ь)ТТР 020391	-	100	600	50
_, II .	-	40	20	9
	-	20	10	9
___ II __	-	10	<10	<9
_ II _	+	100+5	600	80
_ 1! _	+	40+5	100	27
_ II _	+	20+5	100	9
_ н _	+	10+5	30	9
РНА	-	5	600	50
РНА	+	5+5	2000	80
-	-	-	60	<9
-	+	5	10	<9

a) PBL са приготвени от свежа хепаринизирана кръв по FicollHypaque разделителна техника. PBL културите съдържат 7x10 клетки / ml, b> PBL са приготвени от съсиреци^осигурени от Регионалния център по кръвопреливане. Клетките са обработени съгласна метода на Cantel1 и др. ( Meth. Enzymol. 1981, 78, 29-38).

в

PBL културите съдържат 8x10 клетки/ml.

Таблица 6b!

Ефект на усилване индукцията на цитокини в присъствие на

ITCL съединение

Експериментален индуктор	Съединение ITCL	Концентрация g/ml	Цитокини IFN	(units/ml TNF
1.ТТР 010391	-	100	100	18
ТТР 010391	-	30	100	9
ТТР 010391	+	100+10	3000	80
ТТР 010391	+	30+10	300	80
РНА	-	10	3000	250
-	-	-	10	<9
-	+	10	<10	<9
2.ТТР I	-	100	3000	27
ТТР I	-	30	30	<9
ТТР I	+	100+10	3000	250
ТТР I	+	30+10	300	9
РНА	-	10	100	18
-	-	-	10	<9
	+	10	10	<9

Таблица fee:

Ефект на усилване индукцията на цитокини в присъствие на селено-органични съединения.

Експеримент ален индукт ор	Селеноорганични съединения	Концентрация /«.g/ml	Цитокини (units/ml) IFN TNF
1. TTPs	-	10	100	<9
TTPs	-	5	10	<9
TTPs	Comp. (1)	10+20	300	27
TTPs	Comp. (1)	5+20	100	27
TTFs	Comp. (2)	10+20	300	50
TTPs	Comp. (2)	5+20	100	9
PHA	-	10	100	<9
-	Comp. (1)	20	200	9
-	Comp. (2)	20	100	27
-	-	-	10	<9
2.TTP II	-	50	10	<9
TTP II	-	5	10	<9
TTP II	Comp. (3)	50+10	30	27
TTP II	Comp. (3)	10+10	30	27
PHA	-	-	30	<9
-	Comp. (3)	10	10	<9
-	-	-	10	<9

£.

PBL културите съдържат 8x10 клетки/ml. ТТР е торфен препарат, произведен в малки количества. Относително слабата TNF реакция вероятно се дължи на факта, че кръвните съсиреци се съхраняват в продължение на 20 k при температура 4°С преди приготвянето на културите. Селено-органичните съединения са индуктори на цитокини както и ТТР.

Пример ,7. Провежда се диагностичен тест, отразяващ ефекта от оралната администрация на ТТР в дневни дози от 5 mg , приет под формата на достъпни чрез търговската мрежа таблети, върху реакцията на PBL култури in vitro към една допълнителна доза индукция на цитокини чрез ТТР, както е дадено по-долу «

Тестът е проведен с четири здрави доброволци от женски от 43-58 години.

които дават ml венозна кръв, вземана от вена ulnaris седмично преди , по време и след вземането на ТТР в дневна доза от 5 mg на таблетки

Спазвани са два различни режима на приемане

Две от доброволките (по-нататък съответно 8.К. и J.Z.J.) са подложени на третиране с

ТТР в продължение на 3 седемдневни цикъла; дрогата се приема през устата, една таблетка от mg на ден в продължение на една седмица.следвана от една седмица почивка. Пълната доза е 21 таблетки. Останалите две доброволки (по-нататък A.D

I. и W.F.) се третират с по една милиграмове таблетка ТТР дневно, вземани през устата в продължение на три седмици непрекъснато. Пълната доза е 21 таблетки. След две седмици почивка третирането се повтаря милиграмовите таблетки са стандартен търговски продукт

Вроцлав, на фармацевтичната фабрика TORF CORPORATION във Полша. Всяка таблетка съдържа 5 mg

ТТР, 43 m-f лактоза и 2 mg MYVATEX. За да се индуктират цитикини в PBL културите in vitro е използван прахообразен

ТТР, като

чистата субстанция	е	приготвена	под	формата на	основен
разтвор, съдържащ	20	mg TTP/ml	в	освободена	от	сяра
редестилирана вода,	съх	раняван при	температура 4°С.

ч

Кръвните проби с разтвор от концентрация от по-горе, това се начина, за да взети от доброволците^са хепаринизирани

Heparin P0LFA без консерванти units/ml, се третират се получат PBL култури in третират с индуктори на цитокини описан и зползвани тестват за седмица , а

200

IFN се се предотврати протеопиза

IFN и TNF по-горе , както vi tro,

РНА, в крайна е описано които след

LPS и ТТР по в предишните примери. За всяко третиране са /+д при филтратите температура 4 ’ С култури се съхраняват съхраняват и тестват дезактивацията се тестват по

Получените резултати фигури от 8 до 13 (реакция пациенти спрямо индуктори администрация на ТТР)

Както може да се види на от им в същи я са на

IFN и и 9, показващи IFN по време на приемане в продължение на една за TNF при -20°С, за да резулт ат спонтанна начин, както е описано представени графично на

PBL

TNF данните.

