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BE1031211B1 - Composition et son utilisation pour le traitement des maladies héréditaires - Google Patents

Composition et son utilisation pour le traitement des maladies héréditaires Download PDF

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BE1031211B1
BE1031211B1 BE20226100A BE202206100A BE1031211B1 BE 1031211 B1 BE1031211 B1 BE 1031211B1 BE 20226100 A BE20226100 A BE 20226100A BE 202206100 A BE202206100 A BE 202206100A BE 1031211 B1 BE1031211 B1 BE 1031211B1
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molecule
transposase
complementary
region
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BE20226100A
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BE1031211A1 (fr
Inventor
François Cherbonneau
Prunevieille Aurore Cherbonneau
Original Assignee
Quidditas Sa
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Publication date
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Priority to PCT/EP2023/087872 priority patent/WO2024141569A1/fr
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Priority to IL321709A priority patent/IL321709A/en
Priority to AU2023415360A priority patent/AU2023415360A1/en
Priority to KR1020257024825A priority patent/KR20250128352A/ko
Priority to CN202380089442.5A priority patent/CN120569473A/zh
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Abstract

L’invention concerne une composition comprenant - une première molécule d’acides nucléiques simple brin comprenant une région complémentaire d’une cible et des sites de reconnaissance d’une transposase, - une deuxième molécule d’acides nucléiques simple brin comprenant une région complémentaire d’une cible et des sites de reconnaissance d’une transposase, et - une troisième molécule simple brin comprenant une séquence codant une partie du récepteur gamma de l’interleukine 2 ou IL2-Rγ, ou codant le récepteur IL2-Rγ complet, et des sites de liaison à une transposase.

Description

1 BE2022/6100
Description
Titre de l’invention : Composition et son utilisation pour le traitement des maladies héréditaires
L'invention concerne une composition et son utilisation pour le traitement des maladies héréditaires.
La DICS-X ou Déficit Immunitaire Combiné Sévère lié à IX est causé par des mutations du gène IL2Ry induisant un dysfonctionnement du système immunitaire causant des infections sévères, des fièvres et des éruptions cutanées.
La sous-unité gamma du récepteur à l’interleukine-2 (IL2-Ry), régulée par le gène IL2-Ry, est commune à beaucoup de récepteurs à l’interleukine (IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15) et est présente à la surface des cellules souches hématopoïétiques. Cette protéine, en association avec d’autres, est essentielle pour la formation des lymphocytes. Ainsi, la mutation du gène IL2Ry entrainant un blocage de la production du récepteur IL2-Ry entrainera par la même un blocage de la différenciation cellulaire en lymphocytes, principalement les lymphocytes T et Natural
Killer (NK). De même, l’absence de lymphocytes T et NK dans l’organisme entraine une inactivation des lymphocytes B formés.
Ce gène IL2Ry se situe sur le chromosome X. Les mâles ne présentant qu’une seule copie de ce chromosome et donc du gène IL2Ry sont automatiquement atteints par la maladie en cas de mutation du gène. En revanche, les femelles possédant 2 copies du gène, sont dites « porteuses saines » et ne présenteront des symptômes de la maladie que dans des cas extrêmement rares.
Les symptômes de la DICS-X apparaissent généralement à l’âge de 3 à 6 mois. La plupart des enfants atteints présentent des retards de croissance, des éruptions cutanées au niveau oral et génital, ainsi que de multiples infections persistantes entrainant la mort au bout d’1 ou 2 ans en [absence de traitement.
La prévalence de la DICS-X est très difficilement évaluable due à un manque de diagnostic, mais a été estimée à environ 1 naissance sur 50 000.
Le traitement de référence est la reconstitution du système immunitaire par transplantation de moelle osseuse. Le taux de succès de cette approche est directement lié au niveau de compatibilité entre le donneur de moelle et l’enfant malade. Si la compatibilité est élevée (généralement la moelle provenant du frère ou de la sœur du patient), une rémission totale sera atteinte dans 20% des cas. En revanche, dans 80% des cas, le patient développera des symptômes plus ou moins intenses de GVHD (Graft Versus Host Disease), c’est-à-dire que les cellules immunitaires de la moelle transplantée attaqueront le patient.
Le traitement alternatif est la thérapie génique basée sur l’utilisation de virus (lentivirus ou
AAV), où le gène IL2Ry est réintroduit dans un échantillon prélevé des cellules souches hématopoïétiques du patient puis réinjectées pour repeupler le système immunitaire. Cette approche, toujours en cours d’essais cliniques, se veut efficace dans 80% des cas, mais nécessite plusieurs séances de traitements extrêmement coûteux et entrainent dans 20% des cas le développement de leucémies dû au fait que cette approche virale n’est pas ciblée et 5 n’apporte pas le nouveau gène IL2Ry dans son locus originel.
La demande de brevet US20150152438A1 décrit de nouveaux développements thérapeutiques qui tendent à adapter l’approche d’édition du génome CRISPR/CAS9 au traitement de la DICS-X. Toutefois, le polymorphisme associé à cette pathologie, ainsi que la possible insertion de l’'ADNc du gène IL2Ry de plus de 600 paires de bases, demeure un frein technique notable en vue d’une utilisation clinique.
Aussi, le besoin de fournir un traitement efficace demeure.
L’un des buts de l'invention est de pallier les inconvenants de l’art antérieur.
Un but de l'invention est de proposer une composition capable de permettre Ie remplacement du gène IL2Ry de manière efficace et complète.
Un autre but de l'invention est de fournir une méthode ou un médicament capable de traiter des pathologies liées au déficit dudit gène.
L’invention concerne une composition comprenant : - une première molécule d'acides nucléiques simple brin comprenant ou constituée essentiellement d’une séquence À permettant l’insertion d’une séquence complémentaire d’un acide nucléique d’intérêt, ou comprenant une séquence complémentaire d’un acide nucléique d'intérêt, ladite séquence complémentaire étant liée en 5’ à une première séquence riches en
T de 40 à 60 nucléotides de long et en 3’ à une deuxième séquence riches en T de 40 à 60 nucléotides de long, lesdites première et deuxième séquences riches en T comprenant respectivement un premier et un deuxième domaine de 6 à 12 nucléotides riches en G/C, la sequence du premier domaine étant complémentaire de la séquence du deuxième domaine, lesdits premier et deuxième domaines étant positionnés de 15 à 52 nucléotides de ladite séquence À, ladite première molécule comprenant en son extrémité 5’ au moins une première séquence orientée 5-3’ de reconnaissance d’une transposase et en son extrémité 3’ une deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase, - une deuxième molécule d’acides nucléiques simple brin comprenant ou constituée essentiellement d’une séquence B permettant l’insertion d’une séquence complémentaire d’un acide nucléique d’intérêt, ou comprenant une séquence complémentaire d’un acide nucléique d'intérêt, ladite séquence B complémentaire étant liée en 5’ à une troisième séquence riche en T de 40 à 60 nucléotides de long et en 3’ à une quatrième séquence riche en T de 40 à 60 nucléotides de long, lesdites troisième et quatrième séquences riche en T comprenant respectivement un troisième et un quatrième domaine de 6 à 12 nucléotides riches en G/C, la séquence du troisième domaine étant complémentaire de la séquence du quatrième domaine, lesdits troisième et quatrième domaines étant positionnés de 15 à 52 nucléotides de ladite séquence B, ladite deuxième molécule comprenant en son extrémité 5’ au moins la première séquence orientés 5-3’ de reconnaissance de ladite transposase et en son extrémité 3’ la deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase, ladite séquence B étant une séquence complémentaire dudit acide nucléique d'intérêt, la séquence A étant positionnée en 5’ d’une région d'intérêt dudit acide nucléique d’intérêt et la séquence B positionnée en 3’ de la région d'intérêt dudit acide nucléique d’intérêt, et - une troisième molécule simple brin comprenant * dans sa partie 5’, au moins une séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule, * dans sa partie 3’ au moins une séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase de la deuxième molécule, et * une région intermédiaire située entre séquence complémentaire de ladite deuxième sequence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule et la séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase de la deuxième molécule, ladite région intermédiaire comprenant une séquence codant une partie du récepteur gamma de l’interleukine 2 ou IL2-Ry, ou codant le récepteur IL2-Ry complet, les première et troisième molécules d’acides nucléiques simple brin étant appariées selon la complémentarité des bases définie par Watson et Crick de sorte à définir deux sites double brin de liaison de ladite transposase et les deuxième et troisième molécules d'acides nucléiques simple brin étant appariées selon la complémentarité des bases définie par Watson et Crick de sorte à définir deux sites double brin de liaison de ladite transposase.
L'invention repose sur la constatation faite par les inventeurs que l’utilisation d’un complexe molécule tel que décrit ci-dessus, et faisant intervenir une transposase bactérienne permet un remplacement ciblé et efficace du gène IL2Ry, qui code l’IL2-Ry.
Cela signifie que l’invention concerne un complexe moléculaire comprenant une première molécule d’acides nucléiques simple brin, une deuxième molécule d’acides nucléiques simple brin et une troisième molécule d’acides nucléiques simple brin, ladite troisième molécule d'acides nucléiques simple brin comprenant ou étant constituée essentiellement en son extrémité 5’ d’au moins une séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase, et ladite troisième molécule d’acides nucléiques simple brin comprenant ou étant constituée essentiellement en son extrémité 3’ d’au moins une séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase, ledit complexe étant tel que les première, deuxième et troisième molécules d'acides nucléiques simple brin sont appariées selon la complémentarité des bases définie par Watson et Crick de sorte à définir deux sites double brin de liaison de ladite transposase dans l'extrémité 5’ de la troisième molécule et deux sites double brin de liaison de ladite transposase dans l’extrémité 3’ de la troisième molécule.
L’invention repose sur l’observation inattendue faite par l'inventeur que l’utilisation de guides simples brins spécifiques capables de cibler une région d’un acide nucléique d'intérêt permettent de mobiliser de manière contrôlée et « site spécifique » des transposases, et ainsi utiliser les propriétés de recombinaison desdites transposases pour réaliser du remplacement de séquences dans des molécules d'intérêt.
Le complexe moléculaire susmentionné est en fait l’unité de base de la technologie définie dans l'invention. Cette unité de base sert à guider les recombinases sur un site spécifique où doit avoir lieu la recombinaison, et donc le remplacement de séquence. Contrairement au système CRISPR/Cas9 qui requiert la présence de séquences de type PAM (NGG), l’outil moléculaire défini ici peut être utilisé sur n'importe quelle séquence cible, quelle qu’en soit sa séquence.
Le complexe moléculaire susmentionné est donc l’unité de base qui devra être complétée par : - une région homologie d’une région 5’ de la séquence cible, ladite région d’homologie étant représentée par la séquence A et - une région homologie d’une région 3’ de la séquence cible, ladite région d’homologie étant représentée par la séquence B.
Il s’agit donc ici d’un produit intermédiaire de l’outil tel que décrit ci-après.
Le complexe moléculaire est constitué de trois molécules d’acides nucléiques simples brins, qui peuvent être des molécules d'ADN, des molécules d’ARN ou des molécules mixtes d’ARN et d'ADN.
Ces trois molécules sont partiellement complémentaires entre elles deux à deux, selon la complémentarité des bases d'acides nucléiques définie par Watson et Crick, c'est-à-dire qu’une Adénine s’apparie à un Thymidine ou un Uracile, et une Cytosine s’apparie à une
Guanine, et réciproquement.
Plus particulièrement les trois molécules formant le complexe susmentionné comprennent — chacune la séquence d’un des brins d’une molécule double brin correspondant à la séquence de fixation d’une transposase. Aussi, chaque molécule simple brin comprend donc une « demie séquence » de fixation de transposase et ne peut donc pas permettre une interaction avec ladite transposase correspondante. En revanche, lorsque les trois molécules du complexe interagissent ensemble, par appariement des bases tel que défini ci-dessus, une = molécule double brin est ainsi formée, reconstituant un site de liaison double brin de ladite transposase, celle-ci pouvant ainsi interagir avec la molécule formée.
La première molécule.
> BE2022/6100
La première molécule du complexe est la molécule qui comprendra, une fois modifiée, une séquence d’acides nucléiques qui permettra de cibler spécifiquement une région d'intérêt d’une molécule d'acide nucléique d'intérêt. Cette séquence d'intérêt sera choisie par l’utilisateur du système selon la cible choisie. Cette séquence d'intérêt sera insérée dans la première molécule dudit complexe au niveau de la région A. Cette région A correspond a minima à deux acides nucléiques entre lesquels sera inséré la séquence permettant de cibler la molécule cible. Au vu de la structure orientée des acides nucléiques (sens 5-3), il est important que la séquence permettant de cibler la région d’intérêt soit positionnée dans le bon sens, afin que l’appariement soit possible avec la séquence cible.
Aussi, avantageusement, la région À comprend un ou plusieurs sites reconnaissant des enzymes de restrictions afin de favoriser une insertion orientée. Un ou plusieurs des sites suivants peuvent être présents dans la région A : [Table 1]
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Évidemment, dans le cadre d’une synthèse chimique de la première molécule, il n’est pas nécessaire de disposer de sites de clonage (ou d'insertion) de la séquence permettant de cibler la région cible, mais de bien prendre la précaution de donner une séquence correctement orientée. Cela est bien évidemment toutefois possible.
