BE1029427B1

BE1029427B1 - Methods for the administration of beneficial nutrients to invertebrates by an antinutrient-deficient microorganism

Info

Publication number: BE1029427B1
Application number: BE20215758A
Authority: BE
Inventors: Thierry Bogaert; Sharoni Shafir; Geraldine Wright
Original assignee: Apix Biosciences
Priority date: 2021-09-28
Filing date: 2021-09-28
Publication date: 2022-12-14

Abstract

Er is een methode voor het voeren van ongewervelde dieren, bestaande uit ▪ Een stuifmeelvervangende of -aanvullende samenstelling voor ongewervelden, in het bijzonder voor honingbijen en hommels, bestaande uit gist van de Saccharomycetales, zoals S. cerevisiae ▪ Het toedienen van de samenstelling aan ongewervelde dieren, waarbij de samenstelling in hoofdzaak vrij is van ergosterol of zymosterol of combinaties daarvan.There is a method of feeding invertebrates, consisting of ▪ A pollen replacement or supplement composition for invertebrates, in particular for honeybees and bumblebees, consisting of yeast of the Saccharomycetales, such as S. cerevisiae ▪ Administering the composition to invertebrates animals, wherein the composition is substantially free of ergosterol or zymosterol or combinations thereof.

Description

Methoden voor de toediening van heilzame voedingsstoffen aan ongewervelde dieren door een micro-organisme met een tekort aan antinutriënten Achtergrond Honingbijen zijn zeer belangrijk in de moderne landbouw voor de bestuiving van gewassen en voor de productie van honing, koninginnengelei en was.Methods for the delivery of beneficial nutrients to invertebrates by an antinutrient-deficient microorganism Background Honey bees are very important in modern agriculture for crop pollination and for the production of honey, royal jelly and wax.

Honingbijenkolonies hebben te kampen met een groot aantal problemen ten gevolge van hun dichte populatie, beheerspraktijken en landbouw.Honey bee colonies face many problems due to their dense population, management practices and agriculture.

Met name door de moderne landbouw in gewassen waar bijen voor bestuiving worden gebruikt, worden Zij blootgesteld aan pesticiden.Particularly due to modern agriculture in crops where bees are used for pollination, they are exposed to pesticides.

Het houden van bijenvolken in hoge dichtheden met weinig voedsel betekent dat zij onvermijdelijk te maken krijgen met ondervoeding, hetgeen leidt tot een verhoogde prevalentie van ziekteverwekkers en parasieten.Keeping bee colonies in high densities with little food means that they inevitably suffer from malnutrition, leading to an increased prevalence of pathogens and parasites.

Van oudsher laten imkers bijen zichzelf voeden.Traditionally, beekeepers let bees feed themselves.

Honingbijen foerageren voor nectar en stuifmeel op bloeiende planten.Honey bees forage for nectar and pollen on flowering plants.

Antropogene veranderingen in het landschapsbeheer hebben onvermijdelijk geleid tot aanzienlijk minder bloeiende planten, vooral in landbouwomgevingen.Anthropogenic changes in landscape management have inevitably led to significantly fewer flowering plants, especially in agricultural environments.

Als gevolg van deze veranderingen is foerageergebied beperkt in beschikbaarheid en omvang.As a result of these changes, foraging area is limited in availability and size.

Pogingen om het natuurlijke voedsel dat bijen plaatselijk verzamelen te vervangen door stuifmeel dat door andere kolonies op rijke locaties is verzameld, zijn duur, stuifmeel is moeilijk vers te houden en in het wild verzameld stuifmeel kan drager zijn van plagen, ziekten en bestrijdingsmiddelen.Attempts to replace the natural food that bees collect locally with pollen collected by other colonies in rich locations is expensive, pollen is difficult to keep fresh, and pollen collected in the wild can carry pests, diseases and pesticides.

Als gevolg daarvan zijn imkers in de afgelopen 40 jaar meer gebruik gaan maken van in de handel verkrijgbare of zelf geproduceerde voeders op basis van soja en gist ter vervanging van stuifmeel wanneer het landschap niet voldoende gevarieerde en overvloedige bloeiende planten bevat om honingbijenkolonies te ondersteunen.As a result, over the past 40 years, beekeepers have increased the use of commercially available or home-produced soybean and yeast-based feeds as a substitute for pollen when the landscape does not contain enough varied and abundant flowering plants to support honey bee colonies.

Als gevolg van aanbevelingen van het USDA uit de jaren 1950 zijn imkers begonnen honingbijen te voederen met biergist (S. cerevisiae) gemengd met suiker.Following USDA recommendations in the 1950s, beekeepers began feeding honey bees with brewer's yeast (S. cerevisiae) mixed with sugar.

Gist bevat eiwitten, aminozuren, vitaminen en mineralen.Yeast contains proteins, amino acids, vitamins and minerals.

Het bevat <2% vet.It contains <2% fat.

De belangrijkste sterol van Biergist is ergosterol, een van de lipideverbindingen.The main sterol of brewer's yeast is ergosterol, one of the lipid compounds.

