BG60685B1

BG60685B1 - Метод за получаване на рибонуклеазни димери

Info

Publication number: BG60685B1
Application number: BG96579A
Authority: BG
Inventors: Peter Herrmann; Peter Klein
Original assignee: Nika Health Products Ltd
Priority date: 1990-01-08
Filing date: 1992-07-07
Publication date: 1995-12-29
Also published as: FI923124A0; LTIP595A; DK0509989T3; DE69026275D1; AU5640190A; EP0509989A1; ATE136056T1; HK166796A; FI100724B; JPH05505094A; BG96579A; DE69026275T2; JP2732515B2; WO1991010730A1; PL165863B1; RU2067617C1; NO922625D0; SG47607A1; ES2086403T3; HUT65395A

Abstract

Пречистените рибонуклеазни димери може да се използват за третиране на вирусни и бактериални инфекции без цитотоксичните ефекти, свързвани обикновено с рибонуклеазните мономери. Методът включва димеризиране на мономерна рибонуклеаза със суберимидатен свързващ агент, филтриране на недимеризиралите мономери и олигомери от димерния разтвор с помощта на серия от етапи на хроматографиране с йонообменна смола и събиране на пречистения рибонуклеазен димерен продукт, който е в голямо количество и по-евтин.

Description

Изобретението се отнася до серия технически способи, използвани за получаване и прочистване на рибонуклеазен димер, който може да се използва за лечението на вирусни и бактериални инфекции.

НИВО НА ТЕХНИКАТА

Непрекъснато увеличаващия се брой на бактериални щамове и вирусни заболявания, които са устойчиви на известните антибиотици, определят необходимостта от въвеждане на нови типове лекарства за лечението на хора и животни. Сред многообразните форми на лечение и различните медикаменти, използвани към настоящия момент е известно прилагането на ензими в мономерни форми за лекуване на пациенти, засегнати от различни заболявания. В някои случаи това е необходимо, тъй като определени условия на заболяването причиняват намаляване активността на някои ензими. Ензимите са каталитично активни белтъчини, които изпълняват почти всички основни жизнени процеси в организмите. Така например, изолирани са много ензими, индивидуално или в определени комбинации, заради техните физикохимични, физиологични или биологични ефекти.

Сред различните ензими, известни със своите терапевтични ефекти или при които става намаляване на активността при определени условия /състояния/ на заболяването, са рибонуклеазите. Рибонуклеазите представляват група ядрени ензими, намиращи се в много животински и растителни организми. Изучаването на свойствата на рибонуклеазите и методите за изолиране на този ензим е започнало през средата на 1950-те от Шмидт и Макдоналд. Сред различните открития, базиращи се на този ензим, е намерено, че раковата тъкан има значително намалена активност на рибонуклеазите. Установено е за отделни случаи, че мишките с левкемия имат значително намаление на киселата рибонуклеазна активност, което е наблюдавано особено при митохондриалните и микрозомните фракции, получени от тъканта на далака на тези животни. Подобни изследвания показват, че въвеждането на рибонуклеаза би могло да бъде използвано за предотвратяване или борба със симптомите, свързани с вирусната левкемия.

За съжаление, потенциалните благоприятни ефекти, които могат да бъдат постигнати посредством използването на рибонуклеази не са материализирани на практика предимно поради острия цитотоксичен ефект на мономерната форма на този ензим. Например, при опити с култивирани фибробласти, се наблюдава цитотоксичен ефект от прилагана рибонуклеаза в мономерна форма, дори когато се дава при изключително ниски нива. Очевидно е, че е необходимо да се разработят начини за максимално увеличаване на потенциалните благоприятни ефекти от рибонуклеазата при максимално намаляване на потенциалните вредни цитотоксични ефекти, свързани с мономерната форма на ензима.

Неотдавна бе открито, че антивирусни и антибактериални вещества могат да бъдат получени от рибонуклеаза, които не показват цитотоксични ефекти, когато получаването на веществото се основава на димерната форма на ензима. Открито е, че използването на рибонуклеазни димерни вещества е ефективно при лечението на някои инфекциозни заболявания и не се наблюдават високо цитотоксични ефекти, които обикновено са свързани с рибонуклеазния мономер. Използването на рибонуклеазните димери при различни терапевтични лечения е разкрито в свързаната висяща патентна заявка РСТ. Заявка US 88/01785.

Независимо, че са известни някои начини за производство на димерни форми на рибонуклеазата от нейни мономерни форми , сега е важно да могат да се произвеждат големи количества от димерната форма по начин, който не е скъп и е ефикасен. Затова е изключително необходимо да се развие система за производство и изпробване на големи количества пречистен рибонуклеазен димер, който съдържа минимално количество непречистени съставки като например мономери, мултимери или други контаминанти.