La première molécule est en outre constituée de part et d’autre de la région A, de séquences riches en A/T, ou s’il s’agit d’ARN en A/U, afin de permettre une certaine flexibilité de la structure. Par riche en A/T, ou en A/U, on entend dans l’invention une séquence qui comprend plus de 50% de A ou T, ou U, de préférence plus de 50% de T ou de U, par rapport au nombre total de nucléotides constituant la séquence. Ces séquences de part et d’autre de la région À ont une taille en nucléotides variant de 10 nucléotides à 60 nucléotides.
La flexibilité de ces séquences flanquantes de la région A, du fait de la présence de nombreux A, T ou U, peut avoir pour effet de permettre une recombinaison par l’intermédiaire des recombinases trop peu contrôlées, voire même lors que le complexe n’a pas encore reconnu la molécule cible.
Aussi, afin de pallier ce problème, des séquences riches en G/C sont introduites dans chacune des séquences riches en A/T, notamment riches en T, ou A/U, bordant la région A.
Ces régions riches en G/C sont constituées de 6 à 12 nucléotides, dont la quantité de C ou de
G est supérieure à 50% des nucléotides contenus dans ladite séquence riche en G/C.
Pour stabiliser la structure de la première molécule, et comme décrit ci-dessus éviter une recombinaison intempestive, les régions riches en G/C sont positionnées de 15 à 52 nucléotides par rapport à l’extrémité de la région A.
Pour plus de clarté, si la région A consiste en 3 nucléotides, le nucléotide central correspondant à la position O, la région riche en A/T ou A/U débutera à gauche en position -2, et à droite en position +2. Dès lors, à gauche, la région riche en G/C sera positionnée de la position -17 à la position -54, et du côté droit de la position +17 à la position +54.
Autre élément important, la séquence riche en G/C à droite (ou 5’) de la région A est nécessairement complémentaire (selon le principe d’appariement de Watson et Crick) de la région riche en G/C de la région à droite (ou 3’) de la région A. Aussi, la première molécule simple brin s’apparie-t-elle avec elle-même au niveau des régions riches en G/C, ce qui empêche toute recombinaison par les transposases, tant qu’il n’y aura pas d’interaction avec la séquence cible complémentaire de la région qui sera insérée dans la région A de la première molécule.
Enfin la première molécule comprend à son extrémité 5’ une séquence correspondant à un premier site de liaison à une transposase, et à son extrémité 3’ un deuxième site de liaison à ladite transposase.
Le premier site de liaison et le deuxième site de liaison sont avantageusement les mêmes, et surtout correspondent tous les deux au même brin du site de liaison double brin de ladite transposase. Cela signifie que le premier site de liaison à la transposase présent dans la région 5’ de la première molécule ne peut s’apparier intégralement, et donc de manière stable avec le site de liaison à la transposase présent dans la région 3’.
Le premier site de liaison et le deuxième site de liaison sont avantageusement les mêmes, mais correspondent chacun à un brin différent du site double brin de liaison à la transposase.
Aussi, par exemple, si le premier site de liaison à la transposase correspond au brin sens, le deuxième site de liaison à la transposase correspond à la séquence du brin complémentaire.
Il est alors possible d’avoir deux configurations : I) soit le deuxième site de liaison qui correspond au brin complémentaire est orienté dans le sens 3-5’, dans ce cas il pourra s’apparier avec le premier site de liaison à la transposase et former le site double brin, ii) soit le deuxième site de liaison qui correspond au brin complémentaire est orienté dans le sens 5’- 3’, et dans ce cas ne pourra pas s’apparier avec la première séquence de liaison à la transposase, les séquences, du fait de leur orientation n’étant pas complémentaires. Dans le cas ) susmentionné, si la première molécule simple brin s’auto-apparie au niveau des premier et deuxième sites de liaison, il ne sera pas possible de former le complexe susmentionné, car il ny aura plus de région complémentaire simple brin disponible pour s’'apparier avec la deuxième molécule de sorte à former deux sites de liaison double brin à la transposase.
Aussi, la première molécule, lorsqu’elle est dépourvue de séquence complémentaire de la region cible dans la partie A, ou lorsqu’elle contient une telle séquence cible mais que cette dernière n’interagit pas (ne s’apparie pas) avec ladite séquence cible, forme une structure tridimensionnelle où toute la molécule est simple brin à l’exception de la région correspondant aux régions riches en G/C qui s’apparient entre elles.
Une représentation schématique de sous forme appariée est représentée aux Figures 1A à 1E.
La deuxième molécule.
La deuxième molécule du complexe est de structure similaire à la première molécule. les explications susmentionnées s'appliquent donc mutatis mutandis. Toutefois, dans la deuxième molécule la région B (ou séquence B) ainsi que les sites de liaison à la transposase sont organisés de manière différente.
Tout d’abord la région B est différente de la région A de la première molécule. En effet, il ne peut, dans l’objectif d’une recombinaison orientée, y avoir de compétition pour la même cible d’intérêt entre la première et la deuxième molécule.
Aussi, est-il nécessaire que la région B corresponde à une deuxième séquence complémentaire de la séquence cible, cette deuxième séquence complémentaire de la sequence cible étant positionnée en 3’ par rapport à la première séquence reconnue par la séquence complémentaire correspondant à la séquence À de la première molécule.
Par conséquent, lorsque la première molécule et la deuxième molécule seront appariées à la séquence cible, la séquence cible sera bordée par ces deux molécules, la première molécule étant localisée en 5’ et la deuxième molécule étant positionnée en 3’. La région de la séquence cible localisée entre la région d'interaction avec la première molécule et la région d'interaction avec la deuxième molécule correspond à la séquence qui sera remplacée par celle de la troisième molécule.
La troisième molécule
La troisième molécule du complexe susmentionné est plus simple que les deux premières (la première et la deuxième molécule). La troisième molécule comprend, dans sa partie 5’, un site de liaison à la transposase qui est complémentaire du site de liaison à ladite transposase présent dans la partie 3’ de la première molécule. De ce fait, lorsque le complexe sera formé, le % site de liaison à la transposase (simple brin) localisé en 3’ de la première molécule pourrait s'apparier avec le % site de liaison (simple brin) à la transposase localisé en 5’ de la deuxième molécule de sorte à former un site de liaison double brin à la transposase, site double brin sur lequel la transposase pourra venir se fixer.
Dans la partie 3’ de la troisième molécule se trouve un site de liaison à la transposase qui est complémentaire du site de liaison à ladite transposase présent dans la partie 5’ de la deuxième molécule. De ce fait, lorsque le complexe sera formé, le % site de liaison à la transposase (simple brin) localisé en 3’ de la troisième molécule pourrait s’apparier avec le % site de liaison (simple brin) à la transposase localisé en 5’ de la deuxième molécule de sorte à former un site de liaison double brin à la transposase, site double brin sur lequel la transposase pourra venir se fixer.
Entre la partie 5’ qui comprend un % site de liaison à la transposase et la partie 3’ qui comprend un % site de liaison à la transposase, la troisième molécule comprend une séquence de remplacement, c’est à dire la séquence qui à terme remplacera la séquence cible. cette séquence de remplacement est bordée en 5’ par au moins un site de restriction et en 3’ par au moins un site de restriction ; ces deux sites de restriction étant distincts. Aussi, la troisième molécule comprend dans le sens 5’ vers 3: un % site de liaison à la transposase complémentaire du site de liaison à la transposase de la première molécule, suivi d’au moins un site de restriction, suivi de la séquence de remplacement, suivie d’au moins un site de restriction différent du site de restriction en amont de la séquence de remplacement, suivi enfin d’un % site de liaison à la transposase complémentaire du site de liaison à la transposase de la deuxième molécule.
La séquence de remplacement correspond quant à elle à tout ou partie du gène codant la _ protéine IL2-Ry, i.e. tout ou partie du gène ILR2y.
La chaîne gamma commune (yc) (ou CD132), est également connue sous le nom de sous- unité gamma du récepteur de l'interleukine-2 ou IL-2RG, ou IL2-Ry. II s’agit d’une sous-unité du récepteur des cytokines qui est commune aux complexes récepteurs d'au moins six récepteurs d'interleukines différents : interleukine 2 (IL-2), interleukine 4 (IL-4), interleukine 7 (IL-7), interleukine 9 (IL-9), interleukine 15 (IL-15) et le récepteur de l'interleukine-21. Cette chaine est une glycoprotéine qui fait partie de la famille des récepteurs de cytokines de type exprimés sur la plupart des populations de lymphocytes. Le gène ILR2y se trouve sur le chromosome X des mammifères.
IL2-Ry est exprimée à la surface des cellules sanguines immatures de la moelle osseuse.
Une extrémité de la protéine réside à l'extérieur de la cellule où elle se lie aux cytokines et l'autre extrémité de la protéine réside à l'intérieur de la cellule où elle transmet des signaux au noyau de la cellule. La chaîne gamma commune s'associe à d'autres protéines pour diriger les cellules hématopoïétiques vers la formation de lymphocytes. Le récepteur dirige également la croissance et la maturation des sous-types de lymphocytes : les lymphocytes T, les lymphocytes B et les cellules tueuses naturelles (en anglais natural killer ou NK).
La composition selon l’invention permet d’obtenir le complexe sus-décrit. La Figure 2 illustre schématiquement le complexe formé entre les première, deuxième et troisième molécules selon l'invention.
Le complexe formé à partir des molécules de la composition de l’invention, lorsque les trois molécules sont correctement appariées, comprend deux paires de sites de liaison double brin de reconnaissance d’une transposase :
- la première paire étant obtenue par l’hybridation de la première molécule avec la troisième molécule, et - la seconde paire étant obtenue par l’hybridation de la deuxième molécule avec la troisième molécule.
La séquence A contenue dans la première molécule est complémentaire du même brin de l’acide nucléique qui est complémentaire de la séquence B contenu dans la deuxième molécule. En d’autres termes, la séquence A contenue dans la première molécule et la séquence B contenue dans la deuxième molécule sont capables de s'hybrider au même acide nucléique simultanément, car les deux séquences À et B ne reconnaissent pas la même sequence.
Pour clarifier encore plus le propos, l’intérêt dans la présente invention est de proposer une première molécule et une deuxième molécule, toutes deux telles que définies ci-dessus, les séquences A et B respectives étant telles qu’elles sont capables de reconnaître pour l’une, une séquence localisée en 5’ de la séquence cible de l’acide nucléique d’intérêt et pour l’autre, une séquence localisée en 3’ de la même séquence cible de l’acide nucléique d'intérêt. Les séquences A et B sont donc complémentaires de régions bordant la séquence d'intérêt, que l’on souhaite remplacer, de la molécule d’acides nucléiques d'intérêt.
Les première et deuxième molécules d’intérêt sont donc essentielles pour cibler spécifiquement la molécule d'intérêt, afin d’encadrer la séquence à remplacer.
La troisième molécule de l’ensemble, quant à elle, est celle qui apporte la molécule d'acides nucléiques qui contient la séquence de remplacement, i.e. une séquence correspondant à tout ou partie du gène codant l’IL2-Ry.
D’un point de vue mécanistique, le complexe selon l'invention est tel qu’il est constitué de ses trois molécules, la première et la deuxième molécule étant structurellement organisées dans l’espace de sorte que leurs régions riches en G/C soient appariées.
De part et d’autre de la troisième molécule, c’est à dire en 5’ et en 3’, du fait de l’hybridation avec les première et deuxième molécules, deux paires de sites de liaison à une transposase permettent, lorsqu'elles sont présentes, à des dimères de transposases de se lier à l’ensemble.
On notera que les sites de liaison à la transposase de la première molécule peuvent être les mêmes que ceux de la deuxième molécule, ou être différents. Dans le cas où les séquences de liaison sont les mêmes, les dimères de transposases en 5’ de la troisième molécule (par hybridation de la partie 5’ de la troisième molécule avec la première molécule), et en 3’ de la troisième molécule (par hybridation de la partie 3’ de la troisième molécule avec la deuxième molécule) seront les mêmes. Aussi, à titre d’exemple, si les sites de liaison sont tous des sites de liaison de la transposase de Tn5, l’ensemble sera associé à 2 dimères de transposases de Tn5.
Il est également possible que les sites de liaison de la première molécule et de la deuxième molécule ne reconnaissent pas la même transposase. Dans ce cas, et selon la définition donnée ci-dessus, la partie 5’ de la troisième molécule formera par hybridation avec la première molécule deux sites double brin de liaison à une première transposase, et partie 3’ de la troisième molécule formera par hybridation avec la deuxième molécule deux sites double brin de liaison à une deuxième transposase.
Si maintenant le complexe susmentionné, lié à deux dimères de transposase, est mis en présence d’une molécule d'acides nucléiques d'intérêt dont la partie 5’ est complémentaire de la séquence À de la première molécule de l’ensemble et dont la partie 3’ est complémentaire dela sequence B de la deuxième molécule de l’ensemble, alors il y aura appariement entre la molécule d’acides nucléiques d'intérêt et l’ensemble au niveau des régions A et B sus-décrites.
