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L'invention concerne un procédé d'obtention de phospholipides natu- rels à partir de phosphatides végétaux bruts, en particulier à partir de ceux qu'on prépare de façon connue en partant de fèves de soja. Les esters diglycéri- ques de l'acide cholinephosphorique et de l'acide colaminephosphorique sont con- nus comme représentants de phosphatides-esters très répandus dans le règne ani- mal et végétal. Voir par exemple, Paul Karrer, Lehrbuch der organischen Chemie, 1950, p.247. Ces esters sont toujours associés, particulièrement dans les phos- phatides bruts d'origine végétale. Ce mélange de substances est désigné dans le commerce et dans l'industrie sous le nom'de lécithine.
Suivant la nomenclatu- re chimique, on ne désigne cependant sous les noms de lécithine ou lécithines, que les représentants de la classe de corps des phosphatides, qui contiennent la choline comme groupe basique. Quand la colamine représente la partie basique, le chimiste parle de céphaline; voir Karrer, même ouvrage, p. 2470 Les phospha- tides-esters possèdent la formule de structure suivante:
EMI1.1
Lécithine: ester diglycérique d'acide chlolinephosphorique.
EMI1.2
Céphaline: ester diglycérique d'acide colaminephosphoriqueo Comme les radicaux d'acides gras varient, il n'existe plusieurs lécithines, res- pectivement plusieurs oéphalines.
On a découvert à présent que, dans certaines conditions, on peut ob- tenir, à partir de phosphatides bruts d'origine végétale, en particulier égale- ment à partir de phosphatide brut de fèves de soja, des phospholipides natu- rels dans lesquels les esters diglycériques d'acide choline-phosphorique domi- nent, ou qui sont constitués exclusivement d'esters diglycériques d'acide cho- line-phosphorique, et qui possèdent en outre une teneur élevée en acides gras essentiels qui, de leur côté, jouent un rôle essentiel dans l'activité médico- thérapeutique de cette importante classe de corps biologiqueso
On a également découvert que les esters diglycériques d'acide choli- ne-phosphorique obtenus suivant le procédé de la présente invention, peuvent 'être dissociés par voie enzymatique si on les traite par du venin de serpent;
du fait que le venin de serpent attaque et sépare les acides gras fixés en posi- tion alpha, de manière à former des esters de chloline de l'acide monoglycéro- phosphorique, dénommés lysoléoithines, qui, de façon surprenante, portent enco- re en position bêta des acides gras essentiels à non-saturation multiple, ce qui joue un rôle important aux points de vue physiologique et médical,.
Dans le language médical, on entend aujourd'hui par acides gras es- sentiels, de façon générale les acides gras nécessaires à la vie, que le corps humain ne peut créer de lui-même. Il s'agit d'acides gras à non-saturation multiple, de configuration bien déterminée-, parmi lesquels l'acide linoléique occupe l'organisme humain, une position clé, parce que, à partir de cet acide, il se forme dans le corps, comme acide essentiel, par exemple l'acide arachido- nique très actif, qui est un acide tétraénique à 20 atomes de carbone.
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En ce qui concerne le rôle que les acides essentiels jouent dans l'organisme humain, on citera parmi la littérature copieuse, par exemple les pu- blications suivantes:
Rieckehoff et ses collaborateurs (Archiv Biochem. 25, 1-12, 1950), ont découvert par des essais effectués sur des animaux qu'en cas de diète par manque de graisse, une petite quantité d'acide linoléique suffit déjà pour syn- thétiser l'acide arachidonique dans le corps.
Schulz (Medizin. 29/30, VII, 1007, 1954) démontre qu'en cas de ma- ladies aiguës du parenchyme du foie, la durée de la maladie est écourtée par des administrations d'acides gras à non-saturation multiple. On obtient éga- lement un effet net dans des cas d'hépatopathies chroniques.