De meeste commerciële producten die als voedsel voor honingbijen worden verkocht, bevatten biergist, en sommige worden uitsluitend van biergist gemaakt (tabel 1).Most commercial products sold as food for honey bees contain brewer's yeast, and some are made exclusively from brewer's yeast (Table 1).

US2019/0090507 aan Apix Biosciences benadrukt het belang van plantensterolen en in het bijzonder van 24-methyleencholesterol, campesterol, B-sitosterol en cholesterol voor honingbijen als essentiële voedingsstoffen.US2019/0090507 to Apix Biosciences highlights the importance of plant sterols and in particular 24-methylene cholesterol, campesterol, β-sitosterol and cholesterol for honey bees as essential nutrients.

US2019/0090507 vermeldt echter niet ergosterol of zymosterol of een mengsel daarvan als een antinutriënt voor bijen.However, US2019/0090507 does not mention ergosterol or zymosterol or a mixture thereof as an antinutrient for bees.

Korte beschrijving van de uitvinding Bijgevolg bestaat een eerste aspect van de uitvinding uit een methode voor het voederen van ongewervelde dieren, bestaande uit: " een niet-pollencompositie te verstrekken die een qua voedingswaarde effectieve hoeveelheid ergosterolvrije gist bevat; of = het verstrekken van een niet-pollen samenstelling die een nutritioneel effectieve hoeveelheid zymosterolvrije gist bevat; en = toediening van de niet-pollen samenstelling aan ongewervelde dieren.BRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION Accordingly, a first aspect of the invention is a method of feeding invertebrates comprising: "providing a non-pollen composition containing a nutritionally effective amount of ergosterol-free yeast; or = providing a non-pollen -pollen composition containing a nutritionally effective amount of zymosterol-free yeast, and = administration of the non-pollen composition to invertebrates.

In een ander aspect is de samenstelling een volledige voeding van ongewervelde dieren, een deel van een voeding van ongewervelde dieren of een voedingssupplement.In another aspect, the composition is a complete invertebrate diet, part of an invertebrate diet, or a dietary supplement.

In een ander aspect wordt de samenstelling toegediend aan ongewervelde dieren van de geslachten Apis of Bombus, in het bijzonder honingbijen of hommels.In another aspect, the composition is administered to invertebrates of the genera Apis or Bombus, especially honeybees or bumblebees.

In een ander aspect wordt de samenstelling toegediend = in vaste vorm zoals een pasteitje of in vloeibare vorm zoals een oplossing of spray of poeder of een topische toepassing, = binnen of buiten de korf.In another aspect, the composition is administered = in solid form such as a patty or in liquid form such as a solution or spray or powder or topical application, = inside or outside the hive.

Een ander aspect is dat de bron van de ergosterol/zymosterol-vrije gist of een mengsel daarvan een niet-pollenbron is, gekozen uit de groep bestaande uit: =» een schimmel, in het bijzonder een extract, een olie of een raffinage van Saccharomyces cerevisiae, of Yarrowia lipolytica, en met inbegrip van, maar niet beperkt tot, de volgende geslachten Aspergillus, Botrytis, Candida, Cercospora, Cryptococcus, Fusarium (Gibberella), Hansenula, Kluyveromyces, Metschnikowia, Neurospora, Penicillium, Pichia, Puccinia, Rhodotorula, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Sclerotium, Torula, Torulopsis, Trichoderma, en Xanthophyllomyces (Phaffia), ZygosaccharomycesAnother aspect is that the source of the ergosterol/zymosterol-free yeast or a mixture thereof is a non-pollen source selected from the group consisting of: =» a fungus, especially an extract, an oil or a refinement of Saccharomyces cerevisiae, or Yarrowia lipolytica, and including, but not limited to, the following genera Aspergillus, Botrytis, Candida, Cercospora, Cryptococcus, Fusarium (Gibberella), Hansenula, Kluyveromyces, Metschnikowia, Neurospora, Penicillium, Pichia, Puccinia, Rhodotorula, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Sclerotium, Torula, Torulopsis, Trichoderma, and Xanthophyllomyces (Phaffia), Zygosaccharomyces

Een ander aspect is dat de ergosterol/zymosterol-vrije gist of een mengsel daarvan wordt geleverd als onderdeel van een stuifmeelvervangende samenstelling, waarbij de stuifmeelvervangende samenstelling bestaat uit: = eiwitten in een hoeveelheid van 10 tot 50 gew%, bij voorkeur van 20 tot 40 gew%, =» vetzuren in een hoeveelheid van 1 w% tot 20 w%, bij voorkeur van 2 w% tot 12 w%, = koolhydraten in een hoeveelheid van 30 tot 90 gew%, bij voorkeur van 5 tot 50 gew%, =" eventueel vitaminen, en =" eventueel mineralen, waarbij de totale hoeveelheid bestanddelen en eventueel verdere bestanddelen opgeteld 100 w% bedraagt en waarbij het w% betrekking heeft op het totale drooggewicht van de samenstelling.Another aspect is that the ergosterol/zymosterol-free yeast or a mixture thereof is supplied as part of a pollen replacement composition, wherein the pollen replacement composition consists of: = proteins in an amount of 10 to 50% by weight, preferably from 20 to 40 wt%, =» fatty acids in an amount from 1 wt% to 20 wt%, preferably from 2 wt% to 12 wt%, = carbohydrates in an amount from 30 to 90 wt%, preferably from 5 to 50 wt%, =" optionally vitamins, and =" optionally minerals, where the total amount of ingredients and optionally further ingredients add up to 100 w% and where the w% relates to the total dry weight of the composition.