Cette interaction aura pour conséquence de rompre l’interaction des deux séquences riches en G/C de chacune des première et deuxième molécules de l’ensemble. Dès lors, la troisième molécule et la molécule d’acides nucléiques d'intérêt seront rapprochées spatialement et les transposases pourront exercer leur activité de tagmentation, dont le résultat sera le remplacement de la séquence de la molécule d'intérêt, bordée par les séquences complémentaires des séquences À et B, par la séquence de la troisième molécule de l’ensemble, qui se trouve entre les demi-sites de liaison à la /aux transposases en 5’ et en 3’.
Dans l'invention, les première, deuxièmes et troisième molécules de l’ensemble sont avantageusement des molécules constituées de désoxyribonucléotides, afin de former des molécules d’ADN simple brin.
De manière encore plus avantageuse, les première, deuxième et troisième molécules de l’ensemble sont des molécules hybrides ADN/ARN, où, le « squelette » des molécules est de l'ADN, et les séquences de reconnaissance A et B de la molécule d’acides nucléiques d'intérêt, et la région centrale de la troisième molécule sont de l'ARN. Ceci est particulièrement avantageux lorsque le remplacement de séquence que permet Vinvention doit se faire directement sur une molécule d’ARN.
La Figure 2-A illustre l'interaction entre la molécule d’intérêt et l’ensemble selon l'invention.
De manière avantageuse, l’invention concerne le complexe susmentionné, où ladite première molécule ou ladite deuxième molécule, ou les deux est/sont couplée(s) à une enzyme, notamment par le biais d’un nucléotide modifié. Cette enzyme a pour but de favoriser le remplacement de la molécule d'intérêt. II peut s'agir : - d’une hélicase, enzyme capable d'ouvrir une molécule double brin qui serait superenroulée ou encore associée à des protéines telles que des histones, - une topoisomérase, enzyme agissant sur la structure topologique de l'ADN en générant des coupures transitoires,
- une ligase qui permet de former une liaison phosphodiester entre une extrémité 5 phosphate d’un nucléotide et l’extrémité 3’ OH d’un autre nucléotide, - une polymérase, qui synthétisera une molécule d’acides nucléiques à partir d’un site d'initiation, 3S’OH libre, dans le sens 5’-> 3’, notamment en recopiant un brin complémentaire antiparallèle selon le modèle de Watson et Crick.
Il est également possible de combiner deux ou plusieurs desdites enzymes pour disposer de tout le matériel enzymatique nécessaire pour permettre le remplacement de séquence prévu dans le cadre de l'invention.
Dans un aspect particulier, de l'invention, la première molécule de l’ensemble peut contenir dans sa partie 5’, plus précisément entre le premier site de liaison à la transposase et la région
A, un ou plusieurs nucléotides modifiés. De la même manière, la troisième molécule de l'ensemble peut contenir dans sa partie 3’, plus précisément entre le premier site de liaison à la transposase et la région 3, un ou plusieurs nucléotides modifiés.
Ce nucléotide modifié est notamment modifié par greffage d’une chaine carbonée substituêe avec une étiquette protéique, ou tag en anglais, ou encore une molécule permettant une interaction spécifique telle que la streptavidine ou la biotine.
De telles modifications permettent alors de lier spécifiquement, à la première molécule de l’ensemble, des enzymes qui peuvent servir à favoriser la tagmentation, et le remplacement de séquence. || sera particulièrement avantageux d’avoir par exemple un greffage — streptavidine, qui permettra de greffer une hélicase biotinylée (inversement hélicase greffée à la streptavidine et nucléotide biotinylé) servant à ouvrir une molécule double brin. Il est également possible d’envisager le greffage avec une ligase biotinylée (ou couplé à la streptavidine), afin de relier le brin recombiné coté 3’.
Il est également possible d’associer à la première molécule ou à la deuxième molécule de l’ensemble un oligonucléotide, de sorte que ledit oligonucléotide s’appariera sur une région prédéterminée de la dite première ou deuxième molécule. Cet oligonucléotide est alors avantageusement couplé à une molécule de greffage comme expliqué ci-dessus.
De manière avantageuse, l’invention concerne la composition susmentionnée, où ladite séquence À comprend une séquence complémentaire de la séquence d’une première région du gène codant l’IL2-Ry, et où ladite séquence B comprend une séquence complémentaire de la séquence d’une deuxième région du gène codant l’IL2-Ry, ladite séquence A et la dite séquence B étant deux séquences différentes, lesdites première et deuxième régions du gène codant l’IL2-Ry, encadrant une région comprenant une séquence codant une partie de l’IL2-
Ry, ou codant le récepteur IL2-Ry complet.
Comme expliqué ci-dessus, afin d’opérer le remplacement du gène cible par la troisième molécule, il est avantageux que les séquences de la partie À de la première molécule et de la partie B de la deuxième molécule soient capables : - de reconnaître la même molécule cible, et - d’encadrer la région cible à remplacer, ce qui signifie que la première molécule doit, par l'intermédiaire de sa région A, reconnaître une séquence en amont de la séquence à remplacer de la molécule cible et la deuxième molécule doit, par l’intermédiaire de sa région B, reconnaître une séquence en aval de la séquence à remplacer de la molécule cible, ou l’inverse, ie. la première molécule doit, par l'intermédiaire de sa région A, reconnaître une séquence en aval de la séquence à remplacer de la molécule cible et la deuxième molécule doit, par l'intermédiaire de sa région B, reconnaître une séquence en amont de de la séquence à remplacer de la molécule cible.
Il est ainsi possible de remplacer n'importe quelle séquence cible par n'importe quelle séquence de remplacement, du moment que les séquences À et B respectivement des première et deuxième molécules reconnaissent la région cible et l’encadre.
Dans l’invention il est particulièrement avantageux que tout ou partie du gène codant l’IL2-Ry soit remplacé par la séquence de la troisième molécule. Ceci est particulièrement avantageux lorsque la séquence cible est une séquence qui comprend une ou plusieurs mutations par rapport à la séquence sauvage de référence, par exemple, une substitution d’un ou plusieurs nucléotides, contigus ou espacés, une délétion d’un ou plusieurs nucléotides, contigus ou espacés, ou encore une insertion d’un ou plusieurs nucléotides, contigus ou espacés.
Par tout le gène codant l’IL2-Ry on entend toute la séquence dudit gène comprenant les éléments de régulation 5’, 3’ les exons et les introns.
Par « parties du gène codant l’IL2-Ry » on entend dans l'invention un élément du gène qui ne permet pas de coder intégralement la protéine IL2-Ry. II peut s'agir, sans être limitatif, d’un intro, d’un exon, de plusieurs introns et exons sans que la totalité de l’unité traductionnelle soit complete... II peut être particulièrement avantageux de ne remplacer qu’une partie du gène codant l’IL2-Ry, afin par exemple de ne remplacer qu’un seul exon au sein duquel se trouve une mutation. Dans ce cas, il pourrait être avantageux de choisir une séquence complémentaire de la région A de la première molécule dans l’intron précédent la séquence à remplacer, et une partie complémentaire de la région B dans l’intron suivant l’exon à remplacer. Bien évidemment, l'homme du métier saura, fonction de la substitution qui souhaitera opérer, choisir entre le gène entier ou une partie du gène, et ainsi définir les régions
A et B les plus pertinentes.
De manière avantageuse, l'invention concerne la composition telle que définie ci-dessus, où ladite première molécule comprend en son extrémité 5’ une première séquence orientée 5’-3’
de reconnaissance d’une transposase et en son extrémité 3’ une deuxième séquence orientée 5’-3’ de reconnaissance de ladite transposase et où la troisième molécule comprend en son extrémité 5’ une première séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule suivie d’une deuxième séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule.
De manière plus avantageuse, l’invention concerne la composition telle que définie ci-dessus, où ladite première molécule comprend en son extrémité 5’ une première séquence orientée 5-3’ de reconnaissance d’une transposase et en son extrémité 3’ une deuxième séquence orientée 5-3’ de reconnaissance de ladite transposase, ladite deuxième molécule comprend en son extrémité 5’ une première séquence orientée 5’- 3’ de reconnaissance d’une transposase et en son extrémité 3’ une deuxième séquence orientée 5’-3’ de reconnaissance de ladite transposase, et où la troisième molécule comprend en son extrémité 5’ une première séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule suivie d’une deuxième séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule et en son extrémité 3’ une première séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase de la deuxième molécule suivie d’une deuxième séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la deuxième molécule.
Ici il est défini une possibilité de format de première et deuxième molécule de l’invention. Cette configuration est schématisée en figure 1B. Bien évidemment, dans le cadre de cet exemple de configuration des première, deuxième et troisième molécules, entre les deux demis sites de transposase des parties 5’ et 3’ de la troisième molécule se trouve la séquence de remplacement, ici, tout ou partie du gène codant l’IL2-Ry.
De manière avantageuse, l’invention concerne la composition susmentionnée, où ladite première molécule comprend en son extrémité 5’ une première séquence orientée 5’-3’ de reconnaissance d’une transposase et en son extrémité 3’ une deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase, suivie d’une première séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule et où la troisième molécule comprend en son extrémité 5’ une séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule.
De manière encore plus avantageuse, l’invention concerne la composition susmentionnée, où ladite première molécule comprend en son extrémité 5’ une première séquence orientée 5’-3’ de reconnaissance d’une transposase et en son extrémité 3’ une deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase, suivie d’une première séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule, la deuxième molécule comprend en son extrémité 5’ une première séquence orientée 5’-3’ de reconnaissance d’une transposase et en son extrémité 3’ une deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase, ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase de l’extrémité 5’ étant précédé d’une deuxième séquence complémentaire de la ladite deuxième séquence reconnaissance de ladite transposase de la première molécule, et où la troisième molécule comprend en son extrémité 5’ une séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule et en son extrémité 3’ une séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase de la deuxième molécule.
Ici il est défini une autre possibilité de format de première et deuxième molécules de l'invention.
Cette configuration est schématisée en figure 1C et en figure 1D. Bien évidemment, dans le cadre de cet exemple de configuration des première, deuxième et troisième molécules, entre les deux demis sites de transposase des parties 5’ et 3’ de la troisième molécule se trouve la séquence de remplacement, ici, tout ou partie du gène codant l’IL2-Ry.
De manière avantageuse, l’invention concerne la composition susmentionnée, où ladite première molécule comprend en son extrémité 5’ une première séquence orientée 5’-3’ de reconnaissance d’une transposase et en son extrémité 3’ d’une première séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule suivi d’une deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase, et où la troisième molécule comprend en son extrémité 5’ une séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule.
De manière encore plus avantageuse, l’invention concerne la composition susmentionnée, où ladite première molécule comprend en son extrémité 5’ une première séquence orientée 5’-3’ de reconnaissance d’une transposase et en son extrémité 3’ d’une première séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule suivie d’une deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase, la deuxième molécule comprend en son extrémité 5’ une première séquence orientée 5’-3’ de reconnaissance d’une transposase et en son extrémité 3’ d'une deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule, ladite première séquence étant suivie d’une deuxième séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule, et où la troisième molécule comprend en son extrémité 5’ une séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule et en son extrémité 3’ une séquence complémentaire de la première séquence de reconnaissance de la transposase de la deuxième molécule.
Cette configuration est schématisée en figure 1E. Bien évidemment, dans le cadre de cet exemple de configuration des première, deuxième et troisième molécules, entre les deux demis sites de transposase des parties 5’ et 3’ de la troisième molécule se trouve la séquence de remplacement, ici, tout ou partie du gène codant l’IL2-Ry.
Avantageusement, l’invention concerne la composition susmentionnée, où ladite transposase est une transposase bactérienne, notamment une transposase choisie parmi Tn5, Tn9, Tn10 ou Tc1/mariner.
De manière avantageuse, la transposase susmentionnée est une transposase de type bactérienne choisie parmi la transposase du transposon Tn5, la transposase du transposon
Tn9, la transposase du transposon Tn10, Tn903, Tn602 ou encore la transposase du transposon Tc1, ou plus généralement de la superfamille des transposons mariner.
D’autres exemples de transposases qui peuvent être utilisées dans le cadre de l’invention sont: la transposase de Vibrio harveyi (transposase caractérisée par Agilent et utilisée dans le produit SureSelect QXT), la transposase MuA et un site de reconnaissance de la transposase Mu comprenant les séquences terminales R1 et R2, la transposase du transposon Tn552 de Staphylococcus aureus, la transposase du transposon Tn7, la transposase Tn/O et IS10, la transposase du transposon Tn3.
Latransposase de Tn5 est la plus connue. Elle est codée par le gène Tnp du transposon Tn5.
La transposase initie la transposition en formant un dimère de transposases qui se fixe sur ses séquences cibles. Dans le contexte de ce complexe, la transposase catalyse ensuite quatre réactions de transfert de phosphoryle (coupure d'ADN, formation en épingle à cheveux d'ADN, résolution en épingle à cheveux et transfert de brin dans l'ADN cible) entraînant l'intégration du transposon dans son nouveau site d'ADN : il s’agit de la tagmentation.