EMI2.1
Allegri (Croh.Sc.med.Torino, 97, 6, 1954) montre, par des essais effectués sur des animaux, que, comparativement à des animaux témoins, des rats atteints d'hépateotomie partielle, alimentés d'acides gras non saturés, accusent une régénération plus rapide du restant de leur foie - en poids et sous forme d'image histologique - (forte activité karyocinétique) et un accroissement no- table des diamètres des noyaux.
EMI2.2
Knipping (l6ineh,medowsehr. 97,$, VI, 901 1955) montre que les aci- des gras à non-saturation multiple sont aptes à écourter les hépatopathies lé- gères et de gravité moyenne, et surtout la phase si difficile à traiter, com- prise entre l'hépatopathie et la reconstitution. Dans des essais sur animaux, l'engraissement des petites lèvres reprend, et la concentration de glycogène dans le foie s'accroît. En outre, la sécrétion de bile est activée et le miroir d'acide pyrocatéchique s'affaiblit. D'après Schettler, des acides gras essen- tiels à non-saturation multiple, ne possèdent pas seulement une action lipotro- pique, mais exercent également une action favorable sur la synthèse de glyco- gène.
En ce qui concerne le rôle qui revient aux phospholipides à base de choline en général, et aux acides gras essentiels, en particulier en médecine, la Demanderesse s'est donné pour but l'obtention, à partir de phosphatides bruts d'origine végétale, de préférence à partir de phosphatides bruts de fèves de soja, principalement ou exclusivement d'esters de choline de l'acide diglyoéro- phosphorique, ayant une teneur aussi élevée que possible en acides gras essentiels, L'invention a donc-pour but principal de réaliser le traitement de phosphatides végétaux, en particulier des phosphatides bruts de fèves de soja, de manière.
à conserver d'une part les acides gras essentiels contenus dans les phosphatides esters, c'est-à-dire de les amener ainsi à une teneur désirée élevée, mais d'au- tre part également de séparer en même temps une quantité aussi grande que pos- sible des corps d'accompagnement, et parmi eux également tous les phosphatides- esters qui ne contiennent pas de choline comme composant basique. L'invention concerne donc un procédé de préparation de phospholipides naturels ayant une teneur élevée en acides gras essentiels et en choline, et le produit obtenu par ce procédé.
L'invention a en outre pour but la préparation d'un phospholipide neutre, à teneur élevée en acides gras essentiels, constitué pratiquement exclu- sivement d'esters de choline de l'acide diglycérophosphorique, et pouvant être considéré comme chimiquement pur, parce que des phospholipides qui contiennent certains constituants incompatibles avec le plasma, en particulier l'ester di- glycérique de l'acide colamine phosphorique, c'est-à-dire la céphaline, ne con- viennent pas pour l'administration intraveineuse.
A ce sujet, on trouve dans la littérature, les données suivantes: O'Brien publie dans Lanoet, 271, 232 (1956), des essais relatifs à des substances activant la coagulation du sang. Il recherche une interdépen- dance entre l'apparition accrue de thromboses coronariennes-et l'alimentation riche en graisse modifiée des cinquante dernières années. L'auteur réussit à
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montrer que non seulement les graisses, mais également et dans une mesure beau- coup plus grande, certains phospholipoïdes, notamment la phosphatidyl-éthanolami- ne (céphaline), accélérée. les phénomènes de coagulation.
Au cours d'essais d'a- limentation par des catégories de graisses déterminées et de la céphaline, il montre que c'est avec la céphaline que la coagulation se modifie le plus.
Summer et Summer (Joof Biol.Chem. 154, 531, 1940) décrivent un fer- ment existant dans les fèves de soja (peroxydase), apte à oxyder des acides gras non saturés en présence de peroxyde d'hydrogène. Suivant Michlin et Pschenno- va, (Biochimija 11, 437, 1946) ce ferment possède des liaisons non saturées sur lesquelles l'oxygène peut être fixé de façon labile. Les essais de Kamaljan (Biochimija 16, 396, 1951) ont montré que l'addition de colamine abaisse la fixation d'oxygène du ferment, et ralentit également la décoloration des caro- tinoides par des peroxydeso L'oléate de colamine ralentit également l'activité du peroxydase.