In een ander aspect wordt de ergosterol/zymosterol-vrije gist of een mengsel daarvan gemengd met sacharose en/of invertsiroop in een verhouding van 1-60% gist, maar bij voorkeur 10-50% gist, en bij voorkeur 15-30% gist.In another aspect, the ergosterol/zymosterol-free yeast or a mixture thereof is mixed with sucrose and/or invert syrup in a ratio of 1-60% yeast, but preferably 10-50% yeast, and preferably 15-30% yeast .

Korte beschrijving van de tekeningen Figuur 1 toont de keuze van cohorten bijen van dieet met of zonder gist vrij van ergosterol Figuur 2 toont de overleving van cohorten bijen die zich voedden met diëten die specifieke concentraties ergosterolbevattende gist bevatten Figuur 3 toont de drempelwaarde voor de invloed van gist met ergosterol op de productie van broed in bijendieet per eenheid eiwit Figuur 4 toont de toename van de tjd dat een kolonie broedsel kan produceren wanneer sterolen die de bijen nodig hebben aan het dieet worden toegevoegd Figuur 5 toont de overleving van cohorten bijen die zich voeden met diëten die ergosterol bevatten en geïnoculeerd zijn met de darmpathogeen Nosema ceranaeBrief description of the drawings Figure 1 shows the choice of cohorts of bees from diet with or without yeast free of ergosterol Figure 2 shows the survival of cohorts of bees fed on diets containing specific concentrations of ergosterol containing yeast Figure 3 shows the threshold for the influence of yeast with ergosterol on production of brood in bee diet per unit protein Figure 4 shows the increase in time a colony can produce brood when sterols needed by the bees are added to the diet Figure 5 shows the survival of cohorts of bees that are feeding with diets containing ergosterol and inoculated with the intestinal pathogen Nosema ceranae

Gedetailleerde beschrijving van de uitvinding Ongewervelde antinutriënten Gisten zoals Saccharomyces cerevisiae en Yarrowia lypolitica zijn enkele van de belangrijkste micro-organismen die worden gebruikt voor de commerciële productie van vetten en andere vetafgeleide verbindingen zoals sterolen en steroïden.Detailed Description of the Invention Invertebrate Antinutrients Yeasts such as Saccharomyces cerevisiae and Yarrowia lypolitica are some of the major microorganisms used for the commercial production of fats and other fat-derived compounds such as sterols and steroids.

Veel mariene algen en diatomeeën die een uiteenlopende reeks sterolen bevatten, worden ook gemanipuleerd om vetverbindingen te produceren (Rampan et al. 2010, Gallo et al. 2020). Bovendien zijn verschillende plantensoorten gemanipuleerd om specifieke sterolen of lipideverbindingen te produceren of tot expressie te brengen (Sawai et al. 2014). Ongewervelde dieren zijn niet op grote schaal gemanipuleerd voor het gehalte aan lipiden of sterolen, maar hebben het potentieel om dat in de toekomst te worden als informatie over hun genomen en metabolische routes wordt onthuld.Many marine algae and diatoms containing a diverse range of sterols are also engineered to produce lipid compounds (Rampan et al. 2010, Gallo et al. 2020). In addition, several plant species have been engineered to produce or express specific sterols or lipid compounds (Sawai et al. 2014). Invertebrates have not been widely manipulated for lipid or sterol content, but have the potential to become so in the future as information about their genomes and metabolic pathways is revealed.

De meeste van deze bronnen bevatten zeer lage gehalten aan sterolen en zouden als geheel niet in bijenvoedsel kunnen worden verwerkt zonder de sterolen te concentreren of te extraheren, wat kostenverhogend is.Most of these sources contain very low levels of sterols and as a whole could not be processed into bee food without concentrating or extracting the sterols, which increases costs.

Sommige schimmels, waaronder S. cerevisiae Torula, kunnen in bijenvoeder worden verwerkt als bron van eiwitten, vitaminen en aminozuren.Some fungi, including S. cerevisiae Torula, can be incorporated into bee feed as a source of protein, vitamins and amino acids.

De gist die tegenwoordig in de levensmiddelen- en diervoederindustrie wordt gebruikt, bevat producten die volledig op gist zijn gebaseerd.The yeast used in the food and feed industry today contains products that are entirely based on yeast.

Deze specifieke gisten bevatten echter antinutriënten voor bijen.However, these specific yeasts contain antinutrients for bees.