ОБЩО ЗА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Настоящето изобретение има за предмет ефикасен метод за получаване на пречистен рибонуклеазен димерен продукт, който включва следните етапи;

а/ получаване на рибонуклеазен разтвор чрез добавяне на мономерна рибонуклеаза към буферен разтвор и довеждане на pH до поне 9, б/ добавяне на подходящ суберимидатен свързващ реагент, като например диметил суберимидат, за да се димеризират рибонуклеазните мономери в рибонуклеазния разтвор, докато разтворът се поддържа при pH равно или по-високо от 9, в/ намаляване на pH до около 7, за да се спре реакцията на димеризация при определен пункт, г/ пречистване на димеризирания рибонуклеазен разтвор чрез извършване на първия филтрационен етап, при който разтворът се елуира през йонообменна смола и фракциите съдържащи основното количество димерни форми на рибонуклеазата, се събират, д/ осъществяване на втория филтрационен етап, при който събраните фракции от първия филтрационен етап се елуират през йонообменна смола и е/ събиране на високо пречистения димерен рибонуклеазен продукт, получен при втория филтрационен етап.

При използването на горепосочения метод могат да се получат големи количества прочистен рибонуклеазен димерен продукт и този продукт е изключително полезен при лечението на различни вирусни и бактериални заболявания.

КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ЧЕРТЕЖИТЕ

Фигури 1 и 2 са графично изображение на елуационните профили, получени при йонообменна хроматография, извършена в съответствие с настоящото изобретение.

Подробно описание на предпочитаните изпълнения

За получаване на димерната форма на рибонуклеазата в съответствие с настоящото изобретение като изходен материал, може да се използва всеки наличен рибонуклеазен мономер. При настоящото изобретение използваните рибонуклеазни мономери са получени от Serva Feine Biochemica, GmbH Хайделберг и имат каталожен № 28260. Използваните мономери могат да се състоят от рибонуклеаза А, или която и да е от наличните различни рибонуклеази. Рибонуклеазните мономери се получават за свързващата реакция чрез разтваряне на рибонуклеазните мономери във фосфатен буферен разтвор при стайна температура, за да се получи рибонуклеазен мономерен разтвор. Използваният буферен разтвор е, за предпочитане, 0,1 М секундерен натриев фосфатен дихидратен буферен разтвор и мономерът се разтваря при непрекъснато разбъркване на разтвора в продължение на поне 2 часа. Подходящ буферен разтвор се получава чрез разтваряне на около 70 грама секундерен натриев фосфат дихидрат в около 1,000 мл Н₂О. Независимо от това, че действителните количества реагенти и разтвори, използвани в настоящото изобретение могат да варират реакцията на димеризация по настоящото изобретение се извършва използвайки от 40 до около 60 грама от рибонуклеазния мономер, разтворен в чаша /от химически устойчиво стъкло/, съдържаща около 5 литра дихидратен буферен разтвор на секундарен натриев фосфат. За предпочитане е, също така, мономерният разтвор да е с pH, доведено до поне около 9, и най- за предпочитане е да е около 10. Довеждането на pH до желаната стойност може да се извърши, използвайки 0,1 N NaOH.

Реакцията на димеризация се извършва чрез добавяне на суберимидатен свързващ реагент, пропорционален на рибонуклеазния мономерен разтвор при поддържане на стойността на pH на поне или над 9, за предпочитане 10 /+ или - 0,2/. За предпочитане е в настоящото изобретение да се използва диметил суберимидатен свързващ реагент, но и други известни суберимидатни свързващи реагенти, могат също така да бъдат използвани. Към разтвора, получен съгласно описаното погоре се добавят за предпочитане 4-6 грама диметил суберимидат към мономерния разтвор и свързващият реагент се разтваря в рамките на около една минута. При постоянно разбъркване посредством магнитна бъркалка или друго приспособление, реакцията на димеризация се оставя да се извърши за около 30-60 минути при стайна температура, при около 25°С. /+ или - 5°С/. Реакцията може да бъде спряна чрез намаляване на pH до 7,0 /+ или - 0,2/ и това може да бъде постигнато чрез добавяне на 1 М НС1 разтвор. При този пункт е за предпочитане получената смес да бъде концентрирана използвайки тангенциална течна система, както по-подробно ще бъде описано по-долу.

На различни етапи след започване реакцията на свързване е добре и полезно да се вземат пробни образци от разтвора и да се подложат на гел-електрофорезен анализ. Гел-електрофорезните изследвания показват, че независимо от това, че мономерната форма на ензима е ясно видима в почти всяка анализирана фракция, свързване, съответстващо на димерната форма на рибонуклеазата се забелязва след около 10 минути от времето на реакцията. Свързване, съответстващо на димерната форма на ензима, може ясно да бъде видяно след около 15 минути и това свързване става все по-изявено с напредването на реакцията. Олигомерни форми на ензима могат също да бъдат наблюдавани след около 30 минути след добавянето на свързващия реагент. Мономерната форма на рибонуклеазата има относително молекулярно тегло 15,000 и димерната форма ще бъде двойно по-голяма от този размер.

За получаването на големи количества продукт, който е първично пречистен рибонуклеазен димер, за предпочитане е димеразният рибонуклеазен разтвор да премине през поне два филтрационни етапа, за да се изолират рибонуклеазните димери и да се отстранят рибонуклеазата в мономерна или мултимерна форми. Отстранените недимераризирани рибонуклеазни мономери, могат така да бъдат събрани и за предпочитане е да се рециклират в настоящото изобретение, за да се постигне максимален ефект при получаването на димерната форма на ензима.