C’est sur le principe de cette tagmentation que l’invention repose. En utilisant les propriétés de tagmentation des transposases, il est possible d’insérer une séquence dans une autre de manière ciblée, grâce au complexe susmentionné.
Aussi dans le cadre de l'invention, lorsqu'il est fait référence à une transposase, il est fait référence à l’une des transposases susmentionnées, à savoir les transposases des transposons Tn5, Tn9, Tn10 ou Tc1/mariner (ou transposases mutées afin d’augmenter leur activité de transposition ou de tagmentation).
Dans l'invention, lorsque plusieurs transposases sont utilisées simultanément, l’une se liant au complexe formé par la première molécule et à la troisième molécule, et l’autre se liant au complexe formé par la deuxième molécule et la troisième molécule, on privilégiera les couples de transposases issus de transposons Tn5 et Tn10.
De manière avantageuse, la première et la deuxième séquence de reconnaissance de la transposase sont des séquences de reconnaissance de la transposase de Tn5 ayant l’une des séquences suivantes : - CTGtCTCTTataCAcAtcT (SEQ ID NO : 29), -CTGACTCTTataCACAagT (SEQ ID NO : 30), et -CTGtCTCTTgatCAgATCT (SEQ ID NO : 31).
En conséquence les séquences complémentaires correspondantes sont les suivantes : - AgaTgTGtatAAGAGaCAG (SEQ ID NO : 32), complémentaire de la séquence SEQ ID NO: 29, -ActTGTGtatAAGAGTCAG (SEQ ID NO : 33), complémentaire de la séquence SEQ ID NO: 30, et - AGATcT GatcAAGAGaCAG (SEQ ID NO : 34), complémentaire de la séquence SEQ ID NO: 31.
D’autres séquences de reconnaissance d’une transposase sont les suivantes :
Tn5MErev, 5'-[phos]CTGTCTCTTATACACATCT-3' (SEQ ID NO : 35)
Tn5ME-A (lumina FC-121-1030),
S'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3'; (SEQ ID NO : 36) et TN5ME-B (lllumina FC-121-1031), 5-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3' (SEQ ID NO : 37)
Encore d’autres séquences de reconnaissance de la transposase sont les suivantes : - séquence sens SEQ ID NO : i - séquence antisens SEQ ID NO : i+1, où i varie de 38 à 192.
Cela signifie par exemple que les couples de séquences sens et antisens respectifs suivants sont envisagés : SEQ ID NO : 38 et SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO : 40 et SEQ ID NO: 41, SEQ
ID NO : 42 et SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO : 44 et SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO : 46 et SEQ ID
NO: 47, SEQ ID NO : 48 et SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO : 50 et SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO : 52 et SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO : 54 et SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO : 56 et SEQ ID NO: 57,
SEQ ID NO: 58 et SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO : 60 et SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO : 62 et
SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO : 64 et SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO : 66 et SEQ ID NO: 67, SEQ
ID NO : 68 et SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO : 70 et SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO : 72 et SEQ ID
NO: 73, SEQ ID NO : 74 et SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO : 76 et SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO : 78 et SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO : 80 et SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO : 82 et SEQ ID NO: 83, — SEQ ID NO: 84 et SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO : 86 et SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO : 88 et
SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO : 90 et SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO : 92 et SEQ ID NO: 93, SEQ
ID NO : 94 et SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO : 96 et SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO : 98 et SEQ ID
NO: 99, SEQ ID NO : 100 et SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO : 102 et SEQ ID NO: 103, SEQ ID
NO : 104 et SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO : 106 et SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO : 108 et SEQ
ID NO: 109, SEQ ID NO : 110 et SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO : 112 et SEQ ID NO: 113, SEQ
ID NO : 114 et SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO : 116 et SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO : 118 et
SEQID NO: 119, SEQ ID NO: 120 et SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO : 122 et SEQ ID NO: 123,
SEQ ID NO : 124 et SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO : 126 et SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128 et SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO : 130 et SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO : 132 et SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO : 134 et SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO : 136 et SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138 et SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO : 140 et SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO : 142 et SEQ ID
NO: 143, SEQ ID NO : 144 et SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO : 146 et SEQ ID NO: 147, SEQ
ID NO : 148 et SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO : 150 et SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO : 152 et
SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO : 154 et SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO : 156 et SEQ ID NO: 157,
SEQ ID NO : 158 et SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO : 160 et SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO : 162 et SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO : 164 et SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO : 166 et SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168 et SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO : 170 et SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172 et SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO : 174 et SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO : 176 et SEQ ID
NO: 177, SEQ ID NO : 178 et SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO : 180 et SEQ ID NO: 181, SEQ
ID NO : 182 et SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO : 184 et SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO : 186 et
SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO : 188 et SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO : 190 et SEQ ID NO: 191, etSEQID NO: 192 et SEQ ID NO: 193.
De manière avantageuse, le premier domaine riche en G/C de la première molécule (ou de la deuxième molécule) correspond à la séquence suivante GGCGATCGC (SEQ ID NO : 194) de sorte que le deuxième domaine riche en G/C sera le même. En effet, du fait du repliement de la molécule sur elle-même, le deuxième domaine riche en G/C sera dans une orientation complémentaire et antiparallèle par rapport au premier domaine riche en G/C, et l'interaction se fera au niveau de la région palindromique (souligné dans la séquence ci-dessus).
Le premier et le deuxième domaines riches en G/C peut également être la séquence suivante
GCGGCGATCGGC (SEQ ID NO: 195). Les explications ci-dessus s'appliquent mutatis mutandis.
D’autres séquences des domaines riches en G/C de la première molécule ou de la deuxième molécule, peuvent être les suivantes : - premier domaine riche en G/C de séquence GGTCGC (SEQ ID NO: 196) et le second domaine riche en G/C de séquence GCGACC (SEQ ID NO : 197).
Ces exemples sont donnés à titre illustratif seulement et ne sauraient limiter la portée de l'invention.
Dans un mode de réalisation avantageux, les séquences riches en A/T de la première molécule dudit complexe sont constituées essentiellement, ou constituées de A ou de T.
De manière encore plus avantageuse, la séquence riche en A/T de la première molécule dudit complexe est constituée de T.
De manière avantageuse, l'invention concerne la composition susmentionnée où le gène codant l’'IL2-Ry comprend la séquence SEQ ID NO: 1, ou la séquence SEQ ID NO: 2 ou encore la séquence SEQ ID NO : 3.
La séquence SEQ ID NO: 1 correspond au gène IL2Ry humain complet de référence, référencé sous le numéro GenBank: AY692262.1. Ce gène est également connu sous les noms suivants : P64, CIDX, IMD4, CD132, SCIDX, IL-2RG ou encore SCIDX1. II fait 7130 bases.
Les exons du gène correspondent aux séquences délimitées de la manière suivante :
Exon 1 : de 1956 (premier nucléotide du codon initiateur ATG) à 2070, et intron 1 : de 2071 à 2448,
Exon 2 : de 2449 à 2602, et intron 2 : de 2603 à 2810,
Exon 3 : de 2811 à 2995, et intron 3 : de 2996 à 3203,
Exon 4: de 3204 à 3343, et intron 4 : de 3344 à 4108,
Exon 5 : de 4109 à 4271, et intron 5 : de 4272 à 4803,
Exon 6 : de 4804 à 4900, et intron 6 : de 4901 à 5152,
Exon 7 : de 5153 à 5222, et intron 7 : de 5223 à 5577, et
Exon 8 : de 5578 à 5763 (dernier nucléotide du codon stop),
La séquence SEQ ID NO: 2 correspond à un fragment de la SEQ ID NO: 1, puisque sa séquence commence en position 1956 de la séquence SEQ ID NO : 1 et se termine au codon stop en position 5763 de la SEQ ID NO : 1.
La séquence SEQ ID NO : 3 correspond à la région codante (ou CDS en anglais) du gène.
Celle correspondant à la réunion des exons susmentionnés. Cette séquence est référencée sous le numéro GenBank: AK314932.1.
Au vu du découpage susmentionné, l’homme du métier pourra choisir une partie du gène tel que défini ci-dessus, dans le but de réaliser une substitution partielle du gène. Par exemple, et sans être limitatif, s’il est souhaité de remplacer l’exon 1, il sera possible de cibler avec la première molécule Vintron 1, avec la deuxième molécule l’intron 2 tandis que la troisième — molécule comprendra la séquence de l’exon 2.
De manière encore plus avantageuse, l'invention concerne la composition telle que définie ci- dessus, où les premières deuxième et troisième molécules sont choisies parmi les triplets tels que définis dans le tableau 2 ci-dessous.
De manière avantageuse, l'invention concerne une composition comprenant l’un des triplets de première deuxième et troisième molécules décrits dans le tableau 2 suivant [Table 2]
SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO :
Es [a [as
Be | w% | m jp #æ | æ | æ | mu
1 | | % | am [ @ | | 4 [ @ | @ | | 4
[aes dee [ae #6 | «@ | 4 | æ [ @æ | @ | | &
[#5 | 60% | 6m | 6m
Pl #7 | 6 | 67 [ ÿæ | 6 | 60% | 6m [#5 | 66 | 6 | @
Me | 6 | 7 | & 1 ÿ | 6 | 6w | en
He | 6 | 6
[M7 | & | 6 | @ [ ÿ@ | 6 | w% | 0m
[#5 | 00 | am 1 #7 | | 7 | 0 [| | % | m
[#5 | 0 1 7 | 6 | 7 [#8 | | % | nm [#5 | 00 | mn me 1 @æ | | 100110
Aussi avantageusement, l’invention concerne la composition susmentionnée, ladite composition comprenant un triplet choisi parmi les triplets #1 à #312 susmentionnés.
De manière avantageuse, l'invention concerne la composition décrite ci-dessus, comprenant en outre ** une quatrième molécule d’acides nucléiques simple brin comprenant ou constituée essentiellement d’une séquence A’ permettant l’insertion d’une séquence complémentaire d’un acide nucléique d’intérêt, ou comprenant une séquence complémentaire d’un acide nucléique d'intérêt, ladite séquence complémentaire étant liée en 5’ à une cinquième séquence riche en T de 40 à 60 nucléotides de long et en 3’ à une sixième séquence riche en
T de 40 à 60 nucléotides de long, lesdites cinquième et sixième séquences riches en T comprenant respectivement un cinquième et un sixième domaine de 6 à 12 nucléotides riches en G/C, la séquence du cinquième domaine étant complémentaire de la séquence du sixième domaine, lesdits cinquième et sixième domaines étant positionnés de 15 à 52 nucléotides de ladite séquence A’, ladite quatrième molécule comprenant en son extrémité 5’ au moins une première séquence orientés 5’-3’ de reconnaissance d’une transposase et en son extrémité 3’ une deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase, * une cinquième molécule d'acides nucléiques simple brin comprenant ou constituée essentiellement d’une séquence B’ permettant l’insertion d’une séquence complémentaire d’un acide nucléique d’intérêt, ou comprenant une séquence complémentaire d’un acide nucléique d'intérêt, ladite séquence B’ complémentaire étant liée en 5’ à une septième séquence riche en T de 40 à 60 nucléotides de long et en 3’ à une huitième séquence riche en T de 40 à 60 nucléotides de long, ladite septième et huitième séquence riche en T comprenant respectivement un septième et un huitième domaine de 6 à 12 nucléotides riches en G-C, la séquence du septième domaine étant complémentaire de la séquence du huitième domaine, ledit septième et huitième domaine étant positionnés de 15 à 52 nucléotides de ladite séquence B’, ladite cinquième molécule comprenant en son extrémité 5’ au moins la première séquence orientée 5-3’ de reconnaissance de ladite transposase et en son extrémité 3’ la deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase, ladite séquence B’ étant une séquence complémentaire dudit acide nucléique d'intérêt, la séquence A’ étant positionnée en 5’ d’une région d'intérêt dudit acide nucléique d'intérêt et la séquence B’ positionnée en 3’ de la région d’intérêt dudit acide nucléique d'intérêt, et - une sixième molécule simple brin comprenant * dans sa partie 5’, au moins une séquence complémentaire de ladite cinquième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule, * dans sa partie 3’ au moins une séquence complémentaire de ladite quatrième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la deuxième molécule, et * une région intermédiaire située entre séquence complémentaire de ladite quatrième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule et la séquence complémentaire de ladite cinquième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la deuxième molécule, ladite région intermédiaire comprenant une séquence complémentaire, et antiparallèle, de la séquence codant le récepteur gamma de l’interleukine 2 ou IL2-Ry contenue dans la troisième molécule de la première composition, les quatrième et sixième molécules d’acides nucléiques simple brin étant appariées selon la … complémentarité des bases définie par Watson et Crick de sorte à définir deux sites double brin de liaison de ladite transposase et les cinquième et sixième molécules d'acides nucléiques simple brin étant appariées selon la complémentarité des bases définie par Watson et Crick de sorte à définir deux sites double brin de liaison de ladite transposase.