De même, en septembre 1956, dans sa conférence donnée à Londres au Symposium sur la biologie de la vieillesse, Sinclair montre que la facilité accrue de coagulation du sang peut être causée par une concentration accrue en phosphatide d'éthanolamine.
L'invention a finalement pour but de séparer des esters diglycériques d'acide cholinephosphorique, les acides gras fixés en position alpha. Les es- ters de choline d'acide monoglycérophosphorique obtenus, possèdent une activité biologique élevée grâce à leur tensio-activité extraordinairement grande. Ils possèdent une action d'activité d'échange de matières et peuvent par exemple être utilisés comme energeticum cardiaque. Les esters de choline de l'acide monoglycérophosphorique sont, contrairement aux esters d'acide diglycérophospho- rique, remarquablement solubles dans l'eau, et sont par contre insolubles dans l'éther et l'acétone.
Il est connu de préparer des esters de l'acide diglycérophosphorique à partir de phosphatides bruts, en particulier également à partir de phosphati- des bruts de fèves de soja, par extraction préalable du phosphatide brut au moyen d'acétone, suivie du traitement par l'alcool du mélange d'esters obtenu par cet- te. extraction.
Suivant la présente invention, on effectue la préparation à partir de phosphatides bruts, en particulier à partir de phosphatide brut de fèves de soja, par extraction jusqu'à épuisement du phosphatide brut pas l'acétone à une température ne dépassant pas 35 , et.traitement du mélange ainsi obtenu pour en séparer dans une large mesure l'ester diglycérique de l'acide cholinephosphori- que et l'ester diglyoérique de l'acide colaminephosphorique, également par extrac- tion à une température ne dépassant pas 35 , et en présence d'un gaz inerte, par de l'alcool, et de préférence à l'abri de la lumière.
On obtient de cette manière, avec un rendement satisfaisant, des phospholipides, contenant comme constituant basique principalement de la choline et possédant par rapport aux acides gras totaux, une teneur de 60% en acides gras essentiels.
Suivant une nouvelle phase du procédé, pour séparer complètement l'ester diglyoérique de l'acide colaminephosphorique, on introduit la solution alcoolique à une température ne dépassant pas 35 et à l'abri.de la lumière, de l'air ou d'oxygène,en présence d'un gaz inerte, au-dessus d'une colonne con- tenant une suspension alcoolique d'un carbonate ou d'un oxyde d'un ou de plu- sieurs éléments du second et du troisième groupe du système périodique des élé- ments, de préférence de l'aluminium et/ou du magnésium. Aux fins de l'inven- tion, l'oxyde d'aluminium s'est montré particulièrement indiqué.
Par évapora- tion dans le vide de la solution alcooloque quittant la colonne, en présence d'un gaz inerte, on obtient des esters dé choline de l'acide diglycérophospho- rique chimiquement purs, qui conviennent par conséquent à une administration intraveineuse, et qui possèdent une teneur extraordinairement élevée en acides gras essentiels.
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Pour augmenter le rendement en esters diglycériques d'acide choline- phosphorique, il faut séparer par élutriation par de l'alcool, les composés d'addition formés dans la colonne d'une part à partir de l'oxyde ou du carbonate et d'autre part à partir des esters diglycériques des acides choline- ou colami- nephosphoriqueso On réunit à la première solution, la solution obtenue par élu- triation par l'alcool qui s'écoule de la colonne et on concentre les deux so- lutions dans le vide, en présence d'un gaz inerte.
L'ester de choline de l'acide diglyoérophosphorique obtenu conformé- ment à l'invention, est une substance incolore de consistance pâteuse, qui se dissout aisément dans l'éther et le chloroforme, également dans l'alcool, l'é- ther de pétrole et d'autres solvants organiques. Il est complètement insoluble dans l'acétone. Le teneur en azote total atteint théoriquement 2,05%. L'in- dice d'azote sous forme de choline, déterminé analytiquement d'après Kjeldahl, est de 2,04%; par conséquent, plus de 99,5%, c'est-à-dire pratiquement 100% de l'azote total, existent sous forme de choline.
