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,'Pr'cgd6¯de reion d'u . i u. 1'ae d'±9-'hk'ri-chia coli' 2S--BEBäErS5-i3-Sl2B-12SäI coli
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deposE par lLà 'Sacii¯te
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UCB,.SA.
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ä Bruxelles.
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.., ce, tte itivention a'ii Cette inventionae & realn.eesl'Universi teLLibre de BruKelles, Facu.'Ldes Sciences Depattsment:deNiQlosie icolculaire, rue es Chevaux 67' 164Q Rhode-Saint-Ca & se que) Br.
C. ravader" hr 'fBelgique), pär P. ; Jacos, nr. f Sciences ; A. Orsvador Dr. en Scieares R, Loriau, Tchnicenne F. Broc. kty ; ;' a Ch cha > n'a, sitre Bs Sciencc ; B. claUjt Dr. eh Sci. enct. $ ; P. Chchana, DiploTn d'Et-udtes Superieures ApproCoQias an. ssi, 0fli, e DiplÏmE d:'Etude.s Superieures,.Ap'prvi:ctad,ies en ssi ie Moleculaire ; A. Hersog, Or. en Sciences & t A. Bollen, Dr. en Sciences.
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Proeede de preparation d'un clono d'Eschericha coliS ¯g=ki nfts 9 hufha* ne. te : d el onet ... dEche rifchal 'podui, ', A. e & 'preproufoki'na. se'hui'n. e. E a '' ! ' :'. ;, '-''' :. '..'' ?. p. r'oduc t''o. n'-''' ; tt" ? uh'.-''A Dt. tt'. oontptetne t & 'ire'"' ; d'o. ub : t 'b m ; ; ."un AD 1 me'd : ouble bri-ril, AL8; ;práe:nte 0 nvention > 9ppt s pSpar,fiion tUip., ,Xclenei,, "S,Ti dti,EiS,ehertiht lS ' -pr.odu,itnt; e M da la pt'aprouf'okia. so hnmain (ce molcule sefa, pr:ofucti0on'ig ,'unS A'D;N' > oomp8cmentiaiJrie > ' ,,'do.uble' br'.inS < ; I jeorr'Qspòndantj,iA fntor.-at'ion ',genét' 'u i. 0 '4C',t f' ',1 ti ,, de la pr'tiDprouirokinzsc :humaint ;t cètt''s 0 moI*cfulè ser:a:;' appelée c i-, : a pr ä s. i. DN-U t ä vectura comporthnt l'DM-UK, etvue tde la mise ett . oeuvre dejaespr'pri & aiolossrques'.'''.' : :.'' -'"''.
'. oeuttr > die'ses' pr;'priEt-ès'-, bicflògiS4u4',' .. joeuvre de. aes L ; L'urokinase (5C 3. . 99. X & ),'iun des cofnposant. s u 'lasma sangl. lf.' : : ;. est :'s : ynthd, tisée, ; :, t :'dans :.. lel"einì, e't : ;, ; ; \ se < ; retee dans l*'uine Cette enzyme fonctiontte essentieUement en tant < q'acti'vtur du plasmnögne. ; Lss plasmne active resultnt du} civage proteolytique de hon precureur, le plasminogena, ;xerce une activit e aion pré.curseur, < le' pl:asminogèns} exeree', une aCtivitts ribrinoj. ytiqua.
Därt c contaxe, 'urokinase a unte 0 n q e7,. urokinan4'a une v & leur th4rapeutiquo pcur la dissoltion de Lhrombi in vivo et a ete produit pour cela, seit a partir d'urine. soit & partir de nülieu de culture de callules ranales humaines Des etudes biochirniques sur l'urokinase ont montre l'extstence de trois formes de .1' urokinase ont montré; 1' ex.istence de trois formes de I'enxyme. L'une a un po ids moleeulaire de'environ 54000, daltons ; eile consiste en deux ehaines (A et B) liees es \par des ponts disulfures et d'un poids moleculaire respectif de 18000 et 33000 daltons. La seconde forment consiste en le polypeptide de 3000 daltons uniquement t est derivee de la forme de haut poids moleculaire.
;respectif da 18000 et 33000 daltons., La seconde 0 forme Les deux ror'nes, 54K e33K daltons, sont act'ivQs et ut-ilisees en Therapie. Leur eqfuehce en acidesa,. nine Les deux: f'ortnes, ".54K et", 33E. dal.to,ns. sont act'ivé's: et; est connue Leur utilisation comme agent thrombotytique' ';est connùis.
Leiur utilisation commè agent thrombolytlque t; 'a neanmoina ete limit4e par l'activation syatemique du plasminogen qui se produit'iurant le traitement et augmente significativement le ri. sque d'hémorragie.
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u rXW f crme d'e uraki L'e d :'1ten'c, '1,' : d'. u,. l')'toiaiè :,, ; f drnia d''1' : uroki d ; se -UK P, it o (appelle ufokinas. siMpto oHa : ine. ac-UK ou aotivätur du plastnogene r & nal/kPA, o prourokin a Wte omm niG. emontpeercemmantC de < nem, qua sorjacivaio par ttn & . i ; ' j '- :. ' ;'..''.'''' : ; ; ttposi : tioFt contrdl6 a l. plsmine.
Comme 1 & plasmine activa äst trouvassentieHetnent l. ie & la fibrine eu ia form & t. ion de omplexes & v & c dtinhi beurs eat '-'''''-.''-...''.'.-.. ! Qtnpechee, la convrsio. i de ; I, a praup, o'cinase inactive an t & molcule activa po'trrait se raire spcifiqusntct. la surface dLf eaiH. ot sanguin L'utilisation thrapeubique de la prourokinasa permattrait donc d'viter les effets secondaires obaarves av c J'enzyme active..''\. '...''.' a ckt i ve .
La präsent invention a pour obet un procédé de préparation d'un clone d'Escharichia coli produisant la preprourokinase humaine ne'réaliste par le clonage dans une tactrie hote d'th AOM eomp ?. & 'nen (taire double brin a pan'tir des ARN, nessagers de celules humaines produisant da 1'urokinase. Le proc4de faisat l'objet de la presonte invention est basé sur l'application d'UI18 série da moyens dans un ordre bien déterminé. 11 permet d'obtenir la preprourokinase humaine an quantité suffisante, notamment pour l'utiliser dans des applications'thérapeutiques.
Le procede de préparntion d'un clone d'Escherichia coli produisant l ! * preprourokinaae humaine selon la présente invention comprend la con) oi. naison des phases suivantes : a) l'extraction et la purification des ARM messagers totaux de cellules humaines produisar't de l'urokinase ; b) la synthise in vitro de l'ADN complementaire double ùri ri au départ. de cet ARM messager ; c) l'enrichissementt de la preparation d'ADN complémentaire double brin en moleeules de taille supérieure ou égale à celle nécessaire pour encoder
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''jurottias ,., uroki
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cet, es MO t : c i, e ,d). l'add ! t inJortemt.'es..'eoheassa' net :'. D'UK.'das.' et I & melanges ; i vitro'de/cette ;. fractioneMriehie' Pia s mi.
(t4, te n i r d e, e ee.- 'e'l le' mè'L Snk ^i"n'S vAr ; 'd:è, c,,ette .fraei ,i on ie 4 t "'.'-. : : f. ''" !'',-'-'''''j'-',"' ' .'t.' (n41, 6, cule & hi0 ; r i d e .'plastn. < t & '. p & ft. a. nt ; ;'.'. . des. .'. ; '' : mit6 : a. .'oMves.