De manière avantageuse, la composition selon l'invention comprend 6 molécules, soit deux triplets qui permettent un remplacement double brin d’une molécule cible. Ce remplacement pourra se faire seulement si les régions A, B et A’ et B’ sont correctement choisies de sorte que la région d’intérêt à remplacer soit correctement encadrée.
Bien évidemment, toutes les définitions données pour la composition comprenant 3 molécules s'appliquent mutatis mutandis pour une composition comprenant 6 molécules.
De manière avantageuse, l'invention concerne la composition décrite ci-dessus, où - ladite séquence À comprend une séquence complémentaire de la séquence d’une première région du gène codant l’IL2-Ry,
- ladite séquence B comprend une séquence complémentaire de la séquence d’une deuxième région du gène codant l’IL2-Ry, ladite séquence A et la dite séquence B étant deux séquences différentes, lesdites première et deuxième régions du gène codant l’IL2-Ry, encadrant une région comprenant une séquence codant une partie de l’IL2-Ry, ou codant le récepteur IL2-Ry complet, où - ladite séquence A’ comprend une séquence complémentaire de la séquence d’une troisième région du gène codant l’IL2-Ry, - ladite séquence B’ comprend une séquence complémentaire de la séquence d’une quatrième région du gène codant l'IL2-Ry, ladite séquence A’ et la dite séquence B’ étant deux séquences différentes, lesdites troisième et quatrième régions du gène codant l’IL2-Ry, encadrant une région comprenant une séquence complémentaire d’une séquence codant une partie de l’IL2-Ry, ou codant le récepteur IL2-Ry complet, etoù la séquence A et la séquence A’ sont au plus en partie complémentaires, la séquence A et la séquence B’ sont au plus en partie complémentaires, la séquence B et la séquence A’ sont au plus en partie complémentaires, et la séquence B et la séquence B’ sont au plus en partie complémentaires.
Par «au plus en partie complémentaires » on entend dans l'invention que les séquences possèdent des séquences qui sont capables de s’apparier selon la complémentarité des bases définie par Watson et Crick, mais pas sur la totalité des séquences. En d’autres termes, seule une parte des séquences est complémentaire. De manière avantageuses les séquences A,
A’, Bet B’ sont en partie complémentaire sur moins de 50% des séquences, notamment moins de 30% des séquences, en particulier moins de 10% des séquences , notamment ne sont pas du tout complémentaires entre elles.
De cette manière il est possible d’encadrer le gène codant le récepteur IL2-Ry de manière spécifique et orientée, pour les deux brins, afin d’éviter des recombinaisons (ie. des tagmentations) désordonnées ou incohérentes de sorte que le résultat ne serait pas celui — escompté.
De manière encore plus avantageuse, la composition susmentionnée comprend l’un au moins des sextuplets mentionnés dans le tableau 3 suivant : [Table 3]
EE EEE molécule | molécule | molécule | molécule | molécule | molécule
SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID
NO : NO : NO : NO : NO : NO :
Ow | 28 | 29 | 20 | m | 22 | æ
Ow | m0 | m | 242 | w | mu | 24
Ow | 246 | w@ | 248 | 26 | x | x wo | 662 | 563 | 564 | _ 855 | ss | 67
Ow | _ 508 | se | 0 | _ 891 | se | se [#68 | eo | eon | 602 | 603 | 60 | 605 [+6 | ee | 607 | oe | os | 610 | em me | oo | 661 | 662 | 66 | 66 | 66 om | 6e | er | 668 | 669 | en | en [vs | ee | ei | _ 692 | _ 603 | 6 | 6 [vi | 66 | oor | 608 | 6 | 70 | Tor wo | 7 | as | mM | 7m | me | Ter [#6 | 7 | wo | mo | m | m | m [+ | 7e | er | 168 | 789 | 70 | Tet [me | oo | on | 002 | 008 | 904 | 905 [ie | 006 | or | we | _ 209 | oo | om
#2 | 9 | 61 | se | ses | se | vs #æ | se | 97 | _ 968 | se | so | sn mas | so | 1 | ee | ss | su | 0 #3 | 998 | 97 | es | see | 1000 | 1001
La composition selon l’invention, propose ainsi de manière avantageuse, 156 sextuplets de molécules permettant le remplacement au locus du gène IL2Ry d’une séquence potentiellement mutée ou anormale par la séquence sauvage de référence.
Cela permet donc en fonction de la cellule cible de restaurer une fonction perdue par la mutation, et de réaliser une complémentation fonctionnelle.
Dans un autre aspect, l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant la composition susmentionnée, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
La composition susmentionnée, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable peut être utilisée dans le cadre du traitement de pathologies. Le véhicule est un véhicule communément admis et connu de l’homme du métier, par exemple de l’eau distillée,
ou encore un tampon physiologique. Ce véhicule doit permettre la formation d’un complexe comme mentionné ci-dessus, mais aussi être acceptable pour une cellule ou un être vivant.
Dans un autre aspect, l'invention concerne la composition susmentionnée, pour son utilisation en tant que médicament. 1 est d’ailleurs avantageux que la composition comprenant l’un quelconque des triplets du tableau 2, ou l’un quelconque des sextuplets du tableau 3 soit utilisée en tant que médicament.
Dans encore un autre aspect, l'invention concerne une composition pour son utilisation pour le traitement des pathologies liées à une mutation du gène codant l’IL2-Ry.
Les mutations du gène IL2Ry sont largement décrites dans la littérature, et peuvent correspondre à des substitutions, des insertions ou des délétions touchant soit un exon, un intron ou encore les régions régulatrices en 5’ ou en 3’ du gène.
Plus particulièrement, l'invention concerne une composition pour son utilisation pour le traitement des pathologies liées à une mutation du gène codant l’IL2-Ry, ladite composition comprenant un triplet tel que mentionné dans le tableau 2 ou un sextuplet tel que mentionné dans le tableau 3.
Avantageusement, l’invention concerne la composition pour son utilisation susmentionnée, où la maladie associée à une mutation du gène codant l’IL2-Ry est la maladie DICS-X ou encore le syndrome d'Omenn.
Le déficit immunitaire combiné sévère (DICS) T-B+ par déficit en chaîne gamma, aussi appelé
SCIDX1 ou DICS-X, est une forme de DICS caractérisée par des infections sévères et récurrentes associées à des diarrhées et un retard de croissance staturo-pondérale.
Le SCIDX1 se manifeste durant les premiers mois de vie par des infections virales, bactériennes ou fongiques sévères et souvent fatales (par ex pneumonitis à Pneumocystis jiroveci, infection à BCG disséminée secondaire à une vaccination) et un retard de croissance — staturo-pondérale. Des diarrhées chroniques sont une caractéristique fréquente. Certains patients présentent des éruptions cutanées et des anomalies de la fonction hépatique. La maladie du greffon contre l'hôte liée à la transmission materno-foetale est aussi associée à la maladie. Les résultats immunologiques révèlent une lymphopénie avec absence de lymphocytes T ou NK, une hypogammaglobulinémie, et un nombre de lymphocytes B normal ouélevé.
Le syndrome d'Omenn est un trouble inflammatoire caractérisé par une érythrodermie, une desquamation, une alopécie, des diarrhées chroniques, un retard de croissance staturo- pondérale, adénopathies, et une hépatosplénomégalie, associés à un déficit immunitaire combiné sévère. Le syndrome d'Omenn apparaît au cours de la première année de vie avec des manifestations caractéristiques du déficit immunitaire combiné sévère incluant des diarrhées chroniques, une pneumonite et un retard de croissance staturo-pondérale. Les patients présentent aussi des symptômes inflammatoires tels qu'adénopathies, une hépatosplénomégalie et une érythrodermie généralisée, souvent à l'origine d'une alopécie avec chute des sourcils et des cils. La perte de protéines peut entraîner un oedème généralisé et des troubles métaboliques. Les signes et symptômes peuvent évoluer avec le temps et peuvent apparaître séparément. Certains patients manifestent seulement certains symptômes et peuvent alors être décrits comme des cas de Syndrome atypique d'Omenn. Plus qu'une forme de déficit immunitaire combiné sévère distincte, c'est davantage un phénotype inflammatoire qui peut être associé à différents types de déficit immunitaires combinés sévères. La plupart des cas rapportés à ce jour présente des mutations hypomorphes des gènes RAG1 et RAG2 (11p13). Les autres cas de mutations ont lieu dans les gènes RMRP,
ADA et IL2Ry, ainsi que d’autres.
Dans un autre aspect, l'invention concerne une méthode de traitement du DICS-X ou encore du syndrome d'Omenn, ladite méthode comprenant l’administration d’une quantité efficace d’une composition susmentionnée, à un individu dans le besoin, ladite composition comprenant notamment un triplet tel que défini dans le tableau 2 ou un sextuplet tel que défini dans le tableau 3.
Dans encore un autre aspect, l'invention concerne l’utilisation d’une composition telle que définie ci-dessus, pour la substitution, dans une cellule somatique, d’une séquence mutée du gène codant l’IL2-Ry par une séquence sauvage du gène codant l’IL2-Ry sauvage, sous réserve que l’utilisation ne comprenne pas un procédé pour la modification de l’identité génétique germinale d’êtres humains et que ladite utilisation ne soit pas une méthode pour le traitement du corps humain ou animal par une chirurgie ou une thérapie.
Comme expliqué ci-dessus la composition permet de cibler spécifiquement une région cible et de la remplacer par une séquence d'intérêt, en utilisant les propriétés de tagmentation des transposases.
La composition selon l’invention est notamment avantageuse pour réaliser des modifications géniques ciblées (et en particulier des remplacements de gène, ou de séquences non codantes) chez l’homme et en particulier pour remplacer le gène muté IL2Ry par sa séquence sauvage de référence.
Dans encore un autre mode de réalisation avantageuse, l’invention concerne une méthode de remplacement, notamment in vitro, d’une séquence mutée du gène codant l'IL2-Ry par une par une séquence sauvage codant l’IL2-Ry, ladite méthode comprenant : - la mise en contact d’une composition telle que définie précédemment, avec l’acide nucléique comprenant la séquence mutée codant le gène de l’IL2-Ry, ladite composition étant telle que la séquence A de ladite première molécule comprend une séquence complémentaire de la région immédiatement en 5’ de la séquence mutée codant le gène de l’IL2-Ry, la séquence B de ladite deuxième molécule comprend une séquence complémentaire de la région immédiatement en 3’ de la séquence mutée codant le gène de l’IL2-Ry, et la troisième molécule comprend la séquence sauvage du gène codant l’IL2-Ry, située entre une séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule et la séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase de la deuxième molécule, afin d’obtenir un complexe de remplacement, -lamise en présence du complexe de remplacement avec une transposase reconnaissant les sites double brin de liaison de ladite transposase contenus dans ledit ensemble, pour obtenir un complexe de recombinaison, et - la recombinaison du complexe de combinaison pour obtenir la molécule d’acide nucléique hybride la séquence sauvage du gène codant l’'IL2-Ry, à la place de la séquence mutée du gene codant l’IL2-Ry.
De manière avantageuse, l'invention concerne une méthode de remplacement, notamment in vitro, d’une séquence mutée du gène codant l’IL2-Ry par une séquence sauvage codant l’IL2-
Ry, ladite méthode comprenant : - la mise en contact d’une composition comprenant un triplet tel que défini dans le tableau 2 ou un sextuplet tel que défini dans le tableau 3, avec l’acide nucléique comprenant la séquence mutée codant le gène de l’IL2-Ry, afin d’obtenir un complexe de remplacement, - la mise en présence du complexe de remplacement avec une transposase reconnaissant les sites double brin de liaison de ladite transposase contenus dans ledit ensemble, pour obtenir un complexe de recombinaison, et -larecombinaison du complexe de combinaison pour obtenir la molécule d’acide nucléique hybride la séquence sauvage du gène codant l’'IL2-Ry, à la place de la séquence mutée du gène codant l’IL2-Ry.
Dans encore un autre aspect, l'invention concerne une méthode de remplacement in vitro d’une séquence double brin mutée du gène codant l’IL2-Ry d’une cellule souche, notamment une cellule souche hématopoïétique, par une séquence sauvage double brin codant l’IL2-Ry, ladite méthode comprenant : - la mise en contact d’une composition telle que définie ci-dessus, avec la cellule souche hématopoïétique comprenant la séquence mutée codant le gène de l’IL2-Ry, ledit ensemble étant tel que la séquence A de ladite première molécule comprend une séquence complémentaire de la région immédiatement en 5’ de la séquence mutée codant le gène de l’IL2-Ry,
la séquence A’ de ladite quatrième molécule comprend une séquence complémentaire de la région immédiatement en 5’ de la séquence complémentaire mutée codant le gène de l’IL2-
Ry, la séquence B de ladite deuxième molécule comprend une séquence complémentaire de la region immédiatement en 3’ de la séquence mutée codant le gène de l’IL2-Ry, la séquence B’ de ladite cinquième molécule comprend une séquence complémentaire de la région immédiatement en 3’ de la séquence complémentaire mutée codant le gène de l’IL2-
Ry, et la troisième molécule comprend la séquence sauvage du gène codant l’IL2-Ry, située entre une séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule et la séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase de la deuxième molécule, la sixième molécule comprend la séquence complémentaire de la séquence sauvage du gène codant l’IL2-Ry, située entre une séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule et la séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase de la deuxième molécule, afin d’obtenir un complexe de remplacement, - la mise en présence du complexe de remplacement avec une transposase reconnaissant les sites double brin de liaison de ladite transposase contenus dans ladite composition, pour — obtenir un complexe de recombinaison, et - la recombinaison du complexe de combinaison pour obtenir la molécule d’acide nucléique hybride la séquence sauvage du gène codant l’'IL2-Ry, à la place de la séquence mutée du gène codant l’IL2-Ry, - et éventuellement la purification de la cellules souche hématopoïétique ayant un remplacement du gène muté.