За да се отделят олигомерните от димеризирания рибонуклеазен разтвор, за предпочитане е разтворът да се филтрира през йонообменна смола. При предпочитаното изпълнение, филтрацията се извършва чрез използване на колона, получена от Sephadex йонообменен материал. Sephadex колона с около 25 см в диаметър и около 120 см височина се получава и изплаква с количество от около 60 литра 50 мМ кисел амониев карбонат при pH около 8,6. Този карбонатен буферен разтвор се получава чрез разтваряне на около 4 грама амониев водороден карбонат в 1,000 мл вода. Целият получен по-горе рибонуклеазен разтвор се прилага към колоната и елуира с равновесен буферен разтвор. Фракциите на разтвора се събират с колектор на фракции, като нап ример LKB 2211 Suprec и скоростта на потока на разтвора е приблизително 80 мл на минута. Елуационният профил се записва посредством записващо устройство като например LKB2210 рекордер, измерващ при скорост 0,5 мм/минута и абсорбцията може да бъде измерена при 280 nm посредством LKB 2238 Uvicor SH.

Елуационните профили получени от този филтрационен етап обикновено показват три пика: първият пик представлява мултимерите на рибонуклеазата, вторият пик представлява димерите и последният пик съответствува на оставащото количество от мономерни форми на ензима. На този етап е желателно, също така, да се анализират индивидуално събраните фракции, използвайки гел-електрофорезен анализ. Такъв анализ може да се извърши посредством SDS-полиакриламиден гел-електрофорезен процес /или SDS-PAGE/, както е описано в Thomas et al, PNAS 72:2626 (1975). При това електрофоретично изследване за предпочитане се смесват приблизително 50 μ 1 от всяка събрана фракция с около 50μ 1 покриващ буферен разтвор и сместа се нагрява в продължение на около 10 мин. при 95°С. След това около 25μ 1 от тази смес се нанасят в гел джоб. Накрая електрофорезата се извършва за приблизително 4 ч. при 20-35 mA, за да се отделят различните форми на рибонуклеазните ензими. Протеиновите ивици стават видими чрез оцветяване с багрило като например CoomassieBlue R250 (Merck).

Използвайки този SDS-PAGE електрофорезен процес, могат да бъдат отделени и идентифицирани фракции, съдържащи мономерни, димерни или олигомерни форми на рибонуклеазата, или техни смеси. След идентифициране на фракционните вещества, фракциите, които са вече предимно в димерна форма се изолират и събират. За предпочитане е събраните димерни фракции да бъдат по-нататък концентрирани до около 800 мл в тангенциална поточна система. Мембранната диафрагма на тангенциалната поточна система може да бъде изплакната отново с подходящ разтворител, така че да могат да се задържат по-голямо количество от димерите. За предпочитане този разтвор се лиофилизира и може да бъде съхраняван при температура от около 4°С до предприемане на по-нататъшни стъпки. В идеалния случай лиофилизацията се извършва чрез разпределяне на порции от по приблизително 200 мл от разтвора в 500 мл колби с кръгло дъно и поставени в атмосфера на течен азот във въртящ се изпарител. Колбите се затварят, като се запечатват и съхраняват в продължение на 30 мин. при -30°С, след което материалът се лиофилизира.

Тъй като изходните материали често са скъпи, за предпочитане е мономерите, филтрирани съгласно предишния филтрационен етап, да могат да бъдат отново върнати в димеризационния процес на настоящото изобретение. Това може да се извърши чрез събиране на фракциите, идентифицирани като съдържащи значително количество мономерна рибонуклеаза, тяхното концентриране, използвайки тангенциална поточна система и прибавяне на свързващия реагент, идентифициран по-горе. Свързващата реакция протича, както е описано по-горе, и за предпочитане е филтрационния етап да се извърши така, както е описано по-горе. След лиофилизацията на рециклираната рибонуклеаза, новообразуваните димери се смесват добре с димеризирания продукт, получен от първия димеризационен цикъл. Посредством тази техника на рециклиране може да се получи повишение на добива на димерния продукт до 30 %.

Първичните димерни разтвори получени по-горе се прочистват по-нататък чрез извършването на втори филтрационен етап, за да се отделят по-нататък димерите от мономери и олигомери и да се увеличи чистотата на крайния продукт. В този случай, за предпочитане е получената по-горе смес на лиофилизен ензим да се елуира през йонообменна смола като например Sephadex G 50 F колона. На този етап е за предпочитане, също така, йонообменната колона да е с рН, на стойност около 5, и това може да бъде постигнато чрез използване на 0,2 М натриево-ацетатен буферен разтвор. Натриево-ацетатния буферен разтвор с рН 5 е получен, използвайки около 27 г натриево-ацетатен трихидрат, разтворен в 1,000 мл вода.