.,' :-" :' ! ; :' : . \ < .'"'' :.'' ;" t ;' ;' '.' ; ;''.''' :'' ;'. -'i' eomplmentarepcut obtenirtde molcul hybrides ; ' f) la transCot'M & tin ! d & & batfies hota & Escharichia '. ''"'. '.'' < ''" '' ' \'. ''f'' !" :"'' < ' co 1 i : p. r : ; ceam1 : 4c't. lles'hyÇiride : s.'. : " ;', L, :. i, :,' ; t' ; ; " i, na, a r, un fr ei MIO n'. & g". d A D') ; huma i'n, cellea'jqui ont. inaer6 frätnent d'ADM human, de , : " ; " :' f, ; : " \,, : :. i :' :', ". " : maniàr. à obte' . iruneb'e : n < íua'daclon'es ; ' :, c > h) banque :".. h) l.''i. sol. entnd'. oet.'. t baqu ; des clone's por.'te'ura da AD .-,. ÜK e 1*, urokinaso Tcellest ui, Ct ins6r n SrÅagment sd ADN humain, ile -.'' :.''.''. "''' :''''.' ;.-'.' mani Orx @obte;ir, une: - b*'nque tcte .clon'es @S /. fi) l'e'xtractt'odae. a'c'l'one. d'ADM". j./.-"..' ; \'''.. l N9t PaXretStrá.ct.éri.st Iqua de l'',uroki nas,e ;
@iS j) la onstruco d & ce*. A & M-UK et de 'ADM' ; de prssmides veeteurs de molecules hyb'rides que l'on de pl6smides vect,e,urs:^ de .moléaules hybriXdes que -1' on-, clone dans desbacteris, hotea Escharichia coli en v. c de l'expressin ds la p'rprourbki'nase humaine :,' k) le choix des clones ayant insere l'ADM-UK dans l'orientation e la phase de lecture correctes par analyse de restrictph et sequen ? age de l'ADM ; I) la demonstration par immuno-essai de la production de preprourokinae par ees elones.
L'invention a pour'ob, jet, en outre, une sequence d'ADK cofnple < nentaire double brin codant pour la preprourotcinase complete design6 par ADM-UK. qui a ete." 'f isoli das clone's äes'veeteurs'qui le pr > rtent. complémentaire double brin codant pour 1x ', Elle concerne egalement les clones d'Sscherichia coli ; . e : b U porfant : l'ADM-UK etproduisant de la preprcurokihaae prepreurok 0 humaine, obtermsuivant es procd ravendiques. ; La :'sdiquenoe de humaxne produite aui-van.., o" ..'les. pce'd6',.' : 'bj'et comprend entre-' ti on,'t-omprend lés prSocEdesS ,obit,.d,e ,l' lnvon°S,ion, eomprend ,entr4; autres un peptide i gnal de 18 acides amines, un p peptid. 18K caracteri8e par h tryptophane en position. ;.
131, une lysine raiaant la. jonction entre les peptides'
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na 18 t 33KS et un pepti e'33K caractrise par une cystine tnposition 366 et une aline'et position 410. Les < fiffrente & phasaa du procad & Taisant l'objet da l'i nvent i-on l'invention comprennent : i a) Lea ARN massagera totaujt sont axtraits da celluics cellules humaines produisait l'urokina8e. (Gronbw, M. and Rliem.
R., Trends in Biotechnoogy. vol 1. n" 983. 26-29t. sse préference, lea ARN meaaa & ers totaux pr6±6rence, proviennent de cellules da carcinome de pharynx Detrolt 562. Ils peuvent etreextraits par difFrentes mthodes baséea esse, ntielloment 3u. la daatruction complte des structures cellulaires et la denaturation rapide et totale des activits ribonuclaaiquas dan & lextraitOn trouvera dans"olecular Clonin < !" (1982-Maniatis, T. Fritsch, E. F. and Sambrook, J. - G. s. H. Publ.) I'etat de l'art an cette matir.
A titre d'exempl on peut recomrir a l'emploi eorbine de detergents. tela la MP40, at d'inhibite'rs de ribonucléase, tels le vanadyl-ribonucleoside, ou encore à l'emploi d'agents chaotropiquas puiss. ants, tela les sels de guanidine.
Do préférence, on choisit la méthode décrite dans Cox, R. A. (Methods Enzymol. 12B. 120, 1968). basée sur Tutilisation da chlorure de guanidne. qujL conduit à l'obtention d'acides ribonuce'ques non dagradea et actifs.
6S ARN messagers totaux extraits de cellules humaines peuvent etre purifiés an tirant parti d'une de leurs caractéristiques, à savoir la présence d'une aäquence polyadknylique à leur extr4mit6 3'. La mathode de choix consiste a raaliser une Chromatographie d'affinit ur colonne d'oligo d (T) cellulose, selon le protocole décri t dane AV1s, H. and Leder. P. (1972, Proc. atl.
Acad. Sei. USA, 69, 1408). b) La conversion enzymatique in vitrai des ARN messagers
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polyadenylis an ADM complementaire double brin fait appel à des rEactionS enzymatiques dont la description tailléost repriae dans Genetic Engineering (1981) vol. 1. pp. 97 illiamsont\, Ed., AcademicPr'ess, N. Y. ä mple, it, iline auccessi vekment-les A titre ' ax'.emple, on UtiliSQ successiv/ament 1QS enzymes appelés transcriptase inverse, ADN polymérase et nucléase S1 pour synthétiser l'ADN complémentaire double brin portant des extrémités franches. On peut cependant utillser uniquement la transcriptase inverse et la nucléase S1 pour arriver au même résuitat.
Enfin, on peut terminer la préparation de l'ADN complémentaire double brin portant dfs extrmiteg franches par un traitement à l'ADN polymérase (Tragment Rlenow) pou'r pallier aux imperfections du traitement avec la nuclltaseS1. De préférence, on choisit cette dernière voie dans l'exécution de l'invention c) On peut enrichir la préparation d'ADN complémentaire double brin en molecules de taille supérieure ou égale ä celle necessaire pour ecodr l'urokinase en recourant aux techniques de fract\onnement habituelle.
De preference, dans la résalisation de l'invention, on choisit le fractionnement sur gradlfnc de saccharose. d) Différentes m6thodes ont été utilisees pour joindre l'ADN complémentaire double brin à l'ADN de vecteurs plasmides (Molecular Cloning, Mitniatis, T., Fritsch, E. F. and Sambrook, J., 1982, C. S. H Publ.). Les plus courantes consistent à ajouter des ertens@@ns bomopolymöriques complémentaires aux ADN que l'on veut joindre, ou des adapteurs synthétiques à l'ADM que l'on veut introduire dans ün alte de restriction particulier de l'ADN du vecteur. De preference. on choisit l'additiond'extrémitéscohésivescomplémentairesaux ADN que l'on veut joindre.
Cette technique, décrite dans Villa-Komaroff, L., Efstradiatis, A., Broome, S., Lomedico, P., Tizard, R., Naker, S.P., Chick, W. L. and
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W atl Sei. us 727)'mte''."oeu'vp.e une nzyme particuliere appelae trana'fer'asdsoxynMCieotidyle term in 1,'. m a) : Li v tio d4 6116auldä hybridea,-, :, entre, l'ARM co < nplen < attaipe double brin a clone et lADM de woteura plasmdea 'etfe & tue aelon le proce, decrit dans Kolecular Cläni ng'F ; i tsch, 1 Nanl'atis, T.
EF, and Sambrook. J., C. S. H. Publ.) qi consiste a ntManger lea moleulttS dans des cond : tions de tentpérature et da force ioniuat approprieaa. C'eat ce ropri 6e3. C'e t ce protocole qui a a't: suivi dans la réalisation de l'inventi'on. L'ADM veeteur eml & ye dns la raction de recircul & risation in Vitro pent provenir de differenth plasmides. Parmi les. plasmides lea plus couramment utilises, 1 plasmide pBR322 dt ete choiai cornfne vecteur preférenttel. I ? contient deux.sites d'insertion p & saible, PstI et BamHI. Ces deux sites conviennant A l'inaertion de l'AOM 3uamentionn4. (Bolivar, F, Rodriguez, R. L. Greee, P. J.. Betlach. M. C., Heynecker, H. L.. Boyer, H. W., Crosa, J. H, and Falkow, S., Gene. 2., 95, 1977).
Les dÅarivisdu lasmtde pBR322 peuvent aussi convenir.