De manière avantageuse, l’invention concerne une méthode de remplacement in vitro d’une séquence double brin mutée du gène codant l’IL2-Ry d’une cellule souche, notamment une cellule souche hématopoïétique, par une séquence sauvage double brin codant l'IL2-Ry, ladite méthode comprenant : -la mise en contact d’une composition telle que définie ci-dessus, avec la cellule souche hématopoïétique comprenant la séquence mutée codant le gène de l'IL2-Ry, afin d’obtenir un complexe de remplacement, ladite composition comprenant un triplet tel que défini dans le tableau 2 ou un sextuplet tel que défini dans le tableau 3, - la mise en présence du complexe de remplacement avec une transposase reconnaissant les sites double brin de liaison de ladite transposase contenus dans ladite composition, pour obtenir un complexe de recombinaison, et
- la recombinaison du complexe de combinaison pour obtenir la molécule d’acide nucléique hybride la séquence sauvage du gène codant l’'IL2-Ry, à la place de la séquence mutée du gène codant l’IL2-Ry, - et éventuellement la purification de la cellules souche hématopoïétique ayant un remplacement du gène muté.
Dans encore un autre aspect, l'invention concerne une méthode d'insertion, notamment in vitro, d’une séquence double brin du gène sauvage codant l’'IL2-Ry dans une cellule, notamment une cellule souche, en particulier une cellule souche hématopoïétique, au locus du gène codant l’IL2-Ry, où ledit locus du gène codant l’IL2-Ry comprend une mutation affectant l'expression, la fonction, ou les deux, de l’IL2-Ry, où ladite séquence double brin du gène sauvage codant l’IL2-Ry correspond à l’ADNc dudit gène, en particulier la séquence SEQ ID NO : 3, ladite méthode comprenant : - la mise en contact d’une composition telle que définie dans l’une quelconque des revendications 1 à 9, avec la cellule comprenant une mutation affectant l’expression, la fonction, ou les deux, de l’IL2-Ry, au niveau du locus du gène codant l’IL2-Ry ladite composition étant telle que la séquence A de ladite première molécule comprend une séquence complémentaire de la région en 5’ de l’exon 1 du gène codant l’IL2-Ry, la séquence A’ de ladite quatrième molécule comprend une séquence complémentaire de la séquence complémentaire de la région en 5’ de l’exon 1 du gène codant l’IL2-Ry, la séquence B de ladite deuxième molécule comprend une séquence complémentaire en 3’ la région en 5’ de l’exon 1 du gène codant l’IL2-Ry, la séquence B’ de ladite cinquième molécule comprend une séquence complémentaire en 3’ la séquence complémentaire de la région en 5’ de l’exon 1 du gène codant l’IL2-Ry, et la troisième molécule comprend la séquence sauvage de VADNc du gène codant l’IL2-Ry, située entre une séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule et la séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase de la deuxième molécule, la sixième molécule comprend la séquence complémentaire de la séquence sauvage de
VADNc du gène codant l’IL2-Ry, située entre une séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule et la séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase de la deuxième molécule, afin d’obtenir un complexe de remplacement,
- la mise en présence du complexe de remplacement avec une transposase reconnaissant les sites double brin de liaison de ladite transposase contenus dans ledit ensemble, pour obtenir un complexe de recombinaison, et - la recombinaison du complexe de combinaison pour obtenir insertion de ’ADNc du gène codant l’IL2-Ry en 5’ de l’exon 1 du gène codant l’IL2-Ry, - et éventuellement la purification de la cellule ayant l'insertion.
Brève description des figures
L'invention sera mieux comprise à la lecture des exemples ci-après et des figures suivantes : [Fig. 1A] est une première représentation schématique d’une première forme d’appariement des première, deuxième et troisième molécules de la composition selon l’invention. [Fig. 1B] est une deuxième représentation schématique d’une première forme d’appariement des première, deuxième et troisième molécules de la composition selon l’invention. [Fig. 1C] est une troisième représentation schématique d’une première forme d’appariement des première, deuxième et troisième molécules de la composition selon l’invention. [Fig. 1D] est une quatrième représentation schématique d’une première forme d’appariement des première, deuxième et troisième molécules de la composition selon l’invention. [Fig. 1E] est une cinquième représentation schématique d’une première forme d’appariement des première, deuxième et troisième molécules de la composition selon l’invention. [Fig. 2] est un schéma montrant le principe et les étapes du remplacement simple brin en utilisant les première, deuxième et troisième molécules de la composition selon l'invention. [Fig. 3] est un schéma montrant le principe et les étapes du remplacement double brin en utilisant les première, deuxième, troisième, quatrième, cinquième et sixième molécules de la composition selon l'invention. [Fig. 4] est un schéma montrant l’association des molécules contenues dans le tube 1 de l’exemple 1. La boule noire représente la biotine. [Fig. 5] est un schéma montrant l’association des molécules contenues dans le tube 2 de l’exemple 1. La boule noire représente la biotine.
Exemples
Exemple 1 — Obtention de cellules B exprimant le gène ILR2G sauvage
Afin de traiter les patients atteints de DICS-X, impliquant une mutation dans le gène ILR2G, il peut être avantageux de proposer une thérapie cellulaire visant à greffer chez des patients des cellules souches hématopoïétiques CD34+ ayant été modifiées à l’aide d’une composition selon l’invention, notamment pour remplacer le gène ILR2G muté par la séquence sauvage dudit gène.
A - Purification des cellules souches hématopoïétiques (HSC) CD34+ à partir de sang
La purification des cellules CD34+ est bien connue de l'homme du métier, et peut-être résumée comme suit : 1- Des échantillons de sang de donneurs (adultes ou du sang de cordon ombilical riche en cellules CD34+) sont collectés, frais ou congelés (il est également possible de purifier les cellules CD34+ d’un patient atteint de DISC-X) ; 2- Les échantillons sont centrifugés à 1000g pendant 8min sans frein sur milieu de centrifugation à gradient de densité stérile (par exemple Ficoll en présence d’EDTA) pour isoler les cellules mononucléaires du sang périphérique (en anglais PBMC pour Peripheral Blood
Mononuclear Cells) ; 3- Les anneaux de globules blancs sont collectés et lavés au tampon phosphate PBS (en anglais pour Phosphate Buffered Saline) ; 4- Les cellules souches hématopoïétiques (i.e. les cellules CD34+) sont ensuite isolées au trieur cellulaire par sélection positive grâce à un marquage par anticorps anti-CD34 ou par sélection négative grâce à un cocktail d’anticorps anti-CD2, anti-CD3, anti-CD14, anti-CD16, anti-CD19, anti-CD24, anti-CD56n anti-CD66b et anti-CD61 ; 5- Les cellules CD34+ purifiées sont centrifugées à 300g pendant 5min et les culots cellulaires sont suspendus à une densité cellulaire de 100 000 à 300 000 cellules/mL et cultivées à 37°C et 5% de CO: pendant 48h en plaques 24 puits à raison de 1mL par puits dans un milieu de culture spécifiquement dédié à la culture des cellules souches et supplémenté avec un cocktail contenant de l’IL-3 humaine, de l’IL-6 humaine, de la thrombopoïétine recombinante, du hCSF (ligand Kit) recombinant et du ligand FIt3 recombinant, à raison de 100ng/mL pour chaque. 6- les cellules souches CD34+ sont ainsi prêtes à être transfectées avec la composition selon l'invention.
B- Préparation des molécules de la composition selon l’invention
Afin de cibler le gène IL2Ry, et vérifier l’insertion au locus IL2Ry chrX:70,327,254-70,331,958 — GRCh37/hg19, une construction comprenant la GFP a été préparée.
Deux tubes ont été préparés comme suit : ** Tube 1 (10}L) :
- Voligo Great X1 (10uM) correspondant à la molécule 1 de séquence SEQ ID : 198 suivante 5’.
AgaTgTGtatAAGAGaCAGGTAGTGTATTTTTTTITTTTTTTTTATCATCCTGtCTCTTataCAcAtcTTTTT
TTITITITITITITTTTTGGCGATCGCITITITITITITTTTTGCTAGAAAGAGTACTGTTCTGGAAAC
TGACTITITITITITTTITTGCGATCGCCTTITITITITITTGATACATTTAgaTgTGtatAAGAGaCAG
GATGAT-3' - l’oligo Great X3 (10uM) correspondant à la molécule 4, de séquence SEQ ID : 201 suivante 5'-
CACGTGCTGtCTCTTataCAcAtcTTTTCTCGATCATTATTATTTTTTGGCGATCGCTTTTTTTTTTTTTT
TTAGCAAATTGGTAATACTCCTGCCTCCACAGTTTTTTTTTTTTTTTTGCGATCGCCTTTTTTTTTTT
TTTTTTTTTTAgaTgTGtatAAGAGaCAGCACGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAGCTATACTGtCTCT
TataCAcAtcT-3' - l’oligo reverse GREAT X1 Rev (10uM) correspondant à la partie 5’ de la molécule 3 de séquence SEQ ID NO : 1134 suivante 5’-TACACTACCTGtCTCTTataCAcAtcTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTggttacATGCATCGTACA-3’ - l’oligo reverse GREAT X3 Rev (10uM) correspondant à la partie 3’ de la molécule 6 de séquence SEQ ID NO : 1135 suivante 5'-TGTACGATGCATgtaaccTTTTTITITITITITITTTTITTAgaTgTGtatAAGAGaCAGTATAGCTG-3' - l’oligo Reverse Helix Rev correspondant à un brin additionnel permettant de lier une hélicase par l'extrémité 3’ biotinylée, l’oligo ayant la séquence SEQ ID NO : 1136 suivante 5’-ATAATAATGATCGAGAACTTITITITITITITIITITITITTITITITT[Biot]-3" * Tube 2 (10pL) : - l’oligo Great X2 (10uM) correspondant à la molécule 2, de séquence SEQ ID NO: 199 suivante 5.
CACGTGCTGtCTCTTataCAcAtcTTTTCTCGATCATTATTATTTTTTGGCGATCGCTTTTTTTTTTTTTT
TTGTTGAGAATGGTGCTAGTGGTAGTGAACAGTTTTTTTTTITITITTGCGATCGCCTTITITTITIT
TTTTTTTTTTAgaTgTGtatAAGAGaCAGCACGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGACGAATACTGtCTCT
TataCAcAtcT-3' - l’oligo Great X4 (10uM) correspondant à la molécule 5, de séquence SEQ ID NO : 202 suivante : 5’.
AgaTgTGtatAAGAGaCAGAGTATGAATTTTTTTTTTTTTTTTTATCATCCTGtCTCTTataCAcAtcTTTTT
TTITITITITITITTTTTGGCGATCGCTTITITITITTITITTCOCTTCTCCTCTAAATCATTACCTTCTA
TAATTTTTTTTTTTTTTTTGCGATCGCCTTTTTTTTTTTTTGATACATTTAgaTgTGtatAAGAGaCAGGA
TGAT-3' - l’oligo reverse GREAT X2 Rev (10uM) correspondant à la partie 3’ de la molécule 3 de séquence SEQ ID NO : 1137 suivante 5'-CGATACgcggecgcatgtteTTTTITITITITITITTTTTTTTAgaTgTGtatAAGAGaCAGTATTCGTC-3'
- l’oligo reverse GREAT X4 Rev (10uM) correspondant à la partie 5’ de la molécule 6 SEQ ID
NO : 1138 suivante
S’-TTCATACTCTGtCTCTTataCAcAtcTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTgaacatgeggccgcGTATCG-3’ - l’oligo Reverse Helix Rev correspondant à un brin additionnel permettant de lier une hélicase par l’extrémité 3’ biotinylée, l’oligo ayant la séquence SEQ ID NO : 1136.
Les deux tubes sont alors chauffés à 95°C pendant 5 min puis laissés 1h à température ambiante puis chaque tube est alors digéré avec les enzymes de restriction correspondantes :
Tube 1 : Nsil et Tube 2 : Notl puis purifié par PCR purification kit (élution 20uL).
Les figures 4 et 5 représentent schématiquement le contenu des tubes 1 et 2 respectivement avant la digestion enzymatique.
En parallèle, une séquence amplifiée GFP-ILR2y a été obtenue via lyse de cellules HEK293T et protocole d'extraction d'ADN génomique et amplification du locus d'intérêt via PCR à Tag hyper processive. Cette séquence a été amplifiée (à l’aide d’oligonucléotides possédant en 5’ un site de restriction Nsil et en 3’ un site de restrictions Notl). Le produit de PCR a été digéré par les deux enzymes et purifié par kit PCR purification élué à un volume de 20pL. La fusion
GFP-ILR2y est alors à bouts flanquants (i.e. demi-site Nsil et Not! libres) dans le tube 3.