Met name de inheemse sterolen in de meeste gisten zijn ergosterol en zymosterol.In particular, the native sterols in most yeasts are ergosterol and zymosterol.

Wij hebben ontdekt dat gist die ergosterol bevat of ergosterol zelf geen voorkeursbron van bijenvoeding is, aangezien bijen voeder met ergosterol actief mijden en de voorkeur geven aan voeder zonder ergosterol (figuur 1). Bijen leven korter wanneer zij worden gevoederd met voeders die ergosterol bevatten (figuur 2). Bijen produceren minder broed op bijenvoer met ergosterol dan op bijenvoer dat geen ergosterol bevat (fig. 3 en 4). Ergosterol in bijenvoeding passeert de darm van de bij niet en is metabolisch niet nuttig.We have found that yeast containing ergosterol or ergosterol itself is not a preferred source of bee nutrition, as bees actively avoid ergosterol-containing feed and prefer ergosterol-free feed (Figure 1). Bees have a shorter lifespan when fed with ergosterol-containing feeds (Figure 2). Bees produce less brood on bee food containing ergosterol than on bee food that does not contain ergosterol (Fig. 3 and 4). Ergosterol in bee food does not pass through the bee's gut and is not metabolically useful.

In plaats daarvan hebben we ontdekt dat suppletie van het dieet met ergosterol de Nosema populatie in de darm verhoogt, wat resulteert in intestinale microbioom dysbiose en hogere mortaliteit (figuur 5). Ergosterolsupplementatie is waarschijnlijk in het voordeel van Nosema sp. (vooral Nosema ceranae), omdat het ook door deze ziekteverwekker als sterol wordt gebruikt.Instead, we found that dietary supplementation with ergosterol increases the Nosema population in the gut, resulting in intestinal microbiome dysbiosis and higher mortality (Figure 5). Ergosterol supplementation is likely to benefit Nosema sp. (especially Nosema ceranae), as it is also used as a sterol by this pathogen.

Ergosterolsupplementatie zal waarschijnlijk ook leiden tot een toename van de darmpopulaties van trypanosomen zoals Crithidia bombi, die ook ergosterol gebruiken en die bijensoorten van het geslacht Bombus aantasten.Ergosterol supplementation is also likely to increase the intestinal populations of trypanosomes such as Crithidia bombi, which also use ergosterol and affect bee species of the Bombus genus.

Zo hebben de uitvinders hier ontdekt dat ergosterol en zymosterol, sterolen die veel voorkomen in gistsoorten, antinutriënten zijn voor bepaalde ongewervelde dieren, 5 waaronder honingbijen en hommels die microsporidiën of trypanosomale parasieten herbergen. Gisten zijn echter nuttige bronnen van andere voedingsstoffen voor bijen.Thus, the inventors here have discovered that ergosterol and zymosterol, sterols commonly found in yeasts, are antinutrients to certain invertebrates, including honeybees and bumblebees that harbor microsporidia or trypanosomal parasites. However, yeasts are useful sources of other nutrients for bees.

Voordeel is dat wij gistsoorten hebben ontwikkeld die andere voedingsstoffen leveren, maar die deze antinutriënten niet tot expressie brengen, met name uit de sterolen die van nature voorkomen in gisten zoals S. cereviseae. Voordeel is dat deze genetisch gemodificeerde micro-organismen of delen, extracten, oliën of verfijningen daarvan worden toegediend als onderdeel van een in wezen pollenvrij dieet. Dit dieet verhoogt de algemene prestaties van ongewervelde dieren, met name de productie van bijenbroed en de overleving van werkbijen, in vergelijking met een dieet zonder stuifmeel dat dergelijke micro-organismen niet bevat.The advantage is that we have developed strains of yeast that provide other nutrients but do not express these antinutrients, particularly from the sterols that occur naturally in yeasts such as S. cereviseae. The advantage is that these genetically modified microorganisms or parts, extracts, oils or refinements thereof are administered as part of an essentially pollen-free diet. This diet increases overall invertebrate performance, particularly bee brood production and worker bee survival, compared to a pollen-free diet that does not contain such microorganisms.

De productie van dieren vereist de ontwikkeling van kosteneffectieve en toch uit voedingsoogpunt optimale voeders. In de handel verkrijgbare bijenvoedersamenstellingen bevatten alle gist met ergosterol en zymosterol (zoals weergegeven in tabel 1). Met deze uitvinding is dan ook voor het eerst aangetoond dat de toevoeging van gist zonder ergosterol of zymosterol aan een bijenvoer zonder pollen voordelig is.Animal production requires the development of cost-effective yet nutritionally optimal feeds. Commercially available bee feed compositions all contain yeast with ergosterol and zymosterol (as shown in Table 1). With this invention it has therefore been shown for the first time that the addition of yeast without ergosterol or zymosterol to a bee feed without pollen is beneficial.

Het ontwikkelen van giststammen om specifieke verbindingen, waaronder sterolen, al dan niet tot expressie te brengen, is een routinepraktijk. Het inbouwen van een giststam die geen ergosterol of zymosterol of een mengsel van deze twee sterolen bevat, is een uitvinderswerkzaamheid.Developing yeast strains to express or not express specific compounds, including sterols, is routine practice. Incorporating a yeast strain that does not contain ergosterol or zymosterol or a mixture of these two sterols is an inventive step.