Dans la réalisation de cette invention. on choisit de préférence le plaaT. ide pBR322 dont on lineanaa l'ADN et quo l'on munit d'extrémités cohesives pproprlees selon la methode décrite plus haut. D'autres plasmides, tels que le pKT279. pKT280 et pKT287 peuvent être util. tSes avantagausement. f) La plupart des mFthofles utilisées pour transformer, den bactéries par de l'ADM exogene ront appel ä un traitement partieulier dos baeteries paf du chlorure de calcium. et visent ä opti. miser l'efficaeit de transformation pour differentes soucha de bactéries.
La presenLa invention äst basee sur l'utilisabion d'une souche d'E. coli dans les deux phases revendiquées dans
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lesquelles ces bactéries inter. : vi-ennent. Dans le cadre : de la réalisationdel'invention.plusieurat, pas de miero-organ. ismas' tale, que d' autres bactéries ou des; levmres peuvent.egalement aervir d'hotes. On prndra de prefrence, la souche d'Escherichia coli HM2g4, dont les conditions de croissance sont particulièrement commodes.'.
En outre, parmi les différents procédés de transformation, on choisit celui décrit dans Handel, M. and Higa, A. (1970, J. Mol. Biol. 53, 154). g) En raison des marqueurs de résistance aux antibiotiquesprésentsdansl'ADNduvecteur,ilest simple d'isoler les bactéries transformées par l'ADN recombine in vitro. Par exemple, si l'ADN du vecteur porte le gène Tet#, toute bactérie portant un tel vecteur sera résistante à la tetracycline.
En outre, si l'insertion de l'ADN dans le vecteur a pour. effet d'inactiver un gène de résistance à un antibiotique, on repérara les bactéries qui portent le vecteur recombinant par leur senaibilit ä cet antibictique.Depréférence,onchoisitcommemarqueur da selection, le caractère Tet@ du plasmide pBR322 et comme crible pour l'insertion d'ADN dans le vecteur la perte de @ésistance à l'ampicilline. La combinalson de ces deux facteurs condu@t à l'identification de bactéries portant un vectetr recominant. h) Le crible de selection des clones porteurs de l'ADN-UK peut se faire selon des méthodes mettant en oeuvre soit une sonde naturelle ou synthatique, soit des techniques d'hybridation entre l'ADN des clones et l'ARM messager.
ou encore des moyens immunologiques Ces différentes approches sont détaillées dans Genetic Engineering, vol. 1. Milliampon, R.,Rds.. (1981) Academic Press, W. Y.
Dans le cadre de la présente invention, on utilise de
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. prif9rence dessonde oU godéscoxyr ; Í bQrÙJcléoti diques da syntthèsQ,;'caractfistiquesdes acides amiinés snIle-Hi's-Trp-Cyd-Asn-Cya-Ppo de l'ufokinaae et/ou le procede de retention de l'ARNme & sagef spercirique de ' < .'.-..-..'-'... '-. : l'urokinase humaine sur l'AOM des clonaa, auivi da la tra'ductionf in vitro et de la caraotrisation imr-unologi. qne. i) L'extract'ion de l'ADN-U. < des clones sélectionnes par rcstriction paut se fajre par différentes enzymes. Dans le cadre de la prést-nte invention on choisit de preference 1'enzyme 3gll. j) La ligation da cat A & M-UK sä fait avee Lfn plasmide vecteur. De préféra'nue & n choiit la veeteup pCQV2 (Queen, C. J., Mol. Appl. Genet. . 1-10, 1983) Jive par l'anayme BsfnHI. les doux molecules.
ADK-UK at veceur, atant pralablement tr & itees a l'A') N polymerase de 14. La transforation du vecteur hybride a lieu dans la souche d'Eacherichia coM MM29. k) La selection des olohes ayfnt inseri l'ADM-UK. dans l'orieittation et la phaae de lacture correctes a'erfectue pr analyse de restrtcion et pequenage da I'ADM.
I) La demonstration par imuno-esai do la prod'uction de preprourokin & se par ces clone e't realinee en choisiasant de pafrence la methode de 1'immun-transfart derite dans Bollen et al, FEBS Lett & ra JL & A. 67-70 (1984 qui consist. e a saparer les protineaL de l'ext. r & it. par elactrophoreate sur gal de polyacril-uMde, & lea tranaferQr sur reuille de poly4cri,talwide, A lea j tra,nsfórer- sur feuille de nitrocellulose et à r & vler la presenQe d'urokinasa par des & ntieorps antiürkne < de sours onx-memes detota par des anticorps de chevr < anti-'anticorps de souris couples a la peroxidase < GAK-POD) La pr ente invention stra tnieux eomprise a l'aide de l'axemple non lintitatif aivant.
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1. Culture da cellule {t Des cellules huniai nas de", eareinorne de pharynx de la ligne Detroit 562 (ATCC; M CCL13U) connues pour produirede l'urokinaseont été cultives jusqu'a conflueneenmilieu DMEM Supplémenté pour conteni. 0, 4 X HaHCOt. 10 % de serum de,'eau foetal, 0, 1 de mycostatine, et incubé à 370C en atmosphère contenant 5 % de Colt. Les'cellules cor. fluentes sont récoltées par centrifugation après traitement par 0, 17 % de Trypsinepandant5'a 37"C. Les culots sont rincés au PBS et gelés dans l'azote liquide.
2. Extraction et purification des ARN messagers totaux de cellules humaines.
Un culot de cellules gelbes dans l'aznte liquide a été traité au chlorure de guanidine suivant la méthode de Cox, R. A. Methods Enzymol. 12B, 120. 1968. Les ARN sont alors passes sur colonne d'oligo d (T) cellulose de faon A en recuperer lea ARN messagers totaux. 260 ug d'ARN messagers totaux ont et6 obtenus. La fraction mt & ssagere ainsi obtenue est alors traduite en polypeptides in vitro dans un syateme proteo-synthetique acellulaire isau de reticulocytes de ttpin (produit notamment par NEN Laboratories).
L'ensemble des produit synthetisees est alors fractionne sur gel de polyacrilamide < 15 %) en conditions denaturantes.
3. vittc, de l'ADN comv14meritaire double brin corres22ndAnt ä correspondant a la fractior. messaere anrichte.
Au depart de l'ARM mess & ger, on a synthetis6 l'ADM qui lui correspond. Cette Operation requiert la succession d e . plusieurs etapes enzymatiques. D'une part, a l'aide -. t } de la transcriDtase reverse, o : < obtient la fibre ci'ADN comp1émenLaire au messager. et d'autre part, à 1'aide de la mem ? enzyme ou de l'ADN polymeraso, on synthétise la deuxieme fibre d'ADN antiparallèle à la première.
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Enfin, l'action d'une troisième enzyme@ la nucléase G1, permet I'obtention de molécules d'ADN en double hélice depourvues d'extrémités monocaténaires appelées usuellement extrémités ±'ranchers.
4. Enrichissement de la préparation d'ADN complémentaire double brin en molécules de taille supérieure ou égale ä celle necessaire pour encoder l'urokinase.
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La populatin de molecules d'ADN complmentaire étant heterogene, on t*a fractionnae sur gradient de saccharose de façon à ne conserver que la fraction contenant des molecules de taille superieure ou esala a 1, 5 kilo-baaes, et doc ä favoriser l'obtention de clones contenant la majorité, ainon la totalité de l'information génétique correspondant à la preprourokinase. La taille minimale thaorique du messager de l'urokinase codant : pour un total de 410
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i acides aminés comporte donc 4@0 codons, soit 1230 bases.
A cet effet, l'ADN complémentaire double brin a été depose sur un gradient de saccharose 10- % et centrifuge an rotor Beckman SW41. Les fractions correspondant à des molécules de taille supérieure ou egale a 1, 5 kilo-bases ont fte rassemblées.
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5. Ad1ition d' & xtr'mités cohisives à la pripur on d'ADN 'coMplementaire double brin enriehie en ADN-UK.