Le contenu des 3 tubes (tube 1, tube 2 et tube 3) est alors mélangé et de la ligase de phage
T4 est ajoutée au mélange (4uL, 100 U) en présence de tampon approprié (tampon T4 ; 5uL 10X) et 11uL d’eau distillée. Le mélange est laissé 1h à température ambiante. Puis le mélange est purifié sur gel (30uL d’élution) afin d’isoler le fragment le plus important, GFP-ILR2y, de taille supérieure à 1kbases.
Le fragment purifié est prêt à être utilisé et comprend les première, deuxième, quatrième et cinquième molécules aux extrémités, les troisième et sixièmes correspondant à la fusion GFP
IL2Ry (tube 4).
A ce stade, l’oligonucléotide simple brin modifié complémentaire d’une partie des première et quatrième molécules, la partie 3’ de l’oligonucléotide simple brin modifié complémentaire étant couplée à de la biotine (oligo biotinylé), a été ajouté. Cette molécule biotinylée n’est pas obligatoire.
C- Transfection de cellules CD34+ avec la composition selon l’invention.
Le contenu du tube 4, contenant l’oligo biotinylé ou non, est alors utilisé pour transfecter par électroporation les cellules CD34+ isolées.
Les cellules sont centrifugées à 300g pendant 5min et lavées au PBS avant d’être suspendues dans du tampon électrolytique à une densité cellulaire de 75 000 à 100 000 cellules par chambre d’électroporation. Le contenu du tube 4, ainsi qu’un plasmide codant la protéine Tn5, et éventuellement un plasmide codant une fusion hélicase-streptavidine (UVRD-mSA) est ajouté dans la chambre d’électroporation selon le protocole « Episomal IPSC Reprogramming
Vectors » du système de transfection Neon® Transfert System proposé par Thermofisher.
Le mélange est électroporé à 1650V par trois séquences de 10 ms.
Les cellules sont ensuite immédiatement centrifugées à 300g pendant 5min et suspendues dans du milieu de culture pour cellules souches supplémenté pendant 48 à 96h à 37°C et 5% deCO».
La tagmentation (ie. le remplacement génique) est alors possible. Les cellules sont entretenues dans un milieu de culture approprié.
D- Vérification de la transfection
Les cellules transfectées ayant inséré au locus la molécule d'intérêt sont sélectionnées au moyen de la sélection par un antibiotique dont le gène de résistance est contenu dans la séquence de remplacement (par exemple la néomycine, la bléomycine, blasticidine S etc…).
L’ADN génomique des cellules transfectées, et résistantes, est extrait puis fragmenté par sonication, puis on ajoute les adapteurs de séquençage. Une amplification par PCR de tous les fragments d'ADN génomiques est réalisée. Cette librairie a été sequence sur séquenceur (50 x 8 x 50 reads sur un appareil HiSeq 2500, paired-end) et les résultats ont été compilé par cartographie et alignement via module bwa-mem (banque hg19). Analyse on-target/off-target ont été réalisé par sélection spécifique et c/uster read via comparaison avec génome de référence (hg19) par cartographie par le module Bwa-mem en mode short reads et le module minimap2. Les données de pic d'insertion ont quant à elles été assemblées via le module macs2.
Il est également possible de réaliser une simple PCR en utilisant un oligonucléotide sens en 5’ de l’insertion et un oligonucléotide antisens en 3’ de l’insertion (Sing/e-Tail Adapter/Tag (STAT)-PCR based method). Le produit de PCR est alors séquencé selon les techniques — classiques, afin de détecter dans la région d’intérêt au moins la présence de la GFP, signe de de l'insertion de la fusion.
E- Analyse fonctionnelle des cellules CD34+ modifiées par la composition selon
Pinvention
Ladifférentiation des cellules CD34+ modifiées est suivie in vitro grâce au modèle de coculture sur cellules stromales murines OP9-DL1 ou DL4 comme décrit dans la littérature.
Brièvement, les cellules OP9-DL1 ou DL4 sont cultivées avec les cellules CD34 modifiées pendant 14 jours à 37°C à 5% CO: et 10% Oz en milieu MEM (Minimum Essential Medium) supplémenté avec 10% de SVF (Sérum de veau foetal), le cocktail de cytokines nécessaire pour la culture des cellules CD34 (comme décrit ci-dessus) et un cocktail de cytokines _ favorisant l’activation des voies de différentiation myélo-érythroïde et l\ymphoïde.
Après 2 semaines de culture, les cellules CD34+ différenciées sont recueillies et analysées par cytométrie de flux pour observer leur profil de différentiation hématopoïétique grâce aux anticorps anti-CD19 (lignage lymphoïde B), anti-CD3 (lignage lympoïde T, anti-CD56 (lignage
NK), anti-CD16 (lignage monocytes/macrophages), anti-CD14 (lignage macrophage/neutrophiles, anti-CD11c (lignage myéloïde) et anti-CD235a (lignage érythroïde).
La différentiation des cellules CD34+ modifiées est également suivie in vivo grâce au modèle murin NSG ou NOD SCID (souris immunodéficientes).
Les cellules CD34+ modifiées sont injectées IH (intra hépatique) ou IF (intra fémorale) à des souris de 3-4 jours ou 6-8 semaines.
La différentiation est suivie à 8 semaines, 12 semaines et 16 semaines après injection, dans la moelle osseuse, la rate et le sang des souris. Les cellules humaines sont analysées par cytométrie de flux grâce aux anticorps anti-CD45 et anti-HLA ABC, et leur profil cellulaire est analysé grâce au même panel d’anticorps qu’utilisé in vitro.
Pour chaque type cellulaires l’expression de la GFP peut être détectée par cytométrie de flux.
Sur les cellules différenciées, il peut également être réalisé une transcription inverse sur cellules isolées afin d'obtenir une banque d’ADNc. Une amplification de la séquence GFP et
ILR2y est alors réalisée par PCR Oligos pour la PCR et le séquençage IL2Ry:
AGTGAACAGATCCTTCCCAGG (SEQ ID NO: 1139) et GFP Rev :
CACGAACTCCAGCAGGACCATG (SEQ ID NO : 1140) et le fragment amplifié est sequence en séquençage de Sanger mais aussi migré sur gel d’agarose. Comme attendu, après analyse (NCBI blast), on retrouve une similitude très proche avec le fragment GFP-IL2Ry théorique de remplacement de Locus IL2Ry.
Ces résultats montrent que la technologie selon linvention permet de remplacer le gène IL2Ry endogene de manière efficace par une séquence exogène.
Bien évidemment, l'exemple donné ci-dessus a pour but de démontrer l’efficacité de la technologie, et utilise des gènes tels que la GFP pour faciliter la détection de l'insertion.
Dans le cadre d’une thérapie cellulaire, le gène codant la GFP n’est pas utilisé et le séquençage ou encore la détection fonctionnelle du récepteur sont alors utilisés pour vérifier — l’efficacité.
Exemple 2 — Obtention de cellules B exprimant le gène ILR2G sauvage à partir de cellules souches pluripotentes.
Dans la mesure où il peut être difficile d'obtenir des cellules souches CD34+ chez le patient atteint de DICS-X, il est possible d'utiliser la technologie des cellules pluripotentes induites (iPSo).
Les cellules iPSc peuvent être issues de banques de cellules, dont le profil immunologique est compatible avec les patients.
Il est possible également de prélever des cellules différenciées chez le patient (par exemple des fibroblastes ou encore des cellules épithéliales), et de forcer la dédifférenciation par "expression des gènes Oct4 et Socs2, ainsi que d’autres gènes tels que KIf4, Dub3, c-Myc,
Nanog. De telles techniques sont désormais bien connues de l'homme du métier, et il pourra adapter les protocoles décrits dans l’art antérieur selon le type cellulaire qu’il souhaitera engager dans un modèle de dédifférenciation.
A ce stade il est possible de transfecter les cellules iPSc avec de la lipofectamine en présence du tube 4 comme décrit à l’exemple 1.
Les cellules transfectées sont sélectionnées par utilisation de l’antibiotique approprié, et l'insertion est vérifiée comme décrit à l’exemple 1.
Les cellules iPSc sont cultivées sur plaques enduites de gel de matrice cellulaire, en coculture avec des fibroblastes embryonnaires murins inactivés pendant 24h, en milieu de culture complet pour les cellules souches et supplémenté en bFGF et d’inhibiteur de ROCK.
Les cellules iPSc sont ensuite cultivées pendant 7jours dans milieux de culture de 24h contenant des cocktails de différentiation distincts chaque jour : o J0-1: milieu supplémenté en hBMP-4, hVEGF, hWnt3a et KOSR ; oO J2: milieu supplémenté en hBMP-4, hVEGF et KOSR ;
Oo J3: milieu supplémenté en hBMP-4, hVEGF et bFGF ; o J4-5: milieu supplémenté en hVEGF et bFGF ; o J6: milieu IMDM supplémenté en F12, B27, N2, BSA, hVEGF, bFGF, human stem cell factor et hFIt3 ligand ; o J7: milieu IMDM supplémenté en F12, B27, N2, BSA, hVEGF, bFGF, human stem cell factor, hFIt3 ligand, TPO, IL-6, hEPOgen, et FICZ (6-formylindolo [3,2-b]carbazole)
Au bout de 7 jours, les cellules sont ensuite maintenues en culture pendant 3 à 7 jours supplémentaires avant de poursuivre les expérimentations sur les cellules non adhérentes récoltées. Ces cellules sont testées pour vérifier qu’elles expriment le marqueur CD34+, par cytométrie de flux en utilisant un anticorps anti-CD34.
Si les cellules n’ont pas été transfectées au stade iPSc, elles peuvent dès lors être transfectées au stade CD34+ comme décrit à l'exemple 1. Leur différenciation est alors induite comme décrite à l’exemple 1.

Claims (17)

Revendications
1. Composition comprenant - une première molécule d'acides nucléiques simple brin comprenant ou constituée essentiellement d’une séquence A permettant l’insertion d’une séquence complémentaire d’un acide nucléique d'intérêt, ou comprenant une séquence complémentaire d’un acide nucléique d'intérêt, ladite séquence complémentaire étant liée en 5’ à une première séquence riches en T de 40 à 60 nucléotides de long et en 3’ à une deuxième séquence riches en T de 40 à 60 nucléotides de long, lesdites première et deuxième séquences riches en T comprenant respectivement un premier et un deuxième domaine de 6 à 12 nucléotides riches en G/C, la séquence du premier domaine étant complémentaire de la séquence du deuxième domaine, ledit premier et deuxième domaine étant positionnés de à 52 nucléotides de ladite séquence A, ladite première molécule comprenant en son extrémité 5’ au moins une première séquence orientés 5-3’ de reconnaissance d’une transposase et en son extrémité 3’ une deuxième séquence de reconnaissance de ladite 15 transposase, - une deuxième molécule d’acides nucléiques simple brin comprenant ou constituée essentiellement d’une séquence B permettant l’insertion d’une séquence complémentaire d’un acide nucléique d'intérêt, ou comprenant une séquence complémentaire d’un acide nucléique d'intérêt, ladite séquence B complémentaire étant liée en 5’ à une troisième séquence riche en T de 40 à 60 nucléotides de long et en 3’ à une quatrième séquence riche en T de 40 à 60 nucléotides de long, lesdites troisième et quatrième séquences riches en T comprenant respectivement un troisième et un quatrième domaine de 6 à 12 nucléotides riches en G/C, la séquence du troisième domaine étant complémentaire de la séquence du quatrième domaine, lesdits troisième et quatrième domaines étant positionnés de 15 à 52 nucléotides de ladite séquence B, ladite deuxième molécule comprenant en son extrémité 5’ au moins la première séquence orientée 5-3’ de reconnaissance de ladite transposase et en son extrémité 3’ la deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase, ladite séquence B étant une séquence complémentaire dudit acide nucléique d’intérêt, la séquence A étant positionnée en 5’ d’une région d'intérêt dudit acide nucléique d'intérêt et la séquence B positionnée en 3’ de la région d'intérêt dudit acide nucléique d’intérêt, et - une troisième molécule simple brin comprenant * dans sa partie 5’, au moins une séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule, * dans sa partie 3 au moins une séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase de la deuxième molécule, et
* une région intermédiaire située entre séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule et la séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase de la deuxième molécule, ladite région intermédiaire comprenant une séquence codant une partie du récepteur gamma de l’interleukine 2 ou IL2-Ry, ou codant le récepteur IL2-Ry complet, les première et troisième molécules d’acides nucléiques simple brin étant appariées selon la complémentarité des bases définie par Watson et Crick de sorte à définir deux sites double brin de liaison de ladite transposase et les deuxième et troisième molécules d'acides nucléiques simple brin étant appariées selon la complémentarité des bases définie par Watson et Crick de sorte à définir deux sites double brin de liaison de ladite transposase.