Събраните фракции, съответстващи на втория пик, както бе определено посредством измерванията при първия филтрационен етап, се пропускат през Sephadex колона. За предпочитане е да се използват отново условията и материалите, описани в първия филтраци онен етап. Записва се елуационният профил и се използва при идентифицирането и изолирането на желаните фракции, събрани след втория филтрационен етап. В този случай елуационният профил показва основен пик с голямо съдържание на димери и само два слаби вторични пика.

Отново е за предпочитане да се направи SDS-PAGE анализ на рибонуклеазните ензими, взети от събраните фракции, както е посочено по-горе. Тези проучвания показват, че фракциите, съответстващи на основния пик на елуационния профил съдържат високо прочистен рибонуклеазен димерен продукт. В този случай фракциите от основния пик се събират и се концентрират посредством тангенциална поточна система. За предпочитане е също на този етап процесът на обезсоляване да се осъществи чрез пропускане на фракциите през Sephadex G 25 колона. Използва се колона от около 25 см в диаметър и 65 см височина с базисен обем от 32 л при скорост на потока 15 л на час. Допълнително е използван 50 мМ амониев хидроген-карбонатен буфер.

На този етап продуктът се състои от високо прочистено рибонуклеазно димерно вещество. Обаче, за да се превърне лиофилизираният рибонуклеазен димер във фармацевтично пригодна форма, препоръчва се димерите да бъдат подложени на процедура, при която ендотоксините да могат да бъдат отстранени. Затова се предпочита пречистения димерен продукт получен по-горе, да бъде елуиран с помощта на хроматографски способи като например Детоксигел (Detoxigel) който има висок свързващ капацитет за ендотоксини. Детоксигела има приблизителен свързващ капацитет за ендотоксини от около 2 мг/мл. Тъй като е възможно неспецифично свързване с други компоненти като например белтъчни димери, максимално обработване на димерния материал може да бъде получено чрез използване на буферни разтвори в границите на физиологичните стойности на рН. Добавянето на 0,1-0,5 М солен разтвор /напр., NaCl/ осигурява необходимите стойности на рН, за да се получи максимален добив на димер. Обикновено когато разтвор, съдържащ 1,500 E.U./мл се хроматографира върху детоксикираща колона може да бъде намален до по-малко от 1,0 E.U./мл.

След освобождаване на рибонуклеазния димер, разтворът се събира, филтрира се стерилно и се поставя за лиофилизация в стерилна колба с кръгло дъно. Съдържанието на ендотоксини в крайния продукт може да бъде определено с диагностичен набор като например “Coatest(R)” на фирмата Kabi-Vitrum от Мюнхен. Този тест се основава на активирането на Limulus-AmoebOcyten-Lysat(LAL) от ендотоксините. Активираният LAL разделя жълтото багрило р-нитроанилин от хромогенния субстрат /S-2423/, на който се измерва екстинкцията като определяща съдържанието на ендотоксини (НМ) при 450 пш, използвайки спектрален фотометър. Ако това съдържание е под 0,1 ng/mg, димерният разтвор се поставя в колбата с кръгло дъно и се лиофилизира.

Горният процес може да бъде повтарян толкова често, колкото е възможно до получаване на желаното количество окончателен рибонуклеазен димерен продукт. Отделни дози от димера след пречистването могат да бъдат стерилизирани или по-нататък лиофилизирани според необходимостта да бъдат получени хомогенни части рибонуклеазен димер, който да бъде приложим за лечение на много вирусни и бактериални заболявания, както е разкрито във висящата свързана патентна заявка РСТ /ДПК/ САЩ 88/01785. Като допълнение към антивирусните и антибактериални ефекти могат да бъдат извлечени без потенциалната цитотоксичност, свързана с мономерната форма на ензима и други терапевтични приложения като например използване като противовъзпалително или антихистамично вещество. Настоящият метод е особено полезен поради факта, че могат да бъдат получени големи количества пречистен полезен рибонуклеазен димерен продукт. Рибонуклеазните димерни продукти получени по метода съгласно настоящото изобретение, могат да бъдат тестувани за тяхната ензимна активност върху разтвори на рибонуклеинови киселини и наблюдавани, използвайки фотометри. Използването на настоящия метод позволява получаването на високо пречистен димерен ензим, а така също и тест за неговата активност.

Следващите примери са представени само с илюстративна цел и по никакъв начин не са предназначени за ограничаване обхвата на настоящото изобретение.

Пример 1. Получаване на рибонуклеазен димер.

g рибонуклеазен мономер се разтварят в покрит огнеупорен съд, съдържащ 5 1 от 0,1 М дихидрат на натриевия хидроген фосфат и с рН доведено до 10, 0 с 0,1 N NaOH. Буферният разтвор на дихидрата на натриевия хидроген фосфат се получава чрез разтваряне на 70,98 g от дихидрата на натриев хидроген фосфат в 1,000 ml вода. След това се добавят 5 g от свързващия реагент диметил суберимидат /Sigma Batch №29,3687/ при 25°С /стайна температура/ който се разтваря в рамките на 1 min. Нивото на рН на разтвора се контролира и се довежда непрекъснато до рН 10, използвайки 0,1 N NaOH. Използвайки магнитна бъркалка, разтворът непрекъснато се разбърква и се оставя да реагира в продължение на 45 min при около 25°С. Реакцията се спира като рН се намалява до около 7,0 използвайки 1 М НС1.