Het principe voor het maken van dergelijke giststammen is welbekend bij diegenen die ervaring hebben met deze kunst: = Eenergosteroldeficiënte stam van S. cerevisiae kan bijvoorbeeld worden gemaakt door de genen erg4 en erg5 of erg5 alleen in S. cerevisiae te deleten (bv. BG4742 erg4 erg5, Sawai et al. 2014). Hetzelfde kan worden gedaan in Yarowa lipolytica door de orthologen van erg4 en erg5 te deleten.The principle for making such yeast strains is well known to those who are experienced in this art: = For example, an ergosterol deficient strain of S. cerevisiae can be made by deleting the genes erg4 and erg5 or erg5 only in S. cerevisiae (e.g. BG4742 erg4 erg5, Sawai et al. 2014). The same can be done in Yarowa lipolytica by deleting the orthologs of erg4 and erg5.

=» Een ergosteroldeficiënte stam van een andere gistsoort kan bijvoorbeeld worden gemaakt door de orthologs voor de genen erg4 en erg5 in die soort te schrappen (bv. BG4742 erg4 erg5 in S. cerevisiae, Sawai et al. 2014). = Eenergosteroldeficiënte stam van S. cerevisiae kan bijvoorbeeld worden gemaakt door de genen erg4 en erg5 of erg5 alleen in S. cerevisiae te deleten (bv. BG4742 erg4 erg5, Sawai et al. 2014). Hetzelfde kan worden gedaan in Yarrowia lipolytica door de orthologen van erg4 en erg 5 te deleten). Een dergelijke ergosteroldeficiënte stam kan tot expressie worden gebracht van een ander voor bijen nuttig sterol zoals campesterol als primair (290%) sterol door expressie van het DWF1 cDNA of het DHCR7-gen een enzym met dezelfde activiteit in deze stam (stam T55). Tabel 1. Commerciële stuifmeelvervangers bevatten ergosterol en zymosterol uit g/mg Roya | Gist | Ultra | Mega | AP23 | BPro | Brdbld | Feed | Asgoge lee Zymoster 0.02 (0.023 (0.007 | 0.014 | 0.03 | 0.029 | 0.005 | 0.604 a EL Le Ergostero 0.29 (0.208 (0.058 | 0.192 | 0.27 | 0.289 | 0.052 | 1.530=» For example, an ergosterol-deficient strain of another yeast species can be created by deleting the orthologs for the genes erg4 and erg5 in that species (e.g. BG4742 erg4 erg5 in S. cerevisiae, Sawai et al. 2014). = For example, an ergosterol-deficient strain of S. cerevisiae can be created by deleting the genes erg4 and erg5 or erg5 only in S. cerevisiae (e.g. BG4742 erg4 erg5, Sawai et al. 2014). The same can be done in Yarrowia lipolytica by deleting the orthologs of erg4 and erg 5). Such an ergosterol deficient strain can be expressed from another sterol useful to bees such as campesterol as primary (290%) sterol by expression of the DWF1 cDNA or the DHCR7 gene an enzyme with the same activity in this strain (strain T55). Table 1. Commercial pollen substitutes contain ergosterol and zymosterol from g/mg Roya | Yeast | Ultra | mega | AP23| BPro | Brdbld | Feed | Asgoge lee Zymoster 0.02 (0.023 (0.007 | 0.014 | 0.03 | 0.029 | 0.005 | 0.604 a EL Le Ergostero 0.29 (0.208 (0.058 | 0.192 | 0.27 | 0.289 | 0.052 | 1.530

CPE Totaal 0.31 | 0.231 (0.065 | 0.206 | 0.30 | 0.318 | 0.057 | 2.133 anti- 9 7 nutriënten Niet-pollen samenstelling De samenstelling van de uitvinding is bij voorkeur een niet-pollen samenstelling. De eigenschap "niet-stuifmeelhoudend'" betekent in wezen vrij van stuifmeel. Er kunnen echter kleine hoeveelheden stuifmeel aanwezig zijn in de samenstellingen van de huidige uitvindingen. In één belichaming is de hoeveelheid stuifmeel 15 w% of minder, bij voorkeur 10 w% of minder, nog liever 5 w% of minder en nog liever 1 w% of minder en nog liever 0,1 w% of minder in verhouding tot het drooggewicht van de samenstelling.CPE Total 0.31 | 0.231 (0.065 | 0.206 | 0.30 | 0.318 | 0.057 | 2.133 anti-nutrients Non-pollen composition The composition of the invention is preferably a non-pollen composition. The property "non-pollen" means essentially free of pollen However, small amounts of pollen may be present in the compositions of the present inventions In one embodiment, the amount of pollen is 15 wt% or less, preferably 10 wt% or less, more preferably 5 wt% or less, more preferably 1 wt% % or less, more preferably 0.1 wt% or less relative to the dry weight of the composition.