Afin de pouvoir insérer less molecules d'ADN con) plon ; entairo double brin dans l'AD d'un vecteur approprié, il eonv'ient ie leur ajouer des xtremites chesives. A cet eff & t, on adopte la techniqt'c des ext'ensions homopolymteri. ques dcrite par Villa.-Komarofr, L., Efatradiatis, A., Broome, S., Lomedico.. P., Tizard, R.. Haker. S. P., Chick. W L. and Gilbert, w. Proe.
Matl. Acad. Sei. U. S. A. 75, 3727, 1978).
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ssans ee protocola, 90 ng d'AüM complementaire double brin enrichi o. t ete tattds par la transir rase
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terminale de façon a ajouter aux extrémités 3@ des extensions d'oligo d(C) d'environ 15 bases de long.
6. Fabrication in vitro de rec-ombinants entre l'ADN
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complamentaire double brn enricni. portant ded extremstes cohési /es. et l'ADN du vect & ur pBR322.
Les molécules d'ADN complementaire double brin enrichi sont maintenantpretes & etre inarees dans l'ADN d'' < r. vectcur plasmide. On a choisi le plasmide pBR322, portant les marqueurs de sélection Tet# et Amp# (rdsistance à la tetracycline et ä 1'ampicilline).
L'ADN de ce plasmide porte un site unique pour l'enzyme de restriction PatI, dans le gene AmpA. Dès lors, la restriction par PstI linéarise 18 plasmide et offre un sita d'insertion unique. Il suffit alors d'ajouter enzymatiquement par la méthode décrite en 5, des extensions oligo c(G) aux extrémités 5@ de l'ADN du vecteur pour pouvoir réaliser l'insertion de l'ADN ä cloner. Dans l'exemple que l'on décrit, l'ADN du vecteur pBR322 porte des extensions oligo d(G) longues de 30 bases.
Le melange de 90 ng @'ADN complémentaire double brin enrichi avec 200 ng d'ADN de vecteur pBR333, ce qui correspond à un rapport molaire vo@sin de 1, s'effectue in in v tro pendant 5 min. à 65 C et 1h30 à 57 C Le melange est alors refroidi doucement jusqu'à dans oyes conditions les moléoiles d'ADN se recombinent et se recircularisent par appariement des
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extrémft. es cohesives complémentaires.
7. Clona/ : e dans la souche d'Escherlchia coli MM294.
On precede alors à 1a transformation de la souche MM294 dont le systeme de restriction-modification est modifie de façon à tolérer la présence d'un ADN étranger selon la méthode décrite dans Molecular Cloning, Haniatis, T., Fritsch. E. F. and Sambrook, J., 1982, C. S. H. Publ.
An sein de la bacterie, les extrémités cohésives
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ne omli > Zä tee, 'son reparees pa'n u, ne , pour '"''.'. !.-. & '.''''. ;. ''''-"''. /''M\"' , g. Qbt-qntion de la-bang29 de clenes, . Eri taison e, u. earactbre, Tet : p at '¯s t t do'ns 'tAi,.D d, u pl1as mi de , teeomb: nis n t . g ,4 :fi. Ob te n t i o,n. de l a b a nQ ue d e ç l one s . . @r Eh raaon, dcaractre Tetdu'plBmdeo : t i : slecttonne' las bactri es ? transformeea par si mple croiasanca sur mi'liau contean de la'tatracyclne. çsE'}ecF-onneE .':.3l.e3.\: baetiries';l trsnsiçormses 'pur; . sim'pl'e.'t'.
Enfin, pamt le & souehes Tet,, on paut denUfi er croissaneo;' sur mili,eu conte,n,Sr.f e lia i > °tet.rincyclíne. *', reelles quiont n plas < nida)'chi. TteLrique par. e fait , cel Pl r qu'ell :, ds pas qu'el < us he ; pöusent pas n prsenc d'aici lino puisqu, l'ins tibn d'A & M etr'a. nger dana le gene AmpA du vecteur'a ina. ctive. ee gene.'' : :'. ; ;.'..--'. ;. .' ;'." L'nsemble des fnattipulatio decrites ci-dessüa a conduit & l'' btention d'une bänque de 5000 clftas. dont 'une parti & doit'contenir des'sequencas d'A & M coda ; nt pour l'urknase. pour Caractersati on d'u cjLone portem'd L'ADM-UK, On. a reeherchc ls clones porteurs de l'ADM-UK au tnoyen d'Ufne sond3 synthetique correspondant a un fragment du d' une sond3ajsynthetique correspondant a un f. agfnent du gene de I'urokinase.
La séquence en acides aminés de l'urokinase humaine est connue. Sur base d e cette infornatidn, on synthetie c. htmiquemen selon la mathode de Hsiung, H. M..
Br, osseau, R, MichnicMi. cz, J. and Marang, SA. (1979, ucleic Aoids Ret < earch 6. 1371) un fnelange d'oligodsoxyribonucleotidea'da 23 bases correspondant bas 3 correspondant aux acides atnins Asn-Ile-His-Trp-Cys-Asn-Cys-Pr'o, et 3 4' ypiques del'uokinase humaine (positions 27 et 34 dans la chaine A. ; Apres avoir marque cette sonde au "P Kr une raction ensyr. atique (kination en 5'de l a sorde), nouaXl'avssns utilisee pour eribler la banque sla Vsorde), Xno,us svebns utllis'ée pour crll)'ler la ban ,ueD de olones. Pratiqement, on fixe l'ADN de chaque clone sur feuille de nit. *ocellulose. uivant la technique de 'runstein. W. and Hogness, D. (Proc. Natl. Acad. Sei.
Acad. Sc i.
USA 72, 3961, 1975) et on l'hybride avec ld sonde
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synthétique . arquee u F. Dans des conditions iconiques out de température appropriées (0, 9 H NaCl et 28 C), la sonde radioactive va reconnaître spécifiquement l'ADN des clones portant une sequence homologue, c'est-à-dire une sequence de nucleotides typique de l'urokinase hu-naine. On visualise les clones positifs par aucoradiographie. Cette méthode a permis d'identifier 1 clone sur 5000 nalyss) portant tout l'ADN-UK.
A partir du clone sélectionné, désigné par pULB1000, on caractarise l'ADN-UK par l'établissement d'une carte de restriction. A cet effet, l'ADN inséré, isolé de plasmide par restriction PstI, est digéré par une ou plusieursautresenzymesderestiction.Laligneme,t des fragmonts obtenus permet d'obtenir une carte da
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restriction. Les hformations contenues dans cette carte permettent de générer des rragments d'ADN que l'on peut aisément marquor au 32P. Le fragment marqué est alors soumis à une serie de reactions chimiques conduisant à la production d'oligonucléotides marqués, de tailles di. rferentes, dont l'analyse sur gel de polyacrylamideconduitàl'établissementdelaséquence en bases, suivant la technique de Maxam, A.M. et Gilbert, W., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 74, 560.' La sequence est établie parallèlement et donc confirmée par la méthode de Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 5463-5467, 1977). On voit dans la figure 1 que
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1'JHtM cloné dans pULB 1000 cohtientte codon initiateur ATG et que la séquence des 57ases en aval de ce tripletcode pour une. sequence en arides amines ayantL 13$ caractéristique d'un peptide sifghal. On trouve ensuite successivement lä s6queAce codnt pour la peptide 18K, un triplet AAG codant pour une lysine, la séquencecodantpourlepeptide33K,uncodonopale (TGA) et une sequence non codante. 11 est ä remarquer
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que la séquence en acides amines déduite de la sequence du cDNA correspond aux séquences publiées de l'urokinase (Steffens et al.,Mappe-Soyler'sZ.
Physiol. Chue. 363,1043-1058, 1982) a trois exceptions pres : acide amine 131 (numéroté à partir du premier acide amine de la chafne A) est un tryptophane au lieu d't : ne cysteine. et les acides aminés 3,66; et 410 sont une cystéine ä la place d'une glycine et une valine à la place d' une alanine.
Leiragment d'AÜN-CK port6 par le clone sllectior. ne code pour la totalité de la preprourokinase.