На определени периоди след започване на реакцията на свързване се отделят образци за проба и анализират чрез гел-електрофореза. Мономери, димери и мултимери на рибонуклеазата се отделят в SDS гела. Мономерната форма на рибонуклеазата, която се използва, има относително молекулярно тегло 15,000 и димерната форма е приблизително два пъти по-голяма от посочените размери. С електрофоретичните изследвания ясно се вижда, че димерната връзка се образува 15 min след добавянето на свързващия реагент и тази връзка става все по-ясна и отчетлива с напредването на реакцията. В допълнение, олигомерните форми на рибонуклеазата се образуват след 30 min.

Димеризираният рибонуклеазен разтвор се концентрира до 800 ml в тангенциална поточна система (Millipore). Милипорната система включва Filtron Ausschluss 10,000 d филтър, олефинна мембрана от 7 бара износоустойчивост на скъсване и Вердер /Verder/ 80 W тип 20-30 Н 60079 помпа. Началното налягане е 2 бара, а крайното налягане е като минимум по-ниско от 0,2. Работният капацитет е приблизително 1 л на час. Апаратът има мъртво пространство от 400 мл, така че при прекратяване процеса на концентрация, апаратът се промива с 400 мл, който води до краен обем от 1,200 мл.

След това концентрираният рибонуклеазен разтвор се подлага на процес на филтрация, използвайки Sephadex G 50 F /Pharmacia/, за да се отделят различните олигомерни форми по време на димеризационния процес. За провеждане на тази филтрация, колона с диаметър 25,2 см и 120 см височина се промива с обем от 60 л 50 мм амониев хидроген карбонат при pH 8,6. Буферен разтвор на амониев хидроген карбонат в количество 50 мМ се получава чрез разтваряне на 3,95 г амониев хидроген карбонат в 1,000 мл вода. След това целият белтъчен разтвор от 1,200 мл се нанася върху гелна основа и елуира с равновесен буферен разтвор. Фракции от приблизително 1,000 мл се събират от фракционен колектор /LKB 2211 Suprec/ в продължение на приблизително 15 мин, при съответна скорост на потока от 80 мл/мин. Елуационният профил се записва от LKB 2210 рекордер при скорост от 0,5 мм/мин и абсорбцията се измерва при 280 пш чрез LKB 2238 Uvicor sil. Елуационният профил, както се вижда от фиг.1 показва три пика, първият от които представлява мултимерите на рибонуклеазата, вторият показва димерите и последният пик съответства на мономерните форми на ензима. Във фиг. 1 дебелата линия означава абсорбционният профил на рибонуклеазните разтвори с почувствително откриване в сравнение с по-ниската тънка линия на графиката.

След това рибонуклеазната смес в индивидуалните фракции се анализира посредством SDS-полиакриламид-гел-електрофореза / SDS-PAGE/ процедура съгласно с Thomas et al. PNAS 72:2626 (1975). При тази процедура 50 μ 1 от всяка фракция се смесва с 50 μ I от покриващия буферен разтвор и сместта се нагрява в продължение на 10 мин при 95°С. След това 25 μ 1 от тази смес се нанася върху гел джоб. По време на опита стандартната IV / Мегск/ белтъчна смес се нанася като еталон, покривайки молекулярни тегла от 12,300; 30,000; 45,000; 66,200 и 76,000. Използваният покриващ буферен разтвор се състои от следните съставки:

0,72 г трие HCL /0,06 М/ 0,136 г ЕДТА /III/ /5мМ/ 0,18 г Глицерин /10 %/ г SDS, pH установено на 7,2 /добавени 90 мл вода/ мл бета-меркаптоетанол /10 %/

За гел-електрофорезната процедура се приготвя 18 % сепариращ гел, който се наслоява с 3,9 % колекторен гел. Сепариращият гелен разтвор за 18 % акриламид се състои от следните съставки:

г акриламид

0,045 г бисакриламид

0,136 г трие HCL pH 8,8 /0,325 М/

0,03 г SDS

200 μΐ 10 % амониев персулфатен разтвор μΐ TEMED

Колекторният гелен разтвор за 3,9 % акриламид се състои от следното:

0,39 г акриламид

10,4 мг бисакриламид

0,125 м трие HCL pH 6,8 мг SDS

100 μ 1 10 % амониев пероксисулфатен разтвор μΐ TEMED

SDS-полиакриламидният гел се получава като се вземат две стъклени плочки с размери 20 х 20 см, които внимателно се почистват и изплакват с етанол и се поставят една върху друга. Две разделителни ивици с дебелина 1 мм /дължина 20 см, широчина 1 см / осигуряват пространство между плочките, в което се изсипва гела. Разделителните ръбове се поставят от левия и десен край на стъклените плочки. Ръбът на дъното се запечатва с текстилна прилепваща лента и всичките три ръба се укрепват с фиксатори. Ръбовете допълнително се запечатват с 1 % агарозен разтвор. След втвърдяване на агарозата, сепариращият гелен разтвор, получен по-горе се пълни в междините във вертикална позиция до приблизително 3 см под върха на стъклената плочка и с помощта на пипета Pasteur се покрива със слой вода. След приблизително 30 мин телът се полимеризира. Водното покритие се излива и края на гела се изплаква веднъж с колекторния гелен разтвор, описан по-горе.