In een andere belichaming is de samenstelling een stuifmeelvervangende samenstelling die een stuifmeeldieet vervangt.In another embodiment, the composition is a pollen replacement composition that replaces a pollen diet.

Ongewervelden Ongewervelde soorten zijn de meest diverse dieren op aarde.Invertebrates Invertebrates are the most diverse animals on earth.

Zij zijn belangrijke componenten van natuurlijke ecologische systemen en spelen een sleutelrol bij de productie van menselijk voedsel.They are important components of natural ecological systems and play a key role in the production of human food.

Een steeds belangrijker onderdeel van de voedselproductie betreft de teelt van ongewervelde dieren zoals insecten, schaaldieren en weekdieren als voedsel voor mens en dier en voor hun rol in ecosysteemdiensten zoals bestuiving.An increasingly important part of food production involves the cultivation of invertebrates such as insects, crustaceans and molluscs as food for humans and animals and for their role in ecosystem services such as pollination.

Insecten worden ook gekweekt als natuurlijke vijanden van plaaginsecten en uitgezet als onderdeel van strategieën voor geïntegreerde plaagbestrijding.Insects are also bred as natural predators of insect pests and introduced as part of integrated pest management strategies.

Ongewervelde dieren omvatten = geleedpotigen, zoals insecten, spinachtigen, schaaldieren en myriapoden, = weekdieren, zoals chitons, slakken, tweekleppigen, inktvissen en octopussen, = eencelligen, zoals regenwormen en bloedzuigers; en = cnidarianen, zoals hydra's, kwallen, zeeanemonen en koralen.Invertebrates include = arthropods, such as insects, arachnids, crustaceans, and myriapods, = molluscs, such as chitons, snails, bivalves, squid, and octopuses, = unicellulars, such as earthworms and leeches; and = cnidarians, such as hydras, jellyfish, sea anemones and corals.

Ongewervelde dieren die bij voorkeur worden gekweekt of gekweekt voor menselijke of dierlijke voeding, zoals bijen, hommels, regenwormen, meelwormen, garnalen, rivierkreeften, krekels en vliegenlarven, hebben de voorkeur.Invertebrates that are preferentially farmed or reared for human or animal food, such as bees, bumblebees, earthworms, mealworms, shrimp, crayfish, crickets, and fly larvae are preferred.

Ongewervelde dieren van de familie van de Apidae, die worden gebruikt als bestuivers voor land- en tuinbouwgewassen, hebben de voorkeur, zoals = bijen van het geslacht Apis, in het bijzonder Apis mellifera of = hommels van het geslacht Bombus en in het bijzonder Bombus terrestris Ergosterolvrij De samenstelling van de uitvinding bevat geen, d.w.z. is in wezen vrij van ergosterol, zymosterol of combinaties daarvan.Invertebrates of the Apidae family, which are used as pollinators for agricultural and horticultural crops, are preferred, such as = bees of the genus Apis, in particular Apis mellifera or = bumblebees of the genus Bombus and in particular Bombus terrestris Ergosterol Free The composition of the invention does not contain, i.e. is essentially free of, ergosterol, zymosterol or combinations thereof.

Kleine hoeveelheden ergosterol kunnen echter aanwezig zijn in de samenstellingen van de huidige uitvindingen.However, small amounts of ergosterol may be present in the compositions of the present inventions.

In één belichaming is de hoeveelheid ergosterol, zymosterol of combinaties daarvan 5 w% of minder, bij voorkeur 1 w% of minder, nog meer bij voorkeur 0,1 w% of minder, vergeleken met het drooggewicht van de samenstelling.In one embodiment, the amount of ergosterol, zymosterol or combinations thereof is 5 wt% or less, preferably 1 wt% or less, more preferably 0.1 wt% or less, compared to the dry weight of the composition.

Dosering en concentratie De ergosterol/zymosterol-vrije gist moet worden toegediend in een hoeveelheid die uit voedingsoogpunt effectief is voor bijen.Dosage and Concentration The ergosterol/zymosterol-free yeast should be administered in an amount that is nutritionally effective for bees.

In één belichaming betekent voedingskundig doeltreffend de hoeveelheid ergosterol/zymosterol -vrije gist in een hoeveelheid als onderdeel van een stuifmeelvervangende samenstelling, waarbij de stuifmeelvervangende samenstelling bestaat uit: = eiwitten in een hoeveelheid van 10 tot 50 gew%, bij voorkeur van 20 tot 40 gew%, =» vetzuren in een hoeveelheid van 1 w% tot 20 w%, bij voorkeur van 2 w% tot 12 w%, = koolhydraten in een hoeveelheid van 30 tot 90 gew%, bij voorkeur van 5 tot 50 gew%, =" eventueel vitaminen, en =" eventueel mineralen, waarbij de totale hoeveelheid bestanddelen en eventueel verdere bestanddelen opgeteld 100 w% bedraagt en waarbij het w% betrekking heeft op het totale drooggewicht van de samenstelling.In one embodiment, nutritionally effective means the amount of ergosterol/zymosterol-free yeast in an amount as part of a pollen replacement composition, wherein the pollen replacement composition consists of: = proteins in an amount of 10 to 50% by weight, preferably 20 to 40% by weight %, =» fatty acids in an amount from 1 wt% to 20 wt%, preferably from 2 wt% to 12 wt%, = carbohydrates in an amount from 30 to 90 wt%, preferably from 5 to 50 wt%, = " optionally vitamins, and =" optionally minerals, where the total amount of ingredients and optionally further ingredients add up to 100% by weight and where the w% relates to the total dry weight of the composition.