Les acides gras de l'ester ob- tenu suivant l'invention sont de l'ordre de 17,7% d'acides saturés et 82,3% d'a- cides non saturés, calculés par rapport aux acides gras totaux. Les chiffres ab- solus des acides gras non saturés seuls sont les suivants:
pour une teneur to- tale de 82,3%, l'acide oléique intervient à raison de 17,2%, l'acide linoléique à raison de 52%, l'acide linoléique à raison de 13,1%.,.Si on transforme ces chif- fres absolus en chiffres relatifs par rapport aux acides gras non saturés, on obtient 20% d'acide oléique, 64% d'acide linoléique et 16% d'acide linoléique, c'est-à-dire qu'au point de vue des acides essentiels seuls, la proportion d'a- cide linoléique atteint 80%, et la proportion d'acide linoléique 20%, grâce au mode opératoire particulier du procédé conforme à l'invention.
EXEMPLE. -
On sépare les constituants huileux de 8 kg de phosphatide brut de fèves de soja en les traitant en plusieurs fois par environ 150 litres d'acé- tone à une température ne dépassant pas 35 . On sépare l'acétone du résidu in- soluble dans le vide et en présence d'un gaz inerte, puis on le soumet à une extraction répétée par de l'éthanol, de nouveau à une température maximum de 35 et à l'abri de la lumière, de l'air ou de l'oxygène, en faisant passer un gaz inerte à travers l'appareil d'extraction. On purifie les solutions alcooli- ques par repos pendant plusieurs jours, pour en séparer les matières en sus- pension ou à l'état de solution colloïdale.
Par concentration des solutions dans le vide, en faisant passer en même temps un gaz inerte tel que l'azote ou l'anhydride carbonique, on obtient, avec un rendement d'environ 25 à 30%, une fraction de phospholipide qui contient, par rapport aux acides gras totaux, 60% d'acides gras essentiels, ce qui correspond à une teneur d'environ 45% des consti- tuants importants dans la molécule totale.
On introduit 1 litre de la solution ainsi obtenue, à une concentra- tion d'environ 2-3%, en 10 heures, à l'abri de la lumière, de l'air ou de l'oxy- gène, au-dessus d'une colonne d'absorption, ayant par exemple un diamètre de 4 cm, contenant une suspension de, par exemple 10% d'oxyde de magnésium et d'o- xyde d'aluminium dans l'éthanol. Après le passage de la solution alcoolique à travers la colonne, on élutrie au moyen de' 3 litres d'éthanol. On concentre les solutions alcooliques dans le vide en présence d'un gaz inerte. On obtient ainsi, suivant la concentration de la solution de l'aster de choline, 10 à 14 g d'ester de oholine -de l'acide diglycérophosphorique chimiquement pur, c'est-à- dire exempt de céphaline.
On dissout 5,7 g de l'ester de oholine de l'acide diglycérophosphori- que dans 570 cm3 d'éther exempt de peroxydes, on la fait réagir avec 6 cm3 d'une solution aqueuse de 18 mg de venin de serpent (Crotalus adamanteus), puis on laisse au repos pendant 24 heures à la température ordinaire, après des agita- tions répétées. On distille ensuite le solvant dans le vide sans tenir compte de la formation de dépôt. On obtient 2,9 g d'ester de choline de l'acide mono-
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glycéophosphorique, contenant, par rapport aux acides gras totaux, 28% d'aci- des gras essentiels à non-saturation multiplet
REVENDICATIONS.
1.- Procédé d'obtention de phospholipides naturels à partir de phos- phatides bruts végétaux, en particulier de lécithine de fèves de soja, par ex- traction par l'acétone et l'alcool- caractérisé en ce qu'on extrait à une tem- pérature ne dépassant pas 35 et à l'abri de l'air ou de l'oxygène, en présence d'un gaz inerte, tout d'abord la lécithine brute par l'acétone, puis le mélan- ge d'esters résultant de cette extraction par de l'alcool, et finalement on concentre la solution alcoolique dans le vide en faisant passer en même temps un courant de gaz inerte.