След това колекторният гелен разтвор се пълни до ръба и колекторен гребен тип Тефлон се вмъква така, че ръба на дъното на този пробен джоб лежи приблизително 1 см над предния ръб на сепариращия гелен слой. След приблизително 15 мин колекторният гел се полимеризира и гребенът може да бъде отстранен. След това се отстранява текстилната прилепваща лента и гелът се свързва във вертикалната позиция към електрофорезен апарат. Буферните камери се пълнят с елекрофорезен буферен разтвор / 6 г трис-основа, /0,05 Μ/; 28,5 г глицерин, /0,38 Μ/; 1 rSDS, /0,1 %/ и 1,000 мл Н₂О/ и гелните джобове се изплакват веднъж с помощта на буферен спрей. Рибонуклеазните димерни проби се нагряват в продължение на приблизително 10 мин в буфера, покриващ при 95°С и напълнен в контейнер или област в джоба или пространството за тестуване на пробите, съответстващи на гелния джоб.

Електрофорезата се извършва при около 20 мА в продължение на около 4 ч. Ако се предпочита електрофорезата да се извършва през нощта, това може да се направи като се намали заряда до около 6-8 мА. Движещият се фронт може да се направи видим като се смеси 0,02 % син бромфенол с покриващия буфер. Електрофорезата се прекратява, когато движещият се фронт на реакцията достигне ръба на дъното на гела. Сепариращият гел се срязва, оцветява се в продължение на приблизително 30 мин във фиксиращ разтвор и след това отново се избелва в продължение на 2 ч в избелващ разтвор от 400 мл метанол, 140 мл оцетна киселина, и 2,000 мл Н₂О. Фиксиращият разтвор се приготвя чрез комбиниране на 500 мл от избелващия разтвор с 12 мл оцветяващ разтвор, съдържащ 1 г Coomassie-blue /R 250, Мегск/, 50 мл Н₂О и 50 мл метанол. Протеиновите ивици стават видими при оцветяване с оцветяващия разтвор, както бе посочено по-горе. Следите, оставени при използване на SDS-PAGE техниката посочват постепенно увеличение на количеството на димеризирала рибонуклеаза в пробите, които накрая включват фракции, съдържащи също така и мултимери.

Всички фракции, които са предимно в димерна форма, се събират и концентрират до 800 мл в тангенциална поточна система / Millipore/. Мембранната диафрагма се промива отново с 400 мл от разтвореното вещество, така че се получава общ обем от 1,200 мл разтвор с останали димери. След това този разтвор се лиофилизира и съхранява при 4°С до следващия етап. Лиофилизацията се извършва като разтворът се разпределя на порции, приблизително по 200 мл всяка в 500 мл-ови колби с кръгло дъно. След това колбите се поставят в течен азот и замразяват в ротационен изпарител /Heidolph VV69/. След това колбите се затварят, като се запечатват и съхраняват в продължение на 30 мин при -30°С. Накрая то зи материал се лиофилизира с помощта на стандартна процедура.

Преди започване на следващия етап, мономерната рибонуклеаза, отфилтрирана от първия филтрационен етап се събира и рециклира в димеризационния процес. В този случай фракциите от филтрационния етап, които са първоначално рибонуклеаза в мономерна форма, се събират и концентрират до 4 л, използвайки горепосочената тангенциална поточна система. След това мономерните фракции се димеризират, използвайки свързващия реагент, както е посочено по-горе. След свързващия етап, при който се използват рециклираните мономери се извършва филтрационния процес, както е посочено по-горе и сега рециклираните мономери се получават в димерна форма. Лиофилизатите, получени от първия димеризационен процес се комбинират с димерните лиофилизати, получени от рециклирането на мономерите.

Комбинираната лиофилизирана рибонуклеазна смес, получена от горния етап се хроматографира отново върху Sephadex G 50 F, за да се получи подобрено разделяне на димерите от мономерите и олигомерите. Процесът на хроматографиране се извършва, като се използва Sephadex G 50 F (Pharmacia) колона в 0,2 М натриево-ацетатен буфер при pH 5. 0,2 М натриево-ацетатният буферен разтвор се получава, като се разтвори 27,22 г натриев ацетат в 1,000 мл вода. Хроматографията се извършва при условията и използвайки апарата, както е описано погоре в първия филтрационен етап.

В този случай се получава елуационен профил, който може да се наблюдава на фиг.2. На тази фигура дебелата линия представлява профила на абсорбция на рибонуклеазните разтвори, получени при използване на по-чувствителен детектор, отколкото при профила, означен с тънката линия. Средата на по-чувствителния елуационен профил показва голям главен пик, съдържащ димери и само два вторични слаби пика. SDS-PAGE анализ на ензимите, взети от пиковите фракции показва по-голямо акумулиране на димери в основния пик, сравнено с елуационния профил на първия филтрационен етап.