Par aiLleurs,pnconstruitunvecteurhybride portant l'ADH codant pour la pireprotirokinase dan l'orientatiarl correctss et dans la bonne phase da lecture. Dans ce caa, on s'attend ä obaerver la synthese de la preproprot & ine humairte.. La construction de ce vecteur hybrida fnet en ocvre les & tapes suivantes (Fig. 2) : 10. Extraction de l'ADN-UK. par resriction 811 de l'ADN du vecteur hybride du clone pULB 1000 et traitement ä la DNA-polymerase de T4 pour generor des axtrenntes franche.
11. Melange de cet AOM-UK avec l'AHM du vecteur pCQV2 lin6arise par restriction 3amHI puis traite a la . DMA-p & lymerase da T pour generer des extremites frsnohes t Hgation des-Fragments d'A & M par une cnzyme HIiasa) pendant 16 heures & 4"C et transformation ; de btaerie MM294.
2. . P & rnn, caUas-ci, on idehtirie cellea ui portertt 4t lsgase} pendant 16. . heures , & 4' oG et transtormAti on ! *Asstt-UK dana l'or < & K. tatiott eorr'e & te en realisant una 22s 'rmi, c,vlles-ci, o'n,i'den!tiris ;'celles yui Portent :; ca, r. dera trictiondu veetcur hybride. On bbtient ainsi une so'uche äppelo pULB ; Tt35 caracterisee par le ,./aii,rsi.', pune ,3csuehe appelee Xp,ULBt )'35 earact.risée, par be fait qu'el. Ie oorte l'ADM-U < dans la bonne orienta'zon t dans la bonne phase de lecture derriere le pron'oteur fpr du plaatide pCQV2.
13. Pour démontrer la synthèse de preprourokinase
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humaine dans les hacteres"MM294 portant le v'ecteur hybride du clone pULB 1135, on s'appuiesurunessai.immunologique parmettant de dsstectar la pcücgi, ne dans des, extrait : s bacteriens totauy... ; ; '' :' ''"''-'' r i e n s t o t aus . . 0 S ,,, ,, 4 r , r Lorsqu'on applique ca & ystema. uX; extrais povenan des' bacteries prtaht le & diffeentveceur, que comme on s*y actend, la souch ! e cemoin"p < r'tan plasmide Comme ne synth & tise pss de'R'reprourQkrna ni ä 32C ni ä 42'C"a 1 o r,. s'q u e > 42 C, alors que pour le ; cloe pULB 1135/on detecte la presence de dette.'roeg : ine-'Z4. 4Z C.
'''''' :''-. ''''''".'''"'''''...'' Les souhes pULB 1000 ; & t. pUltB 1. 3 & : mentipfnnges Gi-avant ant ; Les sou¯hes pULB 1000. xet:, pU.Lss lit5lmenttnnees ci-avant ont',¯ fait l'ob jet de depotg. ä laCa de Cultures de Microorganismes' (ServCaut. onome Pasteur) ! ; sous les numgrs de ; d & p5t ; ; r. eäp & 0, ;
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in Brussels.
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.., ce, tte itivention a'ii This invention & realn.eesl'Universi teLLibre de BruKelles, Facu.'Ldes Sciences Depattsment: DeNiQlosie icolulaire, rue es Chevaux 67 '164Q Rhode-Saint-Ca & que) Br.
C. ravader "hr 'fBelgique), pär P.; Jacos, nr. F Sciences; A. Orsvador Dr. en Scieares R, Loriau, Tchnicenne F. Broc. Kty;;' a Ch cha> n', sitre Bs Sciencc; B. claUjt Dr. eh Sci. enct. $; P. Chchana, DiploTn d'Et-udtes Superiorses ApproCoQias an. ssi, 0fli, e DiplIME OF: 'Etude.s Superiors, .Ap'prvi: ctad, ies en ssi ie Moleculaire; A. Hersog, Or. In Sciences & t A. Bollen, Dr. in Sciences.
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Preparation process for a clono of Eschericha coliS ¯g = ki nfts 9 hufha * ne. te: d el onet ... dEche rifchal 'podui,', A. e & 'preproufoki'na. today'n. e. E a ''! ':'. ;, '-' '':. '..' '?. p. r'oduc t''o. not'-''' ; tt "? uh '.-' 'A Dt. tt'. oontptetne t & 'ire'" '; do. ub: t 'b m; ; . "un AD 1 me'd: ouble bri-ril, AL8;; práe: nte 0 nvention> 9ppt s pSpar, fiion tUip.,, Xclenei ,," S, Ti dti, EiS, ehertiht lS '-pr.odu , itnt; e M da la pt'aprouf'okia. so hnmain (ce molecule sefa, pr: ofucti0on'ig, 'unS A'D; N'> oomp8cmentiaiJrie> ',,' do.uble 'br'.inS <; I jeorr'Qspòndantj, iA fntor.-at'ion ', genét' 'u i. 0' 4C ', tf' ', 1 ti ,, de la pr'tiDprouirokinzsc: humaint; t cètt''s 0 moI * cfulè ser: a :;' called c i-,: let us know if DN-U t ä vectura behaves as MD-UK, and see tde implementation and work already already prpri & aiolossrques '.' ''. '::.' '-' "''.
'. oeuttr> die'ses 'pr;' priEt-ès'-, bicflògiS4u4 ',' .. work of. aes L; Urokinase (5C 3.. 99. X &), 'one of the co-components. s u 'lasma sangl. lf. ' ::;. is: 's: ynthd, tisée,; :, t: 'in: .. lel "einì, et:;,;; \ se <; retained in the urine This enzyme essentially functions as a" plasmic activity "; Lss active plasm result of the proteolytic civ of honorable precursor, the plasminogena,; exerts a precursor aion activity, <the 'pl: asminogens} exerted', a ribrinoj. ytiqua activities.
Därt c contaxe, 'urokinase a unte 0 n q e7 ,. urokinan4'a v & their th4rapeutiquo pc for dissolving Lhrombi in vivo and was produced for this, is made from urine. either from a culture of human ranal callules Biochemical studies on urokinase have shown the extensence of three forms of urokinase have shown; The existence of three forms of the enzyme. One has a molar weight of about 54,000 daltons; It consists of two strands (A and B) linked by disulfide bridges and with a respective molecular weight of 18,000 and 33,000 Daltons. The second form consists of the 3000 dalton polypeptide only t is derived from the high molecular weight form.
; respectively from 18000 and 33000 daltons., The second 0 forms The two lines, 54K e33K daltons, are active and used in Therapy. Their eqfuehce in acidsa ,. nine Both: f'ortnes, ".54K and", 33E. dal.to, ns. are active: and; is known Their use as a thrombotytic agent ''; is known.
Leiur use as thrombolytlque agent t; Neanmoina was limited by the syatemic activation of plasminogen which occurs during treatment and significantly increases the ri. bleeding.
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u rXW f crme d'e uraki L'e d: '1ten'c,' 1, ': d'. u ,. l ')' toiaiè: ,,; f drnia d''1 ': uroki d; se -UK P, it o (calls ufokinas. siMpto oHa: ine. ac-UK or aotivätur r & nal plastnogene / kPA, o prourokin a Wte omm niG. emontpeercemmantC de <nem, qua sorjacivaio par ttn &. i; ' j '-:.'; '..' '.' '' ':;; ttposi: tioFt contrdl6 a l. plsmine.
As 1 & plasmin activa was found Hetnent l. ie & fibrin had ia form & t. ion de omplexes & v & c dtinhi beurs eat '-''''''-.''-...''.'.- ..! Qtnpechee, the convrsio. i of; I, a praup, o'cinase inactive an t & activa molecule could be specific. the surface dLf eaiH. ot sanguin The therapeutic use of prourokinasa would therefore prevent obaarves side effects with the active enzyme. '' \. '...' '.' a ckt i ve.
The present invention relates to a process for the preparation of a clone of Escharichia coli producing neprealistic human preprourokinase by cloning in a host AOM eomp? & 'nen (double stranded to extract RNA, nessagers of human cells producing urokinase. The process of the subject of the present invention is based on the application of UI18 series of means in a well-ordered 11 allows sufficient human preprourokinase to be obtained, in particular for use in therapeutic applications.