2. Composition selon la revendication 1, où ladite séquence A comprend une séquence complémentaire de la séquence d’une première région du gène codant l’IL2-Ry, et où ladite séquence B comprend une séquence complémentaire de la séquence d’une deuxième région du gène codant l’IL2-Ry, ladite séquence À et la dite séquence B étant deux séquences différentes, lesdites première et deuxième régions du gène codant l’IL2-Ry, encadrant une région comprenant une séquence codant une partie de l’IL2-Ry, ou codant le récepteur IL2-Ry complet.
3. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 2, où ladite première molécule comprend en son extrémité 5’ une première séquence orientée 5-3’ de reconnaissance d'une transposase et en son extrémité 3’ une deuxième séquence orientée 5’-3’ de reconnaissance de ladite transposase et où la troisième molécule en comprend en son extrémité 5’ une première séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule suivie d’une deuxième séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule.
4. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, où ladite première molécule comprend en son extrémité 5’ une première séquence orientée 5-3’ de reconnaissance d’une transposase et en son extrémité 3’ une deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase, suivie d’une première séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase et où la troisième molécule comprend en son extrémité 5’ une séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase.
5. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, où ladite transposase est une transposase bactérienne, notamment une transposase choisie parmi Tn5, Tn9, Tn10 ou Tc1/mariner.
6. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, où le gène codant l’IL2-Ry comprend une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO : 3.
7. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, où les première, deuxième et troisième molécules sont choisies parmi les triplets tels que définis dans le tableau 2.
8. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, comprenant en outre ** une quatrième molécule d'acides nucléiques simple brin comprenant ou constituée essentiellement d’une séquence A’ permettant l’insertion d’une séquence complémentaire d’un acide nucléique d'intérêt, ou comprenant une séquence complémentaire d’un acide nucléique d'intérêt, ladite séquence complémentaire étant liée en 5’ à une cinquième séquence riche en T de 40 à 60 nucléotides de long et en 3’ à une sixième séquence riche en T de 40 à 60 nucléotides de long, lesdites cinquième et sixième séquences riches en T comprenant respectivement un cinquième et un sixième domaine de 6 à 12 nucléotides riches en G/C, la séquence du cinquième domaine étant complémentaire de la séquence du sixième domaine, lesdits cinquième et sixième domaine étant positionnés de 15 à 52 nucléotides de ladite séquence A’, ladite quatrième molécule comprenant en son extrémité 5’ au moins une première séquence orientée 5’-3’ de reconnaissance d’une transposase et en son extrémité 3’ une deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase, ** une cinquième molécule d’acides nucléiques simple brin comprenant ou constituée essentiellement d’une séquence B’ permettant l'insertion d’une séquence complémentaire d’un acide nucléique d’intérêt, ou comprenant une séquence complémentaire d’un acide nucléique d'intérêt, ladite séquence B’ complémentaire étant liée en 5’ à une septième séquence riche en T de 40 à 60 nucléotides de long et en 3’ à une huitième séquence riche en T de 40 à 60 nucléotides de long, ladite septième et huitième séquence riche en T comprenant respectivement un septième et un huitième domaine de 6 à 12 nucléotides riches en G-C, la séquence du septième domaine étant complémentaire de la séquence du huitième domaine, lesdits septième et huitième domaines étant positionnés de 15 à 52 nucléotides de ladite séquence B’, ladite cinquième molécule comprenant en son extrémité
5’ au moins la première séquence orientée 5-3’ de reconnaissance de ladite transposase et en son extrémité 3’ la deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase, ladite séquence B’ étant une séquence complémentaire dudit acide nucléique d'intérêt, la séquence A’ étant positionnée en 5’ d’une région d’intérêt dudit acide nucléique d’intérêt et la séquence B’ positionnée en 3’ de la région d’intérêt dudit acide nucléique d'intérêt, et - une sixième molécule simple brin comprenant * dans sa partie 5’, au moins une séquence complémentaire de ladite cinquième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule, * dans sa partie 3 au moins une séquence complémentaire de ladite quatrième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la deuxième molécule, et * une région intermédiaire située entre séquence complémentaire de ladite quatrième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule et la séquence complémentaire de ladite cinquième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la deuxième molécule, ladite région intermédiaire comprenant une séquence complémentaire, et antiparallèle, de la séquence codant le récepteur gamma de l’interleukine 2 ou IL2-Ry contenue dans la troisième molécule de la première composition, les quatrième et sixième molécules d’acides nucléiques simple brin étant appariées selon la complémentarité des bases définie par Watson et Crick de sorte à définir deux sites double brin de liaison de ladite transposase et les cinquième et sixième molécules d'acides nucléiques simple brin étant appariées selon la complémentarité des bases définie par Watson et Crick de sorte à définir deux sites double brin de liaison de ladite transposase.
9. Composition selon la revendication 8, où - ladite séquence A comprend une séquence complémentaire de la séquence d’une première région du gène codant l’IL2-Ry, - ladite séquence B comprend une séquence complémentaire de la séquence d’une deuxième région du gène codant l’IL2-Ry, ladite séquence A et la dite séquence B étant deux séquences différentes, lesdites première et deuxième régions du gène codant l’IL2-Ry, encadrant une région comprenant une séquence codant une partie de l’IL2-Ry, ou codant le récepteur IL2-Ry complet, où - ladite séquence A’ comprend une séquence complémentaire de la séquence d’une troisième région du gène codant l’IL2-Ry, - ladite séquence B’ comprend une séquence complémentaire de la séquence d’une quatrième région du gène codant l’IL2-Ry,
ladite séquence A’ et la dite séquence B’ étant deux séquences différentes, lesdites troisième et quatrième régions du gène codant l’IL2-Ry, encadrant une région comprenant une séquence complémentaire d’une séquence codant une partie de l’IL2-Ry, ou codant le récepteur IL2-Ry complet, et où la séquence A et la séquence A’ sont au plus en partie complémentaires, la séquence A et la séquence B’ sont au plus en partie complémentaires, la séquence B et la séquence A’ sont au plus en partie complémentaires, et la séquence B et la séquence B’ sont au plus en partie complémentaires.
10. Composition pharmaceutique comprenant une composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
11. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, pour son utilisation en tant que médicament.
12. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, pour son utilisation pour le traitement d’une maladie associée à une mutation du gène codant l’IL2-Ry.
13. Composition pour son utilisation selon la revendication 12, où la maladie associée à une mutation du gène codant l’IL2-Ry est la maladie DICS-X ou encore le syndrome d'Omenn.
14. Utilisation d’une composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, pour la substitution, dans une cellule somatique, d’une séquence mutée du gène codant l’IL2-Ry par une séquence sauvage du gène codant l’IL2-Ry sauvage, sous réserve que l’utilisation ne comprenne pas un procédé pour la modification de l'identité génétique germinale d'êtres humains et que ladite utilisation ne soit pas une méthode pour le traitement du corps humain ou animal par une chirurgie ou une thérapie.
15. Méthode de remplacement in vitro d’une séquence mutée du gène codant l’IL2-Ry par une par une séquence sauvage codant l’IL2-Ry, ladite méthode comprenant : - la mise en contact d’une composition telle que défini dans l’une quelconque des revendications 1 à 9, avec l’acide nucléique comprenant la séquence mutée codant le gène de l’IL2-Ry, ladite composition étant telle que la séquence A de ladite première molécule comprend une séquence complémentaire de la région immédiatement en 5’ de la séquence mutée codant le gène de l’IL2-Ry, la séquence B de ladite deuxième molécule comprend une séquence complémentaire de la région immédiatement en 3’ de la séquence mutée codant le gène de l'IL2-Ry, et la troisième molécule comprend la séquence sauvage du gène codant l’'IL2-Ry, située entre une séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule et la séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase de la deuxième molécule, afin d’obtenir un complexe de remplacement, - la mise en présence du complexe de remplacement avec une transposase reconnaissant les sites double brin de liaison de ladite transposase contenus dans ledit ensemble, pour obtenir un complexe de recombinaison, et - la recombinaison du complexe de combinaison pour obtenir la molécule d’acide nucléique hybride la séquence sauvage du gène codant l’'IL2-Ry, à la place de la séquence mutée du gène codant l’IL2-Ry.
16. Méthode de remplacement in vitro d’une séquence double brin mutée du gène codant l’IL2- Ry d'une cellule souche, notamment une cellule souche hématopoïétique, par une séquence sauvage double brin codant l’'IL2-Ry, ladite méthode comprenant : - la mise en contact d’une composition telle que définie dans l’une quelconque des revendications 1 à 9, avec la cellule souche hématopoïétique comprenant la séquence mutée codant le gène de l’IL2-Ry, ledit ensemble étant tel que la séquence A de ladite première molécule comprend une séquence complémentaire de la région immédiatement en 5’ de la séquence mutée codant le gène de l’IL2-Ry, la séquence A’ de ladite quatrième molécule comprend une séquence complémentaire de la région immédiatement en 5’ de la séquence complémentaire mutée codant le gène de VIL2-Ry, la séquence B de ladite deuxième molécule comprend une séquence complémentaire de la région immédiatement en 3’ de la séquence mutée codant le gène de l'IL2-Ry, la séquence B’ de ladite cinquième molécule comprend une séquence complémentaire de la région immédiatement en 3’ de la séquence complémentaire mutée codant le gène de l'IL2-Ry, et la troisième molécule comprend la séquence sauvage du gène codant l’'IL2-Ry, située entre une séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule et la séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase de la deuxième molécule, la sixième molécule comprend la séquence complémentaire de la séquence sauvage du gène codant l’IL2-Ry, située entre une séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule et la séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase de la deuxième molécule, afin d’obtenir un complexe de remplacement, - la mise en présence du complexe de remplacement avec une transposase reconnaissant les sites double brin de liaison de ladite transposase contenus dans ledit ensemble, pour obtenir un complexe de recombinaison, et - la recombinaison du complexe de combinaison pour obtenir la molécule d’acide nucléique hybride la séquence sauvage du gène codant l’IL2-Ry, à la place de la séquence mutée du gène codant l’IL2-Ry, - et éventuellement la purification de la cellules souche hématopoïétique ayant un remplacement du gène muté.
17.Méthode d'insertion in vitro d’une séquence double brin du gène sauvage codant l’IL2-Ry dans une cellule, notamment une cellule souche, en particulier une cellule souche hématopoïétique, au locus du gène codant l’IL2-Ry, où ledit locus du gène codant l’IL2-Ry comprend une mutation affectant l’expression, la fonction, ou les deux, de l’IL2-Ry, où ladite séquence double brin du gène sauvage codant l’IL2-Ry correspond au ADNc dudit gène, ladite méthode comprenant : - la mise en contact d’une composition telle que définie précédemment, avec la cellule comprenant une mutation affectant l’expression, la fonction, ou les deux, de l’IL2-Ry, au niveau du locus du gène codant l’IL2-Ry ladite composition étant telle que la séquence A de ladite première molécule comprend une séquence complémentaire de la région en 5’ de l’exon 1 du gène codant l’IL2-Ry, la séquence A’ de ladite quatrième molécule comprend une séquence complémentaire de la séquence complémentaire de la région en 5’ de l’exon 1 du gène codant l’IL2-Ry, la séquence B de ladite deuxième molécule comprend une séquence complémentaire en 3’ la région en 5’ de l’exon 1 du gène codant l’IL2-Ry, la séquence B’ de ladite cinquième molécule comprend une séquence complémentaire en 3’ la séquence complémentaire de la région en 5’ de l’exon 1 du gène codant l’IL2-Ry, et la troisième molécule comprend la séquence sauvage de PADNc du gène codant l'IL2-Ry, située entre une séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule et la séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase de la deuxième molécule,
la sixième molécule comprend la séquence complémentaire de la séquence sauvage de l’'ADNc du gène codant l'IL2-Ry, située entre une séquence complémentaire de ladite deuxième séquence de reconnaissance de ladite transposase de la première molécule et la séquence complémentaire de ladite première séquence de reconnaissance de ladite transposase de la deuxième molécule, afin d’obtenir un complexe de remplacement, - la mise en présence du complexe de remplacement avec une transposase reconnaissant les sites double brin de liaison de ladite transposase contenus dans ledit ensemble, pour obtenir un complexe de recombinaison, et
- la recombinaison du complexe de combinaison pour obtenir l'insertion de ’ADNc du gène codant l’IL2-Ry en 5’ de l’exon 1 du gène codant l’IL2-Ry, - et éventuellement la purification de la cellule ayant l'insertion.
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021146666A2 (fr) * 2020-01-18 2021-07-22 Aridis Pharmaceuticals, Inc. Systèmes de transposon ajustables
WO2021257997A2 (fr) * 2020-06-18 2021-12-23 The Broad Institute, Inc. Systèmes de transposases associés à crispr et leurs méthodes d'utilisation

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021146666A2 (fr) * 2020-01-18 2021-07-22 Aridis Pharmaceuticals, Inc. Systèmes de transposon ajustables
WO2021257997A2 (fr) * 2020-06-18 2021-12-23 The Broad Institute, Inc. Systèmes de transposases associés à crispr et leurs méthodes d'utilisation

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