Фракциите на основния пик се събират и концентрират посредством тангенциална поточна система, описана по-горе. Тези събра ни фракции се пускат за обезсоляване през Sepharex G25 колона. Колоната има диаметър

25,2 см, височина 65 см и базисен обем 32 л и действа при скорост на потока 15 л/ч. Всички рибонуклеазни разтвори от основния пик на втория елуационен профил до максимум 5 л се покриват върху Sephadex колоната. Обезсоляването се извършва, използвайки 50 мМ буферен разтвор на амониев хидрокарбонат. Обезсоляващият цикъл продължава 90 мин, при което се събират 5 л. Остатъците от цикъла се изхвърлят. Записва се елуационнен профил и единствения пик се събира в 5 литрова Schott колба. Следи от образеца от пречистения окончателен продукт се очертават при условията на редукция с бета-монотиогликол и в ненамалена форма. SDS-PAGE проучвания на крайния продукт сочат, че само димерната форма на рибонуклеазата присъства.

За да се постави лиофилизирания белтък във фармацевтично използваема форма е необходимо да се освободи рибонуклеазата от ендотоксини. За тази цел пречистените димери се хроматографират, използвайки Детоксигелна /Detoxigel/ колона. За да се получи максимално възстановяване на желания рибонуклеазен димерен материал, е необходимо да се използват буферни разтвори с физиологични граници на pH. Това се постига чрез добавяне на солени разтвори. Ензимните разтвори се нанасят върху Детоксигелната колона и ендотоксините в количеството до 1,500 E.U./мл се отстраняват. Преди и след всеки цикъл Детоксигелът се регенерира с 1 % дезоксихолат, последвано от хубаво промиване с вода, докато ендотоксините не могат повече да бъдат открити в миещото средство. Обемът на колоната е 750 мл /диаметър 9,5 см, височина 14 см/ и колоната се уравновесява с 0,1 М амониев бикарбонат. Свободният от ендотоксини буферен разтвор се смесва със стерилна вода. Рибонуклеазен разтвор с обем от 2 л се нанася върху гелното легло и се оставя да попие в гела. След това белтъкът се елуира с уравновесяващия буферен разтвор и се събира в стерилен огнеупорен съд. След това разтворът се пуска за лиофилизация в стерилна колба с кръгло дъно.

Съдържащите се в получения продукт, ендотоксини се определят с диагностичен набор, наречен “ Coatest (R) ” на фирмата KabiVitrum от Мюнхен. Този тест се основава на активирането на Limulus-Amoebocyten-hysat (LAL) от ендотоксините. Активираният LAL отделя жълтото багрило р-нитроанилин от хромогенен субстрат /S-2423/ и намаляването на цвета се измерва със спектрален фотометър, като определящо съдържанието на ендотоксините при 405 nm. Пречистените рибонуклеазни димерни продукти, които имат под 0,1 ng/ mg се подават до колбата с кръгло дъно и след това се лиофилизират. Полученият продукт е лиофилизиран високо пречистен рибонуклеазен димерен разтвор, който може да бъде съхранен до възникване на необходимост от по-нататъшно използване.

Пример 2. Тест за ензимна активност.

Ензимната активност на димерната рибонуклеаза, получена съгласно настоящото изобретение може да бъде тестувана с помощта на тест за активност, описан от Kunitz, Y.Gen. Physid. 24:15 (1940). Този тест се основава на факта, че като резултат от влиянието на рибонуклеазата върху рибонуклеиновата киселина, нейният абсорбционен спектър се премества в UV /ултравиолетовия/ обхват към по-къса дължина на вълните. В обхвата 290-305 nm концентрацията на нуклеинова киселина се намалява в резултат на разграждане с рибонуклеазата. В началната фаза на реакцията това намаляване протича линейно и може да бъде използвано като мярка за ензимната активност. При този тест намаляването на количеството нуклеинова киселина е измерено на 300 nm.

Тестът се извършва при постоянна температура от 25°С и се използва кювета, която може да се темперира, така че всички разтвори могат да бъдат обработвани преди употреба в продължение на 5 мин при 25°С. Правят се измервания при 300 nm, използвайки спектрален фотометър. Обемът на реакцията е 3 мл и реакцията се извършва в 3 мл кювета, в която дебелината на слоя е 1 см.

Реакционната смес се получава, като се използват 1,5 мл разтвор на рибонуклеинова киселина, 0,05-0,5 мл-ови проби за тестуване, включително рибонуклеазните фракции, и вода в количество от 10 мл. Разтворът на рибонуклеинова киселина се получава, използвайки 80 мг рибонуклеинова киселина и натриева сол /Boehringer/ разтворена в 50 мл ацетатен буферен разтвор. Ацетатният буферен разтвор е 0,1 М ацетатен буферен разтвор при pH 5, получен чрез смесване на 0,57 мл кристална оцетна киселина с приблизително 80 мл дестилирана вода, като pH е доведено до 5 с 1 N NaOH и дестилирана вода до 100 мл, последвано от стерилно филтриране. Тестуваните проби от разтвори, включително рибонуклеазните димери се получават от 5 мг проба от рибонуклеазен димер, разтворен в 5 мл дестилирана вода разредено така, че измерваната стойност да е в благоприятни граници.