The process for the preparation of an Escherichia coli clone producing l! * human preprourokinaae according to the present invention comprises the con) oi. naison of the following phases: a) extraction and purification of total messenger MRAs from human cells producing urokinase; b) the in vitro synthesis of the double DNA complementary at first. of this messenger ARM; c) enrichment of the preparation of complementary double-stranded DNA in mole-stones of size greater than or equal to that necessary to encode
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'' jurottias,., uroki
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ce, es MO t: c i, e, d). the add! t inJortemt.'es .. 'eoheassa' net: '. FROM UK.'das. ' and I &mixtures; i vitro'de / ce;. fractioneMriehie 'Pia s mi.
(t4, te nirde, e ee.- 'e'l le' mè'L Snk ^ i "n'S vAr; 'd: è, c ,, ette .fraei, i on ie 4 t"' .'-.: : f. '' "! '', -'- '' '' 'j'-'," '' .'t. '(n41, 6, cule &hi0; ride .'plastn. <t &'. p & ft. a. nt;; '.'. des.. '.;' ': mit6: a .'oMves.
., ': - ":'!;: ':. \ <.'" '':. ''; "t; ' ; ' '.' ;; ''. '' ':' ';'. -'i 'eomplmentarepcut obtirtde molcul hybrides;' f) transCot'M & tin! d & & batfies hota & Escharichia '.' '"'. '.' '<' '"' '' \ '.' 'f' '!" : "'' <'co 1 i: p. r:; ceam1: 4c't. lles'hyÇiride: s.'.:"; ', L,:. i,:, '; t '; ; "i, na, a r, fr ei MIO n '. & g". d A D '); huma i'n, cellea'jqui have. inaer6 frätnent of ADM human, de,: ";": 'f,; : "\ ,,::. i: ':',". ": way to get. iruneb'e: n <íua'daclon'es; ':, c> h) bank:" .. h) l.' 'i. ground. entnd '. oet. '. t baqu; clone's por.'te'ura da AD .- ,. ÜK e 1 *, urokinaso Tcellest ui, Ct insert n SrÅagment sd human DNA, ile -. '':. ''. ''. "'' ':' '' '.' ; .- '.' mani Orx @obte; ir, une: - b * 'nque tcte .clon'es @S /. fi) the extract'odae. a'c'l'one. from ADM ". j./.- ".. '; \' '' .. l N9t PaXretStrá.ct.éri.st Iqua de l '', uroki nas, e;
@iS j) la onstruco d & ce *. A & M-UK and 'ADM'; of prssmids which are the promoters of hybrid molecules which are plectids, which are vectors, ^ of. moleoli hybridized as -1 'on, cloned in desbacteris, hotea Escharichia coli in v. c of the expression in human perprourbki'nase:, 'k) the choice of clones having inserted ADM-UK in the orientation and the correct reading phase by analysis of restrictph and sequen? age of ADM; I) demonstration by immunoassay of the production of preprourokinae by these elones.
The invention has for its part, moreover, a sequence of double stranded dental ADK coding for the complete preprourotcinase designed by ADM-UK. which has been. "'f isolated from the clones' to the fans 'which present it. complementary double strand coding for 1x', It also concerns the clones of Ssichichia coli;. e: b U porfant: ADM-UK andproducing human preprcurokihaae prepreurok 0, obtermsuendant les processes ravendiques. The: 'sdiquenoe of humaxne produced aui-van .., or "..'. pce'd6 ',.' : 'bj'et includes entre-' ti on, 't-omprend les prSocEdesS, obit, .d, e, lnvon ° S, ion, eomprend, entr4; others a general peptide of 18 amino acids, a p peptid. 18K character by h tryptophan in position. ;.
131, a lysine that streaks. junction between peptides'
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na 18 t 33KS and a pepti e'33K characterized by a cystine tnposition 366 and an aline 'and position 410. The <fiffrente & phasaa of procad & Taisant the object da invent i-on the invention include: ia ) Lea RNA will massaging all of these are extracted from human cells that produced urokin. (Gronbw, M. and Rliem.
R., Trends in Biotechnoogy. vol 1. no. 983. 26-29t. sse preference, the meaa RNAs and total prefers, come from cells of pharynx carcinoma Detrolt 562. They can be extracted by different methods based on esse, ntielloment 3u. cellular structures and the rapid and total denaturation of ribonuclaaiquas activities in the extractWe will find in "olecular Clonin <!" (1982-Maniatis, T. Fritsch, EF and Sambrook, J. - G. s. H. Publ.) of art in this matir.
By way of example, we can recommend the use of eorbin detergents. such as MP40, and ribonuclease inhibitors, such as vanadyl-ribonucleoside, or even the use of potent chaotropic agents. ants, such as guanidine salts.
Do preferably choose the method described in Cox, R. A. (Methods Enzymol. 12B. 120, 1968). based on the use of guanidine chloride. qujL leads to obtaining ribonuce'ques acids not dagradea and active.
6S total messenger RNAs extracted from human cells can be purified by taking advantage of one of their characteristics, namely the presence of a polyadknylic acid at their 3 ′ end. The method of choice consists in carrying out an affinity chromatography on an oligo d (T) cellulose column, according to the protocol described in AV1s, H. and Leder. P. (1972, Proc. Atl.
Acad. Sei. USA, 69, 1408). b) The in vitro enzyme conversion of messenger RNAs
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polyadenylis an additional double stranded ADM uses enzymatic reactions whose description is described in Genetic Engineering (1981) vol. 1. pp. 97 illiamsont \, Ed., AcademicPr'ess, NY ä mple, it, iline auccessi vekment-les As an 'ax'.ample, we use 1QS successive / ament enzymes called reverse transcriptase, DNA polymerase and S1 nuclease to synthesize Complementary double stranded DNA with blunt ends. However, only reverse transcriptase and nuclease S1 can be used to achieve the same result.
Finally, we can complete the preparation of complementary double-stranded DNA carrying blunt dfs extrmiteg by a treatment with DNA polymerase (Tragment Rlenow) to overcome the imperfections of the treatment with nuclltaseS1. Preferably, the latter route is chosen in the execution of the invention. C) The preparation of complementary double-stranded DNA can be enriched with molecules of size greater than or equal to that necessary for ecodr urokinase by using fract techniques. \ usual habit.
Preferably, in the embodiment of the invention, the fractionation on sucrose is chosen on gradation. d) Different methods have been used to join the double stranded complementary DNA to the DNA of plasmid vectors (Molecular Cloning, Mitniatis, T., Fritsch, E. F. and Sambrook, J., 1982, C. S. H Publ.). The most common are to add complementary biomorphic ertens @@ ns to the DNAs that we want to join, or synthetic adapters to the ADM that we want to introduce into a particular restriction alte of the vector DNA. Preferably. we choose the addition of complementary cohesive ends to the DNA that we want to join.
This technique, described in Villa-Komaroff, L., Efstradiatis, A., Broome, S., Lomedico, P., Tizard, R., Naker, S.P., Chick, W. L. and
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W atl Sei. us 727) 'mte' '. "o'vp.e a particular nzyme called trana'fer'asdsoxynMCieotidyle term in 1,'. ma): Li v tio d4 6116auldä hybridea, -,:, between, ARM co < nplen <clone double-strand attack and Woteura plasmdea ADM etfe & kills according to the proce, described in Kolecular Cläni ng'F; i tsch, 1 Nanl'atis, T.
EF, and Sambrook. J., C. S. H. Publ.) Which consists in eating the meat under conditions of temperature and of appropriate ionic strength. This is this 6e3 ropri. It was this protocol that was: followed in carrying out the invention. The vein ADM used in the in Vitro recirculation process can come from different plasmids. From. most commonly used plasmids, 1 plasmid pBR322 dt was chosen as the preferred vector. I? contains two possible insertion sites, PstI and BamHI. These two sites are suitable for the insertion of the AOM 3uamentionn4. (Bolivar, F, Rodriguez, R. L. Greee, P. J .. Betlach. M. C., Heynecker, H. L .. Boyer, H. W., Crosa, J. H, and Falkow, S., Gene. 2., 95, 1977).