Voorbeelden Voorbeeld 1. Voorkeurstest: Bijen vermijden ergosterol in voedsel.Examples Example 1. Preference test: Bees avoid ergosterol in food.

Methode: Pas uitgekomen volwassen werkhoningbijen (Apis mellifera) en volwassen werkhommels (Bombus terrestris) werden getest in een tweekeuzesvoorkeurstest waarbij de bijen toegang hadden tot twee diëten en ad /ibitum toegang tot water.Methods: Newly hatched adult worker honey bees (Apis mellifera) and adult worker bumblebees (Bombus terrestris) were tested in a two-choice preference test in which the bees had access to two diets and ad/ibitum access to water.

Het ene dieet bevatte het ergosterol en het andere geen sterol.One diet contained the ergosterol and the other no sterol.

Pas uitgekomen bijen werden uit het broedraam gehaald en cohorten van 30 bijen per replicaat werden ondergebracht in plastic opfokkooien.Newly hatched bees were removed from the brooder and cohorts of 30 bees per replicate were housed in plastic rearing cages.

In alle experimenten werden 10 cohorten van -30 bijen elk gebruikt voor elke behandelingsgroep.In all experiments, 10 cohorts of -30 bees each were used for each treatment group.

In alle diëten werd het koolhydraatgehalte op 60% gehouden met poedersuiker en het vetgehalte op 8% met een emulsie.In all diets the carbohydrate content was kept at 60% with icing sugar and the fat content at 8% with an emulsion.

De consumptie van elk dieet werd om de 24 uur gemeten gedurende 5 dagen.Consumption of each diet was measured every 24 hours for 5 days.

De voorkeursindex werd berekend als (hoeveelheid geconsumeerd van de behandeling - hoeveelheid geconsumeerd van de controle)/(totale hoeveelheid geconsumeerd voedsel). Voorbeeld 2: Overleving: bijen hebben minder kans om te overleven op diëten die ergosterol bevatten Methode: Pas uitgekomen volwassen werksterhoningbijen kregen een dieetbehandeling en ad J/ibitum toegang tot water.The index of preference was calculated as (amount of treatment consumed - amount of control consumed)/(total amount of food consumed). Example 2: Survival: Bees are less likely to survive on diets containing ergosterol Method: Newly hatched adult worker honey bees were given dietary treatment and ad J/ibitum access to water.

Het behandelde dieet bevatte ergosterol.The treated diet contained ergosterol.

In alle experimenten werden 10 cohorten van -30 bien elk gebruikt voor elke behandelingsgroep.In all experiments, 10 cohorts of -30 bis each were used for each treatment group.

De consumptie van elk dieet werd in de loop van het experiment elke dag gemeten.Consumption of each diet was measured every day during the course of the experiment.

Het aantal levende bijen in de kast werd gedurende 14 dagen elke dag geteld.The number of live bees in the hive was counted every day for 14 days.

Voorbeeld 3 en 4. Broedproductie: Honingbijen kunnen geen broedsel produceren op diëten met grote hoeveelheden ergosterol Methode: Volledig functionele geïsoleerde piepschuimen APIDEA-nestkasten, bestaande uit 5 miniframes bevolkt met volwassen werksters en 1 gedekte legkoningin, werden bevolkt met 300-400 ml jonge volwassen werksters (- N<1.000 bijen van gemengde leeftijden). De kolonie bevond zich in een gesloten serre met ventilatie, zodat de honingbijen niet op nectar of stuifmeel konden foerageren.Examples 3 and 4. Brood production: Honey bees cannot produce brood on diets high in ergosterol Method: Fully functional insulated styrofoam APIDEA nest boxes, consisting of 5 miniframes populated with adult workers and 1 mated laying queen, were populated with 300-400 ml of young adults workers (- N<1,000 bees of mixed ages). The colony was in a closed greenhouse with ventilation, so that the honey bees could not forage for nectar or pollen.

Elke behandeling werd getest met 3-6 kolonies; elke kolonie werd gevoederd met een pasteitje van 60-100 g (vast voer) op de bovenste voederbak, voorzien van een gaasbodem.Each treatment was tested with 3-6 colonies; each colony was fed with a 60-100 g patty (solid food) on the top feeder, fitted with a mesh bottom.

Het voer werd op de eerste dag gegeven en nogmaals op dag 6; de geconsumeerde hoeveelheid werd gemeten op dag 6 en dag 15. Als op dag 6 geen larven of eieren/koninginnen worden waargenomen, wordt het experiment stopgezet.The food was given on the first day and again on day 6; the amount consumed was measured on day 6 and day 15. If no larvae or eggs/queens are observed on day 6, the experiment is stopped.