Рибонуклеиновата киселина и тестуваните пробни разтвори се смесват в кювета и редукцията на нуклеиновата киселина се проследява в продължение на приблизително 20 мин., използвайки спектрален фотометър Spectronic 1001 /Bausch &Lomb/. Абсорбционният профил се записва и линеарните граници се наблюдават в продължение на около 8 мин. Реакциите продължават при 25°С до завършване на реакцията, което става след приблизително 3 часа. След това разтворите отново се измерват за определяне на окончателната стойност, като измерванията се повтарят два пъти, за получаване на средната стойност.

За изчисляване активността на ензима, трябва да се определи екстинкцията на нуклеиновата киселина, при началото на реакцията /Е_о/ и крайната екстинкция /Е_е/ на реакцията при Δ Е/минута от линейния начален обхват. Разреждането на рибонуклеазната димерна проба, трябва така да бъде избрано, че Δ Е/ минута да е не по-голямо от 0,007. Определя се стойността на празна проба от реакцията с рибонуклеаза и вода, която трябва да бъде извадена от измерваните стойности. Една ензимна единица се определя като количеството ензим, при което условията на опита пораждат капка от 100 % на минута със стойност ЕЕ_е от субстрата при 25 % С. Възможно найголямата стойност за екстинкция, наблюдавана при 300 nm е Е_о-Е_е. Изчисляването на специфичната активност на ензима става както следва:

/3 х Δ Е/мин/ фактор на разреждане /Е_о-Е_с/ х обема /мл/ от пробния разтвор

Димерните рибонуклеазни ензими съгласно настоящото изобретение показват значителни стойности на ензимна активност.

Claims

1. Метод за получаване на пречистен рибонуклеазен продукт, където рибонуклеазният разтвор се получава чрез добавяне на мономерна рибонуклеаза към буферен разтвор, добавяне на подходящ свързващ агент за димеризация на рибонуклеазните мономери в рибонуклеазния разтвор и разделяне на димеризиралия рибонуклеазен разтвор от контаминантите с помощта на течна хроматография, характеризиращ се с това, че:

-буферният разтвор е с pH, доведено поне до 9;

-стойността на pH се поддържа поне 9 по време на димеризацията;

-реакцията на димеризация се спира в даден етап, чрез понижаване стойността на pH до около 7; и

-провежда се поне един допълнителен етап на разделяне с течна хроматография.

2. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че мономерният рибонуклеазен разтвор е с pH доведено до около

10.

3. Метод съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че мономерният рибонуклеазен разтвор е с pH доведено до 10 чрез добавяне на NaOH.

4. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че буферът използван в мономерния рибонуклеазен разтвор се състои от разтвор на дихидрат на секундерен натриев фосфат.

5. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че свързващият реагент се добавя към мономерния рибонуклеазен разтвор, като разтворът се поддържа при pH около 10.

6. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че свързващият реагент включва суберимидатни производни, по-специално диметилсуберимидат.

7. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че димеризационните етапи се осъществяват при стайна температура.

8. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че димеризационните етапи се извършват при непрекъснато разбъркване на разтвора.

9. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че димеризационната реакция се спира чрез добавяне на HCL.

10. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че димеризираният рибонуклеазен разтвор се концентрира преди филтрационните етапи, използвайки тангенциална поточна система.

11. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че първият филтрационен етап се извършва, използвайки декстран йонообменна смола с омрежена структура.

12. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че рибонуклеазният мономерен разтвор съдържа 40-60 г рибонуклеазен мономер и 4-6 л буферен разтвор и където свързващият реагент е добавен в количество от около 4-6 г.

13. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че фракциите, събрани след първия филтрационен етап се анализират чрез гел-електрофореза.

14. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че фракциите, събрани след първия филтрационен етап се лиофилизират.

15. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че фракциите, събрани след първия филтрационен етап, които са първично мономерни рибонуклеази се рециклират в димеризационния процес.

16. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че вторият филтрационен етап се извършва, използвайки декстран йонообменна смола с омрежена структура.

5

17. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че вторият филтрационен етап се извършва при pH около 5.

18. Метод съгласно претенция 17, характеризиращ се с това, че pH на втория филтрационен етап е получено използвайки натриев ацетатен буфер.

19. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че фракциите, събрани по време на втория филтрационен етап се анализират чрез гел-електрофореза.

20. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че обезсоляващият етап се извършва след втория филтрационен етап.

21. Метод съгласно претенция 20, характеризиращ се с това, че обезсоляващият етап се извършва използвайки декстран G 25 колона с омрежена структура.

22. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че включва по-нататък етап на отстраняване на ендотоксините от пречистения рибонуклеазен димерен продукт.

23. Метод съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че ендотоксините се отстраняват използвайки Детоксигел колона.