The darivis of the pBR322 lasmt may also be suitable.
In carrying out this invention. the plate is preferably chosen. ide pBR322 whose DNA is lineanaa and which is provided with cohesive pproprleft ends according to the method described above. Other plasmids, such as pKT279. pKT280 and pKT287 can be used. It is advantageously. f) Most of the mFthofles used to transform bacteria into exogenous ADM will require special treatment of calcium chloride baths. and are aimed at opti. bet the transformation efficiency for different strains of bacteria.
The present invention is based on the use of a strain of E. coli in the two phases claimed in
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which these bacteria inter. : are coming. In the context: of the realization of the invention, several, no miero-organ. ismas' tale, than other bacteria or; levmres can also serve breakfast. We prefer to take the Escherichia coli HM2g4 strain, whose growing conditions are particularly convenient. '.
In addition, among the different transformation methods, the one described in Handel, M. and Higa, A. (1970, J. Mol. Biol. 53, 154) is chosen. g) Due to the antibiotic resistance markers present in vector DNA, it is simple to isolate bacteria transformed by recombinant DNA in vitro. For example, if the vector DNA carries the Tet # gene, any bacteria carrying such a vector will be resistant to tetracycline.
In addition, if the insertion of DNA into the vector has for. effect of inactivating an antibiotic resistance gene, bacteria which carry the recombinant vector will be identified by their susceptibility to this antibiotic. Preferably, the selection marker is chosen, the Tet @ character of the plasmid pBR322 and as a screen for the insertion of DNA in the vector loss of ampicillin resistance. The combination of these two factors leads to the identification of bacteria carrying a recurrent vector. h) The selection screen for clones carrying DNA-UK can be carried out according to methods using either a natural or synthatic probe, or hybridization techniques between the DNA of the clones and the messenger ARM.
or immunological means These different approaches are detailed in Genetic Engineering, vol. 1. Milliampon, R., Rds .. (1981) Academic Press, W. Y.
In the context of the present invention,
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. prif9rence desonde OR godéscoxyr; Í bQrÙJucleoti diques de syntthèsQ,; 'characteristicsde amino acids snIle-Hi's-Trp-Cyd-Asn-Cya-Ppo of ufokinaae and / or the process of retention of RNAme & sage spercirique de' <.'.-. .-..'-'... '-. : human urokinase on the AOM of clonaa, auivi da the transduction in vitro and caraotrisation imr-unologi. something. i) Extraction of U-DNA. <clones selected by restriction may be differentiated by different enzymes. In the context of the present invention, the enzyme 3gll is preferably chosen. j) The A & M-UK cat ligation is carried out with the vector plasmid. Preferably, the veeteup pCQV2 is chosen (Queen, C. J., Mol. Appl. Genet. 1-10, 1983) Jive by the anayme BsfnHI. the sweet molecules.
ADK-UK has lived, having previously been treated with A ') N polymerase of 14. Transformation of the hybrid vector takes place in the strain of Eacherichia coM MM29. k) The selection of olohes has been included with ADM-UK. in correct oration and lactation phaae to be perfected for restriction analysis and peening of the ADM.
I) The demonstration by imuno-esai of the production of preprourokine by these clones was carried out by choosing, preferably, the method of the immun-transfart derived in Bollen et al, FEBS Lett & ra JL & A. 67-70 (1984 which consists of sizing the proteins of the outer layer by elactrophoreate on polyacril-uMde gal, & lea tranaferQr on poly4cri rale, talwide, A lea j tra, nsfórer- on sheet of nitrocellulose and to reveal the presence of urokinas by antiurkne antibodies (of their own onion and detoxified by chevr antibodies (anti-mouse antibodies coupled with peroxidase (GAK-POD)). understood with the aid of the non-lentative example alive.
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1. Culture of cell {t Huniai nas cells ", pharynx cell of the Detroit 562 line (ATCC; M CCL13U) known to produce urokinase have been cultivated until confluence in medium DMEM Supplemented for content. 0.4 X HaHCOt 10% of fetal water serum, 0.1 of mycostatin, and incubated at 370C in an atmosphere containing 5% of Colt. The fluent coral cells are harvested by centrifugation after treatment with 0.17% of Trypsinpandant5'a. 37 "C. The pellets are rinsed with PBS and frozen in liquid nitrogen.
2. Extraction and purification of total messenger RNA from human cells.
A pellet of gel cells in the liquid aznte was treated with guanidine chloride according to the method of Cox, R. A. Methods Enzymol. 12B, 120. 1968. The RNAs are then passed through an oligo d (T) cellulose column so as to recover the total messenger RNAs. 260 ug of total messenger RNA were obtained. The mt & ssagere fraction thus obtained is then translated into polypeptides in vitro in an acellular proto-synthetic system comprising ttpin reticulocytes (produced in particular by NEN Laboratories).
All of the synthesized products are then fractionated on polyacrilamide gel (15%) under denaturing conditions.
3. vittc, corresponding double stranded DNA corresponding to the fraction. rich messaere.
At the start of the ARM messenger, we synthesized the ADM which corresponds to it. This Operation requires the succession of e. several enzymatic steps. On the one hand, using -. t} of reverse transcriDtase, where: <gets the complementary DNA fiber to the messenger. and on the other hand, using mem? enzyme or polymeraso DNA, we synthesize the second antiparallel DNA fiber to the first.
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Finally, the action of a third enzyme @ nuclease G1, makes it possible to obtain DNA molecules in double helix lacking single-stranded ends usually called ends ± stanchions.
4. Enrichment of the preparation of double stranded complementary DNA with molecules of size greater than or equal to that necessary to encode urokinase.
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The populatin of complementary DNA molecules being heterogeneous, we are fractionated on a sucrose gradient so as to retain only the fraction containing molecules larger than or esala at 1.5 kilo-baaes, and doc to promote the obtaining clones containing the majority, as well as all of the genetic information corresponding to the preprourokinase. The minimum thaoric size of the coding urokinase messenger: for a total of 410
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i amino acids therefore has 4 @ 0 codons, or 1230 bases.
To this end, the double-stranded complementary DNA was deposited on a 10% sucrose gradient and centrifuged using a Beckman SW41 rotor. The fractions corresponding to molecules of size greater than or equal to 1.5 kilo-bases were collected.
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5. Addition of cohesive ends to the pripur on of double stranded DNA enriehie in DNA-UK.
In order to be able to insert the corresponding DNA molecules; entairo double strand in the AD of a suitable vector, it is necessary ie to add to them chesive ends. To this end, we adopt the technique of homopolymer extensions. as described by Villa.-Komarofr, L., Efatradiatis, A., Broome, S., Lomedico .. P., Tizard, R .. Haker. S. P., Chick. W L. and Gilbert, w. Proe.
Matl. Acad. Sei. U. S. A. 75, 3727, 1978).
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without this protocol, 90 ng of enriched double stranded AüM o. You have been tattooed by the clean shaved
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terminal so as to add to the 3 @ ends oligo d (C) extensions about 15 bases long.
6. In vitro manufacture of recombinants between DNA
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complementary double brn enricni. bearing ded extremstes cohesi / es. and the DNA of the vector pBR322.
The enriched double strand complementary DNA molecules are now ready to be incorporated into the DNA of <r. vectcur plasmid. Plasmid pBR322 was chosen, carrying the selection markers Tet # and Amp # (tetracycline and ampicillin resistance).
The DNA of this plasmid carries a unique site for the restriction enzyme PatI, in the AmpA gene. Therefore, restriction by PstI linearizes 18 plasmid and provides a unique insertion site. It is then sufficient to add enzymatically by the method described in 5, oligo c (G) extensions to the 5 @ ends of the DNA of the vector in order to be able to carry out the insertion of the DNA to be cloned. In the example that is described, the DNA of the vector pBR322 carries oligo d (G) extensions 30 bases long.