култури от , по време представени различни на на орална фигури реакцията на първата група доброволци на ТТР, реакцията намалява и приема началните си стойности след двуседмична почивка. Обратно,

TNF реакцията, показана на фигури 10

11, се повишава по време на приемането на ТТР и се връща към нормалното си ниво след две седмици почивка

Данните, представени на фигури 12 и 13, отразяващи реакцията спрямо индукцията на цитокини при другия начин на приемане на ТТР от доброволката A.D.I., показват, че хипореактивната състояние спрямо индукцията на цитокини се достига след 3 седмици непрекъснато приемане на ТТР през устата. Хилореактивното състояние, изразено като загуба на възможност от страна на PEL да реагират спрямо индукцията на две седмици почивка. Обратно, по време на непрекъснатото триседмично приемане на ТТР хипореактивност спрямо индукцията

TNF не се развива (фиг. 12)

Горните резултати показват, че оптималната доза

имуномодулатор, индуктор на ци т ок и н и може да бъде установена индивидуално за всеки пациент, като бъде подложен на прост PEL тест СЪГЛасНО изобретението

Claims

1. Метод за определяне на иммунната активност на биологичноактивни, цитокино-индуктиращи имуномодулаторни вещества, характеризиращ се с това, че култура от човешки периферни кръвни левкоцити (PBL), получена от донори, които не са хипореактивни спрямо индуциране на интерферон (IFN) и приготвена в хранителна среда, подходяща за клетъчни култури или прясна суспензия от BALB/c миши перитонеални клеткигостоприемници (RPC), взети от здрави неоплождани BALB/c

мишки, за предпочитане на възраст от пет до осем седмици, които не са имунно стимулирани и не проявяват много високо спонтанно продуциране на цитокини, приготвена в подходяща среда, като липсата на хипореактивност при клетъчната култура и липсата на имунно стимулиране и високо спонтанно продуциране на цитокини при клетъчната суспензия са подсигурени чрез позитивен и негативен тест, при което клетъчната култура и клетъчната суспензия се третират с разтвор от веществото, подлежащо на тестване с цел да се индуктира продуциране на цитокини, които след това се определят по стандартни идентификационни методи.

2.Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че разтворът, подлежащ на тестване, се използва в концентрация от 0,1-200у< g/ml.

3 .Метод съгласно претенция 1 , характеризиращ се с това, че във варианта с използване на човешки периферни кръвни левкоцити (PBL), гъстотата на готовата за употреба клетъчна култура е приблизително 8 х 10® левкоцити/ml, а във варианта с използване на миши перитонеални клетки- гостоприемници (RPC) клетъчната гъстота е 1-2 х 10^б клетки/м1.

4.Метод съгласно която и да е от предходните претенции, характеризиращ се с това, че хранителната среда е

приготвена със за предпочитане стерилна, филтрувана и тествана за ендотоксини RPMI-1640 среда или ЕМЕМ с добавка от 10% немитогенен телешки ембрионаллен серум (FBS) и допълнителни съставки по избор.

5 .Метод съгласно която и да е от предходните претенции, характеризиращ се с това, че получените резултати са оценени чрез позитивен и негативен тест.

6. Метод съгласно която и да е от предходните претенции, характеризиращ се с това, че се тества торфен екстракт или негови фракции.

7. Метод съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че споменатият торфен екстракт е ТТР .

8 .Метод съгласно която и да е от предходните претенции, характеризиращ се с това, че за осъществяването му се използва микрометод, като усилването на резултатите се постига чрез смесване на разтвора, подлежащ на тестване с имуномодулиращ агент, подбран от групата на нестероидните, противовъзпалителни, потискащи простагландиновата синтеза медикаменти, селено-органични съединения, изотиазолови деривати, техни аналози ,хомолози и деривати.

9.Метод съгласно претенция 8, характеризиращ се с това, че споменатият усилващ агент е подбран от групата , състояща се от Bis-[2-(N-фенилкарбоксиамидо)]37 фенилдиселенид, 2-фенил-1,2-бензизоселеназол-З(2Н)-он (Ebselen PZ 51), Bis-[2-(N-(2-пиридил) карбоксиамидо) ] фенилдиселенид, р-хлорфениламид на З-метил-5-бензоламиноизотиазол-4-карбоксилна киселина и индометацин.

10.Метод за определяне на имунната реакция на пациент спрямо терапия с цитокино-индуктиращо

имуномодулаторно вещество, характеризиращ се с това, че култура от периферни кръвни левкоцити (PBL) се взема от споменатия пациент през определени интервали от време и се приготвя в подходяща за клетъчни култури хранителна среда, като споменатата PBL култура се третира с цитокиноиндуктиращо вещество с цел да се индуктира продуцирането на цитокини, за предпочитане интерферон и туморонекротизиращ фактор, които цитокини след това се определят съгласно стандартни методи,за да се определи моментът на развиване и изчезване на хипореактивност на споменатите PBL-култури спрямо индуктирането на интерферон.

11. Метод съгласно претенция 10, характеризиращ се с това, че споменатите интервали от време са седмични интервали.

12. Метод съгласно претенции 10 и 11, характеризиращ се с това, че в терапевтичния курс се използва цитокиноиндуктиращо имуномодулаторно вещество, за предпочитане торфен екстракт или негови фракции.

13. Метод съгласно претенция12, характеризиращ се с това, че торфеният екстракт е ТТР.

14. Използването на ТТР в метода се претендира във всяка една от предходните претенции.

15. Състав за осъществяване на метода съгласно която и да е претенция от 1 до 13, характеризиращ се с това, че от една страна съдържа PBL култура или RPC суспензия, както е определено в претенция 1^и от друга страна - нестероиден, противовъзпалителен, потискащ прастагландиновата синтеза медикамент в качеството на усилвател.

16. Състав съгласно претенция 15, характеризиращ се с това, че споменатият усилвател е подбран от групата, включваща селено-органични съединения, изотиазолови деривати, индометацин и техни аналози ,хомолози и деривати.