Het aantal afgedekte broedcellen werd om de 15 dagen geteld.The number of capped brood cells was counted every 15 days.

Het aantal bijenvolken werd bij elke inspectie geschat.The number of bee colonies was estimated at each inspection.

Suikersiroop (34%) en water werden verstrekt in voederbakken in de tent om te voorkomen dat de bijen verhongeren aan koolhydraten en om de foerageeractiviteit te stimuleren.Sugar syrup (34%) and water were provided in feeders in the tent to prevent the bees from starving on carbohydrates and to encourage foraging activity.

Voorbeeld 5. Nosema infectie: Honingbijen hebben aanzienlijk meer Nosema wanneer ze gevoed worden met diëten die ergosterol bevatten Methode: Pas uitgekomen volwassen werkhoningbijen (Apis mellifera) of volwassen werkhommels (Bombus terrestris) werden gekweekt in een proef om te testen of voeding een toename van Nosema ceranae-infectie veroorzaakte.Example 5. Nosema Infection: Honey bees have significantly more Nosema when fed diets containing ergosterol Method: Newly hatched adult worker honey bees (Apis mellifera) or adult worker bumblebees (Bombus terrestris) were bred in a trial to test whether feeding caused an increase in Nosema ceranae infection.

De bijen kregen een dieet dat bestond uit 15% eiwit, 6% vet, 78% koolhydraten en 1% vitaminen en mineralen en ad libitum toegang tot water en sacharoseoplossing.The bees were fed a diet consisting of 15% protein, 6% fat, 78% carbohydrates and 1% vitamins and minerals and ad libitum access to water and sucrose solution.

In alle experimenten werden 10 cohorten van +30 bijen gebruikt voor elke behandelingsgroep.In all experiments, 10 cohorts of +30 bees were used for each treatment group.

De consumptie van elk dieet werd om de 24 uur gemeten gedurende 14 dagen.Consumption of each diet was measured every 24 hours for 14 days.

Nosema ceranae-infectie van elke cohort werd geproduceerd zoals in Tischler et al. (2017). Kort gezegd werden Nosema-sporen verzameld in 10 bijen, geconcentreerd en gekweekt.Nosema ceranae infection of each cohort was produced as in Tischler et al. (2017). Briefly, Nosema spores were collected in 10 bees, concentrated and cultured.

De culturen werden toegevoegd aan 30% sucroseoplossingen en aan de bijen gevoerd.The cultures were added to 30% sucrose solutions and fed to the bees.

Vertaling van Engelse uitdrukkingen in de tekeningen Avoids sterol Vermijdt sterol Prefers sterol Geeft de voorkeur aan sterol Isofucosterol Isofucosterol survival per cohoert overleving per cohoert time (days) tijd (dagen) Capped brood per uni protein per colony | Afgedekt broed per uni eiwit per kolonie per 2 week period per periode van 2 weken Efficiency (brood/g protein) Rendement (broed/g eiwit)Translation of English expressions in the drawings Avoids sterol Avoids sterol Prefers sterol Prefers sterol Isofucosterol Isofucosterol survival per cohort survival per cohort time (days) time (days) Capped bread per uni protein per colony | Hatched brood per uni protein per colony per 2 week period per 2 week period Efficiency (bread/g protein) Efficiency (brood/g protein)

Plurality of bee sterols (% weight) Pluraliteit van bijensterolen (% gewicht) bee sterol profile bijensterolprofiel Capped brood produced per colony over a | Geplukt broed per kolonie over een 2 wk period periode van 2 wekenPlurality of bee sterols (% weight) Plurality of bee sterols (% weight) bee sterol profile bee sterol profile Capped bread produced per colony over a | Picked brood per colony over a 2 wk period of 2 weeks

Claims

Conclusions

1. A method of feeding invertebrates consisting of =» A pollen replacement or supplement composition for invertebrates, in particular for honeybees and bumblebees, consisting of yeast of the Saccharomycetales such as S. cerevisiae = Administering the composition to invertebrates animals, wherein the composition is substantially free of ergosterol or zymosterol or combinations thereof.

2. The method of claim 1, wherein the sterol provided to or produced by the yeast for growth instead of ergosterol or zymosterol is not an antinutrient to bees

3. The method of any of the preceding claims, wherein a pollen replacement or supplement composition for honeybees and bumblebees is made containing not more than 0.01 microg/mg zymosterol.

4 The method of any of the preceding claims, providing a pollen replacement or supplement composition for honeybees and bumblebees containing not more than 0.01 microg/mg ergosterol.

5. The method of any of the preceding claims, wherein a pollen substitute or supplement for honeybees and bumblebees is provided containing not more than 0.01 microg/mg total of any of the following sterols: ergosterol or zymosterol or combinations thereof.

Use of a pollen replacement composition according to any one of claims 1 to 5 for feeding invertebrates, in particular honeybees or bumblebees.