The mixture of 90 ng @ 'complementary double strand DNA enriched with 200 ng of vector DNA pBR333, which corresponds to a vo @ sin molar ratio of 1, is carried out in v tro for 5 min. at 65 ° C. and 1 hr at 57 ° C. The mixture is then cooled gently until, under oyes conditions, the DNA molecular stars recombine and recirculate by pairing the
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extremft. es additional cohesives.
7. Clona /: e in the strain of Escherlchia coli MM294.
This is followed by the transformation of the strain MM294, the restriction-modification system of which is modified so as to tolerate the presence of a foreign DNA according to the method described in Molecular Cloning, Haniatis, T., Fritsch. E. F. and Sambrook, J., 1982, C. S. H. Publ.
Within the bacteria, the cohesive ends
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ne omli> Zä tee, 'son reparees pa'n u, ne, for' "''. '.! .-. &'. '' ''.;. '' '' -" ''. / '' M \ "', g. Qbt-qntion de la-bang29 de clenes,. Eri taison e, u. Earactbre, Tet: p at' ¯stt do'ns' tAi, .D d, u pl1as mi de , teeomb: nis nt. g, 4: fi. Ob te ntio, n. of laba nQ ue de ç l one s. @r Eh raaon, dcaractre Tetdu'plBmdeo: ti: selects' las bactri es? transformé par si mple croiasanca sur mi'liau contean de la'tatracyclne. çsE '} ecF-onneE.' :. 3l.e3. \: baetiries'; l trsnsiçormses' pur;. sim'pl'e.'t '.
Finally, pamt le & souehes Tet ,, on paut denUfi er croissaneo; ' on mili, eu story, n, Sr.f e lia i> ° tet.rincyclíne. * ', real quiont plas <nida)' chi. TteLrique by. e fact, cel Pl r que ell:, ds pas que el <us he; do not have a presence here, since the A & M etr'a ins tibn. nger dana the AmpA gene of the vector'a ina. ctive. ee gene. '':: '. ; ; .'..-- '. ;. . ' ; '. "The set of fnattipulatio described above led to the obtaining of a bank of 5000 clftas. Of which' one party 'must contain the sequences of A & M coda; nt for the urknase, for Characterization of a portem'd ADM-UK, We have reeherchc clones carrying ADM-UK with a synthetic probe3 corresponding to a fragment of a synthetic probe corresponding to a f. have the urokinase gene.
The amino acid sequence of human urokinase is known. On the basis of this information, we synthesize c. htmiquemen according to the method of Hsiung, H. M ..
Br, osseau, R, MichnicMi. cz, J. and Marang, SA. (1979, ucleic Aoids Ret <earch 6. 1371) a fnelange of oligodsoxyribonucleotidea'da 23 bases corresponding low 3 corresponding to the atnin acids Asn-Ile-His-Trp-Cys-Asn-Cys-Pr'o, and 3 4 ' ypiques of human uokinase (positions 27 and 34 in chain A.; After having marked this probe with "P Kr an ensyr. reaction (kination in 5 'of the sorde), nouaXl'avssns used to erect the bank sla Vsorde ), Xno, us svebns utllis'ée pour crll) 'ler la ban, ueD de olones. In practice, we fix the DNA of each clone on a nit sheet. * Ocellulose. Using the technique of' runstein. W. and Hogness , D. (Proc. Natl. Acad. Sci.
Acad. Sc i.
USA 72, 3961, 1975) and hybridized with a probe
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synthetic. arched u F. Under iconic conditions or appropriate temperature (0.9 H NaCl and 28 C), the radioactive probe will specifically recognize the DNA of clones carrying a homologous sequence, that is to say a nucleotide sequence typical of hu-dwarf urokinase. The positive clones are visualized by radiography. This method made it possible to identify 1 clone out of 5000 nalyss) carrying all the DNA-UK.
From the selected clone, designated by pULB1000, the DNA-UK is characterized by the establishment of a restriction map. To this end, the inserted DNA, isolated from plasmid by PstI restriction, is digested by one or more other enzymes of restriction. The alignment, t of the fragmonts obtained makes it possible to obtain a da
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restriction. The information contained in this map makes it possible to generate DNA fragments that can be easily labeled with 32P. The labeled fragment is then subjected to a series of chemical reactions leading to the production of labeled oligonucleotides, of sizes di. References, whose analysis on polyacrylamid gel leads to the establishment of the base sequence, according to the technique of Maxam, A.M. and Gilbert, W., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 74, 560. ' The sequence is established in parallel and therefore confirmed by the method of Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 5463-5467, 1977). We see in Figure 1 that
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1'JHtM cloned into pULB 1000 cohtientte codon initiator ATG and that the sequence of 57ases downstream of this tripletcode for one. amino acid sequence having L 13 $ characteristic of a sifghal peptide. Next, there is successively the sequence Ace coding for the peptide 18K, an AAG triplet coding for a lysine, the sequence coding for the peptide 33K, uncodonopal (TGA) and a non-coding sequence. It should be noted
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that the amino acid sequence deduced from the cDNA sequence corresponds to the published sequences of urokinase (Steffens et al., Mappe-Soyler'sZ.
Physiol. Chue. 363, 1043-1058, 1982) has three exceptions: amino acid 131 (numbered from the first amino acid in chain A) is a tryptophan instead of t: does cysteine. and amino acids 3.66; and 410 are a cysteine in place of a glycine and a valine in place of an alanine.
Leiragment of AÜN-CK carried by the clone sllectior. does code for all of the preprourokinase.
By the way, it constructs a hybrid vector carrying the ADH coding for the worst protirokinase in the correct orientatiarl and in the correct reading phase. In this case, we expect to observe the synthesis of the humane preproprotect. The construction of this hybrid vector takes place in the following steps (Fig. 2): 10. Extraction of DNA-UK. by restriction 811 of the DNA of the hybrid vector of the clone pULB 1000 and treatment with T4 DNA polymerase to generate free radicals.
11. Mixture of this AOM-UK with the AHM of the vector pCQV2 linearized by 3amHI restriction and then treated with. DMA-p & lymerase da T to generate frsnohes ends t Hgation of A-M Fragments by a HIiasa cnzyme) for 16 hours at 4 "C and transformation; of MM294 building.
2.. P & rnn, caUas-ci, on idehtirie cellea ui portertt 4t lsgase} for 16.. hours, & 4 'oG and transtormAti on! * Asstt-UK in gold <& K. tatiott eorr'e & te by making a 22s 'rmi, c, vlles-ci, o'n, i'den! Tiris;' those yui Carry:; because. dera trictiondu veetcur hybride. This results in a pulb äppelo so'uche; Tt35 characterized by,. / Aii, rsi. ', Pune, 3csuehe called Xp, ULBt) '35 earact.risée, by be fact that it. Ie the ADM-U <in the correct orientation in the correct reading phase behind the fpr pronator of the pCQV2 plaatid.
13. To demonstrate the synthesis of preprourokinase
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human in hacteres "MM294 carrying the hybrid vector of the clone pULB 1135, we rely on an immunological test by disrupting the pcücgi, not in, extract: s bacteria totauy ...;; '': '' '" '' - '' rienstot aus. . 0 S ,,, ,, 4 r, r When applying ca & ystema. uX; extract povenan of 'bacteria prtaht the & diffeentveceur, that as we * acted there, the strain! e cemoin "p <r'tan plasmid As not synthesized pss de'R'reprourQkrna neither at 32C nor 42A" at 1 o r ,. if q> 42 C, while for the; cloe pULB 1135 / we detect the presence of debt.'roeg: ine-'Z4. 4Z C.
'' '' '': '' -. '' '' '' ". '' '"' '' '' ... '' Les souhes pULB 1000; & t. pUltB 1. 3 &: mentipfnnges Gi-avant ant; The sou¯hes pULB 1000. xet :, pU.Lss lit5lmenttnnees above have ', ¯ ob jet de depotg. to the Microorganism Cultures' (ServCaut. onome Pasteur)! ; under the numbers of; d &p5t;; r. eäp &0,;